CN102643847A - 多基因共表达体系及含二硫键功能性蛋白的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种多基因共表达体系，包括含二硫键目的蛋白编码基因的表达载体和一种或几种具有促进二硫键目的蛋白功能化作用的酶和/或伴侣蛋白的编码基因的表达载体，所述酶或伴侣蛋白的编码基因以融合基因形式构建在表达载体的一个阅读框中或两个或两个以上所述酶或伴侣蛋白的编码基因分别构建在所述表达载体的不同阅读框中，所述目的蛋白的编码基因构建在与所述酶或伴侣蛋白的所述表达载体含有不同抗性基因的表达载体中。还提供多基因共表达系统的制备方法及用其制备可溶性功能性目的蛋白的方法。本发明的多基因共表达系统使其所表达的含二硫键蛋白形成正确的二硫键、折叠成正确空间构象而溶于裂解上清液中，并保持相应生物学功能或活性。

Description

多基因共表达体系及含二硫键功能性蛋白的生产方法

技术领域

本发明涉及基因技术领域和生物化学领域，涉及使真核生物的二硫键蛋白在原核细菌内表达形成正确的二硫键、折叠成正确构象、成为可溶性活性蛋白质。具体说，利用能促进二硫键正确形成的同源巯基氧化酶、二硫键异构酶、肽基-脯氨酰顺反异构酶、伴侣蛋白等基因与二硫键蛋白基因在原核细胞内共同表达，或使这些相关酶蛋白和伴侣蛋白与二硫键蛋白在细胞外相互作用，从而产生可溶性活性二硫键蛋白的方法和相关物质。本发明还涉及包涵体蛋白质的复性技术领域。

背景技术

用大肠杆菌(E.coli.)原核系统重组表达真核生物蛋白质的优点是成本低、产量高，但是它的最大缺点之一是表达的真核生物蛋白很多都是包涵体形式，即无活性的沉淀蛋白形式。要使包涵体蛋白变成活性蛋白，首先需用高浓度盐酸胍或尿素溶解包涵体蛋白，然后用各种方法，例如稀释，使重组蛋白恢复活性(复性)[王颖等：“蛋白质复性技术研究进展”生物工程进展，2002，22(2)：61-64]。如该领域众所周知，蛋白质复性耗时、成本高、复性率低。由于包涵体蛋白复性的机理尚不清楚，不同蛋白质的复性条件又有所不同，特别是含二硫键蛋白质的复性很困难，大规模生产问题很多。

因此，如何提高大肠杆菌细胞表达可溶性异源蛋白一直是人们研究的课题[任增亮等：“大肠杆菌高效表达重组蛋白策略”中国生物工程杂志，2007，27(9)：103-109；卢晟晔等：“大肠杆菌中外源蛋白高效表达的影响因素及策略研究的新进展”中国实验诊断学，2006，10(9)：1100-1103]，其中如何形成正确的二硫键对表达可溶性异源蛋白最为关键。目前提出的解决原核系统表达可溶性蛋白的方法主要有以下几种。①使目的蛋白与可溶性蛋白融合一起表达，例如，与硫氧还蛋白(Trx)(见Novagen公司的pET system manual)或二硫键异构酶(PDI)(US 2009/0305351A1)融合表达。此方法常可使目的蛋白可溶性分泌，但最大缺点是得到的分泌性融合蛋白需要去除其融合伴侣才能得到纯化的目的蛋白。在大规模制备中，此步骤往往成本高，而且目的蛋白切下后常常有一部分多留有1至多个氨基酸，得到的是非均一性目的蛋白；②使目的蛋白与大肠杆菌外膜蛋白(OmpA)融合，表达的蛋白分泌到大肠杆菌的周质间隙中进而获得可溶性蛋白[J.Manosroi等，Appl EnvironMicrobiol，2001，67(6)：2657-2664]。但此法产量低，难以规模化工业生产；③使目的蛋白与参与蛋白质折叠的伴侣蛋白在细菌细胞内共同表达，或加入小分子化合物，例如L-精氨酸[J.Schaffner等，Appl Environ Microb，2001，67(9)：3994-4000]，包括加入大肠杆菌伴侣素60家族成员(GroEL)、热激蛋白70(Hsp70)或其它参与蛋白质折叠的蛋白[P.Goloubinoff等.Nature，1989，337(6202)：44-47]，但此法促进含二硫键蛋白可溶性表达的效果难以满足实际生产需求。④与真核生物二硫键异构酶PDI蛋白共表达[Ostermeier，M等.J Biol Chem，1996，271(18)：10616-10622]。PDI具有一定的巯基氧化活性，同时又能通过异构作用促进蛋白质正确折叠[G.Kozlov等，Febs Journal，2010，277(19)：3924-3936]，另外PDI还具有类似分子伴侣抑制蛋白质沉聚的功能[H.Cai，等，J Biol Chem，1994，269(40)：24550-24552]；⑤采用硫氧还蛋白还原酶(TrxB)和谷胱甘肽还原酶(gor)缺失大肠杆菌突变株[PH.Bessette等，Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(24)：13703-13708]。含二硫键蛋白在原核细胞内容易形成包涵体的主要原因在于原核细胞的细胞质氧化还原势较低，不能有效地促进二硫键形成，在TrxB和gor这两种还原酶缺失的突变株细胞中，细胞质氧化还原势中的氧化势提高，而有利于氧化蛋白质半胱氨酸的巯基形成二硫键。⑥采用过量表达自身质膜半胱氨酸氧化还原酶(DsbA和DsbC)的大肠杆菌菌株[J.Qiu等，Appl EnvironMicrobiol，1998，64(12)：4891-4896；Y Geng等，Appl Environ Microbiol，2010，76(21)：7226-7230]。DsbA具有催化蛋白质巯基氧化的功能，DsbC具有二硫键异构酶活性，二者的过量表达在一定程度上可促进外源蛋白二硫键的形成。综合分析，使目的蛋白与可溶性蛋白融合一起表达能够较为有效地促进大多数目的蛋白(包括含二硫键蛋白)可溶性表达，但制备成均一性纯化目的蛋白困难；而⑤-⑥方法生产成本较高，据报导④-⑤-⑥三种方法只能使二硫键蛋白一定程度上可溶性表达。

细胞外蛋白质复性除了常规方法外，目前较多地利用能辅助蛋白质折叠的蛋白，例如分子伴侣[王颖、董晓燕、孙彦：生物工程进展，2002，22(2)：61-64]，PDI[J.Yang等，HumAntibodies Hybridomas，1995，6(4)：129-136]来促进蛋白质重折叠复性。但单用分子伴侣往往不能实现辅助含二硫键较多蛋白的正确重折叠复性。

以下4种蛋白是代表性的含多个二硫键的目的蛋白：

人组织纤溶酶原激活蛋白(tpa)是一条含527个氨基酸的多肽，共含有17对二硫键[D.Pennica等，Nature，1983，301(5897)：214-221]。重组人组织纤溶酶原激活蛋白(rpa，又称瑞替普酶)是tpa的非糖基化变体，含有tpa 527个氨基酸中的355个(氨基酸1-3和176-527)，共有9对二硫键，包含第二铰链区(Kringle2)及tpa的酶结合位点[U.Kohnert等，Protein Eng，1992，5(1)：93-100]。采用原核系统表达的tpa和rpa都是包涵体蛋白形式。过去二十年中，研究如何实现原核系统可溶性表达tpa和rpa一直是研究热点，但进展缓慢，目前医用rpa仍需通过复性方法得到。

Gaussia荧光素酶(Gluc)是分离自夏威夷水域海洋桡脚类动物(Gaussia princeps)的一种新型荧光素酶，它能催化底物腔肠动物荧光素(coelenterazine)氧化脱羧而产生荧光发射光。GLuc含185个氨基酸，其中有10个半胱氨酸[M.Verhaegent和Christopoulos TK.Anal Chem，2002，74(17)：4378-4385]。原核系统表达的GLuc都是包涵体蛋白或是可溶性但构象不正确的蛋白，目前都采用哺乳动物细胞表达GLuc[M.Verhaegent和ChristopoulosTK.Anal Chem，2002，74(17)：4378-4385]。

骨形态发生蛋白2(BMP2)是转化生长因子蛋白(TGF-β)超家族成员之一，它的C端序列含有一个保守的半胱氨酸节折叠基序(cystine-knot folding motif)，这段含114个氨基酸的基序包括7个半胱氨酸，成熟的BMP2共有3对二硫键，剩余的一个半胱氨基酸与另外一个BMP2分子的一个半胱氨酸形成分子间二硫键[C.Scheufler等，J Mol Biol，1999，287(1)：103-115]，这段基序在原核系统中表达为包涵体形式。

血管内皮生长因子(VEGF)家族共有六个成员，具有其全部生物活性的最短形式的VEGF121为121个氨基酸的多肽，包含8个半胱氨酸。目前主要是采用添加融合标签，例如添加硫氧还蛋白融合标签，使VEGF121在大肠杆菌中可溶性表达[Backer MV和Backer JM，Protein Expr Purif，2001，23(1)：1-7]。VEGF121在原核系统中的表达强烈受到胞内氧化还原势的影响，目前表达的VEGF121仍为包涵体，需要复性[SA.Pizarro等，ProteinExpr Purif，2010，72(2)：184-193]。但我们实验室的结果证明，如果提高胞内氧化还原势可明显促进VEGF121的可溶性表达。

二硫键形成是蛋白质翻译后的一种重要修饰，对蛋白质正确折叠最终形成活性空间构象有决定作用。随着研究的深入对参与目的蛋白二硫键正确形成的各种酶有了新的认识，其中主要是巯基氧化酶家族，包括：Quiescin巯基氧化酶(QSOX)家族[EJ.Heckler等，Biochim Biophys Acta，2008，1783(4)：567-577]、内质网氧化还原蛋白(Ero1)家族[Wang，L等，J Biol Chem，2009，284(1)：199-206]及呼吸和生长必需蛋白(ERV/ALR)家族[D.Fass，Biochim Biophys Acta，2008，1783(4)：557-566.]。二硫键异构酶(PDI)等也与二硫键蛋白质正确折叠有关。目前的研究表明，在真核细胞内，巯基氧化酶[KL.Hoober等，J Biol Chem，1999，274(32)：22147-22150]和PDI[DP.Humphreys等，J Biol Chem，1995，270(47)：28210-28215]能促进二硫键的正确形成、蛋白质的正确折叠和分泌。体外研究也表明，巯基氧化酶和PDI分别能促进巯基氧化、蛋白质形成正确的二硫键和形成正确的空间构象[PC.Rancy和Thorpe C，Biochemistry，2008，47(46)：12047-12056]，巯基氧化酶还与PDI直接相互作用共同促进二硫键形成[Wang，L等，J Biol Chem，2009，284(1)：199-206；Tu.BP和Weissman，J Cell Biol，2004，164(3)：341-346；PC Rancy和Thorpe，Biochemistry，2008，47(46)：12047-12056]。因此，可利用它们来调控蛋白质二硫键的形成与还原，改变蛋白质和酶的生物活性。目前，虽已有报导采用目的蛋白与二硫键异构酶PDI共同表达或融合表达产生了可溶性功能目的蛋白[M.Ostermeier等，J Biol Chem，1996，271(18)：10616-10622]，但产量不大高。而采用巯基氧化酶在宿主细胞中共同表达促进原核系统中蛋白质二硫键的正确形成、诱导蛋白质折叠成为正确空间构象尚未见报道。目前的研究还证明，在细胞外联合巯基氧化酶与PDI的共同作用可促进还原型蛋白氧化形成活性构象蛋白质[Wang，L等，JBiol Chem，2009，284(1)：199-206；PC Rancy和Thorpe，Biochemistry，2008，47(46)：12047-12056]。

本发明者首先采用巯基氧化酶与目的蛋白基因共表达取得了良好结果，进而通过预试验选择，优选联合巯基氧化酶和二硫键异构酶与目的蛋白在细胞内共同表达相互作用，或在细胞外相互作用。本发明更优选联合巯基氧化酶和/或二硫键异构酶和/或伴侣蛋白多个基因与目的蛋白基因细胞内共表达。将这种方法用于细胞内二硫键包涵体蛋白取得成功，有效产生了二硫键正确和折叠正确、空间构象正确的可溶性功能目的蛋白，从而完成了本发明。

发明概述

本发明的目的在于提供一种多基因共表达体系，用该共表达体系在宿主细胞中共同表达目的蛋白和一个或多个相关酶和/或伴侣蛋白，它们在细胞微环境中相互作用产生可溶性功能目的蛋白；或分别表达目的蛋白与多个相关酶和/或伴侣蛋白，它们在细胞外相互作用，产生可溶性功能目的蛋白。

本发明的目的还在于提供多基因共表达系统的制备方法。

本发明的进一步目的是提供用本发明的多基因共表达体系制备可溶性功能性目的蛋白的方法。

本发明提供的多基因共表达体系，包括含二硫键目的蛋白的编码基因和一种或几种具有促进二硫键目的蛋白功能化作用的酶和/或伴侣蛋白的编码基因，所述酶或伴侣蛋白的编码基因以融合基因形式构建在表达载体的一个阅读框中或两个或两个以上所述酶或伴侣蛋白的编码基因分别构建在所述表达载体的不同阅读框中，所述目的蛋白的编码基因构建在与所述酶或伴侣蛋白的所述表达载体含有不同抗性基因的表达载体中。

所述目的蛋白是其表达后折叠形成的构象正确与否决定其有无生物学功能的蛋白，该目的蛋白含有一个或一个以上分子内和分子间二硫键。

所述具有促进二硫键目的蛋白功能化作用的酶和/或伴侣蛋白是参与或辅助该目的蛋白正确折叠形成正确构象的酶和/或伴侣分子，包括参与二硫键蛋白表达后分子内半胱氨酸正确配对形成正确二硫键、折叠成正确活性构象的各种酶和伴侣蛋白。

本发明提供的多基因共表达系统的制备方法包括以下步骤：

(1)构建具有促进二硫键目的蛋白功能化作用的酶和/或伴侣蛋白的编码基因的融合基因并将所述融合基因构建在表达载体的一个阅读框中，或构建两个或两个以上所述酶或伴侣蛋白的编码基因并将它们分别构建在表达载体的不同阅读框中；和

(2)构建与所述酶或伴侣蛋白的所述表达载体含有不同抗性基因的目的蛋白编码基因的表达载体。

本发明还提供用多基因共表达系统制备可溶性功能性目的蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)将所述多基因共表达系统中的所述含二硫键目的蛋白编码基因的表达载体和所述具有促进二硫键目的蛋白功能化作用的酶和/或伴侣蛋白的编码基因的表达载体同时转化宿主细胞，依据这两种载体抗性的不同，采用二种或三种抗菌素培养基，选出同时转化入这两种载体的阳性克隆菌落；

(2)培养选出的阳性克隆菌落，诱导共表达目的蛋白与相关酶和/或伴侣蛋白，通过它们在细胞内的相互作用产生可溶性功能目的蛋白。

本发明还提供用多基因共表达系统在体外制备可溶性功能性目的蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)将所述多基因共表达系统中的所述含二硫键目的蛋白编码基因的表达载体和所述具有促进二硫键目的蛋白功能化作用的酶和/或伴侣蛋白的编码基因的表达载体分别转化宿主细胞，选出分别表达它们的阳性克隆菌落；

(2)分别培养选出的阳性克隆菌落，分别诱导表达目的蛋白与相关酶和/或伴侣蛋白，通过它们在细胞外的相互作用产生可溶性功能目的蛋白。

本发明提供的多基因共表达系统中，可采用以下优选的具有促进二硫键目的蛋白功能化作用的相关酶和/或伴侣蛋白的组合：

1.巯基氧化酶和人二硫键异构酶PDI的融合蛋白，如人巯基氧化酶Q6与PDI的融合蛋白Q6PDI、PDIQ6；含ERV结构域活性片段的截短的Q6(295-540)与PDI的融合蛋白Q6(295-540)PDI；

2.巯基氧化酶人内质网氧化还原蛋白Ero1家族(与酿酒酵母Ero1家族蛋白同源)蛋白Ero1-Lα和PDI的融合蛋白Ero1-LαPDI；

3.酿酒酵母巯基氧化酶Erv2的巯基氧化活性结构域Erv2-c和PDI的融合蛋白Erv2-cPDI；

4.分别构建在表达载体二个阅读框中的Q6PDI融合蛋白与肽基-脯氨酰顺反异构酶PPI的组合Q6PDI-PPI；

5.以及已发现的相关酶和/或伴侣蛋白的其它优选组合。

本发明还提供含有上述优选组合的相关酶和/或伴侣蛋白基因的表达载体(质粒)，具体包括：含Q6基因的pCDFDuet-1-sumoQ6表达质粒、含Q6PDI融合基因的pCDFDuet-1-sumoQ6PDI表达质粒、含PDIQ6融合基因的pCDFDuet-1-sumoPDIQ6表达质粒、含PDIQ6(295-540)融合基因的pCDFDuet-1-sumoPDIQ6(295-540)表达质粒、含Q6(295-540)PDI融合基因的pCDFDuet-1-sumo Q6(295-540)PDI表达质粒、含Ero1-LαPDI融合基因的pCDFDuet-1-sumoEro1-LαPDI表达质粒、含Erv2-cPDI融合基因的pCDFDuet-1-Erv2-cPDI表达质粒、在二个阅读框中分别含Q6基因和PDI基因的pCDFDuet-1-sumo Q6-PDI表达质粒、在二个阅读框中分别含Q6PDI融合蛋白基因和PPI蛋白基因的三基因pCDFDuet-1-sumoQ6PDI-PPI表达质粒、在二个阅读框中分别含PDIQ6融合蛋白基因和PPI蛋白基因的三基因pCDFDuet-1-sumoQ6PDI-PPI表达质粒等等。

也可将上述优选组合的相关酶和/或伴侣蛋白基因构建在其它表达载体，如pET28a或pET22b质粒中，用这种表达载体与含目的蛋白基因的载体在宿主细胞内共表达可获得同样效果。

本发明的这种三基因、四基因或更多基因在宿主细胞中的共同表达方法，可有效地产生可溶性功能目的蛋白，包括可溶性功能性。

本发明也提供用含二硫键蛋白基因和含上述相关酶和/或伴侣蛋白基因质粒共同转化得到的阳性共表达克隆菌株。

本发明还提供用上述共表达质粒转化宿主菌表达得到的经过纯化的优选相关酶和/或伴侣蛋白及其融合蛋白。可用它们在细胞外与另外表达的目的蛋白混合反应产生可溶性功能目的蛋白。

本发明包括相关酶和/或伴侣蛋白目前已知和将来发现的、保留了其活性的的保守性变体多肽、或活性片段。

发明详述

本发明第一方面内容，是提供与目的蛋白基因在原核细胞系统中共同转录、翻译表达，促进目的蛋白正确折叠形成可溶性功能蛋白质的相关酶或伴侣蛋白的基因，或和二种或和三种这些相关酶或伴侣蛋白组成的融合蛋白的基因核苷酸序列。由于编码蛋白质的基因核苷酸序列密码子的简并性(即某些氨基酸可有二个、或三个、或四个密码子，它们称为该氨基酸的简并密码子)，本发明包括基因中包含有这种简并密码子的编码所述相关酶或伴侣蛋白的所有简并核苷酸序列，它们经转录和翻译后可产生具有相同氨基酸序列的蛋白质。

本文所用术语“目的蛋白”指含有二硫键，尤其是含有多个二硫键的蛋白质，简称为“二硫键蛋白”，这类蛋白含有多个半胱氨酸，表达后只有这些半胱氨酸相互正确配对形成正确的二硫键和折叠成正确构象才能产生功能活性蛋白。例如人组织纤溶酶原激活蛋白、Gaussia荧光素酶Gluc蛋白、人骨形态发生蛋白2-BMP2、人血管内皮生长因子VEGF121蛋白等等，就是典型的含多个二硫键的真核生物蛋白质。采用常规基因工程技术将这类真核蛋白基因在原核细菌或真生物细胞内单独表达时，表达的这类蛋白由于无相关酶或伴侣蛋白的帮助不能迅速形成正确的二硫键而折叠成正确构象，主要产生的是不溶性沉淀的无生物学活性的包涵体蛋白，或是虽然可溶但折叠不正确而无活性的蛋白。

本文所用术语“相关酶”和“伴侣蛋白”指能促进或辅助表达的二硫键蛋白形成正确的二硫键、折叠成正确构象、产生可溶性活性二硫键蛋白的酶或起辅助功能的伴侣蛋白。例如巯基氧化酶中的QSOX(如Q6)、内质网氧化还原蛋白(Ero1，如Ero1-Lα)、呼吸和生长必需蛋白(Erv，如酿酒酵母Erv2蛋白ScErv2)三个家族；二硫键异构酶(PDI)等，以及其它已发现的相关酶和伴侣分子。本发明包括目前已知的这类相关酶或伴侣蛋白，及它们的保留了所述酶活性或伴侣活性的突变体和活性片段，例如这类相关酶或伴侣蛋白氨基酸序列的保守性突变体，包括其氨基酸序列中含保守性缺失、添加、置换、截短所产生的仍保留了所述酶活性或伴侣活性的突变体和活性片段，如本发明的Q6酶蛋白的295-540区段截短体、呼吸和生长必需蛋白酿酒酵母Erv2的活性结构域片段(Erv2-c)等。

本发明第二方面内容，是提供含有所述“相关酶”和“伴侣蛋白”编码基因的表达载体及其构建方法。

本文所用的术语“表达载体”，“质粒”和“表达质粒”可互换使用，指通常携带有基因的染色体外元件，它不是细胞中心代谢的一部分，通常是环状双链DNA分子形式。这种元件可以是衍生自任何来源的单链或双链DNA或RNA，线形、环状或超螺旋形的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中许多核苷酸序列连接或重组入独特构建物中，这种构建物能将所选基因产物的启动子片段和DNA序列连同合适的3’非翻译序列一起引入细胞。本发明中的表达载体主要是pET系列质粒和pCDFduet-1系列质粒，也可以是其它系列质粒例如pBADhisA、pRsetB系列质粒。主要是原核表达质粒，也可以是真核表达质粒，如PVAX-1系列质粒等。pET系列质粒含有一个阅读框，pCDFDuet-1系列质粒含有二个阅读框，可以在两个阅读框内分别插入二个异源蛋白基因。

本发明将目的蛋白的编码基因构建在pET28a或pET22b表达质粒中，而将相关酶蛋白或伴侣蛋白的编码基因构建在pCDFDuet-1表达质粒中。在一个实施方式中，pCDFDuet-1的一个阅读框中含Q6蛋白基因。在一优选实施方式中，pCDFDuet-1的一个阅读框中含Q6PDI融合蛋白基因。在另一个实施方式中，pCDFDuet-1的一个阅读框中含Q6(295-540)截短蛋白基因。在另一优选实施方式中，pCDFDuet-1的一个阅读框中含PDIQ6融合蛋白基因。在另一优选实施方式中，pCDFDuet-1的一个阅读框中含PDIQ6(295-540)融合蛋白基因。在另一优选实施方式中，pCDFDuet-1的一个阅读框中含Q6(295-540)PDI融合蛋白基因。在另一优选实施方式中，pCDFDuet-1的一个阅读框中含Ero1-LαPDI融合蛋白基因。在另一优选实施方式中，pCDFDuet-1的一个阅读框中含Erv2-cPDI(巯基氧化活性结构域Erv2-c和PDI)融合蛋白基因。在另一个实施方式中，pCDFDuet-1的二个阅读框中分别含Q6基因和PDI基因。在还要优选的一个实施方式中，pCDFDuet-1的二个阅读框中分别含Q6PDI融合蛋白基因和肽基-脯氨酰顺反异构酶PPI蛋白基因。也可相反，将目的蛋白的编码基因构建在pCDFDuet-1表达质粒中，而将相关酶蛋白或伴侣蛋白的编码基因构建在pET28a或pET22b表达质粒中，这种互换并不影响共表达的效果。表达载体的选择主要视其抗性标记(抗性基因)、复制起始位点(保证稳定共存)、可容纳外源基因阅读框的大小和表达能力，不必由目的蛋白基因或相关酶或伴侣蛋白基因所特定。利用这二种质粒抗性标记和复制起点的不同，可采用含相应的二种或多种抗菌素的LB平板筛选同时转化入这两种质粒的克隆菌落，而这两种质粒彼此能稳定共存于同一细菌细胞内而共同表达。

本发明第三方面内容，是提供用所构建的含有所述“相关酶”或“伴侣蛋白”的融合蛋白编码基因的质粒转化原核细菌细胞表达所产生的纯化的融合蛋白，和提供制备这类融合蛋白的方法。

本发明第四方面内容，是利用上述第三方面得到的相关酶或伴侣蛋白或其融合蛋白，使其在细胞外与另外表达的目的蛋白相互作用，产生含正确二硫键的正确折叠的可溶性功能二硫键蛋白质的方法。

本发明第五方面内容，是提供所构建的含有所述“相关酶”或“伴侣蛋白”和/或其融合蛋白编码基因的表达质粒，用它们与构建的含目的蛋白基因的质粒共同转化原核细菌或真核生物细胞，通过转录、翻译共表达，在细胞内产生含正确二硫键的正确折叠的可溶性功能二硫键蛋白质的方法。

本文所用术语“共表达”或“共同表达”指目的蛋白质基因与相关酶或伴侣蛋白或其融合蛋白基因在宿主菌细胞中同时转录、翻译表达成相应的蛋白质。在细胞内，表达的相关酶或伴侣蛋白或其融合蛋白可使同时表达的目的蛋白形成正确的二硫键、折叠成正确构象而成为可溶性功能性二硫键蛋白质。

本发明所使用的术语“融合表达”，指经基因工程技术改造将二个或三个相关酶或伴侣蛋白的基因直接串联融合或通过一短肽接头编码序列串联融合形成融合蛋白基因，经转录、翻译表达而产生融合蛋白，该融合蛋白具有这二个或三个相关酶或伴侣蛋白的活性。串联的顺序可颠倒，只要表达的融合蛋白仍具有相关酶或伴侣蛋白的活性，如这种融合蛋白中巯基氧化酶在N端、PDI在C端(Q6PDI)，或PDI在N端、巯基氧化酶在C端(PDIQ6)，或含其它融合标签，例如sumo标签的sumoPDIQ6融合蛋白。

本文所用术语“可溶性蛋白”，指存在于宿主细胞周质间隙内或细菌裂解上清液中的蛋白组分。所述裂解上清液是细菌经超声波粉碎裂解，再经13000rpm，4℃离心去除沉淀后得到的上层清澈液体。与之相反，用常规基因工程技术在原核细菌细胞内表达的真核二硫键蛋白主要是沉淀的无生物学活性的包涵体蛋白，必须经复性才能具有生物学活性，但复性常困难，复性比率低。

本文所用术语“功能性蛋白”或“活性蛋白”含义相同，可互换使用，指具有相应生物学功能的蛋白组分。

本文所用术语“含正确二硫键折叠成正确空间构象”指具有相应生物学功能或活性的可溶性二硫键蛋白。本发明中，将这种二硫键蛋白与巯基氧化酶和/或PDI在细胞内共表达，使其能形成正确的二硫键、折叠成正确空间构象而溶于裂解上清液中，同时保存了其相应生物学功能或活性。

在本发明的一些实施方式中，提供巯基氧化酶与二硫键异构酶的融合基因。例如，在一具体实施方式中，提供Q6PDI融合基因。在另一具体实施方式中，提供PDIQ6融合基因。在另一具体实施方式中，提供PDIQ6(295-540)融合基因。在另一具体实施方式中，提供Q6(295-540)PDI融合基因。在另一具体实施方式中，提供Ero1-LαPDI融合基因。在另一具体实施方式中，提供Erv2-cPDI融合基因。

在本发明的另一些实施方式中，提供含有巯基氧化酶与二硫键异构酶融合基因的表达质粒。例如，在一具体实施方式中，提供含Q6PDI融合基因的pCDFDuet-1-sumoQ6PDI表达质粒。在另一具体实施方式中，提供含PDIQ6融合基因的pCDFDuet-1-sumoPDIQ6表达质粒。在另一具体实施方式中，提供含PDIQ6融合基因的pCDFDuet-1-sumoPDIQ6表达质粒。在另一具体实施方式中，提供含PDIQ6(295-540)融合基因的pCDFDuet-1-sumoPDIQ6(295-540)表达质粒。在另一具体实施方式中，提供含Q6(295-540)PDI融合基因的pCDFDuet-1-sumo Q6(295-540)PDI表达质粒。在另一具体实施方式中，提供含Ero1-LαPDI融合基因的pCDFDuet-1-sumoEro1-LαPDI表达质粒。在另一具体实施方式中，提供含Erv2-cPDI融合基因的pCDFDuet-1-Erv2-cPDI表达质粒。在另一具体实施方式中，提供在二个阅读框中分别含Q6基因和PDI基因的pCDFDuet-1-sumo Q6-PDI表达质粒。在另一具体实施方式中，提供在二个阅读框中分别含Q6PDI融合蛋白基因和肽基-脯氨酰顺反异构酶PPI蛋白基因的三基因pCDFDuet-1-sumoQ6PDI-PPI表达质粒。

在本发明的另一实施方式中，提供用上述质粒和含目的蛋白基因的质粒共同转化宿主细胞，选择同时转化了这二种质粒的宿主细胞的方法。所述方法包括采用含这二种质粒所含抗性标记的相应二种或多种抗菌素的LB平板培养转化菌，挑选同时转化了这两种质粒的阳性克隆菌落。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括已建立的各种大肠杆菌、枯草杆菌菌株等。

本发明也提供用含二硫键蛋白基因的质粒和含上述相关酶和伴侣蛋白基因的质粒共同转化得到的阳性共表达克隆菌株，具体包括：

二基因共表达pCDFDuet-1-sumoQ6/pET28a-rPA-BL21菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6/pET28a-tpa-BL21菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6/pET28a-Gluc-BL21菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6/pET28a-BMP2-BL21菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6/pET28a-VEGF-BL21菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6/pET28a-rPA-Origami B菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6/pET28a-tpa-Origami B菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6/pET28a-Gluc-Origami B菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6/pET28a-BMP2-Origami B菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6/pET28a-VEGF-Origami B菌株；

三基因共表达pCDFDuet-1-sumoQ6PDI/pET28a-rPA-BL21菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6PDI/pET28a-tpa-BL21菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6PDI/pET28a-Gluc-BL21菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6PDI/pET28a-BMP2-BL21菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6PDI/pET28a-VEGF-BL21菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6PDI/pET28a-rPA-Origami B菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6PDI/pET28a-tpa-Origami B菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6PDI/pET28a-Gluc-Origami B菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6PDI/pET28a-BMP2-Origami B菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6PDI/pET28a-VEGF-Origami B菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6-PDI/pET28a-rPA-BL21菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6-PDI/pET28a-tpa-BL21菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6-PDI/pET28a-Gluc-BL21菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6-PDI/pET28a-BMP2-BL21菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6-PDI/pET28a-VEGF-BL21、pCDFDuet-1-sumoQ6-PDI/pET28a-rPA-Origami B菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6-PDI/pET28a-tpa-Origami B菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6-PDI/ET28a-Gluc-Origami B菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6-PDI/pET28a-BMP2-Origami B菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6-PDI/pET28a-VEGF-Origami B菌株；

四基因共表达pCDFDuet-1-sumoQ6(295-540)PDI-PPI/pET28a-rPA-Rossetta菌株、pCDFDuet-1-sumoQ6(295-540)PDI-PPI/pET22b-rPA-Rossetta菌株。

附图说明

图1是巯基氧化酶ERV/ALR结构域示意图(摘自Alon，A等，Febs Lett，2010，584(8)：1521-1525)。图中A为QSOX(300-540区段)的二级结构，浅灰色是β折叠区域，深灰色是α螺旋区域，粗体字母“C”是参与二硫键形成的半胱氨酸残基；B为QSOX的ERV/ALR结构域氨基酸序列与Erv2p氨基酸残基对比(NCBI)；C为QSOX(286-546区段)和Erv2p蛋白质三维结构图。

图2为活性rpa的浓度与405nm吸收光变化斜率的标准曲线。

图3为pCDFDuet-1和pET28a表达质粒的构建和共同转化感受态大肠杆菌的示意图。

图4为同源重组连接示意图。

图5显示不同融合蛋白氧化DTT巯基的活性。meanV360，485指360nm激发光产生的485nm发射光强度变化的斜率，它与巯基被氧化的速率成正比。

图6显示不同融合蛋白氧化rRNase巯基的活性。meanV360，485指360nm光激发产生的485nm发射光强度变化的斜率，它与巯基被氧化的速率成正比。

图7为细胞外sumoPDIQ6融合蛋白体外使rpa复性的效率图。样品为1μM rrpa，于加入5μM sumoPDIQ6融合蛋白后1h、24h、48h分别测定活性rpa浓度。

图8显示rpa单独表达菌或与PDI或Q6PDI或Q6PDI+PPI共表达菌裂解上清液中活性rpa浓度的测定结果。

图9显示rpa单独表达菌或与Q6或PDI或Q6PDI共表达菌裂解液离心前样品及离心后上清液样品的SDS-PAGE电泳结果。A：菌体总裂解液；B：细菌裂解上清液。泳道1.rpa；泳道2.Q6-rpa；泳道3.PDI-rpa；泳道4.Q6PDI-rpa；泳道5.分子量标记。箭头所指为rpa条带。

图10显示18℃诱导的rpa单独表达、与Q6共表达、与PDI共表达、与Q6PDI共表达所得1升培养菌裂解液纯化得到的活性rpa的含量。

图11显示30℃诱导的rpa-PDI共表达、或rpa-PDI Q6共表达所得1升培养菌裂解液纯化得到的活性rpa含量。

图12显示30℃诱导的rpa-PDI Q6(295-540)共表达，或18℃诱导的PDI-rpa共表达所得1升培养菌裂解液纯化得到的活性rpa的含量。

图13显示18℃诱导的rpa-Q6-PDI三基因质粒分别转化的Rosetta和Rosetta gami B培养菌裂解上清液纯化得到的rpa的量。以单独表达rpa的Rosetta gami B菌为对照。

图14显示30℃诱导的Ero1-LαPDI-rpa共表达、或18℃诱导的PDI-rpa共表达所得1升培养菌裂解液纯化得到的活性rpa的含量。

图15显示30℃诱导的Erv2-cPDI-rpa共表达、或18℃诱导的PDI-rpa共表达所得1升培养菌裂解液纯化得到的活性rpa的含量。

图16显示tpa单独表达、与Q6共表达、与PDI共表达、与Q6+PDI共表达的Rosetta菌或Rosetta gami B菌裂解上清液中活性rpa浓度的测定结果。R表示菌株Rosetta；R.g.B表示菌株Rosetta gami B。

图17显示tpa-Q6PDI共表达菌裂解上清液活性rpa浓度的测定结果。R表示菌株Rosetta。

图18显示GLuc-Q6共表达菌裂解上清液中的活性GLuc测定结果。

图19显示GLuc与PDI、或与Q6PDI共表达菌裂解上清液中GLuc活性的测定结果。

图20显示GLuc单独表达、与PDI共表达、与Q6PDI共表达产生的GLuc的比活力测定结果。三种样品浓度均为10nM时测得。

图21显示BMP2单独表达、与Q6、或与PDI、或与Q6PDI共表达菌裂解液的SDS-PAGE鉴定结果。采用15％SDS-PAGE凝胶。BMP2分子量约为13KD，黑色箭头和方框为BMP2条带。泳道1.单独BMP2；泳道2.Q6-BMP2；泳道3.PDI-BMP2；泳道4.Q6PDI-BMP2。

图22显示单独表达或与PDIQ6共表达产生的VEGF121蛋白的SDS-PAGE及斑点印染鉴定。单独表达的VEGF121；与sumoPDIQ6共表达产生的VEGF121；A：SDS-PAGE，箭头所指为VEGF12条带，Marker条带是14.4KD；B：斑点印染。

图23为rpa与sumoPDIQ6分别用pET系列载体和pCDFDuet-1共表达得到的菌体上清中活性rpa的浓度比较。图中左侧直方为pET28a-rpa与pCDFDuet-1-sumoPDIQ6共表达；右侧直方为pCDFDuet-1-rpa与pETsumoPDIQ6共表达。

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施方式仅用于说明本发明而不限于本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按《分子克隆：实验指南》中所述条件，或按照制造提供试剂盒厂商所建议的条件执行。

具体实施方式

以下用实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例仅仅用于举例说明本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。

材料和方法

实施例中主要采用常规基因工程分子生物学克隆方法，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的，例如简·罗斯凯姆斯等的《分子生物学实验参考手册》和J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译的“分子克隆实验指南”(第三版，2002年8月，科学出版社出版，北京)中有关章节所述的方法。本领域普通技术人员按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。

实施例中所用的原核表达pET28a、pET22b、pCDFDuet-1质粒载体购自Novagen公司，原核表达pETsumo质粒载体及试剂盒购自Invitrogen公司(见Champion^TM pET SUMO蛋白表达系统说明书，可高水平表达重组蛋白和增强其可溶性，盒中包括相应的全套pETSUMO TA克隆试剂、感受态大肠杆菌、蛋白酶、线性化的pETsumo质粒、各种所需缓冲液、T4DNA连接酶等)。pET28a、pETsumo、pET22b复制起始位点是pBR322，前两者都含卡那霉素抗性基因，pET22b含氨苄青霉素抗性基因，它们都含有T7启动子和lacI基因，可用IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)在原核生物中诱导表达目的蛋白。pCDFDuet-1复制起点是CDF复制起点，pCDFDuet-1含有两个阅读框，都由T7启动子启动转录，可以同时在两个阅读框内插入异源蛋白基因，可用IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)在原核生物中同时诱导两个异源蛋白表达，同时还含有链霉素抗性基因和lacI基因。含CDF复制起始点的pCDFDuet-1(链霉素抗性)与pET28a(卡那抗性)、pETsumo(卡那抗性)和pET22b(氨苄抗性)的抗性筛选标记(抗性基因)和复制起点不相同，故pCDFDuet-1可以与pET28a或pETsumo或pET22b能同时在宿主细胞中稳定存在。

实施例中的所用的克隆大肠杆菌菌株Machl购自Invitroten公司，Machl因包含tonA基因缺失突变而对T1和T5噬菌体具有抗性。实施例中表达所用的大肠杆菌菌株BL21、Rosetta、Origami B、Rosetta gami B均购自Novagen公司，都包含Lon ATP依赖蛋白酶基因(lon)和外膜蛋白酶基因(ompT)缺失突变，因而表达外源蛋白的稳定性高。Rosetta菌株含有表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因的质粒，对外源蛋白的翻译效率高。OrigamiB菌株是BL21硫氧还蛋白还原酶(trxB)和谷胱甘肽还原酶(gor)缺失突变株，其胞质的氧化还原势高，同时基因组包含四环素和卡那霉素抗性基因(缺失筛选形成的)。Rosettagami B菌株是在Origami B中导入表达大肠杆菌稀有密码子tRNA基因的质粒得到的菌株，其基因组也包含四环素和卡那霉素抗性基因(缺失筛选形成的)。

实施例中普遍采用了聚合酶链式反应(PCR)。我们设计的用于PCR的所有引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成、纯化和经质谱法鉴定正确。实施例所用的Taq DNA聚合酶购自东盛生物，pfu DNA聚合酶购白天根生化科技(北京)有限公司，PrimeSTARDNA聚合酶购自上海TaKaRa公司，三种聚合酶购买时都附赠相应聚合酶缓冲液和dNTP。NdeI、NotI、BamHI、SacI等限制性内切酶、T4连接酶、T4磷酸化酶(T4PNK)购自Fermenpas公司，购买时附带有10×Tango^TM缓冲液等。实施例中所用的CloneEZ PCR克隆试剂盒(含同源重组酶)购自南京金斯瑞生物科技有限公司(原金思特科技(南京)有限公司)。化学试剂均购自国药集团上海化学试剂公司。核酸酶A购自sigma公司，瑞替普酶购自爱德药业(北京)有限公司，抗VEGF抗体为本实验室制备，蛋白A购自sigma公司。

5，5′二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)和咪唑(Imidazole)购自Alfa公司；卡那霉素(Kana)、氨苄青霉素(Amp)、氯霉素(CAM)、二硫苏糖醇(DTT)和还原性谷胱甘肽(GSH)购自Ameresco公司；三羧甲基磷酸(TCEP)购自Pierce公司；黄素腺苷酸二核苷酸磷酸(FAD)购自Alfa公司；辣根过氧化物酶(HRP)和高香草酸(HVA)购自Merck公司生产。

本发明实施例中所用的DNA纯化试剂盒购自BBI公司(加拿大)，质粒小抽试剂盒购白天根生化科技(北京)有限公司。

本发明实施例中用到的主要仪器有：Biotek Synergy 2多功能酶标仪(美国BioTek公司)，AKTA primer蛋白纯化仪(美国GE公司)，X-15R高速冷冻离心机(美国Beckman公司)，Microfuge22R台式高速冷冻离心机(美国beckman公司)，PCR扩增仪(德国Biometra公司)。

本发明实施例中所用的目的蛋白和酶蛋白等的基因序列均通过计算机检索NCBI(美国国立生物技术信息中心)网站获得。检索各蛋白编码基因的具体网站如下：

Q6http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_001004128.1

PDI和PPI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_066953.1)

Erol-Lα(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_055399.1)

Erv2-c(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_015362.1)

Tpa和rpa(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAA60111.1)

Gluc(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAG54095.1)

BMP2(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_001191.1)

VEGF121(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ABO26344.1)

实施例中用到的常规分子生物学方法如下

(一)聚合酶链式反应(PCR)：

1.目的片段扩增PCR：

扩增步骤(bp表示扩增片段的核苷酸数量)：

2.长片段(＞2500bp)扩增PCR：

扩增步骤(bp表示扩增片段的核苷酸数量)：

或者

(二)核酸内切酶酶切反应：

1.对质粒载体进行双酶切的体系(n代表使体系达到总体积所需要加入的灭菌超纯水μL量)：

2.对PCR产物片段进行双酶切的体系(n含义同上)：

3.将双酶切后PCR产物片段连接入双酶切后的质粒载体成环的体系：

注：PCR产物片段与载体双酶切产物的质量比大致在2∶1-6∶1之间。

(三)DNA片段5’端磷酸化反应然后自身环化反应：

从微生物中抽提出的质粒或者基因组末端都含有磷酸基团，而PCR产物没有，故需对PCR产物的5’端碱基进行磷酸基团加成反应，只有末端含有磷酸基团DNA分子才能发生连接反应。自身环化连接反应指线性化载体的3’端和5’端连接反应。

T4PNK为T4多聚核苷酸激酶的简写，用于对DNA分子的5’端磷酸基团的加成反应。使5’端磷酸化的DNA片段产物自身环化的反应体系：

(四)同源重组连接反应(按照CloneEZ克隆试剂盒，南京金斯瑞生物科技有限公司，原金思特科技(南京)有限公司说明书操作)：

PCR产物片段扩增时在两侧加入了15bp与线性化载体两侧的15bp核酸序列同源的核苷酸序列，扩增得到的PCR产物两侧15bp核苷酸序列与线性化载体序列两侧核苷酸序列同源，在同源重组酶的作用下，PCR产物片段与线性化载体同源重组连接成环状。

注：n值视PCR产物片段的大小而不同，小于1kb时n＝4，1-2kb时n＝6，2-3kb时n＝8，大于3kb时n＝10。

(五)质粒转化菌表达蛋白质的鉴定：

1.小量表达蛋白质样品的获取：

用单个质粒载体或多个质粒载体共同转化感受态大肠杆菌表达菌株(包括大肠杆菌BL21、Origami B、Rosetta、Rosetta gami B菌株)后，在含相应抗菌素的LB平板中培养过夜，次日利用质粒载体中所含的抗菌素抗性筛选标记对转化菌落进行选择。从转化平板中挑选单个阳性菌落(重组的表达菌)接种含相应抗菌素的3ml LB培养液进行培养，当菌液的OD600达到0.6-1.0时，加入终浓度0.1-1.5mM的IPTG(为表达巯基氧化酶还要加入终浓度10μM的辅基黄素腺苷酸二核苷酸磷酸(FAD))，在18℃或30℃或37℃培养16-24h诱导重组蛋白表达。然后取1ml菌液4000rpm离心4分钟收菌，重悬于含10mMEDTA的PBS液。冰浴超声波裂解细菌，超声仪设定：探头Φ3，功率10％，工作1s，间隔3s，总工作150s。12000rpm离心细菌裂解液10min分离得到上清液与沉淀(可能含包涵体蛋白)，分别为上清液蛋白样品与沉淀蛋白样品。

2.重组人组织纤溶酶原激活蛋白(rpa)的纯化：

用含rpa基因的质粒或含rpa和巯基氧化酶双基因或三基因的质粒转化上述感受态大肠杆菌后，在含相应抗菌素的LB平板中培养过夜，次日利用质粒载体中所含的抗菌素抗性筛选标记对转化菌落进行选择。从转化平板中挑选单个阳性菌落(重组的表达菌)接种含相应抗菌素的5ml LB培养液37℃培养过夜。第二天取培养菌转接种100mL LB培养液锥形瓶37℃振荡培养3-4小时。当菌液OD600达到约0.6-1.0时加入终浓度0.1-1.5mM的IPTG(为表达巯基氧化酶还要加入终浓度5μM的FAD)，在18℃培养16-20小时或30℃培养6-10小时或37℃培养4-6小时诱导表达。然后4000rpm离心20分钟收集菌体沉淀，-80度保存。

将上述沉淀菌体重悬于平衡缓冲液(0.4M NaCl 50mM K₂HPO₄PH 7.4)，转移到15ml离心管中置于冰上，冰浴超声波裂解细菌，超声仪设定：探头Φ6，功率30％，工作1s，间隔3s，总工作200s，共进行4轮。超声结束后，4℃，10000rpm离心细菌裂解液30分钟，分离得到上清液与沉淀(可能含包涵体蛋白)。

利用刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)能特异性结合rpa的原理来纯化rpa(29)，将ETI与葡聚糖凝胶偶联制备亲和凝胶(30)(偶联ETI的亲和凝胶由易进华博士和张元兴教授赠送)，在100mM TrisHCl PH8.0(含0.1％叠氮钠)中保存。用该亲和凝胶自制的1ml ETI偶联亲和柱的平衡缓冲液为0.4M NaCl 50mM K₂HPO₄PH 7.4，洗脱液为0.7M ArgAc PH4.0。用10ml平衡液平衡此柱后，加入上述细菌裂解上清液，继用1ml洗脱液洗脱，能得到电泳纯的rpa蛋白。用1M NaOH调PH到7.4，进行活性测定。

3.人组织纤溶酶原激活蛋白(rpa或tpa)活性的测定：

活性人组织纤溶酶原激活蛋白(rpa或tpa)是一种酶，能水解其底物甲磺酰-D-环己酪氨酰-甘氨酰-精氨酸对硝基苯偶氮-β-萘酚乙酸(CH₃SO₂-D-CHT-Gly-Arg-pNA.AcOH)生成pNA，pNA能吸收405nm光，测定405nm吸收光的变化可反映pNA的生成量，继而计算出活性rpa或tpa的浓度。在反应缓冲液(100mM Tris·HCl PH 7.4)中包含10μL rpa或tpa样品和0.067mM底物(CH₃SO₂-D-CHT-Gly-Arg-pNA.AcOH)，混合反应后将其加入白色透明384孔板中，用Synergy2多功能酶标仪(美国BioTek公司)测定405nm吸收光在10-30分钟内的变化。用购买的rpa标准品进行上述反应和测定，绘制出0.2-2μM浓度范围内rpa或tpa浓度与405nm吸收光变化斜率的标准曲线(见图3)，根据该标准曲线查出所测样品中活性rpa或tpa的含量。

以下通过实施例和附图对本发明内容作进一步阐述。

实施例1.pCDFDuet-1-sumoQ6PDI表达载体的构建

1.构建pETsumoQ6表达载体(含Q6基因核苷酸序列的pETsumo中间质粒)

根据Q6基因核苷酸序列设计以下引物：

引物P1：5’-ATGGCCCCGCGGTCGGCGCTCTATTC-3’

引物P2：5’-AATAAGCTCAGGTCCCTCAGCCGGC-3’

P1与Q6基因的编码序列的5’端26个核苷酸完全一致，P2与Q6基因的编码序列的3’端25个核苷酸完全反向互补。采用P1和P2引物，以含Q6基因的pGEM-T载体(本实验室原先构建并保存)中的Q6基因为模板，按上面所述目的基因片段的PCR条件扩增Q6基因。

经过以上步骤后，PCR体系中再加入0.5μL Taq DNA聚合酶，72℃反应10min，使PCR产物3’末端加一个A(腺嘌呤核苷酸)。用1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的扩增子DNA条带，用DNA纯化试剂盒回收该扩增子。通过连接反应使纯化的扩增子直接连接入购买的线性化TA克隆载体pETsumo)中。

用连接了扩增子的质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取质粒获得表达载体pETsumoQ6克隆。

2.构建pETsumoQ6PDI表达载体(含Q6和PDI双基因核苷酸序列的pETsumo中间质粒)。设计以下引物，

引物P3：5’-TGAGCTTATTAGACAAATGGACGCTCCGGAAG-3’

引物P4：5’-CCGAATAAATACCTATTACAGTTCATCTTTCACAGC-3’

P3的第1-15个核苷酸(下划线部分)与表达载体pETsumoQ6HindIII(pETsumoQ6载体上Q6基因3’端第5-10个核苷酸为HindIII的识别位点(AAGCTT)，第5个核苷酸的3’端是切割位点)切割位点之前的15个核苷酸相一致，第17-32个核苷酸与PDI基因5’端核苷酸序列相一致，第16个核苷酸A是为了防止移码突变而添加的核苷酸。P4第1-15个核苷酸(下划线部分)与表达载体pETsumoQ6反义链HindIII切割位点5’端15个核苷酸完全一致，第16-36核苷酸与PDI 3’核苷酸序列反向互补。采用P3和P4引物，以pET28b-PDI载体(本实验室原先构建并保存)中的PDI基因为模板，

以上面所述的相同PCR条件扩增PDI基因，用DNA纯化试剂盒按所述纯化方法获得含有pETsumoQ6HindIII酶切位点上下游各15bp同源片段的PDI基因。用HindIII单酶切pETsumoQ6，再用DNA纯化试剂盒(BBI公司)回收得到线性化pETsumoQ6质粒载体。按上面所述同源重组连接方法(如图4)将获得的PDI基因序列同源重组连接入pETsumoQ6载体中，然后用其转化菌株Mach1并培养，通过提取质粒获得pETsumoQ6PDI表达载体。该载体在Mach1中表达的产物是Q6与PDI的融合蛋白(二者直接串联融合或通过精氨酸和谷氨酰胺组成的短肽接头串联融合)，其N端有his标签和融合标签sumo(购买的pETsumo质粒中原来就有的)。

3.构建pCDFDuet-1-sumoQ6PDI表达载体(将sumoQ6PDI融合基因转到pCDFDuet质粒中目的是得到完整的表达体系，把与Q6相关的基因全部构建在pCDFDuet-1中，而把目的基因构建在能与此质粒稳定共存的另一质粒中)。

设计以下引物：

引物P5：5’-CATCACCACAGCCAGATGTCGGACTCAGAAGTC-3’

引物P6：5’-CCGAGCTCGAATTCGTTACAGTTCATCTTTCACAGC-3’

P5第1-15个核苷酸(下划线部分)与表达载体pCDFDuet-1的BamHI核酸内切酶识别位点(位于载体第一阅读框的多克隆位点中，是GGATCC，切割位点是G的3’末端，BamHI识别位点之前有His标签基因)切割位点之前的15个核苷酸相一致，第16-33个核苷酸与sumo标签5’端核苷酸序列相一致。P6第1-15个核苷酸(下划线部分)与表达载体pCDFDuet-1反义链的BamHI切割位点5’端15个核苷酸完全一致，第16-36核苷酸与PDI基因3’核苷酸序列反向互补。采用P5和P6引物，以pETsumoQ6PDI载体上的操作性相连接的sumoQ6PDI基因为模板，按上面所述长片段扩增PCR条件，扩增获得的sumoQ6PDI融合蛋白基因。

以上面所述的相同条件进行PCR扩增，并按所述方法纯化获得含有pCDFduet-1BamHI酶切位点上下游各15bp同源片段的sumoQ6PDI融合蛋白基因。用BamHI单酶切pCDFDuet-1质粒，再用DNA纯化试剂盒(BBI公司)回收得到线性化pCDFDuet-1载体。按上面所述同源重组连接方法将sumoQ6PDI融合蛋白基因连接入pCDFDuet-1载体中，用其转化菌株Mach1并培养，通过提取质粒获得pCDFDuet-1-sumoQ6PDI(Q6基因与PDI基因在同一个阅读框内融合表达)表达载体。

实施例2.pCDFDuet-1-sumoQ6-PDI(Q6基因与PDI基因分别在pCDFDuet-1的两个阅读框内表达，即共表达，见图3)表达载体的构建

1.先构建pCDFDuet-1-PDI(mcs2)表达载体(mcs2是多克隆表达位点，在第二个阅读框内)。设计以下引物：

引物P7：5’-TAACATATGGACGCTCCGGAAGAAGAGGACCAC-3’

引物P8：5’-CCGGGTACCTTACAGTTCATCTTTCACAGC-3’

P7含NdeI酶切位点(下划线CATATG)，P8含KpnI酶切位点(下划线GGTACC)。以pET28b-PDI(本实验室构建并保存)中的PDI基因序列为模板，按照上面所述的扩增目的片段的PCR方法，扩增其中的PDI基因。按实施例1所述方法纯化回收PCR产物中的扩增子。用NdeI和KpnI分别双酶切质粒载体pCDFDuet-1和纯化的扩增子PDI基因序列。

用DNA纯化试剂盒(BBI)分别回收酶切后的线性化载体和PCR扩增子片段，按上面所述连接方法进行连接，用连接产物转化菌株Mach1并培养，通过提取质粒获得pCDFDuet-1-PDI(mcs2)载体。

2.再构建pCDFDuet-1-sumoQ6-PDI表达载体。设计以下引物：

引物P5：5’-CATCACCACAGCCAGATGTCGGACTCAGAAGTC-3’

引物P9：5’-CCGAGCTCGAATTCGTCAAATAAGCTCAGGTCCC-3’

P9第1-15个核苷酸(下划线部分)与表达载体pCDFDuet-1的反义链BamHI切割位点5’端15个核苷酸完全一致，第16-36个核苷酸与Q6基因3’核苷酸序列反向互补。采用P5和P9引物，以实施例1构建的pETsumoQ6表达载体中操作性相连的sumoQ6基因序列为模板，按照上面所述的扩增目的片段的PCR方法，扩增sumoQ6融合蛋白基因序列。

按上面所述方法纯化，获得含有pCDFduet-1-PDI(mcs2)BamHI酶切位点上下游各15bp同源片段的sumoQ6融合蛋白基因序列。用BamHI单酶切pCDFDuet-1(mcs2)质粒，再用DNA纯化试剂盒(BBI公司)回收得到线性化pCDFDuet-1-PDI(mcs2)载体。按上面所述同源重组连接方法将sumoQ6融合蛋白基因连接入pCDFDuet-1-PDI(mcs2)载体中与PDI基因同源重组，用此重组质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取质粒获得表达载体pCDFDuet-1-sumoQ6-PDI。

实施例3.pCDFDuet-1-sumoPDIQ6表达载体(构建此质粒目的是将其中的PDI基因与Q6基因序列前后位置互换，以观察其与pCDFDuet-1-sumoQ6PDI相比那种更好)

1.先构建pETsumoPDIQ6中间质粒

设计以下引物：

引物P1：5’-ATGGCCCCGCGGTCGGCGCTCTATTC-3’

引物P10：5’-ACCACCAATCTGTTCTCTGTGAGCCTC-3’

P10与sumo融合标签序列的3’端反向互补。用P1和P10为引物，以实施例1制备的pETsumoQ6为模板，按照上面所述的长片段PCR扩增方法扩增线性化的载体pETsumoQ6，其中断裂点在sumo基因和Q6基因之间。

同时设计以下引物：

引物P11：5’-GAACAGATTGGTGGTATGGACGCTCCGGAAG-3’

引物P12：5’-CGACCGCGGGGCCATTTACAGTTCATCTTTCAC-3’

P11第1-15个核苷酸(下划线部分)与pETsumoQ6表达载体sumo基因的3’端序列相一致，第16-31个核苷酸与PDI基因5’端核苷酸序列相一致。P12第1-15个核苷酸(下划线部分)与Q6基因5’端15个核苷酸序列反向互补，第16-33核苷酸与PDI 3’核苷酸序列反向互补。用P11和P12引物，以pET28b-PDI载体(本实验室构建并保存)中的PDI基因序列为模板，按照上面所述的目的片段PCR扩增方法扩增PDI基因序列。

用实施例1所述的纯化方法分别回收PCR扩增得到的线性化pETsumoQ6和PDI基因序列。按上面所述同源重组连接方法将PDI基因序列连接入表达载体pETsumoQ6中，用该重组载体转化菌株Mach1并培养，通过提取质粒获得表达载体pETsumoPDIQ6。

2.再构建pCDFDuet-1-sumoPDIQ6表达载体

设计以下引物：

引物P5：5’-CATCACCACAGCCAGATGTCGGACTCAGAAGTC-3’

引物P9：5’-CCGAGCTCGAATTCGTCAAATAAGCTCAGGTCCC-3’

采用P5和P9引物，以实施例1构建的pETsumoPDIQ6质粒中操作性相连的sumo-PDI-Q6基因序列为模板，按所述长片段PCR扩增方法扩增获得sumoPDIQ6融合蛋白的基因序列。

按照上面所述的方法纯化获得含有pCDFduet-1BamHI酶切位点上下游各15bp同源片段的sumoPDIQ6融合蛋白基因序列。用BamHI单酶切pCDFDuet-1使之线性化，用DNA纯化试剂盒(BBI公司)回收得到线性化载体pCDFDuet-1。按上面所述同源重组连接方法将sumoPDIQ6融合蛋白基因序列连接入载体pCDFDuet-1中，用该重组质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取质粒获得表达载体pCDFDuet-1-sumo PDI Q6。

实施例4.pCDFDuet-1-sumoPDIQ6(295-540)表达载体的构建

1.先构建pETsumoQ6(295-604)(含Q6蛋白295-604区段截短体序列的)中间质粒。

设计以下引物：

引物P13：5’-GATCGCTCCAAGATCTACATGGCTGACCTG-3’

引物P10：5’-ACCACCAATCTGTTCTCTGTGAGCCTC-3’

P13与Q6基因编码第295-304号氨基酸的核苷酸序列相一致。用P13和P10为引物，以实施例1制备的pETsumoQ6为模板，按照上面所述的长片段PCR扩增方法扩增其中的Q6截短区段编码序列，此截短序列不含编码N端第30-294个氨基酸的核苷酸序列(1-29氨基酸是真核细胞定位信号，原核表达的Q61-29位氨基酸已被切除)。

按照上面所述方法纯化并回收PCR扩增产物，并按照上面所述的DNA片段5’端磷酸化方法，用T4磷酸化酶(PNK)在PCR扩增产物的5’末端加入一个磷酸基团，再按照上面所述的DNA片段5’端磷酸化产物环化反应，使线性载体重新环化，然后用其转化克隆菌株并培养，通过提取质粒获得中间质粒pETsumoQ6(295-604)。

2.再构建pETsumoQ6(295-540)中间质粒

设计以下引物：

引物P14：5’-AGACAAGCTTAGGTATTTATTCGGCGC-3’

引物P15：5’-CTAGATGTTGCTTGGGGAGAAGTG-3’

P14与实施例1制备的载体pETsumoQ6中Q6基因3’端序列相一致，P15与编码Q6第534-540位氨基酸的核苷酸序列反向互补。采用P14和P15为引物，以上面制备的pETsumoQ6(295-604)中间质粒为模板，按照上面所述的长片段PCR扩增方法，扩增得到不含Q6的30-294和541-604氨基酸的核苷酸序列的线性化载体。按照上面所述的方法纯化并回收该线性化载体，并按照上面所述的DNA片段5’端磷酸化方法，用T4磷酸化酶(PNK)在PCR扩增产物的5’末端加入一个磷酸基团，再按照上面所述的DNA片段5’端磷酸化产物环化反应，使线性载体重新环化，然后用其转化克隆菌株并培养，通过提取质粒获得表达Q6截短体的表达载体pETsumoQ6(295-540)。

3.构建pETsumoPDIQ6(295-540)表达载体

设计以下引物：

引物P13：5’-GATCGCTCCAAGATCTACATGGCTGACCTG-3’

引物P10：5’-ACCACCAATCTGTTCTCTGTGAGCCTC-3’

采用P13和P10为引物，以上面构建的pETsumoQ6(295-540)为模板，按照上面所述的长片段PCR扩增方法扩增线性化的载体pETsumoQ6(295-540)，其中断裂点在sumo基因和Q6(295-540)基因之间。同时，

设计以下引物：

引物P11：5’-GAACAGATTGGTGGTATGGACGCTCCGGAAG-3’

引物P16：5’-GATCTTGGAGCGATCTTACAGTTCATCTTTCAC-3’

P11第1-15个核苷酸(下划线部分)与pETsumoQ6(295-540)表达载体sumo基因的3’端序列相一致，第16-31个核苷酸与PDI基因5’端核苷酸序列相一致。P12第1-15个核苷酸(下划线部分)与编码Q6第295-299位氨基酸的核苷酸序列反向互补，第16-33个核苷酸与PDI基因的3’核苷酸序列反向互补。采用P11和P16引物，以pET28b-PDI载体(本实验室构建并保存)中的PDI基因序列为模板，按照上面所述的目的片段PCR扩增方法扩增PDI基因序列。

按照实施例1所述方法分别纯化并回收PCR扩增的线性化pETsumoQ6(295-540)质粒和PDI基因序列。按上面所述同源重组连接方法将PDI基因序列连接入pETsumoQ6中，用此重组质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取质粒获得中间载体pETsumoPDIQ6(295-540)。

4.构建表达载体pCDFDuet-1-sumoPDIQ6(295-540)。

设计以下引物：

引物P5：5’-CATCACCACAGCCAGATGTCGGACTCAGAAGTC-3’

引物P17：5’-CCGAGCTCGAATTCGGATGTTGCTTGGGGAGAAG-3’

P17第1-15个核苷酸(下划线部分)与表达载体pCDFDuet-1反义链BamHI切割位点5’端15个核苷酸完全一致，第16-34核苷酸与编码Q6第535-540位氨基酸的核苷酸序列反向互补。采用P5和P17引物，以上面构建的pETsumoPDIQ6(295-540)中操作性相连的sumo-PDI-Q6(295-540)基因序列为模板，按所述长片段PCR扩增方法扩增sumoPDIQ6(295-540)融合蛋白基因序列。

按照上面所述的方法纯化获得含有pCDFduet-1BamHI酶切位点上下游各15bp同源片段的sumoPDIQ6(295-540)的融合蛋白基因序列。用BamHI单酶切pCDFDuet-1使之线性化，用DNA纯化试剂盒(BBI公司)回收得到线性化载体pCDFDuet-1。按上面所述同源重组连接方法将sumoPDIQ6(295-540)融合蛋白基因序列连接入pCDFDuet-1质粒中，用该重组质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取质粒获得表达载体pCDFDuet-1-sumo PDI Q6(295-540)。

实施例5.pCDFDuet-1-sumoQ6(295-540)PDI表达载体的构建

1.先构建pCDFDuet-1-sumoQ6(295-540)表达载体

设计以下引物：

引物P5：5’-CATCACCACAGCCAGATGTCGGACTCAGAAGTC-3’

引物P17：5’-CCGAGCTCGAATTCGGATGTTGCTTGGGGAGAAG-3’

采用P5和P17引物，以实施例1制备的pETsumoQ6(295-540)中间质粒中操作性相连的sumo-Q6(295-540)基因序列为模板，按所述目的片段PCR扩增方法扩增sumoQ6(295-540)融合蛋白的基因序列。

按照上面所述的方法纯化获得含有pCDFduet-1BamHI酶切位点上下游各15bp同源片段的sumoQ6(295-540)的融合蛋白基因序列。用BamHI单酶切pCDFDuet-1使之线性化，用DNA纯化试剂盒(BBI公司)回收得到线性化载体pCDFDuet-1。按上面所述同源重组连接方法将sumoQ6(295-540)融合蛋白基因序列连接入pCDFDuet-1质粒中，用该重组质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取质粒获得表达载体pCDFDuet-1-sumoQ6(295-540)。

2.构建pCDFDuet-1-sumoQ6(295-540)PDI表达载体

设计以下引物：

引物P18：5’-TTGAGCTCTCTATGGACGCTCCGGAAG-3’

引物P19：5’-GCCAAGCTTTTACAGTTCATCTTTCACAGC-3’

P18含SacI酶切位点(下划线GAGCTC)，P19含HindIII酶切位点(下划线AAGCTT)。采用P18和P19为引物，以pET28b-PDI(本实验室构建并保存)为模板，按照上面所述的目的片段扩增PCR方法扩增PDI基因序列。按实施例1所述方法纯化并回收PCR产物。用SacI和HindIII分别双酶切质粒pCDFDuet-1-sumoQ6(295-540)和纯化的扩增子PDI基因序列。

用DNA纯化试剂盒(BBI)分别回收酶切的质粒和PCR产物片段，用所述连接体系进行连接，取连接产物转化菌株Mach1并培养，通过提取获得pCDFDuet-1-sumoQ6(295-540)PDI质粒。

实施例6.pCDFDuet-1-sumoQ6PDI-PPI载体(含串联的Q6-PDI-肽基-脯氨酰顺反异构酶(PPI)基因)质粒(Q6与PDI在同一阅读框内串联表达，PPI在另一阅读框内分开表达，见图3)的构建

设计以下引物：

引物P20：TAACATATGTATGGTCAACCCCAC-3’

引物P21：CCGGGTACCTTATTCGAGTTGTC-3’

P20含NdeI酶切位点(下划线CATATG)，P21含KpnI酶切位点(下划线GGTACC)。以pET15b-PPI(本实验室构建并保存)质粒为模板，按照上面所述的目的片段扩增PCR方法扩增其中的PDI基因序列。按实施例1所述方法纯化并回收PCR产物。用NdeI和KpnI分别双酶切实施例1构建的质粒载体pCDFDuet-1-sumoQ6PDI和纯化的扩增子PDI基因序列。

用DNA纯化试剂盒(BBI)分别回收酶切的载体和PDI基因序列，用所述连接体系进行连接，取连接产物转化菌株Mach1并培养，通过提取获得pCDFDuet-1-sumoQ6PDI-PPI质粒。

实施例7pCDFDuet-1-sumoEro1-LαPDI表达载体(Ero1-Lα是人源Ero1家族蛋白之一)的构建

1.先构建pETsumoEro1-Lα中间载体

设计以下引物：

引物P22：5’-GAGGAGCAGCCCCCGGAGAC-3’

引物P23：5’-ATGAATATTCTGTAACAAGTTC-3’

P22与Ero1-Lα基因序列的5’端完全一致，P23与Ero1-Lα基因序列的3’端完全反向互补。采用P22和P23引物，以pET28a-Ero1-Lα载体(本实验室构建并保存)中的Ero1-Lα基因序列为模板，按照上面所述的目的片段PCR扩增方法扩增Ero1-Lα基因序列。经过扩增后，PCR体系中再加入0.5μL Taq DNA聚合酶，72℃反应10min，使PCR产物3’末端加入一个A(腺嘌呤核苷酸)。PCR产物按照上面所述的方法纯化并回收其中的扩增子，使之直接连接入pETsumo质粒中。用连接完成后的质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取获得pETsumoEro1-Lα中间质粒。

2.构建pCDFDuet-1-sumoEro1-Lα表达载体

设计以下引物：

引物P5：5’-CATCACCACAGCCAGATGTCGGACTCAGAAGTC-3’

引物P24：5’-CCGAGCTCGAATTCGATGAATATTCTGTAACAAG-3’

P24的第1-15个核苷酸(下划线部分)与表达载体pCDFDuet-1反义链BamHI切割位点5’端15个核苷酸完全一致，第16-34个核苷酸与Ero1-Lα基因3’核苷酸序列反向互补。采用P5和P24引物，以上面制备的pETsumoEro1-Lα质粒中操作性相连的sumo-Ero1-Lα基因序列为模板，按上述目的片段PCR扩增方法扩增sumoEro1-Lα融合蛋白的基因序列。

按照上面所述的方法纯化获得含有pCDFDduet-1中BamHI酶切位点上下游各15bp同源片段的sumoEro1-Lα融合基因序列。另用BamHI单酶切pCDFDuet-1质粒使之线性化，用DNA纯化试剂盒(BBI公司)回收线性化的pCDFDuet-1质粒。按上面所述同源重组连接方法将sumoEro1-Lα融合基因序列连接入pCDFDuet-1中，用该重组质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取获得表达载体pCDFDuet-1-sumoEro1-Lα质粒。

3.构建pCDFDuet-1-sumoEro 1-LαPDI表达载体

采用实施例5-2扩增的PDI基因序列作SacI和HindIII双酶切。同时用SacI和HindIII双酶切上面获得的质粒载体pCDFDuet-1-sumoEro1-Lα。

用DNA纯化试剂盒(BBI)回收酶切的载体和PDI基因序列，按上面所述的双酶切连接方法将二者连接成环，取连接后的质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取获得pCDFDuet-1-sumoEro 1-LαPDI质粒。

实施例8.pCDFDuet-1-Erv2-cPDI(含巯基氧化活性结构域Erv2-c和PDI基因序列)表达载体的构建

1.先构建pETsumoErv2-c中间载体

设计以下引物：

引物P25：5’-ATGCCATTGATGGGCGATGAC-3’

引物P26：5’-ACCGTGCTGTTTAGCCTCCTTC-3’

P25与编码Erv2第69-75个氨基酸的核苷酸序列完全一致，P26与Erv2编码序列的3’端完全反向互补。采用P25和P26引物，以酿酒酵母(BY4741)基因组(本实验室制备，其中包含有Erv2-c基因序列)为模板，按照上面所述的目的片段PCR扩增方法扩增Erv2-c序列。经过以上步骤后，在PCR体系中加入0.5μL TaqDNA聚合酶，72℃反应10min，使PCR产物3’末端加入一个A(腺嘌呤核苷酸)。按照上面所述的方法纯化并回收PCR产物中的扩增子，将其直接入pETsumo中。用连接完成后的质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取获得pETsumoErv2-c中间质粒。

2.构建pCDFDuet-1-sumoErv2-c表达载体

设计以下引物：

引物P5：5’-CATCACCACAGCCAGATGTCGGACTCAGAAGTC-3’

引物P27：5’-CCGAGCTCGAATTCGACCGTGCTGTTTAGCCTCC-3’

P27的第1-15个核苷酸(下划线部分)与表达载体pCDFDuet-1反义链BamHI切割位点5’端15个核苷酸完全一致，第16-34个核苷酸与Erv2基因3’核苷酸序列反向互补。采用P5和P27引物，以pETsumoErv2-c中间质粒中的操作性相连的sumo-Erv2-c基因序列为模板，按照上面所述的目的片段PCR扩增方法扩增sumoErv2-c融合基因。

按照上面所述的方法纯化获得含有pCDFDduet-1的BamHI酶切位点上下游各15bp同源片段的sumoErv2-c融合基因序列。另用BamHI单酶切pCDFDuet-1使之线性化，用DNA纯化试剂盒(BBI公司)回收得到线性化的pCDFDuet-1。按上面所述同源重组连接方法将sumoErv2-c融合基因连接入载体pCDFDuet-1中，用该重组质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取获得表达载体pCDFDuet-1-sumoErv2-c质粒。

3.构建pCDFDuet-1-sumoErv2-cPDI表达载体

采用实施例5-2扩增的PDI基因序列作SacI和HindIII双酶切。同时用SacI和HindIII双酶切上面获得的质粒载体pCDFDuet-1-sumoErv2-c。

用DNA纯化试剂盒(BBI)分别回收酶切的载体和PDI基因序列，按上面所述的双酶切连接方法将二者连接成环，取连接后的质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取获得pCDFDuet-1-sumoErv2-cPDI表达质粒。

实施例9.pET28a-rpa(含重组人组织纤溶酶原激活蛋白rpa基因)质粒的构建

设计以下引物：

引物P28：5’-GGGCCATGGCGTCTTACCAAGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGG-3’

引物P29：5’-GTGGCGGCCGCTCACGGTCGCATGTTGTCACGAATC-3’

P28含NcoI酶切位点(下划线CCATGG)，第10-11个核苷酸是添加的防止移码突变的两个核苷酸，第12-20个核苷酸与编码tpa第1-3个氨基酸的核苷酸序列相一致，第21-44个核苷酸与编码tpa第176-183个氨基酸(tpa第二个铰链区N端的8个氨基酸)的核苷酸序列相一致。P29含NotI酶切位点(下划线，GCGGCCGC)，第15-36个核苷酸与tpa(人组织纤溶酶原激活蛋白)基因3’端反向互补。采用P28和P29为引物，以pBOT7-tpa(本实验室制备，其中包含有tpa基因序列)为模板，按照上面所述目的片段扩增PCR方法扩增其中的rpa基因序列。按实施例1所述方法纯化并回收PCR产物中的rpa基因序列用NcoI和NotI双酶切，同时用此二酶双酶切体质粒pET28a。

用DNA纯化试剂盒(BBI)分别回收酶切的载体和rpa基因序列，按上面所述同源重组连接方法将二者连接成环，取连接后的质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取获得pET28a-rpa质粒。pET28a-rpa本身含卡那霉素抗性基因，不能在Origami B(基因组含kana抗性基因)菌株中筛选，故又构建了实施例10的pET22b-rpa质粒

实施例10.pET22b-rpa质粒的构建(用于在Origami B菌株中表达rpa)

设计以下引物：

引物P30：5’-GGGCATATGTCTTACCAAGGAAACAGTGACTGCTACTT TGGG-3’

引物P29：5’-GTGGCGGCCGCTCACGGTCGCATGTTGTCACGAATC-3’

P30含NdeI酶切位点(下划线CATATG)，第10-18个核苷酸与编码tpa第1-3个氨基酸的核苷酸序列相一致，第21-44个核苷酸与编码tpa第176-183个氨基酸(tpa第二个铰链区N端的8个氨基酸)的核苷酸序列相一致。采用P30和P29为引物，以pBOT7-tpa(本实验室制备，其中包含有tpa基因序列)为模板，按照上面所述的目的片段扩增PCR方法扩增rpa基因。按实施例1所述方法纯化并回收PCR产物中的rpa基因序列用NcoI和NotI双酶切，同时用此二酶双酶切质粒载体pET22b。

用DNA纯化试剂盒(BBI)分别回收酶切的载体和rpa基因序列，按上面所述双酶切连接方法将二者连接成环，取连接后的质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取获得pET22b-rpa质粒。

实施例11.pET22b-GLuc质粒(含Gaussia荧光素酶Gluc基因)的构建

设计以下引物：

引物P31：5’-GGGCATATGAAGCCCACCGAGAACAACG-3’

引物P32：5’-TAACTCGAGTGCGGCCGCGTCACCACCG-3’

P31含NdeI酶切位点(下划线CATATG)，P30含XhoI酶切位点(下划线CTCGAG)。采用P31和P30为引物，以pGLuc-Basic(购自NEB的含GLuc基因的真核表达载体)质粒为模板，按照上述目的片段扩增PCR方法扩增其中的GLuc基因序列。按实施例1所述方法纯化并回收PCR产物中的GLuc基因序列用NdeI和NotI双酶切，同时用此二酶双酶切质粒载体pET22b。

用DNA纯化试剂盒(BBI)分别回收酶切的载体和GLuc基因序列，按上面所述双酶切连接方法将二者连接成环，取连接后的质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取获得pET22b-GLuc质粒，其中GLuc基因的3’端含有编码组氨酸标签的核苷酸序列。

实施例12.pET28a-BMP2质粒(含骨形态发生蛋白2-BMP2基因)的构建

设计以下引物：

引物P33：5’-GGGCCATGGCTCAAGCCAAACACAAACAGCG-3’

引物P34：5’-GGGGAATTCCTAGCGACACCCACAACCCTCC-3’

P27含NcoI酶切位点(下划线CATATG)，P28含EcoRI酶切位点(下划线GAATTC)。采用P27和P28为引物，以pINCY-BMP2(本实验室制备保存，其中包含有BMP2基因)质粒为模板，按照上述目的片段扩增PCR方法扩增其中的BMP2基因序列。按实施例1所述方法纯化并回收PCR产物中的BMP2基因序列用NcoI和NotI双酶切，同时用此二酶双酶切质粒载体pET28a。

用DNA纯化试剂盒(BBI)分别回收酶切的载体和BMP2基因序列，按上面所述双酶切连接方法将二者连接成环，取连接后的质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取获得pET28a-BMP2质粒。

实施例13.pET28a-VEGF121质粒(含血管内皮生长因子VEGF121基因)的构建

设计以下引物：

引物P35：5’-GGGCCATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATC-3’

引物P36：5’-GGGCTCGAGTCACCGCCTCGGCTTGTCAC-3’

P29含NcoI酶切位点(下划线CATATG)，P28含XhoI酶切位点(下划线GAATTC)。采用P29和P30为引物，以pET15b-VEGF121(本实验室制备保存，含VEGF121基因)为模板，按照上述目的片段扩增PCR方法扩增VEGF121基因序列。按实施例1所述方法纯化并回收PCR产物中的VEGF121基因序列用NcoI和XhoI双酶切，同时用此二酶双酶切质粒载体pET28a。

用DNA纯化试剂盒(BBI)分别回收酶切的载体和VEGF121基因序列，按上面所述双酶切连接方法将二者连接成环，取连接后的质粒转化菌株Mach1并培养，通过提取获得pET28a-VEGF121质粒。

实施例14.对纯化Q6-PDI融合蛋白或其截短体的巯基氧化活性的测定

1.纯化Q6与PDI融合蛋白或其截短体

按照萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》，第一章，方案1.25常规操作，制备大肠杆菌BL21感受态，分别用上述pCDFDuet-1-sumoQ6PDI、pCDFDuet-1-sumoPDIQ6、pCDFDuet-1-sumoPDIQ6(295-540)、pCDFDuet-1-sumoQ6(295-540)PDI重组质粒转化，然后分别接种含相应抗菌素的LB平板，培养后分别挑取单个阳性菌落移至5mL LB培养液中37℃培养过夜。第二天分别取培养菌转接种100mL LB培养液锥形瓶，37℃振荡培养3-4小时。当菌液OD600达到约0.6-0.8时加入终浓度0.5mM的IPTG诱导表达，同时加入终浓度5μM黄素腺苷酸二核苷酸磷酸(FAD)，18℃培养16-20小时。诱导培养结束后，4000rpm离心20分钟收集菌体沉淀，-80℃保存。

分别用10ml镍柱纯化平衡缓冲液(20mM磷酸钠、500mM NaCl、10mM咪唑，pH 7.4)重悬上述各沉淀菌体，转移到15ml离心管中置于冰上，冰浴超声波破碎细胞，超声仪设定：探头Φ6，功率30％，工作1s，间隔3s，总工作200s，共进行4轮超声破碎，然后4℃10000rpm离心破碎菌体悬液30分钟，分离上清液与沉淀。

分别用自装Ni²⁺亲和层析柱纯化各上清液中的所需各重组蛋白。

Ni²⁺亲和层析柱的凝胶介质：通用公司(GE Healthcare)的Ni2+螯合Sepharose FastFlow，6mL柱和0.22um滤膜垫片。按公司说明书操作，加入Ni2+亲和层析凝胶装柱；

平衡缓冲液：20mM磷酸钠、500mM NaCl、10mM咪唑，pH 7.4；

洗涤缓冲液：20mM磷酸钠、500mM NaCl、50mM咪唑，pH 7.4；

洗脱缓冲液：20mM磷酸钠、500mM NaCl、200mM咪唑，pH 7.4；

清洁缓冲液：20mM磷酸钠、500mM NaCl、500mM咪唑，pH7.4。

采用重力流方式，先用5-10倍柱体积的抽滤脱气去离子水清洗柱。然后用5-10倍柱体积的平衡缓冲液平衡柱。取分离的各上清液上柱，收集流穿液。上样结束后用20倍柱体积的平衡缓冲液平衡柱，然后用5倍柱体积的洗涤缓冲液除去未结合的杂蛋白；再用5倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱的所需蛋白液，用SDS-PAGE鉴定洗脱蛋白的纯度大约为90％。用10倍清洁缓冲液清洗柱除去残留的强结合杂蛋白。换用去离子水清洗20个柱体积去除盐离子。若暂时不用加入20％乙醇4℃保存。

蛋白定量：纯化得到的四种融合蛋白[sumoQ6PDI、sumoPDIQ6、sumoQ6(295-540)PDI、sumoPDIQ6(295-540)]，各取40μL加到384孔白色透明板各孔中，用Synergy2多功能酶标仪(美国BioTek公司)测定各孔的280nm光吸收值，从EXPASY网站查到四种融合蛋白的摩尔消光系数，计算出四种融合蛋白各自的浓度。

2.四种融合蛋白氧化二硫苏糖醇(DTT)的活性测定

DTT是含有两个巯基的小分子，常作为被巯基氧化酶氧化的巯基小分子模式底物(31)。巯基氧化酶催化底物的巯基使之被氧化而形成二硫键，同时产生过氧化氢，过氧化氢在HRP作用下能氧化高香草酸(HVA)，使之产生一种荧光物质，用360nm波长光激发，此荧光物质可产生485nm波长的发射光，通过检测发射光强度的动态变化可以衡量巯基氧化酶氧化小分子巯基的活性变化。

在80μL的反应体系中含有500nM浓度的各融合蛋白、5mM DTT、HVA、辣根过氧化物酶(HRP)，将其加入384孔黑色荧光板(Greiner Bio One公司)的不同孔中，用Synergy2多功能酶标仪(美国BioTek公司)测定360nm激发光产生的485nm发射光强度变化，来标定各融合蛋白中的巯基氧化酶(Q6或其截短体)氧化底物巯基的活性。结果显示，单独PDI无活性，而四种融合蛋白都有氧化DTT巯基的活性(如图5)，其中Q6(295-540)PDI活性最强。

3.四种融合蛋白氧化还原态核酸酶A(rRNase)活性的测定

核酸酶A(RNase)中含有4对二硫键，还原状态下含有8个游离巯基，常作为巯基氧化酶氧化蛋白质巯基的模式底物(31)，测定巯基氧化酶氧化还原态RNase活性的方法同上面DTT活性测定所述。

还原态RNase(rRNase)的制备：在5mg/ml的RNase A(购自sigma)中加入50mMDTT，4℃反应4h。用5ml HiTrap HP Desalting(购自GE healthcare公司)脱盐柱和AKTAprimer蛋白纯化仪(美国GE公司)分离除去DTT还原RNase反应中过量加入的可能干扰巯基氧化酶氧化还原态RNase活性的DTT，并用上述测定280nm光吸收的蛋白质定量方法确定实施例14-1中Q6相关融合蛋白的浓度。用5，5′二硫代双2-硝基苯甲酸(DTNB)测定rRNase中的巯基浓度，在384孔白色透明板孔中加入40μL rRNase+40μL 4mM DTNB使之反应，用多功能酶标仪测定412nm光吸收值(A412)，并用标准DTT浓度来标定rRNase的巯基浓度。

在80μL的反应体系中含有500nM浓度的融合蛋白、含300μM巯基的rRNase、HVA、HRP，将其加入384孔黑色荧光板(Greiner Bio One公司)的不同孔中，用Synergy2多功能酶标仪(美国BioTek公司)测定360nm激发光产生的485nm发射光强度变化，来标定各融合蛋白中巯基氧化酶(Q6或其截短体)氧化rRNase巯基的活性。结果显示，单独PDI无活性，四种融合蛋白都有氧化rRNase巯基的活性(如图6)，以Q6(295-540)PDI的活性最高。

实施例15.Q6和PDI融合蛋白细胞外诱导还原型rpa复性

如实施例14所述制备大肠杆菌BL21感受态，用上述pET28a-rpa质粒转化后，接种含相应抗菌素的LB平板，培养后挑取单个阳性菌落移至5mL LB培养液中37℃培养过夜。第二天取培养菌转接种100mL LB培养液锥形瓶，37℃振荡培养3-4小时。当菌液OD600达到约0.6-0.8时加入终浓度1mM的IPTG诱导表达，37℃培养4-6小时。诱导结束后，4000rpm离心20分钟收集菌体沉淀，-80℃保存。

用PBS(NaCl 137mM，KCl 2.7mM，Na2HPO44.3mM，KH2PO41.4mM，PH7.4)重悬上述沉淀菌体，转移到15ml离心管中置于冰上，冰浴超声波破碎细胞，超声仪设定：探头Φ6，功率30％，工作1s，间隔3s，总工作200s，共进行4轮超声破碎，10000rpm离心破碎后的菌体悬液30分钟。取沉淀用变性液(50mM Tris-HCl，8M脲，5mMEDTA，PH8.5)充分溶解包涵体还原型rpa蛋白(简写为rrpa)，加入终浓度200mM的DTT(巯基还原剂，常用于还原蛋白质的二硫键，作用与巯基乙醇类似，但相同浓度下还原能力比巯基乙醇强七倍左右)，37℃培育2h，10000rpm离心10mins，取上清液。

按实施例14-3所述除去DTT的方法，以变性液为缓冲液，分离除去rrpa样品中的DTT，并定量测定rrpa浓度。用DTNB测定巯基的浓度方法测定rrpa的巯基浓度，计算出单个分子rrpa的巯基个数。

保证获得的rrpa样品不含有多余的DTT(测得的巯基数不多于18个)，并且rrpa完全被还原(测定的巯基个数不少于18个)或至少95％的巯基被还原(测得的巯基个数不少于17个)。根据rrpa浓度的不同，用稀释液(50mM Tris-HCl，5mM EDTA，PH8.5)将rrpa样品稀释4-100倍，加入终浓度100nM-10μM的PDI与Q6的融合蛋白(PDIQ6或Q6PDI等)使之氧化。37℃孵育1-24h。然后测定活性rpa的浓度。

用上述rpa活性测定方法测定稀释液中活性rpa的浓度，显示rpa的复性效率达到20％以上(如图7)。

实施例16.在大肠杆菌中共同表达Q6PDI融合蛋白、PPI和目的蛋白rpa

本实施例采用含上述巯基氧化酶和二硫键形成相关酶基因的表达载体与含二硫键蛋白质如rPA，tPA基因的其他表达载体，共同转化大肠杆菌BL21(DE3)，或Rosetta(DE3)，或Rosetta gami B(DE3)等菌株，获得双基因、三基因甚至四基因共表达菌株。培养这种重组大肠杆菌并诱导这些基因共同表达，通过酶活性测定，SDS-PAGE等方法研究共同表达的上述相关酶促进二硫键蛋白质正确折叠和分泌的功能。

目的蛋白(二硫键蛋白)基因以重组人组织纤溶酶原激活蛋白rpa为例。取pET28a-rpa质粒分别与pCDFDuet-1-sumoQ6、pCDFDuet-1-sumoQ6PDI、pCDFDuet-1-sumoQ6PDI-PPI质粒共同转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株。对照为：pET28a-rpa单独转化的Rosetta(DE3)菌株，pET28a-rpa与实施例2构建的pCDFDuet-1-PDI(mcs2)质粒共同转化的Rosetta(DE3)菌株。pET28a和pCDFDuet-1的筛选抗性分别为卡那霉素和链霉素，可筛选得到同时含有这两个质粒的菌落。这两种质粒中的复制起始位点分别是pBR322起点和CDF起点，因此两质粒在大肠杆菌宿主细胞内能同时稳定存在；而Rosetta(DE3)自身携带的表达稀有密码子质粒含氯霉素抗性基因。用含氯霉素、链霉素和卡那霉素的LB培养基不难选出用两种质粒共同转化获得的共同表达二基因(rpa与PDI，对照)、共同表达三基因(rpa与Q6PDI融合蛋白)、或共同表达四基因(rpa与Q6PDI-PPI融合蛋白)的菌落。培养这种重组表达菌至OD600＝0.8-1.0时，加入终浓度0.3mM的IPTG和10μM的Q6酶的辅基黄素腺苷酸二核苷酸磷酸(FAD)，18℃培养20h诱导共表达。然后取1ml菌液4000rpm离心5分钟收菌，重悬于含10mMEDTA的PBS液。如上所述冰浴超声波破碎细胞，离心分离上清液与沉淀，按上面所述方法检测上清液中的活性rpa和含量。单独表达rpa的上清液几乎测不到活性rpa表明其没能正确折叠复性和分泌，共同表达PDI与rpa的上清液有0.05μM浓度的活性rpa；而共同表达二种或三种酶可以检测到0.1-0.2μM浓度的活性rpa(见图8)。将共表达上清液放置25℃24h，或4℃48h，活性rpa的含量继续提高10％-30％。SDS-PAGE图显示，这种上清液的活性rpa含量可达到rpa总表达量的20-30％，占上清液总蛋白的5-10％，以rpa与Q6PDI-PPI四基因共表达的上清液rpa含量最高(见图9)。

取pET28a-rpa质粒与pCDFDuet-1-sumoQ6PDI共转化Rosetta(DE3)的菌株后，移至5mL LB培养液中37℃培养过夜。第二天取培养菌转接种100mL LB培养液锥形瓶，37℃振荡培养3-4小时。当菌液OD600达到约0.6-0.8时加入终浓度0.5mM的IPTG和终浓度5μM的黄素腺苷酸二核苷酸磷酸(FAD)，18℃培养16-20小时诱导表达。然后离心收集菌体沉淀，-80℃保存。按所述的rpa纯化方法纯化与sumoQ6PDI共表达的rpa，用活性rpa测定方法测定纯化rpa的活性，在活性rpa测定时，根据建立的活性rpa标准曲线，测定出100ml培养菌液中的活性rpa的含量，换算成1L培养菌液的活性rpa含量(见图10)。图10的结果表明Q6共表达可提高活性rpa的含量5倍左右，Q6PDI融合蛋白共表达可提高活性rpa的含量50倍左右。

实施例17.在大肠杆菌中共同表达PDIQ6融合蛋白与目的蛋白rpa

取pET28a-rpa质粒与pCDFDuet-1-sumoPDIQ6质粒共同转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株，如实施例16所述选择阳性菌落、培养、诱导共表达；提取纯化细菌裂解上清液中的rpa。在活性rpa测定时，根据建立的活性rpa标准曲线，测定出100ml培养菌液中活性rpa的含量，换算成1L培养菌液的活性rpa含量(见图11)。图11的结果表明，从30℃诱导的PDIQ6共表达菌纯化得到的活性rpa含量比18℃诱导的rpa-PDI共表达菌高40倍左右。

实施例18.在大肠杆菌中共同表达PDIQ6(295-540)融合蛋白与目的蛋白rpa

取pET28a-rpa质粒与pCDFDuet-1-sumoPDIQ6(295-540)质粒共同转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株，如实施例16所述选择阳性菌落、培养、诱导共表达；提取纯化细菌裂解上清液中的rpa。在活性rpa测定时，根据建立的活性rpa标准曲线，测定出100ml培养菌液中活性rpa的含量，换算成1L培养菌液的活性rpa含量(见图12)。图12的结果表明，从30℃诱导的rpa与PDIQ6(295-540)共表达菌纯化得到的活性rpa含量比18℃诱导的PDI-rpa共表达菌高20倍左右。

实施例19.在大肠杆菌中共同表达Q6、PDI与目的蛋白rpa

取pET22b-rpa质粒与pCDFDuet-1-sumoQ6-PDI质粒分别共同化大肠杆菌Rosetta(DE3)和Rosetta gami B菌株。对照为：pET22b-rpa转化的Rosetta gami B(DE3)菌株。如实施例16所述选择阳性菌落、培养、18℃诱导共表达；提取纯化细菌裂解上清液中的rpa。在活性rpa测定时，根据建立的活性rpa标准曲线，确定纯化rpa的浓度，分别测定出三种诱导表达条件所得100ml培养菌液中的活性rpa含量，换算成1L培养菌液的活性rpa含量(见图13)。图13显示，rpa与Q6和PDI共表达菌的裂解上清液纯化得到的可溶性rpa显著高于单独表达rpa的Rosetta gami B菌，尤其是Q6-PDI-rpa共表达的Rosettagami B菌纯化得到的可溶性rpa更高。

实施例20.在大肠杆菌中共同表达Ero1-LαPDI融合蛋白与目的蛋白rpa

取pET28a-rpa质粒与pCDFDuet-1-sumoEro1-LαPDI质粒共同转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株，如实施例16所述，选择阳性菌落、培养、30℃诱导共表达；提取纯化细菌裂解上清液中的rpa。在活性rpa测定时，根据建立的活性rpa标准曲线，测定出100ml培养菌液中活性rpa的含量，换算成1L培养菌液的活性rpa含量(见图14)。图14结果显示，从30℃诱导的Ero1-LαPDI-rpa共表达菌纯化得到的活性rpa含量比18℃诱导的PDI-rpa共表达菌高10倍左右。

实施例21.在大肠杆菌中共同表达Erv2-cPDI融合蛋白与目的蛋白rpa

取pET28a-rpa质粒与pCDFDuet-1-sumoErv2-cPDI质粒共同转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株，如实施例16所述，选择阳性菌落、培养、30℃诱导共表达；提取纯化细菌裂解上清液中的rpa。在活性rpa测定时，根据建立的活性rpa的标准曲线，测定出100ml培养菌液中的活性rpa含量，换算成1L培养菌液的活性rpa含量(见图15)。图15结果显示，30℃诱导的Erv2-cPDI-rpa共表达菌纯化得到的活性rpa含量比18℃诱导的PDI-rpa共表达菌高将近4倍。

实施例22.在大肠杆菌中共同表达Q6-PDI与目的蛋白人组织纤溶酶原激活蛋白(tpa)

取按实施例9类似方法构建的pET28a-tpa质粒分别与pCDFDuet-1-sumoQ6、pCDFDuet-1-sumoQ6-PDI质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株，如实施例16所述，选择阳性菌落，获得tpa-sumoQ6和tpa-sumoQ6-PDI共表达菌株。对照为：pET28a-tpa质粒分别转化的Rosetta和Rosetta gami B菌株；pET28a-tpa质粒和实施例2构建的pCDFDuet-1-PDI(mcs2)质粒共转化的Rosetta(DE3)菌株。培养、诱导共表达，获得细菌裂解上清液，按照上面所述的tpa活性测定方法，测定上清液中活性tpa的含量(见图16)。图16显示，单独表达tpa的Rosetta菌裂解上清液没有检测到活性tpa，共表达tpa-Q6-PDI的细菌裂解上清液中活性tpa含量高。

实施例23.在大肠杆菌中共同表达Q6PDI融合蛋白与目的蛋白tpa

取pET28a-tpa质粒与pCDFDuet-1-sumoQ6PDI质粒共同转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株，如实施例16所述，选择阳性菌落，获得tpa-sumoQ6PDI共表达菌株，培养、诱导共表达、获得细菌裂解上清液。按照上面所述的tpa活性测定方法，测定上清液中活性tpa的含量(见图17)。图17显示，tpa-Q6PDI共表达菌裂解上清液中活性tpa的含量高，而对照pET28a-tpa质粒单独转化的细菌裂解上清液中没有活性tpa。

实施例24.在大肠杆菌中共同表达Q6与目的蛋白Gaussia荧光素酶(GLuc)

取实施例11构建的pET22b-GLuc质粒与pCDFDuet-1-sumoQ6质粒共MG转化大肠杆菌BL21(DE3)，如实施例16所述选择阳性菌落，获得GLuc-sumoQ6共表达菌株。对照为：pET22b-GLuc质粒单独转化的BL21(DE3)菌株。培养、诱导共表达，获得细菌裂解上清液。

GLuc活性测定方法：取10μL含GLuc样品加入384孔板中，再加入30μL GLuc测活工作液[含10μL 100ng/mL荧光素Coelenterazine(购自NEB)与90μL 200mM NaCl，50mM Tris，0.08％(v/v)x-100，pH＝7.8]混合，混匀后立即用多功能酶标仪测定发射光强度，反映GLuc活性的大小(将单独表达GLuc的大肠杆菌BL21(DE3)裂解上清液测得的发射光强度定义为1个单位)。

用上述方法，测定裂解上清液中的GLuc相对活性(与单独表达GLuc细菌裂解上清液所测得发光强度相比的比值)(见图18)。图18表明，GLuc与Q6共表达菌裂解上清液的活性GLuc含量比单独表达GLuc菌的裂解上清液大大提高。

实施例25.在大肠杆菌中同共表达Q6PDI融合蛋白与目的蛋白GLuc

取pET22b-GLuc质粒与pCDFDuet-1-sumoQ6PDI质粒共同转化大肠杆菌BL21(DE3)，如实施例16所述，选择阳性菌落，获得GLuc-sumoQ6PDI共表达菌株。对照为：pET22b-GLuc质粒与pCDFDuet-1-PDI(mcs2)质粒转化的BL21(DE3)菌株。培养、诱导共表达、获得细菌裂解上清液。用上述GLuc活性测定方法，测定各裂解上清液中的GLuc相对活性(见图19)。图19显示，GLuc-Q6PDI共表达菌的裂解上清液中活性GLuc的含量比单独表达GLuc菌和共表达PDI-GLuc菌的裂解上清液大大提高。

GLuc蛋白的纯化：从所述重组质粒转化平板上挑取单个阳性菌落移至5mL LB培养基中37℃培养过夜。第二天取培养菌转接种100mL LB培养基锥形瓶，37℃振荡培养3-4小时。当菌液OD600达到约0.6-0.8时加入终浓度0.5mM的IPTG和终浓度5μM FAD，18℃培养16-20小时诱导表达。然后离心收集菌体沉淀，-80度保存。用实施例14所述的Ni柱方法纯化，得到含有组氨酸标签的荧光素酶GLuc和sumoQ6PDI蛋白的混合液。由于GLuc(19.6KD)和sumoQ6PDI(133KD)的分子量大小相差较大，可用分子筛凝胶层析纯化该混合液中的GLuc。采用HiPrep 16/60Sephacryl S-100HR(聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶S-100，购自美国GE Healthcare公司)和AKTA primer蛋白纯化仪(美国GE公司)，缓冲液为TBS(50mM Tris.HCl，150mM NaCl，pH 7.4)，按其说明书操作，收集含GLuc组分，得到电泳纯的GLuc。测定其蛋白含量，并用上述GLuc活性测定方法测定10nM GLuc的活性(见图20)。图20显示，与Q6PDI共表达纯化得到的GLuc比活性，远高于单独表达的GLuc，也高于PDI-GLuc共表达的，表明Q6PDI共表达促进了GLuc蛋白形成正确的二硫键从而折叠成正确构象提高了可溶性活性GLuc的产量。

实施例26.在大肠杆菌中共同表达Q6PDI与目的蛋白骨形态发生蛋白2(BMP2)

取实施例12构建的pET28a-BMP2质粒与pCDFDuet-1-sumoQ6PDI质粒共同转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，如实施例16所述，选择阳性菌落，获得BMP2-sumoQ6PDI共表达菌株。对照为：pET28a-BMP2质粒单独转化的大肠杆菌BL21(DE3)；pET28a-BMP2质粒分别与pCDFDuet-1-sumoQ6和pCDFDuet-1-PDI(mcs2)质粒共同转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。培养、诱导共表达，获得细菌裂解上清液，用BRADFORD法测定蛋白质浓度。取未经离心的细菌裂解液、含10μg蛋白的上清液和沉淀作还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，鉴定BMP2表达组分的分布状况(见图21)。结果显示，虽然就细菌总表达量而言，BMP2-Q6PDI共表达比BMP2单独表达低约30％，但只有BMP2-Q6PDI共表达菌裂解上清液中才有BMP2条带，而其它BMP2为包涵体沉淀蛋白。表明共表达的Q6PDI融合蛋白显著促进了可溶性BMP2的产生。

以上实施例16和图8和图10中，实施例17和图11中，实施例18和图12中，实施例20和图14中，实施例21和图15中，实施例22和图16中，实施例25和图19和图20中，及实施例26和图21中，都设立了模仿Ostermeier，M等j.BiolChem，1996，271(18)：10616-10622用PDI基因与目的蛋白基因共表达得到的对照，均显示该对照产生的可溶性功能目的蛋白比单独表达的目的蛋白要好，但不如本发明的多基因共表达目的蛋白。

实施例27.在大肠杆菌中共同表达PDIQ6与目的蛋白血管内皮生长因子(VEGF121)

取实施例13构建的pET28a-VEGF121质粒与pCDFDuet-1-sumoPDIQ6质粒共同转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，如实施例16所述，选择阳性菌落，获得VEGF121-sumoPDIQ6共表达菌株，对照为pET28a-VEGF121质粒单独转化的大肠杆菌BL21(DE3)。培养、诱导共表达，获得细菌裂解液，用BRADFORD法测定蛋白质浓度。取未经离心的细菌裂解液(各含10μg蛋白)作还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(见图22A)，显示各自表达的VEGF121总蛋白量。进一步用能识别天然活性VEGF的抗体作VEGF斑点印染鉴定来检测活性VEGF121。

VEGF斑点印染鉴定法：取一张2cm×1cm硝酸纤维素膜(NC膜)，在1em×1em的方框内分别点入1μL单独表达VEGF121，或共表达VEGF121-sumoPDIQ6的BL21(DE3)菌株裂解上清液待干，用封闭液(含1％酪蛋白(Casein)的TBS)封闭0.5-1h。加入一滴2.5μg/mL抗VEGF抗体(识别天然活性VEGF的抗体，购自罗氏制药公司)室温孵育30分钟，用TBS-T(含0.05％吐温20)洗三次，每次5分钟。加入一滴12.5ng/mL的辣根过氧化物酶(HRP)标记的蛋白A(Sigma公司，按其说明书操作)室温孵育30-60分钟。用TBS-T洗三次，每次5-10分钟。加入HRP底物液(购自罗氏化学公司)孵育1分钟后，进行曝光成像30分钟(见图22B)。

图22A显示，在二种转化BL21(DE3)菌株裂解液中，单独表达的VEGF121总表达量高于与sumoPDIQ6共表达的VEGF121。但图22B表明，与sumoPDIQ6共表达产生的可溶性活性VEGF121含量大约是单独表达的2-3倍。表明单独表达的VEGF121表达量虽较高，但大都是无活性的蛋白，而与sumoPDIQ6融合蛋白共表达促进了VEGF121蛋白形成正确的二硫键从而折叠成正确构象的活性VEGF121。

实施例28.鉴定rpa与PDIQ6融合蛋白所在的载体对产生有活性rpa的影响

按实施例9类似方法将目的蛋白rpa基因构建在pCDFDuet-1质粒中得到pCDFDuet-1-rpa质粒，与实施例3-1构建的pET-sumoPDIQ6质粒共同转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株(与实施例17相比，含rpa基因和含PDIQ6融合蛋白基因的质粒互换)，如实施例16所述，选择阳性菌落，培养、诱导共表达，获得细菌裂解上清液，用BRADFORD法测定蛋白质浓度。用rpa活性测定方法测定上清液中活性rpa的含量，与采用实施例17的pET28a-rpa质粒和pCDFDuet-1-sumoPDIQ6质粒转化共表达菌体的裂解上清液作比较(见图23)。图23的结果显示pET28a-rpa与pCDFDuet-1-sumoPDIQ6共表达，或pCDFDuet-1-rpa与pETsumoPDIQ6共表达产生的活性rpa量大约相同，表明载体的选择不必由目的蛋白基因或相关酶或伴侣蛋白基因所特定，只要能良好表达其中的基因，可选择任何好的表达载体。

应该理解，在实施例或实验材料方法中所显示的成分用量、反应条件等数字或是本申请说明书内容所使用的数字均为大约数值。因此，除非文中特别注明，本说明书的上述数字参数均为近似值，可根据所需要获得的本发明结果而加以变化。并且，这些参数并非用来限定与本发明申请专利范围均等的原理，而是应用正常的操作技术下所得到的较佳数据。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料及可以应用于本发明中。文中所述的较佳实验方法与材料仅作为示范之用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用为参考。此外应该理解，在阅读了本发明的上述内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样属于本申请所附权利要求书所限定的范围内。

参考文献：

1.王颖、董晓燕、孙彦：蛋白质复性技术研究进展，生物工程进展，2002，22(2)：61-64。

2.任增亮、堵国成、陈坚、吴敬卜；大肠杆菌高效表达重组蛋白策略，中国生物工程杂志，2007，27(9)：103-109。

3.卢晟晔、王丽颖：大肠杆菌中外源蛋白高效表达的影响因素及策略研究的新进展，中国实验诊断学，2006，10(9)：1100-1103。

4.J Manosroi，Tayapiwatana C，Gotz F，Werner RG & Manosroi A.Secretion of activerecombinant human tissue plasminogen activator derivatives in Escherichia coli.Appl Environ Microbiol，2001，67(6)：2657-2664.

5.J  Schaffner，Winter J，Rudolph  R & Schwarz E.Cosecretion  of chaperones  andlow-molecular-size medium additives increases the yield of recombinant disulfide-bridged proteins.Appl Environ Microb，2001，67(9)：3994-4000.

6..P Goloubinoff，Gatenby AA & Lorimer GH.GroE heat-shock proteins promote assembly offoreign prokaryotic ribulose bisphosphate carboxylase oligomers in Escherichia coli.Nature，1989，337(6202)：44-47.

7.M Ostermeier，De Sutter K & Georgiou G.Eukaryotic protein disulfide isomerase complementsEscherichia coli dsbA mutants and increases the yield of a heterologous secreted protein with disulfidebonds.J Biol Chem，1996，271(18)：10616-10622.

8.G Kozlov，Maattanen P.Thomas DY & Gehring K.A structural overview of the PDI family ofproteins.Febs Journal，2010，277(19)：3924-3936.

9.H Cai，Wang CC & Tsou CL.Chaperone-like activity of protein disulfide isomerase in therefolding of a protein with no disulfide bonds.J Biol Chem，1994，269(40)：24550-24552.

10.PH Bessette，Aslund F，Beckwith J & Georgiou G.Efricient folding of proteins with multipledisulfide bonds in the Escherichia coli cytoplasm.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(24)：13703-13708.

11.J Qiu，Swartz JR & Georgiou G.Expression of active human tissue-type plasmmogen activatorin Escherichia coli.Appl Environ Microbiol，1998，64(12)：4891-4896.

12.Y Geng，Wang S&Qi Q.Expression of active recombinant human tissue-type plasmmogenactivator by using in vivo polyhydroxybutyrate granule display.Appl Environ Microbiol，2010，76(21)：7226-7230.

13.J Yang，Raju R，Sharma R & Xiang J.A genetically engineered fusion protein M4/TNF withincreased bifunctional activity refolded in the presence of protein disulfide isomerase.Hum AntibodiesHybridomas，1995，6(4)：129-136.

14.D Pennica，Holmes WE，Kohr WJ，Harkins RN，Vehar GA，Ward CA，et al.Cloning andexpression of human tissue-type plasminogen activator cDNA in E.coli.Nature，1983，301(5897)：214-221.

15.U Kohnert，Rudolph R，Verheijen JH，Weening-Verhoeff EJ，Sterm A，Opitz U，et al.Biochemical properties of the kringle 2and protease domams are maintained in the refolded t-PAdeletion variant BM 06.022.Protein Eng，1992，5(1)：93-100.

16.M Verhaegent & Christopoulos TK.Recombinant Gaussia luciferase.Overexpression，purification，and analytical application of a bioluminescent reporter for DNA hybridization.Anal Chem，2002，74(17)：4378-4385.

17.C Scheufler，Sebald W，&Hulsmeyer M.Crystal structure of human bone morphogeneticprotein-2at 2.7A resolution.J Mol Biol，1999，287(1)：103-115.

18.Backer MV和Backer JM.Functionally active VEGF fusion proteins.Protein Expr Purif，2001，23(1)：1-7.

19.SA Pizarro，Gunson J，Field MJ，Dinges R，Khoo S，Dalal M，et al.High-yield expression ofhuman vascular endothelial growth factor VEGF(165)in Escherichia coli and purification fortherapeutic applications.Protein Expr Purif，2010，72(2)：184-193.

20.EJ Heckler，Rancy PC，Kodali VK，&Thorpe C.Generating disulfides with theQuiescin-sulfhydryl oxidases.Biochim Biophys Acta，2008，1783(4)：567-577.

21..Wang，Li SJ，Sidhu A，Zhu L，LiangY，Freedman RB，et al.Reconstitution of humanErol-Lalpha/protein-disulfide isomerase  oxidative folding pathway  in  vitro.Position-dependentdifierences in role between the a and a′domams of protein-disulfide isomerase.JBiol Chem，2009，284(1)：199-206.

22..D Fass.The Erv family of sulfhydryl oxidases.Biochim Biophys Acta，2008，1783(4)：557-566.

23.KL Hoober，Sheasley SL，Gilbert HF & Thorpe C.Sulfhydryl oxidase from egg white-Afacile catalyst for disulfide bond formation in proteins and peptides.J Biol Chem，1999，274(32)：22147-22150.

24.DP Humphreys，Weir N，Mountain A & Lund PA.Human protein disulfide isomerasefunctionally complements a dsbA mutation and enhances the yield of pectate lyase C in Escherichia coli.J Biol Chem，1995，270(47)：28210-28215.

25.PC Rancy & Thorpe C.Oxidative protein folding in vitro：a study of the cooperation betweenquiescin-sulfhydryl oxidase and protein disulfide isomerase.Biochemistry，2008，47(46)：12047-12056.

26.BP Tu  & Weissman JS.Oxidative protein folding in eukaryotes：mechanisms andconsequences.J Cell Biol，2004，164(3)：341-346.

27.PC Rancy & Thorpe C.Oxidative Protein Folding in Vitro：A Study of the Cooperationbetween Quiescin-Sulfhydryl Oxidase and Protein Disulfide Isomerase.Biochemistry，2008，47(46)：12047-12056.

28.A Alon，Heckler EJ，Thorpe C & Fass D.QSOX contains a pseudo-dimer of functional anddegenerate sulfhydryl oxidase domains.Febs Lett，2010，584(8)：1521-1525.

29.J Gerber，Muhlenhoff U，Hofhaus G，Lill R & Lisowsky T.Yeast Erv2p is the first microsomalFAD-linked sulfhydryl oxidase of the Ervlp/Alrp protein family.J Biol Chem，2001，276(26)：23486-23491.

30.Johan Kemmink.N.J.D.，Klaas Dijkstra，Michael Nilges，Thomas & Creighton，E.Thefolding catalyst protein disulfide isomerase is constructed of active and inactive thioredoxin modules.Research Paper 1997，7：239-245.

31.Wang，W Z.，Winther，J.R.& Thorpe，C.Erv2p：Characterization of the redox behavior of ayeast sulfhydryl oxidase.Biochemistry 2007，46，3246-3254.

32.C Heussen，Joubert F & Dowdle EB.Purification of human tissue plasminogen activator withErythrina trypsin inhibitor.J Biol Chem，1984，259(19)：11635-11638.

33.易进华，吴劲松，张元兴.重组刺桐胰蛋白酶抑制剂的复性纯化，中国医药工业杂志，2007，38(5)：340-343.

34.EJ Heckler，Alon A，Fass D & Thorpe C.Human quiescin-sulfhydryl oxidase，QSOX1：Probing internal redox steps by mutagenesis.Biochemistry，2008，47(17)：4955-4963.

Claims (12)

1.一种多基因共表达体系，包括含二硫键蛋白编码基因的表达载体和一种或几种具有促进二硫键目的蛋白功能化作用的酶和/或伴侣蛋白的编码基因的表达载体，所述酶或伴侣蛋白的编码基因以融合基因形式构建在表达载体的一个阅读框中或两个或两个以上所述酶或伴侣蛋白的编码基因分别构建在所述表达载体的不同阅读框中，所述目的蛋白的编码基因构建在与所述酶或伴侣蛋白的所述表达载体含有不同抗性基因的表达载体中。

2.如权利要求1所述的多基因共表达系统，其中所述目的蛋白是其表达后折叠形成的构象正确与否决定其有无生物学功能的蛋白，所述目的蛋白含有一个或一个以上分子内和分子间二硫键。

3.如权利要求2所述的多基因共表达系统，其中所述目的蛋白选自人组织纤溶酶原激活蛋白rpa、Gaussia荧光素酶Gluc蛋白、人骨形态发生蛋白2-BMP2和人血管内皮生长因子VEGF121蛋白。

4.如权利要求1所述的多基因共表达系统，其中所述具有促进二硫键目的蛋白功能化作用的酶和/或伴侣蛋白是参与或辅助所述目的蛋白正确折叠形成正确构象的酶和/或伴侣分子，包括参与二硫键蛋白表达后分子内半胱氨酸正确配对形成正确二硫键、折叠成正确活性构象的各种酶和伴侣蛋白。

5.如权利要求4所述的多基因共表达系统，其中所述具有促进二硫键目的蛋白功能化作用的酶和/或伴侣蛋白选自以下组合：巯基氧化酶Q6和二硫键异构酶PDI的融合蛋白；巯基氧化酶人内质网氧化还原蛋白Ero1家族蛋白Ero1-Lα和人二硫键异构酶PDI的融合蛋白Ero1-LαPDI；酿酒酵母巯基氧化酶Erv2的巯基氧化活性结构域Erv2-c和人二硫键异构酶PDI的融合蛋白Erv2-cPDI，及Q6PDI融合蛋白与肽基-脯氨酰顺反异构酶PPI的组合Q6PDI-PPI。

6.如权利要求1所述的多基因共表达系统，其中所述目的蛋白的编码基因构建在pET28a或pET22b表达质粒中。

7.如权利要求1所述的多基因共表达系统，其中所述具有促进二硫键目的蛋白功能化作用的酶和/或伴侣蛋白的编码基因构建在选自以下质粒的表达质粒中：含Q6基因的pCDFDuet-1-sumoQ6表达质粒、含Q6PDI融合基因的pCDFDuet-1-sumoQ6PDI表达质粒、含PDIQ6融合基因的pCDFDuet-1-sumoPDIQ6表达质粒、含PDIQ6(295-540)融合基因的pCDFDuet-1-sumoPDIQ6(295-540)表达质粒、含Q6(295-540)PDI融合基因的pCDFDuet-1-sumo Q6(295-540)PDI表达质粒、含Ero1-LαPDI融合基因的pCDFDuet-1-sumoEro1-LαPDI表达质粒、含Erv2-cPDI融合基因的pCDFDuet-1-Erv2-cPDI表达质粒、在二个阅读框中分别含Q6基因和PDI基因的pCDFDuet-1-sumo Q6-PDI表达质粒、在二个阅读框中分别含Q6PDI融合蛋白基因和PPI蛋白基因的三基因pCDFDuet-1-sumoQ6PDI-PPI表达质粒，及在二个阅读框中分别含PDIQ6融合蛋白基因和PPI蛋白基因的三基因pCDFDuet-1-sumoQ6PDI-PPI表达质粒。

8.权利要求1所述多基因共表达系统的制备方法，其特征在于包括：

(1)构建具有促进二硫键目的蛋白功能化作用的酶和/或伴侣蛋白的编码基因的融合基因并将所述融合基因构建在表达载体的一个阅读框中，或构建两个或两个以上所述酶或伴侣蛋白的编码基因并将它们分别构建在表达载体的不同阅读框中；和

(2)构建与所述酶或伴侣蛋白的所述表达载体含有不同抗性基因的目的蛋白编码基因的表达载体。

9.含有组合的相关酶和/或伴侣蛋白基因的表达载体(质粒)，包括：含Q6基因的pCDFDuet-1-sumoQ6表达质粒、含Q6PDI融合基因的pCDFDuet-1-sumoQ6PDI表达质粒、含PDIQ6融合基因的pCDFDuet-1-sumoPDIQ6表达质粒、含PDIQ6(295-540)融合基因的pCDFDuet-1-sumoPDIQ6(295-540)表达质粒、含Q6(295-540)PDI融合基因的pCDFDuet-1-sumo Q6(295-540)PDI表达质粒、含Ero1-LαPDI融合基因的pCDFDuet-1-sumoEro1-LαPDI表达质粒、含Erv2-cPDI融合基因的pCDFDuet-1-Erv2-cPDI表达质粒、在二个阅读框中分别含Q6基因和PDI基因的pCDFDuet-1-sumo Q6-PDI表达质粒、在二个阅读框中分别含Q6PDI融合蛋白基因和PPI蛋白基因的三基因pCDFDuet-1-sumoQ6PDI-PPI表达质粒、在二个阅读框中分别含PDIQ6融合蛋白基因和PPI蛋白基因的三基因pCDFDuet-1-sumoQ6PDI-PPI表达质粒。

10.用权利要求1所述多基因共表达系统制备可溶性功能性目的蛋白的方法，其特征在于包括：

(1)将所述多基因共表达系统中的所述含二硫键目的蛋白编码基因的表达载体和所述具有促进二硫键目的蛋白功能化作用的酶和/或伴侣蛋白的编码基因的表达载体同时转化宿主细胞，依据这两种载体抗性的不同，采用二种或三种抗菌素培养基，选出同时转化入这两种载体的阳性克隆菌落；

(2)培养选出的阳性克隆菌落，诱导共表达目的蛋白与相关酶和/或伴侣蛋白，通过它们在细胞内的相互作用产生可溶性功能目的蛋白。

11.用权利要求1所述多基因共表达系统在体外制备可溶性功能性目的蛋白的方法，其特征在于包括：

(1)将所述多基因共表达系统中的所述含二硫键目的蛋白编码基因的表达载体和所述具有促进二硫键目的蛋白功能化作用的酶和/或伴侣蛋白的编码基因的表达载体分别转化宿主细胞，选出分别表达它们的阳性克隆菌落；

(2)分别培养选出的阳性克隆菌落，分别诱导表达目的蛋白与相关酶和/或伴侣蛋白，通过它们在细胞外的相互作用产生可溶性功能目的蛋白。

12.用权利要求10或11的方法制得的纯化的可溶性功能目的蛋白和相关酶和/或伴侣蛋白及其融合蛋白。

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