JP2019516401A - 組換えヒト血清アルブミンの高発現のための遺伝子工学操作された細菌の構築 - Google Patents
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Abstract
Description
rHSAとERO1;
rHSAとPDI;
rHSAとPDIとHAC1;
rHSAとPPIとKAR2;または
rHSAとPDIとPPIとHAC1。
用語「rHSA発現促進因子」は、本明細書で使用する場合、rHSAの発現を促進し得る種々のタンパク質因子を指し、その供給源は特定の種に限定されない。具体的には、分子シャペロン活性を有するタンパク質、例えば、KAR2;折りたたみ酵素、例えば、PDI;および転写レギュレーター、例えば、HAC1などが含まれる。
発現ベクターpPIC9K(Invitrogenから購入)は、外来タンパク質分泌および発現させるために使用できる酵母α−因子シグナルペプチドを保持している。以下のプライマーをGenBankによって公開されているNM_000477.5の配列に従って設計した:(酵素切断部位に下線が施されている)
HSAフォワード:CCGCTCGAGAAAAGAGACGCTCACAAGAGTGAGGT(配列番号1)
HSAリバース:CCGGAATTCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC(配列番号2)
本発明では、ピキアGS115(Invitrogenから購入)を宿主株として使用し、pPIC9K−HSAベクターをSalI消化により線状化し、GS115株に電気形質転換した。適格な調製および電気形質転換のための方法は文献を参照した(James M. Cregg, Pichia Protocols, 第2版)。挿入配列はGS115染色体のHIS4遺伝子座に組み込まれ、形質転換株に対し、2mg/mLジェネティシン(G418)を含有するYPD(酵母抽出物ペプトンデキストロース)固体培地を用いた抗生物質富化スクリーニングを行い、rHSAを分泌可能な酵母株GS115−rHSAを得た。
ピキアERO1遺伝子のDNA配列をNCBIデータベースから取得し、遺伝子増幅のために以下のプライマーを設計した:(酵素切断部位に下線が施されている)
EROフォワード:CGGTTCGAAAGCATGAACCCTCAAATCCCTTT(配列番号3)
EROリバース:GCTGGCGGCCGCTTACAAGTCTACTCTATATGTGG(配列番号4)
ピキアHAC1遺伝子のDNA配列をNCBIデータベースから取得し、遺伝子増幅のために以下のプライマーを設計した:(酵素切断部位に下線が施されている)
HACフォワード:CGGTTCGAAACGATGCCCGTAGATTCTTCT(配列番号5)
HACリバース:GCTGGCGGCCGCCTATTCCTGGAAGAATACAAAGTC(配列番号6)
ピキアPDI遺伝子のDNA配列をNCBIデータベースから取得し、遺伝子増幅のために以下のプライマーを設計した:(酵素切断部位に下線が施されている)
PDIフォワード:CGGTTCGAAACGATGCAATTCAACTGGAATATT(配列番号7)
PDIリバース:GCTGGCGGCCGCTTAAAGCTCGTCGTGAGCGTCTGC(配列番号8)
ピキアPPI遺伝子のDNA配列をNCBIデータベースから取得し、遺伝子増幅のために以下のプライマーを設計した:(酵素切断部位に下線が施されている)
PPIフォワード:CGGTTCGAAACGATGGAATTAACCGCATTGCGCAGC(配列番号9)
PPIリバース:GCTGGCGGCCGCTTACAACTCACCGGAGTTGGTGATC(配列番号10)
ピキアKAR2遺伝子のDNA配列をNCBIデータベースから取得し、遺伝子増幅のために以下のプライマーを設計した:(酵素切断部位に下線が施されている)
KAR2フォワード:CGGTTCGAAACGATGCTGTCGTTAAAACCATCT(配列番号11)
KAR2リバース:GCTGGCGGCCGCCTATGATCATGATGAGTTGTAG(配列番号12)
rHSA分泌および発現株GS115−rHSAを原株として使用し、上記で構築したpPICZα−ERO1ベクターをSacI消化により線状化し、GS115−rHSA株に電気形質転換した。適格な調製および電気形質転換のための方法は文献を参照した(James M. Cregg, Pichia Protocols, 第2版)。挿入配列はGS115−rHSA株の染色体5’AOX部位に組み込まれた。形質転換株に対し、2mg/mLゼオシンを含有するYPD固体培地を用いた抗生物質富化スクリーニングを行い、ERO1およびrHSA共発現酵母株GS115−rHSA−ERO1を得た。
rHSA分泌および発現株GS115−rHSAを原株として使用し、実施例4で構築されたpPIC6−HAC1ベクターをSacI消化により線状化し、GS115−rHSA株に電気形質転換した。適格な調製および電気形質転換のための方法は文献を参照した(James M. Cregg, Pichia Protocols, 第2版)。挿入配列はGS115−rHSA株の染色体5’AOX部位に組み込まれた。形質転換株に対し、1mg/mLブラストサイジンを含有するYPD固体培地を用いた抗生物質富化スクリーニングを行い、HAC1およびrHSA共発現酵母株GS115−rHSA−HAC1を得た。
rHSA分泌および発現株GS115−rHSAを原株として使用し、上記で構築されたpPICZα−PDIベクターをSacI消化により線状化し、GS115−rHSA株に電気形質転換した。適格な調製および電気形質転換のための方法は文献を参照した(James M. Cregg, Pichia Protocols, 第2版)。挿入配列はGS115−rHSA株の染色体5’AOX部位に組み込まれた。形質転換株に対し、2mg/mLゼオシンを含有するYPD固体培地を用いた抗生物質富化スクリーニングを行い、PDIおよびrHSA共発現酵母株GS115−rHSA−PDIを得た。
rHSA分泌および発現株GS115−rHSAを原株として使用し、実施例6で構築されたpPIC6−PPIベクターをPmeI消化により線状化し、GS115−rHSA株に電気形質転換した。適格な調製および電気形質転換のための方法は文献を参照した(James M. Cregg, Pichia Protocols, 第2版)。挿入配列はGS115−rHSA株の染色体5’AOX部位に組み込まれた。形質転換株に対し、1mg/mLブラストサイジンを含有するYPD固体培地を用いた抗生物質富化スクリーニングを行い、PPIおよびrHSA共発現酵母株GS115−rHSA−PPIを得た。
rHSA分泌および発現株GS115−rHSAを原株として使用し、実施例7で構築されたpPIC6−KAR2ベクターをPmeI消化により線状化し、GS115−rHSA株に電気形質転換した。適格な調製および電気形質転換のための方法は文献を参照した(James M. Cregg, Pichia Protocols, 第2版)。挿入配列はGS115−rHSA株の染色体5’AOX部位に組み込まれた。形質転換株に対し、1mg/mLブラストサイジンを含有するYPD固体培地を用いた抗生物質富化スクリーニングを行い、KAR2およびrHSA共発現酵母株GS115−rHSA−KAR2を得た。
発現株GS115−rHSA−PDIを原株として使用し、上記で構築されたpPIC6−HAC1ベクターをSacI消化により線状化し、GS115−rHSA−PDI株に電気形質転換した。適格な調製および電気形質転換のための方法は文献を参照した(James M. Cregg, Pichia Protocols, 第2版)。挿入配列はGS115−rHSA−PDI株の染色体5’AOX部位に組み込まれた。形質転換株に対し、1mg/mLブラストサイジンを含有するYPD固体培地を用いた抗生物質富化スクリーニングを行い、HAC1、PDIおよびrHSA共発現酵母株GS115−rHSA−PDI−HAC1を得た。
実施例10でスクリーニングされた発現株GS115−rHSA−PDIを原株として使用し、実施例6で構築されたpPIC6−PPIベクターをPmeI消化により線状化し、GS115−rHSA−PDI株に電気形質転換した。適格な調製および電気形質転換のための方法は文献を参照した(James M. Cregg, Pichia Protocols, 第2版)。挿入配列はGS115−rHSA−PDI株の染色体5’AOX部位に組み込まれた。形質転換株に対し、1mg/mLブラストサイジンを含有するYPD固体培地を用いた抗生物質富化スクリーニングを行い、PPI、PDIおよびrHSA共発現酵母株GS115−rHSA−PDI−PPIを得た。
上記の実施例でスクリーニングされたGS115−rHSA−ERO1、GS115−rHSA−HAC1、GS115−rHSA−PDI、GS115−rHSA−PPI、GS115−rHSA−KAR2、GS115−rHSA−PDI−HAC1およびGS115−rHSA−PDI−PPI株の単一コロニーを個別に採取し、2mlのMGY培地(1.34%酵母窒素源ベース;1.0%グリセロール;4.0×10−5ビオチン)に植え込み、30℃で16時間培養した。遠心分離後、葉状体を採取し、培養のために20mlのBMMY培地(1.0%酵母抽出物;2.0%ペプトン;0.1Mリン酸カリウムバッファー、pH6.0;1.34%酵母窒素源ベース;0.5%無水メタノール)に打つし、72時間発現誘導し、12時間ごとに50μlの無水メタノールを加えた。誘導の終了後、SDS−PAGE電気泳動のために培養上清を採取した(図19)。対照株(GS115−rHSA)と比較したところ、rHSAの発現レベルは7つの共発現株の全てで向上していた。Quantity Oneソフトウエアを用いて分析を行い、発現比を表1に示す。
GS115−rHSA株ならびに実施例15でスクリーニングされたGS115−rHSA−ERO1、GS115−rHSA−HAC1、GS115−rHSA−PDI、GS115−rHSA−PPI、GS115−rHSA−KAR2、GS115−rHSA−PDI−HAC1およびGS115−rHSA−PDI−PPI株を、5リットル発酵槽を用いて発酵させ、発酵条件はInvitrogenにより公開されている「ピキア発酵法ガイドライン」を参照した。発酵は80時間の誘導発現後に終了し、培養上清を採取してrHSAの発現レベルを分析した。結果を表2に示す。固定発酵時間が80時間であった場合、共発現株におけるrHSAの発現レベルは18.2g/L発酵上清まで著しく増大し、これはrHSAの大規模工業生産の基盤を築くものであった。
Claims (14)
- 組換えヒト血清アルブミンを高発現させる方法であって、酵母宿主細胞で(a)ヒト血清アルブミン遺伝子と(b)1以上のrHSA発現促進因子遺伝子を共発現させる工程を含んでなる、方法。
- 酵母がピキア属である、請求項1に記載の方法。
- 酵母がピキア・パストリスである、請求項1に記載の方法。
- rHSA発現促進因子が転写アクチベーターHAC1、結合タンパク質KAR2、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)、小胞体オキシドレダクターゼ(ERO1)およびペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ(PPI)からなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 1、2、3またはそれを超えるrHSA発現促進因子遺伝子が酵母宿主細胞に導入される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト血清アルブミン遺伝子がプラスミドにより酵母宿主細胞に形質転換される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- rHSA発現促進因子遺伝子が1、2またはそれを超えるプラスミドにより酵母宿主細胞に形質転換される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 組換えヒト血清アルブミンを高発現する遺伝子工学操作された真菌であって、酵母であり、かつ、(a)ヒト血清アルブミン遺伝子と(b)1以上のrHSA発現促進因子遺伝子を含んでなる、遺伝子工学操作された真菌。
- 酵母がピキア属である、請求項9に記載の遺伝子工学操作された真菌。
- 酵母がピキア・パストリスである、請求項9に記載の遺伝子工学操作された真菌。
- rHSA発現促進因子が転写アクチベーターHAC1、結合タンパク質KAR2、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)、小胞体オキシドレダクターゼ(ERO1)およびペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ(PPI)からなる群から選択される、請求項8〜10のいずれか一項に記載の遺伝子工学操作された真菌。
- 1、2、3またはそれを超えるrHSA発現促進因子遺伝子が遺伝子工学操作された真菌に導入されている、請求項8〜10のいずれか一項に記載の遺伝子工学操作された真菌。
- ヒト血清アルブミン遺伝子がプラスミドにより遺伝子工学操作された真菌に形質転換された、請求項8〜12のいずれか一項に記載の遺伝子工学操作された真菌。
- 1、2またはそれを超えるプラスミドにより遺伝子工学操作された真菌に形質転換された、請求項8〜13のいずれか一項に記載の遺伝子工学操作された真菌。
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