CN116200279A - 一种里氏木霉重组菌株、其制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种里氏木霉重组菌株、其制备方法及其应用，该里氏木霉重组菌株为里氏木霉TrEP‑4，里氏木霉TrEP‑4为可过表达伴侣蛋白的里氏木霉。本申请的里氏木霉重组菌株TrEP‑4可过表达伴侣蛋白。因而，利用该重组菌株进行纤维素酶的生产，能够在促进蛋白质的正确折叠及分泌的情况下，得以高效分泌表达纤维素酶，降低里氏木霉产酸性纤维素酶的生产成本。

Description

一种里氏木霉重组菌株、其制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体而言，涉及一种里氏木霉重组菌株、其制备方法及其应用。
背景技术
纤维素是通过β-1，4糖苷键连接葡萄糖而成的同聚多糖，它是植物细胞壁的主要成分，是地球上最丰富的可再生资源。纤维素酶是一种能够将纤维素降解为葡萄糖的复合酶系，根据在纤维素上的作用位点可以分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶。以纤维素为底物时，内切葡聚糖酶能够识别并切割纤维素内部非结晶区的β-1，4葡萄糖苷键，从而释放出不同长度的短链纤维寡糖和纤维多糖，为外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶提供底物。因此，内切葡聚糖酶在纤维素的水解过程中扮演着重要角色，内切葡聚糖酶活力的高低往往直接影响纤维素酶对纤维素的水解效率。
里氏木霉(Trichoderma reesei)是当前生物界中分泌纤维素酶能力最强的微生物之一，并且其胞外分泌的纤维素酶系较全，其内切葡聚糖酶具有很好的热稳定性并且在酸性条件下具有很好的活性，使其在纺织、生物能源以及食品加工等领域具有很好的应用潜力。大量文献研究发现，在里氏木霉表达系统中蛋白表达的同时往往伴随着某些伴侣蛋白基因的上调，比如pdi1、bip1等，这些基因的功能是直接帮助新生肽链和解折叠的蛋白质肽链折叠成具有生物功能构象的蛋白质，因此，在蛋白质分泌途径中内质网的折叠和加工被认为是分泌成熟蛋白的重要过程。
目前影响纤维素酶产业化的主要因素是酶的产量低，因此提高酶的产量并降低生产成本是其完成产业化亟需解决的问题。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种里氏木霉重组菌株、其制备方法及其应用，以解决现有技术中纤维素酶产量低的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种里氏木霉重组菌株，里氏木霉重组菌株为里氏木霉TrEP-4，里氏木霉TrEP-4为可过表达伴侣蛋白的里氏木霉。
进一步地，里氏木霉重组菌株中包含编码伴侣蛋白的核酸分子的重组质粒；优选地，伴侣蛋白为二硫键异构酶PDI1；优选地，编码伴侣蛋白PDI1的核酸分子为表达盒Pcbh1-pdi1-Tcbh1，其中，Pcbh1表示纤维二糖水解酶I启动子Pcbh1，pdi1表示伴侣蛋白基因pdi1，Tcbh1表示纤维二糖水解酶I终止子Tcbh1；优选地，重组质粒还包括氨苄青霉素抗性基因AmpR及筛选标记基因pyr4；优选地，重组菌株的出发菌株为包含重组质粒的里氏木霉TU-6；优选地，里氏木霉TU-6保藏号为ATCC MYA-256。
进一步地，表达盒中的纤维二糖水解酶I启动子Pcbh1、伴侣蛋白基因pdi1及纤维二糖水解酶I终止子Tcbh1均来自里氏木霉；优选地，伴侣蛋白基因pdi1的DNA序列如SEQ IDNO：1所示。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种生产纤维素酶的方法，方法包括：利用上述里氏木霉重组菌株制备孢子悬液；将孢子悬液进行种子培养，得到种子液；将种子液进行摇瓶发酵，得到发酵后的上清液，即为纤维素酶。
进一步地，制备孢子悬液包括：将里氏木霉重组菌株接种至PDA培养基，进行产孢培养，得到孢子悬液；优选地，产孢培养的温度为28-30℃；优选地，产孢培养的时间为5-6d；优选地，孢子悬液中孢子浓度为1×107-108个/mL。
进一步地，种子培养包括：将孢子悬液接种至种子培养基中，进行摇瓶培养，得到种子液；优选地，孢子悬液接种量为5-6ml；优选地，种子培养基量为50-60ml；优选地，种子培养的温度为30-32℃；优选地，摇瓶培养的转速为200-220rpm；优选地，以质量分数计，种子培养基包括2-3％葡萄糖、0.50-0.55％酵母粉、0.50-0.55％磷酸氢二钾、0.50-0.55％磷酸二氢钾、0.02-0.04％硫酸镁及0.02-0.04％氯化钙，种子培养基的pH＝6.0-6.5；优选地，种子液中孢子浓度为1×106-107个/mL。
进一步地，摇瓶发酵包括：将种子液接种至发酵培养基，进行摇瓶发酵；优选地，以体积比计，种子液的接种量为10-12％；优选地，摇瓶发酵的温度为30-32℃；优选地，摇瓶发酵的转速为200-220rpm；优选地，以质量分数计，发酵培养基包括3.5-4.5％微晶纤维素、2-3％玉米浆、0.3-0.4％硫酸铵、0.50-0.55％磷酸氢二钾、0.50-0.55％磷酸二氢钾、0.02-0.04％硫酸镁及0.02-0.04％氯化钙，发酵培养基的pH＝5.5-6.5。
为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种制备上述里氏木霉重组菌株的方法，方法包括如下步骤：S1，构建重组质粒；S2，将重组质粒转化至里氏木霉TU-6，得到重组菌株。
进一步地，S1包括：以里氏木霉基因组DNA为模板，扩增得到纤维二糖水解酶I启动子Pcbh1、伴侣蛋白基因pdi1、纤维二糖水解酶I终止子Tcbh1；以携带乳清酸磷酸核糖转移酶基因pyr4的质粒pAN7.1-pyr4为模板，扩增得到抗性基因AmpR的启动子、抗性基因AmpR、复制原点、筛选标记基因pyr4的启动子、筛选标记基因pyr4及筛选标记基因pyr4的终止子，得到片段pAN4；将纤维二糖水解酶I启动子Pcbh1、伴侣蛋白基因pdi1、纤维二糖水解酶I终止子Tcbh1及片段pAN4进行体外组装，进行大肠杆菌转化，得到测序正确的阳性转化子即为重组质粒。
进一步地，S2包括：制备里氏木霉TU-6的原生质体；通过PEG-CaCl2介导将重组质粒转化至里氏木霉TU-6的原生质体中，得到转化产物；将转化产物进行培养，得到测序正确的阳性转化子即为重组菌株；优选地，里氏木霉TU-6的保藏号为ATCC MYA-256。
为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种上述的里氏木霉重组菌株、或上述的方法得到的重组菌株在生产纤维素酶中的应用。
应用本发明的技术方案，本申请的里氏木霉重组菌株TrEP-4可过表达伴侣蛋白。因而，利用该重组菌株进行纤维素酶的生产，能够在促进蛋白质的正确折叠及分泌的情况下，得以高效分泌表达纤维素酶，降低里氏木霉产酸性纤维素酶的生产成本。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了实施例1中重组质粒转化子菌落PCR凝胶电泳结果；
图2示出了实施例1中重组质粒pAN-pdi1-pyr4图谱；
图3示出了实施例3中重组菌株基因组PCR凝胶电泳结果；
图4示出了实施例5中使用还原糖比色法测定发酵上清液中内切葡聚糖酶的活力结果；
图5示出了实施例5中使用定性滤纸条作为底物测定滤纸酶活的结果。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所述，现有技术中提升酸性纤维素酶酶活的生物技术大多是聚焦在提高纤维素酶基因的表达水平，而蛋白表达量过高时酶的产量也会受到分子伴侣合成量的限制，非正常折叠蛋白积累会造成UPR响应(非折叠蛋白应答)，阻碍蛋白分泌量的进一步提升。因此，在提升里氏木霉纤维素酶产量的同时可能需要对其伴侣蛋白系统进行研究，进一步提升菌株的酸性纤维素酶产量。本申请通过过量表达伴侣蛋白以减少非正常折叠蛋白积累造成的UPR响应对蛋白分泌量的阻碍。发明人通过将携带伴侣蛋白PDI1的重组质粒导入里氏木霉中，能够减少非正常折叠蛋白积累，提高纤维素酶的分泌表达，进而提高纤维素酶的酶活，降低了里氏木霉产酸性纤维素酶的生产成本。
本发明的第一种典型的实施方式中，提供了一种里氏木霉重组菌株，该里氏木霉重组菌株为里氏木霉TrEP-4，里氏木霉TrEP-4为可过表达伴侣蛋白的里氏木霉。
里氏木霉是生物界中分泌纤维素酶能力最强的微生物之一，本申请自此基础上对里氏木霉进行改造，通过在里氏木霉中过表达伴侣蛋白，以减少非正常折叠的蛋白产生使得纤维素酶酶活得以提升。
上述里氏木霉重组菌株中包含编码伴侣蛋白的核酸分子的重组质粒。通过在里氏木霉中转化可过表达伴侣蛋白的重组质粒对里氏木霉进行改造。任何可以对减少非正常折叠的伴侣蛋白均适用于本申请，在一种优选的实施例中，伴侣蛋白为二硫键异构酶PDI1。任何可以在里氏木霉中过表达伴侣蛋白PDI1的核酸分子均适用于本申请，在一种优选的实施例中，编码伴侣蛋白PDI1的核酸分子为表达盒Pcbh1-pdi1-Tcbh1，其中，Pcbh1表示纤维二糖水解酶I启动子Pcbh1，pdi1表示伴侣蛋白基因pdi1，Tcbh1表示纤维二糖水解酶I终止子Tcbh1。该表达盒中由纤维素诱导型启动子Pcbh1调控伴侣蛋白基因pdi1的过表达，以提高里氏木霉的纤维素酶活力。
任何可以在里氏木霉中过表达伴侣蛋白的PDI1的重组质粒均适用于本申请，在一种优选的实施例中，重组质粒还包括氨苄青霉素抗性基因AmpR及筛选标记基因pyr4。利用上述的筛选基因在构建重组菌株的过程中进行阳性菌株的筛选，以得到本申请的重组菌株。
任何可以表达重组质粒的里氏木霉均适用于本申请，在一种优选的实施例中，里氏木霉重组菌株的出发菌株为包含重组质粒的里氏木霉TU-6，保藏号为ATCC MYA-256。里氏木霉TU-6菌株为尿嘧啶营养缺陷型突变体，只能在含有尿嘧啶的培养基上的生长。
任何可以编码上述伴侣蛋白或具有上述启动子与终止子功能的基因序列均适用与本申请。在一种优选的实施例中，上述表达盒中的纤维二糖水解酶I启动子Pcbh1、伴侣蛋白基因pdi1及纤维二糖水解酶I终止子Tcbh1均来自里氏木霉；伴侣蛋白基因pdi1的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。本申请的启动子、伴侣蛋白基因pdi1、终止子来自于里氏木霉QM6a野生型菌株。
SEQ ID NO：1:
ATGCAACAGAAGCGTCTTACTGCTGCCCTGGTGGCCGCTTTGGCCGCTGTGGTCTCTGCCGAGTCGGATGTCAAGTCCTTGACCAAGGACACCTTCAACGACTTCATCAACTCCAATGACCTCGTCCTGGCTGAGTGTATGTCTCTCTCTCTCTCTCTCCCCCCCTCCCCTTTGCCTTCTGCCCTCTCAAGCTTCTGCATCTCTCGACCCCTCCCCCGCCAGCCCCCCGGCATCGAGATCCCCGCTAACAGCTGCAATCTTCCAGTCTTCGCTCCCTGGTGCGGCCACTGCAAGGCTCTCGCCCCCGAGTACGAGGAGGCGGCCACGACTCTCAAGGACAAGAGCATCAAGCTCGCCAAGGTCGACTGTGTCGAGGAGGCTGACCTCTGCAAGGAGCATGGAGTTGAGGGCTACCCCACGCTCAAGGTCTTCCGTGGCCTCGATAAGGTCGCTCCCTACACTGGTCCCCGCAAGGCTGACGGGTAAGCTTTGAATTGCACTGTTCTTTGCATCAATCCATTCATTCGCTAACGTTGGTTGTCCTTTCAGCATCACCTCCTACATGGTGAAGCAGTCCCTGCCTGCCGTCTCCGCCCTCACCAAGGATACCCTCGAGGACTTCAAGACCGCCGACAAGGTCGTCCTGGTCGCCTACATCGCCGCCGATGACAAGGCCTCCAACGAGACCTTCACTGCTCTGGCCAACGAGCTGCGTGACACCTACCTCTTTGGTGGCGTCAACGATGCTGCCGTTGCTGAGGCTGAGGGCGTCAAGTTCCCTTCCATTGTCCTCTACAAGTCCTTCGACGAGGGCAAGAACGTCTTCAGCGAGAAGTTCGATGCTGAGGCCATTCGCAACTTTGCTCAGGTTGCCGCCACTCCCCTCGTTGGCGAAGTTGGCCCTGAGACCTACGCCGGCTACATGTCTGCCGGTATCCCTCTGGCTTACATCTTCGCCGAGACCGCCGAGGAGCGTGAGAACCTGGCCAAGACCCTCAAGCCCGTCGCCGAGAAGTACAAGGGCAAGATCAACTTCGCCACCATCGACGCCAAGAACTTTGGCTCGCACGCCGGCAACATCAACCTCAAGACCGACAAGTTCCCCGCCTTTGCCATTCACGACATTGAGAAGAACCTCAAGTTCCCCTTTGACCAGTCCAAGGAGATCACCGAGAAGGACATTGCCGCCTTTGTCGACGGCTTCTCCTCTGGCAAGATTGAGGCCAGCATCAAGTCCGAGCCCATCCCCGAGACCCAGGAGGGCCCCGTCACCGTTGTCGTTGCCCACTCTTACAAGGACATTGTCCTTGACGACAAGAAGGACGTCCTGATTGAGTTCTACGCTCCCTGGTGCGGTCACTGCAAGGCTCTCGCCCCCAAGTACGATGAGCTCGCCAGCCTGTATGCCAAGAGCGACTTCAAGGACAAGGTTGTCATCGCCAAGGTTGATGCCACTGCCAACGACGTCCCCGACGAGATCCAGGGCTTCCCCACCATCAAGCTCTACCCCGCCGGTGACAAGAAGAACCCCGTCACCTACAGCGGTGCCCGCACTGTTGAGGACTTCATCGAGTTCATCAAGGAGAACGGCAAGTACAAGGCCGGCGTCGAGATCCCCGCCGAGCCCACCGAGGAGGCTGAGGCTTCCGAGTCCAAGGCCTCTGAGGAGGCCAAGGCTTCCGAGGAGACTCACGATGAGCTGTAA。
本发明的第二种典型的实施方式中，提供了一种生产纤维素酶的方法，该方法包括：利用上述的里氏木霉重组菌株制备孢子悬液；将孢子悬液进行种子培养，得到种子液；将种子液进行摇瓶发酵，得到发酵后的上清液，即为纤维素酶。利用本申请的重组菌株进行上述发酵培养以得到产量更高的纤维素酶。
上述制备孢子悬液包括：将里氏木霉重组菌株接种至PDA培养基，进行产孢培养，得到孢子悬液。通过产孢培养令重组菌株能够生长一定数量具有活力的孢子为后续的纤维素酶生产提供保障。
任何可以完成产孢培养的条件均适用于本申请，在一种优选的实施例中，产孢培养的温度为28-30℃；产孢培养的时间为5-6d；孢子悬液中孢子浓度为1×107-108个/mL。选择适宜的温度时间，可以令菌株在活力最佳的情况生长，并在孢子浓度达到一定浓度时进行下一培养阶段，保持最佳的生长状态。
上述种子培养包括：将孢子悬液接种至种子培养基中，进行摇瓶培养，得到种子液。将上述得到的适宜生长状态的孢子悬液进行扩大培养以得到浓度更高的种子液以进行后续的发酵培养。
任何可以得到适合的种子液的培养条件均适用于本申请，在一种优选的实施例中，孢子悬液接种量为5-6ml；种子培养基量为50-60ml；种子培养的温度为30-32℃；摇瓶培养的转速为200-220rpm；以质量分数计，种子培养基包括2％葡萄、0.5％酵母粉、0.5％磷酸氢二钾、0.5％磷酸二氢钾、0.02％硫酸镁、0.02％氯化钙，种子培养基的pH＝6.0；种子液中孢子浓度为1×106-107个/mL。选择适宜的孢子悬液接种量利于后续种子液中的孢子生长，培养过程中的温度、摇瓶转速及培养基成分均对种子液中的孢子生长有影响，因而选择适合的条件对得到高质量的种子液十分重要。而种子培养到何程度结束对后接种进行发酵培养的孢子活力也有一定影响，控制种子液中的孢子浓度，以进行后续高效的发酵培养。
上述摇瓶发酵包括：将种子液接种至发酵培养基，进行摇瓶发酵。进行发酵培养以得到发酵上清液中的纤维素酶产物。
任何可以得到适合的种子液的培养条件均适用于本申请，在一种优选的实施例中，以体积比计，种子液的接种量为10-12％；摇瓶发酵的温度为30-32℃；摇瓶发酵的转速为200-220rpm；以质量分数计，发酵培养基包括3.5％微晶纤维素、2％玉米浆、0.3％硫酸铵、0.5％磷酸氢二钾、0.5％磷酸二氢钾、0.02％硫酸镁、0.02％氯化钙，发酵培养基的pH＝5.5。选择适宜的种子液接种量能够确保孢子进行正常的纤维素酶生产，培养过程中的温度、摇瓶转速及培养基成分均对孢子生产纤维素酶的过程有影响，因而选择适合的条件对高效生产纤维素酶十分重要。
本发明的第三种典型的实施方式中，提供了一种制备上述的里氏木霉重组菌株的方法，方法包括如下步骤：S1，构建重组质粒；S2，将重组质粒转化至里氏木霉TU-6，得到重组菌株。以里氏木霉TU-6为出发菌株，将可过表达伴侣蛋白PDI1的重组质粒转入出发菌株中，以得到本申请的重组菌株。
上述S1包括：以里氏木霉基因组DNA为模板，扩增得到纤维二糖水解酶I启动子Pcbh1、伴侣蛋白基因pdi1、纤维二糖水解酶I终止子Tcbh1；以携带乳清酸磷酸核糖转移酶基因pyr4的质粒pAN7.1-pyr4为模板，扩增得到抗性基因AmpR的启动子、抗性基因AmpR、复制原点、筛选标记基因pyr4的启动子、筛选标记基因pyr4及筛选标记基因pyr4的终止子，得到片段pAN4；将纤维二糖水解酶I启动子Pcbh1、伴侣蛋白基因pdi1、纤维二糖水解酶I终止子Tcbh1及片段pAN4进行体外组装，进行大肠杆菌转化，得到测序正确的重组质粒。通过构建以纤维素诱导型启动子Pcbh1调控伴侣蛋白基因pdi1过表达的重组质粒，以得到可在里氏木霉内表达的重组质粒。
上述S2包括：制备里氏木霉TU-6的原生质体；通过PEG-CaCl2介导将重组质粒转化至里氏木霉TU-6的原生质体中，得到转化产物；将转化产物进行培养，得到测序正确的阳性转化子即为重组菌株。通过原生质体转化将重组质粒转入里氏木霉TU-6中，得到可以正常表达质粒的阳性重组菌株。
任何可以转化表达重组质粒的里氏木霉均适用于本申请，在一种优选的实施例中，里氏木霉为TU-6，保藏号为ATCC MYA-256。
本发明的第四种典型的实施方式中，提供了一种上述的里氏木霉重组菌株、或上述制备重组菌株的方法得到的重组菌株在生产纤维素酶中的应用。利用本申请的重组菌株里氏木霉TrEP-4可以过表达伴侣蛋白PDI1，能够减少纤维素酶的错误折叠，进而提高纤维素酶的分泌表达，提高纤维素酶的产量。
以下结合具体实施例对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。
本申请实施例中所用实验材料与试剂如下：
菌株与质粒：里氏木霉(Trichoderma reesei)TU-6菌株为尿嘧啶营养缺陷型突变体，其保藏号为ATCC(MYA-256)；大肠杆菌Escherichia coli strain TOP10用作重组质粒的构建，购自Takara公司；质粒pAN7.1-pyr4，由本实验室构建，由载体pAN7.1改造而来，携带乳清酸磷酸核糖转移酶基因pyr4。
酶与试剂：
高保真Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase购自南京诺唯赞生物科技有限公司。
NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit试剂盒购自NEB公司。
Figure BDA0004154739670000071
SP Fungi DNA kit试剂盒购自Omega公司。
溶液I：1.2M山梨醇，0.1M KH2PO4，pH 5.6。
溶液II：1M山梨醇，50mM CaCl2.2H2O，10mM Tris-HCl，pH 7.5。
PEG溶液：25％PEG 6000，50mM CaCl2.2H2O，10mM Tris-HCl，pH7.5。
培养基：
MM培养基：2％葡萄糖，0.5％硫酸铵，1.5％磷酸二氢钾，0.06％氯化钙，0.06％硫酸镁，0.2％蛋白胨，0.0037g/L CoCl2·6H2O，0.005g/L FeSO4·7H2O，0.0014g/L ZnSO4·7H2O，0.0016g/L MnSO4·H2O，1.8％琼脂粉，pH4.5～5.5。
MMS-soft培养基：2％葡萄糖，0.5％硫酸铵，1.5％磷酸二氢钾，0.06％氯化钙，0.06％硫酸镁，0.2％蛋白胨，0.0037g/L CoCl2·6H2O，0.005g/L FeSO4·7H2O，0.0014g/LZnSO4·7H2O，0.0016g/L MnSO4·H2O，1M山梨醇，0.7％琼脂糖，pH5.6。
种子培养基：2％葡萄糖，0.5％酵母粉，0.5％磷酸氢二钾，0.5％磷酸二氢钾，0.02％硫酸镁，0.02％氯化钙，pH6.0。
发酵培养基：3.5％微晶纤维素，2％玉米浆，0.3％硫酸铵，0.5％磷酸氢二钾，0.5％磷酸二氢钾，0.02％硫酸镁，0.02％氯化钙，pH5.5。
实施例1：过表达伴侣蛋白基因pdi1重组质粒的构建
(1)根据NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)上公开的编码蛋白质二硫键异构酶PDI1的基因序列(GeneID:18483398)设计引物，以里氏木霉QM6a基因组DNA为模板，使用引物P1(SEQ ID NO:2)和引物P2(SEQ ID NO:3)进行高保真PCR扩增得到pdi1基因片段，使用引物P3(SEQ ID NO:4)和引物P4(SEQ ID NO:5)扩增纤维二糖水解酶I启动子，使用引物P5(SEQ ID NO:6)和引物P6(SEQ ID NO:7)扩增纤维二糖水解酶I终止子，得到的PCR产物分别命名为pdi1、Pcbh1和Tcbh1；以质粒pAN7.1-pyr4为模板，使用引物P7(SEQ ID NO:8)和引物P8(SEQ ID NO:9)扩增得到片段pAN4；所用DNA聚合酶为高保真Phanta MaxSuper-Fidelity DNAPolymerase，扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1kb/30s，32个循环；最后72℃扩展延伸10min。
(2)使用NEBuilder HiFi DNAAssembly Cloning Kit，将所述的Pcbh1、pdi1、Tcbh1和pAN4这4个片段进行体外组装(具体参考试剂盒说明书)。组装产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，转化条件：42℃水浴90s。转化产物置于37℃摇床，100rpm培养1h。随后，转化产物涂布LB+Amp(终浓度100μg/mL)固体培养基，37℃条件下倒置培养12h。挑取部分转化子使用引物P9(SEQ ID NO:10)和P10(SEQ ID NO:11)进行菌落PCR，凝胶电泳结果见图1。阳性转化子转接LB+Amp(终浓度100μg/mL)液体培养基培养，提取质粒后送至上海生工进行测序。测序结果正确的质粒即为过表达伴侣蛋白基因pdi1的重组质粒，命名为pAN-pdi1-pyr4(图谱见图2)。
表1.本发明中使用的引物
Figure BDA0004154739670000081
实施例2：构建高产酸性纤维素酶的重组菌株
(1)制备原生质体：
将里氏木霉Tu-6接种于PDA培养基(添加0.5g/L尿嘧啶)，30℃静置培养5d待其产出足量孢子；用无菌水将孢子轻轻洗脱并接种于50mL含有尿嘧啶的PDB培养基中，孢子的终浓度为105个/mL，在30℃、180rpm摇床培养直至菌丝形态成熟；用尼龙布过滤收集菌丝，取适量的菌丝并加入裂解酶液(10mg/mL溶壁酶，10mg/mL溶菌酶和5mg/mL纤维素酶)，30℃处理1.5h-2h；在4℃、3000rpm的条件下，离心收集制备好的原生质体，用溶液II稀释至原生质体的终浓度为107个/mL。
(2)PEG-CaCl2介导的原生质体转化：
取上述原生质体200μL，加入重组质粒5μg及预冷的PEG溶液50μL后轻轻混匀，冰上静置20min；先加入PEG溶液1mL，25℃孵育5min，再缓慢加入2mL溶液II并轻轻混匀，最后将转化产物混合至MMS-soft培养基并覆盖在MM培养基平板上，待其冷却凝固后28℃倒置培养5d。
实施例3：重组菌株转化子的筛选及验证：
待上述平板长出转化子后，挑取适量菌丝至PDA固体培养基，28℃培养5d；取部分生长出来的菌丝转接至PDB培养基，28℃、200rpm培养24h；用尼龙布过滤收集菌丝至2mL离心管中，烘干后用组织研磨器进行研磨，使用
Figure BDA0004154739670000091
SP Fungi DNAkit提取基因组DNA。/>
将上述转化子基因组DNA作为模板，使用引物P9和P10进行PCR验证，以重组质粒为模板作为阳性对照，以里氏木霉TU-6基因组DNA为模板作为阴性对照，PCR凝胶电泳结果见图3。将条带大小正确的PCR产物进行测序，测序结果正确的重组菌株命名为TrEP-4。
实施例4：重组菌株摇瓶发酵
(1)收集孢子：将上述测序正确的重组菌株TrEP-4，接种至PDA培养基进行产孢培养，28℃培养5d。收集孢子悬液，利用血球计数板计算每毫升悬液含有孢子的数量。
(2)种子培养：将孢子重悬液接种至50mL的种子培养基，孢子终浓度为106个/mL，在30℃、200rpm条件下培养直至菌丝形态成熟。
(3)摇瓶发酵：将上述种子液以10％的接种量接种至发酵培养基，在30℃、220rpm条件下进行摇瓶发酵，发酵过程中收集发酵上清液，测定内切葡聚糖酶活力及滤纸酶活力。
实施例5：发酵上清液中内切葡聚糖酶活力及滤纸酶(FPase)活力测定
上述摇瓶发酵过程中不同时间点收集的发酵上清液进行适当稀释后，测定其内切葡聚糖酶活力。酶活定义：在50℃、pH4.8条件下，将每分钟产生1μmoL还原糖所需的酶量定为一个酶活力单位(U)。内切葡聚糖酶作为产酸性纤维素酶的一种，其酶活力的高低往往直接影响纤维素酶对纤维素的水解效率。因而，本申请将参考内切葡聚糖酶活力来侧面反映里氏木霉产酸性纤维素酶的酶产量高低水平。
(1)使用还原糖比色法测定发酵上清液中内切葡聚糖酶的活力，具体方法：
取0.8％羧甲基纤维素钠溶液2mL，加入适当稀释的酶液2mL，涡旋振荡混匀。37℃反应30min后加入5mL DNS试剂，漩涡震荡3s混匀，以终止酶解反应，沸水浴加热5min，加蒸馏水定容到25mL，涡旋振荡混匀，在540nm处测吸光值。空白对照是先加DNS再加酶液。酶活定义：在37℃、pH5.5条件下，将每分钟从浓度为7.5mg/mL的羧甲基纤维素钠溶液中产生1μmoL还原糖所需的酶量定为一个酶活力单位(U)。
(2)使用定性滤纸条作为底物测定滤纸酶活，具体方法：
将1×6.4cm的Whatman快速定性滤纸条折叠，放入25mL比色管底部，加入1.5mL柠檬酸缓冲液(pH为4.8)，实验组加入0.5mL酶液(对照组不加)，并混匀，50℃水浴反应1h，对照组加入0.5mL酶液，实验组及对照组均立即加入3mL DNS溶液将反应终止，沸水浴煮沸10min，加水定容到25mL，涡旋混匀3s，使用分光光度计测量540nm处的吸光值。酶活定义：在50℃、pH4.8条件下，将每分钟产生1μmoL还原糖所需的酶量定为一个酶活力单位(U)。
从检测结果可以看出，图4中发酵上清液中内切葡聚糖酶活力测定结果显示在发酵84h，重组菌株TrEP-4的内切葡聚糖活力为24.6U/mL，比出发菌株TU-6(18.5U/mL)提高了33％。根据上述结果，测定发酵84h时上清液中的滤纸酶活力，图5显示重组菌株TrEP-4的滤纸酶活力为5.9U/mL，相较于出发菌株(4.1U/mL)提高了43.9％。以上结果表明，在纤维素诱导型启动子Pcbh1的调控下过表达伴侣蛋白基因pdi1能够有效地提高里氏木霉的纤维素酶活力。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本申请以里氏木霉TU-6为出发菌株，将可过表达伴侣蛋白PDI1的重组质粒导入TU-6中，得到里氏木霉重组菌株TrEP-4。利用该里氏木霉重组菌株进行纤维素酶的生产，可以在提高伴侣蛋白表达量的情况下，能够促进纤维素酶蛋白质结构的正确折叠，进而使得纤维素酶的分泌表达的产量提高，降低了里氏木霉产酸性纤维素酶的生产成本。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种里氏木霉重组菌株，其特征在于，所述里氏木霉重组菌株为里氏木霉TrEP-4，所述里氏木霉TrEP-4为能够过表达伴侣蛋白的里氏木霉。
2.根据权利要求1所述的里氏木霉重组菌株，其特征在于，所述里氏木霉重组菌株中包含编码所述伴侣蛋白的核酸分子的重组质粒；
优选地，所述伴侣蛋白为二硫键异构酶PDI1；
优选地，编码所述伴侣蛋白PDI1的核酸分子为表达盒Pcbh1-pdi1-Tcbh1，其中，Pcbh1表示纤维二糖水解酶I启动子Pcbh1，pdi1表示伴侣蛋白基因pdi1，Tcbh1表示纤维二糖水解酶I终止子Tcbh1；
优选地，所述重组质粒还包括氨苄青霉素抗性基因AmpR及筛选标记基因pyr4；
优选地，所述里氏木霉重组菌株的出发菌株为包含所述重组质粒的里氏木霉TU-6；
优选地，所述里氏木霉TU-6保藏号为ATCC MYA-256。
3.根据权利要求2述的里氏木霉重组菌株，其特征在于，所述表达盒中的所述纤维二糖水解酶I启动子Pcbh1、所述伴侣蛋白基因pdi1及所述纤维二糖水解酶I终止子Tcbh1均来自里氏木霉；
优选地，所述伴侣蛋白基因pdi1的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
4.一种生产纤维素酶的方法，其特征在于，所述方法包括：
利用权利要求1-3中任一项所述的里氏木霉重组菌株制备孢子悬液；
将所述孢子悬液进行种子培养，得到种子液；
将所述种子液进行摇瓶发酵，得到发酵后的上清液，即为所述纤维素酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述制备孢子悬液包括：将所述里氏木霉重组菌株接种至PDA培养基，进行产孢培养，得到所述孢子悬液；
优选地，所述产孢培养的温度为28-30℃；
优选地，所述产孢培养的时间为5-6d；
优选地，所述孢子悬液中孢子浓度为1×107-108个/mL。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述种子培养包括：将所述孢子悬液接种至种子培养基中，进行摇瓶培养，得到所述种子液；
优选地，所述孢子悬液接种量为5-6ml；
优选地，所述种子培养基量为50-60ml；
优选地，所述种子培养的温度为30-32℃；
优选地，所述摇瓶培养的转速为200-220rpm；
优选地，以质量分数计，所述种子培养基包括2-3％葡萄糖、0.50-0.55％酵母粉、0.50-0.55％磷酸氢二钾、0.50-0.55％磷酸二氢钾、0.02-0.04％硫酸镁及0.02-0.04％氯化钙，所述种子培养基的pH＝6.0-6.5；
优选地，所述种子液中孢子浓度为1×106-107个/mL。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述摇瓶发酵包括：将所述种子液接种至发酵培养基，进行所述摇瓶发酵；
优选地，以体积比计，所述种子液的接种量为10-12％；
优选地，所述摇瓶发酵的温度为30-32℃；
优选地，所述摇瓶发酵的转速为200-220rpm；
优选地，以质量分数计，所述发酵培养基包括3.5-4.5％微晶纤维素、2-3％玉米浆、0.3-0.4％硫酸铵、0.50-0.55％磷酸氢二钾、0.50-0.55％磷酸二氢钾、0.02-0.04％硫酸镁及0.02-0.04％氯化钙，所述发酵培养基的pH＝5.5-6.5。
8.一种制备权利要求1-3中任一项所述的里氏木霉重组菌株的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1，构建重组质粒；
S2，将所述重组质粒转化至所述里氏木霉TU-6，得到所述重组菌株。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述S1包括：
以里氏木霉基因组DNA为模板，扩增得到纤维二糖水解酶I启动子Pcbh1、伴侣蛋白基因pdi1、纤维二糖水解酶I终止子Tcbh1；
以携带乳清酸磷酸核糖转移酶基因pyr4的质粒pAN7.1-pyr4为模板，扩增得到抗性基因AmpR的启动子、抗性基因AmpR、复制原点、筛选标记基因pyr4的启动子、筛选标记基因pyr4及筛选标记基因pyr4的终止子，得到片段pAN4；
将所述纤维二糖水解酶I启动子Pcbh1、所述伴侣蛋白基因pdi1、所述纤维二糖水解酶I终止子Tcbh1及所述片段pAN4进行体外组装，进行大肠杆菌转化，得到测序正确的阳性转化子即为所述重组质粒。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述S2包括：
制备所述里氏木霉TU-6的原生质体；
通过PEG-CaCl2介导将所述重组质粒转化至所述里氏木霉TU-6的原生质体中，得到转化产物；
将所述转化产物进行培养，得到测序正确的阳性转化子即为所述重组菌株；
优选地，所述里氏木霉TU-6的保藏号为ATCC MYA-256。
11.一种权利要求1-3中任一项所述的里氏木霉重组菌株、或权利要求8-10中任一项所述的方法得到的重组菌株在生产纤维素酶中的应用。
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