CN110106098A

CN110106098A - 一种高产丙酮酸的酿酒酵母工程菌株及其发酵方法

Info

Publication number: CN110106098A
Application number: CN201910358778.2A
Authority: CN
Inventors: 李亿; 王青艳; 秦艳; 朱婧; 梁戈; 彭龙云; 潘丽霞
Original assignee: Guangxi Academy of Sciences
Current assignee: Guangxi Academy of Sciences
Priority date: 2019-04-30
Filing date: 2019-04-30
Publication date: 2019-08-09
Anticipated expiration: 2039-04-30
Also published as: CN110106098B

Abstract

本发明公开了一种高产丙酮酸的酿酒酵母基因工程菌株，菌株分类命名为Saccharomyces cerevisiae XY‑156A，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CCTCC M 2019129。本发明所述的酿酒酵母基因工程菌株XY‑156A，能够利用大量葡萄糖发酵生产丙酮酸，在分批补料发酵76h之后，发酵液中的丙酮酸浓度可达105g/L，丙酮酸得率为0.5g/g葡萄糖，在丙酮酸发酵生产中具有潜在应用价值。

Description

一种高产丙酮酸的酿酒酵母工程菌株及其发酵方法

技术领域

本发明涉及一种高产丙酮酸的酿酒酵母工程菌株及其发酵方法，属于发酵工程技术领域。

背景技术

丙酮酸(pyruvic acid)，一种浅黄色至黄色的透明液体，广泛存在于人体、动植物及微生体内，是细胞代谢过程中的重要中间产物；丙酮酸及其盐作为一类重要的平台化合物，在化工、制药、农用化学品、食品保健等领域具有广泛应用。例如，丙酮酸及其盐是合成L-酪氨酸、L-色氨酸、维生素B6、N-乙酰-D-神经氨酸、(R)-乙酰基苯甲醇等重要化合物的前体物质；此外，在抗疲劳、增加耐力、降血脂、减肥等人类健康保健方面具有潜在应用。

目前，工业化生产丙酮酸主要采用化学合成法，主要是通过酒石酸和焦硫酸钾混合，酒石酸发生脱水脱羧而生成丙酮酸，该方法操作简单，存在成本较高，产率低、污染环境等明显缺点；与之相比，生物发酵法因具有原料来源广泛、成本低、反应条件温和、产生的丙酮酸具有被生物膜识别的左旋结构光学活性等特点，因而更具有市场竞争优势。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)又称面包酵母或出芽酵母，被美国食品药物管理局 (FDA)认证为GRAS(Generally RegardedAs Safe)微生物，具有营养需求简单、产品分离工艺成本低廉、能耐受低pH条件、对产物和底物的耐受性强、发酵产品具有安全性等优点；并且S.cerevisiae作为真核模式微生物，遗传信息丰富，代谢改造操作简便，因而被认为是发酵生产丙酮酸的潜在最适菌株。

由于野生型S.cerevisiae在长期自然进化过程中形成了偏好性产乙醇的机制，自身有机酸 (如丙酮酸、苹果酸等)积累量很低。而对于目标产物(丙酮酸)而言，乙醇的产生势必会造成大量碳代谢流量和还原力浪费，丙酮酸不能大量积累；因此，乙醇合成途径的弱化或阻断是实现S.cerevisiae大量积累丙酮酸的关键。对乙醇合成途径进行弱化或阻断的策略主要包括：(1)缺失乙醇脱氢酶；(2)缺失丙酮酸脱羧酶；(3)同时弱化乙醇脱氢酶和丙酮酸。乙醇脱氢酶缺失可完全消除乙醇的产生，但会造成毒性物质乙醛的大量堆积，对细胞产生严重的毒害作用。丙酮酸脱羧酶是乙醇代谢路径上游的限速酶，该酶受三个结构基因(pdc1、pdc5、 pdc6)表达调控。其中，pdc1和pdc5在葡萄糖为碳源的培养基中表现活性，pdc6则在非葡萄糖碳源如乙醇、乳糖等中表现活性。同时敲除pdc1、pdc5和pdc6，获得的工程菌株则无法在葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长，但通过对菌株进行驯化和筛选，可获得能利用葡萄糖并大量积累丙酮酸的菌株。近年来，有关改造酿酒酵母积累丙酮酸的研究取得了一定的成果，如，Yuma Ito等敲除了酿酒酵母的adh1、adh2、adh3、adh4、adh5得到工程菌株S149，该菌株乙醇产量有了明显降低，但仍有乙醇产生，而且由于乙醛的大量堆积，菌株生长缓慢。天津科技大学的邓旭衡以Saccharomyces cerevisiae Y2为出发菌株，通过敲除pdc1和pdc5最终获得工程菌株S.cerevisiae Y2-15，并在后续发酵实验中利用该菌株以80g/L葡萄糖为底物发酵96h，最终获得的丙酮酸浓度为24.85g/L，产率为0.26g/(L.h)。Wang等以丙酮酸脱羧酶缺陷菌株pdc-S.cerevisiae BY5419为出发菌株，通过定向进化策略筛选到一株能够利用葡萄糖发酵生产丙酮酸的工程菌株BY5419-A₀，后期利用该菌株分别在葡萄糖浓度为100g/L和 150g/L的YPD培养基条件下进行发酵120h，获得的丙酮酸浓度分别为64.8g/L、66.4g/L，产率分别为0.54g/(L.h)、0.55g/(L.h)，发酵过程中并没有乙醇产生。

虽然目前产丙酮酸酿酒酵母工程菌株的构建和筛选已经取得了很大的进展，但仍存在不足。例如，大部分文献报道所用的出发酿酒酵母菌株是营养缺陷型，在使用合成培养基进行发酵的过程中，需要额外添加必需氨基酸等营养物质，增加了发酵控制难度和发酵成本；此外，获得的工程菌株还存在丙酮酸产量不够高、发酵周期过长等问题。

发明内容

本发明提供了一种高产丙酮酸酿酒酵母基因工程菌株及其发酵方法。该酿酒酵母工程菌株不产乙醇，能够较为快速地利用大量葡萄糖发酵积累丙酮酸。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供的一株高产丙酮酸酿酒酵母工程菌株，该菌株为XY-156A，分类学名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2019年3月6日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2019129。

所述的高产丙酮酸酿酒酵母工程菌株的构建方法，包括如下步骤：以酿酒酵母XY-49为出发菌株，在分离制备MATa和MATα两性单倍体的基础上，通过同源重组的方法，依次敲除其pdc1、pdc5、pdc6三个基因，分别得到两种配型的pdc三基因缺失酿酒酵母工程菌株。

将得到的MATa和MATα配型的pdc三基因缺失酿酒酵母工程菌株杂交复倍成二倍体菌株，获得的菌株记为XY-156。

对工程菌株XY-156进行葡萄糖适应性定向驯化和筛选，恢复其利用葡萄糖生长的能力，在此基础上进一步驯化，逐渐提高其对高浓葡萄糖的耐受性，获得的菌株记为XY-156A。

本发明还提供了该酿酒酵母工程菌株在丙酮酸发酵生产中的应用。

本发明还提供了该酿酒酵母工程菌株的发酵工艺，该发酵工艺包括以下步骤：

将活化好的种子液按体积比为1％～10％的接种量接入装有1L发酵培养基的2L发酵罐中，发酵温度为30～40℃，搅拌转速为300～600rpm，通气速率为0.4～0.8L/min，发酵pH为3.8～6.5，当发酵培养基中的残糖降至10g/L左右时，补加800g/L葡萄糖母液使发酵培养基葡萄糖浓度维持在80g/L左右，整个发酵过程共补料两次；

所述发酵工程菌株为XY-156A，分类学名为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，于2019 年3月6日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019129；

所述发酵培养基包括：初始葡萄糖100g/L，酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，6.6gK₂SO₄，3g KH₂PO₄，0.5g MgSO₄，微量元素母液10mL/L；

微量元素母液(1L)：1.5g EDTA，0.45g ZnSO₄·7H₂O，0.03g CoCl₂.6H₂O，0.1gMnCl₂.4H₂O，0.03g CuSO₄.4H₂O，0.45g CaCl₂.H₂O，0.3g FeSO₄.7H₂O，0.04g NaMoO₄.2H₂O，0.1g H₃BO₄，0.01g KI；

补料母液：800g/L葡萄糖；

本发明的有益效果：

采用基因同源重组的方法敲除酿酒酵母丙酮酸脱羧酶编码基因，并结合葡萄糖适应性定向进化策略对丙酮酸脱羧酶缺陷工程菌株进行驯化和筛选，获得的工程菌株能较为快速地利用葡萄糖高效积累丙酮酸，且发酵过程无乙醇生成；该菌株在以葡萄糖为碳源进行批次补料发酵76h，获得的丙酮酸浓度达到105g/L，发酵速率为1.38g/(L.h)，丙酮酸对葡萄糖得率为 0.5g/g，具有工业化应用潜力。

附图说明

图1.S.cerevisiae XY-156A配型以及pdc1、pdc5和pdc6基因敲除PCR验证结果；

图2.S.cerevisiae XY-156A在发酵罐中利用葡萄糖进行批次补料发酵过程中的糖耗曲线、生物量(OD600)曲线以及丙酮酸生成曲线；

图3.HPLC检测结果。(A)乙醇标准品出峰时间及峰形，(B)S.cerevisiae XY-156A发酵产物HPLC检测结果。

具体实施方式

本发明所述的出发菌株酿酒酵母XY-49，是在本实验室自行筛选的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Y09tj(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、保藏编号CGMCC N0.3476)的基础上，经过诱变筛选、杂交优选后获得。

单倍体制备

将XY-49培养液涂布在产孢培养基上，30℃下，培养5～7天，用1mL无菌去离子水冲洗产孢平板，收集冲洗液12000rpm离心3min去上清，然后用1.5mL无菌水重悬后离心去上清，沉淀用0.85％NaCl清洗两次，然后用1mL破胞液重悬，破胞液成分如下：

0.01M Tris-HCl(pH8.0) 0.7ml

10％β-巯基乙醇 0.1ml

10％蜗牛酶 0.2ml

重悬后于30℃，180rpm条件下处理12～14h，然后将其置于58℃水浴中热激处理15～20 min，高温杀死营养细胞；离心弃上清，再用0.01M的Tris-HCl(pH8.0)清洗两次，无菌水重悬孢子并适当稀释后，涂布平板，30℃下静置培养2～3天后挑取单倍体进行液体培养，并利用引物验证单倍体的配型，引物如下：

MATF：5'-AGTCACATCAAGATCGTTTATGG-3'

MATa：5'-ACTCCACTTCAAGTAAGAGTTTG-3'

MATα：5'-GCACGGAATATGGGACTACTTCG-3'

PCR扩增条件为95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物，条带唯一且大小约为544bp的对应的单倍体为MATa型单倍体，条带唯一且大小约为404bp的对应的单倍体为MATα型单倍体。

实施例1：△pdc1△pdc5△pdc6三基因缺陷型菌株的构建

高产丙酮酸酿酒酵母工程菌株的构建，包括以下步骤：

1)△pdc6缺陷型酿酒酵母工程菌株的构建

酿酒酵母pdc6基因敲除组件引物设计如下：

上游引物

GAATTGATCTGTATCTGCACCTAGATCGATTTGATTACAGTTCGTACGCTGCAGGTCGA

下游引物

GTAACATGCGAATTGCGTAATTCACGGCGATAACGTAGGCATAGGCCACTAGTGGAT CT

利用上下游引物，以质粒pUG6为模版，PCR扩增得到含有pdc6开放阅读框(ORF)上下游同源臂以及抗性筛选标记基因KamX的敲除组件片段，通过PEG/LiAc化学转化方法将上述敲除组件片段分别导入XY-49-MATa和XY-49-MATα两性单倍体感受态细胞中，将转化培养物稀释适当倍数后涂布到含300μg/mL G418的YPD平板上，并于30℃恒温培养箱中静置培养 2～3天，随机挑取直径较大的单菌落进行基因组提取，以对应配型的单倍体基因组作为对照，进行PCR验证，最后将质粒pSH65转化进入得到的阳性克隆子中，半乳糖诱导表达Cre重组酶，去除抗性筛选标记KamX；连续转接传代培养至少10次以丢失pSH65，最终得到△pdc6基因缺陷型单倍体菌株。

2)△pdc5△pdc6双基因缺陷型酿酒酵母工程菌株的构建

酿酒酵母pdc5基因敲除组件引物设计如下

上游引物

CTACATGCGTTTATGGGAAAAGCCTCCATATCCAAAGGTCTTCGTACGCTGCAGGTCGA 下游引物

AGGTATGGTTAAAGATCACACCACCCTCTTCAATTAGCGCATAGGCCACTAGTGGAT CT

利用上下游引物，以质粒pUG6为模版，PCR扩增得到含有pdc5开放阅读框(ORF)上下游同源臂以及抗性筛选标记基因KamX的敲除组件片段，通过PEG/LiAc化学转化方法将上述敲除组件片段分别导入XY-49-MATa-△pdc6和XY-49-MATα-△pdc6两性单倍体感受态细胞中，将转化培养物稀释适当倍数后涂布到含300μg/mL G418的YPD平板上，并于30℃恒温培养箱中静置培养2～3天，随机挑取直径较大的单菌落进行基因组提取，以对应配型的单倍体基因组作为对照，进行PCR验证，最后将质粒pSH65转化进入得到的阳性克隆子中，半乳糖诱导表达Cre重组酶，去除抗性筛选标记KamX；连续转接传代培养至少10次以丢失pSH65，最终得到△pdc5△pdc6双基因缺陷型单倍体菌株。

3)△pdc1△pdc5△pdc6三基因缺陷型酿酒酵母工程菌株的构建

酿酒酵母pdc1基因敲除组件引物设计如下

上游引物

CCTTTTTCTGTTAGACGGTGTCTTGATCTACTTGCTATCGTTCGTACGCTGCAGGTCGA下游引物

GCCAATTCAACAGACTGTCGGCAACTTCTTGTCTGGTCGCATAGGCCACTAGTGGA TCT

利用上下游引物，以质粒pUG6为模版，PCR扩增得到含有pdc1开放阅读框(ORF)上下游同源臂以及抗性筛选标记基因KamX的敲除组件片段，通过PEG/LiAc化学转化方法将上述敲除组件片段分别导入XY-49-MATa-△pdc5△pdc6和XY-49-MATα-△pdc5△pdc6两性单倍体感受态细胞中，将转化培养物稀释适当倍数后涂布到含400μg/mL G418和2％(v/v)乙醇的 YPE平板上，并于30℃恒温培养箱中静置培养3～5天，随机挑取直径较大的单菌落进行基因组提取，以对应配型的单倍体基因组作为对照，进行PCR验证，最后将质粒pSH65转化进入得到的阳性克隆子中，半乳糖诱导表达Cre重组酶，去除抗性筛选标记KamX；在2％YPE中连续转接传代培养至少10次以丢失pSH65，最终得到△pdc1△pdc5△pdc6三基因缺陷型单倍体菌株。

pdc1、pdc5、pdc6三基因敲除验证结果见图1。

4)单倍体杂交复倍

将活化好的MATa型和MATα型的△pdc1△pdc5△pdc6三基因缺陷型单倍体菌液，取约2 ×106个MATa型转化子细胞和1×107个MATα型转化子细胞充分混匀，8000rpm离心3min，弃上清；取适当含2％乙醇YPE液体培养基重悬细胞，30℃静置培养6～8h后，用灭菌的0.45μ m硝酸纤维素膜过滤，5mLYPE过滤冲洗滤膜；将滤膜(沾有菌的一面向下)贴在含3％乙醇的YPE平板上，30℃恒温箱培养12～16h，用5mLYPE液体培养基洗脱菌体，8000rpm离心 3min，稀释涂板，30℃恒温箱中培养3～5天后观察菌落生长情况；随机挑取菌径较大的单菌落进行PCR或产孢验证，验证正确的二倍体工程菌株记作XY-156。

5)葡萄糖适应性定向驯化和筛选

由于丙酮酸脱羧酶基因缺陷型(pdc-)酿酒酵母对葡萄糖高度敏感，即便葡萄糖浓度很低，生长仍然受到严重抑制，因此有必要对菌株进行葡萄糖适应性定向驯化、筛选，以使工程菌株恢复利用葡萄糖作为单一碳源的能力，定向进化策略包括以下步骤：

培养基：

YPE培养基：酵母提取物10g/L，胰蛋白胨20g/L，乙醇2％(v/v)；

合成培养基Ⅰ(SE)：无氨基酸酵母氮源(YNB)13.4g/L，乙醇2％(v/v)；

合成培养基Ⅱ(SDE)：无氨基酸酵母氮源(YNB)13.4g/L，乙醇2％(v/v)，葡萄糖5g/L；

合成培养基Ⅲ(SD)：无氨基酸酵母氮源(YNB)13.4g/L，葡萄糖5g/L～100g/L；固体培养基则添加琼脂粉20g/L。

定向进化具体操作过程：

(1)、将工程菌株XY-156在YPE平板上活化之后，挑取单克隆接入YPE液体培养基中， 30℃，220rpm培养48h；

(2)、将上一步获得的培养物转入50mLYPE-2％液体培养基，30℃，220rpm培养48h；

(3)、重复步骤(2)一次，使菌液OD600超过5；

(4)、将上述培养物于30℃下静置2～3h，弃掉上清液，重新往摇瓶加入50mL含2％乙醇的合成培养基(SE-2％)，30℃，220rpm培养3天；

(5)、重复步骤(4)一次；

(6)、将步骤(5)得到的培养物于30℃下静置2～3h，弃掉上清液，重新往摇瓶加入50mL 含2％乙醇的合成培养基(SDE-2％)，30℃，220rpm培养3天；

(7)、重复步骤(6)两次；

(8)、换用乙醇浓度逐渐降低的SDE液体培养基进行转接，控制乙醇浓度从2％—1.5％— 1％—0.5％—0.25％—0.1％—0.05％—0％逐渐变化，每种培养基重复3次，每次转接需培养3～5 天；

(9)、将培养物分别涂布大量含5g/L葡萄糖的SD固体培养基，30℃条件下培养3～5天，将得到的菌落用无菌去离子水洗脱，转移到新鲜的5g/L葡萄糖SD液体培养基中，恢复培养并且保藏菌种。

(10)、将步骤(9)的培养物按(体积比为1:20)比例转接至50mL新鲜的含5g/L葡萄糖的SD液体培养基中，30℃，220rpm培养3～5天。

(11)、重复步骤(10)2～3次；

(12)、换用葡萄糖浓度逐渐升高的SD液体培养基进行转接，控制葡萄糖浓度从5g/L— 10g/L—15g/L—20g/L—30g/L—50g/L—70g/L—100g/L，每次转接重复3次；

(13)、将上述培养物涂布到含50g/L葡萄糖的SD固体培养基平板上，30℃下培养5天，挑取平板上菌落直径较大的40株菌进行活化培养，保藏菌种；然后观察菌体生长状况，从中挑选生长相对较快的菌株20株。

(14)、将上述得到的40株菌株培养物分别涂布于含有5g/L碳酸钙和50g/L葡萄糖的SD固体培养基平板上，30℃下培养5天，观察水解圈大小，挑选水解圈较大的菌株；

(15)综合步骤(13)和(14)，从步骤(13)挑选的20株菌株中再次选取水解圈较大并且生长较快的菌株若干株，分别接种到新鲜的含50g/L葡萄糖的SD液体培养基中，30℃，220rpm发酵5天，对上清液进行HPLC检测产酸情况，最终筛选到一株能够利用葡萄糖、生长较快、产丙酮酸能力强的工程菌株，记为XY-156A。

酿酒酵母工程菌株XY-156A批次补料发酵产丙酮酸

实验菌株saccharomyces cerevisiae XY-156A

种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L

发酵培养基：葡萄糖100g/L，酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，6.6g K2SO4，3gKH2PO4，0.5g MgSO4，微量元素母液10mL/L

微量元素母液(1L)：1.5g EDTA，0.45g ZnSO4·7H2O，0.03g CoCl2.6H2O，0.1gMnCl2.4H2O，0.03g CuSO4.4H2O，0.45g CaCl2.H2O，0.3g FeSO4.7H2O，0.04gNaMoO4.2H2O，0.1g H3BO4，0.01g KI

补料母液：800g/L葡萄糖

葡萄糖单独115℃，灭菌15min，其余溶液均在121℃下，灭菌20min，待葡萄糖溶液降到室温再跟灭菌的其余成分混匀。

酿酒酵母工程菌株XY-156A批次补料发酵产丙酮酸，包括以下步骤:

(1)种子培养：从YPD平板上挑取工程菌株XY-156A单菌落接入种子培养基中，30℃， 220rpm培养48h，，种子连续活化培养两次。

(2)发酵培养：2L发酵罐发酵培养体积为1L，121℃灭菌20min，再添加已高温灭菌的葡萄糖母液，使发酵罐中葡萄糖初始浓度为100g/L。将步骤(1)活化得到的二级种子液按体积比为10％的接种量接入发酵培养基，发酵温度为30℃，搅拌转速为400rpm，通风量为0.6 L/min，发酵过程中用10mol/LKOH维持pH为4.8，并按一定的时间间隔取样，当发酵培养基中的残糖降至10g/L左右时，补加800g/L葡萄糖母液使发酵培养基葡萄糖浓度维持在80g/L左右，整个发酵过程共补料两次。

分析方法：

(1)菌体浓度测定：利用Beckman coulter UV800紫外可见分光光度计在波长为600 nm条件下测定菌体浓度。

(2)有机酸测定：发酵液中的有机酸采用高效液相色谱仪(戴安Ultimate3000)测定。色谱柱为Phenomenex Rezex ROA-Organic Acid H+(8％)(300mm×7.8mm)，流动相为2.5 mmol/L H2SO4(pH2.5)，流速为0.6mL/min，柱温50℃，自动进样器进样，进样量10μ L，紫外检测器波长为210nm。

(3)总糖测定：残糖浓度测定采用HPLC法，色谱柱为Phenomenex Rezex RCM-MonosaccharideCa2+(8％)(300mm×7.8mm)，流动相为超纯H2O，流速为0.6 mL/min，柱温60℃，进样量5μL，示差检测器(RI)温度45℃。

发酵实验结果：

如图2所示，酿酒酵母基因工程菌株XY-156A在经过6h后开始进入对数生长期，开始快速利用葡萄糖，大量产生丙酮酸；在经过两次补加葡萄糖之后继续发酵至76h，丙酮酸最终产量达到了105g/L，得率为0.5g/g葡萄糖。发酵全程无乙醇产生(见图3)。

Claims

1.一种高产丙酮酸的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，该菌株为XY-156A，分类学名为酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae，于2019年3月6日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CCTCC M 2019129。

2.如权利要求1所述的一种高产丙酮酸的酿酒酵母基因工程菌株在丙酮酸发酵生产中的应用，其特征在于，好氧条件下，以葡萄糖作为碳源发酵生产丙酮酸，其中：发酵pH为3.8～6.5，发酵温度为30～40℃，发酵接种体积百分比为1％～15％，发酵时间为60～100h。