CN101952448A

CN101952448A - 高产率产生异丁醇的酵母生物

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Publication number: CN101952448A
Application number: CN2008801273441A
Authority: CN
Inventors: 里德·M·R·费尔德曼; 尤维尼·古纳沃德纳; 琼·尤拉诺; 彼得·迈因霍尔德; 阿里斯托斯·阿里斯蒂杜; 凯瑟琳·A·邓登; 克里斯托弗·史密斯
Original assignee: Gevo Inc
Current assignee: Gevo Inc
Priority date: 2007-12-23
Filing date: 2008-12-23
Publication date: 2011-01-19
Also published as: CA2990939A1; US20110318799A1; WO2009086423A2; WO2009086423A3; ES2563040T3; EP2235193A2; US8017375B2; EP2235193B1; CA2710359C; CA2710359A1; DK2235193T3; JP2011507532A; US20110183392A1; US20090226991A1

Abstract

本发明公开了产生异丁醇的方法。在一个实施方式中，该方法包括提供用包含至少一种外源基因的异丁醇产生途径的转化的微生物。所述微生物经选择从而以至少10％的理论产率由碳源产生异丁醇。所述方法包括在含有提供碳源的原料的培养基中培养微生物直至产生异丁醇。所述方法包括回收异丁醇。在一个实施方式中，所述微生物为具有Crabtree-阴性表型的酵母。在另一实施方式中，所述微生物为具有Crabtree-阳性表型的酵母微生物。本发明公开了产生异丁醇的微生物。在一个实施方式中，所述微生物包含含有至少一种外源基因的异丁醇产生途径，并经选择从以至少10％的理论产率由碳源产生可回收量的异丁醇。

Description

高产率产生异丁醇的酵母生物

相关申请的交叉引用

本申请要求2007年12月23日提交的美国临时申请流水号61/016,483的优先权。因此，通过提述整体并入该申请，其程度为上述申请的所有主题不与本申请相矛盾。

技术领域

本发明提供了代谢上经工程改造的微生物和产生这种生物体的方法。还提供了制备作为生物燃料的代谢产物的方法，所述方法通过将合适的底物与代谢上经工程改造的生物和来自该生物的酶制备物接触来进行。

背景技术

生物燃料具有很长的历史，其可以追溯到20世纪初。早在1900年，Rudolf Diesel在法国巴黎世界博览会上展示了依赖于花生油运转的机器。此后不久，Henry Ford展示了他的依赖于源自玉米的乙醇运行的福特T型车。由于石油衍生的燃料供应量增加和较低成本下的高效率，在20世纪30年代和40年代石油衍生的燃料取代了生物燃料。

在20世纪70年代与美国油产量下降相伴随的市场波动导致了原油价格增长，而生物燃料重新得到关注。今天，许多利益集团，包括政策制定者、工业策划者、有所意识的市民和金融界都对用生物质衍生的生物燃料取代石油衍生的燃料感兴趣。发展生物燃料的主要动机是其经济性、政治性和环保性。

其中之一“油品高峰(peak oil)”的威胁，即原油消耗率超过供给率，从而导致燃料成本价显著增加，这导致对替代性燃料需求的增加。另外，中东和其他富油区域的不稳定性增加了对本土生产生物燃料的需求。此外，与二氧化碳相关的气候变化的可能性有关的环境问题是一个重要的社会和道德的驱动力，这种驱动力开始致使形成政府的规章和政策，如汽车的二氧化碳排放量的上限、对二氧化碳排的税收以及对使用生物燃料的税收激励。

乙醇是目前最丰富的发酵生产的燃料，但是其与汽油相比有几个缺点。相比之下，丁醇作为燃料与乙醇相比有几个优点：其可以由与生产乙醇相同的原料制备，但是与乙醇不同，它可以与汽油以任何比率相容，并且也可以不经过改性在现存的内燃机中作为纯燃料使用。与乙醇不同，丁醇不吸水并因此可以在现有的石油化工基础设施中储存和分销。由于其接近于汽油的高能含量，其燃料经济性(英里/加仑)优于乙醇。此外，丁醇-汽油混和物比乙醇-汽油混和物具有更低的蒸气压，其在降低蒸发性碳氢化合物排放中很重要。

异丁醇具有与丁醇相同的优点，并且由于支化的碳链其还具有更高的辛烷值这个额外的优点。异丁醇作为商品化的化学品也很有用，并且也是MTBE的前体。异丁醇可以在表达异源性代谢途径的微生物中产生，但是这些微生物由于其固有的低性能特征而不适用于商业，低性能特征包括低繁殖力、低滴度、低产率和在发酵过程中对氧的需求。

发明内容

在一个实施方式中，提供了产生异丁醇的方法。该方法包括提供包含产生异丁醇的代谢途径的重组微生物，所述微生物经选择从而以至少5％的理论产率(at a yield of at least 5 percent theoretical)从碳源产生异丁醇。该方法进一步包括在包含提供碳源的原料的培养基中培养微生物，直至产生可回收量的异丁醇，以及回收异丁醇。在一些方面，所述微生物经选择从而在以高于约10％、20％或50％的理论产率产生异丁醇。

在另一实施方式中，此处提供的方法包括经工程化改造从而与亲本微生物相比包括降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性的重组微生物。在一方面，所述重组微生物在至少一种丙酮酸脱羧酶(PDC)基因中包括突变，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性的降低。在另一方面，所述重组微生物包括对丙酮酸脱羧酶(PDC)基因的部分缺失，其导致由该基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性的降低。在另一方面，所述重组微生物包含对丙酮酸脱羧酶(PDC)基因的完全缺失，其导致由该基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性的降低。在又一方面，所述重组微生物包括对与至少一种丙酮酸脱羧酶(PDC)基因相关的调节区的修饰，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性的降低。在另一方面，所述重组微生物包含对转录调节子的修饰，其导致丙酮酸脱羧酶基因转录的减少。在另一方面，所述重组微生物在所有丙酮酸脱羧酶(PDC)基因中包含突变，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性的降低。

在另一实施方式中，此处提供的方法利用已经进一步工程改造从而表达将丙酮酸(pyruvate)转化成异丁醇的异源代谢途径的重组微生物。在一方面，所述重组微生物经进一步工程改造从而增加将丙酮酸转化成异丁醇的天然(naive)代谢途径的活性。在另一方面，所述重组微生物经进一步工程改造从而包括至少一种由异源基因编码的酶和至少一种由天然基因编码的酶。在又一方面，所述重组微生物经选择从而包括将丙酮酸转化成异丁醇的天然代谢途径。

在一个实施方式中，此处提供的方法包含酵母属进化枝(Saccharomyces clade)的酵母重组微生物。

另一个实施方式中，此处提供的方法包括重组生物体，其为酵母属狭义酵母微生物(Saccharomyces sensu stricto yeast microorganism)。在一方面，酵母属狭义酵母微生物选自如下的种之一：酿酒酵母、酿酒酵母、库德里阿兹威酵母(S.kudriavzevii)、S.mikatae、贝酵母、葡萄汁酵母、S.carocanis或其杂种。

在另一实施方式中，此处提供的方法包括Crabtree-阳性重组酵母微生物。在一方面，Crabtree-阳性酵母微生物选自如下的属之一：酵母属、克鲁维酵母属、接合酵母属、德巴利酵母属、毕赤酵母属或裂殖酵母属。在另外的方面，Crabtree-阳性酵母微生物选自酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母、Saccharomyces castelli、克鲁弗酵母、耐热克鲁维酵母、光滑假丝酵母、拜耳接合酵母、鲁氏接合酵母菌、汉逊德巴利酵母、巴斯德毕赤酵母、粟酒裂殖酵母或葡萄汁酵母。

在另一实施方式中，此处提供的方法包括后-WGD(全基因组倍增)酵母微生物。在一方面，后-WGD酵母选自酵母菌属或假丝酵母属之一。在另一方面，后-WGD酵母选自酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母、Saccharomyces castelli和光滑假丝酵母。

在另一实施方式中，提供了一种产生异丁醇的方法。该方法包括提供重组微生物，其包括产生异丁醇的代谢途径并经选择从而由碳源产生异丁醇。重组体进一步包括与亲本微生物相比减少的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。该方法包括在包含提供碳源的原料的培养基中培养所述微生物直到产生可回收量的异丁醇并回收异丁醇。在一些方面，所述微生物是酵母进化枝的酵母。在其他方面，所述微生物经工程改造从而以基本上等同于亲本微生物生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。在一方面，所述微生物是酵母属狭义酵母。在另一方面，所述微生物经工程改造从而以基本上等同于亲本微生物生长速率的生长速率不依赖C2化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。

在其他方面，所述微生物是Crabtree-阴性酵母微生物，其选自如下的属之一：克鲁维酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属或假丝酵母属。在其他方面，所述Crabtree-阴性酵母微生物选自乳酸克鲁维酵母、马克思克鲁维酵母、异常毕赤酵母、树干毕赤酵母、异常汉逊酵母、产朊假丝酵母或Kluyveromyces waltii。在其他方面，所述Crabtree-阴性酵母微生物选自茁牙丝孢酵母、嗜木红酵母或Myxozyma vanderwaltii、乙醇假丝酵母、Debaromyces carsonii、Pichia castillae。

在另一方面，所述微生物是Crabtree-阳性酵母微生物。在一些方面，所述微生物经工程改造从而以基本上等同于亲本微生物生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。Crabtree-阳性酵母微生物可以选自如下的属之一：酵母菌属、克鲁维酵母属、接合酵母属、德巴利酵母属、毕赤酵母属或裂殖酵母属。在其它方面，所述Crabtree-阳性酵母微生物选自酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母、Saccharomyces castelli、克鲁弗酵母、耐热克鲁维酵母、光滑假丝酵母、拜耳接合酵母、鲁氏接合酵母、汉逊德巴利酵母、巴斯德毕赤酵母、粟酒裂殖酵母或葡萄汁酵母。在其它方面，所述微生物经工程改造从而以基本上等同于亲本微生物生长速率的生长速率生长不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。

在其它方面，所述微生物是选自酵母属或假丝酵母属之一的后-WGD(全基因组倍增)酵母。在其它方面，后-WGD酵母选自酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母、Saccharomyces casteili和光滑假丝酵母。在其它方面，所述微生物经工程改造从而以基本上等同于亲本微生物生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。

在另一方面，所述微生物是前-WGD(全基因组倍增)酵母，其选自如下的属之一：酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、管囊酵母属(Pachysolen)、西洋蓍霉属或裂殖酵母属。在其它方面，前-WGD酵母选自如下：克鲁弗酵母、耐热克鲁维酵母、马克思克鲁维酵母、Kluyveromyces waltii、乳酸克鲁维酵母、热带假丝酵母、巴斯德毕赤酵母、异常毕赤酵母、树干毕赤酵母、汉逊德巴利酵母、异常汉逊酵母、嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilis)、解脂西洋蓍霉和粟酒裂殖酵母。

在其它方面，此处提供的方法包括是非-发酵酵母微生物的微生物，其选自如下的属之一：丝孢酵母属、红酵母属或Myxozyma。

在另一实施方式中，提供了重组微生物。该微生物包括产生异丁醇的代谢途径，所述微生物经选择从而由碳源产生异丁醇。所述微生物还包括与亲本微生物相比降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。在多个方面，此处提供的微生物包括Crabtree-阴性酵母微生物、酵母进化枝的微生物、酵母属狭义酵母微生物、Crabtree-阳性酵母微生物、后-WGD(全基因组倍增)酵母微生物、前-WGD(全基因组倍增)酵母微生物和非发酵酵母微生物。

在一些实施方式中，此处提供的微生物已经工程修饰从而以基本上等同于亲本微生物生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。

附图简述

在附图中说明了本发明的例示性实施方式，其中：

图1例示了异丁醇途径的示范性实施方式；

图2A例示了经由糖酵解产生丙酮酸，以及将丙酮酸转化成异丁醇的异丁醇途径和将丙酮酸转化为乙醛和二氧化碳的PDC途径；

图2B例示了异丁醇途径，由于PDC途径的缺失或减少，该异丁醇途径接受额外的丙酮酸以高产率地形成异丁醇；

图EX4-1例示了在酿酒酵母Pdc-负型菌株GEVO1584恒化进化过程中随时间变化的碳源组成以及进料速率。该图显示乙酸盐怎样在480小时的时间内从0.375g/L减少到0g/L。其还显示了总进料速率。较高的进料速率意味着生长速率较高。由于恒化器包含200ml培养物，稀释速率可以通过将进料率除以200ml计算得到；

图EX4-2例示了与亲本菌株GEVO1187相比在YPD中进化的(evolved)Pdc-负型突变株GEVO1863的生长。

图EX4-3例示了与亲本菌株GEVO1187不同，变体PCD突变株GEVO1863在YPD培养基中不产生乙醇。

图EX1-1例示了质粒pGV1503的示意图。

图EX1-2例示了质粒pGV1537的示意图。

图EX5-1例示了质粒pGV1429的示意图。

图EX5-2例示了质粒pGV1430的示意图。

图EX5-3例示了质粒pGV1431的示意图。

图EX5-4例示了质粒pGV1472的示意图。

图EX5-5例示了质粒pGV1473的示意图。

图EX5-6例示了质粒pGV1475的示意图。

图EX6-1例示了质粒pGV1254的示意图。

图EX6-2例示了质粒pGV1295的示意图。

图EX6-3例示了质粒pGV1390的示意图。

图EX6-4例示了质粒pGV1438的示意图。

图EX7-1例示了质粒pGV1590的示意图。

图EX7-2例示了质粒ρGV1726的示意图。

图EX7-3例示了质粒pGV1727的示意图。

图EX8-1例示了质粒pGV1056的示意图。

图EX8-2例示了质粒pGV1062的示意图。

图EX8-3例示了质粒pGV1102的示意图。

图EX8-4例示了质粒pGV1103的示意图。

图EX8-5例示了质粒pGV1104的示意图。

图EX8-6例示了质粒pGV1106的示意图。

图EX8-7例示了质粒ρGV1649的示意图。

图EX8-8例示了质粒pGV1664的示意图。

图EX8-9例示了质粒pGV1672的示意图。

图EX8-10例示了质粒pGV1673的示意图。

图EX8-11例示了质粒pGV1677的示意图。

图EX8-12例示了质粒pGV1679的示意图。

图EX8-13例示了质粒pGV1683的示意图。

发明详述

除非上下文中另有明确表示，如在此处及所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一种/一个”、“和”以及“该/所述”(″a″，″and″and″the″)包括复数的所指对象。因此，例如，提及“一种/一个多核苷酸”包括多个这样的多核苷酸，而提及“该/所述微生物”包括提及一种或多种微生物等。

除非另外限定，在此使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属的技术领域一个普通技术人员所理解的相同的含义。尽管与那些在此处描述的方法和材料相似或等价的方法和材料可以用于所公开的方法和组合物中，此处描述了示例性的方法、装置和材料。

上文以及全文中讨论的任何出版物仅是为了它们在本申请申请日之前的公开内容而提供的。都不应理解为发明人由于在先公开的内容而承认本文的内容不能置于这些内容之前。

术语“微生物”包括来自古细菌域、细菌域和真核域(Domains Archaea，Bacteria and Eucarya)的原核和真核微生物种，后者包括酵母和丝状真菌、原生动物、藻类或高等原生生物(Protista)。术语“微生物细胞”和“微生物(microbe)”与术语微生物可以互换使用。

“ 细菌”或“真细菌”，指原核生物的一个域。细菌包括如下的至少11个不同的类群：(1)革兰氏-阳性(gram+)细菌，其中有两个主要的亚类(1)高G+C组(放线菌(Actinomycetes)、分枝杆菌(Mycobacteria)、微球菌(Micrococcus)、其它)(2)低G+C组(芽孢杆菌(Bacillus)、梭菌(Clostridia)、乳杆菌(Lactobacillus)、葡萄球菌(Staphylococci)、链球菌(Streptococci)、支原体(Mycoplasmas))；(2)变形菌(Proteobacteria)，例如紫色光合+非光合革兰氏-阴性细菌(包括大多数“普通”革兰氏-阴性细菌)；(3)蓝细菌(Cyanobacteria)，例如氧光能利用菌；(4)螺旋体(Spirochetes)和相关物种；(5)浮游菌(Planctomyces)；(6)拟杆菌(Bacteroides)、黄杆菌(Flavobacteria)；(7)衣原体(Chlamydia)；(8)绿色硫细菌；(9)绿色非硫细菌(又称厌氧光能利用菌)；(10)抗辐射微球菌和相关菌；(11)热袍菌(Thermotoga)和嗜热栖热腔菌(Thermosipho thermophiles)。

“ 革兰氏-阴性细菌”包括球菌、非肠杆菌(nonenteric rods)和肠杆菌(enteric rods)。革兰氏-阴性细菌的属包括，例如，奈瑟氏菌属(Neisseria)、螺菌属(Spirillum)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、布鲁氏菌属(Brucella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、弗朗西丝菌属(Francisella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、博德特氏菌属(Bordetella)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、弧菌属(Vibrio)、假单胞菌属(Pseudomonas)、拟杆菌属(Bacteroides)、乙酸杆菌属(Acetobacter)、产气杆菌属(Aerobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、固氮菌属(Azotobacter)、螺菌属(Spirilla)、沙雷氏菌属(Serratia)、弧菌属、根瘤菌属(Rhizobium)、衣原体属(Chlamydia)、立克次体属(Rickettsia)、密螺旋体属(Treponema)和梭形杆菌属(Fusobacterium)。

“革兰氏阳性细菌”包括球菌、不产孢子的杆菌(nonsporulating rods)和产孢子的杆菌(sporulating rods)。革兰氏阳性细菌的属包括，例如，放线菌、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、乳杆菌属(Lactobacillus)、李斯特菌属(Listeria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、粘球菌属(Myxococcus)、诺卡氏菌属(Norcardia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)和链霉菌属(Streptomyces)。

术语“属”定义为根据Taxonomic Outline of Bacteria and Archaea(细菌和古细菌的分类大纲)(Garrity，G.M.，Lilburn，T.G.，Cole，J.R.，Harrison，S.H.，Euzeby，J.，and Tindall，BJ.(2007)The Taxonomic Outline of Bacteria and Archaea.TOBA Release 7.7，March 2007.Michigan State University Board of Trustees，[http://www.taxonomicoutline.org/])定义为相关种的分类群。

术语“种”定义为密切相关的生物体的集合，其具有大于97％的16S核糖体RNA序列同源性和大于70％的基因组杂交，并且与所有其它生物体有充分的区别从而被认为是不同的单位。

术语“重组微生物”与“重组宿主细胞”在此处可互换使用并指如下的微生物，所述微生物经遗传修饰以表达或过表达内源多核苷酸，或表达异源性多核苷酸(例如包含在载体中的那些)，或在内源基因的表达上有变化。“变化”的意思是基因的表达、或RNA分子水平或编码一种或多种多肽或多肽亚基的等效RNA分子水平、或一种或多种多肽或多肽亚基的活性被上调或下调，使得表达、水平或活性大于或小于在没有该变化时所观察到的。例如，术语“改变”可以表示“抑制”，但是词语“改变”的意思并不限于这个定义。

关于基因序列的术语“表达”指该基因的转录，以及在适当时，将所得的mRNA转录物翻译成蛋白质。这样，从上下文中可明确，蛋白质的表达是由开放读码框序列的转录和翻译产生的。宿主细胞中期望产物的表达水平可基于细胞中存在的相应mRNA的量或由所选序列编码的期望产物的量来决定。例如，从所选序列转录的mRNA可以由PCR或Northern杂交来定量(参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))。由所选序列编码的蛋白质可以通过多种方法定量，例如，通过ELISA，通过测定蛋白质生物活性的含量，或通过采用不依赖这种活性的测定法，如蛋白质印迹或放射免疫测定，其使用识别蛋白质并与蛋白质结合反应的抗体。参见Sambrook et al，1989，见上文。所述多核苷酸通常编码与产生期望代谢产物的代谢途径有关的目标酶。术语“重组微生物”和“重组体宿主细胞”应理解为不仅仅指具体的重组微生物，还指这种微生物的子代或潜在子代。由于某些修饰可能因为突变或环境影响而在在后代中产生，所以事实上这些子代可能与亲本细胞不同，但是其仍然包含在此处所用的术语的范围之内。

术语“野生型微生物”描述出现在自然界的细胞，即，未经遗传修饰的细胞。野生型微生物可以被遗传修饰以表达或过表达第一目标酶。这种微生物可以在经修饰而表达或过表达第二目标酶的微生物的产生中充当亲本微生物。依次类推，可以修饰经修饰以表达或过表达第一和第二目标酶的微生物以使其表达或过表达第三目标酶。

因此，“亲本微生物”起到连续遗传修饰事件的参照细胞的作用。每次修饰事件都可以通过将核酸分子引入参照细胞来完成。这种引入促进目标酶的表达或过表达。应该理解的是术语“促进”包含通过对亲本微生物中的例如启动子序列进行遗传修饰而活化编码目标酶的内源多核苷酸。还应理解的是术语“促进”包含向亲本微生物中引入编码目标酶的异源多核苷酸。

术语“工程改造”指的是导致微生物中可查的变化的任何操作，其中所述操作包括但不限于插入对于所述微生物是异源的多核苷酸和/或多肽和突变对于所述微生物是天然的多核苷酸和/或多肽。术语“代谢上工程改造的”或“代谢上工程改造”涉及为了产生期望的代谢产物而进行的合理的途径设计以及组装生物合成基因、与操纵子相关的基因及这些多核苷酸的控制元件。“代谢上工程改造的”还可包括通过调节优化代谢通量和使用遗传工程和适当的培养条件优化转录、翻译、蛋白质稳定性和蛋白质功能，包括将与通向期望途径的中间物竞争的竞争性代谢途径减少、破坏或敲除。

术语“代谢上工程改造的微生物”和“修饰的微生物”在说明书中可以互换使用并且不仅仅指特定的题述细胞，还涉及这种细胞的子代及潜在子代。因为可能因突变或者环境影响而在后代中发生修饰，所以事实上这种子代可能与亲本细胞不同，但是仍然包含在此处所使用的术语范围内。

此处所用的术语“突变”表明任何导致改变的核酸或多肽的对核酸和/或多肽的修饰。突变包括，例如，多核苷酸中的点突变、缺失或单个或多个残基的插入，其包括出现在基因的蛋白编码区内的改变以及在蛋白编码序列以外区域(例如，但不限于，调控或启动子序列)中的改变。遗传改变可以是任何形式的突变。例如，突变可以构成点突变、移码突变、插入或部分或全部基因的缺失。此外，在一些修饰的微生物的实施方式中，微生物基因组的一部分已经被异源多核苷酸取代。在一些实施方式中，突变是天然存在的。在其他实施方式中，突变是人工选择压力的结果。在其他实施方式中，微生物基因组中的突变是遗传工程改造的结果。

术语“生物合成途径”，也称为“代谢途径”，指的是为了将一种化学物质(chemical specie)转化为另一种化学物质的一组合成代谢的或分解代谢的生化反应。如果基因产物平行或连续地作用于相同的底物，产生相同的产物，或作用于或产生在相同底物和代谢终产物(即代谢产物)之间的代谢中间产物，那么他们属于相同“代谢途径”。

此处使用的关于分子，且特别是酶和多核苷酸的术语“异源”表示分子在生物体中表达，该生物体不同于分子所起源的生物体或在自然界中存在该分子的生物体，而与表达水平无关，表达水平可能低于、等于或高于该分子在天然微生物中的表达水平。

另一方面，此处使用的关于分子，且特别是酶和多核苷酸的术语“天然”或“内源”表示该分子在生物体中表达，该生物体是所述分子所起源的生物体或在自然界中存在该分子的生物体，而与表达水平无关，表达水平可能低于、等于或高于该分子在天然微生物中的表达水平。应理解的是在重组微生物中可以修饰天然酶或多核苷酸的表达。

术语“原料”定义为提供给微生物或能够产生其他产物的发酵过程的原材料或原材料的混合物。例如，碳源，如生物质或由生物质衍生的含碳化合物是供在发酵过程中产生生物燃料的微生物用的原料。然而，原料可以包括碳源之外的营养物。

术语“底物”或“合适的底物”指的是通过酶的作用转化或要转化为另一种化合物的任何物质或化合物。该术语不仅仅包括单一的化合物，还包括化合物的组合，如包含至少一种底物或其衍生物的溶液、混合物以及其他材料。此外，术语“底物”不仅包括提供适宜作为起始材料使用的碳源的化合物，如任何生物质衍生的糖，还包括如此处描述的在与代谢工程改造的微生物有关的途径中使用的中间产物和终产物代谢产物。

术语“发酵”或“发酵过程”定义为这样的过程，其中在包含原材料(如原料和营养物)的培养基中培养微生物，其中所述微生物将原材料(如原料)转化为产物。

术语“细胞干重”或“CDW”指的是用本领域的技术人员已知的方法将包含在微生物内的水去除以后微生物的重量。CDW以克表示。

术语“生物燃料”指的是这样的燃料，其中包含在该燃料中的所有的碳都衍生自生物质并通过微生物以生物化学方法转化(至少部分转化)为燃料。生物燃料进一步定义为一种包含小于0.5个氧原子/碳原子的非-乙醇化合物。生物燃料本身就是燃料，但可以与石油-衍生的燃料混合以产生燃料。生物燃料可用作石油化工-衍生的汽油、柴油或喷气燃料的替代品。

术语“容积生产率”或“生产率”定义为单位时间每体积培养基形成的产物的量。容积生产率是以克每升每小时(g/L/h)表示的。

术语“产率”定义为每单位重量的原材料获得的产物的量且可以表示为克产物每克底物(g/g)。产率可以表示为理论产率的百分比。“理论产率”定义为由给定量底物能够产生的产物的最大量，如用于产生产物的代谢途径的化学计量学所规定的。例如，葡萄糖成为异丁醇的一种典型的转化的理论产率是0.41g/g。照这样，0.39g/g的由葡萄糖到异丁醇的产率可以表示为理论值的95％或95％理论产率。

术语“滴度(titer)”定义为溶液的浓度或溶液中物质的浓度。例如，发酵液中生物燃料的滴度描述为每升发酵液中的溶液中生物燃料的克数(g/L)。

“兼性厌氧生物”或“兼性厌氧微生物”定义为在存在或不存在氧的条件下能够生长的生物。

“严格厌氧生物”或“严格厌氧微生物”定义为在存在氧时不能生长并且暴露于任何氧浓度均不能存活的生物。

“厌氧生物”或“厌氧微生物”定义为不能在氧的存在下生长的生物。

“有氧条件”定义为发酵培养基中的氧浓度对于需氧或兼性厌氧微生物而言足以用作末端电子受体的条件。

相反，“厌氧条件”定义为发酵培养基中的氧浓度对于微生物而言太低而不能用作末端电子受体的条件。厌氧条件可以通过将惰性气体(如氮)充入发酵培养基直到作为氧不再能够用作微生物的末端电子受体来实现。或者，厌氧条件可以通过微生物消耗发酵中的可用氧直至氧不能用作微生物的末端电子受体来实现。

“有氧代谢”指的是如下生化过程，其中氧被用作末端电子受体以由碳水化合物产生能量，通常以ATP的形式。例如通过糖酵解和TCA循环发生有氧代谢，其中在氧的存在下，将单个葡萄糖分子完全代谢为二氧化碳。

相反，“无氧代谢”指的是其中氧不为包含在NADH中的电子最终受体的生化过程。无氧代谢可以分为：无氧呼吸，其中不同于氧的化合物被用作末端电子受体；和底物水平磷酸化，其中利用来自NADH的电子以通过发酵性途径产生还原产物。

在“发酵性途径”中，NAD(P)H将其电子贡献给通过产生NAD(P)H上携带的电子的同一代谢途径所产生的分子。例如，在某些酵母菌株的发酵性途径之一中，通过糖酵解产生的NAD(P)H将其电子传递给丙酮酸，产生乙醇。发酵性途径通常在厌氧条件下有活性，但是也可以发生在有氧条件下，在NADH没有经由呼吸链完全氧化的条件下。例如，高于某写葡萄糖浓度时，Crabtree阳性酵母在有氧条件下产生大量乙醇。

术语“副产品”指的是与生物燃料或生物燃料前体的产生相关的不需要的产品。副产品通常当做废品丢弃，增加了生产过程的成本。

术语“非发酵酵母”是一种酵母，其不能展示出其中利用来自NADH的电子经由发酵性途径产生还原产物的无氧代谢，例如由葡萄糖产生乙醇和CO₂。非发酵酵母可以通过“德拉姆试管检测”(J.A.Barnett，R.W Payne，and D.Yarrow.2000.Yeasts Characteristics and Identification.3^rd edition，p.28-29.Cambridge University Press，Cambridge，UK.)或通过监测发酵产物(如乙醇和CO₂)的产生来确认。

此处所用的术语“多核苷酸”可以和术语“核酸”互换使用，并且指的是由两种或多种包括核苷酸、核苷或其类似物的单体组成的有机聚合物，包括但不限于任意长度的单链或双链、有义或反义脱氧核糖核酸(DNA)，以及在适当时，任意长度的单链或双链、有义或反义核糖核酸(RNA)，包括siRNA。术语“核苷酸”指的是由结合到嘌呤或嘧啶碱并结合到磷酸基团的核糖或脱氧核糖组成几种化合物中的任一，并且它们是核酸的基本结构单元。术语“核苷”指的是由嘌呤或嘧啶碱与脱氧核糖或核糖的组合组成的化合物(如鸟苷或腺苷)，并且它特别存在于核酸中。术语“核苷酸类似物”或“核苷类似物”分别指的是这样的核苷酸或核苷，其中一个或多个单独的原子被不同原子或不同的官能团替换。因此，术语多核苷酸包括任意长度的核酸、DNA、RNA、其类似物和片段。三个或更多个核苷酸的多核苷酸也称为核苷酸寡聚物或寡核苷酸。

可以理解的是此处描述的多核苷酸包括“基因”，并且此处描述的核酸分子包括“载体”或“质粒”。因此，术语“基因”，也称为“结构基因”，指的是编码特定氨基酸序列的多核苷酸，其包含一种或多种蛋白质或酶的全部或部分，并且可以包括调节性(不转录的)DNA序列，如启动子序列，其确定例如在何种条件下表达基因。基因的转录区可以包括非翻译区(包括内含子、5′-非翻译区(UTR)和3′-UTR)，以及编码序列。

术语“操纵子”指的是由共同启动子作为单一转录单元转录的两种或更多种基因。在一些实施方式中，构成操纵子的基因是相邻的基因。可以理解的是可以通过修饰该共同启动子而修饰整个操纵子的转录(即，增加、减少或消除)。或者，可以修饰操纵子中的任何基因或基因的组合以改变所编码的多肽的功能或活性。修饰能够导致编码多肽的活性的提高。进一步地，修饰可以赋予编码的多肽新的活性。示例性新活性包括可选底物的应用和/或在可选环境条件中起作用的能力。

“载体”是任何如下的手段，即可以通过该手段使核酸在生物体、细胞或细胞成分之间增殖(propagate)和/或转移。载体包括病毒、噬菌体、原病毒、质粒、噬菌粒、转座子和人工染色体如YAC(酵母人工染色体)，BAC(细菌人工染色体)和PLAC(植物人工染色体)等，这些是“附加体(episome)”，也就是说，其自主地复制或者可以整合入宿主细胞的染色体内。载体也可以是裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、在同一链内由DNA和RNA二者组成的多核苷酸、多聚赖氨酸结合的DNA或RNA、多肽结合的DNA或RNA、脂质体结合的DNA等，它们本质上不是附加体，或者载体可以是包含一种或多种上述多核苷酸构建体的生物体，如土壤杆菌或细菌。

“转化”指的是将载体引入宿主细胞的过程。转化(或转导，或转染)可以通过包括化学转化(例如乙酸锂转化)、电穿孔、显微注射、基因枪(或粒子轰击介导的传递)或土壤杆菌介导的转化在内的许多方法中的任意一种来完成。

此处使用的术语“酶”指的是催化或促进一种或多种化学或生化反应的任何物质，其通常包括全部或部分由多肽组成的酶，但是可以包括由不同分子(包括多核苷酸)组成的酶。

此处使用的术语“蛋白质/蛋白”或“多肽”表示由两种或更多种氨基酸单体(amino acidic monomer)和/或其类似物组成的有机聚合物。此处所使用的术语“氨基酸”或“氨基酸单体”指的是包括甘氨酸和D或L光学异构体在内的任何天然和/或合成的氨基酸。术语“氨基酸类似物”指的是一个和多个单独的原子被不同的原子或不同的官能团替换的氨基酸。因此，术语多肽包括任意长度的氨基酸聚合物，其包括全长蛋白质，和肽以及其类似物和片段。三个或更多个氨基酸的多肽也称为蛋白寡聚物或寡肽。

关于第一家族(family)或种的原始酶或基因的术语“同源物(homolog)”指的第二家族或种的不同的酶或基因，其是通过功能、结构或基因组分析来确定的对应于第一家族或种的原始酶或基因的第二家族或种的酶或基因。最通常的情况，同源物会具有功能、结构或基因组相似性。使用基因探针和PCR可以容易地克隆酶或基因的同源物的技术是已知的。克隆的序列作为同源物的身份(identity)可以使用功能测定法和/或通过对基因的基因组作图来确认。

如果编码蛋白质的核酸序列与编码第二蛋白质的核酸序列具有相似的序列，则该蛋白质与第二蛋白质具有“同源性”或与第二蛋白质是“同源的”。或者，如果蛋白质与第二蛋白质具有“相似的”氨基酸序列，则两种蛋白质具有同源性。(这样，为术语“同源蛋白”定义的含义为两种蛋白质具有相似的氨基酸序列)。

术语“类似物”或“类似的”指的是仅在功能上彼此相关但不来自共同的谱系(descetn)或不共有共同祖先序列的核酸或蛋白序列或蛋白质结构。由于趋同进化，类似物在序列上可能不同但是可以共有相似的结构。例如，如果两种酶催化相同的底物转化为产物的反应、两种酶在序列上是无关的、且不论两种酶在结构上是否相关，那么这两种酶是类似物或者是类似的。

一般的微生物

1-丁醇的天然生产者，如丙酮丁醇梭菌是已知的，但是这些生物体在发酵过程中也产生副产品如丙酮、乙醇和丁酸盐。此外，这些微生物相对难以操作，可使用的手段比更常用的生产宿主(例如酿酒酵母或大肠杆菌)少得多。另外，对这些天然生产者的生理学和代谢调节知之甚少，妨碍了向高效率生产的快速进展。此外，尚未鉴定出能够以工业相关量将葡萄糖代谢成为异丁醇的天然微生物。

通过多种酵母菌种(包括酿酒酵母)产生异丁醇和其它燃料醇对于酒精饮料的蒸馏者有特别的价值，对于他们来说燃料醇通常形成不需要的怪味(off-notes)。已经证明了在多种生长培养基中在野生型酵母中产生异丁醇，所述培养基从葡萄酒制备过程中的葡萄醪(grape must)(Romano，et al.，Metabolic diversity of Saccharomyces cerevisiae strains from spontaneously fermented grape musts，World Journal of Microbiology and Biotechnology.19：311-315，2003)，其中产生了12-219mg/L异丁醇，到补充的基本培养基(Oliviera，et al.(2005)World Journal of Microbiology and Biotechnology 21：1569-1576)，其产生了16-34mg/L异丁醇。Dickinson等人(J Biol Chem.272(43)：26871-8，1997)的研究已经鉴定出在将支链氨基酸(例如，缬氨酸或亮氨酸)转化为异丁醇的内源酿酒酵母途径中使用了酶步骤。

此处提供的重组微生物可以表达多种异源和/或天然目标酶，该目标酶与从合适的碳源产生异丁醇的途径有关。

因此，代谢上“工程改造的”或“修饰的”微生物是经由将遗传物质引入所选的宿主或亲本微生物中和/或通过修饰天然基因的表达，由此修饰或改变该微生物的细胞生理学和生物化学而产生的。通过遗传物质的引入和/或对内源基因表达的修饰，亲本微生物获得新的性质，例如产生新的或更大量的胞内代谢产物的能力。如在此处所描述，亲本微生物中遗传物质的引入和/或对内源基因表达的修饰导致新的或改良的产生异丁醇的能力。在亲本微生物中引入的遗传物质和/或表达得到修饰的基因含有基因、或部分基因，其编码与产生异丁醇的生物合成途径相关的一种或多种酶，并且也可以包括用于表达这些基因和/或调节这些基因的表达的别的元件，例如启动子序列。

除了将遗传物质引入宿主或亲本微生物之外，经工程改造的或修饰的微生物还可包括基因或多核苷酸的改变、破坏、缺失或敲除以改变该微生物的细胞生理学和生物化学。通过基因或多核苷酸的改变、破坏、缺失或敲除，微生物获得新的或改进的性质(如产生新的代谢产物或更大量胞内代谢产物的能力，改进代谢产物沿着所需途径的流量和/或降低副产物的产量)。

此处提供的重组微生物还可以以在亲本微生物中无法获得的量产生代谢产物。“代谢产物”指的是通过代谢产生的任何物质或特定代谢过程中所必需的物质或参与特定代谢过程的物质。代谢产物可以是一种作为代谢的起始材料(如葡萄糖或丙酮酸)，中间产物(如2-酮异戊酸)或终产物(如异丁醇)的有机化合物。代谢产物可以用于构成更复杂的分子，或其可以分解成简单的分子。中间代谢产物可以由其他代谢产物合成，可能用于制备更复杂的物质，或分解成更简单的化合物，常常伴有化学能量的释放。

示例性的代谢产物包括葡萄糖、丙酮酸和异丁醇。所述代谢产物异丁醇可以通过代谢上经工程改造以表达或过表达将丙酮酸转化为异丁醇的代谢途径的重组微生物来产生。将丙酮酸转化为异丁醇的示例性代谢途径可以由乙酰羟酸合酶(ALS)、酮醇酸还原异构酶(KARI)、二羟酸脱水酶(DHAD)、2-酮酸脱羧酶(KIVD)、醇脱氢酶(ADH)组成。

因此，此处提供了产生异丁醇的重组微生物，且在一些方面所述重组微生物可以包括目标酶(如ALS、KARl、DHAD、KIVD和ADH)的高表达。

本公开鉴定了在所述方法中有用的特定基因、本公开的组合物和生物体；然而会被公认的是与这些基因完全一致是没有必要的。例如，在包含编码多肽或酶的序列的特定基因或多核苷酸中可以进行改变，并筛选活性。通常这些改变包含保守突变和沉默突变。可以使用本领域已知的方法筛选这些经修饰或突变的多核苷酸和多肽的功能性酶的表达。

由于遗传密码固有的简并性，编码基本上相同或功能上等同的多肽的其它多核苷酸也可以用于克隆和表达编码这些酶的多核苷酸。

正如本领域的技术人员所了解，修饰编码序列以提高其在特定宿主中的表达是有利的。遗传密码具有64种可能密码子，是冗余的，但是大多数生物体通常使用这些密码子的一个亚组。在某个种中最常被利用的密码子称为最佳密码子，而那些不常使用的密码子被归为罕见或利用率低的密码子。密码子可以被置换以反映宿主的优选密码子选择，即有时被称为“密码子优化”或“控制种密码子偏好”的过程。

例如，可以制备含有特定原核或真核宿主所优选的密码子的优化编码序列(参见，Murray et al.(1989)Nucl.Acids Res.17：477-508)，从而与产自非优化序列的转录物相比增加翻译例或产生具有期望性质(如更长的半衰期)的重组RNA转录物。也可以修饰翻译终止密码子以反映宿主偏好。例如，酿酒酵母和哺乳动物的典型终止密码子分别是UAA和UGA。单子叶植物的典型终止密码子是UGA，而昆虫和大肠杆菌通常使用UAA作为终止密码子(Dalphin et al.(1996)Nucl.Acids Res.24：216-218)。例如，美国专利号第6015891以及其中引用的参考文献中提供了为在植物中表达而优化核苷酸序列的方法。

本领域的那些技术人员将会认识到，由于遗传密码的简并性，多种核苷酸序列不同的DNA化合物可以用于编码本公开给定的酶。此处涉及的上述编码生物合成酶的天然DNA序列仅用于说明本公开的实施方式，而本公开包括具有编码本公开方法中利用的酶的蛋白质和多肽的氨基酸序列的任何序列的DNA化合物。类似地，多肽通常可以容许其氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的取代、缺失和插入而不损失或不显著损失所需的活性。本公开包括这些具有不同于此处描述的特定蛋白的氨基酸序列的多肽，只要所述修饰的或变体多肽具有参照多肽的酶促合成代谢或分解代谢活性即可。此外，在此显示的由DNA序列编码的氨基酸序列仅例示了本公开的实施方式。

此外，对产生代谢产物有用的酶的同源物涵盖在此处提供的微生物和方法中。

如此处所使用的，当氨基酸序列具有至少约30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性时，两种蛋白质(或蛋白质中的区域)基本上是同源的。为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，比对序列以便进行最佳的比较(例如，为了最佳的排列，可将缺口引入第一和/或第二氨基酸或核酸序列中，且为了比较的目的非同源序列可以忽略)。在一个实施方式中，为了比较目的而比对的参照序列的长度是参照序列长度的至少30％、通常为至少40％、更通常为至少50％、甚至最通常为至少60％，还甚至通常为至少70％、80％、90％、100％。然后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当在第一序列中的位置由与第二序列中相应位置上相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么在那个位置上所述分子是相同的(如在此所用的氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的百分比同一性是序列共享的相同位置数的函数，其考虑缺口数和每个缺口的长度，为了两个序列的最佳比对需要引入缺口。

当对蛋白质或肽使用“同源的”时，认为不同的残基位置是因保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是这样的取代，即其中氨基酸残基由具有化学性质(如电荷或疏水性)相似的侧链(R基团)的另一氨基酸残基所取代。一般而言，保守的氨基酸取代不会从本质上改变蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而相互有区别的情况下，百分比序列同一性或同源性程度可以向上调整以校正取代的保守性。本领域的技术人员熟知实施这种调整的手段(参见，例如，Pearson W.R.Using the FASTA program to search protein and DNA sequence databases，Methods in Molecular Biology，1994，25：365-89，在此处通过提述并入)。

下述六个组分别包含互为保守取代的氨基酸：1)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

也称作百分比序列同一性的多肽的序列同源性通常使用序列分析软件来测量。参见，例如the Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group(GCG)，University of Wisconsin Biotechnology Center，910University Avenue，Madison，Wis.53705。蛋白质分析软件用指定给各种取代、缺失和其它修饰(包括保守氨基酸取代)的同源性量度来匹配相似序列。比如，GCG包含可按默认参数使用的程序如“Gap”和“Bestfit”，以确定密切相关的多肽(如来自不同种生物体的同源多肽)之间或野生型蛋白与其突变体蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参加，例如GCG Version 6.1。

用于将分子序列与包含大量来自不同生物体的序列的数据库进行比较的一种典型算法是计算机程序BLAST(Altschul，S.F.，et al.(1990)″Basic local alignment search tool.″J.MoI.Bioi.215：403-410；Gish，W.and States，DJ.(1993)″Identification of protein coding regions by database similarity search.″Nature Genet.3：266-272；Madden，T.L.，et al.(1996)″Applications of network BLAST server″Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul，S.F.，et al.(1997)″Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs.″Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Zhang，J.and Madden，T.L.(1997)″PowerBLAST：A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation.″Genome Res.7：649-656)，特别是blastp或tblastn(Altschul，S.F.，et al.(1997)″Gapped BLAST and PSl-BLAST：a new generation of protein database search programs.″Nucleic Acids Res.25：3389-3402)。BLASTp的典型参数是：期望值(Expectation value)：10(缺省)；过滤器：seg(缺省)；产生一个缺口的罚分：11(缺省)；延长一个缺口的罚分：1(缺省)；最大比对：100(缺省)；字长：11(缺省)；说明数(No.of descriptions)：100(缺省)；罚分矩阵(Penalty Matrix)：BLOWSUM62。

当搜索包含来自大量不同生物体的序列的数据库时，通常比较氨基酸序列。使用氨基酸序列的数据搜索可以通过本领域已知的不同于blastp的算法来测量。例如，多肽序列可以用GCG Version 6.1中的程序FASTA来比较。FASTA提供对查询序列和搜索序列之间的重叠最佳的区域的比对及百分比序列同一性(Pearson，W.R.(1990)″Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA″Meth.Enzymol.183：63-98)。例如，氨基酸序列之间的百分比序列同一性可以使用如GCG Version 6.1中提供的FASTA用其缺省参数(2的字长和PAM250的计分矩阵)来测定，在此通过提述并入。

本公开提供了包含由合适底物以高产率产生异丁醇的生物化学途径的代谢上经工程改造的微生物。本公开的代谢上经工程改造的微生物包含在该生物体基因组之内或在该生物体内基因组的外部的一个或多个重组多核苷酸。所述微生物可包含野生型生物体中存在的基因的减少、破坏或敲除和/或异源多核苷酸的引入和/或内源多核苷酸的表达或过表达。

在一方面，本公开提供一种重组微生物，其包含与亲本微生物相比表达提高的至少一种目标酶或者编码亲本生物体中不存在的酶。在另一或进一步的方面，所述微生物包含对至少一种基因的减少、破坏或敲除，该基因编码与产生异丁醇所必需的代谢产物竞争的酶。所述重组微生物产生至少一种与产生异丁醇的生物合成途径有关的代谢产物。一般而言，所述重组微生物包括至少一种重组代谢途径，该途径包含目标酶并可以进一步包括在竞争性生物合成途径中的酶的活性或表达的降低。该途径在异丁醇的产生中起到修饰底物或代谢中间产物的作用。目标酶由源自合适生物源的多核苷酸编码并表达。在一些实施方式中，所述多核苷酸包含源自原核或真核来源并通过重组工程改造进入本公开的微生物的基因。在另一些实施方式中，所述多核苷酸包括对于宿主生物体是天然的基因。

可以理解的是可以修改微生物的范围以包括适合产生异丁醇的重组代谢途径。在多种实施方式中，微生物可以选自酵母微生物。用于产生异丁醇的酵母微生物可以基于如下某些特征来选择：

一种特征可以包括这样的性质，即微生物经选择以将各种碳源转化为异丁醇。因此，在一个实施方式中，此处公开的重组微生物可以将多种碳源转化为产物，这些碳源包括但不限于葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、乳糖、蔗糖及其混合物。

另一种特征可以包括这样的性质，即野生型或亲本微生物是非发酵性的。换句话说，其不能在缺氧情况下代谢碳源，而酵母能够在氧存在的情况下代谢碳源。非发酵酵母指天然存在的酵母和经遗传修饰的酵母二者。在用发酵性酵母进行厌氧发酵期间，氧化来自糖酵解的NADH的主要途径是通过产生乙醇。乙醇是通过醇脱氢酶(ADH)经由乙醛的还原产生的，乙醛是通过丙酮酸脱羧酶(PDC)自丙酮酸产生的。因此，在一个实施方式中，可以通过减少或消除天然PDC活性来将发酵性酵母工程改造成非-发酵性的。因此，由糖酵解产生的大多数丙酮酸没有被PDC消耗，并可用于异丁醇途径。这种途径的缺失增加了异丁醇途径可用的丙酮酸和还原当量。发酵性途径促成异丁醇的低产量和低生产率。因此，PDC的缺失可以增加异丁醇的产量和生产率。

第三个特征可以包括这样的性质，即选择生物催化剂以将不同的碳源转化为异丁醇。

在一个实施方式中，酵母微生物可以选自“酵母属酵母进化枝(Saccharomyces Yeast Clade)”，由Kurtzman和Robnett在1998年定义为子囊菌酵母(ascomycetous yeast)分类学类别(″Identification and phylogeny of ascomycetous yeast from analysis of nuclear large subunit(26S)ribosomal DNA partial sequences.″Antonie van Leeuwenhoek 73：331-371，图2)。他们通过比较编码核糖体大亚基26S的基因5′末端的D1/D2域的核苷酸序列能够测定约500个酵母种的相关性。在酿酒酵母的D1/D2核苷酸序列和两种来自这个酵母属酵母进化枝的距离最远的酵母(即乳酸克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母)的配对比较中共享超过80％的同一性。

术语“酵母属狭义(Saccharomyces sensu stricto)”分类群是这样一组酵母种，其与酿酒酵母高度相关(Rainieri，S.et al 2003.Saccharomyces Sensu Stricto：Systematics，Genetic Diversity and Evolution.J.Biosci Bioengin 96(1)1-9.Saccharomyces sensu stricto yeast species include but are not limited to S.cerevisiae，S.cerevisiae，S.kudriavzevii，S，mikatae，S，bayanus，S.uvarυm，S.carocanis and hybrids derived from these species(Masneuf et at.1998.New Hybrids between Saccharomyces Sensu Stricto Yeast Species Found Among Wine and Cider Production Strains.Yeast 7(1)61-72)。

在半子囊酵母(hemiascomycete yeast)的进化过程中发生了古老的(ancient)全基因组倍增(WGD)事件，并且该事件是使用比较基因组工具发现的(Keliis et al 2004″Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast S.cerevisiae.″Nature 428：617-624.Dujon et al 2004″Genome evolution in yeasts.″Nature 430：35-44.Langkjaer et al 2003″Yeast genome duplication was followed by asynchronous differentiation of duplicated genes.″Nature428：848-852.Wolfe and Shields 1997″Molecular evidence for an ancient duplication of the entire yeast genome.″Nature 387：708-713)。使用这些主要的进化事件，酵母可以分成在WGD事件之后偏离共同祖先的种(此处称“后-WGD酵母”)和在WGD事件之前偏离酵母谱系的种(此处称“前-WGD酵母”)。

因此，在一个实施方式中，所述酵母微生物可以选自后-WGD酵母属，包括但不限于酵母属和假丝酵母属。优选的后-WGD酵母种包括：酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母、S.castelli和光滑假丝酵母。

在另一实施方式中，所述酵母微生物可以选自前-全基因组倍增(pre-WGD)酵母属，其包括但不限于酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、伊萨酵母属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、西洋蓍霉属和裂殖酵母属。代表性的前-WGD酵母种包括：克鲁弗酵母、耐热克鲁维酵母、马克思克鲁维酵母、K.waltii、乳酸克鲁维酵母、热带假丝酵母、巴斯德毕赤酵母、异常毕赤酵母、树干毕赤酵母、东方伊萨酵母、罕见伊萨酵母、菱形伊萨酵母、汉逊德巴利酵母、异常汉逊酵母、解脂西洋蓍霉和粟酒裂殖酵母。

酵母微生物可以是Crabtree-阴性或是Crabtree-阳性的。具有Crabtree-阴性表型的酵母细胞是任何不展现Crabtree效应的酵母细胞。术语“Crabtree-阴性”指天然存在的或经遗传修饰的生物体二者。简单的说，Crabtree效应定义为在有氧条件下培养时微生物由于高浓度葡萄糖的存在(如50g-葡萄糖L^-1)而抑制氧的消耗。换句话说，具有Crabtree-阳性表型的酵母细胞由于葡萄糖的存在而无论氧的可用性为多少都继续发酵，而具有Crabtree-阴性表型的酵母细胞不会显示葡萄糖介导的对氧消耗的抑制。

因此，在一个实施方式中，所述酵母微生物可以选自具有Crabtree-阴性表型的酵母，其包括但不限于如下的属：克鲁维酵母属、毕赤酵母属、伊萨酵母属、汉逊酵母属和假丝酵母属。Crabtree-阴性的种包括但不限于：乳酸克鲁维酵母、马克思克鲁维酵母、异常毕赤酵母、树干毕赤酵母、东方伊萨酵母、罕见伊萨酵母、菱形伊萨酵母、异常汉逊酵母和产朊假丝酵母。

在另一个实施方式中，所述酵母微生物可以选自具有Crabtree-阳性表型的酵母，包括但不限于酵母属、克鲁维酵母属、接合酵母属、德巴利酵母属、毕赤酵母属和裂殖酵母属。Crabtree-阳性酵母的种包括但不限于：酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母、S.castelli、克鲁弗酵母、耐热克鲁维酵母、光滑假丝酵母、拜耳接合酵母、鲁氏接合酵母、汉逊德巴利酵母、巴斯德毕赤酵母和粟酒裂殖酵母。

在一个实施方式中，工程改造酵母微生物以通过糖酵解将碳源(如葡萄糖)转化为丙酮酸，并且经由经工程改造的异丁醇途径将丙酮酸转化为异丁醇(PCT/US2006/041602、PCT/US2008/053514)。在国际专利申请号PCT/US2006/041602和Dickinson et al.，Journal of Biological Chemistry273：25751-15756(1998)中描述了产生异丁醇的可选途径。

因此，经工程改造的将丙酮酸转化为异丁醇的异丁醇途径可以包含如下反应：

1.2丙酮酸→乙酰乳酸+CO₂

2.乙酰乳酸+NADPH→2，3-二羟基异戊酸+NADP⁺

3.2，3-二羟基异戊酸→α-酮异戊酸

4.α-酮异戊酸→异丁醛+CO₂

5.异丁醛+NADPH→异丁醇+NADP⁺

这些反应通过如下酶来进行：1)乙酰乳酸合酶(ALS，EC4.1.3.18)、2)酮酸还原异构酶(KARI，EC 1.1.1.86)、3)二羟酸脱水酶(DHAD，EC4.2.1.9)、4)α-酮异戊酸脱羧酶(KIVD，EC4.1.1.1)和5)醇脱氢酶(ADH，EC1.1.1.1或1.1.1.2)。

在另一实施方式中，所述酵母微生物经工程改造以过表达这些酶。例如，这些酶可以由天然基因编码。例如，ALS可以由枯草芽孢杆菌的alsS基因、L.lactis的alsS基因、或肺炎克雷伯氏菌(K.pneumonia)的ilvK基因编码。例如，KARI可以由大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)、海沼甲烷球菌(M.maripaludis)或瘤胃壶菌E2的ilvC基因编码。例如，DHAD可以由大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌的ilvD基因编码。KIVD可以由L.lactis的kivD基因编码。ADH可以由酿酒酵母的ADH2、ADH6或ADH7编码。

可以工程改造本发明的酵母微生物以使其具有提高的将丙酮酸转化为异丁醇的能力。在一个实施方式中，所述酵母微生物可以经工程改造以提高将丙酮酸转化为异丁醛的能力。在另一实施方式中，所述酵母微生物可以经工程改造以提高将丙酸转化为酮异戊酸的能力。在另一实施方式中，所述酵母微生物可以经工程改造以提高将丙酮酸转化为2，3-二羟基异戊酸的能力。在另一实施方式中，所述酵母微生物可以经工程改造以提高将丙酮酸转化为乙酰乳酸的能力。

此外，可以通过基因/蛋白工程技术优化编码上述酶的任何基因(或此处提及的任何其他酶的任何基因(或控制或调整其表达的任何调节元件))，如定向进化或合理诱变，这些技术是本领域普通技术人员所熟知的。这些行为允许本领域的技术人员优化酶在酵母中的表达和活性。

此外，编码这些酶的基因可以从其它真菌和细菌菌种中鉴定并且可以进行表达以调节这种途径。多种生物体可以充当这些酶的来源，包括但不限于酵母属菌种，包括酿酒酵母和葡萄汁酵母；克鲁维酵母属菌种，包括耐热克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母和马克思克鲁维酵母；毕赤酵母属菌种；汉逊酵母属菌种，包括多形汉逊酵母(H.polymorpha)；假丝酵母属菌种；毛孢子菌属菌种(Trichosporon spp.)；Yamadazyma属菌种，包括Y.spp.Stipitis，球有孢圆酵母(Torulaspora pretoriensis)；裂殖酵母属菌种，包括粟酒裂殖酵母；隐球菌属菌种(Cryptococcus spp.)；曲霉属菌种(Aspergillus spp.)；脉孢菌属菌种(Neurospora spp.)或黑粉菌属菌种(Ustilago spp.)。来自厌氧真菌的基因来源包括但不限于瘤胃壶菌属菌种(Piromyces spp.)、Orpinomyces属菌种或Neocallimastix属菌种。有用的原核酶的来源是包括但不限于大肠杆菌、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、芽孢杆菌属菌种、梭菌属菌种、棒杆菌属菌种、假单胞菌属菌种、乳球菌属菌种(Lactococcus spp.)、肠杆菌属菌种(Enterobacter spp.)和沙门氏菌属菌种。

一般的方法

酵母微生物中PDC的鉴定

可以使用任何方法鉴定编码具有丙酮酸脱羧酶(PDC)活性的酶的基因。PDC催化丙酮酸脱梭以形成乙醛。一般而言，同源或相似的PDC基因和/或同源或相似的PDC酶可以通过功能、结构和/或遗传分析来鉴定。在大多数情况下，同源或相似的PDC基因和/和同源或相似的PDC酶会有功能、结构或遗传相似性。本领域的技术人员已知的技术可适用于鉴定同源基因和同源酶。一般而言，类似基因和/或类似的酶可以通过功能分析来鉴定并且会具有功能相似性。本领域的技术人员已知的技术可适用于鉴定类似基因和类似的酶。例如，鉴定同源或类似基因、蛋白质或酶的技术可以包括但不限于，使用基于基因/酶的公开序列的引物通过PCR克隆PDC基因或使用设计用来扩增PDC基因中保守区的简并引物通过简并PCR克隆PDC基因。此外，本领域技术人员可以使用技术来鉴定具有功能同源性或相似性的同源或类似的基因、蛋白质或酶。这些技术包括通过针对所述活性的体外酶测定法检查细胞或细胞培养物的酶催化活性，然后通过纯化分离具有所述活性的酶，通过如Edman降解确定所述酶的蛋白质序列，为最可能的核酸序列设计PCR引物、通过PCR对所述DNA序列进行扩增，以及克隆所述核酸序列。用于鉴定同源或相似基因和/或同源或相似的酶、类似基因和/或类似酶或蛋白质的技术还包括将关于候选基因或酶的数据与数据库如BRENDA、KEGG或MetaCYC比较。候选基因或酶可以根据此处的教导在上述数据中鉴定。此外，PDC活性可以从表型上确定。例如，可以评价在发酵条件下的乙醇产生。乙醇产生的缺乏可能预示着酵母微生物不具有PDC活性。

基因插入或缺失

可以使用任何方法以将核酸分子引入酵母中，并且已知许多这样的方法。例如，转化和电穿孔是将核酸引入酵母细胞的常用方法。参见，例如Gietz et al.，Nucleic Acids Res.27：69-74(1992)；Ito et al.，J.Bacterol.153：163-168(1983)；和Becker and Guarente，Methods in Enzymoiogy 194：182-187(1991)。

在一个实施方式中，根据同源重组的原理，发生目标基因整合到酵母微生物的DNA片段或目标基因中。根据这个实施方式，将包含含有至少一种酵母标记基因和/或待整合基因的模块(内部模块)的整合盒用与目标整合位点两端的DNA片段同源的DNA片段(引起重组的序列)从两侧包围。在通过合适的方法用所述整合盒转化酵母之后，引起重组的序列之间的同源重组可以导致内部模块取代基因组中对应于整合盒中引起重组之序列的两个位点间的染色体区域(Orr-Weaver et al.，Proc Natl Acad Sci USA 78：6354-6358(1981))。

在一个实施方式中，用于将目标基因整合入酵母微生物的整合盒包括在适当启动子和终止子控制下的异源基因以及选择标记，它们由引起重组的序列从侧翼包围，用于异源基因整合入酵母染色体。在一个实施方式中，异源基因包括适当的天然基因，期望增加天然基因的拷贝数。选择标记基因可以是用于酵母的任何标记基因，包括但不限于HIS3、TRP1、LEU2、URA3、bar、ble、hph和kan。引起重组的序列可以随意选择，取决于适合于所需用途的理想整合位点。

在另一实施方式中，将基因整合入酵母微生物的染色体可以通过随机整合发生(Kooistra，R.，Hooykaas，P.J.J.，Steensma，H.Y.2004.Yeast 21：781-792)。

此外，在一个实施方式中，使用本领域技术人员熟知的技术从基因组去除某些引入的标记基因。例如，URA3标记的丢失可以通过将含URA3的细胞铺板在含有FOA(5-氟-乳清酸)的培养基中并选择FOA抗性菌落而获得(Boeke，J.et al，1984，Mol.Gen.Genet，197，345-47)。

包含在本公开的酵母细胞内的外源核酸分子可以任何形式保持在细胞中。例如，外源核酸分子可以整合入细胞的基因组或保持在附加体状态，这种状态可以稳定地传递(“遗传”)给子细胞。这样的染色体外遗传元件(如质粒等)能够额外包含确保这样的遗传元件在子细胞中存在的选择标记。此外，可以将酵母细胞稳定地或暂时地转化。此外，此处所述的酵母细胞可以含有如上所述的特定外源核酸分子的单个拷贝或多个拷贝。

酶活性的降低

在本发明范围内的酵母微生物可以具有降低的酶活性，例如降低的丙酮酸脱羧酶活性。如此处使用的关于特定酶活性的术语“降低”指的是与在相同种的可比较的酵母细胞中测量的相比较低的酶活性水平。术语降低还指与相同种的可比较的酵母细胞中测量的相比消除了酶活性。这样，缺乏丙酮酸脱羧酶活性的酵母细胞被视为具有降低的丙酮酸脱羧酶活性，因为，即使不是全部，也是大部分的可比较的酵母菌株具有至少一些丙酮酸脱梭酶活性。这种降低的酶活性可以是较低的酶浓度和/或较低的酶比活性的结果。可以使用许多不同的方法以产生具有降低的酶活性的酵母。例如，可以使用常用的诱变或敲除技术工程改造酵母细胞以使其具有被破坏的酶编码基因座。参见，例如Methods in Yeast Genetics(1997版)，Adams，Gottschling，Kaiser和Stems，Cold Spring Harbor Press(1998)。此外，可以引入导致具有降低活性的酶的某写点突变。

或者，可以使用反义技术来降低酶活性。例如，可以工程改造酵母以使其包含编码反义分子的cDNA，该反义分子阻止酶的产生。如此处所用的术语“反义分子”包括含有对应于内源多肽编码链的序列的任意核酸分子。反义分子还可以具有侧翼序列(如调节序列)。因此，反义分子可以是核酶或反义寡核苷酸。核酶可具有任意的一般结构，包括但不限于，发夹、锤头或斧头(axhead)结构，只要该分子切割RNA。

具有降低的酶活性的酵母可以用多种方法鉴定。例如，具有降低的丙酮酸脱羧酶活性的酵母可以使用普通方法容易地鉴定，该方法可以包括，例如，通过气相层析测量乙醇的形成。

异源基因的过表达

从天然或异源核酸分子过表达多肽的方法是已知的。这些方法包括，但不限于，构建核酸序列使得调节元件促进编码所需多肽的核酸序列的表达。通常调节元件是在转录水平调节其他DNA序列表达的DNA序列。因此，调节元件包括，但不限于，启动子、增强子等。例如，外源基因可以在诱导型启动子或组成型启动子控制之下。而且，已知在酵母种自外源核酸分子表达多肽的方法。例如，已知用于在克鲁维酵母属和酵母属内表达外源多肽的核酸构建体(参见，对于克鲁维酵母属，例如美国专利号4,859,596和4,943,529，以及对于酵母属，例如，Gellissen等人Gene 190(1)：87-97(1997))。此外，某些质粒也可以含有着丝粒序列。这些着丝粒质粒通常是单拷贝或低拷贝质粒。无着丝粒序列并利用2微米(酿酒酵母)或1.6微米(乳酸克鲁维酵母)复制起点的质粒是高拷贝质粒。选择标记可以是原养型的，如HIS3、TRP1、LEU2、URA3或ADE2，或者抗生素抗性，如bar、ble、hph或kan。

在另一实施方式中，异源调控元件可以用于激活或抑制内源基因的表达。此外，当表达需要受到抑制或消除时，可以通过已知的缺失技术来消除相关的酶、蛋白质或RNA的基因。

如在此处所述，本公开范围内的任何酵母可以通过针对所表达、过表达或抑制的特定酶的选择技术来鉴定。鉴定具有所需表型的菌株的方法是本领域的技术人员熟知的。这些方法包括，但不限于，PCR、RT-PCR和核酸杂交技术如Northern和Southern分析，改变在特定底物上或在特定底物、化合物、选择剂等存在下的生长能力。在一些情况下，免疫组织化学和生物化学技术可以通过探测编码多肽的表达来确定细胞是否包含特定核酸。例如，对于编码的酶具有特异性的抗体可以用于确定特定酵母细胞是否包含该编码的酶。进一步，生物化学技术可以用于通过检测作为酶多肽表达的结果产生的产物来确定细胞是否包含编码酶多肽的特定核酸分子。例如，用编码乙酰乳酸合酶的载体转化细胞并检测与无载体的细胞相比乙酰乳酸浓度的增加同时表明载体存在且基因产物有活性。检测特定酶活性或特定产物存在的方法是本领域的技术人员所熟知的。例如，乙酰乳酸的存在可以按Hugenholtz and Starrenburg，Appl.Microbiol.Biotechnol.38：17-22(1992)所描述的方法来测定。

酶活性的增加

可以进一步工程改造本发明的酵母微生物以使其具有增加的酶活性。如此处所用的关于特定酶活性的术语“增加的”指的是与在相同种的可比较的酵母细胞中测量的相比更高的酶活性水平。例如，特定酶的过表达可以导致在细胞中该酶的活性水平增加。糖酵解或异丁醇途径中涉及的酶活性的增加会导致异丁醇的生产率和产量的增加。

增加酶活性的方法是本领域的技术人员已知的。这些技术可以包括通过增加的拷贝数和/或使用强启动子、引入减轻对酶的负调节的突变、引入增加比活性和/或降低对底物的Km的特定突变、或通过定向进化来增加酶的表达。参见，例如Methods in Molecular Biology(vol.231)，ed.Arnold and Georgiou，Humana Press(2003)。

碳源

此处公开的生物催化剂可将多种碳源转化为异丁醇，术语“碳源”通常指适合用作供原核或真核生物细胞生长用的碳的来源的物质。碳源包括，但不限于，生物质水解产物、淀粉、蔗糖、纤维素、半纤维素、木糖和木质素，以及这些底物的单体成分。碳源可以包括各种不同形式的多种有机化合物，包括，但不限于聚合物、碳水化合物、酸类、醇类、醛类、酮类、氨基酸类、多肽类等。这些包括，例如多种单糖(例如，葡萄糖、右旋糖(D-葡萄糖)、麦芽糖、寡糖、多糖)、饱和或不饱和脂肪酸、琥珀酸盐/酯、乳酸盐/酯、乙酸盐/酯、乙醇等，或其混合物。光合生物可以额外地产生作为光合作用产物的碳源。在一些实施方式中，碳源可以选自生物质水解产物和葡萄糖。

所用术语“C2-化合物”指的是包括两个碳原子的有机化合物，包括但不限于乙醇和乙酸盐/酯，该“C2-化合物”用作碳源供经工程改造的酵母用，所述酵母在所有丙酮酸脱羧酶(PDC)基因中带有突变，导致所述基因的丙酮酸脱羧酶活性降低。

术语“原料”定义为提供给微生物或发酵过程的、可以自其产生其他产物的原材料或原材料的混合物。例如，碳源(如生物质或由生物质衍生的含碳化合物)是供在发酵过程中产生生物燃料的微生物用的原料。然而，原料可以含有除碳源外的营养物。

术语“传统的碳水化合物”指的是产生自专用植物如甘蔗、玉米和小麦的糖和淀粉。通常，这些专用植物在植物的某些部分(如谷粒)中集中了糖和淀粉，该部分被收获并加工以提取糖和淀粉。传统的碳水化合物被用作食物，以及较低程度地被用作碳源供产生生物燃料和化学品的发酵过程用。

此处所用的术语“生物质”主要是指绿色植物的茎、叶和含淀粉部分，并且主要由淀粉、木质素、纤维素、半纤维素和/或果胶组成。生物质可以通过化学处理或酶处理分解成组成该生物质的单体糖和酚类。(Wyman，CE.2003 Biotechnological Progress 19：254-62)。这样所得的物质称为生物质水解产物，对其进行中和并处理以除去痕量的可能不利地影响生物催化剂的有机物质，然后用作原料供使用生物催化剂的发酵用。

此处所用的术语“淀粉”是指容易通过消化酶水解的葡萄糖的聚合物。淀粉通常集中在植物的专门部分，如马铃薯、玉米粒、稻粒、麦粒和甘蔗茎。

此处所用的术语“木质素”是指聚合物材料，其主要由连接的酚类单体化合物(如对香豆醇、松柏醇和芥子醇)组成，其形成植物中结构刚性的基础并且常常是指作为植物的木质部分。木质素也被视为植物细胞壁的非-碳水化合物部分。

此处所用的术语“纤维素”是指化学式(C₆H₁₀O₅)_n的β-葡萄糖的长链高分子多糖碳水化合物，通常与木质素和任何半纤维素一起存在于植物细胞壁中。

术语“半纤维素”指的是一类植物细胞壁多糖，其可以为几种杂聚物中的任一。这些包括木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖、阿拉伯半乳聚糖、葡糖醛酸木聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖。半纤维素的单体成分包括但不限于：D-半乳糖、L-半乳糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、L-岩藻糖、D-木糖、L-阿拉伯糖和D-葡糖醛酸。这类多糖与纤维素一起存在于几乎所有的细胞壁中。半纤维素重量比纤维素低且不能通过热水或螯合剂萃取，但是可以通过碱性水溶液萃取。半纤维的高分子链结合交联纤维网络中的果胶和纤维素，形成大多数植物细胞的细胞壁。

特征为以高产率产生异丁醇的微生物

为了使生物催化剂最经济地产生异丁醇，期望产生高产率。优选地，产生的唯一产物是异丁醇。额外的产物导致产率的减少以及资本和生产费用的增加，特别是如果副产品价值很小或没有价值。副产品还需要额外的资本和生产费用来讲这些产物与异丁醇分离。

微生物以高于理论值的5％的产率将一种或多种由生物质衍生的碳源转化为异丁醇。在一个实施方式中，产率高于10％。在一个实施方式中，产率高于理论值的50％。在一个实施方式中，产率高于理论值的60％。在另一个实施方式中，产率高于理论值的70％。在又一个实施方式中，产率高于理论值的80％。在又一个实施方式中，产率高于理论值的85％。在又一个实施方式中，产率高于理论值的90％。在又一实施方式中，产率高于理论值的95％。在又一实施方式中，产率高于理论值的97.5％。

更具体而言，微生物以高于理论值的5％的产率将由生物质衍生的葡萄糖转化为异丁醇。在一个实施方式中，产率高于理论值的10％。在一个实施方式中，产率高于理论值的50％。在一个实施方式中，产率高于理论值的60％。在另一实施方式中，产率高于理论值的70％。在又一实施方式中，产率高于理论值的80％。在又一实施方式中，产率高于理论值的85％。在又一实施方式中，产率高于理论值的90％。在又一实施方式中，产率高于理论值的95％。在又一实施方式中，产率高于理论值的97.5％。

特征为经由过表达的异丁醇途径从丙酮酸产生异丁醇和Pdc-负表型的微生物

在酵母中，丙酮酸转化为乙醛是对丙酮酸池的主要消耗(图2A)，而因此，是与异丁醇途径竞争的主要因素。这种反应由丙酮酸脱羧酶(PDC)酶催化。酵母微生物中的这种酶活性的降低导致用于异丁醇途径的丙酮酸和还原当量的可用性增加，并可以在表达丙酮酸依赖性异丁醇途径的酵母微生物中改进异丁醇的产生和产率(图2B)。

PDC活性的降低可以由如下方式实现：1)编码PDC的结构基因的正转录调节子的突变或缺失，或2)在给定生物体中所有PDC基因的突变或缺失。术语“转录调节子”可以指定反向作用的蛋白质或核酸以增加或减少基因组中不同基因座的转录。例如，在酿酒酵母中，编码PDC1，5，6基因正转录调节子的PDC2基因可以被缺失；报道缺失了PDC2基因的酿酒酵母仅具有野生型PDC活性的～10％(Hohmann，Mol Gen Genet，241：657-666(1993))。或者，例如，将PDC的所有结构基因(如在酿酒酵母中的PDC1、PDC5、PDC6或在乳酸克鲁维酵母中的PDC1)缺失。

包含对所有三个PDC等位基因的破坏的Crabtree-阳性酵母菌株(如酿酒酵母菌株)不再通过发酵产生乙醇。然而，由PDC催化的反应的下游产物乙酰辅酶A是合成代谢产生必要分子所需要的。因此，Pdc突变体不能单独在葡萄糖中生长，还需要二-碳的碳源，或者乙醇或乙酸盐，以合成乙酰辅酶A(Flikweert MT，de Swaaf M，van Dijken JP，Pronk JT.FEMS Microbiol Lett.1999May 1；174(1)：73-9.PMlD：10234824 and van Maris AJ，Geertman JM，Vermeulen A，Groothuizen MK，Winkler AA，Piper MD，van Dijken JP，Pronk JT.Appl Environ Microbiol.2004 Jan；70(1)：159-66.PMID：14711638)。因而，在一个实施方式中，这种Crabtree-阳性酵母菌株可以进化以产生PDC突变体酵母的变体，其不需要二碳分子且在葡萄糖上与野生型具有相似的生长速率。可以使用包括恒化器进化或系列稀释的任何方法来产生能够在作为单一碳源的葡萄糖上以类似于野生型的速率生长的、缺失三个PDC等位基因的菌株变体(van Maris et al，，Directed Evolution of Pyruvate Decarboxylase-Negative Saccharomyces cerevisiae，Yielding a C2-independentt Glucose-Tolerant，and Pyruvate-Hyperproducing Yeast，Applied and Environmental Microbiology，2004，70(1)，159-166)。

使用供高产率异丁醇发酵用的微生物的方法

在以高产率由碳源产生异丁醇的方法中，将所述酵母微生物在包含碳源的适当培养基中培养。

另一个示例性的实施方式提供了用于产生异丁醇的方法，包括在包含碳源的合适培养基中的本发明的重组酵母微生物，所述碳源可以通过本发明的酵母微生物转化为异丁醇。

在某些实施方式中，所述方法进一步包括从培养基分离异丁醇。例如，可以通过本领域的技术人员已知的任何方法(如蒸馏、全蒸发或液-液提取)从培养基分离异丁醇。

实施例

通用方法

样品制备：将来自发酵液的样品(2mL)储存在-20℃以供后续的底物和产物分析。分析之前，将样品解冻，然后以14,000×g离心10分钟。上清通过0.2μm滤器过滤。使用可靠的标准品(＞99％，购自Sigma-Aldrich)和5-点校准曲线(用1-戊醇作为内标物用于气相层析分析)进行底物和产物的分析。

光密度和细胞干重的测定：在600nm用DU 800分光光度计(Beckman-Coulter，Fulierton，CA，USA)测定酵母培养物的光密度。视需要稀释样品以得到0.1-0.8的光密度。通过离心50mL培养基之后倾析上清液来测定细胞干重。用50mL milliQ水洗涤细胞团块一次，离心并将团块用25mL milliQ水再次洗涤。然后将细胞团块在80℃下干燥至少72小时。通过从包含干细胞团块的离心管的重量中扣去离心管的重量计算得到细胞干重。

气相层析：对乙醇和异丁醇的分析在配备有DB-FFAP柱(Agilent Technologies；长度：30m，ID：0.32mm，膜厚度：0.25μM)或等效连接到火焰电离检测器(FID)的HP 5890气相层析仪中进行。温度程序如下：注射器：200℃；探测器：300℃；烤箱：100℃，1分钟；70℃/分钟梯度升温至235℃，然后维持2.5分钟。

高效液相层析：在配备有Aminex HPX-87H离子排阻柱(Bio-Rad，300x7.8mm)或等同物和H⁺阳离子保护柱或等同物的HP-1100高效液相层析系统上进行对葡萄糖和有机酸的分析。有机酸使用HP-1100 UV检测器(210nm，8nm 360nm参比)检测，而葡萄糖用HP-1100折射率检测器来检测。柱温是60℃。这种方法用0.008N硫酸水溶液作为恒定流动相。流速设为0.6mL/min，注入量是20μL而运行时间是30分钟。

厌氧分批发酵：厌氧分批培养在30℃下在用塞密封的100mL血清瓶中进行。使用初始葡萄糖浓度为20g/L葡萄糖的总共20mL合成培养基(Kaiser et al，Methods in Yeast Genetics，a Cold Spring Harbor Laboratory Manual(1994))。在24和48小时取出2mL样品。在48小时后或当所有葡萄糖耗尽时结束发酵。通过如上所述的气相层析和/或高效液相层析来处理和分析样品。

酵母转化-乳酸克鲁维酵母：根据Kooistra等，Yeast 21：781-792 (2004)通过电穿孔进行转化。

酿酒酵母的乙酸锂转化通过乙酸锂法转化了菌株(Gietz et al.，Nucleic Acids Res.27：69-74(1992)。通过在室温下以2700rcf离心2分钟从过夜培养物收集细胞，所述培养物以大约0.8～1.0的OD₆₀₀生长在50mL成分确定的(SC)乙醇培养基中。将细胞团块再悬浮在50mL无菌水中，通过离心法收集(2700rcf；2min；室温)，然后重悬在25mL蒸馏水中。通过离心收集(2700 rcf；2min；室温)细胞，并重悬在1mL的100mM乙酸锂中。将细胞悬液转移到无菌的1.5ml管中，并通过全速离心10秒收集。将细胞重悬在体积为细胞团块体积四倍的100mM碳酸锂中(例如，100μL细胞团块用400μL)。向制成的DNA混合物(72μl 50％PEG、10μl 1M碳酸锂、3μl煮沸的鲑精DNA和5μl的各质粒)加入15μl细胞悬液并通过涡旋振荡混合，其间短暂停顿5次。将细胞/DNA悬液在30℃下温育30分钟并在42℃下温育22分钟。通过全速离心10秒收集细胞并重悬在100μl SOS(1M山梨醇，0.34％(w/v)酵母提取物，0.68％(w/v)蛋白胨，6.5mM CaCl₂)中。将所述细胞悬液铺在适当的选择性琼脂平板上。

酵母菌落PCR：从琼脂培养基取酵母细胞并转移到30μl 0.2％SDS中，然后在90℃加热4分钟。离心沉降(spun down)细胞，并将1μl上清用于使用标准Taq(NEB)的PCR。

分子生物学：除非特别声明，通常采用用于克隆和质粒构建的标准分子生物学方法(Sambrook & Russell)。

培养基：

YP：包含1％(w/v)酵母提取物、2％(w/v)蛋白胨。YPD为包含2％(w/v)葡萄糖的YP，YPE为包含2％(w/v)乙醇的YP。

SC+Complete：20g/L葡萄糖、14g/L Sigma^TM Synthetic Dropout Media添加剂(包括氨基酸和营养物，不包括组氨酸、色氨酸、尿嘧啶和亮氨酸)和6.7g/LDifco^TM Yeast Nitrogen Base、0.076g/L组氨酸、0.076g/L色氨酸、0.380g/L亮氨酸和0.076g/L尿嘧啶。

SC-HWUL：20g/L葡萄糖、14g/L Sigma^TM Synthetic Dropout Media添加剂(包括氨基酸和营养物，不包括组氨酸、色氨酸、尿嘧啶和亮氨酸)和6.7g/LDifco^TM Yeast Nitrogen Base。

SC-WLU：20g/L葡萄糖、14g/L Sigma^TM Synthetic Dropout Media添加剂(包括氨基酸和营养物，不包括组氨酸、色氨酸、尿嘧啶和亮氨酸)、6.7g/L不含氨基酸的Difco^TM Yeast Nitrogen Base和0.076g/L组氨酸。

SC-HWU：20g/L葡萄糖、14g/L Sigma^TM Synthetic Dropout Media添加剂(包括氨基酸和营养物，不包括组氨酸、色氨酸、尿嘧啶和亮氨酸)、6.7g/L不含氨基酸的Difco^TM Yeast Nitrogen Base和0.380g/L亮氨酸。

SC-乙醇-HWU：2％(w/v)乙醇、14g/L Sigma^TM Synthetic Dropout Media添加剂(包括氨基酸和营养物，不包括组氨酸、色氨酸、尿嘧啶和亮氨酸)、6.7g/L Difco^TM Yeast Nitrogen Base和0.380g/L亮氨酸。

上述培养基的固体形式含2％(w/v)琼脂。

菌株、质粒和引物序列

表1详细显示了本文公开的菌株的表型：

¹与ATCC200826相同

²菌株Gevo1537和Gevo1538为最初指定的GG570(来源于菌株T2-3D)，并获得自荷兰莱顿大学的Paul van Heusden。关于这两种菌株的完整参考文献，参见：Flikweert，M.T.et al.，(1996)Yeast 12：247-257。

表2：说明书中公开的质粒的概要

表3.本文公开的引物序列的概要

No.	名称	序列
			489	MAT共有的	AGTCACATCAAGATCGTTTATGG
490	MAT alpha	GCACGGAATATGGGACTACTTCG
			491	MAT a	ACTCCACTTCAAGTAAGAGTTTG
838	pGV1423-seq1(838)	TATTGTCTCATGAGCGGATAC
			965	KIPDC1-616FOR	ACAACGAGTGTCATGGGGAGAGGAAGAGG
966	KIPDC1+2528REV	GATCTTCGGCTGGGTCATGTGAGGCGG
			995	KIPDC1内部的	ACGCTGAACACGTrGGTGTCTTGC
996	KIPDC1内部的	AACCCTTAGCAGCATCGGCAACC
			1010	KI-PDC1-prom-seq-c	TATTCATGGGCCAATACTACG
1006	KI-PDC1-prom-3c	GTAGAAGACGTCACCTGGTAGACCAAAGATG
			1009	KI-PDC1-term-5c	CATCGTGACGTCGCTCAATTGACTGCTGCTAC
1016	KI-PDC1-prom-5-v2(1016)	ACTAAGCGACACGTGCGGTTTCTGTGGTATAG

1017	KI-PDC1-term-3c-v2(1017)	GAAACCGCACGTGTCGCTTAGTTTACATTTCTTTCC
			1019	TEF1prom-5c(1019)	TTTGAAGTGGTACGGCGATG
1321	Bs-alsS-Q-A5(1321)	AATCATATCGAACACGATGC
			1324	Bs-alsS-Q-B3(1324)	AGCTGGTCTGGTGATTCTAC
1325	Ec-ilvC-dN-Q-A5(1325)	TATCACCGTAGTGATGGTTG
			1328	Ec-ilvC-dN-Q-B3(1328)	GTCAGCAGTTTCTTATCATCG
1330	Ec-ilvD-dN-co-KI-Q-A3(1330)	GCGAAACTTACTTGACGTTC
			1331	Ec-ilvD-dN-co-KI-Q-B5(1331)	ACTTTGGACGATGATAGAGC
1334	LI-kivd-co-Ec-Q-A3(1334)	GCGTTAGATGGTACGAAATC
			1335	LI-kivd-co-Ec-Q-B5(1335)	CTTCTAACACTAGCGACCAG
1338	Sc-ADH7-Q-A3(1338)	AAAGATGATGAGCAAACGAC
			1339	Sc-ADH7-Q-B5(1339)	CGAGCAATACTGTACCAATG
1375	HO+1300F	TCACGGATGATTTCCAGGGT

1376

HO+1761R

CACCTGCGTTGTTACCACAA

实施例1：乳酸克鲁维酵母中PDC缺失的构建和确认

本实施例的目的是描述属于酵母进化枝、Crabtree-阴性酵母、前-WGD酵母的乳酸克鲁维酵母成员的PDC-缺失变体是怎样构建和确认的。

质粒pGV1537的构建：质粒pGV1537(SEQ ID NO.1.1)通过以下的一系列步骤构建。使用KOD聚合酶(Novagen，Inc.，Gibbstown，NJ)并按照制造者的标准反应条件进行所有PCR反应以产生pGV1537。第一轮进行两个PCR反应，其中一个PCR反应包含引物1006和1016，并使用来自乳酸克鲁维酵母GEVO1287的约100ng的基因组DNA作为模板。另一第一轮PCR反应包含引物1017和1009，和来自乳酸克鲁维酵母菌GEVO1287的约100ng的基因组DNA作为模板。用Zymo Research凝胶DNA提取试剂盒(Zymo Research，Orange，CA)根据制造者的说明书凝胶纯化两种所得的PCR产物(大小分别约为530bp和630bp)，并洗脱至10μL水中。然后将二(2)微升洗脱的各PCR产物用作模板供最后一轮KOD聚合酶催化的PCR用，该PCR包括引物1006加1009。纯化所得产物(Zymo Research DNA Clean & Concentrate试剂盒，Zymo Research，Orange，CA)，用酶MfeI和Aat II完全消化，并对所得产物如上所述进行凝胶纯化并洗脱。将这种DNA连接到用EcoRI加AatII消化的载体pGV1503(图EX1-1)中，用小牛碱性磷酸酶处理并如上所述凝胶纯化。通过由限制消化分析筛选由连接DNA的转化产生的菌落，并通过使用引物838、1010和1019的DNA测序反应确认。将由连接和后续分析所得的正确的重组DNA称为pGV1537(图EX1-2)。

乳酸克鲁维酵母Klpdc1Δ菌株的构建：用经PmlI-消化的线性化质粒pGV1537来转化菌株GEVO1287。转化通过使用约300ng线性化pGV1537的电穿孔来进行，基本上如Kooistra等人所述(Kooistra，R.，Hooykaas，P.J.J.，and Steensman，H.Y.(2004)″Efficient gene targeting in Kluyveromyces lactis″.Yeast 21：781-792)。通过铺板到包含0.2mg/mL遗传霉素(G418)的YPD平板上来选择转化细胞。通过将菌落贴片(patch)到YPD平板上，然后复制铺板到包含5μM(终浓度)呼吸抑制剂抗霉素A的YPD上来进一步选择从转化得到的菌落，因为乳酸克鲁维酵母的Pdc-变体在抗霉素A存在下不能在葡萄糖上生长(Btanchi，M.，et al.，(1996).″The′petite negative yeast Kluyveromyces lactis has a single gene expressing pyruvate decarboxylase activity″.Molecular Microbiology 19(1)：27-36)，因而可以通过这种方法来鉴定。在贴片到YPD+抗霉素A的83个G418抗性菌落中，六个菌落(～7％)不能生长，并因此鉴定为候选Klpdc1::pGV1537破坏菌株(disruption strain)。

通过菌落PCR确认乳酸克鲁维酵母Klpdc1Δ菌株：候选Klpdc1::pGV1537破坏菌株是通过菌落PCR分析来确认的。为此，通过以下方法从候选系获得了基因组DNA。将少量(相当于火柴头(matchhead)大小)的酵母细胞重悬在50μL 0.2％SDS中并加热至95℃保持6分钟。将悬液通过离心(30秒，16,000×g)沉淀，并将1μL上清在50μL PCR反应中用作模板。除了标准的成分外，反应含有终浓度为1.5％的Triton X-100和终浓度为5％的DMSO。所用的多种引物组和期望的扩增子的大小在表EX1-1中指出。通过这些分析，鉴定了正确的Klpdc1Δ::pGV1537菌株并命名为GEVO1742。

表EX1-1：为菌落PCR筛选的候选Klpdc1Δ::pGV1537细胞预测的引物对和预期扩增子大小

通过发酵确认GEVQ 1742 Klpdc1Δ::pGV1537：已经证明了缺乏KlPdc1p(Klpdc1Δ)的乳酸克鲁维酵母菌株当在葡萄糖上生长时产生显著较低水平的乙醇(Bianchi，M.，et al.，(1996).″The′petite negative yeast Kluyveromyces lactis has a single gene expressing pyruvate decarboxylase activity″.Molecular Microbiology 19(1)：27-36)。为了确认这种表型，进行了使用菌株GEVO1287和GEVO1742的发酵。简言之，将在YPD中培养的各菌株的饱和过夜(3mL)培养物以0.1的起始OD₆₀₀接种到25ml YPD中，并在盖未盖紧的瓶中在30℃下250 rpm的摇床中有氧培养24小时。培养以后，收集2mL培养物，通过离心(5分钟，14,000×g)沉淀细胞并且通过气相层析和液相层析分析上清。从这些分析得到的数据的概要归纳在表EX1-2中。发酵培养基中显著降低的乙醇产生和丙酮酸积累的增加是缺失了PDC1的乳酸克鲁维酵母菌株的特点。因此，这些观察结果确认分子遗传学结论，即菌株GEVO1742事实上是Klpdc1Δ。

表EX1-2：在GEVO1287和GEVO1742的有氧发酵中产生的乙醇和丙酮酸以及消耗的葡萄糖

实施例2：酿酒酵母中PDC缺失的构建和确认

这个实施例的目的是描述属于酵母属狭义酵母类群、酵母属酵母进化枝、Crabtree-阳性酵母、和前-WGD酵母的酿酒酵母成员的PDC缺失变体是如何构建和确认的。

将菌株GEVO1537和GEVO1538在诱导孢子形成的1％乙酸钾中温育3-4天。通过随机孢子分析回收所得的单倍体孢子。简言之，用显微镜检查正在形成孢子的细胞的培养物以确保细胞中有足够一部分形成了孢子(＞10％)。将五(5)ml形成了孢子的细胞的培养物通过离心(5分钟3000xg)收集并在1mL水中洗涤一次。将细胞重悬在加入了0.5mL的1mg/mL Zymolyase-T(水)溶液(新鲜配制)和10μLβ-巯基乙醇的5mL水中。将细胞悬液液置于50rpm的摇床中在30℃下温育过夜。加入5mL的1.5％ Triton X-100，并在冰上温育混合物15分钟。以50％的功率超声处理溶液三次，每个周期30秒，在各超声周期之间在冰上静置2分钟。离心悬液(1200×g，5分钟)，并用5mL水洗涤两次。将最终细胞团块重悬在1mL水中，并将细胞铺板到YP+2％EtOH上。

在此过程之后，将分开的单独孢子铺板到固体培养基上以得到菌落，所有基因型HO pdc1::Tn5ble pdc5::Tn5ble pdc6:APT1 HIS3 LEU2 TRP1 URA3和未知的交配型。由于HO+基因状态以及所得交配型转变并重新交配形成二倍体，所以一部分细胞是(纯合的)二倍体。

通过PCR确认了推定的Pdc-负型菌落的交配型基因座的基因型，所述PCR在标准条件下使用Taq DNA聚合酶(New England BioLabs，Ipswich，MA)，使用对于MAT a基因座特异性的引物(引物#489和#491)或对于MATα基因座特异性的引物(引物#490和#491)。使用所述两组可能的引物组之一的引物组产生了单个PCR产物且当使用另一组测试时没有产物的菌落为推定的Pdc-负型菌株。为了确认交配型，将这样的菌株与Gevo1187和Gevo1188(CEN.PK)杂交。在包含葡萄糖(以选择通过CEN.PK本底引入的PDC+基因的存在)且同时缺乏至少一种下述营养物的培养基上选择所得的二倍体子代，所述营养物为：组氨酸、亮氨酸、色氨酸或尿嘧啶(以从Gevo1537或GEV01538本底中选择由相应基因的野生型等位基因提供的适当的原养型)。

使二倍体细胞形成孢子并在包含YP+2％乙醇(以允许Pdc-负型分离株(isolate)生长)的琼脂平板上萌发。为了鉴定Pdc-负型候选物，将活的菌落划线接种到YPD琼脂平板上并将不能在葡萄糖上存活的菌落分离。不能在葡萄糖上生长确认了这些候选物是pdc1::ble和pdc5::ble。确认pdc6::apt1在含抗霉素G418的YP+乙醇平板上的生长能力。通过PCR确认了推定的Pdc-负型菌落的交配型基因座的基因型，所述PCR在标准条件下使用Taq DNA聚合酶(New England BioLabs，Ipswich，MA)，使用对于MAT a基因座特异性的引物(引物#489和#491)或对于MATα基因座特异性的引物(引物#490和#491)。来自两组PCR反应的产物的存在表明了种群中存在两种交配型等位基因，这是由活性HO-编码的酶进行的交配型等位基因转变的结果。一组MAT基因座-特异性引物的PCR产物存在而另一组不存在表明所述菌株缺乏这种活性，而因此是ho-。根据这些分析，六个候选菌落被鉴定为ho-菌株，而一个候选物#4是HO。

将这些Pdc-负型菌株划线接种到缺乏如下之一的SC+乙醇平板上：亮氨酸、组氨酸、色氨酸或尿嘧啶，以确定这些菌株中营养缺陷性突变的存在。一种Pdc-负型菌株，GEVO1581，是组氨酸、尿嘧啶和色氨酸的营养缺陷型，并且因此携带三种标记(his3、ura3和trp1)。另一种Pdc-负型菌株，GEVO1715，是尿嘧啶和亮氨酸的营养缺陷型，并且因此携带两种标记，ura3和leu2。

通过RFLP分析筛选GEVO1581和GEVO1715以验证ho等位基因的存在。通过PCR扩增了HO基因座的447 bp部分，所述PCR使用引物1375和1376，该部分包含在ho等位基因中改变了的密码子(H475L)。这种突变引入AluI限制性位点，并且因此用AluI消化(New England BioLabs，Ipswich，MA)产生了447bp片段(HO)或122bp片段加325bp片段(ho)。根据RFLP分析，GEVO1581是HO，而GEVO1715是ho。

为了得到具有所有四种营养缺陷型标记的Pdc-负型菌株，将GEVO1715与GEVO1188和如上所述产生的二倍体杂交。使所得的二倍体产生孢子并通过铺板到包含腐草霉素和G418的YP+乙醇上来分离Pdc-负型候选物。然后将这些候选物划线接种到YPD琼脂平板上并测试它们在葡萄糖中的不存活率(inviability)。将那些不在葡萄糖上生长的候选物作为这种表型分离，除了它们对腐草霉素和G418的抗性之外，确认这些候选者是pdc1::ble，pdc5::ble和pdc6::apt1。将这些分离株划线接种到缺乏如下之一的SC+乙醇平板上：亮氨酸、组氨酸、色氨酸或尿嘧啶，以测定这些菌株内营养缺陷性突变的存在。这些Pdc-负型菌株之一，GEVO1584，是组氨酸、尿嘧啶、色氨酸和亮氨酸，的营养缺陷型，而因此携带所有的四种标记：his3、ura3、trp1和leu2。如上所述，通过菌落PCR和RFLP分析也分别确认了GEVO1584是MATa和ho。

表EX2-1：所得的酿酒酵母Pdc-负型菌株的概要表

实施例3：其它Pdc-负型酿酒酵母菌株

之前已经描述了工程改造为PDC活性缺陷的酿酒酵母(Flikweert，M.T.，van der Zanden，L.，Janssen，W.M.T.M，Steensma，H.Y.，van Dijken J.P.，Pronk JT.(1996)Yeast 12(3)：247-57)。这样的菌株可以从这些来源获得。

实施例4：酿酒酵母PDC三重-突变体(triple-mutant)的恒化进化

这个实施例表明属于酵母属狭义酵母类群、酵母属进化枝酵母、Crabtree-阳性、前-WGD酵母的酿酒酵母成员的PDC缺失的变体可以得到进化，从而不需要二-碳分子并以类似于亲本菌株的生长速率在葡萄糖上生长。

将DasGip发酵容器灭菌并填充200mL YNB(Yeast Nitrogen Base(酵母含氮基底)；包含每升蒸馏水：6.7g YNB，不含有来自Difco的氨基酸，向每升培养基加入如下各项：0.076g组氨酸、0.076g色氨酸、0.380g亮氨酸和/或0.076g尿嘧啶；通过加入数滴HCL或KOH调节培养基的pH至5)并包含2％w/v乙醇。安装所述容器并且根据DasGip说明书校准所有探针。还将所述容器连接到DasGip系统的废气分析器和质谱仪。在整个实验过程中在线测量氧气、二氧化碳、异丁醇和乙醇。在整个实验过程中用两个探针都在容器内测量pH和溶解氧水平。在容器上也安装有培养基的入口和出口。出口管刚好设在200mL水平之上的高度，且将泵的速率设置到最大值。这种安排帮助容器维持200mL的容量。全程空气以12标准升每小时(slph)喷射入发酵罐。容器的温度保持在31.8℃恒温并且搅拌速率保持在300rpm。分析废气的CO₂、O₂、乙醇和异丁醇浓度。二氧化碳(Xco₂)和氧(Xo₂)水平在废气中的量被用于评估细胞的代谢状态。增加的Xco₂水平和降低的Xo₂水平表明生长率和葡萄糖消耗率的增加。监测乙醇水平以确定没有来自其它酵母细胞或者突变体菌株的潜在回复体的污染，因为酿酒酵母PDC三重-突变体(GEVO1584)不产生乙醇。设定容器内的最小pH为5，并且设置基本控制仪在pH降至5以下时将氢氧化钾泵入容器内。

将GEVO1584接种到含2％w/v乙醇作为碳源的10mL YNB培养基中。将培养物在30℃下伴随振荡温育过夜。将过夜培养物用于接种DasGip容器。最初，罐以分批模式运行，以建立高细胞密度。当细胞生物质达到约3gCDW/L时，将容器转换成恒化模式并开始稀释培养物。泵入容器内的培养基是含有7.125g/L葡萄糖和0.375g/L乙酸盐的YNB(5％碳当量)。最初稀释速率被设置成0.1h^-1，但随着细胞密度开始下降，稀释速率下降至.025h^-1以避免冲失(washout)。GEV01584为交配型a。实验开始后几日PCR检查恒化群体的交配型表明仍然存在的菌株是交配型a。

使恒化器中的培养物稳定化并使稀释速率增加到0.1h^-1。在0.1h^-1稀释速率下达到稳态后，缓慢减少乙酸盐的浓度。这是通过使用两个泵系统实现的，其有效产生梯度泵送方案。最初，泵A以12.5mL/h的速率泵入含有7.125g/L葡萄糖和0.6g/L乙酸盐的YNB，而泵C以7.5mL/h的速率泵入仅含7.125g/L葡萄糖的YNB。进入容器中的总乙酸盐是0.375g/L。然后，历时3周的时间，缓慢降低泵A的速率，并以相同的量增加泵C的速率，从而使进料的总速率始终是20mL/h。当泵A的速率下降到3mL/h以下时培养物开始缓慢冲失。为了避免完全冲失，将稀释速率从0.1h^-1下降至0.075h^-1(图EX4-1)。在这种稀释速率，泵A的速率最终降低至0，并且进化的菌株能够在只有葡萄糖时生长。在历时约五周的时间内，不时地直接从容器内或者从流出管道取样。用HPLC分析样品的葡萄糖、乙酸盐和丙酮酸，并铺板在具有葡萄糖的YNB上、具有乙醇的YNB上，以及YNB(w/o尿嘧啶)加葡萄糖或乙醇上作为阴性对照。从恒化器分离的菌株不能在没有尿嘧啶的YNB平板上生长。有规律地取OD₆₀₀以确保恒化器没有冲失。有规则地制备培养物样品的冷冻储液以供将来表征菌株。

为了表征进化菌株YNB的生长，将YPD(酵母提取物、蛋白胨、右旋糖)和YPE(酵母提取物、蛋白胨、乙醇)与多种浓度的葡萄糖或乙醇一起使用。或者在snap-cap试管中或者在48孔平板(7.5ml)中进行生长表征。snap-cap试管没有完全封闭以便空气可以排进/出试管，而将48孔板用透气膜覆盖以使氧气可以转移。为了检测污染，YPD或YPE琼脂平板与抗生素G418和腐草霉素一起使用。PDC三重突变体菌株(GEVO1584)同时具有G418和腐草霉素抗性标记，所以这种菌株的子代能够在这些抗生素上生长。研究从各恒化样品分离的单个菌落的生长速率。选择从35-天恒化群体分离的单个菌落，因为其在作为唯一碳源的葡萄糖上的高生长率，该单个菌落对G418和腐草霉素二者具有抗性，并且生长不需要乙醇或乙酸盐。通过在试管中在YPD上，30℃下，250rpm振荡条件下连续系列24次转移，进一步进化所述单菌落。所得的菌株，GEVO1863，类似于野生型酵母亲本在葡萄糖上生长(图EX4-2)，不产生乙醇(图EX4-3)，且生长不需要乙醇和乙酸盐。

实施例5：Pdc-正型乳酸克鲁维酵母中的异丁醇产生

这个实施例显示在属于酵母属进化枝、Crabtree-阴性、前-WGD酵母的乳酸克鲁维酵母成员中产生异丁醇。

在基于乳酸克鲁维酵母载体的表达系统中克隆了异丁醇产生途径：包含TEF1启动子的SacI-MluI片段。将乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)alsS和部分CYC1终止子序列克隆入乳酸克鲁维酵母表达质粒pGV1430的相同位点(图EX5-2)，以产生pGV1472(图EX5-4，SEQ ID NO.5-1)。将包含TEF1启动子、大肠杆菌ilvD、TDH3启动子、大肠杆菌ilvC和部分CYC1终止子的SacI-MluI片段克隆入乳酸克鲁维酵母表达质粒ρGV1429的相同位点(图EX5-1)，以产生pGV1473(图EX5-5，SEQ ID NO.5.2)。将包含TEF1启动子、乳酸乳球菌kivD、TDH3启动子和酿酒酵母ADH7.ScAdh7的BssHII-NotI片段克隆入乳酸克鲁维酵母表达质粒pGV1431(图EX5-3)，以获得pGV1475(图EX5-6，SEQ ID NO.5.3)。

用上述质粒pGV1472、pGV1473和pGV1475转化乳酸克鲁维酵母菌株GEVO1287(表EX5-1)以表达异丁醇途径。作为对照，将乳酸克鲁维酵母GEVO1287也用空载体pGV1430、PGV1429和pGV1431转化(表EX5-1)。

表EX5-1：乳酸克鲁维酵母克隆表达异丁醇途径

使转化的细胞过夜生长并转移至用20mL SC-WLU培养基的100mL发酵瓶中。在24和48小时取2mL样品用于GC分析。在每个时间点，在取出样品用于GC分析后加入2mL的20％葡萄糖。在48小时结束发酵。将GC样品按上述处理。结果显示在表EX5-2中。在用异丁醇途径转化的乳酸克鲁维酵母中产生了高达0.25g/L的异丁醇，而没有该途径的对照菌株在48小时内仅产生了0.022g/L。

表EX5-2：乳酸克鲁维酵母发酵作用的结果

为了测定异丁醇滴度是否可以通过使用丰富的复合培养基而增加，如上所述用iB 165(仅含载体的对照)和iB 173用YPD代替SC-WLU培养基进行发酵。此外，发酵也在250mL螺旋盖瓶(微需氧条件)和125mL金属盖瓶(有氧条件)中进行。在24、48和72小时取样，并将获得的异丁醇水平显示在表EX5-3中。

表EX5-3：使用YPD的乳酸克鲁维酵母发酵的结果

实施例6：Pdc-正性酿酒酵母中的异丁醇产生

这个实施例显示在属于酵母属狭义类群、酵母属进化枝、Crabtree-阳性、后-WGD酵母的酿酒酵母成员中产生异丁醇。

构建携带异丁醇产生途径的多种质粒以在酿酒酵母的Pdc-正性变体GEVO1187中表达这种代谢途径。质粒pGV1254(图EX6-1；SEQ ID NO.6.6)、pGV1295(图EX6-2；SEQ ID NO.6.7)、pGV1390(图EX6-3；SEQ ID NO.6.8)和pGV1438(图EX6-4；SEQ ID NO.6.9)是高拷贝酿酒酵母质粒，其共同表达异丁醇途径中的五种基因(表EX6-1)。通过将包含乳酸乳球菌alsS的SalI-BamHI片段(SEQ ID NO.6.1)克隆到高拷贝酿酒酵母表达质粒pGV1387中产生pGV1390，其中乳酸乳球菌alsS会在CUP1启动子下表达。通过将包含大肠杆菌ilvC的SalI-BamHl片段(SEQ ID NO.6.2)克隆到高拷贝酿酒酵母表达质粒pGV1266中产生pGV1295，其中大肠杆菌ilvC会用TDH3启动子表达。通过将包含包含大肠杆菌ilvD的SalI-BamHl片段(SEQ ID NO.6.3)克隆到高拷贝酿酒酵母表达质粒pGV1267中产生pGV1438，其中大肠杆菌ilvD会用TDH3启动子表达。通过将包含TDH3启动子和来自pGV1241的酿酒酵母ADH2的EcoRI(通过Klenow聚合酶处理填补)-XhoI片段克隆到pGV1186的BamHI(通过Klenow填补)和XhoI位点产生pGV1254。通过将包含乳酸球菌kivD的SalI-BamHl片段(SEQ ID NO.6.4)克隆到高拷贝酿酒酵母表达质粒pGV1102中产生pGV1186，其中乳酸乳球菌kivD会用TEF1启动子表达。通过将包含酿酒酵母ADH2的SalI-BamHl片段(SEQ ID NO.6.5)克隆到高拷贝酿酒酵母表达质粒pGV1106中产生pGV1241，其中酿酒酵母ADH2会用TDH3启动子表达。

用表EX6-1中所示质粒转化GEVO1187。作为缺陷性异丁醇途径对照，用pGV1056(图EX8-1，空载体对照)代替pGV1390转化细胞。将转化体铺板到适当的选择平板上。分离来自转化的单菌落并通过发酵检测异丁醇的产生。

表：EX6-1

将细胞培养过夜，并如通用方法中所述进行厌氧分批发酵。将SC-HWUL用作培养基。在24、48和72小时分别取出2mL样品用于GC。在各时间点，向培养物加入2mL 40％葡萄糖溶液。发酵在72小时之后结束。如前述处理和分析样品。结果示于表EX6-2中。如所示，在用包含异丁醇途径的质粒转化的GEVO1187中产生异丁醇。

表EX6-2：72小时后酿酒酵母GEVO1187中的异丁醇产生

这个实施例显示在属于酵母属进化枝、Crabtree-阴性、前-WGD酵母的乳酸克鲁维酵母的Pdc-负型成员中异丁醇的产生。

质粒PGV1590、ρGV1726、pGV1727的说明：pGV1590(图EX7-1，SEQ ID No.7.1)是用于表达乳酸乳球菌kivD(在TEF1启动子下)和酿酒酵母ADH7(在TDH3启动子下)的乳酸克鲁维酵母表达质粒。这种质粒也携带马克思克鲁维酵母URA3基因和允许在乳酸克鲁维酵母中DNA复制的1.6微米复制起点。pGV1726(图EX7-2，SEQ ID No.7.2)是携带TRP1标记并使用CUP1启动子表达枯草芽孢杆菌alsS的酵母整合质粒。pGV1727(图EX7-3，SEQ ID No.7.3)是携带LEU2标记并在TEF1启动子下表达大肠杆菌ilvD和在TDH3启动子下表达大肠杆菌ilvC的酵母整合质粒。pGV1726或pGV1727均不携带酵母复制起点。

GEVO1829，一种整合了途径的乳酸克鲁维酵母的构建：通过途径基因的随机整合将异丁醇途径引入到Pdc-负型乳酸克鲁维酵母菌株GEVO1742中。用包含乳酸乳球菌kivd和酿酒酵母ADH7但不具有酵母复制起点的pGV1590的Acc65I-NgoMIV片段转化GEV01742以产生GEVO1794。通过分别使用引物组1334+1335和1338+1339的菌落PCR确认了乳酸乳球菌kivd和酿酒酵母ADH7二者的存在。将GEVO1794用pGV1727，一种携带大肠杆菌ilvD(在TEF1启动子下)和大肠杆菌ilvC(在TDH3启动子下)的酵母整合质粒转化，其已经通过用BcgI消化来线性化。所得菌株GEVO1818通过分别针对大肠杆菌ilvD和大肠杆菌ilvC的存在使用引物组1330+1331和1325+1328的菌落PCR得到确认。然后将GEVO1818用pGV1726，一种携带枯草芽孢杆菌alsS(在CUP1启动子下)的酵母整合质粒转化，其已经通过用Ahdl消化来线性化，以产生GEVO1829。通过使用引物1321+1324的菌落PCR确认了枯草芽孢杆菌alsS的存在。

进行有氧发酵以测试携带异丁醇途径的Pdc-负型菌株GEVO1829的异丁醇产生。不具有异丁醇途径的Pdc-负型菌株GEV01742被用作对照。将这些菌株在YPD中，在30℃、250rpm下培养过夜，然后稀释入125ml烧瓶中的20mL新鲜YPD中，并在30℃、250rpm下培养。在24和48小时取出2mL样品，将细胞在14,000×g下离心5分钟且通过GC分析上清中的异丁醇。此外，通过LC分析葡萄糖浓度。结果示于表EX7-1中。在48小时，GEVO1742菌株的OD超过8.5而GEVO1829的OD小于5。GEVO1829消耗了约15.7g/L的葡萄糖而GEVO1742消耗了约7.7g/L葡萄糖。GEVO1829产生了0.17g/L异丁醇而GEVO1742没有产生任何在培养基本底之上的异丁醇。

表EX7-1：乳酸克鲁维酵母发酵结果

实施例8A：在Pdc-负型酿酒酵母GEVO1581中的异丁醇产生

这个实施例显示在酵母属狭义类群、酵母属进化枝酵母、Crabtree-阳性酵母、后-WGD酵母、酿酒酵母的Pdc-负型成员中的产生异丁醇。

将缺失了编码PDC活性的三种基因的菌株GEVO1581 (pdc1Δ，pdc5Δ和pdc6Δ)用于产生异丁醇。异丁醇途径的酶由克隆入三种质粒的基因编码。pGV1103(图EX8-4，SEQ ID NO 8.4)、pGV1104(图EX8-5，SEQ ID NO 8.5)和pGV1106(图EX8-6，SEQ ID NO 8.6)是分别携带URA3、HIS3和TRP1作为标记基因的高拷贝空表达载体。用CUP1启动子表达的枯草芽孢杆菌alsS基因在低拷贝CEN质粒pGV1673(图EX8-10，SEQ ID NO 8.10)或高拷贝质粒pGV1649(图EX8-7，SEQ ID NO 8.7)上编码。这两种质粒都用TRP1作为标记基因。大肠杆菌ilvD(用TEF1启动子表达)和大肠杆菌ilvC(用TDH3启动子表达)在高拷贝质粒pGV1677(图EX8-11，SEQ ID NO.8.11)不表达(express off)。这种质粒利用HIS3作为标记基因。乳酸乳球菌kivd(用TEF1启动子表达)和酿酒酵母ADH7(用TDH3启动子表达)在高拷贝质粒pGV1664(图EX8-8，SEQ ID NO 8.8)不表达。这种质粒利用URA3作为标记基因。将用于重建异丁醇途径的这些质粒的组合(表EX8-1)通过乙酸锂(在通用方法中描述)转化引入GEVO1581。

表EX8-1：转化入GEVO1581的质粒

使用根据表EX8-1用质粒转化的GEV01581进行发酵实验以测定产生的异丁醇量(升)和异丁醇占消耗的葡萄糖的百分比(产率)。

用GEVO1581转化体的发酵：用在3mL成分确定的(SC-乙醇)培养基中生长的细胞，用GEVO1581的转化体(3个独立的菌落/转化组)接种20mL的培养物至OD₆₀₀约为0.1。将培养物在125mL金属盖瓶中在30℃，250RPM下温育直到它们的OD₆₀₀达到约1。加入葡萄糖至终浓度为5％且从每个样品中移出2mL等分试样(T＝0样品)。测量每个样品的OD₆₀₀，将每个样品中的细胞通过离心(14,000×g，5min)沉淀，且将来自每个样本的上清储存在-20℃。剩余的培养物在30℃，125 RPM下再温育48小时。24和48小时后取样(2mL)并如前述制备。解冻样品，并如通用方法所描述的进行制备。在发酵过程中对于每组质粒使用三个独立的转化体。48小时后消耗的葡萄糖量和产生的丙酮酸、甘油、乙醇和异丁醇的量列在表EX8A-2中。

表EX8A-2：作为三次重复的平均值显示的48小时时间点数据

再次使用在3mL成分确定的(SC-乙醇)培养基中生长的细胞，用GEVO1581的转化体接种20mL培养物至OD₆₀₀约为0.1。将培养物在125mL金属盖瓶中以30℃，250RPM温育直到它们的OD₆₀₀达到约1。使生物质沉淀并重悬在具有2％葡萄糖作为唯一碳源的20mL培养基中并从每个样品取出2mL等分试样(T＝0样品)。测量每个样品的OD₆₀₀并将每个样品储存在-20℃。剩余的培养物在30℃，125 RPM下再温育48小时。24和48小时后取样(2mL)并储存在-20℃。解冻样品，并按通用方法中所述制备。48小时后产生的乙醇和异丁醇的量列在表EX8A-3中。

表EX8A-3：在葡萄糖中发酵的48小时时间点数据，按三次重复的平均值显示

实施例8B：在Pdc-负型酿酒酵母GEVO1584中产生异丁醇

这个实施例显示酵母属狭义类群、酵母属进化枝、Crabtree-阳性酵母、WGD酵母、酿酒酵母的Pdc-负型成员中的异丁醇产生。

GEVO1581是二倍体菌株，因此，进行了Pdc-负型酵母与CEN.PK本底的二次回交，产生具有质粒增殖所需营养缺陷型标记的Pdc-负型二倍体菌株GEVO1584。

GEVO1584的转化：使用乙酸锂转化(通用方法中描述)将下列的质粒组合转化入GEVO1584(表EX8B-1)，接着在适当的基本培养基中选择。PGV1672(图EX8-9，SEQ ID NO 8.9)、pGV1056(图EX8-1，SEQ ID NO 8.1)和pGV1062(图EX8-2，SEQ ID NO 8.2)是携带TRP1、HIS3和URA3作为标记基因的空的低拷贝CEN表达载体。pGV1103(图EX8-4，SEQ ID NO 8.4)、pGV1104(图EX8-5，SEQ ID NO 8.5)和pGV1102(图EX8-3，SEQ ID NO 8.3)是分别携带URA3、HIS3和TRP1作为标记基因的空的高拷贝表达载体。异丁醇途径在低拷贝CEN质粒pGV1673(图EX8-10，SEQ ID NO 8.10)、pGV1679(图EX8-12，SEQ ID NO 8.12)和pGV1683(图EX8-13，SEQ ID NO 8.13)不表达。pGV1673携带在CUP1启动子之下的枯草芽孢杆菌alsS并利用TRP1标记基因。pGV1679携带分别用TEF1和TDH3启动子表达的大肠杆菌ilvD和大肠杆菌ilvC基因，并利用HIS3标记基因。pGV1683携带分别用TEF1和TDH3启动子表达的乳酸乳球菌kivd和酿酒酵母ADH7基因并利用URA3标记基因。异丁醇途径在高拷贝质粒pGV1649(图EX8-7，SEQ ID NO 8.7)、pGV1677(图EX8-11，SEQ ID NO 8.11)和pGV1664(图EX8-8，SEQ ID NO 8.8)不表达。pGV1649携带在CUP1启动子之下的枯草芽孢杆菌alsS并利用TRP1标记基因。pGV1677携带分别用TEF1和TDH3启动子表达的大肠杆菌ilvD和大肠杆菌ilvC基因，并利用HIS3标记基因。pGV1664携带分别用TEF1和TDH3启动子表达的乳糖乳球菌kivd和酿酒酵母ADH7基因，并利用URA3标记基因。

表EX8B-1

用GEVO1584转化体的发酵：用在3mL包含乙醇的确定成分的(SC)培养基(SC+乙醇-HWU)中生长的细胞，用GEVO1584的转化体接种200mL培养物，并在500mL摇瓶中的SC+乙醇-HWU中在30℃，250 RPM下温育72小时。72小时之后测量OD₆₀₀值在1.4至3.5的范围内。将培养物以1∶10稀释至新鲜250mL SC+乙醇-HWU培养基中并在30℃，250 RPM下在500mL摇瓶中温育24小时。通过以3000 RPM离心3分钟收集细胞并重悬在125mL金属盖瓶中的20mL SC+葡萄糖-HWU培养基中。向每个培养物加入250μL100％乙醇以使乙醇浓度达到1％。移出2mL等分试样，用100μL测量OD₆₀₀，并将剩余的等分试样离心成团块细胞(14,000×g，5分钟)且将上清储存在-20℃。将培养物在125rpm，30℃下温育。在24和48小时温育之后从每个培养物移出2mL等分试样，并如上测量OD₆₀₀值(参见表3，t＝24和t＝48)且如上所述离心并储存样品。解冻样品，且如通用方法中描述经由GC和HPLC制备并分析样品。结果显示在表EX8B-2中。

表EX8B-2：48小时时间点数据按三次重复的平均值显示

48小时温育后，所有Pdc-负型酵母(GEVO1584)消耗了约10g/L葡萄糖和小于2g/L的乙醇(图1，A和B)。除了那些在2μ质粒上携带异丁醇途径的菌株(＜0.5g/L)之外，所有菌株积累了-1.5g/L丙酮酸。丙酮酸的积累和酵母不能从葡萄糖产生乙醇确认了所有都缺乏PDC活性。48小时之后，在2μ质粒上编码异丁醇途径的Pdc-负型酵母以消耗葡萄糖的6.36％的理论产率产生了0.248±0.032g/L异丁醇(表EX8B-2)。CEN质粒异丁醇途径菌株以10.27％的产率产生了0.392±0.087g/L异丁醇(表EX8B-2)。异丁醇滴度显然在等效载体对照菌株之上。

Claims

1.产生异丁醇的方法，该方法包括：

提供包含产生异丁醇的代谢途径的重组微生物，所述微生物经选择从而以至少5％的理论产率从碳源产生异丁醇；

在包含提供碳源的原料的培养基中培养所述微生物，直至产生可回收量的异丁醇；和

回收异丁醇。

2.根据权利要求1的方法，其中所述微生物经选择从而以大于约10％的理论产率产生异丁醇。

3.根据权利要求1的方法，其中所述微生物经选择从而以大于约20％的理论产率产生异丁醇。

4.根据权利要求1的方法，其中所述微生物经选择从而以大于约50％的理论产率产生异丁醇。

5.根据权利要求1的方法，其中所述重组微生物经工程改造从而与亲本微生物相比具有降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。

6.根据权利要求5的方法，其中所述重组微生物在至少一种丙酮酸脱羧酶(PDC)基因中包含突变，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。

7.根据权利要求5的方法，其中所述重组微生物包含部分缺失的丙酮酸脱羧酶(PDC)基因，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。

8.根据权利要求5的方法，其中所述重组微生物完全缺失丙酮酸脱羧酶(PDC)基因，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。

9.根据权利要求5的方法，其中所述重组微生物包含对与至少一种丙酮酸脱羧酶(PDC)基因相关的调节区的修饰，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。

10.根据权利要求5的方法，其中所述重组微生物包含对转录调节子的修饰，其导致丙酮酸脱羧酶基因转录降低。

11.根据权利要求5的方法，其中所述重组微生物在所有丙酮酸脱羧酶(PDC)基因中包含突变，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。

12.根据权利要求5的方法，其中所述重组微生物经进一步工程改造从而表达将丙酮酸转化为异丁醇的异源代谢途径。

13.根据权利要求5的方法，其中所述重组微生物经进一步工程改造从而提高将丙酮酸转化为异丁醇的天然代谢途径的活性。

14.根据权利要求5的方法，其中所述重组微生物经进一步工程改造从而表达将丙酮酸转化为异丁醇的代谢途径，其中所述微生物包含至少一种由异源基因编码的酶和至少一种由天然基因编码的酶。

15.根据权利要求5的方法，其中所述微生物经选择以包含将丙酮酸转化为异丁醇的天然代谢途径。

16.根据权利要求1的方法，其中所述微生物为酵母进化枝(Saccharomyces clade)的酵母微生物。

17.根据权利要求16的方法，其中所述酵母微生物经选择从而以高于约10％的理论产率产生异丁醇。

18.根据权利要求16的方法，其中所述酵母微生物经选择从而以高于约20％的理论产率产生异丁醇。

19.根据权利要求16的方法，其中所述重组酵母微生物经选择从而以高于约50％的理论产率产生异丁醇。

20.根据权利要求16的方法，其中所述重组酵母微生物经工程改造从而与亲本生物体相比具有降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。

21.根据权利要求20的方法，其中所述重组酵母微生物在至少一种丙酮酸脱羧酶(PDC)基因中包含突变，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。

22.根据权利要求20的方法，其中所述重组酵母微生物包含部分缺失的丙酮酸脱羧酶基因，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。

23.根据权利要求20的方法，其中所述重组酵母微生物完全缺失丙酮酸脱羧酶基因，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。

24.根据权利要求20的方法，其中所述重组酵母微生物包含对与至少一种丙酮酸脱羧酶基因相关的调节区的修饰，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。

25.根据权利要求20的方法，其中所述重组酵母微生物包含对转录调节子的修饰，其导致丙酮酸脱羧酶基因转录降低。

26.根据权利要求20的方法，其中所述重组酵母微生物在所有丙酮酸脱羧酶(PDC)基因中包含突变，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。

27.根据权利要求20的方法，其中所述重组酵母微生物经进一步工程改造从而表达将丙酮酸转化为异丁醇的异源代谢途径。

28.根据权利要求20的方法，其中所述重组酵母微生物经进一步工程改造从而提高将丙酮酸转化为异丁醇的天然代谢途径的活性。

29.根据权利要求20的方法，其中所述重组酵母微生物经进一步工程改造从而表达将丙酮酸转化为异丁醇的代谢途径，其中所述途径包含至少一种由异源基因编码的酶和至少一种由天然基因编码的酶。

30.根据权利要求20的方法，其中所述重组酵母微生物经选择从而包含将丙酮酸转化为异丁醇的天然代谢途径。

31..根据权利要求20的方法，其中所述重组酵母微生物以基本上等同于亲本微生物生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。

32.根据权利要求1的方法，其中所述微生物为酵母属(Saccharomyces)狭义酵母微生物。

33.根据权利要求32的方法，其中所述酵母属狭义酵母微生物选自如下的种之一：酿酒酵母(S.cerevisiae)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、库德里阿兹威酵母(S.kudriavzevii)、S.mikatae、贝酵母(S.bayanus)、葡萄汁酵母(S.uvarum)、S.carocanis或其杂种。

34.根据权利要求32的方法，其中所述微生物经选择从而以大于约10％的理论产率产生异丁醇。

35.根据权利要求32的方法，其中所述微生物经选择从而以大于约20％的理论产率产生异丁醇。

36.根据权利要求32的方法，其中所述微生物经选择从而以大于约50％的产率产生异丁醇。

37.根据权利要求32的方法，其中所述重组酵母微生物具有降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。

38.根据权利要求37的方法，其中所述重组酵母微生物在至少一种丙酮酸脱羧酶(PDC)基因中包含突变，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。

39.根据权利要求37的方法，其中所述重组酵母微生物在所有丙酮酸脱羧酶(PDC)基因中包含突变，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。

40.根据权利要求37的方法，其中所述重组酵母微生物包含部分缺失的丙酮酸脱羧酶(PDC)基因，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。

41.根据权利要求37的方法，其中所述重组酵母微生物完全缺失丙酮酸脱羧酶基因，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。

42.根据权利要求37的方法，其中所述重组酵母微生物包含对与至少一种丙酮酸脱羧酶基因相关的调节区的修饰，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。

43.根据权利要求37的方法，其中所述重组酵母微生物包含对转录调节子的修饰，其导致丙酮酸脱羧酶基因转录的降低。

44.根据权利要求37的方法，其中所述重组酵母微生物经进一步工程改造从而表达将丙酮酸转化为异丁醇的异源代谢途径。

45.根据权利要求37的方法，其中所述重组酵母微生物经进一步工程改造从而提高将丙酮酸转化为异丁醇的天然代谢途径的活性。

46.根据权利要求37的方法，其中所述重组酵母微生物经进一步工程改造从而表达将丙酮酸转化为异丁醇的代谢途径，其中所述代谢途径包含至少一种由异源基因编码的酶和至少一种由天然基因编码的酶。

47.根据权利要求37的方法，其中所述重组酵母微生物经选择从而包含将丙酮酸转化为异丁醇的天然代谢途径。

48.根据权利要求37的方法，其中所述重组酵母微生物以基本上等同于亲本微生物生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。

49.根据权利要求1的方法，其中所述酵母微生物为Crabtree-阳性酵母微生物。

50.根据权利要求49的方法，其中所述Crabtree-阳性酵母微生物选自如下的属之一：酵母属、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、毕赤酵母属(Pichia)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。

51.根据权利要求49的方法，其中所述Crabtree-阳性酵母微生物选自酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)、Saccharomyces castelli、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、拜耳接合酵母(Z.bailli)、鲁氏接合酵母(Z.rouxii)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastorius)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)或葡萄汁酵母。

52.根据权利要求49的方法，其中所述酵母微生物经选择从而以大于约10％的理论产率产生异丁醇。

53.根据权利要求45的方法，其中所述酵母微生物经选择从而以大于约20％的理论产率产生异丁醇。

54.根据权利要求49的方法，其中所述酵母微生物经选择从而以大于约50％的理论产率产生异丁醇。

55.根据权利要求49的方法，其中所述酵母微生物经工程改造而从与亲本微生物相比具有降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。

56.根据权利要求55的方法，其中所述重组酵母微生物在至少一种丙酮酸脱羧酶(PDC)基因中包含突变。

57.根据权利要求55的方法，其中所述重组酵母微生物在所有丙酮酸脱羧酶(PDC)基因中包含突变，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。

58.根据权利要求55的方法，其中所述重组酵母微生物包含部分缺失的丙酮酸脱羧酶基因，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。

59.根据权利要求55的方法，其中所述重组酵母微生物完全缺失丙酮酸脱羧酶基因，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。

60.根据权利要求55的方法，其中所述重组酵母微生物包含对与至少一种丙酮酸脱羧酶基因相关的调节区的修饰，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。

61.根据权利要求55的方法，其中所述重组微生物包含对转录调节子的修饰，其导致丙酮酸脱羧酶基因转录降低。

62.根据权利要求55的方法，其中所述重组酵母微生物经工程改造从而表达将丙酮酸转化为异丁醇的异源代谢途径。

63.根据权利要求55的方法，其中所述重组酵母微生物经工程改造从而提高将丙酮酸转化为异丁醇的天然代谢途径的活性。

64.根据权利要求55的方法，其中所述重组酵母微生物经工程改造从而表达将丙酮酸转化为异丁醇的代谢途径，其中所述代谢途径包含至少一种由异源基因编码的酶和至少一种由天然基因编码的酶。

65.根据权利要求55的方法，其中所述重组酵母微生物以基本上等同于亲本微生物生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。

66.根据权利要求55的方法，其中所述重组微生物经选择从而包含将丙酮酸转化为异丁醇的天然代谢途径。

67.根据权利要求1的方法，其中所述微生物为后-WGD(全基因组倍增)酵母。

68.根据权利要求67的方法，其中所述后-WGD酵母选自酵母属或假丝酵母属之一。

69.根据权利要求67的方法，其中所述后-WGD酵母选自酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母、Saccharomyces castelli和光滑假丝酵母。

70.根据权利要求67的方法，其中所述酵母微生物经选择从而以大于约10％的理论产率产生异丁醇。

71.根据权利要求7的方法，其中所述酵母微生物经选择从而以大于约20％的理论产率产生异丁醇。

72.根据权利要求67的方法，其中所述酵母微生物经选择从而以大于约50％的理论产率产生异丁醇。

73.根据权利要求67的方法，其中所述酵母微生物经工程改造从而与亲本微生物相比具有降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。

74.根据权利要求73的方法，其中所述重组酵母微生物在至少一种丙酮酸脱羧酶(PDC)基因中包含突变，其导致所述基因的丙酮酸脱羧酶活性降低。

75.根据权利要求73的方法，其中所述重组酵母微生物在所有丙酮酸脱羧酶(PDC)基因中包含突变，其导致所述基因的丙酮酸脱羧酶活性降低。

76.根据权利要求73的方法，其中所述重组酵母微生物包含部分缺失的丙酮酸脱羧酶基因，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。

77.根据权利要求73的方法，其中所述重组酵母微生物完全缺失丙酮酸脱羧酶基因，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。

78.根据权利要求73的方法，其中所述重组微生物包含对与至少一种丙酮酸脱羧酶基因相关的调节区的修饰，其导致由所述基因编码的多肽的丙酮酸脱羧酶活性降低。

79.根据权利要求73的方法，其中所述重组微生物包含对转录调节子的修饰，其导致丙酮酸脱羧酶基因转录的降低。

80.根据权利要求73的方法，其中所述重组酵母微生物经工程改造从而表达将丙酮酸转化为异丁醇的异源代谢途径。

81.根据权利要求73的方法，其中所述重组酵母微生物经工程改造从而提高将丙酮酸转化为异丁醇的天然代谢途径的活性。

82.根据权利要求73的方法，其中所述重组酵母微生物经工程改造从而表达将丙酮酸转化为异丁醇的代谢途径，其中所述代谢途径包含至少一种由异源基因编码的酶和至少一种由天然基因编码的酶。

83.根据权利要求73的方法，其中所述重组酵母微生物经选择从而包含将丙酮酸转化为异丁醇的天然代谢途径。

84.根据权利要求73的方法，其中所述重组酵母微生物以基本上等同于亲本微生物生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。

85.产生异丁醇的方法，该方法包括：

提供重组微生物，其包含：

a)产生异丁醇的代谢途径，所述微生物经选择从而从碳源产生异丁醇；

b)与亲本微生物相比降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性；

回收异丁醇。

86.根据权利要求85的方法，其中所述微生物为酵母进化枝的酵母。

87.根据权利要求86的方法，其中所述微生物经工程改造从而以基本上等同于亲本微生物生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。

88.根据权利要求85的方法，其中所述微生物为酵母属狭义酵母。

89.根据权利要求88的方法，其中所述酵母属狭义酵母微生物选自：酿酒酵母、酿酒酵母、库德里阿兹威酵母、S.mikatae、贝酵母、葡萄汁酵母、S.carocanis或其杂种。

90.根据权利要求88的方法，其中所述微生物经工程改造从而以基本上等同于亲本微生物生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。

91.根据权利要求85的方法，其中所述微生物为Crabtree-阴性酵母微生物。

92.根据权利要求91的方法，其中所述Crabtree-阴性酵母微生物选自如下的属之一：克鲁维酵母属、毕赤酵母属、伊萨酵母属(Issatchenkia)、汉逊酵母属(Hansenula)或假丝酵母属。

93.根据权利要求85的方法，其中所述Crabtree-阴性酵母微生物选自乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、树干毕赤酵母属(Pichia stipitis)、东方伊萨酵母(I.orientalis)、罕见伊萨酵母(I.occidentalis)、菱形伊萨酵母(I.scutulata)、异常汉逊酵母(Hanenusula anomala)、产朊假丝酵母(Candida utilis)或Kluyveromyces waltii。

94.根据权利要求85的方法，其中所述酵母微生物为Crabtree-阳性酵母微生物。

95.根据权利要求94的方法，其中所述酵母微生物经工程改造从而以基本上等同于亲本微生物生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。

96.根据权利要求94的方法，其中所述Crabtree-阳性酵母微生物选自如下的属之一：酵母属、克鲁维酵母属、接合酵母属、德巴利酵母属、毕赤酵母属或裂殖酵母属。

97.根据权利要求94的方法，其中所述Crabtree-阳性酵母微生物选自酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母、Saccharomyces castelli、克鲁弗酵母、耐热克鲁维酵母、光滑假丝酵母、拜耳接合酵母、鲁氏接合酵母、汉逊德巴利酵母、巴斯德毕赤酵母、粟酒裂殖酵母或葡萄汁酵母。

98.根据权利要求85的方法，其中所述微生物为后-WGD(全基因组倍增)酵母。

99.根据权利要求98的方法，其中后-WGD酵母选自酵母属或假丝酵母属之一。

100.根据权利要求98的方法，其中所述后-WGD酵母选自酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母、Saccharomyces castelli和光滑假丝酵母。

101.根据权利要求98的方法，其中所述酵母微生物经工程改造从而以基本上等同于亲本微生物生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。

102.根据权利要求85的方法，其中所述微生物为前-WGD(全基因组倍增)酵母。

103.根据权利要求102的方法，其中所述前-WGD酵母选自如下的属之一：酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、伊萨酵母属、西洋蓍霉属(Yarrowia)或裂殖酵母属。

104.根据权利要求102的方法，其中所述前-WGD酵母选自克鲁弗酵母、耐热克鲁维酵母、马克思克鲁维酵母、Kluyveromyces waltii、乳酸克鲁维酵母、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、巴斯德毕赤酵母、异常毕赤酵母属、树干毕赤酵母属、汉逊德巴利酵母、异常汉逊酵母、东方伊萨酵母、罕见伊萨酵母、菱形伊萨酵母、解脂西洋蓍霉和粟酒裂殖酵母。

105.根据权利要求85的方法，其中所述微生物为非发酵酵母微生物。

106.根据权利要求105的方法，其中所述非发酵酵母微生物选自如下的属之一：丝孢酵母属(Tricosporon)、红酵母属(Rhodotorula)或Myxozyma。

107.根据权利要求105的方法，其中所述非发酵酵母微生物选自以下的茁牙丝孢酵母(Tricosporon pullulans)、嗜木红酵母(Rhodotorula lignophila)或Myxozyma vanderwaltii、乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)、Debaromyces carsonii或Pichia castillae。

108.重组微生物，其包含：

b)与亲本微生物相比降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。

109.根据权利要求108的重组微生物，其中所述微生物为Crabtree-阴性酵母微生物。

110.根据权利要求109的重组微生物，其中所述Crabtree-阴性酵母微生物选自如下的属之一：克鲁维酵母属、毕赤酵母属、伊萨酵母属、汉逊酵母属或假丝酵母属。

111.根据权利要求109的重组微生物，其中所述Crabtree-阴性酵母微生物选自乳酸克鲁维酵母、马克思克鲁维酵母、异常毕赤酵母、树干毕赤酵母、东方伊萨酵母、罕见伊萨酵母、菱形伊萨酵母、异常汉逊酵母、产朊假丝酵母菌或Kluyveromyces waltii。

112.根据权利要求108的重组微生物，其中所述微生物为酵母进化枝的酵母。

113.根据权利要求112的重组微生物，其中所述酵母微生物经工程改造从而使其以基本上等同于亲本微生物生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。

114.根据权利要求108的重组微生物，其中所述微生物为酵母属狭义酵母。

115.根据权利要求114的重组微生物，其中所述酵母属狭义酵母微生物选自酿酒酵母、酿酒酵母、库德里阿兹威酵母、S.mikatae、贝酵母、葡萄汁酵母、S.carocanis或这些种的杂种。

116.根据权利要求114的方法，其中所述酵母微生物经工程改造从而以基本上等同于亲本微生物生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。

117.根据权利要求108的重组微生物，其中所述微生物为Crabtree-阳性酵母微生物。

118.根据权利要求117的重组微生物，其中所述微生物经工程改造从而使其以基本上等同于亲本微生物生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。

119.根据权利要求117的重组微生物，其中所述Crabtree-阳性酵母微生物选自如下属之一：酵母属、克鲁维酵母属、接合酵母属、德巴利酵母属、毕赤酵母属或裂殖酵母属。

120.根据权利要求117的重组微生物，其中所述Crabtree-阳性酵母微生物选自酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母、Saccharomyces castelli、克鲁弗酵母、耐热克鲁维酵母、光滑假丝酵母、拜耳接合酵母、鲁氏接合酵母、汉逊德巴利酵母、巴斯德毕赤酵母、粟酒裂殖酵母或葡萄汁酵母。

121.根据权利要求108的重组微生物，其中所述微生物为后-WGD(全基因组倍增)酵母。

122.根据权利要求121的重组微生物，其中所述酵母微生物经工程改造从而使其以基本上等同于亲本微生物生长速率的生长速率不依赖C2-化合物在葡萄糖上生长而PDC活性不改变。

123.根据权利要求121的重组微生物，其中所述后-WGD(全基因组倍增)酵母选自酵母属或假丝酵母属之一。

124.根据权利要求121的重组微生物，其中所述后-WGD酵母选自酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母、Saccharomyces castelli和光滑假丝酵母。

125.根据权利要求108的重组微生物，其中所述微生物为前-WGD(全基因组倍增)酵母。

126.根据权利要求125的重组微生物，其中所述前-WGD酵母选自如下的属之一：酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、伊萨酵母属、西洋蓍霉属或裂殖酵母属。

127.根据权利要求125的重组微生物，其中所述前-WGD酵母选自克鲁弗酵母、耐热克鲁维酵母、马克思克鲁维酵母、Kluyveromyces waltii、乳酸克鲁维酵母、热带假丝酵母、巴斯德毕赤酵母、异常毕赤酵母、树干毕赤酵母、汉逊德巴利酵母、异常汉逊酵母、东方伊索酵母、罕见伊萨酵母、菱形伊萨酵母、解酯西洋蓍霉和粟酒裂殖酵母。

128.根据权利要求108的重组微生物，其中所述微生物为非发酵酵母微生物。

129.根据权利要求128的重组微生物，其中所述非发酵酵母微生物选自如下的属之一：丝孢酵母属、红酵母属或Myxozyma。

130.根据权利要求128的重组微生物，其中所述非发酵酵母微生物选自茁牙丝孢酵母、嗜木红酵母(Rhodotorula lignophila)或Myxozyma vanderwaltii、乙醇假丝酵母、Debaromyces carsonii或Pichia castillae。