JPH0515380A - ベクター - Google Patents
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- JPH0515380A JPH0515380A JP24513491A JP24513491A JPH0515380A JP H0515380 A JPH0515380 A JP H0515380A JP 24513491 A JP24513491 A JP 24513491A JP 24513491 A JP24513491 A JP 24513491A JP H0515380 A JPH0515380 A JP H0515380A
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Abstract
aromyces pombe)内で発現させることができる新規なベ
クターを提供する。 【構成】酵母シゾサッカロミセス ポンベ内において機
能する複製開始点、SV40あるいはサイトメガロウイルス
由来のプロモーター領域、および該プロモーター領域の
下流に存在しかつヒトリポコルチンIをコードする遺伝
子領域などの外来遺伝子を挿入しうる挿入部位、を含む
ベクター。
Description
り真核細胞を用いて異種タンパク質を製造する場合に有
用な、外来遺伝子挿入部位を有するベクター、そのベク
ターに異種タンパク質をコードする構造遺伝子領域を含
む外来遺伝子が挿入された発現ベクター、およびその発
現ベクターを利用し真核細胞を用いて異種タンパク質を
製造する方法に関する。特に、本発明は、酵母 S.pombe
の細胞内において発現しうる発現ベクターとその利用に
関するものである。
菌、枯草菌、及び酵母サッカロミセスセレビジエなどが
汎用されてきた。このような宿主に、目的とする異種タ
ンパク質をコードする構造遺伝子領域を含む発現ベクタ
ーを導入し、この発現系を用いて目的とするタンパク質
を多量に製造する方法が広く検討され、既に一部のタン
パク質の製造に実用化されている。
量製造を目的とした場合、宿主細胞の選定は重要なポイ
ントとなる。従って、宿主の選択範囲を広げておくこと
は重要である。現在では、上記宿主・ベクター系以外に
もいくつかの系が知られている[Candida maltosa (J.Ba
cteriol.,167,561(Takagi ら))、Bacillus amyloliquef
aciens、Acetobacter aceti 、Corynebacterium giutum
icum、Pseudomonas putidaなど]。
択肢をさらに広げるため、宿主としてシゾサッカロミセ
ス ポンベ(Shizosaccharomyces pombe)[以下、S.po
mbe という]を用いることを検討した。S.pombe は分裂
酵母 Shizosaccharomyces 属の酵母である。本酵母は酵
母類の中では動物細胞に近い性質を示すことが知られて
おり、例えばその糖鎖については動物細胞のものと類似
していることが報告されている。
たタンパク質としてはヒト型タンパク質が望まれること
が多い。しかし、従来の酵母発現系で製造されたタンパ
ク質は、糖鎖を有しないかヒト型タンパク質と糖鎖の相
異が大きく、ヒト体内で免疫反応を起こし易く、またヒ
ト体内で不安定であることが多かった。
効率よく発現させるために、転写開始に必要な遺伝子シ
グナルであるプロモーターとしてより高活性なものを選
択したり、発現ベクターのコピー数を増大させる手段が
行われてきた。しかしながら、S.pombe において高い活
性を有するプロモーターについては知られておらず、S.
pombe を宿主としたベクター系の開発は遅れていた。
状に鑑み、S.pombe 細胞内で機能するプロモーターを開
発する必要があると考え、各種プロモーターを検索し
た。その結果、検索したプロモーターの内、動物細胞ウ
イルス由来のプロモーター、特にSV40プロモーターおよ
びサイトメガロウイルスプロモーター、に強いプロモー
ター活性を認めた。また、このプロモーターは、動物細
胞内でも発現を誘起しうる性質を持っていることから、
S.pombe 以外の他の酵母や動物細胞などの真核細胞の発
現ベクターとして使用することが可能である。
モーターを有し、しかも真核細胞内で機能する複製開始
点と発現される異種タンパク質をコードする構造遺伝子
領域を含む外来遺伝子が挿入される挿入部位とを有する
下記のベクターである。
点、動物細胞ウイルス由来のプロモーター領域、および
該プロモーター領域の下流に存在する外来遺伝子挿入部
位を含むベクター。
子挿入部位に異種タンパク質をコードする構造遺伝子領
域を含む外来遺伝子が挿入されてなる発現ベクター、お
よびその発現ベクターを有する真核細胞からなる異種タ
ンパク質発現系である。
する真核細胞を培養して異種タンパク質を産生させ、こ
の異種タンパク質を回収することを特徴とするタンパク
質の製造方法である。特に、従来の酵母宿主細胞系と比
べより動物細胞に近い特性を示すS.pombe を宿主とした
異種タンパク質発現系を使用して、異種タンパク質を製
造する方法である。
が本来有していない遺伝子をいい、この外来遺伝子は異
種タンパク質をコードする構造遺伝子領域を有してい
る。異種タンパク質とは宿主細胞が本来有していない構
造遺伝子領域でコードされたタンパク質であり、特にヒ
ト細胞が産生しかつ生理活性を有するタンパク質が好ま
しい。
において機能する複製開始点、(2) 動物細胞ウイルス由
来のプロモーター領域、および(3) 上記プロモーター下
流に設けられた外来遺伝子挿入部位、を含み、さらに好
ましくは、(4) サッカロミセス セレビジエ(Saccharo
myces cerevisiae)のLEU2またはURA3遺伝子、および/
または(5) 上記プロモーター支配下のネオマイシン耐性
遺伝子、
好ましい。さらに、本発明の(発現)ベクターは、大腸
菌内でのプラスミド調製などを容易にするために、大腸
菌内でも複製、選択ができるようなDNA領域を持つも
の(すなわち、シャトルベクターとして使用しうるも
の)が好ましい。
0 あるいはサイトメガロウイルスが好ましいが、充分な
プロモーター活性を有するプロモーター領域を有する動
物細胞ウイルスである限り必ずしもこれに限られるもの
ではない。
来遺伝子挿入部位は外来の遺伝子を導入するための部位
であり、種々の制限酵素切断部位を含む遺伝子領域であ
る。制限酵素切断部位は市販の適当な合成リンカーを導
入することによって容易に作ることができる。外来遺伝
子は異種タンパク質をコードする構造遺伝子領域を含
み、この構造遺伝子領域を細胞内で発現させることによ
り異種タンパク質が産生される。
ーをロイシンまたはウラシル要求性の細胞に導入しロイ
シンまたはウラシル要求性を解除した形質転換体を選択
するために通常必要とされる。この操作を行うことによ
り希望する遺伝子を導入したベクターを持った酵母を容
易に得ることが可能になる。
的で発現ベクターコピー数を増大させるために、ベクタ
ーにネオマイシン耐性遺伝子を導入することが好まし
い。この発現ベクターを導入した酵母に対し G418(ネオ
マイシン)選択を行えば、ネオマイシン耐性遺伝子を多
く含む酵母のみが選択される。これにより、それを行わ
ない場合に比較して数倍の発現ベクターコピー数増加が
期待される。
腸菌を宿主とするのが簡便なため大腸菌中でも複製、調
製が可能であることが望ましい(すなわち、本発明のベ
クターや発現ベクターはシャトルベクターであることが
好ましい)。このシャトルベクターを構築するために使
用する大腸菌中で複製可能なベクターとしては種々の公
知ベクターを利用することができる。
タンパク質としては、生理活性を有するタンパク質、特
にヒトに対して有用な生理活性を有するタンパク質が好
ましい。さらには、大腸菌を宿主とする組換えDNA技
術によっては製造の困難な糖鎖を有するタンパク質、す
なわち糖タンパク、が好ましい。生理活性を有する糖タ
ンパクとしては、例えばヒト由来リポコルチンI、アル
ギナーゼ、IL−6などがある。
ーゼA2 の活性を抑制する作用を有する分子量約3〜4
万の糖タンパクであり、ステロイドの有害な副作用なし
に抗炎症効果を有する医薬として期待されている。この
ヒトリポコルチンIを組換えDNA技術により大腸菌等
を宿主として製造する方法が知られている(例えば、特
表昭62-501679 号公報参照)。しかし、この大腸菌を使
用する方法はヒトリポコルチンIの発現量が低いことが
報告されている。ヒトリポコルチンIの遺伝子を導入し
た本発明の発現ベクターを使用することにより、ヒトリ
ポコルチンIの発現量を大幅に向上することができる。
るが、実施例は具体的認識を得るために挙げたものであ
り、本発明を限定するものではない。
いた形質転換方法 酵母ベクター;pAU5(ars、stb、URA3) pAL7(ars、stb、LEU2)、及び DNA ベクター;pcD、 pcD2、 pcD4 、
Acids Research,Vol.18,6485-6489,(1990) 、K.Okayam
a et.al.,Molecular Cellular Biology,Vol.3,280-289,
(1983))で調製した(図1に得られたこれらベクターの
ベクター構成図を示す)。
ものを調製し、これを重量で1に対してcDNAベクター2
の割合で公知の酵母の形質転換方法によって、以下の方
法を用いて形質転換体を得ることができた。
ul-32h-(ATCC-38399) を用いた。この宿主細胞を最少培
地にて (0.5 〜1) ×107 cells/mlになるまで生育さ
せ、集菌、洗菌後109 cells/mlとなるように、0.1M LiO
Ac(酢酸リチウム)(pH 5)で懸濁し、30℃で60分間イン
キュベートした。
たり1μg、50%(w/v) ポリエチレングリコール(PEG40
00) 水溶液を290 μl加えてよく撹拌した後、30℃で60
分間、43℃で15分間インキュベートし、室温で10分放置
した。遠心によりPEG を除去した後、適当量の培養液に
懸濁し、最少培地にまいた。形質転換効率は 105/μg
( DNA) 以上であった。
ラント化した後pstIで切断した。一方、pcD 、pcD2、 p
cD4 ベクターを salI で切断し、ブラント化した後pstI
で切断した。次いで、前者と後者の切断されたベクター
を結合した(図2はこのベクターの構築方法を示すフロ
ーシートである)。
pcD4AL、pcD4AU(名称は両ベクター名の結合で表わす)
を得た。これらのベクターを1μg用いて、(1) と同様
に形質転換を行った。
1eul-32h-(ATCC-38399) を最少培地で 0.6×107cells/m
lになるまで生育させた。集菌、洗菌後107 cells/mlに
なるように 0.1MLiOAc(pH5)に懸濁し、30℃、60分間イ
ンキュベートした。その後、上記懸濁液 100μlに、pA
L7を PstI で切断したもの1μg、 pcD4AT 2μgをTE
(トリスEDTA) 15μlに加えたもの、および50%(w/v)
PEG4000 水溶液 290μlを加え、よく混合した後、30℃
で60分間、43℃で15分間、室温で10分間の順にインキュ
ベートし、遠心により PEGを除去した後、培養液1mlに
懸濁した。
mlとともに加えて32℃で30分間、室温で60分間インキュ
ベートした後、0.3ml を最少寒天培地に塗布した。2日
後、形質転換体が 105/μg(pAL7) の割合で出現した。
3%グルコース、0.5 %イースト抽出液、25μg/mlのG4
18を含む培地50mlで2日間培養後、集菌、洗菌し、250m
M トリス塩酸(pH8.0)に懸濁し、超音波破砕して遠心
し、上清の細胞抽出液を得た。同様にしてS.pombe leul
-32h-、及びpAL7+pcDCAT で形質転換した株とpAL7+pcD4
CATで形質転換した株を上記培地からG418を除いた培地
で同様に生育させ細胞抽出液を調製した。
mMアセチルCoA. 18 μl、水1μl、および14C−クロ
ラムフェニコールを加え、37℃で1時間インキュベート
した後、400 μlのEtOAc(酢酸エチル) を加え上層を抽
出した。遠心乾固させた後25μlのEtOAc に再び溶かし
TLC にスポットし、クロロホルム/メタノール(=95/
5)の展開溶媒にて展開、オートラジオグラフ15時間で C
AT(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ)アッセイを行った。
1はコントロールでベクターを含まない宿主酵母を用い
た結果、レーン2はSV40プロモーターを持つ形質転換体
での結果、レーン3はサイトメガロウイルスプロモータ
ー、レーン4はサイトメガロウイルスプロモーターを含
む菌体をG418存在下で培養した形質転換体での結果を示
す。
む発現ベクターの作製方法 ヒト繊維芽細胞由来の岡山−バーグcDNAライブラリ
ー(pcD ベクター)を公知の方法により調製した。
86) ) ヒトリポコルチンIの遺伝子配列のうち、タンパ
ク質のN端側アミノ酸配列をコードする遺伝子配列(AT
GGCAATGGTATCAGAATTCCTCAAGCAGGCCTGGTTTATTGAAAATGAの
50塩基)をDNAプローブとして上述のライブラリーか
らリポコルチンIの遺伝子をコロニーハイブリダイゼイ
ション法により取得し、塩基配列を決定することによ
り、リポコルチンIタンパク質全長をコードするもので
あることを確認した。取得したクローンをpcD lipoI と
名付けた。
り、リポコルチンI遺伝子を切り出した。一方公知の方
法で調製したpcD4CATをBamHI で切断し、CAT 遺伝子を
除去後ライゲーションし、pcD4を作製した。pcD4をBamH
I で部分切断し、平滑末端化した後ライゲーションして
pcD4 Bを作製した。pcD4 BをBamHI で切断し、アルカリ
フォスファターゼ処理したものと、pcD lipoI から得た
リポコルチンI遺伝子断片とをライゲーションすること
によりpcD4 lipoIを得た。図4はこのベクターの構築方
法を示すフローシートである。
leu1-32h-(ATCC-38399) を最少培地で 0.6×107cells/
mlになるまで生育させた。集菌、洗菌後109 cells/mlに
なるように0.1M LiOAc(pH5) に懸濁し、30℃、60分間イ
ンキュベートした。
tIで切断したもの1μg、実施例4で得た pcD4 lipoI
2μg、TE 15 μlを加え、さらに50%(w/v)PEG4000水
溶液を 290μl加えよく混合した後30℃で60分間、43℃
で15分間、室温で10分間の順にインキュベートし、遠心
によりPEG を除去、培養液1mlに懸濁した。200 mlフラ
スコ中に培養液9mlとともに加えて32℃で30分間、室温
で60分間インキュベートした後、0.3 mlを最少寒天培地
に塗布した。2日後形質転換体が105/μg(pAL7)の割
合で出現した。
2%グルコース、1%イースト抽出液、2%ペプトン、
からなる培地50mlにて32℃で一晩培養後、その培養液か
ら5×107cells程度の菌体をとり、1%イースト抽出
液、2%ペプトン、2%グルコース、200 μg/mlのG4
18を含む培地にて37℃で24時間培養した。培養後、集
菌、洗菌し、生理食塩水に懸濁し超音波破砕して遠心
し、上清の細胞抽出液を得た。この細胞抽出液をSDS
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて解析したところ分
子量 36Kのタンパク質のバンドが確認され、クーマシー
ブリリアントブルー染色によれば全タンパク質の5%に
相当するものと認められた。
あることを確認する目的でウェスタンブロットを行っ
た。 36KバンドはヒトリポコルチンIに特異的に反応す
る抗体により特異的に染色された。対照としてヒトリポ
コルチン遺伝子を含まないベクターを持つS.pombe 細胞
抽出液を解析したが、ヒトリポコルチン抗体により染色
されるバンドは認められなかった。
泳動図(クーマシーブリリアントブルー染色(1)(2))、
及びウェスタンブロット観察図((3)(4))を示す。 (1)(3);対照となるプラスミドpcD4 Xで形質転換したS.p
ombe (2)(4);pcD4 lipoIにて形質転換したS.pombe
ポコルチンは以下のようにして精製した。実施例6で得
た細胞抽出液を、0.15M NaClと1mM CaCl2 を含む20mMト
リス塩酸(pH7.5)に透析し、Uchida & Filburn ( J.Bio
l.Chem.259、12311 (1984))の方法によって作製したポリ
アクリルアミド固定化フォスファチジルセリンと混ぜ、
4℃、1 時間放置した。遠心後(8,000 G 、15min)、残
渣を、0.15M NaClと1mM CaCl2を含む20mMトリス塩酸(p
H7.5) にて洗い、さらに5mM EDTAと0.15M NaClを含む20
mMトリス塩酸(pH7.5) に懸濁した。4℃、30分放置後、
遠心(8,000 G 、20min )し、上清を5mM NH4OAc(酢酸
アンモニウム)(pH 8.6)にて透析した。
Mono Qカラム(ファルマシア)にかけ未吸着画分を集
め、さらにそれを10mM NH4OAc(pH6.0)に透析したのち、
10mMNH4OAc(pH6.0)で平衡化したMono Sカラム(ファル
マシア)にかけ0〜0.4M NaCl の直線勾配により溶出さ
せ0.07M NaClで溶出されてくる画分を集めた。これによ
りヒトリポコルチンIを精製することができた。純度は
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(4%−20%ア
クリルアミドゲル(TEFCO)) により検定することができ
クーマシーブリリアントブルー染色により36K の位置に
唯一のバンドを確認した。
新規なベクターを構築することができ、しかもそのベク
ターを用いてS. pombeにより効率よく異種タンパク質を
産生させることができた。
ト
すフローシート
びウェスタンブロット観察図
Claims (12)
- 【請求項1】真核細胞宿主内において機能する複製開始
点、動物細胞ウイルス由来のプロモーター領域、および
該プロモーター領域の下流に存在する外来遺伝子挿入部
位を含むベクター。 - 【請求項2】宿主の真核細胞が酵母シゾサッカロミセス
ポンベ(Shizosaccharomyces pombe)である、請求項
1のベクター。 - 【請求項3】動物細胞ウイルス由来のプロモーター領域
が、SV40あるいはサイトメガロウイルス由来のプロモー
ター領域である、請求項1のベクター。 - 【請求項4】請求項1のベクターが、さらに、ネオマイ
シン耐性遺伝子領域、LEU2遺伝子領域、およびURA3遺伝
子領域の少なくとも1種を含む、請求項1のベクター。 - 【請求項5】請求項1〜4のいずれかのベクターの外来
遺伝子挿入部位に異種タンパク質をコードする構造遺伝
子領域を含む外来遺伝子を挿入してなる、発現ベクタ
ー。 - 【請求項6】異種タンパク質をコードする構造遺伝子領
域が、ヒトリポコルチンIをコードする遺伝子領域であ
る、請求項5の発現ベクター。 - 【請求項7】請求項5あるいは6の発現ベクターを有す
る真核細胞からなる、異種タンパク質発現系。 - 【請求項8】真核細胞が酵母シゾサッカロミセス ポン
ベ(Shizosaccharomyces pombe)である、請求項7の発
現系。 - 【請求項9】請求項5の発現ベクターを有する真核細胞
を培養して異種タンパク質を産生させ、この異種タンパ
ク質を回収することを特徴とするタンパク質の製造方
法。 - 【請求項10】真核細胞が酵母シゾサッカロミセス ポ
ンベ(Shizosaccharomyces pombe)である、請求項9の
製造方法。 - 【請求項11】請求項6の発現ベクターを有する真核細
胞を培養してヒトリポコルチンIを産生させ、このヒト
リポコルチンIを回収することを特徴とするヒトリポコ
ルチンIの製造方法。 - 【請求項12】真核細胞が酵母シゾサッカロミセス ポ
ンベ(Shizosaccharomyces pombe)である、請求項11
の製造方法。
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