CN105062942B - 可生产正丁醇的菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种可生产正丁醇的菌株，属于大肠杆菌且包括：一丙酮丁醇梭杆菌的hbd基因、一丙酮丁醇梭杆菌的crt基因、adhE2基因、phaA基因、一齿垢密螺旋体的ter基因、一酿酒酵母的fdh1基因、一启动子PλPL、一操作子lacO。启动子PλPL为镶嵌于菌株的染色体，以调控染色体上的zwf基因、pgl基因、udhA基因、以及aceEF基因操纵组‑E354K点突变的lpdA基因，操作子lacO为镶嵌于菌株的染色体，以调控色体上的gltA基因，且菌株缺少pgi基因、ldhA基因、pta基因、adhE基因、frdA基因。
Description
技术领域
本发明关于一种利用基因工程技术建构的菌株，且特别关于一种可生产正丁醇的菌株及其应用。
先前技术
石化产业虽与我们的日常生活息息相关，但石化燃料价格不断上涨、存量日趋减少与对环境造成的伤害逐日严重已局限这项产业的发展。因此，确实有必要开发更多再生且环保的燃料，利用生物过程制造化学制品便应蕴而生。一般而言，生物所制造的化学制品多为微生物的发酵产物。于微生物发酵过程中，发生了许多以NADH与NAD+为辅因子的氧化还原反应。当NAD+作为电子接受者时，醣类代谢会伴随NADH产生。之后，于NADH存在下还原醣类代谢中间物而再次产生NAD+。于大肠杆菌内，此种还原反应通常会产生乙醇、乳酸、琥珀酸。故，维持NADH与NAD+间的氧化还原平衡乃是确保微生物发酵持续的关键。
梭菌属(Clostridium)的正丁醇制造为微生物发酵的典型例(Jones and Woods1986)。这种发酵制造分成二阶段：产酸(acidogenesis)与产溶剂(solventogenesis)(Leeet al.2008)。产酸时，梭菌属会发酵葡萄糖而产生乙酸、丁酸。产溶剂时，梭菌属于再吸收这些有机酸的同时制造丙酮、正丁醇与乙醇为最终产物。依这种合成路径，自葡萄糖直接合成正丁醇会导致NADH/NAD+氧化还原失衡，主因在于此合成路径所需的NADH较于醣解途径所产生的NADH多。正丁醇为一可替代的燃料，且就能量密度、蒸气压、吸湿性而言，正丁醇优于乙醇(Mussatto et al.2008)。以特定比例混合正丁醇与汽油后，此混合物可作为交通运输的燃料，并直接使用已存在的输油管运输。上述性质让微生物所制造的正丁醇极受业界注目。
目前已有许多于不同菌种内制造正丁醇(Atsumi et al.2008、Bhandiwad etal.2014、Berezina et al.2010、Lan and Liao 2011、Nielsen et al.2009、Steen etal.2008、Tong et al.2014)的方案。这些方案虽然可行，但因其正丁醇的产量低而无法普及。大肠杆菌已广泛作为生物科技的工具以用来制造高价值的化学制品和生物燃料。于引用梭菌属的合成途径至大肠杆菌后，利用大肠杆菌制造正丁醇将大有可为。即使如此，胞内氧化还原状态仍旧为一难以解决的问题。之后，此问题透过增加大肠杆菌内的NADH量获致解决(Lim at el.2013、Shen et al.2011)。然而，这些现有技术所用的TB培养基(成分为：1.2g/L胰化蛋白(tryptone)、24g/L酵母萃取物、2.31g/L磷酸二氢钾(KH2PO4)、12.54g/L磷酸氢二钾(K2HPO4)、4mL/L甘油)价格不斐，限制了它们的应用。
发明内容
调控一种特殊大肠杆菌内NADH含量可提升正丁醇的产生，且引用梭菌属的CoA依赖合成途径至此菌株内。这种调控为透过修饰菌株的中心代谢途径完成的，包含有：(1)将丙酮酸导入乙酰辅酶A；(2)放大五碳糖磷酸途径(pentose phosphate pathway，PPpathway)；(3)将醣解通量引导至五碳糖磷酸途径；(4)自柠檬酸循环(tricarboxylic acidcycle，TCA cycle)转向乙酰辅酶A。如此一来，此菌株可培养于外加葡萄糖的M9Y培养基(含有M9盐类与酵母萃取物)并有效地制造正丁醇。
依上述概念，本发明提出一种可生产正丁醇的菌株，其属于大肠杆菌且含有：一丙酮丁醇梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)的hbd基因、一丙酮丁醇梭杆菌的crt基因、一丙酮丁醇梭杆菌的adhE2基因、一钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)的phaA基因、一齿垢密螺旋体(Terponema denticola)的ter基因、一酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的fdh1基因、一启动子PλPL、一操作子lacO。启动子PλPL为镶嵌于菌株的染色体，以调控染色体上的zwf基因、pgl基因、udhA基因、以及aceEF基因操纵组-E354K点突变的lpdA基因，操作子lacO为镶嵌于菌株的染色体，以调控色体上的gltA基因，且菌株缺少pgi基因、ldhA基因、pta基因、adhE基因、frdA基因。
于一实施例中，菌株为衍生自大肠杆菌BL21。
于另一实施例中，启动子PλPL为镶嵌于zwf基因、pgl基因、udhA基因、及aceEF基因操纵组-E354K点突变的lpdA基因的上游区域。
于又一实施例中，操作子lacO为镶嵌于gltA基因的上游区域。
于再一实施例中，hbd基因、crt基因、adhE2基因、phaA基因、ter基因、fdh1基因为受另一启动子PλPL调控。
此外，于本发明揭露的范围内，更提出一种生产正丁醇的方法，其包含：培养上述菌株于一含葡萄糖的M9Y培养基中。
于一实施例中，培养基含有6g/L磷酸氢二钠(Na2HPO4)、3g/L磷酸二氢钾、0.5g/L氯化钠、1g/L氯化铵、1mM硫酸镁、0.1mM氯化钙、10mg/L维他命B1、5g/L酵母萃取物、20g/L葡萄糖。
为让本发明更明显易懂，文中使用的基因全名于下：aceEF-lpdA，丙酮酸去氢酶复合体(pyruvate dehydrogenase complex)；adhE，丁醛/丁醇去氢酶(butyraldehyde/butanol dehydrogenase)；adhE2，丁醛/丁酸去氢酶(butyraldehyde/butanoldehydrogenase)；crt，巴豆酸酶(crotonase)；fdh1，甲酸去氢酶(formatedehydrogenase)；frdA，富马酸还原酶(fumarate reductase)；gltA，柠檬酸合成酶(citrate synthase)；hbd，3-羟基丁基辅酶A去氢酶(3-hydroxybutyryl-CoAdehydorgenase)；ldhA，乳酸去氢酶(lactate dehydrogenase)；pgi，磷酸葡糖异构酶(phosphoglucose isomerase)；pgl，内酯酶(lactonase)；phaA，β-酮硫解酶(β-ketothiolase)；pta，磷酸乙酰转移酶(phosphate acetyltransferase)；ter，反烯酰基辅酶A还原酶(trans-enoyl-coA reductase)；udhA，吡啶核苷酸转氢酶(pyridinenucleotide transhydrogenase)；zwf，葡萄糖-6-磷酸去氢酶(glucose-6-phosphatedehydrogenase)。
附图说明
图1为大肠杆菌菌株BuT-14的正丁醇生产途径；图中符号
为强化基因的表现，
为减弱或抑制基因的表现。
图2为大肠杆菌菌株BuT-8-Fdh1于培养液中培养24小时后的各种物质浓度。
图3为大肠杆菌菌株BuT-9于培养液中培养24小时后的各种物质浓度。
图4为大肠杆菌菌株BuT-10于培养液中培养24小时后的各种物质浓度。
图5为大肠杆菌菌株BuT-12于培养液中培养24小时后的各种物质浓度。
图6为大肠杆菌菌株BuT-13于培养液中培养不同时间后的各种物质浓度。
图7为大肠杆菌菌株BuT-14于培养液中培养不同时间后的各种物质浓度。
具体实施方式
兹以下述实施例，详细说明本发明：
制备例1：菌株的培养
接种液为透过将大肠杆菌生长于含2g/L葡萄糖的Luria-Bertani培养液中至隔夜而取得。细胞密度为于光线波长550nm测得。接着，将接种液培养于50mL的M9Y培养液中，其含有：6g/L磷酸氢二钠、3g/L磷酸二氢钾)、0.5g/L氯化钠、1g/L氯化铵、1mM硫酸镁、0.1mM氯化钙、10mg/L维他命B1、5g/L酵母萃取物、20g/L葡萄糖。于光线波长550nm下测得的细胞密度达0.1时，提供有限供氧条件给菌株。
制备例2：菌株的建构
本实施例的菌株与引子列示于表1。
表1
用RC12171引子(SEQ ID NO：22)与RC12314引子(SEQ ID NO：28)对质体pTrc-Fdh1(Chiang et al.2012)进行PCR以增幅出一受trc启动子(Ptrc)调控的酿酒酵母fdh1。以BamHI限制酶处理增幅产物后，将产物连接至BamHI与NruI等限制酶处理过的质体pP21-Km来取得质体pP21-Fdh1。接着，用质体pP21-Fdh1将含Ptrc-fdh1的DNA片段插入至大肠杆菌内，且移除插入至菌株内的卡纳霉素抗性基因(Chiang et al.2008)。用RC12154引子(SEQID NO：20)与RC12155引子(SEQ ID NO：21)对菌株BL21进行PCR以增幅出一lpdA片段，并将增幅产物插入至NdeI与XhoI等限制酶处理过的质体pMCS-5来取得质体pMSC-lpdA。以RC12215引子(SEQ ID NO：23)与RC12216引子(SEQ ID NO：24)对质体pMSC-lpdA中的lpdA进行E354K点突变(亦即，lpdA的蛋白质产物中第354位置由谷胺酸变成赖胺酸)。于NdeI与XhoI等限制酶处理经点突变后的质体，取得一E354K点突变的lpdA片段(以lpdA*表示)。然后，将lpdA*转质至夹有LE*-kan-RE*-PλPL盒匣的质体pLoxKm-PR(Saini et al.2014)，得到的质体pLoxKm-lpdA*含有受LE*-kan-RE*-PλPL调控的lpdA*(LE*-kan-RE*-PλPL-lpdA*)。另以RC12289引子(SEQ ID NO：26)与RC12290引子(SEQ ID NO：27)增幅出lpdA的上游区域，并接合至BamHI与SacI等限制酶处理过的质体pBluescript以得到质体pBlue-ac。以BamHI与XhoI等限制酶处理质体pLoxKm-lpdA*，并将得到的LE*-kan-RE*-PλPL-lpdA*片段插入至质体pBlue-ac以获得质体pBlue-ac/lpdA*。此外，以RC11210引子(SEQ ID NO：2)与RC12331引子(SEQ ID NO：29)对质体pBlue-ac/lpdA*进行PCR。先以EcoRI切割PCR产物，后自接成质体pBlue-Ac-lpdA，其具有受LE*-kan-RE*阻断的lpdA。为剔除lpdA，以RC12288引子(SEQ ID NO：25)与RC12290引子(SEQ ID NO：27)对质体pBlue-Ac-lpdA进行PCR以取得一截断(truncated)的lpdA，并电穿孔至大肠杆菌菌株内。最后，以RC10178引子(SEQ IDNO：1)与RC12288引子(SEQ ID NO：25)对质体pBlue-ac/lpdA*进行PCR来取得一含PλPL-lpdA*的DNA片段，并以BamHI限制酶处理此片段。透过接合此片段与经BamHI与EcoRV等限制酶处理的质体pLam-Crt(Saini et al.2014)来取得质体pLam-LpdA*。最后，将含有PλPL-lpdA*的DNA片段插入至大肠杆菌内后，移除插入的标记(Chiang et al.2012)。
为提升内源基因的表现，将启动子PλPL置于特定基因的前方以取代原本的启动子，详细操作于下。首先，以RC11403引子(SEQ ID NO：3)与RC11404引子(SEQ ID NO：4)对菌株BL21进行PCR以增幅出一含zwf上游区域与5’-端区域的片段；以RC11407引子(SEQ IDNO：7)与RC11408引子(SEQ ID NO：8)对菌株BL21进行PCR以取得一含udh上游区域与5’-端区域的片段；以RC12085引子(SEQ ID NO：18)与RC12086引子(SEQ ID NO：19)对菌株BL21进行PCR以取得一含aceE上游区域与5’-端区域的片段。每一片段经KpnI与SacI等限制酶处理后，插入至质体pBluescript以分别取得质体pBlue-zwf、pBlue-udhA与pBlue-aceE。之后，以RC11405引子(SEQ ID NO：5)与RC11406引子(SEQ ID NO：6)对质体pBlue-zwf进行PCR以建立NdeI与BamHI等限制酶的切点于质体上；以RC11409引子(SEQ ID NO：9)与RC11410引子(SEQ ID NO：10)对质体pBlue-udhA进行PCR以建立NdeI与BamHI等限制酶的切点于质体上；以RC12058引子(SEQ ID NO：15)与RC12059引子(SEQ ID NO：16)对质体pBlue-aceE进行PCR以建立NdeI与XbaI等限制酶的切点于质体上。以NdeI与BamHI(或NdeI与XbaI)等限制酶处理质体pLoxKm-PR以取得LE*-kan-RE*-PλPL盒匣，并插入至质体pBlue-zwf、pBlue-udhA与pBlue-aceE来各别取得质体pPR-zwf、pPR-udhA、pPR-aceE。最终，以RC11417引子(SEQ IDNO：11)与RC11418引子(SEQ ID NO：12)对质体pPR-zwf进行PCR以增幅出一客座DNA(passenger DNA)；以RC11419引子(SEQ ID NO：13)与RC11420引子(SEQ ID NO：14)对质体pPR-udhA进行PCR以增幅出另一客座DNA；以RC12060引子(SEQ ID NO：17)与RC12086引子(SEQ ID NO：19)对质体pPR-aceE进行PCR以增幅出又一客座DNA。以电穿孔法将此三客座DNA插入至菌株，并移除标记基因(Chiang et al.2012)。
为取得pgl，用RC13292引子(SEQ ID NO：40)与RC13293引子(SEQ ID NO：41)对菌株MG1655进行PCR。于PCR产物经EcoRV与SacI等限制酶处理后，与质体pBluescript接合成一质体pBlue-pgl。接着，先以SmaI与XhoI等限制酶处理质体pBlue-pgl，再将处理后的产物与质体pLoxKm-PL接合。如此，可取得一含与LE*-kan-RE*-PλPL融合的pgl的质体pSPL-pgl。然后，利用RC13001引子(SEQ ID NO：30)与RC13293引子(SEQ ID NO：41)对质体pSPL-pgl进行PCR增幅出LE*-kan-RE*-PλPL-pgl片段。之后，将此增幅片段接合至经EcoRI与NruI等限制酶处理过的质体pSPL-ato(Saini et al.2014)。同样，以RC13034引子(SEQ ID NO：31)与RC13035引子(SEQ ID NO：32)对接合后的质体pSPL-ato进行PCR以得到一客座DNA，并电穿孔至菌株内。最后，移除插入的标记基因。
为调控gltA的表现，以操作子lacO取代启动子P2，取代过程如下。首先，以RC13195引子(SEQ ID NO：33)与RC13196引子(SEQ ID NO：34)对质体pLoxKm-PR进行PCR以增幅出一含操作子lacO的片段。于此片段经SmaI限制酶处理后，自黏成质体pLoxCm-LacO，此质体融合有LE*-kan-RE*-lacO。其次，以RC13197引子(SEQ ID NO：35)与RC13198引子(SEQ ID NO：36)对菌株BL21进行PCR以增幅出一含gltA上游区域与5’-端区域的片段。将增幅得到的片段插入至经KpnI与SmaI等限制酶处理过的质体pBluescript来得到一质体pBlue-GltA。再者，以RC13199引子(SEQ ID NO：37)与RC13200引子(SEQ ID NO：38)对质体pBlue-GltA进行PCR以建立ApaI与SalI等限制酶的切点于质体上。以ApaI与SalI等限制酶处理质体pLoxCm-LacO以取得LE*-kan-RE*-lacO盒匣，并接合至建立有ApaI与SalI等限制酶的切点的质体pBlue-GltA来取得一质体pBlue-GltO。最后，以RC14025引子(SEQ ID NO：42)与RC14026引子(SEQ ID NO：43)对质体pKD3进行PCR以得到FRT-Cm-FRT盒匣。将PCR产物插入至经EcoRI与SalI等限制酶处理过的质体pBlue-GltO，使FRT-Cm-FRT盒匣取代LE*-kan-RE*盒匣并得到一质体pB-gltO-Cm。同样，以RC13197引子(SEQ ID NO：35)与RC13201引子(SEQ ID NO：39)对质体pB-gltO-Cm进行PCR以得到一客座DNA，并电穿孔至菌株内和移除插入的标记基因。
制备例3：分析方法
此处分析方法主要参照Saini et al,2015。使用配有Reflective Index RID-10A的高效液相层析仪(High Performance Liquid Chromatography，HPLC；购自Shimadzu，日本)测量葡萄糖与甘油。使用气相层析仪Trace 130测量正丁醇(购自Thermo Scientific，美国)。
胞内NADH含量为用荧光NAD+/NADH检测套组(购自Cell Technology，美国)测得的。此项测量流程可参考使用者说明书。简言之，先对细菌培养液进行离心，并将离心得到的细胞团回溶于200μL分解缓冲液与200μLNADH萃取液。将所得的混合液置于60℃下约20分钟。于对混合液离心后，取出离心所得的上层物并与反应试剂混合。将得到的混合物置于暗处、室温下1小时以进行反应。最后，以波长530至570nm的激发光与波长590至600nm的放射光测量反应产物以取得NADH含量。
制备例4：酵素活性分析
细胞培养液离心后，将离心得到的细胞团回溶于1mL溶解缓冲液。先以超音波震荡破坏细胞，再离心。收集离心取得的上层物并称之为「无细胞萃取物(cell-freeextract)」。无细胞萃取物中的总蛋白质浓度为采用Bio-Rad蛋白质分析套组测得的。丙酮酸去氢酶的活性如Bond-Watts et al.2011所述于室温下用波长340nm监测NAD+的还原，所用的反应溶液含有50mM磷酸钾(pH7.9)、5mM丙酮酸钠、1.3mM辅酶A、0.5mM硫胺素焦磷酸(thiamine pyrophosphate)、与5mM氯化镁。为开启还原反应，取100μL无细胞萃取物至1mL反应溶液。葡萄糖-6-磷酸去氢酶的活性如Snoep et al.1996所述用波长340nm监测NADP+的还原，所用反应溶液含2mM葡萄糖-6-磷酸、0.67mMNADP+、10mM氯化镁、与50mMTris-氯化氢(pH7.5)。为开启还原反应，于30℃下取100μL无细胞萃取物至1mL反应溶液中。6-磷酸葡萄糖酸内酯酶的活性的测量如葡萄糖-6-磷酸去氢酶的活性测量(Sinha and Maitra1992)，除了所用的反应溶液有50μM葡萄糖-6-磷酸酶、0.5mMNADP+、50mMTris-氯化氢、10mM氯化镁、与50mMTris-氯化氢(pH7.5)。此外，柠檬酸合成酶的活性的测量如Walsh andKoshland Jr 1985所述，所使用的反应溶液含有0.1mM乙酰辅酶A、0.5mM草醋酸、0.2mM5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoic Acid))、与50mMTris-氯化氢(pH7.5)。
分析例1：丙酮酸氧化途径的放大
本实施例的起始菌株为大肠杆菌菌株BuT-8(Saini et al.2015)，其具备了生产正丁醇的辅酶A依赖途径，并含有丙酮丁醇梭杆菌的hbd基因、crt基因、与adhE2基因、钩虫贪铜菌的phaA基因、及齿垢密螺旋体的ter基因。此外，为减少碳源耗损与保存NADH，自此菌株中移除涉入不必要途径的内源基因，如adhE基因、ldhA基因、pta基因、frdA基因。如图1所示，自一个葡萄糖还原合成成一个正丁醇需要的NADH量比醣解所提供者来的多。依此，可期待透过补充NADH来促进正丁醇的生产。于本实施例中，连结醣解的丙酮酸节点(node)与柠檬酸循环显然为一可行的标的。于大肠杆菌内，丙酮酸在有氧环境下透过丙酮酸去氢酶氧化成乙酰辅酶A，而在发酵条件下透过丙酮酸甲酸裂解酶(pyruvate-formate lyase)氧化成乙酰辅酶A(White 2007)。甲酸为丙酮酸甲酸裂解酶反应的还原产物。其它微生物的甲酸去氢酶，如博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)fdh、酿酒酵母fdh1，能氧化甲酸成二氧化碳与NADH(Berrios-Rivera et al.2002)。此二基因早已用于大肠杆菌内来提升胞内NADH，藉此增加正丁醇的生产(Chiang et al.2012、Shen et al.2011)。于是，受trc启动子调控的酿酒酵母fdh1插入至菌株BuT-8内。如图2所示，所得到的菌株BuT-8-Fdh1于有限供氧条件下生长24小时可产生3.1g/L正丁醇，且其正丁醇浓度较菌株BuT-8的正丁醇浓度约增加25％。
相对丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸去氢酶的反应生成了NADH作为还原产物。因此，可期望透过控制丙酮酸去氢酶的表现来改变胞内的NADH。这可于菌株BuT-8-Fdh1中透过PλPL启动子结合至aceEF基因操纵组达成。为使丙酮酸去氢酶对NADH的抑制不灵敏，去除内源lpdA基因并额外建构一E354K点突变的lpdA(亦即lpdA*)于菌株BuT-8-Fdh1内，且lpdA*受PλPL启动子控制。此时，得到的菌株称为菌株BuT-9。如图3所示，于同样条件下，菌株BuT-9可生产4.3g/L正丁醇。又如表2所示，菌株BuT-9中的丙酮酸去氢酶活性约为菌株BuT-8的1.3倍，且前者菌株中的NADH量较后者菌株多45％。
表2
同样方式早已应用于具备辅酶A依赖合成途径的大肠杆菌的正丁醇生成(Shen etal.2012、Bond-Watt et al.2011、Lim et al.2013)。然而，习用的菌株为培养于价格昂贵的TB培养液中；反之，本实施例的菌株为培养于相对便宜的M9Y培养液。
分析例2：五碳糖磷酸途径的放大
醣解途径于葡萄糖-6-磷酸结点分支。以葡萄糖-6-磷酸为起始代谢物，五碳糖磷酸途径产生供核酸与芳香族胺基酸合成的前驱物，并供应大量供还原性生物合成的NADPH(White2007)。于是，可透过调节葡萄糖-6-磷酸结点来提升NADH的取得。葡萄糖-6-磷酸去氢酶可于五碳糖磷酸途径中催化第一步，故菌株BuT-9的zwf基因融合有PλPL启动子。于大肠杆菌内，吡啶核苷酸转氢酶的功能为NADH与NADPH的互相转变(Canocaco et al.2001)，故菌株BuT-9的udhA基因融合有PλPL启动子。如图4所示，所得到的菌株BuT-10可生产4.9g/L正丁醇。如表2所示，相较于菌株BuT-9，菌株BuT-10中的葡萄糖-6-磷酸去氢酶活性约增加2倍，且生产的正丁醇量约增加10％。
由于菌株BuT-8衍生自大肠杆菌BL21，故其缺乏pgl基因(Meier et al.2012)。内酯酶主要于五碳糖磷酸途径中负责葡萄糖-6-磷酸去氢酶之后的步骤。因此，由提升表现的葡萄糖-6-磷酸去氢酶引导至五碳糖磷酸途径中的碳流量可能会于内酯酶调控的步骤受限。为解决此问题，自大肠杆菌K-12取得受PλPL启动子调控的pgl基因并导入至菌株BuT-10。最后，如图5所示，所得到的菌株BuT-12可生产5.4g/L正丁醇。如表2所示，相较于菌株BuT-10，菌株BuT-12中的内酯酶活性约增加10倍，生成的NADH量约增加36％，且其正丁醇量约增加25.6％。
由上可知，于醣解与五碳糖磷酸途径中碳流量的重新分布可影响胞内NADH的含量。须注意的是，一个葡萄糖进入五碳糖磷酸途径会产生二个还原性等效物并浪费一个二氧化碳。尽管如此，相较于菌株BuT-8，菌株BuT-12生成的NADH量约增加96％，且生产的正丁醇量约增加为2倍。
分析例3：经五碳糖磷酸途径的葡萄糖代谢
依大肠杆菌的中央代谢，每单位葡萄糖经五碳糖磷酸途径较经醣解多生成85％的还原效能。故，透过将碳流量自醣解转移至五碳糖磷酸途径可有效提升胞内NADH量。磷酸葡糖异构酶负责于葡萄糖-6-磷酸的异构化，且失活可让五碳糖磷酸途径为葡萄糖代谢的主要途径(Hua et al.2003)。故，藉由剔除菌株BuT-12中的pgi基因来得到菌株BuT-13。如图6所示，相较于菌株BuT-12，菌株BuT-13于生物质量与葡萄糖利用约减少32％与30％。于发酵30小时后，菌株BuT-13并无法完全消耗葡萄糖且产生较少的正丁醇(4.6g/L)。
透过缺乏pgi基因的菌株可实现改善NADPH的取得，但此菌株却于比生长率(specific growth rate)减少47％(Chemler et al.2010)。这种缺乏pgi基因所致的生长缺失乃因过剩的NADPH会伤害细胞的生理状态(Canonaco et al.2001)。有趣的是，葡萄糖-6-磷酸去氢酶与吡啶核苷酸转氢酶的高活性可促进缺乏pgi基因的菌株生长(Canonaco etal.2001、Flores et al.2004)。然而，菌株BuT-13虽有高葡萄糖-6-磷酸去氢酶与吡啶核苷酸转氢酶的活性、及正丁醇合成途径，但仍受到生长缺失所影响。此结果意谓着此菌株存在失衡的还原状态。
分析例4：自柠檬酸循环的碳流量的转移
乙酰辅酶A是合成正丁醇的前驱物且亦可于柠檬酸循环中氧化。为适应氧气张力，柠檬酸循环可进行氧化途径或还原途径以产生不同程度的还原等效物(White 2007)。柠檬酸合成酶可催化柠檬酸循环的第一步。可以期待透过降低柠檬酸合成酶活性来从柠檬酸循环将碳流量转移，从而保留乙酰辅酶A与调控还原等效物的产生。此可透过于菌株BuT-13中以操作子lacO取代柠檬酸合成酶原来的启动子P2。接着，培养所得的菌株BuT-14并分析其发酵能力。因此，几乎回复菌株BuT-14生长且其生物质量与菌株BuT-12相当。如图7所示，菌株BuT-14的葡萄糖利用稍为缓慢并于29小时后产生6.1g/L正丁醇。如表2所示，相较于菌株BuT-12，菌株BuT-14生成的NADH量约增加16％，且其柠檬酸合成酶活性约降低32％。为进一步了解菌株BuT-14对于更低柠檬酸合成酶活性的反应，将lacIQ导入至此菌株内。发现相较于菌株BuT-12，所得的菌株BuT-14-A的柠檬酸合成酶活性约降低50％。而且，此菌株亦展现不佳的生长、仅耗损40％葡萄糖且于30小时产生1.8g/L正丁醇(结果未示)。过去咸知，降低柠檬酸合成酶活性90％并未影响大肠杆菌于葡萄糖中的生长(Walsh and KoshlandJr1985)。相对地，缺乏pgi基因的菌株于葡萄糖的生长则与柠檬酸合成酶的活性相关。透过调控柠檬酸合成酶的活性，可让菌株自缺乏pgi基因导致的缺陷复原。这可能是柠檬酸合成酶的调控破坏胞内的还原状态。显然地，此菌株展现了对胞内还原状态的高感受性，且适度调节柠檬酸合成酶活性对于确保菌株优异的表现是必要的。
甲酸去氢酶的使用及丙酮酸去氢酶表现的提升为大肠杆菌内用来提升NADH取得的常见方法。透过建构乙酰辅酶A与NADH的驱动，Shen et al.2011已使用甲酸去氢酶来达到0.2g/L/h正丁醇产生速率与88％转换率。另外，Bond-Watts et al.2011已透过丙酮酸去氢酶来达到0.065g/L/h正丁醇产生速率。再者，Lim et al.2013已透过甲酸去氢酶与丙酮酸去氢酶来达0.26g/L/h正丁醇产生速率与0.27g/g正丁醇葡萄糖转换率。须注意的是，这些前案使用的培养基为昂贵的TB培养基，且培养基中非葡萄糖的组份可贡献15％正丁醇生产(Shen et al.2011)。于本实施例，采用较便宜的M9Y培养基来系统性地调控胞内NADH。首先，于菌株BuT-8中提升甲酸去氢酶及丙酮酸去氢酶的活性，此菌株的正丁醇生产速率为0.18g/L/h、正丁醇葡萄糖转换率为0.22g/g。其次，菌株BuT-12可引导碳流量至五碳糖循环来增加NADPH并透过吡啶核苷酸转氢酶将NADPH转变为NADH，其正丁醇生产速率与正丁醇葡萄糖转换率各为0.23g/L/h、0.27g/g。最后，于菌株BuT-14中透过引导碳流量至五碳糖循环并自柠檬酸循环转移碳流量来改善还原效力。菌株BuT-14的NADH量与正丁醇浓度均为起始菌株BuT-8的1.3倍，且其正丁醇生产速率为0.21g/L/h、正丁醇葡萄糖转换率为0.31g/g。理论上，于经五碳糖磷酸循环的葡萄糖代谢中每摩尔葡萄糖会产生0.85摩尔(非1摩尔)正丁醇，这归咎于二氧化碳的产生。如此一来，正丁醇葡萄糖的转换率的理论值为0.35g/g。经计算后，菌株BuT-14的正丁醇葡萄糖转换率约为此理论值的89％。
综上所述，说明着本发明所构筑的菌株可有效地生产正丁醇，且正丁醇的生产可于相对便宜的培养基中实现。
惟以上所述者，仅为本发明的较佳实施例，但不能以此限定本发明实施的范围；故，凡依本发明申请专利范围及发明说明书内容所作的简单的等效改变与修饰，皆仍属本发明专利涵盖的范围内。
Claims (6)
1.一种可生产正丁醇的菌株，其特征在于，属于大肠杆菌且包括：
一丙酮丁醇梭杆菌的hbd基因、一丙酮丁醇梭杆菌的crt基因、一丙酮丁醇梭杆菌的adhE2基因、一钩虫贪铜菌的phaA基因、一齿垢密螺旋体的ter基因、一酿酒酵母的fdh1基因、多个启动子PλPL、一操作子lacO；
其中，各该启动子PλPL为镶嵌于该菌株的染色体，该染色体上的zwf基因、pgl基因、udhA基因、以及aceEF基因操纵组-E354K点突变的lpdA基因为分别各自受一个启动子PλPL调控；
该hbd基因与该phaA基因、该crt基因、该adhE2基因、该ter基因、为分别各自受一个该启动子PλPL调控；
其中，该操作子lacO为镶嵌于该菌株的染色体，以调控该染色体上的gltA基因；
该fdh1基因受一Ptrc启动子调控；
其中，该菌株缺少pgi基因、ldhA基因、pta基因、adhE基因、frdA基因。
2.如权利要求1所述的菌株，其特征在于，衍生自大肠杆菌BL21。
3.如权利要求1所述的菌株，其特征在于，各该启动子PλPL分别各自为镶嵌于该zwf基因、该pgl基因、该udhA基因、及该aceEF基因操纵组-E354K点突变的lpdA基因的上游区域。
4.如权利要求1所述的菌株，其特征在于，该操作子lacO为镶嵌于该gltA基因的上游区域。
5.一种生产正丁醇的方法，其特征在于，包括：
培养如权利要求1至4中任一所述的菌株于一含葡萄糖的M9Y培养基中。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，该培养基包含：
6g/L磷酸氢二钠、3g/L磷酸二氢钾、0.5g/L氯化钠、1g/L氯化铵、1mM硫酸镁、0.1mM氯化钙、10mg/L维他命B1、5g/L酵母萃取物、20g/L葡萄糖。
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