CN104371964B - 有氧下可提升重组蛋白质表现的菌株 - Google Patents

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Abstract

一种有氧下可提升重组蛋白质表现的菌株，其属于大肠杆菌，且含有：至少一非内源启动子，为可操作地连接至菌株染色体上的glpF基因、gldA基因、dhaKLM基因操纵组、及araE基因；一araBAD启动子，为可操作地连接至染色体上的T7 RNA聚合酶基因；及一T7启动子，为可操作地连接至一重组蛋白质基因。而且，菌株缺少araABD基因操纵组、及araFGH基因操纵组。

Description

有氧下可提升重组蛋白质表现的菌株
技术领域
本发明关于一种利用基因工程技术建构的菌株，且特别关于一种有氧下可提升重组蛋白质表现的大肠杆菌菌株。
背景技术
细胞内的蛋白质表现为一耗能的生理现象，而消耗的能量大多由细胞摄取、代谢的碳源所供应。因此，若欲提升细胞内重组蛋白质的表现量，细胞须大量摄取并代谢碳源。葡萄糖因容易摄取、代谢，故为这些碳源中最为常见者。
大肠杆菌代谢葡萄糖时，葡萄糖会抑制乳糖、蜜二糖、麦芽糖、与甘油等碳源的穿透酶活性，使菌体无法代谢这类碳源。这过程称为「诱导物排除(inducer exclusion)」。同时，葡萄糖亦会抑制环化酶(adenylyl cyclase)活性，使环化酶无法催化三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)成环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)。环化酶活性的抑制造成菌体内环腺苷酸的含量降低，从而抑制木质糖、阿拉伯糖、鼠李糖、与半乳糖等碳源的穿透酶基因与代谢基因表现，让菌体无法代谢此类碳源。此过程称为「分解代谢物阻抑(catabolite repression)」。
于具T7表现系统(T7expression system)的大肠杆菌内，因分解代谢物阻抑会抑制表现系统的lac基因操纵组的启动子活性，以间接向下调控(down regulate)重组蛋白质的表现量。为解决此问题，J Agric Food Chem.2011；59(12):6534-42已建构一株新颖大肠杆菌菌株，命名为BAD5。阿拉伯糖于有氧下能诱导菌株BAD5表现重组蛋白质。然而，菌株BAD5无法有效代谢葡萄糖以外的碳源，故不能产生足够的能量，以致限制重组蛋白质的表现量。申言之，菌株BAD5的重组蛋白质表现量无法满足业界需求。
发明内容
本发明的第一构想提出一种有氧下可提升重组蛋白质表现的菌株，其属于大肠杆菌，且包含：至少一非内源启动子，为可操作地连接至菌株的染色体上的glpF基因、gldA基因、dhaKLM基因操纵组、及araE基因；一araBAD启动子，为可操作地连接至染色体上的T7RNA聚合酶基因；以及一T7启动子，为可操作地连接至一重组蛋白质基因。而且，菌株缺少araABD基因操纵组、及araFGH基因操纵组。
本发明的第二构想提出一种有氧下可提升重组蛋白质表现的菌株，此属于大肠杆菌，且包含：至少一非内源启动子，为可操作地连接至菌株的染色体上的glpF基因、gldA基因、dhaKLM基因操纵组、araE基因、galP基因、及glk基因；一araBAD启动子，为可操作地连接至染色体上的T7RNA聚合酶基因；以及一T7启动子，为可操作地连接至一重组蛋白质基因。而且，菌株缺少araABD基因操纵组、araFGH基因操纵组、及ptsG基因。
附图说明
图1说明着大肠杆菌的甘油无氧代谢、甘油有氧代谢、及葡萄糖有氧代谢；图中符号说明为：活化基因的表现；抑制基因的表现；
图2为非原态硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺电泳图，以说明菌株生产的可溶性蛋白质；其中，径M，蛋白质标准物；径1，重组菌株BAD5/pChHDT生产的可溶性蛋白质；径2，重组菌株N30/pChHDT生产的可溶性蛋白质；箭头，D-HDT；
图3显示菌株N30的液态培养基于不同时间培养后的葡萄糖与甘油浓度；
图4显示菌株N30-Gal的液态培养基于不同时间培养后的葡萄糖与甘油浓度；
图5为非原态硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺电泳图，以说明菌株生产的蛋白质；其中，径M，蛋白质标准物；径1，重组菌株N30-Gal(φ80-TrHDT)生产的可溶性蛋白质；径2，重组菌株N30(φ80-TrHDT)生产的可溶性蛋白质；径3，重组菌株N30-Gal(φ80-TrHDT)生产的不可溶性蛋白质；径4，重组菌株N30(φ80-TrHDT)生产的不可溶性蛋白质；箭头，融合蛋白质TrxA/D-HDT。
具体实施例
为让本发明更明显易懂，文中使用的基因全名于下：araA，阿拉伯糖异构酶(arabinose isomerase)；araB，核酮糖激酶(ribulokinase)；araD，核酮糖-5-磷酸-4-表异构酶(ribulose 5-phosphate 4-epimerase)；araE，阿拉伯糖转运蛋白(arabinosetransporter)；araFGH，阿拉伯糖转运蛋白(arabinose transporter)；dhaKLM，二羟基丙酮激酶(dihydroxyacetone kinase)；galP，半乳糖穿透酶(galactose permease)；gldA，甘油脱氢酶(glycerol dehydrogenase)；glk，葡萄糖激酶(glucokinase)；glpF，传送甘油的辅助蛋白(glycerol uptake facilitator protein)；ptsG，葡萄糖磷酸转移酶系统穿透酶(glucose phosphotransferase system permease)。
请参照图1，大肠杆菌的甘油代谢可分为：有氧代谢及无氧代谢。于有氧代谢中，先将甘油转变成甘油-3-磷酸(glycerol-3-phosphate，G3P)，接着将甘油-3-磷酸转变为二羟丙酮磷酸(dihydroxyacetone phosphate，DHAP)。于无氧代谢中，先将甘油转化为二羟基丙酮(dihydroxyacetone，DHA)，再将二羟基丙酮转化成二羟丙酮磷酸。由上可知，glpF基因、gldA基因、及dhaKLM基因操纵组的启动子可能为缺氧(hypoxia)相关的调控件。若替换这些启动子为其它与缺氧无关的调控件，则可能于有氧下同时进行甘油有氧代谢与甘油无氧代谢。透过此方式，当菌体于有氧下表现重组蛋白质时，可利用甘油此等代谢方式所产生的能量。
于是，本发明的第一实施方式提出一种有氧下可提升重组蛋白质表现的菌株。此菌株属于大肠杆菌，且包括：至少一非内源启动子，为可操作地连接至菌株染色体上的glpF基因、gldA基因、dhaKLM基因操纵组、及araE基因；一araBAD启动子，为可操作地连接至染色体上的T7RNA聚合酶基因；以及一T7启动子，为可操作地连接至一重组蛋白质基因。此外，此菌株缺少araABD基因操纵组、及araFGH基因操纵组。
文中使用的「非内源启动子」乙词意指，一非自然(non-naturally)连接于一基因的启动子，其实例可以为但不限于EM7启动子、Trc启动子、或λ噬菌体PR启动子。文中使用的「可操作地连接(operably linked)」片语意指，二核酸片段相当接近，且其中一者可影响另一者。
于本实施方式中，连接至glpF基因的非内源启动子为Trc启动子，连接至gldA基因的非内源启动子为λ噬菌体PR启动子，连接至dhaKLM基因操纵组的非内源启动子为λ噬菌体PR启动子，且连接至araE基因的非内源启动子为EM7启动子。
于本实施方式中，glpF基因的非内源启动子为位于glpF基因上游区域，gldA基因的非内源启动子为位于gldA基因上游区域，dhaKLM基因操纵组的非内源启动子为位于dhaKLM基因操纵组上游区域，而araE基因的非内源启动子为位于araE基因上游区域。
于本实施方式中，重组蛋白质基因为位于菌株染色体上，或位于菌株内的一质体。
于本实施方式中，T7启动子为位于重组蛋白质基因上游区域。
综上，本实施方式的菌株于有氧下培养于一含甘油与阿拉伯糖的培养基时，阿拉伯糖可活化araBAD启动子以表现T7RNA聚合酶，接着能活化T7启动子而表现重组蛋白质。由于glpF基因、gldA基因、及dhaKLM基因操纵组的产物量增加，可于有氧下一并进行甘油有氧代谢与甘油无氧代谢，以大量产生能量。产生的能量可供重组蛋白质的表现利用，以促进其表现量。另外，基于araE基因的产物含量提升、且缺乏araFGH基因操纵组的产物，菌株与其它如本实施方式的菌株可均匀地受阿拉伯糖诱导来产生重组蛋白质。此外，由于缺少araABD基因操纵组的产物，菌株可避免代谢阿拉伯糖，从而长时间地受到阿拉伯糖诱导。简言之，本实施方式的菌株于有氧下可利用甘油有氧代谢与甘油无氧代谢产生的能量，来促进受阿拉伯糖诱导的重组蛋白质的表现量。
请再参照图1，于大肠杆菌的葡萄糖有氧代谢中，葡萄糖磷酸转移酶系统与半乳糖穿透酶均能磷酸化葡萄糖成葡萄糖-6-磷酸。于葡萄糖磷酸转移酶系统执行的过程中，伴随着磷酸烯醇丙酮酸成丙酮酸的反应，这反应同样发生于甘油无氧代谢中二羟基丙酮转变为二羟丙酮磷酸的过程。因此，葡萄糖有氧代谢中葡萄糖磷酸转移酶系统执行的过程与甘油无氧代谢中二羟基丙酮转变为二羟丙酮磷酸的过程会相互调控。若加强第一实施方式菌株的葡萄糖有氧代谢中半乳糖穿透酶执行的过程，并阻断葡萄糖磷酸转移酶系统执行的过程，则此菌株于有氧下尚可利用葡萄糖代谢产生的能量来表现重组蛋白质。
于是，本发明的第二实施方式提出一种有氧下可提升重组蛋白质表现的菌株。此菌株属于大肠杆菌，且包括：至少一非内源启动子，为可操作地连接至菌株染色体上的glpF基因、gldA基因、dhaKLM基因操纵组、araE基因、galP基因、及glk基因；一araBAD启动子，为可操作地连接至染色体上的T7RNA聚合酶基因；以及一T7启动子，为可操作地连接至一重组蛋白质基因。此外，菌株缺少araABD基因操纵组、araFGH基因操纵组、及ptsG基因。
于本实施方式中，连接至glpF基因的非内源启动子为Trc启动子，连接至gldA基因的非内源启动子为λ噬菌体PR启动子，连接至dhaKLM基因操纵组的非内源启动子为λ噬菌体PR启动子，连接至araE基因的非内源启动子为EM7启动子，连接至galP基因的非内源启动子为Trc启动子，而连接至glk基因的非内源启动子为λ噬菌体PR启动子。
于本实施方式中，glpF基因的非内源启动子为位于glpF基因上游区域，gldA基因的非内源启动子为位于gldA基因上游区域，dhaKLM基因操纵组的非内源启动子为位于dhaKLM基因操纵组上游区域，araE基因的非内源启动子为位于araE基因上游区域，galP基因的非内源启动子为位于galP基因上游区域，而且glk基因的非内源启动子为位于glk基因上游区域。
于本实施方式中，重组蛋白质基因为位于菌株染色体上，或位于菌株内的一质体中。
于本实施方式中，T7启动子为位于重组蛋白质基因上游区域。
依上，本实施方式的菌株于有氧下培养于一含葡萄糖、甘油、与阿拉伯糖的培养基时，阿拉伯糖可活化araBAD启动子以表现T7RNA聚合酶，进而活化T7启动子来表现重组蛋白质。由于glpF基因、gldA基因、及dhaKLM基因操纵组的产物含量增加，可于有氧下同时进行甘油有氧代谢与甘油无氧代谢，以产生能量。再者，透过galP基因及glk基因的产物含量上升、与缺少ptsG基因的产物，可于有氧下进行葡萄糖有氧代谢以产生能量，且葡萄糖有氧代谢与甘油无氧代谢无相互干扰。产生的能量可供作重组蛋白质的表现，以提升其表现量。另外，基于araE基因的产物含量提升、与缺乏araFGH基因操纵组的产物，菌株与其它如本实施方式的菌株均可受阿拉伯糖诱导来产生重组蛋白质。此外，藉由欠缺araABD基因操纵组的产物，菌株可避免代谢阿拉伯糖，从而长时效地受阿拉伯糖诱导。申言之，本实施方式的菌株于有氧下可利用甘油代谢与葡萄糖有氧代谢产生的能量，来提升受阿拉伯糖诱导的重组蛋白质的表现量。
兹以下述具体例，详细说明本发明的实施方式。
《实验方法与材料》
下文采用的实验方法与材料可参考本发明所属技术领域人士熟悉的工具书：Sambrook J.,et al.,2001,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,3rd ed.，如限制酶剪切DNA(DNA cleavage by restriction enzyme)、T4DNA黏接酶接合DNA(DNA ligationwith T4DNA ligase)、聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction，PCR)及非原态硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)等均可透过上述工具书及所属技术领域人士本身的专业素养来实现。
菌液浓度是使用分光光度计(Thermo Co.)测得的，测量使用的光波长为550nm，而浓度纪录为OD550。细菌染色体、质体、及DNA片段的纯化是各利用Blood&Tissue GenomicMini Kit(Viogene Co.)、Plasmid Extraction Mini Kit(Favorgen Co.)、及Gel/PCR DNAFragment Extraction Kit(Geneaid Co.)等商业套组完成的。限制酶购自New EnglandBiolabs、及Thermo Co.。T4DNA黏接酶、与PfuDNA聚合酶购自Promega Co.。PCR使用的引子为委托明欣生物科技公司、及源资生物科技公司合成的。转形使用的细胞为大肠杆菌菌株BAD5，其具备以下特征：(1)一araBAD启动子可操作地连接至菌株染色体上的T7RNA聚合酶基因；(2)一EM7启动子可操作地连接至菌株染色体上的araE基因；(3)菌株缺乏araABD基因操纵组、araFGH基因操纵组、及ptsG基因。
针对下文提到的「化学转形法」、及「电穿孔法(electroporation)」于下做详细介绍：
Ⅰ、化学转形法
从固态培养基中挑选单一菌落至液态培养基，并于适当温度下以150rpm震荡培养12至16小时。将菌液接种到液态培养基，其起始浓度为OD550＝0.08，并在适当温度下以150rpm震荡培养。直到菌液浓度为OD550＝0.3至0.5，取出4mL的菌液至试管中，冰浴10分钟，然后以4000rpm离心2分钟并移除得到的上清液。将所剩下的菌体与2mL的MgCl2(0.1M)均匀混合后，冰浴5分钟，再以4000rpm离心2分钟并移除离心后的上清液。将离心剩余的菌体与1.5mL的CaCl2(0.05M)均匀混合后，冰浴20分钟，再以4000rpm离心2分钟并移除离心得到的上清液。加入300μL的CaCl2(0.05M)与离心残存的菌体均匀混合后，则制得胜任细胞(competent cell)。
接着，取2ng/mL的质体与100μL的胜任细胞加入至试管中混合均匀。冰浴30分钟后，将试管移至42℃恒温水浴槽中2分钟，再冰浴5分钟。加入1mL的液态培养基(4℃)至胜任细胞菌液后，置于适当温度中培养2小时，再以4000rpm离心10分钟并移除得到的上清液。将残存的液态培养基与离心下来的胜任细胞混合均匀后，吸取适量的胜任细胞菌液，均匀涂在含抗生素的固态培养基，并将其置于适当温度的恒温培养箱中，隔夜培养至长出菌落。
Ⅱ、电穿孔法
从固态培养基中挑选单一菌落至含适当量的抗生素的液态培养基，并于适当温度下，以150rpm震荡培养12至16小时。将菌液接种到液态培养基，其起始浓度为OD550＝0.08，并在适当温度下以150rpm震荡培养。直到菌液浓度达OD550＝0.3至0.5，取出20mL的菌液至试管中，冰浴10分钟，然后以4000rpm离心2分钟并移除所得的上清液。将剩下的菌体与5mL的10％甘油均匀混合后，于4℃下以4000rpm离心10分钟并移除得到的上清液。将离心剩余的菌体与5mL的10％甘油均匀混合后，于4℃下以4000rpm离心10分钟并移除离心后的上清液。加入240μL的10％甘油与离心残存的菌体均匀混合后，则制得胜任细胞。
接着，取500ng/mL的线性DNA与40μL的胜任细胞加入至电穿管中并混合均匀。冰浴1分钟后，以250欧姆、2500伏特的条件电击胜任细胞，接着迅速加入2mL的SOC培养基(98mL的SOB培养基、1mL的2M的MgSO4、及1mL的2M的葡萄糖，其中SOB培养基的配方为：20g/L的胰蛋白(tryptone)、5g/L的酵母萃取物(yeast extract)、0.584g/L的NaCl、0.186g/L的KCl、及980mL的水)。于适当温度下培养SOC培养基2小时后，以4000rpm离心10分钟并移除离心上清液。将残存的SOC培养基与离心下来的胜任细胞混合均匀后，吸取适量的胜任细胞菌液，均匀涂布在含抗生素的固态培养基，并将其置于适当温度的恒温培养箱中，隔夜培养至长出菌落。
《实施例1》
Ⅰ、Trc启动子取代glpF基因的启动子
依质体pTrc99A设计Ta1引子(SEQ ID NO：1)及Ta2引子(SEQ ID NO：2)，Ta1引子有限制酶EcoRI的剪切位。以质体pTrc99A为模板，利用此二引子对其进行PCR，以增幅得到一含Trc启动子的DNA片段。依质体pLoxKm-PR(参考中国台湾发明专利申请号102144504)设计PK1引子(SEQ ID NO：3)与PK2引子(SEQ ID NO：4)，PK1引子有限制酶SmaI的剪切位，PK2引子有限制酶EcoRI的剪切位。以质体pLoxKm-PR为模板，使用此二引子对其进行PCR，以增幅得到一依序含LoxP位、抗卡纳霉素(kanamycin)基因、LoxP位的DNA片段。使用限制酶EcoRI剪切前者的DNA片段，并使用限制酶SmaI及限制酶EcoRI剪切后者的DNA片段后，利用T4黏接酶接合二剪切的DNA片段，以得到质体pLoxKm-Trc，此依序含LoxP位、抗卡纳霉素基因、LoxP位、Trc启动子。
依照大肠杆菌菌株BL21(DE3)染色体设计PT09185引子(SEQ ID NO：5)与PT09186引子(SEQ ID NO：6)，PT09185引子有限制酶XhoI的剪切位，PT09186引子有限制酶XbaI的剪切位。以大肠杆菌菌株BL21(DE3)染色体为模板，利用此二引子对其进行PCR，以增幅得到一含glpF基因的部分上游区域及glpF基因的部分区域的DNA片段。使用限制酶XhoI和限制酶XbaI剪切得到的DNA片段与质体pBluescript后，利用T4黏接酶接合剪切的DNA片段与剪切的质体，以得到质体pBlue-glpF，其含有glpF基因的部分上游区域及glpF基因的部分区域。
依质体pBlue-glpF设计PT09187引子(SEQ ID NO：7)与PT09188引子(SEQ ID NO：8)，PT09187引子有限制酶BamHI的剪切位，PT09188引子有限制酶NdeI的剪切位。以质体pBlue-glpF为模板，透过此二引子对其进行PCR，以增幅出一含glpF基因的部分上游区域及glpF基因的部分区域的直线DNA片段。以限制酶BamHI与限制酶NdeI剪切得到的直线DNA片段与质体pLoxKm-PR后，利用T4黏接酶接合剪切的直线DNA片段与剪切的质体，以得到质体pBlue-glpF-lox，其含有glpF基因的部分上游区域、LoxP位、抗卡纳霉素基因、LoxP位、λ噬菌体PR启动子、glpF基因的部分区域。使用限制酶BamHI及限制酶NdeI剪切质体pLoxKm-Trc及质体pBlue-glpF-lox后，利用T4黏接酶接合二剪切的质体，以得到质体pLoxKm-Trc/glpF’，其依序含glpF基因的部分上游区域、LoxP位、抗卡纳霉素基因、LoxP位、Trc启动子、glpF基因的部分区域。
依质体pLoxKm-Trc/glpF’设计PT09189引子(SEQ ID NO：9)与PT09190引子(SEQID NO：10)，并以质体pLoxKm-Trc/glpF’为模板，采用此二引子对其进行PCR。以上述「电穿孔法」将增幅得到的线性DNA片段转形至一大肠杆菌菌株BAD5，再参照Proc Natl Acad SciUSA.2000；97(12):6640-5，自转形后的菌株BAD5中移除LoxP位、抗卡纳霉素基因。而，此处最后得到的菌株BAD5称为「菌株BAD5-1」此外，于电穿孔法转形前，以上述「化学转形法」将质体pKD46转形至菌株BAD5内。
Ⅱ、λ噬菌体PR启动子取代gldA基因的启动子
照大肠杆菌菌株BL21染色体设计gldA1引子(SEQ ID NO：11)与gldA2引子(SEQ IDNO：12)，gldA1引子有限制酶KpnI的剪切位，gldA2引子有限制酶SacI的剪切位。以菌株BL21染色体为模板，利用此二引子对其进行PCR，以增幅出一含gldA基因的部分上游区域及gldA基因的部分区域的DNA片段。以限制酶KpnI与限制酶SacI剪切DNA片段与质体pBluescript后，利用T4黏接酶接合剪切的DNA片段与剪切的质体，以得到质体pBlue-gldA，其含有gldA基因的部分上游区域及gldA基因的部分区域。
依质体pBlue-gldA设计gldA3引子(SEQ ID NO：13)与gldA4引子(SEQ ID NO：14)，gldA3引子有限制酶NdeI的剪切位，gldA4引子有限制酶BamHI的剪切位。以质体pBlue-gldA为模板，使用此二引子对其进行PCR，以增幅得到一含gldA基因的部分上游区域及gldA基因的部分区域的线性DNA片段。使用限制酶NdeI与限制酶BamHI剪切线性DNA片段与质体pLox-Km-PR后，利用T4黏接酶接合剪切的线性DNA片段与剪切的质体，以得到质体pPR-gldA，此依序含gldA基因的部分上游区域、LoxP位、抗卡纳霉素基因、LoxP位、λ噬菌体PR启动子、gldA基因的部分区域。
据质体pPR-gldA设计gldA5引子(SEQ ID NO：15)，且以质体pPR-gldA为模板，利用gldA2引子与gldA5引子对其进行PCR。以上述「电穿孔法」将增幅得到的直线DNA片段转形至菌株BAD5-1，再参照Proc Natl Acad Sci USA.2000；97(12):6640-5，自转形后的菌株BAD5-1中移除LoxP位、抗卡纳霉素基因。而，此处最后得到的菌株BAD5-1称为「菌株BAD5-2」。
Ⅲ、λ噬菌体PR启动子取代dhaKLM基因操纵组的启动子
依照质体pLoxKm-PR设计dhakA+引子(SEQ ID NO：16)与dhakA－引子(SEQ ID NO：17)，并以质体pLoxKm-PR为模板，利用此二引子对其进行PCR。增幅得到的DNA片段依序含LoxP位、抗卡纳霉素基因、LoxP位、λ噬菌体PR启动子。
依据前述DNA片段设计dhakB+引子(SEQ ID NO：18)与dhakB－引子(SEQ ID NO：19)，并以此片段为模板，使用此二引子对其进行PCR，以增幅得一线形DNA片段，其依序含dhaKLM基因操纵组的部分上游区域、LoxP位、抗卡纳霉素基因、LoxP位、λ噬菌体PR启动子、dhaKLM基因操纵组的部分区域。
根据前述的线形DNA片段设计dhakC+引子(SEQ ID NO：20)与dhakC－引子(SEQ IDNO：21)，并以此线形片段为模板，使用此二引子对其进行PCR，以增幅得到一直线DNA片段，其依序含dhaKLM基因操纵组的部分上游区域、LoxP位、抗卡纳霉素基因、LoxP位、λ噬菌体PR启动子、dhaKLM基因操纵组的部分区域。
以上述「电穿孔法」将前述的直线DNA片段转形至菌株BAD5-2，再参照Proc NatlAcad Sci USA.2000；97(12):6640-5，自转形后的菌株BAD5-2中移除LoxP位、抗卡纳霉素基因、质体pKD46。而，此处最后得到的菌株BAD5-2称为「菌株N30」。
《实施例2》
以上述「化学转形法」将质体pChHDT(参考J Biotechnol.2005；117(3):267-75)分别转形至菌株N30与菌株BAD5，以得到重组菌株N30/pChHDT与重组菌株BAD5/pChHDT，其中质体pChHDT至少含T7启动子可操作地连接的D型乙内酰酶基因。
自LB固态培养基中挑选此二重组菌株的一菌落至5mL的含50μg/mL胺芐青霉素的LB液态培养基后，菌液于30℃培养箱内以200rpm震荡培养16小时，再接种至20mL的含1.5g/L酵母粉、50μg/mL胺芐青霉素及0.6％甘油的M9液态培养基(6g/L的Na2HPO4、3g/L的KH2PO4、0.5g/L的NaCl、1g/L的NH4Cl、1mM的MgSO4.7H2O、0.1mM的CaCl2)，其起始浓度为OD550＝0.08。接着，菌液于30℃培养箱内以250rpm震荡培养，直到其浓度达OD550＝0.3，再加入30μM的阿拉伯糖继续培养6小时，以诱导重组菌株表现D型乙内酰酶。然后，先自培养液收集菌体并以0.1M的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)清洗菌体，后将菌体悬浮于3mL的Tris-HCl缓冲液。超音波作用于悬浮后的缓冲液以打破菌体，其中超音波条件如下：震幅强度为35％、开启/关闭时间为1秒/1秒、总作用时间为3分钟。最后，于4℃下以15294Xg转速离心超音波处理后的缓冲液10分钟，并取10μL的所得上层液进行非原态硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺电泳分析表现的重组蛋白质。
如图2所示，于阿拉伯糖诱导后，此二重组菌株均可生产重组蛋白质，但重组菌株N30/pChHDT生产的重组蛋白质量明显高于重组菌株BAD5/pChHDT生产的重组蛋白质量。
另外，加入10μL的上层液至反应溶液中，反应溶液含10mM的HPH、0.5mM的MnCl2、100mM的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)。所得的反应物总体积为1mL，而反应物于40℃下反应30分钟后，置于100℃下10分钟以终止反应。冷却后，以10625Xg转速离心反应物，并收集所得的上层物。最后，以0.2μm过滤膜过滤上层物后，采用高效率液相层析(high performanceliquid chromatography，HPLC)仪分析过滤后的上层物，以测定D型对羟苯基甘胺酸(D-HDT)的量。
如表一所示，重组菌株N30/pChHDT的甘油消耗速率、D型对羟苯基甘胺酸量、D型乙内酰酶活性各约为重组菌株BAD5/pChHDT的9倍、1.6倍、和1.4倍。也就是说，重组菌株N30/pChHDT于有氧下同时进行甘油有氧代谢与甘油无氧代谢，这不仅可提升甘油代谢速率，还可提升重组蛋白质的表现量。
表一
《实施例3》
Ⅰ、Trc启动子取代galP基因的启动子
依大肠杆菌菌株BL21染色体设计gal1引子(SEQ ID NO：22)与gal2引子(SEQ IDNO：23)，gal1引子有限制酶KpnI的剪切位，gal2引子有限制酶SacI的剪切位。以菌株BL21染色体为模板，利用此二引子对其进行PCR，以增幅出一含galP基因的部分上游区域及galP基因的部分区域的DNA片段。以限制酶KpnI与限制酶SacI剪切DNA片段与质体pBlue-glpF-lox后，利用T4黏接酶接合剪切的DNA片段与剪切的质体，以得到质体pBlue-galP，其含galP基因的部分上游区域及galP基因的部分区域。
根据质体pBlue-galP设计gal3引子(SEQ ID NO：24)与gal4引子(SEQ ID NO：25)，gal3引子有限制酶NdeI的剪切位，gal4引子有限制酶BamHI的剪切位。以质体pBlue-galP为模板，使用此二引子对其进行PCR，以增幅出一含galP基因的部分上游区域及galP基因的部分区域的线性DNA片段。使用限制酶NdeI与限制酶BamHI剪切线性DNA片段与质体pLoxKm-Trc后，利用T4黏接酶接合剪切的线性DNA片段与剪切的质体，以得到一质体pTrc-galP，此依序含galP基因的部分上游区域、LoxP位、抗卡纳霉素基因、LoxP位、Trc启动子、galP基因的部分区域。
依照质体pTrc-galP设计gal5引子(SEQ ID NO：26)及gal6引子(SEQ ID NO：27)，并以质体pTrc-galP为模板，利用此二引子对其进行PCR。以上述「电穿孔法」将增幅得到的直线DNA片段转形至菌株N30，再参照Proc Natl Acad Sci USA.2000；97(12):6640-5，自转形后的菌株N30中移除LoxP位、抗卡纳霉素基因。而，此处最后得到的菌株N30称为「菌株N30-1」同样地，于电穿孔法转形前，以上述「化学转形法」将质体pKD46转形至菌株N30内。
Ⅱ、λ噬菌体PR启动子取代glk基因的启动子
根据大肠杆菌菌株BL21染色体设计glk1引子(SEQ ID NO：28)与glk2引子(SEQ IDNO：29)，glk1引子有限制酶SacI的剪切位，glk2引子有限制酶EcoRV的剪切位。以菌株BL21染色体为模板，利用此二引子对其进行PCR，以增幅出一含glk基因的部分上游区域及glk基因的部分区域的DNA片段。以限制酶SacI与限制酶EcoRV剪切DNA片段与质体pBluescript后，利用T4黏接酶接合剪切的DNA片段与剪切的质体，以得到质体pBlue-glk，其含glk基因的部分上游区域及glk基因的部分区域。
依据质体pBlue-glk设计glk3引子(SEQ ID NO：30)与glk4引子(SEQ ID NO：31)，glk3引子有限制酶NdeI的剪切位，glk4引子有限制酶BamHI的剪切位。以质体pBlue-glk为模板，使用此二引子对其进行PCR，以增幅得出一含glk基因的部分上游区域及glk基因的部分区域的线性DNA片段。使用限制酶NdeI与限制酶BamHI剪切线性DNA片段与质体pLoxKm-PR后，利用T4黏接酶接合剪切的线性DNA片段与剪切的质体，以得到一质体pPR-glk，此依序含glk基因的部分上游区域、LoxP位、抗卡纳霉素基因、LoxP位、λ噬菌体PR启动子、glk基因的部分区域。
以质体pPR-glk为模板，利用glk1引子与glk2引子对其进行PCR。以上述「电穿孔法」将增幅得到的直线DNA片段转形至菌株N30-1，再参照Proc Natl Acad Sci USA.2000；97(12):6640-5，自转形后的菌株N30-1中移除LoxP位、抗卡纳霉素基因、及质体pKD46。而，此处最后得到的菌株N30-1称为「菌株N30-Gal」。
《实施例4》
分别接种菌株N30与菌株N30-Gal至20mL的含1.5g/L酵母粉、0.3％葡萄糖及0.3％甘油的M9液态培养基(6g/L的Na2HPO4、3g/L的KH2PO4、0.5g/L的NaCl、1g/L的NH4Cl、1mM的MgSO4.7H2O、0.1mM的CaCl2)，其起始浓度为OD550＝0.08。接着，菌液于30℃培养箱内以250rpm震荡培养，并采用高效率液相层析仪分析不同培养时间后的菌液葡萄糖浓度与甘油浓度。
如图3所示，菌株N30先消耗甘油，而于甘油消耗完后，再开始消耗葡萄糖。而且，于培养10小时后，菌株N30消耗完这二种碳源。又如图4所示，菌株N30-Gal同时消耗这二种碳源，且于培养8小时后，消耗完毕。亦即，菌株N30-Gal于有氧下可同时进行甘油有氧代谢、甘油无氧代谢、与葡萄糖有氧代谢。
《实施例5》
依质体pET-TrHDTCh(参考中国台湾发明专利公开号201418462)设计TrH1引子(SEQ ID NO：32)与TrH2引子(SEQ ID NO：33)，TrH1引子有限制酶SacI的剪切位，TrH2引子有限制酶NheI的剪切位。以质体pET-TrHDTCh为模板，利用此二引子对其进行PCR，以增幅得一含T7启动子可操作地连接的TrxA/D-HDT融合基因的DNA片段。以限制酶SacI与限制酶NheI剪切DNA片段与质体pPhi80-Km(参考Biotechnol Bioeng.2008；101(5):985-95)后，利用T4黏接酶接合剪切的DNA片段与剪切的质体，以得到质体pφ80-WTrHDTCh，其依序含attB位、T7启动子、TrxA/D-HDT融合基因。
参考Biotechnol Bioeng.2008；101(5):985-95，将质体pφ80-WTrHDTCh各自转形至菌株N30与菌株N30-Gal，且转形前，转形质体pAH123至此二菌株。如此一来，菌株染色体上的attP位会与质体pφ80-WTrHDTCh上的attB位进行同源重组(homologousrecombination)，以将T7启动子与TrxA/D-HDT融合基因镶嵌于染色体上，且T7启动子可操作地连接于TrxA/D-HDT融合基因。其中，转形后的菌株N30称为重组菌株N30(φ80-TrHDT)，转形后的菌株N30-Gal称为重组菌株N30-Gal(φ80-TrHDT)。
自LB固态培养基中挑选此等重组菌株的一菌落至5mL的LB液态培养基后，菌液于37℃培养箱内以200rpm震荡培养16小时，再接种至20mL的含0.2％麸酰胺酸、0.3％葡萄糖与0.2％甘油的M9液态培养基(6g/L的Na2HPO4、3g/L的KH2PO4、0.5g/L的NaCl、1g/L的NH4Cl、1mM的MgSO4.7H2O、0.1mM的CaCl2)，其起始浓度为OD550＝0.08。接着，菌液于37℃培养箱内以250rpm震荡培养，直到其浓度达OD550＝1.0，再加入30μM的阿拉伯糖并于30℃下继续培养4小时，以诱导重组菌株表现重组融合蛋白质TrxA/D-HDT。然后，先自培养液收集菌体并以0.1M的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)清洗菌体，再将菌体悬浮于1mL的Tris-HCl缓冲液。超音波作用于悬浮后的缓冲液以打破菌体，其中超音波条件如下：震幅强度为35％、开启/关闭时间为1秒/1秒、总作用时间为3分钟。最后，于4℃下以15,294Xg转速离心超音波处理后的缓冲液10分钟，并取5μL所得的上层液及2μL所得的下层液进行非原态硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺电泳分析表现的重组融合蛋白质TrxA/D-HDT。
如图5所示，此二重组菌株均可表现可溶性重组融合蛋白质TrxA/D-HDT与不可溶性重组融合蛋白质TrxA/D-HDT。又如表二所示，此二重组菌株均可消耗完甘油，但重组菌株N30-Gal(φ80-TrHDT)的葡萄糖消耗量、可溶性重组融合蛋白质TrxA/D-HDT表现量、与不可溶性重组融合蛋白质TrxA/D-HDT表现量约为重组菌株N30(φ80-TrHDT)的2.3倍、1.4倍与1.27倍。由此可知，重组菌株N30-Gal(φ80-TrHDT)于有氧下同时进行甘油代谢与葡萄糖有氧代谢，这不仅可提升甘油与葡萄糖代谢速率，还可提升重组蛋白质的表现量。
表二
惟以上所述者，仅为本发明的较佳实施例，但不能以此限定本发明实施的范围；故，凡依本发明申请专利范围及发明说明书内容所作的简单的等效改变与修饰，皆仍属本发明专利涵盖的范围内。

Claims (6)

1.一种有氧下提升重组蛋白质表现的方法，其特征在于，包括：
于有氧下培养一大肠杆菌菌株于一含葡萄糖、甘油、与阿拉伯糖的培养基；
其中，该大肠杆菌菌株包括：
至少一非内源启动子，可操作地连接至该大肠杆菌菌株的染色体上的glpF基因、gldA基因、dhaKLM基因操纵组、araE基因、galP基因、及glk基因；
一araBAD启动子，可操作地连接至该染色体上的T7RNA聚合酶基因；以及
一T7启动子，可操作地连接至一重组蛋白质基因；
其中，该大肠杆菌菌株缺少araABD基因操纵组、araFGH基因操纵组、及ptsG基因。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该非内源启动子选自于由EM7启动子、Trc启动子、及λ噬菌体PR启动子所组成的群组。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该连接至glpF基因的非内源启动子为Trc启动子，该连接至gldA基因的非内源启动子为λ噬菌体PR启动子，该连接至dhaKLM基因操纵组的非内源启动子为λ噬菌体PR启动子，该连接至galP基因的非内源启动子为Trc启动子，而该连接至glk基因的非内源启动子为λ噬菌体PR启动子。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，该连接至glpF基因的非内源启动子位于该glpF基因的上游区域，该连接至gldA基因的非内源启动子位于该gldA基因的上游区域，该连接至dhaKLM基因操纵组的非内源启动子位于该dhaKLM基因操纵组的上游区域，该连接至galP基因的非内源启动子位于该galP基因的上游区域，而该连接至glk基因的非内源启动子位于该glk基因的上游区域。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该重组蛋白质基因位于该大肠杆菌菌株的染色体上，或位于该大肠杆菌菌株内的一质体中。
6.如权利要求1或5所述的方法，其特征在于，该T7启动子位于该重组蛋白质基因的上游区域。
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