CN112553097A - 一种高产香茅醇的酵母基因工程菌株及其构建方法和发酵方法 - Google Patents

一种高产香茅醇的酵母基因工程菌株及其构建方法和发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及酿酵母菌株构建及发酵技术领域，特别涉及一种高产香茅醇的酵母基因工程菌株及其构建方法和发酵方法。该酵母基因工程菌株的改造包括：转入CrIS、NmIS2、OeIS、OYE2、OYE3基因中的一种或几种；将酵母底盘菌株的ERG20突变为ERG20F96W；在表达异构酶IDI1、还原酶CrIS和融合蛋白GE的同时，引入由SH3、PDZ、GBD组成的蛋白支架，组装成蛋白复合体。本发明的重组酿酒酵母菌株相对于现有技术更为环保、成本低廉，为香茅醇的生产提供了一种绿色高效的方法。

Description

一种高产香茅醇的酵母基因工程菌株及其构建方法和发酵 方法
技术领域
本发明涉及酿酵母菌株构建及发酵技术领域，特别涉及一种高产香茅醇的酵母基因工程菌株及其构建方法和发酵方法。
背景技术
香茅醇(Citronellol，3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇，C10H20O，分子量为156.27)，是一种手性线性单萜化合物，分为左旋香茅醇(玫瑰醇)、右旋香茅醇和消旋香茅醇三种。香茅醇存在于多种植物挥发油中，比如香茅油、玫瑰油、芸香油等。由于气味香甜优雅，在香精香料领域占有广阔的市场，每年的需求量在1000吨以上，可被用于化妆品、护肤品、洗浴用品以及家庭清洁用品等。香茅醇还可被用于农业领域，具有较好的杀虫效果。除此之外，香茅醇还被证明具有十多种药理活性，而且毒性较低，可被用于比如抗炎、抗痉挛、抗痛觉过敏、降低胆固醇等。由于香茅醇具有手性中心，可以为合成其他手性化合物添加手性中心。
目前香茅醇的生产主要是通过从植物精油中提取或者化学全合成和半合成的方式，存在环境污染、能源浪费且安全性不好控制、成本较高等问题。研究日趋成熟的微生物细胞工厂为生产香茅醇提供了一个绿色高效、符合可持续发展要求的有潜力的平台。随着合成生物学的发展，基因编辑越来越便捷，微生物细胞工厂的构建和改造成本也越来越低。酿酒酵母是第一个被测序的真核模式生物，具有清楚的遗传学背景而且基因改造较为简单，最重要的是酿酒酵母是通过美国食品药品监督管理局认证的安全菌株。
目前香茅醇的天然生物合成路径并不清楚，由微生物从头全合成香茅醇的研究也很少。最早在1999年的时候发现，香叶天竺葵(Pelargonium graveolens)能够将香茅基焦磷酸(CPP)转化为玫瑰醚，玫瑰醚结构与香茅醇高度类似，因此他们推断以CPP为底物能够生成香茅醇，但是现在并没有在植物中发现CPP以及与CPP相关的酶。2019年首都医科大学的张夏楠团队通过分析雷公藤植物的基因组，首次发现了一个可以体外催化GPP(牦牛儿基焦磷酸)生成香茅醇的基因，但是催化效率很低。生物转化相关的文献早有提及酿酒酵母能够将柠檬醛和香叶醇转化为香茅醇，但是具体负责催化的酶并不清楚而且副反应多，催化效率很低。从2010以后，香茅醇生物合成受到了越来越多研究者的注意，他们发现香茅醇可以通过香叶醇中C2＝C3碳碳双键的还原获得，这一步还原反应可以利用酿酒酵母内源的老黄酶或者植物来源的还原酶实现。2011年和2013年，国内外两个团队分别证实了酿酒酵母内源的老黄酶OYE2能够将香叶醇还原得到香茅醇，但也仅限于酶功能的验证。2012年，Cooner教授的团队首次发现，来自长春花Catharanthus roseus的环烯醚萜合酶CrIS能够还原香叶醇衍生物中的C2＝C3。2016年，Campbell通过体内和体外实验证明，CrIS确实能够香叶醇还原为香茅醇，香茅醇产量达到200mg/L。所以，以香叶醇为底物在还原酶的催化下获得香茅醇是一种很有潜力的方法。如何进一步提高香茅醇产量需要继续研究。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种高产香茅醇的酵母基因工程菌株及其构建方法和发酵方法。该酵母基因工程菌株经发酵培养后的香茅醇产量得到了显著提高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种高产香茅醇的酵母基因工程菌株，该酵母基因工程菌株的改造包括如下一种或几种：
1)转入CrIS、NmIS2、OeIS、OYE2、OYE3基因中的一种或几种；
2)将酵母底盘菌株的ERG20突变为ERG20F96W；
3)在表达异构酶IDI1、还原酶CrIS和融合蛋白GE的同时，引入由SH3、PDZ、GBD组成的蛋白支架，组装成蛋白复合体。
在本发明中，酵母底盘菌株为酿酒酵母、解脂属酵母、克鲁维属酵母、藻类、霉菌、细菌中的一种。
优选地，酵母底盘菌株为酿酒酵母。
在本发明中，霉菌包括但不限于链霉菌，细菌包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。
优选地，酿酒酵母底盘菌株为CEN.PK系列或BY系列。
在本发明提供的具体实施例中，酿酒酵母底盘菌株为CEN.PK2-1C。
作为优选，酵母底盘菌株为强化甲羟戊酸路径的酵母菌株。
本发明还提供了一种高产香茅醇的酵母基因工程菌株的构建方法，构建方法包括如下一种或几种改造：
1)转入CrIS、NmIS2、OeIS、OYE2、OYE3基因中的一种或几种；
2)将酵母底盘菌株的ERG20突变为ERG20F96W；
3)在表达异构酶IDI1、还原酶CrIS和融合蛋白GE的同时，引入由SH3、PDZ、GBD组成的蛋白支架，组装成蛋白复合体。
作为优选，蛋白支架为SH3-PDZ-GBD、SH3-PDZ2-GBD2、SH3-PDZ3-GBD3、SH3-PDZ4-GBD2、SH3-PDZ2-GBD4。
作为优选，PDZ与GBD的数量之比为1:1。
优选地，蛋白支架为SH3-PDZ-GBD。
作为优选，步骤3)中，IDI1与SH3的配体连接，CrIS与PDZ的配体连接，GE与GBD的配体连接。
本发明还提供了一种生产香茅醇的发酵方法，包括如下步骤：
将上述酵母基因工程菌株进行发酵培养，得到香茅醇；
发酵培养包括发酵第一阶段和发酵第二阶段，发酵第一阶段以葡萄糖作为碳源，发酵第二阶段以乙醇作为碳源。
本发明提供了一种高产香茅醇的酵母基因工程菌株及其构建方法和发酵方法。该酵母基因工程菌株的改造包括如下一种或几种：1)转入CrIS、NmIS2、OeIS、OYE2、OYE3基因中的一种或几种；2)将酵母底盘菌株的ERG20突变为ERG20F96W；3)在表达异构酶IDI1、还原酶CrIS和融合蛋白GE的同时，引入由SH3、PDZ、GBD组成的蛋白支架，组装成蛋白复合体。本发明的优点如下：
本发明开发了一种利用重组酿酒酵母菌株高产香茅醇的方法，有效地将廉价的碳源转化为香茅醇。发酵过程采用两相发酵，减轻单萜细胞毒性并且提供萃取拉力，为香茅醇的生产提供了一种切实可行的方法。
本发明的重组酿酒酵母菌株相对于现有技术更为环保、成本低廉，为香茅醇的生产提供了一种绿色高效的方法。
附图说明
图1利用重组酿酒酵母合成香茅醇路径图；绿色高亮表示酿酒酵母内源基因，粉色高亮代表酿酒酵母外源基因；
图2香叶醇生产菌株构建示意图；
图3含有不同还原酶的酿酒酵母中香茅醇摇瓶产量图；
图4底盘菌株竞争路径改造示意图；
图5ERG20原位突变对香茅醇产量(a)和细胞生长(b)的影响；
图6蛋白支架设计示意图；
图7含有不同蛋白支架的酿酒酵母菌株中香茅醇摇瓶产量图；
图8香茅醇高产菌株上罐发酵图；
图9标准化的基因表达盒序列；其中，限制性内切酶酶切位点、TGPM1、PGAL7、TGPD、PGAL10、TFBA1、TTDH2和PGAL1分别用黄色、浅绿色、浅蓝色、粉色、浅灰色、深蓝色、深绿色、深灰色高亮标出。
具体实施方式
本发明公开了一种高产香茅醇的酵母基因工程菌株及其构建方法和发酵方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一株高产香茅醇的重组酿酒酵母菌株的构建及发酵方法，包括如下步骤：
(1)以一株强化甲羟戊酸路径的酿酒酵母菌株为底盘，构建香叶醇生产菌株，然后理性选取4种不同植物来源的还原酶和2种酿酒酵母内源的还原酶，4个编码外源还原酶的基因经酿酒酵母密码子优化构建于单拷贝质粒pRS415K上，内源还原酶直接从基因组扩增以后构建于单拷贝质粒pRS415K，转化到香叶醇生产底盘中，通过摇瓶发酵筛选合成香茅醇最优的还原酶；
(2)改造底盘菌株竞争路径进一步提高香茅醇产量；
(3)引入蛋白支架提高底物转化效率，提高香茅醇产出。
本发明还提供了一株高产香茅醇的重组酿酒酵母菌株，其命名为SyBE_Sc02020236。
本发明高产香茅醇的酵母基因工程菌株及其构建方法和发酵方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1筛选不同合成香茅醇的还原酶
1、强化甲羟戊酸路径的酵母底盘菌株的获得
由元英进课题组提供，菌株编号为SyBE_Sc02020001，该菌株基因型为CEN.PK2-1C，gal80Δ::tHMG-PGAL1,10-IDI1-His3。
2、香叶醇生产菌株的构建
香叶醇的生产由长春花来源的香叶醇合酶(CrGES)催化(图1)，为提高CrGES在酿酒酵母中的催化效率，将其N端截短43个氨基酸，而且编码CrGES的基因经过酿酒酵母密码子优化。通过重叠延伸PCR(OE-PCR)将t43CrGES和编码突变后的法尼烯合酶的基因ERG20F96W,N127W融合到一起，两个基因之间通过短的柔性linker GSG连接得到基因t43CrGES-ERG20F96W,N127W(GE)，GE两端添加BsaI的酶切位点，酶切以后5’端粘性末端设计为AATG，3’端为ATTT。将酶切后的片段连入具有相同粘性末端的载体pRS415-TGPM1-PGAL7-TGPD(由元英进课题组提供)中，转化大肠杆菌以后，经筛选得到正确克隆。提取质粒以后，经NotI酶切，得到GE的表达盒TGPM1-PGAL7-GE-TGPD，通过CRISPR-Cas9的方法整合到酿酒酵母HO位点。gRNA设计为GACGACCAGGTCAGCTAGGG，通过引物退火的方式将其连入经BsmBI酶切的Cas9质粒中。以酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组为模板，通过OE-PCR的方法获得上下游同源臂HOL-TGPM1和TGPD-HOR，将同源臂和GE的表达盒与gRNA表达质粒通过醋酸锂转化法转到底盘菌株SyBE_Sc02020001中，经筛选得到香叶醇生产菌株SyBE_Sc02020057，构建过程如图2所示。
3、编码还原酶的基因元件的获得
本发明提供6种候选编码还原酶的基因，包括2个酿酒酵母内源基因和4个不同植物来源的外源基因。内源基因为编码老黄酶的基因OYE2和OYE3。外源基因分别是来自青蒿(Artemisia annua)的AaDBR2和来自3种不同植物来源的编码环烯醚萜合酶的基因IS，IS的来源分别是长春花(Catharanthus roseus)、荆芥(Nepeta mussinii)和油橄榄(Oleaeuropaea)，依次简写为CrIS、NmIS2、OeIS。上述基因均为经过酿酒酵母密码子优化并适当规避常用限制性酶切位点后，在基因5’端添加gcggccgcggtctcca、3’添加taaaggagaccgcggccgc通过人工合成得到。OYE2和OYE3以酿酒酵母CEN.PK2-1C为模板，通过高保真酶扩增获得，基因两端添加的碱基序列与外源基因相同。
4、生产香茅醇酿酒酵母菌株的构建
将6种不同的还原酶编码基因通过BsaI酶切连入表达盒pRS415K-TGPD-PGAL10-TFBA1。该表达盒的构建过程如下，首先以酿酒酵母CEN.PK2-1基因组为模板，扩增终止子TGPD和TFBA1以及启动子PGAL10，通过OE-PCR将这三部分按照设计的顺序连接到一起，其中PGAL10和TFBA1之间添加两个BsaI酶切位点，使BsaI酶切以后产生的粘性末端为TTAC和TAAA。利用NotI酶切位点，将表达盒连接到单拷贝质粒pRS415K上，转化大肠杆菌Trans T1，经验证得到正确的克隆。通过醋酸锂高效转化法将得到的质粒pRS415K-TGPD-PGAL10-reductase-TFBA1分别转入生产香叶醇的酿酒酵母菌株SyBE_Sc02020057中，转化后采用SC-Leu固体培养基(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，2％的琼脂粉)进行筛选，得到的菌株命名为SyBE_Sc02020119-SyBE_Sc020224，以上菌株对应的还原酶编码基因分别是OYE2、OYE3、CrIS、NmIS2、OeIS、AaDBR2。将质粒pRS415K转化到SyBE_Sc02020057中得到对照菌株SyBE_Sc02020118。
5、比较菌株SyBE_Sc02020119-SyBE_Sc02020124的香茅醇摇瓶产量
实验材料：酿酒酵母菌株SyBE_Sc02020119-SyBE_Sc02020124
实验方法：
种子培养基：合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L；
发酵培养基：合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L；
从固体划线平板上挑取单菌落接种于3mL SC-Leu液体培养基中，在30℃、250rpm条件下过夜培养。然后以初始OD600＝0.2接种于新鲜的3mL SC-Leu液体培养基中，于30℃、250rpm条件下培养12-15h左右至菌体生长至对数中期，以初始OD600接种于25mL发酵培养基Sc-Leu中，同时加入20％的十四酸异丙酯IPM在30℃、200rpm条件下进行两相发酵，24h和48h分别补加两次10g/L无水乙醇，120h后结束发酵。
香茅醇提取方法：发酵结束后，将发酵液倒入50mL离心管中，12,000rpm，离心5min。用移液枪取1mL上层有机相于2mL EP管中，并且加入适量无水硫酸钠除水，静置20min左右，EP管中有一部分无水硫酸钠应该为粉末状。12,000离心5min后，用1mL注射器取上层有机相通过0.22μm有机滤膜过滤至干净的EP管中，产物处理过程结束。检测时用气相-质谱(GC-MS)专用正己烷稀释20-40倍上样。
实验结果：发酵结果如图3所示。表达IS的菌株生产香茅醇的能力有明显差异，表达CrIS的菌株(SyBE_Sc02020121)中香茅醇产量最高，达到285.88mg/L，表达OeIS的菌株中香茅醇产量是CrIS的50％左右，表达NmIS2的菌株中香茅醇产量仅略高于对照菌株，只有13.19mg/L。在表达AaDBR2的菌株中，香茅醇的产量与对照菌株没有明显差异，说明AaDBR2并不具有还原香叶醇的功能。过表达OYE2和OYE3的酿酒酵母菌株中香茅醇产量是对照组的8倍以上。这与以前文献报道结果相反，他们认为老黄酶不能还原α,β不饱和醇。过表达OYE2和OYE3之所以能够显著提高香茅醇的产量可能与酿酒酵母本底OYE2和OYE3的启动子有关。PGAL10属于表达强度很高的启动子而POYE3只有受到较高浓度香叶醇的诱导才能够开启。此外，通过手性分析我们发现，表达CrIS的菌株不仅香茅醇产量最高而且旋光性单一，为左旋香茅醇(S-citronellol)。因此，选择合适的还原酶对于香茅醇的异源合成有着积极影响。
实施例2改造底盘竞争路径对香茅醇产量的影响
1、竞争路径改造方法
虽然过表达ERG20F96W,N127W能够使更多前体流向香茅醇，但是酿酒酵母底盘细胞中野生型ERG20(FPP合成酶基因)仍然会竞争性代谢香茅醇前体GPP。本发明通过CRISPR-Cas9技术将ERG20原位突变为ERG20F96W(图4)。此处所用gRNA为GGACTTGTCCATCATATCAT。通过引物退火的方式将其连入经BsmBI酶切的Cas9质粒中。同源片段构建时，采用OE-PCR的方法将ERG20上gRNA所对应位置上游的CGG突变为CAG，阻断Cas9的反复切割，此处突变为同义突变，所涉及的99位丙氨酸未发生改变。同样的，F96W的引入也是通过OE-PCR的方法。将OE-PCR产物经胶回收以后和Cas9质粒共同转化到菌株SyBE_Sc02020057和SyBE_Sc02020001。酵母转化完成以后，使用高保真酶Phanta Max做菌落PCR，扩增ERG20送测，比对测序结果，最终得到内源野生型ERG20被突变的菌株SyBE_Sc02020209和SyBE_Sc02020210。将CrIS的表达质粒pRS415K-TGPD-PGAL10-CrIS-TFBA1利用醋酸锂转化法转化到酿酒酵母SyBE_Sc02020209中，在SC-Leu平板上筛选得到正确的转化子，命名为SyBE_Sc02020211。
2、比较菌株SyBE_Sc02020211和SyBE_Sc02020121香茅醇的摇瓶产量
实验材料：菌株SyBE_Sc02020211、SyBE_Sc02020121
实验方法：与实施例1完全相同。
实验结果：将酵母本底ERG20突变为ERG20F96W后比突变前香茅醇的产量提高了42％，从285.88mg/L增长到406.01mg/L，同时鲨烯含量下降了33％(图5a)。此外，虽然将本底ERG20突变为ERG20F96W使鲨烯合成减少，但是与含有野生型ERG20的菌株相比，无论是对数期还是最终生物质积累都没有发生显著变化(图5b)。因此，内源野生型ERG20对于单萜合成的竞争作用仍不可忽略，用ERG20F96W替换酵母本底ERG20的策略能够在维持细胞正常生长的基础上有效增加GPP的供给，提高香茅醇产量。
实施例3引入蛋白支架对香茅醇生产的影响
1、蛋白支架的设计与构建
本发明通过蛋白支架的方法，将连续催化的三个蛋白，异构酶IDI1、融合蛋白GE以及还原酶CrIS组装成一个大的蛋白复合体。蛋白支架的设计示意图如图6所示。常用的蛋白支架结构域有三种，分别是来自大鼠N-WASP蛋白的GBD、小鼠Crk蛋白的SH3和小鼠α-互养蛋白的PDZ。本发明通过适配性实验证明，当GE与GBD的配体连接时最有利于生产香叶醇，而CrIS与PDZ的配体连接时最有利于生产香茅醇，因此通过PCR的方法分别在IDI1、GE和CrIS的C端添加SH3、GBD和PDZ的配体，配体和基因之间通过短的柔性linker GSG连接。SH3和PDZ的配体序列较短，将其和linker一起设计在引物上，通过PCR的方式添加到目标蛋白的C端。GBD配体较长，采用OE-PCR将GBD和linker添加到目标蛋白的C端。在OE-PCR产物5’端添加gcggccgcggtctcca、3’添加taaaggagaccgcggccgc。片段IDI1-SH3、GE-GBD、CrIS-PDZ经BsaI酶切以后，分别与表达载体ygg415-TFBA1-PGAL1-TTDH2、pRS415K-TGPM1-PGAL7-TGPD和pRS415K-TGPD-PGAL10-TFBA1连接，经筛选得到正确的克隆ygg415-TFBA1-PGAL1-IDI1-SH3-TTDH2、pRS415K-TGPM1-PGAL7-GE-GBD-TGPD和pRS415K-TGPD-PGAL10-CrIS-PDZ-TFBA1。
按照清华大学戴俊彪课题组开发的快速蛋白支架组装方法Artificial ProteinScaffold System(AProSS)，我们构建了5种不同的蛋白支架，分别是SH3-PDZ-GBD(SF1)、SH3-PDZ2-GBD2(SF2)、SH3-PDZ3-GBD3(SF3)、SH3-PDZ4-GBD2(SF4)和SH3-PDZ2-GBD4(SF5)。将组装好的蛋白支架通过IIs型内切酶酶切处理以后，用T4 DNA连接酶连入表达载体pRS415K-TGPM1-PGAL7-TGPD中，通过菌落PCR和测序验证得到正确的克隆。然后用NotI单酶切将蛋白支架的表达模块从质粒上切下，胶回收以后得到的片段通过T4 DNA连接酶与具有相同粘性末端的pRS414质粒连接，转化大肠杆菌，通过蓝白斑筛选和菌落PCR得到正确克隆pRS414-TGPM1-PGAL7-SF-TGPD。
为了方便构建，我们将GE-GBD的表达盒TGPM1-PGAL7-GE-GBD-TGPD和CrIS-PDZ的表达盒TGPD-PGAL10-CrIS-PDZ-TFBA1利用CRISPR-Cas9技术整合到菌株SyBE_Sc02020210基因组上HO位点，构建方法与菌株SyBE_Sc02020057相同。经筛选得到整合菌株SyBE_Sc02020227。将IDI1-SH3和不同SF的表达质粒共转到SyBE_Sc02020227中，转化体系涂在SC-Leu-Trp固体培养基上，得到菌株SyBE_Sc02020230-SyBE_Sc02020234，对应的蛋白支架为SF1-SF5。此外，将IDI1-SH3表达质粒和质粒ygg415共转到SyBE_Sc02020227中，得到对照菌株SyBE_Sc02020229。
2、比较不同蛋白支架对香茅醇生产的影响
实验材料：SyBE_Sc02020229-SyBE_Sc02020234
实验方法：
除种子培养基和发酵培养基中换成缺色氨酸和亮氨酸的混合氨基酸粉末以外，其余条件都和实施例1相同。
实验结果：在表达IDI1-SH3的基础上，大多数蛋白支架的表达均能使香茅醇的产量有所提升。PDZ与GBD的数量之比为1:1的蛋白支架(SF1、SF2和SF3)对于香茅醇产量的提升优于SF4和SF5，其中SF1效果最好，与未表达蛋白支架的菌株相比，香茅醇的产量提高了11％，达到655.20mg/L(图7)。蛋白支架的引入拉近连续催化的多个酶的空间距离更能够提高底物到产物的转化效率，使香茅醇产出进一步增加。
实施例4香茅醇高产菌株发酵设计与优化
1、整合菌株的构建
酿酒酵母内源乙酰基转移酶ATF1会代谢底物香叶醇和产物香茅醇，故将IDI1-SH3的表达盒和SF1的表达盒整合到ATF1位点，设计引物分别扩增PGAL7-SF1-TGPD和TFBA1-PGAL1-IDI1-SH3-TTDH2，引物中加入与50-60bp与ATF1同源序列作为整合同源臂。通过DNA凝胶电泳回收PCR产物，这两个片段回收以后通过CRISPR-Cas9系统整合到SyBE_Sc02020227基因组上ATF1的位置，所用gRNA为GACTTCGGAATAAACAAGTA。经菌落PCR初筛以后，用高保真酶扩增整合片段，测序验证无突变后得到正确的克隆，命名为SyBE_Sc02020235。随后将菌株SyBE_Sc02020235中的营养缺陷型标签Ura3、Leu2、Trp1补齐，得到菌株SyBE_Sc02020236。
2、在5-L发酵罐中进行分批补料实验验证菌株的生产能力
实验材料：SyBE_Sc02020236
实验方法：
种子培养基：蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，葡萄糖20g/L；
发酵培养基：蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，葡萄糖20g/L，硫酸镁3.2g/L；
发酵过程参数：pH控制在5.8左右，溶氧设置为40％，搅拌转速为400-600rpm，采用溶氧和搅拌级联的方式，通气量设置为2vvm。在发酵第6h的时候添加500mL有机相IPM，用于萃取产生的单萜同时减轻单萜产生的细胞毒性。从发酵第6h开始，流加600g/L的葡萄糖母液并控制培养基中葡萄糖浓度低于1g/L。在菌株生长进入稳定期以后，停止流加葡萄糖，将碳源切换为乙醇。当培养基中乙醇浓度小于10g/L以后，开始流加无水乙醇，并且控制培养基中乙醇浓度低于10g/L。此外，在发酵第12h和24h分别补充10g/L酵母浸粉，用于补充培养基中的氮源和维生素。
发酵结果：由于所有过表达的蛋白质均采用了GAL启动子控制，因此发酵过程被分为两个阶段(图8)。在发酵第一阶段，以葡萄糖作为碳源且为了减少溢流代谢将葡萄糖浓度控制在1g/L以下，此时能够观察到生物质快速积累。在发酵42h到47h之间，OD600几乎没有增长，细胞生长进入延滞期，47h时停止流加葡萄糖，进入以乙醇作为碳源的第二个发酵阶段。发酵碳源转换为乙醇后，香茅醇的积累速率约为89.98mg/L/h，与以葡萄糖为碳源相比提高了2.09倍。最终，在116h时停止发酵，此时OD600逐渐提高至184.10，香茅醇产量达到8.30g/L，这也是迄今已知的单萜在微生物中异源生产的最高产量。此外，我们对发酵过程中单萜的成分做了进一步的分析。在发酵47小时后香叶醇浓度逐渐降低而香茅醇的浓度相应增加，香茅醇的比例从48％增加到97％。本研究所构建的香茅醇生产菌株在本研究所提供的发酵条件下，展示了酿酒酵母生产香茅醇的潜力，也为其他单萜化合物在酿酒酵母中的异源合成提供了有效借鉴。
以上实施例中所用的引物和基因以及表达盒序列见表1-4和图9：
表1引物序列
Figure BDA0002801743300000111
Figure BDA0002801743300000121
Figure BDA0002801743300000131
表2酿酒酵母密码子优化后的外源基因序列
Figure BDA0002801743300000132
Figure BDA0002801743300000141
Figure BDA0002801743300000151
表3用于构建蛋白支架的蛋白结构域和支架序列
Figure BDA0002801743300000152
表4标准化的基因表达盒序列
Figure BDA0002801743300000161
Figure BDA0002801743300000171
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种高产香茅醇的酵母基因工程菌株，其特征在于，所述酵母基因工程菌株的改造包括如下一种或几种：
1)转入CrIS、NmIS2、OeIS、OYE2、OYE3基因中的一种或几种；
2)将酵母底盘菌株的ERG20突变为ERG20F96W；
3)在表达异构酶IDI1、还原酶CrIS和融合蛋白GE的同时，引入由SH3、PDZ、GBD组成的蛋白支架，组装成蛋白复合体。
2.根据权利要求1所述的酵母基因工程菌株，其特征在于，所述酵母底盘菌株为酿酒酵母、解脂属酵母、克鲁维属酵母、藻类、霉菌、细菌中的一种。
3.根据权利要求1所述的酵母基因工程菌株，其特征在于，所述酿酒酵母底盘菌株为CEN.PK系列或BY系列。
4.根据权利要求1所述的酵母基因工程菌株，其特征在于，所述酵母底盘菌株为强化甲羟戊酸路径的酵母菌株。
5.一种高产香茅醇的酵母基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下一种或几种改造：
1)转入CrIS、NmIS2、OeIS、OYE2、OYE3基因中的一种或几种；
2)将酵母底盘菌株的ERG20突变为ERG20F96W；
3)在表达异构酶IDI1、还原酶CrIS和融合蛋白GE的同时，引入由SH3、PDZ、GBD组成的蛋白支架，组装成蛋白复合体。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述蛋白支架为SH3-PDZ-GBD、SH3-PDZ2-GBD2、SH3-PDZ3-GBD3、SH3-PDZ4-GBD2、SH3-PDZ2-GBD4。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述PDZ与所述GBD的数量之比为1:1。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤3)中，IDI1与SH3的配体连接，CrIS与PDZ的配体连接，GE与GBD的配体连接。
9.一种生产香茅醇的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求1至4中任一项所述的酵母基因工程菌株或权利要求5至8中任一项构建方法得到的酵母基因工程菌株进行发酵培养，得到香茅醇；
所述发酵培养包括发酵第一阶段和发酵第二阶段，所述发酵第一阶段以葡萄糖作为碳源，所述发酵第二阶段以乙醇作为碳源。
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