JP2022553854A - タンパク質生産性が増強された表現型を含む糸状菌株及びその方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、概して、タンパク質生産性が増強された表現型を含む改変糸状菌株（細胞）であって、深部培養における増殖（例えば、工業的／商業的用途のためのタンパク質の大量生産）に特に好適である改変糸状菌株（細胞）に関する。従って、本開示の特定の実施形態は、天然ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子を含む親菌株に由来する（それから得られる）糸状菌のそのような変異（改変）菌株であって、天然ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子を破壊するか又は欠失させる遺伝子改変を含み、同じ条件下で増殖／培養／発酵されたとき、（即ち親菌株に対して）タンパク質生産性が増加した表現型を含む、そのような変異（改変）菌株に関する。【選択図】図１Ａ

Description

本開示は、概して、生物学、分子生物学、糸状菌、酵母、発酵、遺伝学、工業用タンパク質生産等の分野に関する。より詳細には、本開示の本菌株及び方法は、改変された表現型を有する変異（改変）菌株を生じさせる、糸状菌における遺伝子改変であって、そのような改変菌株は、深部培養における増殖（例えば、工業的／商業的用途のためのタンパク質の大量生産）に特に好適である、遺伝子改変に関する。

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１１月０８日に出願された米国仮特許出願第６２／９３２，５２５号明細書に対する利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

配列表の参照
「ＮＢ４１３８３－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称の配列表のテキストファイルの電子提出の内容は、２０２０年１０月２７日に作成され、サイズが５５ＫＢであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

糸状菌（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）種、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種等）は、天然タンパク質及び異種タンパク質を高レベルで発現させ、それらを、医薬用途、動物健康用途、食品用途、飲料用途、洗濯用途及び織物用途等の工業的用途及び／又は商業的用途のためのタンパク質（例えば、酵素、抗体、ペプチド等）及び／又は代謝産物を大量生産するように適合させることができる。糸状菌は、典型的には、酸素及び栄養分を培養培地（即ち培養ブロス）に導入及び分配するために適合されたバイオリアクター（発酵槽）内において菌糸体用深部培養で増殖させる。例えば、糸状菌のトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）（Ｔリーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）；真菌のヒポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ）のアナモルフ）は、セルラーゼ酵素の効率的な産生株であることが知られている。

従って、糸状菌は、セルロース系（由来の）エタノール、繊維加工、穀物加工、洗剤、繊維／パルプ／紙、食品添加物、飼料添加物等の日用品の製造に有用なタンパク質（例えば、酵素）を産生する能力を有するために利用されてきた。例えば、そのような真菌宿主菌株における組換え遺伝子発現は、タンパク質の生産のための（即ち工業目的及び商業目的のための）一般的な方法であり、従って、真菌宿主菌株のタンパク質生産性の改善は、タンパク質生産コストの重要な経済的要因となる。従って、当業者によって理解されるように、糸状菌株におけるタンパク質生産を増強するためのそのような新規組成物及び方法は、商業的関心が極めて高いものである。

本開示は、概して、タンパク質生産性が増強された表現型を含む改変糸状菌株（細胞）であって、深部培養における増殖（例えば、工業的／商業的用途のためのタンパク質の大量生産）に特に好適である改変糸状菌株（細胞）に関する。従って、本開示の特定の実施形態は、天然ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子を含む親菌株に由来する（それから得られる）糸状菌のそのような変異（改変）菌株であって、天然ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子を破壊するか又は欠失させる遺伝子改変を含み、同じ条件下で増殖／培養／発酵されたとき、（即ち親菌株に対して）タンパク質生産性が増加した表現型を含む、そのような変異（改変）菌株に関する。

生物学的配列の簡単な説明
配列番号１は、配列番号２を含む天然ＧＥＦ１タンパク質をコードするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ポリヌクレオチド配列である。

配列番号２は、配列番号１のポリヌクレオチドによってコードされる天然完全長ＧＥＦ１タンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号３は、配列番号２の天然完全長ＧＥＦ１タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）である。

配列番号４は、配列番号２のアミノ酸１～１，２４４位を含むＣ末端切断型ＧＥＦ１変異タンパク質である。

配列番号５は、配列番号２に存在するＧＥＦ１ドメインのアミノ酸配列である。

配列番号６は、配列番号２に存在するＢＡＲドメインのアミノ酸配列である。

配列番号７は、配列番号２に存在する保存された未知のドメインのアミノ酸配列である。

配列番号８は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＧＥＦ１遺伝子内の標的部位３（ＴＳ３）ＲＮＡ配列である。

配列番号９は、プライマーＡＬ９５０の核酸配列である。

配列番号１０は、プライマーＡＬ９５２の核酸配列である。

配列番号１１は、プライマーＲｈｏＦ１の核酸配列である。

配列番号１２は、プライマーＲｈｏＲ１の核酸配列である。

配列番号１３は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＧＥＦ１遺伝子内の標的部位４（ＴＳ４）ＲＮＡ配列である。

配列番号１４は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼマーカー遺伝子の核酸配列である。

配列番号１５は、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）ｃｐｃ１プロモーターの核酸配列である。

配列番号１６は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｔｒｐＣターミネーターの核酸配列である。

配列番号１７は、プライマーＨｙｇＦ１の核酸配列である。

配列番号１８は、プライマーＨｙｇＲ１の核酸配列である。

配列番号１９は、ｐｙｒ２マーカー遺伝子の核酸配列である。

配列番号２のアミノ酸配列を含む、天然のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種のＧＥＦ１タンパク質相同体をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１；図１Ａ～図１Ｂ）を表す。図１Ａ及び図１Ｂに示すように、ＧＥＦ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列（配列番号２）は、小文字（ヌクレオチド）で表される２つのイントロンと、大文字（ヌクレオチド）で表される３つのエキソンとを含み、Ｃａｓ９標的部位３（ＴＳ３）ヌクレオチドは、二重下線の引かれた大文字として表され、Ｃａｓ９標的部位４（ＴＳ４）ヌクレオチドは、一重下線の引かれた大文字として表され、野生型配列（配列番号１）のコドンＧＡＧは、太字の大文字として表され、このコドンを変異菌株において未成熟終止コドン（ＴＡＧ）に変異させ、それによりＣ末端切断型ＧＥＦ１タンパク質（図１Ｂ）をコードする。

配列番号２の天然ＧＥＦ１タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列（配列番号３；図２Ａ～図２Ｂ）を示す。

天然ＧＥＦ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２；図３Ａ）及び変異（Ｃ末端切断型）ＧＥＦ１タンパク質（配列番号４；図３Ｂ）を示す。図３には、配列番号２の天然ＧＥＦ１タンパク質のＧＥＦ１ドメイン（図３Ｃ；配列番号５）、ＢＡＲドメイン（図３Ｄ；配列番号６）及び未知のドメイン（図３Ｅ；配列番号７）も示される。例えば、天然ＧＥＦ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２；図３Ａ）は、Ｐｆａｍで予測されたＧＥＦ１ドメイン（図３Ａ、網掛けされた薄い灰色のアミノ酸；ＰＦ００６２１）及びＢＡＲドメイン（図３Ａ、太字のアミノ酸；ＰＦ０３１１４）を含む。図３Ｂに示すように、変異ＧＥＦ１タンパク質（配列番号４）は、Ｃ末端切断型であり、切断は、ＧＥＦ１ドメインのＮ末端の近傍（例えば、残基「ＶＩＫ」）に生じる。

本明細書で説明及び記載するように、本開示は、概して、工業的タンパク質の生産における遺伝子改変糸状菌株（細胞）及びその使用に関する。より詳細には、本開示の本菌株及び方法は、改変された表現型を有する変異菌株を生じさせる、糸状菌における遺伝子改変であって、そのような変異菌株は、深部培養における増殖（例えば、工業的／商業的用途のためのタンパク質の大量生産）に特に好適である、遺伝子改変に関する。従って、本明細書で記載されるように、本開示の特定の実施形態は、糸状菌の遺伝子改変菌株及びその方法に関し、そのような改変菌株は、例えば、容積効率が向上し、比生産性が高くなり、炭素源に対する収率が向上し、バイオリアクター（発酵槽）の運転コストが減少する等、タンパク質生産性が増強された表現型を含む。

Ｉ．定義
本菌株及び方法を詳細に説明する前に、明確にするために以下の用語を定義する。定義されていない用語は、関連する技術分野で使用されるそれらの通例の意味に適合するものとする。他に定義されていない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語の全ては、本組成物及び方法を適用する当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。

本明細書に引用されている全ての刊行物及び特許は、参照により本明細書に組み込まれる。

ある範囲の値が示されている場合、文脈上別段の明確な指示がなければ、その範囲の上限と下限との間にある下限値の単位の１０分の１までの各介在値及びその記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在値が本組成物及び方法の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立してより小さい範囲に含まれ得、また記載された範囲における任意の具体的に除外された限界に従うことを条件として本発明の組成物及び方法の範囲内に包含される。記載された範囲が限界値の一方又は両方を含む場合、それらの含まれた限界値の一方又は両方を除く範囲も本組成物及び方法に含まれる。

本明細書において、いくつかの範囲は、「約」という用語が先行する数値で示される。本明細書では、「約」という用語は、それに先行する正確な数及びその用語に先行する数に近い又は近似する数について文字通りの支持を提供するために使用される。数字が具体的に挙げられた数に近いか又は近似するかどうかを判断する際、挙げられていない近い又は近似する数は、それが提示される文脈において、具体的に挙げられた数の実質的に均等な数を提供する数であり得る。例えば、ある数値に関して、「約」という用語は、この用語が文脈において別途具体的に定義されていない限り、この数値の－１０％～＋１０％の範囲を意味する。別の例では、「約６のｐＨ値」という語句は、ｐＨ値が別途具体的に定義されていない限り、５．４～６．６のｐＨ値を意味する。

本明細書に示した見出しは、本明細書全体を参照することによって得ることができる本組成物及び方法の様々な態様又は実施形態を限定するものではない。従って、直後に定義する用語は、本明細書全体を参照することによってより詳細に定義される。

この詳細な説明によれば、以下の略語及び定義が適用される。文脈が明白に他を指示していない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、複数の対象を含むことに留意されたい。従って、例えば、「酵素」という言及は、複数のそのような酵素を含み、「その用量」という言及は、１つ以上の用量及び当業者に公知のその均等物等を含む。

特許請求の範囲は、任意選択の要素を排除するように記載され得ることにも更に留意されたい。従って、この記述は、請求項の構成要素の列挙に関連して「唯一」、「のみ」、「除いて」、「含まない」等の排他的な用語を使用するため又は「否定的な」限定を使用するための先行する根拠として機能することを意図する。

更に、本明細書で使用される「含む」という用語は、「含む」という用語の後の構成要素を「含むが、限定されない」ことを意味することに留意されたい。「含む」という用語の後の構成要素は、必要とされるか又は必須であるが、この構成要素を含む組成物は、他の非必須の構成要素又は任意選択の構成要素を更に含み得る。

本明細書で使用される「からなる」という用語は、「からなる」という用語の後の構成要素を「含み、且つ限定される」ことを意味することにも留意されたい。従って、「からなる」という用語の後の構成要素は、必要とされるか又は必須であり、他の構成要素がその組成物中に存在しない。

本開示を読むことで当業者に明らかなように、本明細書に記載及び例示する個々の実施形態のそれぞれは、本明細書に記載する本組成物及び方法の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他の一部の実施形態の何れかの特徴から容易に分離するか又は組み合わせることができる別個の構成要素及び特徴を有する。記載した方法の何れも、記載した事象の順序又は論理的に可能な他の任意の順序で実施することができる。

本明細書に記載した操作、構築及び使用のための糸状菌細胞は、一般に、子嚢菌門（ｐｈｙｌｕｍ Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、チャワンタケ亜門（ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、特に栄養菌糸状態を有する真菌に由来する。そのような生物としては、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ゲオスミチア（Ｇｅｏｓｍｉｔｈｉａ）種、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種等を含むが、それらに限定されない、商業的に重要な工業用及び製薬用タンパク質を生産するために使用される糸状菌細胞が挙げられる。

例えば、特定の実施形態では、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）（以前にはトリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）及びヒポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ）として分類されていた）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・イタコニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｉｔａｃｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、タラロマイセス（ゲオスミチア）・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ（Ｇｅｏｓｍｉｔｈｉａ）ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）及びクリソスポリウム・ルクノウエンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）（Ｃ１）等を含むが、それらに限定されない糸状菌細胞及びそれらの菌株が挙げられる。

本明細書で使用するとき、例えば、「糸状菌株（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｕｓ ｓｔｒａｉｎ（ｓ））」、「糸状菌株（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇａｌ ｓｔｒａｉｎ（ｓ））」、「真菌株（ｆｕｎｇｕｓ ｓｔｒａｉｎ（ｓ））」、「真菌株（ｆｕｎｇａｌ ｓｔｒａｉｎｓ（ｓ））」、「糸状菌細胞（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｕｓ ｃｅｌｌ（ｓ））」、「糸状菌細胞（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇａｌ ｃｅｌｌ（ｓ））」、「真菌細胞（ｆｕｎｇｕｓ ｃｅｌｌ（ｓ））」、「真菌細胞（ｆｕｎｇａｌ ｃｅｌｌ（ｓ））」等の用語及び語句は、説明の便宜性のために互換的に使用することができ、本開示の範囲を限定することを意図しない。

本明細書で使用される「酵母」及び／又は「酵母菌株」としては、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．パストリアヌス（Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、Ｓ．カールスベルゲンシス（Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ））、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種（例えば、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ））、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種（例えば、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））等が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、タンパク質又はＲＮＡをコードし、発現を誘導する核酸（ポリヌクレオチド）を指す「対立遺伝子」という用語と同義である。糸状菌の栄養型は、一般に、一倍体であるため、特定の表現型を付与するには、特定の遺伝子の単一コピー（即ち単一の対立遺伝子）で十分である。

本明細書で使用される「親細胞」、「親真菌細胞」、「親菌株」、「親真菌株」、「糸状菌細胞の親菌株」、「参照菌株」等という語句は、互換的に使用され得、「未改変」親糸状菌細胞を指す。例えば、「糸状菌細胞の親菌株」は、糸状菌の任意の細胞又は菌株を指し、この「親」細胞のゲノムは、「親」細胞と「娘」細胞とが異なるような糸状菌細胞の変異（娘）菌株を生成するように（例えば、親細胞内に導入された遺伝子改変によって）改変される。

本明細書で使用される「変異細胞」、「娘細胞」、「変異菌株」、「娘菌株」、「変異真菌株又は娘真菌株」、「糸状菌細胞の変異菌株又は娘菌株」等という語句は、糸状菌細胞の親（又は参照）菌株に由来する（即ちそれらから得られるか又は得ることができる）糸状菌細胞の改変菌株を指すために互換的に使用され得、ここで、変異菌株は、「親」及び「変異」菌株間の表現型の差異が、比較することによって遺伝子改変に帰せることができるように、親菌株に存在しない遺伝子改変を含む。換言すれば、親菌株及び変異菌株は、変異菌株に「導入された」遺伝子改変を除いて、他の点で同質遺伝子的である。

従って、親「菌株」及び変異「菌株」は、遺伝子改変、発現表現型、形態表現型等などの所定の特徴を有するものであると説明することができるが、しかしながら、当業者であれば、それが、技術的にそのような特徴を有する親菌株又は変異菌株の「細胞」であること及び便宜上「菌株」と呼ばれることを理解するであろう。

本明細書で使用される「野生型」及び「天然」という用語は、互換的に使用され、天然に見られるような遺伝子、タンパク質、タンパク質混合物又は菌株を指す。

本明細書で使用される、目的タンパク質をコードする「内在性糸状菌遺伝子」としては、当業者に公知であり、理解されているように、グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー酵素（例えば、ＥＣ番号３．２．１．１～３．２．１．２０６など）をコードする内在性遺伝子、プロテアーゼをコードする内在性遺伝子、エステラーゼをコードする内在性遺伝子、リパーゼをコードする内在性遺伝子等が挙げられるが、それらに限定されない。

本明細書で使用される「リグノセルロース分解酵素」、「セルラーゼ酵素」及び「セルラーゼ」という語句は、互換的に使用され、これらには、グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）酵素、例えばセロビオヒドロラーゼ、キシラナーゼ、エンドグルカナーゼ及びβ－グルコシダーゼが挙げられ、セルロース（ヘミセルロース）のβ－（１，４）結合のグリコシド結合を加水分解してグルコースを生成する。

特定の実施形態では、セロビオヒドロラーゼとしては、酵素番号（ＥＣ３．２．１．９１）のもとで分類される酵素が挙げられ、エンドグルカナーゼとしては、ＥＣ３．２．１．４のもとで分類される酵素が挙げられ、エンド－β－１，４キシラナーゼとしては、ＥＣ３．２．１．８のもとで分類される酵素が挙げられ、β－キシロシダーゼとしては、ＥＣ３．２．１．３７のもとで分類される酵素が挙げられ、β－グルコシダーゼとしては、ＥＣ３．２．１．２１のもとで分類される酵素が挙げられる。

本明細書で使用される「エンドグルカナーゼ」タンパク質は、「ＥＧ」と省略することができ、「セロビオヒドロラーゼ」タンパク質は、「ＣＢＨ」と省略することができ、「β－グルコシダーゼ」タンパク質は、「ＢＧ」と省略することができ、「キシラナーゼ」タンパク質は、「ＸＹＬ」と省略することができる。従って、本明細書で使用される、ＥＧタンパク質をコードする遺伝子（又はＯＲＦ）は、「ｅｇ」と省略することができ、ＣＢＨタンパク質をコードする遺伝子（又はＯＲＦ）は、「ｃｂｈ」と省略することができ、ＢＧタンパク質をコードする遺伝子（又はＯＲＦ）は、「ｂｇ」と省略することができ、ＸＹＬタンパク質をコードする遺伝子（又はＯＲＦ）は、「ｘｙｌ」と省略することができる。

特定の実施形態では、本明細書に記載されるような操作、構築及び使用のための糸状菌細胞は、一般に、チャワンタケ亜門（ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、特に栄養菌糸状態を有し、ＧＥＦ１遺伝子又はその相同体を含む真菌に由来するものである。

本明細書で使用される「天然ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子又はポリヌクレオチド」は、配列番号１との配列相同性を含む。特定の実施形態では、天然ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子又はポリヌクレオチドは、配列番号１又は配列番号３と約７０％～１００％の配列同一性を含む。特定の他の実施形態では、天然ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子又はポリヌクレオチドは、配列番号１又は配列番号３と約７０％～１００％の配列同一性を含み、配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を含むＧＥＦ１ドメインをコードする。特定の他の実施形態では、天然ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子又はポリヌクレオチドは、中程度～ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１又は配列番号３の核酸配列とハイブリダイズする。

特定の実施形態では、上流の（５’）セルラーゼ遺伝子のプロモーター配列としては、セロビオヒドロラーゼ（ｃｂｈ）遺伝子のプロモーター配列、エンドグルカナーゼ（ｅｇ）遺伝子のプロモーター配列、β－グルコシダーゼ（ｂｇ）遺伝子のプロモーター配列、キシラナーゼ（ｘｙｌ）遺伝子のプロモーター配列等が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「天然のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種のＧＥＦ１タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）核酸配列」は、配列番号３のＯＲＦ核酸配列との配列相同性を含む。特定の他の実施形態では、ＯＲＦ核酸配列は、配列番号２と約７０％～１００％の配列同一性を含む、天然のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種のＧＥＦ１タンパク質をコードする。他の実施形態では、ＯＲＦ核酸配列は、配列番号２と約７０％～１００％の配列同一性を含む、天然のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種のＧＥＦ１タンパク質をコードし、配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を有するＧＥＦ１ドメインを含む。特定の他の実施形態では、天然ＧＥＦ１タンパク質をコードするＯＲＦは、中程度～ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１又は配列番号３の核酸配列とハイブリダイズする。

本明細書で使用される「所定のアミノ酸配列」内のアミノ酸残基の「位置」は、本明細書では、配列番号２の天然のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種のＧＥＦ１タンパク質のアミノ酸残基の番号付け（位置）を用いて番号付けされる。例えば、図３Ａは、天然のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種のＧＥＦ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を表している。従って、「配列番号２の１，２４４位に対応する配列位置にグルタミン酸（Ｅ；Ｇｌｕ）残基を含む」又は「配列番号２の１，２４２～１，４５４位に対応する配列位置にＧＥＦ１ドメインを含む」などの語句では、天然の（トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種の）ＧＥＦ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）が参照（親）タンパク質配列として機能する。例えば、図３Ａに示すように、本明細書に記載される所与のアミノ酸配列は、本明細書に記載されるアラインメントアルゴリズム（及び／又は当業者に公知のアラインメントアルゴリズム）を用いて、天然のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種のＧＥＦ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）とアラインメントさせることができ、天然配列内のアミノ酸残基とアラインメントする（好ましくは最適にアラインメントする）所与のアミノ酸配列内のアミノ酸残基は、ＧＥＦ１配列内の対応するアミノ酸残基を参照することによって便宜的に番号付けすることができる。

同様に、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種のＧＥＦ１タンパク質（配列番号２）の一次（１°）配列との配列相同性又は配列同一性を立証するために、当業者であれば、当業者に公知の配列アラインメントアルゴリズム、ソフトウェア及びそれらの方法を用いて、１つ以上の候補となるＧＥＦ１タンパク質の相同配列／オーソログ配列と配列番号２の一次配列を容易に比較することができる。従って、アラインメントを維持するために必要な挿入及び欠失を許容して保存残基をアラインメントさせた後（即ち任意の欠失及び挿入による保存残基の排除を回避する）、候補となる糸状菌のＧＥＦ１タンパク質の一次配列内の特定のアミノ酸と均等な残基が規定される。保存残基のアラインメントは、好ましくは、そのような残基の１００％を保存していなければならない。しかしながら、均等な残基を規定するには、保存残基のアラインメントが９８％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、５０％又は少なくとも４５％超でも十分である。

本明細書で使用される「Ｔ４」という名称のトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は、比生産性（Ｑｐ）に悪影響を及ぼすことなく、高温でタンパク質を産生することができるそれらの変異菌株を同定及び単離するために、選択的条件下で連続的に増殖させたものである。

本明細書で使用される「Ｔ４－Ｅ１」という名称の変異トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株（即ち親「Ｔ４」菌株に由来する）は、選択的温度下で同定及び単離したものであり、Ｔ４－Ｅ１変異菌株は、２５℃でのＴ４菌株の比生産性（Ｑｐ）に対して２８℃で同様のＱｐを有する。

本明細書で使用される「Ｔ４－ΔＲｈｏ＃２２Ｄ」という名称の変異トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は、Ｔ４親菌株に由来したものであり、この変異Ｔ４－ΔＲｈｏ＃２２Ｄ菌株は、Ｃａｓ９切断部位（ＴＳ３）に導入されたｐｙｒ２マーカー遺伝子を含むことにより、ＧＥＦ１コード配列が破壊されている。

本明細書で使用される「ｔ－ＡＴＶ８４」という名称のトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は、３コピーのＤＸＳＴエンドグルカナーゼをコードするＳ．ココスポラム（Ｓ．ｃｏｃｃｏｓｐｏｒｕｍ）遺伝子を含み、ＣＢＨＩ、ＣＢＨＩＩ、ＥＧＩ及びＥＧＩＩタンパク質をコードする天然セルラーゼ遺伝子の欠失（又は破壊）を含んでいる。

本明細書で使用される「ｔ－ＡＷＣ８８」という名称のトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は、ｔ－ＡＴＶ８４菌株に由来したものであり、ＧＥＦ１遺伝子の破壊の導入を更に含む。

本明細書で使用される、スタフィロトリカム・ココスポラム（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃｏｃｃｏｓｐｏｒｕｍ）のエンドグルカナーゼである「ＳＴＣＥ１」は、米国特許第７，５９５，１８２号明細書に記載されている（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

本明細書で使用される「Ｓ．ココスポラム（Ｓ．ｃｏｃｃｏｓｐｏｒｕｍ）ＳＴＣＥ１エンドグルカナーゼ」は、「Ｓ．ココスポラム（Ｓ．ｃｏｃｃｏｓｐｏｒｕｍ）ＤＸＳＴエンドグルカナーゼ」と称することも可能であり、従ってＳＴＣＥ１及びＤＸＳＴという用語は、互換的である。特定の実施形態では、ＤＸＳＴタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ｃｂｈＩなどのプロモーターの制御下に置かれている。

本明細書で使用される「高い発酵（培養）温度」という語句は、２５℃超の発酵温度である。特定の実施形態では、高い発酵温度は、少なくとも約２５．５℃～約２８℃である。特定の実施形態では、高い発酵温度は、少なくとも約２５．１℃～約２５．９℃である。

本明細書で使用される「ポリペプチド」及び「タンパク質」（並びに／又はそれらのそれぞれの複数形）という用語は、互換的に使用され、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基を含む任意の長さのポリマーを指す。本明細書では、アミノ酸残基には、従来の１文字コード又は３文字コードを使用する。ポリマーは、直鎖又は分枝鎖であり得、修飾アミノ酸を含み得、非アミノ酸によって中断され得る。この用語は、天然又は介在により修飾されている例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化又は任意の他の操作若しくは修飾、例えば標識成分とのコンジュゲーションによって修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する。この定義の範囲には、例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸等を含む）を含有するポリペプチド及び当技術分野において公知の他の改変も含まれる。

本明細書で使用される「誘導体ポリペプチド／タンパク質」という用語は、Ｎ末端及びＣ末端の何れか若しくは両方への１つ以上のアミノ酸の付加、アミノ酸配列中の１つ若しくは多数の異なる部位での１つ以上のアミノ酸の置換、タンパク質の何れか若しくは両方の末端若しくはアミノ酸配列中の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の欠失並びに／又はアミノ酸配列中の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の挿入により、タンパク質から誘導されるか又は誘導可能なタンパク質を指す。タンパク質誘導体の調製は、天然タンパク質をコードするＤＮＡ配列を改変し、そのＤＮＡ配列を好適な宿主に形質転換し、その改変ＤＮＡ配列を発現させて誘導体タンパク質を形成することによって達成することができる。

関連（及び誘導体）タンパク質には、「変異タンパク質」が含まれる。変異タンパク質は、少数のアミノ酸残基における置換、欠失及び／又は挿入により、参照／親タンパク質（例えば、野生型タンパク質）と異なる。変異タンパク質と親タンパク質との間で異なるアミノ酸残基の数は、１個以上、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０個又はそれを超えるアミノ酸残基であり得る。変異タンパク質は、参照タンパク質と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％若しくは少なくとも約９９％又はそれを超えるアミノ酸配列同一性を共有し得る。変異タンパク質は、選択されたモチーフ、ドメイン、エピトープ、保存領域等でも参照タンパク質と異なり得る。

本明細書で使用される「類似配列」という用語は、目的タンパク質（即ち典型的には元の目的タンパク質）と類似の機能、三次構造及び／又は保存残基を提供するタンパク質内の配列を指す。例えば、αへリックス又はβシート構造を含有するエピトープ領域では、類似配列中の置換アミノ酸は、好ましくは、同一の特異的構造を維持する。この用語は、ヌクレオチド配列と同様にアミノ酸配列も指す。いくつかの実施形態では、アミノ酸の置換が、類似した又は改良された機能を示す変異酵素を生じさせるような類似配列が発生する。いくつかの実施形態では、目的タンパク質内のアミノ酸の三次構造及び／又は保存残基は、目的のセグメント又は断片に位置するか又はその付近に位置する。従って、目的のセグメント又は断片が例えばαへリックス又はβシート構造を含有する場合、置換アミノ酸は、好ましくは、その特異的構造を維持する。

本明細書で使用される「相同タンパク質」という用語は、参照タンパク質と類似した活性及び／又は構造を有するタンパク質を指す。相同体は、必ずしも進化的関連があることを意図するものではない。従って、この用語は、異なる生物から得られる（即ち構造及び機能に関して）同一の、類似の又は対応するタンパク質を包含することを意図する。いくつかの実施形態では、参照タンパク質に類似する四次構造、三次構造及び／又は一次構造を有する相同体を同定することが望ましい。

配列間の相同性の程度は、当技術分野で公知の任意の好適な方法を使用して決定することができる（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ等のプログラム；並びにＤｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４を参照されたい）。

例えば、ＰＩＬＥＵＰは、配列相同性レベルを決定するための有用なプログラムである。ＰＩＬＥＵＰは、漸進的なペアワイズアラインメントを用いて、関連配列の群から多重配列アラインメントを作成する。これにより、アラインメントを作成するために使用されるクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８７）のプログレッシブアラインメント法の簡易版を使用する。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ（１９８９）によって記載された方法に類似している。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターは、３．００のデフォルトのギャップ重み、０．１０のデフォルトのギャップ長重み及び重み付け末端ギャップを含む。有用なアルゴリズムの別例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０及びＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３によって記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズムである。１つの特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２プログラムである（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６を参照されたい）。パラメーター「Ｗ」、「Ｔ」及び「Ｘ」は、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９８９を参照されたい）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ’５、Ｎ’－４及び両方のストランドの比較を使用する。

本明細書で使用される「実質的に類似」及び「実質的に同一」という語句は、少なくとも２つの核酸又はポリペプチドと関連する場合、典型的には、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、参照（即ち野生型）配列と比較して少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約７５％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性若しくは少なくとも約９９％の同一性又はそれを超える同一性を有する配列を含むことを意味する。配列同一性は、標準的なパラメーターを用いて、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ及びＣＬＵＳＴＡＬなどの公知のプログラムを使用して決定することができる（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３；及びＨｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９８８を参照されたい）。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、アメリカ国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通して公的に入手可能である。ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８）を使用してデータベースを検索することもできる。２つのポリペプチドが実質的に同一である１つの指標は、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。典型的には、保存的アミノ酸置換により異なるポリペプチドは、免疫学的に交差反応性である。従って、ポリペプチドは、例えば、２つのペプチドで保存的置換のみが異なる場合、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下（例えば、中程度～高度のストリンジェンンシーの範囲内）で互いにハイブリダイズすることである。

本明細書で使用される「核酸」は、ヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列及びそれらの断片又は部分並びにゲノム又は合成起源のＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡを指し、これらは、センス鎖を表すか又はアンチセンス鎖を表すかを問わず、二本鎖又は一本鎖であり得る。

本明細書で使用される「発現」という用語は、本開示の核酸分子に由来するセンス（ｍＲＮＡ）又はアンチセンスＲＮＡの転写及び安定した蓄積を指す。発現は、ｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳することを指す場合もある。従って、「発現」という用語には、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、分泌等が挙げられるが、これらに限定されないポリペプチドの産生に関与する任意のステップが含まれる。

本明細書で使用される「糸状菌細胞の変異菌株が（即ち親細胞に対して）「増加した」量の目的タンパク質（ＰＯＩ）を発現する／産生する」などの語句に使用される「発現／産生する」という複合用語は、本開示のそのような変異糸状菌株におけるタンパク質の発現及び産生に関与する任意のステップを含むことを意味する。

特定の実施形態では、「配列相同性」を含む天然ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子、ポリヌクレオチド又は核酸配列は、（それと比較される）対応する核酸配列に由来する極めて僅少な配列変化を有し、且つ（それと比較される）対応する核酸配列と実質的に同一の生物学的機能を保持するＤＮＡ又はＲＮＡ（核酸）配列を指す。例えば、特定の実施形態では、天然ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子、ポリヌクレオチド又は核酸との実質的な配列相同性を含む核酸配列は、本明細書で記載するように、コードされた遺伝子産物（天然ＧＥＦ１タンパク質）を同定することによって評価される。

特定の他の実施形態では、天然ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子、ポリヌクレオチド又は核酸との配列相同性を含む遺伝子配列、ポリヌクレオチド配列又は核酸配列は、核酸ハイブリダイゼーション法を用いて決定／同定される。例えば、特定の実施形態では、天然ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子（例えば、配列番号２）との実質的な配列相同性を含むＤＮＡ／ＲＮＡ配列は、そのようなＤＮＡ／ＲＮＡ配列がストリンジェントな条件下で本開示の特定の核酸配列とハイブリダイズする能力によって同定される。

本明細書で使用される「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、互いに有意に同一又は相同なヌクレオチド配列が、互いにハイブリダイズされたままで維持されるハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を記載することを意図する。そのようなストリンジェントな条件は、当業者によく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい）。例えば、特定の実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例としては、約６５～７０℃での４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション（又は約４２～５０℃での４×ＳＳＣ＋５０％のホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）、その後の約６５～７０℃での１×ＳＳＣ中での１回以上の洗浄が挙げられる。同様に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションの非限定的な例としては、約６５～７０℃での１×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション（又は約４２～５０℃での４×ＳＳＣ＋５０％のホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）、その後の約６５～７０℃での０．３×ＳＳＣ中での１回以上の洗浄が挙げられる。従って、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、約５０～６０℃での４×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション（又は代わりに約４０～４５℃での６×ＳＳＣ＋５０％のホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）、その後の約５０～６０℃での２×ＳＳＣ中での１回以上の洗浄が挙げられる。上記に記載された数値、例えば６５～７０℃又は４２～５０℃の中間の範囲も本開示に包含されることが意図される。特定の実施形態では、ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４及び１．２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）をハイブリダイゼーション緩衝液及び洗浄緩衝液中でＳＳＣ（１×ＳＳＰＥは、０．１５ＭのＮａＣｌ及び１５ｍＭのクエン酸ナトリウムである）と置き換えることができ；洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後にそれぞれ１５分間実施する。長さが５０塩基対未満となることが予想されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの溶融温度（Ｔｍ）より５～１０℃低くなければならず、ここで、Ｔｍは、下記の式に従って求められる。長さが１８塩基対未満のハイブリッドの場合、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）である。長さが１８～４９塩基対のハイブリッドの場合、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃ％）－（６００／Ｎ）（式中、Ｎは、ハイブリッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣの場合には［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ））である。ブロッキング剤（例えば、ＢＳＡ又はサケ若しくはニシン精子キャリアＤＮＡ）、洗剤（例えば、ＳＤＳ）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、フィコール、ＰＶＰ等を含むが、それらに限定されない追加の試薬をハイブリダイゼーション緩衝液及び／又は洗浄緩衝液に添加して、膜、例えばニトロセルロース膜又はナイロン膜に核酸分子が非特異的にハイブリダイズすることを低減させ得ることも当業者に認識されるであろう。ナイロン膜を使用する場合、特に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の追加の非限定的な例は、約６５℃での０．２５～０．５ＭのＮａＨ２ＰＯ４、７％のＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、その後の６５℃での０．０２ＭのＮａＨ２ＰＯ４、１％のＳＤＳ中又は代わりに０．２×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ中での１回以上の洗浄である（例えば、Ｃｈｕｒｃｈ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ，１９８４を参照されたい）。

従って、上記で概説したように、本開示の特定の実施形態は、天然ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含む糸状菌細胞の変異菌株に関する。本明細書で使用される「改変」及び「遺伝子改変」という用語は、互換的に使用され、（ａ）遺伝子内の１つ以上のヌクレオチドの導入、置換若しくは除去又は遺伝子の転写若しくは翻訳に必要とされる調節エレメント内の１つ以上のヌクレオチドの導入、置換若しくは除去、（ｂ）遺伝子破壊、（ｃ）遺伝子変換、（ｄ）遺伝子欠失、（ｅ）遺伝子のダウンレギュレーション（例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）（ｆ）特異的突然変異誘発（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した突然変異誘発を含むが、それらに限定されない）、及び／又は（ｇ）本明細書に開示した任意の１つ以上の遺伝子のランダム突然変異誘発が挙げられるが、それらに限定されない。

本明細書で使用される、遺伝子改変を含む糸状菌の変異菌株には、本明細書で開示される天然ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変が含まれるが、それらに限定されない。従って、以下でより詳細に記載するように、様々な分子生物学的方法がよく知られており、当業者であれば、糸状菌細胞のそのような変異菌株を生成／構築するために利用することができる。

本明細書で使用される「タンパク質をコードする遺伝子内の１つ以上のヌクレオチドの導入、置換又は除去」では、そのような遺伝子改変には、遺伝子のコード配列（即ちエキソン）及び非コード介在（イントロン）配列が含まれる。

本明細書で使用される「遺伝子の破壊」、「遺伝子破壊」、「遺伝子の不活性化」及び「遺伝子不活性化」は、互換的に使用され、標的遺伝子を実質的に破壊／不活性化する任意の遺伝子改変を広範に指す。例示的な遺伝子破壊方法には、限定されないが、ポリペプチドコード配列（ＣＤＳ）、プロモーター、エンハンサー若しくは別の調節エレメントを含む遺伝子の任意の部分の完全若しくは部分的欠失又はそれらの突然変異誘発が含まれ、ここで、突然変異誘発は、標的遺伝子を破壊／不活性化し、機能性遺伝子産物の発現／産生を実質的に減少又は防止する、置換、挿入、欠失、逆位並びにそれらの任意の組み合わせ及びそれらの変形形態を包含する。本開示の特定の実施形態では、そのような遺伝子破壊により、コードされたｌｏｖ遺伝子産物を宿主細胞が発現／産生することが妨げられる。

特定の実施形態では、天然ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子、ポリヌクレオチド又は核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）遺伝子編集、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ編集（ＴＡＬＥＮ）、ホーミング（メガ）ヌクレアーゼ編集等の確立された遺伝子編集技術を使用して遺伝子改変される。

他の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、遺伝子変換のプロセスによって構築（即ち遺伝子改変）される（例えば、Ｉｇｌｅｓｉａｓ ａｎｄ Ｔｒａｕｔｎｅｒ，１９８３を参照されたい）。

他の実施形態では、本開示の真菌細胞によって発現／産生した目的タンパク質（例えば、内在性ＰＯＩ又は異種ＰＯＩ）は、タンパク質移動／移動度（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、質量分析法、ＨＰＬＣ、サイズ排除、超遠心分離沈降速度分析、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、蛍光タグ、エピトープタグ、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＲＦＰ等）キメラ／ハイブリッド等を含むが、それらに限定されないタンパク質定量法、遺伝子転写法、ｍＲＮＡ翻訳法等によって検出、測定、アッセイ等される。

本明細書で使用される、機能的及び／又は構造的に類似するタンパク質は、「関連タンパク質」であると見なされる。そのような関連タンパク質は、属及び／若しくは種が異なる生物又は異なる分類の生物（例えば、細菌及び真菌）に由来し得る。関連タンパク質は、一次配列分析によって決定されるか、二次若しくは三次構造分析によって決定されるか、又は免疫学的交差反応性によって決定される相同体及び／又はオーソログを更に包含する。

本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、コード配列又は機能性ＲＮＡの発現を制御できる核酸配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’（下流）に位置する。プロモーターは、それらの全体が天然遺伝子に由来し得るか、若しくは天然に見られる異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成され得るか、又は合成核酸セグメントを含み得る。異なるプロモーターが異なる細胞型において、又は異なる発生段階において、又は異なる環境若しくは生理的条件に応答して遺伝子の発現を誘導し得ることは、当業者に理解されている。多くの細胞型で遺伝子の発現を最も多く引き起こすプロモーターは、一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれている。更に、殆どの場合、調節配列の正確な境界が完全に明らかになっていないため、異なる長さのＤＮＡ断片が同じプロモーター活性を有し得ることが認識されている。

本明細書で使用される「作動可能に連結された」という用語は、一方の機能が他方に影響を及ぼすような、単一核酸断片上での核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合（即ちそのコード配列がプロモーターの転写制御下にある場合）、プロモーターは、コード配列（例えば、ＯＲＦ）に作動可能に連結されている。コード配列は、センス又はアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結させることができる。核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、「作動可能に連結されて」いる。例えば、分泌リーダー（即ちシグナルペプチド）をコードするＤＮＡがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現している場合、分泌リーダーをコードするＤＮＡは、そのポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されている。プロモーター又はエンハンサーが配列の転写に影響を及ぼす場合、プロモーター又はエンハンサーは、コード配列に作動可能に連結されているか；又はリボソーム結合部位が翻訳を促進するように配置されている場合、リボソーム結合部位は、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結された」は、連結されるＤＮＡ配列が隣接していることを意味し、分泌リーダーの場合、隣接し且つリーディング相にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接している必要はない。連結は、便宜的な制限部位でのライゲーションによって行われる。そのような部位が存在しない場合、従来の手法に従って合成オリゴヌクレオチドのアダプター又はリンカーを使用する。

本明細書で定義されるように、「好適な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内又はその下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくはＲＮＡ安定性又は翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステムループ構造が含まれ得る。

本明細書で定義されるように、「導入する」という用語は、少なくとも１つのポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又はその遺伝子若しくはそのベクターを「真菌細胞中に導入する」などの語句に使用される場合、プロトプラスト融合、天然若しくは人工形質転換（例えば、塩化カルシウム、エレクトロポレーション）、形質導入、形質移入等が挙げられるが、これらに限定されないポリヌクレオチドを細胞中に導入するための当技術分野で公知の方法を含む。

本明細書で使用される「形質転換された」又は「形質転換」は、細胞が組換えＤＮＡ技術を使用して形質転換されていることを意味する。形質転換は、典型的には、１つ以上のヌクレオチド配列（例えば、ポリヌクレオチド、ＯＲＦ又は遺伝子）を細胞に挿入することによって生じる。挿入されるヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列（即ち形質転換する細胞中に天然には存在しない配列）であり得る。

本明細書で使用される「形質転換」は、ＤＮＡが染色体組み込み体又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、外来性ＤＮＡを宿主細胞に導入することを指す。本明細書で使用される「形質転換ＤＮＡ」、「形質転換配列」及び「ＤＮＡ構築物」は、配列を宿主細胞内に導入するために使用されるＤＮＡを指す。このＤＮＡは、ＰＣＲ又は任意の他の好適な技術によってインビトロで生成することができる。いくつかの実施形態では、形質転換ＤＮＡは、入来配列を含むが、他の実施形態では、形質転換ＤＮＡは、ホモロジーボックスに隣接した入来配列を更に含む。更に別の実施形態では、形質転換ＤＮＡは、末端に付加された他の非相同配列（即ちスタッファー配列又は隣接配列）を含む。例えば、ベクターへの挿入などのように、末端を閉じて、形質転換ＤＮＡが閉環を形成するようにし得る。

本明細書で使用される「入来配列」は、真菌細胞染色体内に導入されるＤＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、入来配列は、ＤＮＡ構築物の一部である。他の実施形態では、入来配列は、１種以上の目的タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、入来配列は、形質転換対象の細胞のゲノム内に既に存在しても又はしなくてもよい（即ち相同配列又は非相同配列であり得る）配列を含む。いくつかの実施形態では、入来配列は、１種以上の目的タンパク質、遺伝子及び／又は突然変異若しくは改変遺伝子をコードする。代替的な実施形態では、入来配列は、機能性野生型遺伝子若しくはオペロン、機能性変異遺伝子若しくはオペロン又は非機能性遺伝子若しくはオペロンをコードする。いくつかの実施形態では、入来配列は、遺伝子の機能を破壊するために遺伝子内に挿入される非機能性配列である。別の実施形態では、入来配列は、選択マーカーを含む。更なる実施形態では、入来配列は、２つのホモロジーボックスを含む。

本明細書で使用される「ホモロジーボックス」は、真菌細胞染色体内の配列と相同な核酸配列を指す。より具体的には、ホモロジーボックスは、本発明に従って欠失、破壊、不活性化、ダウンレギュレートされる等の遺伝子又は遺伝子の一部の直接隣接するコード領域と約８０～１００％の配列同一性、約９０～１００％の配列同一性又は約９５～１００％の配列同一性を有する上流又は下流領域である。これらの配列は、真菌細胞染色体内にＤＮＡ構築物が組み込まれる箇所を指示し、入来配列に置換される真菌細胞染色体の部位を指示する。本開示を限定することを意図するものではないが、ホモロジーボックスには、約１塩基対（ｂｐ）～２００キロ塩基（ｋｂ）が含まれ得る。好ましくは、ホモロジーボックスは、約１ｂｐ～１０．０ｋｂ；１ｂｐ～５．０ｋｂ；１ｂｐ～２．５ｋｂ；１ｂｐ～１．０ｋｂ及び０．２５ｋｂ～２．５ｋｂを含む。ホモロジーボックスは、約１０．０ｋｂ、５．０ｋｂ、２．５ｋｂ、２．０ｋｂ、１．５ｋｂ、１．０ｋｂ、０．５ｋｂ、０．２５ｋｂ及び０．１ｋｂも含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝子のコード領域に直接隣接する核酸配列を含むホモロジーボックスに選択マーカーの５’及び３’末端が隣接している。

本明細書で使用される「選択マーカーをコードするヌクレオチド配列」という用語は、宿主細胞内で発現することができ、選択マーカーの発現により、発現した遺伝子を含有する細胞に、対応する選択剤の存在下又は必須栄養素の欠如下で増殖する能力が付与されるヌクレオチド配列を指す。

本明細書で使用される「選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ）」及び「選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍａｒｋｅｒ）」という用語は、宿主細胞内で発現することができる核酸（例えば、遺伝子）を指し、これによりベクターを含有するそれらの宿主を容易に選択することが可能となる。このような選択マーカーの例としては、抗菌剤が挙げられるが、これに限定されない。従って、「選択マーカー」という用語は、宿主細胞が目的の入来ＤＮＡを取り込んだか、又は何らかの他の反応が生じた徴候を示す遺伝子を指す。典型的には、選択マーカーは、形質転換中に任意の外来性配列を受け入れなかった細胞と、外来性ＤＮＡを含有する細胞とを区別することを可能にするために、抗菌剤耐性又は代謝有利性を宿主細胞に付与する遺伝子である。

本明細書で定義されるように、宿主細胞「ゲノム」、真菌細胞「ゲノム」又は糸状菌細胞「ゲノム」には、染色体遺伝子及び染色体外遺伝子が含まれる。

本明細書で使用される「プラスミド」、「ベクター」及び「カセット」という用語は、多くの場合、典型的に細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を運び、通常、環状の二本鎖ＤＮＡ分子の形態である染色体外エレメントを指す。そのようなエレメントは、多数のヌクレオチド配列が、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片及びＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列と共に細胞内に導入できる固有の構造物に接合又は再結合されている任意の起源に由来する自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列、線状若しくは環状の一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。

本明細書で使用される「ベクター」という用語は、細胞内で複製（増殖）することができ、新規の遺伝子又はＤＮＡセグメント（例えば、「入来配列」）を細胞中に運ぶことができる任意の核酸を指す。従って、この用語は、異なる宿主細胞間における移行のために設計された核酸構築物を指す。ベクターとしては、「エピソーム」である（即ち自律的に複製する）か、又は宿主細胞の染色体内に組み込むことができる、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、プラスミド、ファージミド、トランスポゾン及びＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、ＰＬＡＣ（植物人工染色体）等の人工染色体が挙げられる。

本明細書で使用される「形質転換カセット」は、遺伝子（又はそのＯＲＦ）を含み、その遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を促進するエレメントを有する特異的ベクターを指す。

本明細書で使用される「発現ベクター」は、細胞内に異種ＤＮＡを組み込んで発現させる能力を有するベクターを指す。多数の原核生物及び真核生物の発現ベクターが市販されており、当業者に公知である。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。

本明細書で使用される「発現カセット」及び「発現ベクター」という用語は、標的細胞中の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて、組換え又は合成的に生成される核酸構築物を指す（即ち、これらは、上記に記載したようなベクター又はベクターエレメントである）。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ、ウイルス又は核酸断片内に組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写対象の核酸配列及びプロモーターが含まれる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ構築物には、標的細胞内の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントも含まれる。特定の実施形態では、本開示のＤＮＡ構築物は、本明細書に定義されるような選択マーカー及び不活性化染色体セグメント又は遺伝子セグメント又はＤＮＡセグメントを含む。

本明細書で使用される「標的化ベクター」は、標的化ベクターが形質転換される宿主細胞の染色体内の領域に相同なポリヌクレオチド配列を含み、その領域で相同組換えを促進することができるベクターである。例えば、標的化ベクターは、相同組換えによって宿主細胞の染色体に遺伝子改変を導入するのに利用される。いくつかの実施形態では、標的化ベクターは、例えば、末端に付加された他の非相同配列（即ちスタッファー配列又は隣接配列）を含む。例えば、ベクターへの挿入などのように、末端を閉じて、標的化ベクターが閉環を形成するようにし得る。

本明細書で使用される「タンパク質生産性が増強された表現型」を含む変異細胞（又は菌株）としては、増強／増加した容積生産性を含む変異細胞（又は菌株）、増強／増加した炭素変換効率を含む変異細胞（又は菌株）、増強／増加したタンパク質収率を含む変異細胞（又は菌株）、増強／増加した比タンパク質生産性を含む変異細胞（又は菌株）等が挙げられるが、それらに限定されない。例えば、特定の実施形態では、タンパク質生産性が増強された表現型を含む変異細胞又は菌株は、（親菌株に対して）供給糖類１ｇ当たり少なくとも０．１％以上の総タンパク質（ｇ）を発現／産生し、ここで、供給糖類は、産生期中（即ち供給開始後）に発酵槽に添加された糖の質量によって表示することができる。

本明細書で定義されるように、「タンパク質生産性が増強された表現型」及び「タンパク質生産性が増加した表現型」という語句は、互換的に使用することができる。

本明細書で使用される、改変（変異／娘）細胞に対する未改変（親）細胞における「タンパク質生産性が増強／増加した表現型」について述べるとき、「親」及び「変異」細胞を同じ条件（例えば、培地、温度、ｐＨ等などの同じ条件）下で増殖／培養／発酵することが理解されるであろう。同様に、改変（変異／娘）細胞における同一の目的タンパク質（ＰＯＩ）の「発現／産生」に対する未改変（変異／娘）細胞におけるＰＯＩの「発現／産生」について述べるとき、「親」及び「変異」細胞を本質的に同じ条件（例えば、培地、温度、ｐＨ等などの同じ条件）下で増殖／培養／発酵することが理解されるであろう。

本明細書で使用される「好気性発酵」は、酸素の存在下における増殖を指す。

本明細書で使用される「ブロス」、「細胞ブロス」、「発酵ブロス」及び／又は「培養ブロス」という用語は、互換的に使用され、液体（深部）培養中の（ｉ）発酵（培養）培地、及び（ｉｉ）細胞をまとめて指す。

本明細書で使用される「細胞集団」という用語は、液体（深部）培養中に存在する細胞成分（インタクト細胞及び溶解細胞を含む）を指す。細胞集団は、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）又は湿潤細胞重量（ＷＣＷ）で表すことができる。

ＩＩ．高い培養温度でタンパク質生産性が増強された表現型を含む真菌株
実施例の項で下記に一般的に記載及び説明するように、本出願人は、選択的条件下でトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のＴ４という名称の全セルラーゼ菌株を連続的に増殖し、高温でタンパク質を産生することが可能な（即ち比生産性（Ｑｐ）に悪影響を及ぼすことなく；例えば、実施例１を参照されたい）これらの変異菌株を同定して単離した。より具体的には、２５℃での親Ｔ４菌株に対して２８℃で同様の比生産性を有する（表１）「Ｔ４－Ｅ１」という名称の変異Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株をそのような選択的条件下で同定して単離した（実施例２）。本出願人は、Ｔ４－Ｅ１菌株の変異遺伝子を同定し、コード化タンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号２；ＰＩＤ：１２０４８２）には、ＧＥＦ１タンパク質ドメイン（配列番号５）と配列相同性を有する領域が含まれている。実施例２に詳細に記載されているように、Ｔ４－Ｅ１菌株における変異は、グルタミン酸コドン（Ｇｌｕ；アミノ酸１，２４５位）が未成熟終止コドンと置き換わっており、それにより「ＧＥＦ１ドメイン」の先頭の近傍にある（ＧＥＦ１）タンパク質が切断される（例えば、図３Ａの天然配列に対して図３ＢのＣ末端切断型配列を参照されたい）。

本開示の実施例３に記載されるように、本出願人は、Ｔ４親菌株に由来する変異（改変）トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株（名称は「Ｔ４－ΔＲｈｏ＃２２Ｄ」）を更に構築し、変異Ｔ４－ΔＲｈｏ＃２２Ｄ菌株は、Ｃａｓ９切断部位（ＴＳ３）に導入されたｐｙｒ２マーカー遺伝子を含むことにより、ＧＥＦ１コード配列が破壊されている。例えば、野生型（親）Ｔ４菌株、変異Ｔ４－Ｅ１菌株及び構築された変異Ｔ４－ΔＲｈｏ＃２２Ｄ菌株の発酵（培養）能力が表１に示され、ここで、変異Ｔ４－Ｅ１菌株及び構築された変異Ｔ４－ΔＲｈｏ＃２２Ｄ菌株は、親Ｔ４菌株の２５℃での総タンパク質産生速度に対して２８℃での総タンパク質産生速度が向上したことを示している。

実施例４に更に記載されているように、本出願人は、Ｓ．ココスポラム（Ｓ．ｃｏｃｃｏｓｐｏｒｕｍ）ＤＸＳＴ（ＳＴＣＥ１）エンドグルカナーゼをコードする遺伝子のコピーで形質転換したトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種産生菌株を構築した。より具体的には、「ｔ－ＡＴＶ８４」という名称の親トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ＤＸＳＴ産生菌株を、Ｓ．ココスポラム（Ｓ．ｃｏｃｃｏｓｐｏｒｕｍ）ＤＸＳＴエンドグルカナーゼをコードし、更にＣＢＨＩ、ＣＢＨＩＩ、ＥＧＩ及びＥＧＩＩタンパク質をコードする天然のセルラーゼ遺伝子の欠失を含む遺伝子のコピーで形質転換した。同様に、「ｔ－ＡＷＣ８８」という名称の変異（改変）トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ＤＸＳＴ産生菌株は、ｔ－ＡＴＶ８４菌株に由来したものであり、ＧＥＦ１遺伝子の破壊の導入を更に含む。例えば、表２に示されるように、破壊されたＧＥＦ１遺伝子を含む変異トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株（ｔ－ＡＷＣ８８）は、天然ＧＥＦ１遺伝子を含む親菌株（ｔ－ＡＴＶ８４）によって２５℃で産生されたＤＸＳＴエンドグルカナーゼの量に対して、２５℃、２６℃及び２７℃で産生されるＤＸＳＴエンドグルカナーゼの量の方が多いことを示している。

ＩＩＩ．分子生物学
上記で概説したように、本開示の特定の実施形態は、タンパク質生産性が増強された表現型を含む改変糸状菌株に関する。特定の好ましい実施形態では、改変（変異）糸状菌株は、高い発酵（培養）温度でタンパク質生産性が増強された表現型を含んでいる。別の実施形態では、本開示は、エタノール生産性が増強された表現型を含む改変酵母菌株に関する。特定の好ましい実施形態では、改変（変異）酵母菌株は、高い発酵（培養）温度でエタノール生産性が増強された表現型を含んでいる。

従って、本開示の特定の他の実施形態は、分子生物学、遺伝子改変、ポリヌクレオチド、遺伝子、ＯＲＦ、ベクター、発現カセット等に関する。特定の実施形態では、本開示は、目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする遺伝子又はＯＲＦを含む組換え核酸（ポリヌクレオチド）に関する。特定の実施形態では、組換え核酸（ポリヌクレオチド）は、ＰＯＩをコードするポリヌクレオチドの発現カセットを含む。

特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、１つ以上の選択マーカーを含む。糸状菌に使用される選択マーカーとしては、ａｌｓｌ、ａｍｄＳ、ｈｙｇＲ、ｐｙｒ２、ｐｙｒ４、ｐｙｒＧ、ｓｕｃＡ、ブレオマイシン耐性マーカー、ブラストサイジン耐性マーカー、ピリチアミン耐性マーカー、クロリムロンエチル耐性マーカー、ネオマイシン耐性マーカー、アデニン経路遺伝子、トリプトファン経路遺伝子、チミジンキナーゼマーカー等が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、選択マーカーは、ｐｙｒ２であり、その組成物及び使用方法は、国際公開第２０１１／１５３４４９号パンフレットで概説されている。

本開示の真菌宿主細胞を形質転換するために、糸状菌の形質転換及び真菌の培養のための標準的な手法（これらは、当業者によく知られている）が使用される。従って、真菌宿主細胞へのＤＮＡ構築物又はベクターの導入法としては、形質転換、エレクトロポレーション、核マイクロインジェクション、形質導入、形質移入（例えば、リポフェクション媒介及びＤＥＡＥ－デキストリン媒介形質移入）、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション、ＤＮＡ被覆微粒子を用いる高速銃、遺伝子銃又はバイオリスティック形質転換、プロトプラスト融合等の手法が挙げられる。一般的な形質転換手法は、当技術分野で公知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１及び２０１２並びにＣａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい）。トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）における異種タンパク質の発現は、例えば、米国特許第６，０２２，７２５号明細書；同第６，２６８，３２８号明細書；Ｈａｒｋｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１及びＨａｒｋｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９に記載されている。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）菌株の形質転換については、Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）も参照されたい。

一般に、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種の形質転換は、典型的には、１０^５～１０^７／ｍＬ、特に２×１０^６／ｍＬの密度で透過性処理を施したプロトプラスト又は細胞を使用する。適切な溶液中（例えば、１．２Ｍのソルビトール及び５０ｍＭのＣａＣｌ_２）のこれらのプロトプラスト又は細胞の１００μＬの容量を所望のＤＮＡと混合する。一般に、取り込み溶液に高濃度のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が添加される。形質転換を促進するために、取り込み溶液にジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム等の添加剤も添加し得る。他の真菌宿主細胞に同様の処置を使用することができる（例えば、その両方が参照により組み込まれる米国特許第６，０２２，７２５号明細書及び米国特許第６，２６８，３２８号明細書を参照されたい）。

従って、本開示の方法及び組成物は、一般に、組換え遺伝子の分野におけるルーチン手法に依存する。例えば、特定の実施形態では、目的タンパク質をコードする異種遺伝子又はＯＲＦが糸状菌（宿主）細胞に導入される。特定の実施形態では、異種遺伝子又はＯＲＦは、典型的には、複製及び／又は発現のために糸状菌（宿主）細胞に形質転換される前に中間ベクターにクローニングされる。これらの中間ベクターは、例えば、プラスミド又はシャトルベクターなどの原核生物ベクターであり得る。特定の実施形態では、異種遺伝子又はＯＲＦの発現は、その天然プロモーターの制御下にある。他の実施形態では、異種遺伝子又はＯＲＦの発現は、異種構成的プロモーター又は異種誘導性プロモーターであり得る異種プロモーターの制御下に置かれる。

当業者は、１つ以上のヌクレオチドを交換、置換、付加又は脱離することにより、その機能を変化させずに天然（未変性）のプロモーターを改変できることを認識している。本発明の実施は、プロモーターに対するそのような改変を包含するが、それらに束縛されるものではない。

発現ベクターは、典型的には、異種配列の発現に必要な全ての追加のエレメントを含む転写ユニット又は「発現カセット」を含有する。例えば、典型的な発現カセットは、目的タンパク質をコードする異種核酸配列に作動可能に連結された５’プロモーターを含有し、転写物、リボソーム結合部位及び翻訳終結配列の効率的なポリアデニル化に必要な配列シグナルを更に含み得る。カセットの追加のエレメントは、エンハンサーを含み得、ゲノムＤＮＡが構造遺伝子として使用される場合、機能性スプライスドナー部位及びアクセプター部位を有するイントロンを含み得る。

発現カセットは、プロモーター配列に加えて、効果的な終結をもたらすために構造遺伝子の下流に転写終結領域も含み得る。終結領域は、プロモーター配列と同一の遺伝子から得るか又は異なる遺伝子から得ることができる。本発明では、任意の真菌のターミネーターが機能すると考えられるが、好ましいターミネーターとしては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）のｃｂｈＩ遺伝子由来のターミネーター、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のｔｒｐＣ遺伝子由来のターミネーター（Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｍｕｌｌａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８５）及びアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）又はアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のグルコアミラーゼ遺伝子（Ｎｕｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｂｏｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４）が挙げられる。

遺伝子情報を細胞に輸送するのに使用される特定の発現ベクターは、特に重要ではない。真核細胞又は原核細胞における発現に使用される任意の従来のベクターを使用することができる。標準的な細菌発現ベクターとしては、バクテリオファージλ及びＭ１３並びにｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄなどのプラスミド並びに融合発現系、例えばＭＢＰ、ＧＳＴ及びＬａｃＺが挙げられる。便宜的な単離方法を提供するために、組換えタンパク質にエピトープタグ、例えば、ｃ－ｍｙｃを添加することもできる。

発現ベクター中に含むことができるエレメントは、レプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子又は異種配列の挿入を可能にするためのプラスミドの非必須領域における固有の制限部位でもあり得る。当技術分野において公知の多くの耐性遺伝子の何れも好適であり得るため、選択された特定の抗生物質耐性遺伝子は確、定的なものではない。原核生物配列は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）におけるＤＮＡの複製又は組み込みを妨害しないように選択することが好ましい。

本発明の形質転換方法により、形質転換ベクターの全部又は一部を糸状菌ゲノムに安定的に組み込むことが結果として可能となる。しかしながら、自己複製する染色体外形質転換ベクターのままで維持されることになる形質転換も想定される。大量の異種タンパク質を発現するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）細胞菌株を産生するために、多くの標準的な形質移入方法を使用することが可能であり、そのようにして外来ヌクレオチド配列を真菌宿主細胞に導入するための任意の公知の手順を使用し得る。これらには、リン酸カルシウム形質移入、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、バイオリスティック法、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウイルスベクター及びクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は他の外来遺伝子物質を宿主細胞に導入するための他の公知の方法の何れかの使用が挙げられる。米国特許第６，２５５，１１５号明細書に記載されているようなアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介トランスフェクション法も有用である。

発現ベクターが細胞内に導入された後、形質転換細胞を遺伝子の発現に好都合な条件下で培養する。本明細書で記載されるように、大量のバッチの形質転換細胞を培養することができる。最終的に、標準的な手法を用いて培養物からタンパク質産物を回収する。従って、本明細書の開示により、特に本明細書に記載される高い発酵（培養）温度において、所望の目的タンパク質の発現と、所望の目的タンパク質の増強された生産性とが提供される。

特定の他の実施形態では、本開示は、タンパク質生産性が増強された表現型を含む遺伝子改変糸状菌株（細胞）に関する。特定の実施形態では、本開示の改変真菌株は、高い発酵温度でタンパク質生産性が増強された表現型を含むものであった。例えば、特定の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変であって、（ａ）ＧＥＦ１遺伝子（若しくはそのＯＲＦ）内の１つ以上のヌクレオチドの導入、置換若しくは除去又はＧＥＦ１遺伝子（若しくはそのＯＲＦ）の転写若しくは翻訳に必要とされる調節エレメント内の１つ以上のヌクレオチドの導入、置換若しくは除去、（ｂ）遺伝子破壊、（ｃ）遺伝子変換、（ｄ）遺伝子欠失、（ｅ）遺伝子のダウンレギュレーション、（ｆ）特異的突然変異誘発、及び／又は（ｇ）配列番号２との配列同一性を含むＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子のランダム突然変異誘発を含むが、それらに限定されない遺伝子改変を含む。

従って、特定の実施形態では、遺伝子改変を含む糸状菌の変異菌株は、ＧＥＦ１タンパク質の発現／産生を排除するような遺伝子欠失によって構築される。

他の実施形態では、遺伝子改変を含む糸状菌の変異菌株は、天然ＧＥＦ１タンパク質の発現／産生を排除するような部分的遺伝子欠失又は遺伝子破壊によって構築される。例えば、実施例３で下記に説明されているように（図３Ｂ）、親糸状菌株の天然ＧＥＦ１遺伝子の不活性化は、未成熟終止コドンを導入することにより（即ちそのＣ末端によってＧＥＦ１タンパク質が切断される；配列番号４）、２５℃で発酵されたときに親細胞に対してタンパク質生産性が増強された表現型を含む変異（娘）菌株がもたらされた。より具体的には、親（Ｔ４）菌株及び娘（Ｔ４－ΔＲｈｏ ＃２２Ｄ）菌株を高い発酵温度（２８℃）で発酵させると、変異（娘）菌株は、親菌株に対してタンパク質生産性が増加した表現型を示した（表１、タンパク質産生速度）。

従って、特定の実施形態では、改変糸状菌株は、ＧＥＦ１遺伝子の部分的欠失を含み、ここで、部分的欠失は、ＧＥＦ１遺伝子のコード配列の何れかの部分の部分的欠失を含み、そのような変異菌株は、タンパク質生産性が増強された表現型を含む。従って、特定の他の実施形態では、そのような変異菌株は、ＧＥＦ１タンパク質を発現／産生しないか、又はそのような変異菌株は、親菌株に対して減少した量のＧＥＦ１タンパク質を発現／産生する。

従って、本明細書で概説し、上記に記載したように、当業者であれば、本明細書で開示される１つ以上の核酸配列及び／又はタンパク質配列を参照することにより、容易に１つ以上の遺伝子改変を実行し、これらの変異糸状菌株を構築することができる。

例えば、遺伝子欠失手法によって遺伝子の部分的又は完全な除去が可能になり、それによりタンパク質の発現／産生を排除するか若しくは減少させ、且つ／又はコードされたタンパク質（例えば、ＧＥＦ１）の発現／産生を排除するか若しくは減少させる。そのような方法では、遺伝子の欠失は、遺伝子に隣接する５’及び３’領域を近接して含有するように構築された組み込みプラスミド／ベクターを使用する相同組換えによって達成することができる。隣接する５’及び３’領域は、例えば、プラスミドを細胞に組み込むことができるように、選択マーカーを伴って組み込みプラスミド／ベクター上で糸状菌細胞内に導入され得る。

他の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、タンパク質（例えば、ＧＥＦ１）をコードする遺伝子を破壊又は不活性化する遺伝子改変を含む。遺伝子破壊／不活性化の例示的な方法には、ポリペプチドコード配列（ＣＤＳ）、プロモーター、エンハンサー又は別の調節エレメントを含む遺伝子の何れかの部分（例えば、図１～図３を参照されたい）を破壊することが含まれ、その破壊としては、置換、挿入、欠失、逆位並びにそれらの組み合わせ及びそれらの変形形態が挙げられる。遺伝子破壊手法の非限定的な例としては、本開示の１つ以上の遺伝子内に、（例えば、ＧＥＦ１）遺伝子と相同な核酸断片を含有する組み込みプラスミドを挿入（組み込み）することが挙げられ、これにより重複領域間で相同性の領域と組み込み（挿入）ベクターのＤＮＡとの重複が生じることになる。特定の他の非限定的な例では、遺伝子破壊手法には、遺伝子（例えば、ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子）に、（例えば、ＧＥＦ１）遺伝子と相同な核酸断片を含有する組み込みプラスミドを挿入することが挙げられ、これにより重複領域間で相同性の領域と組み込み（挿入）ベクターのＤＮＡとの重複が生じることとなり、ここで、挿入されたベクターのＤＮＡにより、例えばＧＥＦ１遺伝子のプロモーターがＧＥＦ１タンパク質コード領域から分離されるか、又はＧＥＦ１遺伝子のコード配列若しくは非コード配列が中断（破壊）され、その結果としてタンパク質生産性が増強された表現型がもたらされる。従って、破壊構築物は、ＧＥＦ１遺伝子と相同な５’及び３’領域を伴う選択マーカー遺伝子（例えば、ｐｙｒ２）であり得る。この選択マーカーにより、破壊遺伝子を含有する形質転換体を同定することができる。従って、特定の実施形態では、遺伝子破壊には、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、未翻訳領域（ＵＴＲ）、コドン変化等などの遺伝子の制御エレメントの改変が含まれる。

他の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、遺伝子又はそれらの転写若しくは翻訳に必要とされる調節エレメント内の１つ以上のヌクレオチドを導入、置換又は除去することによって構築（即ち遺伝子改変）される。例えば、未成熟終止コドンの導入、開始コドンの除去又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のフレームシフトを生じさせるようにヌクレオチドを挿入又は除去し得る。そのような改変は、当技術分野の公知の方法に従い、部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ生成突然変異誘発によって実行することができる（例えば、Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｓｈｏｒｔｌｅ，１９８５；Ｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｓｈｉｍａｄａ，１９９６；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９及びＳａｒｋａｒ ａｎｄ Ｓｏｍｍｅｒ，１９９０を参照されたい）。

別の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、遺伝子変換のプロセスによって構築される（例えば、Ｉｇｌｅｓｉａｓ ａｎｄ Ｔｒａｕｔｎｅｒ，１９８３を参照されたい）。例えば、遺伝子変換法では、標的遺伝子に対応する核酸配列をインビトロで変異誘発して欠陥核酸配列を生成し、次いでこれを親細胞に形質転換して、欠陥遺伝子を含む変異細胞を生成する。相同組換えにより、欠陥核酸配列が内在性遺伝子に置換される。欠陥遺伝子又は欠陥遺伝子断片は、欠陥遺伝子を含有する形質転換体の選択に使用することができるマーカーもコードすることが望ましい場合がある。例えば、欠陥遺伝子は、選択マーカーを伴って非複製プラスミド又は温度感受性プラスミド上で導入することができる。プラスミドの組み込みについての選択は、プラスミド複製が可能でない条件下でマーカーを選択することによって実施される。遺伝子置換をもたらす第２の組換え事象についての選択は、選択マーカーが消失し、変異遺伝子が獲得されたかどうかについてコロニーを検査することによって実施される（Ｐｅｒｅｇｏ，１９９３）。

他の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、ＧＥＦ１遺伝子の核酸配列と相補的なヌクレオチド配列を使用して、確立されたアンチセンス（遺伝子サイレンシング）手法によって構築される（Ｐａｒｉｓｈ ａｎｄ Ｓｔｏｋｅｒ，１９９７）。より具体的には、糸状菌株による遺伝子の発現を、遺伝子の核酸配列に相補的である、細胞内で転写され、細胞内で産生されるｍＲＮＡにハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド配列を導入することによって減少（ダウンレギュレート）させるか又は排除することができる。このように、相補的なアンチセンスヌクレオチド配列がｍＲＮＡにハイブリダイズすることが可能な条件下では、翻訳されるタンパク質の量が減少するか又は排除される。そのようなアンチセンス法としては、以下に限定されないが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられ、これらの全ては、当業者によく知られているものである。

他の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、化学的突然変異誘発及び転座（例えば、Ｙｏｕｎｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３を参照されたい）を含むが、それらに限定されない、当技術分野でよく知られた方法を使用して、ランダム突然変異誘発又は特異的突然変異誘発によって構築される。遺伝子の改変は、親細胞に突然変異誘発を受けさせ、その中でＧＥＦ１遺伝子の発現が減少したか又は排除された変異細胞についてスクリーニングすることによって実施され得る。突然変異誘発は、特異的突然変異誘発又はランダム突然変異誘発であり得、例えば好適な物理的若しくは化学的突然変異誘発剤を使用することにより、好適なオリゴヌクレオチドを使用することにより又はＤＮＡ配列にＰＣＲ生成突然変異誘発を受けさせることにより実施され得る。更に、突然変異誘発は、これらの突然変異誘発法を任意に組み合わせて使用することにより実施され得る。本発明の目的に好適な物理的又は化学的な変異誘発剤の例としては、紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、Ｏ－メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸及びヌクレオチド類似体が挙げられる。そのような薬剤を使用する場合、変異誘発は、典型的には、好適な条件下において、選択した変異誘発剤の存在下で変異誘発対象の親細胞をインキュベートし、遺伝子の発現が減少したか又は発現しないことを示す変異細胞を選択することによって実施される。

特定の他の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、部位特異的な遺伝子編集技術によって構築される。例えば、特定の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、転写活性化因子様エンドヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ホーミング（メガ）エンドヌクレアーゼ等を使用することによって構築（即ち遺伝子改変）される。より具体的には、改変対象の遺伝子の一部（例えば、コード領域、非コード領域、リーダー配列、プロペプチド配列、シグナル配列、転写ターミネーター、転写活性化因子又はコード領域を発現させるために必要とされる他の調節エレメント）は、ＺＦＮ遺伝子編集、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集、ホーミング（メガ）エンドヌクレアーゼ等によって遺伝子改変が施され、それらの改変方法は、当業者によく知られており、利用可能である。

特定の他の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集によって構築される（例えば、本明細書の実施例を参照されたい）。より具体的には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによる真菌ゲノムを改変するための組成物及び方法は、当技術分野において記載され、よく知られているものである（例えば、ＰＣＴ出願国際公開第２０１６／１００５７１号パンフレット、同第２０１６／１００５６８号パンフレット、同第２０１６／１００２７２号パンフレット、同第２０１６／１００５６２号パンフレット等を参照されたい）。従って、ＤＮＡ上の標的配列にエンドヌクレアーゼを動員するガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９）又はガイドＤＮＡ（例えば、ＮｇＡｇｏ）の何れかと結合することでそれらの標的ＤＮＡを見つけ出す核酸誘導型エンドヌクレアーゼにより、ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子を破壊、欠失、突然変異又は別の方法で遺伝子改変することができ、ここで、エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ内に一本鎖切断又は二本鎖切断を生じさせることができる。この標的ＤＮＡ切断は、ＤＮＡ修復のための基質となり、提供された編集鋳型と再結合して遺伝子を破壊するか又は欠失させることができる。例えば、核酸誘導型エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９又はＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするコドン最適化遺伝子）は、糸状菌細胞内で活性なプロモーター及び糸状菌細胞内で活性なターミネーターに作動可能に連結されており、これにより糸状菌Ｃａｓ９発現カセットを作製する。同様に、目的遺伝子に固有の１つ以上の標的部位は、当業者により容易に同定される。

例えば、目的遺伝子内の標的部位に誘導するｇＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物を構築するために、可変標的ドメイン（ＶＴ）は、（ＰＡＭ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＴＧＧ）の５’である標的部位のヌクレオチドを含み、このヌクレオチドは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９に対するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ認識（ＣＥＲ）ドメインをコードするＤＮＡに融合されている。ＶＴドメインをコードするＤＮＡと、ＣＥＲドメインをコードするＤＮＡとを組み合わせることにより、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを生成する。従って、ｇＲＮＡのための糸状菌発現カセットは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを、糸状菌細胞内で活性なプロモーターと、糸状菌細胞内で活性なターミネーターとに作動可能に連結させることによって作製される。

特定の実施形態では、エンドヌクレアーゼによって誘導されたＤＮＡ切断は、入来配列を用いて修復／置換される。例えば、上記に記載したＣａｓ９発現カセット及びｇＲＮＡ発現カセットによって生じたＤＮＡ切断を正確に修復するために、ヌクレオチド編集鋳型を提供して、細胞のＤＮＡ修復機構が編集鋳型を利用できるようにする。例えば、標的遺伝子の約５００ｂｐの５’を標的遺伝子の約５００ｂｐの３’に融合させて編集鋳型を生成することができ、この鋳型は、ＲＧＥＮ（ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ）によって生じたＤＮＡ切断を修復するために糸状菌宿主の機構によって使用される。

Ｃａｓ９発現カセット、ｇＲＮＡ発現カセット及び編集鋳型は、多数の異なる方法（例えば、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション法、天然コンピテンス又は誘導コンピテンス）を使用して糸状菌細胞に共送達することができる。形質転換細胞は、順方向プライマー及び逆方向プライマーを用いて標的遺伝子座を増幅させることによるＰＣＲによってスクリーニングする。これらのプライマーにより、野生型遺伝子座又はＲＧＥＮによって編集された改変遺伝子座を増幅させることができる。次いで、シーケンシングプライマーを使用してこれらの断片を配列決定し、編集されたコロニーを同定する。

本開示のＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子を遺伝子改変することができる別の方法としては、目的遺伝子の発現レベルを変化させることによるものがある。例えば、そのようなヌクレオチド誘導型エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ欠陥変異体（例えば、Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａ、Ｎ８６３Ａ又はＣａｓ９ Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ）を使用して、標的遺伝子の転写を増強又は減弱させることによって遺伝子発現レベルを調節することができる。これらのＣａｓ９変異体は、タンパク質配列内に存在する全てのヌクレアーゼドメインに対しては不活性であるが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合活性を保持している（即ち、これらのＣａｓ９変異体は、同種標的部位に結合した場合、ＤＮＡの何れの鎖も切断することができない）。従って、ヌクレアーゼ欠陥タンパク質（即ちＣａｓ９変異体）は、糸状菌発現カセットとして発現させることができ、糸状菌ｇＲＮＡ発現カセットと結合すると、その結果としてＣａｓ９変異タンパク質が細胞内の特異的標的配列に誘導される。Ｃａｓ９（変異）タンパク質が特異的遺伝子標的部位に結合することにより、細胞のＤＮＡ上の転写機構の結合又は移動が遮断され、それにより産生される遺伝子産物の量を減少させることができる。従って、この方法を用いると、本明細書で開示される遺伝子の何れも、遺伝子発現を低下させるための標的となり得る。ＲＮＡｓｅｑなどの方法を使用することにより、ヌクレアーゼ欠陥Ｃａｓ９発現カセット及びｇＲＮＡ発現カセットを含有する細胞の遺伝子サイレンシングを観察することができる。

Ｖ．目的タンパク質
前項で手短に述べたように、本発明の菌株及び方法は、糸状菌の深部培養における商業的に重要なタンパク質の産生に利用されるものである。本開示の目的タンパク質（ＰＯＩ）は、任意の内在性タンパク質又は異種タンパク質であり得、それは、そのようなＰＯＩの変異体であり得る。タンパク質は、１つ以上のジスルフィド架橋を含有し得るか、又はその機能的形態が単量体若しくは多量体であるタンパク質である。即ち、タンパク質は、四次構造を有し、複数の同一（相同）又は非同一（異種）サブユニットから構成され、ここで、ＰＯＩ又はその変異ＰＯＩは、好ましくは、目的の特性を備えるタンパク質である。

特定の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、（未改変）親菌株に対して増加したタンパク質力価を示し、ここで、タンパク質力価は、１容積当たりのタンパク質の量（ｇ／Ｌ）として定義される。例えば、力価は、当技術分野において公知の方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、ブラッドフォードアッセイ、ＬＣ／ＭＳ等）によって測定することができる。従って、特定の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、未改変（親）細胞と比較して少なくとも約０．１％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％又は少なくとも約１０％以上のタンパク質力価の増加を含む。

特定の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、（未改変）親菌株に対して増加した容積生産性を示し、ここで、容積生産性は、全発酵時間（ｈ）当たりの呼び容積（Ｌ）当たりの発酵中に産生されたタンパク質の量（ｇ）として定義される。例えば、容積生産性は、当技術分野において公知の方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、ブラッドフォードアッセイ、ＬＣ／ＭＳ等）によって測定することができる。従って、特定の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、未改変（親）細胞と比較して少なくとも約０．１％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％又は少なくとも約１０％以上の容積生産性の増加を含む。

特定の他の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、（未改変）親菌株に対して増加した総タンパク質収率を示し、ここで、総タンパク質収率は、供給された炭水化物１ｇ当たりの産生されたタンパク質の量（ｇ）として定義される。従って、本明細書で使用する場合、総タンパク質収率（ｇ／ｇ）は、下記の式：
Ｙ_ｆ＝Ｔ_ｐ／Ｔ_ｃ

（式中、「Ｙ_ｆ」は、総タンパク質収率（ｇ／ｇ）であり、「Ｔ_ｐ」は、発酵中に産生された総タンパク質（ｇ）であり、「Ｔ_ｃ」は、発酵（バイオリアクター）作動中に供給された全炭水化物（ｇ）である）を用いて計算することができる。特定の実施形態では、改変菌株の総タンパク質収率における増加は、未改変（親）細胞と比較して少なくとも約０．１％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％又は少なくとも約１０％以上の増加となる。

総タンパク質収率は、例えば、総タンパク質中に取り込まれる、供給された炭素のパーセンテージ（％）として、炭素変換効率／炭素収率として記載することもできる。従って、特定の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、（未改変）親菌株に対して増加した炭素変換効率（例えば、総タンパク質中に取り込まれる、供給された炭素のパーセンテージ（％）における増加）を含む。特定の実施形態では、（即ち親菌株に対する）改変菌株の炭素変換効率における増加は、未改変（親）細胞と比較して少なくとも約０．１％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％又は少なくとも約１０％以上の増加となる。

特定の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、（未改変）親菌株に対して増加したＰＯＩの比生産性（Ｑｐ）を示す。例えば、比生産性（Ｑｐ）を検出することは、タンパク質の生産率を評価するのに好適な方法である。比生産性（Ｑｐ）は、下記の式：
「Ｑｐ＝ｇＰ／ｇＤＣＷ・ｈｒ」
（式中、「ｇＰ」は、タンク中に産生されるタンパク質のグラム数であり、「ｇＤＣＷ」は、タンク中の乾燥細胞重量（ＤＣＷ）のグラム数であり、「ｈｒ」は、産生時間及び増殖時間を含む接種時点からの発酵時間（時間）である）を用いて求めることができる。従って、特定の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、未改変（親）細胞と比較して少なくとも約０．１％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％又は少なくとも約１０％以上の比生産性（Ｑｐ）の増加を含む。

特定の実施形態では、ＰＯＩ又はその変異ＰＯＩは、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、α－グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド－β－グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンナナーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオール酸化酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。

特定の実施形態では、ＰＯＩ又はその変異ＰＯＩは、ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、ＥＣ５又はＥＣ６からなる群から選択される酵素（ＥＣ）番号から選択される。

例えば、特定の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ１．１０．３．２（例えば、ラッカーゼ）、ＥＣ１．１０．３．３（例えば、Ｌ－アスコルビン酸オキシダーゼ）、ＥＣ１．１．１．１（例えば、アルコール脱水素酵素）、ＥＣ１．１１．１．１０（例えば、クロライドペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．１７（例えば、ペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．１．２７（例えば、Ｌ－乳酸脱水素酵素）、ＥＣ１．１．１．４７（例えば、グルコース１－脱水素酵素）、ＥＣ１．１．３．Ｘ（例えば、グルコースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１０（例えば、ピラノースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１３．１１．Ｘ（例えば、ジオキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１３．１１．１２（例えば、リノール酸１３Ｓ－リポキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１．３．１３（例えば、アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ１．１４．１４．１（例えば、モノオキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１４．１８．１（例えば、モノフェノールモノオキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１５．１．１（例えば、スーパーオキシドジスムターゼ）、ＥＣ１．１．５．９（以前にはＥＣ１．１．９９．１０、例えばグルコース脱水素酵素）、ＥＣ１．１．９９．１８（例えば、セロビオース脱水素酵素）、ＥＣ１．１．９９．２９（例えば、ピラノース脱水素酵素）、ＥＣ１．２．１．Ｘ（例えば、脂肪酸還元酵素）、ＥＣ１．２．１．１０（例えば、アセトアルデヒド脱水素酵素）、ＥＣ１．５．３．Ｘ（例えば、フルクトシルアミン還元酵素）、ＥＣ１．８．１．Ｘ（例えば、ジスルフィド還元酵素）及びＥＣ１．８．３．２（例えば、チオールオキシダーゼ）から選択されるＥＣ１（酸化還元酵素）酵素を含むが、それらに限定されない酸化還元酵素である。

特定の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ２．３．２．１３（例えば、トランスグルタミナーゼ）、ＥＣ２．４．１．Ｘ（例えば、ヘキソシルトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．４０（例えば、アルテルナンスクラーゼ）、ＥＣ２．４．１．１８（例えば、１，４α－グルカン分枝酵素）、ＥＣ２．４．１．１９（例えば、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．２（例えば、デキストリンデキストラナーゼ）、ＥＣ２．４．１．２０（例えば、セロビオースホスホリラーゼ）、ＥＣ２．４．１．２５（例えば、４－α－グルカノトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．３３３（例えば、１，２－β－オリゴグルカンリントランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．４（例えば、アミロスクラーゼ）、ＥＣ２．４．１．５（例えば、デキストランスクラーゼ）、ＥＣ２．４．１．６９（例えば、ガラクトシド２－α－Ｌ－フコシルトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．９（例えば、イヌロスクラーゼ）、ＥＣ２．７．１．１７（例えば、キシルロキナーゼ）、ＥＣ２．７．７．８９（以前にはＥＣ３．１．４．１５、例えば［グルタミンシンテターゼ］－アデニリル－Ｌ－チロシンホスホリラーゼ）、ＥＣ２．７．９．４（例えば、αグルカンキナーゼ）及びＥＣ２．７．９．５（例えば、ホスホグルカンキナーゼ）から選択されるＥＣ２（トランスフェラーゼ）酵素を含むが、それらに限定されないトランスフェラーゼ酵素である。

他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ３．１．Ｘ．Ｘ（例えば、エステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．１（例えば、ペクチナーゼ）、ＥＣ３．１．１．１４（例えば、クロロフィラーゼ）、ＥＣ３．１．１．２０（例えば、タンナーゼ）、ＥＣ３．１．１．２３（例えば、グリセロールエステルアシルヒドロラーゼ）、ＥＣ３．１．１．２６（例えば、ガラクトリパーゼ）、ＥＣ３．１．１．３２（例えば、ホスホリパーゼＡ１）、ＥＣ３．１．１．４（例えば、ホスホリパーゼＡ２）、ＥＣ３．１．１．６（例えば、アセチルエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．７２（例えば、アセチルキシランエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．７３（例えば、フェルロイルエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．７４（例えば、クチナーゼ）、ＥＣ３．１．１．８６（例えば、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．８７（例えば、フモニシンＢ１エステラーゼ）、ＥＣ３．１．２６．５（例えば、リボヌクレアーゼＰ）、ＥＣ３．１．３．Ｘ（例えば、リン酸モノエステルヒドロラーゼ）、ＥＣ３．１．３０．１（例えば、アスペルギルスヌクレアーゼＳ１）、ＥＣ３．１．３０．２（例えば、セラチア・マルセッセンスヌクレアーゼ）、ＥＣ３．１．３．１（例えば、アルカリホスファターゼ）、ＥＣ３．１．３．２（例えば、酸性ホスファターゼ）、ＥＣ３．１．３．８（例えば、３－フィターゼ）、ＥＣ３．１．４．１（例えば、ホスホジエステラーゼＩ）、ＥＣ３．１．４．１１（例えば、ホスホイノシチドホスホリパーゼＣ）、ＥＣ３．１．４．３（例えば、ホスホリパーゼＣ）、ＥＣ３．１．４．４（例えば、ホスホリパーゼＤ）、ＥＣ３．１．６．１（例えば、アリールスルファターゼ）、ＥＣ３．１．８．２（例えば、ジイソプロピルフルオロホスファターゼ）、ＥＣ３．２．１．１０（例えば、オリゴー１，６－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１０１（例えば、マンナンエンド－１，６－α－マンノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１１（例えば、α－１，６－グルカン－６－グルカノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．１３１（例えば、キシランα－１，２－グルクロノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１３２（例えば、キトサンＮ－アセチルグルコサミノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．１３９（例えば、α－グルクロニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１４（例えば、キチナーゼ）、ＥＣ３．２．１．１５１（例えば、キシログルカン特異的エンド－β－１，４－グルカナーゼ）、ＥＣ３．２．１．１５５（例えば、キシログルカン特異的エキソ－β－１，４－グルカナーゼ）、ＥＣ３．２．１．１６４（例えば、ガラクタンエンド－１，６－β－ガラクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１７（例えば、リゾチーム）、ＥＣ３．２．１．１７１（例えば、ラムノガラクツロナンヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．１７４（例えば、ラムノガラクツロナンラムノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．２（例えば、β－アミラーゼ）、ＥＣ３．２．１．２０（例えば、α－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．２２（例えば、α－ガラクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．２５（例えば、β－マンノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．２６（例えば、β－フルクトフラノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．３７（例えば、キシラン１，４－β－キシロシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．３９（例えば、グルカンエンド－１，３－β－Ｄ－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．４０（例えば、α－Ｌ－ラムノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５１（例えば、α－Ｌ－フコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５２（例えば、β－Ｎ－アセチルヘキソサミニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５５（例えば、α－Ｎ－アラビノフラノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５８（例えば、グルカン１，３－β－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５９（例えば、グルカンエンド－１，３－α－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．６７（例えば、ガラクツラン１，４－α－ガラクツロニダーゼ、ＥＣ３．２．１．６８（例えば、イソアミラーゼ）、ＥＣ３．２．１．７（例えば、１－β－Ｄ－フルクタンフルクタノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．７４（例えば、グルカン１，４－β－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．７５（例えば、グルカンエンド－１，６－β－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．７７（例えば、マンナン１，２－（１，３）－α－マンノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．８０（例えば、フルクタンβ－フルクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．８２（例えば、エキソ－ポリ－α－ガラクツロノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．８３（例えば、κ－カラギナーゼ）、ＥＣ３．２．１．８９（例えば、アラビノガラクタンエンド－１，４－β－ガラクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．９１（例えば、セルロース１，４－β－セロビオシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．９６（例えば、マンノシル－糖タンパク質エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．９９（例えば、アラビナンエンド－１，５－α－Ｌ－アラビナーゼ）、ＥＣ３．４．Ｘ．Ｘ（例えば、ペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１１．Ｘ（例えば、アミノペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１１．１（例えば、ロイシルアミノペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１１．１８（例えば、メチオニルアミノペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１３．９（例えば、Ｘａａ－Ｐｒｏジペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１４．５（例えば、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）、ＥＣ３．４．１６．Ｘ（例えば、セリン型カルボキシペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１６．５（例えば、カルボキシペプチダーゼＣ）、ＥＣ３．４．１９．３（例えば、ピログルタミルペプチダーゼＩ）、ＥＣ３．４．２１．Ｘ（例えば、セリンエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２１．１（例えば、キモトリプシン）、ＥＣ３．４．２１．１９（例えば、グルタミルエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２１．２６（例えば、プロリルオリゴペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２１．４（例えば、トリプシン）、ＥＣ３．４．２１．５（例えば、トロンビン）、ＥＣ３．４．２１．６３（例えば、オリジン）、ＥＣ３．４．２１．６５（例えば、テルモミコリン）、ＥＣ３．４．２１．８０（例えば、ストレプトグリシンＡ）、ＥＣ３．４．２２．Ｘ（例えば、システインエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２２．１４（例えば、アクチニダイン）、ＥＣ３．４．２２．２（例えば、パパイン）、ＥＣ３．４．２２．３（例えば、フィカイン）、ＥＣ３．４．２２．３２（例えば、ステムブロメライン）、ＥＣ３．４．２２．３３（例えば、果実ブロメライン）、ＥＣ３．４．２２．６（例えば、キモパパイン）、ＥＣ３．４．２３．１（例えば、ペプシンＡ）、ＥＣ３．４．２３．２（例えば、ペプシンＢ）、ＥＣ３．４．２３．２２（例えば、エンドチアペプシン）、ＥＣ３．４．２３．２３（例えば、ムコルペプシン）、ＥＣ３．４．２３．３（例えば、ガストリシン）、ＥＣ３．４．２４．Ｘ（例えば、メタロエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２４．３９（例えば、ドイテロリシン）、ＥＣ３．４．２４．４０（例えば、セラリシン）、ＥＣ３．５．１．１（例えば、アスパラギナーゼ）、ＥＣ３．５．１．１１（例えば、ペニシリンアミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．１４（例えば、Ｎ－アシル－芳香族－Ｌ－アミノ酸アミドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．５．１．２（例えば、Ｌ－グルタミンアミドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．５．１．２８（例えば、Ｎ－アセチルムラモイル－Ｌ－アラニンアミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．４（例えば、アミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．４４（例えば、タンパク質－Ｌ－グルタミンアミドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．５．１．５（例えば、ウレアーゼ）、ＥＣ３．５．１．５２（例えば、ペプチド－Ｎ（４）－（Ｎ－アセチル－β－グルコサミニル）アスパラギンアミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．８１（例えば、Ｎ－アシル－Ｄ－アミノ酸デアシラーゼ）、ＥＣ３．５．４．６（例えば、ＡＭＰデアミナーゼ）及びＥＣ３．５．５．１（例えば、ニトリラーゼ）から選択されるＥＣ３（ヒドロラーゼ）酵素を含むが、それらに限定されないヒドロラーゼ酵素である。

他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ４．１．２．１０（例えば、マンデロニトリルリアーゼ）、ＥＣ４．１．３．３（例えば、Ｎ－アセチルノイラミン酸リアーゼ）、ＥＣ４．２．１．１（例えば、炭酸脱水酵素）、ＥＣ４．２．２．－（例えば、ラムノガラクツロナンリアーゼ）、ＥＣ４．２．２．１０（例えば、ペクチンリアーゼ）、ＥＣ４．２．２．２２（例えば、ペクチン酸三糖リアーゼ）、ＥＣ４．２．２．２３（例えば、ラムノガラクツロナンエンドリアーゼ）及びＥＣ４．２．２．３（例えば、マンヌロン酸特異的アルギン酸リアーゼ）から選択されるＥＣ４（リアーゼ）酵素を含むが、それらに限定されないリアーゼ酵素である。

特定の他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ５．１．３．３（例えば、アルドース１－エピメラーゼ）、ＥＣ５．１．３．３０（例えば、Ｄ－プシコース３－エピメラーゼ）、ＥＣ５．４．９９．１１（例えば、イソマルツロースシンターゼ）及びＥＣ５．４．９９．１５（例えば、（１→４）－α－Ｄ－グルカン１－α－Ｄ－グルコシルムターゼ）から選択されるＥＣ５（イソメラーゼ）酵素を含むが、それらに限定されないイソメラーゼ酵素である。

なお他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ６．２．１．１２（例えば、４－クマル酸：補酵素Ａリガーゼ）及びＥＣ６．３．２．２８（例えば、Ｌ－アミノ酸α－リガーゼ）から選択されるＥＣ６（リガーゼ）酵素を含むが、それらに限定されないリガーゼ酵素である。

本発明の菌株及び方法のこれら及び他の態様及び実施形態は、本明細書及び下記の実施例に照らして当業者に明白になるであろう。

ＶＩＩ．発酵
特定の実施形態では、本開示は、糸状菌細胞を発酵させることを含む、目的タンパク質を産生するための方法であって、真菌細胞は、目的タンパク質を分泌する、方法を提供する。他の実施形態では、本開示は、酵母菌株において増加した量のエタノールを産生するための方法を提供する。一般的に、真菌細胞を発酵するために、当技術分野でよく知られた発酵方法が使用されている。いくつかの実施形態では、真菌細胞は、バッチ発酵又は連続発酵条件下で増殖させる。古典的なバッチ発酵は、培地の組成が発酵の開始時に設定され、発酵中に変更されない閉鎖系である。発酵の開始時に所望の生物を培地に接種する。この方法では、系にいかなる成分も添加することなく発酵を行うことができる。典型的には、バッチ発酵は、炭素源の添加に関して「バッチ」であると見なされ、ｐＨ及び酸素濃度などの因子を制御するための試みは、頻繁に行われる。バッチ系の代謝産物及びバイオマス組成は、発酵が停止するときまで絶えず変化する。細胞は、バッチ培養内で静的誘導期を経て高増殖対数期に進み、最終的に増殖率が減少又は停止する静止期に進む。処理を行わなければ、静止期にある細胞は、最終的に死滅する。一般に、対数期の細胞が生成物の大部分の産生を担っている。

標準的なバッチ系における好適な変形形態は、「流加発酵」系である。典型的なバッチ系のこの変形形態では、発酵の進行に伴って基質が徐々に加えられる。流加系は、カタボライト抑制が細胞の代謝を阻害する可能性が高い場合及び培地中の基質量が限られた量であることが望ましい場合に有用である。流加系では、実際の基質濃度を測定することが困難であるため、ｐＨ、溶存酸素及びＣＯ_２などの廃ガスの分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて基質濃度を推定する。バッチ発酵及び流加発酵は、当技術分野において一般的であり、よく知られている。

連続発酵は、規定の発酵培地がバイオリアクターに連続的に加えられ、処理のために等量の馴化培地が同時に除去される開放系である。連続発酵は、一般に、細胞が主として対数増殖期にある一定の高密度で培養を維持する。連続発酵は、細胞の増殖及び／又は産生物の濃度に影響する１つ以上の因子を調節することができる。例えば、一実施形態では、炭素源又は窒素源などの制限栄養素が一定比率で維持され、他の全てのパラメーターを調節することができる。他の系では、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼす多数の因子を連続的に変化させることができる。連続系は、定常状態の増殖条件を維持しようとする。従って、除去される培地によって生じる細胞消失を発酵中の細胞増殖率とバランスさせなければならない。連続発酵プロセスのための栄養素及び増殖因子を調節する方法並びに産生物形成速度を最大化するための手法は、工業微生物学の技術分野でよく知られている。

本開示の特定の実施形態は、真菌を培養するための発酵手順に関する。セルラーゼ酵素を産生するための発酵手順は、当技術分野において公知である。例えば、セルラーゼ酵素は、バッチプロセス、流加プロセス及び連続フロープロセスを含む、固体培養又は深部培養の何れかによって産生することができる。培養は、一般に、水性無機塩類培地、有機増殖因子、炭素及びエネルギー源物質、分子状酸素並びに当然のことながら使用される糸状菌宿主の出発接種材料を含む増殖培地中で行われる。

適切な微生物の増殖を確実にし、微生物変換プロセスで細胞による炭素及びエネルギー源の吸収を最大にし、発酵培地において最大細胞密度で最大細胞収率を達成するには、炭素及びエネルギー源、酸素、資化性窒素並びに微生物接種材料に加えて、好適な量の無機栄養素を適切な割合で供給する必要がある。

水性無機培地の組成は、当技術分野で公知のように、使用する微生物及び基質に部分的に依存して広範囲にわたって変動させることができる。無機培地には、窒素に加えて好適な量のリン、マグネシウム、カルシウム、カリウム、硫黄及びナトリウムが好適な可溶性の吸収可能なイオン形態及び複合形態で含まれ、また好ましくは銅、マンガン、モリブデン、亜鉛、鉄、ホウ素及びヨウ素等の特定の微量元素が、全て当技術分野で公知のように、この場合にも好適な可溶性の吸収可能な形態で存在しなければならない。

発酵反応は、微生物種が活発に増殖することを促進するのに効果的な好適な酸素分圧において、発酵槽の内容物を維持するために提供される必要な分子状酸素が、空気、酸素富化空気又はは実質的に純粋な分子状酸素などの分子状酸素を含有するガスによって供給される好気的プロセスである。

微生物は、資化性窒素源も必要とする。資化性窒素源は、任意の窒素含有化合物又は微生物による代謝利用に好適な形態で窒素を放出することができる任意の化合物であり得る。タンパク質加水分解物などの様々な有機窒素源化合物を使用することができるが、通常、アンモニア、水酸化アンモニウム、尿素などの安価な窒素含有化合物及びリン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、ピロリン酸アンモニウム、塩化アンモニウム又は他の様々なアンモニウム化合物などの各種アンモニウム塩を利用することができる。アンモニアガス自体は、大規模な操作に便利であり、好適な量で水性発酵物（発酵培地）をバブリングして使用することができる。同時に、そのようなアンモニアを使用してｐＨ調節を補助することもできる。

水性微生物発酵物（発酵混合物）のｐＨ範囲は、約２．０～８．０の例示的な範囲でなければならない。糸状菌の場合、ｐＨは、通常、約２．５～８．０の範囲であり、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の場合、ｐＨは、通常、約３．０～７．０の範囲である。微生物の好ましいｐＨ範囲は、使用する培地及び特定の微生物にある程度依存するものであり、従って当業者であれば容易に決定できるように、培地の変更によって幾分変化する。

炭素含有基質を制限因子として制御することができるような方法で発酵を行うことが好ましく、それにより炭素含有基質の細胞への良好な転換がもたらされ、相当量の未転換基質による細胞の汚染が回避される。未転換基質による細胞の汚染について、微量の残存物は、容易に洗い流せるため、水溶性基質で問題にならない。しかしながら、それは、非水溶性基質の場合に問題となる可能性があり、好適な洗浄工程などの追加の生成物処理工程が必要になる。

上記に記載したように、このレベルに到達するまでの時間は、重要ではなく、特定の微生物及び実施する発酵プロセスによって変動する可能性がある。しかしながら、発酵培地中の炭素源濃度を測定する方法及び所望の炭素源レベルが達成されているか否かを判断する方法は、当技術分野でよく知られている。

発酵は、バッチ操作又は連続操作として行うことができ、流加操作は、制御の容易さ、均一な量の生成物の生産及び全ての装置のうちで最も経済的に使用されるという点で非常に好ましい。

必要に応じて、水性無機培地を発酵槽に供給する前に、炭素及びエネルギー源物質の一部若しくは全て並びに／又はアンモニアなどの資化性窒素源の一部を水性無機培地に加えることができる。

反応器に導入される流れの各々は、所定の速度で制御するか、又は炭素及びエネルギー基質の濃度、ｐＨ、溶存酸素、発酵槽から発生する気体中の酸素若しくは二酸化炭素、乾燥細胞重量により測定可能な細胞密度、透光度等など、モニタリングによって測定可能な必要性に応じて制御することが好ましい。炭素及びエネルギー源の効率的な利用と整合した、可能な限り迅速な細胞増殖速度が得られ、基質の供給に対して可能な限り高い微生物細胞の収率が得られるように、各種材料の供給速度を変動させることができる。

バッチ操作又は好ましい流加操作では、全ての装置、反応器又は発酵手段、槽若しくは容器、配管、付随する循環装置若しくは冷却装置等を、最初に、通常、蒸気を使用して、例えば約１２１℃で少なくとも約１５分間滅菌する。次いで、酸素を含む全ての必要な栄養素及び炭素含有基質の存在下において、選択された微生物の培養物を滅菌した反応器に接種する。使用する発酵槽の種類は、重要ではない。

発酵ブロスからのタンパク質の回収及び精製も、当業者に公知の手順によって行うことができる。発酵ブロスは、一般に、細胞残屑、例えば細胞、種々の懸濁した固体及び他のバイオマス混入物質並びに所望のセルラーゼ酵素産物を含み、これらは、当技術分野において公知の手段によって発酵ブロスから除去することが好ましい。

そのような除去に好適なプロセスとしては、無細胞濾液を生成するための、例えば遠心分離、濾過、透析、精密濾過、回転真空濾過又は他の公知のプロセスなどの従来の固液分離手法が挙げられる。結晶化前に、限外濾過、蒸発又は沈殿などの手法を使用して、発酵ブロス又は無細胞濾液を更に濃縮することが好ましい場合がある。

塩、例えば硫酸アンモニウムによって上清又は濾液のタンパク質成分の沈殿を行い、続いて各種クロマトグラフ手法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー又は類似の技術分野で認められている方法によって精製を行うことができる。

ＶＩＩＩ．代表的な実施形態
本開示の非限定的な実施形態としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。

１．天然ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子を含む親糸状菌株に由来する糸状菌の変異（又は改変）菌株であって、天然ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子を破壊するか又は欠失させる遺伝子改変を含み、同じ条件下で培養されたとき、親菌株に対してタンパク質生産性が増強した表現型を含む変異（又は改変）菌株。

２．タンパク質生産性が増強された表現型は、増加したタンパク質生産性、増加した総タンパク質生産性、増加した容積生産性、増加した炭素変換効率及び増加した比生産性からなる群から選択される、実施形態１に記載の変異菌株。

３．糸状菌は、チャワンタケ亜門（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）である、実施形態１に記載の変異菌株。

４．糸状菌は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種株、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種株、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種株、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種株、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種株、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）種株、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）種株、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）種株、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種株及びミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種株からなる群から選択される、実施形態１に記載の変異菌株。

５．変異菌株及び親菌株が同じ条件下で２５℃において発酵されるとき、親菌株に対してタンパク質生産性が増加した表現型を含む、実施形態１に記載の変異菌株。

６．変異菌株及び親菌株が同じ条件下で２６℃において発酵されるとき、親菌株に対してタンパク質生産性が増加した表現型を含む、実施形態１に記載の変異菌株。

７．変異菌株及び親菌株が同じ条件下で２７℃において発酵されるとき、親菌株に対してタンパク質生産性が増加した表現型を含む、実施形態１に記載の変異菌株。

８．変異菌株及び親菌株が同じ条件下で２８℃において発酵されるとき、親菌株に対してタンパク質生産性が増加した表現型を含む、実施形態１に記載の変異菌株。

９．内在性の目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする遺伝子を含む、実施形態１に記載の変異菌株。

１０．内在性ＰＯＩは、リグノセルロース分解酵素である、実施形態９に記載の変異菌株。

１１．異種目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする発現構築物を含む、実施形態１に記載の変異菌株。

１２．異種ＰＯＩは、酵素、抗体又はその断片、受容体タンパク質及びペプチドから選択される、実施形態１１に記載の変異菌株。

１３．異種ＰＯＩは、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼからなる群から選択される酵素である、実施形態１２に記載の変異菌株。

１４．異種ＰＯＩは、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、α－グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド－β－グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンナナーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオール酸化酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ及びヘキソースオキシダーゼからなる群から選択される酵素である、実施形態１２に記載の変異菌株。

１５．実施形態１に記載の変異菌株から産生される目的タンパク質。

１６．コードされているＧＥＦ１タンパク質は、配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を含む、実施形態１に記載の変異菌株。

１７．コードされているＧＥＦ１タンパク質は、配列番号５のＧＥＦ１ドメインと少なくとも９０％の配列同一性を含む、実施形態１に記載の変異菌株。

１８．ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１のＧＥＦ１ポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を含む、実施形態１に記載の変異菌株。

１９．ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号３のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列と少なくとも７０％の配列同一性を含む、実施形態１に記載の変異菌株。

２０．ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子は、中程度～ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１のＧＥＦ１遺伝子又は配列番号３のＧＥＦ１のＯＲＦとハイブリダイズする、実施形態１に記載の変異菌株。

２１．遺伝子改変は、ＧＥＦ１のＮ末端の少なくとも最初の２０個のアミノ酸残基を切断するか、又はＧＥＦ１のＣ末端の少なくとも最後の２０個のアミノ酸残基を切断する、実施形態１に記載の変異菌株。

２２．遺伝子改変は、ＧＥＦ１のＮ末端の少なくとも最初の２００個のアミノ酸残基を切断するか、又はＧＥＦ１のＣ末端の少なくとも最後の２００個のアミノ酸残基を切断する、実施形態１に記載の変異菌株。

２３．遺伝子改変は、ＧＥＦ１のＮ末端の少なくとも最初の５００個のアミノ酸残基を切断するか、又はＧＥＦ１のＣ末端の少なくとも最後の５００個のアミノ酸残基を切断する、実施形態１に記載の変異菌株。

２４．遺伝子改変は、ＧＥＦ１のＣ末端の少なくとも７００～７５０個のアミノ酸残基を切断する、実施形態１に記載の変異菌株。

２５．ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子が欠失されている、実施形態１に記載の変異菌株。

２６．改変糸状菌株において増加した量の内在性の目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生するための方法であって、（ａ）天然ＧＥＦ１遺伝子を破壊するか又は欠失させることによって糸状菌株を遺伝子改変することと、（ｂ）ＰＯＩの産生のために好適な条件下で改変菌株を発酵することであって、改変菌株は、同じ条件下で２５℃において培養されたとき、親菌株に対して増加した量のＰＯＩを産生する、発酵することとを含む方法。

２７．糸状菌は、チャワンタケ亜門（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）である、実施形態２６に記載の方法。

２８．糸状菌は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種株、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種株、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種株、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種株、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種株、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）種株、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）種株、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）種株、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種株及びミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種株からなる群から選択される、実施形態２６に記載の方法。

２９．改変菌株は、同じ条件下で２６℃において培養されたとき、親菌株に対して増加した量のＰＯＩを産生する、実施形態２６に記載の方法。

３０．改変菌株は、同じ条件下で２７℃において培養されたとき、親菌株に対して増加した量のＰＯＩを産生する、実施形態２６に記載の方法。

３１．改変菌株は、同じ条件下で２８℃において培養されたとき、親菌株に対して増加した量のＰＯＩを産生する、実施形態２６に記載の方法。

３２．内在性ＰＯＩは、リグノセルロース分解酵素である、実施形態２６に記載の方法。

３３．改変菌株は、異種ＰＯＩをコードする発現構築物を更に含む、実施形態２６に記載の方法。

３４．コードされているＧＥＦ１タンパク質は、配列番号２と少なくとも７０％の配列同一性を含む、実施形態２６に記載の方法。

３５．コードされているＧＥＦ１タンパク質は、配列番号５のＧＥＦ１タンパク質と少なくとも９０％の配列同一性を含む、実施形態２６に記載の方法。

３６．ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１のＧＥＦ１ポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を含む、実施形態２６に記載の方法。

３７．ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号３のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列と少なくとも７０％の配列同一性を含む、実施形態２６に記載の方法。

３８．ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子は、中程度～ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１のＧＥＦ１遺伝子又は配列番号３のＧＥＦ１のＯＲＦとハイブリダイズする、実施形態２６に記載の方法。

３９．遺伝子改変は、ＧＥＦ１のＮ末端の少なくとも最初の２０個のアミノ酸残基を切断するか、又はＧＥＦ１のＣ末端の少なくとも最後の２０個のアミノ酸残基を切断する、実施形態２６に記載の方法。

４０．遺伝子改変は、ＧＥＦ１のＮ末端の少なくとも最初の２００個のアミノ酸残基を切断するか、又はＧＥＦ１のＣ末端の少なくとも最後の２００個のアミノ酸残基を切断する、実施形態２６に記載の方法。

４１．遺伝子改変は、ＧＥＦ１のＮ末端の少なくとも最初の５００個のアミノ酸残基を切断するか、又はＧＥＦ１のＣ末端の少なくとも最後の５００個のアミノ酸残基を切断する、実施形態２６に記載の方法。

４２．遺伝子改変は、ＧＥＦ１のＣ末端の少なくとも７００～７５０個のアミノ酸残基を切断する、実施形態２６に記載の方法。

４３．ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子が欠失されている、実施形態２６に記載の方法。

４４．改変糸状菌株において増加した量の異種目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生するための方法であって、（ａ）天然ＧＥＦ１遺伝子を破壊するか又は欠失させることにより、且つ異種ＰＯＩをコードする発現カセットを導入することにより、糸状菌株を遺伝子改変することと、（ｂ）異種ＰＯＩの産生のために好適な条件下で改変菌株を発酵することであって、改変菌株は、同じ条件下で２５℃において培養されたとき、親菌株に対して増加した量のＰＯＩを産生する、発酵することとを含む方法。

４５．糸状菌は、チャワンタケ亜門（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）である、実施形態４４に記載の方法。

４６．糸状菌は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種株、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種株、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種株、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種株、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種株、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）種株、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）種株、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）種株、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種株及びミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種株からなる群から選択される、実施形態４４に記載の方法。

４７．改変菌株は、同じ条件下で２６℃において培養されたとき、親菌株に対して増加した量のＰＯＩを産生する、実施形態４４に記載の方法。

４８．改変菌株は、同じ条件下で２７℃において培養されたとき、親菌株に対して増加した量のＰＯＩを産生する、実施形態４４に記載の方法。

４９．改変菌株は、同じ条件下で２８℃において培養されたとき、親菌株に対して増加した量のＰＯＩを産生する、実施形態４４に記載の方法。

５０．異種ＰＯＩは、酵素、抗体又はその断片、受容体タンパク質及びペプチドから選択される、実施形態４４に記載の方法。

５１．異種ＰＯＩは、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼからなる群から選択される酵素である、実施形態４４に記載の方法。

５２．異種ＰＯＩは、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、α－グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド－β－グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンナナーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオール酸化酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ及びヘキソースオキシダーゼからなる群から選択される酵素である、実施形態４４に記載の方法。

５３．実施形態２６又は実施形態４４に記載の方法によって産生される目的タンパク質。

５４．酵母発酵プロセスにおいて増加した量のエタノールを産生するための方法であって、（ａ）天然ＧＥＦ１遺伝子を欠失させるか又は破壊することによって酵母菌株を遺伝子改変することと、（ｂ）エタノールの産生のために好適な条件下で改変菌株を発酵することであって、改変菌株は、同じ条件下で培養されたとき、発酵終了（ＥＯＦ）時に親菌株によって産生されるエタノールの量に対して、ＥＯＦ時に増加した量のエタノールを産生する、発酵することとを含む方法。

５５．ＧＥＦ１タンパク質相同体をコードする遺伝子を含む親菌株に由来する変異酵母菌株であって、ＧＥＦ１タンパク質相同体をコードする遺伝子を欠失させるか又は破壊する遺伝子改変を含み、同じ条件下で培養されたとき、親菌株に対してエタノール生産性が増加した表現型を含む変異酵母菌株。

本開示の特定の態様は、以下の実施例に照らして更に理解することができ、これらは、限定するものと解釈すべきでない。材料及び方法に対する変更形態は、当業者に明白であろう。

実施例１
高い培養温度でタンパク質生産性が増強された表現型を含む変異トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株の同定
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の全セルラーゼ（Ｔ４）菌株を選択的条件下で連続的に増殖させ、比生産性に悪影響を及ぼすことなく高温でタンパク質を産生することが可能な変異菌株を単離した。２５℃の親Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｔ４菌株に対して、２８℃で同様の比生産性（Ｑｐ）を有する、「Ｔ４－Ｅ１」という名称の変異Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株を同定して単離した。例えば、Ｔ４親菌株をＢＩＲＤ寒天上で胞子を形成させ、この寒天平板から１×１０^７胞子／ｍＬを回収し、水中に懸濁して、室温で２時間、０．１５ｍｇ／ｍｌの１－メチル－３－ニトロ－１－ニトロソグアニジン（Ｓｉｇｍａ １１２，９９４－１）で１％の胞子のみが生存可能に残存するまで処理した。微結晶セルロース（ＥＭＣＯＣＥＬ、ＪＲＳ Ｐｈａｒｍａ、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃ５６７８、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）又は酸性膨潤セルロース（例えば、その調製については、Ｗｏｏｄ，１９８８を参照されたい）の何れかを単一炭素源として０．５％含有する発生培地に胞子を接種した。１リットル当たり硫酸アンモニウム（４ｇ）、一塩基性リン酸ナトリウム（４．５ｇ）、硫酸マグネシウム七水和物（１ｇ）、塩化カルシウム二水和物（１ｇ）及び２．５ｍｌの４００倍の微量元素溶液でもあった。

より具体的には、第１の方法において、単一炭素源としてＡｖｉｃｅｌ（登録商標）を含む、上記に記載した発生培地を含有する２５０ｍｌの底がへこんだフラスコに約１００万個の化学的に変異させた胞子を接種した。このフラスコを３１℃で５日間、１８０ｒｐｍでインキュベートした。この時点で第２の同一のフラスコに１０％体積／体積の移し変えを行い、これを同様の方法でインキュベートした。１１の継代（Ｐ）にわたり、以下の通りに連続的な移し変えを継続した：Ｐ１＝５日、Ｐ２＝５日、Ｐ３＝４日、Ｐ４＝４日、Ｐ５＝４日、Ｐ６＝４日、Ｐ７＝４日、Ｐ８＝４日、Ｐ９＝３日、Ｐ１０＝３日及びＰ１１＝２日。Ｐ１１の振盪フラスコからのＰ１１のブロスを４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄を捨てて細胞を水中に懸濁し、ＢＩＲＤ培地に蒔いた。

個々のコロニー形成単位について、徐放性ラクトースマイクロタイタープレート（ｓｒＭＴＰ；例えば、ＰＣＴ国際公開第２０１４／０４７５２０号パンフレットを参照されたい）内で４日間、３１℃で２００ｒｐｍ及び湿度８０％でインキュベートした後、総タンパク質ＢＣＡ（製品番号２３２２８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を評価した。これにより、親菌株によって２５℃で産生された総タンパク質の量に対して３１℃で等量の総タンパク質を産生する変異菌株を、発酵槽内において高温でタンパク質を産生するかどうかについて更に評価した。

第２の方法では、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｔ４親菌株の変異胞子を、Ｂａｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）に記載されている方法を用いて水及び油のエマルジョン液滴中に封入した。液滴は、微結晶セルロース（ＥＭＣＯＣＥＬ、ＪＲＳ Ｐｈａｒｍａ、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、カルボキシメチルセルロース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃ５６７８、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）又は酸性膨潤セルロース（Ｗｏｏｄ，１９８８）の何れかを単一炭素源として０．５％を含む発生培地を含有するものであった。１リットル当たり硫酸アンモニウム（４ｇ）、一塩基性リン酸ナトリウム（４．５ｇ）、硫酸マグネシウム七水和物（１ｇ）、塩化カルシウム二水和物（１ｇ）及び２．５ｍｌの４００倍の微量元素溶液でもあった。チューブ内で液滴を３１℃で３日間インキュベートし、そのとき、Ｂａｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）に記載されている方法を用いて水及び油のエマルジョン液滴中に封入した。細胞を回収して寒天平板上に胞子を形成させ、再度封入して３１℃で３日間インキュベートした。このプロセスを１０回繰り返した。最後の移し変え後、細胞を水中に懸濁してＢＩＲＤ培地に蒔いた。個々のコロニー形成単位について、ｓｒＭＴＰラクトースプレート（ＰＣＴ国際公開第２０１４／０４７５２０号パンフレット）内で４日間、３１℃で２００ｒｐｍ及び湿度８０％でインキュベートした後、総ＢＣＡタンパク質（製品番号２３２２８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を評価した。親菌株によって２５℃で産生された総タンパク質の量に対して、３１℃で等量の総タンパク質を産生する変異菌株を、発酵槽内において高温でタンパク質を産生するかどうかについて更に評価した。これにより、上記で概説し、下記に示すように、親Ｔ４菌株のタンパク質が２５℃で最適に産生されることと比較して（対比して）、２８℃で最適にタンパク質を産生することができる高温の変異体として、「Ｔ４－Ｅ１」という名称の変異Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）（Ｔ４）菌株を同定した。

実施例２
変異したＧＥＦ１遺伝子を含む変異トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株の特性決定
実施例１において上述したトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）変異（突然変異）菌株内で変異した遺伝子は、野生型Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＱＭ６ａのｖ２．０ゲノム配列アセンブリにおいて足場位置３：１５３２６３９－１５３８７８１に存在し、このゲノム配列アセンブリは、Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＪＧＩ）のウェブサイトで利用可能である（ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ）。例えば、推定アミノ酸配列（ＰＩＤ：１２０４８２；配列番号２）には、Ｒｈｏ／Ｒａｃ／Ｃｄｃ４２様グアニンヌクレオチド交換因子ドメイン（ＧＥＦ１ドメイン；Ｐｆａｍ ＰＦ００６２１、Ｄｂｌ相同ドメイン又はＤＨドメインとも呼ばれている）と配列相同性の領域（例えば、配列番号４）が含まれている。この相同領域は、推定アミノ酸配列（即ちＰＩＤ：１２０４８２；配列番号２）内のアミノ酸残基１，２４２～１，４５４位に存在する。ＲｈｏファミリーのＧＴＰアーゼは、多くの異なる細胞内プロセスを調節しており、そのようなＧＴＰアーゼは、結合したＧＤＰを放出し、その後、ＧＴＰと結合することによって活性化するが、これは、ＧＥＦ１ファミリーのグアニン交換因子によって触媒される。変異Ｔ４－Ｅ１菌株における変異によってグルタミン酸コドン（Ｇｌｕ（Ｅ）；アミノ酸１，２４５位）が未成熟終止コドンと置き換わり、それによりＧＥＦ１ドメインの先頭の近傍にあるタンパク質が切断される（例えば、図３Ａ～図３Ｃを参照されたい）。

同様に、推定アミノ酸配列（ＰＩＤ：１２０４８２；配列番号２）は、配列番号２の残基１，５７６～１，６７７位にＢＡＲ又はＡＨ／ＢＡＲドメイン（例えば、配列番号５；Ｐｆａｍ ＰＦ０３１１４）との相同性も含む。ＡＨ／ＢＡＲドメインは、様々なタンパク質に見られるものである。ＡＨ／ＢＡＲドメインは、場合により膜と相互作用し、二量体化するか、又はゴルジ複合体に出芽する小胞に関与する小型ＧＴＰアーゼであるＡＲＦ１を含むＡｒｆ及びＲｈｏファミリーのＧＴＰアーゼと結合することが分かっている。ＡＨ／ＢＡＲドメイン（配列番号５）は、他の４つのＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のＧＥＦ１ドメインタンパク質では観察されていない。

いくつかの他のＧＥＦ１ドメインタンパク質と異なり、配列番号２（ＰＩＤ：１２０４８２）には、プレクストリン相同ドメイン（ＰＨドメイン、Ｐｆａｍ ＰＦ００１６９）が見られない。ＰＨドメインは、膜にあるホスファチジルイノシトールとヘテロ三量体Ｇタンパク質のβ／γサブユニット又はプロテインキナーゼＣとを結合させることができることにより、シグナル伝達経路と関連するものである。ＧＥＦ１ドメインを含有するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のＱＭ６ａゲノムに見出された推定タンパク質配列が他に４つ存在し、その２つがＰＨドメインも含有している。

加えて、推定アミノ酸配列（ＰＩＤ：１２０４８２；配列番号２）には、フザリウム・フジクロイ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、ポドスポラ・アンセリナ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ ａｎｓｅｒｉｎａ）、ペニシリウム・ルーベンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｕｂｅｎｓ）及びアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）を含む一部の他の糸状菌のＧＥＦ１ドメインタンパク質によって高度に保存されている、配列番号２の残基１，９１８～１，９９０位のＣ末端配列（例えば、配列番号６）が含まれている。しかしながら、このＣ末端配列ドメイン（配列番号６）は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ゲノムにおいて同定された他の４つのＧＥＦ１ドメインタンパク質に存在しいない。

実施例３
ｐｙｒ２遺伝子を挿入することによるトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株のＧＥＦ１遺伝子の不活性化
配列番号２（ＰＩＤ：１２０４８２）のＧＥＦ１タンパク質をコードするＧＥＦ１遺伝子（ＪＧＩ Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｖ２．０足場３：１５３２６３９－１５３８７８１）の不活性化を、Ｃａｓ９をベースとした方法を使用してＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株に行った。より具体的には、精製Ｃａｓ９タンパク質及び改変ＥＺ ｔｒａｃｒＲＮＡをＳｙｎｔｈｅｇｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から購入し、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＧＥＦ１遺伝子内の標的部位（ＴＳ３）に特異的な以下の配列（ＴＳ３；配列番号７）を５’末端に含む改変ｃｒＲＮＡをＳｙｎｔｈｅｇｏにより合成した。
ＴＳ３：ＣＡＵＵＣＡＵＣＣＡＡＧＡＡＵＣＣＧＡＧ（配列番号７）

上記のＲＮＡ配列（配列番号７）によって決定されるＧＥＦ１遺伝子のＣａｓ９標的部位（ＴＳ）は、コード配列のヌクレオチド３，６５９～３，６７８位に存在し、Ｔ４－Ｅ１変異菌株（実施例２）で観察されるヌクレオチド３，７３３位における変異に近接している。製造業者の指示に従い、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡをアニーリングしてガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を形成し、次いでＣａｓ９－２ＮＬＳと組み合わせ、リボ核タンパク質複合体（Ｃａｓ９：ＲＮＰ）を形成した。使用前に、Ｃａｓ９：ＲＮＰを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から購入したリポフェクタミンＣＲＩＳＰＲ－ＭＡＸと混合した。

天然プロモーター配列及びターミネーター配列を含むＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２遺伝子を含有し、４９２ｂｐのＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）反復配列（配列番号１８）に隣接する直鎖ＤＮＡ断片を、プライマーＡＬ９５０（配列番号８）及びＡＬ９５２（配列番号９）プライマーを用いてＰＣＲで増幅した。Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを使用して、得られたＰＣＲ産物を精製した。
ＡＬ９５０：ＣＣＴＡＡＣＴＡＡＣＧＴＣＴＧＡＣＡＴＣＧ（配列番号８）
ＡＬ９５２：ＣＧＴＡＣＣＡＴＴＴＧＡＣＴＧＡＴＡＣＧＡＴＧ（配列番号９）

Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）親菌株のプロトプラストをｐｙｒ２のＰＣＲ産物に加えてＣａｓ９：ＲＮＰで形質転換した。形質転換体をウリジン栄養要求性により選択した。ＧＥＦ１のＣａｓ９にわたって増幅する順方向プライマー及び逆方向プライマー対のＲｈｏＦ１（配列番号１０）及びＲｈｏＲ１（配列番号１１）を用いたＰＣＲにより、形質転換体においてｐｙｒ２がＧＥＦ１遺伝子に所望の通りに挿入されたかをスクリーニングした。
ＲｈｏＦ１：ＧＡＧＣＴＡＧＡＣＡＣＧＧＧＣＧＡＡＧ（配列番号１０）
ＲｈｏＲ１：ＡＧＧＡＡＣＣＣＴＴＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧ（配列番号１１）

ｐｙｒ２を挿入することにより、ＰＣＲ産物のサイズが７５５ｂｐから約２．８ｋｂに増加した。「ΔＲｈｏ ＃２２Ｄ」という名称の形質転換体由来の２．８ｋｂのＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を、ＲｈｏＦ１及びＲｈｏＲ１プライマーを用いてサンガーシーケンシングによって決定し、Ｃａｓ９切断部位におけるｐｙｒ２の挿入と、ＧＥＦ１コード配列の破壊とを確認した。

表１に示すように、ΔＲｈｏ ＃２２Ｄ形質転換体の発酵能力を、親Ｔ４菌株と、実施例１に記載されるＴ４－Ｅ１菌株という名称の変異体とで比較した。例えば、２５℃における対照菌株Ｔ４の最終的な比生産性（Ｑｐ）率に対する、２８℃におけるＴ４、Ｔ４－Ｅ１及びＴ４－ΔＲｈｏ＃２２Ｄ菌株の最終的なＱｐ率を百分率（％）で表１に示す。

実施例４
異種セルラーゼ発現構築物を含むトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株の部分的欠失によるＧＥＦ１遺伝子の不活性化
本実施例に記載されるように、「Ｔ４－ＤＸＳＴ」という名称のトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は、親Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｔ４菌株に由来／構築されたものであり、ここで、ＣＢＨＩ、ＣＢＨＩＩ、ＥＧＩ及びＥＧＩＩタンパク質をコードする天然セルラーゼ遺伝子は、欠失又は破壊によって（即ち当業者に公知の慣用的な分子生物学的手法を用いて）不活性化され、高効率のｃｂｈＩプロモーターの制御下に置かれたスタフィロトリカム・ココスポラム（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃｏｃｃｏｓｐｏｒｕｍ）エンドグルカナーゼ１（ＳＴＣＥ１）をコードする遺伝子のコピーで形質転換されている。

外来的に加えられたプラスミドＤＮＡによるＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の形質転換方法は、公開されている（Ｐｅｎｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。プラスミドＤＮＡを宿主の染色体に組み込むことによって安定的な形質転換体が生じる。組み込みは、プラスミドＤＮＡの領域と相同性を有するゲノム内の部位で生じさせることができるか、又は非相同部位で生じさせることができる。

Ｃａｓ９をベースとした方法を用いて、導入されたＳＴＣＥ１セルラーゼ構築物のコピーを含む親Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株で、ＧＥＦ１をコードする遺伝子の不活性化（例えば、米国特許第７，５９５，１８２号明細書を参照されたい）を行った。より具体的には、精製Ｃａｓ９－２ＮＬＳタンパク質及び改変ＥＺ ｔｒａｃｒＲＮＡをＳｙｎｔｈｅｇｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から購入した。Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＧＥＦ１遺伝子内の標的部位３及び４（ＴＳ３／ＴＳ４）に特異的な以下のＲＮＡ配列を５’末端に含む改変ｃｒＲＮＡをＳｙｎｔｈｅｇｏにより合成した。
ＴＳ３：ＣＡＵＵＣＡＵＣＣＡＡＧＡＡＵＣＣＧＡＧ（配列番号７）
ＴＳ４：ＡＵＵＧＵＧＧＡＧＧＡＡＡＵＣＵＡＣＡＡ（配列番号１２）

上記のＲＮＡ配列によって決定されるＧＥＦ１遺伝子内のＣａｓ９標的部位（ＴＳ３／ＴＳ４）は、コード配列のヌクレオチド３，６５９～３，６７８位及び３，７７５～３７９４位に存在し、Ｔ４－Ｅ１変異菌株で観察されるヌクレオチド３，７３３位における変異に近接している。製造業者の指示に従い、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡをアニーリングしてガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を形成し、次いでＣａｓ９－２ＮＬＳと組み合わせ、リボ核タンパク質複合体（Ｃａｓ９：ＲＮＰ）を形成した。使用前に、Ｃａｓ９：ＲＮＰを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から購入したリポフェクタミンＣＲＩＳＰＲ－ＭＡＸと混合した。

ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）ｃｐｃ１プロモーター（配列番号１４）及びアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｔｒｐＣターミネーター（配列番号１５）に作動可能に連結された、細菌性ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（配列番号１３）を含有する直鎖ＤＮＡ断片を、プライマーＨｙｇＦ１（配列番号１６）及びＨｙｇＲ１（配列番号１７）を用いてＰＣＲで増幅した。
ＨｙｇＦ１：ＴＧＧＣＴＴＴＣＣＧＴＣＴＣＣＡＴＴＧ（配列番号１６）
ＨｙｇＲ１：ＡＧＴＧＴＡＣＣＴＧＴＧＣＡＴＴＣＴＧＧＧ（配列番号１７）

Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）親菌株のプロトプラストを、直鎖ＤＮＡ断片と、Ｃａｓ９：ＲＮＰの両方の混合物（何れもｃｒＲＮＡを含む）とで形質転換した。形質転換体を適切な寒天培地上でハイグロマイシン耐性により選択した。ただし、選択寒天平板から、より小さく、ゆっくりと増殖する形質転換コロニーを選択し、非選択培地を含む寒天平板に移した。非選択培地上で増殖させた後に形質転換体を選択し、培地にハイグロマイシンを滴下した。ハイグロマイシンの存在下で増殖しなかった形質転換体が、更なる試験のために選択された。これらの形質転換体は、一過性のハイグロマイシン耐性を示し、その後、ハイグロマイシン耐性ＤＮＡマーカー断片をＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ゲノムに組み込まれることなく消失したものと推定された。ＲｈｏＦ１（配列番号１０）及びＲｈｏＲ１（配列番号１１）プライマーによるＰＣＲを用いて、ハイグロマイシンに感受性のある形質転換体をスクリーニングした。

Ｃａｓ９標的部位ＴＳ３及びＴＳ４間に欠失が生じた場合に予期されるような、約６３０ｂｐのＰＣＲ産物をもたらす形質転換体を同定した。野生型細胞におけるこのＰＣＲ産物のサイズは、７５６ｂｐである。プライマーＲｈｏＦ１（配列番号１０）及びＲｈｏＲ１（配列番号１１）を用いて、ＰＣＲ産物を両端から配列決定した。形質転換体＃８９（ｔ－ＡＷＣ８８）は、ＴＳ３及びＴＳ４間に挿入がない状態で１２５ｂｐ（即ちコード配列のヌクレオチド３，６６８～３，７９１位）の欠失を有していた。続いて、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）形質転換体＃８９（ｔ－ＡＷＣ８８）を発酵させ、表２に示すように、２５℃及び２８℃におけるＳＴＣＥ／ＤＸＳＴタンパク質産生について親菌株（ｔ－ＡＶＴ８４）と比較した（対比した）。

より具体的には、上記の表２に示すように、Ｔ４－ＤＸＳＴ娘菌株（ｔ－ＡＷＣ８８）は、親菌株（ｔ－ＡＶＴ８４）に対して少なくとも２～３℃高い最適なタンパク質産生温度を有している。

参考文献
ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１９／２７５９０号明細書
ＰＣＴ国際公開第２０１１／１５３４４９号パンフレット
ＰＣＴ国際公開第２０１１／１５３４４９号パンフレット
ＰＣＴ国際公開第２０１２／１４５５８４号パンフレット
ＰＣＴ国際公開第２０１２／１４５５９５号パンフレット
ＰＣＴ国際公開第２０１６／１００２７２号パンフレット
ＰＣＴ国際公開第２０１６／１００５６２号パンフレット
ＰＣＴ国際公開第２０１６／１００５６８号パンフレット
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米国特許第６，２６８，３２８号明細書
米国特許第７，５９５，１８２号明細書
２０１８年７月３０日出願の米国仮特許出願第６２／７１１，８４６号明細書
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Claims (19)

1. ＧＥＦ１タンパク質をコードする遺伝子を含む親細胞に由来する変異糸状菌細胞であって、前記ＧＥＦ１タンパク質をコードする前記遺伝子を破壊するか又は欠失させる遺伝子改変を含み、同じ条件下で発酵されたとき、前記親細胞に対してタンパク質生産性が増強された表現型を含む変異糸状菌細胞。
2. 前記タンパク質生産性が増強された表現型は、増加したタンパク質生産性、増加した総タンパク質生産性、増加した容積生産性、増加した炭素変換効率及び増加した比生産性からなる群から選択される、請求項１に記載の変異細胞。
3. 前記変異細胞及び前記親細胞が同じ条件下で２６℃において発酵されるとき、前記親細胞に対してタンパク質生産性が増加した表現型を含む、請求項１に記載の変異細胞。
4. 内在性の目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする遺伝子を含み、且つ／又は異種ＰＯＩをコードする発現カセットを含む、請求項１に記載の変異細胞。
5. 前記内在性ＰＯＩは、リグノセルロース分解酵素である、請求項４に記載の変異細胞。
6. 前記リグノセルロース分解酵素は、セロビオヒドロラーゼ、キシラナーゼ、エンドグルカナーゼ及びβ－グルコシダーゼからなる群から選択される、請求項５に記載の変異細胞。
7. 前記発現カセットは、酵素、抗体、受容体及びペプチドから選択される異種ＰＯＩをコードする、請求項４に記載の変異細胞。
8. 前記酵素は、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼからなる群から選択される、請求項７に記載の変異細胞。
9. 請求項１に記載の変異細胞によって産生される目的タンパク質。
10. 改変糸状菌細胞において増加した量の内在性の目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生するための方法であって、
    （ａ）天然ＧＥＦ１遺伝子を破壊するか又は欠失させることによって親糸状菌細胞を遺伝子改変することと、
    （ｂ）前記ＰＯＩの前記産生のために好適な条件下で前記改変細胞を発酵させることであって、前記改変細胞は、同じ条件下で２５℃において発酵されたとき、前記親菌株に対して増加した量の前記ＰＯＩを産生する、発酵させることと
    を含む方法。
11. 前記内在性ＰＯＩは、リグノセルロース分解酵素である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記リグノセルロース分解酵素は、セロビオヒドロラーゼ、キシラナーゼ、エンドグルカナーゼ及びβ－グルコシダーゼからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記改変菌株は、異種ＰＯＩをコードする発現構築物を更に含む、請求項１０に記載の方法。
14. 改変糸状菌細胞において増加した量の内在性の目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生するための方法であって、
    （ａ）天然ＧＥＦ１遺伝子を破壊するか又は欠失させることにより、且つ異種ＰＯＩをコードする発現カセットを導入することにより、糸状菌細胞を遺伝子改変することと、
    （ｂ）前記異種ＰＯＩの前記産生のために好適な条件下で前記改変細胞を発酵させることであって、前記改変細胞は、同じ条件下で２５℃において発酵されたとき、親菌株に対して増加した量の前記ＰＯＩを産生する、発酵させることと
    を含む方法。
15. 前記異種ＰＯＩは、酵素、抗体又はその断片、受容体タンパク質及びペプチドから選択される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記異種ＰＯＩは、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼからなる群から選択される酵素である、請求項１４に記載の方法。
17. 請求項１０又は１４に記載の方法によって産生される目的タンパク質。
18. 酵母発酵プロセスにおいて増加した量のエタノールを産生するための方法であって、
    （ａ）天然ＧＥＦ１遺伝子を欠失させるか又は破壊することによって酵母菌株を遺伝子改変することと、
    （ｂ）前記エタノールの産生のために好適な条件下で前記改変菌株を発酵させることであって、前記改変菌株は、同じ条件下で発酵されたとき、発酵終了（ＥＯＦ）時に親菌株によって産生されるエタノールの量に対して、ＥＯＦ時に増加した量のエタノールを産生する、発酵させることと
    を含む方法。
19. ＧＥＦ１タンパク質相同体をコードする遺伝子を含む親菌株に由来する変異酵母菌株であって、前記ＧＥＦ１タンパク質相同体をコードする前記遺伝子を欠失させるか又は破壊する遺伝子改変を含み、同じ条件下で発酵されたとき、前記親菌株に対してエタノール生産性が増加した表現型を含む変異酵母菌株。

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