CN110951768A - 一种通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α‑半乳糖苷酶甲醇诱导表达量的方法，可有效解决提高毕赤酵母工程菌中α‑半乳糖苷酶甲醇诱导表达量及其应用的问题，方法是，构建表达质粒pPIC9K‑Gal1；构建甲醇诱导型表达α‑半乳糖苷酶的毕赤酵母工程菌出发菌株，构建共表达质粒pPICZαA‑PVT‑Gal1，将出发菌株制作成感受态细胞，将共表达质粒pPICZαA‑PVT‑Gal1电转化至其中，涂布在含100μg/mL博来霉素的YPDS平板上筛选阳性克隆，得到共表达毕赤酵母工程菌株；本发明制备方法简单，新颖独特，易操作，表达效果好。

Description

一种通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖 苷酶甲醇诱导表达量的方法
技术领域
本发明涉及化工，特别是一种通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量的方法。
背景技术
α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.12)能够将α-半乳寡糖、半乳甘露聚糖侧链、半乳糖脂和糖蛋白通过α-半乳糖苷键连接的非还原端的半乳糖苷残基逐个水解掉。α-半乳糖苷酶在食品、饲料等工业中有着广泛的应用。在制糖工业中，α-半乳糖苷酶可以分解甜菜浆中的棉籽糖来提高蔗糖的回收率。在饲料工业中，α-半乳糖苷酶可以分解饲料中的棉籽糖家族寡糖类抗营养物质，减少其在单胃动物饲喂中引起的腹胀和腹泻问题，同时又能提高饲料的利用率。在造纸工业中，α-半乳糖苷酶还可以用来提高甘露聚糖酶对纸浆的漂白效果。所以α-半乳糖苷酶有着广阔的市场前景。在生产方面，利用基因工程的手段构建高效的表达菌株是现在α-半乳糖苷酶生产的主要途径，毕赤酵母就是一种最常用的工程菌株，为了提高毕赤酵母工程菌株中α-半乳糖苷酶的表达量，通过在甲醇诱导型分泌表达α-半乳糖苷酶的毕赤酵母工程菌株中共表达透明颤菌血红蛋白的方法来提高毕赤酵母工程菌株发酵液中α-半乳糖苷酶的表达量，具有显著的提高效果，相对于出发菌株，共表达透明颤菌的血红蛋白将α-半乳糖苷酶的表达量提高，但至今未见有公开报导。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量的方法，可有效解决提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量及其应用的问题。
本发明解决的技术方案是，一种通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量的方法，包括以下步骤：
（1）、构建表达质粒pPIC9K- Gal1：用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对α-半乳糖苷酶基因Gal1和毕赤酵母甲醇诱导型表达载体pPIC9K同时进行双酶切，之后用T4 DNA连接酶将α-半乳糖苷酶基因连接进载体pPIC9K中，形成表达质粒pPIC9K- Gal1；
所述α-半乳糖苷酶基因为在密码子、mRNA二级结构和GC含量方面进行优化后的米根毛霉（Rhizomucor miehei）来源的一个α-半乳糖苷酶基因；
（2）、构建甲醇诱导型表达α-半乳糖苷酶的毕赤酵母工程菌出发菌株：按照Invitrogen公司的酵母转化方法将质粒pPIC9K- Gal1转化到毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布在MD平板上，30℃培养4天，用无菌水吹取MD平板表面的克隆涂布于含有4 mg/mL G418的YPD平板上，30℃培养5天，挑选阳性克隆作为出发菌株；
所述的质粒pPIC9K- Gal1为经DNA限制性内切酶PmeⅠ酶切过的质粒；
（3）、构建共表达质粒pPICZαA-PVT- Gal1：以与步骤（1）同样的方法构建毕赤酵母表达质粒pPICZαA- Gal1，用DNA限制性内切酶BamHⅠ酶切基因片段PVT以及毕赤酵母表达质粒pPICZαA- Gal1，之后用T4 DNA连接酶将PVT连接进表达质粒pPICZαA- Gal1中，形成共表达质粒pPICZαA-PVT- Gal1；
所述基因片段PVT为将透明颤菌血红蛋白基因vgb置于树干毕赤酵母低氧诱导启动子PsADH2及终止子之间形成的DNA片段；
（4）、构建共表达毕赤酵母工程菌株：按照Invitrogen公司的酵母转化方法，将第（2）步得到的出发菌株制作成感受态细胞，将共表达质粒pPICZαA-PVT- Gal1电转化至其中，涂布在含100 μg/mL博来霉素的YPDS平板上筛选阳性克隆，得到共表达毕赤酵母工程菌株；
所述共表达质粒pPICZαA-PVT- Gal1为经DNA限制性内切酶PmeⅠ酶切后的质粒；
所述的毕赤酵母工程菌株在棉子糖水解中的应用。
本发明制备方法简单，新颖独特，易操作，表达效果好，可有效解决通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量，并实现毕赤酵母工程菌在α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量中的应用，经济和社会效益显著。
附图说明
图1为本发明摇瓶表达高活性菌株筛选发酵液酶活均有显著提升图。
具体实施方式
以下结合实施例和具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，一种通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量的方法，包括以下步骤：
（1）、构建表达质粒pPIC9K- Gal1：
表达基因为米根毛霉（Rhizomucor miehei）来源的一个α-半乳糖苷酶基因Gal1，按照毕赤酵母密码子偏好性对mRNA二级结构、GC含量优化，确定序列为SEQ1，基因合成后，用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对α-半乳糖苷酶基因和毕赤酵母甲醇诱导型表达载体pPIC9K同时进行双酶切，之后，用T4 DNA连接酶将α-半乳糖苷酶基因连接进载体pPIC9K中，形成表达质粒pPIC9K- Gal1，用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对质粒进行酶切检测，以确保质粒构建成功；
（2）、构建甲醇诱导型表达α-半乳糖苷酶的毕赤酵母工程菌出发菌株：
按照Invitrogen公司的酵母转化方法，用DNA限制性内切酶PmeⅠ对质粒pPIC9K- Gal1线性化后电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布在MD平板上，30℃培养4天，用无菌水吹取MD平板表面的克隆涂布于含有4 mg/mL G418的YPD平板上，30℃培养5天；挑取单克隆接种至50 mL（250 mL锥形瓶）YPD培养基中培养，30℃培养3天，离心，收集菌体，转入装有50mL BMMY培养基的锥形瓶中诱导表达，每天补加BMMY培养基体积1%的甲醇，3天后测定发酵液中α-半乳糖苷酶酶活，取100µL发酵液和浓度10 mmol/L的的pNPG溶液100 µL混合，60℃下反应10 min，加入800 µL 0.5 mo/L的Na2CO3溶液终止反应，取200 µL加入到96孔板中，用酶标仪测405 nm处吸收值，代入对硝基苯（pNP）测定的标准曲线，得α-半乳糖苷酶的活力值，选取保存活性最高的克隆最为毕赤酵母工程菌出发菌株；
所述的α-半乳糖苷酶酶活定义为：每分钟水解对硝基苯-α-D-半乳糖苷（pNPG）产生1 µmol的对硝基苯酚（pNP）所需的酶量定义为1个α-半乳糖苷酶酶活单位；
所述的BMMY培养基的配制方法是：酵母粉10g、蛋白胨20g、KH2PO4 11.8g、K2HPO4 3g，加水至890mL，121℃灭菌20分钟，温度降至60℃以下时加入浓度13.4g/L过滤灭菌的YNB（无氨基酵母氮源）溶液100mL、0.4mg/L的生物素溶液1mL、甲醇5mL，混匀制成；
所述的YPD培养基配制方法是，酵母粉10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g，加水至1000mL，108℃灭菌20分钟；
（3）、构建共表达质粒pPICZαA-PVT- Gal1
以与步骤（1）同样的方法构建毕赤酵母表达质粒pPICZαA- Gal1，用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对质粒进行酶切检测以确保质粒构建成功，为了提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶的表达量，在工程菌中共表达一种透明颤菌的血红蛋白，以提升毕赤酵母对氧气的利用率，提高其在高密度发酵时对低氧环境的耐受性，提高α-半乳糖苷酶基因的表达量，按照毕赤酵母密码子偏好性对透明颤菌的血红蛋白基因优化mRNA二级结构、GC含量，合成透明颤菌血红蛋白基因vgb，其序列为SEQ2中的下划线部分，通过拼接PCR的方法将其置于树干毕赤酵母低氧诱导启动子PsADH2及终止子之间，形成DNA片段PVT，序列为SEQ2，用DNA限制性内切酶BamHⅠ酶切PVT以及构建好的质粒pPICZαA- Gal1，之后用T4 DNA连接酶将PVT连接进质粒pPICZαA- Gal1中，形成共表达质粒pPICZαA-PVT- Gal1，用DNA限制性内切酶BamHⅠ对质粒进行酶切检测以确保质粒构建成功；
（4）、构建共表达毕赤酵母工程菌株
按照Invitrogen公司的酵母转化方法，将第（2）步得到的出发菌株制作成感受态细胞，将用DNA限制性内切酶PmeⅠ线性化后的共表达质粒pPICZαA-PVT- Gal1电转化至其中，涂布在含100 μg/mL博来霉素的YPDS平板上筛选阳性克隆，挑取单克隆接种至50 mL（250 mL锥形瓶）YPD培养基中培养，30℃培养3天后离心收集菌体转入50 mL（250 mL锥形瓶）BMMY培养基诱导表达，每天补加1%的甲醇，3天后用与步骤2中相同的方法测定发酵液中α-半乳糖苷酶酶活最高，实现共表达毕赤酵母工程菌株构建；
所述的YPDS平板是，酵母粉10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、山梨醇182g、琼脂粉15g，加水至1000mL，108℃灭菌20分钟。
附件：
SEQ1：
GCTGCTGGTTTGTTGTCTACTGGTATTCACAAGCATCCAGATTTGGATACTTGGTTCTTGGTTACCGAACGTTCTACTTACGTTGTTGGTGCTACTGATGATGGTTACTTGTTGAACTTGCATTGGGGTGATAGATTGAACGAATTGGACAACGACTTGAACGCTACTCGTATTTTCACTACCACCACTTTCAACCCACCAATCACTTACGCTCAAGAAGAATTGCCAGCTTTTGGTGGTTTGAGATACAGAGAATTGGCCTTGAAGGTTGAATTGCCAAACGGTGTTAGAGAATTGAACTTGTTGTACTCCGGTAGATCCAACATGACTGGTGACTCTTTGTTGGATTTGGAATTGGAAGCTGGTAACTACACTGGTTTGACCGTTACTTTGCATTACGAGTTGGACGTTGACAACGACATTATTCGTCGCTCTTACACTATCCGTAACGGTTTGAAGAAGGGTAACGTCAACTTGTCTAAGGCTTTGTCTGCTGCTTGGCATCCACCATCTGCTATGGGTTTGGATGAAGAAAGAGAGTTGTTGACTTTGTCTGGTGATTGGGCTCATGAAGCTATTACTCAGAGAACCAGACTTAGACCAGGTGTTTCTCATACTGTTCAATCCCCAAGAGGTTTTCCATCTCATCAATCCTACCCATACTTCGCTTTGAGACAAGTTCCAACTGGTGAAACTTCTCCAGGTACTTCTAACGAAGTTTACTTTGGTGCTTTGGCTTGGTCTGGTTCTTGGGAAATTACTGTTGATACCACCATCTACGGTTACTCTAGAATCACTGGTGGTATTCACCATCAAGACTTTGGTTGGACTTTGGAACCAGGTGAATCTTTTACCACTCCAGTTTTTGCTGCTGGTTACACTAACGAAGGTTTGCCAGGTGCTAGAAAGAGAATGCCAAGACATGTTCGTAAGTACCAATTGAAGAACGTTAAGACCCAGCAAAAGAAGGAAGATATGTACAACCCCGTTTTGTACAACTCTTGGGAGGCTTTGACTTTTAACATCACCTACGACAAGCAAATTGCTTTGGCTGATAAGGCTGCTGCTATGGGTATTGAATTGTTCGCTGTCGATGATGGTTGGTTTGGTGCTAGAGATAACGATTCTGCTGGTTTGGGTGATTGGTTTGTTAACAAGCGTAAGTTTCCACATGGTATGAAGCCATTGGCTGATCATGTTCATAACTTGGGTATGAAGTTCGGTTTGTGGTTTGAGCCAGAGTCTTTTAACCCAAACTCCGACTTGTACAGAAAGCATCCAGATTGGGCTTTTTACTACGATGGTATCCCAAGATACGAAGCCAGAAACCAATTGTTGATGAACTTGGGTTTGCCAGAAGTTAGAGAGTACTTGTACAACAGAATTTCCACCTTGGTCAAGGAAATTGGCATCGATTTCATCAAGTGGGATATGAACAGACCATTTGCTGAAGTCACTATGCATAACTACAAGGACAGAAACCCAAGAGAAGCTTGGGTTTTGGCTGTTGAAGGTTTTTACTCCATCATCGACAAGTTGAAGCAGGAGTTCCCAGATTTGATGATCGAAACTTGTGCTTCTGGTGGTGGTAGAATGGATATTGGTATCTTGCAGAAGGTTGATCAAGCTTGGACTTCTGATAACACTAGACCAGACGCTCGTTTGTTTATTCAATACGGCGCCTCCATGTTTTTGCCACCACGTATTATGTACGGTTGGGTTACTGATTCTCCATACGATTCTCAGATTGAGATCCCATTGTCTTTCCGTTTCCACGTTTCTTTCATGGGTGGTTTGGGTGTTGGTTCTAACTTGAACAACATGGAGGAGTCCGATATTAAGGAAGCTGCTGGTTGGATTGAATTGTACAAGCAGATCCGTCATGTCATCCAAAACGGTGATTTGGATTGGTTGGTTCAACCATCTTGTGTTGGTGATTTGGTTGCTGTTTCTCAGACTACTTCTCAAGATAGATCCGAAGCTGTTGTTTTGGCTTACCGTTTCAACTCTGTCTTTTCCGACCAATTGAACCCATTGCGTTTGAGATACCTTGATCCAAAGCATACTTACCGTGTTCGTGTTTACCAAGATGATCCATCTACTCCATCTGATGAGTACGAAATGTCTGGTGCTTTGTTGTTGTCTCGTGGTATTGTTTTGCCAGGTTTGAACAACATCATGTTCAGATCCGCCGTTGTTTGGGTTCAACAGAAGTAG
SEQ2：
GCGGAAGCACAGTCTAATGCTGATTCTTGATAGTGCTCATCGCCGACAGCCAGATTCGAAGAAAGGGGGGACGAGATCCGGGTTCATCTGCAAGAGACACAGAAAATAAAAAACATACGATCCTTTTCAGCTACCAAGCGCTTAACCAGGAAATCCACTGCTGGAGTGGCCAGCATGTCACGAGGTGGCAGATTCCGATAATGTGTGATTGGAGTGTAGCATTGGCGCAAGTCGAATTTCGGTCATATTCCGTGTCTGGATATTATTCCACTATTTTTTAATTTTTCAGGTTGGATGCGATTGTTCCCTTTATGTCTGGACGATGCCTGAAGCCCCAGGTCTATATAAGGGGCTCGAAAGTCCTTTGACCAGCTGGTTGATTTGATTTTGTTTGTTCCTTTCTTTCTTTCATCTACCATCACTCAATTGCATTCGCAATTACCCATTAATACATATTTCACTTGCTCCACATATTGCACCCATCTGCATAAGTGCTGCGATCCATCCAAATTATCATGTTGGACCAACAAACCAT CAACATCATCAAGGCTACTGTTCCAGTTTTGAAGGAACATGGTGTCACTATCACTACTACCTTCTACAAGAACTTGT TTGCCAAGCATCCAGAAGTTAGACCATTGTTTGACATGGGTAGACAGGAATCTTTGGAACAACCAAAGGCTTTGGCT ATGACTGTTTTGGCTGCTGCTCAAAACATTGAAAACTTGCCCGCTATTTTGCCAGCTGTTAAGAAGATTGCCGTCAA GCATTGTCAAGCTGGTGTTGCTGCTGCTCATTACCCAATTGTTGGCCAAGAATTGTTGGGTGCCATTAAGGAAGTTT TGGGTGATGCTGCTACTGATGATATTTTGGATGCTTGGGGTAAGGCTTACGGTGTTATTGCTGACGTCTTCATTCAA GTTGAAGCCGATTTGTACGCTCAAGCTGTTGAATAAACAAGCCGTGCTAGATAGTGTTTTGTTCTATTCCACCTCGTGTTTTATTTACCTTTTAACTAGTGCTAATTTACGAATAATGTACGTTAGAAAAATTGACCTATTTATATATGGGTGCAAAAAAGTTGCGTCCTGTCCGAAGGTTGCATTTCCCCTCAAGCAATTTCTTTGCCCCATAACAACCAAAAGGAGTTAGGATCTGGGAACTATTTAACGCCGCTGGGGCAACTATTGAGATGTACCTAGATGCCACGCCCCACCTGACCAATCTAATTGCTGTAATTCATATCCTTAAGATTAGTTCTCGCCGTGAACCTAGAGATGTGACCCTTAGCTTAGAAGTTTTCTAAGAAAAATCGTAACTTTAAGAAACTATTAATTAGGCGGCTTTTTCAGAACTTTTTCATTAGCATCATTGAGCTTTTCGGCTTCTACCTGAGCTCCGC
上述所述的共表达毕赤酵母工程菌株可有效用于棉子糖的水解，实现共表达毕赤酵母工程菌株在棉子糖水解中的应用。
本发明方法简单，易操作，通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量的效果好，本发明方法制备的共表达毕赤酵母工程菌株对棉籽糖具有很好的水解效果，可以将棉籽糖中的α-半乳糖苷键完全水解，可用于生产实际的需要，并经实地应用和测试取得了非常满意的技术效果，有关资料如下：
实验一：构建表达质粒pPIC9K- Gal1
表达基因为米根毛霉（Rhizomucor miehei）来源的一个α-半乳糖苷酶基因Gal1，按照毕赤酵母密码子偏好性对其进行优化，合理优化其mRNA二级结构，GC含量等，最终确定了最优序列如SEQ1所示，基因合成后，用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对α-半乳糖苷酶基因和毕赤酵母甲醇诱导型表达载体pPIC9K同时进行双酶切，之后用T4 DNA连接酶将α-半乳糖苷酶基因连接进载体pPIC9K中，形成表达质粒pPIC9K- Gal1，用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对质粒进行酶切检测以确保质粒构建成功，检测结果是，琼脂糖凝胶电泳中，可见，EcoRⅠ/NotⅠ酶切质粒pPIC9K- Gal1与pPICZαA- Gal1后，均可以切出一条载体条带和Gal1基因条带，证明载体构建成功；
实验二：构建甲醇诱导型表达α-半乳糖苷酶的毕赤酵母工程菌出发菌株
按照Invitrogen公司的酵母转化方法，用DNA限制性内切酶PmeⅠ对质粒pPIC9K- Gal1线性化后电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布在MD平板上，30℃培养4天，用无菌水吹取MD平板表面的克隆涂布于含有4 mg/mL G418的YPD平板上，30℃培养5天；挑取单克隆接种至50 mL（250 mL锥形瓶）YPD培养基中培养，30 ℃培养3天后离心收集菌体转入50 mL（250 mL锥形瓶）BMMY培养基诱导表达，每天补加1%的甲醇，3天后测定发酵液中α-半乳糖苷酶酶活，取100 µL适当稀释的发酵液液和100 µL的pNPG溶液（10 mmol/L）混合，60 ℃下反应10 min，加入800 µL 0.5 mo/L的Na2CO3溶液终止反应，取200 µL加入到96孔板中，用酶标仪测405 nm处吸收值，代入预先用对硝基苯（pNP）测定的标准曲线，得α-半乳糖苷酶的活力值，选取保存活性最高的克隆最为毕赤酵母工程菌出发菌株；
实验三：构建共表达质粒pPICZαA-PVT- Gal1
以与步骤1（实验一）同样的方法构建毕赤酵母表达质粒pPICZαA- Gal1，用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对质粒进行酶切检测以确保质粒构建成功，经检测：琼脂糖凝胶电泳中，可见，EcoRⅠ/NotⅠ酶切质粒pPIC9K- Gal1与pPICZαA- Gal1后，均可以切出一条载体条带和Gal1基因条带，证明载体构建成功；为了提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶的表达量，在工程菌中共表达一种透明颤菌的血红蛋白，可以提升毕赤酵母对氧气的利用率，提高其在高密度发酵时对低氧环境的耐受性，最终提高α-半乳糖苷酶基因的表达量，按照毕赤酵母密码子偏好性对透明颤菌的血红蛋白基因进行优化，合理优化其mRNA二级结构、GC含量等，合成透明颤菌血红蛋白基因vgb，其序列如SEQ2下划线部分所示，通过拼接PCR的方法将其置于树干毕赤酵母低氧诱导启动子PsADH2及终止子之间，形成DNA片段PVT，序列如SEQ2所示，用DNA限制性内切酶BamHⅠ酶切PVT以及构建好的质粒pPICZαA- Gal1，之后用T4 DNA连接酶将PVT连接进质粒pPICZαA- Gal1中，形成共表达质粒pPICZαA-PVT- Gal1，用DNA限制性内切酶BamHⅠ对质粒进行酶切检测以确保质粒构建成功，质粒酶切检测结果是，琼脂糖凝胶电泳中，可见用BamHⅠ酶切质粒pPICZαA-PVT- Gal1后，可以切出一条pPICZαA-PVT- Gal1的条带和PVT的条带，证明载体构建成功；
实验四
构建共表达毕赤酵母工程菌株
按照Invitrogen公司的酵母转化方法，将第2步（实验二）得到的出发菌株制作成感受态细胞，将用DNA限制性内切酶PmeⅠ线性化后的共表达质粒pPICZαA-PVT- Gal1电转化至其中，涂布在含100 μg/mL博来霉素的YPDS平板上筛选阳性克隆，挑取单克隆接种至50 mL（250 mL锥形瓶）YPD培养基中培养，30 ℃培养3天后离心收集菌体转入50 mL（250 mL锥形瓶）BMMY培养基诱导表达，每天补加1%的甲醇，3天后用与步骤2（实验二）中相同的方法测定发酵液中α-半乳糖苷酶酶活，如图1所示，可见第1号菌株的发酵液中α-半乳糖苷酶酶活最高，相对于出发菌株，其发酵液中α-半乳糖苷酶的酶活提高了63.13%，至此，共表达毕赤酵母工程菌株构建完成，从结果可见在甲醇诱导型分泌表达α-半乳糖苷酶的毕赤酵母工程菌株中共表达透明颤菌血红蛋白的方法可以显著提高毕赤酵母工程菌株发酵液中α-半乳糖苷酶的表达量。
实验五：共表达毕赤酵母工程菌株的应用
挑取共表达毕赤酵母工程菌株单克隆接种至2 mL YPD液体培养基中，30℃摇床培养1天后转接至250 mL YPD液体培养基中（500 mL锥形瓶），30 ℃摇床培养至OD600在2-6之间，转接至2.5 L含4%甘油的无机盐培养基中（7.5 L发酵罐），所述的无机盐培养基是，NH4H2PO4 38.66 g/L、CaSO4∙2H2O 1.17 g/L、KSO4 18.2 g/L、MgSO4∙7H2O 14.9 g/L、KOH4.13 g/L和质量含量85%的磷酸3.76 ml/L加水定容制成；用氨水调节pH值至5.5，通空气量为每分钟3L，搅拌速度为800 rpm，30℃培养20小时以后，测定溶氧值回升到100%左右；然后，搅拌速度提高至1200 rpm，开始流加50%甘油（每升含12 mL PTM1无机盐营养液），流加速度为每小时54 mL，共3-4小时；至细胞湿重达到200 g/L左右时，停止补加甘油，开始流加甲醇（每升含12 mL PTM1无机盐营养液）诱导，流加速度为每小时10 mL，一小时后，流加速度增大为每小时20 mL，之后通过调整甲醇流加速度和通气量来保持20%以上的溶氧量。持续诱导发酵166小时，发酵过程中（0、18、40、64、84、114、135、142、158、166小时）取样，进行SDS-PAGE电泳，发酵液SDS-PAGE电泳中，在70-100KD间有明显的条带，与α半乳糖苷酶Gal1的分子量84KD相符，说明共表达菌株发酵时确实能够分泌表达α半乳糖苷酶Gal1，可见在发酵后期，发酵液中有大量分泌表达的α-半乳糖苷酶。在60℃，pH4.5条件下测定发酵液中α-半乳糖苷酶酶活可以达到2000U/mL（α-半乳糖苷酶酶活定义为：每分钟水解对硝基苯-α-D-半乳糖苷（pNPG）产生1 µmol的对硝基苯酚（pNP）所需的酶量定义为1个α-半乳糖苷酶酶活单位），将上述发酵液应用于水解天然的α-半乳寡糖：棉籽糖，配制含有棉籽糖的反应体系，反应体系中含有4 mg/mL的糖、10个酶活单位的α-半乳糖苷酶酶和50 mmol/L的pH 4.5的缓冲剂（醋酸钠缓冲液），60 ℃反应，不同时间点取样，取出样品立即煮沸失活，用层析液（丙醇：醋酸：水=1:1.5:0.1）在硅胶层析板（Merck Silica Gel 60F 254，Germany）上展开样品（层析两次），喷洒显色液（甲醇：浓硫酸=95:5）后，将层析板置于105 ℃烘箱加热显色，通过层析法检测共表达菌株发酵液水解棉籽糖的效果，可见反应60分钟后，棉籽糖被完全水解为蔗糖和半乳糖，说明本发明方法制备的共表达毕赤酵母工程菌株发酵产生的α-半乳糖苷酶对于棉籽糖具有很好的水解效果，可以将棉籽糖中的α-半乳糖苷键完全水解，可用于生产实际的需要。
实验表明，本发明通过在甲醇诱导型分泌表达α-半乳糖苷酶的毕赤酵母工程菌株中共表达透明颤菌血红蛋白的方法来提高毕赤酵母工程菌株发酵液中α-半乳糖苷酶的表达量，具有显著的提高效果，相对于出发菌株，共表达透明颤菌的血红蛋白将α-半乳糖苷酶的表达量提高63.13%，并可有效用于共表达毕赤酵母工程菌株发酵产生的α-半乳糖苷酶对棉籽糖进行水解效果，可以将棉籽糖中的α-半乳糖苷键完全水解为蔗糖和半乳糖，可满足生产的实际需要，经济和社会效益显著。
序列表
<110> 河南省科学院生物研究所有限责任公司
<120> 一种通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2217
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
gctgctggtt tgttgtctac tggtattcac aagcatccag atttggatac ttggttcttg 60
gttaccgaac gttctactta cgttgttggt gctactgatg atggttactt gttgaacttg 120
cattggggtg atagattgaa cgaattggac aacgacttga acgctactcg tattttcact 180
accaccactt tcaacccacc aatcacttac gctcaagaag aattgccagc ttttggtggt 240
ttgagataca gagaattggc cttgaaggtt gaattgccaa acggtgttag agaattgaac 300
ttgttgtact ccggtagatc caacatgact ggtgactctt tgttggattt ggaattggaa 360
gctggtaact acactggttt gaccgttact ttgcattacg agttggacgt tgacaacgac 420
attattcgtc gctcttacac tatccgtaac ggtttgaaga agggtaacgt caacttgtct 480
aaggctttgt ctgctgcttg gcatccacca tctgctatgg gtttggatga agaaagagag 540
ttgttgactt tgtctggtga ttgggctcat gaagctatta ctcagagaac cagacttaga 600
ccaggtgttt ctcatactgt tcaatcccca agaggttttc catctcatca atcctaccca 660
tacttcgctt tgagacaagt tccaactggt gaaacttctc caggtacttc taacgaagtt 720
tactttggtg ctttggcttg gtctggttct tgggaaatta ctgttgatac caccatctac 780
ggttactcta gaatcactgg tggtattcac catcaagact ttggttggac tttggaacca 840
ggtgaatctt ttaccactcc agtttttgct gctggttaca ctaacgaagg tttgccaggt 900
gctagaaaga gaatgccaag acatgttcgt aagtaccaat tgaagaacgt taagacccag 960
caaaagaagg aagatatgta caaccccgtt ttgtacaact cttgggaggc tttgactttt 1020
aacatcacct acgacaagca aattgctttg gctgataagg ctgctgctat gggtattgaa 1080
ttgttcgctg tcgatgatgg ttggtttggt gctagagata acgattctgc tggtttgggt 1140
gattggtttg ttaacaagcg taagtttcca catggtatga agccattggc tgatcatgtt 1200
cataacttgg gtatgaagtt cggtttgtgg tttgagccag agtcttttaa cccaaactcc 1260
gacttgtaca gaaagcatcc agattgggct ttttactacg atggtatccc aagatacgaa 1320
gccagaaacc aattgttgat gaacttgggt ttgccagaag ttagagagta cttgtacaac 1380
agaatttcca ccttggtcaa ggaaattggc atcgatttca tcaagtggga tatgaacaga 1440
ccatttgctg aagtcactat gcataactac aaggacagaa acccaagaga agcttgggtt 1500
ttggctgttg aaggttttta ctccatcatc gacaagttga agcaggagtt cccagatttg 1560
atgatcgaaa cttgtgcttc tggtggtggt agaatggata ttggtatctt gcagaaggtt 1620
gatcaagctt ggacttctga taacactaga ccagacgctc gtttgtttat tcaatacggc 1680
gcctccatgt ttttgccacc acgtattatg tacggttggg ttactgattc tccatacgat 1740
tctcagattg agatcccatt gtctttccgt ttccacgttt ctttcatggg tggtttgggt 1800
gttggttcta acttgaacaa catggaggag tccgatatta aggaagctgc tggttggatt 1860
gaattgtaca agcagatccg tcatgtcatc caaaacggtg atttggattg gttggttcaa 1920
ccatcttgtg ttggtgattt ggttgctgtt tctcagacta cttctcaaga tagatccgaa 1980
gctgttgttt tggcttaccg tttcaactct gtcttttccg accaattgaa cccattgcgt 2040
ttgagatacc ttgatccaaa gcatacttac cgtgttcgtg tttaccaaga tgatccatct 2100
actccatctg atgagtacga aatgtctggt gctttgttgt tgtctcgtgg tattgttttg 2160
ccaggtttga acaacatcat gttcagatcc gccgttgttt gggttcaaca gaagtag 2217
<210> 2
<211> 1402
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
gcggaagcac agtctaatgc tgattcttga tagtgctcat cgccgacagc cagattcgaa 60
gaaagggggg acgagatccg ggttcatctg caagagacac agaaaataaa aaacatacga 120
tccttttcag ctaccaagcg cttaaccagg aaatccactg ctggagtggc cagcatgtca 180
cgaggtggca gattccgata atgtgtgatt ggagtgtagc attggcgcaa gtcgaatttc 240
ggtcatattc cgtgtctgga tattattcca ctatttttta atttttcagg ttggatgcga 300
ttgttccctt tatgtctgga cgatgcctga agccccaggt ctatataagg ggctcgaaag 360
tcctttgacc agctggttga tttgattttg tttgttcctt tctttctttc atctaccatc 420
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tcatcaaggc tactgttcca gttttgaagg aacatggtgt cactatcact actaccttct 600
acaagaactt gtttgccaag catccagaag ttagaccatt gtttgacatg ggtagacagg 660
aatctttgga acaaccaaag gctttggcta tgactgtttt ggctgctgct caaaacattg 720
aaaacttgcc cgctattttg ccagctgtta agaagattgc cgtcaagcat tgtcaagctg 780
gtgttgctgc tgctcattac ccaattgttg gccaagaatt gttgggtgcc attaaggaag 840
ttttgggtga tgctgctact gatgatattt tggatgcttg gggtaaggct tacggtgtta 900
ttgctgacgt cttcattcaa gttgaagccg atttgtacgc tcaagctgtt gaataaacaa 960
gccgtgctag atagtgtttt gttctattcc acctcgtgtt ttatttacct tttaactagt 1020
gctaatttac gaataatgta cgttagaaaa attgacctat ttatatatgg gtgcaaaaaa 1080
gttgcgtcct gtccgaaggt tgcatttccc ctcaagcaat ttctttgccc cataacaacc 1140
aaaaggagtt aggatctggg aactatttaa cgccgctggg gcaactattg agatgtacct 1200
agatgccacg ccccacctga ccaatctaat tgctgtaatt catatcctta agattagttc 1260
tcgccgtgaa cctagagatg tgacccttag cttagaagtt ttctaagaaa aatcgtaact 1320
ttaagaaact attaattagg cggctttttc agaacttttt cattagcatc attgagcttt 1380
tcggcttcta cctgagctcc gc 1402

Claims (3)

1.一种通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、构建表达质粒pPIC9K- Gal1：用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对α-半乳糖苷酶基因Gal1和毕赤酵母甲醇诱导型表达载体pPIC9K同时进行双酶切，之后用T4 DNA连接酶将α-半乳糖苷酶基因连接进载体pPIC9K中，形成表达质粒pPIC9K- Gal1；
所述α-半乳糖苷酶基因为在密码子、mRNA二级结构和GC含量方面进行优化后的米根毛霉（Rhizomucor miehei）来源的一个α-半乳糖苷酶基因；
（2）、构建甲醇诱导型表达α-半乳糖苷酶的毕赤酵母工程菌出发菌株：按照Invitrogen公司的酵母转化方法将质粒pPIC9K- Gal1转化到毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布在MD平板上，30℃培养4天，用无菌水吹取MD平板表面的克隆涂布于含有4 mg/mL G418的YPD平板上，30℃培养5天，挑选阳性克隆作为出发菌株；
所述的质粒pPIC9K- Gal1为经DNA限制性内切酶PmeⅠ酶切过的质粒；
（3）、构建共表达质粒pPICZαA-PVT- Gal1：以与步骤（1）同样的方法构建毕赤酵母表达质粒pPICZαA- Gal1，用DNA限制性内切酶BamHⅠ酶切基因片段PVT以及毕赤酵母表达质粒pPICZαA- Gal1，之后用T4 DNA连接酶将PVT连接进表达质粒pPICZαA- Gal1中，形成共表达质粒pPICZαA-PVT- Gal1；
所述基因片段PVT为将透明颤菌血红蛋白基因vgb置于树干毕赤酵母低氧诱导启动子PsADH2及终止子之间形成的DNA片段；
（4）、构建共表达毕赤酵母工程菌株：按照Invitrogen公司的酵母转化方法，将第（2）步得到的出发菌株制作成感受态细胞，将共表达质粒pPICZαA-PVT- Gal1电转化至其中，涂布在含100 μg/mL博来霉素 的YPDS平板上筛选阳性克隆，得到共表达毕赤酵母工程菌株；
所述共表达质粒pPICZαA-PVT- Gal1为经DNA限制性内切酶PmeⅠ酶切后的质粒。
2.根据权利要求1所述的通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、构建表达质粒pPIC9K- Gal1：
表达基因为米根毛霉（Rhizomucor miehei）来源的一个α-半乳糖苷酶基因Gal1，按照毕赤酵母密码子偏好性对mRNA二级结构、GC含量优化，确定序列为SEQ1（见序列表SEQ1），基因合成后，用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对α-半乳糖苷酶基因和毕赤酵母甲醇诱导型表达载体pPIC9K同时进行双酶切，之后，用T4 DNA连接酶将α-半乳糖苷酶基因连接进载体pPIC9K中，形成表达质粒pPIC9K- Gal1，用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对质粒进行酶切检测，以确保质粒构建成功；
（2）、构建甲醇诱导型表达α-半乳糖苷酶的毕赤酵母工程菌出发菌株：
按照Invitrogen公司的酵母转化方法，用DNA限制性内切酶PmeⅠ对质粒pPIC9K- Gal1线性化后电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布在MD平板上，30℃培养4天，用无菌水吹取MD平板表面的克隆涂布于含有4 mg/mL G418的YPD平板上，30℃培养5天；挑取单克隆接种至50 mL YPD培养基中培养，30℃培养3天，离心，收集菌体，转入装有50mL BMMY培养基的锥形瓶中诱导表达，每天补加BMMY培养基体积1%的甲醇，3天后测定发酵液中α-半乳糖苷酶酶活，取100µL发酵液和浓度10 mmol/L的的pNPG溶液100 µL混合，60 ℃下反应10 min，加入800 µL 0.5 mo/L的Na2CO3溶液终止反应，取200 µL加入到96孔板中，用酶标仪测405nm处吸收值，代入对硝基苯（pNP）测定的标准曲线，得α-半乳糖苷酶的活力值，选取保存活性最高的克隆最为毕赤酵母工程菌出发菌株；
所述的α-半乳糖苷酶酶活定义为：每分钟水解对硝基苯-α-D-半乳糖苷（pNPG）产生1 µmol的对硝基苯酚（pNP）所需的酶量定义为1个α-半乳糖苷酶酶活单位；
所述的BMMY培养基是由酵母粉10g、蛋白胨20g、KH2PO4 11.8g、K2HPO4 3g，加水至890mL，121℃灭菌20分钟，温度降至60℃以下时加入浓度13.4g/L过滤灭菌的YNB溶液100mL、0.4mg/L的生物素溶液1mL、甲醇5mL，混匀制成；
所述的YPD培养基是由酵母粉10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g，加水至1000mL，108℃灭菌20分钟制成；
（3）、构建共表达质粒pPICZαA-PVT- Gal1
以与步骤1同样的方法构建毕赤酵母表达质粒pPICZαA- Gal1，用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对质粒进行酶切检测以确保质粒构建成功，为了提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶的表达量，在工程菌中共表达一种透明颤菌的血红蛋白，以提升毕赤酵母对氧气的利用率，提高其在高密度发酵时对低氧环境的耐受性，提高α-半乳糖苷酶基因的表达量，按照毕赤酵母密码子偏好性对透明颤菌的血红蛋白基因优化mRNA二级结构、GC含量，合成透明颤菌血红蛋白基因vgb，其序列为SEQ2中的下划线部分，通过拼接PCR的方法将其置于树干毕赤酵母低氧诱导启动子PsADH2及终止子之间，形成DNA片段PVT，序列为SEQ2，用DNA限制性内切酶BamHⅠ酶切PVT以及构建好的质粒pPICZαA- Gal1，之后用T4 DNA连接酶将PVT连接进质粒pPICZαA- Gal1中，形成共表达质粒pPICZαA-PVT- Gal1，用DNA限制性内切酶BamHⅠ对质粒进行酶切检测以确保质粒构建成功；
（4）、构建共表达毕赤酵母工程菌株
按照Invitrogen公司的酵母转化方法，将第（2）步得到的出发菌株制作成感受态细胞，将用DNA限制性内切酶PmeⅠ线性化后的共表达质粒pPICZαA-PVT- Gal1电转化至其中，涂布在含100 μg/mL博来霉素 的YPDS平板上筛选阳性克隆，挑取单克隆接种至50 mL YPD培养基中培养，30℃培养3天后离心收集菌体转入50mL BMMY培养基诱导表达，每天补加1%的甲醇，3天后用与步骤2中相同的方法测定发酵液中α-半乳糖苷酶酶活最高，实现共表达毕赤酵母工程菌株构建；
所述的YPDS平板是，酵母粉10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、山梨醇182g、琼脂粉15g，加水至1000mL，108℃灭菌20分钟。
3.权利要求1或2所述的方法构建的共表达毕赤酵母工程菌株在棉子糖水解中的应用。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1712534A (zh) * 2004-06-25 2005-12-28 私立逢甲大学 用以增进重组蛋白质的生产的核酸构建体与表达载体以及用以大量生产重组蛋白质的方法
US20110269200A1 (en) * 2010-04-30 2011-11-03 Tony Sanny Increased Ethanol Production By Genetic Engineering Of Microorganisms To Express Hemoglobin
CN102408480A (zh) * 2010-09-20 2012-04-11 中国农业科学院饲料研究所 一种酵母表达的牛乳铁蛋白衍生抗菌片段BLfA及其制备方法
CN105420269A (zh) * 2015-12-11 2016-03-23 江南大学 一种毕赤酵母中共表达血红蛋白VHb和纤维素酶蛋白的构建方法
CN107164398A (zh) * 2017-06-30 2017-09-15 浙江工业大学 一种重组α‑半乳糖苷酶基因、载体、工程菌及其应用
CN109652437A (zh) * 2019-02-21 2019-04-19 中国农业大学 一种产壳聚糖酶的重组菌的构建方法及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1712534A (zh) * 2004-06-25 2005-12-28 私立逢甲大学 用以增进重组蛋白质的生产的核酸构建体与表达载体以及用以大量生产重组蛋白质的方法
US20110269200A1 (en) * 2010-04-30 2011-11-03 Tony Sanny Increased Ethanol Production By Genetic Engineering Of Microorganisms To Express Hemoglobin
CN102408480A (zh) * 2010-09-20 2012-04-11 中国农业科学院饲料研究所 一种酵母表达的牛乳铁蛋白衍生抗菌片段BLfA及其制备方法
CN105420269A (zh) * 2015-12-11 2016-03-23 江南大学 一种毕赤酵母中共表达血红蛋白VHb和纤维素酶蛋白的构建方法
CN107164398A (zh) * 2017-06-30 2017-09-15 浙江工业大学 一种重组α‑半乳糖苷酶基因、载体、工程菌及其应用
CN109652437A (zh) * 2019-02-21 2019-04-19 中国农业大学 一种产壳聚糖酶的重组菌的构建方法及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JYH-MING WU ET AL.: "Lower Temperature Cultures Enlarge the Effects of Vitreoscilla Hemoglobin Expression on Recombinant Pichia pastoris", 《INT. J. MOL. SCI.》 *
乔雪锋等: "低氧诱导启动子PsADH2在毕赤酵母中的调控特性", 《华东理工大学学报(自然科学版)》 *
唐辉桂等: "利用透明颤菌血红蛋白在低氧条件下提高毕赤酵母中植酸酶的表达", 《中国农业科技导报》 *
张晓龙等: "共表达透明颤菌血红蛋白对毕赤酵母产β-甘露聚糖酶发酵过程的影响", 《生物技术通报》 *
汪小锋 等: "毕赤酵母中表达透明颤菌血红蛋白提高重组脂肪酶的表达", 《生物工程学报》 *

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