KR940005584B1 - 트롬빈 억제제의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
내용 없음.
Description
제1도 및 2도는 각각 플라스미드 pML 300 및 pML 305의 작제를 보여주는 도식적 그림이다.
제3도는 trp 프로모터를 함유하는 플라스미드 pHRi 148의 작제를 도시한 것이다.
제4도는 발현 플라스미드 pML 310의 작제를 도시한 것이다.
제5도는 성숙 데설페이토히루딘(desulphatohirudin)을 코드화하는 DNA 단편의 분리를 보여주는 도식적 그림이다.
제6도는 데설페이토히루딘 분비용 발현 플라스미드의 작제를 도식적으로 보여 준 것이다.
제7도는 데설페이토히루딘의 세포내 발형용 발현 플라스미드의 작제를 도식적으로 보여준 것이다.
제8도는 PH05프로모터 영역을 포함하는 PH05의 BamH I-Sal I제한 단편의 DNA서열을 도시한 것이다.
제9도는 GAPDH 유전자의 프로모터 영역의 DNA 서열을 보여준 것이다.
제10도는 플리스미드 pGAPDH-EL의 작제를 보여주는 도식적 그림이다.
제11도는 플라스미드 pGAPDH-FL 및 pGAPDH-EL에 존재하는 GAPDH 프로모터 단편의 서열을 도시한 것이다.
제12도는 플라스미드 pJDB 207/PH05(ECO)-HIR의 작제를 보여준 것이다.
제13도는 플라스미드 pJDB 207/PAPEL-HIR(UAS 1+ UAS2)의 작제를 보여준 것이다.
제14도는 플라스미드 pJDB 207/[GAPEL-HIR]D의 작제를 도시한 것이다.
제15도는 플라스미드 pJDB 207/GAPFL-I-HIR의 작제를 보여주는 도식적 그림이다.
본 발명은 재조합 DNA기술 분야로서, 유전자 조작된 진핵 세포 보조하에 트롬빈 억제제 데설페이토히루딘을 제조하는 방법, 상기 유전자 조작죈 진핵 세포,데설페이토히루딘에 대한 유전자를 함유하는 하이브리드 벡터, 및 상기 진핵 세포 및 상기 하이브리드 백터를 제조하는 방법에 관한 것이다.
히루딘은 거머리(Hirudo medicinalis)에서 자연적으로 존재하는 항응고제이다. 하루딘은 단일 단백질 종이 아니고 히루딘 변종 1(HV 1), 하루딘 변종 2(HV 2)[참조:유럽 특허원 제158,564호] 및 "데스-(Val)2-히루딘"[참조:유럽 특허원 제158,986호]으로 표기되는 적어도 3개의 성분으로 이루어진다. 변종은 구조에서 서로 아미노산의 수가 다르지만(특히,HV-1의 N-말단 서열은 Val-Val-Tyr이고, HV2의 N-말단 서열은 Ile-Thr-Tyr이며"데스-(Val)2-히루딘"의 N-말단서열은 Thr-Tyr이다), N-말단에는 소수성 아미노산이 축적되어 있고 C-말단에는 극성 아미노산이 축적되어 있으며, 티로신 잔기(Tyr63)가 설페이트 모노에스테르로서 존재하고 3개의 디설파이드 결합 및 항응고 활성을 갖는 것이 통상적이다.
하루딘은 6x10-11M의 Ki-값(복합제 해리 상수)를 가지며 가장 강력한 트롬빈 억제제로 알려져 있고 트롬빈에 대한 특이적 친화도에 의해 특정지워진다.
혈액응고 캐스케이드(cascade)의 다른 효소는 히루딘에 의해 억제되지 않는다.
통상의 항응고치료에서 바람직한 항응제인 헤파린에 비해 히루딘은 트롬빈상에 직접그dml 억제작용을 발휘하며 헤파린과는 달리, 안티트롬빈 Ⅲ를 통해 작용하지 않는다.
정재된 히루딘의 약물학적으로 탐지가능한 유일한 효과는 혈액 응고 억제 및 혈전증예방이다. 개에 비록 고용량으로 정맥내 투여하더라도 심박동수, 호흡,혈압, 혈소판 계수 피브리노겐 및 헤로글로빈 상에서의 효과는 관찰될 수 없다. 쥐,돼지, 및 개에게서의 시험에서 히루딘은 실험적 혈전증(혈액정지에 의해 또는 트롬빈 주사에 의해 유도), 내독소 쇼크 및 DIC(파종성 혈관내 응고)에서 효과적이라고 입증되었다.
직접 비교 실험을 수행 할 때마다, 히루딘이 헤파린보다 월등하다고 입증되었다.
더우기 히루딘은 독성이 매우 낮으며, 비항원성이고 생물학적 활성 형태에서 신장을 통해 거의 완전한 청정율(clearance)을 보여준다.
오랫동안 공지되어 있었어도 히루딘은 아직까지 그의 탁월한 생물학적 특성을 기본으로 하여 기대할수 있는 광범위한 치료적 용도를 성취하지 못했다. 이의 극도로 제한 된 이용성은 의약에서 이의 광범위한 사용에 직면한 중대한 결점이다. 현재까지 히루딘 제제는 거의 천연물질(거머리 추출물)로부터 수득해 왔는데. 이는 비싸고 구하기 어려우며 사용에 시간이 소용되고 분리 및 정제과정에서도 비용이 든다.[참조 : P. Walsmann et al., Pharmazie 36, 653(1981); 유럽특허원 제 158,986호]. 65개의 아미노산의 비교적 긴 서열견지에서 통상의 펩타이드 합성법은 경제적인 이유에서 성공 희망이 매우 적다. 그러므로 항 응고 치료에서 이의 치료적 잠재성 및 이의 광범위한 치료적 사용의 상세한 임상적 시험을 가능하게 하는 새로운 방법을 적절한 양의 히루딘의 제조에 적용해야 한다.
이러한 방법은 특히 제조합 DNA기술에 의해 제공된다. 이러한 기술에 의해, 상응하게 유전적으로 변형된 숙주 유기체를 배양함으로써 가장 다양한 생리학적 활성 폴리펩타이드를 제조 할수 있다.
이에 관련해서 히루딘은 추측상, 해독후 황산염화되는 데설페이토히루딘 전구체를 통해 거머리에 의해 생성된다고 언급되어야 한다.
거머리 이외의 숙주는 특이성 황산염-전이효소계가 부족하여 히루딘보다 데셀페이토히루딘을 생성할 것이라 예측된다. 그러나, 상응하는 히루딘 단백질의 Tyr 63잔기의 페놀성 하이드록시 그룹으로부터 황산 염 그룹을 효소적으로 제거하여 수득한 데셀페이토 히루딘 단백질에 의해 입증된 바와 같이 생물학적 활성은 황산염 그룹 부재에 의해 손상되지는 않는다.[참조 ;유럽 특허원 제 142, 860호].
최근에 공개된 유럽 특허원 제 158,564호에는 각각의 데설페이토히루딘에 대한 구조 유전자를 함유하는 폴라스미드로 형질 전환된 이.콜라이 세포에 의해 데설페이토히루딘 변종1 및 2 및 이의 유사물을 제조하는 방법이 기술되어 있다.
항응고 활성은 배양된 이.콜라이 세포의 세포 추출물에서 측정하고 0.2㎎ 히루딘/OD/ℓ의 농도에 상응하는 (15,000-20,000 ATU/순수 히루딘 ㎎의 측정된 특히 활성기준) 3,000-4,000ATU/OD600/배양물ℓ의 항-트롬빈 단위 ("ATU")량의 용어로 기재한다.
형질전환된 이.콜라이 세포로부터 수득된 히루딘 활성의 수율이 낮은 것은 추측상 히루딘 단백질의 대부분이 분자의 부정확한 폴딩(folding)에 의해 세포질내에서 불활성 형태로 축적되기 때문이다. 정확한 폴딩은 효소 활성에 필수적인 히루딘 분자내에서 3개의 디설파이드 결합의 형성에 따라 달라진다.[참조: P. Walsmann et al., 다른 자연적으로 분비된 포유동물 단백질(예 : 소의 성장 호르몬, 인체의 조직 플라스미드겐 활성화제 및 인체의 Υ-인터페론)은, 생성되어 미생물의 세포질에서 축적되는 경우 , 마찬가지로 거의 불활성이다[참조 : R.A.Smith et al., Science 229,1219(1985)]. 디설파이드 결합을 함유하는 대부분의 단백질이 세포외에 존재하므로 분비 경로는 디설파이트 결합의 형성에 유리할 수 있음이 확실하다. 분비를 가장 바람직하게 하는 다른 면도 있다.
분비 단백질은 일반적으로 세포내 축적된 생성물 보다 탐지 및 정제가 용이하고 ; 목적하는 생성물의 배지내로의 분비는 생성물을 회수하기 위해 숙주 유기체를 파괴해야 하는 필요성을 없애주며; 일부의 이질 단백질은 숙주 유기체상에 독성 효과를 가질수도 있다.
분비되는 경우 이들은 정상적인 세포 작용을 덜 방해하며; 분비 단백질은 세포의 분해시 단백질 분해효소에 의해 공격받는 세포내 축적된 단백질보다 단백질 분해효소에 의해 덜 분해된다.
대부분의 분비된 단백질은 성숙 아미노산 서열의 부가된 n-말단 연장으로서 시그널 펩타이드를 갖는 프리단백질로서 DNA상에 코드화된다.
시그널 펩타이드는 원형질 세망(ER) 막내로 단백질의 공해독(contrans lational) 삽입 기간동안 중요한 역할을 한다.
시그널 펩티다아제는 초기에 ER의 루멘면에서 시그널 펩타니드를 절단한다. 외부 세포 막으로의 수송에는 골기(Golgi) 및 분비소포가 수반된다.
단백질은 페리플라스믹 공간에 (예 ; 산 포스파타제, 인버타제)또는 배양 배지에 (예 :α인자, 킬러독소)분비된다.
모든 진핵 세포가 유전정보의 발현 및 발현된 단백질의 분배에 대한 메카니즘을 공유하고 있는 것처럼 보여지므로 진핵 유전자의 발현은 이.콜라이에서 보다 진핵숙주에서 더욱 효율적으로 진행된다. 진핵 유기체중에서 효모가 다루고 배양하는데 가장 쉽다. 다수의 이질 단백질이 효모에서 성공적으로 발현된다. 그러나 배지에 효율적으로 분비되는 -부속의 시그널 펩타이드를 제외하고는 -단백질의 기본적인 양상을 한정할 수 없다. 그러므로 단백질이 분비되는지에 대한 믿을만한 예상은 없다. 즉 형질전환된 효모(프리-글리코아밀라아제에 대한 유전정보 함유)에 의해 생성된 전체 글루코아밀라아제의 90%가 배지에 분비되고 [참고 ;PCT 특허원 제84/2921호], 고 역가의 표피성장 인자(EGF)가 EGF 유전자를 부속의 α인자 시그널펩타이드와 함께 함유하는 배양된 효모 배지에서 발견되며[참조 ; 유럽특허원 제116,201호], 단지 소량 또는 미량의 β-엔드로핀[α-인자 시그널 펩타이드; PCT 특허원제 84/4330호], 백혈구 인터페론 A[인버타제 시그널 펩타이드; 유럽 특허원 제127, 304호]인체의 γ-인터페론 인체의 혈청 알부민, 소의 인터페론 α1 및 α2 조직 플라스미노겐 활성화제, 레닌 및 인체의 인슐린-형 성장 인자[α-인자 시그널 펩타이드; 유럽특허원 제123,844호] 백혈구 인터페론 D 및 A, γ-인터페론 및 인체의 성장호르몬(MGH)(인터페론 및 MGH 시그널 펩타이드, 각각, 유럽 특허원 제88,632호)가 배디에서 탐지 가능하며, 형질전환된 효모에 의한 슈도모나스 카복시펩티다아제(Pseudomonas carboxypeptidase) G2(CPG2) [G2(CPG2) 시그널펩타이드 ; 유럽 특허원제121,352호] 및 조직 플라스노겐 활성화제 (PH05 시그널 펩타이드; 유럽 특허원 제143,081호)의 배지로의 분비는 관찰되지 않았다.
따라서, 부속의 시그널 펩타이드를 갖는 주어진 단백질이 효모에 의해 분비되는지에 대해서는 예측불가능하며 무엇보다도 분비 단백질에 따라 달라진다.
따라서, 부속의 시그널 펩타이드를 갖는, 히루딘과 같은, 선택된 단백질이 효모와 같은, 형질 전환된 숙주 유기체에 의해, 적어도 어느 정도까지 분비되는지는 불확실하다.
놀랍게도, 본 발명에 이르러 히루딘 활성을 갖는 단백질이, 데설페이토히루딘에 대한 구조 유전자와 함께 판독 프레임중 및 판독 프레임 상부에 존재하는 시그널 펩타이드를 코드화하는 DNA 서열을 포함하는 DNA를 함유하는 진핵 숙주 유기체에 의해 배지에 분비된다고 밝혀졌다.
본 발명의 목적은 히루딘 활성을 갖는 단백질을 진핵 숙주 유기체에서 생성하고 분비하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 데설페이토히루딘에 대한 구조 유전자와 함께 판독프레임중 및 판독프레임 상부에 존재하는 시그널 펩타이드를 코드화하는 DNA 서열을 포함하는 하이브리드 벡터, 및 상기 하이브리드 벡터로 형질전환된 진핵 숙주 유기체를 제공하는 것이다.
1.[데실페이토히루딘의 제조방법]
본 발명은 각각 진핵 발현 조절서열, 판독 프레임의 상부 및 판독 프레임중에 존재하는 시그널 펩타이드를 코드화하는 제1DNA 서열과 성숙 데설페이토히루딘을 코드화하는 제2DNA 서열로 이루어진 DNA 단편(이 DNA 단편은 상기 발현 조절서열의 전사 조절하에 있다), 및 진핵 전사 종결시그널을 함유하는 DNA서열을 포함하는 하나 이상의 DNA 삽입물을 갖는 하이브리드 벡터로 형질전환된 진핵 숙주 유기체를 적절한 영양 조건하에서 배양하고,배양 배지로부터 히루딘 활성을 갖는 단백질을 분리하고, 필요한 경우, 임으로 세포 내부로부터 세포연관된 히루딘 활성을 갖는 추가의 단백질을 분리하고, 필요한 경우, 생성된 히루딘 활성을 갖는 상이한 단백질로 전환시킴을 특징으로 하여, 히루딘 활성을 갖는 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
"성숙 데설페이토히루딘을 코드화하는 DNA서열"이란 용어는 성숙 데설페이토히루딘 변종 HV 1, HV 2, PA, 및 데스-(Val)2-데설페이토히루딘(이것이 HV 1 유전자의 발현의 단순한 인공품이 아닌한)에 대한 구조 유전자와 같이, 거머리 제놈에 존재한다고 알려지고/지거나 거머리 제놈으로부터 분리될 수 있는 히루딘 활성을 갖는 성숙 단백질을 코드화하는 모든 구조 유전자를 포함하는 것으로 의도된다. "성숙 데설페이토히루딘"이란 용어는 어떠한 프리- 및 프로-서열도 없는 데설페이토히루딘에 관한 것이다.
"히루딘 활성을 갖는 단백질"은 트롬빈-억제작용, 및 안티-히루딘 항체와 양성 반응을 가지며,페설페이토히루딘의 1차 구조 뿐만 아니라, 변형된, 예를 들어 황산염화된, 이의 유도체(예 : 상응하는 히루딘) 및 단축된 이의 유도체(예를 들면 C-말단에서 1 내지 7개의 아미노산이 결핍된 데설페이토히루딘)를 갖는 분비 숙주 세포로부터 수득된 단백질로 이해되어야 한다.
이러한 단백질은 특히 하기 일반식(I)의 단백질, 및 C-말단 아미노산 Gln, C-말단 디펩타이드-Leu-Gln, C-말단 트리펩타이드-Tyr(R)-Leu-Gln 또는 C-말단 테트라펩타이드-Glu-Tyr(R)-Leu-Gln이 결핍된 이의 유도체, 또는 하기 일반식(II)의 단백질(HV 2), 또는 하기 일반식(III)을 가지며, 거머리에 의해 생성된 [참조: J.Dodt, Thesis, University of Munich, FRG, 1984] 또 다른 히루딘 변종인 히루딘 PA이다.
X Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys
Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn Lys Cys
Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val Thr Gly
Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser His Asn Asp Gly Asp Phe
Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln
┃
R
( I )
Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys
Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys
Ile Leu Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gln Cys Val Thr Gly
Glu Gly Thr Pro Asn Pro Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe
Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln
┃
R
( II )
Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys
Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys
Ile Leu Gly Ser Gln Gly Lys Asp Asn Gln Cys Val Thr Gly
Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser His Asn Gln Gly Asp Phe
Glu Pro Ile Pro Glu Asp Ala Tyr Asp Gln
┃
R
( III )
상기식에서, X는 디펩타이드 잔기 Val-Val-(HV 1)또는 Thr(데스-(Val)2 -히루딘)을 나타내고, R은 Tyr의 페놀성 하이드록시 그룹 또는 구조식 -O-SO3H의 그룹을 나타낸다.
히루딘 활성을 갖는 바람직한 단백질은 X가 잔기 Val-Val-을 나타내고 R이 Tyr의 페놀성 하이드록시그룹을 나타내는 일반식(I)의 단백질, 및 C-말단에서 1내지 7개, 특히 1내지 4개의 아미노산이 단축된 이의 유도체이다.
적절한 진핵 숙주 유기체는 고등 유기체의 세포, 특히 포유동물의 세포, 특히 공개된 인체 또는 동물의 세포주, 예를 들면 VERO 또는 HeLa세포, 또는 중국산 햄스터 난소(CHO)세포주, 및 효모, 예를 들면 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)이다. 본 발명에 따른 바람직한 숙주 유기체는 효모, 특히 사카로마이세스 세레비지애 균주이다.
상기 DNA서열을 함유하는, 진핵 숙주 유기체, 특히 효모는 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 배양한다.
즉, 본 발명에 따른 형질전환된 효모균주는 탄소, 질소 및 무기산 염의 동화성 공급원을 함유하는 액체배지에서 배양한다.
여러 가지 탄소 공급원이 사용될 수 있다.
바람직한 탄소 공급원의 예로는 단독으로 또는 적절한 혼합물 형태로 사용될 수 있는, 동화성 탄수화물(예:글루코오즈, 말토오즈, 만니톨 또는 락토오즈),또는 아세테이트(예:나트륨 아세테이트)가 있다. 적절한 질소 공급원에는 단독으로 또는 적절한 혼합물 형태로 사용될 수 있는, 아미노산(예:카스아미노산), 펩타이드 및 단백질 및 이들의 분해 생성물(예:트립톤,펩톤 또는 육즙), 또한 효모 추출액, 맥아 추출액, 옥수수 침지액 뿐만 아니라 암모늄염(예:염화암모늄), 황산염 또는 질산염이 포함된다.사용될 수 있는 무기산 염에는 황산,염화,인산 및 탄산나트륨,칼륨,마그네슘 및 칼슘이 포함된다. 또한,영양 배지는 성장 촉진 물질을 함유할 수도 있다. 성장을 촉진시키는 물질에는 철,아연,망간 등과 같은 미량 원소,또는 개개의 아미노산이 포함된다.
다양하게,자발적 복제 플라스미드,예를 들면 효모 2μ 플라스미드 DMA(하기 참조)를 함유하는 플라스미드로 형질전환된 효모세포는 도입된 하이브리드 플라스미드를 상실하기 쉽다. 이러한 이유로, 이러한 효모세포는 선택조건,즉 성장을 위해 플라스미드-코드화된 유전자의 발현을 필요로 하는 조건하에서 성장 시켜야 한다.
통상적으로 사용되고 있으며 본 발명에 다른 하이브리드 벡터에 존재하는 대부분의 선택표지물은 아미노산 또는 퓨린 생합성 효소를 코드화하는 유전자이다.
이것은 상응하는 아미노산 또는 퓨린 염기가 부족한 합성의 최소 배지를 필수적으로 사용하게 한다.
그러나,적절한 살생제에 대한 내성을 부여하는 유전자[예를 들면, 사이클로헥스아미드, 아미노-글리코사이드 G418, 중금속 등에 대한 내성을 부여하는 유전자]도 사용될 수 있다. 항생물질 내성 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환된 효모세포를 상응하는 항생물질을 함유하는 복합 배지에서 성장시키면, 성장속도가 빨라지고 세포밀도가 높아진다.
염색체에 이입되는 DNA로 형질전환된 효모세포는 선택성장 조건을 필요로 하지 않는다. 이들 형질전환된 세포는 선택압 없이도 성장에 충분히 안정하다.
이들 세포를 복합 배지에서 성장시키는 것이 유리하다.
구성적(constitutive) 프로모터 (예: ADH I, GRAPDH)를 갖는 하이브리드 플라스미드를 함유하는 효모세포는 유도없이 상기 프로모터에 의해 조절된 데설페이토히루딘 유전자를 발현시킨다. 그러나, 데설페이토히루딘 유전자가 조절된 프로모터(예: PGK 또는 PHO5)의 조절하에 있는 경우,성장 배지의 조성은 mRNA전사를 최대수준으로 수득하도록 적합하게 해야 한다. 다시 말해서, PHO5프로모터를 사용하는 경우,성장배지는 이 프로모터억제 해제를 위해 저농도의 무기인산염을 함유해야만한다.
배양은 통상의 기술을 사용하여 수행한다. 온도,배지의 pH 및 발효시간과 같은 배양조건은 데설페이토히루딘이 최대 수준으로 생성되도록 하는 방식으로 선택된다. 선택된 효모균주는 바람직하게는 약 25。내지 35。C,바람직하게는 약 30。C의 온도, 및 4내지 8의 pH, 예를 들어 대략 pH 7에서, 약 4내지 20시간 동안, 바람직하게는 단백질의 최고수율에 도달할 때까지, 호기성 조건하에서 진탕 또는 교반하면서 액침 배양으로 성장시킨다.
놀랍게도, 사용된 숙주 유기체 및 시그널 펩타이드와는 무관하게, 생성된 히루딘 화합물의 대부분은 배양배지에 분비되고, 단지 최소부분만 세포에 연관되어 남아있는 것이 발견되었다.
정확한 비율(분비된 화합물/세포 연관 화합물)은 적용한 발효조건 및 회수 방법에 따라 달라진다. 일반적으로 이 비율은 대략 9 : 1 이거나 그 이상이다. 따라서,분비된 히루딘이 항상 매우 우세하다.
히루딘 화합물은 배양 배지로부터 통상적인 방법으로 분리할 수 있다.
예를 들어, 첫 번째 단계는 통상적으로 배양액으로부터 원심분리방법으로 세포를 분리하는 것으로 이루어진다.
생성된 상등액은 폴리에틸렌이민으로 처리하여 비-단백질성의 대부분을 제거하고,용액을 황산암모늄으로 포화시키거나 트리클로로아세트산에 의해 단백질을 침전시킴으로써 히루딘 화합물을 농축시킬 수 있다. 숙주 단백질은,존재하는 경우, 아세트산 (예를 들면 O.1％, pH 4-5)으로 산성화시켜 의해 침전시킬 수 있다.
아세트산 상등액을 n-부탄올로 추출시켜 히루딘 화합물을 보다 더 농축시킬 수 있다. 기타의 정제 단계에는, 예를 들어, 탈염, 크로마토그라피 과정(예: 이온 교환 크로마토그라피, 겔 여과 크로마토그라피, 분배 크로마토그라피, HPLC, 역상 HPLC 등)이 포함된다. 혼합물의 내용물의 분리는 투석, 전하에 따른 겔 전기영동 또는 담체-비함유 전기영동,분자크기에 따른 적절한 세파덱스 컬럼, 항체, 특히 모노클로날 항체, 또는 친화성 크로마토그라피에 적절한 담체에 커플링된 트롬빈을 사용한 친화성 크로마토그라피, 또는 다른 방법, 특히 문헌에 공지된 방법에 의해 수행한다.
세포에 연관된,즉 세포내 또는 페리플라스믹 공간에 축적된 추가의 히루딘 화합물을 분리하고자 하는 경우, 얼마의 보충의 정제단계가 필요하다.
즉 히루딘 단백질이 세포내에 축적되어 있는 경우, 목적하는 단백질을 회수하는 첫 번째 단계는 세포 내부로부터 단백질을 유리시키는 것으로 이루어진다.
대부분의 방법에서, 세포벽을 먼저 클루코시다제(하시 참조)를 사용하여 효소적으로 분해시켜 제거한다. 계속해서, 생성된 스페로플라스트(speroplast)를 계면활성제, 예를 들면 트리톤(Triton)으로 처리한다.
또한, 기계적 힘,예를 들면 전단응력 (예: X-프레스, 프렌치-프레스)또는 유리 비이드를 사용하여 흔드는 것도 세포를 파괴하는데 적절하다.
히루딘 화합물이 숙주, 특히 효모 세포에 의해 페리플라스믹 공간으로 분비되는 경우, 간소화된 프로토콜을 사용할 수 있다.
세포벽을 효소적으로 제거하거나 화학시약, 예를 들면 티올 시약 또는 EDTA(이들은 생성된 단백질이 방출되도록 세포벽을 손상시킨다)로 처리하여 세포를 용해시키지 않고서 단백질을 회수한다.
놀랍게도, "성숙 데설페이토히루딘을 코드화하는 DNA 서열"에 상응하는 데설페이토히루딘 화합물은 별 문제로 하고도,C-말단에서 1 내지 4개의 아미노산이 부족한, 기대한 화합물과는 다른, 일부의 다른 데설페이토히루딘 화합물을 배양액으로부터 분리할 수 있음이 밝혀졌다. 즉, 데설페이토히루딘 변종 HV1을 코드화하는 유전자를 함유하는 효모세포를 배양하면 이들 변종뿐만 아니라, 각각 C-말단 아미노산 Gln[데스-(Gln65)-데설페이토히루딘],C-말단 디펩타이드 잔기-Leu-Gln[데스-(Leu64,Glnⁿ )-데설페이토히루딘], C-말단 트리펩타이드 잔기-Tyr-Leu-Gln[데스-(Tyrⁿ n=63, Leuⁿn=64, Glnⁿn=65)-데설페이토히루딘] 및 C-말단 테트라펩타이드 잔기-Glu-Tyr-Leu-Gln[데스-(Gluⁿn=62, Tyrⁿn=63, Leuⁿn=64, Glnⁿn= 65)-데설페이토히루딘]이 결핍된 데설페이토히루딘 화합물이 저수율로 수득된다. 이들 화합물은 주요 발현 생성물 데설페이토히루딘을 (부분적으로) 단백질 분해시켜 형성시킬 수 있으며 사용된 효모숙주 및 적용된 발효조건에 관계없이 모든 배양액에서 확인된다.
데스-(Glnⁿn=65)-데설페이토히루딘, 데스-(Tyrⁿn=63, Leuⁿn=64, Glnⁿn=65)-데설페이토히루딘 및 데스-(Gluⁿn=62, Tyrⁿn=63, Leuⁿn=64, Glnⁿn=65)-데설페이토히루딘은 신규이며 본 발명의 목적이다.
항-히루딘 또는 항-데설페이토히루딘 항체(예를 들면, 하이브리도마 세포로부터 수득가능한 모노클로날항체)를 사용한 시험, 트롬빈 시험[참조: M.U. Bergmeyer(ed.), Methods in Enzymatic Analysis, Vol. II. 314-316 페이지, Verlag Chemic, Weinheim(FRG) 1983] 또는 혈액 응고 시험[참조: F.Markwardt et al.. Thromb. Haemost. 47, 226(1982)]을 사용하여 히루딘 활성을 탐지할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 수득가능한 히루딘 화합물을 자체에 공지된 방식으로 상이한 히루딘 화합물로 전환시킬 수 있다.
즉, 예를 들어, R이 Tyr의 페놀성 하이드록시 그룹을 나타내는 일반식(I)내지 (III)의 화합물을 황산염(예:황산이나트륨) 및 티로신 설포트란스퍼라제(거머리세포로부터 수득가능)와 반응시켜, R이 일반식-OSO3H의 그룹을 나타내는 일반식(I) 내지 (III)의 화합물로 전환시킬 수 있다.
또한, 수득된 데설페이토히루딘 화합물, 예를 들면 데설페이토히루딘 변종 HV 1을, 예를 들어 적절한 카복시펩티다아제 (예: 카복시펩티다아제 Y)를 작용시켜, C-말단에서 1 내지 7개의 아미노산이 부족한 이의 유도체로 전환시킬 수 있다.
본 발명에 따른 형질전환된 진핵 숙주 유기체는 하기 단계들로 이루어진 재조합 DNA 기술로 제조할 수 있다
: - 진핵 발현 조절 서열, 판독프레임의 상부 및 판독 프레임중에 존재하는 시그널 펩타이드를 코드화하는 제1 DNA 서열과 성숙 데설페이토히루딘을 코드화하는 제2 DNA 서열로 이루어진 DNA 단편(이 DNA 단편은 상기 발현 조절서열의 전사 조절하에 있다), 및 진핵 전사 종결 시그널을 함유하는 DNA서열을 포함하는 DNA 작제물을 제조하고, - 상기 DNA 작제물을 포함하는 하이브리드 벡터를 제조하여,- 생성된 하이브리드 벡터로 적절한 진핵 숙주 유기체를 형질전환시킨 다음, - 형질전환된 숙주 세포를 형질전환되지 않은 숙주 세포로부터 선별한다.
2.시그널 펩타이드 및 데설페이토히루딘의 코드화 영역을 포함하는 DNA 작제물
본 발명은 진핵 발현조절 서열, 판독 프레임의 상부 및 판독 프레임중에 존재하는 시그널 펩타이드를 코드화하는 제1 DNA서열과 성숙 데설페이토히루딘을 코드화하는 제2 DNA서열로 이루어진 DNA단편(이 DNA단편은 상기 발현 조절 서열의 전사조절하에 있다), 및 진핵 전사종결 시그널을 함유하는 DNA서열을 포함하는 DNA 작제물에 관한 것이다.
여러 가지의 발현 조절서열이 시그널 펩타이드 및 데설페이토히루딘을 코드화하는 DNA 서열의 발현을 조절하는데 사용될 수 있다. 특히 형질전환될 숙주의 고도로 발현되는 유전자에 대한 발현 조절서열이 사용된다.
포유동물 세포에서 사용하기 위해, 발현 조절서열은 바람직하게는 바이러스로부터 유도된다. 예를 들어, 포유동물 세포에서 사용하기 위해 적절한 발현 조절서열은 원숭이 바이러스 40(SV 40)의 초기 및 후기 프로모터, 백시니아 프로모터, HTLV 프로모터 또는 폴리오마 또는 아데노바이러스 2로부터 유도된 프로모터들이다.
본 발명에 따른 가장 바람직한 숙주 유기체인 효모에 대한 발현 조절서열은 효모, 사카로마이세스 세레비지애의 제놈 DNA로부터 유도된 것이다. 바람직하게는, 고도로 발현되는 효모 유전자에 대한 발현조절 서열이 데설페이토히루딘의 발현을 위해 사용된다.
즉, TRP1 유전자, ADH I 또는 ADH II 유전자, 산 포스파타제(PHO5) 유전자, 이소사이토크롬 C유전자의 프로모터 : 또는 에놀라아제, 글리세르-알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH), 3-포스포글리세레이트 키나제(PGK), 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라아제, 포스포푸룩토키나제, 글루코오즈-6-포스페이트 이소머라제,3-포스포글리세레이트 뮤타제,피루베이트키나제, 트리오즈포스페이트 이소머라제,포스포글루코오즈 이소머라제 및 글루코키나제 유전자의 프로모터 : 또는 a-또는 α-인자를 코드화하는 효모 교배 페로몬 유전자의 프로모터가 사용될 수 있다. 상부에는 하나의 효모 유전자의 활성화 서열(UAS), 하부에는 다른 효모 유전자의 작용성 TATA박스를 포함하는 프로모터 성분, 예를 들면 효모 PHO5 유전자의 UAS(s) 및 하부에 효모 GAPDH유전자의 작용성 TATA 박스를 포함하는 프로모터 성분을 함유하는 하이브리드 프로모터를 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 벡터는 전사 조절을 갖는 프로모터를 함유한다. 이러한 형태의 프로모터, 예를 들면 PHO5유전자의 프로모터 및 PHO5-GAPDH 하이브리드 프로모터는 성장 조건을 변화시킴으로써 작동시키거나 작동시키지 않을 수 있다. 예를 들어, PHO5 프로모터는, 단지 배지에서 무기 인산염의 농도를 증가시키거나 감소시킴에 의해, 의지대로, 억제하거나 억제해제할 수 있다. 본 발명에 따른 더욱 바람직한 프로모터는 GAPDH 유전자의 프로모터, 특히 GAPDH 유전자의 뉴클레오타이드-300 내지 -180, 특히 뉴클레오타이드 -263 또는 -199에서 시작하여 뉴클레오타이드 -5에서 끝나는 이의 작용성 단편이다.
시그널 펩타이드를 코드화하는 DNA서열(''시그널 서열")은 바람직하게는 통상 분비되는 폴리펩타이드를 코드화하는 진핵, 예를 들면 효모, 유전자로부터 유도된다. 적절한 시그널 서열은, 예를 들어, 거머리 제놈 DNA로부터 수득가능한 히루딘 시그널 서열, 효모 시그널 서열(예: 효모 인버타제, a-인자, α-인자, 페로몬 펩티다아제, "킬러 독소" 및 억제가능한 산 포스파타제(PHO5) 유전자의 시그널 및 프리프로서열 및 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori)로 부터의 글루코-아밀라아제 시그널 서열이다.
또한,사용된 프로모터에 자연적으로 연결된 유전자의 시그널 서열(존재하는 경우)의 부분을 히루딘 시그널 서열의 부분과 연결시켜 융합된 시그널 서열을 작제할 수도 있다.
이러한 조합은 시그널 서열과 성숙 데설페이토히루딘 아미노산 서열사이에 정확한 절단을 허용하므로 바람직하다. 추가의 서열,예를 들면 특이성 프로세싱 시그널을 함유하거나 함유하지 않을 수 있는 프로- 또는 스페이서- 서열도 전구체 분자의 정확한 프로세싱을 용이하게 하기 위해 작제물에 포함될 수 있다. 또한,융합된 단백질을 생체 내 또는 시험관 내에서 적절한 성숙을 허용하는 내부 프로세싱 시그널을 함유하도록 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 프로세싱 시그널은 골기 막에 존재하는 효모 엔도펩티다아제에 의해 인식되는 Lys-Arg 잔기를 함유한다. 본 발명에 따른 바람직한 시그널 서열은 하기 서열(A)을 갖는 시그널 펩타이드를 코드화하는 효모 PHO5 유전자의 시그널 서열 및 하기 서열(B)을 갖는 시그널 펩타이드를 코드화하는 효모 인버타제 유전자의 시그널 서열이다.
Met Phe Lys Ser Val Val Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ala
Asn Ala,
(A)
Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala
Ala Lys Ile Ser Ala
(B)
성숙 데설페이토히루딘을 코드화하는 DNA 서열은 특히 상기 정의한 데설페이토히루딘에 대한 구조 유전자로부터 선택된다. 바람직한 DNA 서열은 데설페이토히루딘 변종 1 (HV 1)을 코드화하며 하기 서열을 갖는다 :
GTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGT
CAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTGGACACGGACACGCTTCCA
TCTAACGTTTGCGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAG
AGATTGCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGACTGCCACTTTTTTTGGTC
TGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTCACAACGACGGTGACTTCGAA
ACGCAATGGCCACTTCCATGGGGCTTTGGCGTCAGAGTGTTGCTGCCACTGAAGCTT
GAAATCCCGGAAGAATACCTGCAG
CTTTAGGGCCTTCTTATGGACGTC
진핵 전사 종결 시그널을 함유하는 DNA서열은 바람직하게는 전사 종결 및 폴리아데닐화에 대한 적절한 시그널을 함유하는 진핵 유전자의 3' 플랭킹 서열이다.
적절한 3'플랭킹 서열은 예를 들면 사용된 발현 조절서열에 자연적으로 연결된 유전자의 3'플랭킹서열이다. 숙주유기체로 효모가 사용되는 경우, 바람직한 플랭킹 서열은 효모 PH05 유전자의 플랭킹 서열이다.
본 발명에 따른 DNA작제물은 양 말단에, 클로닝벡터에서 작제물의 삽입 및 클로닝을 허용하는 합성 데옥시-뉴클레오타이드 링커를 가짐이 바람직하다.
진행 발현 조절서열, 시그널 펩타이드를 코드화하는 DNA 서열, 성숙 데설페이토히루딘을 코드화하는 DNA서열 및 진핵 전사종결 시그널은 서로서로 작동적으로 연결된다. 다시 말해서, 이들은 이들의 정상적인 작용이 유지되는 방식으로 나란히 놓인다. 즉, 배열은 발현 조절 서열이 시그널 펩타이드-데설페이토히루딘 유전자 복합체를 적절히 발현시키고, 전사 종결 시그널이 적절히 전사 종결 및 폴리아데닐화시키고, 시그널 서열이 데설페이토-히루딘이 분비되도록 하는 방식으로 데설페이토히루딘 유전자에 연결하도록 되어 있다. 따라서,발현 조절 서열 및 시그널 서열이 상이한 유전자로부터 유도되는 경우, 발현 조절 서열은 바람직하게는 주요 mRNA 출발부위와 발현 조절서열에 자연적으로 연결된 유전자의 ATG 사이에 존재하는 시그널 서열에 연결된다. 시그널 서열은 해독 개시를 위한 자체 ATG를 가져야 한다. 이들 서열은 바람직하게는 엔도뉴클레아제의 인지 서열을 함유할 수 있는 합성 올리고 데옥시뉴클레오타이드 링커에 의해 연결시킨다.
한편, 시그널 서열의 마지막 코돈은 데설페이토히루딘에 대한 유전자와 첫 번째 코돈에 직접 연결시킨다.
본 발명에 따른 DNA 작제물은 본 분야에 공지된 방식으로, 예를 들어, 진핵 발현 조절 서열, 판독 프레임의 상부 및 판독 프레임중에 존재하는 시그널 펩타이드를 코드화하는 제1 DNA 서열과 데설페이토히루딘을 코드화하는 제2 DNA 서열로 이루어진 DNA단편, 및 진핵 전사 종결 시그널을 함유하는 DNA서열을, DNA단편의 적절한 발현 및 생성된 데설페이토히루딘의 분비가 진핵 숙주 유기체에서 일어나도록 하는 방식으로 연결시켜 제조할 수 있다.
여러 가지 DNA 서열을 연결시켜 본 발명에 다른 DNA 작제물을 수득하는 과정은 이들 DNA 서열의 정상적인 작용을 유지시키도록 세심하게 주의하면서 정확하게 연결시키기 위해 평활 말단 연결법에 의해 또는 적절한 통상적인 제한 부위 또는 합성 링커 분자를 통해 수행할 수 있다. 즉, 시그널 서열과, 데설페이토히루딘 유전자를 평활 말단 연결법에 의해 융합시킬 수 있다. 시그널 서열과 데설페이토히루딘 유전자를 정확하게 연결시키는 또 다른 접근 방법은, 가능하다면, 3'말단근처의 시그널 서열과, 5'말단 근처의 데설페이토히루딘을, 각각 미리 예상한 수의 염기쌍이 부족하도록, 제한시키는 것이다.
또한,합성 올리고데옥시뉴클레오타이드 링커를, 제한된 시그널 서열과 제한된 데설페이토히루딘 유전자를 연결 올리고 데옥시뉴클레오타이드를 통해 연결시키는 경우 손실된 염기쌍이 복구되고 데설페이토히루딘 유전자가 시그널 서열에 대해 적절한 판독 프레임에 존재하도록 하는 방식으로 작제할 수 있다.
데석페이토히루딘을 코드화하는 DNA서열은 거머리 제놈 DNA로부터 분리시킬 수 있거나 상보성 이본쇄 데설페이토히루딘 DNA(,데설페이토히루딘 ds cDNA)는 데설페이토히루딘 mRNA로부터 생성하거나, 데설페이토히루딘의 아미노산 서열을 코드화하는 유전자는 화학적 및 효소적 방법으로 생성시킨다.
제놈 데설페이토히루딘 DNA 및 데설페이토히루딘 ds cDNA는, 예를 들어, 자체에 공지된 방법에 따라 수득한다.
예를 들어, 제놈 데설페이토히루딘 DNA는 데설페이토히루딘 유전자를 함유하는 거머리 유전자 은행으로부터, 거머리 DNA단편을 미생물에 클로닝시키고 데설페이토히루딘 DNA를 함유하는 클론을, 예를 들어, 적어도 15개, 바람직하게는 15내지 30개의 데옥시뉴클레오타이드를 함유하는, 방사능 표지된 데설페이토히루딘 DNA-특이적 올리고데록시뉴클레오타이드를 사용하여 콜로니 하이브리드화에 의해 확인함으로써 수득한다. 생성된 DNA 단편은 일반적으로 데설페이토히루딘 유전자외에, 적절한 엑소-또는 엔도- 뉴쿨레아제로 처리하여 제거될 수 있는 다른 원치않은 DNA 구성물도 함유한다.
이본쇄 데설페이토히루딘 cDNA는, 예를 들어,적절한 거머리 세포(히루딘 형성을 유도하는데 바람직한)로부터 mRNA를 분리시키고, 생성된 mRNA 혼합물에서 자체에 공지된 방식으로 데설페이토히루딘 mRNA를 농축시키고, 이 mRNA를 일본쇄 cDNA를 제조하기 위한 주형으로 사용하여, 이로부터, RNA-의존 DNA폴리머라제 보조하에 ds cDNA를 합성한 다음, ds cDNA를 적절한 벡터에 클로닝시켜 제조할 수 있다. 데설페이토히루딘 cDNA를 함유하는 클론은 예를 들어 상기 기술한 방식으로, 방사능 표지된 데설페이토히루딘 DNA-특이적 올리고 데옥시뉴클레오타이드를 사용하여 콜로니 하이브리드화에 의해 확인한다.
데설페이토히루딘 유전자 화학적 합성법에 의해 제조할 수도 있다. 이 방법은 상기 유전자의 코드화 본쇄 및 상보성 본쇄의 단편을 화학적으로 합성하여 생성된 단편을 데설페이토히루딘에 대한 구조 유전자로 효소적으로 전환시킴을 특징으로 한다.
DNA의 화학적 합성법은 본 분야에 공지되어 있으며 통상의 기술로 사용할 수 있다.
적절한 기술은 하기 문헌에 기재되어 있다[참조: S.A. Narang, Tetrahedron 39, 3(1983)]. 특히, 유럽 특허원 제146,785호에 기술되어 있는 방법을 사용할 수 있으며 본 명세서에서는 참조로 인용한다.
유사한 방식으로, 시그널 서열을 화학적 합성법으로 제조할 수 있거나 적절한 진핵 유기체의 염색체 DNA로부터 분리한다.
3. 시그널 펩타이드의 코드화 영역 및 데설페이토히루딘의 코드화영역을 갖는 DNA 작제물을 함유하는 하이브리드 벡터
본발명에 따라 진핵 발현 조절 서열, 판독 프레임의 상부 및 판독 프레임중에 존재한 시그널 펩타이드를 코드화하는 제1DNA서열과 성숙 데설페이토히루딘을 코드화하는 제2 DNA서열로 이루어진 DNA단편(이 DNA 단편은 상기 발현 조절 서열의 전사 조절하에 있다), 및 진핵 전사 종결 시그널을 함유하는 DNA 서열을 포함하는 하나이상의 DNA삽입물을 갖는 하이브리드 벡터가 제공된다.
본 발명에 따른 하이므리드 벡터는 하이브리드 플라스미드 및 선형 DNA 벡터로 이루어진 그룹중에서 선택되며 형질 전환에 사용될 숙주 유기체에 따라 선택된다.
본 발명은 특히 진핵 발현 조절 서열 판독 프레임의 제1DNA서열과 성숙 테서페이토히루딘을 코드화하는 상부 및 판독 프레임중에 존재하는 시그널 펩타이드를 코드화하는 제2DNA서열로 이루어진 DNA단편(이 DNA 단편은 상기 발현 조절 서열의 전사 조절하에 있다). 및 진핵 전사 종결 시그널을 함유하는 DNA서열을 포함하는 하나 이상의 DNA삽입물을 갖는 선형DNA백터 (여기에서 상기 발현 조절 서열, 및 전사 종결 시그널을 함유하는 상기서열은 동일한 진핵 유전자로 유도된다)에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 효모 PH05프로모터, 상기DNA단편 및 PH05의 3' 플랭킹 영역을 포함하는 선형 DNA벡터에 관한 것이다.
동질3' 및 5' 플랭킹 서열에 의해 시그널 펩타이드 및 데설페이토히루딘의 코드화 영역을 포함하는 전체 선형 DNA벡터를 안정하게 각각의 숙주 염색체, 즉 효모 PH05 프로모터 및 효모 PH05 유전자의 3' 플랭킹서열의 경우 효모 염색체Ⅱ내에 PH05좌에서 이입시킨다.
본 발명은 또한 특히, 발현 조절 서열화에, 상기 DNA 단편 및 전사 종결 시그널을 함유하는 서열이 프로모터의 작용에 , 즉 데설페이토 히루딘 유전자의 발현에는 불필요하거나 덜 중요하지만 상기 하이브리드 플라스미드로 형질전환된 세포의 증식에 중요하게 작용하는 추가의 DNA서열을 함유하는 하이브리드 플라스미드에 관한 것이다. 추가의 DNA서열을 언핵 및/또는 진핵 세포로부토 유도될 수 있으며 염색체 및/또는 염색체의 DNA서열을 포함할 수 있다. 예를 들어 추가의 DNA 서열은 플라스미드DNA(예를 들면 세균 또는 진핵 플라스미드 DNA)로부터 생성될 수(또는 이루어질수) 있다. 바람직한 하이브이드 플라스미드는 세균 플라스미드, 특히 이,콜라이 플라스미드 pBR 322 또는 관련 플라스미드 박테리오파지 λ 효모 2μ플라스미드 및/또는 효모염색체 DNA로부터 유도된 추가의 DNA 서열을 함유한다.
본 발명에 따른 바람직한 하이브리드 플라스미드에서 추가의 DNA 서열은 효모에 대한 효모 복제원 및 선택성 유전자 표지물을 함유한다. 효모 복제원, 예를 들어 자발적 복제 단편(ars)을 함유하는 하이브리드 플라스미드는 형질전환후에 효모세포 내에서 염색체외적으로 유지되며 유사분열에 따라 자발적으로 복제한다 바이러스DNA 및/또는 염색체 DNA(예를 들면 세균, 효모 또는 고등 잰핵 염색체 DNA).
효모2μ 플라스미드 DNA에 동질인 서열을 함유하는 하이브리드 플라스미드도 사용될 수 있다. 이들 하이브리드 플라스미드는 재조합에 의해 세포내에 이미 존재하는 2μ 플라스미드에 이입될 수있거나 자발적으로 복제된다.
효모에 대한 선택성 유전자 표지물에 관해서는 표지물의 표현형 발현에 기인한 형질전환체의 선택을 용이하게 하는 어떠한 표지물 유전자도 사용될 수 있다.
효모에 대해 적절한 표지물은 특히 항생물질 내성 D전자 또는 영양요구성 효모 돌연변이체의 경우, 숙주 장애를 보충시키는 유전자를 발현시키느 ㄴ표지물이다. 상응하는 유전자는, 예를 들어, 항생물질 사이클로헥스이미드에 내성을 부여하거나 영양요구성 효모 돌연변이체에서 자가영양을 위해 예를 들면 URA-1, URA3, ARG 4, LEU 2, HIS4, HIS3, TRP5 또는 TRP1 유전자를 제공한다.
유리하게는 본 발명에 따른 하이브리드 플라스미드에 존재하는 추가의 DNA서열은 세균 숙주, 특히 이.콜라이에 대한 복제원 및 선책성 유전자 표지물도 포함한다. 효모 하이브리드 플라스미드가 이.콜라이 복제원 및 이.콜라이 표지물 존재와 연관 되어 있는 경우 유용하다. 첫째로 다양의 하이브리드 플라스미드 DNA를 이.콜라이에서 성장 및 증폭시킴으로써 수득할 수있고, 둘째로 하이브리드 플라스미드의 작제가 이.콜라이에서 이.콜라이를 기본으로 하는 클로닝 기술의 전체 레퍼토리를 사용하여 유리하게 수행된다.
이.콜라이 플라스미드 ,예를 들면, pBR322등은 이.콜라이 복제원 및 항생물질 예를 들면 테트라사이클린 및 앰피실린에 내성을 부여하는 이.콜라이 유전자 표지물 둘다를 함유하며, 효모 하이브리드 벡터의 부분으로서 유리하게 사용된다.
효모 및 세균 숙주(상기 참조) 대한 복제원 및 유전자 표지물을 함유하는 추가의 DNA 서열은 하기에서는 발현 조절 서열 및 데설페이토히루딘 우전자를 함유하는 상기 DNA작제물과 함께 본 발명에 따른 하이브리드 플라스미드를 형성하는 "벡터 DNA"로서 언급된다.
본 발명에 따른 하이브리드 벡터는 각각 특히 발현 조작 서열, 시그널 펩타이드를 코드화하는 DNA 서열 및 성숙 데설페이토히루딘을 코드화하는 DNA서열을 포함하는 하나 이상의 DNA삽입물을 함유할 수 있다. 하이브리드 벡터가 다중 DNA 삽입물, 바람직하게는 2내지 4개의 DNA 삽입믈을 함유하는 경우 이들을 직렬로 또는 하이브리드 벡터의 상이한 위치에 존재할 수 있다. 바람직한 하이브리드 벡터는 하나의 DNA삽입물 또는 DNA삽입물들을 직렬로 함유한다. DNA삽입물은 특히 헤드에서 테일로 배열된다.
본 발명에 따른 하이브리드 플라스미드는 본 분야에 공지된 방법으로 제조한다.하이브리드 벡터를 제조하는 방법은 진핵 발현 조절 서열, 판독 프레임의 상부 및 판독 프레임중에 존재하는 시그널 펩타이드를 코드화하는 제1 DNA서열과 성숙 데설페이토히루딘을 코드화하는 제2 DNA서열로 이루어진 DNA단편(이 DNA단편 상기 발현 조절 서열의 전사 조절하에 있다), 및 진핵 전사 종결 시그널을 함유하는 DNA서열을 포함하는 하나 이상의 DNA작제물을 그 자체로, 또는 상기 DNA작제물의 성분을 미리 예정한 순서대로 계속해서, 벡터 DNA에 도입하는 단계로 이루어진다.
본 발명에 따른 하이브리드 플라스미드의 작제는 통상의 연결 기법을 적용하여 수행한다. 플라스미드의 성분들은 통상의 제한 부위르 통해 및/또는 합성 링커 분자에 의해 및/또는 평활 말단 연결법에 의해 연결시킨다.
본 발명에 따른 선형 DNA 벡터는 실질적으로 단락2에 기술한 DNA 작제물을 상응하며 유사한 방식으로 제조된다.
[4.형질전환된 진핵 숙주 유기체]
본 발명의 또 다른 관점은 각각 진핵 발현 조절 서열, 판독 프레임의 상부 및 판독 프레임중에 존재하는 시그널 펩타이드를 코드화 하는 제1DNA 서열과 성숙 데설페이토히루딘을 코드화하는 제2DNA 서열로 이루어진 DNA단편( 이 DNA 단편은 상기 발현 조절 서열의 전사 조절하에 있다), 및 진핵 전사 종결 시그널을 함유하는 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 DNA삽입물을 갖는 하이브리드 벡터로 형질전환된 진핵 숙주 유기체 및 이외 돌연변이체도 포함한다.
적절한 진핵 유기체는 특히 상기 기술하 진핵 숙주 유기체 특히 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 캔디다((Candida), 피치아(Pichia), 야로위아(Yarrowia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 시초사카로마이세스(Shizosaccharomyces), 토룰롭시스(Torulopsis)속 및 관련된속[참조:J. Lodder, The Yeasts, Amsterdam 1971]의 종을 포함한 효모, 특히 사카로마이세스 세리비지애(Saccharomyces cerevisiae)균주이다.
형질전환된 진핵 숙주 유기체는 각각 진핵 발현 조절 서열, 판독 프레임의 상부 및 판독 프레임중에 존재하는 시그널 펩타이드를 코드화하는 제1 DNA 서열과 성숙 데설페이토히루딘을 하는 제2 DNA 서열로 이루어진 DNA 단편(이 단편은 상기 발현 조절 서열의 전사 조절하에 있다), 및 진핵 전사 종결 시그널을 함유하는 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 DNA 삽입물을 갖는 하이브리드 플라스미드로 형질전환된 진핵 숙주 유기체, 및 숙주 염색체에안정하게 이입된 상기 DNA삽입물(들)을 갖는 진핵 숙주 유기체중에서 선택된다.
상기 형질 전환된 진핵숙주 세포를 제조하는 방법은 각각 진핵 발현 조절 서열, 판독 프레임의 상부 및 판독 프레임중에 존재하는 시그널 펩타이드를 코드화하는 제1DNA 서열과 성숙 데설페이토히루딘을 코드화하는 제2 DNA서열로 이루어진 DNA단편(이 DNA단편은 상기 발현 조절 서열의 전사 조절하에 있다), 및 진핵 전사 종결 시그널 함유하는 DNA서열을 포함하는 하나 이상의 DNA삽입물을 갖는 하이브리드 벡터로 진핵 숙주를 형질전환시킴을 특징으로 한다.
진핵 숙주 세포의 형질전환은 본 분야에 공지된 방법으로 수행한다. 예를 들어 하이브리드 벡터를 사용하여 효모를 형질전환시키는 방법은 하기 문헌에 기술된 방법에 따라 수행할 수 있다[참조 : Hinnen et al, Proc. Natl. Sci. USA75 1929(1978)]. 이 방법은 다음과 같이 3단계로 나누어질 수 있다;
(1)여러가지 글루코시다제 제품, 예를 들면 달팽이 소화관액(예 ;Glusulase
또는 Helicase
) 또는 미생물로부터 수득된 효소 혼합물(예 : Zymolyase )을 사용하여 삼투압적으로 안정한 용액(예 : 1M솔비톨)에서 효모 세포벽 또는 이의 부분을 제거.
(2)"세포벽이 제거된 (naked)"효모 세포(스페로플라스트)를 PEG(폴리에틸렌글리콜) 및 Ca2+이온 존재 하에 DNA벡터로 처리.
(3)세포벽의 재생 및 아가의 교체층에서 형질 전환된 세포의 선별,세포벽의 재생은 편리하게는 스페로플라스트를 아가에 삽입함에 의해 수행한다. 예를 들어 용융된 아가(약50℃)를 스페로플라스트부와 혼합한다. 용액을 효모 성장온도(약30℃)로 냉각시킴에 따라 고체층이 수득된다. 이 아가층은 스페로풀라스트부터 필요한 거대분자가 재빠르게 확산하여 손실되는 것을 방지하므로 세포벽의 재생을 용이하게 해준다. 그러나 세포벽의 재생은 형성된 아가층은 표면상에 스페로플라스트를 도말함에 위해 수득될 수 있다(비록 저효율 이지만).
바람직하게는, 재생 아가는 형질전환된 세포의 재생 및 선별을 동시에 허용하는 방식으로 제조한다. 아미노산 생합성 경로의 효소를 코드화하는 효모 유전자가 일반적으로 선택표지물(상기 참조)로서 사용되므로, 생성을 바람직하게는 효모 최소 배지 아가에서 수행한다. 재생에 매우 고 효율이 필요한 경우 다음의 2단계가 유리하다; (1)풍부한 복합체 배지에서 세포벽 재생,및(2) 세포층을 선택성 아가 플레이트상에 복제 도말하여 형질 전환된 세포의 선별.
상기 선형 DNA벡터가 진핵 숙주세포의 형질전화에 사용되는 경우 형질전환은 바람직하게는 효모에 대한 선택 표지물을 함유하는 제2벡터 존재하에 수행된다.
이 공형질전환(contransformation)은 직접 선별 될 수 없는 DNA를 갖는 숙주세포를 농축시킨다. 적절한 세포가 모든 형태의 DNA를 취하므로, 선택성 벡터(예를 들면 상기 선형 DNA벡터)로 형질전환된 세포의 높은 퍼센테지는 또한 추가의 DNA도 함유할 것이다.
본 발명에 다른 하이브리드 플라스미드를 함유하거나 숙주 염색체에 안정하게 이입된 데설페이토히루딘 유전자로 이루러진 선형 DNA벡터를 갖는 형질전환된 진핵 숙주 유기체, 특히 형질전환된 효모 균주는 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 돌연변이 및 선별에 위해 데설페이토히루딘의 생성을 향상 시킬 수 있다.
돌연변이는 예를 들어 자외선 조사 또는 적절한 화학 시약에 의해 수행할 수 있다.
프로테아제 결핍 돌연변이체 특히 효모 돌연변이체를 생성하여 세포내에서 생성된 데설페이토히루딘의 단백질 분해적 분해를 피하는 것이 특히 바람직하다.
적절한 돌연변이체는 통상의 방법에 의해 선별되고 분리할 수 있다,
본 발명은 특히 데설페이토히루딘 유전자를 포함하는 DNA 작제물, 하이브리드 벡터, 형질 전환된 진핵 숙주 유기체 및 이들의 제조방법 뿐만아니라, 실시예에 기술된 바와 같이 히루딘 활성을 갖는 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
하기 약자는 도면에서 다음과 같이 사용한다.;
P프로모터, SS 시그널, T 터이네이터, L 링커.
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공되며 이로써 제한되지는 않는다.
[실험부]
실시예에서 사용되는 약자의 의미는 다음과 같다.
TNE : 10mM NaCl, 50mM 트리스 ,HCL pH 7.5 및 5mm EDTA를 함유하는 용액
SDS : 나트륨 도데실 셀페이트
EDTA : 에틸렌디아민테트라아세트산
DTT : 1.4-디티오트레이톨 (1,4-디머캅토-2.4-부탄디올)
BSA : 소외 혈청안부민
EtBr : 에티듐 브로마아드
트리스 : 트리스-(하이드록시메틸) 아미노메탄
트리스*HCL : 트리스 모노하이드로클로라이드
[실시예 1]
보호된 뉴클레오사이드 - 폴리스티렌 수직의 제조
750㎎의 무수 숙식산 및 910㎎의 4-디메틸아미노 피리딘을 20ml의 무수 피리딘중 2.57g(5mmol)의 5'-(4-메톡시트리틸)티미딘(MMT-D-T-OH)에 가하고 전체를 실온에서 16시간동안 방치한다. 피리딘용액을 농축시킨 후 이것을 200ml 의 에틸 아세데이트에 용해시키고 진탕시키면서 매회 10ml의 포화 염화 나트륨용액을 가하여 200ml의 0.1M 인산염 완충액으로 2회 추출하고 포화 염화나트륨 용액으로 다시 세척하여 건조 시키고 농축한 다음 핵산을 적가한다.
침전된 생성물울 분리하여 에테르로 2회 연마한 다음 300ml의 에틸 아세테이트에 용해시키고 0℃에서 진탕시키면서 180ml의 0.1M 이황산 칼륨(pH2.5)으로 추출한다,
물로 2회 세척한 후 에틸 아세테이트 용액을 황산 나트륨으로 건조시키고 여과하여 0.5ml의 피리딘을 가하여 전체를 농축시킨 다음 핵산을 적가하여 희석 시킨다.침전된 숙신산 유도체를 여과로 회수한다.
이 화합물1.0g을 190㎎의 N-하이드록시숙신이미드와 함께 4ml의 에틸 아세테이트 및 2ml의 디메틸포름아미드에 용해시키고 0℃에서 370㎎의 N,N'-디사이클로헥실 카보디이미드를 가한다. 냉장고에 밤새 정치한 후 침전된N.N'-디사이클로헥실우레아를 여과하고 여액을 에틸아세테이트로 희석시켜, 냉0.1M 중탄산나트륨 및 물로 추출하고 건조시켜 진공중에서 증발시켜 농축 건조시킨다.
잔류물을 실리카겔상에서 용출제로 에틸 아세테이트를 사용하여 크로마토그라피한다.
TCL:디클로로메탄/메탄올(9:1)중에서 Rf 0.45.
이 N-숙신이미도일숙신산 에스테르 100㎎을 2ml의 디클로로메탄 및 4ml의 디메틸포름아미드중에서 1g의 아미노메틸폴리스티렌(아민 함량 110μmol//g)과 함께 20시간 동안 교반한다..
중합체 수지를 여과하여, 디메틸포름아미드, 메탄올 디클로로메탄 및 메탄올로 세척하여 추출한다.
건조시킨후 반응되지 않은 아미노 그룹은 수지를 6m;l의 피리딘중에서 1ml의 무수 아세트산 및 100㎎의 4-디메틸아미노피리딘과 함께 30분동안 교반 시켜 아세틸화시킨다. 중합체 수지를 디클로로메탄, 디메틸포름아미드, 메탄올 및 디클로로메탄으로 세척하여 추출하여 일정한 중량이 될 때가지 건조시킨다. 분광적 메록시트리틸 (MMT)-측정으로 57μmol/g이 수득된다.
[실시예 2]
다음의 보호된 뉴클레오사이드/폴리스티렌 수지는 실시예1과 유사한 방식으로 제조된다 ; 5-(4-메톡시트리틸)-N-이소부티릴-데옥시구아노신으로부터
32μmol/g.
[실시예3]
트리뉴클레오타이드의 합성
[ a) 디뉴클레오타이드의 합성]
7.7g(15mmol)의 5'-(4-메톡시트리틸)티미딘(MMT-O-T-OH)을 무수 피리딘을 사용하여 증발시킴에 의해 2회 농축시킨다. 잔류물을 20ml의 무수 테트라하이드로푸란에 용해시키고 테트라하이드로푸란중의 2-클로로페닐-디-(1-벤조트리아졸릴)-포스페이트의 0.2M 용액80ml에 교반하고 습기를 제거하면서 적가하고 반응혼합물을 실온에서 1시간동안 교반한다.
생성된 2-클로로페닐-1-벤조트리아졸릴-5'-(4-메톡시트리틸)티미딘-3'-포스페이트의 용액을 3분획으로 나눈다.
α)트리에틸암모늄-2-클로로페닐-5'-(4-메톡시트리틸)티미딘-3'-포스페이트로 가수분해 ; 100ml의 0.5M 트리에틸암모늄 중탄산염을 2-클로로페닐-1-벤조트리아졸릴-5'-(4-메톡시트리틸)티미딘-3'-포스페이트의 상기용액의 세 번째 분획에 냉각시키면서 가한다. 15분후에 디클로로메탄으로 추출한다. 디클로로메탄 용액을 물로 세척하여 농축시키고 여기에 석유 에테르를 적가한다. 생성된 침전물을 흡인 여과하고 에티르/석유에테르 (1:1)로 세척하여 추출하고 니공중에서 건조시킨다. TLC : 디클로로메탄/메탄올.물(75:22:4)중에서 Rf 0.35.
β)2- 시아노에틸-2-클로로페닐-5'-(4-메톡시트리틸)티미딘-3'-포스페이트로의 에스테르화 및 4-메톡시트리틸 보호그룹의 제거; 1.3ml의 2-시아노에탄올 및 2ml의 피리딤을 2-클로로페닐-1-벤조트리아졸릴-5'-(4-메톡시트리틸)티미딘 -3'-포스페이트이 용액의 세 번째 분획에 가한다. 혼합물을 실온에서 밤새 방치한다. 용매를 진공중에서 증류하고 잔류물을 에틸 아세테이트에 용해시키고 0.1M 인산염 완충액(pH 7) 및 물로 진탕시킴에 의해 반복추출한다. 유기상을 건조시키고 농축시켜 헥산에 적가한다.,
침전물을 여과하여, 50ml의 디클로로메탄/메탄올(7:3)에 용해시키고 0℃에서 75ml의 디클로로메탄/메탄올(7:3)중의 3.8g의 p-톨루엔-설폰산 모노하이드레이트의 용액을 가한다. 2시간후 반응 용액을 디클로로메탄으로 희석시키고 냉 중탄산 나트륨 용액으로 진탕시킴에 의해 추출한다. 유가상을 농축시키고 헥산을 가한다.
침전된2-시아노에틸-2-클로로페닐-티미딘-3'-포스페이트를 실리카겔상에서 용출제로 디클로로메탄/메탄올(96:4)을 사용하여 크로마토그라피 한다.
TCL : 디클로로메탄/메탄올(9:1)중에서 Rf 0.45.
γ)5'-4-(메톡시트리틸)-3'-시아노에틸-비스-티미딘 디뉴클레오타이드로 축합; 2.2g의 2-시아노에틸-2-클로로페닐-티미딘-3'포스페이트를 무수 피리딘으로 즈아시킴에 의해 2회 존ㅇ축시켜 탈수시키고, 생성물을 20ml의 무수 테트라하이드로푸란에 용해시켜 2-클로로페닐-1-벤조트리아졸릴-5'-(4-메톡시트리틸)티미딘-3'-포스페이트의 용액의 남아있는 세 번째 분획에 가한다.
실온에서 18시간후 반응용액에 10ml의 물 및 200ml의 에틸 아세테이트를 얼음으로 냉각시키면서 가한다.
유가성을 중탄산나트륨 및 물로 반복세척하여 황산나트륨상에서 건조시키고 소 용적으로 농축시킨다.인산염잔기에서 및 5'- 및 3' 말단에서 보호된 디뉴클레오타이드는 에테르/헥산(1:1)에 적가함에 의해 침전된다.
TCL : 디클로로메탄/메탄올(9:1)중에서 Rf 0.48
[b) 트리뉴클레오타이드의 합성]
상기-기술한 충분히 보호된 디뉴클레오타이드 1.17g(1mmol)을 30ml의 디클로로메탄/메탄올(7:3)에 용해시키고 얼음으로 냉각시키면서 20ml의 디클로로메탄/메탄올(7:3)중의 1.9g의 p-톨루엔설폰산 모노하이드레이트의 용액을 가한다.
2시간후 빙냉 중탄산 나트륨 용액을 가하고 디클로로메탄으로 추출한다.
유기상을 건조시키고, 농축시켜 헥산에 적가한다.
침전된 유리 5'-하이드록시 그룹을 갖조 디-뉴클레오타이드를 실리카 rps상에서 용출제로 디클로로메탄중의 2-8% 메탄올 구배를 사용하여 크로마토그라피한다.
TLC : 디클로로메탄/메탄올(9:1)중에서 Rf 0.33.
이 5'-하이드록시-디뉴클레오타이드 850㎎ 및 1.06g의 트리에틸암모늄-2-클로로페닐-5'-(4-메톡시트리틸)티미딘-3'-포스페이트[참조 : 단 a)α)]를 피리딘으로 증발시킴에 의해 2회 농축시킨 다음, 10ml의 무수피리딘에 용해시키고 560㎎의 1-메시틸렌설포닐-3-니트로-1,2,4-트리아졸(MSNT)을 가한다.
2시간후 2ml의 빙냉 물을 가하고 추가의 시간후 디클로로메탄으로 추출한다.
유기상을 포화 중탄산 나트륨 용액 및 물로 세척하고 건조시켜, 농축시키고 에테르를 가한다. 침전된 트리뉴클레러타이드를 실리타 겔상에서 크로마토그라피에 의해 정제한다. 디클로로메탄/메탄올(9:1)중에서 Rf 0.45
[실시예4]
실시예3과 유사한 방식으로 하기 구조식 B1B2B3를 갖는 보호된 트리클레오타이드를 제조한다.
뉴클레오타이드 B1, B2, B3를 위해 하기약자가 사용된다.
A=N-벤조일=-데옥시아데노신
C=N-벤조일-데옥시티딘
G=N-이소부티릴-데옥시구아노신
T=티미딘
a)디클로로메탄/메탄올(9:1)중의 실리카겔 상에서 박충 크로마토그람.
[실시예 5]
[DNA 본쇄 96/97의 염기번호 96에서 염기번호 162까지으의67개의 염기길이의 DNA 단편의 합성.]
[a)트리뉴클레오타이드로부터 2-시아노에틸보호그룹의 제거]
실시예 3또는 4로부터의 트리뉴클레어타이드 10μmol을 습기를 제거하면서, 60μl의 피리딘.아세토니트릴/트릴에틸아민(1:1:1)에 용해시킨다.
실온에서 1시간 후에 0.7ml의 과산화-유리 에테르를 적가하고 침전물을 원심분리하여 회수한다. 조 트리에틸 암모늄염을 50μl의 피리틴에 용해시키고 다시 0.5ml의 에테르로 침전시켜 원심분리하고 고진공중에서 15시간 건조시킨다.
[b)부분적으로 보호된 트리뉴클레오타이드를 폴리스티렌 수직에 결합된 올리고뉴클레오타이드 쇄와 커플링]
모든 조작은 220μl 용량의 반응 용기에서 습기를 제거하면서 용매 및 시약을 마이크로프로세서-조절첨가(microprdcessor-controlled addition)하여 수행한다.
13㎎(0.74μmol)의 티미딘/폴리스티렌 수지(실시예1)를 반응용기에 넣어 다음 조작을 수행한다.
1. 메틸렌 클로라이드, 2ml/분, 4분
2. 메틸렌 클로라이드/이소프로판올(85:15), 2ml/분, 2분.
3. 메틸렌 클로라이드/이소프로판올(85:15)중의 1M 브롬화아연 및 0.02M 1,2,4-트리아졸, 2ml/분,2-3.5분.
4. 메틸렌 클로라이드/이소프로판올(85:15).2ml/분, 4분
5. DMF중의 0.5M 트리에틸암모늄 아세테이트,2ml/분,5분
6. 분자체-건조된 피리딘, 2ml/분, 3분.
7. 테트라하이드로푸란(과산화물-유리, 분자체-건조된), 2ml/분, 3분
8.질소 기류,10분
9. 150μl의 피리딘에 용해된 10μmol의 트리뉴클레오타이드 GTC(단락 a)로부터의 트리메틸암모늄염) 및 8.9㎎(30μmol)의 1-메시틸렌설포닐-3-니트로-1,2,4 트리아졸(MSNT)주입.
10. 45℃, 20분.
11. 피리딘, 2ml/분, 4분
12. 피리딘중의 5% 무수 아세트산 및 2.5% 4-디메틸아미노피리딘, 2ml/분, 4분.
13. 피리딘, 2ml/분 4분.
14. 피리딘/이소프로판올(1:1), 2ml/분, 3분
모든 14개의 조작을 21회 반복 수행하되 , 9번째 조작에서 GCT대신에 각각 하기 트리뉴클레오타이드를 이들의 트리에틸암모늄염의 형태(단락 a)로 사용한다.
GCA, ACC, GAA, CCC, TAC, AGG, TGA, CGC,, TAC, CGT, GTG, CCA, AAA, AAA, TGA,CGG, TGA, TTC, GGG, CCT, CAT. 평균 커플링 수율은 97%이다. 최종의 생성물은 하기 구조를 갖는다.
MMT-CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTA
CCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAG
TCT-폴리스티렌
[c) 담체로부터 DNA 단편의 제거 및 보호그룸의 제거]
40.0㎎(대략 0.60μmol)의 합성수지 96/67을 400μl의 95% 피리딘중의 66㎎(0.40mmol)의 o-니트로벤즈알독심 및 50μl(0.40mmol)의 1,1,3,3-테트라메틸 -구아니딘과 함께 50℃에서 3시간 동안 및 실온에서 12시간동안 유지시킨다.
피리딘에 질소를 주입한 후 1.6ml의 수성 암모니아(33%)를 잔류물에 가하고 전체를 밀폐용기내 50℃에서 24시간 동안 유지시킨다.
액체상을 분리하여 진공중에서 암모니아를 유리시키고 매회 과산화무-유리 디에틸에테르 3ml씩으로 3회 세척한다.
Biogel P6컬럼(100-200메쉬,3x66㎝, 0.01M 트리메틸암모늄 중탄성염 pH7.5, 1.5ml/분)상에서 저분자량 내용물을 제거한후 285OD(260nm)의 DNA를 분리 시킨다.
60 OD 전체를 HPLC 컬럼(PRP-1/Hamilton, 250x4.6mm)상에서 분리시킨다. 구배(용액 A: 0.05M 트리에틸암모늄 아세테이트 pH 7.0; 용액B ; 용액A ; 아세토니트릴 1:1): A중의 B60%, 50℃에서 20분 및 2ml/분.
친지방성 주 피크(유지시간은 대략 14분)을 회수하여, DE 52셀룰로오즈 (Whatman)컬럼상에서 농축시키고, 용출시켜 에탄올로 침전시킨다.
4-메톡시트리틸 보호그룹을 제거하기위해, 침전물을 50μl의 아세트산/H2O (4:1)에 용해시키고,실온에서 45분동안 유지시킨다.
반응생성물을 동결건조시키고 에탄올로 침전시킨다음, 정제를 위해 8% 폴리아크링아미드겔(7M 우레아)상에서 전기영동적으로 분리한다.
목적하는 DNA 크기에 상응하는 밴드를 절단하여 생성물을 전기 용출시키고, DE 52셀룰로오즈 상에서 농축시켜 하기 구조를 갖는 DNA 96/97을 에탈올로 침전시킨다.
5'-CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCT-3'
[실시예6]
실시예5와 유사한 유사한 방식으로 하기의 DNA 단편(5'-3')을 제조한다.
1/58
CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAACCTGCCTGT
상보성 46/64
CAGAACCCAGGATGCATTTGTTACCCTGACCGCAAACGTTAGAACCTTCGCACAGGCACAGGTT
상보성154/64
CAGGATCCTACTGCAGGTATTCTTCCGGGATTTCTTCGAAGTCACCGTCGTTGTGAGACTGCGG
[실시예7]
단편 1/58, 상보성46/64, 96/97 및 상보성 154/65의 포스포릴화
5'-말단에서의 포스포릴화 및 방사능표지는 하기 문헌에 기술된방식대로[γ-32P] ATP 및 폴리뉴클레오타이드키나제(Boechringer)를 사용하여 수행한다[참조: T.Maniaatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manunal, Cold Spring Harbor Lab., 1982, 125페이지]
[실시예8]
[이본쇄 구조물 Ⅱ(데설페이토히루딘 HVI 유전자의 단편F2)로의 중합반응]
각 경우 키나제 처리된 단편96/97A;C 키나제 처리된 154/64 50pmol을 24μl의 물에 용해시키고 용액을 90℃에서 3분동안 가열한 다음 5분 이내에 12℃로 냉각시킨다. 4μl의 Endo-R 완충액(0.1M 트리스. HCL pH7.5, 66mM MgCl2, 66mM β-머캅토에탄올,0.6M NaCl)을 가한 후 10μl의 데옥시-뉴클레오사이드 트리포스페이트 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, TTP, 각각 2x10-3M, NH3로 pH7.0으로 조절) 및 2μL(10단위)의DNA 폴리머라제 I, 클레노우 단편(Boehringer) 배양을 12℃에서 30분동안 수행하다. 90℃에서 3분동안 가열하여 반응을 중지시키고 혼합물을 추가의 프로세싱이 필요할 때까지, -80℃에서 보관한다.
유사한 방식으로, 키나제 처리된 단편 1/58과 46/64를 반응시켜 이본쇄 구조물 I (데설페이토히루딘 유전자의 단편F1)을 제조한다.
이본쇄 구조물 I 및 Ⅱ는 다음 구조를 갖는다.
이본쇄 구조물 I
이본쇄 구조물Ⅱ
데설페이토히루딘 유전자의 단편F1 및 F2의 제조방법은 하기 반응도식1에 설명되어 있다.;
[반응도식 1]
[데설페이코히루딘 유전자 HVI의 단편F1및 F2, 및 F1-F2DNA의 제조방법]
[실시예 9]
[단편 1.58, 키나제 처리된 46/64, 키나제처리된 96/67 및 154/64의 중합반응 및 연결 반응; 데설페이토히루딘 HVI 유전자의 제조방법]
각 경우 50pmol의 단편 1/58, 키나제 처리된 46/64, 키나제 처리된 96/67, 및 154/64를 48μl의 물에 용해시키고 용액을 90℃에서 3분동안 가열한 다음 5분내에 12℃로 냉각시킨다.
8μl의 Endo-R 완충액(참조 ; 실시예8), 20μL의 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, TTP, 각 경우 0.002M, NH3로 pH7.0으로 조절), 2μl(10단위)의 DNA 폴리머라제 I 및 클레노우 단편(Boehringer) 배양을 12℃에서 30분동안 수행한다.
90℃에서 3분동안 가열하여 반응을 중지시키고 ,페놀/클로로포름으로 추출한 후 에탄올로 침전시켜 DNA를 분리한다,
생성된 DNA 혼합물을 100μl의 리가제/완충액(66mM 트리스. HCL pH 7.5, 6.6mM MgCl2, 10mM 디티오트레이틀, 5mM ATP)에 용해시키고 50단위(2μl)의 T4DNA리가제(Biolabs)를 가하여 전체를 20℃에서 20시간 동안 배양한다.
70℃에서 5분동안 가열하여 반응을 중지시키고, 페놀/클로로포름으로 추출한 후 에탄올로 침전시켜 DNA를 분리한다.
혼합물을 8% 폴리아크릴아미드 겔(변성)상에서 전기동영에 의해분리한 후 217개의 염기상을 갖는 연결반응 생성물을 전기 용출시키고 DE 52셀룰로오즈 컬럼상에서 농축시킨 다음, 용출한 후 에탄올로 침전시켜 분리한다.
데설페이토히루딘 유전자는 다음 구조를 갖는다.;
4개의 단편으로부터 데설페이토히루딘 유전자를 제조하는 방법은 다음의 반응도식 2에 설명되어 있다;
[반응도식 2]
[4개의 합성 단편으로부터 히루딘 유전자를 제조하는 방법]
(데설페이토히루딘 유전자)
[실시예10]
[데설페이토히루딘 HVI 유전자의 F1-DNA를 함유하는 플라스미드 pML 300의 작제(제1도)]
[a)선형화된 벡터 pBR 322/EcoR I/PvuⅡ의 제조]
5㎍의 pBR 322플라스미드 DNA를 100㎍/ml의 젤라틴 용액 200ml중, 37℃에서 1시간동안 5단위의 PvuⅡ 제한 엔도뉴클레라제(Biolabs)로 분해 시킨다.
계속해서 이 용액을 100mM 트리스 HCI(pH7.5) 및 50mM NaCl로 조절하고 DNA를 37℃에서 2시간동안 30단위의 EcoR I 제한 엔도뉴클레아제(Biolabs)로 분해시킨다. 용액을 50mM 트리스 HC1 pH 8로 조절한 다음 10㎍/μL의 DNA농도에서 37℃에서 30분동안 2단위의 장내 알카리성 송아지 포스파타제(Boehringer)로 배양한다. 이 용액을 65℃에서 60분동안 가열하여 효소를 실활성화 시킨다. 용액을 TNE로 표준화한 다음, 1용적의 페놀 및 클로로포름으로 추출하여 분해된 DNA를 -20℃에서 밤새 2용적의 알콜로 침전시킨다.
pBR 322 DNA로부터 절단한 벡터(pBR 322/EcoR I/Pvu Ⅱ, 2297개의 염기쌍)를 트리스-아세테이트-EDTA 완충액 pH 8중의 1% 저-융점 아가로오즈 (Biorad)상에서 겔 전기영동에 의해 작은 DNA 단편(2067개의 염기쌍)으로부터의 분리 시킨다. DNA를 아가로오즈 겔에서 EtBr로 염색한 후, pBR 322/EcoR I/Pvu Ⅱ벡터(2297개의 염기쌍)의 DNA 밴드를 함유하는 겔의 부분을 겔로부터 절단하여 65℃에서 10분동안 액화 시킨다. 이 DNA 용액에 20용적의 TNE를 가하여 DNA를 문헌[참조; Mueller et al., J. Mol. Biol. 124, 343, (1978)]에 기술된 방법에 따라 DE-52 크로마토그라피에 의해 정제하고 , 페놀/클로로포름으로 추출한 다음 DNA를 -20℃에서 밤새 알코올로 침전 시킨다. DNA침전물을 50μl의 0.01M 트리스. HCL (pH8) 및 0.1mM EDTADP 융해시키고 사용할때가니 -20℃에서 보관한다. 1.4㎍(3.2pmol의 말단)의 DNA가 수득된다.
[b) F1-DNA/EcoR I의 제조]
24ng(1.3pmol의 말단)의 화학적으로 합성된 F1-DNA(참조 : 실시예 8)를 100mM 트리스. HCL (pH 7.5), 50mM NaCl 및 100㎍/ml의 겔라틴중,37℃에서 30분동안 5단위의 EcoR I 제한 엔도뉴클레아제(BiOABS)로 분해시킨다.
계속해서, 이 용액에 0.06㎍(0.14pmol의 말단)의 선형화된 벡터 pBR 322 /EcoR I/Pvu Ⅱ(실시예 10a)를 가한다. 65℃에서 가열하여 효소를 불활성화 시키고 10분후에 용액을 TNE로 표준화시켜 페놀/클로로포름으로 추출한다. DNA를 알콜로침전 시킨다. 침전된 DNA를 추가의 프로세싱 때까지 알코올하 -20℃에서 보관한다.
[c)pBR 322/EcoR I/Pvu Ⅱ 벡터와 F1-DNA/EcoR I와의 연결반응 및 플라스미드 pML300의작제]
상기 언급한 2개의 DNA 단편을 함유하는 실시예 10b)에서 수득된 DNA침전물을 20μl의 50mM 트리스. HCL(pH7.8), 10mM MgCl2, 10mM DTT, 0.5mM ATP 및 100㎍/l의 젤라틴의 용액에 용해시켜 15℃에서 3시간동안 25단위/μl T4 DNA 리가제(Biolabs)로 처리한다. 이러한 방식으로, F1-DNA를 함유하는 재조합 플라스미드 pML 300을 용액에서 수득한다.
[d) 플라스그미드 pML 300으로 이,콜라이 HB 101의 형질전환]
형질전환에 필요한 칼슘으로 미리 처리한 이.콜라이 HB101 세포를 문헌에 기술된 방식으로 제조한다.[참조 : Mandel et al., J. Mol. Biol.53 159(1970)].
재조합 플라스미드 pML 300을 함유하는 ,c)에서 수득된 용액을 65℃에서 10분동안 가열하여 T4DNA 리가제를 불활성화 시킨 다음 37℃로 냉각시킨다. 이 반응 혼합물 10μl를 전체 용적 200μl중에서 10mM MgCl2및 10mM 트리스 HCL(pH7.5)중의 150μl의 칼슘-처리된 이.콜라이 HB 101 세포에 가한다.
계속해서 이 혼합물을 얼음중에서 30분동안 냉각시키고 42℃에서 2분동안 가열한 다음 1ml의 L-배지(참조:실시예 18)중, 37℃에서 50분동안 정치시킨다. 이어서 이혼합물을 60㎍mldm 앰피실린(Serva)을 함유하는 5개의 아가 플레이트(McConkey Agar, Difco)상에서 0.2ml의 분취량으로 도말한다. 이어서 이 아가 플레이트를 37℃에서 16내지 18시간동안 유지 시킨다.
형질전환된 이.콜라이 HB 101의 484개의 앰피실린-내성 콜로니가 수득된다.
[e)F1-DNA를 함유하는 콜로니의 스크리닝]
470개의 형질전횐된 콜로니 (실시예10d)를 니트로셀룰로오즈 필터 B85(Schleicher and Schull)상에서 압력을 가한다. 문헌[참조 : M. Grunstein 및 D.S Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961(1979)]에 기술된 방법에 따라, 콜로니를 용해시키고 이들의 변성된 DNA를 필터상에 고정시킨다.
계속해서 필터를 20ml(필터당)의 4xSET(30mM 트리스, HCL(pH8), 150mM NaCl, 1mM EDTA의 용액],0.1%(W/V) Ficoll 400(Pharmacia), 0.5% SDS 및 50㎍/ml의 변성된 송아지 흉선 DNA중, 64℃에서 4시간동안 예비하이브리드화시킨다. 계속해서 니트로셀룰로오즈 필터를 20ml(필터당)의 5xSET(W/V) Ficoll 400, 0.2% SDS 및 50㎍/ml의 변성된 송아지 흉선 DNA중 64℃에서 16시간동안 32p 방사능 표지된 프로브(필터당 대략 103-104세렌코브 Cpm)로 처리한다. 상보성 올리고뉴클레오타이드 46/64를 프로브로서 사용한다.
계속해서, 필터를 실온에서 2xSET 및 0.2% SDS로 2회세척한 다음, 60℃에서 (처음에는 30분동안, 이어서 60분동안 ), 2xSET 및 0.5% SDS로 2회 세척한다.
필터를 3MM 페이퍼(Whatman) 사이에서 건조시킨 다음 증감 스크린(Ilfold)을 갖는 X-레이 필름(Fuji)상-80℃에서 1내지 2일 동안 놓아둔다.
생성된 방사선 자동 사진결과 추가의 프로세싱에 사용될 수 있는 71개의 양성 콜로니(클론)를 볼수 있으며, 이중의 하나를 pML 300으로 표기한다.
[실시예 11]
[데설피이토히루딘 HVI 유전자의 F1-DNA를 함유하는 플라스미드 pML 300의 작도(제2도)]
[a)선형화된 벡터 pBR 322/BamH I/Nru I 의 제조]
5㎍의 pBR 322 플라스미드 DNA를 100mM NaCl, 6mM 트리스(pH7.9), 6mM MgCl2및 100㎍/ml 젤라틴의 용액중 37℃에서 30분동안 30단위의 BamH I 제한 엔도뉴클레아제로 분해시킨다. 이 용액에 15단위의 Pvu Ⅱ제한 엔도뉴클레아제를 가한 다음 용액을 37℃에서 2시간동안 분해시킨다.
반응 혼합물을 70℃에서 10분동안 가열하여 효소를 불활성화한다. 계속해서 트리스-아세테이트-EDTA 완충액(pH 8)중의 1% 저-융점 아가로오즈상에서 겔 전기영동에 의해 2개의 DNA 단편을 서로 분리시킨다(참조 : 실시예 10a).
pBR 322/BamH I/ PvuⅡ벡터(2672개의 염기쌍)의 DNA밴드를 절단하여 , 액화시키고 무엘러 등의 문헌(상기 참조)에따라 DE-52 크로마토그라피로 정제한다.
0.75μl(1.5pmol의 말단)의 DNA가 수득된다.
[b) F2-DNA/BamH I의 제조]
25μl(1.3pmol의 말단)의 화학적으로 합성된 F2-DNA(실시예 8)를 20μl의 150mM NaCl,6mM 트리스 HCL(pH7.9),6mM MgCl2및 100㎍/ml 젤라틴중, 37℃에서 30분동안 16단위의 BamH I제한 엔도뉴클레아제(Biolabs)로 분해시킨다.
이어서 이 용액에 60㎎(96mmol의 말단)의 선형화된 벡터 pBR 322/BamH I/Pvu Ⅱ(실시예 11a)를 가하고 전체 용액을 TNE로 표준화하여 페놀/클로로포름으로 추출한 다음, DNA를 2용적의 알코올로 침전 시킨다. 침전된 DNA를 추가의 프로세싱이 필요할 때까지 , 알콜하-20℃에서 보관한다.
[c) pBR 322/BamH I/PvuⅡ 벡터 DNA와 F2-DNA/BamH I와의 연결반응 및 플라스미드 pML 305의 L작제]
상기 언급한 2개의 DNA 단편을 함유하는 실시예 11b)에서 수득된 DNA 침전물을 50mM 트리스 HCL(pH7.8), 10mM MgCl2, 10mM DTT, 0.5mM ATP 및 100㎍/ml 젤라틴의 용액에 용해시키고 15℃에서 3시간동안 15단위/μl T4DNA리가제 (Biolabs)로 처리한다. 이러한 방식으로 F2-DNA를 함유하는 재조합 플라스미드 pML 305를 용액중에 수득한다.
[d) 플라스미드 pML 305로 이.콜라이 HB 101의 형질전환]
칼슘-처리된 이.콜라이 HB 101 세포의 형질전환을 실시예10d)에 기술된 바와 같이 수행한다.
실시예 11c)에서 수득된 반응 혼합물10μl를 사용한다.
313개의 앰피실린-내성 콜로니가 수득된다.
[e) F2-DNA를 함유하는 콜로니의 스크리닝
65개의 형질전환된 콜로니(실시예11d)를 실시예10e)에 기술된 방식으로 F2-DNA에 대해 검사한다.
상보성 올리고뉴클레오타이드 154/64(참조 : 실시예 6)를 방사능 프로브로서 사용한다. 방사능 자동사진에서 2개의 양성 콜로니가 수득되는데 이중 하나를 pML 305로 표기한다.
[실시예 12]
[클론의 pML 300 및 pML305의 특성화.]
재조합 플라스미드 pML 300 및 pML 305의 DNA를 문헌에 기술한 방법에 따라 분리한다.[참조: Ish-Horowitz, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ed. T. Mainiatis et al., Cold Spring Habo Lab., 1982, 368페이지].
F1-DNA 및 F2-DNA삽입물의 뉴클레오타이드 서열을 문헌에 기술된 방법에 따라 확인한다[참조 : Maxam 및 Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560(1977); 또한 Meth. Enzym.65, 499(1980)].
이 목적을 위해 , 각 경우 pML 300의 플라스미드 DNA 10㎍을 EcoR I 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고 pML 305의 플라스미드 DNA 10㎍을 BamH I 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고 성형화된 DNA를 아가로오즈겔로부터 겔 용출에 의해 분리한다[참조 : 실시예 10a]. 계속해서분리된 DNA를 알칼리성 포스파타제로 분해시켜 DE-52상에서 크로마토그라피한다.[참조 : 실시예 11a]
이어서 DNA를 5' 말단에서 [γ-32p] ATP(비활성5000Ci/mmol, Amersham) 및 T4폴리뉴클레오타이드 키나제 (P-L-Biochemicals)로 방사능 표지한다.
방사능표지된 DNA를 제2제한 엔도뉴클레아제(EcoR Ⅱ)로 절단한다. 생성된 DNA 단편을 악로오즈로부터 겔 용출에 의해 분리한다. pML300의 F1-DNA뉴클레오타이드 서열을 EcoRⅡ-EcoR I*단편(약109 염기쌍 )으로 확인하고 pML 300의 경우 F2-DNA를 EcoRⅡ-BamH I* 단편(약122 염기쌍)으로 확인한다.(*는 방사능 표지된 DNA 말단을 가리킨다)
F1-DNA및 F2-DNA로 확인한 뉴클레오타이드 서열은 실시예 8에 예시된 것과 동일하다.
[실시예 13]
[발현 플라스미드 pML의 작제]
a) trp 프로모터―오퍼레이터를 함유하는 선형화한 벡터 pHRi 148/EcoR I /BamG I 의 작제 (제 3 도 및 제 4 도).
A. 플라스미드 p159작제
플라스미드 pBRHtrp[DE―OS 3 111 405] 10㎍을 EcoR I (Biolabs) 50단위로 37℃에서 60분 동안 절단하고, 분해 혼합물을 페놀 추출후 TST 41(Kontron AG) 회전자중 50mM 트리스.HCl(pH 8.0), 1mM EDTA에서 사카로오즈 밀도 구배(5―23%)상에 분획화한다. 15℃에서 40,000revs/분으로 14시간 동안 원심 분리시킨다. 0.3ml 분획을 1ml/분으로 ISCO 구배 수거기로 수거한다. 작은 단편을 함유하는 분획을 합하고, 용액을 NE로 표준화하며, -20℃에서 에탄올 2용적으로 침전시킨다. 에펜도르프 원심분리기에서 원심분리후 DNA를 10mM 트리스·HCl pH 7.5, 0.5mM EDTA의 100μl중에 용해한다.
이 DNA 단편 5㎍을 BglII (Biolabs) 5단위로 37℃에서 60분 동안 절단한다.
반응 혼합물을 페놀 및 크로로포름으로 추출하고 DNA를 에탄올 2용적과 -80℃에서 10분 동안 배양한다 ; DNA를 원심분리하여 수거하고 50mM 트리스.HCl(pH 8.0) 50μl에 다시 용해한다. 이 용액 2μl를 회수하여 (DNA 0.2㎍) 50mM 트리스·HCl(pH 8.0)중 10mg/μl의 DNA 농도로 장내 알칼리성 소의 포스파타제(Boehringer) 1단위와 함께 37℃에서 30분 동안 배양한다. 용액을 65℃로 60분 동안 가열하여 효소를 불활성화 한다. DNA 0.04㎍을 회수하여 50mM 트리스.HCl(pH 9.5), 10mM MgCl2, 및 5mM DTT의 반응 용적 20μl중에서 [γ-32P] ― ATP(5000Ci/mmol, Amersham) 10μCi 및 T4폴리뉴클레오타이드키나제 (P―L Biochemicals) 5단위와 함께 37℃에서 30분 동안 5`―말단적으로 배양한다. 방사성 샘플을 비―표지한 샘플(상기 참조)과 함께 혼합하고 DNA 단편을 TST 60 회전자에게 50mM 트리스·HCl(pH 80.), 1mM EDTA중 5―23% 사카로오즈 밀도 구배에 의해 분획화한다. 60,000revs/분 및 15℃에서 5시간 동안 원심분리한다. 0.2ml 분획을 수거한다. 각 분획의 방사능을 세렌코브 방사 측정에 의해 판정하고 단편을 동정한다.
작은 DNA 단편을 함유하는 목적 분획을 합하고, DNA를 에탄올 2용적으로 침전시키며, 원심분리후 다시 10mM 트리스·HCl pH 7.5, 0.5mM EDTA의 20μl에 용해한다.
32p―표지된 EcoR I ―BglII DNA 단편을 50μl 용적에서 Taq I (Biolabs) 0.2단위로 37℃에서 10분 동안 부분적으로 절단한다. 반응 혼합물을 0.2% SDS, 10% 글리세린, 10mM EDTA, 0.05% 브로모페놀―블루로 조정하고, DNA 단편을 트리스―보레이트―EDTA중 6% 폴리아크릴아마이드 겔상에서 분리한다[참조 : A. C. Pacocket al., Biochemistry 6, 1818(1967) ]. 목적하는 EcoR I ― Taq I (대형 부분 단편)을 함유하는 밴드를 자동방사성 사진상에서 확인한다. 이 단편(제 3 도 참조)을 겔로부터 추출하고 정제하며[참조 : W.Muler etal., 상기인용], 10mM 트리스·HCl pH 7.5, 1mM EDTA의 10μl에 용해한다.
Cla I 및 EcoR I으로 절단한 플라스미드 pBR 322를 수용체로서 사용한다: pBR 322 2μg을 반응 용적 20μl중에서 Cla I (Biolabs) 4단위로 37℃에서 60분 동안 분해한다. 단백질을 페놀로 추출하고 이어서 DNA를 -80℃에서 10분 동안 에탄올 2용적으로 침전시킨다. DNA를 원심분리로 수거하고 이어서 EcoR I (Biolabs) 10단위로 반응 용적 20μl중, 37℃에서 30분 동안 분해한다.
후속적으로 0.1M 트리스.HCl(pH 8.7) 2용적을 용액에 가하고, 전체를 32℃에서 30분 동안 알칼리성 소의 포스파타제 (Boehringer) 1단위로 배양한다. 이어서 포스파타제를 65℃에서 60분 동안 배양하여 불활성화 한다.
수용체 플라스미드 100ng를 10mM MgCl2, 20mM 트리스·HCl(pH 7.8), 10mM DTT, 0.5mM ATP의 반응 용적 15μl중 단편 L―DNA 5μl 및 방응 용적 μl당 T4DNA 리가제(Biolabs) 30단위와 함께 2시간 동안 배양한다.
이 용액 5μl를 10mM MgCl2, 10mM CaCl2및 10mM트리스·HCl(pH 7.5)의 총 용적 200μl중 염화칼슘(상술)으로 처리한 이.콜라이 HB 101 세포 150ml를 함유하는 혼합물에 가한다. 혼합물을 얼음에서 20분 동안 냉각하고, 42℃에서 1분 가열하며, 20℃로 10분 배양한다. 트립톤 배지[박토―트립톤(Difco) 10g ; 효모 추출물 (Difco) lg ; 글루코즈 lg ; NaCl 8g 및 CaCl2·2H2O 294mg을 증류수 1ι에 함유하는 트립톤 배지] 1ml를 가하고 혼합물을 300revs/분으로 교반하면서 37℃에서 30분 동안 배양한다.
혼합물을 앰피실린(Sigma) 50μg/ml를 보충한 2개의 아가 플레이트 (McConkey Agar, Difco ; 0.6ml/플레이트)상에 놓는다. 플레이트를 37℃에서 12 내지 17시간 동안 배양한다.
10개의 상이한 콜로니의 플라스미드 DNA를 하기와 같이 분리한다:
상기와 같이 콜로니를 사용하여 215ml 삼각플라스크에서 앰피실린 50μg/ml를 보충한 트립톤 배지 10ml에 접종한다. 배양액을 37℃ 및 300revs/분으로 15 내지 18시간 동안 교반한다.
세포를 원심분리하여 수거한다. (Sorval, HS―4 회전자, 4000revs/분으로 10분, 4℃). 약 0.1g의 세포를 수거하는데 이를 50mM 트리스·HCl(pH 8.0) 1ml에 재현탁한다. 라이소자임 용액[50mM 트리스 .HCl(pH 8.0)중 10mF/ml ; 라이소자임은 Sigma 상품임] 0.25ml를 가하고, 0℃에서 10분 동안 배양한 후, 0.5mM EDTA(pH 7.5) 0.15ml를 가한다. 0℃에서 10분 후 2% 트리톤 X―100(Merck) 60μl를 가한다.
0℃에서 30분후 샘플을 Sorval SA―600회전자에게 15,000revs/분 및 4℃로 30분 동안 원심분리한다. 상등액을 페놀(TNE로 포화) 1용적으로 탈단 백질화를 한다. 상들을 5000revS/분 및 4℃에서 10분 원심분리(Sorval HB―4 회전자)에 의해 분리한다.
상부상을 클로로로픔 1용적으로 2회 추출한다. 췌장 RNAse A(sigma : 85℃에서 10분 예비 가열한 TNE중 100mg/ml)를 최종 농도가 25μg/ml에 달할 때까지 가하고 혼합물을 37℃에서 40분 배양한다. 이어서 용액을 1M NaCl 및 10% 폴리에틸렌글리콜 6000(Fluka, 가압멸균기상에서 120℃로 20분 처리)로 조정하고 ― 10℃에서 2시간 배양한다. 침전물을 Soval HB―4 회전자(10,000revs/분, 0℃에서 20분)에 수거하고 다시 TNE 100μl에 용해시킨다. DNA 용액을 페놀 1용적으로 추출하고 -80℃에서 10분 동안 에탄올 2용적으로 첨전시킨다. 침전물을 에펜도르프 원심분리기에서 원심분리하여 수거하고 DNA를 다시 10mM 트리스·HCl (pH 7.5) 및 0.5mM EDTA의 20μl중에 용해한다. 플라스미드 DNA 8 내지 10μg을 10ml 배양물로부터 수득한다.
플라스미드 DNA를 하기 제한효소로 분해한 다음 분석한다 :
각 경우에 있어서 플라스미드 DNA 0.5μg을 표준 지침 효소 제조회사의 지시에 따라 Hpa I (Biolabs), EcoR I (Biolabs) 및 Cla I (Biolabs)로 절단한다. DNAs 40mM 트리스.아세테이트(pH 7.8), 1mM EDTA 및 0.5μg/ml 에티듐브로마이드중의 1% 아가로오즈 겔상에서 분획화 한다. 목적 플라스미드는 Hpa I 부위를 함유하며, 3회 분해후 대형 DNA 단편외에 pBR 322의 소형 EcoR I―Cla I 단편 보다 큰 2개의 소형 단편을 산출한다. 이중 하나를 p159라 표기한다(제 3 도 참조).
[B. 플라스미드 pHRi 145의 작제]
p159 DNA 2μg을 37℃에서 30분 동안 EcoR I (Biolabs) 10단위로 분해한다.
DNA를 페놀로 추출하고, 에탄올을 침전시켜, 원심분리후 10mM 트리스· HCl(pH 7.5), 0.5mM EDTA의 10μl에 용해한다.
EcoR I으로 분해한 DNA를 또한 10mM MgCl2, 10mM β-머갑토에탄올, 50mM NaCl 0.1mM dATPCP&L (Biochemucals) 0.1mM DTTP(P & L Biochemicals)중에서 폴리머라제(클레노우 단편) 5단위로 12℃에서 15분 처리한다. 이어서 폴리머라제를 80℃에서 5분 동안 배양하여 불활성화한다.
반응 혼합물을 20nM 트리스·HCl(pH 7.8), 10mM MaCl2, 10mM DTT, 0.5mM ATP(Sigma)중에 10배 희석하고 반응 혼합물 μl당 T4DNA 리가제 30단위와 함께 15℃에서 1시간 배양한다.
DNA 50mg을 이.콜라이(상술한 방식으로)에 형질전환하고 앰피실린 50μg/ml를 보충한 맥콘키 아가상에 도말한다.
10개의 상이한 콜로니의 플라스미드 DNA를 상술한 방식으로 분리한다. 폴라스미드 DNA를 EcoR I으로 분해하여 분석한다. 목적 플라스미드는 EcoR I―내성이다. 분석은 상술한 방법으로 수행한다.
목적 플라스미드중 하나를 HRi 145로 표기한다(제 3 도).
[C.플라스미드 pHRi 148작제]
pHRi 145―DNA 2μg을 Cla I (Boehringer) 5단위로 37℃에서 60분 처리하고, 이어서 페놀 추출하여 단백질을 제거한다. DNA를 에탄올로 침전시키고, 10mM 트리스.HCl(pH 7.5), 0.5mM EDTA의 20μl에 용해한다. 상술한 바와 같이 돌출 말단올 dATP 및 dTTP를 dCTP(P & L Biochemicals) 및 dGTP(P & L Biochemicals)로 대치하여 DNA 폴리머라제 I (클레노우 단편)으로 작제한다. 폴리머라제를 85℃에서 5분 배양하여 불활성화시킨다. 0.1M 트리스·HCl(pH 8.7) 2용적을 소의 포스파타제(Boehringer) 0.5단위로 37℃에서 30분 배양한 반응 혼합물에 가한다. 반응 혼합물을 페놀로 추출하여 단백질을 제거한다. DNA를 에탄올로 침전시키고 10nM 트리스·HCl(pH 7.5), 0.5mM EDTA의 8μl에 용해시킨다.
서열 5`―GAATTCCATGGTACCATGGAATTC―3`의 화학적으로 합성한 DNA 링커를 0.1mM rATP (Sigma), 50mM 트리스·HCl(pH 9.5), 10mM MaCl2, 5mM DTT 및 T4폴리뉴클레오타이드키나제(P & L Biochemicals)를 함유하는 반응 용적 8μl중에서 링커 8pmol과 5μCi[r―32p]―ATP(5500Ci mmol-1; Amersham)을 37℃에서 30분동안 함께 배양하여 5` 말단을 포스포릴화 한다.
반응을 -80℃로 동결하여 정지시킨다.
이어서 방사능 표지된 링커를 Cla I 1μg 및 포스파타제로 처리하고 0.5mM rATP(Sigma), 10mM DTT(Calbiochem), 20mM 트리스·HCl(pH 7.8), 1mM MgCl2및 T4DNA 리가제(Biolabs) 800단위를 함유하는 반응 용적 20μl중에서 pHRi 145―DNA(상기 참조)로 연결시킨다.
15℃에서 2시간 동안 배양한다. 라가제를 85℃에서 10분 배양하여 불활성화시킨다. 이어서 물을 2용적을 가하고, 염화나트륨 농도를 10mM로 조정하며, Kpn I (Biolabs) 20단위를 37℃에서 30분에 걸쳐 가한다. 페놀 및, 클로로포름으로 추출한 후 혼합물을 40mM 트리스 아세테이트(pH 7.8), 1mM EDTA 및 0.5μg/ml 에티듐 브로마이드중의 0.9% 저용융 아가로오즈 겔(Biorad)을 통해 분획화한다. UV 방사에 의해 눈에 보이는, 동일한 크기의 표지물 DNA와 동일한 이동성을 나타내는 밴드를 작은 칼로 절단해 낸다. 겔 부분을 65℃에서 5분 용융시키고 37℃로 냉각한다. 약 20μl의 용적을 수득한다. 이 용액 5μl를 수거하여 15℃에서 이미 0.5mM ATP, 10mM DTT, 10mM MgCl2, 20mM 트리스·HCl(pH 7.8)로 조정한 반응 용적 10μl중에서 T4리가제(Biolabs) 400단위와 함께 12시간 동안 배양한다. 10mM 트리스·HCl(pH 7.5), 100mM CaCl2및 100mM MaCl2의 용액 1/10 용적을 리가제 혼합물에 가하고(15℃에서 응고) 전체를 65℃에서 5분 배양한다. 이 용액을 사용하여 상술한 방법대로 칼슘―처리한 이.콜라이 HB 101 세포를 형질전환시킨다. 앰피실린 50μg/ml를 보충한 맥콘키 아가 플레이트상에 도말한다.
10개의 상이한 콜로니의 플라스미드 DNAs를 상술한 방법대로 분리하고, DNA를 하기 제한효소로 분석한다 : 각 경우에 있어서, 플라스미드 DNA 0.5μg을 효소 제조회사의 지시에 따라 Kpn I (Biolabs), Nco I (Biolabs) 및 EcoR I (Biolabs)로 연속 절단한다. 절단 생성물을 40mM 트리스 아세테이트(pH 7.8),1mM EDTA, 0.5μg/ml 에티듐 브로마이드중의 1% 아가로오즈 겔상에 분획화한다. 모든 플라스미드는 각각 목적하는 바와같이 이들 효소 절단 부위 하나씩을 갖는다. 그중 하나를 HRi 148로 표기한다.
플라스미드 HRi 148은 트립토판 프로모터―오퍼레이터, 리보솜 결합 부위 및 ATG를 함유한다. 히루딘 및 기타 이질성 유전자는 플라스미드에 하나씩 있는 EcoR I, Nco I, Kpn I 부위에 직접 결합될 수 있다. 또한 이 작제는 상응하는 유전자상에 존재하는 전사 개시에 필요한 ATG없이 이질성 유전자와 직접 결합 및 발현시킬 수 있게 한다.
이것은 Nco I으로 절단하고 상술한 방법대로 DNA 폴리머라제 I으로 돌출 말단을 채우거나, 또는 Kpn I으로 절단하고 돌출말단을 뉴클레아제 S1으로 제거하여 용이하게 수행할 수 있다. 따라서 플라스미드 HRi 148은 광역적인 발현 플라스미드이다.
[D. 선형화 벡터 pHRi 148/ECoR I /BamH I의 제조]
pHRi 148의 플라스미드 DNA 5μg을 제한 엔도뉴클레아제 EcoR I 및 BamH I 으로 분해한다. 절제한 벡터 pHRi 148/EcoR I /BamH I을 밀도구배 원심분리에 의하여 분리한다.
[b) F1―DNA/EcoR I /EcoR II 및 F2―DNA/BamH I /EcoRII의 제조]
[Ⅰ. F1―DNA/EcoRⅠ/EcoRⅡ의 제조]
pML 300의 플라스미드 DNA 5μg을 우선 100mM 트리스·HCl(pH 7.5), 50mM NaCl 및 젤라틴 100 μg/ml의 용액 50μl중에 ECoR I 제한 엔토뉴클레아제 10단위로 37℃에서 1시간 동안 분해한다. 이 선형화 플라스미드 DNA/EcoR I의 분취량(0.5μg)을 아가로오즈 겔로부터 용출시켜 분리하고 (실시예 10a 참조).
[r―32p] ATP로 방사능 표지한다(실시예 12참조). 플라스미드 DNA/EcoR I의 주요량을 이 방사능 표지한 DNA와 혼합하고, EcoR I 제한 엔도뉴클레아제로 분해하며, EcoRⅡ―EcoR I * DNA 단편(109염기쌍)을 8% 폴리아크릴아미드상에서 겔 전기영동하여 분리한다. 200μg의 F1―DNA/EcoR Ⅱ를 겔 용출에 의해 분리한다.
[Ⅱ. F1―DNA/BamH I /EcoR Ⅱ의 제조]
pML 305의 플라스미드 DNA 5μg을 BamH Ⅰ 제한 엔도뉴클레아제 10단위로 절단한다. 이 선형화 플라스미드 DNA/BamH Ⅰ의 분취량을 아가로오즈 겔로부커 겔 용출에 의해 분리하고(실시에 10a참조) [r-33p]로 방사능 표지한다(실시예 12참조).
이어서 플라스미드 DNA/BamH I의 주요량을 이 방사능 표지한 DNA와 혼합하고, EcoR Ⅱ 제한 엔도뉴클레아제로 분해하며, EcoR Ⅱ―BamH I * DNA 단편(122염기쌍)을 8% 플라아크릴아미드 상에서 겔 전기영동에 의해 분리한다.
250μg의 F2―DNA/BamH I */EcoRⅡ를 분리한다.
[c) F1―DNA와 F2―DNA의 연결 및 발현 플라스미드 pML 310의 작제]
F1―DNA/EcoR I/EcORⅡ 10ng(=473nmol) 및 F2―DNA/BamH I/EcoRⅡ 9ng(=495nmol)을 실시예 10c에 기술한 방법대로 T4DNA 리가제 20μl 용적중에서 처리한다. 이어서 혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출하고 DNA를 알콜로 침전시킨다.
이어서 DNA 침전물을 실시예 10c에 기술한 바와 같이 용해하고 EcoR I 및 BamH I 제한 엔도뉴클레아제로 분해한다.
용액을 이어서 TNE로 표준화하고 벡터 DNA pHRi 148/EcoR I/Bamh I (실시예 13aD참조) 30ng(=50nmol의 말단)을 가한다.
이어서 용액을 다시 폐놀/클로로포름으로 추출하고 DNA을 알콜로 침전시킨다. 침전된 DNA 혼합물을 실시예 10c에서 지시한 바대로 T4DNA 리가제(Biolabs)로 처리한다. 이 방법에서 용액중에는 삽입물 F1―F2―DNA(데설페이토히루딘 유전자)을 함유하는 제조합 플라스미드가 있다.
[d) 플라스미드 pML 310으로 이.콜라이 HB 101의 형질전환
칼숨 처리한 이.콜라이 HB 101 세포를 실시예 10d에 기술한 방법으로 형질전환시킨다.
실시예 13c에서 수득한 반응혼합물을 10μl를 사용한다. 420개의 앰피실린―내성 콜로니를 수득한다.
[e) F1―F2―DNA를 함유하는 콜로니의 스크리닝]
18개의 형질전환된 콜로니(실시예 13d)를 실시에 10e에 기술한 방법으로 F1―F2―DNA 함량에 대해 조사한다. 실시예 5 및 실시예 6에 기술된 올리고뉴클레오타이드의 혼합물을 방사성 프로브로 사용한다.
방사성 사전에서 12개의 양성 콜로니를 수득하고, 그중 5개를 pML 310, pML 311, pML 312, pML 313, pML 314로 표시한다.
[실시예 14]
[클론 pML 310의 특성화]
재조합 플라스미드 pML 310에서 F1―F2―DNA 서열의 특성화는 실시예 12에 기술한 막삼 및 길버트의 방법(상기 인용)에 따라 F1―F2-DNA를 서열화하여 수행한다. 플라스미드 DNA 10μg을 시험한다. F1―F2-DNA의 뉴클레오타이드 서열은 합성 데설페이토히루딘 유전자에 대해 기술한 것과 동일하다.
[실시예 15]
[효모에서의 데설페이토히루딘 HV1발현]
하루딘에 대해 화학적으로 합성한 유전자를 플라스미드 pML 310에서 206bp EcoR I―BamH I 삽입물로서 증폭시킨다(실시예 14참조). 유전자를 플라슴드로부터 절제해 내고 억제성PH05프로모터의 통제하에 발현시킨다. 작제물은 유럽 특허원 제143, 081호에 기술된 바와 같이 541bpPH05프로모터 서열 및 완전한PH05시그널 서열(17 아미노산을 코드화하는 51개의 뉴클레오타이드)을 함유한다. 이 서열은 천연의 성숙 하루딘의 NH2―종결 아미노산으로서 발린의 코돈으로 시작하는 히루딘의 성숙 코드화 서열에 대한 프레임에 응합된다. 히루딘 유전자는PH05전사 종결 시그널을 제공하는 DNA 단편에 의해 3` 말단에 플랭킹된다.
발현 플라스미드의 벡터 부분은 효모 2μ 서열을 함유하며, 효모에서 선별을 위한 효모LEU2유전자, 이.콜라이에서 선별 및 증폭시 필요한 앰피실린 내성 유전자 및 이.콜라이 복제 기원을 함유한다.
공정이 제5,6 및 7도에 설명되어 있다.
[데설페이토히루딘 유전자의 5` 말단에 있는 뉴클레오타이드 서열의 조정]
데셀페이토히루딘을 코드화하는 뉴클레오타이드 서열은 최종 유전자 생성물에서 NH2-종결 발린을 나타내는 GTT로 시작한다. 이.콜라이에서의 용이한 서브클로닝 및 발현을 위해 코드화 서열을 EcoR I 제한 부위 및 ATG 개시코돈을 함유하는 8개의 뉴클레오타이드로 5` 말단을 연장시킨다.PH05시그널 펩타이드를 코드화하는 서열에 대한 히루딘 코드화 서열의 프레임 융합상 정확을 기하기 위해 이들 부가적 뉴클레오타이드를 제거한다.
이것은 EcoR I 제한부위를 평활말단으로 전환하고 Hga I 인지부위를 함유하는 합성 올리고 뉴클레오타이드를 가하여 이 위치에서 후속적 Hga I 절단이 GTT 코돈 상부에 인접해서 발생하도록 한다.
[데설페이토히루딘의 전반부의 Hga I 인자부위의 유입 (제 5 도 참조)]
플라스미드 pML 310(실시예13c) 참조 8μg을 제한 엔도뉴클레아제 EcoR I으로 완전히 분해한다. DNA(pML 310/EcoR I)을 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시킨다. 5` 돌출 말단을 뉴클레아제 S1으로 제거한다. pML 310/EcoR I DNA 4μg을 250mM NaCl, 1mM ZnSO4, 30mM 나트륨 아세테이트 pH 4.6 및 뉴클레아제 S1(Simga) 20u/ml의 100μl에서 37℃로 45분동안 분해한다.
DNA를 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시킨다.
DNA(pML 310/EcoR I /S1)을 50mM 트리스·Hcl pH 8.0의 100μl에 재현탁하고 소의 장내 알칼리성 포스파타제(CIAP, Boehringer) 2단위와 함께 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 65℃에서 1.5시간 동안 효소를 불활성화시킨다.
배양 혼합물 중 NaCl 농도를 150mM로 조정한다. 탈인산화된 DNA(pML 310/EcoR I/S1/CIAP)를 저염 완충액(150mM NaCl, 10mM 트리스 HCl pH 8.0, 1mM EDTA)중의 DE 52(Whatman) 이온 교환 컬럼에 흡착시켜 정제하고, 이어서 고염 완충액(1.5M NaCl, 10mM 트리스 HCl pH 8.0, 1mM EDTA)으로 용출시킨다. DNA를 에탄올로 침전시키고 H2O에 0.8mg/ml 농도로 재현탁한다.
서열 5`―AGCGTCGACGCT―3`의 올리고뉴클레오타이드를 포스포트리에스테르법[참조:Itakura et al., J. Am. Chem. Soc.103. 706(1981)]으로 합성한다. 올리고뉴클레오타이드의 서열은 제한효소 Hga I의 인지부위 -GACGC-를 함유하는 자기―상보적이다. 2개의 일본쇄를 아닐링하여 12염기쌍의 2본쇄 DNA 링커를 유도한다.
합성 일본쇄 올리코데옥시뉴클레오타이드 1.2μg을 60mM 트리스 HCl pH 7.5, 10mM MaCl2, 5mM DTT, 30μCi의 [r-32p] ATP(3000Ci. mmol-1: Amer sham) 및 T4폴리뉴클레오타이드 키나제(Boehringer) 6단위중에서 37℃로 30분동안 포스포릴화 하고, 이어서 0.5mM ATP의 존재하에 37℃로 15분동안 처리한다. 혼합물을 또한 75℃에서 10분동안 배양하여 효소를 불활성화 시키고 실온으로 냉각하여 아닐링시킨다.
32p―표지한 링커 DNA 0.6μg(170pmoles)를 pML 310/Ecor I/S1/CIAP 2.4μg(1075pmoles)과 혼합하고 60mM 트리스 HCl pH 7.5, 10mM MgCl2, 5mM DTT, 3.5m ATP, T4DNA 리가제(Biolabs) 800 단위중에서 15℃로 20시간 동안 연결시킨다. 리가제를 85℃에서 10분동안 불활성화시키고 과량의 링커 분자는 10mM EDTA pH 7.5 300mM 나트륨 아세테이트 pH 6.0 및 이소프로판을 0.54 용적의 존재하에 DNA를 침전시켜서 제거한다. 실온에서 30분후 DNA를 펠렛으로 만들고 연결 혼합물(상기 언급) 45μL중에 재현탁하며 15℃에서 6시간 동안 연결시켜 환형 DNA를 형성한다.
연결 혼합물 1μl 및 3μl의 분취량을 문헌[참조 : D. Hanahan, J. Biol. Chem.166,557(1983)]의 방법에 따라 제조한 칼슘―처리한, 형질 전환에 적절한 이.콜라이 HB 101 세포 100μl에 RL한다. 세포를 얼음상에서 30분 방치하고, 이어서 42℃로 3분 배양하며, 얼음상에서 2분동안 냉각하고, SOC 배지 400μl 중에서 37℃로 1시간 동안 배양한다. 세포를 각각 100μl 농도로 만들고 앰피실린 50μl/ml를 함유하는 LB 아가플레이트상에 도말한다.
12개의 형질전환된 ampR콜로니를 앰피실린 100μg/ml 함유하는 LB 배지에서 독립적으로 증식시킨다.
플라스미드 DNA를 문헌[참조 : D.S Holmes et al., Anal. Biochem.114,193(1981)]의 방법에 따라 제조한다.
합성 올리고뉴클레오타이드 링커의 존재를 프라이머로서 히루딘을 코드화하는 본쇄에 하이브리드화하는 일본쇄 DNA 단편을 사용하여 DNA 서열화로 확인한다.
히루딘 유전자의 전방에 정확한 위치로 링커 DNA를 함유하는 클론 하나를 pML 310L이라 칭한다.
[실지예 16]
[PH05시그널 서열과 데설페이토히루딘 구조 유전자의 융합]
[a) 0.2kb 데셀페이토히루딘 단편의 분리(제 5 도)]
플라스미드 pML 310L 12μg을 제한효소 BamH I 및 Pvu I으로 완전히 분해한다. DNA를 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시킨 다음 2개의 제한 단편을 트리스―보레이트―EDTA 완충액 pH 8.3중의 1.2% 아가로오즈 겔상에서 분리한다.
에티듐―브로마이드로 염색한 0.84kb Pvu I―BamH I 단편을 겔 조각으로 분리한다. DNA의 0.2 xTBE 완충액 3ml로 채운 투석베드중에서 전기용출시킨다.
밀봉한 빽을 TBE 완충액 pH 8.3(90mM 트리스―염기, 90mM 붕상, 2.5mM EDTA)중에 침전시킨다. 100mA에서 30분후 전류의 극성을 45초동안 역전시켜 투석막으로부터 DNA를 밀어내게 한다. 투석빽중 겔 조각 주변의 완충액을 회수하여 150mM NaCl로 조정하고 DE 52(Whatman) 이온 교환 칼럼을 통해 통과시킨다.
DNA의 고염 완충액(1.5M NaCl, 10mM 트리스 HCl pH 8.0, 1mM EDTA)로 용출시키고, 에탄올로 침전시키며, H2O에 0.1mg/ml 농도로 재용해한다.
pML 310L의 0.84kb Pvu I―BamH I 단편을 또한 제한요소 HgaI으로 분해한다.
이 분해는 성숙 데설페이토히루딘의 완전한 코드화 서열을 함유하는 198bp Hga I―BamH I 단편을 생성한다. 부가적 Alu I 분해는 198bp Hga I―BamH I 단편을 건드리지는 않고 다른 유사 크기의 Hga I 단편을 제거한다.
0.2gb Kb Hga I―BamH I 단편을 TBE 완충액중 1.5% 아가로오즈 겔상에서 다른 단편으로부터 부리하고 전기용출을 분리한다(상술한 바와 같다). DNA를 DE 52 이온 교환 크로마토그라피 및 에탄올 침전에 의해 정제한다. DNA를 H2O에 30μg/ml(0.2pmoles/μl) 농도로 재현탁한다.
[b)PH05시그널 서열의 일부를 함유하는PH05프로모터 영역의 분리(제 6 도)
플라스미드 p31/PH05―TPA 18(참조 : 유럽 특허원 제143,081호)은 외인성 구조 유전자(t―PA)에 프레임상에서 융합된PH05프로모터 및PH05시그널 서열을 함유한다. 584bp BamH I―Bal I 단편은PH05프로모터 및 3` 말단의 8개 뉴클레오타이드를 제외한 모든PH05시그널 서열을 함유한다.
8μg의 p31/PH05―TPA 18 DNA를 제한 엔도뉴클레아제 BaⅡ으로 분해한다 (16시간 동안 37℃에서).
DNA를 페놀/클로로포름 추출하고 에탄올 침전시켜 정제한다, DNA를 0.7mg/ml의 농도로 H2O에 재현탁 시킨다.
PH05시그널 서열과 데설페이토히루딘에 대한 코드화 영역 사이의 올바른 연결부는 다음 서열의 합성링커에 의해 제공된다.
(1) 5`―CCAATGCA―3`
(2) 3`―GGTTACGTCAACA―5`
링커(5`CCAATGCA)의 5`―말단에 있는 8 뉴클레오타이드는 Bal I 부위로부터 프로세싱 부위까지PH05시그널 서열의 일부를 나타낸다. 올리고뉴클레오타이드 (2)의 5`에 달려있는 5 뉴클레오타이드는 데설페이토히루딘 코드화 서열의 5`―말단의 Hga I 절단 부위에 맞추어진다.
개개의 일본쇄 올리고뉴클레오타이드 (1) 및 (2)를 포스포트리에스테르 방법(참조 : Itakura et al., 상기 인용)에 의해 합성한다.
각각 1.1μg 및 1.8μg의 올리고뉴클레오타이드 (1) 및 (2)는 이의 5`―말단을 개별적으로 포스포릴화하고 동일한 양으로 혼합한 다음 실시예 15에 기재된 대로 아닐링시킨다.
1.3μg(200pmoles)의 포스포릴화된 이본쇄 링커 DNA를 15℃에서 16시간 동안 40μl의 60mM 트리스 HCl pH 7.5, 10mM MaCl2, 3.5mM ATP, 5mM DTT 및 1400 단위의 T4DNA 리가제(Biolabs) 중에서 7μg(1.8pmoles)의 Bal I로 절단한 p31/PH05―TPA 18에 연결시킨다. 85℃에서 10분간 리간제를 불활성화시킨다. 파량의 링커를 10mM EDTA, 300mM 나트륨 아세테이트 pH 6.0 및 0.54 용적의 이소프로판을 존재하에 DNA 침전에 의해 제거한다. DNA를 재현탁시키고, 제한효소 BamH I로 더 분해시킨다. 페놀/클로로포름으로 DNA를 추출하고, 에탄올 침전시킨후 두가지 제한 단편을 트리스―보레이트―EDTA 완충액 pH 8.0중의 1.2% 아가로오즈겔 상에서 분리한다. 0.6kb 단편을 겔로부터 분리한다. DNA를 전기 용출시키고 DE 52 이온 교환 크로마토그라피 및 에탄올 추출로 더 정제한다.
0.6kb BamH I―Hga I 단편을 40μg/ml의 농도로 H2O에 재현탁시킨다.
(c) pJDB 207 효모 벡터 단편의 분리 (제 6 도)
9μg의 플라스미드 pJDB207R/PH05―TPA(12-2) DNA (유럽 특허원 제143,081호 참조)를 제한 엔토뉴클레아제 BamH I으로 분해시킨다. 완전히 분해한 후, DNA를 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올 침전시킨다.
DNA를 50mM 트리스 HCl pH 8.0에 0.1mg/ml의 농도로 재현탁시키고, 37℃에서 1시간 동안 7단위의 송아지 장내 알칼리성 포스파타제로 분해시킨다. 포스파타제를 65℃에서 1.5시간 동안 불활성화시키고 DNA를 DE 52 이온 교환 크로마토그라피(실시예 15 참조) 및 에탄올 침전으로 정제한다.
6.8kb의 대형 BamH I 단편을 트리스―보레이트―EDTA 완충액 pH 8.3에서 1.2% 아가로오즈겔 상에서 분리한다.
DNA를 전기용출시키고 DE 52 이온 교환 크로마토그라피 및 에탄올 침전시켜 정제한다. DNA를 0.4mg/ml(0.1pmoles/μl)의 농도로 H2O에 용해시킨다.
(d) pJDB 207 효모 벡터 단편에PH05프로모터 단편 및 데설페이토히루딘 구조 유전자의 연결 (제 6 도)
pJDB 207 효모 벡터, 즉PH05시그널 서열을 함유하는PH05프로모터 단편 및 데설페이토히루딘 구조 유전자를 발현 플라스미드를 형성시키기 위해 연결시킨 DNA 단편(실시예 16a-c)으로설 분리한다. 0.3pmoles의 p31/PH05―TPA 18의 0.6kb BamH I-Hga I 단편 및 0.3pmoles의 pML의 0.2kb Hga I―BamH I 단편을 10μl의 60mM 트리스 HCl pH 7.5 10mM MaCl2,5mM DTT, 1mM ATP 및 400단위의 T4DNA 리가제중 15℃에서 20시간 동안 pJDB 207R/PH05―TPA(12-2)의 0.1pmoles의 6.8kb BamH I 단편에 연결시킨다.
1μl 분취량의 연결 혼합물을 하나한(Hanahan, 상기 인용)에 따라 제조한 100μl의 형질전환에 적합한 이.콜라이 HB101 세포에 가한다. 형질전환 프로토콜은 상기 기재한 문헌의 것을 적용한다. 세포를 50μg/ml의 앰피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트에 놓는다.
24개의 ampR콜로니를 100μg/ml의 앰피실린을 함유하는 LB 배지에서 개별적으로 성장시킨다. 플라스미드 DNA를 제한 엔도뉴클레아제 Pst I으로 절단시킴으로써 삽입물의 크기 및 배양을 분석한다. 정배향의 삽입물을 함유하는 단일 클론을 pJDB 207/PH05―HIR로 명명한다.
[실시예 17]
[사카로마이세스 세레비지애 균주 GRF 18의 형질전환]
플라스미드 pJDB 207/PH05HIR을 힌넨 등(상기 인용)이 기술한 형질전환 프로토콜을 사용하여 사카로 마이세스 세레비지애 균주 GRF 18(α,his3―11,his3―15,leu2―3,leu2―112, canR)로 도입한다. 플라스미드 DNA 5μg을 스페로플라스트 현탁액 100μl에 가하고, 혼합물을 폴리에틸렌 글리콜로 처리한다. 스페로플라스트를 재생 아가 10ml와 혼합하고 로이신이 없는 효모 최소 배지 플레이트상에 도말한다. 형질전환 단인 효모 콜로니를 취하여 로이신 없는 효모 최소 배지에서 성장시킨다. 콜로니를 사카로마이세스 세레비지애 GRF 18/pJDB 207/PH05―HIR로 칭한다.
[실시예 18]
[사카로마이세스 세레비지애 GRF 18/pJDB 207/PH05―HIR의 배양]
사카로마이세스 세레비지애 GRF 18/pJDB 207/PH05―HIR의 세포를 효모 최소 배지(아미노산이 없으며 2% 글루코오즈 및 20mg/l L―히스티딘을 가한 Difco 효모 질소 염기 20ml에서 30℃로 교반하고 세포 밀도 3 S107세포/ml까지 배양한다. 세포를 0.39% NaCL로 세척하고 이어서 저 Pi―최소 배지의 50ml 배양액에 접종한다. 저 Pi―최소 배지는 Difco 효모 질소 염기 배지(아미노산 없이)의 조성에 따라 제조하나 0.03g/l KH2PO4, lg/l KCl, 및 (NH4)2SO4대신에 L―아스파라긴 10g/l, 2% 글루코오즈 및 lg/l―히스티딘을 함유한다. 배양액을 세포 밀도가 4×106세포/ml로 될때까지 접종하고 30℃에서 200revs/분으로 42시간 까지 교반한다.
[실시예 19]
[사카로마이세스 세레비지애 GRF 18/pJDB 207/PH05-HIR로부터 데설페이토히루딘 화합물의 분리]
a) 배양 배지로부터 데설페이토히루딘 화합물 분리
A. RP―C18 컬럼상에서 히루딘 화합물 농축
각각 18시간, 26시간 및 42시간 발효 후, 각각 10ml의 샘플 10개를 배양 배지로부터 취하고, Bond Elut C―18 컬럼(1ml, Analytichem Internaional)상에서 탈염 및 농축시켜 단백질을 농축시킨다. 샘플을 컬럼에 적용하고 액체를 진공중에서 제거한 다음 컬럼을 1.5ml 물―아세토니트릴(9 : 1)-0.1% 트라풀루오로아세트산(9:1)으로 2회 세척한다. 히루딘 화합물을 물―아세토니트릴― 0.1% 트리풀루오로아세트산(6 : 4)으로 컬럼에서 용출시킨다. 2ml 용출액을 Speed Vac 농축기(Savant)에서 농축시켜 최종 용적 400μl로 한다. 히루딘 화합물을 HPLC 분석에 의해 진짜 데설페이토히루딘과 비교하고 트롬빈 억제 측정법에 의해 확인한다. 히루딘 화합물 약 0.2 내지 2μg/ml가 샘플중에 함유되어 있다.
B. DEAE 셀룰로오즈 컬럼상의 이온 교환 크로마토그라피
42시간의 발효 시간후 배양 배지 1ι를 수거하여 원심분리한다. 상등액을 pH 7.5인 DE 셀룰로오즈(Whatman)의 음이온 교환 컬럼에 적용한다[조건 : 컬럼 2.5 ×15.5cm(76ml) ; 용출 완충액 A: 20mM 암모늄 아세테이트, 100mM NaCl, pH 7.5 ; 용출 완충액 B : 20mM 암모늄 아세테이트, 4M NaCl, pH 5.0 ; 유속 : 66ml/시간]. 컬럼을 완충액 A 228ml로 세척하고 이어서 완충액 A 및 완충액 B 각각228ml의 선형 염 구배로 용출시킨다. 분획 22ml를 수거한다. 히루딘 화합물을 분획 71 내지 74(88ml)에서 용출시키고 트롬빈 억제 측정법에 의해 확인한다. 활성 분획을 4℃에서 20mM 암모늄 아세테이트에 대해 밤새 투석시킨다. 이어서 분취량을 2회 동결건조한다. 동결건조물은 역상 HPLC에 의하면 데설페이토히루딘 화합물을 함유한다.
C. 세파덱스 G―50 상에서의 겔 여과 및 HPLC에 의한 최종 정체
트롬빈 억제 시험에서 활성이 있는 주요 분획(용출액 80ml)을 20mM 암모늄 아세테이트 pH7.5에 대해 4℃에서 밤새 투석하고, 35℃에서 회전 증발기를 사용하여 최종 용적 5ml로 농축한다.
생성된 맑은 수용액을 베드 용적이 160ml이고, 컬럼(2.5×64cm, Biorad)을 5% 아세트산으로 미리 평형화한 세파덱스 G-50 미세 컬럼(Pharmacia)에 적용한다.
용출액(분획 5―7, 유속 50ml/시간, 25분/분획) 50ml에 함유되어 있는 주요 활성물을 회전 증발기를 사용하여 농축하고 이어서 역상 HPLC 분리시킨다.
개개의 분획 분취량(500μl)을 "Speed Vac" 농축기(Savant)를 사용하여 1 : 10으로 농축하고 역상 HPLC 분석에 의해 데설페이토 히루딘 화합물의 함량을 시험한다. 용액은 데설페이토히루딘 화합물을 함유하고 있다.
분획 6(18ml)는 제 2 성분을 극소량 함유하고 있으며 반제조식 역상 HPLC로 또한 정제한다.
실험 조건 : Vydac 218 TP 510 RP―HPLC 컬럼, 10×250mm ; 정제당 분획 6의 분취부(1 : 10 농도 200μl) ; 220nm에서 AUFS 0.5 ; 유속 : 2ml/분, 용출액 : A:0.1% 트리플루오로아세트산, B : 아세토니트릴/물 8 : 2+0.07% 트리플루오로아세트산, 1분. 16% B, 이어서 40분에 걸쳐 64% B로 증가. 생성된 분획들을 물로 1 : 1 희석하고 동결건조한다. 잔여물은 순수한 데설페이토히루딘 화합물로 이루어져 있다.
b) 사카로마이세스 세레비지애 GRF 18/pJDB 207/PH05―HIR의 세포 추출물로부터 데설페이토히루딘 화합물의 분리
세포는 통상적으로 파쇄한다(참조 : 유렵 특허원 제100,561호). 2% 아세트산으로 처리한 상등액을 원심분리한다(12,000rpm, 10℃). 암모니아를 최종 pH 7.5로 가하고 약간 불투명한 용액(50ml)을 또한 상기와 같이 처리한다(참조 : 실시예 19a). 히루딘 화합물을 상기와 같이, 즉 트롬빈 억제 측정 및 역상 HPLC로 확인한다.
[실시예 20]
[사카로마이세스 세레비지애 GRF 18/pJDB 207/PHO5―HIR의 발효물로부터 생성혼함물의 분석
a) 상기와 같이(실시예 19b 참조) 제조한 상등액 2ml 분취량을 고도의 진공하에 "Speed Vac" 농축기상에서 건조한다. 샘플을 각각 물 100μl에 용해하고 HPLC 분석한다(하기 실험조건 1번 참조). 각 분획의 트롬빈 억제도록 시험한다. 잔류시간 16.5 및 17.7분의 분획이 트롬빈 억제성을 보인다. 이들 2분획의 비율(발현 수율)은 약 4 : 1이다. 아미노산 조성에 따르면 이들 분획은 데설페렌히루딘이다.
b) 실시예 19a에 기술한 바와 같이 수득한 트롬빈 억제 시험에서의 활성 분획을 2가지 상이한 일련의 조건하에서 HPLC 분석한다.
―실험 조건 1번 : 뉴클레오실(MN) C18, 5μm RP―HPLC 컬럼, 4.6 ×120mm : 정제당 50μl 히루딘 화합물, 214mm에서 att. 6; 유속 1.2ml/분 ; 용출액 : A: 0.1% 트리플루오로아세트산, B: 아세토니트릴/물 8: 2(0.08% 트리플루오로아세트산 함유), 2분 16% B, 이어서 50분에 걸쳐 64% B로 증가. 상대압력 : 66바아.
―실험 조건 2번 : 상기와 같음. 단 다음은 제외 : 2분 20% B 구배, 이어서 40분에 걸쳐 80% B로 증가. 분획을 1분 간격(총 45)으로 취하고 트롬빈 억제 시험을 한다. 분획 17―19가 활성적임이 입증되었다. 또한 아미노산 조성, N―말단 및 N―말단 서열을 분획 17 및 18의 활성 히루딘 화합물에 대해 측정한다. 하나의 분획(17번)을 또한 거머리로부터의 천연 히루딘을 요소 아릴설파타제와 반응시켜 수득한 진짜 데설페이토히루딘과 비교한다.
결과가 하기 표 1에 수록되어 있다:
[표 1]
분획 17 및 18의 수율상 비율은 역시 4 :1이다.
c) 상기와 같이(실시예 19a 참조) 제조한 상등액의 200ml 분취량을 HPLC 분석(하기 조건 3번 참조) 및 FPLC 분리(조건 4번)한다. 각 분획의 트롬빈 억제도를 시험한다. 잔류시간 8.0분(피크 1), 11.1분(피크 2) 및 12.1분(피크 3)의 분획이 강력한 트롬빈 억제도를 나타낸다. 이들 E가지 화합물의 비율(발현 수율)은 약 1 : 4 : 1이다. HPLC 분석에 따르면 피크 2 및 3에 해당하는 화합물이 실시예 20b에 기술한 히루딘 화합물과 동일하였다(분획 17 및 18).
결과가 표 2에 정리되어 있다.
[표 2]
―실험조건 3번 : Vy dac 218 TP―B5 RP―HPLC 컬럼, 4.0×120mm, 정제당 15μg 히루딘 화합물, 214mm에서 att. 7, 유속 1.2ml/분 ; 용출액 A : 0.1% 트리플루오로아세트산, B : 0.08% 트리플루오로아세트산을 함유하는 아세토니트릴, 2분 16% B, 이어서 20분에 걸쳐 40% B로 증가 ; 배경 압력 80바아.
―실험조건 4번 : Pharmacia Mono Q FPLC 음이온 교환―컬럼, 5.0×50mm, 정제당 15μg 히루딘 화합물 280mm에서 AUFS, 0.01, 유속 1.0ml/분, 구배 용출 완충액 A : 20mM 트리스―HCl pH 7.5, 완충액 B : 완충액 A 및 1M NaCl pH 7.5, 9분 15% B, 이어서 21분에 걸쳐 70% B로 증가.
[실시예 21]
[균주 사카로마이세스 세리비지애 GRF18/pJDB207/PHO5―HIR의 발효물로부터 데설페이토히루딘 화합물의 특성화
HPLC에 따르면 배지로부터 분리한 분획 17(또는 피크 1) 및 18(또는 피크 2)의 히루딘 화합물(실시예 20, 표 1 및 2 참조)은 세포 추출물로부터 분리한 해당 화합물(세포내 히루딘 화합물)과 동일하다. 이들 화합물 및 피크 3의 화합물(표 2 참조)을 하기와 같이 특성 분석한다:
a) 아미노산 조성의 측정
순수한 히루딘 화합물 약 2.5μg을 110℃에서 24시간 동안 가수분해하고 이어서 문헌[참조 : Changet al., Methos in Enzymology 91, 41(1983)]에 기술된 DABS―Cl 법으로 분석한다. 가수분해물은 하기조성을 갖는다 :
[표 1]
[표 2]
[표 3]
b) 부분 서열 분석
순수한 히루딘 화합물 18μg(2.5mmol)을 에드만에 따라 종래의 서열 분석하고 N―말단 페닐 티오하이단토인(PTH)―아미노산을 RP―HPLC에 의해 확인한다.
결과
피크 2(분획 17, 표 1 및 2 참조)
사이클 1 5 10
아미노산 ValVal Tyr Thr Asp n.d. Thr Glu Ser Gly
사이클 11 15
아미노산 Gln Asn Leu n.d. Leu n.d. Glu Gly Ser
사이클 20 25
아미노산 Asn Val n.d. Gly n.d Gly Asn Lys n.d.
사이클 29 35
아미노산 Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn
사이클 38 40 45
아미노산 n.d. n.d. Val Thr Gly Gly Thr Pro Lys
사이클 48 50
아미노산 Pro n.d. Ser n.d
(n.d. =측정치 않음)
피크 1(표 2참조)
상기 사이클 1 내지 29의 서열.
피크 3(분획 18, 표 1 및 2 참조)
상기 사이클 1 내지 27의 서열
시험한 생합성 히루딘 화합물질 N―말단 서열은 진짜 하루딘의 것과 동일한다.
c) C―말단 분석
히루딘 하합물을 가복시펩티다아제 Y로 분해하고 방출된 아마노산을 아미노산 분석리로 확인한다(참조 : J.Y.Chang, R.Knedel. D.G, Braun Biochem. .J.199,547).
결과
피크 1표(표 2 참조)
C-말단 아미노산 : ―Glu―Tyr
피크 2(분획 17, 표1 및 2 참조)
C―말단 아미노산 :―Glu―Tyr―Leu―Gln
피크 3(분획 18, 표 1 및 2 참조)
C―말단 아미노산 : ―Glu―Tyr―Leu
d) 겉보기 분자량
데설페이토히루딘 화합물(30μg)을 SDS 우레아 겔상에서 분석한다[SUDS 겔; 참조 : Kyte et al., Anal. Biochem.133, 515(1983)]. 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염색전에 12% 트리플루오로아세트산으로 고정화한다. 6000 내지 7000달톤 사아의 겉보기 분자량에 상응하는 단일 밴드가 관찰된다.
e) FAB―MS에 의한 분자량 측정
데설페이토히루딘 화합물을 FAB―MS(fast atom bombardment positive ion mass spectrometry)로 측정한다. 장치 : 맨체스터의 VG―Analytical Ltd. 제품인 ZAB―HF 질량 분광계 ; 매트릭스 ; 티오그리세롤 ; Xenon 충격 ; 이온 에너지 10KeV ; 외부 조정 ; Cs26J25(분자량 : 6887.9) 및 Cs28J27(7147.76).
결과
피크 1(표 2 참조)
실험식 : C276H421N77O107S6
분자량(계산치) : 6722.23
분자량(실측치) : 6719.3
피크 2(분획 17, 표 1 및 2 참조)
실험식 : C287H440N80O110S6
분자량(계산치) : 6963.518
분자량(실측치) : 6963.44
분자량은 2개의 상이한 측정치의 평균이다.
피크 3(분획 18, 표 1 및 2 참조)
실험식 : C282H432N78O108S6
분자량(계산치) : 6835.39
분자량(실측치) : 6832.9
상기 자료에 근거하면 피크 1의 화합물은 데설페이토히루딘(1―63)이고, 피크 2의 화합물은 진짜 데설페이토히루딘(1―65)과 동일하며, 피크 3의 화합물은 신규의 데설페이토히루딘(1―64)이다.
f) 인체의 트롬빈―히루딘 해리상수
인체의 트롬빈―데설페이토히루딘 복합체의 해리상수 KD를 문헌[참조 : S. R. Stone and J. Hofsteenge, Biochemistry25,4622-4628(1986)]의 방법에 따라 측정하여 하기 표에 정리하였다. 표는 또한 수득한 3 종류의 데설페이토히루딘의 비활성(ATU/gm로 표현)을 포함하고 있다.
g) 형질전환된 효모로부터 수득한 추가의 데설페이토히루딘
실시예 19에 기술한 바와 같이 발효시키고 정제한 데설페이토히루딘의 혼합물을 더욱 분리하여 상세하게 특성을 분석한다.
Vydac 281 TP 510 RP―HPLC 컬럼상의 반제조적 분리는 상술한 (실시예 21e 참조) 데설페이토히루딘 화합물외에 컬럼으로부터 잔류시간 8.1분을 갖는 데설페이토히루딘―유사화합물을 용출시킨다.
이 물질은 FAB―MS 및, 아미노산 분석, 부분 서열화, 및 C―말단 분석에 의해 특성을 알아낸다.
FAB―MS는 이 물질이 각각 분자량 6429.5 및 6556.8인 두 화합물의 혼합물임을 나타낸다.
아미노산 조성은 다음과 같다.
부분 서열 분석(N―말단)
사이클 1 2 3
아미노산 Vla Vla Tyr
C―말단 분석(실시예 21C 참조)
59 60 61 62
C―말단 아미노산 ―Ile―Pro―Glu―(Glu)
이들 자료에 근거하면 이 혼합물은 데설페이토히루딘(1-61) 및 데설페이토히루틴(1-62)으로 이루어져 있다.
[실시예 22]
[시그널 서열이 없는 데셀페이토히루딘 유전자를 보유하는 효모에서의 데설페이토히루딘 화합물의 발현(제 7 도)
a) pJDB 207 벡터 단편의 분리
플라스미드 pJDB 207R/IF(α―3) (EP 100, 561) 6μg을 제한 엔도뉴클레아제 BamH I 으로 완전히 분해한다. 생성된 DNA 단편(6.85kb 및 1.15kb)을 에탄올로 침전시키고, 50mM 트리스 HCl pH 8.0의400μl에 취한다.
송아지 장내 포스파타제 Boehringer, Mannheim) 4.5 단위를 가한다. 혼합물을 37℃에서 1시간 배양하고, 이어서 포스파타제를 65℃에서 1.5시간동안 가열하여 불활성화시킨다. 용액을 150mM NaCl로 조정하고 미리 10mM 트리스 HCl pH 7.5, 105mM NaCl, 1mM EDTA로 평형화한 DE52(Whatman) 음이온 교환 컬럼(100μl 용적)에 적용한다.
동일한 완충액으로 세척한 후, DNA를 400μl의 1.5M NaCl, 10mM 트리스 HCl pH 7.5, 1mM EDTA로 용출시켜 에탄올로 침전시킨다. 대형 6.85kb BamH I 단편을 트리스―보레이트―EDTA 완충액 pH 8.3 중의 1.2% 아가로오즈 겔상에서 소형 단편으로부터 분리한다.
b) 534bp PHO5 프로모터 단편의 분리
플라스미드 p31/R(EP 100,561) 6μg을 제한 엔도 뉴클레아제 EcoR I 및 Bamh I으로 분해한다. 생성된 3개의 DNA 단편을 트리스―보레이트―EDTA 완충액 pH 8.3 중의 1.2% 아가로오즈 겔상에서 분리한다. 534bp BamH I―EcoR I 단편을 분리한다. 이것은 전사 출발부위를 위시하여PHO5프로모터를 함유한다.
c) 데설페이토히루딘을 코드화하는 서열을 갖는 206bp DNA 단편의 분리
플라스미드 pML 310(실시예 13c 참조) 9μg을 제한 효소 BamH I 및 EcoR I 으로 완전히 분해한다. 생성된 2개의 DNA 단편을 트리스―보레이트―EDTA 완충액 pH 8.3 중 1.2% 아가로오즈 겔상에서 분리하다. 206bp EcoR I―BamH I 단편을 분리한다.
d) DNA 단편의 연결
단락 a―c(상기 참조)에서 언급한 DNA 단편을 아가로오즈 겔 블록으로부터 전기용출에 의해 수득하고, DE 52(Whatman) 음이온 교환기를 통해 정제하며, 에탄올로 침전시키고, H2O에 재현탁 한다.
6.85kb Bamh I 벡테 단편 0.1pmol(0.45㎍), 534bp BamH I―EcoR IPHO5프로모터 단편 0.3pmol(0.1μg) 및 pML310의 206bp EcR I―BamH I 단편 0.25pmol(34ng)을 T4 DNA 리가제(Biolabs) 600 단위를 함유하는 15μl의 60mM 트리스 HCl pH 7.5, 10mM MgCl2, 10mM DTT, 1mM ATP 중에서 15℃로 16시간동안 연결시킨다.
24개의 형질전환된 ampR콜로니를 100μg/ml 앰피실린의 LB 배지에 분리 배양한다. 플라스미드 DNA를 홀롬즈(Holmes, 상기 인용)등의 방법에 따라 분리하고 HindⅢ―EcpR I 이중분해에 의해 분석한다. 약 600bp 대형 EcoR I―HindⅢ 단편의 출현은 관련된 클론에서PHO5프로모터―히루딘 DNA 단편이 벡터상의 전사 정지 시그널에 대해 정배향으로 있음을 가리킨다. 예상한 바와 같이 클론의 약 50%가 정배향의 삽입물을 함유한다.
이들 클론중 하나를 pJDB 207R/PHO5―HIR로 표기한다.
e) 사카로마이세스 세리비지애 GRF 18의 형질전환
사카로마이세스 세리비지애 균주 GRF 18(α, his 3―11, his 3―15, leu 2-3, leu 2―112, canR)을 힌넨(상기 인용)등의 프로토콜에 따라 플라스미드 pJDB 207R/PHO5―HIR로 형질전환시킨다. 로이신이 없는 효모 최소 배지의 아가 플레이트상에서 형질전환된 효모 세포를 선별한다. 형질전환된 효모 콜로니를 분리하고 사카로마이세스 세리비지애 GRF18/pJDB207R/PHO5―HIR로 표기한다.
f) 사카로마이세스 세레비지애 GRF18/pJDB207R/PHO5―HIR의 배양
사카로마이세스 세리비지애 GRF18/pJDB207R/PHO5―HIR의 세포를 효모 최소 배지(아미노산이 없는 Difco 효모 질소 염기에 2% 글루코즈 및 20mg/ιL―히스티딘을 가함) 20ml 중에서 30℃로 교반하고 세포밀도 3×107세포/ml까지 배양한다. 세포를 0.9% NaCl 중에서 세척하고 이어서 저 Pi―최소 배지의 50ml 배양액에 접종한다. 저 Pi―최소 배지는 Difco 효모 질소 염기 배지(아미노산 부재)의 조성에 상응하게 제조하나, 0.03g/KH2PO4, lg/KCl, 및 (NH4)2SO4대신에 10g/ιL―아스파라긴, 2% 글루코즈 및 1g/ιL―히스티딘을 함유한다. 배양액을 세포밀도 4 S106세포/ml까지 접종하고 30℃에서 200revs/분으로 42시간동안 교반한다.
g) 사카로마이세스 세레비지애 GRF18/pJDB207R/PHO5―HIR의 발효물로부터 생성 혼합물의 분석
세포(실시예 22f 참조)는 통상의 방식으로 분리한다(참조 : 유럽 특허원 제100,561호).
1.5% 아세트산으로 처리한 상등액을 원심분리하고 맑은 용액 각각 2ml를 "Speed Vac" 농축기 및 고도의 진공중에서 건조 시킨다. 샘플을 각각 물 100μl에 용해하고 HPLC 분석한다(실시예 20에서와 같은 조건). 각 분획의 트롬빈 억제도를 시험한다. 잔류시간 16.5분의 분획이 트롬빈 억제 활성을 갖는다.
아미노산 조성에 따르면 이 분획이 데설페이토히루딘이다.
HPLC 분석에 의하면 역가는 약10㎍/l 배양육즙이다. 배지에서는 아무런 히루딘 활성이 검출되지 않는다.
부속된 시그널 서열이 없거나 있는 데설페이토히루딘 유전자를 보유하는 효모숙주로부터 수득한 세포내 및 세포의 히루딘 활성의 수율이 표 3에 정리되어 있다.
히루딘 활성은 크롬빈 억제 검정법으로 측정하였다.
[실시예 23]
[PH05 프로모터 결실부의 작제]
[a) Bal31 분해]
제8도에 인용한 PH05의 BamHI-Sal 단편을 함유하는 재조합 파지 mp9 /PH05 Bam-Sal PH05프로모터를 위한 공급원으로 사용한다(참조: 유럽 특허원 제143, 081호).
파지 DNA(RF:복제형)20㎍을 제한 엔도뉴클레아제 Sal I으로 분해하여 약 9kb의 선형DNA를 산출한다. 페놀/클로로포름으로 추출한 DNA를 에탄올로 침전시킨다. DNA를 0.5㎍/mlshd도로 10mM 트리스pH8.0에 재현탁한다.
SalI 절단된 DNA 16㎍을 20mM 트리스 pH 8.0, 199mM NaCl, 12mM MgCl2및 1mM EDTA의 100μl중에서 엑소뉴클레아제 Bal 31(BRL) 2U로 분해한다.
각각 2㎍ DNA 분취량을 30℃에서의 배양 1,2,3,4,5 및 6분 후 회수하고 페놀50μl 및 TNE 60μl와 즉시 혼합한다. 페놀/클로로포름으로의 추출 및 에탄올 침전후, DNA를 10mM트리스 pH8.0중에 100㎍/ml농도로 현탁한다. Bal 31에 의한 엑소뉴클레아제 분해(exonucleoytic)절단의 정도를 분석하기 위해 매시점으로부터 0.5㎍의 DNA를 엔도뉴클리아제 BamH I으로 분해하고 트리스-보레이트완충액 pH8.3(90mM 트리스 HCL pH8.3 90mM 붕산 2.5mM EDTA)중에서 1.5%아가로오즈 겔상에 분석한다. Bal 31분해의 1부당 평균 100bp가 각각의 단편의 말단으로부터 제거된다.
[b) Bal 31 처리한 DNA에 EcoR I링커의 첨가]
EcoR I 링커(5'-GGAATTCC-3', BRL)의 2 A260단위를 10mM 트리스 L pH8 1mM EDTA의 250μl중에 현탁한다. EcoR I 링커 2㎍을 60mM 트리스 pH7.5, 10mM MgCl2, 15mM DDT,10μM ATP 및 T4폴리뉴클레어타이드키나제 (Boechringer) 33U의 75μl중에서 키나제 처리한다. 37℃에서 1시간 후 혼합물을 실온으로 냉각하고 있어서 -20℃로 보관한다.
아닐링된 이본쇄 EcoR I 링커의 평활말단을 Bal 31처리한 DNA 단편에 연결한다. Bal 31 처리한 DNA(실시예 1a참조) 0.5마이크로 그람을 키나제 처리한 EcoR I링커의 50배 과량과 함께 60mM 트리스 pH7.5, 10mM MgCl2, 10mM DTT, 4mM ATP 및 T4 DNA 리가제(Biolabs) 600U의 20μL중에서 실온으로 16시간동안 배양한다. T4 DNA 리가제를 불활성화한 후 (65℃에서 10분)과량의 EcoR I 링커를 50U EcoR I(Boehringer) 50μl 용적으로 절단한다. DNA를 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄옹로 침전시킨 다음 10mM 트리스, 1mM EDTA(=TE)중에 재 현탁한다. 이어서 DNA를 BamH I(Biolabs) 5단위로 절단하고 , 혼합물을 트리스-보레이트 완충액(상기 참조)중에서 1.5% 저용융 아가로오즈 겔(sibma)에 적용한다.
벤드롤 에티듐 브로마이드로 염색하고 366nm의 장파장 UV 빛하에 가시화한다. 약 100bp내지 600bp의 광범위한 확산 밴드형태를 겔 밖으로 절단해내고 DNA룰 하기와같이 추출한다 : 아가로오즈의 조각을 65℃에서 액화시키고 500mM NaCl로 조정하며 20분동안 65℃로 배양한다. 페놀(10mM 트리스 HCL pH7.5, 1mM EDTA, 500mM NaCl로 평형화) 1용적을 가한다. 수성상을 페놀 로 2회 및 클로로포름으로 1회 추출한다. DNA 냉 무수 에탄올 2.5 용적으로 침전시키고 원심분리하여 수거한다. DNA펠렛을 냉 80% 에탄올로 세척하고 진공중에서 건조한다. DNA를 10μl TE에 재현탁한다.
[c) M13 mp 9에 연결]
M13 mp 9이 RF 3㎍을 40μl 용적중에서 EcoR I(Biolabs) 15단위 및 HamH I(Boehringer) 15단위로 분해한다. 페놀 추출 및 에탄올 침전후 DNA를 50μlTE에 재현탁한다. 절단벡터 DNA 5μl(약200㎎)를 상기 샘플(실시예 23b에 기술한 바와 같이 다양한 Bal 31분해에 유도한 DNA단편) 10μl와 혼합하고, 60mM 트리스/HCL pH7.5, 6mM MgCl2, 10mM DTT, 1mM ATP 및 T4DNA 리가제 200U의 존재하에 총 용적 20μl중에서 15시간동안 연결시킨다.
균주 이,콜라이 JM 101이 적절한 세포에의 형질도입은 뉴우 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)가 출판한 문헌["M13 cloning and sequecing system"]에따라 수행한다. 많은 백색 플라그로부터의 파지를 중식시키고 , 제한효소 EcoR I 및 BamH I으로 절단하여 그들의 DNA 삽입물의 크기에 대해 분석한다.
[d) 상거 서열화에 의한 Bal 31 결실 말단점의 측정(Sal I 부위로부터 결실)]
상술한 문헌에 기술한 바와 같이 상거 등[참조: Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 5463(1977)]의 디데옥시 DNA 서열화 시스템을 사용하여 서열화 한다. 결실 말단점은 하기와 같다.
[e)상거 서열화에 의한 Bal 31결실 말단점의 측정(BamH I 부위로부터 결실)]
유사한 일련의 Bal 31결실을 M13 mp9 PH05 Bam-Sal을 BamH I으로 절단하는 것외에 ,a-c에서 기술한 바와 같이 수행한다. Bal 31분해한 분자를 EcoR I 및 Sal I으로 절단하고 생성된 단편을 EcoR I 및 Sal I으로 분해한 M13 mp 9으로 클로닝한다.
결실 말단점은 하기와 같다.
[f) 내부 PH05프로모터 결실물의 작제]
d)에서 기술한 Bal 31 결실 세트는EcoR I 부위로 끝나는" 좌지 (lift arm)" PH05프로모터 단편을 제공하고 e)에서 기술한 Bal 31결실 세트는 EcoR I부위로 끝나는 "우지(right arm)"PH05 프로모터 단편을 제공한다. 여러 위치의 "좌지" 및 "우지"의 조합에 의해 결실된 DNA의 부위에 EcoR I 링커 절편을 함유하는 내부 결실물을 제조한다. 제한효소 EcoR I 및 BamH I(좌지) 또는 Ecor I 및 Sal I(우지)에 의해 M13 mp 9 유도체로부터 "좌지","우지"를 절단하고, b)에서 기술한 연성 아가로오즈 겔 전기연동을 통해 상응하는 단편을 분리함으로써 각각의 내부 결실물을 작제한다. "좌지", "우지" 의 동몰량 및 BamH I 및 Sal I 분해한 M13 mp9 벡터 DNA 200ng을 c)에서 기술한 바와 같이 연결한다.
이.콜라이 JM101로 형질도입한 후 백색 플라그를 취하여 RF를 생성시키고 제한효소 분석(BamH I, Sal I, EcoR I)에 의해 분석한다.
하기 암(arms)을 조합하여 특수한 내부 결실물을 제조한다,뉴클레오타이드 번호에 대해서는 제8도를 참조하라)
[g) PH05프로모터의 내부 결실물의 생체내 분석]
실시예 23f)에 기술한 여러 가지 결시물을, 야생형PH05 Bam-Sal단편을 결실된 부분으로 대치함으로서 플라스미드 pJDB 207/PH05[참조 :R. Haguenauer-Tsapia and A. Hinnen, Molocular and Cellular Biology, 4, 2668-2675(1984)]에 클로닝한다. 효모 균주 사카로마이세스 세레비지애 AH216(참조 : 유럽특허원 제 143,081호)의 형질전환 후, 산 포스파타제 활성을 문헌[참조 : Toh-e et al. J. Bacteriol. 113,727(1973)]에 기술된 바와 같이 측정한다
결실△1l 및 △12는 PH05 활성 약 10배 감소를 나타내며, PH05 발현시 필수적인 상부 영역("상부 활성 부위", USA)을 규정하고 있다. 유사한 하향효과가 결실△17(약5배 감소) 및 TATA 박스 결실물 △23-△26(약30배 감소)에 대해 관찰된다. 모든 그 밖의 결실물은 거의 야생형 수준의 활성을 보인다.
이 결과는 PH05발현시 필수적인 정보의 세 지역의 하기 위치에 있음을 가리킨다.
1. 위치-349 및 -383 사이(UAS 1)
2. 위치-225 및 -263 사이(UAS 2)
3. 위치- 87 및 -125 사이(TATA 박스)
PH05의 UAS 1또는 UAS 2또는 UAS1과 UAS2를 함유하는 DNA 단편은 적합한 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 재조합 파지 M13 mp 9/PH05 Bam-Sal(상기 참조)로부터 제조할 수 있다.
UAS 1은 하기 서열의 268bp BamH I-Cla I 단편중에 포함된다.
UAS2는 하기 서열의 100bp Cla I- BstEⅡ 단편중에 포함된다.
UAS 1 및 UAS2는 하기서열의 368bp BamH I-BstE Ⅱ 단편에 존재한다.
[실시예 24]
[융합된 PH05-GAPDH 하이브리드 프로모터의 조절하에 데설페이토히루딘의 발현]
실시예 23은 조절기능을 갖는 USA일수 있는 위치-365 주위의 영역[USA 1(PH05)] 및 위치-180 주위의 영역[UAS 2(PH05)]를 제공한다.
UAS 1(PH05)는 268bp BamH I-Cla I 단편을 함유하는 반면UAS 1(PH05) 및 UAS 2(PH05) 모두는 368bp BamH I-BstE Ⅱ단편을 함유한다.
이들 두가지 단편은 각각 TATA 박스와 GAPDH의 전사 개시 부위를 포함하는 두 개의 서로다른 GAPDH 하부의 프로모터 성분에 융합된다.
[a) 효모 유전자 라이브러리의 작제]
야생형 사카로마이세스 세레비지애 균주 S228C로부터 총 고분자량의 효모 DNA[M.V. Olsen et al. J. Mol. Biol. 132, 387(1979)] 30㎍을 제조회사가 지시한대로 250μl의 EcoR I 메틸화 완충액중에서 37℃에서 30분간 2단위의 EcoR I 메틸라제(New England Biolabs)와 함께 배양시킨다. 에탄올로 DNA를 침전시키고 500μl의 25mM 트리스 HCL pH8.5, 2mM MgCl2(EcoR I*완충액)[참조 : H. Meyer, FEBS Lett. 90, 341(1979)]에 재 현탁시키고 DNA 단편의 크기 분포가 최대 30내지 50kb 범위(λDNA의 Xho I 분해로 약 33kb 및 17kb 표지물을 제공함)일 때까지EcoR I(Boehringer)로 분해시킨다.
Eco R I 조건하에 분해된 효모DNA는 수크로우즈 구배(10mM 트리스 HCL pH 7.5중 5내지 20% 수크로오즈)로 38,000rpm의 SW40 회전자에서 6시간 동안 크기 분획화시킨다.
구배의 상단부에서부터 각 0.4ml씩 30개의 분획을 수집한다. 16번 분획은 30내지 40kb 크기의 DNA단편을 함유한다. 상기의 분획의 DNA(3㎍)를 에탄올 침전시키고 총 부피 15μl중 15℃에서 16시간동안, EcoR I에 의해 선형화된 1㎍의 코스미드 벡터 pYc1에 연결시킨다.[참조 : B. Hohn et al. in "Genntic Engineering", Vol. 2, p 169, New York 1980]연결은 공급자에 의해 설명된 완충 시스템을 사용하여 300U T4 DNA리가제(New England Biolabs)로 수행한다. 시험관내에서 DNA를 박테리오파지 λ에 넣고 [참조 :B. Hohn in "Methods in Enzymology", Vol 68, p299, New York 1979], 조합한 파지를 이.콜라이 균주 HB 101(rk-, mk-, pro-, recA)에 형질유입시키는데 사용한다.
형질유입효율은 pYc1벡터 1㎍당 약 5000앰피실린-내성 콜로니이다.
3000개의 ampR콜로니를 떼어 ,100㎍/ml 앰피실린을 함유하는 LB 배지[10g 박토-트립톤(Difco), 5g 박토 효모 추출물(Difco), 10g NaCl]중 미세 역가 접시의 웰에서 각각 성장 시킨다
[b) 효모 GAPDH 유전자의 분리]
상기에 기술된 유전자의 라이므러리를 서열 5'-GCTCCATCTTCCACCGC CCC-3'의 합성 올리고뉴클레오타이드[포스포트리 에스테르 방법으로제조 : K. Itatura et al J. Am. Chem. Soc. 97.7377(1975); J. F. M. de. Rooij et al., Recl. Trav. Chim Pays-Bas 98.537(1979)]로 스크리닝한다. 10㎍의 올리고뉴클레오타이드를 문헌[참조; Maniatis et al "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Lab., 1982.페이지125]에 기재된 바와 같이 50μl의 총용적 중 10μl의 r-32p-ATP(3000Ci/mmol, 10μCi/μl Amercham)을 사용하여 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제(Boehringer)로 키나제 처리한다. 코로니 하이브리드화는 상기하 동일한 저자에 의해 기재된 바와 같이 수행단다(312 페이지 양성)
콜로니를 코닥X-5 X-레이 필름을 사용하여 방사성 사진 측정에 의해 검출한다. 플라스미드 DNA를 분리하여 GAPDH를 코드화하는 2100bp HindⅢ 단편을 함유하는 하이브리드 클론을 산출한다[참조 :J. P. Holland et al., J. Biol. Chem. 254, 9839(19790]. 클로닝된 DNA의 최종확인은 이본쇄 DNA에 대한 지.에프. 홍[참조 ;G. F. Hong, Bioscience Reports 1, 243(1981)]이 기술한 디데옥시 서열화 프로토콜에 따라 상기언급한 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 DNA 서열화 실험으로 증명된다.
클로닝된 유전자(제9도 참조)는 홀랜드 (Holland)등에 의해 발표된 pgap 491과 같은 서열을 갖는다.[참조 : J. Biol. Chem. 225, 2596(1980)].
[c) GAPDH 하부 프로모터 성분의 제조(제10도참조)]
GAPDH 유전자 (제9도 참조)의 ATG로부터 -27네서 -675위치를 포함하는 649bp Taq I(New England Biolabs)을 상기 언급한 하이브리드 플라스미드를 Taq I으로 절단하고 1,2%의 연성 아가로오즈 겔 상에 DNA단편을 분리하고 뜨거운 페놀로 DNA를 추출하여 (실시예 23참조)분리한다. Taq I 단편의 클로닝은 pBR 322의 Cla I 부위에 행해지는데 :1Mg의 pBR 322를 공급자의 설명에 따라 3단위의 Cla I(New England Biolabs)로 절단한다.
300ng의 페놀화되고 절단된 벡터를 총20μl의 용적중 200U의 T4 DNA 리가제를 사용하여 약 300ng의 삽입 DNA(649bp Taq 단편)에 연결시킨다.(실시예23b)참조).
형질지전환은 앰피실린 내성인 이.콜라이 HB 101에서 수행하며, 플라스미드 DNA를 제조하고, 제한 분석[Taq I, Dra I]에 의해 분석한다.
Taq I 단편의 배향은 플라스미드의 BamH I부위와 함께 제한 엔도뉴클레아제 Dra I을 사용하여 확인하고 -675위치의 Taq I 부위가 pBR 322의 HindⅢ에 근접한 플라스미드를 선택한다.
pBR 322/GAPDH로 나타낸 상기 플라스미드는 BamH I(New England Biolabs)를 사용하셔 선형화 하고, Bal 31을 사용하는 분해는 BgⅡ 링커 C5'-CAGAT CTG -3', New England Biolabs)가 사용되는 이외에는 실시예 23의 방법대로 수행하며, 분해된 플라스미드는 총 20μl의 용적중 5㎍/ml의 농도에서 직접 환상화한다. Bal 31로 단축시킨 Taq1 단편의 크기는 제한 분석으로 측정한다(Bgl Ⅱ 및 HindⅢ사용). GAPDH 프로모터에 ATG 상부로부터 약 200bp 및 265bp 연장된 DNA 단편을 갖는 두 개의 클론을 선택한다. 두 단편은 모두 약 -140bp에 예상 TATA 박스를 함유한다. 이 클론은 또한 pBR322에서 유도된 부분에 복제 기원을 함유하는데, 각각 pGAPDH-F 및 pGAPDH-E로 명명한다.
[d)PH05의 UAS 1(PH05)를 갖는 하부 GAPDH 성분과 데설페이토 히루딘의 단백질 코드화 영역의 조합]
[I) GAPDH 성분]
GAPDH 유전자의 ATG에 바로 인접한 위치에 -27위치의 Taq I 부위로부터 GAPDH 프로모터 성분을 연장시키기위해 다음 서열의 합성 올리고뉴클레오타이드를 합성한다.
상기의 올리고뉴클레오타이드는 말단의 EcoR I 부위를 생성시킴과 함께 -26내지 -5위치의 순수한 GAPDH 프로모터 서열을 제공한다. 실시예 24c로부터의 2개의 Bal 31분리물 2㎍(PGAPDH-E 및 -F)를 50μl중 6단위의 Taq I 분해하고 생성된 혼합물을 페놀화시키고 , 에탄올 침전시킨 다음 10μl의 물에 재현탁시킨다. 합성 올리고뉴클레오 타이드를 10mM 트리드 HCL pH 7.5, 10mM MgCl2, 50mM NaCl을 함유하는 용액100μl중에서 2μl의 각 일본쇄를 혼합시키고 3분간 90℃로 가열한 다음 이 용액을 실온까지 서서히 냉각시킴(약 3시간 이내)으로서 아닐링시킨다. Taq I 분해된 플라스미드 각 1㎍을 800U의 T4 DNA 리가제를 사용하여 약18시간동안 20μl의 용적 중 약 20몰배 과량의 아닐링된 올리고뉴클레오타이드와 혼합한다. 총 혼합물을 3단위의 BglⅡ(New England Biolabs)로 분해 시킨다. DNA 단편을 1.5%연성 아가로오즈겔 상에서 분리한다.
각 약 200bp 및 265bp의 BalⅡ 및 EcoR I 단편을 겔로부터 잘라내어 추출하고 에탄올 침전시킨다,
플라스미드 pGAPDH-E를 BglⅡ 및 EcoR I 로 분해하고 큰(약3.5kb) 단편을 분리한다. 이 단편을 벡터로 사용하고, 전술한 영결, 형질전환 및 플라스미드 분리조건을 사용하여 265bp 및 200bp BalⅡ-EcoR I 단편을 클로닝한다. 생성된 플라스미드를 pGAPDH-EL 및 pGAPDH-FL로 명명한다.
pGAPDH-EL 및 pGAPDH-FL로 클로닝된 BglⅡ-EcoR I 단편의 DNA 서열은 제11도에 나타내었다.
단편의 정확한 크기는 각각266bp 및 201bp이다.
[Ⅱ) UAS 1(PH05) 조절성분]
3㎍의 플라슴미드 p31/Y(유럽 특허원 제100,501호 참조)를 6단위의 Cla I(New England Biolabs)로 분해한다.
3'-접착 말단(reccesed emds)을 마니아티스(상기 인용)에따라 이.콜라이 DNA폴리머라제 I(Bethesda Research Lababoratories)의 클레노우 단편과 함께 반응시켜 채운다.
Bgl Ⅱ링커(5'-CAGATCTG-3')를 실시예 23에서와 같이 가한다. DNA를 Sal I 및 Bgl Ⅱ(New England Biolabs)로 분해하고 1% 연성 아가로즈겔 상에서 분리한다. 전술한 바와같이 548bp 단편을 겔로부터 잘라내어 페놀 처리하고 에탄올 침전시킨다.
[Ⅲ)데설페이토히루딘을 코드화하는 DNA]
폴라스미드 pJDB 207(PH05(Eco)-HIR(제12도 참조)의 작제. PH05 시그널 서열(플라스미드 pJDB 207/PH05-HIR 내의)를 포함하는 데설페이토히루딘의 코드화 영역에 UAS(PH05)-GAPDH 하이브리드 프로모터 성분을 결합시키기위해 EcoR I 제한 부위를 mRNA 출발부위 및 코드화 영역의 ATG 사이의 5'비해독 영역에 도입시킨다. 15㎍의 플라스미드 pJDB 207/PHO5-HIR(실시예 16d 참조)을 제한 엔도뉴클레아제 Dra I (Boehringer)로 분해된다..
4단면을 트리스-보레이트 EDTA 완충액 pH 8.35 아가로오즈 겔 상에서 분리한다.
4.2kb DNA 단편을 겔로부터 회수하고 전기용출시키고 에탄올로 침전 시킨다.
DNA를 H2O에 0.6mg/ml의 농도로 재 현탁시킨다.
다음구조식의 합성 올리고뉴클레오타이드(각각 2.3㎍ 및 2.9㎍)을 각각 20μl의 60mM 트리스 pH7.5 10mM MgCl2, 5mM DTT, 0.5mM ATP 및 20U의 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제 (Boehringer)중에서 키나제 차리한다.
37℃에서 45분 후 두 반응 혼합물을 혼합하고 75℃로 10분간 가열한 다음 실온까지 냉각시킨다. 아닐링된 올리고뉴클레오타이드 링커를 -20℃에서 보관한다.
6.5㎍(2.3pmoles)의 4.2kb Dral I DNA 단편을 50μl의 60mM 트리스 pH7.5, 10mM MgCl2, 5mM DTT, 3.5mM ATP 및 800U의 T4 DNA 리가제(Biolabs) 중에 70배 과량의 키나제 처리되고 아닐링된 올리고뉴클레오타이드 링커와 함게 15℃에서 16시간동안 배양한다. 85℃에서 10분동안 T4 DNA 리가제를 불활성화한 후 10mM EDTA, 300mM 나트륨-아세테이트 pH6.0 및 0.54용적의 이소프로판올의 존재하에 DNA를 침전시켜 과량의 링커를 제거한다. 이 DNA를 EcoR I 및 HindⅢ로 분해한다. 생성되는 단편을 트리스-보레이트 -EDTA 완충액 pH 8.3중의 1% 아가오즈 갤 상에서 분리한다. 643bp 단편을 전기용출 및 에탄올 침전에 의해 겔로부터 회수한다.
DNA를 0.1pmoles/μl의 농도로 재현탁시킨다. EcoR I-HindⅢ 단편은 PH05 시그널 서열 데설페이토히루딘의 코드화 서열 및 PH05 전사 터미네이터를 함유한다.
534bp PH05프로모터 단편을 플라스미드 p31/R로부터 분리한다. (유럽 특허원 제100,561호).
10㎍의 p31/R을 제한 효소 EcoR I 및 BamH I으로 분해시킨다. 생성되는 3단편을 트리스-보레이트-EDTA 완충액pH8.3중 0.6% 저 용융 아가로오즈겔 상에서 분리한다. mRNA 출발 부위를 함유하는 PH05 프로모터를 함유하는 534bp BamH I-EcoR 단편을 분리한다.
벡터 단편을 플라스미드 pJDB 207/PH05-HIR(실시예 16d 참조)로부터 분리한다. 6㎍으 상기 플라스미드를 BamH I 및 HindⅢ로 분해한다.
트리스-보레이트-EDTA 완충액 pH8.3중 0.6%저용융 아가로오즈 겔 상에서 대형 6.5kb BamH I-HindⅢ 단편을 소형 단편들로부터 분리한다.
점성 말단을 갖는 상기의 3개의 DNA 단편을 다음의 반응으로 연결시킨다.: 0.2pmoles(70ng)의 534bp BamH I-EcoR I PH05 프로모터 단편, 0.2pmoles (85ng)의 643bp EcoR I -단편(히루딘 코드화 서열) 및 0.1pmole(0.4㎍)의 6.5kb BamH I -HindⅢ 벡터단편을 15℃에서 6시간동안 10μl의 60mM 트리스 pH 7.5 10mM 트리스 7.5, 10mM MgCl2, 5mM DTT 1mM ATP 및 400U의 T4리가제 중에서 연결시킨다. 1μl분취량의 연결 혼합물을 100μl의 칼슘 처리돈 형질 저노한 가능한 이.콜라이 HBI이 세포에 가한다.
12개의 형질전환된 ampR콜로니를 각각 100㎍/ml의 엠피실린을 함유하는 LB배지에서 성장시킨다. 플라스미드 DNA를 홀름즈 등의 방법[참조 ; Anal. Bioche.114(1981) 193]에 다라 제조하고 EcoR I 및 BamH I 제한 분해에 의해 분석한다. 기대하는 제한단편을 갖는 하나의 클론을 분리하여 pJDB 207/PH05(Eco)-HIR로 명명한다.
[Ⅳ) 데설페이토히루딘의 단백질 코드화 영역에 (UAS 1(PH05)-GAPDH 하이브리드 프로모터의 연결 15㎍의 플라스미드 pJDB 207/PH05(Eco)-HIR(실시예 24Ⅲ 참조) 에 EcoR I 및 HindⅢ로 분해 한다.
DNA단편을 트리스-보레이트 EDTA완충액 pH8.3중1% 아가로오스 겔상에서 분리한다. 643p 단편을 겔로부터 분리하고 전기용출하여 에탄올로 침전시킨다.
DNA를 0.1pmoles/μl의 농도로 H2O에 재현탁시킨다.
6㎍의 플라스미드 pJDB 207/PH05-HIR을 제한효소 HindⅢ 및 Sal I으로 완전히 분해한다. 큰 6.3kb단편(벡터부의)를 연성 아가로오즈겔 전기영동, 페놀추출 및 에탄올 침전으로 분리한다. 벡터 DNA 단편을 0.05pmoles/μl의 농도로 H2O에 재현탁시킨다.
10㎍의 플라스미드 pGAPDH-EL(실시예 24dI 참조)를 Bgl Ⅱ 및 EcoR I으로 분해한다. 266bp Bgl Ⅱ-EcoR I 단편을 트리스-보레이트-EDTA 완충액 pH8.3중 1.2% 아가로오즈겔 상에서 분리하고 겔로부터 전기용출시키고 에탄올로 침전시킨다
DNA를 0.3pmoles/μl의 농도를 H2O에 재현탁시킨다.
0.3moles의 UAS1(PH05)를 함유하는 548bp Sal I-BglⅡ단편(실시예 24dⅡ), 0.3pmoles의 pGAPDH-EL의 266bp Bal Ⅱ-EcoR I 단편0.3pmoles의 pJDB 207/PH05(Eco)-HIR의 643bp EcoRi-HindⅢ 단편 및 0.12pmoles의 6.3kb Sal I -HindⅢ 벡터 단편을 20μl의 60mM 트리스pH7.5, 10mM MgCl2. 5mM DTT 1mM ATP 및 400U의 T4 DNA 리가제(Biolabs) 중에서 15℃로 6시간동안 연결시킨다. 연결 혼합물 1μl 분취량 및 3μl 분취량을 칼슘 처리한 이.콜라이 HB101 세포 100μL에 가한다. ampR콜로니로부터 플라스미드에 분리 및 Sal I, Bgl Ⅱ, EcoR I 및 Hind Ⅲ를 사용하는 제한 분석은 전술한 바와 같이 수행한다(실시예 24d Ⅲ 참조).
하나의 양성 콜로니를 선택하여 pJDB 207/PAPEL -HIR(UAS1)으로 명명한다.
pGAPDH-FL로부터 분리된 201bp Bgl Ⅱ-EcoR I 단편으로 유시한 작제를 수행한다. 하나의 선택된 플라스미드를 pJDB 207/PAPFL -HIR(UAS1)으로 명명한다.
[Ⅴ) 데설페이토히루딘의 단백질 코드화 영역에 UAS1(PH05)-UAS2(PH05)-GAPDH 하이브리드 프로모터의 연결]
각각 3㎍의 플라스미드pJDB 207/.PAPEL-HIR(UAS1) 및 pJDB 207/ PAPFL-HIR(UAS1)을 BglⅡ 로 분해한다. 페놀 추출 및 에탄올 침전후, DNA의 3'점성 말단을 마니아티스의 방법(상기 인용)에 따라 이.콜라이 DNA 폴리머라제(클레노우 단편 : Bethesda Research Laboratories)와 반응시켜 채운다. 70℃에서 10분간 효소를 불활성화시킨다.
Sal I으로 DNA를 더 분해하고 연성 아가로오즈겔 전기영동, 페놀 추출 및 에탄올 침전에 의해 대형 7.2kb 단편을 분리한다. 각 단편을 0.05pmoles/μl의 농도로 H2O에 재현탁시킨다. 이 단편은 히루딘 코드화영역 대부분의 벡터 서열 및 pGAPDH-EL 또는 pGAPDH-FL로부터 분리된 두가지 서로다른 GAPDH 프로모터 성분중 하나를 함유한다,
플라스미드 p31/y(유럽 특허원 제 100,561호)를 BstEⅡ로 분해시키고 전술한 바와 같이 이.콜라이 DNA 폴리머라제(클레노우 단편)와 함께 배양한 다음 Sal I으로 절단한다. 649bp 단편을 연성 아가로오즈겔 상에서 분리시키고 페놀추출 및 에탄올 침전으로 회수한다.
UAS1-UAS2(PH05)프로모터성분을 함유하는 649bp단편 0.3pmoles과 0.15pmoles의 7.2kb 단편중 하나를 연결시키고 전술한 바와 같이 이 콜라이 HB 101에 형질전환시킨다. 플라스미드는 ampR콜로니로부터 제조되며 제한 분해에 의해 분석한다. 단일클론을 선택하고 이의 플라스미드 DNA를 pJDB 207/PAPEL-HIR (UAS1+UAS2) 및 pJDB 207/PAPFL-HIR(UAS1+UAS2)로 명명한다.
[실시예 25]
데설페이토히루딘의 단백질 코드화 서열에 융합된 프로모터 성분
상기한 길이의 2가지 GAPDH 프로모토 성분(실시예 24d I 에 기술)을 PH05 시그널을 포함한 데설페이토히루딘의 단백질 코드화영역에 연결한다.
두성분(각각 266bp 및 201bp)은 GAPDH TATA 박스,mRNA 출발부위 및 AT가 풍부한 5'비해독영역을 포함한다. 두 성분의 뉴클레오타이드 서열이 제10도에 있다.
이들 성분위 3' 말단은 둘다 EcoR I 인지 부위가 뒤따르는 GAPDH 유전자의 ATG로부터 위치-5에 있는 (실시예24d I에서 소개한 올리고뉴클레오타이드 링커 참조), 5' 말단은 이 위치에 첨가한 BglⅡ링커의 ATG로부터 각각위치 -198 및 -263에 있다.
BglⅡ-EcoR I 프로모터 단편을 PH 05시그널서열 및 데설페이토히루딘을 코드화하는 서열의 EcoR I-HindⅢ 단편 및 HindⅢ-BamH I 벡터단편에 연결시킨다.
플라스미드 pJDB 207/PH05-HIR 6㎍을 제한 엔도뉴클레이제 HindⅢ 및 BamH I으로 완전히 분해한다.
대형 6.5kg 단편(벡터 부분)을 트리스-보레이트-EDTA 완충액 pH8.3중의 0.8% 아가로오즈 겔상에서 분리하고 겔로부터 전기 용출시키며, 페놀추출하고 에탄올 침전시킨다. 벡터 DNA단편을 H2O에 0.05pmoles/μl 농도로 재현탁 한다.
PGAPDH-EL의 266bp BglⅡ-EcoR I 단편(실시예24dIV) 0.3pmoles, pJDB 207/PH05(Eco)-HIR의 634bp EcoR I-HindⅢ 단편(실시예 24dIⅡ) 0.3pmoles 및 6.5kb HindⅢ-BamH I벡터 단편 0.1pmoles를 10μl의 60mM 트리스 pH7.5, 10mM MgCl2, 5mM DTT, 1mM ATP 및 400U의 T4 DNA리가제(Biolabs) 중에서 15℃로 6시간동안 연결한다. 연결혼합물 1μl를 칼슘처리한 이 콜라이 HB 101세포 100μl에 가한다.
ampR콜로니로부터 플라스미드 분리 및 EcoR I으로 제한 분석을 실시예24d Ⅲ에 기술한 바와 같이 수행한다. 하나의 양성 클론을 선별한다. 이 플라스미드 DNA를 pJDB 207/GAPEL-HIR 이라 칭한다.
유사한 작제를 pGAPDH-FL로부터 분리한 201bp BglⅡ-EcoR I단편으로 수행한다. 하나의 선택 클론의 플라스미드 DNA를 pJDB 207/GAPFL-HIR이라 명명한다.
[실시예26]
분비되는 데설페이토히루딘을 코드화하는 서열의 직렬 삽입물을 갖는 발현 플라스미드의 작제(제14도 참조)
하기 작제물은 직렬식의 헤드에서 테일 배열로 중복된 DNA 단편을 함유한다.
중복된 단편은 GAPDH프로모터 또는 하이므리드 PH05-GAPDH 프로모터(각각 실시예24 및 25에 기술), PH05 시그널 서열, 데설페이토히루딘의 코드화 서열 및 PH05 전사터미네이터를 함유한다.
플라스미드 pJDB 207/GAPEL-HIR 7㎍을 제한 엔도뉴클레아제 HindⅢ로 분해 한다. 3' 접착성 말단을 마나아티스(상기 인용)에따라 이.콜라이 DNA 폴리머라제 I(클레노우단편 : (Bethesda Research Laboratory)과의 반응으로 채운다.
Sal I 링커5'-GGTCGACC-3'(Biolabs) 1.85㎍을 50μl의 60mM 트리스 pH 7.5, 10mM MgCl2, 5mM DTT, 0.5mM ATP 및 50U의 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제(Boehringer) 중에서 키나제 처리한다.
37℃에서 45분 후 혼합물을 75℃로 10분 가열하고 실온에서 냉각한다.
HindⅢ 부위를 평활 말단으로 전환시킨 선형화 플라스미드 pJDB 207/ GAPEL-HIR 7㎍(1.5pmoles)을 키나제 처리하고 아닐링시킨 Sal 링커의 80배 과량과 함께 30μl의 60mM 트리스 pH 7.5,10mM MgCl2, 5mM DTT, 3.5mM ATP 및 800U T4 DNA 리가제(Biolabs) 중에서 15℃로 16시간 배양한다.
75℃로 10분 가열하고 T4 DNA 리가제를 불활성화 시킨 후 10mM EDTA, 30mM 나트륨 아세테이트pH 6.0 및 이소프로판올 0.54용적의 존재하에 DNA를 침전시켜 과량의 링커를 제거한다. DNA를 Sal I으로 분해한다.
생성된 단편을 트리스-보레이트-EDTA완충액 pH 8.3중 1% 아가로오즈 겔상에서 분리한다.
1,1kb Sal I 단편을 겔로부터 전기 용출, 페놀 추출 및 에탄올 침전에 의해 회수한다. DNA를 0.1pmoles/μl 농도로 재현탁한다.
플라스미드pJDB 207.GAPEL-HIR 5㎍을 Sal I으로 완전히 분해한다. 페놀 추출 및 에탄올 침전후 DNA를 100μl의 50mM 트리스 pH8.0에 재현탁시킨다.
송아지 장내 알카리성 포스파티제(Boehringer) 46U를 가한다.
37℃에서 1시간후 포스타아제를 100mM NaCl,5mM EDTA 및 0.5% SDS의 존재하에 65℃로 15분 가열하여 불활성화시킨다.
DNA 용액을 10mM 트리스 pH7.5, 150mM NaCl 및 1mM EDTA로 평활화한 DE 52(Whatman) 음이온 교환기 100μl베드에 적용한다. 컬럼을 동일한 완충액으로 세척후 DNA를 400μl의 1.5m NaCl, 10mM 트리스 pH7.5, 1mM EDTA로 용출시키고 에탄올로 침전시킨다. 선형화된 플라스미드를 트리스-아세테이트 완충액 중의 0.6% 아가로오즈겔상에서 비절단 DNA로부터 분리한다.
선형 7.3kb DNA 단편을 겔로부터 회수하고 전기용출시키며, 페놀추출, 에탄올침전하고 , 0.1pmoles/μl의 농도로 재현탁한다.
1.1kb Sal I 단편 0.2pmoles 및 선형화 벡터 0.1pmoles를 10μl의 60mM 트리스 pH 7.5, 10mM MgCl2, 5mM DTT, 1mM ATP 및 200U의 T4 DNA 리가제 중에서 15℃로 16시간동안 연결시킨다. 연결 혼합물 1μl 분취량을 100μl의 칼슘 처리한 형질전환 가능한 이.콜라이 HB 101 세포에 가한다.
24개의 형질전환된 ampR콜로니를 앰피실린 100㎍/ml 함유하는 LB 배지에서 각각 증식시킨다. 플라스미드 DNA를 홀름즈등[참조 :Anal. Bio chem. 114(1981) 193]의 방법에 따라 제조하고 EcoR I 제한분해로 분석한다.
예상 제한단편을 가진 한개의 클론을 분리하여 pJDB 207/[GAPEL-HIR]D로 칭한다. 유사한 작제를 플라스미드 pJDB 207/GAPFL-HIR 및 pJDB 207/ PAPFL/HIR(UAS1+UAS2)로 수행한다. 각각 선택한 하나의 클론의 생성 플라스미드 DAN를 pJDB 207/[GAPFL-HIR]D 및 pJDB 207/[PAPFL-HIR(UAS1+UAS2)] D라 명명한다.
[실시예 27]
분리되는 데설페이토히루딘 코드화 서열의 4개 삽입물을 갖는 발현 플라스미드의 작제
GAPDH-프로모터,PHO5 시그널 서열, 데설페이토히루딘의 코드화 서열 및 PHO5 전사 터미네이터를 함유하는 DNA 단편의 4복사물을 효모 발현 벡터 중에 직렬식의 헤드에서 테일 배열로 삽입한다.
플라스미드 pJDB 207/[GAPFL-HIR]D(실시예 26참조) 10μg을 Sal I으로 분해한다. 생성된 선형 단편의 점성 말단을 마니아티스 등(상기 인용)에 따라 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I (클레노우 단편, BRL)과 반응시켜 채운다. Hindlll 링커[5'CAAGCTTG-3',Biolabs] 0.94㎍ 키나제 처리하고, 자기-아닐링시키며, Sal I 부위를 평활 말단으로 전환시킨 선형 플라스미드 pJDB 207/[GAPFL-HIR]D(상기 참조)에 연결시킨다. 링커 연결 및 이소프로판을 침전은 실시예 26에 기술한 바와같다. 이어서 DNA를 Hind Ⅲ로 절단하고 생성된 2.2Kb단편을 전기용출, 페놀추출 및 에탄올 침전으로 분리한다. DNA를 0.1pmoles/μl 농도로 재현탁한다.
플라스미드 pJDB 207[GAPFL-HIR]D 5㎍ D을 Hindlll로 완전히 분해한다. DNA를 실시예 26에 기술한 바와같이 송아지 장내 알칼리성 포스파타제(Boehinger)로 탈인산화하고, DE 52이온 교환 크로마토그라피로 정제하며, 전기용출에 의해 0.6% 아가로즈 겔로부터 분리한다.
2.2kb Hindlll 단편 0.2pmoles 및 선형 벡터 0.1pmoles를 연결시킨다(상기인용). 연결 혼합물 1μ1 분취량을 칼슘처리한, 형질전환가능한 이. 콜라이 HB 101세포 100μ1에 가한다.
12개의 형질전환된 ampR콜로니를 앰피실린 100㎍/ml를 함유하는 LB배지에서 증식시킨다. 플라스미드 DNA를 제조하고 Sal I,Xba I;Ava I,Xba I 2중 분해 및 BamH I 분해로 분석한다. 1.1kb BamH I -연결 단편은 삽입물이 플라스미드상의 2개의 복사물에 대해 헤드에서 테일 배열로 존재함을 가리킨다. 삽입물이 이러한 배열로된 클론 하나를 pJDB 207/[GAPFL-HIR]T로 칭한다.
[실시예 28]
PH05프로모터, 인버타제 시그널 서열 및 데설페이토히루딘 코드화 영역을 함유하는 효모 발현 벡터의 작제
A) 인버타제 시그널 서열에 올리고데옥시리보뉴플레오타이드의 합성 :
4가지 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 : I-1, I-2, I-3 및 I-4를 DNA 합성기(MODEL 380B Applied Biosystems)로 합성한다. 탈보호시킨 후, 합성 단편을 8M 요소를 함유하는 12% 폴리아크릴아미드 겔상에서 정제한다. Sep.pak(Waters Ass oociates)를 사용하여 염이 없는 순수한 올리고데옥시리보뉴클레오타이드를 수득한다. 상기 단편은 자주 사용되는 효모 코돈을 갖는 인버타제 시그널 서열을 코드화하는 이본쇄를 구성한다.
B) 인버타제 시그널 서열의 서부클로닝
a) 백터의 제조
1.5㎍의 p31R/SS-TRA 2(유럽 특허원 제143,081호 참조)를 50㎍의 10mM 트리스 HCL pH 7.5, 6mM Mgcl2,100mM Nacl, 6mM 머캅토 에탈올 중에서 1시간 동안 37℃에서 10U의 EcoRI(Boehringer)로 분해한다. 1μl의 2.5M Nacl을 가한후, 10U의 Xhol(Boehringer)을 가하고 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 4.2kb 벡터를 0.8% 제조 아가로오즈 겔상에서 분리한다. 겔 조작을 마이크로 콜로이더 튜브(Micro colloidor tube ; Sartorius GmbH)로 이동시키고, 200μl의 TE로 덮은 다음 전기용출(90mA에서 50분간 전기 영동)시킨다. TE 용액을 수거하여 0.1용적의 10x TNE를 가한후 2.5용적의 무수 에탄올 중에서 침전시킨다. DNA 펠렛을 냉 80% 에탄올로 세척하고 진공중에서 건조시킨다. DNA를 6μl TE(40pmoles/μl)에 재현탁한다.
b) 올리고데옥시리보뉴클레오타이드(I-1, I-2, I-3, I-4)아닐링, 키나제 처리 및 벡터와 연결
10μl의 0.5트리스 HCL pH 8중의 4가지 데옥시리보뉴클레오타이드 각각 10pmoles을 함유하는 용액을 수욕에서 5분간 95℃로 배양한다. 수욕을 5시간 동안 서서히 30℃까지 냉각시킨다. 상기의 아닐링된 용액에 0.1M Mgcl20.1M Nacl, 30mmM DTT, 40mM APT 및 8U(1μl)의 폴리뉴플레오타이드 키나제(Boehringer)의 각 2μl를 가한다. 키나제 처리는 37℃에서 1시간 동안 수행한다. 아닐링하고 키나제 처리한 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 및 60pmoles의 EcoRI-XhoI 절단 백터(1.5μl)를 14℃에서 17시간동안 400U(1μ1)의 T4 DNA 리가제(Biolabs)로 연결시킨다. 65℃에서 10분간 배양하여 반응을 종결시킨다. 상기 연결 혼합물 10μl로 이 콜라이 HB101 Ca++ 세포를 형질 전환시킨다[참조:M.Dagert and D.S. Ehrlich, Gene 56, 23-28(1979)]. 20개의 ampR콜로니를 선택한다. DNA를 빠른 분리 공정에 의해 제조한다[참조:D.S.Holmes and M.Quigley.Anal.Biochem. 114, 193-197(1981)]. DNA를 EcoRI 및 Xhol으로 분해하고, EcoRI 말단에서 방사능 표지한 다음 표지물로서 방사능 표지된 pBR322 HaeIII 절단 DNA를 사용하여 8M 우레아를 함유하는 6% 폴리아크릴아미드 겔상에서 분석한다. 정확한 크기의 밴드가 모든 20개의 클론으로 부터 수득되는 DNA에서 관찰된다. 한 클론을 100㎍/ml의 엠피실질을 함유하는 100ml LB 배지에서 성장시킨다. 폴라스미드 DNA를 분리하여 p31 RIT-12로 칭한다.
C) GAPFL 프로모터 성분을 인버터제 시그널 서열에 연결:
폴라스미드 p31 RIT-12 5㎍을 Sal I 및 EcoRI으로 완전히 분해한다. 대형 3.3kb SalI-EcoRI 단편을 트리스-아세테이트 완충액 pH 8.2중 0.6% 아가로오즈 겔상에 분리한다. DNA를 겔로부터 전기용출시키고, 페놀 침전 및 에탄올 침전시킨다. 폴라스미드 pJDB 207/GAFL-HIR(실시예 25 참조) 10㎍을 Sall 및 EcoRI으로 분해한다. 477bp Sall-EcoRI 단편을 트리스-보레이드-EDTA 완충액 pH 8.3중 0.8% 아가로오즈 겔상에 분리한다. DNA를 전기용출, 페놀 추출 및 에탄올 침전시킨다. 2개의 분리된 DNA단편을 연결시킨다. 연결 혼합물의 분취량을 사용하여 적절한 이. 콜라이 HB101 세포를 형질전환시킨다. AmpR클로니를 증식시키고 폴라스미드 DNA를 Hindlll, sall 2중 분해에 의해 분석한다. 정확한 삽입을 갖는 폴라스미드를 p31/GAFL-IT라 명명한다.
D) 플라스미드 pJDB207/GAPFL-I-HIR의 작제(제15도참조)-플라스미드 p31/GAPFL-IT 25㎍을 PstI 및 Sall으로 완전히 분해한다. 생성된 676bp 단편을 트리스-보레이트-EDTA 완충액 pH 8.3중의 10% 제조 아가로오즈 겔 상에서 분리한다. DNA를 전기용출시키고, DE 52 이온 교환 크로마토그라피로 정제하며, 에탄올 침전시키고, HgaI 분해를 위해 추전되는 완충액에 0.1㎍/μ1 농도로 재현탁한다. SalI-PstI DNA 단편을 0.5 단위/㎍ DNA의 존재하에 37℃로 60분 동안 HgaI으로 부분 분해한다. EDTA를 최종 농도 10mM 로 가하여 반응을 정지시킨다. 534bp SalI-HgaI 단편을 1% 제조 아가로오즈 겔상에서 분리한다. DNA를 겔로부터 용출시키며, DE 52 크로마토그라피로 정제하고, 에탄올 침전시켜 H2O에 약 0.1pmoles/μ1 농도로 재현탁한다.
플라스미드 pJDB207/PH05-HIR(실시예 16 참조) 10㎍을 Bal I 및 HindIII로 분해한다. 생성된 587bp Bal I-HindII 단편을 제조 1% 아가로오즈 겔상에 분리한다. DNA를 전기용출하고, 에탄올 침전 및 Hinf I 으로 분해한다.
하기의 올리고데옥시뉴클레오타이드 각각 1.3㎍(160pmoles)을 실시예 24dIII에 기술한 바와 같이 키나제처리하고 아닐링시킨다.
5'-CTGCAGTTGTTTACACCGACTGCACCG-3'
3'-CAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTA-5'
Hindf I 분해시킨 Bal I-HindIII 단편(상기 참조) 0.6㎍(1.6moles) 및 키나제 처리 및 아닐링시킨 링커 160pmoles를 83μl의 10mM 트리스-HC1 pH 7.5, 10mM MgC12, 5mM DTT, 3.5mM ATP 및 400단위의 T4 DNA 리가제중에서 15℃로 16시간 동안 연결시킨다. 85℃에서 10분후, 과량의 링커를 DNA의 이소프로판올 침전에 의해 제거한다(실시예 24dIII 참조). 584bp Hga I-HindIII 단편을 1% 제조 아가로오즈 겔상에 분리한다. 용출 및 정제, 에탄올 침전시킨 DNA를 H2O에 0.1pmoles/μl 농도로 재현탁한다.
pJDB207/PH05-HIR 5㎍을 HindIII 및 SalI으로 분해하고 대형, 6.2kb 단편을 분리한다.
534bp SalI-HgaI 단편 0.2pmoles, 584bp HgaI-HindIII 단편 0.2pmoles 및 6.2kb Sal I-HindIII벡터 단편 0.1pmoles를 10μl의 10mM 트리스. HC1 pH 7.5, 10mM MgC12, 5mM DTT, 1mM ATP 및 400단위의 T4 DNA 리가제중에서 15℃로 5시간 동안 연결시킨다. 연결 혼합물 1μ1 분취량을 사용하여 적절한 이. 콜라이 HB101 세포를 형질전환시킨다.
24개의 형질전환된 앰피실린 내성 콜로니를 엠피실린 100㎍/ml를 함유하는 LB 배지중에서 각각 증식시킨다. 플라스미드 DNA를 제조하고 HindIII, Sal I 2중 분해에 의해 분석한다. 올바른 제한 양식을 갖는 단일 클론을 분리하여 pJDB 207/GAPFLI-HIR으로 칭한다. 인버타제 시그널 서열의 확인 및 히루딘 코드화 서열과의 올바른 융합의 확인은 뉴클레오타이드 서열화로 수행한다.
실시예 29
a) 사카로마이세스 세레비지애 GRF18의 형질전환:
사카로마이세스 세레비지애 균주 GRF18(α, his 3-11, his 3-15, leu 2-3, leu 2-112, canR)을 힌넨등에 의해 기술된 형질전환 프로토콜을 사용하여 다음의 플라스미드로 형질 전환시킨다[참조 : Proc.Nat1.Acad.Sci.USA 75 1929(1978)].
pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1),
pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1),
pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1+UAS2),
pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1+UAS2),
pJDB207/GAPEL-HIR,
pJDB207/GAPFL-HIR,
pJDB207/[GAPEL-HIR]D,
pJDB207/[GAPFL-HIR]D,
pJDB207/[PAPEL-HIR(UAS1+UAS2]D,
pJDB207/[GAPFL-HIR]T,
pJDB207/GAPFL-I-HIR
형질전환된 효모 세포를 로이신이 결핍된 효모 최소 배지에서 선별한다. 단일 형질전환된 효모 콜로니를 분리하여 다음과 같이 명명한다.
사카로마이세스 세레비지애 GRF18/pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1),
사카로마이세스 세레비지애 GRF18/pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1),
사카로마이세스 세레비지애 GRF18/pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1+UAS2),
사카로마이세스 세레비지애 GRF18/pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1+UAS2),
사카로마이세스 세레비지애 GRF18/pJDB207/GAPEL-HIR,
사카로마이세스 세레비지애 GRF18/pJDB207/GAPFL-HIR,
사카로마이세스 세레비지애 GRF18/pJDB207/[GAPEL-HIR]D,
사카로마이세스 세레비지애 GRF18/pJDB207/[GAPFL-HIR]D,
사카로마이세스 세레비지애GRF18/pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1+UAS2)] D,
사카로마이세스 세레비지애 GRF18/pJDB207/[GAPFL-HIR]T,
사카로마이세스 세레비지애 GRF18/pJDB207/GAPFL-I-HIR.
b) 형질전환체의 발효
사카로마이세스 세레비지애 GRF 18 형질전환체의 세포를 30℃에서 24시간 동안 진탕시키며, 50ml들이 삼각 플라스크중에서 3×107세포/ml의 밀도가 될때까지 10ml의 효모 최소 배지(아미노산이 없는 Difco 효모 질소 배지에 2% 글리코즈 및 200㎎/ℓ L-히스티딘을 가함)에서 성장시킨다. 하이브리드 PHO5-GAPDH 프로모터를 갖는 플라스미드를 함유하는 효모 형질전환체는 데설페이토히루딘의 발현을 위해 프로모티의 탈억제가 필요하다. 세포를 0.9% NaC1로 세척하고, 0.03ｇ/l KH2PO4, (NH4)2SO4대신에 L-아스파라긴 1ｇ/ℓ, 2% 글루코오즈 및 1ｇ/ℓ L-히스티딘을 함유하는 Difco 효모 질소 염기 배지(아미노산부재)의 처방에 따라 제조한 50ml의 저 pi 최소 배지에 접종시킨다. 배양액을 4×106세포/ml의 세포 밀도가 될때까지 접종시키고, 30℃에서 24시간까지 200rev/분으로 교반한다. 최종 밀도 1×108세포/ml가 수득된다.
GAPDH 프로모터를 갖는 플라스미드를 함유하는 효모 형질전환체는 구성적으로 데셀페이토히루딘을 발현시킨다. 세포를 펩톤(5ｇ/l), 효모 추출물(10), 글루코오즈(20), 수크로오즈(40), 황산암모늄(3), KH2PO4(2), MｇSO4(0.5), NaC1(0.1), CaC12(0.1), 비오틴(10㎍/l)을 함유하는 복합배지에서 증식시킨다. 약 1.109세포/ml를 30℃ 및 200rev/분에서 48시간 배양후에 수득한다.
몇몇 대표적 형질전환 효모 균주에 의해 분비된 데설페이토히루딘의 양(트롬빈 억제 검정에 의해 측정)이 하기 표에 정리되어 있다.
[표 1]
또한 효모 형질전환체에 의해 발현된 데설페이토히루딘 화합물 90%이상이 배양 배지에 분비되는 것으로 측정되었다. 수거 시간에 따른 배양 육즙 및 세포내 데설페이토히루딘의 배분을 측정하기 위해 3l MBR 생물반응기(MBR Bioreactor AG, Wetzikon, 스위스연방)에서 발효시켰다. 균주 사카로마이세스 세레비지애 GRF 18/pJDB 207/GAPFL-HIR을 3l 복합 배지(상기 참조)에 접종하고 500rev/분의 교반비와 200ℓ/시간의 통기율로 30℃에서 배양하였다. 최종 밀도 5×109세포/ ml로 배양한다. 샘플은 각각 18,24 및 42시간에 취하고, 배양 육즙 및 세포내(파괴후, 실시예 22 참조) 데셀페이토히루딘의 양을 트롬빈 억제 검정 및 HPLC에 의해 측정한다.
[표 2]
실시예 30
형질전환체의 300ℓ 규모 배양
a) 접종 사이클
다수의 사면 아가를 균주 사카로마이세스 세레비지애 GRF 18/pJDB 207/GAPFL-HIR 세포를 함유하는 냉동 앰플로 접종한다. 하나 또는 그 이상의 사면 아가를 25-30℃에서 3-5일 동안 배양한다. 단일 사면 아가의 함유물을 수류 방지 장치가 없이 예비 배양 배지 100ml를 함유하는 단일 500ml 삼각 플라스크에 무균적으로 접종한다. 플라스크를 250r.p.m.에서 동작 거리 50mm의 회전 진탕기상에서 배양 온도 28℃로 48시간 동안 진탕시킨다. 48시간후 이들 플라스크(제1예비 배양물)의 함량 2%(V/V)를 예비 배양 배지 600ml 함유하는 2ℓ삼각 플라스크에 무균적으로 접종한다. 이들 플라스크(제2예비 배양물)를 120r.p.m. 및 50mm 동작 거리의 회전 진탕기상에서 28℃로 진탕시킨다. 제2예비 배양 플라스크중 한개의 함유물(2%V/V)을 예비 배양 배지 30ℓ를 함유하는 50ℓ 스테인레스 스틸 발효조(공장 예비 배양)에 무균적으로 유입한다. 공장 예비 배양을 위한 발효 조건은 다음과 같다:600r.p.m,(단일 6날 터빈 교반기, 115mm 직경), 4수류 방지 장치; 헤드 압력:0.3바아; 매분 배지의 ℓ당 공기 1ℓ의 통기, 온도 28℃, 48시간 동안.
아가 배지 및 예비 배양 배지는 아가의 존재 유무를 제외하고는 동일하다. 동일한 예비 배양 배지를 예비 배양 단계에 사용한다.
예비 배양 배지의 조성(ｇ/ℓ):
효모 질소 염기(Difco) 8.4
L-아스파라긴 H2O 11.6
L-히스티딘 1.0
글루코오즈(별도로 멸균) 2.0
아가 배지의 조성:
동일한 예비 배양 배지+20ｇ 아가/ℓ.
b) 생산 발효(300ℓ 규모)
증식시킨 공장 예비 배양물 5%(V/V, 15ℓ)를 멸균 발효 생산 배지 300ℓ를 함유하는 600ℓ 발효조에 무균적으로 도입한다. 300ℓ 생산 배지의 발효 조건은 다음과 같다:450r.p.m.(단일 6날 교반기, 직경 230nm) ; 4수류 방지 장치; 헤드 압력:0.3바아; 공기-처리:0-9시간; 매분 배지 ℓ당 공기 0.25ℓ, 9시간 수거:매분 배지 ℓ당 공기 1ℓ; 온도:28℃, 24-48시간 동안, OD60015-20. 수율:15-25mg/ℓ(시험 방법 : HPLC 및 트롬빈 시험).
생산 배지의 조성(g/ℓ) :
펩톤 5
효모 추출물 10
수크로오즈 40
(NH4)2SO46
MgSO4·7H2O 1
NaC1 0.1
KH2PO42
CaC1·2H2O 0.013
멸균전의 pH∼6.0
소포제:UCON LB 625 필요
[실시예 31]
300ℓ 배양 육즙으로부터 데설페이토히루딘의 분리
pH 3.3인 배양 육즙(실시예 30 참조)를 17℃로 냉각한다. Westfalia SA-14 탈-슬러지(de-Sludging)장치(400-600ℓ/시간)에 의해 세포를 분리한다. 걸쭉한 슬러지를 제거한다. 약간 탁한 상등액을 일련의 Skan 여과 카르투쉬(Cartouches)를 통해 여과하고(첫번째:구경 5㎛; 두번째:구경 1㎛; 세번째:구경 0.22㎛), NaOH로 pH 7.5에 조정하며, DEAE 음이온 교환 컬럼에 적용한다. 컬럼을 나트륨 아세테이트(20mM, pH4.5)로 세척하고, 나트륨 아세테이트(20mM, pH 3.1)로 용출시킨다. 용액(15ℓ)를 NaOH로 pH 7.5에 조정하고 순환 증발기에서 최종 용적 1.8ℓ로 농축시킨다. 1ℓ 분취량을 세파덱스 G-25 컬럼(베드 용적:8ℓ;컬럼은 물로 평형화)에 적용한다. 데설페이토히루딘을 함유하는 분획을 HPLC로 확인한다. 데설페이토히루딘 분획(2.5ℓ)을 고도의 진공하에서 농축하여(rotavap으로) 최종 용적 200ml로 하고 동결 건조한다.
미가공 물질의 분취량(2g)을 물 50ml에 용해하고 NaOH로 pH 7.5에 조정하며 Q 세파로오즈 고속 컬럼(베드 용적:200ml)에 적용한다. 컬럼을 암모늄 포르메이트(100mM, pH 3.9)로 세척한다. 25ml 분획을 취하여 HPLC로 데설페이토히루딘 시험을 한다. 데설페이토히루딘을 함유하는 분획(1-65)을 모아서(125ml) 고도의 진공하에 농축하여(rotavap으로)최종 용적 10ml로 한다. 농축된 용액을 세파덱스 G-25 컬럼(Amicon, 컬럼은 물로 평형화)에 적용하여 탈염시킨다. 수득한 맑은 용액(25ml)을 동결 건조한다. 생성된 고체는 순수한 데설페이토히루딘의로 이루어져 있다.
[실시예 32]
플라스미드 pJDB 207/PHO5-EGL의 작제 :
유럽 특허원 제146,785호에 기술된 바와 같이, 거머리로부터의 70개 아미노산의 폴리펩타이드, 에글린 C를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열을 시험관내 합성하고 서브클로닝하며 이 콜라이에서 발현시킨다. PHO5 시그널 펩타이드를 코드화하는 서열에 대한 에글린 코드화 서열의 정확한 프레임 융합은 실시예 15및 16에서 히루딘에 대해 기술한 바와 거의 유사한 방법으로 수행한다. 벡터에 삽입물이 정배향으로 있는 단일 클론을 pJDB 207/PHO5-EGL이라 칭한다. 사카로마이세스 세레비지애 균주 GRF 18을 통상적으로 형질전환시킨다. 형질전환체를 실시예 29에 기술한 바와 같이 선별하고 배양한다. 에글린 C가 배양 육즙에서 전혀 검출되지 않는다.
Claims (29)
- 각각 진핵 발현 조절 서열, 판독 프레임의 상부 및 판독 프레임 중에 존재하는 시그널 펩타이드를 코드화하는 제1 DNA 서열과 성숙 데설페이토히루딘을 코드화하는 제 2DNA 서열로 이루어진 DNA 단편(이DNA 단편은 상기 발현 조절 서열의 전사 조절하에 있다), 및 진핵 전사 종결 시그널을 함유하는 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 DNA 삽입물을 갖는 하이브리드 벡터로 형질전환된 진핵 숙주 유기체를 적절한 영양 조건하에서 배양하고, 배양 배지로부터 하루딘 활성을 갖는 단백질을 분리하고, 필요한 경우, 임의로 세포 내부로부터 세포 연관된, 히루딘 활성을 갖는 추가의 단백질을 분리시키고, 필요한 경우, 생성된 히루딘 활성을 갖는 단백질을 히루딘 활성을 갖는 상이한 단백질로 전화시킴을 특징으로 하여 히루딘 활성을 갖는 단백직을 제조하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 제2 DNA 서열이 데설페이토히루딘 변종 HV1을 코드화함을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 제2 DNA 서열이 데설페이토히루딘 변종 HV2를 코드화함을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제2 DNA 서열이 데스-(Val)2-데설페이토히루딘을 코드화함을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제2 DNA 서열이 데설페이토히루딘 변종 PA를 코드화함을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 숙주가 포유동물 세포주 및 효모로 이루어진 그룹중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 숙주가 효모임을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 발현 조절 서열이, 포유동물 숙주에서 사용하기 위해, 바이러스로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 발현 조절 서열이, 효모 숙주에서 사용하기 위해, 효모의 게놈 DNA로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
- 제9항에 있어서, 발현 조절 서열이 효모 GAPDH 및 PHO5 유전자의 프로모터들로 이루어진 그룹중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
- 제9항에 있어서, 발현 조절 서열이 상부에는 하나의 효모 유전자의 활성화 서열 및 하부에는 다른 효모 유전자의 작용성 TATA 박스를 포함하는 프로모터 성분을 함유하는 하이브리드 프로모터임을 특징으로 하는 방법.
- 제9항에 있어서, 발현 조절 서열이 상부에는 효모 PHO5 유전자의 활성화 부위(들) 및 하부에는 효모 GAPDH 유전자의 TATA 박스를 포함하는 프로모터 성분을 함유하는 하이브리드 프로모터임을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 시그널 펩타이드를 코드화하는 DNA 서열이 효모 인버타제, a-인자, α-인자, 페로몬 펩티다아제, “킬러 독소”및 억제 가능한 산 포스파타제 (PHO5) 유전자의 시그널 서열 및 아스러질러스 아와모리(Aspergillus awamori)로부터의 글리코아밀라아제 시그널 서열로 이루어진 그룹중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
- 제13항에 있어서, 시그널 펩타이드를 코드화하는 DNA 서열이 효모 PHO5 및 인버타제 유전자의 시그널 서열들로 이루어진 그룹중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 진핵 전사 종결 시그널을 함유하는 서열이 사용된 발현 조절 서열에 자연적으로 연결된 유전자의 서열임을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 각각 PHO5 프로모터, 판독 프레임을 상부 및 판독 프레임 중에 존재하는 PHO5 시그널 서열과 성숙 데설페이토히루딘을 코드화하는 DNA 서열로 이루어진 DNA 단편(이 DNA 단편은 PHO5 프로모터의 전사 조절하에 있다), 및 PHO5 유전자의 3´플랭킹 서열을 포함하는 하나 이상의 DNA 삽입물을 갖는 하이브리드 벡터로 형질전환된 효모가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 각각 GAPDH 프로모터, 판독 프레임의 상부 및 판독 프레임 중에 존재하는 PHO5 시그널 서열과 성숙 데설페이토히루딘을 코드화하는 DNA 서열로 이루어진 DNA 단편(이 DNA 단편은 GAPDH 프로모터의 전사 조절하에 있다), 및 PHO5 유전자의 3´플랭킹 서열을 포함하는 하나 이상의 DNA 삽입물을 갖는 하이브리드 벡터로 형질전환된 효모가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 각각 상부에는 효모 PHO5 유전자의 활성화 부위(들) 및 하부에는 효모 GAPDH 유전자의 TATA 박스를 포함하는 프로모터 성분을 함유하는 하이브리드 프로모터, 판독 프레임의 상부 및 판독 프레임 중에 존재하는 PHO5 시그널 서열과 성숙 데설페이토히루딘을 코드화하는 DNA 서열로 이루어진 DNA 단편(이 DNA 단편은 하이브리드 프로모터의 전사 조절하에 있다), 및 PHO5 유전자의 3´플랭킹 서열을 포함하는 하나 이상의 DNA 삽입물을 갖는 하니브리드 벡터로 형질전환된 효모가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 각각 PHO5 프로모터, 판독 프레임의 상부 및 판독 프레임 중에 존재하는 인버타제 시그널 서열과 성숙 데설페토히루딘을 코드화하는 DNA 서열로 이루어진 DNA 단편(이 DNA 단편은 PHO5 프로모터의 전사 조절하에 있다), 및 PHO5 유전자의 3´플랭킹 서열을 포함하는 하나 이상의 DNA 삽입물을 갖는 하이브리드 벡터로 형질전환된 효모가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 하이브리드 벡터가 하나의 DNA 삽입물을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 하이브리드 벡터가 2내지 4개의 DNA 삽입물을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 하이브리드 벡터가 2개의 DNA 삽입물을 직렬로 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 하기 서열을 갖는 데스-(Leu64, Glu65)-데설페이토히루딘 변종 HV1을 제조하는 방법.Val Val Tyr Thr Asp Cys Thy Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys Val Thr Giy Giu Giy Thr Pro Lys Pro Gin Ser His Asn Asp Giy Asp Phe Giu Gir Ile Pro Gir Glu Tyr
- 제1항에 있어서, 하기 서열을 갖는 -(Gln65)데설페이토히루딘 변종 HV1을 제조하는 방법.Val Val Tyu Ghr Asp Cys Thr Glu Ser Giy Gln Asn Leu Cys Leu Cys Giu Giy Ser Asn Val Cys Gly Gin Gly Asn Lys Cys Ile Leu Giy Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Ler
- 제1항에 있어서, 하기 서열을 갖는 데서페이토히루딘 변종 HV1을 제조하는 방법.Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Clu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Gly Lys Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln
- 제1항에 있어서, 하기 서열을 갖는 데설페이토히루딘 변종 HV2를 제조하는 방법.Ile Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln
- 제1항에 있어서, 하기 서열을 갖는 데설페이토히루딘 변종 PA를 제조하는 방법.Ile Tyr Thr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Gln Gly Lys Asp Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser His Asn Gln Gly Asp Phe Glu Pro Ile Pro Glu Asp Ala Tyr Asp Glu
- 제1항에 있어서, 데스-(Val)2-데설페이토히루딘을 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서, 수득된 데설페이토히루딘 화합물을 황상염 및 티로신 설포트란그퍼라제와 반응시켜 상응하는 히루딘 화합물을 수득함을 특징으로 하는 방법.
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