CN106337068A - 一种丁二酮还原酶的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一个来源于阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae subsp.dissolvens SDM的丁二酮还原酶BDH的应用。通过酶学分析，证实所述BDH酶学活性高、底物特异性好、光学选择性单一，具有广阔的工业应用前景。根据所述BDH的特有性质，本发明提供了利用所述BDH或含有所述BDH编码基因bdh的细胞生物催化合成手性纯(S)-乙偶姻、(R)-乙偶姻、(S，S)-2，3-丁二醇、meso-2，3-丁二醇以及乳酸乙酯的多种应用，对实现手性纯(S)-乙偶姻/(R)-乙偶姻和(S，S)-2，3-丁二醇/meso-2，3-丁二醇的合成研究具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及酶的应用，具体是涉及一个来源于阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae subsp.dissolvens SDM的丁二酮还原酶BDH的应用。
背景技术
乙偶姻(acetoin)具有明显的奶酪香、脂香特征，主要用于奶油、乳品、咖啡、酸奶等香料的生产，是符合国家标准GB2760-86的食品香料添加剂。此外，乙偶姻是一种重要的化学合成中间体，2004年美国能源部将乙偶姻列为30种优先开发利用的平台化合物之一，可广泛应用于制药、化工等领域。乙偶姻存在(S)-乙偶姻和(R)-乙偶姻两种旋光异构体。手性纯乙偶姻除了上述应用外，还具有特殊的用途，例如用于合成手性药物和液晶复合材料【Lett.Appl.Microbiol.，2013，57：274-281；Bioresource Technol.，2013，137：111-115；BioresourceTechnol.，2011，10741-10744；PLoS ONE，2010，5：e8860；Crit.Rev.Microbiol.，2007，33，127-140；Biotechnol.Adv.，2011，29，351-364】。而现有的化学合成法和天然微生物发酵法生产的乙偶姻都是(S)-乙偶姻和(R)-乙偶姻的旋光异构体混合物，要想得到手性纯乙偶姻还需要经过复杂的手性拆分过程，存在成本高、收率低的问题。
2，3-丁二醇(2，3-butanediol，BD)是一种重要的化工原料，广泛应用于化工、食品、航空航天等领域。同时，通过特定的化学反应，2，3-丁二醇可以衍生出多种重要的化学品如3-羟基丁酮、甲乙酮及1，3-丁二烯。因此，它被视作一种极具潜力的平台化合物。2，3-丁二醇分子内含有两个手性碳原子，存在三种旋光异构体，分别是(R，R)-2，3-丁二醇、(S，S)-2，3-丁二醇和meso-2，3-丁二醇。现有的化学合成法和原始微生物发酵法生产的2，3-丁二醇均是混旋-2，3丁二醇，同时包含上述三种旋光异构体。手性纯的2，3-丁二醇不仅具有混旋2，3-丁二醇的一般功能，而且在不对称合成方面的优势突出，是合成手性试剂盒和手性配体的重要中间体，在手性药物的合成中也有潜在应用。【Appl Microbiol Biotechnol.，2001，55：10-18；CN 102071174B】
因此，实现手性纯(S)-乙偶姻/(R)-乙偶姻和(S，S)-2，3-丁二醇/meso-2，3-丁二醇的合成研究具有重要意义。利用具有特定旋光异构体选择性的生物酶进行催化，则可以实现上述目的。来源于阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae subsp.dissolvens SDM的丁二酮还原酶BDH可以在一定条件下分别完成手性纯(S)-乙偶姻、(R)-乙偶姻、(S，S)-2，3-丁二醇、meso-2，3-丁二醇的生物合成，且光学纯度达到98％以上。此外，所述丁二酮还原酶BDH还能催化丙酮酸乙酯生成乳酸乙酯。在对该酶的相关研究中，虽已报道了其在生物合成(S，S)-2，3-丁二醇方面的应用，且仅限于以丁二酮为底物的应用【Bioresource Technol.，2012，115：111-116；Scientific Reports，2013，3：2643】，但其相关的酶学性质和其它多种应用未能有进一步的研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，全面分析一种来源于阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacaesubsp.dissolvens SDM)的丁二酮还原酶BDH的酶学性质，并根据其特性，提出该酶的多种用途及有关方法。
一种来源于阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae subsp.dissolvens SDM的丁二酮还原酶BDH，其氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO：1表示，其人工优化后的编码基因bdh序列由序列表中的SEQ ID NO：2表示。
由于本发明所述丁二酮还原酶BDH只能利用NAD+/NADH为辅酶，不能利用NADP+/NADPH为辅酶，所以所述丁二酮还原酶BDH酶活测定均以NADH的变化为依据。
本发明还原酶活定义为：每1L样品每分钟消耗1μmolNADH所需的酶量为一个酶活单位(U/L)；氧化酶活定义为：每1L样品每分钟生成1μmolNADH所需的酶量为一个酶活单位(U/L)。
所述BDH酶学性质分析如下：
1.BDH的丁二酮还原反应的最适反应温度和pH(丁二酮+NADH→乙偶姻+NAD+)
最适温度：以5mM丁二酮为底物，0.2mM NADH为辅酶，100mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)体系，测定了该酶从33℃到50℃的酶活力。测定结果显示该酶的丁二酮还原活性的最适温度为45℃。
最适pH：在45℃条件下，以5mM丁二酮为底物，0.2mM NADH为辅酶，100mM磷酸盐缓冲液体系，测定了该酶从pH5.0到8.0的酶活力。测定结果显示该酶的丁二酮还原活性的最适pH为6.0。
2.BDH的乙偶姻还原反应的最适反应温度和pH(乙偶姻+NADH→2，3-丁二醇+NAD+)
最适温度：以5mM乙偶姻为底物，0.2mM NADH为辅酶，100mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)体系，测定了该酶从30℃到55℃的酶活力。测定结果显示该酶的乙偶姻还原活性的最适温度为50℃。
最适pH：在50℃条件下，以5mM乙偶姻为底物，0.2mM NADH为辅酶，100mM磷酸盐缓冲液体系，测定了该酶从pH6.0到8.0的酶活力。测定结果显示该酶的乙偶姻还原活性的最适pH为7.0。
3.BDH的meso-2，3-丁二醇氧化反应的最适反应温度和pH(2，3-丁二醇+NAD+→乙偶姻+NADH)
最适温度：以5mM meso-2，3-丁二醇为底物，0.2mM NAD+为辅酶，100mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)体系，测定了该酶从30℃到55℃的酶活力。测定结果显示该酶的meso-2，3-丁二醇氧化活性的最适温度为45℃。
最适pH：在45℃条件下，以5mM meso-2，3-丁二醇为底物，0.2mM NAD+为辅酶，100mM缓冲液体系，测定了该酶从pH6.0到10.0的酶活力(pH6.0-8.0时为磷酸盐缓冲体系，pH8.0-10.0时为Tris-HCl缓冲体系)。测定结果显示该酶的meso-2，3-丁二醇氧化活性的最适pH为9.5。
4.BDH的底物特异性测定
在该酶最适反应条件下，分别测定了该酶在氧化反应和还原反应中的底物特异性。具体方法如下：氧化反应中，添加5mM底物、0.2mM NAD+辅酶、100mM缓冲液；还原反应中，添加5mM底物、0.2mM NADH辅酶、100mM缓冲液(pH6.0-8.0时为磷酸盐缓冲体系，pH8.0-10.0时为Tris-HCl缓冲体系)。
设定对丁二酮的还原酶活性活力为100％，对meso-2，3丁二醇的氧化酶活力为100％，其它化合物的酶活和相对活力值如表1所示。
表1丁二酮还原酶的氧化还原反应的底物特异性测定结果
注：“ND”表示Not detected；“-”表示没有活性；“±”代表三次平行试验的标准差值。
上表的结果表明，还原反应中该酶的最佳反应底物是丁二酮，其次是(R)/(S)-乙偶因，对丙酮酸乙酯也有较高活性；氧化反应中该酶的最佳反应底物是meso-2，3-丁二醇，对(S，S)-2，3-丁二醇仅有微弱活性，对(R，R)-2，3-丁二醇没有活性。
根据上述酶学特性，本发明提出所述BDH的用途技术方案如下：
本发明所述丁二酮还原酶BDH的应用，为下述反应之一：
1)利用所述丁二酮还原酶BDH，以丁二酮为底物，NADH为辅酶，在pH5.0-8.0，33℃-50℃中反应，得到(S)-乙偶姻。
2)利用所述丁二酮还原酶BDH，以meso-2，3-丁二醇为底物，以NAD+为辅酶，在pH7.0-10.0，30℃-55℃中反应，制备得到(R)-乙偶姻。
3)利用所述丁二酮还原酶BDH，以(S)-乙偶姻为底物，以NADH为辅酶，在pH6.0-8.0，30℃-55℃中反应，制备得到(S，S)-2，3-丁二醇。
4)利用所述丁二酮还原酶BDH，以(R)-乙偶姻为底物，以NADH为辅酶，在pH6.0-8.0，30℃-55℃中反应，制备得到meso-2，3-丁二醇。
5)利用所述丁二酮还原酶BDH，以丙酮酸乙酯为底物，以NADH为辅酶，在pH6.0-8.0，33℃-55℃中反应，制备得到乳酸乙酯。
本发明所述BDH的应用，包括直接利用丁二酮还原酶BDH制备(S)-乙偶姻、(R)-乙偶姻、(S，S)-2，3-丁二醇、meso-2，3-丁二醇、乳酸乙酯；还包括利用包含丁二酮还原酶BDH的编码基因的宿主细胞生产(S)-乙偶姻、(S，S)-2，3-丁二醇、meso-2，3-丁二醇、乳酸乙酯。
本发明利用含有丁二酮还原酶BDH的编码基因的宿主细胞生产(S)-乙偶姻、(S，S)-2，3-丁二醇、meso-2，3-丁二醇、乳酸乙酯，具体包括以下步骤：
a)构建含有丁二酮还原酶BDH编码基因和甲酸脱氢酶FDH编码基因的重组大肠杆菌表达载体，导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)BDH-FDH；
b)将E.coli BL21(DE3)BDH-FDH单菌落转接到LB液体培养基活化培养后，在16℃-30℃、0.1-2.0mM IPTG条件下诱导蛋白表达，得到同时具有丁二醇脱氢酶BDH活力和甲酸脱氢酶FDH活力的细胞作为生物催化剂；
利用步骤b)获得的生物催化剂，以丁二酮为底物，甲酸或甲酸盐为氢供体，在pH6.0-9.0，30℃-45℃下反应，得到(S)-乙偶姻；
利用步骤b)获得的生物催化剂，以(S)-乙偶姻为底物，甲酸或甲酸盐为氢供体，在pH6.0-9.0，30-45℃下反应，得到(S，S)-2，3-丁二醇；
利用步骤b)获得的生物催化剂，以(R)-乙偶姻为底物，甲酸或甲酸盐为氢供体，在pH6.0-9.0，30-45℃下反应，得到meso-2，3-丁二醇；
利用步骤b)获得的生物催化剂，以丙酮酸乙酯为底物，甲酸或甲酸盐为氢供体，在pH6.0-9.0，30-45℃下反应，得到乳酸乙酯。
上述步骤b)中得到同时具有丁二醇脱氢酶BDH活力和甲酸脱氢酶FDH活力的细胞包括以下步骤：
1)平板培养：将重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)BDH-FDH划线到含有琼脂和筛选抗生素的LB平板上，37℃过夜培养；
2)种子培养：在无菌条件用牙签挑取步骤1)平板上的一个单菌落，然后接种到含有筛选抗生素的LB液体培养基中，37℃培养6-12h；
3)诱导培养：在无菌条件下，取步骤2)所得的为种子培养液接种到含有筛选抗生素的LB液体培养基中，25℃-40℃培养1-5h，然后再加入终浓度为0.1-2.0mM的IPTG，16℃-37℃诱导5-24h，得到一种培养物；
4)收集菌体：将步骤3)的培养物5,000-8,000rpm离心5-15min，并用生理盐水洗涤菌体2-3遍，然后将细胞悬浮于pH 6.0-8.0的缓冲液中，使细胞干重的终浓度为1-15g/L，即得到重组大肠杆菌全细胞生物催化剂。
本发明还提供了一种表达上述丁二酮还原酶BDH的方法，是将含有上述丁二酮还原酶编码基因bdh和甲酸脱氢酶编码基因fdh的重组表达载体导入大肠杆菌宿主细胞，同时表达得到丁二酮还原酶BDH和甲酸脱氢酶FDH。
所述用于构建含有丁二酮还原酶编码基因bdh的大肠杆菌表达载体的出发载体可以是pUC18、pET-22b、pET28、pET32、pETDuet-1或pTrc99a。
本发明的有益效果是：
1)本发明对一个来源于阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae subsp.dissolvens SDM的丁二酮还原酶BDH做了全面的酶学分析，证实了该酶具有酶学活性高，底物特异性好，光学选择性专一等特性，工业应用前景广阔。
2)本发明提供了利用所述丁二醇还原酶BDH或含有所述丁二酮还原酶编码基因bdh的细胞生物催化合成手性纯(S)-乙偶姻、(R)-乙偶姻、(S，S)-2，3-丁二醇、meso-2，3-丁二醇、以及乳酸乙酯的方法，对实现手性纯(S)-乙偶姻/(R)-乙偶姻和(S，S)-2，3-丁二醇/meso-2，3-丁二醇的合成研究具有重要意义。
附图说明：
图1为丁二酮还原酶BDH最适反应温度和pH。其中：(a)为丁二酮还原反应最适温度和pH；(b)为乙偶姻还原反应最适温度和pH；(c)为meso-2，3-丁二醇氧化反应最适温度和pH。
图2为标准品的气相色谱图谱。其中A：(R)-乙偶因；B：(S)-乙偶姻；C：(S，S)-2，3-丁二醇；D：(R，R)-2，3-丁二醇；E：meso-2，3-丁二醇。
图3为丁二酮还原酶BDH以丁二酮为底物催化合成(S)-乙偶姻的气相色谱图。
图4为丁二酮还原酶BDH以meso-2，3-丁二醇为底物催化合成(R)-乙偶姻的气相色谱图。
图5为丁二酮还原酶BDH以(R)/(S)-乙偶姻为底物催化合成meso-2，3-丁二醇和(S，S)-2，3-丁二醇的气相色谱图。
图6为丁二酮还原酶BDH以丙酮酸乙酯为底物催化合成乳酸乙酯的气相色谱图。
图7为含丁二酮还原酶BDH的重组大肠杆菌催化丁二酮合成(S)-乙偶姻的气相色谱图。
图8为含丁二酮还原酶BDH的重组大肠杆菌催化(S)-乙偶姻合成(S，S)-2，3-丁二醇的气相色谱图。
具体实施方式：
实施例1应用丁二酮还原酶BDH制备(S)-乙偶姻、(R)-乙偶姻、(S，S)-2，3-丁二醇、meso-2，3-丁二醇和乳酸乙酯。
以pETDuet-1为出发载体，将经PCR获得的含丁二酮还原酶bdh编码基因片段双酶切后，连接到经同样双酶切处理的pETDuet-1中，构建得到pETDuet-bdh。在此基础上用同样的方法构建得到pETDuet-bdh-fdh。将pETDuet-bdh-fdh导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(pETDuet-bdh-fdh)。挑选阳性单克隆在37℃下摇菌至OD600＝0.6-0.8，加入0.2mM IPTG，25℃诱导10h后离心收集菌体，重悬于结合缓冲液(含20mM磷酸盐、300mM NaCl、10mM咪唑、pH7.4)中，超声破碎细胞。
通过His-tag标签进行蛋白纯化，具体方法为：经超声破碎获得上清液过Ni-NTA凝胶柱，含有His-tag标签的蛋白被结合到Ni-NTA上；除杂缓冲液(含20mM磷酸盐、300mM NaCl、20-100mM咪唑、pH7.4)洗涤非特异性结合的杂蛋白；洗脱缓冲液(含20mM磷酸盐、300mMNaCl、500mM咪唑、pH7.4)将目的蛋白洗脱；洗脱得到的目的蛋白过HiTrap Desalting脱盐柱更换缓冲液(100mM磷酸盐，pH7.4)，得到纯化的丁二酮还原酶。
利用上述方法获得的丁二酮还原酶BDH，在100mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)体系中，添加50mM丁二酮为底物，50mM NADH为辅酶，45℃反应2h，制备得到(S)-乙偶姻。说明书附图3的结果证实丁二酮还原酶BDH催化丁二酮所得产物为手性纯(S)-乙偶姻。
利用与上述相同方法获得的丁二酮还原酶BDH，在100mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0)体系中，添加50mM meso-2，3-丁二醇为底物，50mM NAD+为辅酶，50℃反应2h，制备得到(R)-乙偶姻。说明书附图4的结果证实丁二酮还原酶BDH催化meso-2，3-丁二醇所得产物为手性纯(R)-乙偶姻。
利用与上述相同方法获得的丁二酮还原酶BDH，在100mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)体系中，添加50mM(R)/(S)-乙偶姻为底物，50mM NADH为辅酶，50℃反应2h，制备得到meso-2，3-丁二醇和(S，S)-2，3-丁二醇。说明书附图5的结果证实丁二酮还原酶BDH催化(R)-乙偶因/(S)-乙偶姻所得产物分别为手性纯meso-2，3-丁二醇和(S，S)-2，3-丁二醇。
利用与上述相同方法获得的丁二酮还原酶BDH，在100mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)体系中，添加50mM丙酮酸乙酯为底物，50mM NADH为辅酶，45℃反应2h，制备得到乳酸乙酯。说明书附图6的结果证实丁二酮还原酶BDH催化丙酮酸乙酯所得产物为乳酸乙酯。
实施例2应用含丁二酮还原酶BDH编码基因bdh的重组大肠杆菌催化丁二酮合成(S)-乙偶姻
1)以pETDuet-1为出发载体，构建含有丁二酮还原酶编码基因bdh和甲酸脱氢酶编码基因fdh的重组大肠杆菌表达载体pETDuet-bdh-fdh，导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh-fdh；
2)将E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh-fdh单菌落转接到LB液体培养基活化培养后，在25℃、0.2mM IPTG条件下诱导蛋白表达，得到同时具有丁二醇脱氢酶BDH活力和甲酸脱氢酶FDH活力的细胞作为生物催化剂；
3)利用步骤2)获得的生物催化剂，以丁二酮为底物，甲酸钠为氢供体，在pH6.0-9.0，33℃下反应。
气相色谱分析测定转化液上清中(S)-乙偶姻的浓度及光学纯度。检测结果显示：(S)-乙偶姻的浓度达到10-25g/L。说明书附图7的结果证实含丁二酮还原酶BDH的重组大肠杆菌催化合成的(S)-乙偶姻光学纯度为98.5％。
实施例3应用含丁二酮还原酶BDH编码基因bdh的重组大肠杆菌催化(S)-乙偶姻合成(S，S)-2，3-丁二醇
1)以pETDuet-1为出发载体，构建含有丁二酮还原酶编码基因bdh和甲酸脱氢酶编码基因fdh的重组大肠杆菌表达载体pETDuet-bdh-fdh，导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh-fdh；
2)将E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh-fdh单菌落转接到LB液体培养基活化培养后，在25℃、0.2mM IPTG条件下诱导蛋白表达，得到同时具有丁二醇脱氢酶BDH活力和甲酸脱氢酶FDH活力的细胞作为生物催化剂；
3)利用步骤2)获得的生物催化剂，以(S)-乙偶姻为底物，甲酸钠为氢供体，在pH6.0-9.0，33℃下反应。
气相色谱分析测定转化液上清中(S，S)-2，3-丁二醇的浓度及光学纯度。检测结果显示：(S，S)-2，3-丁二醇的浓度达到10-15g/L。说明书附图8的结果证实含丁二酮还原酶BDH的重组大肠杆菌催化合成的(S，S)-2，3-丁二醇光学纯度＞99％。
实施例4应用含丁二酮还原酶BDH编码基因bdh的重组大肠杆菌催化(R)-乙偶姻合成meso-2，3-丁二醇
1)以pETDuet-1为出发载体，构建含有丁二酮还原酶编码基因bdh和甲酸脱氢酶编码基因fdh的重组大肠杆菌表达载体pETDuet-bdh-fdh，导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh-fdh；
2)将E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh-fdh单菌落转接到LB液体培养基活化培养后，在25℃、0.2mM IPTG条件下诱导蛋白表达，得到同时具有丁二醇脱氢酶BDH活力和甲酸脱氢酶FDH活力的细胞作为生物催化剂；
3)利用步骤2)获得的生物催化剂，以(R)-乙偶姻为底物，甲酸钠为氢供体，在pH6.0-9.0，33℃下反应。
气相色谱分析测定转化液上清中meso-2，3-丁二醇的浓度。检测结果显示：meso-2，3-丁二醇的浓度达到10-15g/L。
实施例5应用含丁二酮还原酶BDH编码基因bdh的重组大肠杆菌催化丙酮酸乙酯合成乳酸乙酯
1)以pETDuet-1为出发载体，构建含有丁二酮还原酶编码基因bdh和甲酸脱氢酶编码基因fdh的重组大肠杆菌表达载体pETDuet-bdh-fdh，导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh-fdh；
2)将E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh-fdh单菌落转接到LB液体培养基活化培养后，在25℃、0.2mM IPTG条件下诱导蛋白表达，得到同时具有丁二醇脱氢酶BDH活力和甲酸脱氢酶FDH活力的细胞作为生物催化剂；
3)利用步骤2)获得的生物催化剂，以丙酮酸乙酯为底物，甲酸钠为氢供体，在pH6.0-9.0，33℃下反应。
气相色谱分析测定转化液上清中乳酸乙酯的浓度。检测结果显示：乳酸乙酯的浓度达到6-12g/L。
Claims (7)
1.一种来源于阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae subsp.dissolvens SDM的丁二酮还原酶BDH的应用，为下述反应之一：
1)利用所述丁二酮还原酶BDH，以丁二酮为底物，NADH为辅酶，在pH5.0-8.0，33℃-50℃中反应，得到(S)-乙偶姻；
2)利用所述丁二酮还原酶BDH，以meso-2，3-丁二醇为底物，NAD+为辅酶，在pH7.0-10.0，30℃-55℃中反应，得到(R)-乙偶姻；
3)利用所述丁二酮还原酶BDH，以(S)-乙偶姻为底物，NADH为辅酶，在pH6.0-8.0，30℃-55℃中反应，得到(S，S)-2，3-丁二醇；
4)利用所述丁二酮还原酶BDH，以(R)-乙偶姻为底物，NADH为辅酶，在pH6.0-8.0，30℃-55℃中反应，得到meso-2，3-丁二醇；
5)利用所述丁二酮还原酶BDH，以丙酮酸乙酯为底物，以NADH为辅酶，在pH6.0-8.0，33℃-55℃中反应，制备得到乳酸乙酯。
2.一种如权利要求1所述丁二酮还原酶BDH的应用，其特征在于利用包含所述丁二酮还原酶BDH编码基因的宿主细胞生产(S)-乙偶姻，具体包括以下步骤：
a)构建含有权利要求1所述丁二酮还原酶BDH编码基因和甲酸脱氢酶FDH编码基因的重组大肠杆菌表达载体，导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)BDH-FDH；
b)将E.coli BL21(DE3)BDH-FDH单菌落转接到LB液体培养基活化培养后，在16℃-30℃、0.2-2.0mM IPTG条件下诱导蛋白表达，得到同时具有丁二醇脱氢酶BDH活力和甲酸脱氢酶FDH活力的细胞作为生物催化剂；
c)利用步骤b)获得的生物催化剂，以丁二酮为底物，甲酸或甲酸盐为氢供体，在pH6.0-9.0，30℃-45℃下反应，得到(S)-乙偶姻。
3.一种如权利要求1所述丁二酮还原酶BDH的应用，其特征在于利用包含所述丁二酮还原酶BDH的编码基因的宿主细胞生产(S，S)-2，3-丁二醇，具体包括以下步骤：
a)构建含有权利要求1所述丁二酮还原酶BDH编码基因和甲酸脱氢酶FDH编码基因的重组大肠杆菌表达载体，导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)BDH-FDH；
b)将E.coli BL21(DE3)BDH-FDH单菌落转接到LB液体培养基活化培养后，在16℃-30℃、0.2-2.0mM IPTG条件下诱导蛋白表达，得到同时具有丁二醇脱氢酶BDH活力和甲酸脱氢酶FDH活力的细胞作为生物催化剂；
c)利用步骤b)获得的生物催化剂，以(S)-乙偶姻为底物，甲酸或甲酸盐为氢供体，在pH6.0-9.0，30℃-45℃下反应，得到(S，S)-2，3-丁二醇。
4.一种如权利要求1所述丁二酮还原酶BDH的应用，其特征在于利用包含所述丁二酮还原酶BDH的编码基因的宿主细胞生产meso-2，3-丁二醇，具体包括以下步骤：
a)构建含有权利要求1所述丁二酮还原酶BDH编码基因和甲酸脱氢酶FDH编码基因的重组大肠杆菌表达载体，导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)BDH-FDH；
b)将E.coli BL21(DE3)BDH-FDH单菌落转接到LB液体培养基活化培养后，在16℃-30℃、0.2-2.0mM IPTG条件下诱导蛋白表达，得到同时具有丁二醇脱氢酶BDH活力和甲酸脱氢酶FDH活力的细胞作为生物催化剂；
c)利用步骤b)获得的生物催化剂，以(R)-乙偶姻为底物，甲酸或甲酸盐为氢供体，在pH6.0-9.0，30℃-45℃下反应，得到meso-2，3-丁二醇。
5.一种如权利要求1所述丁二酮还原酶BDH的应用，其特征在于利用包含所述丁二酮还原酶BDH的编码基因的宿主细胞生产乳酸乙酯，具体包括以下步骤：
a)构建含有权利要求1所述丁二酮还原酶BDH编码基因和甲酸脱氢酶FDH编码基因的重组大肠杆菌表达载体，导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)BDH-FDH；
b)将E.coli BL21(DE3)BDH-FDH单菌落转接到LB液体培养基活化培养后，在16℃-30℃、0.2-2.0mM IPTG条件下诱导蛋白表达，得到同时具有丁二醇脱氢酶BDH活力和甲酸脱氢酶FDH活力的细胞作为生物催化剂；
c)利用步骤b)获得的生物催化剂，以丙酮酸乙酯为底物，甲酸或甲酸盐为氢供体，在pH6.0-9.0，30℃-45℃下反应，得到乳酸乙酯。
6.如权利要求2至5中任一权利要求所述步骤b)中得到同时具有丁二醇脱氢酶BDH活力和甲酸脱氢酶FDH活力的细胞的生物催化剂，其特征在于具体制备步骤如下：
1)平板培养：将重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)BDH-FDH划线到含有琼脂和筛选抗生素的LB平板上，37℃过夜培养；
2)种子培养：在无菌条件用牙签挑取步骤1)平板上的一个单菌落，然后接种到含有筛选抗生素的LB液体培养基中，37℃培养6-12h；
3)诱导培养：在无菌条件下，取步骤2)所得的为种子培养液接种到含有筛选抗生素的LB液体培养基中，25℃-40℃培养1-5h，然后再加入终浓度为0.1-2.0mM的IPTG，16℃-37℃诱导5-24h，得到一种培养物；
4)收集菌体：将步骤3)的培养物5,000-8,000rpm离心5-15min，并用生理盐水洗涤菌体2-3遍，然后将细胞悬浮于pH 6.0-8.0的缓冲液中，使细胞干重的终浓度为1-15g/L，即得到重组大肠杆菌全细胞生物催化剂。
7.如权利要求2至5中任一权利要求所述的重组大肠杆菌表达载体，其特征在于构建该重组大肠杆菌表达载体的出发载体可以是pUC18、pET-22b、pET28、pET32、pETDuet-1或pTrc99a。
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