KR101244315B1 - 에탄올―저항성 효모 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 ALD3(YMR169C), USV1(YPL230W), FMP16(YDR070C), RGI1(YER067W), BTN2(YGR142W), RTC3(YHR087W), HSP30(YCR021C), CTT1(YGR088W), AIM17(YHL021C), STF2(YGR008C), GPH1(YPR160W), YFR017C, SOL4(YGR248W), PHM8(YER037W), HSP12(YFL014W), SSA4(YER103W), SPI1(YER150W) 및 OM45(YIL136W)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 과다발현된 에탄올-저항성 형질변형 효모 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 효모 균주는 고농도 에탄올, 바람직하게는 6-12% 에탄올에서 성장할 수 있는 효모 균주이다. 따라서, 고농도의 에탄올에 내성을 보이는 균주를 발명함으로써 보다 효율적인 에탄올 생산에 유용하게 사용될 것이며 또한 바이오에탄올 생산공정시 발생하는 여러 스트레스에 저항성을 가진 고효율의 에탄올 생성능의 슈퍼균주로서 실용성을 가질 것이다.

Description

에탄올―저항성 효모 유전자 및 이의 용도{Ethanol―Resistant Yeast Genes and Uses Thereof}

본 발명은 에탄올―저항성 효모 유전자 및 이의 용도에 대한 것이다.

식물 또는 해초(seaweed) 바이오매스로부터의 바이오에탄올의 생산은 장기간의 유용성 및 화석 연료의 해로운 환경적 측면에서 전세계적인 관심의 대상이 되고 있다(Jeffries, T., and P. Lindbladm, 2009; Ragauskas, A. J., et al., 2006; Rubin, E. M., 2008). 하지만, 바이오에탄올의 상대적으로 높은 생산 비용이 연관 산업에서의 투자를 방해하고 있다. 이에, 바이오매스 획득, 전처리, 발효 및 산물 회수의 비용을 저감시키기 위한 많은 노력이 있어 왔다(Xu, Q., A. Singh, and M. E. Himmel, 2009). 바이오에탄올 생산 과정 동안, 에탄올-생산 미생물은 초기 기질의 높은 농도, 증가된 에탄올 농도 및 독성 부산물의 축적 같은 다양한 스트레스에 직면한다. 빠른 성장 및 효과적인 발효능 이 외에도, 상술한 스트레스들에 견딜 수 있는 능력이 에탄올 생산자를 선택하는 데 중요한 인자이다(Ding, J., et al., 2009; Gibson, B. R., et al., 2007; Yoshikawa, K., et al., 2009). 에탄올 생산율을 개선하기 위한 하나의 방법이 증가된 스트레스 저항성을 가진 스트레인들을 개발하는 것이다.

효모 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae)는 바이오매스 자원으로부터 바이오에탄올의 생산을 포함하는 여러 산업 분야에서 다양하게 이용되어 왔다. 효모 세포는 산업적 에탄올 발효 과정 동안 발생하는 고농도 에탄올 같은 여러 환경적 스트레스에 항상 노출되고, 이는 결국 세포 성장, 세포 생존율 및 에탄올 생산에 있어서의 감소를 초래한다(Casey and Ingledew, 1986). 따라서, 고농도 에탄올에 의해 야기된 스트레스를 극복할 수 있는 효모 균주의 개발이 요구되어져 왔다. 더 나아가, 마이크로어레이 및 포괄적 발현 패턴 분석 같은 지놈 전반에 걸친(genome-wide) 분석들의 이용이 에탄올 스트레스 관련된 신규한 유전자들을 동정하는 데 유용하였다(Hirasawa, et al., 2007; Teixeira, et al., 2009; Yoshikawa, et al., 2009). 이러한 접근방법을 통해, 에탄올 저항성에 관련된 많은 유전자들이 비-필수(nonessential) 유전자들로 동정되었다. 또한, 에탄올 저항성에 관련된 결과들은 각각 매치하지 않았고, 이러한 불일치는 균주 및 성장 조건에 기인한다고 보고하였다(Teixeira, et al., 2009). 따라서, 상술한 유전 정보로부터 구축된 균주는 항상 에탄올 스트레스 조건에 대한 변화를 초래하지 않는다(Yoshikawa, et al., 2009). 또한, 상업적으로 유용한 사카로미세스 세레비지에의 결실 돌연변이 라이브러리는 에탄올 저항성에 관련된 유전자들의 지놈 전반에 걸친 스크리닝에 이용되었다(Fujita, et al., 2006; Teixeira, et al., 2009; Yoshikawa, et al., 2009). 상술한 연구들은 주로 에탄올 민감성을 나타내는 돌연변이체들을 선택하여 상응하는 유전자를 고농도 에탄올 조건 하에서 성장에 필요한 유전자들로 동정하였다.

일반적으로, 많은 유전자들이 중요한 세포내 표현형(예컨대, 병적 상태부터 대사산물의 과다발현)에 영향을 미친다고 알려져 있다. 하지만, 대부분의 세포 및 대사적 변형(engineering) 접근방법들은 벡터 구축 및 형질전환 효율의 실험적 제한점들로 인해 단일 유전자들의 결실(deletion) 또는 과다발현(overexpression)을 통해 실시되었다. 이로 인해, 여러 유전자들의 변형을 통한 조사가 배제되었다.

에탄올 스트레스 저항성에 대한 기작을 조사하기 위해, 많은 연구들이 있었다. 특히, 막 유동성과 관계된 불포화 지방산은 효모에서 에탄올 저항성의 중요한 결정인자로 간주되어 보고되었다(Kajiwara, et al., 2000; You, et al, 2003). 또한, 트리할로오스(Kim, et al., 1996) 또는 프롤린(Takagi, et al., 2005)의 세포내 축적이 효모의 에탄올 저항성을 개선시키고 에르고스테롤이 사카로미세스 세레비지에의 에탄올 저항성과 관련된 중요한 인자(Inoue, et al., 2000)라는 것이 보고되었다.

에탄올 저항성 스트레인들을 개발하기 위해, 진화적 적응(Stanley, D., et al., 2010), 임의적 화학물질 돌연변이유발법(Mobini-Dehkordi, M., et al., 2008) 및 유전자 셔플링(Hou, L., 2010) 같은 고전적인 전략 이외에 3가지 다른 전략들이 최근에 이용되고 있다: 지놈 전반에 걸친 DNA 마이크로어레이 분석(Hirasawa, T., et al., 2007), 트랜스포존-매개된 결실 돌연변이 라이브러리(Takahashi, T., et al., 2001), 단일 유전자 넉-아웃(SGKO) 라이브러리(Auesukaree, C., et al., 2009; Fujita, K., et al., 2006; Kubota, S., et al., 2004; Teixeira, M. C., et al., 2009;van Voorst, F., et al., 2006; Yoshikawa, K., et al., 2009) 스크리닝 및 gTME(global transcriptional machinery engineering; Alper, H., et al., 2006). DNA 마이크로어레이 분석에서, 에탄올 스트레스에 의해 유도된 상향- 또는 하향-조절된 유전자들이 타겟 유전자들로서 처음으로 동정된 후, 에탄올 저항성을 부여하는 유전자들의 능력이 상향-조절된 유전자들의 과다발현 또는 하향-조절된 유전자들의 결실에 의해 검증된다. SGKO 라이브러리 스크리닝의 경우에는, 감소된 또는 증가된 성장을 나타내는 클론들은 에탄올을 존재 하에서 스크리닝하여 우선적으로 분리한다. 결실이 둔화된 성장을 야기하는 유전자들은 실질적으로 에탄올 민감성과 연관되어 있기 때문에, 과다발현에 의한 에탄올 저항성과의 연관성에 대해 검증해야 한다. 이와 대조적으로, 결실이 증가된 성장을 야기하는 유전자들은 에탄올 저항성 스트레인들을 제조하는 데 직접적으로 이용될 수 있다. 하지만, 상기 2가지 접근방법들의 문제는 매우 많은 수의 타겟 유전자들이 동정되어 있어야만 한다는 것이다. 예컨대, 효모 지놈에서 인코딩된 유전자들의 5-10% 정도의 유전자들이 동정된 경우에만 상기 방법들을 이용할 수 있다. 에탄올 민감성 유전자들의 동정은 에탄올 저항성의 분자 기반을 이해하는 데 도움을 줄 수 있지만, 에탄올 저항성 스트레인의 구축을 확실하게 보장하지는 않는다. 비록 에탄올 민감성 유전자들의 과다발현이 에탄올 저항성을 부여할 지 여부를 검증하는 것이 용이하고 간단할 지라도, 성공적인 예들이 거의 보고되지 않았다(Gibson, B. R., et al., 2007).

gTME는 하나 이상의 일반적인 전사인자들의 임의적 돌연변이유발법을 통해 전반적인 전사 프로파일을 재프로그래밍한다. 상기 접근방법은 이전에 치명적인 에탄올 농도에서 자랄 수 있는 것으로 보고된 SPT15 유전자에 의해 인코딩되는 TBP(TATA-binding protein)의 돌연변이를 유발함으로써 증가된 에탄올 저항성을 가지는 스트레인을 창출하는 데 처음으로 이용되었다(Alper, H., et al., 2006). 하지만, 다른 저자들은 이러한 증가된 에탄올 저항성이 산업적 적용을 위해 선택되지 않는 풍부 배지(rich medium)에서는 재생되지 않는다는 것을 보고하였다(Baerends, R. J., et al., 2009). 그럼에도 불구하고, SPT15 돌연변이는 많은 RNA 폴리머라제 II-의존성 유전자들을 조절하는 SAGA(Spt-Ada-Gcn5-아세틸트랜스퍼라제) 복합체의 서브유니트인 Spt3p와의 상호작용을 통해 전사 프로파일을 변화시킨다. 또한, SPT15 돌연변이는 다면발현 유전형질(pleiotrophic)로 동정되었으며(Eisenmann, D. M., et al., 1989), SPT15의 조절 도메인에서 몇몇 돌연변이가 전사증가를 초래하였다(Cang, Y., et al., 1999). 상술한 발견들은 SPT15의 다른 돌연변이들이 다른 세트의 유전자들의 발현을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.

본 연구에서, 에탄올 저항성을 가지는 S. 세레비지에 스트레인을 개발하기 위해 이전에 보고된 바와 같이 gTME를 실시하였다(Alper, H., et al., 2006). 본 발명자들은 서로 다른 SPT15 돌연변이체 대립형질(allele)을 포함하는 다섯 개의 에탄올 저항성 스트레인들(ETSs)을 얻었으며, 에탄올 저항성 상에 SPT15 돌연변이의 효과를 조사하였다. 지놈 전반에 걸친(genome-wide) 마이크로어레이를 실시하여 에탄올 저항성에 관련된 유전자들을 동정하고 결실 돌연변이체를 이용하여 그들의 기능을 추가적으로 조사하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 에탄올-저항성에 관여하는 신규한 유전자를 동정하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 PCR-매개된 임의적 돌연변이유발법(random mutagenesis)을 이용하여 돌연변이된 SPT15 유전자가 형질전환된 효모에서 전사체 프로파일(transcriptome profiling)을 실시하여 에탄올-저항성에 관여하는 18개의 유전자를 분리/동정하였으며, 이를 이용해 형질변형된 효모 균주들이 고농도 에탄올(예컨대, 6-12% 에탄올)에서 성장할 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 에탄올-저항성 형질변형 효모 균주를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 에탄올 생산방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 ALD3(YMR169C), USV1(YPL230W), FMP16(YDR070C), RGI1(YER067W), BTN2(YGR142W), RTC3(YHR087W), HSP30(YCR021C), CTT1(YGR088W), AIM17(YHL021C), STF2(YGR008C), GPH1(YPR160W), YFR017C, SOL4(YGR248W), PHM8(YER037W), HSP12(YFL014W), SSA4(YER103W), SPI1(YER150W) 및 OM45(YIL136W)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열이 과다발현된 에탄올-저항성 형질변형 효모 균주를 제공한다.

본 발명자들은 에탄올-저항성에 관여하는 신규한 유전자를 동정하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 PCR-매개된 임의적 돌연변이유발법(random mutagenesis)을 이용하여 돌연변이된 SPT15 유전자가 형질전환된 효모에서 전사체 프로파일(transcriptome profiling)을 실시하여 에탄올-저항성에 관여하는 18개의 유전자를 분리/동정하였으며, 이를 이용해 형질변형된 효모 균주들이 고농도 에탄올(예컨대, 6-12% 에탄올)에서 성장할 수 있다는 것을 확인하였다.

발화성, 휘발성 무색 액체인 에탄올은 가장 널리 이용되는 용매이다. 산업적으로, 에탄올은 자동차 연료 및 연료 첨가제로서 이용되며, 향수(scents), 향료(flavorings), 착색제(colorings) 및 의약품(medicines)으로도 이용된다. 또한, 에탄올은 알코올 음료 내 주요 정신활성 구성성분으로 중추신경계에 진정 효능을 가진다. 에탄올은 에틸렌의 수화를 통해 석유화학적으로 생산될 수 있으며, 효모를 이용하여 당을 발효시킴으로써 생물학적으로 생산될 수 있는데, 이러한 생물학적 생산은 석유 및 곡물 사료제의 가격에 의존적인 석유화학적 과정에 의한 생산보다 훨씬 경제적이다. 따라서, 생물학적 에탄올의 생산 과정을 위한 효모 균주의 개발은 매우 중요하다.

본 발명에 따르면, 본 발명은 에탄올-저항성 형질변형 효모 균주를 이용한 전사체 프로파일을 통해 에탄올-저항성에 관여하는 신규한 유전자를 분리/동정하고 이를 이용하여 형질전환된 효모 균주들이 에탄올 저항성을 가진다는 것을 확인하였다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 야생형 SPT15 유전자의 아미노산 서열이 돌연변이된 효모 균주를 이용하며, 보다 바람직하게는 야생형 SPT15 유전자의 L76 및 L175 위치의 아미노산 서열이 돌연변이된 아미노산 서열; 또는 야생형 SPT15 유전자의 S42, C78, S163 및 I212 위치의 아미노산 서열이 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이된 SPT15 유전자로 형질전환된 효모 균주를 이용한다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 야생형 SPT15 유전자의 L76 및 L175 위치의 아미노산 서열이 L76V 및 L175S로 변이된 돌연변이 서열; 또는 야생형 SPT15 유전자의 S42, C78, S163 및 I212 위치의 아미노산 서열이 S42N, C78R, S163P 및 I212N으로 변이된 돌연변이 서열을 포함하는 돌연변이된 SPT15 유전자로 형질전환된 효모 균주를 이용한다.

본 발명에 따르면, 전사체 프로파일이 상술한 효모 균주에서 실시한다.

보다 상세하게는, 상기 에탄올-저항성에 관여하는 유전자의 동정은 (ⅰ) 본 발명의 형질전환된 효모 균주 및 형질전환되지 않은 정상 효모로부터 전사체 프로파일(transcriptome profiling)을 실시하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 전사체 프로파일을 비교/분석하는 단계를 실시함으로써, 에탄올 저항성 및/또는 민감성 효모 유전자를 대량으로 동정할 수 있다.

상기 전사체 프로파일의 비교/분석에 있어서, 상기 정상 효모보다 상기 형질전환된 효모 균주에서 혼성화 시그널이 2배 이상의 증가 배수(fold increase)로 검출되면 에탄올 저항성을 상향-조절하는 유전자로 판단되고, 상기 시그널이 2배 이상의 감소 배수(fold decrease)로 검출되면 에탄올 저항성을 하향-조절하는 유전자로 판단된다.

본 발명의 방법은 상술한 본 발명의 돌연변이된 SPT15 유전자로 형질전환된 효모 균주를 유효성분으로 포함하기 때문에, 둘 사이에 중복된 내용은 중복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 전사체 프로파일은 마이크로어레이로 실시할 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명의 프로브는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산(PNA)(M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)되어 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 시료 DNA는 아미노알릴-dUTP가 삽입되어 합성되며, NHS-에스테르 Cy 다이로 표지되어 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 상기 생시료는, 바람직하게는 효모 세포, 가장 바람직하게는 상술한 본 발명의 형질전환된 효모 세포이다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수 있다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

핵산 시료 또는 프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P³² 및 S³⁵), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 핵산 시료 또는 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 에탄올 저항성 및/또는 민감성 효모 유전자의 대규모 동정을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 상술한 본 발명의 형질전환 효모 균주 및 정상 효모로부터 유래한 핵산 시료를 마이크로어레이 기판에 고정된 프로브와 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 에탄올 저항성 및/또는 민감성 효모 유전자 여부를 판단할 수 있다. 즉, 시료에서의 혼성화 시그널이 정상 시료(정상 세포)보다 1.5배 이상의 증가 배수로 검출되면 에탄올 저항성을 상향-조절하는 유전자로 판단되고, 상기 시그널이 2배 이상의 감소 배수로 검출되면 에탄올 저항성을 하향-조절하는 유전자로 판단된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 마이크로어레이를 통해 검출된 에탄올 저항성 유전자는 ALD3(YMR169C), USV1(YPL230W), FMP16(YDR070C), RGI1(YER067W), BTN2(YGR142W), RTC3(YHR087W), HSP30(YCR021C), CTT1(YGR088W), AIM17(YHL021C), STF2(YGR008C), GPH1(YPR160W), YFR017C, SOL4(YGR248W), PHM8(YER037W), HSP12(YFL014W), SSA4(YER103W), SPI1(YER150W) 또는 OM45(YIL136W)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 마이크로어레이를 통해 검출된 에탄올 민감성 유전자는 RAX2(YLR084C), BSC1(YDL037C), PRM7(YDL039C), VTS1(YOR359W), RRN7(YJL025W), VEL1(YGL258W), YGR035C 또는 YOR387C를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 마이크로어레이를 통해 검출된 에탄올 저항성 및/또는 민감성 효모 유전자의 발현량을 추가적으로 측정함으로써 재확인할 수 있다. 발현량의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 노던 블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC press) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))을 이용하여 실시할 수 있다.

RT-PCR 프로토콜에 따라 실시하는 경우에는 우선, 본 발명의 형질전환된 효모 균주 및 형질전환되지 않은 정상 효모로부터 총 RNA를 분리한 다음, 올리고 dT 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 제1쇄 cDNA를 제조한다. 이어, 제1쇄 cDNA를 주형으로 이용하고, 에탄올 저항성 및/또는 민감성 효모 유전자-특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 그런 다음, PCR 증폭 산물을 전기영동하고, 형성된 밴드를 분석하여 상술한 마이크로어레이 데이터와 비교함으로써 에탄올 저항성 및/또는 민감성 효모 유전자의 발현량 변화를 재검증한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상술한 뉴클레오타이드 서열은 플라스미드로 효모 세포에 도입될 수 있다. 또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상술한 뉴클레오타이드 서열은 효모 세포의 지놈(genomic) DNA에 도입될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상술한 상술한 뉴클레오타이드 서열의 형질전환에 이용될 수 있는 효모 균주는 사카로마이세스 종(Saccharomyces spp.), 시조사카로마이세스 종(Schizosaccharomyces spp.), 피키아 종(Pichia spp.), 파피아 종(Paffia spp.), 클루이베로미세스 종(Kluyveromyces spp.), 칸디다 종(Candida spp.), 탈라로미세스 종(Talaromyces spp.), 브레타노미세스 종(Brettanomyces spp.), 파키솔렌 종(Pachysolen spp.), 데바리오미세스 종(Debaryomyces spp.) 또는 산업적인 배수체(polyploid) 효모 균주를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는, 상술한 돌연변이된 SPT15 유전자의 형질전환에 이용될 수 있는 효모 균주는 사카로마이세스 종이며, 보다 더 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지에이고, 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지에 L3262이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 뉴클레오타이드 서열을 효모 균주에 도입하는 단계 및/또는 효모 세포의 지놈 DNA의 상술한 뉴클레오타이드 서열을 과다발현시키는 단계를 포함하는 에탄올-저항성 효모 균주 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 뉴클레오타이드 서열이 삽입된 효모 균주를 에탄올로 대사될 수 있는 하나 이상의 기질을 포함하는 배양배지에서 배양하는 단계를 포함하는 에탄올 생산방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 상술한 뉴클레오타이드 서열로 형질전환된 효모 균주를 유효성분으로 포함하기 때문에, 둘 사이에 중복된 내용은 중복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 에탄올로 대사될 수 있는 기질은 C6 당(sugars)을 포함하고, 본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 C6 당은 글루코오스를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 상술한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터 또는 그의 전사체에 의해 감염된 세포 및 유전자 도입에 의한 형질전환된 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 상술한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터 또는 상술한 뉴클레오타이드 서열이 인코딩하는 단백질에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 재조합 벡터는 서열목록 제1서열 내지 제18서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 및 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 원핵세포는 박테리아 세포 및 고세균을 포함하며, 진핵세포는 효모세포, 포유동물세포, 식물세포, 곤충세포, 줄기세포 및 곰팡이를 포함하고, 가장 바람직하게는 효모세포이다.

바람직하게는, 본 발명의 재조합 벡터는 (ⅰ) 상술한 본 발명의 발현대상물질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 동물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터를 포함하며, 보다 바람직하게는 (ⅰ) 상술한 본 발명의 서열목록 제19서열 내지 제36서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 뉴클레오타이드 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 동물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (ⅲ) 동물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위를 포함하는 재조합 발현벡터를 포함한다.

바람직하게는, 상술한 발현대상물질은 상술한 뉴클레오타이드 서열이 인코딩하는 단백질, 보다 바람직하게는 서열목록 제19서열 내지 제36서열로 이루어진 단백질을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 “프로모터”는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 본 발명의 제조합 발현벡터에서 발현대상물질-코딩 뉴클레오타이드 서열은 상기 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 용어 “작동적으로 결합된(operatively linked)”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.

본 발명의 벡터가 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lac UV5 프로모터, lpp 프로모터, p_L ^λ 프로모터, p_R ^λ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터, T7 프로모터, 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 숙주 세포는 E. coli이며, 가장 바람직하게는E. coli DH5α이다. 또한, 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158: 1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(p_L ^λ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14: 399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다. 한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pRS316, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지(예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

또한, 본 발명의 재조합 벡터가 진핵세포, 바람직하게는 효모 세포에 적용되는 경우, 이용될 수 있는 프로모터는, 본 발명의 발현대상물질의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 효모 세포에서 유래된 프로모터, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, 효모(S. cerevisiae) GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 프로모터, 효모(S. cerevisiae) GAL1 내지 GAL10 프로모터, 효모(Pichia pastoris) AOX1 또는 AOX2 프로모터, CMV(cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 효모 GAPDH 프로모터이다.

바람직하게는, 본 발명에 이용되는 발현 컨스트럭트는 폴리 아네닐화 서열을 포함한다(예: 소성장 호르몬 터미네이터 및 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열).

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법들을 이용할 수 있으며, 예를 들어 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있으며, 진핵세포인 경우, 전기천공법(electroporation), 리포펙션(lipofection), 마이크로인젝션, 유전자총(particle bombardment), YAC에서 이용되는 효모 구형질체/세포 융합, 식물세포에서 이용되는 아그로박테리움-매개된 형질전환 등을 이용하여 실시할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 이용되는 발현대상물질-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 “프로모터-발현대상물질 인코딩 뉴클레오타이드 서열-폴리 아데닐화 서열”의 구조를 갖는다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 재조합 발현벡터를 이용하여 형질전환된 효모 세포의 제조는 당업계에 통상적으로 공지된 유전자 전이방법에 의해 실시될 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 리튬 아세테이트/DMSO 방법(Hill, J., et al., (1991), DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Res. 19, 5791. ), 리포좀-매개 전이방법(Wong, 등, 1980), 레트로바이러스-매개 전이방법(Chen, H.Y., et al., (1990), J. Reprod. Fert. 41:173-182; Kopchick, J.J. et al., (1991) Methods for the introduction of recombinant DNA into chicken embryos. In Transgenic Animals, ed. N.L. First & F.P. Haseltine, pp.275-293, Boston; Butterworth-Heinemann; Lee, M.-R. and Shuman, R. (1990) Proc. 4th World Congr. Genet. Appl. Livestock Prod. 16, 107-110) 등을 이용하여 실시한다.

한편, 본 발명의 발현대상물질 단백질을 유효성분으로써 유전자 도입에 이용하기 위해 발현대상물질 단백질이 효과적으로 세포 내로 침투할 수 있어야 한다. 예를 들어, 상술한 단백질(서열목록 제19서열 내지 제36서열)을 유효성분으로 이용하는 경우, 단백질 운반 도메인(PTD: protein transduction domain)을 상술한 단백질에 부착시키는 것이 바람직하다. 즉, 유효성분으로서 본 발명의 상술한 단백질을 세포 내로 도입(permeable peptide transduction)하기 위하여 단백질 운반 도메인(PTD: protein transduction domain)을 상기 단백질과 융합하여 융합 단백질을 만든다. 상기 단백질 운반 도메인(PTD)은 라이신/아르기닌 등 기본 아미노산 잔기들을 주로 포함하고 있어서 이와 융합된 단백질들을 세포막을 투과하여 세포내로 침투시키는 역할을 한다. 상기 단백질 운반 도메인(PTD)은 바람직하게는 HIV-1 Tat 단백질, 드로소필라 안테나페디아의 homeodomain, HSV VP22 전사조절단백질, vFGF에서 유도된 MTS 펩타이드, 페네트라틴, 트랜스포탄 또는 Pep-1 펩타이드에서 유래된 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 에탄올-저항성에 관여하는 신규한 유전자 및 이를 이용하여 형질변형된 효모 균주, 그리고 이의 용도에 관한 것이다.

(b) 본 발명의 효모 균주는 고농도 에탄올, 바람직하게는 6-12% 에탄올에서 성장할 수 있는 효모 균주이다.

(c) 고농도의 에탄올에 내성을 보이는 균주를 발명함으로써 보다 효율적인 에탄올 생산에 유용하게 사용될 것이며, 또한 바이오에탄올 생산공정 시 발생하는 여러 스트레스에 저항성을 가진 고효율의 에탄올 생성능의 슈퍼균주로서 실용성을 가질 것이다.

도 1은 5개의 ETS1-5의 증가된 에탄올 저항성을 보여주는 스팟 어세이 결과이다. 세포를 YSCD-Ura 또는 YPD 액체 배지에서 OD₆₀₀ 값 1까지 성장시킨 후 10배씩 연속적으로 희석하였다. 배양된 세포의 분취액(5 ㎕)을 적합한 농도의 에탄올을 포함하는 YSCD-Ura 또는 YPD 플레이트 배지에 스팟팅하고, 플레이트를 30℃에서 4-6일 동안 배양시켰다. 대조군 스트레인들은 부모 플라스미드(parental plasmids)를 L3262(C-L3262) 및 BY4741(C-BY4741)에 형질전화시켜 제조하였다. 도 1A는 YSCD-Ura 플레이트에서 ETS1-5의 스팟 어세이를 실시한 결과이다. 도 1B는 ETS1-5로부터 회수된 플라스미드를 L3262 및 BY4741에 다시 형질전환시켜 각각 rL-ETS1-5 및 rBY-ETS1-5을 제조하고, YSCD-Ura 플레이트에서 스팟 어세이를 실시하였다. 도 1C는 YPD 플레이트에서 실시한 ETS2 및 ETS3의 스팟 어세이 결과이다. 도 1D는 부모 플라스미드, 및 ETS2 및 ETS3로부터 회수된 플라스미드를 L3262의 지놈에 통합시킴으로써, 각각 iL3262, iETS2 및 iETS3을 제조하고, YSCD-Ura(위쪽 패널) 및 YPD 플레이트(아래쪽 패널)에서 스팟 어세이를 실시하였다.
도 2는 ETS2 및 ETS3의 에탄올 민감성을 보여주는 결과이다. 지시된 시간에 에탄올 충격을 가한 후, C-L3262, ETS2 및 ETS3를 12.5%(A) 및 15%(B) 에탄올의 존재 하에서 YSCD-Ura 플레이트에서 2일 동안 성장시켰다. 상대적인 생존율을 콜로니의 수를 카운팅한 후 % 대조군으로서 표현하였다. 심볼: C-L3262, △; ETS2, ■; 및 ETS3, ●. 실험은 세 번에 걸쳐서(triplicate) 실시하였다.
도 3은 ETS2 및 ETS3의 마이크로어레이 데이터 분석 결과이다. 마이크로어레이 분석은 에탄올 스트레스 없이 중간-로그 기(mid-log phase)까지 성장된 C-L3262(대조군), ETS2 및 ETS3로부터 제조된 폴리(A)⁺ RNAs를 이용하여 실시하였다. 2배 이상의 발현 배수 변화를 보이는 서로 다르게 발현된 유전자들이 클러스터링(A) 및 벤 도식(Venn diagram; B)로 프로파일링되었다. 도 3C는 마이크로어레이 데이터는 Hsp30, Hsp42 및 Hsp104에 대한 반-정량적 RT-PCR을 이용하여 재검증한 결과이다. 수자 1 및 2는 생물학적으로 서로 독립적으로 두 번에 걸쳐서 실시한 것을 나타낸다.
도 4는 SGKO 돌연변이체들의 에탄올 민감도를 보여주는 스팟 어세이 결과이다. ETS2 및 ETS3에서 공통적으로 상향-조절되는 30개 유전자에 상응하는 개별 클론들을 BY4741 SGKO 라이브러리로부터 얻었다. 도 1과 마찬가지로, 스팟 어세이를 실시하였다. 부모 스트레인인 BY4741은 대조군으로서 이용하였다. 세포를 액체 YPD에서 배양시켜 0%, 6%, 8%, 10% 및 12% 에탄올을 포함하는 고형 YPD에 스팟팅한 후, 30℃에서 4-6일 동안 배양시켰다.
도 5는 iETS2 및 iETS3의 에탄올 저항성 스트레인들의 발효 능력을 관찰한 결과이다. 지수적으로 성장하는 대조군(iL3262, ▲) 및 2개의 저항성 스트레인, iETS2(■) 및 iETS3(●) 세포를 수득하여 100 ml의 YPD30E6[30% 글루코오스 및 6%(v/v) 에탄올로 보충된 YP]로 옮겼다. 시작 세포 밀도는 0.3의 OD₆₀₀ 값으로 조정하였다. 세포를 120 rpm으로 흔들면서 30℃에서 배양하였다. 시료를 12시간 마다 취한 후, 세포 성장(A) 및 에탄올 농도(B)를 각각 세포 밀도 측정 및 HPLC(high-pressure liquid chromatography)를 이용하여 결정하였다. 실험은 두 번에 걸쳐서(triplicate) 실시하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

효모 균주 및 성장 조건

사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) L3262(MAT-α, ura3-52 leu2-3 ll2 his4-34; 생명공학 연구소, 대전) 및 BY4741 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0)를 발현 숙주(transformation recipients)로 이용하였다. 필수적이지 않은 반수체(nonessential haploid) 사카로마이세스 세레비지에 결실 라이브러리는 허원기 박사(Seoul National University, Seoul, Korea)로부터 친절하게도 제공되었으며, 동정된 유전자의 확인에 이용되었다. 특별한 언급이 없는 한, 효모 세포는 비-선택적 증식(propagation)을 위해서 YPD 배지(1% 박토 효모 추출물, 2% 박토 펩톤 및 2w/v% 글루코오스, 그리고 고형 플레이트를 위해서 15% 박토-아가를 추가적으로 포함; Difco, MI)에서 30℃로 배양하거나 또는 선택적 증식을 위해서 효모 합성 완전 배지(YSCD medium; 아미노산이 없는 0.67% 효모 질소 베이스, 아미노산 보충 혼합물 및 2% 덱스트로오스, 그리고 고형 플레이트를 위해서 1.5% 박토-아가를 추가적으로 포함; MP, OH)에서 30℃로 배양하였다. 플라스미드 구축을 위해, pRS316 벡터(본 연구소 소장; CEN-기반된 벡터, S. 세레비지애 GAPDH 프로모터, URA3 선택마커)를 발현 벡터로 이용하였으며, E. coli DH5α(Stratagene, CA)를 숙주로 이용하여 100 mg/l의 암피실린(Sigma-Aldrich, MO)이 보충된 루리아-베르타니 배지(LB): Difco, MI)에서 37℃ 배양시켰다.

분자생물학적 방법

플라스미드 제조, 클로닝 및 시퀀싱은 이전에 기재된 바와 같이 실시하였다(Sambrook, 2001). E.coli DH5α(Stratagene, USA)를 플라스미드 제조를 위한 숙주로 사용하였다.

RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction) 및 PCR

RT를 위해, 총 RNA를 지수적으로 성장하는 세포로부터 추출하였다. 일차 가닥 cDNAs를 제조자가 추천하는 바와 같이 임의적 헥사머 및 200 U의 M-MLV 역전사 효소(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 2 ㎍의 총 RNA를 전사하여 합성하였다. PCR에 이용된 올리고뉴클레오타이드는 표 1에 기재되어 있다. 증폭 조건은 다음과 같다: 95℃, 1분; 55-60℃, 1분; 및 72℃, 증폭될 DNA 길이에 따라 적합한 연장 시간. RT-PCR 및 일반 PCR은 각각 20사이클 및 30사이클을 수행하였다. 필요하다면, PCR 산물을 젤 추출에 의해 정제하여 pGEM-T easy vector(Promega)에 클로닝하고 시퀀싱((주)Bionics, Seoul)하였다.

STP15 돌연변이 라이브러리 구축

야생형 SPT15(SPT15wt)의 전체 ORF(open reading frame)를 지놈 DNA를 템플레이트로 이용하여 센스 프라이머(5’-gtagggatcctgagatggccgatgaggaacgtt-3’, 밑줄 친 서열은 BamHI 위치) 및 안티센스 프라이머(5’-gtaggaattctcacatttttctaaattcacttag-3’, 밑줄 친 서열은 EcoRI 위치)로 PCR-증폭시켜 pGEM-T easy 벡터에 클로닝하여 pT-SPT15를 제조하였다. SPT15 돌연변이 라이브러리는 pT-SPT15를 템플레이트로 GeneMorph II 임의 돌연변이유발 키트(Stratagene, La Jolla, CA, USA) 및 상술한 프라이머를 이용하여 제조하였다. PCR 산물을 BamHI 및 EcoRI로 절단하여 pRS316-유래된 플라스미드인 pRS316-GCYH2gR에 클로닝하혔으며, 클론된 유전자들은 글라이세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제 프로모터(TDH3 _P) 및 갈락토오스-1-포스페이트 종결자(GAL7_T)의 조절 하에 위치한다. 결과적인 플라스미드들을 E.coli DH5α에 형질전화시켜 30℃에서 배양함으로써, 4×10⁶의 총 콜로니 수를 가지는 SPT15 돌연변이체에 대한 일차 라이브러리를 제조하였다. 임의적으로 선택된 20개의 콜로니들의 시퀀싱 결과, 분자-기반돤 돌연변이 생성률이 70%로 측정되었다. 돌연변이는 14개의 콜로니에서 거의 하나 이상, 대부분 3-5 위치에서 발견되었으며, 나머지는 야생형과 동일하였다. 증폭 및 대규모 제조를 거쳐, 라이브러리 플라스미드(500 ㎍)가 S. 세레비지에 L3262로 형질전환되어 고형 YSCD-Ura에서 25℃로 배양시켰다. 전체적인 효모 콜로니의 수는 약 5×10⁶개로, 1 ㎍의 DNA 당 약 4×10⁶의 콜로니 형성 단위(CFU)의 형질전환 효율을 나타냈다. 모든 콜로니들을 15 ml YSCD-Ura로 도포된 플레이트 표면을 긁어서 수득하여 SPT15 돌연변이체에 대한 효모 라이브러리를 제조하였다. 25℃에서 세포수를 4배 증식시킨 후, 사용할 때까지 세포 현탁액의 분취액(aliquots)을 20% 글라이세롤의 존재 하에서 -80℃에 저장하였다.

효모 형질전환

효모 형질전환을 위한 모든 플라스미드들을 RNA 절단 없이 수작업으로 제조하였다. DNA 농도는 알려진 농도의 대조군 DNA의 밴드 강도와 비교하여 측정하였다. DNAs 및 RNAs의 혼합물을 이전에 기술된 바와 같이 효모 형질전환에 사용하였다(Hirasawa, T., et al., 2007).

스팟 어세이

OD₆₀₀ 값 1로 배양된 세포의 분취액(5 ㎕)을 10배씩 연속적으로 희석하여 적합한 농도의 에탄올을 포함하는 고형 합성 배지 또는 풍부 배지에 스팟팅하였다. 플레이트를 30℃에서 4-6일 동안 배양시켰다.

에탄올 민감성 어세이

OD₆₀₀ 값 1로 배양된 세포를 수득하여 12.5%(v/v) 및 15%(v/v) 에탄올을 포함하는 신선한 YSCD-Ura 배지에 동일하게 분주하고 30℃에서 4-6시간 동안 배양시켰다. 적절한 시간에 분취액을 희석하여 고형 YPD 플레이트에 플레이팅하였다. 세포 생존율을 시간에 따라 측정하고 상대적인 CFU 수로 표현하였다.

지놈 통합(Genomic integration)

돌연변이된 SPT15 유전자를 통합용 벡터 pRS406에 클로닝하여 URA3 내의 유일한 ApaI 위치를 이용하여 선형화시킨 후 S. 세레비지에 L3262로 형질전환시켰다. 또한, 클론을 포함하지 않는 플라스미드(inset-free plasmid)를 유사하게 처리하여 대조군 스트레인인 iL3262를 제조하였다. 지놈 통합은 PCR에 의해 확인하였다.

전사체 프로파일(Transcriptome profiling) 및 데이터 분석

전사체 프로파일을 위해, S. 세레비지에 30K 올리고 마이크로어레이(MYcroarray, Ann Arbor, MI, USA)를 이용하였다. 이전에 기술된 바와 같이, 총 RNA를 지수적으로 성장하는 세포로부터 추출하였으며, 마이크로어레이 분석을 위한 RNA QC(quality control)를 실시하였다(Park, J. N., et al., 2007). 아미노알릴-dUTP가 삽입된 cDNAs이 아미노알릴 포스트 DNA 표지 키트(GeneChem, Daejeon, Korea) 및 Superscript 역전사 효소(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 40-50 ㎍의 총 RNA로부터 합성되었다. 합성된 cDNA는 NHS-에스테르 Cy 다이로 표지되어 혼성화에 이용되었다. 혼성화된 슬라이드는 SSC 완충액으로 세척한 후, ScanArray 5000 스캐너(Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, USA)로 스캐닝되었다. 일차(raw) 마이크로어레이 데이터는 표준화를 위한 플랫폼-비의존성 Java 수단인 ArrayNorm(http://genome.tugraz.at/) 및 통계 분석을 이용하여 분석하였다(Pieler, R., et al., 2004). 평균적으로 두 배 이상으로 높게 변화하는 유전자들에 대한 클러스터링은 Cluster 3.0(http://rana.lbl.gov/EisenSoftware.htm)을 이용하여 실시하였다. 서로 다르게 발현된 유전자들 간의 기능적 카테고리의 인리치먼트는 MIPS Functional Catalogue(http://mips.gsf.de)를 이용하여 분석하였다. 특정 유전자 기능은 사카로미세스 지놈 데이터베이스(http://www.yeastgenome.org)에 기반하였고 전사인자 결합 위치는 YEATRACT(http://www.yeastact.com/index.php)로 분석하였다. DNA 마이크로어레이 데이터를 유효화시키기 위해, 반-정량적 역전사 PCR를 마이크로어레이 실험에 이용된 RNA 시료로 이전에 기술된 바와 같이 실시하였다(Oh K. S., et al., 2004).

발효

지수적으로 성장하는 세포를 수득하여 100 ml의 YPD30E6[30% 글루코오스 및 6%(v/v) 에탄올로 보충된 YP]로 옮겼다. 시작 세포 밀도는 0.3의 OD₆₀₀ 값으로 조정하였다. 세포를 120 rpm으로 흔들면서 30℃에서 배양하였다. 시료를 12시간 마다 취한 후, 세포 성장 및 에탄올 농도를 각각 세포 밀도 측정 및 HPLC(high-pressure liquid chromatography)를 이용하여 결정하였다. 시료를 60℃로 세팅된 Aminex HPX-87H 컬럼(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 로딩하였다. 글루코오스 및 에탄올을 0.5 mM H₂SO₄를 이용하여 0.6 ml/분의 유동속도로 용출시켰다. 피크들은 굴절율(refractory index)에 의해 검출되고 지연시간(retention time)에 따라 동정되어 표준 곡선에 따라 정량화되었다. 세포 성장은 600 nm에서 광학밀도를 측정함으로써 모니터링하였다.

실험결과

에탄올-저항성 스트레인들의 동정

고속 스크리닝을 통해 에탄올-저항성을 부여하는 유전자들을 동정하기 위해, 저농도의 에탄올 저항성 백그라운드를 가지는 스트레인을 이용하는 것이 일반적으로 유용하다. 테스트된 여러 S. 세레비지에 실험실 스트레인들은 대부분의 에탄올 민감하였기 때문에(결과를 보이지 않음), L3262를 선택하여 효모 SPT15 돌연변이체 라이브러리를 구축하는 데 이용하였다. 에탄올 저항성 스트레인의 스크리닝을 위해, 5×10⁶ CFU의 효모 라이브러리 스탁의 분취액을 12.5% 또는 15% 에탄올이 첨가된 고형 YSCD-Ura 배지에 플레이팅하였다. 에탄올 증발을 억제하기 위해 플레이트를 밀봉한 후 30℃에서 배양시켰다. 10일 후, 12.5% 또는 15% 에탄올의 존재 하에서 각각 9개 및 6개의 콜로니가 나타났다. 15개 콜로니의 에탄올 저항성을 15% 에탄올까지 포함하는 고형 YSCD-Ura 배지에서 스팟 어세이로 조사하였다. 그 결과, 5개의 에탄올 저항성 스트레인들(ETS; ETS1-5)를 얻었다. 모든 5개의 스트레인들은 합성 배지 하의 15% 에탄올에 저항성을 가진 반면에, 대조군은 10%를 초과하는 에탄올 농도에 저항성을 가지지 않았다(도 1A).

증가된 에탄올 저항성이 돌연변이된 SPT15에 의해 부여되는 지 여부를 확인하기 위해, 플라스미드들을 ETS15(SPT15의 돌연변이된 대립형질들에 대해 각각 pSPT15-M1, -M2, -M3, -M4 및 -M5)로 회복시켰다. 상술한 플라스미드들이 개별적으로 L3262 및 By4741로 재도입되어 각각 rL-ETS1-5 및 rBY-ETS1-5가 제조되었다. 대조군 스트레인을 구축하기 위해, SPT15wt를 포함하는 pRS316-GCYH2gR가 L3262 및 By4741로 재도입되어 각각 C-L3262 및 C-By4741가 제조되었다. 합성 배지 상에서 실시된 스팟 어세이의 경우, rL-ETS1-5는 ETS1-5와 동일한 정로도 에탄올 저항성을 나타냈다(도 1B, 위쪽 패널). 반면에, rBY-ETS1-5는 17.5% 에탄올과 같은 높은 에탄올에서 저항성을 나타냈다(도 1B, 아래쪽 패널). 이는 BY4741이 기본적으로 L3262보다 더 높은 에탄올 저항성을 보였던 스트레인이기 때문에 놀라운 현상이 아니다(결과를 보이지 않음). 따라서, ETS1-5의 증가된 에탄올 저항성은 돌연변이된 SPT15의 효과로 간주할 수 있었다.

다음으로, 돌연변이를 확인하기 위해 각 플라스미드들을 시퀀싱하였다. 표 1은 각 SPT15 대립형질에서 돌연변이된 아미노산을 기재하고 있다: SPT15-M1의 경우, K201Q, G216S 및 Q225Stop; SPT15-M2의 경우, L76V 및 L175S; SPT15-M3의 경우, S42N, C78R, S163P 및 I212N; SPT15-M4의 경우, F10S 및 M197K; SPT15-M5의 경우, K15T, W26C 및 G192D.

SPT15 대립형질에서 발생된 점 돌연변이들.

스트레인	SPT15 대립형질	아미노산 대체	위치된 점 돌연변이의 구조 도메인 a
ETS1 ETS2 ETS3 ETS4 ETS5	SPT15-M1b SPT15-M2 SPT15-M3 SPT15-M4 SPT15-M5	K201Q, G216S, Q225Stop L76V, L175S S42N, C78R, S163P, I212N F10S, M197K K15T, W26C, G192D	S3'-S4' 루프, S5', H2' S1-H1 루프, H1' N-말단, S1-H1 루프, S1', S5' N-말단, S3'-S4' 루프 N-말단, N-말단, S3'

^a Chasman et al. (1993)에 기재된 바와 같은 구조 도메인 명칭: H, α-헬릭스; S, β-쉬트.

^b N225Sto으로 인한 C-말단에서 16개의 아미노산이 결실됨.

특히, SPT15-M1에서의 침묵 돌연변이(silent mutation)는 C-말단에 16개의 잔기가 결실된 절단 형태(truncated version)를 생산하였다. 표 1에서 볼 수 있듯이, SPT15 ORF 전반에 걸쳐서 퍼져있는 점 돌연변이들은 증가된 에탄올 저항성과 관련된 구조 도메인에 위치하지 않았다. SPT15-M2만이 유전자 전사 조절에 있어서 더욱 초기에 포함된 Spt3p와 상호작용하는 도메인에 돌연변이(L175S)를 포함하였다. 상술한 데이터는 Spt15p의 여러 소구역(subregions)에서의 돌연변이가 에탄올 저항성을 부여한다는 제안과 일치하는데, 이는 Spt3p 이 외에도 전사 기전의 다른 구성성분들과의 상호작용을 통해 이루어질 것으로 추측된다.

도 1B의 데이터에 따르면, ETS1은 ETS4 및 ETS5보다 덜 저항성을 나타냈으며, ETS2 및 ETS3는 ETS4 및 ETS5보다 약간 더(또는 적어도 동일한) 저항성을 나타냈다. 따라서, ETS2 및 ETS3를 향후 실험을 위해 선택하였다. 특정 유전자의 발현을 위해 이용되는 S. 세레비지에 실험실 스트레인들은 항상 아미노산 생합성에 관계된 효소들을 인코딩하는 많은 유전자들에서 서로 독립적인 돌연변이들을 가지기 때문에 제한된 배지에서 배양되는 경우 성장을 위한 특정 아미노산을 보충할 필요가 있다. 돌연변이된 SPT15가 아닌 저농도 루이신 보충으로 인해 증가된 에탄올 저항성이 나타날 수 있다는 것이 논쟁의 대상이었다(Baerends, R. J., et al., 2009). 보다 자세하게는, 세포가 산업적 적용에 적합하지 않은 YPD 복합물 풍부 배지에서 배양된 경우 에탄올 저항성이 파괴되었다. 또한, ETS2 및 ETS3의 성장을 위해 루이신 및 히스티딘 보충이 필요하기 때문에, 이들 스트레인들의 증가된 에탄올 저항성이 SPT15 돌연변이에 의한 것이 아닐 수 있다. 따라서, ETS2 및 ETS3의 에탄올 저항성이 YPD 상의 스팟 어세이로 테스트되었다. 도 1C에서 볼 수 있듯이, 도 1A의 데이터에 반하여 ETS2는 15% 에탄올에 민감한 반면에, ETS3는 합성 배지에서 보여진 결과와 유사한 에탄올 저항성을 나타냈다. 하지만, 합성 배지에서 15% 에탄올에 매우 민감하였던 C-L3262 스트렌인은 YPD 상에서 약간의 에탄올 저항성을 가지는 것처럼 보였는데, 이는 풍부 배지에서 에탄올 저항성의 기본 레벨이 합성 배지보다 더 높다는 것을 의미한다. 종합적인 데이터는 ETS3가 ETS2보다 YPD 상에서 에탄올에 대한 저항성이 더 크다는 결론과 일치하였다.

발현 상의 세포-세포 이질성(heterogeneity)는 실험실 스트레인들에서 에피좀 과다발현으로부터 얻어진 정보가 산업적 적용으로까지 확대된 경우에 직면할 수 있는 문제들 중 하나이다. 이질성은 산업적 적용에서 효모 배양을 위해 임의대로 선택할 수 없는 선택 압력(selective pressures)의 지속적인 존재에도 불구하고 카피 수를 조절할 수 없음으로 인해 야기된다. 따라서, 선택 압력의 부재(즉, 염색체로의 통합) 하에서 유전자의 안정적인 발현 및 유지가 매우 바람직하다. 본 발명에서, 본 발명자들은 SPT15-M2 및 -M3가 L3262의 지놈에 통합된 스트레인들을 구축하였다: 상응하는 컨스트럭트를 각각 iETS2 및 iETS3로 명명하였다. 대조군 스트레인인 iL3262는 SPT15wt를 포함하는 플라스미드로 제조하였다. 도 1D는 YSCD(위쪽 패널) 및 YPD(아래쪽 패널)에서 상기 3개의 스트레인들의 스팟 어세이 결과를 보여준다. YSCD에서 iETS2 및 iETS3의 에탄올 저항성 정도는 YPD에서와 모두 유사하였다(도 1C). 즉, YPD에서 iETS2 및 iETS3가 YSCD에서보다 더 높은 에탄올 저항성을 가졌는데, 둘 간의 차이는 15% 에탄올 농도에서 조차도 관찰되지 않았다.

스팟 어세이 결과들을 다시 확인하기 위해, 12.5% 및 15%에 대한 민감성을 조사하였다. 두 스트레인들의 생존율이 12.5% 및 15% 에탄올 모두에서 대조군에 비해 현저하게 증가하였다(도 2). 12.5% 에탄올에서 50% 생존율(T₅₀)을 나타내는 시간은 ETS2 및 ETS3의 경우 4.5시간이었으며, 대조군에서는 3.5시간이었다. 15% 에탄올에서는 T₅₀은 ETS2 및 ETS3의 경우 100분, 그리고 대조군에서는 40분으로 더욱 큰 차이가 관찰되었다. 스팟 어세이 데이터와 함께 상술한 데이터는 ETS2 및 ETS3가 SPT15 돌연변이에 의해 증가된 에탄올 저항성을 가진다는 것을 확증하였다.

증가된 에탄올 저항성을 가진 5개의 스트레인들은 SPT15 돌연변이체 라이브러리 스크리닝을 통해 얻어졌다. 플라스미드들이 이들 스트레이들로부터 회복되어 라이브러리 구축(L3262) 및 다른 스트레인(BY4741)에 이용된 스트레인에 다시 형질전환되었다. 또한, 새롭게 구축된 모든 스트레인들도 제한된 배지에서 증가된 에탄올 저항성을 나타냈다. ETS2 및 ETS3의 증가된 에탄올 저항성은 복합 풍부 배지에서도 유지되었기 때문에, 이전에 논쟁(Baerends, R. J., et al., 2009)과 같은 증가된 에탄올 저항성이 특정 SPT15 돌연변이체 대립형질에 의한 루이신 섭취 및/또는 이용의 활성화에 의해 부여된다는 가능성을 배제하였다. ETS2 및 ETS3의 증가된 에탄올 저항성은 에탄올 민감성에 따른 에탄올 충격에 의해 확인되었다. 증가된 에탄올 저항성은 2개의 통합된 스트레인들에서 추가적으로 관찰되었는데, ETS2 및 ETS3로부터 유래된 이들 SPT15 돌연변이체 대립형질들은 L3262 지놈 상에 통합되었다.

에탄올-저항성 돌연변이체 스트레인들의 전사체 프로파일 분석

본 발명자들은 ETS2 및 ETS3의 증가된 에탄올 저항성을 책임지는 유전자들의 발현 레벨이 SPT15 돌연변이에 의해 조절되는가 여부에 관심을 가졌다. 이를 위해, YSCD-Ura에서 초기-로그 기(early-log phase)로 성장된 대조군 C-L3262, ETS2 및 ETS3 세포들로부터 추출된 총 RNAs를 이용하여 전사체 프로파일에 대한 DNA 마이크로어레이를 실시하였다. 두 번에 걸쳐서 마이크로어레이 실험을 실시한 후, 발현 배수의 변화를 평균화하였다. 일차 데이터가 접근번호 GSE23965로 GEO(Gene Expression Omnibus)에 등록되었다. 대조군과 비교하여 발현 배수 변화(fold change)가 두 배보다 크게 변화한 유전자들의 클러스터링은 ETS2와 ETS3 간의 서로 다른 발현 패턴으로 나타났는데, 이는 전반적인 전사 상에 SPT15의 다른 돌연변이들의 효과를 반영한다(도 3A). ETS2의 경우, 49개 및 11개의 유전자들이 각각 상향- 및 하향-조절되는 반면에, ETS3에서는 79개 및 21개의 유전자들이 각각 상향- 및 하향-조절되었다(도 3B). ETS2와 ETS3는 34개의 상향-조절된 유전자들 및 8개의 하향-조절된 유전자들을 공유하였다(도 3B). 마이크로어레이 데이터를 검증하기 위해, 컷오프(cutoff) 값 이상의 HSP30 및 HSP42, 그리고 컷오프 값 이하의 HSP104의 실제 발현 레벨을 RT-PCR로 조사하였다. 마이크로어레이 데이터에 따르면, HSP30, HSP42 및 HSP104가 ETS2에서는 각각 5.7배, 4.5배 및 1.7배 상향-조절되었으며, ETS3에서는 각각 6.3배, 4.1배 및 1.8배 상향-조절되었다. 상술한 유전자들의 증가 배수는 RT-PCR 데이터와 일치하였다(도 3C).

다음으로, 공통적으로 상향- 및 하향-조절된 유전자들을 지시된 기능에 기반하여 분류하였다. 상향-조절된 유전자들의 기능은 스트레스 반응 및 단백질 폴딩(11개의 유전자들); 펜토오스-포스페이트 경로, 세포벽 및 운반(각각 2개의 유전자들); 에너지 저장의 대사과정 및 에너지 발생(1개의 유전자); 및 분류되지 않는 단백질들(15개의 유전자들)을 포함하였다(표 2).

에탄올 스트레스의 부재 하에서 에탄올 저항성 스트레인인 ETS2 및 ETS3에서 공통적으로 상향-조절된 유전자들의 리스트.

유전자	증가 배수(Log2)				Msn4p/ Msn2p	Yap1p	Hsf1p	Hac1p
	ETS2		ETS3
	Exp1	Exp2	Exp1	Exp2
스트레스 반응 및 단백질 폴딩
APJ1 ALD3 CTT1 HSP12 HSP30 HSP31 HSP42 SDP1 SSA4 TSL1 YJL144W	1.4 2.5 1.7 1.1 2.7 1.5 2.3 2.0 1.0 1.2 3.7	1.1 1.8 1.7 1.5 2.3 1.6 1.9 1.3 1.7 1.2 2.3	1.3 1.6 1.4 1.0 3.0 4.5 1.8 1.8 1.4 1.1 3.4	1.3 2.1 1.9 1.5 2.3 1.5 2.3 1.6 2.0 1.9 2.7	3 2 4 7 0 1 3 3 3 7 1	0 1 2 0 2 1 0 0 1 0 1	1 0 4 1 0 2 2 2 1 1 2	2 1 1 4 0 0 1 0 1 2 2
펜토오스-포스페이트 경로
PGM2 SOL4	1.7 1.9	1.2 1.5	1.7 1.6	2.1 1.9	7 1	1 0	0 6	1 0
세포벽
SPI1 OSW2	2.0 1.2	1.3 1.0	1.8 1.9	1.6 1.40	3 0	1 1	2 2	1 1
운반
PIC2 BTN2	1.5 2.9	1.1 3.1	1.4 2.9	1.1 3.5	1 2	0 0	2 1	0 0
에너지 저장의 대사과정
GPH1	1.6	1.3	1.2	2.1	3	1	0	1
에너지 발생
STF2	1.7	1.2	1.8	1.4	2	1	1	2
분류되지 않는 단백질들
AIM17 FMP16 OM45 PHM8 RTC3 RTN2 USV1 RGI1 YBL029C-A YBR285W YER053C-A YFR017C YJR096W YNR034W-A YPR145C-A	2.4 1.2 1.4 1.5 2.4 3.4 2.4 3.3 1.3 1.7 1.3 3.1 1.4 3.4 1.3	1.0 1.3 1.0 1.6 2.1 1.7 1.0 1.1 1.0 1.2 1.1 1.1 1.3 2.5 1.0	1.8 1.0 1.0 1.6 2.1 1.6 1.8 3.1 1.3 1.6 1.3 2.6 1.7 3.3 1.6	1.9 1.6 1.5 1.0 1.6 2.4 1.7 2.2 1.1 1.3 1.0 1.6 1.6 3.1 1.0	3 1 3 4 4 1 6 4 4 2 2 2 1 5 0	0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0	2 0 4 2 0 2 0 4 0 2 0 0 2 0 0	2 0 3 0 0 0 4 3 0 1 0 1 1 0 0

2배 이상의 증가 배수를 나타내는 유전자들이 기재되어 있다. 결실로 인해 세포에 에탄올 민감성을 부여하는 유전자들이 굵은 글씨체로 표시되어 있다(참고: 도 4A).

ETS2 및 ETS3에서 에탄올 저항성에 관여하는 유전자 리스트.

유전자 이름	잠재적인 기능
ALD3 USV1 FMP16 RGI1 BTN2 RTC3 HSP30 CTT1 AIM17 STF2 GPH1 YFR017C SOL4 PHM8 HSP12 SSA4 SPI1 OM45	알데하이드 디하이드로게나제 전사 스트레스 조건에 대한 반응 철 결핍 단백질 운반; pH 항상성 RNA 대사 및 온도 저항성에 포함됨 열충격 단백질 산화 스트레스 반응 기능이 알려지지 않음 마이토콘드리아 ATP 합성효소(synthase)의 조절; Lnh의 억제인자들의 안정화 폴리사카라이드 대사 DNA-손상 제제인 MMS에 의해 유도됨 PPP 경로(6-P글루코노락토나제) 기능이 알려지지 않음 열충격 단백질 단백질 폴딩 및 안정화 세포벽 발생 또는 구성요소(?) 마이토콘드라이 OMP45

스트레스 반응 및 단백질 폴딩 유전자들은 많은 서브-세포내 위치(예컨대, 핵, 마이토콘드리아, 세포질, 세포골격, 막 및 세포벽)에서 기능하는 여러 열충격 유전자들(HSP42, HSP31, HSP30, HSP12)을 포함하였으며, 산화적 스트레스 반응 유전자(CTT1) 및 소포체 및 마이토콘드리아 이동(translocation) 유전자(SSA4)도 포함하였다. 에탄올에 의해 유도되는 것으로 보고된 여러 유전자들도 포함되었다: 해당과정에 관여하는 PGM2, 당신생(glyconeogenesis)에 관여하는 GPH1, 트리할로오스 생합성에 관여하는 TSL1 및 에너지 저장의 대사과정에 관여하는 STF2(Ma, M., and Z. L. Liu., 2010). 공통적으로 하향-조절된 유전자들의 기능은 버딩 세포 극성 및 필라멘트 형성(1개의 유전자); 탄소 화합물(C-compound) 및 카보하이드레이트 대사과정(1개의 유전자); 메이팅(수정; 1개의 유전자); 단백질 타겟팅 분류(protein targeting sorting) 및 이동(1개의 유전자); rRNA 합성(1개의 유전자); 및 분류되지 않는 단백질들(3개의 유전자들)을 포함하였다(표 4).

에탄올 스트레스의 부재 하에서 에탄올 저항성 스트레인인 ETS2 및 ETS3에서 공통적으로 하향-조절된 유전자들의 리스트.

유전자	증가 배수(Log2)				Msn4p/ Msn2p	Yap1p	Hsf1p	Hac1p
	ETS2		ETS3
	Exp1	Exp2	Exp1	Exp2
버딩 세포 극성 및 필라멘트 형성
RAX2	-1.3	-1.0	-1.0	-1.5	0	1	2	0
탄소 화합물(C-compound) 및 카보하이드레이트 대사과정
BSC1	-2.1	-2.1	-1.5	-2.2	3	1	1	0
메이팅(수정)
PRM7	-1.0	-1.0	-1.3	-1.2	0	0	0	2
단백질 타겟팅 분류 및 이동
VTS1	-1.5	-1.1	-1.1	-1.1	2	0	2	0
rRNA 합성
RRN7	-1.7	-1.3	-4.0	-1.2	2	0	2	0
분류되지 않는 단백질들
VEL1 YGR035C YOR387C	-2.6 -1.8 -2.7	-1.0 -1.1 -1.0	-1.2 -1.1 -1.1	-5.1 -1.7 -4.5	0 0 0	0 0 0	2 2 2	0 1 1

2배 이상의 감소 배수를 나타내는 유전자들이 기재되어 있다. 결실로 인해 세포에 에탄올 저항성을 부여하는 유전자들이 굵은 글씨체로 표시되어 있다(참고: 도 4B).

공통적으로 상향- 및 하향-조절된 유전자들의 전사 조절에 대한 추가적인 정보를 얻기 위해, 본 발명자들은 다양한 스트레스 반응에 포함될 것으로 예측되는 전사인자들에 대한 잠재적인 결합위치의 존재를 조사하였다. 예를 들어, 상기 전사인자는 일반적인 스트레스에 관여하는 Msn2p/Msn4p(Watanabe, M., et al., 2007), 단백질 분비 스트레스에 관여하는 Hac1p(Ogawa, N., and K. Mori., 2004), 열 스트레스에 관여하는 Hsf1p(Yamamoto, N., et al., 2008) 및 산화적 스트레스에 관여하는 Yap1p(He, X. J., and J. S. Fassler, 2005) 등을 포함한다. 매우 흥미롭게도, 상술한 전사인자들에 대한 결합 위치들은 공통적으로 상향-조절된 유전자들의 업스트림 부위에 매우 풍부하게 존재하였다(표 2). 특히, Msn2p/Msn4p에 대한 결합 위치들이 거의 모든 상향-조절된 유전자들에서 공통적으로 발견되었다. 한편, Hac1p 및 Hsf1p는 상향-조절된 유전자들와 하향-조절된 유전자들에서 유사한 빈도인 반면에, Msn2p/Msn4p 및 Yap1p에 대한 결합 위치들은 8개의 하향-조절된 유전자들에서 공통적으로 거의 발견되지 않았다(표 3). 종합적인 데이터는 Msn2p/Msn4p 및 Yap1p이 에탄올 저항성과 연관된 유전자들의 조절을 책임진다는 것을 제시한다. 상술한 전사인자들이 돌연변이된 Spt15p에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 조절되는 지, 또는 돌연변이된 Spt15p와 협력하여 기능하는 지 여부를 조사하기 위한 추가적인 연구가 필요하다. 상술한 과정을 통해, 증가된 에탄올 저항성을 부여하는 일련의 유전자들의 상향- 및 하향-조절이 야기될 것이다.

에탄올-저항성에 대한 공통적으로 조절된 유전자들의 효과

상기 공통적인 34개의 상향-조절된 유전자들 및 8개의 하향-조절된 유전자들이 에탄올 저항성에 대한 원인 또는 효과를 가지는 지 여부가 주된 관심사였다. 한 유전자의 상향-조절이 에탄올 저항성을 증가시킨다면, 유전자의 결실은 세포에 에탄올에 대한 민감성 또는 저항성을 부여할 가능성이 클 것이다. 역으로, 하향-조절된 유전자에 대해서도 마찬가지일 것이다. 30개의 상향-조절된 유전자들 및 6개의 하향-조절된 유전자들에 상응하는 결실 돌연변이체들을 BY4741 SGKO 라이브러리로부터 얻었다. 4개의 상향-조절된 유전자들(YER053C-A, YNR034W-A, YPR145C-A 및 YBL029C-A) 및 2개의 하향-조절된 유전자들(RRN7 및 YOR387C)에 상응하는 결실 돌연변이체들은 유용하지 않았는데, 이는 그들의 치명성(lethality) 때문이다. OD₆₀₀ 값이 0.5까지 배양된 대조군으로서 BY4741 및 개개의 결실 돌연변이체들을 10배씩 연속적으로 희석하여 여러 다른 농도의 에탄올을 포함하는 고형 YPD 배지에 스팟팅하였다.

공통적으로 상향-조절된 유전자들에 상응하는 30개의 결실 돌연변이체들에 대한 결과가 도 4A에 보여진다. 몇 개의 결실 돌연변이들은 6% 에탄올 같이 저농도 에탄올에 대해 민감하였는데, 이는 BY4741에 독성 효과를 나타내는 농도보다 더 낮은 농도였다. 전체 민감성 돌연변이체들의 수가 12%까지 증가된 에탄올 농도에 비례하여 증가하였다. 6% 에탄올에 대한 민감도는 GPH1, SOL4 및 SSA4의 결실 돌연변이체들에서 나타났다. 추가적인 7개의 돌연변이체들(ALD3, BTN2, SPI1, OM45, RTC3, USV1 및 YFR017C)은 8% 에탄올에 민감하였다. HSP12 결실 돌연변이체는 10% 에탄올에 민감하였다. 마지막으로, HSP30, CTT1, SDP1, STF2, AIM17, FMP16, RGI1 및 PHM8에서의 결실 돌연변이들은 12% 에탄올에 민감하였다. 따라서, ETS2 및 ETS3에서 공통적으로 상향-조절된 30개의 유전자들 중 19개의 유전자들의 결실은 에탄올 민감도를 부여하였다. 에탄올 민감도에 대한 기여 정도는 GPH1, SOL4 또는 SSA4에서 가장 컸으며, 그 다음으로 ALD3, BTN2, SPI1, OM45, RTC3, USV1 또는 YFR017C의 순서였고, HSP12가 그 다음을 이었으며, HSP30, CTT1, SDP1, STF2, AIM17, FMP16, RGI1 및 PHM8에서 가장 낮았다.

한편, 상술한 가설에 기초한 본 발명자들의 예상과는 달리, 공통적으로 하향-조절된 유전자들에 상응하는 6개의 결실 돌연변이체들 중 어떠한 것도 증가된 성장을 나타내지 않았으며, 하향-조절된 유전자들에 상응하는 결실 돌연변이체들은 대조군처럼 동일한 또는 더 높은 정도의 에탄올 저항성을 나타냈다. 이것에 대한 이유는 불확실한 상태이다.

에탄올 생산에서 돌연변이된 SPT15s의 효과

에탄올 저항성에 관한 기작을 이해하는 것 이외에도, 에탄올 저항성 스트레인의 제조 목적은 에탄올 생산성 및/또는 최종 수율을 개선하는 것이다. 대조군 스트레인과 비교하여, 증가된 에탄올 저항성을 가진 스트레인들은 에탄올의 독성 효과를 보다 더 잘 대처할 수 있을 것으로 추측된다(Ding, J., et al., 2009). 표현형질적으로 규명된 이후, 증가된 에탄올 저항성의 효과는 일반적으로 글루코오스를 30%까지 포함하는 복합 풍부 배지에서 배치 배양으로부터 가장 높은 에탄올 역가를 측정함으로써 결정된다(Hong, M. E., et al., 2009; Hou, L., 2009; Hou, L., et al., 2009; Teixeira, MC., et al., 2009). 하지만, 상술한 연구들에서의 수율은 현저하게 개선되지 않았고 대조군 스트레인과 비교하여 10% 정도로만 증가하였다. 이러한 원인은 이용되는 대부분의 실험실 부모 스트레인들이 기본적으로 에탄올의 최대 레벨을 생산할 수 있어서 증가된 에탄올 저항성의 효과를 관찰하기 어렵기 때문일 것이다. 따라서, 부모 스트레인들의 기본적인 에탄올-생산 능력을 거의 초과하지 않는 에탄올 농도에서만 그러한 효과를 관찰하는 것이 가능할 것이다. 본 발명의 연구에서, 6%(v/v) 에탄올이 시작부터 첨가된 YPD30 배지인 YPD30E6 배지를 발효를 위해 이용하였다.

발효가 실험물질 및 실험방법에 기재된 바와 같이 실시되었을 경우, 대조군(iL3262) 및 2개의 에탄올 저항성 인테그란트(iETS2 및 iETS3)의 세포 밀도는 84시간 째에 최대치에 이른 후 감소하였다(도 5A). 이러한 프로파일의 특징은 iL3262가 시작부터 첨가된 에탄올에 대한 적응을 위해 보다 더 긴 유도기(lag period; 24시간)를 필요로 하며 포화기(saturation plateau)가 관찰되지 않는다는 것이었다. 이후 24시간 동안 iETS3의 성장률은 동일 비율로 성장하는 iL3262 및 iETS2의 성장률보다 약간 더 높았다. 일반적으로, 48시간 후에는 3가지 스트레인이 60시간 째(iETS3의 경우)를 제외하고는 84시간 까지 유사한 성장률로 성장하였다. 따라서, 상대적으로 짧은 길이의 유도기는 에탄올 저항성 스트레인들의 특징을 나타낸다.

iL3262, iETS2 및 iETS3의 발효 능력은 동인한 YPD30E6 배양액으로부터 에탄올 역가를 측정함으로써 결정하였다. 6%(v/v)의 개시 에탄올은 HPLC 상에서 47.5 g/L에 상응하였다. 도 5B에서 볼 수 있듯이, 120시간의 발효 과정 동안 iETS2 및 iETS3에 의해서 생산된 가장 높은 에탄올 역가는 각각 95.0 g/L 및 93.0 g/L이었던 반면에, 대조군의 에탄올 역가는 74.0 g/L이었다. 흥미롭게도, 에탄올 생산에서의 유도기는 세포 성장과는 대조적으로 대조군 스트레인에서는 관찰되지 않았는데, 그 이유는 불분명하다. 최종 역가 수율에서 시작부터 첨가된 에탄올(47.5 g/L)을 공제함으로써 발효 과정 동안 생산된 에탄올의 양(net amount)은 다음과 같다: 대조군, 26.5g/L; iETS2, 47.5 g/L; 및 iETS3, 45.5 g/L. 상술한 수율이 예상보다 더 낮았을 지라도, iETS2 및 iETS3는 본 발명에서 이용된 실험 조건에서 대조군보다 80% 정도 더 높은 발효 능력을 나타냈다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술 하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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서열목록 전자파일 첨부

Claims (11)

1. CTT1(YGR088W)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 과다발현된 에탄올-저항성 형질변형 효모 균주로, 상기 과다발현은 전사체 프로파일(transcriptome profiling)에서 평균적으로 1.5-4.5배 증가하는 것을 특징으로 하는 효모 균주.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 플라스미드로 효모 세포에 도입되는 것을 특징으로 하는 효모 균주.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 효모 세포의 지놈(genomic) DNA에 도입되는 것을 특징으로 하는 효모 균주.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 효모 균주는 6-12% 에탄올 배양 조건에서 성장할 수 있는 것을 특징으로 하는 효모 균주.
   
5. 삭제
6. 제 1 항에 있어서, 상기 전사체 프로파일은 마이크로어레이를 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 효모 균주.
   
7. 제 1 항에 있어서, 상기 효모 균주는 사카로마이세스 종(Saccharomyces spp.), 시조사카로마이세스 종(Schizosaccharomyces spp.), 피키아 종(Pichia spp.), 파피아 종(Paffia spp.), 클루이베로미세스 종(Kluyveromyces spp.), 칸디다 종(Candida spp.), 탈라로미세스 종(Talaromyces spp.), 브레타노미세스 종(Brettanomyces spp.), 파키솔렌 종(Pachysolen spp.), 데바리오미세스 종(Debaryomyces spp.) 또는 산업적인 배수체(polyploid) 효모 균주인 것을 특징으로 하는 효모 균주.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 효모 균주는 사카로마이세스 종인 것을 특징으로 하는 효모 균주.
   
9. 제 1 항 내지 제 4 항, 그리고 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 효모 균주를 에탄올로 대사될 수 있는 하나 이상의 기질을 포함하는 배양배지에서 배양하는 단계를 포함하는 에탄올 생산방법.
   
10. 제 9 항에 있어서, 상기 에탄올로 대사될 수 있는 기질은 C6 당(sugars)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
11. 제 10 항에 있어서, 상기 C6 당은 글루코오스인 것을 특징으로 하는 방법.
    

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