WO2012128260A1 - シゾサッカロミセス属酵母の形質転換体、該形質転換体の製造方法、β－グルコシダーゼの製造方法、およびセルロースの分解方法 - Google Patents

シゾサッカロミセス属酵母の形質転換体、該形質転換体の製造方法、β－グルコシダーゼの製造方法、およびセルロースの分解方法 Download PDF

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mutation
modified
amino acid
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和士 岡田
英毅 東田
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    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2445—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase

Definitions

  • the present invention relates to a transformant of yeast belonging to the genus Schizosaccharomyces, a method for producing the transformant, a method for producing ⁇ -glucosidase using the transformant, and a method for decomposing cellulose using the ⁇ -glucosidase. .
  • the present invention relates to a transformant of Schizosaccharomyces yeast that can produce modified ⁇ -glucosidase having higher heat stability or glucose inhibition resistance than wild-type ⁇ -glucosidase, a method for producing the same, and the like.
  • Cellulose biomass such as wood, rice straw, rice husk, and weeds must be decomposed to produce cellulose as a fermentation raw material and eventually biomass fuel such as bioethanol, which is a major component of plant cell walls.
  • biomass fuel such as bioethanol
  • Cellulose degradation includes acid saccharification methods such as concentrated sulfuric acid saccharification and dilute sulfuric acid saccharification methods, and enzymatic saccharification methods using enzymes. With the rise of biotechnology in recent years, research and development of enzymatic saccharification methods It is actively done.
  • enzyme saccharification of cellulose a group of enzymes collectively referred to as cellulases is used.
  • an endoglucanase (EG) having an activity of randomly cleaving a cellulose chain decomposes an amorphous region of cellulose and exposes a glucose terminal.
  • the exposed glucose terminus is degraded by cellobiohydrase (CBH), and cellobiose is released.
  • CBH cellobiohydrase
  • BGL ⁇ -glucosidase
  • Filamentous fungi such as Aspergillus and Trichoderma are widely used for enzymatic saccharification of cellulose. This is because various cellulases and hemicellulases for decomposing and saccharifying crystalline cellulose can be produced, and a large amount of these enzymes can be secreted extracellularly.
  • Non-Patent Document 1 was obtained by transforming the budding yeast Saccharomyces cerevisiae with a gene encoding ⁇ -glucosidase I (BGLI) of Aspergillus acculeatus, one of the filamentous fungi. It is disclosed that these enzymes were expressed in transformants.
  • BGLI ⁇ -glucosidase I
  • Schizosaccharomyces yeasts do not have a unique ⁇ -glucosidase gene and cannot assimilate cellobiose.
  • ⁇ -glucosidase itself is also desired.
  • the hydrolysis reaction of cellulose by the enzyme proceeds and glucose accumulates in the reaction system
  • the accumulated glucose inhibits ⁇ -glucosidase
  • cellobiose accumulates
  • the accumulated cellobiose accumulates in the end.
  • glucanase and cellobiohydrase there is a problem that cellulose cannot be completely decomposed. Therefore, development of ⁇ -glucosidase with higher glucose inhibition resistance (difficulty of glucose inhibition) is desired.
  • enzymatic reactions tend to have higher reaction efficiency as the reaction temperature is higher.
  • Random mutagenesis to an enzyme is one of the important techniques for improving the function of the enzyme. Random single nucleotide substitution mutations are introduced into the target gene by error-prone PCR (polymerase chain reaction) method (Non-patent Document 2). A codon at a specific site is randomly modified by a saturation mutagenesis method (Non-patent Document 2). According to the in vitro recombination method (Non-patent Document 2), several mutant genes are crossed to combine mutation points. Mutant enzyme libraries can be prepared by introducing random mutations into the gene encoding the target enzyme by these random mutation introduction methods. A useful improved enzyme can be obtained by selecting using a screening method capable of selecting a function according to the purpose from among them.
  • Patent Document 1 E. coli
  • Patent Document 2 cell-free protein synthesis system
  • Patent Document 3 introduces random mutations in Saccharomyces cerevisiae, but there are steps for insertion of the mutant gene into the vector and amplification and purification of the mutant gene insertion vector in E. coli, which is not convenient.
  • an object of the present invention is to provide a transformant of Schizosaccharomyces yeast that can produce a modified ⁇ -glucosidase with improved glucosidase activity, a method for producing the transformant, and a method for producing the modified ⁇ -glucosidase. It is an object of the present invention to provide a production method and a method for decomposing cellulose using the modified ⁇ -glucosidase.
  • the present inventors have determined that a structure encoding a modified ⁇ -glucosidase synthesized by introducing a specific mutation into a structural gene sequence encoding a ⁇ -glucosidase derived from a filamentous fungus.
  • the present inventors have found that the above problems can be solved by introducing a gene into a yeast of the genus Schizosaccharomyces and transforming it, and have completed the present invention.
  • the present invention provides the following [1] to [15].
  • Modified ⁇ -glucosidase ⁇ -glucosidase derived from a filamentous fungus in which at least one mutation selected from the group consisting of the following mutations 1 to 6 is present, and from a ⁇ -glucosidase derived from a filamentous fungus not having the mutation ⁇ -glucosidase, which is also highly heat stable or resistant to glucose inhibition.
  • Mutation 1 A mutation in which the amino acid corresponding to the 244th isoleucine of AaBGL1 (BGL1 of Aspergillus acculeatus) is substituted with phenylalanine.
  • Mutation 2 A mutation in which the amino acid corresponding to the 282nd glycine of AaBGL1 is substituted with phenylalanine.
  • Mutation 3 A mutation in which the amino acid corresponding to the 442nd asparagine of AaBGL1 has been substituted with serine.
  • Mutation 4 A mutation in which the amino acid corresponding to the 452nd glycine of AaBGL1 is substituted with serine.
  • Mutation 5 A mutation in which the amino acid corresponding to the 503rd valine of AaBGL1 is substituted with alanine.
  • Mutation 6 A mutation in which the amino acid corresponding to the 613rd arginine of AaBGL1 is substituted with leucine.
  • the structural gene sequence has a signal-coding region or a tag-coding region on at least one of the 5 ′ end side and the 3 ′ end side of the region encoding the modified ⁇ -glucosidase.
  • a yeast of the genus Schizosaccharomyces is transformed with a structural gene sequence comprising a region encoding the following modified ⁇ -glucosidase, and a vector comprising a promoter sequence and a terminator sequence for expressing the structural gene.
  • a method for producing a transformant Modified ⁇ -glucosidase: ⁇ -glucosidase derived from a filamentous fungus in which at least one mutation selected from the group consisting of the following mutations 1 to 6 is present, and from a ⁇ -glucosidase derived from a filamentous fungus not having the mutation ⁇ -glucosidase, which is also highly heat stable or resistant to glucose inhibition.
  • Mutation 1 A mutation in which the amino acid corresponding to the 244th isoleucine of AaBGL1 (BGL1 of Aspergillus acculeatus) is substituted with phenylalanine.
  • Mutation 2 A mutation in which the amino acid corresponding to the 282nd glycine of AaBGL1 is substituted with phenylalanine.
  • Mutation 3 A mutation in which the amino acid corresponding to the 442nd asparagine of AaBGL1 has been substituted with serine.
  • Mutation 4 A mutation in which the amino acid corresponding to the 452nd glycine of AaBGL1 is substituted with serine.
  • Mutation 5 A mutation in which the amino acid corresponding to the 503rd valine of AaBGL1 is substituted with alanine.
  • Mutation 6 A mutation in which the amino acid corresponding to the 613rd arginine of AaBGL1 is substituted with leucine.
  • the structural gene sequence has a signal-coding region or a tag-coding region on at least one of the 5′-terminal side and the 3′-terminal side of the region encoding the modified ⁇ -glucosidase.
  • the method for producing a transformant according to [10] wherein the vector is incorporated into a transposon gene Tf2 site in a chromosome.
  • a method for producing ⁇ -glucosidase comprising obtaining modified ⁇ -glucosidase from a culture supernatant obtained by culturing the transformant according to [6].
  • a method for decomposing cellulose comprising using a modified ⁇ -glucosidase obtained by the method for producing ⁇ -glucosidase according to [12] or [13].
  • a method for decomposing cellulose comprising culturing the transformant according to [6] in the presence of cellulose.
  • a modified ⁇ -glucosidase improved in at least one of heat stability and glucose inhibition resistance can be produced.
  • Transformants can be produced.
  • the modified ⁇ -glucosidase obtained from the transformant by the method for producing ⁇ -glucosidase of the present invention can be preferably used for cellulose degradation.
  • FIG. 1 is a diagram showing a phylogenetic tree of ⁇ -glucosidase derived from filamentous fungi, together with homology to BGL1 (AaBGL1) encoded by the bgl1 gene of Aspergillus accretus.
  • FIG. 2A is a diagram showing an alignment of the amino acid sequence of AaBGL1 and the amino acid sequence of ⁇ -glucosidase derived from other filamentous fungi.
  • FIG. 2B shows an alignment of the amino acid sequence of AaBGL1 and the amino acid sequences of ⁇ -glucosidase derived from other filamentous fungi.
  • FIG. 1 is a diagram showing a phylogenetic tree of ⁇ -glucosidase derived from filamentous fungi, together with homology to BGL1 (AaBGL1) encoded by the bgl1 gene of Aspergillus accretus.
  • FIG. 2A is a diagram showing an alignment of the
  • FIG. 2C shows an alignment of the amino acid sequence of AaBGL1 and the amino acid sequences of ⁇ -glucosidase derived from other filamentous fungi.
  • FIG. 3 is a block diagram of the expression vector pSL6AaBGL1.
  • FIG. 4 is a block diagram of the expression vector pSL6P3AaBGL1.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of measurement of glucose inhibition of the culture supernatant of each mutant and thermal stability at a temperature of 50 ° C. to 75 ° C. in Example 8.
  • ⁇ -glucosidase (EC 3.2.1.21) is a generic term for enzymes that specifically catalyze the hydrolysis reaction of ⁇ -D-glucopyranoside bonds. It is also called cellobiase because it decomposes cellobiose into glucose, and it is widely distributed in bacteria, filamentous fungi, plants and animals. There are many genes encoding ⁇ -glucosidase in each species. For example, in Aspergillus oryzae, which is one type of filamentous fungus, the presence of bgl1 to bgl7 has been reported (Soy protein Research, Japan 12, p78-83, 2009, and Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-086310). ).
  • the “ ⁇ -glucosidase derived from a filamentous fungus” means a wild-type ⁇ -glucosidase inherent in the filamentous fungus.
  • a filamentous fungus is a eukaryotic microorganism composed of tubular cells called mycelium among fungi. Examples of the filamentous fungi include the genus Aspergillus, the genus Trichoderma, the genus Fusarium, the genus Penicillium, and the genus Acremonium.
  • Aspergillus fungi examples include Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Aspergillus acretas, Aspergillus niger, Aspergillus pulgures sperguls pelberlentus (Asperguls pelberlentus (Asperguls pelger sulgi). Etc.
  • FIG. 1 shows the phylogenetic tree of ⁇ -glucosidase derived from filamentous fungi, together with the homology (%: numerical value at the end of each ⁇ -glucosidase) with BGL1 (AaBGL1) encoded by the bgl1 gene of Aspergillus accretus.
  • the first six characters of each ⁇ -glucosidase are the accession numbers registered in the UniProtKB / Swiss-Prot database.
  • high glucose inhibition resistance means that the ratio of glucosidase activity in the presence of glucose to the activity catalyzing the hydrolysis reaction of ⁇ -D-glucopyranoside bond in the absence of glucose (hereinafter referred to as glucosidase activity).
  • glucosidase activity The relative activity value of the glucosidase activity in the presence of glucose when the glucosidase activity in the absence of glucose is defined as 100%
  • high heat stability means that the ratio of the glucosidase activity when the heat treatment is performed to the glucosidase activity when the heat treatment is not performed before the enzyme reaction is high.
  • the transformant of the present invention has a structural gene sequence containing a region encoding the following modified ⁇ -glucosidase, and a promoter sequence and terminator sequence for expressing the structural gene in the chromosome or as an extrachromosomal gene. It is characterized by that.
  • the modified ⁇ -glucosidase is a ⁇ -glucosidase derived from a filamentous fungus having at least one mutation selected from the group consisting of (Mutation 1) to (Mutation 6) described later, and ⁇ -glucosidase having no such mutation. It is more heat stable or resistant to glucose inhibition than glucosidase.
  • This modified ⁇ -glucosidase can be obtained by introducing a specific amino acid substitution mutation into ⁇ -glucosidase derived from a filamentous fungus.
  • the modified ⁇ -glucosidase is an enzyme having one or more mutations selected from the group consisting of the following (mutation 1) to (mutation 6) and having glucosidase activity as compared with ⁇ -glucosidase derived from filamentous fungi It is.
  • the modified ⁇ -glucosidase having mutation 2 or 4 has improved glucose inhibition resistance as compared with ⁇ -glucosidase not having the mutation.
  • the modified ⁇ -glucosidase having the mutation 3, mutation 5 or mutation 6 has improved thermal stability as compared with ⁇ -glucosidase not having the mutation.
  • the modified ⁇ -glucosidase having the mutation 1 has both improved glucose inhibition resistance and thermal stability as compared with ⁇ -glucosidase not having the mutation.
  • Mutation 1 a mutation in which the amino acid corresponding to the 244th isoleucine of AaBGL1 (BGL1 of Aspergillus acculeatus) is substituted with phenylalanine.
  • Mutation 2 A mutation in which the amino acid corresponding to the 282nd glycine of AaBGL1 is substituted with phenylalanine.
  • Mutation 3 A mutation in which the amino acid corresponding to the 442nd asparagine of AaBGL1 is substituted with serine.
  • Mutation 4 A mutation in which the amino acid corresponding to the 452nd glycine of AaBGL1 is substituted with serine.
  • Mutation 5 A mutation in which the amino acid corresponding to the 503rd valine of AaBGL1 is substituted with alanine.
  • Mutation 6 A mutation in which the amino acid corresponding to the 613rd arginine of AaBGL1 is replaced with leucine.
  • the six mutations possessed by the modified ⁇ -glucosidase may be only one of these mutations, or two or more mutations may be combined.
  • the modified ⁇ -glucosidase having mutation 2 and mutation 4 is more resistant to glucose inhibition than the modified ⁇ -glucosidase having a single mutation.
  • the modified ⁇ -glucosidase having mutation 5 and mutation 6 has higher thermal stability than the modified ⁇ -glucosidase having mutation 5 alone.
  • the modified ⁇ -glucosidase having mutation 3, mutation 5 and mutation 6 has higher thermal stability than the modified ⁇ -glucosidase having mutation 5 and mutation 6.
  • the modified ⁇ -glucosidase having mutation 1, mutation 2, mutation 5, and mutation 6 has higher thermal stability than the modified ⁇ -glucosidase having only mutation 1 and mutation 2.
  • amino acid corresponding to the Xth amino acid of AaBGL1 in a certain ⁇ -glucosidase refers to the amino acid sequence of AaBGL1 (SEQ ID NO: 1) and the amino acid sequence of the ⁇ -glucosidase, It means an amino acid at a position corresponding to the Xth amino acid of AaBGL1 when alignment is performed so that the homology is maximized.
  • FIG. 2 shows the result of alignment of the amino acid sequence of AaBGL1 and the amino acid sequence of ⁇ -glucosidase derived from other filamentous fungi.
  • the amino acid corresponding to the 244th isoleucine of AaBGL1 is the 245th valine in Aspergillus oryzae and Aspergillus tereus, and the 244th valine in Aspergillus niger. In Emericella nidulans, it is the 247th isoleucine.
  • the amino acid corresponding to the 282nd glycine of AaBGL1 is the 283rd threonine in Aspergillus oryzae, the 283rd serine in Aspergillus tereus, the 282nd alanine in Aspergillus niger, and Emerycera nidulans.
  • the amino acid corresponding to the 442nd asparagine of AaBGL1 is the 443rd asparagine in Aspergillus oryzae, the 443rd asparagine in Aspergillus tereus, the 442nd asparagine in Aspergillus niger, and Emerycera nidulans. Then it is 445th glutamine.
  • the amino acid corresponding to the 452nd glycine of AaBGL1 is the 453rd glycine in Aspergillus oryzae and Aspergillus tereus, the 452nd glycine in Aspergillus niger, and the 455th glycine in Emerycera Nidulans.
  • the amino acid corresponding to the 503rd valine of AaBGL1 is the 504th valine in Aspergillus oryzae and Aspergillus tereus, the 503rd valine in Aspergillus niger, and the 506th valine in Emerycera Nidulans. .
  • the amino acid corresponding to the 613rd arginine of AaBGL1 is the 614th lysine in Aspergillus oryzae, the 614th threonine in Aspergillus tereus, the 613th threonine in Aspergillus niger, and Emerycera nidulans. Then, it is the 616th threonine.
  • the wild-type ⁇ -glucosidase having no mutation in the present invention is a protein derived from a filamentous fungus and has only to have glucosidase activity, but is preferably BGL1 from the viewpoint of high enzyme activity.
  • the wild-type ⁇ -glucosidase may be derived from any filamentous fungus as long as it is derived from a filamentous fungus, but ⁇ -glucosidase derived from a filamentous fungus of the genus Aspergillus is preferred, and Aspergillus oryzae or Aspergillus accretus
  • the derived ⁇ -glucosidase is preferred.
  • ⁇ -glucosidase derived from Aspergillus acretas is preferable, and AaBGL1 is more preferable because it has a high ability to decompose crystalline cellulose and is excellent in monosaccharide production. According to Dr.
  • the modified ⁇ -glucosidase in the present invention has one or more mutations among the above (mutation 1) to (mutation 6) as compared with wild-type ⁇ -glucosidase derived from a filamentous fungus.
  • mutations among the above (mutation 1) to (mutation 6) as compared with wild-type ⁇ -glucosidase derived from a filamentous fungus.
  • mutations or modifications other than the mutation as long as the effect of the mutation is not impaired and the glucosidase activity is not impaired. You may do it.
  • the modified ⁇ -glucosidase having such other mutations include, for example, one or more amino acids of wild type ⁇ -glucosidase, preferably 1 to several tens, more preferably 1 to several tens, and even more preferably 1.
  • a protein having -9, more preferably 1 to several amino acid deletions, substitutions, or additions and having glucosidase activity is selected from the group consisting of the above (mutation 1) to (mutation 6).
  • Examples include one or more selected mutations.
  • an N-terminal or C-terminal region of wild-type ⁇ -glucosidase lacking a region consisting of 1 to several tens of amino acids that does not affect glucosidase activity and the above (mutation 1) to (mutation)
  • Those having one or more mutations selected from the group consisting of 6) can be modified ⁇ -glucosidase.
  • the modified ⁇ -glucosidase in the present invention has a homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of 60% or more, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, still more preferably 75% or more, and still more
  • the protein having an activity of catalyzing the hydrolysis reaction of ⁇ -D-glucopyranoside bond that is 80% or more has one or more mutations selected from the group consisting of (mutation 1) to (mutation 6). It may exist.
  • the host of the transformant of the present invention is Schizosaccharomyces yeast.
  • the yeast of the genus Schizosaccharomyces used in the present invention may be a wild type or a mutant type in which a specific gene is deleted or inactivated depending on the use.
  • a known method can be used as a method for deleting or inactivating a specific gene. Specifically, the gene can be deleted by using the Latour method (described in Nucleic Acids Res, 2006, Vol. 34, No. e11, and International Publication No. 2007/063919).
  • the gene can be inactivated by introducing a mutation into a part of the gene.
  • yeasts belonging to the genus Schizosaccharomyces from which a specific gene has been deleted or inactivated are described in, for example, International Publication No. 2002/101038, International Publication No. 2007/015470.
  • a yeast having a marker for selecting a transformant as a yeast belonging to the genus Schizosaccharomyces.
  • a host in which a specific nutritional component is essential for growth because a certain gene is missing When a transformant is produced by transforming with a vector containing the target gene sequence, the transformant can be auxotrophic of the host by incorporating this missing gene (auxotrophic complementary marker) into the vector. Sex disappears. Due to the difference in auxotrophy between the host and the transformant, the transformant can be obtained by distinguishing both.
  • a yeast that belongs to the genus Schizosaccharomyces that is uracil-required by deletion or inactivation of the orotidine 5′-phosphate decarboxylase gene has a ura4 gene (auxotrophic complementary marker).
  • ura4 gene auxotrophic complementary marker
  • the gene that becomes auxotrophic due to deletion in the host is not limited to the ura4 gene as long as it is used for selection of transformants, and may be an isopropylmalate dehydrogenase gene (leu1 gene) or the like.
  • yeast belonging to the genus Schizosaccharomyces examples include Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces japonicus and Schizosaccharomyces octosposcospospoc.
  • Schizosaccharomyces yeasts Schizosaccharomyces pombe is preferred because various useful mutants can be used.
  • An expression cassette is a combination of DNA necessary for expressing a protein, and includes a structural gene encoding the protein and a promoter and terminator that function in yeast of the genus Schizosaccharomyces.
  • the transformant of the present invention comprises a structural gene sequence containing a region encoding the modified ⁇ -glucosidase (modified ⁇ -glucosidase-containing structural gene sequence), and a promoter sequence and a terminator sequence for expressing the structural gene.
  • the containing expression cassette is prepared by introducing it into a yeast of the genus Schizosaccharomyces.
  • the expression cassette may further contain any one or more of a 5'-untranslated region and a 3'-untranslated region.
  • a preferred expression cassette is an expression cassette containing all of the modified ⁇ -glucosidase-containing structural gene sequence, promoter, terminator, 5'-untranslated region, and 3'-untranslated region. Further, it may have a gene such as an auxotrophic complementary marker.
  • the nucleotide sequence of the region encoding the modified ⁇ -glucosidase in the modified ⁇ -glucosidase-containing structural gene sequence is converted into (mutant 1) to (mutant 6) by the genetic engineering method to the structural gene of the wild type ⁇ -glucosidase. It is obtained by performing base substitution reflecting at least one or more amino acid substitutions and other modifications as necessary. Further, except for the modified portion, a gene encoding ⁇ -glucosidase derived from a filamentous fungus may be used as it is. However, in order to increase the expression level in yeast of the genus Schizosaccharomyces, the above gene sequence is expressed as follows. It is preferable to modify the codon that is frequently used in a highly expressed gene in the genus yeast.
  • the modified ⁇ -glucosidase-containing structural gene sequence may have a region encoding another peptide or protein in addition to the region encoding the modified ⁇ -glucosidase.
  • a protein in which another peptide or the like is bound to the N-terminal or C-terminal of the modified ⁇ -glucosidase is produced.
  • the peptide to be bound to the modified ⁇ -glucosidase include a secretion signal, a signal such as a signal for transfer to a specific organelle, a tag such as a His tag and a FLAG tag.
  • the various signals need to be signals that function in Schizosaccharomyces yeasts.
  • a secretion signal is a peptide having a function of secreting an expressed protein outside the host cell by being present at the N-terminus.
  • a secretion signal that functions in Schizosaccharomyces yeasts the P3 signal described in WO 1996/23890 is particularly preferable.
  • the modified ⁇ -glucosidase-containing structural gene sequence is preferably a sequence in which a region encoding a secretory signal is bound to the 5 ′ end side of the region encoding the modified ⁇ -glucosidase.
  • the promoter and terminator are not particularly limited as long as they can function in the yeast of the genus Schizosaccharomyces and can express the modified ⁇ -glucosidase.
  • promoters that function in Schizosaccharomyces yeasts promoters originally possessed by Schizosaccharomyces yeasts (preferably having high transcription initiation activity) and promoters originally possessed by Schizosaccharomyces yeasts (such as virus-derived promoters) Can be used. Two or more promoters may be present in the vector.
  • promoters inherent to Schizosaccharomyces yeast include, for example, alcohol dehydrogenase gene promoter, nmt1 gene promoter involved in thiamine metabolism, fructose-1, 6-bisphosphatase gene promoter involved in glucose metabolism, and catabolite repression Invertase gene promoters (see International Publication No. 99/23223), heat shock protein gene promoters (see International Publication No. 2007/26617), and the like.
  • promoters that Schizosaccharomyces yeast originally does not include are those derived from animal cell viruses described in JP-A-5-15380, JP-A-7-163373, and JP-A-10-234375.
  • HCMV promoter and SV40 promoter are preferable.
  • a terminator that functions in the yeast belonging to the genus Schizosaccharomyces a terminator inherent in the yeast belonging to the genus Schizosaccharomyces or a terminator not inherent in the yeast belonging to the genus Schizosaccharomyces can be used. Two or more terminators may be present in the vector. Examples of the terminator include human terminators described in JP-A-5-15380, JP-A-7-163373, and JP-A-10-234375, and human lipocortin I terminator is preferable. .
  • a method for producing a transformant of the genus Schizosaccharomyces of the present invention (hereinafter referred to as a method for producing the transformant of the present invention) is characterized by transforming a yeast of the genus Schizosaccharomyces with a vector containing the expression cassette. To do.
  • the expression cassette containing Shizosaccharomyces yeast, the modified ⁇ -glucosidase, the filamentous fungus, and the modified ⁇ -glucosidase-containing structural gene sequence as the host is as described above.
  • a vector used for production of the transformant of the present invention contains the above-described expression cassette. Moreover, it is preferable that a selection marker is included. For example, it is preferable to use a vector incorporating the auxotrophic complementary marker according to the auxotrophy of the host. Furthermore, the vector in the present invention preferably has a secretory signal gene that functions in the yeast of the genus Schizosaccharomyces. The position of the secretion signal gene is on the 5 ′ end side of the ⁇ -glucosidase structural gene. A heterologous protein having a secretory signal added to the N-terminus is expressed from a heterologous protein structural gene having a secretory signal gene bound to the 5 'end.
  • This heterologous protein has its secretion signal cleaved by the endoplasmic reticulum or Golgi apparatus in the host, and then the heterologous protein from which the secretion signal has been removed is secreted outside the cell.
  • Secretion signal genes are required to function in Schizosaccharomyces yeasts.
  • a secretory signal gene that functions in the yeast of the genus Schizosaccharomyces, for example, those described in International Publication No. 1996/23890 can be used.
  • the vector used for production of the transformant of the present invention is a vector having a circular DNA structure or a linear DNA structure.
  • the vector is a sequence for replication in the yeast of the genus Schizosaccharomyces, that is, A plasmid containing an autonomously replicating sequence (ARS) is preferable.
  • ARS autonomously replicating sequence
  • a transformant in which an expression cassette is integrated into the chromosome of Schizosaccharomyces yeast is preferred from the viewpoint of subculture.
  • the incorporated expression cassette becomes difficult to drop off, and the maintenance stability in passage becomes extremely high. That is, a transformant in which an expression cassette is integrated into a chromosome can produce a heterologous protein with more stable productivity.
  • the vector for producing the transformant integrated in the chromosome of the yeast of the genus Schizosaccharomyces will be described.
  • Incorporation of the expression cassette into the chromosome is preferably by homologous recombination because it can be incorporated at any position in the chromosome.
  • a vector When a vector is introduced into a host with a linear DNA structure, if the vector has a circular DNA structure such as a commonly used plasmid DNA, the vector is linearly cut with a restriction enzyme and then introduced into cells of Schizosaccharomyces yeast. It is preferable to introduce. In this case, the position for opening the vector having a circular DNA structure is within the recombination site. As a result, the recombination sites partially exist at both ends of the opened vector, and the entire vector is integrated into the target site of the chromosome by homologous recombination.
  • a circular DNA structure such as a commonly used plasmid DNA
  • the vector can have a linear DNA structure in which a part of the recombination site exists at each end, a method other than the method of cleaving a vector having a circular DNA structure, such as an enzymatic amplification method or a chemistry by PCR. It may be constructed by a synthesis method.
  • plasmids derived from E. coli such as pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, and pUC19 can be preferably used.
  • a vector constructed using a plasmid derived from E. coli usually has a replication initiation region called “ori” necessary for replication in E. coli. Even when not using the above-mentioned plasmid derived from Escherichia coli, when using Escherichia coli to construct and amplify the vector in the present invention, the above “ori” is utilized, and the vector having “ori” Is obtained.
  • the vector used for homologous recombination preferably has a replication initiation region called “ori” that is necessary for replication in E. coli.
  • ori replication initiation region
  • the method for constructing the vector from which the replication initiation region has been removed is not particularly limited, but the method described in JP-A-2000-262284 is preferably used. That is, a method is preferred in which a precursor vector in which a replication initiation region is inserted at the cleavage site in the recombination site is constructed so that the replication initiation region is excised at the same time as the linear DNA structure as described above. Thereby, a vector from which the replication initiation region has been easily removed can be obtained.
  • expression vectors described in JP-A-5-15380, JP-A-7-163373, International Publication No. 96/23890, JP-A-10-234375, and the construction method thereof are applied for expression.
  • a method may be used in which a precursor vector having a cassette and a recombination site is constructed, and a vector used for homologous recombination is obtained by further removing the replication initiation region from the precursor vector by an ordinary genetic engineering technique.
  • the number of expression cassettes in the vector may be only one or two or more.
  • the vector used for producing the transformant of the present invention preferably has 1 to 8 expression cassettes, and particularly preferably 1 to 4 expression cassettes.
  • the number of expression cassettes possessed by the vector is 2 or more, it becomes easier to increase the number of expression cassettes incorporated into the chromosomes of Schizosaccharomyces yeast and increase the expression level of heterologous proteins.
  • the number of expression cassettes in the vector is 2 or more, a plurality of expression cassettes are continuously incorporated at the same location of the chromosome of Schizosaccharomyces yeast.
  • the number of expression cassettes contained in the vector is 8 or less, it is easy to suppress the reduction of the vector integration efficiency due to homologous recombination due to the vector becoming too large. If the number of expression cassettes is 4 or less, the incorporation efficiency can be further increased.
  • the number of expression cassettes incorporated can be increased even if the number of expression cassettes in the vector is one.
  • two or more expression cassettes may be incorporated at the same location on the chromosome of the yeast of the genus Schizosaccharomyces.
  • the expression level of the modified ⁇ -glucosidase per transformant can be varied. Aligned in converters. For example, when assessing the effect of various mutations on glucosidase activity, aligning the expression level of modified ⁇ -glucosidase for each transformant, the cultured transformant (when secreted extracellularly) In addition, by comparing the glucose activity per dry weight of the culture supernatant), the glucose activity of the modified ⁇ -glucosidase produced by each transformant can be comparatively evaluated.
  • the recombination site of the vector is a site having a base sequence that allows homologous recombination to be performed on the target site of homologous recombination in the chromosome of Schizosaccharomyces yeast.
  • the target site is a site that becomes a target for incorporating an expression cassette in the chromosome of Schizosaccharomyces yeast.
  • the target site can be freely set by setting the recombination site of the vector to a base sequence that allows homologous recombination to be performed on the target site.
  • the homology between the base sequence of the recombination site and the base sequence of the target site must be 70% or more. Further, the homology between the base sequence of the recombination site and the base sequence of the target site is preferably 90% or more, and more preferably 95% or more from the viewpoint that homologous recombination is likely to occur.
  • the expression cassette is incorporated into the target site by homologous recombination.
  • the length of the recombination site is preferably 20 to 2000 bp. If the length of the recombination site is 20 bp or more, homologous recombination is likely to occur. Moreover, if the length of the recombination site is 2000 bp or less, it is easy to prevent the vector from becoming too long and causing homologous recombination to hardly occur.
  • the length of the recombination site is more preferably 100 bp or more, and further preferably 200 bp or more. Further, the length of the recombination site is more preferably 800 bp or less, and further preferably 400 bp or less.
  • the target site for incorporating the expression cassette is one of the chromosomes of the yeast belonging to the genus Schizosaccharomyces without the essential gene being deleted or inactivated. It is preferable that the target site exists at the position of. If there is only one target site, the number of expression cassettes incorporated into the chromosome is constant and comparison between mutant strains is facilitated, so that the selectivity of the modified protein is further improved.
  • the essential gene is a gene that cannot grow when the gene is deleted or inactivated, and means a gene that is essential for the growth of the transformant of the present invention.
  • the target sites for incorporating the expression cassette are (1) two or more target sites existing on different chromosomes among the chromosomes of the yeast of the genus Schizosaccharomyces. Or (2) two or more target sites present at a plurality of positions on the same chromosome so that one or more essential genes are sandwiched therebetween, or a plurality satisfying both (1) and (2) A target site is preferred.
  • These two or more target sites are sites having substantially the same base sequence.
  • the substantially identical base sequence means that the homology of the base sequences of the target sites is 90% or more.
  • the homology between target sites is preferably 95% or more, and more preferably 99% or more.
  • the expression cassettes are dispersed and incorporated in the chromosomes, so that the incorporated expression cassettes are difficult to drop off, and The maintenance stability at is extremely high. Therefore, a heterologous protein can be stably produced with high productivity.
  • the target sites are set in this way, even if a plurality of target sites exist at different positions, the vector can be easily incorporated into these target sites with a single vector. it can.
  • the number of target sites to incorporate the vector is 5 or more. If the number of target sites is 5 or more, it becomes easy to increase the number of expression cassettes incorporated into the chromosome, so that the productivity of the heterologous protein is further improved. More preferably, the target site is 10 to 60 sites. If there are 10 or more target sites, the number of expression cassettes incorporated into the chromosome can be further increased, and the productivity of heterologous proteins can be further improved. If the target site is 60 sites or less, it is easy to suppress that the expression cassette incorporated in the chromosome becomes too much and the expression level of the heterologous protein decreases.
  • the target site is preferably a base sequence in the transposon gene Tf2 from the viewpoint that an expression cassette can be incorporated at once into a target site that is dispersed on a plurality of chromosomes of Schizosaccharomyces yeast with a single vector.
  • Tf2 is a transposon gene of about 4900 bp in length (number of bases) that is present in a total of 13 locations on each of the three chromosomes, and the base sequence homology with each other is 99.7%. (See Nathan J. Bowen et al, Genome Res. 2003 13: p1984-1997).
  • the target site is not limited to the above.
  • a target site eg, a gene
  • a target site having a plurality of substantially identical base sequences having a length equal to or longer than the recombination site in the chromosome
  • a vector may be introduced into the target site.
  • Transformation method Using the above-mentioned vector, a yeast of the genus Schizosaccharomyces is transformed.
  • any known method for transforming yeast of the genus Schizosaccharomyces can be used. Examples of such transformation methods include conventionally known methods such as lithium acetate method, electroporation method, spheroplast method, glass bead method, and the method described in JP-A-2005-198612. it can.
  • a commercially available yeast transformation kit may also be used.
  • the obtained transformant is usually selected.
  • the selection method include the following methods. Screening is performed with a medium capable of selecting transformants using the auxotrophic marker, and a plurality of colonies obtained are selected. Next, after culturing them separately in liquid culture, the amount of heterologous protein expressed in each transformant (or culture supernatant when secreted outside the cell) is examined, and the amount of heterologous protein expressed is greater. A transformant is selected. Moreover, the number of vectors integrated in the chromosome and the number of expression cassettes can be examined by performing genome analysis by pulse field gel electrophoresis on the selected transformants.
  • the transformant of the present invention can be cultured in the same manner as natural Schizosaccharomyces yeasts.
  • a culture solution for culturing the transformant of the present invention a known yeast culture medium can be used, which contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by Schizosaccharomyces yeast. Any yeast can be used as long as it can efficiently culture Zosaccharomyces yeasts.
  • a natural medium or a synthetic medium may be used as the culture solution.
  • Examples of the carbon source include sugars such as glucose, fructose, and sucrose.
  • Examples of the nitrogen source include inorganic acids such as ammonia, ammonium chloride, and ammonium acetate, ammonium salts of inorganic acids, peptone, and casamino acids.
  • examples of inorganic salts include magnesium phosphate, magnesium sulfate, and sodium chloride.
  • a well-known yeast culture method can be used for culture
  • the culture temperature is preferably 23 to 37 ° C.
  • the culture time can be determined as appropriate.
  • the culture may be batch culture or continuous culture.
  • the transformant of the present invention is a Schizosaccharomyces yeast that can produce a modified ⁇ -glucosidase having higher heat stability or glucose inhibition resistance than wild-type ⁇ -glucosidase. Since the transformant can produce a modified ⁇ -glucosidase, it can assimilate cellobiose.
  • the modified ⁇ -glucosidase can be obtained from the cells obtained by culturing the transformant of the present invention.
  • a known protein separation method can be used. For example, after culturing, the microbial cells are separated from the culture broth, and the microbial cells are destroyed to obtain a cell disruption solution containing modified ⁇ -glucosidase. From the cell disruption solution, a known protein separation method such as salting out, Modified ⁇ -glucosidase can be obtained by column purification, chromatography, immunoprecipitation, or the like.
  • modified ⁇ -glucosidase is secreted extracellularly.
  • modified ⁇ -glucosidase can be obtained from the culture supernatant using a known protein separation method.
  • the culture supernatant containing the modified ⁇ -glucosidase is recovered from the culture medium cultured for a certain period of time by centrifugation or the like, and the culture medium is repeatedly added to the remaining cells and cultured. Can be cultured to produce ⁇ -glucosidase.
  • a transformant is cultured, and a modified ⁇ -glucosidase is separated or purified from the culture supernatant or bacterial cells to produce biomass containing cellulose, endoglucanase, and cellobio.
  • a method of incubation with hydrase is mentioned.
  • known reaction conditions for ⁇ -glucosidase can be employed.
  • the preferred pH in the decomposition reaction solution with the modified ⁇ -glucosidase is 3.0 to 8.0, and the preferred reaction temperature is 20 to 65 ° C.
  • the culture supernatant or cell lysate may be directly contacted with the cellulose to be decomposed.
  • the transformant when using a transformant in which an expression cassette having a region encoding a secretion signal is introduced at the 5 ′ end of a region encoding a modified ⁇ -glucosidase, the transformant is used in a culture medium containing cellulose.
  • the cellulose in the culture solution can be decomposed with the modified ⁇ -glucosidase secreted into the culture solution after culturing.
  • Specific methods for decomposing cellulose include, for example, a method of culturing the transformant in the presence of the biomass, and a method of mixing and incubating the transformant cultured with the biomass.
  • general culture conditions for Schizosaccharomyces yeasts can be adopted as the culture conditions.
  • the preferred pH of the culture solution is 3.0 to 8.0, and the preferred culture temperature is 23 to 37 ° C.
  • Example 1 ⁇ Preparation of transformant of Schizosaccharomyces pombe producing AaBGL1> A gene sequence was designed in which the AaBGL1 peptide sequence represented by SEQ ID NO: 1 was replaced with a highly expressed codon of Schizosaccharomyces pombe (see SEQ ID NO: 2, hereinafter referred to as AaBGL1 gene). KpnI and BspHI recognition sequences were added before the start codon. XbaI and SacI recognition sequences were added after the stop codon. A plasmid containing this sequence (manufactured by Gene Art, Regensburg, Germany) was digested with restriction enzymes BspHI and XbaI.
  • pSL6lacZ was digested with restriction enzymes AarI and XbaI and treated with alkaline phosphatase. After this treatment, electrophoresis was performed on an agarose gel, the vector pSL6 fragment and the above AaBGL1 gene fragment were excised from the agarose gel, ligated, and then introduced into E. coli DH5 ⁇ (Takara Bio Inc.) for transformation. A vector was prepared from the obtained transformant, and the target expression vector pSL6AaBGL1 (see FIG. 3, SEQ ID NO: 3) was obtained. From the construction of the restriction enzyme map, the target vector was confirmed.
  • P3AaBGL1 in which a secretory signal P3 signal was added to the N-terminal deletion of the AaBGL1 deleted N-terminal 19 amino acids, an In-fusion primer was used as a template for pSL6AaBGL1.
  • the AaBGL1 gene fragment was amplified by PCR.
  • pSL6P3lacZ was digested with restriction enzymes AflII and XbaI. This fragment and the AaBGL1 gene fragment obtained by PCR were circularized by the In-fusion method, and then introduced into E. coli DH5 ⁇ for transformation.
  • a vector was prepared from the obtained transformant, and the target expression vector pSL6P3AaBGL1 (see FIG. 4, SEQ ID NO: 5) was obtained. From the construction of restriction enzyme maps and the confirmation of partial nucleotide sequences, it was confirmed to be the target vector.
  • p3AaBGL1 gene fragment was amplified by error-prone PCR using pSL6P3AaBGL1 as a template and the primer represented by SEQ ID NO: 6 and the primer represented by SEQ ID NO: 7.
  • Diversity PCR Random Mutagenesis Kit (Clontech) was used.
  • a leu1 + promoter fragment was amplified by PCR using pSL6P3AaBGL1 as a template and a primer represented by SEQ ID NO: 8 and a primer represented by SEQ ID NO: 9.
  • the terminator top2 fragment was amplified by PCR using pSL6P3AaBGL1 as a template and the primer represented by SEQ ID NO: 10 and the primer represented by SEQ ID NO: 11.
  • PrimeSTAR Max DNA polymerase manufactured by Takara Bio Inc.
  • the restriction enzyme DpnI was added to the reaction solution of these three fragments, the template was digested, and purified using SUPREC-PCR (manufactured by Takara Bio Inc.) for primer replacement.
  • P3AaBGL1 mutant strain By using 0.1% glucose and 2% cellobiose as the carbon source for the minimal agar medium, only the active P3AaBGL1 mutant strain can use cellobiose as the carbon source. Therefore, only the P3AaBGL1 mutant strain that has a large colony formation and retains its activity. Can be selected. After 5 days, a transformant (P3AaBGL1 mutant) was obtained. This was designated as a P3AaBGL1 mutant library.
  • the ratio (%) of the colorimetric quantitative value of each reaction solution when the colorimetric quantitative value of the control sample (sample not added with glucose) was 100% was defined as the residual activity at the time of glucose inhibition.
  • the residual activity of each mutant was compared with the results of the ASP3326 strain, and a mutant strain with altered glucose inhibition resistance was selected. (Thermal stability measurement) To 10 ⁇ l of 20 mM pNPG, 10 ⁇ l of 1M sodium acetate buffer (pH 5.0) and 130 ⁇ l of water were added, and 50 ⁇ l of an enzyme-diluted sample heat-treated at 65 ° C. to 70 ° C. for 10 minutes was added and reacted at 37 ° C. for 10 minutes.
  • an enzyme-diluted sample that was not heat-treated was similarly reacted at 37 ° C. for 10 minutes.
  • the reaction was stopped by adding 100 ⁇ l of 2% sodium carbonate solution to 100 ⁇ l of each reaction solution, and the amount of liberated p-nitrophenol was colorimetrically determined at a wavelength of 450 nm.
  • the ratio (%) of the colorimetric value of each reaction solution was defined as the residual activity after heat treatment.
  • the mutants with improved thermal stability were selected by comparing the residual activity of each mutant with the results of the ASP3326 strain.
  • the P3AaBGL1 mutant obtained above was cultured in a YES medium at 30 ° C. for 1 day. 100 ⁇ l of this culture solution was transferred to 5 ml of YPD medium (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose) and cultured at 30 ° C. for 2 days. This culture solution was centrifuged to obtain a culture supernatant.
  • YPD medium 1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose
  • a P3AaBGL1 mutant gene fragment was amplified by PCR using In-fusion primers (primer represented by SEQ ID NO: 16 and primer represented by SEQ ID NO: 17).
  • pSL6P3lacZ was digested with restriction enzymes AflII and XbaI.
  • This fragment and the P3AaBGL1 mutant gene fragment obtained by PCR were circularized by the In-fusion method, and then introduced into E. coli DH5 ⁇ for transformation.
  • a vector was prepared from the obtained transformant, and an expression vector pSL6P3AaBGL1mutXX (XX is a mutant strain name) was obtained.
  • the base sequences in the P3AaBGL1 gene of the pSL6P3AaBGL1mutXX vector and the P3AaBGL1 mutant gene fragment were confirmed, and the mutation introduction point was identified.
  • the mutation introduced into P3AaBGL1 the glucosidase activity
  • the residual activity of the glucosidase activity when the glucose concentration in the culture solution is 20 mM and 50 mM (the glucose concentration in the culture solution is Relative value for glucosidase activity when 0 mM)
  • residual activity of glucosidase activity after incubation of the culture solution at 65 ° C. and 67 ° C. for 10 minutes (relative to glucosidase activity when the heat treatment of the culture solution before enzyme reaction is untreated)
  • Table 7 shows the relative values.
  • Example 2 ⁇ Preparation of G298X Site-Saturation Mutagenesis Fragment> Specific amino acid substitution of G298 was performed using degenerate primers.
  • the leu1 + -G298X fragment was amplified by PCR using pSL6P3AaBGL1 as a template and the primer represented by SEQ ID NO: 8 and the primer represented by SEQ ID NO: 18.
  • the G298X-top2 fragment was amplified by PCR using the primer represented by SEQ ID NO: 19 and the primer represented by SEQ ID NO: 11.
  • the restriction enzyme DpnI was added to the reaction solution of these two fragments, the template was digested, and purified using SUPREC-PCR for primer replacement.
  • the leu1 + -G298X-top2 fragment was amplified by PCR using 50 ng of the two fragments after purification, the primer represented by SEQ ID NO: 12, and the primer represented by SEQ ID NO: 13. Thereafter, the column was purified by SUPREC-PCR.
  • a mutant was prepared in the same manner as in Example 1 except that the above leu1 + -G298X-top2 fragment was used as a mutant gene-incorporated fragment. Measurement of glucose inhibition and incubation temperature of the obtained culture supernatant of the mutant were 50. Measure the thermostability between °C and 75 °C, select a mutant whose activity has changed compared to the ASP3326 strain, and select the base in the P3AaBGL1 gene integrated in the chromosome of the selected mutant The sequence was confirmed and the 298th amino acid was identified. As a result, in the P3AaBGL1 mutant strain in which glucose inhibition resistance or heat stability was changed as compared with the ASP3326 strain, the 298th amino acid was serine, phenylalanine, or proline.
  • Example 3 ⁇ Preparation of V519X Site-Saturation Mutagenesis Fragment> Specific amino acid substitution of V519 was performed using degenerate primers.
  • the leu1 + -V519X fragment was amplified by the PCR method using pSL6P3AaBGL1 as a template and the primer represented by SEQ ID NO: 8 and the primer represented by SEQ ID NO: 20.
  • the V519X-top2 fragment was amplified by PCR using the primer represented by SEQ ID NO: 21 and the primer represented by SEQ ID NO: 11.
  • the restriction enzyme DpnI was added to the reaction solution of these two fragments, the template was digested, and purified using SUPREC-PCR for primer replacement.
  • the leu1 + -V519X-top2 fragment was amplified by the PCR method using 50 ng of the two fragments after purification, the primer represented by SEQ ID NO: 12, and the primer represented by SEQ ID NO: 13. Thereafter, the column was purified by SUPREC-PCR.
  • a mutant strain was prepared in the same manner as in Example 1 except that the leu1 + -V519X-top2 fragment was used as a mutant gene-incorporated fragment. Measurement of glucose inhibition and incubation temperature of the obtained culture supernatant of the mutant strain was 50. Measure the thermostability between °C and 75 °C, select a mutant whose activity has changed compared to the ASP3326 strain, and select the base in the P3AaBGL1 gene integrated in the chromosome of the selected mutant The sequence was confirmed and the 519th amino acid was identified. As a result, in the P3AaBGL1 mutant strain whose glucose inhibition resistance or heat stability was changed as compared with the ASP3326 strain, the 519th amino acid was alanine, glycine, or cysteine.
  • the leu1 + -Q142X-top2 fragment was amplified by PCR using 50 ng of the two fragments after purification, the primer represented by SEQ ID NO: 12, and the primer represented by SEQ ID NO: 13. Thereafter, the column was purified by SUPREC-PCR.
  • a mutant strain was prepared in the same manner as in Example 1 except that the leu1 + -Q142X-top2 fragment was used as the mutant gene integration fragment. Measurement of glucose inhibition and incubation temperature of the obtained culture supernatant of the mutant strain were 50. Measure the thermostability between °C and 75 °C, select a mutant whose activity has changed compared to the ASP3326 strain, and select the base in the P3AaBGL1 gene integrated in the chromosome of the selected mutant The sequence was confirmed and the 142nd amino acid was identified. As a result, in the P3AaBGL1 mutant strain in which glucose inhibition resistance or heat stability was changed as compared with the ASP3326 strain, the 142nd amino acid was asparagine or arginine.
  • Example 5 ⁇ Preparation of G468X Site-Saturation Mutagenesis Fragment> A specific amino acid substitution of G468 was performed using a degenerate primer.
  • the leu1 + -G468X fragment was amplified by the PCR method using pSL6P3AaBGL1 as a template and the primer represented by SEQ ID NO: 8 and the primer represented by SEQ ID NO: 24.
  • the G468X-top2 fragment was amplified by PCR using the primer represented by SEQ ID NO: 25 and the primer represented by SEQ ID NO: 11.
  • the restriction enzyme DpnI was added to the reaction solution of these two fragments, the template was digested, and purified using SUPREC-PCR for primer replacement.
  • the leu1 + -G468X-top2 fragment was amplified by the PCR method using 50 ng of the two fragments after purification, the primer represented by SEQ ID NO: 12, and the primer represented by SEQ ID NO: 13. Thereafter, the column was purified by SUPREC-PCR.
  • a mutant was prepared in the same manner as in Example 1 except that the above leu1 + -G468X-top2 fragment was used as a mutant gene-incorporated fragment. Measurement of glucose inhibition and incubation temperature of the obtained culture supernatant of the mutant were 50. Measure the thermostability between °C and 75 °C, select a mutant whose activity has changed compared to the ASP3326 strain, and select the base in the P3AaBGL1 gene integrated in the chromosome of the selected mutant The sequence was confirmed and the 468th amino acid was identified. As a result, in the P3AaBGL1 mutant strain in which glucose inhibition resistance or heat stability was changed as compared with the ASP3326 strain, the 468th amino acid was serine.
  • G298F substitution of 298th glycine with phenylalanine
  • V519A replacement of 519th valine with alanine
  • G468S The 468th glycine is substituted to serine
  • Q142N substitution of glutamine at position 142 with asparagine
  • Example 6 ⁇ Integration of mutant genes by StEP method> Using two or several types of pSL6P3AaBGL1mutXX vector (total 1 ng) as a template, PrimeSTAR HS DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) using Primer represented by SEQ ID NO: 6 and primer represented by SEQ ID NO: 7, Based on the StEP method (Huimin Zhao, METHODS IN ENZYMOLOGY, vol.388, p42-49, 2004.), PCR conditions were 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. for 20 seconds (2.
  • the P3AaBGL1 gene fragment was amplified in 5 cycles of 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. for 3 minutes (2.6 kb).
  • a leu1 + promoter fragment was amplified by PCR using pSL6P3AaBGL1 as a template and a primer represented by SEQ ID NO: 8 and a primer represented by SEQ ID NO: 9.
  • the terminator top2 fragment was amplified by PCR using pSL6P3AaBGL1 as a template and the primer represented by SEQ ID NO: 10 and the primer represented by SEQ ID NO: 11.
  • PrimeSTAR Max DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) was used for the PCR method.
  • the restriction enzyme DpnI was added to the reaction solution of these three fragments, the template was digested, and purified using SUPREC-PCR (manufactured by Takara Bio Inc.) for primer replacement.
  • the leu + promoter-P3AaBGL1-terminator top2 fragment was amplified by PCR using the purified 3 fragment 50 ng and the primer represented by SEQ ID NO: 12 and the primer represented by SEQ ID NO: 13. Thereafter, the column was purified by SUPREC-PCR.
  • a mutant strain was prepared in the same manner as in Example 1 except that the fragment obtained above was used as the mutant gene-incorporated fragment. Measurement of the glucose inhibition of the culture supernatant of the obtained mutant strain and the incubation temperature of 50 ° C. to Measure the thermostability at 75 ° C., select a mutant whose activity has changed compared to the ASP3326 strain, and select the nucleotide sequence in the P3AaBGL1 gene incorporated in the chromosome of the selected mutant. confirmed.
  • Example 7 ⁇ Production of Site-Saturation Mutagenesis Fragment> Using pSL6P3AaBGL1mut27A10 vector as a template and degenerate primers, specific amino acid substitution to Q142N and G468S was performed.
  • the leu1 + -Q142X fragment was amplified by PCR using the primer represented by SEQ ID NO: 8 and the primer represented by SEQ ID NO: 22.
  • the Q142N-top2 fragment was amplified by PCR using the primer represented by SEQ ID NO: 23 and the primer represented by SEQ ID NO: 11.
  • the restriction enzyme DpnI was added to the reaction solution of these two fragments, the template was digested, and purified using SUPREC-PCR for primer replacement.
  • the leu1 + -Q142N-top2 fragment was amplified by the PCR method using 50 ng of the two fragments after purification, the primer represented by SEQ ID NO: 12, and the primer represented by SEQ ID NO: 13. Thereafter, the column was purified by SUPREC-PCR.
  • the leu1 + -Q142X fragment was amplified by PCR using the primer represented by SEQ ID NO: 7 and the primer represented by SEQ ID NO: 24.
  • the G468S-top2 fragment was amplified by PCR using the primer represented by SEQ ID NO: 25 and the primer represented by SEQ ID NO: 11.
  • the restriction enzyme DpnI was added to the reaction solution of these two fragments, the template was digested, and purified using SUPREC-PCR for primer replacement.
  • the leu1 + -G468S-top2 fragment was amplified by the PCR method using 50 ng of the two fragments after purification, the primer represented by SEQ ID NO: 12, and the primer represented by SEQ ID NO: 13. Thereafter, the column was purified by SUPREC-PCR.
  • a mutant strain was prepared in the same manner as in Example 1 except that the above-mentioned fragments were used as mutant gene-incorporated fragments.
  • the base sequence in the P3AaBGL1 gene of the obtained mutant strain was confirmed, and glucose inhibition of the culture supernatant was confirmed. Measurement and thermal stability measurement at a temperature of 50 ° C. to 75 ° C. were performed. Mutations introduced into P3AaBGL1 of each obtained mutant strain, glucosidase activity, residual activity of glucosidase activity when the glucose concentration in the culture solution was 20 mM and 50 mM, and the culture solution were incubated at 65 ° C. and 67 ° C. for 10 minutes. Table 10 shows the remaining activity of the subsequent glucosidase activity.
  • FIG. 5 (A) shows the residual activity of glycosidase activity of each culture supernatant at each glucose concentration, with the glycosidase activity when the glucose concentration is 0 mM being 100%.
  • FIG. 5 (B) shows the residual activity of glycosidase activity of each culture supernatant at each temperature, with the glycosidase activity without heat treatment before the enzyme reaction as 100%.
  • Example 9 From the results of Examples 1 to 7, Q142N (substitution of glutamine at position 142 with aspartic acid), Q156L (substitution of glutamine at position 156 with leucine), I120F (substitution of isoleucine at position 120 with phenylalanine), G298F (298th place) N458S (substitution of 458th asparagine to serine), G468S (substitution of 468th glycine to serine), V519A (substitution of 519th valine to alanine), R629L (629th arginine) It was suggested that AaBGL1 is involved in glucose inhibition resistance or thermal stability. Therefore, glucose inhibition resistance and thermal stability were examined in more detail for mutants in which only each mutation was introduced into P3AaBGL1.
  • a mutant strain into which only Q156L, I120F, N458S, or R629L was introduced was prepared.
  • Q156L-specific amino acid substitution using a primer was performed.
  • the leu1 + -Q156L fragment was amplified by PCR using pSL6P3AaBGL1 as a template and the primer represented by SEQ ID NO: 8 and the primer represented by SEQ ID NO: 26.
  • the Q156L-top2 fragment was amplified by PCR using the primer represented by SEQ ID NO: 27 and the primer represented by SEQ ID NO: 11.
  • the restriction enzyme DpnI was added to the reaction solution of these two fragments, the template was digested, and purified using SUPREC-PCR for primer replacement.
  • the leu1 + -Q156L-top2 fragment was amplified by the PCR method using 50 ng of the two fragments after purification, the primer represented by SEQ ID NO: 12, and the primer represented by SEQ ID NO: 13. Thereafter, the column was purified by SUPREC-PCR. I120F-specific amino acid substitution using a primer was performed.
  • the leu1 + -I120F fragment was amplified by PCR using pSL6P3AaBGL1 as a template and the primer represented by SEQ ID NO: 8 and the primer represented by SEQ ID NO: 28.
  • the I120F-top2 fragment was amplified by PCR using the primer represented by SEQ ID NO: 29 and the primer represented by SEQ ID NO: 11.
  • the restriction enzyme DpnI was added to the reaction solution of these two fragments, the template was digested, and purified using SUPREC-PCR for primer replacement.
  • the leu1 + -I120F-top2 fragment was amplified by the PCR method using 50 ng of the two fragments after purification, the primer represented by SEQ ID NO: 12, and the primer represented by SEQ ID NO: 13. Thereafter, the column was purified by SUPREC-PCR. N458S specific amino acid substitution was performed using primers.
  • the leu1 + -N458S fragment was amplified by PCR using pSL6P3AaBGL1 as a template and the primer represented by SEQ ID NO: 8 and the primer represented by SEQ ID NO: 30.
  • the N458S-top2 fragment was amplified by PCR using the primer represented by SEQ ID NO: 31 and the primer represented by SEQ ID NO: 11.
  • the restriction enzyme DpnI was added to the reaction solution of these two fragments, the template was digested, and purified using SUPREC-PCR for primer replacement.
  • the leu1 + -N458S-top2 fragment was amplified by the PCR method using 50 ng of the two fragments after purification, the primer represented by SEQ ID NO: 12, and the primer represented by SEQ ID NO: 13. Thereafter, the column was purified by SUPREC-PCR. R629L-specific amino acid substitution was performed using primers.
  • the leu1 + -R629L fragment was amplified by PCR using pSL6P3AaBGL1 as a template and the primer represented by SEQ ID NO: 8 and the primer represented by SEQ ID NO: 32.
  • the R629L-top2 fragment was amplified by PCR using the primer represented by SEQ ID NO: 33 and the primer represented by SEQ ID NO: 11.
  • the restriction enzyme DpnI was added to the reaction solution of these two fragments, the template was digested, and purified using SUPREC-PCR for primer replacement.
  • the leu1 + -R629L-top2 fragment was amplified by PCR using 50 ng of the two fragments after purification, the primer represented by SEQ ID NO: 12, and the primer represented by SEQ ID NO: 13. Thereafter, the column was purified by SUPREC-PCR.
  • a mutant strain was prepared in the same manner as in Example 1 except that each of the above fragments was used as a mutant gene-incorporated fragment, and the base sequence in the P3AaBGL1 gene of the obtained mutant strain was confirmed.
  • I260F improved both glucose inhibition resistance and thermal stability of P3AaBGL1.
  • G298F and G468S improve the glucose inhibition tolerance of P3AaBGL1, and reduce thermal stability.
  • N458S, V519A, and R629L can improve thermal stability without reducing the glucose inhibition resistance of P3AaBGL1.
  • Q156L reduces both glucose inhibition tolerance of P3AaBGL1 and heat stability.
  • the 468th glycine and the 519th valine are highly conserved among ⁇ -glucosidases.
  • amino acids corresponding to 260th isoleucine, 298th glycine, 458th asparagine, or 629th arginine have similar side chain sizes and polarities among the ⁇ -glucosidases, and Before and after are areas with very high storage stability.
  • amino acids are all important amino acids for the activity of ⁇ -glucosidase, and by replacing these amino acids in the same manner as P3AaBGL1, each ⁇ -glucose is substituted in the same manner as P3AaBGL1 in this Example.
  • the activity of glucosidase is also considered to be affected.
  • mutant P3AaBGL1 ⁇ Purification of mutant P3AaBGL1> Among the mutant strains, 11F10 strain, 22A12 strain, 28C02 strain, 29F09 strain, mutBGL1 strain and the parent strain ASP3326 strain were cultured in YPD medium 100 ml / Sakaguchi flask at 30 ° C. for 2 days. Ammonium sulfate was added to the culture supernatant to 80% saturated ammonium sulfate, and ammonium sulfate precipitation was performed at 4 ° C. for 2 hours.
  • the pellet was collected by centrifugation, dissolved in 10 ml of 10 mM citrate-phosphate buffer (pH 7.0), desalted and concentrated with a 100,000 MWCO ultrafiltration membrane to obtain 1 ml of a crude purified solution.
  • the crude purified solution was purified with a Hitrap QXL column, and the peak fraction of pNPG activity was collected and used as a purified sample. Elution was performed with 10 mM citrate-phosphate buffer (pH 7.0) and NaCl salt gradient (0-1M).
  • ⁇ -glucosidase obtained from the transformant of the present invention can be used for enzymatic saccharification of cellulose.
  • the transformant of the present invention can express ⁇ -glucosidase having a secretion signal, ⁇ -glucosidase is secreted into the culture medium, so that this trait in the culture medium containing cellulose is present.
  • the cellulose in the culture can be enzymatically saccharified.

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Abstract

　グルコシダーゼ活性が改良された改変型β－グルコシダーゼを産生することのできるシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体、該形質転換体の製造方法、該改変型β－グルコシダーゼの製造方法、および該改変型β－グルコシダーゼによるセルロースの分解方法の提供を目的とする。　糸状菌由来のβ－グルコシダーゼに、特定の変異群の少なくとも１の変異が導入された改変型β－グルコシダーゼをコードする領域を含む構造遺伝子配列、並びに該構造遺伝子を発現させるためのプロモーター配列およびターミネーター配列を、染色体中に有する、または染色体外遺伝子として有し、前記改変型β－グルコシダーゼは、前記特定の変異を有しないβ－グルコシダーゼよりも、熱安定性またはグルコース阻害耐性が高いことを特徴とするシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体。

Description

シゾサッカロミセス属酵母の形質転換体、該形質転換体の製造方法、β－グルコシダーゼの製造方法、およびセルロースの分解方法
　本発明は、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母の形質転換体、該形質転換体の製造方法、該形質転換体を用いたβ－グルコシダーゼの製造方法、および該β－グルコシダーゼによるセルロースの分解方法に関する。詳しくは、野生型のβ－グルコシダーゼよりも熱安定性またはグルコース阻害耐性が高い改変型β－グルコシダーゼを生産することのできるシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体およびその製造方法等に関する。
　木材や稲ワラ、もみ殻、雑草などのセルロース系バイオマスから、発酵原料としての糖、ひいてはバイオエタノールなどのバイオマス燃料を生産するためには、植物細胞壁の主要な構成成分であるセルロースを分解する必要がある。セルロースの分解には、濃硫酸糖化法や希硫酸糖化法といった酸糖化法、酵素を利用した酵素糖化法などの方法があり、近年のバイオテクノロジーの隆盛を背景に、酵素糖化法の研究開発が盛んに行われている。セルロースの酵素糖化には、セルラーゼと総称される一群の酵素が利用される。まず、セルロース鎖をランダムに切断する活性を有するエンドグルカナーゼ（ＥＧ）が、セルロースの非結晶領域を分解し、グルコース末端を露出させる。露出したグルコース末端は、セロビオハイドラーゼ（ＣＢＨ）により分解され、セロビオースが遊離する。そして、遊離したセロビオースをβ－グルコシダーゼ（ＢＧＬ）が分解することで、グルコースが遊離する。
　セルロースの酵素糖化には、アスペルギルス属やトリコデルマ属といった糸状菌が広く利用されている。結晶セルロースを分解して糖化するための種々のセルラーゼやヘミセルラーゼを生産できることや、それらの酵素を細胞外に大量に分泌することができるためである。
　また、これら糸状菌のセルラーゼを異種株で発現させることも試みられている。非特許文献１には、糸状菌のひとつであるアスペルギルス・アクリータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）のβ－グルコシダーゼＩ（ＢＧＬＩ）をコードする遺伝子によって出芽酵母サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を形質転換し、得られた形質転換体にこれらの酵素を発現させたことが開示されている。
　一方、アスペルギルス属やトリコデルマ属よりも、シゾサッカロミセス属酵母の方が遺伝子解析が進んでおり、種々の有用な変異株や遺伝子導入用ベクターが確立している、タンパク質の工業的大量生産に適しているといった利点がある。しかしながら、シゾサッカロミセス属酵母は、固有のβ－グルコシダーゼ遺伝子を有しておらず、セロビオースを資化することができない。
　さらに、β－グルコシダーゼ自体の高機能化も望まれている。例えば酵素糖化法の場合、酵素によるセルロースの加水分解反応が進行し、グルコースが反応系内に蓄積すると、蓄積したグルコースがβ－グルコシダーゼを阻害し、セロビオースが蓄積し、さらに、蓄積したセロビオースがエンドグルカナーゼとセロビオハイドラーゼを阻害する結果、セルロースの完全分解が出来なくなるという問題がある。そのため、グルコース阻害耐性（グルコース阻害の受け難さ）がより高いβ－グルコシダーゼの開発が望まれている。
　また、酵素反応は一般的に、反応温度が高いほど、反応効率が高い傾向があるため、セルロース分解反応の際の温度を高くすることで、より効率よくセルロースを分解し得ることが期待できる。さらに、熱安定性が高いほど酵素反応を長時間続けることが可能である。このため、より熱安定性の高いβ－グルコシダーゼの開発が望まれている。
　酵素へのランダム変異導入法は、その酵素の機能を改良する上で重要な手法の一つである。エラープローンＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法（非特許文献２）などで目的遺伝子にランダムな一塩基置換変異を導入する。サチュレーション変異導入法（非特許文献２）により特定部位のコドンをランダムに改変する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え法（非特許文献２）により、いくつかの変異体の遺伝子をかけあわせて変異点を組合せる。これらランダム変異導入法により目的酵素をコードする遺伝子にランダム変異を導入することで変異酵素ライブラリーを作製できる。その中から目的に応じた機能を選抜できるスクリーニング法を用いて選抜することで有用な改良酵素を取得することができる。さらに、ランダム変異とスクリーニングを繰返すことで、有用な変異点を蓄積させ、酵素の機能をさらに向上させることができる。
　しかしながら、ランダム変異導入による酵素の改良は、その大部分が大腸菌（特許文献１）や無細胞タンパク質合成系（特許文献２）での事例であり、真核生物由来の糖タンパク質の変異導入には不向きである。また、特許文献３には出芽酵母においてランダム変異導入を行っているが、変異遺伝子のベクターへの挿入および大腸菌での変異遺伝子挿入ベクターの増幅および精製の工程があり、簡便ではない。
特許第４４０２４４６号公報 特開２００５－２４５３３６号公報 特許第４４４８７７２号公報
Ｇ．Ｔａｎａｋａ，ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（１９９８）　６２（８），ｐ１６１５－１６１８． Ｆ．Ａｒｎｏｌｄ，ｅｔ　ａｌ．　"Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｒｅａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ", Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　(２００３)ｖｏｌ.２３１．
　そこで、本発明の目的は、グルコシダーゼ活性が改良された改変型β－グルコシダーゼを産生することのできるシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体、該形質転換体の製造方法、該改変型β－グルコシダーゼの製造方法、および該改変型β－グルコシダーゼによるセルロースの分解方法を提供することにある。
　本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、糸状菌由来のβ－グルコシダーゼをコードする構造遺伝子配列に特定の変異を導入して合成された改変型β－グルコシダーゼをコードする構造遺伝子を、シゾサッカロミセス属酵母へ導入して形質転換することで、上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の［１］～［１５］を提供するものである。
［１］下記改変型β－グルコシダーゼをコードする領域を含む構造遺伝子配列、並びに該構造遺伝子を発現させるためのプロモーター配列およびターミネーター配列を、染色体中に有するまたは染色体外遺伝子として有する、シゾサッカロミセス（ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母の形質転換体。
　改変型β－グルコシダーゼ：下記変異１～変異６からなる群より選択される少なくとも１の変異が存在する糸状菌由来のβ－グルコシダーゼであって、前記変異を有しない糸状菌由来のβ－グルコシダーゼよりも熱安定性またはグルコース阻害耐性が高い、β－グルコシダーゼ。
　　変異１；ＡａＢＧＬ１（アスペルギルス・アクリータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）のＢＧＬ１）の２４４番目のイソロイシンに相当するアミノ酸が、フェニルアラニンに置換された変異。
　　変異２；ＡａＢＧＬ１の２８２番目のグリシンに相当するアミノ酸が、フェニルアラニンに置換された変異。
　　変異３；ＡａＢＧＬ１の４４２番目のアスパラギンに相当するアミノ酸が、セリンに置換された変異。
　　変異４；ＡａＢＧＬ１の４５２番目のグリシンに相当するアミノ酸が、セリンに置換された変異。
　　変異５；ＡａＢＧＬ１の５０３番目のバリンに相当するアミノ酸が、アラニンに置換された変異。
　　変異６；ＡａＢＧＬ１の６１３番目のアルギニンに相当するアミノ酸が、ロイシンに置換された変異。
［２］前記糸状菌由来のβ－グルコシダーゼがＢＧＬ１である、前記［１］に記載の形質転換体。
［３］前記糸状菌が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の微生物である、前記［１］または［２］に記載の形質転換体。
［４］前記糸状菌由来のβ－グルコシダーゼが、配列番号１で表されるアミノ酸配列とのホモロジーが７０％以上であり、かつβ－Ｄ－グルコピラノシド結合の加水分解反応を触媒する活性を有する蛋白質である、前記［１］～［３］のいずれか一つに記載の形質転換体。
［５］前記構造遺伝子配列が、前記改変型β－グルコシダーゼをコードする領域の５’末端側および３’末端側の少なくともいずれか一方に、シグナルをコードする領域またはタグをコードする領域を有する、前記［１］～［４］のいずれか一つに記載の形質転換体。
［６］前記構造遺伝子配列が、前記改変型β－グルコシダーゼをコードする領域の５’末端側に、分泌シグナルをコードする領域を有する、前記［１］～［４］のいずれか一つに記載の形質転換体。
［７］下記改変型β－グルコシダーゼをコードする領域を含む構造遺伝子配列、並びに該構造遺伝子を発現させるためのプロモーター配列およびターミネーター配列を含むベクターにより、シゾサッカロミセス属酵母を形質転換することを特徴とする形質転換体の製造方法。
　改変型β－グルコシダーゼ：下記変異１～変異６からなる群より選択される少なくとも１の変異が存在する糸状菌由来のβ－グルコシダーゼであって、前記変異を有しない糸状菌由来のβ－グルコシダーゼよりも熱安定性またはグルコース阻害耐性が高い、β－グルコシダーゼ。
　　変異１；ＡａＢＧＬ１（アスペルギルス・アクリータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）のＢＧＬ１）の２４４番目のイソロイシンに相当するアミノ酸が、フェニルアラニンに置換された変異。
　　変異２；ＡａＢＧＬ１の２８２番目のグリシンに相当するアミノ酸が、フェニルアラニンに置換された変異。
　　変異３；ＡａＢＧＬ１の４４２番目のアスパラギンに相当するアミノ酸が、セリンに置換された変異。
　　変異４；ＡａＢＧＬ１の４５２番目のグリシンに相当するアミノ酸が、セリンに置換された変異。
　　変異５；ＡａＢＧＬ１の５０３番目のバリンに相当するアミノ酸が、アラニンに置換された変異。
　　変異６；ＡａＢＧＬ１の６１３番目のアルギニンに相当するアミノ酸が、ロイシンに置換された変異。
［８］前記構造遺伝子配列が、前記改変型β－グルコシダーゼをコードする領域の５’末端側および３’末端側の少なくともいずれか一方に、シグナルをコードする領域またはタグをコードする領域を有する、前記［７］に記載の形質転換体の製造方法。
［９］前記構造遺伝子配列が、前記改変型β－グルコシダーゼをコードする領域の５’末端側に、分泌シグナルをコードする領域を有する、前記［７］に記載の形質転換体の製造方法。
［１０］前記ベクターを、シゾサッカロミセス属酵母の染色体の１カ所以上に組み込む、前記［７］～［９］のいずれか一つに記載の形質転換体の製造方法。
［１１］前記ベクターを、染色体中のトランスポゾン遺伝子Ｔｆ２部位に組み込む、前記［１０］に記載の形質転換体の製造方法。
［１２］前記［１］～［５］のいずれか一つに記載の形質転換体を培養して得られた菌体から、改変型β－グルコシダーゼを取得することを特徴とするβ－グルコシダーゼの製造方法。
［１３］前記［６］に記載の形質転換体を培養して得られた培養液上清から、改変型β－グルコシダーゼを取得することを特徴とするβ－グルコシダーゼの製造方法。
［１４］前記［１２］または［１３］に記載のβ－グルコシダーゼの製造方法により得られた改変型β－グルコシダーゼを用いることを特徴とするセルロースの分解方法。
［１５］前記［６］に記載の形質転換体を、セルロースの存在下で培養することを特徴とするセルロースの分解方法。
　本発明のシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体の製造方法により、熱安定性とグルコース阻害耐性の少なくともいずれか一方が改良された改変型β－グルコシダーゼを生産することができるシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体を製造することができる。また、本発明のβ－グルコシダーゼの製造方法により該形質転換体から取得された改変型β－グルコシダーゼは、セルロースの分解に好適に使用できる。
図１は、糸状菌由来のβ－グルコシダーゼの系統樹を、アスペルギルス・アクリータスのｂｇｌ１遺伝子によりコードされているＢＧＬ１（ＡａＢＧＬ１）とのホモロジーと共に示した図である。 図２Ａは、ＡａＢＧＬ１のアミノ酸配列と、その他の糸状菌由来のβ－グルコシダーゼのアミノ酸配列のアラインメントを示した図である。 図２Ｂは、ＡａＢＧＬ１のアミノ酸配列と、その他の糸状菌由来のβ－グルコシダーゼのアミノ酸配列のアラインメントを示した図である。 図２Ｃは、ＡａＢＧＬ１のアミノ酸配列と、その他の糸状菌由来のβ－グルコシダーゼのアミノ酸配列のアラインメントを示した図である。 図３は、発現ベクターｐＳＬ６ＡａＢＧＬ１の構成図である。 図４は、発現ベクターｐＳＬ６Ｐ３ＡａＢＧＬ１の構成図である。 図５は、実施例８において、各変異株の培養上清のグルコース阻害測定および保温温度５０℃～７５℃の熱安定性測定の結果を示した図である。
　β-グルコシダーゼ（ＥＣ．３．２．１．２１）とは、β－Ｄ－グルコピラノシド結合の加水分解反応を特異的に触媒する酵素の総称として用いられる。特にセロビオースをグルコースに分解することからセロビアーゼとも呼ばれ、広く細菌、糸状菌、植物および動物に分布する。それぞれの生物種内に、β－グルコシダーゼをコードする遺伝子が複数存在することが多い。例えば、糸状菌の１種であるアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）では、ｂｇｌ１～ｂｇｌ７の存在が報告されている（Ｓｏｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊａｐａｎ　１２，ｐ７８－８３，２００９、および特開２００８－０８６３１０号公報）。
　本発明および本願明細書において、「糸状菌由来のβ－グルコシダーゼ」とは、糸状菌が本来有する野生型β－グルコシダーゼを意味する。糸状菌とは、菌類のうち、菌糸と呼ばれる管状の細胞から構成される真核細胞微生物である。糸状菌としては、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属およびアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属等が挙げられる。アスペルギルス属の糸状菌としては、例えば、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・アクリータス、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・パルベルレンタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｐｕｌｖｅｒｕｌｅｎｔｕｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｅｒｒｅｕｓ）、等を挙げることができる。
　図１に、糸状菌由来のβ－グルコシダーゼの系統樹を、アスペルギルス・アクリータスのｂｇｌ１遺伝子によりコードされているＢＧＬ１（ＡａＢＧＬ１）とのホモロジー（％：各β－グルコシダーゼの末尾の数値）と共に示した。また、図１中、各β－グルコシダーゼの初めの６文字が、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ/Ｓｗｉｓｓ-Ｐｒｏｔデータベースに登録されているアクセッション番号である。
　本願明細書および本発明において、グルコース阻害耐性が高いとは、グルコース非存在下のβ－Ｄ－グルコピラノシド結合の加水分解反応を触媒する活性（以下、グルコシダーゼ活性）に対するグルコース存在下のグルコシダーゼ活性の比（グルコース非存在下のグルコシダーゼ活性を１００％とした場合の、グルコース存在下のグルコシダーゼ活性の相対活性値）が高いことを意味する。また、熱安定性が高いとは、酵素反応の前に加熱処理を行わなかった場合のグルコシダーゼ活性に対する、加熱処理を行った場合のグルコシダーゼ活性の比が高いことを意味する。
［形質転換体］
　本発明の形質転換体は、下記改変型β－グルコシダーゼをコードする領域を含む構造遺伝子配列、並びに該構造遺伝子を発現させるためのプロモーター配列およびターミネーター配列を、染色体中に有するまたは染色体外遺伝子として有することを特徴とする。該改変型β－グルコシダーゼは、後述の（変異１）～（変異６）からなる群より選択される少なくとも１の変異が存在する糸状菌由来のβ－グルコシダーゼであり、該変異を有しないβ－グルコシダーゼよりも、熱安定性またはグルコース阻害耐性が高い。この改変型β－グルコシダーゼは、糸状菌由来のβ－グルコシダーゼに特定のアミノ酸置換変異を導入することによって得ることができる。
（改変型β－グルコシダーゼ）
　改変型β－グルコシダーゼは、糸状菌由来のβ－グルコシダーゼに比較して、下記（変異１）～（変異６）からなる群より選択される１以上の変異を有し、かつグルコシダーゼ活性を有する酵素である。変異２または変異４の変異を有する改変型β－グルコシダーゼは、該変異を有しないβ－グルコシダーゼよりもグルコース阻害耐性が向上する。また、変異３、変異５または変異６の変異を有する改変型β－グルコシダーゼは、該変異を有しないβ－グルコシダーゼよりも熱安定性が改善される。変異１の変異を有する改変型β－グルコシダーゼは、該変異を有しないβ－グルコシダーゼよりもグルコース阻害耐性と熱安定性の両方が向上する。
　　変異１；ＡａＢＧＬ１（アスペルギルス・アクリータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）のＢＧＬ１）の２４４番目のイソロイシンに相当するアミノ酸を、フェニルアラニンに置換する変異。
　　変異２；ＡａＢＧＬ１の２８２番目のグリシンに相当するアミノ酸を、フェニルアラニンに置換する変異。
　　変異３；ＡａＢＧＬ１の４４２番目のアスパラギンに相当するアミノ酸を、セリンに置換する変異。
　　変異４；ＡａＢＧＬ１の４５２番目のグリシンに相当するアミノ酸を、セリンに置換する変異。
　　変異５；ＡａＢＧＬ１の５０３番目のバリンに相当するアミノ酸を、アラニンに置換する変異。
　　変異６；ＡａＢＧＬ１の６１３番目のアルギニンに相当するアミノ酸を、ロイシンに置換する変異。
　なお、上記（変異１）～（変異６）が存在することにより、β－グルコシダーゼの熱安定性またはグルコース阻害耐性が向上することは、本発明者らにより初めて得られた知見である。該知見は、シゾサッカロミセス属酵母を宿主としたランダム変異導入法および機能的スクリーニング法による改良タンパク質の取得方法によって得られた。具体的には、ランダム変異法によりＡａＢＧＬ１に様々な変異を導入し、これをシゾサッカロミセス属酵母に導入することによって、変異型β－グルコシダーゼライブラリーを作製した後、このライブラリーの中から、β－グルコシダーゼの熱安定性またはグルコース阻害耐性が改善された形質転換体をスクリーニングし、該形質転換体中のＡａＢＧＬ１をコードする構造遺伝子の塩基配列を解析することによって得られた。
　改変型β－グルコシダーゼが有する６つの変異は、これらの変異が１つのみでもよく、２以上の変異が組み合わされていてもよい。例えば、変異２と変異４を有する改変型β－グルコシダーゼは、それぞれ単独の変異を有する改変型β－グルコシダーゼよりもグルコース阻害耐性が高い。また、例えば、変異５を単独で有する改変型β－グルコシダーゼよりも、変異５と変異６を有する改変型β－グルコシダーゼのほうが、より高い熱安定性を有する。また、変異５と変異６を有する改変型β－グルコシダーゼよりも、変異３と変異５と変異６を有する改変型β－グルコシダーゼのほうが、より高い熱安定性を有する。さらに、変異１、変異２、変異５、および変異６を有する改変型β－グルコシダーゼは、変異１および変異２のみを有する改変型β－グルコシダーゼよりも高い熱安定性を有する。
　なお、本願明細書および本発明において、あるβ－グルコシダーゼにおける「ＡａＢＧＬ１のＸ番目のアミノ酸に相当するアミノ酸」とは、ＡａＢＧＬ１のアミノ酸配列（配列番号１）と該β－グルコシダーゼのアミノ酸配列とを、ホモロジーが最大になるようにアラインメントした場合に、ＡａＢＧＬ１のＸ番目のアミノ酸と対応する位置にあるアミノ酸を意味する。図２に、ＡａＢＧＬ１のアミノ酸配列と、その他の糸状菌由来のβ－グルコシダーゼのアミノ酸配列のアラインメントを行った結果を示す。
　具体的には、図２に示すように、ＡａＢＧＬ１の２４４番目のイソロイシンに相当するアミノ酸は、アスペルギルス・オリゼーやアスペルギルス・テレウスでは２４５番目のバリンであり、アスペルギルス・ニガーでは２４４番目のバリンであり、エメリセラ・ニジュランス（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ　ｎｉｄｕｌａｎｓ）では２４７番目のイソロイシンである。
　また、ＡａＢＧＬ１の２８２番目のグリシンに相当するアミノ酸は、アスペルギルス・オリゼーでは２８３番目のスレオニンであり、アスペルギルス・テレウスでは２８３番目のセリンであり、アスペルギルス・ニガーでは２８２番目のアラニンであり、エメリセラ・ニジュランスでは２８５番目のセリンである。
　また、ＡａＢＧＬ１の４４２番目のアスパラギンに相当するアミノ酸は、アスペルギルス・オリゼーでは４４３番目のアスパラギンであり、アスペルギルス・テレウスでは４４３番目のリジンであり、アスペルギルス・ニガーでは４４２番目のアスパラギンであり、エメリセラ・ニジュランスでは４４５番目のグルタミンである。
　また、ＡａＢＧＬ１の４５２番目のグリシンに相当するアミノ酸は、アスペルギルス・オリゼーやアスペルギルス・テレウスでは４５３番目のグリシンであり、アスペルギルス・ニガーでは４５２番目のグリシンであり、エメリセラ・ニジュランスでは４５５番目のグリシンである。
　また、ＡａＢＧＬ１の５０３番目のバリンに相当するアミノ酸は、アスペルギルス・オリゼーやアスペルギルス・テレウスでは５０４番目のバリンであり、アスペルギルス・ニガーでは５０３番目のバリンであり、エメリセラ・ニジュランスでは５０６番目のバリンである。
　また、ＡａＢＧＬ１の６１３番目のアルギニンに相当するアミノ酸は、アスペルギルス・オリゼーでは６１４番目のリジンであり、アスペルギルス・テレウスでは６１４番目のスレオニンであり、アスペルギルス・ニガーでは６１３番目のスレオニンであり、エメリセラ・ニジュランスでは６１６番目のスレオニンである。
　本発明における変異を有しない野生型β－グルコシダーゼは、糸状菌由来の蛋白質であって、グルコシダーゼ活性を有していればよいが、酵素活性の高さなどから、ＢＧＬ１であることが好ましい。
　また、該野生型β－グルコシダーゼは、糸状菌由来であればいずれの糸状菌由来のものであってもよいが、アスペルギルス属の糸状菌由来のβ－グルコシダーゼが好ましく、アスペルギルス・オリゼーまたはアスペルギルス・アクリータス由来のβ－グルコシダーゼが好ましい。中でも、結晶セルロース分解力が高く、単糖生成力に優れていることから、アスペルギルス・アクリータス由来のβ－グルコシダーゼが好ましく、ＡａＢＧＬ１がより好ましい。坂本禮一郎博士論文（「Aspergillus aculeatus No. F-50のセルラーゼ系に関する研究」、大阪府立大学、１９８４年）によれば、アスペルギルス・アクリータスから精製した野生型のＡａＢＧＬ１の分子量は約１３３ＫＤａ、至適ｐＨは４．０で、安定ｐＨ範囲は３～７（２５℃、２４時間）である。
　本発明における改変型β－グルコシダーゼとしては、具体的には、糸状菌由来の野生型のβ－グルコシダーゼに比較して、上記（変異１）～（変異６）のうちの１以上の変異が存在するものであってもよく、上記（変異１）～（変異６）に加えて、該変異による効果が損なわれず、かつグルコシダーゼ活性が損なわれない限りにおいて該変異以外のその他の変異または改変が存在するものでもよい。該その他の変異等が存在する改変型β－グルコシダーゼとしては、例えば、野生型β－グルコシダーゼの１以上のアミノ酸、好ましくは１～数十個、より好ましくは１～十数個、さらに好ましくは１～９個、よりさらに好ましくは１～数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは付加が存在しており、かつグルコシダーゼ活性を有する蛋白質に、上記（変異１）～（変異６）からなる群より選択される１種以上の変異が存在しているものが挙げられる。例えば、野生型のβ－グルコシダーゼのＮ末端側若しくはＣ末端側の領域であって、グルコシダーゼ活性に影響しない１～数十個のアミノ酸からなる領域が欠損し、かつ上記（変異１）～（変異６）からなる群より選択される１種以上の変異が存在するものを、改変型β－グルコシダーゼとすることができる。
　本発明における改変型β－グルコシダーゼとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列とのホモロジーが６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、よりさらに好ましくは８０％以上であり、かつβ－Ｄ－グルコピラノシド結合の加水分解反応を触媒する活性を有する蛋白質に、上記（変異１）～（変異６）からなる群より選択される１以上の変異が存在するものであってもよい。
（宿主）
　本発明の形質転換体の宿主は、シゾサッカロミセス属酵母である。本発明に用いるシゾサッカロミセス属酵母は野生型であってもよく、用途に応じて特定の遺伝子を欠失または失活させた変異型であってもよい。特定の遺伝子を欠失または失活させる方法としては、公知の方法を用いることができる。具体的には、Ｌａｔｏｕｒ法（Ｎｕｃｒｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、２００６年、第３４巻第ｅ１１号、および国際公開第２００７／０６３９１９号等に記載）を用いることにより遺伝子を欠失させることができる。また、変異剤を用いた突然変異分離法（酵母分子遺伝学実験法、１９９６年、学会出版センター）や、ＰＣＲを利用したランダム変異法（ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｐｐｌ．、１９９２年、第２巻、ｐ．２８－３３。）等により遺伝子の一部に変異を導入することにより、該遺伝子を失活させることができる。特定遺伝子を欠失または失活させたシゾサッカロミセス属酵母宿主としては、例えば、国際公開第２００２／１０１０３８号、国際公開第２００７／０１５４７０号等に記載されている。
　さらに宿主となるシゾサッカロミセス属酵母には、形質転換体を選択するためのマーカーを有するものを用いることが好ましい。例えば、ある遺伝子が欠落していることにより特定の栄養成分が生育に必須である宿主を使用することが好ましい。目的遺伝子配列を含むベクターにより形質転換をして形質転換体を作製する場合、ベクターにこの欠落している遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を組み込んでおくことにより、形質転換体は宿主の栄養要求性が消失する。この宿主と形質転換体の栄養要求性の相違により、両者を区別して形質転換体を得ることができる。
　例えば、オロチジン５’－リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｕｒａ４遺伝子）が欠失または失活してウラシル要求性となっているシゾサッカロミセス属酵母を宿主とし、ｕｒａ４遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を有するベクターにより形質転換した後、ウラシル要求性が消失したものを選択することにより、ベクターが組み込まれた形質転換体を得ることができる。宿主において欠落により栄養要求性となる遺伝子は、形質転換体の選択に用いられるものであればｕｒａ４遺伝子には限定されず、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１遺伝子）等であってもよい。
　シゾサッカロミセス属酵母としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、シゾサッカロミセス・ジャポニカス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、シゾサッカロミセス・オクトスポラス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ）等が挙げられる。上記シゾサッカロミセス属酵母のうち、種々の有用な変異株が利用できることから、シゾサッカロミセス・ポンベが好ましい。
（発現カセット）
　発現カセットとは、蛋白質を発現するために必要なＤＮＡの組み合わせであり、該蛋白質をコードする構造遺伝子とシゾサッカロミセス属酵母内で機能するプロモーターとターミネーターとを含む。
　本発明の形質転換体は、前記改変型β－グルコシダーゼをコードする領域を含む構造遺伝子配列（改変型β－グルコシダーゼ含有構造遺伝子配列）、並びに該構造遺伝子を発現させるためのプロモーター配列およびターミネーター配列を含む発現カセットを、シゾサッカロミセス属酵母に導入することにより作製する。
　上記発現カセットには、さらに、５’－非翻訳領域、３’－非翻訳領域のいずれか１つ以上が含まれていてもよい。好ましい発現カセットは、改変型β－グルコシダーゼ含有構造遺伝子配列、プロモーター、ターミネーター、５’－非翻訳領域、３’－非翻訳領域を全て含む発現カセットである。さらに、栄養要求性相補マーカーなどの遺伝子を有していてもよい。
　改変型β－グルコシダーゼ含有構造遺伝子配列中の改変型β－グルコシダーゼをコードする領域の塩基配列は、遺伝子工学的方法により、野生型β－グルコシダーゼの構造遺伝子に、（変異１）～（変異６）の少なくとも１以上のアミノ酸置換を反映させた塩基置換、および必要に応じてその他の改変を施すことにより得られる。また、改変部分以外は、糸状菌由来のβ－グルコシダーゼをコードする遺伝子をそのまま用いてもよいが、シゾサッカロミセス属酵母内での発現量を増大させるために、上記遺伝子配列を、シゾサッカロミセス属酵母での高発現遺伝子において使用頻度の高いコドンに改変することが好ましい。
　該改変型β－グルコシダーゼ含有構造遺伝子配列は、改変型β－グルコシダーゼをコードする領域以外にも、その他のペプチドまたは蛋白質をコードする領域を有していてもよい。この場合、本発明の形質転換体中では、改変型β－グルコシダーゼのＮ末端またはＣ末端にその他のペプチド等が結合した蛋白質が生産される。改変型β－グルコシダーゼに結合させるペプチドとしては、分泌シグナル、特定の細胞内小器官への移行シグナル等のシグナル、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ等のタグ等が挙げられる。各種シグナルは、シゾサッカロミセス属酵母内で機能するシグナルであることが必要である。
　分泌シグナルは、Ｎ末端に存在することにより、発現した蛋白質を宿主細胞外に分泌させる機能を有するペプチドである。シゾサッカロミセス属酵母内で機能する分泌シグナルとしては、国際公開第１９９６／２３８９０号に記載のＰ３シグナルが特に好ましい。
　該改変型β－グルコシダーゼ含有構造遺伝子配列としては、改変型β－グルコシダーゼをコードする領域の５’末端側に分泌シグナルをコードする領域を結合させた配列が好ましい。Ｎ末端に分泌シグナルをそなえることにより、形質転換体で産生された改変型β－グルコシダーゼをシゾサッカロミセス属酵母の細胞外に分泌させられる。細胞外に分泌された改変型β－グルコシダーゼは、培養液の上清から簡便に回収・精製できる。
　プロモーターとターミネーターは、宿主であるシゾサッカロミセス属酵母内で機能して改変型β－グルコシダーゼを発現できるものであればよい。シゾサッカロミセス属酵母内で機能するプロモーターとしては、シゾサッカロミセス属酵母が本来有するプロモーター（転写開始活性が高いものが好ましい）やシゾサッカロミセス属酵母が本来有しないプロモーター（ウイルス由来のプロモーターなど）を使用することができる。なお、プロモーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。
　シゾサッカロミセス属酵母が本来有するプロモーターとしては、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、チアミンの代謝に関与するｎｍｔ１遺伝子プロモーター、グルコースの代謝に関与するフルクトース－１、６－ビスホスファターゼ遺伝子プロモーター、カタボライト抑制に関与するインベルターゼ遺伝子のプロモーター（国際公開第９９／２３２２３号参照）、熱ショック蛋白質遺伝子プロモーター（国際公開第２００７／２６６１７号参照）などが挙げられる。
　シゾサッカロミセス属酵母が本来有しないプロモーターとしては、例えば、特開平５－１５３８０号公報、特開平７－１６３３７３号公報、特開平１０－２３４３７５号公報に記載されている動物細胞ウイルス由来のプロモーターが挙げられ、ｈＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターが好ましい。
　シゾサッカロミセス属酵母内で機能するターミネーターとしては、シゾサッカロミセス属酵母が本来有するターミネーターやシゾサッカロミセス属酵母が本来有しないターミネーターを使用することができる。なお、ターミネーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。
　ターミネーターとしては、例えば、特開平５－１５３８０号公報、特開平７－１６３３７３号公報、特開平１０－２３４３７５号公報に記載されているヒト由来のターミネーターが挙げられ、ヒトリポコルチンＩのターミネーターが好ましい。
［形質転換体の製造方法］
　本発明のシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体の製造方法（以下、本発明の形質転換体の製造方法）は、前記発現カセットを含むベクターによりシゾサッカロミセス属酵母を形質転換することを特徴とするものである。
　宿主となるシゾサッカロミセス属酵母、改変型β－グルコシダーゼ、糸状菌、改変型β－グルコシダーゼ含有構造遺伝子配列を含む発現カセットについては、上記したとおりである。
（ベクター）
　本発明の形質転換体の製造に用いるベクターは、上記した発現カセットを含むものである。また、選択マーカーを含むことが好ましい。例えば、宿主の栄養要求性に応じて前記栄養要求性相補マーカーを組み込んだベクターを使用することが好ましい。
　さらに、本発明におけるベクターは、シゾサッカロミセス属酵母内で機能する分泌シグナル遺伝子を有することが好ましい。分泌シグナル遺伝子の位置は、β－グルコシダーゼ構造遺伝子の５’末端側である。５’末端側に分泌シグナル遺伝子が結合した異種蛋白質構造遺伝子から、Ｎ末端に分泌シグナルが付加した異種蛋白質が発現する。この異種蛋白質は、宿主内の小胞体やゴルジ装置等で分泌シグナルが切断され、その後分泌シグナルが除去された異種蛋白質が細胞外に分泌される。分泌シグナル遺伝子（および分泌シグナル）はシゾサッカロミセス属酵母内で機能することが必要である。シゾサッカロミセス属酵母内で機能する分泌シグナル遺伝子としては、例えば、国際公開第１９９６／２３８９０号に記載のものを使用できる。
　本発明の形質転換体の製造に用いるベクターは、環状ＤＮＡ構造または線状ＤＮＡ構造を有するベクターである。上記発現カセットが、シゾサッカロミセス属酵母の細胞内で染色体外遺伝子として保持される形質転換体を作製する場合には、ベクターは、シゾサッカロミセス属酵母内で複製されるための配列、即ち、自律複製配列（Autonomously Replicating Sequence: ARS）を含むプラスミドであることが好ましい。
　一方で、上記発現カセットが、シゾサッカロミセス属酵母の染色体中に組み込まれた形質転換体を作製する場合には、ベクターを線状ＤＮＡ構造で宿主に導入することが好ましい。
　発現カセットがシゾサッカロミセス属酵母の染色体中に組み込まれた形質転換体の方が、継代培養の点から好ましい。組み込まれた発現カセットが脱落し難くなり、継代における維持安定性が極めて高くなる。つまり、発現カセットが染色体に組み込まれた形質転換体は、異種蛋白質をより安定した生産性で製造することができる。
　以下、シゾサッカロミセス属酵母の染色体中に組み込まれた形質転換体を作製するためのベクターについて説明する。
　染色体中への発現カセットの組み込みは、染色体中の任意の位置に組み込むことが可能なことから、相同組換えによるものが好ましい。
　ベクターを線状ＤＮＡ構造で宿主に導入する場合、通常用いられるプラスミドＤＮＡのような環状ＤＮＡ構造を有するベクターであれば、制限酵素でベクターを線状に切り開いた後にシゾサッカロミセス属酵母の細胞に導入することが好ましい。この場合、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く位置は、組換え部位内とする。これにより、切り開かれたベクターの両端にそれぞれ組換え部位が部分的に存在することとなり、相同組換えによりベクター全体が染色体の標的部位に組み込まれる。
　ベクターは、両端それぞれに組換え部位の一部が存在するような線状ＤＮＡ構造とすることができれば、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く方法以外の方法、たとえばＰＣＲによる酵素的な増幅法や化学合成法、で構築してもよい。
　本発明におけるベクターを構築するために、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等の大腸菌由来のプラスミドを好適に用いることができる。大腸菌由来のプラスミドを用いて構築したベクターは、通常、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域を有する。また、上記のような大腸菌由来のプラスミドを用いない場合であっても、本発明におけるベクターを構築し増幅するために大腸菌を使用する場合は上記「ｏｒｉ」が利用され、「ｏｒｉ」を有するベクターが得られる。
　相同組換えに用いる際のベクターは、大腸菌内での複製のために必要であった「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域が除去されていることが好ましい。これにより、上述したベクターを染色体に組み込む際に、その組み込み効率を向上させることができる（特開２０００－２６２２８４号公報参照）。
　複製開始領域が除去されたベクターの構築方法は特に限定されないが、特開２０００－２６２２８４号公報に記載されている方法を用いることが好ましい。すなわち、組換え部位内の切断箇所に複製開始領域が挿入された前駆体ベクターを構築しておき、前述のように線状ＤＮＡ構造とすると同時に複製開始領域が切り出されるようにする方法が好ましい。これにより、簡便に複製開始領域が除去されたベクターを得ることができる。
　また、特開平５－１５３８０号公報、特開平７－１６３３７３号公報、国際公開第９６／２３８９０号、特開平１０－２３４３７５号公報等に記載された発現ベクターやその構築方法を適用して、発現カセットおよび組換え部位を有する前駆体ベクターを構築し、さらに通常の遺伝子工学的手法で該前駆体ベクターから複製開始領域を除去して相同組換えに用いるベクターを得る方法であってもよい。
　ベクター中の発現カセットの数は、１個のみであってもよく、２個以上であってもよい。本発明の形質転換体作製に用いられるベクターは、発現カセットを１～８個有することが好ましく、特に１～４個が好ましい。
　ベクターが有する発現カセットの数が２個以上であれば、シゾサッカロミセス属酵母の染色体に組み込まれる発現カセットの数を増やし、異種蛋白質の発現量をより多くすることが容易になる。例えば、ベクター中の発現カセットの数が２個以上であれば、シゾサッカロミセス属酵母の染色体の同一箇所に複数の発現カセットが連続して組み込まれる。また、ベクターが有する発現カセットの数が８個以下であれば、ベクターが大きくなりすぎることにより相同組換えによるベクターの組み込み効率が低下してしまうことを抑制しやすい。発現カセットの数が４個以下であれば、組み込み効率をより高くすることができる。
　染色体中の後記標的部位の数が多い場合には、ベクター中の発現カセットの数が１個であっても組み込まれる発現カセットの数を多くすることができる。また、シゾサッカロミセス属酵母の染色体の同一箇所に２個以上の発現カセットが組み込まれることもある。
　また、ベクター中の発現カセットの数が１個であり、かつ染色体中の後記標的部位の数を１とすることにより、一の形質転換体当たりの改変型β－グルコシダーゼの発現量を、各種形質転換体において揃えられる。例えば、各種変異の導入によるグルコシダーゼ活性に対する影響を評価する際には、各種形質転換体当たりの改変型β－グルコシダーゼの発現量を揃えることにより、培養した形質転換体（細胞外へ分泌させた場合には、培養液上清）の乾燥重量当たりのグルコース活性を比較することにより、各形質転換体で生産された改変型β－グルコシダーゼのグルコース活性を比較評価することができる。
　ベクターの組換え部位は、シゾサッカロミセス属酵母の染色体における相同組換えの標的部位に対して相同組換えを行わせることのできる塩基配列を有する部位である。また、標的部位は、シゾサッカロミセス属酵母の染色体内で発現カセットを組み込む標的となる部位である。標的部位は、ベクターの組換え部位を該標的部位に対して相同組換えを行わせる塩基配列とすることにより自由に設定することができる。
　相同組換えを行わせるには、前記組換え部位の塩基配列と、標的部位の塩基配列との相同性を７０％以上とすることが必要である。また、組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は、相同組換えが起きやすくなる点から、９０％以上とすることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。このような組換え部位を有するベクターを用いることにより、発現カセットが相同組換えにより標的部位に組み込まれる。
　組換え部位の長さは、２０～２０００ｂｐであることが好ましい。組換え部位の長さが２０ｂｐ以上であれば、相同組換えが起きやすくなる。また、組換え部位の長さが２０００ｂｐ以下であれば、ベクターが長くなりすぎて相同組換えが起き難くなることを防ぎやすい。組換え部位の長さは１００ｂｐ以上であることがより好ましく、２００ｂｐ以上であることがさらに好ましい。また、組換え部位の長さは８００ｂｐ以下であることがより好ましく、４００ｂｐ以下であることがさらに好ましい。
（宿主の標的部位）
　宿主の染色体中に前記発現カセットを１つのみ組み込む場合には、発現カセットを組み込む標的部位は、シゾサッカロミセス属酵母が有する染色体のうち、必須遺伝子が欠失または失活しないに染色体の１箇所の位置に存在する標的部位であることが好ましい。標的部位が１箇所であれば、染色体に組み込まれる発現カセットの数が一定で変異株間の比較が容易になるため、改変型タンパク質の選択性がより向上する。
　上記の必須遺伝子とは、その遺伝子が欠失または失活すると生育できなくなる遺伝子であり、本発明の形質転換体の生育に不可欠な遺伝子を意味する。
　宿主の染色体中に前記発現カセットを複数組み込む場合には、発現カセットを組み込む標的部位は、シゾサッカロミセス属酵母が有する染色体のうち、（１）別々の染色体に存在する２箇所以上の標的部位であるか、（２）１つ以上の必須遺伝子が間に挟まれるように同一染色体の複数位置に存在する２箇所以上の標的部位であるか、（１）および（２）の両方を満たす複数の標的部位であることが好ましい。これら２箇所以上の標的部位は、実質的に同一の塩基配列を有する部位である。ただし、実質的に同一の塩基配列とは、互いの標的部位の塩基配列の相同性が９０％以上であることを意味する。標的部位同士の相同性は、９５％以上であることが好ましく、９９％以上であることがより好ましい。
　必須遺伝子を挟んで導入された発現カセットは、それが脱落すると必須遺伝子も脱落して形質転換体が生育できなくなる。これにより、形質転換体の培養において、発現カセットが脱落した形質転換体が、発現カセットが脱落していない形質転換体とともに生育するおそれが少なくなり、異種蛋白質の生産効率が低下するおそれが少なくなる。通常は、発現カセットが脱落した形質転換体の方が増殖速度が高いため、上記（２）を満たす標的部位に発現カセットを導入することが好ましい。
　このように、標的部位がシゾサッカロミセス属酵母の染色体において分散して存在していることにより、染色体に発現カセットが分散して組み込まれるため、組み込まれた発現カセットが脱落し難くなり、継代における維持安定性が極めて高くなる。そのため、異種蛋白質を安定して高い生産性で製造することができる。
　また、このように塩基配列が実質的に同一の標的部位とすることにより、異なる位置に複数の標的部位が存在していても、１種のベクターでそれら標的部位に簡便にベクターを組み込むことができる。
　本発明の形質転換方法では、複数の発現カセットを組み込む場合、ベクターを組み込む標的部位が５箇所以上であることが好ましい。標的部位が５箇所以上であれば、染色体に組み込まれる発現カセットの数を増加させることが容易になるため、異種蛋白質の生産性がより向上する。
　また、標的部位は１０～６０箇所であることがより好ましい。標的部位が１０箇所以上であれば、染色体に組み込まれる発現カセットの数をさらに増加させやすく、異種蛋白質の生産性がさらに向上する。標的部位が６０箇所以下であれば、染色体に組み込まれる発現カセットが多くなりすぎて異種蛋白質の発現量が少なくなることを抑制しやすい。
　標的部位は、１種のベクターでシゾサッカロミセス属酵母の複数の染色体に分散して存在する標的部位に一度に発現カセットを組み込める点から、トランスポゾン遺伝子Ｔｆ２中の塩基配列とすることが好ましい。Ｔｆ２は、シゾサッカロミセス・ポンベでは、３本の染色体それぞれに合計１３箇所存在する、長さ（塩基数）約４９００ｂｐのトランスポゾン遺伝子であり、互いの塩基配列の相同性は９９．７％である（Nathan J. Bowen et al, Genome Res. 2003 13: p1984-1997参照）。
　ただし、標的部位は上記のものには限定されない。例えば、トランスポゾン遺伝子Ｔｆ２以外に、前記組換え部位の長さ以上の長さを有する実質的に同一の塩基配列が染色体中に複数有する部位（遺伝子など）を標的部位とすることができる。また、例えば、前記組換え部位の長さ以上の長さを有する実質的に同一の塩基配列を有する遺伝子（標的部位）を染色体に新たに複数導入して標的部位を形成した後に、それら複数の標的部位にベクターを導入するようにしてもよい。
（形質転換方法）
　上記ベクターを用いて、宿主であるシゾサッカロミセス属酵母を形質転換する。形質転換方法は、公知のシゾサッカロミセス属酵母の形質転換方法をいずれも用いることができる。そのような形質転換方法としては、例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、ガラスビーズ法など従来周知の方法や、特開２００５－１９８６１２号公報記載の方法などを挙げることができる。また、市販の酵母形質転換用キットを用いてもよい。
　形質転換を行った後、通常は得られた形質転換体を選抜する。選抜方法としては、例えば、以下に示す方法が挙げられる。前記栄養要求性マーカーにより形質転換体を選択できる培地によりスクリーニングし、得られたコロニーから複数を選択する。次に、それらを別々に液体培養した後、それぞれの形質転換体（細胞外へ分泌させた場合には、培養液上清）における異種蛋白質の発現量を調べ、異種蛋白質の発現量がより多い形質転換体を選抜する。また、それら選抜した形質転換体に対してパルスフィールドゲル電気泳動法によるゲノム解析を行うことにより、染色体に組み込まれたベクターの数や発現カセットの数を調べることができる。
（培養方法）
　本発明の形質転換体は、天然のシゾサッカロミセス属酵母と同様に培養することができる。
　本発明の形質転換体の培養のための培養液には、公知の酵母培養培地を用いることができ、シゾサッカロミセス属酵母が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、シゾサッカロミセス属酵母の培養を効率良く行えるものであればよい。培養液としては、天然培地を用いてもよく、合成培地を用いてもよい。
　炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース等の糖が挙げられる。
　窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または無機酸のアンモニウム塩、ペプトン、カザミノ酸が挙げられる。
　無機塩類としては、例えば、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムが挙げられる。
　培養には公知の酵母培養方法を用いることができ、例えば振盪培養、攪拌培養等により行うことができる。
　また、培養温度は、２３～３７℃であることが好ましい。また、培養時間は適宜決定することができる。
　また、培養は、回分培養であってもよく、連続培養であってもよい。
　本発明の形質転換体は、野生型のβ－グルコシダーゼよりも熱安定性またはグルコース阻害耐性が高い改変型β－グルコシダーゼを生産することができるシゾサッカロミセス属酵母である。該形質転換体は、改変型β－グルコシダーゼを生産できるため、セロビオースを資化することができる。
［β－グルコシダーゼの製造方法］
　本発明の形質転換体を培養して得られた菌体から、改変型β－グルコシダーゼを取得することができる。形質転換体を培養し、培養液や菌体から改変型β－グルコシダーゼを分離する場合、公知の蛋白質分離方法を用いることができる。例えば、培養後、菌体を培養液から分離し、菌体を破壊して改変型β－グルコシダーゼを含む細胞破砕液を得て、その細胞破砕液から公知の蛋白質分離方法、例えば、塩析、カラム精製、クロマトグラフィー、免疫沈降等を用いて改変型β－グルコシダーゼを取得できる。
　改変型β－グルコシダーゼをコードする領域の５’末端に分泌シグナルをコードする領域が付加された構造遺伝子配列を含む発現カセットが導入された形質転換体の場合には、形質転換体で生産された改変型β－グルコシダーゼは、細胞外へ分泌される。そこで、培養液上清から公知の蛋白質分離方法を用いて改変型β－グルコシダーゼを取得できる。また、一定時間培養した培養液から遠心等により改変型β－グルコシダーゼを含む培養上清を回収し、残った菌体に再び培養液を加えて培養することを繰り返して、連続的に形質転換体を培養してβ－グルコシダーゼを産生させることもできる。
［セルロースの分解方法］
　本発明のセルロースの分解方法は、上記本発明のシゾサッカロミセス属酵母の形質転換体を培養して得られる菌体や培養物から取得した改変型β－グルコシダーゼを用いる。
　分解対象となるセルロースの形態に特に制限はなく、精製セルロースであっても、木材や稲ワラ、もみ殻、雑草などのバイオマス中に含まれるセルロースであってもよい。
　具体的なセルロースの分解方法としては、例えば、形質転換体を培養し、培養液上清や菌体から改変型β－グルコシダーゼを分離もしくは精製して、セルロースを含むバイオマスと、エンドグルカナーゼ、セロビオハイドラーゼとともにインキュベーションする方法が挙げられる。形質転換体が産生したものを分離・精製した改変型β－グルコシダーゼを用いてセルロースを分解する場合、反応条件は公知のβ－グルコシダーゼの反応条件を採用することができる。改変型β－グルコシダーゼによる分解反応液中の好適なｐＨは、３．０～８．０であり、好適な反応温度は、２０～６５℃である。
　改変型β－グルコシダーゼを含有する培養液上清や細胞破砕液から改変型β－グルコシダーゼを分離せずに、該培養液上清や細胞破砕液を直接分解対象であるセルロースに接触させてもよい。例えば、改変型β－グルコシダーゼをコードする領域の５’末端に分泌シグナルをコードする領域を有する発現カセットが導入された形質転換体を使用する場合、セルロースが存在する培養液中で形質転換体を培養し、培養液に分泌される改変型β－グルコシダーゼで培養液中のセルロースを分解することもできる。具体的なセルロースの分解方法としては、例えば、上記バイオマスの存在下で、上記形質転換体を培養する方法や、上記バイオマスと培養した上記形質転換体を混合してインキュベーションする方法等が挙げられる。この場合、培養条件は、シゾサッカロミセス属酵母の一般的な培養条件を採用することができる。培養液の好適なｐＨは、３．０～８．０であり、好適な培養温度は、２３～３７℃である。
　以下、実施例および比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。
［実施例１］
＜ＡａＢＧＬ１を産生するシゾサッカロミセス・ポンベの形質転換体の作製＞
　配列番号１で表されるＡａＢＧＬ１ペプチド配列からシゾサッカロミセス・ポンベの高発現型コドンで置き換えた遺伝子配列を設計した(配列番号２参照。以下、ＡａＢＧＬ１遺伝子と称する。)。開始コドン前にＫｐｎＩ、ＢｓｐＨＩ認識配列を付加した。終止コドン後にＸｂａＩ、ＳａｃＩ認識配列を付加した。この配列を含んだプラスミド（ジーンアート社製、レーゲンスブルク、ドイツ、にて合成）を制限酵素ＢｓｐＨＩ、ＸｂａＩで消化した。
　一方、これとは別にｐＳＬ６ｌａｃＺを制限酵素ＡａｒＩ、ＸｂａＩで消化し、アルカリフォスファターゼ処理した。この処理後、アガロースゲル上で電気泳動し、ベクターｐＳＬ６断片と、上記のＡａＢＧＬ１遺伝子断片をアガロースゲルから切出し、ライゲーションした後、大腸菌ＤＨ５α（タカラバイオ社製）に導入して形質転換した。得られた形質転換体よりベクターを調製し、目的とする発現ベクターｐＳＬ６ＡａＢＧＬ１(図３、配列番号３参照。)を取得した。制限酵素地図の作製から目的とするベクターであることを確認した。
　また、前記ＡａＢＧＬ１のＮ末端の１９アミノ酸を削除した欠損体に分泌シグナルであるＰ３シグナルをＮ末端に付加したＰ３ＡａＢＧＬ１（配列番号４参照。）の作製のため、ｐＳＬ６ＡａＢＧＬ１を鋳型としてＩｎ－ｆｕｓｉｏｎプライマーを用いてＰＣＲ法によりＡａＢＧＬ１遺伝子断片を増幅した。一方、ｐＳＬ６Ｐ３ｌａｃＺを制限酵素ＡｆｌＩＩ、ＸｂａＩで消化した。この断片とＰＣＲによって得られた上記ＡａＢＧＬ１遺伝子断片とをＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ法により環状化した後、大腸菌ＤＨ５αに導入して形質転換した。得られた形質転換体よりベクターを調製し、目的とする発現ベクターｐＳＬ６Ｐ３ＡａＢＧＬ１(図４、配列番号５参照。)を取得した。制限酵素地図の作製および部分塩基配列の確認から目的とするベクターであることを確認した。
　宿主としてシゾサッカロミセス・ポンベのロイシン要求株（遺伝子型：ｈ－、ｌｅｕ１－３２、東京大学大学院理学系研究科付属遺伝子実験施設・飯野雄一教授より供与）（ＡＴＣＣ３８３９９)をＹＥＳ(０．５％酵母エキス、３％グルコース、０．１ｍｇ／ｍｌ　ＳＰサプリメント)培地で０．６×１０７細胞数／ｍｌになるまで生育させた。集菌、洗浄後１．０×１０８細胞数／ｍｌになるように０．１ｍ 酢酸リチウム（ｐＨ５．０）に懸濁した。その後、懸濁液１００μｌに上記で得られたベクターｐＳＬ６Ｐ３ＡａＢＧＬ１を制限酵素ＮｏｔＩで消化したもの１μｇを加え、さらに５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００)水溶液を２９０μｌ加えてよく撹拌した後、３０℃で６０分間、４２℃で５分間、室温で１０分間の順にインキュベートした。遠心によりＰＥＧ４０００を除去し、洗浄後１５０μｌの滅菌水に懸濁し、最少寒天培地に塗布した。
　３日後、得られた形質転換体（ＡａＢＧＬ１発現株）をＡＳＰ３３２６株とした。
＜エラープローンＰＣＲ断片の作製＞
　ｐＳＬ６Ｐ３ＡａＢＧＬ１を鋳型として、配列番号６で表されるプライマーおよび配列番号７で表されるプライマーを用いてエラープローンＰＣＲ法によりＰ３ＡａＢＧＬ１遺伝子断片を増幅した。エラープローンＰＣＲにはＤｉｖｅｒｓｉｆｙ　ＰＣＲ　Ｒａｎｄｏｍ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いた。一方、これとは別にｐＳＬ６Ｐ３ＡａＢＧＬ１を鋳型として、配列番号８で表されるプライマーおよび配列番号９で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりｌｅｕ１＋プロモーター断片を増幅した。また、これとは別にｐＳＬ６Ｐ３ＡａＢＧＬ１を鋳型として、配列番号１０で表されるプライマーおよび配列番号１１で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりターミネーターｔｏｐ２断片を増幅した。ＰＣＲ法にはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製)を用いた。
　これら３断片の反応溶液に制限酵素ＤｐｎＩを加え、鋳型を消化した後、プライマー置換のため、ＳＵＰＲＥＣ－ＰＣＲ (タカラバイオ社製)を用いて精製した。精製後の３断片５０ｎｇと、配列番号１２で表されるプライマーおよび配列番号１３で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりｌｅｕ１＋プロモーター－変異型Ｐ３ＡａＢＧＬ１－ターミネーターｔｏｐ２を融合させた変異遺伝子組込み断片を増幅した。その後、ＳＵＰＲＥＣ－ＰＣＲによりカラム精製した。
＜形質転換体の作製＞
　宿主としてシゾサッカロミセス・ポンベのロイシン要求株（遺伝子型：ｈ－、ｌｅｕ１－３２、東京大学大学院理学系研究科付属遺伝子実験施設・飯野雄一教授より供与）（ＡＴＣＣ３８３９９）をＹＥＳ（０．５％酵母エキス、３％グルコース、０．１ｍｇ／ｍｌ　ＳＰサプリメント)培地で０．６×１０７細胞数／ｍｌになるまで生育させた。集菌、洗浄後２．０×１０８細胞数／ｍｌになるように０．１Ｍ　酢酸リチウム（ｐＨ５．０）に懸濁した。その後、懸濁液１００μｌに上記で得られたｌｅｕ＋プロモーター－Ｐ３ＡａＢＧＬ１－ターミネーターｔｏｐ２断片１μｇを加え、さらに５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール （ＰＥＧ４０００）水溶液を２９０μｌ加えてよく撹拌した後、３０℃で６０分間、ＤＭＳＯを４３μｌ加えた後４２℃で５分間、室温で１０分間の順にインキュベートした。遠心によりＰＥＧ４０００を除去し、洗浄後１５０μｌの滅菌水に懸濁し、最少寒天培地に塗布した。最少寒天培地の組成を表１～６に示す。
　最少寒天培地の炭素源を０．１％グルコースおよび２％セロビオースにすることで活性型のＰ３ＡａＢＧＬ１変異株のみがセロビオースを炭素源にできるため、コロニーの形成が大きく、活性を保持したＰ３ＡａＢＧＬ１変異株のみの選択が可能になる。
　５日後、形質転換体(Ｐ３ＡａＢＧＬ１変異株)が得られた。これをＰ３ＡａＢＧＬ１変異株ライブラリーとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
＜最少寒天培地の炭素源検討＞
　最少寒天培地の炭素源（表６中の＊印）を０．１％グルコースおよび２％セロビオースにすることで活性型のＰ３ＡａＢＧＬ１変異株（グルコース活性を有するＡａＢＧＬ１変異体が産生される形質転換体）のみがセロビオースを炭素源にできる。このため、以下に述べるように、最少寒天培地で形質転換体を培養することで、コロニーの形成が大きく、活性を保持したＰ３ＡａＢＧＬ１変異株のみの選択が可能になる。
　２％グルコースの場合とのＰ３ＡａＢＧＬ１変異株のコロニー形成および、ＢＧＬ活性の有無を比較した。炭素源がグルコースの最少寒天培地で形成したＰ３ＡａＢＧＬ１変異株を下記の活性測定法にしたがい活性を測定した結果、全コロニーのうちＢＧＬ活性がある変異株は２６．５％であった。これに対し、炭素源が０．１％グルコースおよび２％セロビオースの最少寒天培地で形成したＰ３ＡａＢＧＬ１変異株のうち７０．５％のＰ３ＡａＢＧＬ１変異株は、コロニー形成が小さかった。比較的コロニー形成が大きな残りのＰ３ＡａＢＧＬ１変異株を下記の活性測定法にしたがい活性を測定した結果、このうち８３．９％のＡａＢＧＬ１変異株でＢＧＬ活性を検出できた。つまり、炭素源が０．１％グルコースおよび２％セロビオースの最少寒天培地でコロニー形成の大きなＰ３ＡａＢＧＬ１変異株を選択的に取得することで、失活したＰ３ＡａＢＧＬ１変異株を除くことが可能であった。また、炭素源が２％セロビオースのみの場合、形質転換体の取得効率が極端に低下し、多数の変異株の取得が困難になった。これは、活性を保持した変異型Ｐ３ＡａＢＧＬ１の発現のための炭素源が無いためセロビオースを資化できないためと考えられる。
＜Ｐ３ＡａＢＧＬ１変異株ライブラリーからのスクリーニング＞
　Ｐ３ＡａＢＧＬ１変異株ライブラリーから、コロニー形成の大きな変異株および元株であるＰ３ＡＳＰ３３２６株をＹＥＳ培地１５０μｌ／ｗｅｌｌ(９６ウェルプレート)で３０℃、２日間培養した。この培養上清５０μlを５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１５０μｌで希釈し酵素希釈サンプルを調製し、下記方法にしたがって活性測定を行った。
（活性測定法）
　２０ｍＭ　ｐ－ニトロフェニル-β－Ｄ－グルコシド(以下、ｐＮＰＧと略す)１０μｌに１Ｍ　酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）１０μｌと水１３０μｌを加え、酵素希釈サンプル５０μｌを添加して、３７℃で１０分間反応させた。２％炭酸ナトリウム液１００μｌに反応液１００μｌを加えて反応停止させ、遊離したｐ－ニトロフェノール量を波長４５０ｎｍで比色定量した。
　１分間当たり、１μｍｏｌに相当するｐ－ニトロフェノールを生成する酵素量を１Ｕとした。
（グルコース阻害測定）
　２０ｍＭ　ｐＮＰＧ　１０μｌに１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）１０μｌと１Ｍグルコース４μｌ～１０μｌ（終濃度２０ｍＭ～５０ｍＭ）を添加し、水で１５０μｌにメスアップ後、酵素希釈サンプル５０μｌを添加して、３７℃で１０分間反応させた。対照として、グルコース未添加の反応液を用いて、同様に３７℃で１０分間反応させた。各反応液１００μｌに２％炭酸ナトリウム液１００μｌを加えて反応停止させ、遊離したｐ－ニトロフェノール量を波長４５０ｎｍで比色定量した。
　対照サンプル（グルコース未添加サンプル）の比色定量値を１００％とした場合の各反応液の比色定量値の割合（％）を、グルコース阻害時の残存活性とした。各変異体の該残存活性をＡＳＰ３３２６株の結果と比較して、グルコース阻害耐性が変化した変異株を選択した。
（熱安定性測定）
　２０ｍＭ　ｐＮＰＧ　１０μｌに１Ｍ　酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）１０μｌと水１３０μｌを加え、６５℃～７０℃で１０分間熱処理した酵素希釈サンプル５０μｌを添加して、３７℃で１０分間反応させた。対照として、熱処理をしていない酵素希釈サンプルを用いて、同様に３７℃で１０分間反応させた。各反応液１００μｌに２％炭酸ナトリウム液１００μｌをそれぞれ加えて反応停止させ、遊離したｐ－ニトロフェノール量を波長４５０ｎｍで比色定量した。
　対照サンプル（未処理サンプル）の比色定量値を１００％とした場合の各反応液の比色定量値の割合（％）を熱処理後の残存活性とした。各変異体の該残存活性をＡＳＰ３３２６株の結果と比較して、熱安定性が向上した変異株を選択した。
＜取得変異株の培養＞
　上記で得られたＰ３ＡａＢＧＬ１変異株をＹＥＳ培地で３０℃、１日間培養した。この培養液１００μｌを５ｍｌのＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース)に植継ぎ、３０℃で２日間培養した。この培養液を遠心分離し培養上清を得た。
＜取得変異株の評価＞
　上記で得られたＰ３ＡａＢＧＬ１変異株の培養上清を用いて、酵素希釈サンプルを調製し、上記の活性測定法にしたがい活性を測定した。また、終濃度０．１ｍＭ～２００ｍＭのグルコース阻害測定および保温温度５０℃～７５℃の熱安定性測定を行い評価した。
＜改変型Ｐ３ＡａＢＧＬ１遺伝子の取得＞
　上記で得られたＰ３ＡａＢＧＬ１変異株のうち、グルコシダーゼ活性のグルコース阻害耐性および熱安定性が、ＡＳＰ３３２６株と比較して変化していたＰ３ＡａＢＧＬ１変異株を選択した。選択されたＰ３ＡａＢＧＬ１変異株の培養液１００μｌを遠心分離し、菌体を回収した。ザイモリエース処理後の菌体を鋳型として、配列番号１４で表されるプライマーおよび配列番号１５で表されるプライマー、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲ法により組込み遺伝子断片を増幅した。さらにこの断片を鋳型としてＩｎ－ｆｕｓｉｏｎプライマー（配列番号１６で表されるプライマーおよび配列番号１７で表されるプライマー）を用いてＰＣＲ法によりＰ３ＡａＢＧＬ１変異遺伝子断片を増幅した。一方、ｐＳＬ６Ｐ３ｌａｃＺを制限酵素ＡｆｌＩＩ、ＸｂａＩで消化した。この断片とＰＣＲによって得られた上記Ｐ３ＡａＢＧＬ１変異遺伝子断片とをＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ法により環状化した後、大腸菌ＤＨ５α導入して形質転換した。得られた形質転換体よりベクターを調製し、発現ベクターｐＳＬ６Ｐ３ＡａＢＧＬ１ｍｕｔＸＸ（ＸＸは変異株名）を取得した。
　ｐＳＬ６Ｐ３ＡａＢＧＬ１ｍｕｔＸＸベクターおよびＰ３ＡａＢＧＬ１変異遺伝子断片のＰ３ＡａＢＧＬ１遺伝子内の塩基配列を確認し、変異導入点を特定した。
　以上の操作を独立して４回繰り返した結果、得られた改変型Ｐ３ＡａＢＧＬ１遺伝子のグルコシダーゼ活性のグルコース阻害耐性および熱安定性に影響を与える変異がＰ３ＡａＢＧＬ１に導入されたＰ３ＡａＢＧＬ１変異株が７つ得られた。該Ｐ３ＡａＢＧＬ１変異株が産生する変異型Ｐ３ＡａＢＧＬ１およびＰ３ＡａＢＧＬ１について、Ｐ３ＡａＢＧＬ１へ導入された変異、グルコシダーゼ活性、培養液中のグルコース濃度が２０ｍＭおよび５０ｍＭの場合のグルコシダーゼ活性の残存活性（培養液中のグルコース濃度が０ｍＭである場合のグルコシダーゼ活性に対する相対値）、培養液を６５℃および６７℃で１０分間保温した後のグルコシダーゼ活性の残存活性（酵素反応前の培養液の熱処理が未処理の場合のグルコシダーゼ活性に対する相対値）を表７に示す。表中、「活性」はグルコシダーゼ活性を、右欄「サイレント」は、各変異サイレント変異の数を示す。また、表中、「ｗ．ｔ．」は、ＡＳＰ３３２６株の結果を示す。この結果、Ｐ３ＡａＢＧＬ１のＱ１４２（１４２番目のグルタミン、ＡａＢＧＬ１の１２６番目のグルタミンに相当）、Ｑ１５６（１５６番目のグルタミン、ＡａＢＧＬ１の１４０番目のグルタミンに相当）、Ｉ２６０（２６０番目のイソロイシン、ＡａＢＧＬ１の２４４番目のイソロイシンに相当）、Ｇ２９８（２９８番目のグリシン、ＡａＢＧＬ１の２８２番目のグリシンに相当）、Ｎ４５８（４５８番目のアスパラギン、ＡａＢＧＬ１の４４２番目のアスパラギンに相当）、Ｇ４６８（４６８番目のグリシン、ＡａＢＧＬ１の４５２番目のグリシンに相当）、Ｖ５１９（５１９番目のバリン、ＡａＢＧＬ１の５０３番目のバリンに相当）、およびＲ６２９（６２９番目のアルギニン、ＡａＢＧＬ１の６１３番目のアルギニンに相当）が、グルコース阻害耐性または熱安定性に関与していることが推察された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
［実施例２］
＜Ｇ２９８Ｘ　Ｓｉｔｅ－Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ断片の作製＞
　縮重プライマーを用いたＧ２９８の特異的アミノ酸置換を行った。ｐＳＬ６Ｐ３ＡａＢＧＬ１を鋳型として、配列番号８で表されるプライマーおよび配列番号１８で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりｌｅｕ１＋－Ｇ２９８Ｘ断片を増幅した。一方、配列番号１９で表されるプライマーおよび配列番号１１で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりＧ２９８Ｘ－ｔｏｐ２断片を増幅した。
　これら２断片の反応溶液に制限酵素ＤｐｎＩを加え、鋳型を消化した後、プライマー置換のため、ＳＵＰＲＥＣ－ＰＣＲを用いて精製した。精製後の２断片５０ｎｇと、配列番号１２で表されるプライマーおよび配列番号１３で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりｌｅｕ１＋－Ｇ２９８Ｘ－ｔｏｐ２断片を増幅した。その後、ＳＵＰＲＥＣ－ＰＣＲによりカラム精製した。
＜Ｓｉｔｅ－Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ変異株の取得＞
　変異遺伝子組込み断片として、上記ｌｅｕ１＋－Ｇ２９８Ｘ－ｔｏｐ２断片を用いた以外は、実施例１と同様にして変異株を作製し、得られた変異株の培養上清のグルコース阻害測定および保温温度５０℃～７５℃の熱安定性測定を行い、いずれかの活性がＡＳＰ３３２６株と比較して変化していた変異株を選抜し、選抜された変異株の染色体に組み込まれているＰ３ＡａＢＧＬ１遺伝子内の塩基配列を確認し、２９８番目のアミノ酸を特定した。この結果、グルコース阻害耐性または熱安定性がＡＳＰ３３２６株と比較して変化していたＰ３ＡａＢＧＬ１変異株では、２９８番目のアミノ酸は、セリン、フェニルアラニン、またはプロリンであった。
［実施例３］
＜Ｖ５１９Ｘ　Ｓｉｔｅ－Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ断片の作製＞
　縮重プライマーを用いたＶ５１９の特異的アミノ酸置換を行った。ｐＳＬ６Ｐ３ＡａＢＧＬ１を鋳型として、配列番号８で表されるプライマーおよび配列番号２０で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりｌｅｕ１＋－Ｖ５１９Ｘ断片を増幅した。一方、配列番号２１で表されるプライマーおよび配列番号１１で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりＶ５１９Ｘ－ｔｏｐ２断片を増幅した。
　これら２断片の反応溶液に制限酵素ＤｐｎＩを加え、鋳型を消化した後、プライマー置換のため、ＳＵＰＲＥＣ－ＰＣＲを用いて精製した。精製後の２断片５０ｎｇと、配列番号１２で表されるプライマーおよび配列番号１３で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりｌｅｕ１＋－Ｖ５１９Ｘ－ｔｏｐ２断片を増幅した。その後、ＳＵＰＲＥＣ－ＰＣＲによりカラム精製した。
＜Ｓｉｔｅ－Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ変異株の取得＞
　変異遺伝子組込み断片として、上記ｌｅｕ１＋－Ｖ５１９Ｘ－ｔｏｐ２断片を用いた以外は、実施例１と同様にして変異株を作製し、得られた変異株の培養上清のグルコース阻害測定および保温温度５０℃～７５℃の熱安定性測定を行い、いずれかの活性がＡＳＰ３３２６株と比較して変化していた変異株を選抜し、選抜された変異株の染色体に組み込まれているＰ３ＡａＢＧＬ１遺伝子内の塩基配列を確認し、５１９番目のアミノ酸を特定した。この結果、グルコース阻害耐性または熱安定性がＡＳＰ３３２６株と比較して変化していたＰ３ＡａＢＧＬ１変異株では、５１９番目のアミノ酸は、アラニン、グリシン、またはシステインであった。
［実施例４］
＜Ｑ１４２Ｘ　Ｓｉｔｅ－Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ断片の作製＞
　縮重プライマーを用いたＱ１４２の特異的アミノ酸置換を行った。ｐＳＬ６Ｐ３ＡａＢＧＬ１を鋳型として、配列番号８で表されるプライマーおよび配列番号２２で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりｌｅｕ１＋－Ｑ１４２Ｘ断片を増幅した。一方、配列番号２３で表されるプライマーおよび配列番号１１で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりＱ１４２Ｘ－ｔｏｐ２断片を増幅した。
　これら２断片の反応溶液に制限酵素ＤｐｎＩを加え、鋳型を消化した後、プライマー置換のため、ＳＵＰＲＥＣ－ＰＣＲを用いて精製した。精製後の２断片５０ｎｇと、配列番号１２で表されるプライマーおよび配列番号１３で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりｌｅｕ１＋－Ｑ１４２Ｘ－ｔｏｐ２断片を増幅した。その後、ＳＵＰＲＥＣ－ＰＣＲによりカラム精製した。
＜Ｓｉｔｅ－Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ変異株の取得＞
　変異遺伝子組込み断片として、上記ｌｅｕ１＋－Ｑ１４２Ｘ－ｔｏｐ２断片を用いた以外は、実施例１と同様にして変異株を作製し、得られた変異株の培養上清のグルコース阻害測定および保温温度５０℃～７５℃の熱安定性測定を行い、いずれかの活性がＡＳＰ３３２６株と比較して変化していた変異株を選抜し、選抜された変異株の染色体に組み込まれているＰ３ＡａＢＧＬ１遺伝子内の塩基配列を確認し、１４２番目のアミノ酸を特定した。この結果、グルコース阻害耐性または熱安定性がＡＳＰ３３２６株と比較して変化していたＰ３ＡａＢＧＬ１変異株では、１４２番目のアミノ酸は、アスパラギンまたはアルギニンであった。
［実施例５］
＜Ｇ４６８Ｘ　Ｓｉｔｅ－Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ断片の作製＞
　縮重プライマーを用いたＧ４６８の特異的アミノ酸置換を行った。ｐＳＬ６Ｐ３ＡａＢＧＬ１を鋳型として、配列番号８で表されるプライマーおよび配列番号２４で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりｌｅｕ１＋－Ｇ４６８Ｘ断片を増幅した。一方、配列番号２５で表されるプライマーおよび配列番号１１で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりＧ４６８Ｘ－ｔｏｐ２断片を増幅した。
　これら２断片の反応溶液に制限酵素ＤｐｎＩを加え、鋳型を消化した後、プライマー置換のため、ＳＵＰＲＥＣ－ＰＣＲを用いて精製した。精製後の２断片５０ｎｇと、配列番号１２で表されるプライマーおよび配列番号１３で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりｌｅｕ１＋－Ｇ４６８Ｘ－ｔｏｐ２断片を増幅した。その後、ＳＵＰＲＥＣ－ＰＣＲによりカラム精製した。
＜Ｓｉｔｅ－Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ変異株の取得＞
　変異遺伝子組込み断片として、上記ｌｅｕ１＋－Ｇ４６８Ｘ－ｔｏｐ２断片を用いた以外は、実施例１と同様にして変異株を作製し、得られた変異株の培養上清のグルコース阻害測定および保温温度５０℃～７５℃の熱安定性測定を行い、いずれかの活性がＡＳＰ３３２６株と比較して変化していた変異株を選抜し、選抜された変異株の染色体に組み込まれているＰ３ＡａＢＧＬ１遺伝子内の塩基配列を確認し、４６８番目のアミノ酸を特定した。この結果、グルコース阻害耐性または熱安定性がＡＳＰ３３２６株と比較して変化していたＰ３ＡａＢＧＬ１変異株では、４６８番目のアミノ酸は、セリンであった。
　実施例２～５で得られた各変異株のＰ３ＡａＢＧＬ１へ導入された変異、グルコシダーゼ活性、培養液中のグルコース濃度が２０ｍＭおよび５０ｍＭの場合のグルコシダーゼ活性の残存活性（相対値）、並びに培養液を６５℃および６７℃で１０分間保温した後のグルコシダーゼ活性の残存活性（相対値）を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　この結果、Ｇ２９８Ｆ（２９８番目のグリシンをフェニルアラニンへ置換）により、Ｐ３ＡａＢＧＬ１のグルコース阻害耐性が向上し、熱安定性が低下することがわかった。また、Ｖ５１９Ａ（５１９番目のバリンをアラニンへ置換）により、Ｐ３ＡａＢＧＬ１のグルコース阻害耐性は影響を受けないが、熱安定性が顕著に改善することがわかった。また、Ｇ４６８Ｓ（４６８番目のグリシンをセリンへ置換）により、グルコース阻害耐性が向上し、熱安定性が低下することがわかった。さらに、Ｑ１４２Ｎ（１４２番目のグルタミンをアスパラギンへ置換）により、Ｐ３ＡａＢＧＬ１の熱安定性が改善されることが示唆された。
［実施例６］
＜ＳｔＥＰ法による変異遺伝子の統合＞
　２種類または数種類のｐＳＬ６Ｐ３ＡａＢＧＬ１ｍｕｔＸＸベクター（ｔｏｔａｌ　１ｎｇ）を鋳型として、配列番号６で表されるプライマーおよび配列番号７で表されるプライマーを用いてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて、ZhaoらのＳｔＥＰ法（Huimin Zhao, METHODS IN ENZYMOLOGY, vol.388, p42-49, 2004.）を基にし、ＰＣＲ条件は９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、７２℃で２０秒間（２．６ｋｂ）を３０サイクルした後、９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、７２℃で３分間（２．６ｋｂ）を５サイクルでＰ３ＡａＢＧＬ１遺伝子断片を増幅した。一方、これとは別にｐＳＬ６Ｐ３ＡａＢＧＬ１を鋳型として、配列番号８で表されるプライマーおよび配列番号９で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりｌｅｕ１＋プロモーター断片を増幅した。また、これとは別にｐＳＬ６Ｐ３ＡａＢＧＬ１を鋳型として、配列番号１０で表されるプライマーおよび配列番号１１で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりターミネーターｔｏｐ２断片を増幅した。ＰＣＲ法にはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ (タカラバイオ社製)を用いた。
　これら３断片の反応溶液に制限酵素ＤｐｎＩを加え、鋳型を消化した後、プライマー置換のため、ＳＵＰＲＥＣ－ＰＣＲ(タカラバイオ社製)を用いて精製した。精製後の３断片５０ｎｇと、配列番号１２で表されるプライマーおよび配列番号１３で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりｌｅｕ＋プロモーター－Ｐ３ＡａＢＧＬ１－ターミネーターｔｏｐ２断片を増幅した。その後、ＳＵＰＲＥＣ－ＰＣＲによりカラム精製した。
＜ＳｔＥＰ変異統合株の取得＞
　変異遺伝子組込み断片として、上記で得られた断片を用いた以外は、実施例１と同様にして変異株を作製し、得られた変異株の培養上清のグルコース阻害測定および保温温度５０℃～７５℃の熱安定性測定を行い、いずれかの活性がＡＳＰ３３２６株と比較して変化していた変異株を選抜し、選抜された変異株の染色体に組み込まれているＰ３ＡａＢＧＬ１遺伝子内の塩基配列を確認した。
　得られた各変異株のＰ３ＡａＢＧＬ１へ導入された変異、グルコシダーゼ活性、培養液中のグルコース濃度が２０ｍＭおよび５０ｍＭの場合のグルコシダーゼ活性の残存活性、並びに培養液を６５℃および６７℃で１０分間保温した後のグルコシダーゼ活性の残存活性を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
［実施例７］
＜Ｓｉｔｅ－Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ断片の作製＞
　ｐＳＬ６Ｐ３ＡａＢＧＬ１ｍｕｔ２７Ａ１０ベクターを鋳型とし、縮重プライマーを用いて、Ｑ１４２ＮおよびＧ４６８Ｓへの特異的アミノ酸置換を行った。
　Ｑ１４２Ｎの特異的アミノ酸置換を行う場合には、具体的には、配列番号８で表されるプライマーおよび配列番号２２で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりｌｅｕ１＋－Ｑ１４２Ｘ断片を増幅した。一方、配列番号２３で表されるプライマーおよび配列番号１１で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりＱ１４２Ｎ－ｔｏｐ２断片を増幅した。
　これら２断片の反応溶液に制限酵素ＤｐｎＩを加え、鋳型を消化した後、プライマー置換のため、ＳＵＰＲＥＣ－ＰＣＲを用いて精製した。精製後の２断片５０ｎｇと、配列番号１２で表されるプライマーおよび配列番号１３で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりｌｅｕ１＋－Ｑ１４２Ｎ－ｔｏｐ２断片を増幅した。その後、ＳＵＰＲＥＣ－ＰＣＲによりカラム精製した。
　また、Ｇ４６８Ｓへの特異的アミノ酸置換を行う場合には、配列番号７で表されるプライマーおよび配列番号２４で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりｌｅｕ１＋－Ｑ１４２Ｘ断片を増幅した。一方、配列番号２５で表されるプライマーおよび配列番号１１で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりＧ４６８Ｓ－ｔｏｐ２断片を増幅した。
　これら２断片の反応溶液に制限酵素ＤｐｎＩを加え、鋳型を消化した後、プライマー置換のため、ＳＵＰＲＥＣ－ＰＣＲを用いて精製した。精製後の２断片５０ｎｇと、配列番号１２で表されるプライマーおよび配列番号１３で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりｌｅｕ１＋－Ｇ４６８Ｓ－ｔｏｐ２断片を増幅した。その後、ＳＵＰＲＥＣ－ＰＣＲによりカラム精製した。
＜Ｓｉｔｅ－Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ変異株の取得＞
　変異遺伝子組込み断片として、上記各断片を用いた以外は、実施例１と同様にして変異株を作製し、得られた変異株のＰ３ＡａＢＧＬ１遺伝子内の塩基配列を確認し、培養上清のグルコース阻害測定および保温温度５０℃～７５℃の熱安定性測定を行った。
　得られた各変異株のＰ３ＡａＢＧＬ１へ導入された変異、グルコシダーゼ活性、培養液中のグルコース濃度が２０ｍＭおよび５０ｍＭの場合のグルコシダーゼ活性の残存活性、並びに培養液を６５℃および６７℃で１０分間保温した後のグルコシダーゼ活性の残存活性を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
［実施例８］
　野生型Ｐ３ＡａＢＧＬ１を産生する変異株、変異株１１Ｆ１０、変異株２２Ａ１２、変異株２９Ｆ０９、変異株２８Ｃ０２株をそれぞれ培養し、培養上清のグルコース阻害測定および保温温度５０℃～７５℃の熱安定性測定を行った。測定結果を図５に示す。図５（Ａ）は、グルコース濃度が０ｍＭの時のグリコシダーゼ活性を１００％とし、各グルコース濃度における各培養上清のグリコシダーゼ活性の残存活性を示す。図５（Ｂ）は、酵素反応前の加熱処理無しの時のグリコシダーゼ活性を１００％とし、各温度における各培養上清のグリコシダーゼ活性の残存活性を示す。
［実施例９］
　実施例１～７の結果から、Ｑ１４２Ｎ（１４２番目のグルタミンをアスパラギン酸へ置換）、Ｑ１５６Ｌ（１５６番目のグルタミンをロイシンへ置換）、Ｉ１２０Ｆ（１２０番目のイソロイシンをフェニルアラニンへ置換）、Ｇ２９８Ｆ（２９８番目のグリシンをフェニルアラニンへ置換）、Ｎ４５８Ｓ（４５８番目のアスパラギンをセリンへ置換）、Ｇ４６８Ｓ（４６８番目のグリシンをセリンへ置換）、Ｖ５１９Ａ（５１９番目のバリンをアラニンへ置換）、Ｒ６２９Ｌ（６２９番目のアルギニンをロイシンへ置換）が、ＡａＢＧＬ１のグルコース阻害耐性または熱安定性に関与していることが示唆された。そこで、各変異のみがＰ３ＡａＢＧＬ１に導入された変異株について、より詳細に、グルコース阻害耐性および熱安定性を調べた。
＜部位特異的変異断片の作製＞
　まず、Ｑ１５６Ｌ、Ｉ１２０Ｆ、Ｎ４５８Ｓ、またはＲ６２９Ｌのみが導入された変異株を作製した。
　プライマーを用いたＱ１５６Ｌ特異的アミノ酸置換を行った。ｐＳＬ６Ｐ３ＡａＢＧＬ１を鋳型として、配列番号８で表されるプライマーおよび配列番号２６で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりｌｅｕ１＋－Ｑ１５６Ｌ断片を増幅した。一方、配列番号２７で表されるプライマーおよび配列番号１１で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりＱ１５６Ｌ－ｔｏｐ２断片を増幅した。
　これら２断片の反応溶液に制限酵素ＤｐｎＩを加え、鋳型を消化した後、プライマー置換のため、ＳＵＰＲＥＣ－ＰＣＲを用いて精製した。精製後の２断片５０ｎｇと、配列番号１２で表されるプライマーおよび配列番号１３で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりｌｅｕ１＋－Ｑ１５６Ｌ－ｔｏｐ２断片を増幅した。その後、ＳＵＰＲＥＣ－ＰＣＲによりカラム精製した。
　プライマーを用いたＩ１２０Ｆ特異的アミノ酸置換を行った。ｐＳＬ６Ｐ３ＡａＢＧＬ１を鋳型として、配列番号８で表されるプライマーおよび配列番号２８で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりｌｅｕ１＋－Ｉ１２０Ｆ断片を増幅した。一方、配列番号２９で表されるプライマーおよび配列番号１１で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりＩ１２０Ｆ－ｔｏｐ２断片を増幅した。
　これら２断片の反応溶液に制限酵素ＤｐｎＩを加え、鋳型を消化した後、プライマー置換のため、ＳＵＰＲＥＣ－ＰＣＲを用いて精製した。精製後の２断片５０ｎｇと、配列番号１２で表されるプライマーおよび配列番号１３で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりｌｅｕ１＋－Ｉ１２０Ｆ－ｔｏｐ２断片を増幅した。その後、ＳＵＰＲＥＣ－ＰＣＲによりカラム精製した。
　プライマーを用いたＮ４５８Ｓ特異的アミノ酸置換を行った。ｐＳＬ６Ｐ３ＡａＢＧＬ１を鋳型として、配列番号８で表されるプライマーおよび配列番号３０で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりｌｅｕ１＋－Ｎ４５８Ｓ断片を増幅した。一方、配列番号３１で表されるプライマーおよび配列番号１１で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりＮ４５８Ｓ－ｔｏｐ２断片を増幅した。
　これら２断片の反応溶液に制限酵素ＤｐｎＩを加え、鋳型を消化した後、プライマー置換のため、ＳＵＰＲＥＣ－ＰＣＲを用いて精製した。精製後の２断片５０ｎｇと、配列番号１２で表されるプライマーおよび配列番号１３で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりｌｅｕ１＋－Ｎ４５８Ｓ－ｔｏｐ２断片を増幅した。その後、ＳＵＰＲＥＣ－ＰＣＲによりカラム精製した。
　プライマーを用いたＲ６２９Ｌ特異的アミノ酸置換を行った。ｐＳＬ６Ｐ３ＡａＢＧＬ１を鋳型として、配列番号８で表されるプライマーおよび配列番号３２で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりｌｅｕ１＋－Ｒ６２９Ｌ断片を増幅した。一方、配列番号３３で表されるプライマーおよび配列番号１１で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりＲ６２９Ｌ－ｔｏｐ２断片を増幅した。
　これら２断片の反応溶液に制限酵素ＤｐｎＩを加え、鋳型を消化した後、プライマー置換のため、ＳＵＰＲＥＣ－ＰＣＲを用いて精製した。精製後の２断片５０ｎｇと、配列番号１２で表されるプライマーおよび配列番号１３で表されるプライマーを用いてＰＣＲ法によりｌｅｕ１＋－Ｒ６２９Ｌ－ｔｏｐ２断片を増幅した。その後、ＳＵＰＲＥＣ－ＰＣＲによりカラム精製した。
＜Ｓｉｔｅ－Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ変異株の取得＞
　変異遺伝子組込み断片として、上記各断片を用いた以外は、実施例１と同様にして変異株を作製し、得られた変異株のＰ３ＡａＢＧＬ１遺伝子内の塩基配列を確認した。
＜グルコシダーゼ活性、グルコース阻害耐性、および熱安定性の評価＞
　実施例１と同様にして、各変異株の培養上清のグルコース阻害測定および保温温度５０℃～７５℃の熱安定性測定を行った。結果を表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　この結果、Ｉ２６０Ｆにより、Ｐ３ＡａＢＧＬ１のグルコース阻害耐性と熱安定性のいずれも向上することがわかった。また、Ｇ２９８ＦおよびＧ４６８Ｓにより、Ｐ３ＡａＢＧＬ１のグルコース阻害耐性が向上し、熱安定性が低下することがわかった。さらに、Ｎ４５８Ｓ、Ｖ５１９Ａ、およびＲ６２９Ｌにより、Ｐ３ＡａＢＧＬ１のグルコース阻害耐性を低下させることなく、熱安定性を改善させられることがわかった。また、Ｑ１５６Ｌにより、Ｐ３ＡａＢＧＬ１のグルコース阻害耐性と熱安定性のいずれも低下することがわかった。
　Ｐ３ＡａＢＧＬ１におけるこれらの変異部位のうち、４６８番目のグリシンおよび５１９番目のバリンは、βーグルコシダーゼ間で非常に保存性が高い。また、２６０番目のイソロイシン、２９８番目のグリシン、４５８番目のアスパラギン、または６２９番目のアルギニンに相当するアミノ酸は、各βーグルコシダーゼ間で側鎖の大きさや極性が類似しており、かつ、当該アミノ酸の前後は非常に保存性の高い領域である。したがって、これらのアミノ酸は、いずれもβーグルコシダーゼの活性に重要なアミノ酸である可能性が高く、これらのアミノ酸をＰ３ＡａＢＧＬ１と同様に置換することにより、本実施例におけるＰ３ＡａＢＧＬ１と同様に、各βーグルコシダーゼの活性も影響を受けると考えられる。
［実施例１０］
＜変異型Ｐ３ＡａＢＧＬ１の精製＞
　変異株中、１１Ｆ１０株、２２Ａ１２株、２８Ｃ０２株、２９Ｆ０９株およびｍｕｔＢＧＬ１株並びに親株であるＡＳＰ３３２６株をＹＰＤ培地１００ｍｌ／坂口フラスコで３０℃、２日間培養した。この培養上清に８０％飽和硫酸アンモニウムになるように硫酸アンモニウムを添加し、４℃で２時間硫安沈澱を行った。遠心分離でペレットを回収し、１０ｍＭクエン酸－リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに溶解させ、１００，０００ＭＷＣＯ限外ろ過膜で脱塩・濃縮し、１ｍｌの粗精製液を取得した。粗精製液をＨｉｔｒａｐ　ＱＸＬカラムで精製し、ｐＮＰＧ活性のピーク画分を回収し、精製サンプルとした。１０ｍＭ　クエン酸－リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、ＮａＣｌ塩濃度勾配（０－１Ｍ）により、溶出した。
＜精製変異型Ｐ３ＡａＢＧＬ１の性状解析＞
　実施例１と同様にして、グルコース濃度０．１ｍＭ～２００ｍＭまでのグルコース阻害による残存活性を測定した。また、５０℃～７５℃で１０分間熱処理後の残存活性を測定した。この結果、グルコース阻害耐性改善型Ｐ３ＡａＢＧＬ１である１１Ｆ１０株は、５０ｍＭグルコース存在下で５３％の活性を有していた。熱安定性改善型Ｐ３ＡａＢＧＬ１である２２Ａ１２株は、６５℃で８０％ほどの残存活性を有していた。また、グルコース阻害耐性改善および熱安定性改善型Ｐ３ＡａＢＧＬ１であるｍｕｔＢＧＬ１株では、５０ｍＭグルコース存在下で６０％の活性を有し、６５℃で４５％ほどの残存活性を有していた。
　本発明の形質転換体から得られるβ－グルコシダーゼはセルロースの酵素糖化に使用できる。また、本発明の形質転換体が分泌シグナルを有するβ－グルコシダーゼを発現しうるものである場合は、培養液中にβ－グルコシダーゼが分泌されることより、セルロースの存在する培養液中でこの形質転換体を培養することによって、その培養液中のセルロースを酵素糖化することができる。
　なお、２０１１年３月２４日に出願された日本特許出願２０１１－０６６５３９号の明細書、特許請求の範囲、要約書および図面の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。

Claims (15)

  1. 　下記改変型β－グルコシダーゼをコードする領域を含む構造遺伝子配列、並びに該構造遺伝子を発現させるためのプロモーター配列およびターミネーター配列を、染色体中に有するまたは染色体外遺伝子として有する、シゾサッカロミセス（ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母の形質転換体。
    　改変型β－グルコシダーゼ：下記変異１～変異６からなる群より選択される少なくとも１の変異が存在する糸状菌由来のβ－グルコシダーゼであって、前記変異を有しない糸状菌由来のβ－グルコシダーゼよりも熱安定性またはグルコース阻害耐性が高い、β－グルコシダーゼ。
    　　変異１；ＡａＢＧＬ１（アスペルギルス・アクリータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）のＢＧＬ１）の２４４番目のイソロイシンに相当するアミノ酸が、フェニルアラニンに置換された変異。
    　　変異２；ＡａＢＧＬ１の２８２番目のグリシンに相当するアミノ酸が、フェニルアラニンに置換された変異。
    　　変異３；ＡａＢＧＬ１の４４２番目のアスパラギンに相当するアミノ酸が、セリンに置換された変異。
    　　変異４；ＡａＢＧＬ１の４５２番目のグリシンに相当するアミノ酸が、セリンに置換された変異。
    　　変異５；ＡａＢＧＬ１の５０３番目のバリンに相当するアミノ酸が、アラニンに置換された変異。
    　　変異６；ＡａＢＧＬ１の６１３番目のアルギニンに相当するアミノ酸が、ロイシンに置換された変異。
  2. 　前記糸状菌由来のβ－グルコシダーゼがＢＧＬ１である、請求項１に記載の形質転換体。
  3. 　前記糸状菌が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の微生物である、請求項１または２に記載の形質転換体。
  4. 　前記糸状菌由来のβ－グルコシダーゼが、配列番号１で表されるアミノ酸配列とのホモロジーが７０％以上であり、かつβ－Ｄ－グルコピラノシド結合の加水分解反応を触媒する活性を有する蛋白質である、請求項１～３のいずれか一項に記載の形質転換体。
  5. 　前記構造遺伝子配列が、前記改変型β－グルコシダーゼをコードする領域の５’末端側および３’末端側の少なくともいずれか一方に、シグナルをコードする領域またはタグをコードする領域を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の形質転換体。
  6. 　前記構造遺伝子配列が、前記改変型β－グルコシダーゼをコードする領域の５’末端側に、分泌シグナルをコードする領域を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の形質転換体。
  7. 　下記改変型β－グルコシダーゼをコードする領域を含む構造遺伝子配列、並びに該構造遺伝子を発現させるためのプロモーター配列およびターミネーター配列を含むベクターにより、シゾサッカロミセス属酵母を形質転換することを特徴とする形質転換体の製造方法。
    　改変型β－グルコシダーゼ：下記変異１～変異６からなる群より選択される少なくとも１の変異が存在する糸状菌由来のβ－グルコシダーゼであって、前記変異を有しない糸状菌由来のβ－グルコシダーゼよりも熱安定性またはグルコース阻害耐性が高い、β－グルコシダーゼ。
    　　変異１；ＡａＢＧＬ１（アスペルギルス・アクリータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）のＢＧＬ１）の２４４番目のイソロイシンに相当するアミノ酸が、フェニルアラニンに置換された変異。
    　　変異２；ＡａＢＧＬ１の２８２番目のグリシンに相当するアミノ酸が、フェニルアラニンに置換された変異。
    　　変異３；ＡａＢＧＬ１の４４２番目のアスパラギンに相当するアミノ酸が、セリンに置換された変異。
    　　変異４；ＡａＢＧＬ１の４５２番目のグリシンに相当するアミノ酸が、セリンに置換された変異。
    　　変異５；ＡａＢＧＬ１の５０３番目のバリンに相当するアミノ酸が、アラニンに置換された変異。
    　　変異６；ＡａＢＧＬ１の６１３番目のアルギニンに相当するアミノ酸が、ロイシンに置換された変異。
  8. 　前記構造遺伝子配列が、前記改変型β－グルコシダーゼをコードする領域の５’末端側および３’末端側の少なくともいずれか一方に、シグナルをコードする領域またはタグをコードする領域を有する、請求項７に記載の形質転換体の製造方法。
  9. 　前記構造遺伝子配列が、前記改変型β－グルコシダーゼをコードする領域の５’末端側に、分泌シグナルをコードする領域を有する、請求項７に記載の形質転換体の製造方法。
  10. 　前記ベクターを、シゾサッカロミセス属酵母の染色体の１カ所以上に組み込む、請求項７～９のいずれか一項に記載の形質転換体の製造方法。
  11. 　前記ベクターを、染色体中のトランスポゾン遺伝子Ｔｆ２部位に組み込む、請求項１０に記載の形質転換体の製造方法。
  12. 　請求項１～５のいずれか一項に記載の形質転換体を培養して得られた菌体から、改変型β－グルコシダーゼを取得することを特徴とするβ－グルコシダーゼの製造方法。
  13. 　請求項６に記載の形質転換体を培養して得られた培養液上清から、改変型β－グルコシダーゼを取得することを特徴とするβ－グルコシダーゼの製造方法。
  14. 　請求項１２または１３に記載のβ－グルコシダーゼの製造方法により得られた改変型β－グルコシダーゼを用いることを特徴とするセルロースの分解方法。
  15. 　請求項６に記載の形質転換体を、セルロースの存在下で培養することを特徴とするセルロースの分解方法。
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