CN100406563C - 用以增进重组蛋白质的生产的核酸构建体与表达载体以及用以大量生产重组蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示用以增进重组多肽/蛋白质(recombinantpolypeptide/protein)的生产的核酸构建体与表达载体，以及用以大量生产重组多肽/蛋白质的方法，其中一编码硫氧还蛋白(thioredoxin)的第一核酸序列以及一编码血红蛋白的第二核酸序列被克隆至一重组宿主细胞内，由此而增强该重组宿主细胞生产一选定的基因产物的生产力以及帮助该重组宿主细胞缓解由于该基因产物的过量生产所致的细胞内应激(intracellular stress)。

Description

用以增进重组蛋白质的生产的核酸构建体与表达载体以及用以大量生产重组蛋白质的方法
技术领域
本发明揭示用以增进重组多肽/蛋白质(recombinantpolypeptide/protein)的生产的核酸构建体与表达载体，以及用以大量生产重组多肽/蛋白质的方法，其中一编码硫氧还蛋白(thioredoxin)的第一核酸序列以及一编码血红蛋白的第二核酸序列被克隆至一重组宿主细胞内，由此而增强该重组宿主细胞生产一选定的基因产物的生产力以及帮助该重组宿主细胞缓解由于该基因产物的过量生产所致的细胞内应激(intracellular stress)。
背景技术
“重组多肽/蛋白质的生产”堪称是生物技术领域中的一个非常重要的基因工程技术，其基本原理在于将一能够表达一所需的基因产物(例如，工农业用酶、治疗性蛋白质、干扰素、白介素、激素、生长激素、抗原性多肽、抗体)的靶基因克隆至一个适当的载体上，随后将所形成的重组载体输送至一胜任的宿主细胞(competent host cell)中，由此所形成的重组宿主细胞(recombinant host cell)可于一适当的培养基与培养条件下进行培养，并于适当时机诱导该靶基因的表达，以便达到大量生产所需的基因产物的目的。
迄今在重组多肽/蛋白质的生产上，大肠杆菌(Escherichia coli)是一最被广泛运用且最为成功的宿主细胞，而由此菌种所研发出的质粒载体种类也相当多，包括：高复制数目的质粒型态(如ColE1)、中复制数目的质粒型态(如p15)、低复制数目的质粒型态(如pSC101)以及以温度控制质粒复制数目的质粒型态(如R 1)等等(S.C.Makrides et al.(1996)，Microbiol.Rev.60：512-538)。这些被研发建构出的质粒载体往往具有一诱导型人工启动子(inducible artificialpromoter)，而一靶基因若被克隆于该人工启动子的下游区域，便可达到调控该靶基因的表达的目的。
一般最常被使用的人工启动子包括lac、trp、tac、trc、araBAD、λPRPL和T7启动子等，而被用来诱导这些启动子的方式可为加入异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、乳糖(lactose)、阿拉伯糖(arabinose)，或是温度的变化等等(S.C.Makrides etal.(1996)，Microbiol.Rev.60：512-538)。另一方面，一被克隆的靶基因若含有本身的启动子，它可被直接地克隆至一载体内，而当使用此种靶基因来建构重组载体时，通常无须使用诱导的方式来诱导重组多肽/蛋白质的生产。
而不论是以何种方式将靶基因克隆至质粒载体上，欲生产重组多肽/蛋白质，就必须将含有被克隆的靶基因的重组质粒载体输送至宿主细胞内，并以所形成的转化的宿主细胞作为重组多肽/蛋白质的生产工厂。但是，有许多因素可能造成被导入于转化宿主细胞中的质粒载体不稳定而流失，这些因素包含，例如：培养基的构成组分、宿主细胞的培养条件、质粒以及宿主细胞本身的特性，以及被表达的多肽/蛋白质产物具有毒性等。因此，基于质粒载体的稳定性问题，也可考虑通过采用同源重组(homologous recombination)以及噬菌体和转座子(transposon)的方式来将靶基因插入至细胞染色体中(A.Haldimann et al.(2001)，J Bacteriol.183：6384-6393)。
依据现今生物技术领域所存在的知识与技术，理论上几乎源自于各种不同生物来源的基因都可于大肠杆菌(Escherichia coli)的细胞内被表达，而有关的操作技术也已相当成熟。但是，当付诸产业上的实施时，仍有一些问题亟待解决。例如，当被诱导以大量生产重组多肽/蛋白质时，经转化的细菌细胞往往会承受极大的生理代谢负担(metabolicburden)。而所谓的“细胞生理代谢负担”是指转化宿主细胞因为生产一重组多肽/蛋白质而致使细胞的生长缓慢，进而触发应激反应(T.Schweder et al.(2002)，Appl.Microbiol.Biotechnol.58：330-337)。结果，细胞内会产生大量的热休克蛋白(heat shock proteins)，而引发被生产的重组多肽/蛋白质遭受到分解攻击的命运(H.Bahl et al.(1987)，Gene Dev.1：57-64)。热休克蛋白的产生也有可能造成细胞生长迟缓(C.G.Kurland et al.(1996)，Mol.Microbiol.21：1-4)，或是引发rRNA的破坏瓦解并造成核糖体的损失，进而导致细胞死亡(H.Dong et al.(1995)，J.Bacteriol.177：1497-1504)。值得注意的是，由转化宿主细胞所大量生产出的重组多肽/蛋白质，无论是否与宿主细胞的代谢生长相关或是否具有毒性，均可能于转化宿主细胞内引发应激反应，以致无法达到大量生产重组多肽/蛋白质的目标。
由于重组多肽/蛋白质的高生产量攸关生技工业的产业竞争力，如何克服上述问题以达到重组多肽/蛋白质的高生产量的目标，即成为生物技术产业上的一个极为重要的研发课题。
另一方面，在各种不同的生物加工(bioprocesses)中，对需氧生长的细胞培养物(aerobically growing cell cultures)维持一适当的氧气供应，是一重要的问题。
透明颤菌属(Vitreoscilla)细菌是一群可于缺氧的环境(oxygen-poor environments)下生长的长丝状需氧细菌(filamentous aerobic bacteria)。该属的细菌在低氧条件下的生长会导致诱发合成数倍的一种可溶性血红素蛋白(sobulbeheme protein)(亚单位M W 15,775)。该血红素蛋白后来被证实是一种细菌性血红蛋白，它和真核生物的血红蛋白具有一显著的光谱性的(speactral)(Webster et al.(1974)，Journal ofBiological Chemistry，249：4257-4260)、结构性的(Wakabayashi et al.(1986)，Nature，322：481-483)以及动力学上的(Orii et al.(1986)，Journal of Biological Chemistry261：2978-2986)同源性(homology)(参照US 5,049,493)。
于C.Khosla等人的先前研究中，透明颤菌物种(Vitreoscilla sp.)的血红蛋白基因被克隆至大肠杆菌细胞内并被表达(C.Khosla and J.E.Bailey(1988)，Mol.Gen.Genet.214：158-161)，而且在低氧条件的发酵培养过程中，带有透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin)基因的重组大肠杆菌菌株的生长性质较诸于野生型菌株获得明显改善，例如，生长较为快速、细胞总质量增加(C.Khosla and J.E.Bailey(1988)，Nature，331：633-635)。
于授予C.Khosla等人的USP 5,049,493中揭示有关于透明颤菌血红蛋白的核苷酸序列，包括一编码该蛋白质的结构基因，以及一基因启动子/调控子可用于对DNA序列的转录/翻译进行通过外部性控制的选择性调控(selective regulationby external control)；以及含有这些核苷酸序列的质粒载体，它们可用于增进细胞的生长特性以及提高细胞的各种蛋白质与代谢物的生产。该透明颤菌血红蛋白可以促进需氧微生物在具有充足的或减低的或低量的氧气环境下的生长以及产物合成特性。
另有文献报导，在低氧条件的发酵培养过程中，生产透明颤菌血红蛋白的重组大肠杆菌可以有效地增加细胞本身蛋白质的生成量(C.Khosla et al.(1990)，Bio/Technology，8：849-853)以及重组α-淀粉酶(α-amylase)的产量(M.Khosraviet al.(1990)，Plasmid，24：190-194)。此外，当以枯草杆菌(Bacillus subtilis)和中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamsterovary cell)作为宿主细胞，在低氧条件下，含有透明颤菌血红蛋白的重组细胞同样地可以生产出较高量的重组蛋白质(P.T.Kallio and J.E.Bailey(1996)，Biotechnol.Prog.12：31～39；G.J.Pendse and J.E.Bailey(1994)，Biotehnol.Bioeng.44：1367-1370)。
有趣的是，相比于野生型菌株，生产透明颤菌血红蛋白的重组大肠杆菌细胞内的NAD(P)H的生产速率降低2.4倍，这个结果显示，生产透明颤菌血红蛋白的重组细胞内是处于氧化状态(P.S.Tsai et al.(1995)，Biotechnol Bioeng.49：347-354)。
一般而言，在正常的细胞生理状况下，大肠杆菌细胞内是处于还原状态，因此位于细胞质内的蛋白质不易形成二硫键。但是，目前已知有两种细胞内的酶(intracellularenzymes)，如核糖核苷酸还原酶(ribonucleotide reductase)和氧化应激反应转录因子(oxidative response transcriptionfactor，OxyR)，在它们参与的反应周期中可以形成二硫键，此种蛋白质过渡二硫键的形成有赖于细胞内的硫氧还蛋白(thioredoxin)和谷胱苷肽-谷氧还蛋白(glutathione/glutaredoxin)反应途径机制(A.Aberg et al.(1989)，J.Biol.Chem.264：12249-12252；M.Zheng et al.(1998)，Science，279：1718-1721)。曾有文献报导，在大肠杆菌中大量生产硫氧还蛋白可以促进细胞内的还原状态，而有助于所生产的真核生物细胞的蛋白质的溶解性(E.R.LaVallie et al.(1993)，Bio/Technology，11：187-193；T.Yasukawa et al.(1995)，J.Biol.Chem.270：25328-25331)。
US 2003/0167524 A1揭示一种用于生产与油体结合的重组蛋白质(recombinant proteins in association with oil bodies)的改良方法，该重组蛋白质可为：第一和/或第二重组多肽、多元性蛋白质复合物(multimeric-protein-complexs)、异体多元性蛋白质复合物(heteromultimeric-protein-complexs)、多元性融合蛋白质(multimeric-fusion-proteins)、异体多元性融合蛋白质(hetero-multimeric-fusion-protein)、免疫球蛋白多肽链、免疫球蛋白、氧化还原融合多肽(redox-fusion-polypeptides)和/或硫氧还蛋白相关的蛋白质(thioredoxin-related proteins)，其中该第一重组多肽是一硫氧还蛋白，而该第二重组多肽是一硫氧还蛋白还原酶。
但是，就申请人所知，要以当今生物技术领域所存在的技术来达成高产量的重组蛋白质的目标上，仍有困难。因此，本领域仍然存在有一需要来发展出新技术以改进重组多肽/蛋白质的生产。
发明内容
当运用转化宿主细胞来过量生产一所需的重组蛋白质时，有可能在转化宿主细胞内引发所谓的应激反应或生理负担，进而导致转化宿主细胞无法大量生产该重组蛋白质。因此，申请人尝试提供一种兼具有效和通用性的解决方法，以达到大量生产重组蛋白质的目的。
于是，在第一个方面，本发明提供一种用以提高重组宿主细胞内一选定的基因产物的生产的方法，其包含下列步骤：
(a)将一编码该选定的基因产物的基因序列、一编码硫氧还蛋白的第一核酸序列以及一编码血红蛋白的第二核酸序列导入至一宿主细胞内；
(b)将步骤(a)所形成的重组宿主细胞培养于一合适的培养基中，以便容许该基因序列的表达；以及
(c)收获被表达的基因产物。
在第二个方面，本发明提供一种可表达一选定的基因产物的重组宿主细胞，其包含一编码该选定的基因产物的基因序列，以及一编码硫氧还蛋白的第一核酸序列和一编码血红蛋白的第二核酸序列。
在第三个方面，本发明提供可供上述方法的实施以及上述重组宿主细胞的生成的核酸构建体，其包含一编码硫氧还蛋白的第一核酸序列以及一编码血红蛋白的第二核酸序列。本发明也提供携带有该核酸构建体的载体。
本发明的技术可以用来改善生产重组蛋白质的转化宿主细胞的性质，例如单位细胞蛋白质的产量、抗蛋白质毒害的能力、保护细胞内被生成的蛋白质不被分解以及维持细胞内核糖体的完整性。
依据本发明，可以促进转化宿主细胞在有氧条件(aerobicconditions)下生产重组蛋白质的效能，可以有效缩短发酵培养的时间，并且有利于转化宿主细胞在高细胞密度下的培养操作。
此外，本发明的实施不受限于使用特定的宿主细胞，而可以运用到各类宿主细胞，包括细菌、酵母、真菌、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等，并可用来生成各种形式的蛋白质，包括位于细胞质(cytoplasm)或外周胞质(periplasm)内的蛋白质、位于细胞膜(membrane)上或细胞外(extracellular)的蛋白质，以及工业、农业、食品、环境、水产业和畜牧业用的酶，尤其是医药用蛋白质和肽，诸如干扰素、人类和动物激素、免疫性抗原和抗体等。
附图说明
下面结合附图及实施例来对本发明进行详细说明，所以本发明在上述以及其他目的与特征，可借由参照下文的描述、随文检附的权利要求书和伴随的附图而变得更为明显，附图中：
图1是一显示质粒pUHE21-2的结构的图，其中含有：pMB1 ori，质粒pMB1的复制起点；PA1，T7 A1启动子；Apr，氨苄青霉素抗性基因；ScaI，限制酶ScaI切割位点；以及多重克隆位点(multiple cloning site，MCS)，其中所包含的核糖体结合位点(ribosome binding site，RBS)与限制酶切割位点被标示于MCS框内；
图2是一显示质粒pA199A-2的结构的图，其中含有：pMB1 ori，质粒pMB1的复制起点；PA1，T7 A1启动子；lacI，lac抑制蛋白质基因；rrnBT1T2，rrnB基因转录终止位点(translation termination site)；Apr，氨苄青霉素抗性基因；NruI，限制酶NruI切割位点；以及多重克隆位点，其中所包含的核糖体结合位点(RBS)与限制酶切割位点被标示于MCS框内；
图3是一显示质粒pGB2的结构的图，其中含有：pSC101ori，质粒pSC101的复制起点；Spcr/Strr，抗链霉素基因；以及多重克隆位点，其中所包含的限制酶切割位点被标示于MCS框内；
图4是一显示质粒pGB-VHb的结构的图，其中含有：pSC101 ori，质粒pSC101的复制起点；vgb，透明颤菌血红蛋白的结构基因；PA1，T7 A1启动子；lacI，lac抑制蛋白质基因；以及Spcr/Strr，抗链霉素基因；
图5是一显示质粒pJF118EH的结构的图，其中含有：pBR322 ori，质粒pBR322的复制起点；Ptac，tac启动子；lacIq，lac抑制蛋白质基因；rrnBT1T2，rrnB基因转录终止位点；NruI，限制酶NruI切割位点；Apr，氨苄青霉素抗性基因；以及多重克隆位点，其中所包含的限制酶切割位点被标示于MCS框内；
图6是一显示质粒pGB-Trx的结构的图，其中含有：pSC101 ori，质粒pSC101的复制起点；trxA，硫氧还蛋白的结构基因；Ptac，tac启动子；lacIq，lac抑制蛋白质基因；以及Spcr/Strr，抗链霉素基因；
图7是一显示质粒pJF-TrxFus的结构的图，其中含有：pBR322 ori，质粒pBR322的复制起点；Ptac，tac启动子；trxA，硫氧还蛋白结构基因(不含有终止密码子)；lacIq，lac抑制蛋白质基因；NruI，限制酶NruI切割位点；rrnBT1T2，rrnB基因转录终止位点；Apr，氨苄青霉素抗性基因；以及多重克隆位点，其中所包含的限制酶切割位点被标示于MCS框内；
图8是一显示质粒pGB-TV1的结构的图，其中含有：pSC101 ori，质粒pSC101的复制起点；trxA，硫氧还蛋白的结构基因；vgb，透明颤菌血红蛋白的结构基因；Ptac，tac启动子；lacIq，lac抑制蛋白质基因；以及Spcr/Strr，抗链霉素基因；
图9是一显示质粒pGB-TV2的结构的图，其中含有：pSC101 ori，质粒pSC101的复制起点；trxA，硫氧还蛋白的结构基因；vgb，透明颤菌血红蛋白的结构基因；Ptac，tac启动子；PA1，T7 A1启动子；lacIq，lac抑制蛋白质基因；以及Spcr/Strr，抗链霉素基因；
图10是一Western印迹分析图，其显示以透明颤菌血红蛋白的第一抗体来免疫检测经IPTG诱导的大肠杆菌重组菌株BL21(DE3)/pGB-VHb的透明颤菌血红蛋白生产情形，其中泳道1：蛋白质标准物(
Figure C20041006185500211
Color Protein Marker，Cambrex BioScience)；泳道2：未经IPTG诱导；泳道3：以30μM IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道4：以100μMIPTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道5：以500μM IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；以及箭头指示透明颤菌血红蛋白的位置；
图11是一Western印迹分析图，其显示以硫氧还蛋白的第一抗体来免疫检测经IPTG诱导的重组菌株BL21(DE3)/pGB-Trx的硫氧还蛋白生产情形，其中泳道1：蛋白质标准物(
Figure C20041006185500212
Color Protein Marker，CambrexBioScience)；泳道2：未经I PTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道3：以30μM IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道4：以100μM IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道5：以500μMIPTG诱导的菌株的蛋白质样本；以及箭头指示硫氧还蛋白的位置；
图12是一Western印迹分析图，其显示以硫氧还蛋白的第一抗体来免疫检测经IPTG诱导的重组菌株BL21(DE3)/pGB-TV1的硫氧还蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合蛋白质生产情形，其中泳道1：蛋白质标准物(Color Protein Marker，Cambrex BioScience)；泳道2：未经IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道3：以30μM IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道4：以100μM IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道5：以500μM IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；以及箭头指示硫氧还蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合蛋白质的位置；
图13是一Western印迹分析图，其显示以硫氧还蛋白的第一抗体来免疫检测经IPTG诱导的重组菌株BL21(DE3)/pGB-TV2的硫氧还蛋白生产情形，其中泳道1：蛋白质标准物(
Figure C20041006185500221
Color Protein Marker，CambrexBioScience)；泳道2：未经I PTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道3：以30μM IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道4：以100μM IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道5：以500μMIPTG诱导的菌株的蛋白质样本；以及箭头指示硫氧还蛋白的位置；
图14是一Western印迹分析图，其显示以透明颤菌血红蛋白的第一抗体来免疫检测经IPTG诱导的重组菌株BL21(DE3)/pGB-TV2的透明颤菌血红蛋白生产情形，其中泳道1：蛋白质标准物(
Figure C20041006185500222
Color Protein Marker，Cambrex BioScience)；泳道2：未经IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道3：以30μM IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道4：以100μM IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道5：以500μM IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；以及箭头指示透明颤菌血红蛋白的位置；
图15是一显示质粒pET-IFN的结构的图，其中含有：ori，复制起点；flori，fl复制起点；IFNα2，人类干扰素α2基因；T7，T7启动子；NdeI，限制酶NdeI切割位点；XhoI，限制酶XhoI切割位点；lacI，lac抑制蛋白质基因；以及Apr，氨苄青霉素抗性基因；
图16是一蛋白质电泳图，其中泳道1：蛋白质标准物(MBI Fermentas)；泳道2：未经诱导的对照菌株(Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB2)；泳道3：经诱导后的对照菌株(Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB2)；泳道4：经诱导后生产出透明颤菌血红蛋白的菌株(Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB-VHb)；泳道5：经诱导后生产出硫氧还蛋白的菌株(Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB-Trx)；以及泳道6：经诱导后生产出硫氧还蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合蛋白质的菌株(Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB-TV1)；
图17是一显示质粒pET-estII的结构的图，其中含有：ori，pBR322复制起点；flori，fl复制起点；estA，香茅醇假单胞菌(Pseudomonas citronellolis)的酯酶基因；T7，T7启动子；BamHI，限制酶BamHI切割位点；XhoI，限制酶XhoI切割位点；lacI，lac抑制蛋白质基因；以及Apr，氨苄青霉素抗性基因；
图18是一显示质粒pA1-AspA的结构的图，其中含有：pMB1 ori，pMB1复制起点；aspA，天冬氨酸酶基因；BamHI，限制酶BamHI切割位点；SalI，限制酶SalI切割位点；rrnBT1T2，rrnB基因转录终止位点；PA1，T7 A1启动子；lacI，lac抑制蛋白质基因；以及Apr，氨苄青霉素抗性基因；
图19是一蛋白质电泳图，其显示经过发酵培养7小时(上方)与20小时(下方)后，被诱导生产天冬氨酸酶的重组菌株的蛋白质生产情形，其中泳道1：蛋白质标准物(MBIFermentas)；泳道2：未生产透明颤菌血红蛋白和硫氧还蛋白的菌株(VJS632/pA1-AspA/pGB2)；泳道3：生产透明颤菌血红蛋白的菌株(VJS632/pA1-AspA/pGB-VHb)；泳道4：生产硫氧还蛋白的菌株(VJS632/pA1-AspA/pGB-Trx)；泳道5：同时生产透明颤菌血红蛋白和硫氧还蛋白的菌株(VJS632/pA1-AspA/pGB-TV2)；泳道6：生产硫氧还蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合蛋白的菌株(VJS632/pA1-AspA/pGB-TV1)；以及箭头指示天冬氨酸酶的位置；以及
图20是一显示质粒pET-20Z的结构的图，其中含有：ori，pBR322复制起点；flori，fl复制起点；lacZ，半乳糖苷酶的基因；T7，T7启动子；NdeI，限制酶NdeI切割位点；HindIII，限制酶HindIII切割位点；以及Apr，氨苄青霉素抗性基因。
具体实施方式
关于要如何达到重组蛋白质高产量的目标，综观当今生物技术领域所存在的问题，申请人认为可由两个方面来寻求解决方策：第一个方面是确保细胞的生长或有效提高细胞的生长密度，而另一个方面是有效提高重组蛋白质的产量。
虽然硫氧还蛋白基因和透明颤菌血红蛋白基因已有被使用于转化生产重组蛋白质的宿主细胞，迄今未见有任何文献资料明示或暗示，这两个基因当被组合使用时，会对于转化宿主细胞产生何种效用。
而申请人经由研究而发现，若将硫氧还蛋白基因和透明颤菌血红蛋白基因一起输送至宿主细胞内，可赋予转化宿主细胞下列效用：保护所生产的重组蛋白质不被分解，促进细胞生长而不受大量生产蛋白质所引发的生理代谢负担的负面影响，以及增进重组蛋白质的产量。而从所得实验结果来看，这个策略确实可以有效解决上述所提的在大量生产重组蛋白质时所碰到的问题，而对于生物技术产业将会有极为重要的贡献。
于是，本发明提供一种用以提高重组宿主细胞内一选定的基因产物的生产的方法，其包含下列步骤：
(a)将一编码该选定的基因产物的基因序列、一编码硫氧还蛋白的第一核酸序列以及一编码血红蛋白的第二核酸序列导入至一宿主细胞内；
(b)将步骤(a)所形成的重组宿主细胞培养于一合适的培养基中，以便容许该基因序列的表达；以及
(c)收获被表达的基因产物。
“核酸”或“核酸序列”等术语意指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸序列或核糖核苷酸序列，且包含已知的天然存在的核苷酸或人工化学模拟物(aritificial chemical mimics)。如本文中所用的，“核酸”此术语可与“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”交换使用。
除非另有指明，一核酸序列除了于本文中所显示的特测序列外，也涵盖其互补序列以及保守性类似物，例如具有简并性密码子取代的同源性序列。特别地，简并性密码子取代可以经由，例如，在一核酸序列中的一或多个被选定的密码子的第3位置处替换以其他的核苷酸残基而被产生。
用来操作核酸的技术，像是例如用来于序列中产生突变(mutation)、亚克隆(subcloning)、标记(labelling)、探针检测(probing)、测序(sequencing)、杂交(hybridization)等等，在科学和专利文献中皆有详细说明。参见，例如，Sambrook J，Russell DW(2001)Molecular Cloning：a Laboratory Manual，3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York；Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel ed.JohnWiley & Sons，Inc.New York(1997)；Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology：Hybridization  WithNucleic Acid Probes，Part I，Theory and Nucleic AcidPreparation，Tijssen ed.Elsevier，N.Y.(1993)。
如本文中所用的，“多肽”、“肽”和“蛋白质”等术语可被相互交换使用，且意指一种由氨基酸残基所构成的聚合物，其中一或多个氨基酸残基是天然存在的氨基酸或人工化学模拟物。
如本文中所用的，“细胞”、“宿主细胞”、“转化宿主细胞”与“重组宿主细胞”等术语可被互换使用，而且不仅指特定的个体细胞(individual cells)还包括继代培养的子代(sub-cultured offsprings)或可能的子代(potential offsprings)。子代细胞可能在后续世代中因为突变作用或环境影响而发生特定的遗传修饰(genetic modification)，而致使子代细胞事实上可能与母细胞并不相一致，但子代细胞仍被涵盖在本文中所用的术语的范畴内。
可被使用于本发明方法的步骤(a)中的宿主细胞可以是原核生物细胞或真核生物细胞，且为未转化/转染的细胞(non-transformed/transfected cells)，或是已被至少一种其它重组核酸序列转化/转染的细胞(transformed/transfectedcells)。
适用于本发明的原核生物细胞包括，但不限于，源自于下列的细胞：细菌，例如大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌(Bacillussubtilis)、乳杆菌属物种(Lactobacillus sp.)、链霉菌属物种(Streptomyces sp.)以及伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)；蓝细菌(Cyanobacteria)；放线菌(Actinomycetes)等等。
适用于本发明的真核细胞包含，例如，真菌细胞、原生动物(protozoa)细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物细胞以及人类细胞。合适的真菌细胞代表例是酵母细胞，例如面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)或嗜甲醇酵母(Pichia pastoris)。合适的植物细胞衍生自裸子植物(gynosperms)或被子植物(angiosperms)，以单子叶植物(monocots)与双子叶植物(dicots)为佳，特别是作物(crops)，而且是取自这些植物的根、茎、叶或分生组织(meristem)等部位，并以原生质粒(protoplasts)或愈合组织(callus)的形式被培养。合适的昆虫细胞代表例是果蝇S2细胞以及衍生自草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)的Sf21细胞与Sf9细胞。合适的动物细胞可以是培养的细胞或体内细胞，且优选为脊椎动物细胞，更优选为哺乳动物细胞，并且是衍生自动物的肾脏、肝脏、肺脏、卵巢、乳房、皮肤、骨胳、血液等器官或组织，其中的代表例例如CHO、COS、BHK、HEK-293、Hela、NIH3T3、VERO、MDCK、MOLT-4、Jurkat、K562、HepG2等等。
适用于进行DNA重组技术的宿主细胞的适当培养基以及培养条件，在生物技术领域中已被详知。例如，可将宿主细胞培养在本领域中所惯用的发酵生物反应器、摇动烧瓶、试管、微滴盘与平浅培养皿中，且该培养可在适合于重组宿主细胞生长的温度、pH值及氧含量下进行。
在依据本发明的一个优选具体实施方式中，该步骤(a)的进行可通过将该基因序列、该第一核酸序列和该第二核酸序列导入至一可于该宿主细胞内表达的载体内，以及将由此所形成的重组载体输送至该宿主细胞内。
在依据本发明的另一个优选具体实施方式中，该步骤(a)的进行是通过将该基因序列、该第一核酸序列和该第二核酸序列分别导入至一可于该宿主细胞内表达的载体内，以及将由此所形成的重组载体一起输送至该宿主细胞内。
在依据本发明的另一个优选具体实施方式中，该步骤(a)是通过下列次步骤来进行：
(i)建构一可于该宿主细胞内表达并且包含该第一核酸序列以及该第二核酸序列的第一重组载体；
(ii)建构一可于该宿主细胞内表达并且包含该基因序列的第二重组载体；以及
(iii)将该第一重组载体与第二重组载体输送至该宿主细胞内。
在依据本发明的一个优选具体实施方式中，于该次步骤(i)中所建构的该第一重组载体进一步包含一诱导型启动子序列用以控制该第一核酸序列与该第二核酸序列的表达。
在依据本发明的另一个优选具体实施方式中，于该次步骤(i)中所建构的该第一重组载体进一步包含一诱导型第一启动子序列用以控制该第一核酸序列的表达，以及一诱导型第二启动子序列用以控制该第二核酸序列的表达，该第一启动子序列与第二启动子序列彼此不相同。
“启动子序列”此术语是指一DNA序列，其通常是位于一DNA聚合物内所存在的一个基因的前方，并且提供一用于起始该基因的转录以生成mRNA的位点。适用于本发明的实施的启动子序列可以衍生自病毒、噬菌体、原核生物细胞或真核生物细胞，且可为一组成性启动子(constitutive promoter)或是一诱导型启动子(inducible promoter)。
依据本发明，该编码该选定的基因产物的基因序列、该编码硫氧还蛋白的第一核酸序列与该编码血红蛋白的第二核酸序列可分别地被可操作地连接至一启动子，特别是一诱导型启动子。
“可操作地连接”此术语是指一第一序列被放置于足够近于一第二序列，而使得该第一序列可以影响该第二序列或该第二序列所控制的区域。例如，一启动子序列可操作地连接一基因序列，且通常是在该基因序列的5’位置，而使得该基因序列在该启动子序列的控制下表达。此外，一调节序列可以可操作地连接一个启动子序列，以便强化该启动子序列促进转录的能力。在这情况下，该调节序列通常是位于该启动子序列的5’位置。
适用于本发明的该启动子序列优选地衍生自病毒、细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、藻类细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物细胞以及人类细胞。例如，可被使用于细菌细胞的启动子包含，但不限于，tac启动子、T7启动子、T7 A1启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、araBAD启动子以及λPRPL启动子等。可被使用于植物细胞的启动子包含，例如，35S CaMV启动子、肌动蛋白启动子、泛素(ubiquitin)启动子等。适用于哺乳动物细胞的调节元件包含CMV-HSV胸腺核苷激酶启动子、SV40、RSV-启动子、CMV增强子或SV40增强子。
在依据本发明的一个优选具体实施方式中，该编码硫氧还蛋白的第一核酸序列与该编码血红蛋白的第二核酸序列被导入于一第一载体内，而该编码该选定的基因产物的基因序列被导入至一第二载体内，且该第一载体与该第二载体各自具有一诱导型启动子序列来控制该第一核酸序列与第二核酸序列以及该基因序列的表达。
在依据本发明的一个优选具体实施方式中，被导入于该第一重组载体内的该第一核酸序列与第二核酸序列的表达是受同一个启动子所控制，例如，tac启动子、T7启动子、T7A1启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、araBAD启动子或是λPRPL启动子，优选是一tac启动子。
在依据本发明的一个优选具体实施方式中，将该第一核酸序列与该第二核酸序列相连接用于编码一由硫氧还蛋白与血红蛋白所构成的融合蛋白质。
在另一个优选具体实施方式中，被导入于该第一重组载体内的该第一核酸序列与第二核酸序列的表达是各自为一选自于下列所构成的一组中的不同启动子所控制：tac启动子、T7启动子、T7A1启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、araBAD启动子以及λPRPL启动子。在一更优选的具体实施方式中，该第一重组载体包含一tac启动子用以控制该第一核酸序列的表达以及一T7 A1启动子用以控制第二核酸序列的表达。
适用于本发明的载体包含一般遗传工程技术中所使用的载体，例如，噬菌体、质粒、粘粒、病毒或逆转录病毒。
适用于本发明的载体可以含有其他表达控制元件，例如一转录起始位点、一转录终止位点、一核糖体结合位点、一RNA剪接位点、一个聚腺苷酸化位点以及一个翻译终止位点。适用于本发明的载体还可包含另外的调控元件，例如转录/翻译的增强子序列，以及至少一个供在适当的条件下筛选该载体的标记基因(marker gene)或报导基因(reporter gene)。可用于本发明的标记基因包括，例如，用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶基因以及G418或新霉素(neomycin)抗性基因，以及用于大肠杆菌与其他细菌培养物的氨苄青霉素、链霉素、四环素或卡那霉素抗性基因。适用于本发明的载体可再包含一编码分泌信号(secretion signal)的核酸序列。这些序列是熟习此项技术者已知的。
如本文中所用的，“表达载体”此术语是指一种重组表达系统，其可于体外(inv itro)或体内(in vivo)，在任一宿主细胞中构成地(constitutively)或诱导地(inducibly)表达依据本发明的该第一核酸序列、该第二核酸序列与该基因序列。该表达载体可为一线性或环形表达系统，且涵盖保持游离基因形式或是被整合至宿主细胞的基因组内的表达系统。该表达系统可具有或不具有自我复制的能力，它可能只会驱使宿主细胞的瞬时表达。
根据本发明，术语“转染(transfection)”可与术语“转化(transformation)”交替地使用，并且泛指将一核酸分子引入一选定的宿主细胞内的方式。依据本领域中已知的技术，一核酸分子(例如，一重组DNA构建体或一重组载体)可通过多种技术而被引入至一选定的宿主细胞内，例如磷酸钙或氯化钙介导的转染作用(transfection)、电穿孔法(electroporation)、微注射法(microinjection)、粒子撞击法(particlebombardment)、脂质体介导的转染作用(liposome-mediatedtransfection)、利用细菌噬菌体的转染作用、利用逆转录病毒(retrovirus)或其他病毒(例如，痘苗病毒(vaccinia virus)或昆虫细胞的杆状病毒(baculovirus))的转导作用(transduction)、原生质融合(protoplast fusion)、农杆菌介导的转化法(Agrobacterium-mediated transformation)或其他方法。
依所使用的载体与宿主系统而定，本发明所产生的重组基因产物(蛋白质)可被维持在重组宿主细胞内、被分泌至培养基内、被分泌至两个细胞膜间的空间内或被保留在细胞膜的外表面上。由本发明方法所生成的重组基因产物(蛋白质)可使用多种标准蛋白质纯化技术来纯化，例如，但不限于，亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤法、电泳法、逆相层析法、色层焦集法(chromatofocusing)等等。优选地，由本发明方法所生成的重组基因产物(蛋白质)是“基本上纯的形式”被回收。如本文中所用的，“基本上纯的”是指一被纯化的蛋白质所具有的纯度可使该蛋白质能有效地作为一商业产品。
依据本发明，该第一核酸序列衍生自下列任一种细胞的硫氧还蛋白基因：细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、藻类细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物细胞以及人类细胞。在本发明的一个优选具体实施方式中，该第一核酸序列衍生自大肠杆菌的硫氧还蛋白基因(trxA)。
依据本发明，该第二核酸序列衍生自下列任一种细胞的血红蛋白或含有血红素的携氧蛋白(heme-containing oxygencarrier protein)基因：细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、藻类细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物细胞以及人类细胞。在本发明的一个优选具体实施方式中，该第二核酸序列衍生自透明颤菌属物种(Vitreoscilla sp.)的血红蛋白基因(vgb)。
依据本发明的方法可用来生产一同源性多肽或一异源性多肽。在本发明的一个优选具体实施方式中，本发明方法所要生产的基因产物是选自于下列一组：酶，例如β-半乳糖苷酶、酯酶以及天冬氨酸酶；治疗性多肽，例如干扰素、白介素、动物或人类激素；抗原决定簇或抗体。优选地，该基因产物是一源自下列的抗原决定簇：病原性病毒、细菌或其他微生物，寄生虫或肿瘤细胞。
本发明也提供一种核酸构建体，其包含一编码硫氧还蛋白的第一核酸序列以及一编码血红蛋白的第二核酸序列。
在依据本发明的一个优选具体实施方式中，该核酸构建体可进一步包含一诱导型启动子序列用以控制该第一核酸序列与该第二核酸序列的表达。优选地，该启动子序列衍生自病毒、细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、藻类细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物细胞以及人类细胞。依据本发明，该启动子序列可以选自于下列所构成的一组：tac启动子、T7启动子、T7 A1启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、araBAD启动子以及λPRPL启动子，且优选为tac启动子。
在依据本发明的一个优选具体实施方式中，将该第一核酸序列与该第二核酸序列相连接用以编码一由硫氧还蛋白与血红蛋白所构成的融合蛋白质。
在依据本发明的一个优选具体实施方式中，该核酸构建体进一步包含一诱导型第一启动子序列用以控制该第一核酸序列的表达，以及一诱导型第二启动子序列用以控制该第二核酸序列的表达，该第一启动子序列与第二启动子序列彼此不相同。
优选地，该第一启动子序列与该第二启动子序列是各自地衍生自病毒、细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、藻类细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物细胞以及人类细胞。依据本发明，该启动子序列可以是各自地选自于下列所构成的一组：tac启动子、T7启动子、T7 A1启动子、trp启动子、lac启动子、trc启动子、araBAD启动子以及λPRPL启动子。在依据本发明的一个优选具体实施方式中，该第一启动子序列是tac启动子，而该第二启动子序列是T7 A1启动子。
本发明也提供一种载体，其包含一如上所述的核酸构建体。依据本发明，该载体可进一步包含下列至少一者：一标记基因、一报导基因、一抗生素抗性基因、一增强子序列、一编码一被选定的基因产物的基因、一个聚腺苷酸化位点以及一调节序列。
本发明也提供一种可表达一选定的基因产物的重组宿主细胞，其包含一编码该选定的基因产物的基因序列，以及一编码硫氧还蛋白的第一核酸序列和一编码血红蛋白的第二核酸序列。
在依据本发明的一个优选具体实施方式中，该基因序列、该第一核酸序列和该第二核酸序列被携带于一可于该宿主细胞内表达的载体上。在依据本发明的另一个优选具体实施方式中，该基因序列、该第一核酸序列和该第二核酸序列各自被携带于一可于该宿主细胞内表达的载体上。在依据本发明的另一个优选具体实施方式中，该第一核酸序列和该第二核酸序列被携带于一可于该宿主细胞内表达的第一载体上，而该基因序列被携带于一可于该宿主细胞内表达的第二载体上。
依据本发明，该第一载体可进一步包含一诱导型启动子序列用以控制该第一核酸序列与该第二核酸序列的表达，而该启动子序列可以衍生自病毒、细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、藻类细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物细胞以及人类细胞。优选地，该启动子序列是选自于下列所构成的一组：tac启动子、T7启动子、T7 A1启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、araBAD启动子以及λPRPL启动子，且优选为tac启动子。
在依据本发明的一个优选具体实施方式中，被包含于该重组宿主细胞中的该第一核酸序列与该第二核酸序列相连接用以编码一由硫氧还蛋白与血红蛋白所构成的融合蛋白质。
在依据本发明的一个优选具体实施方式中，被包含于该重组宿主细胞中的该第第一载体进一步包含一诱导型第一启动子序列用以控制该第一核酸序列的表达，以及一诱导型第二启动子序列用以控制该第二核酸序列的表达，该第一启动子序列与第二启动子序列彼此不相同。
依据本发明，该第一启动子序列与该第二启动子序列是各自地衍生自病毒、细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、藻类细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物细胞以及人类细胞。优选地，该第一启动子序列与该第二启动子序列是各自地选自于下列所构成的一组：tac启动子、T7启动子、T7 A1启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、araBAD启动子以及λPRPL启动子。在依据本发明的一个优选具体实施方式中，该第一启动子序列是tac启动子，而该第二启动子序列是T7 A1启动子。
依据本发明，被包含在该重组宿主细胞内的该第一载体进一步包含一标记基因、一报导基因、一抗生素抗性基因、一增强子序列、一个聚腺苷酸化位点或一调节序列。
在依据本发明的一个优选具体实施方式中，该第一核酸序列与该第二核酸序列被整合于该宿主细胞的基因组DNA内。
依据本发明，该重组宿主细胞会生产一选定的同源性多肽或异源性多肽。在本发明的一个优选具体实施方式中，该重组宿主细胞会生产一选自于下列一组中的基因产物：酶，例如β-半乳糖苷酶、酯酶以及天冬氨酸酶；治疗性多肽，例如干扰素、白介素、动物或人类激素；抗原决定簇或抗体。优选地，该基因产物是一源自下列的抗原决定簇：病原性病毒、细菌或其他微生物，寄生虫或肿瘤细胞。
依据本发明，该重组宿主细胞选自于下列所构成的一组：细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物细胞或人类细胞。在本发明的一个优选具体实施方式中，该重组宿主细胞是大肠杆菌细胞。
本发明将就下面实施例来做进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明用，而不应被解释为对本发明实施上的限制。
实施例
一般实验方法与材料：
本发明中所采用的实验方法以及用于DNA克隆(DNAcloning)的相关技术，是参考本领域中所详知的教科书：Sambrook J，Russell DW(2001)Molecular Cloning：aLaboratory Manual，3rd ed.Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York，例如使用限制酶的DNA剪切反应、使用T4DNA连接酶(ligase)的DNA连接反应、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)、琼脂凝胶电泳法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western印迹分析和质粒转化法等，而这些技术都是熟悉此项技术人士可根据本身的专业素养来实施者。例如，于下面实施例中所使用的质粒转化法是以经氯化钙(CaCl2)处理的胜任细胞(calcium chloride-treatedcompetent cell)来进行。此外，细胞密度是使用分光光度计(V530，Jasco)测量，测量波长定为550nm，所得到的吸光值纪录为OD550。蛋白质浓度分析是使用蛋白质分析试剂(Protein Assay Reagent，BioRad Co.)，并以影像分析仪(GAS9000，UVItec)来分析定量经凝胶电泳的蛋白质。
细菌染色体、质粒和DNA片段的纯化是分别使用
Figure C20041006185500361
基因组DNA纯化试剂盒(Genomic DNA PurificationKit)(Promega Co.)、
Figure C20041006185500362
Spin Miniprep kit(Qiagen Co.)和
Figure C20041006185500363
核酸纯化试剂盒(Nucleic Acid PurificationKit)(Clontech Co.)等商业化纯化试剂盒来进行。
所有的限制酶(restriction enzymes)、T4 DNA连接酶和Pfu DNA聚合酶购自于New England Biolabs。聚合酶链反应中所用的引物是由明欣生物科技公司(台北)所合成。用于测定透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin)的第一抗体(primary antibody)是委托亚诺法生技公司(台北)来制备，而用于测定硫氧还蛋白的第一抗体、第二抗体(secondaryantibody)(被使用于本文中的第二抗体是辣根过氧化酶-缀合的山羊抗-兔IgG(horseradish peroxidase-conjugated goatanti-rabbit IgG))以及其余的化学药品皆是购自于SigmaChemical Co.
实施例1.构建包含透明颤菌血红蛋白结构基因(vgb)和硫氧还蛋白结构基因(trxA)的表达质粒
实验材料：
于DNA克隆过程中所使用的中介细胞(intermediatecells)是大肠杆菌(Escherichia coli)XL1-Blue(StratageneCo.)，并在37℃下培养于Luria-Bertani(LB)培养基内(Miller，J.H.(1972)，Experiments in Molecular Genetics，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)，随后将经转化的大肠杆菌培养于添加有抗生素的培养基内(抗生素的用量为链霉素是使用15μg/mL，而氨苄青霉素是使用50μg/mL)。
透明颤菌属物种(Vitreoscilla sp.)(Murray strain no.389)是由Dr.Webster(Department of Biology，Illinois Institute ofTechnology，Chicago，USA)所赠与，并在30℃下培养于一含有1.5％酵母提取物(yeast extract)、1.5％蛋白胨(peptone)和0.02％醋酸钠(sodium acetate)的培养基内。
A.构建带有透明颤菌血红蛋白结构基因(vgb)的重组质粒pGB-VHb
质粒pGB-VHb包含一个T7 A1启动子用以控制透明颤菌血红蛋白结构基因(vgb)的表达，其构建方式说明如下。
根据透明颤菌血红蛋白结构基因的核苷酸序列(KhoslaC，Bailey JE.(1988)，Mol Gen Genet.214：158-161)来合成下面两个引物：
正向引物
5’-aagggatccatgttagaccagcaaacc-3’(SEQ ID NO：1)
反向引物
5’-atagtcgacccaagttttggcaacagc-3’(SEQ ID NO：2)
上述两个引物分别被设计成具有限制酶BamHI和SalI的切割位点(如下划线所标示者)。
以使用
Figure C20041006185500381
基因组DNA纯化试剂盒所纯化出的透明颤菌染色体作为模版(template)，并以上述两个引物来进行PCR反应，由此而扩增出一含有透明颤菌血红蛋白的结构基因vgb的DNA片段(0.55kb)。之后，以
Figure C20041006185500382
核酸纯化试剂盒来纯化所扩增出的DNA片段，以限制酶BamHI/SalI进行切割，并将所形成的切割产物掺入(incorporate)至以BamHI/SalI切开的质粒pUHE21-2(如图1所示，此质粒是得自于Dr.Bujard，Heidelbrg University，Germany，且具有氨苄青霉素抗性基因、pMB1复制起点(replication origin)、T7 A1启动子、限制酶ScaI切割位点以及多重克隆位点)内，而得到质粒pUHE-VHb。
接着使用限制酶EcoRI/HindIII而从质粒pUHE-VHb切出一带有核糖体结合位点和透明颤菌血红蛋白结构基因(vgb)的DNA片段，并予以连接至以EcoRI/HindIII切开的质粒pA199A-2(如图2所示，此质粒具有氨苄青霉素抗性基因、pMB 1复制起点、lacI抑制基因、T7 A1启动子和多重克隆位点)(Y.-P.Chao et al.(2003)，Biotechnol Prog.19：1076-1080)，而得到质粒pA1A2-VHb。
最后，使用限制酶NruI/HindIII而从质粒pA1A2-VHb切出一含有lacI抑制基因、T7 A1启动子以及透明颤菌血红蛋白结构基因(vgb)的DNA片段，并予以掺入至以SmaI/HindIII切开的质粒pGB2(如图3所示，此质粒具有链霉素抗性基因、pSC101复制起点和多重克隆位点)(G.Churchward et al.(1984)，Gene，31：165-171)，而获得质粒pGB-VHb，其结构如图4所示。
质粒pGB-VHb是委托源资国际生物科技公司(台北)来进行测序分析，而被证实包含质粒pGB-VHb上所含有的T7A1启动子的核苷酸序列以及透明颤菌血红蛋白结构基因(vgb)的核苷酸序列。
B.构建带有硫氧还蛋白结构基因(trxA)的重组质粒pGB-Trx
质粒pGB-Trx包含tac启动子用以控制硫氧还蛋白结构基因的表达，其构建方式说明如下。
根据硫氧还蛋白结构基因的核苷酸序列(C.J.Lim etal.(1985)，J Bacteriol.163：311-316)来合成下面两个引物：
正向引物
5’-ccgaattcaaccacacctatggtgtatg c-3’(SEQ ID NO：3)
反向引物
5’-ggggatccgctgcaaggcgattaag-3’(SEQ ID NO：4)
上述两个引物分别被设计成具有限制酶EcoRI和BamHI的切割位点(如下划线所标示者)。
以使用Spin Miniprep kit所纯化出的质粒pTrx(Invitrogen Co.)作为模版，并以上述两个引物来进行PCR反应，由此而扩增出一含有硫氧还蛋白结构基因(trxA)的DN A片段(0.58kb)。
之后，以
Figure C20041006185500402
核酸纯化试剂盒来纯化所扩增出的DNA片段，以限制酶EcoRI/BamHI进行切割，并将所形成的切割产物掺入至以EcoRI/BamHI切开的质粒pJF118EH(如图5所示，其具有氨苄青霉素抗性基因、pBR322复制起点、lacIq抑制基因、tac启动子和多重克隆位点)(J.P.Furste etal.(1986)，Gene，48：119-131)，而得到质粒pJF-Trx。
最后，以限制酶NruI/HindIII而从质粒pJF-Trx切出一含有lacIq抑制基因、tac启动子和硫氧还蛋白结构基因(trxA)的DNA片段，并予以掺入至以SmaI/HindIII切开的质粒pGB2内，而获得质粒pGB-Trx，如图6所示。
质粒pGB-Trx也是委托源资国际生物科技公司(台北)来进行测序分析，而被证实包含质粒pGB-Trx上所含有的tac启动子的核苷酸序列以及硫氧还蛋白结构基因(trxA)的核苷酸序列。
C.构建带有经融合的硫氧还蛋白结构基因(trxA)和透明颤菌血红蛋白结构基因(vgb)的重组质粒pGB-TV1
质粒pGB-TV1包含tac启动子用以控制经融合的硫氧还蛋白结构基因(trxA)和透明颤菌血红蛋白结构基因(vgb)的表达，其构建方式说明如下。
使用限制酶BamHI/HindIII而从上述A部分中所得到的质粒pUHE-VHb切出一含有透明颤菌血红蛋白结构基因(vgb)的DNA片段，并予以掺入至以BamHI/HindIII切开的质粒pKF3(Takara Shuzo Co.)内，而得到质粒pKF-VHb。
接着使用限制酶BamHI/SacI而从质粒pKF-VHb切出一含有透明颤菌血红蛋白结构基因(vgb)的DNA片段，并予以掺入至以BamHI/SacI切开的质粒pBluescript II-SK(Stratagene Co.)内，而得到质粒pBlue-VHb。
之后，使用限制酶SmaI/PstI而从质粒pBlue-VHb切出一含有完整的透明颤菌血红蛋白结构基因(vgb)的DNA片段，并予以掺入至以SmaI/PstI切开的质粒pJF-TrxFus(如图7所示，其具有氨苄青霉素抗性基因、pBR322复制起点、lacIq抑制基因、tac启动子、限制酶NruI切割位点以及多重克隆位点，并且在tac启动子下游处引入有一个不含有终止密码子的硫氧还蛋白结构基因)(Y.-P.Chao et al.(2000)，Appl.Microbiol.Biotechnol.54：348-353)，而得到质粒pJF-Trx/VHb。
最后，使用限制酶NruI/HindIII而从质粒pJF-Trx/VHb切出一个含有lacIq抑制基因、tac启动子以及经融合的硫氧还蛋白结构基因(trxA)和透明颤菌血红蛋白结构基因(vgb)的DNA片段，并予以掺入至以SmaI/HindIII切开的质粒pGB2，而获得质粒pGB-TV1，如图8所示。
质粒pGB-TV1也是委托源资国际生物科技公司(台北)来进行测序分析，而被证实包含质粒pGB-TV1上所含有的tac启动子的核苷酸序列以及经融合的硫氧还蛋白结构基因(trxA)与透明颤菌血红蛋白结构基因(vgb)的核苷酸序列。
D.构建带有硫氧还蛋白结构基因(trxA)和透明颤菌血红蛋白结构基因(vgb)的重组质粒pGB-TV2
质粒pGB-TV2包含T7 A1启动子以及tac启动子分别用以控制透明颤菌血红蛋白结构基因(vgb)与硫氧还蛋白的基因(trxA)的表达，其构建方式说明如下。
以限制酶ScaI/HindIII而从上述A部分中所得到的质粒pUHE-VHb切出一个含有T7 A1启动子和完整的透明颤菌血红蛋白结构基因(vgb)的DNA片段，同时以限制酶NruI/BamHI而从上述B部分中所得到的质粒pJF-Trx切出一个含有lacIq抑制基因、tac启动子以及完整的硫氧还蛋白结构基因(trxA)的DNA片段，然后将这两个DNA片段掺入至以BamHI/HindIII切开的质粒pGB2内，而获得质粒pGB-TV2(图9)。
质粒pGB-TV2也是委托源资国际生物科技公司(台北)来进行测序分析，而被证实包含如图9所示的载体结构，其中透明颤菌血红蛋白结构基因(vgb)是位于T7 A1启动子的下游，而硫氧还蛋白结构基因(trxA)是位于tac启动子的下游。
实施例2.以大肠杆菌来生产硫氧还蛋白、透明颤菌血红蛋白以及硫氧还蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合蛋白质
依照上面“一般实验方法”中所述的质粒转化法，将实施例1中所得到的重组质粒pGB-VHb、pGB-Trx、pGB-TV1和pGB-TV2分别转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)(Novagen Co.)中，而得到重组菌株BL21(DE3)/pGB-VHb、BL21(DE3)/pGB-Trx、BL21(DE3)/pGB-TV1和BL21(DE3)/pGB-TV2。
由固态培养皿点选出各个重组菌株的菌落，并予以接种至5mL含有15μg/mL链霉素的L B培养基内，于37℃下培养过夜。之后，将经过夜培养的细胞接种至一含有20mL LB培养基(含15μg/mL链霉素)的250mL烧瓶中，在细胞起始密度达到0.05(OD550)后，将新接种的菌液培养于一为37℃和250rpm的恒温震荡培养箱内。待细胞密度达到约0.3(OD550)时，将不同浓度的IPTG加入培养液中以诱导重组菌株来生产重组蛋白质产物。
在加入诱导剂4小时后，以离心方式收集细胞，并以高压均质机(French Press)将收集到的细胞打破，然后以冷冻离心机分离细胞并回收上清液。接着以Protein Assay Reagent(BioRad Co.)来测量所收集的上清液内的蛋白质浓度，并以Western印迹分析来免疫检测重组蛋白质的生产量。
Western印迹分析系依照上面“一般实验方法”中所述来进行。将所收集的样品(含有20μg蛋白质)依次装填至15％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。电泳完毕后，使用电转装置(Electrophoretic Transfer Cell，BioRad)，以恒定电流300mA将凝胶上被分离的蛋白质转印至硝基纤维素膜，历时3小时。转印后的硝基纤维素膜以第一抗体于室温中进行杂交历时3小时，然后使用含有1％明胶(gelatin)的清洗缓冲液来重复清洗硝基纤维素膜2次。之后，于室温中将硝基纤维素膜浸泡在含有第二抗体的溶液中摇晃浸泡历时1小时，再以含有1％明胶的清洗缓冲液来重复清洗2次，最后将硝基纤维素膜浸泡在一含有9mg氯萘酚(4-chloro-1-naphthol)的呈色液中至色带出现。取出硝基纤维素膜并以去离子水清洗以终止反应。
图10是一Western印迹分析图，其显示以透明颤菌血红蛋白第一抗体来免疫检测经IPTG诱导的大肠杆菌重组菌株BL21(DE3)/pGB-VHb的透明颤菌血红蛋白生产情形，其中泳道1：蛋白质标准物(
Figure C20041006185500431
Color Protein Marker，Cambrex BioScience)；泳道2：未经IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道3：以30μM IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道4：以100μM IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道5：以500μM IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；箭头指示透明颤菌血红蛋白的位置。
图11是一Western印迹分析图，其显示以硫氧还蛋白的第一抗体来免疫检测经IPTG  诱导的重组菌株BL21(DE3)/pGB-Trx的硫氧还蛋白生产情形，其中泳道1：蛋白质标准物(
Figure C20041006185500441
Color Protein Marker，CambrexBioScience)；泳道2：未经IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道3：以30μM IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道4：以100μM IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道5：以500μMIPTG诱导的菌株的蛋白质样本；箭头指示硫氧还蛋白的位置。
图12是一Western印迹分析图，其显示以硫氧还蛋白的第一抗体来免疫检测经IPTG  诱导的重组菌株BL21(DE3)/pGB-TV1的硫氧还蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合蛋白质生产情形，其中泳道1：蛋白质标准物(
Figure C20041006185500442
Color Protein Marker，Cambrex BioScience)；泳道2：未经IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道3：以30μM IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道4：以100μM IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道5：以500μM IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；箭头指示硫氧还蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合蛋白质的位置。
图13是一Western印迹分析图，其显示以硫氧还蛋白的第一抗体来免疫检测经IPTG诱导的重组菌株BL21(DE3)/pGB-TV2的硫氧还蛋白生产情形，其中泳道1：蛋白质标准物(
Figure C20041006185500443
Color Protein Marker，CambrexBioScience)；泳道2：未经IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道3：以30μM IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道4：以100μM IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道5：以500μMIPTG诱导的菌株的蛋白质样本；箭头指示硫氧还蛋白的位置。
图14是一Western印迹分析图，其显示以透明颤菌血红蛋白的第一抗体来免疫检测经IPTG诱导的重组菌株BL21(DE3)/pGB-TV2的透明颤菌血红蛋白生产情形，其中泳道1：蛋白质标准物(Color Protein Marker，Cambrex BioScience)；泳道2：未经IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道3：以30μM IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道4：以100μM IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；泳道5：以500μM IPTG诱导的菌株的蛋白质样本；箭头指示透明颤菌血红蛋白的位置。
从图10-14可见，未经IPTG诱导的重组菌株无法检测到重组蛋白质的生成，而在加入IPTG诱导后，重组菌株即可被诱导而生产出重组蛋白质，且蛋白质生产量会随着诱导剂剂量的增加而增高。这些结果显示，依据本发明而被转化的大肠杆菌重组菌株具有生产硫氧还蛋白、透明颤菌血红蛋白或硫氧还蛋白与透明颤菌血红蛋白的融合蛋白质的能力，并且重组蛋白质的生产量可以通过使用不同IPTG浓度来予以控制。
实施例3.以经转化的大肠杆菌来生产异源性蛋白质——人类干扰素α2
质粒pET-IFN含有T 7启动子用以控制人类干扰素α2结构基因的表达，其构建方式说明如下。
根据人类干扰素α2结构基因的核苷酸序列(E.Austruyet al.(1998)，Cancer Gene Ther.5：247-256)来合成下面两个引物：
正向引物
5’-tgctctcatatgttg atctgcctcaaac-3’(SEQ ID NO：5)
反向引物
5’-cgtgctcgag ttattattccttacttcttaaac-3’(SEQ ID NO：6)
上述两个引物分别被设计成具有限制酶NdeI和XhoI的切割位点(如下划线所标示者)。
以使用
Figure C20041006185500461
Spin Miniprep kit所纯化出的质粒pIFN2A(得自于国家卫生研究院的徐祖安教授，它含有被导入在质粒pET22b(+)(Novagen Co.)内的人类干扰素α2基因)作为模版，并以上述两个引物来进行PCR反应，由此而扩增出一含有人类干扰素α2基因(INFα2)的DNA片段。
之后，以
Figure C20041006185500462
核酸纯化试剂盒来纯化所扩增出的DNA片段，以限制酶NdeI/XhoI进行切割，并将所形成的切割产物掺入(incorporate into)至质粒pET22b(Novagen Co.)内，而得到质粒pET-IFN，其结构如图15所示。
依照上面“一般实验方法”中所述的质粒转化法，将质粒pGB2、pGB-VHb、pGB-Trx和pGB-TV1分别连同质粒pET-IFN予以转化至大肠杆菌菌株Rosetta(DE3)(Novagen Co.)内，而得到重组菌株Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB2、Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB-VHb、Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB-Trx和Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB-TV1。重组菌株的培养方法是依照实施例2中所述程序来进行，但在培养基中同时添加链霉素和氨苄青霉素，使用剂量依照上面“一般实验方法”中所述。
当新接种的菌液的细胞密度达到大约0.3(OD550)时，将500μM IPTG加入至培养液中，以便诱导重组菌株来生产重组蛋白质产物。当细胞生长接近早期的停滞生长时期(加入诱导剂6小时后)时，以离心方式收集细胞并以蛋白质电泳分析法来测量重组蛋白质的生产量。
蛋白质电泳分析法(即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)系依照上面“一般实验方法”中所述来进行。将收集到的细胞以沸水煮3分钟，以冷冻离心机分离细胞并回收上清液，接着以Protein Assay Reagent(BioRad Co.)来量测所收集的上清液的蛋白质浓度。将所收集的的上清液的样品(含有20μg蛋白质)依次装填至15％的聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)上进行电泳，随后以影像分析仪(GAS9000，UVItec)来分析定量电泳胶的蛋白质。实验结果如表1所示。
表1.经诱导生产人类干扰素α2的重组菌株的生长状况
Figure C20041006185500471
*：括号中的数字代表是各重组菌株相对于对照菌株的细胞密度的比值。相对细胞密度的计算方式是将表中经诱导后各重组菌株所达到的细胞密度除以经诱导后对照菌株(Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB2)的细胞密度。
在发酵终止时，未被诱导生产人类干扰素α2的菌株(Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB2)的细胞密度可达到4.0(OD550)，但是当加入IPTG来诱导生成人类干扰素α2时，对照菌株——也就是不生产透明颤菌血红蛋白和硫氧还蛋白的菌株(Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB2)——的生长立即受到抑制，这种细胞生长抑制现象也发生在生产透明颤菌血红蛋白的菌株(Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB-VHb)中，最终这两者的细胞密度分别只达到1.54(OD550)和1.36(OD550)。
但是，与被诱导生成人类干扰素α2的对照菌株(Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB2)相比较，经诱导后生产硫氧还蛋白的菌株(Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB-Trx)以及生产硫氧还蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合蛋白的菌株(Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB-TV1)的生长可以增加70％，最后的细胞密度均可达到大约2.65(OD550)。
此外，图16的蛋白质电泳分析显示，与未生产透明颤菌血红蛋白和硫氧还蛋白的对照菌株(Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB2)相比，生产透明颤菌血红蛋白的菌株(Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB-VHb)所生成的人类干扰素α2产量减少53％，而生产硫氧还蛋白的菌株(Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB-Trx)所生成的人类干扰素α2产量也减少35％。反观生产硫氧还蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合蛋白质的菌株(Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB-TV1)，其所生成的人类干扰素α2产量与对照菌株相当。与对照菌株相比，由生产硫氧还蛋白的菌株(BL21(DE3)/pET-IFN/pGB-Trx)所生成的人类干扰素α2减少，这个结果说明了可能因为此菌株生成较为少量的人类干扰素α2，所以此菌株的细胞生长状况较佳。
总结，相对于未经诱导生成人类干扰素α2的对照菌株(Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB2)而言，经诱导的对照菌株的生长会受到严重抑制。然而与经诱导的对照菌株相比，生产硫氧还蛋白和透明颤菌血红蛋白基因融合蛋白质的菌株(Rosetta(DE3)/pET-IFN/pGB-TV1)可以生成等量的人类干扰素α2，而细胞密度却增加70％以上。这意谓着，带有硫氧还蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合基因的载体可以赋予被转化的宿主细胞缓解过量生成重组蛋白质产物(例如人类干扰素)时所产生的毒害效应。
实施例4.以经转化的大肠杆菌来生产异源性蛋白质——香茅醇假单胞菌的酯酶(esterase)
在我们先前的研究中曾制备出质粒pET-estII(图17)，其含有T7启动子用以控制香茅醇假单胞菌的酯酶基因的表达(Y.P.Chao et al.(2003)，Res.Microbiol.154：521-526)。
依照上面“一般实验方法”中所述的质粒转化法，将质粒pGB2、pGB-VHb、pGB-Trx、pGB-TV1和pGB-TV2分别连同质粒pET-estII转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，而得到重组菌株BL21(DE3)/pET-estII/pGB2、BL21(DE3)/pET-estII/pGB-VHb、BL21(DE3)/pET-estII/pGB-Trx、BL21(DE3)/pET-estII/pGB-TV1和BL21(DE3)/pET-estII/pGB-TV2。
重组菌株的培养是照实施例3中所述方式来进行，当新接种的菌液的细胞密度达到大约0.3(OD550)时，将300μMIPTG加入至培养液中，以便诱导重组菌株来生产重组蛋白质产物。当加入诱导剂6小时后(也就是发酵时间9小时)，以离心方式收集细胞并检测所生产出的酯酶的活性。
香茅醇假单胞菌的酯酶活性的测定是根据我们较早的论文内所报导的方法来进行(Y.P.Chao et al.(2003)，Res.Microbiol.154：521-526)。主要地，以高压均质机(FrenchPress)将收集到的细胞打破，继而以冷冻离心机分离细胞并回收上清液。接着以Protein Assay Reagent(BioRad Co.)来量测所收集的上清液的蛋白质浓度。在400μL的反应溶液中加入6μL的细胞上清液和10mM的对硝基苯酚醋酸盐(para-nitrophenol acetate)，而反应溶液包含100mM磷酸钠盐缓冲液(pH7.4)、0.1％的阿拉伯胶(arabic gum)和0.4％Triton X-100。在室温下进行反应，随着时间纪录反应产物在波长410n m下的吸光值，并据此来计算酶的比活性(U/mg)，其中酶活性单位(U)被定义为每分钟每μmole的产物产生。所得实验结果被显示于表2。
表2.经诱导生产假单胞菌酯酶的重组菌株的生长状况以及酶生产量
Figure C20041006185500501
*：括号中的数字代表是各重组菌株相对于对照菌株的细胞密度和所生产的酶比活性的比值。相对细胞密度和相对酶比活性的计算方式，是将表中经诱导后各重组菌株所达到的细胞密度和酶比活性分别除以经诱导后对照菌株(BL21(DE3)/pET-estII/pGB2)的细胞密度和酶比活性。
由此实验可以观察到在发酵终止时，未被诱导生产酯酶的对照菌株(BL21(DE3)/pET-estII/pGB2)的细胞密度可达到5.2(OD550)，但是当被诱导生产酯酶后，对照菌株-也就是不生产透明颤菌血红蛋白和硫氧还蛋白的菌株(BL21(DE3)/pET-estII/pGB2)-的生长立即受到抑制，这种细胞生长抑制现象也发生在生产透明颤菌血红蛋白的菌株(BL21(DE3)/pET-estII/pGB-VHb)中，最终这两者的细胞密度只达到1.7(OD550)。
但是，与被诱导生产酯酶的对照菌株(BL21(DE3)/pET-estII/pGB2)相比较，经诱导后生产硫氧还蛋白的菌株(BL21(DE3)/pET-estII/pGB-Trx)以及同时生产透明颤菌血红蛋白和硫氧还蛋白的菌株(BL21(DE3)/pET-estII/pGB-TV2)或是生产硫氧还蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合蛋白质的菌株(BL21(DE3)/pET-estII/pGB-TV1)的生长却可增加110-150％，最后细胞密度分别可达到4.2(OD550)、3.5(OD550)和3.7(OD550)。
由表2中所示的酶生产量的结果可知，加入IPTG诱导后，不生产透明颤菌血红蛋白和硫氧还蛋白的菌株(BL21(DE3)/pET-estII/pGB2)可以得到酯酶比活性达15.5U/mg，而生产透明颤菌血红蛋白的菌株(BL21(DE3)/pET-estII/pGB-VHb)所得到的酯酶比活性为11.5U/mg，而同时生产透明颤菌血红蛋白和硫氧还蛋白的菌株(BL21(DE3)/pET-estII/pGB-TV2)或是生产硫氧还蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合蛋白质的菌株(BL21(DE3)/pET-estII/pGB-TV1)所得到的酯酶比活性则分别可达到15.5U/mg和15U/mg，而与经诱导的对照菌株(BL21(DE3)/pET-estII/pGB2)所得到的酯酶产量相当。
与对照菌株相比，生产硫氧还蛋白的菌株(BL21(DE3)/pET-estII/pGB-Trx)所得到的酯酶却减少60％(酶比活性只达到6U/mg)，这个结果说明了因为此菌株生成较为少量的酯酶，所以此菌株的细胞生长状况优选。
总结，相对于未被诱导生产酯酶的对照菌株(BL21(DE3)/pET-estII/pGB2)，经诱导的对照菌株的生长会受到严重抑制。然而，与经诱导的对照菌株相比，同时生产透明颤菌血红蛋白和硫氧还蛋白的菌株(BL21(DE3)/pET-estII/pGB-TV2)或是生产硫氧还蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合蛋白质的菌株(BL21(DE3)/pET-estII/pGB-TV1)均可以生成等量的酯酶，而细胞密度却增加110％以上。这意谓着，无论同时生产透明颤菌血红蛋白和硫氧还蛋白或是生产硫氧还蛋白和透明颤菌血红蛋白基因融合蛋白质，可以赋予经转化的宿主细胞具有缓解过量生成重组蛋白质产物(例如香茅醇假单胞菌的酯酶)时所产生的毒害效应。
实施例5.以经转化的大肠杆菌来生产同源性蛋白质-天冬氨酸酶(aspartase)
质粒pA1-AspA包含T7 A1启动子用以控制大肠杆菌天冬氨酸酶基因的表达，其构建方式说明如下。
根据天冬氨酸酶基因的核苷酸序列(S.A.Woods et al.(1986)，Biochem J.237：547-557)来合成下面两个引物：
正向引物
5’-cacaggatccacaacattcgtatcgaag-3’(SEQ ID NO：7)
反向引物
5’-acgagtcgacttcgctttcatcagtatag-3’(SEQ ID NO：8)
上述两个引物分别被设计成具有限制酶BamHI和SalI的切割位点(如下划线所标示者)。
以使用
Figure C20041006185500521
基因组DNA纯化试剂盒所纯化出的野生型大肠杆菌菌株VJS632(得自于Dr.Stewart，University ofCalifornia，Davis，CA，USA)的染色体作为模版，并以上述两个引物来进行PCR反应，由此而扩增出一含有天冬氨酸酶基因(aspA)的DNA片段。
之后，以
Figure C20041006185500522
核酸纯化试剂盒来纯化所扩增出的DNA片段，以限制酶BamHI/SalI进行切割，并将所形成的切割产物掺入至质粒pA199A-2中，而得到质粒pA1-AspA，其结构如图18所示。
依照上面“一般实验方法”中所述的质粒转化法，将质粒pGB2、pGB-VHb、pGB-Trx、pGB-TV1和pGB-TV2分别连同质粒pA1-AspA予以转化至大肠杆菌菌株VJS632中，而得到重组菌株VJS632/pA1-AspA/pGB2、VJS632/pA1-AspA/pGB-VHb、VJS632/pA1-AspA/pGB-Trx、VJS632/pA1-AspA/pGB-TV1和VJS632/pET-AspA/pGB-TV2。
重组菌株的培养是依照实施例3中所述方式来进行，但使用的培养基含有下列组分：Na2HPO4(6g/L)、KH2PO4(3g/L)、NaCl(0.5g/L)、NH4Cl(1g/L)、MgSO4·7H2O(1mM)、CaCl2(0.1mM)、葡萄糖(0.4％)和链霉素(10μg/mL)以及氨苄青霉素(15μg/mL)。当新接种的菌液的细胞密度达到大约0.3(OD550)时，将1000μM IPTG加入至培养液中，以便诱导重组菌株来生产重组蛋白质产物，并随着培养时间来收取菌液样品以测量细胞密度。在培养时间为7和20小时的时间点，以离心方式收集细胞并测量重组蛋白质产物的生产量和酶活性。
蛋白质电泳分析的方法是参照实施例3中所述方式来进行，并将所收集的的上清液的样品(含有20μg蛋白质)依次装填至10％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。大肠杆菌天冬氨酸酶活性的测定是根据我们较早的论文(Y.-P.Chao et al.(2000)，Res.Microbiol.154：521-526)内所报导的方法来进行。主要地，在1mL的反应溶液中加入0.05mg蛋白质，反应溶液的组成包含100mM天冬氨酸、100mM Tris缓冲液(pH 8.4)和5mM MgSO4。当在室温下反应10分钟后，以高性能液相层析(HPLC)来分析产物，分析条件为：移动相溶液为0.05N硫酸，流速为0.5mL/min，检测波长为210nm。酶的比活性单位为U/mg，而酶活性单位(U)被定义为每分钟每μmole的产物产生。所得实验结果被示于表3。
表3.经诱导生产天冬氨酸酶的重组菌株于不同发酵时
间点的酶生产量
Figure C20041006185500541
*：括号中的数字是代表重组菌株于发酵20小时所获得的酶比活性相对于发酵7小时所获得的酶比活性的比值。相对酶比活性的计算方式是将表中各重组菌株在发酵20小时所生成的酶比活性除以在发酵7小时所生成的酶比活性。
参见图19的上方，在发酵培养7小时后，所有被诱导生产天冬氨酸酶的重组菌株可以生成相当量的天冬氨酸酶，且酶比活性达到大约20U/m g左右(参见表3)。参见图19的下方，在发酵培养20小时后，不生产透明颤菌血红蛋白和硫氧还蛋白的菌株(VJS632/pA1-AspA/pGB2)所生成的天冬氨酸酶酶活性只有3.7U/mg，而降低了81％；生产透明颤菌血红蛋白的菌株(VJS632/pA1-AspA/pGB-VHb)所生成的天冬氨酸酶酶活性只有6.1U/mg，而降低了71％；以及生产硫氧还蛋白的菌株(VJS632/pA1-AspA/pGB-Trx)所生成的天冬氨酸酶酶活性只达12.5U/mg，而降低了37％。由图19所示的蛋白质电泳结果也可观察到上述菌株所生成的天冬氨酸酶的量明显减少。
反观同时生产透明颤菌血红蛋白和硫氧还蛋白的菌株(VJS632/pA1-AspA/pGB-TV2)或是生产硫氧还蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合蛋白质的菌株(VJS632/pA1-AspA/pGB-TV1)，它们所生成的天冬氨酸酶的量并未受到影响(参见图19下方)，而且酶比活性均维持在大约20U/mg(表3)。
总结，生产透明颤菌血红蛋白和硫氧还蛋白或是生产硫氧还蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合蛋白质可以赋予经转化的宿主细胞具有保护并安定化重组蛋白质产物(例如天冬氨酸酶)的效用，而可确保重组蛋白质产物不会受到细胞内蛋白质分解酶的不利分解作用。
实施例6.以经转化的大肠杆菌来生产同源性蛋白质——β-半乳糖苷酶
质粒pET20-Z包含T7启动子用以控制β-半乳糖苷酶基因的表达，其构建方式说明如下。
根据半乳糖苷酶基因的核苷酸序列(A.Kalnins et al.(1983)，EMBO J.2；593-597)来合成下面两个引物：
正向引物
5’-tatgcatatgaggatccattcactggccgtc-3’(SEQ ID NO：17)
反向引物
5’-cggaagcttttatttttgacaccagacc-3’(SEQ ID NO：18)
上述两个引物分别被设计成具有限制酶NdeI和XhoI的切割位点(如下划线所标示者)。
以使用
Figure C20041006185500561
基因组DNA纯化试剂盒所纯化出的大肠杆菌菌株BL21(DE3)的染色体作为模版，并以上述两个引物来进行PCR反应，由此而扩增出一含有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的DNA片段。
之后，以
Figure C20041006185500562
核酸纯化试剂盒来纯化所扩增出的DNA片段，以限制酶NdeI/HindIII进行切割，并将所形成的切割产物掺入至质粒pET22b中，而得到质粒pET20-Z，其结构如图20所示。
依照上面“一般实验方法”中所述的质粒转化法，将质粒pGB2、pGB-VHb、pGB-Trx、pGB-TV1和pGB-TV2分别连同质粒pET20-Z予以转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，而得到重组菌株BL21(DE3)/pET20-Z/pGB2、BL21(DE3)/pET20-Z/pGB-VHb、BL21(DE3)/pET20-Z/pGB-Trx、BL21(DE3)/pET20-Z/pGB-TV1和BL21(DE3)/pET20-Z/pGB-TV2。
重组菌株的培养是依照实施例5中所述方式来进行，当新接种的菌液的细胞密度达到大约0.3(OD550)时，将300μMIPTG加入至培养液中，以便诱导重组菌株来生产重组蛋白质产物，并随着培养时间收取菌液样品以测量细胞密度，并在培养时间达11小时后，以离心方式收集细胞并测量所生产的β-半乳糖苷酶的活性。
大肠杆菌β-半乳糖苷酶活性的测定是根据Miller JH(1972)Experiments in Molecular Genetics.Cold SpringHarbor，NY：Cold Spring Harbor Laboratory中所述的方法。
主要地，将培养中的细胞随取样时间取出0.1mL的菌液放入至0.9mL Z缓冲溶液(16.1g/L Na2HPO4·7H2O、5.5g/LNaH2PO4·H2O、0.75g/L KCl、0.246g/L MgSO4·7H2O、2.7mL β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol))中，并使最后体积维持为1mL。之后，加入10μL甲苯，以旋转器震荡打破细胞，并以冷冻离心机来分离细胞并回收上清液。
于所收集的上清液中加入含有邻-硝基苯基-β-D-硫代半乳糖苷(o-nitrophenyl-β-D-thiogalactoside)(4mg/mL)的反应溶液0.2mL。在室温下反应历时5分钟后，予以加入0.5mLNa2CO3(1M)以终止反应，并于420nm的波长下进行检测。β-半乳糖苷酶的比活性单位被定义为Miller单位。所得实验结果被示于表4。
表4.经诱导生产β-半乳糖苷酶的重组菌株的生长状况以及酶生产量
Figure C20041006185500571
*：括号中的数字代表是各重组菌株相对于对照菌株的细胞密度和所获得的酶比活性的比值。相对细胞密度和相对酶比活性的计算方式是将表中经诱导后各重组菌株所测得的细胞密度和酶比活性除以经诱导后对照菌株(BL21(DE3)/pET-20Z/pGB2)的细胞密度和酶比活性。
在发酵终止时，未被诱导生产β-半乳糖苷酶的对照菌株-也就是不生产透明颤菌血红蛋白和硫氧还蛋白的菌株(BL21(DE3)/pET20-Z/pGB2)-的细胞密度可达到3.2(OD550)，但是当加入IPTG以诱导生成β-半乳糖苷酶时，对照菌株和生产透明颤菌血红蛋白的菌株(BL21(DE3)/pET20-Z/pGB-VHb)的生长立即受到严重的抑制，直到培养时间终止，最终细胞密度只达到0.7-0.9(OD550)。而与经诱导的对照菌相比，生产硫氧还蛋白的菌株(BL21(DE3)/pET20-Z/pGB-Trx)以及生产硫氧还蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合蛋白质的菌株(BL21(DE3)/pET20-Z/pGB-TV1)于发酵最终的细胞密度可达到2.3-2.5(OD550)，细胞密度增加230～260％；而同时生产透明颤菌血红蛋白和硫氧还蛋白的菌株(BL21(DE3)/pET20-Z/pGB-TV2)的细胞密度也可达到1.7(OD550)，细胞密度增加140％。
另一方面，由表4所示的酶比活性的结果可知，经诱导过后，对照菌株(BL21(DE3)/pET20-Z/pGB2)可以生成约56,000Miller单位的β-半乳糖苷酶，而生产透明颤菌血红蛋白的菌株(BL21(DE3)/pET20-Z/pGB-VHb)也可生成大约51,000Miller单位的β-半乳糖苷酶。然而，同时生产透明颤菌血红蛋白和硫氧还蛋白的菌株(BL21(DE3)/pET20-Z/pGB-TV2)可以生产大约97,000Miller单位的β-半乳糖苷酶，而生产硫氧还蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合蛋白的菌株(BL21(DE3)/pET20-Z/pGB-TV1)可以生产大约83,000Miller单位的β-半乳糖苷酶，与经诱导的对照菌株(BL21(DE3)/pET20-Z/pGB2)相比，增加了大约50-75％的β-半乳糖苷酶产量。
反观生产硫氧还蛋白的菌株(BL21(DE3)/pET20-Z/pGB-Trx)，其只能生成40,000Miller单位的β-半乳糖苷酶，与经诱导的对照菌株(BL21(DE3)/pET20-Z/pGB2)相比较，β-半乳糖苷酶产量减少了大约30％。这个结果说明了生产硫氧还蛋白的菌株(BL21(DE3)/pET20-Z/pGB-Trx)因为重组蛋白质的产量减少，故而此菌株的细胞生长状况优选。
总结，无论同时生产透明颤菌血红蛋白和硫氧还蛋白或是生产硫氧还蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合蛋白质，可以赋予经转化的宿主菌株具有增高β-半乳糖苷酶产量且生长良好的效用。根据H.Dong et al.(1995)，J.Bacteriol.177：1497-1504的报导，过量生成半乳糖苷酶会导致大肠杆菌的核糖体瓦解而使得细胞生长受到严重抑制。由此推断，可同时生产透明颤菌血红蛋白和硫氧还蛋白或是生产硫氧还蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合蛋白的转化菌株将可能具有减缓细胞核糖体因为过量生产蛋白质以致瓦解的效用。
于本说明书中被引述的所有文献资料与专利案以其整体被并入本案作为参考资料。若有所冲突时，本案的详细说明(包含界定在内)将占上风。
虽然本发明已参考上述特定的具体实施方式被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神的下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明仅受如随文检附的权利要求书中所示者的限制。
                       序列表
<110>私立逢甲大学
<120>用以增进重组蛋白质的生产的核酸构建体与表达载体以及用以大量
     生产重组蛋白质的方法
<130>PE-26683-CM
<160>8
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于透明颤菌血红蛋白基因的人工正向引物
<400>1
aagggatcca tgttagacca gcaaacc    27
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于透明颤菌血红蛋白基因的人工反向引物
<400>2
atagtcgacc caagttttgg caacagc    27
<210>3
<211>29
<212>DN A
<213>人工序列
<220>
<223>用于大肠杆菌硫氧还蛋白基因的人工正向引物
<400>3
ccgaattcaa ccacacctat ggtgtatgc        29
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于大肠杆菌硫氧还蛋白基因的人工反向引物
<400>4
ggggatccgc tgcaaggcga ttaag             25
<210>5
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于人类干扰素alpha2基因的人工正向引物
<400>5
tgctctcata tgttgatctg cctcaaac          28
<210>6
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于人类干扰素alpha2基因的人工反向引物
<400>6
cgtgctcgag ttattattcc ttacttctta aac    33
<210>7
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于天冬氨酸酶基因的人工正向引物
<400>7
cacaggatcc acaacattcg tatcgaag     28
<210>8
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于天冬氨酸酶基因的人工反向引物
<400>8
acgagtcgac ttcgctttca tcagtatag    29

Claims (82)

1.一种用以提高重组宿主细胞内一选定的基因产物的生产的方法，其特征在于该方法包含下列步骤：
(a)将一编码该选定的基因产物的基因序列、一编码硫氧还蛋白的第一核酸序列以及一编码透明颤菌血红蛋白的第二核酸序列导入至一宿主细胞内；
(b)将步骤(a)所形成的重组宿主细胞培养于一合适的培养基中，以便容许该基因序列的表达；以及
(c)收获被表达的基因产物。
2.权利要求1的方法，其特征在于：
步骤(a)的进行是通过将该基因序列、该第一核酸序列和该第二核酸序列一起导入至一个可于该宿主细胞内表达的载体内，以及将由此所形成的重组载体输送至该宿主细胞内。
3.权利要求1的方法，其特征在于：
步骤(a)的进行是通过将该基因序列、该第一核酸序列和该第二核酸序列分别地导入至可于该宿主细胞内表达的载体内，以及将由此所形成的重组载体一起输送至该宿主细胞内。
4.权利要求1的方法，其特征在于：
步骤(a)的进行是通过：
(i)建构一可于该宿主细胞内表达并且包含该第一核酸序列以及该第二核酸序列的第一重组载体；
(ii)建构一可于该宿主细胞内表达并且包含该基因序列的第二重组载体；以及
(iii)将该第一重组载体与第二重组载体输送至该宿主细胞内。
5.权利要求4的方法，其特征在于：
于次步骤(i)中所建构的该第一重组载体进一步包含一诱导型启动子序列用以控制该第一核酸序列与该第二核酸序列的表达。
6.权利要求5的方法，其特征在于：
于次步骤(i)中所建构的该第一重组载体所包含的启动子序列衍生自病毒、细菌细胞、真菌细胞、藻类细胞、植物细胞、动物细胞或人类细胞。
7.权利要求6的方法，其中所述真菌细胞为酵母细胞。
8.权利要求6的方法，其中所述动物细胞为昆虫细胞。
9.权利要求6的方法，其特征在于：
于次步骤(i)中所建构的该第一重组载体所包含的启动子序列选自tac启动子、T7启动子、T7 A1启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、araBAD启动子或λPRPL启动子。
10.权利要求9的方法，其特征在于：
于次步骤(i)中所建构的该第一重组载体所包含的启动子序列是tac启动子。
11.权利要求4的方法，其特征在于：
于次步骤(i)中所建构的该第一重组载体中，将该第一核酸序列与该第二核酸序列相连接用以编码一由硫氧还蛋白与透明颤菌血红蛋白所构成的融合蛋白质。
12.权利要求4的方法，其特征在于：
于次步骤(i)中所建构的该第一重组载体进一步包含一诱导型第一启动子序列用以控制该第一核酸序列的表达，以及一诱导型第二启动子序列用以控制该第二核酸序列的表达，该第一启动子序列与第二启动子序列彼此不相同。
13.权利要求12的方法，其特征在于：
于次步骤(i)中所建构的该第一重组载体中，该第一启动子序列与该第二启动子序列各自地衍生自病毒、细菌细胞、真菌细胞、藻类细胞、植物细胞、动物细胞或人类细胞。
14.权利要求13的方法，其中所述真菌细胞为酵母细胞。
15.权利要求13的方法，其中所述动物细胞为昆虫细胞。
16.权利要求13的方法，其特征在于：
于次步骤(i)中所建构的该第一重组载体中，该第一启动子序列与该第二启动子序列各自地选自于tac启动子、T7启动子、T7 A1启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、araBAD启动子或λPRPL启动子。
17.权利要求16的方法，其特征在于：
于次步骤(i)中所建构的该第一重组载体中，该第一启动子序列是tac启动子，而该第二启动子序列是T7 A1启动子。
18.权利要求4的方法，其特征在于：
于次步骤(i)中所建构的该第一重组载体进一步包含下列各项中的至少一种：标记基因、报导基因、抗生素抗性基因、增强子序列、聚腺苷酸化位点以及调节序列。
19.权利要求1的方法，其特征在于：
于步骤(a)中所用的该第一核酸序列衍生自下列任一种细胞的硫氧还蛋白基因：细菌细胞、真菌细胞、藻类细胞、植物细胞、动物细胞或人类细胞。
20.权利要求19的方法，其中所述真菌细胞为酵母细胞。
21.权利要求19的方法，其中所述动物细胞为昆虫细胞。
22.权利要求1 9的方法，其特征在于：
于步骤(a)中所用的该第一核酸序列衍生自大肠杆菌的硫氧还蛋白基因(trxA)。
23.权利要求1的方法，其特征在于：
于步骤(a)中所用的该第二核酸序列衍生自透明颤菌属物种(Vitreoscilla sp.)的血红蛋白基因(vgb)。
24.权利要求1的方法，其特征在于：
该选定的基因产物是一同源性多肽或一异源性多肽。
25.权利要求24的方法，其特征在于：
该选定的基因产物是酶、治疗性多肽、抗原决定簇或抗体。
26.权利要求25的方法，其特征在于：
该选定的基因产物选自于干扰素、β-半乳糖苷酶、酯酶或天冬氨酸酶。
27.权利要求1的方法，其特征在于：
用于步骤(a)中的宿主细胞选自于细菌细胞、真菌细胞、植物细胞、动物细胞或人类细胞。
28.权利要求27的方法，其中所述真菌细胞为酵母细胞。
29.权利要求27的方法，其中所述动物细胞为昆虫细胞。
30.权利要求27的方法，其特征在于：
用于步骤(a)中的宿主细胞是大肠杆菌细胞。
31.一种核酸构建体，其特征在于：
该核酸构建体包含一编码硫氧还蛋白的第一核酸序列以及一编码透明颤菌血红蛋白的第二核酸序列。
32.权利要求31的核酸构建体，其特征在于：
其进一步包含一诱导型启动子序列用以控制该第一核酸序列与该第二核酸序列的表达。
33.权利要求32的核酸构建体，其特征在于：
该启动子序列衍生自病毒、细菌细胞、真菌细胞、藻类细胞、植物细胞、动物细胞或人类细胞。
34.权利要求33的核酸构建体，其中所述真菌细胞为酵母细胞。
35.权利要求33的核酸构建体，其中所述动物细胞为昆虫细胞。
36.权利要求33的核酸构建体，其特征在于：
该启动子序列选自于tac启动子、T7启动子、T7 A1启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、araBAD启动子或λPRPL启动子。
37.权利要求36的核酸构建体，其特征在于：
该启动子序列是tac启动子。
38.权利要求32的核酸构建体，其特征在于：
将该第一核酸序列与该第二核酸序列相连接用以编码一由硫氧还蛋白与透明颤菌血红蛋白所构成的融合蛋白质。
39.权利要求31的核酸构建体，其特征在于：
其进一步包含一诱导型第一启动子序列用以控制该第一核酸序列的表达，以及一诱导型第二启动子序列用以控制该第二核酸序列的表达，该第一启动子序列与第二启动子序列彼此不相同。
40.权利要求39的核酸构建体，其特征在于：
该第一启动子序列与该第二启动子序列各自地衍生自病毒、细菌细胞、真菌细胞、藻类细胞、植物细胞、动物细胞或人类细胞。
41.权利要求40的核酸构建体，其中所述真菌细胞为酵母细胞。
42.权利要求40的核酸构建体，其中所述动物细胞为昆虫细胞。
43.权利要求40的核酸构建体，其特征在于：
该第一启动子序列与该第二启动子序列各自地选自于tac启动子、T7启动子、T7 A1启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、araBAD启动子或λPRPL启动子。
44.权利要求4 3的核酸构建体，其特征在于：
该第一启动子序列是tac启动子，而该第二启动子序列是T7 A1启动子。
45.权利要求31的核酸构建体，其特征在于：
该第一核酸序列衍生自下列任一种细胞的硫氧还蛋白基因：细菌细胞、真菌细胞、藻类细胞、植物细胞、动物细胞或人类细胞。
46.权利要求45的核酸构建体，其中所述真菌细胞为酵母细胞。
47.权利要求45的核酸构建体，其中所述动物细胞为昆虫细胞。
48.权利要求45的核酸构建体，其特征在于：
该第一核酸序列衍生自大肠杆菌的硫氧还蛋白基因(trxA)。
49.权利要求31的核酸构建体，其特征在于：
该第二核酸序列衍生自透明颤菌属物种(Vitreoscillasp.)的血红蛋白基因(vgb)。
50.一种载体，其特征在于：
该载体包含一权利要求31至49项中任一项的核酸构建体。
51.权利要求50的载体，其特征在于：
其进一步包含下列各项中的至少一种：标记基因、报导基因、抗生素抗性基因、增强子序列、编码一被选定的基因产物的基因、聚腺苷酸化位点以及调节序列。
52.一种可表达一选定的基因产物的重组宿主细胞，其特征在于：
该重组宿主细胞包含一编码该选定的基因产物的基因序列，以及一编码硫氧还蛋白的第一核酸序列和一编码透明颤菌血红蛋白的第二核酸序列。
53.权利要求52的重组宿主细胞，其特征在于：
该基因序列、该第一核酸序列和该第二核酸序列被携带于一可于该宿主细胞内表达的载体上。
54.权利要求52的重组宿主细胞，其特征在于：
该基因序列、该第一核酸序列和该第二核酸序列各自被携带于一可于该宿主细胞内表达的载体上。
55.权利要求52的重组宿主细胞，其特征在于：
该第一核酸序列和该第二核酸序列被携带于一可于该宿主细胞内表达的第一载体上，而该基因序列被携带于一可于该宿主细胞内表达的第二载体上。
56.权利要求55的重组宿主细胞，其特征在于：
该第一载体进一步包含一诱导型启动子序列用以控制该第一核酸序列与该第二核酸序列的表达。
57.权利要求56的重组宿主细胞，其特征在于：
该启动子序列衍生自病毒、细菌细胞、真菌细胞、藻类细胞、植物细胞、动物细胞或人类细胞。
58.权利要求57的重组宿主细胞，其中所述真菌细胞为酵母细胞。
59.权利要求57的重组宿主细胞，其中所述动物细胞为昆虫细胞。
60.权利要求57的重组宿主细胞，其特征在于：
该启动子序列选自于tac启动子、T7启动子、T7 A1启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、araBAD启动子或λPRPL启动子。
61.权利要求60的重组宿主细胞，其特征在于：
该启动子序列是tac启动子。
62.权利要求55的重组宿主细胞，其特征在于：
将该第一核酸序列与该第二核酸序列相连接用以编码一由硫氧还蛋白与透明颤菌血红蛋白所构成的融合蛋白质。
63.权利要求55的重组宿主细胞，其特征在于：
该第一载体进一步包含一诱导型第一启动子序列用以控制该第一核酸序列的表达，以及一诱导型第二启动子序列用以控制该第二核酸序列的表达，该第一启动子序列与第二启动子序列彼此不相同。
64.权利要求63的重组宿主细胞，其特征在于：
该第一启动子序列与该第二启动子序列各自地衍生自病毒、细菌细胞、真菌细胞、藻类细胞、植物细胞、动物细胞或人类细胞。
65.权利要求64的重组宿主细胞，其中所述真菌细胞为酵母细胞。
66.权利要求64的重组宿主细胞，其中所述动物细胞为昆虫细胞。
67.权利要求64的重组宿主细胞，其特征在于：
该第一启动子序列与该第二启动子序列各自地选自于tac启动子、T7启动子、T7 A1启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、araBAD启动子或λPRPL启动子。
68.权利要求67的重组宿主细胞，其特征在于：
该第一启动子序列是tac启动子，而该第二启动子序列是T7 A1启动子。
69.权利要求52的重组宿主细胞，其特征在于：
该第一核酸序列衍生自下列任一种细胞的硫氧还蛋白基因：细菌细胞、真菌细胞、藻类细胞、植物细胞、动物细胞或人类细胞。
70.权利要求69的重组宿主细胞，其中所述真菌细胞为酵母细胞。
71.权利要求69的重组宿主细胞，其中所述动物细胞为昆虫细胞。
72.权利要求69的重组宿主细胞，其特征在于：
该第一核酸序列衍生自大肠杆菌的硫氧还蛋白基因(trxA)。
73.权利要求52的重组宿主细胞，其特征在于：
该第二核酸序列衍生自透明颤菌属物种(Vitreoscillasp.)的血红蛋白基因(vgb)。
74.权利要求55的重组宿主细胞，其特征在于：
该第一载体进一步包含一标记基因、报导基因、抗生素抗性基因、增强子序列、聚腺苷酸化位点或调节序列。
75.权利要求52的重组宿主细胞，其特征在于：
该第一核酸序列与该第二核酸序列被整合于该宿主细胞的基因组DNA内。
76.权利要求52的重组宿主细胞，其特征在于：
该选定的基因产物是一同源性多肽或一异源性多肽。
77.权利要求52的重组宿主细胞，其特征在于：
该选定的基因产物是酶、治疗性多肽、抗原决定簇或抗体。
78.权利要求77的重组宿主细胞，其特征在于：
该选定的基因产物选自于干扰素、β-半乳糖苷酶、酯酶或天冬氨酸酶。
79.权利要求52的重组宿主细胞，其特征在于：
该重组宿主细胞选自于细菌细胞、真菌细胞、植物细胞、动物细胞或人类细胞。
80.权利要求79的重组宿主细胞，其中所述真菌细胞为酵母细胞。
81.权利要求79的重组宿主细胞，其中所述动物细胞为昆虫细胞。
82.权利要求79的重组宿主细胞，其特征在于：
该重组宿主细胞为大肠杆菌细胞。
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