DE3486452T2 - Superoxiddismutase und deren Expression in Mikroorganismen - Google Patents

Superoxiddismutase und deren Expression in Mikroorganismen

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Description

  • Gegenstand der Erfindung sind Vektoren zur Expression der Superoxiddismutase.
  • Die Superoxiddismutase ("SOD") ist in Wirklichkeit eine Verschiedenheit von verschiedenen Enzymen, die in den meisten lebenden Organismen gefunden werden. Eine Funktion in Säugern ist die Zerstörung von Superoxid, ein Stoff, der natur licherweise während der Phagocytose entsteht. Superoxiddismutasen werden, basierend auf der Metall, welches mit der Enzym assoziiert vorliegt, wobei die Metalle unter Eisen, Mangan, Kupfer und Kupfer-Zink variieren, in Familien charakterisiert. Superoxiddismutase z.B. aus Rinderleher hat klinische Verwendung gefunden, insuesondere als ein antiinflammatorisches Mittel in Säugern einschließlich des Menschen Andere Nutzen schließen das Einfangen von Superoxidanionen ein, welche als Folge der Exposition des Wirtes mit verschiedenen Superoxidinduzierenden Verbindungen, wie z.B. Bestrahlung, Paraquat etc., entstehen; Prophylaxe oder Therapie für verschiedene degenerative Erkranungen, z.B. Emphysem; Nahrungskonservierung; und dgl.
  • Es ist daher wichtig, daß eine stabile Bereitstellung von physiologisch annehmbarer Superoxiddismutase verfügbar gemacht wird, insbesondere fur eine in vivo-Verwendeng als ein antiinflammatorisches Mittel oder for andere therapeutische Zwecke. Für menschliche Anwendung wäre es vorzuziehen, das homologe Enzym zu verwenden, un mögliche Immunantworten zu verhindern oder zu minimieren. Bei Verwendung von rekombinanten DNA- Techniken besteht die Möglichkeit, Produkte, die die gewünschten biologischen Aktivitäten der Superoxiddismutase, wie z.B. immunologische und enzymatische Aktivitäten, haben, effizient zu produzieren.
    • Beschreibung des Standes der Technik
  • Die Aminosäuresequenz der menschlichen Erythrocyten Cu-Zn-Superoxiddismutase wird in Jabusch et al., Biochemistry (1980) 19:2310-2316 und Barra et al., FEBS Letters (1980) 120:53-55, beschrieben. Die Rindererythrocyten Cu-Zn-SOD wird von Steinman et al., J. Biol. Chem. (1974) 249: 7326-7338, beschrieben. Ein SOD-1 cDNA-Clon wird von Lieman-Hurwitz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79: 2808-2811, beschrieben. Betreffend des Effektes auf die Translationseffizienz durch Variieren der nichttranslatierten Region stromaufwärts vom Intitiationscodon siehe Gheysen et al., Gene (1982) 17:55-63; Thummel et al., J. Virol. (1981) 37:683-697; und Matteucci und Heyneker, Nucl. Acids Res. (1983) 11:3113- 3121.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Eine effiziente Bildung von Polypeptiden, die die biologische Aktivität von humaner Cu-Zn-Superoxiddismutase zeigen, wird durch die Herstellung einer cDNA des größten Teiles des Strukturgens, das mit einem Gemisch von Adaptoren verbunden wird, die sich von der ribosomalen Bindungsstelle an erstrecken, un Nucleotide in der codierenden Region zu degenerieren, und durch die Insertion des vollständigen Gens mit seinen Translationssignalen in einen Expressionsvektor gezeigt. Die Transformation von Mikroorganismen führt zu einer effizienten Bildung eines kompetenten Polypeptids, das die biologische Aktivität der humanen Cu-Zn-Superoxiddismutase zeigt. Das Gen kann weiterhin fur die Kombination mit sekretorischen und Prozessierungssignalen zur Sekretion in einem geeigneten Wirt verwendet werden.
  • Es werden neue Protokolle zum Steigern der Expression eines Polypeptids bereitgestellt, die die Verwendung von Adaptorengemischen beinhalten, die verschiedene Sequenzen, die die Initiationsstelle der Translation flanieren, besitzen, d.h. in der Region zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und der Translationsinitiationsstelle und in mehreren Initialen 5'-Codons des Polypeptins, wo dies durch die Bedingungen der Redundanz des genetischen Codes möglich ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt daher ein DNA-Konstrukt bereit, welches einen Vektor umfaßt, der einen in Hefe funktionellen Promotor, der funktionell mit einem DNA-Abschnitt, welche fur das menschliche cytoplasmatische Cu/Zn-Superoxiddismutase-Polypeptid codiert, umfaßt, wobei das Polypeptid eine von der Hefe erkennbare N-terminale Acetylierungssignalsequenz enthält.
  • Die Erfindung stellt zudem eine transformierte Wirtszelle bereit, die das DNA-Konstrukt enthält, und ein Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle, die in der Lage ist, eine biologisch aktive acetylierte humane cytoplasmatische Cu/Zn-Superoxiddismutase (hSOD) herzustellen, wobei die Methode das Einschließen des DNA-Konstruktes in eine Wirtszelle beinhaltet.
  • Derartige Vektoren und Wirtszellen können zur Herstellung von Polypeptiden, die an ihrem N-Terminus acetyliert sind, und bei Verfahren zur Herstellung solcher acetylierten Polypeptide verwendet werden.
  • Durch die Bereitstellung einer spezifischen Acetylierungssignalsequenz am 5'-Ende des Strukturgens des gewünschten Polypeptids wird die N-termnale Aminosäure acetyliert, wenn das Gen in Hefe exprimiert wird. Die Acetylierungssignalsequenz codiert fur wenigstens die ersten zwei N- terminalen Aminosäuren, wobei die erste Aminosäure entweder Alanin oder Glycin ist und die zweite Aminosäure eine polare Aminosäure, gewöhnlich Threonin, Serin oder Aspartat ist. Die Acetylierung von in Hefe gebildeter humaner Superoxiddismutase ist nachgewiesen, wenn die ersten beiden Aminosäuren Alanin bzw. Threonin sind.
    • Kurze Beschreibung der Figuren
  • Fig. 1 zeigt die DNA-Linkersequenz und ein Fließdiagramm, das ihre Verwendung zeigt;
  • Fig. 2 und 3 sind Fließdiagramme, welche die Herstellung von plot5/SOD zeigen.
  • Fig. 4 zeigt die Sequenz von sowohl dem codierenden Strang der humanen SOD-cDNA (5'T3') als auch des entstehenden Translationsproduktes.
  • Fig. 5 stellt die Sequenz des isolierten humanen SOD-Gens dar, wie im folgenden experimentellen Abschnitt beschrieben.
  • Fig. 6 ist eine Restriktionskarte des isolierten menschlichen SOD- Gens, wie im folgenden experimentellen Abschnitt beschrieben.
    • Beschreibung spezifischer Ausführungsformen
  • Es werden Verfahren und Zusammensetzungen fur die effiziente Expression von Polypeptiden, die die biologische Aktivität der humanen Cu- Zn-Superoxiddismutase ("hSOD") zeigen, bereitgestellt. Die Methoden verwenden eine DNA-Sequenz ("hSOD-Gen"), die einen wesentlichen Teil der Aminosäuresequenz des hSOD codieren, in Verbindung mit einer Translationsinitiationsregion, die fur die Expression in dem Expressionswirt optimiert wurde. Das hSOD-Gen wird in einen fur die Expression in einem Wirt geeigneten Vektor insertiert, vorzugsweise unter Bedingungen, die eine Sekretion ermöglichen, so daß das SOD-Produkt aus dem extrazellulären Medium geerntet werden kann.
  • Es werden außerdem Verfahren und Zusammensetzungen fur die N-terminale Acetylierung von hSOD und anderen Polypeptiden bereitgestellt. Im folgenden bezieht sich Acetylierung auf die Anfügung an den Aminoterminus von Polypeptiden und Proteinen im Gegensatz zur Modifikation der Aminosäureseitenketten, wie z.B. Lysin, wie es in der Natur ebenfalls beobachtet wird. Die Acetylierung von Polypeptiden und Proteinen ist aus einer Reihe von Gründen nutzlich. Wenn der natürliche Zustand das Polypeptins eine Acetylierung einschließt, wie es im Falle der cytoplasmatischen hSOD der Fall ist, ergeben Methoden der Expression, die eine Acetylierung einschließen, ein Produkt, das die gewünschte natürliche Struktur und Konformation hat. Wenn das Produkt eine pharmazeutische und/oder in vitro oder in vivo diagnostische Verwendung hat, wird das acetylierte Material eine Immunogenität minimieren oder eliminieren, wenn es einem Wirt verabreicht wird und/oder einer biologischen Probe exponiert wird. Zudem sind acetylierte Polypeptide wahrscheinlich stabiler und gegenüber einem Abbau durch Proteasen resistenter und bleiben daher in der Zelle, im Blut oder im Körper und in Körperflüssigkeiten länger vorhanden.
  • Das Strukturgen fur hSOD oder andere Polypeptide behaltet eine Acetylierungssignalsequenz am 5'-Ende, wobei diese Signalsequenz einen Hefeexpressionswirt dazu bringt, die Acetylierung durchzuführen. Die Acetylierungssignalsequenz codiert wenigstens die ersten zwei N-terminalen Aminosäuren im Polypeptid. Die erste Aminosäure ist entweder Alanin, Glycin oder Serin, während die zweite Aminosäure eine polare oder aromatische Aminosäure, in der Regel Threonin, Serin, Aspartat oder Phenylalanin, ist.
  • Die Aminosäuren können die natürlich vorkommenden N-terminälen Aminosäuren sein, die normalerweise in dem zu exprimierenden Polypeptid vorhanden sind. Dies ist für hSOD der Fall, bei dem die ersten beiden Aminosäuren Alanin bzw. Threonin sind. Andere natürlicherweise acetylierte Proteine, die in Hefe exprimiert und acetyliert werden können, schließen ein:
  • Die Erfindung ist ebenso fur das Acetylieren von Polypeptiden und Proteinen, die natürlicherweise nicht acetyliert sind, nützlich. Die Acetylierung kann dadurch erreicht werden, daß die Acetylierungssignalsequenz an das 5'-Ende des Strukturgens fur das Polypeptid gebunden wird. Die Acetylierungssignalsequenz wird fur wenigstens zwei Aminosäuren (wie oben beschrieben) codieren und kann bis zu zehn oder mehr Aminosäuren, vorzugsweise weniger als fünf Aminosäuren, codieren. In der Regel sind weniger zugefügte Aminosäuren anzustreben, un eine Interferenz mit oder einem Verlust der gewünschten Aktivität des Polypeptins einzuschränken. Bequemerweise kann die Signalsequenz synthetisiert werden und unter Verwendung gut bekannter Techniken an das Strukturgen angefügt werden.
  • Als eine Alternative zum Anfügen der Acetylierungssignalsequenz an das Strukturgen wird es manchmal möglich sein, das 5'-Ende des Strukturgens zu modifizieren, um eine oder beide der ersten beiden Aminosäuren des Polypeptins zu ersetzen. Eine solche Modifikation kann mit einer Verschiedenheit von konventionellen Methoden durchgeführt werden. Z.B. kann das Strukturgen nahe an seinem 5'-Ende restriktionsgespalten werden, um eine bekannte Anzahl von Nucleotiden zu entfernen. Es kann dann ein synthetisches Oligonucleotid mit den kohäsiven Enden, die nach der Restriktionsspaltung übrig bleiben, verbunden werden. Das Oligonucleotid wird die Basenpaare, die notwendig sind, um die gewünschte Acetylierungssignalsequenz zur Verfügung zu stellen, wiederherstellen und ersetzen. Alternativ kann ortsspezifische Mutagenese unter Verwendung von z.B. dem Phagen M13 verwendet werden, um eine geeignete Medifikation des 5'-Endes des Strukturgens zu erreichen.
  • Um hSOD zu produzieren, ist es notwendig, eine DNA-Sequenz zu heben, die fur hSOD codiert. Eine Art und Weise, um eine solche Sequenz zu erhalten, ist es, cDNA ausgehend von Messenger-RNA aus Zellen, die hSOD herstellen, zu clonieren. Zweckdienlicherweise können fur diesen Zweck menschliche Leberzellen verwendet werden. Nachdem die cDNA cloniert wurde, wobei die DNA-codierende Sequenz unbekannt ist, aber wenigstens eine partielle Aminosäuresequenz bekannt ist, kann man dann die cDNA mit einem Gemisch von Sonden, die alle möglichen Variationen der Nucleotide, welche für die besondere Reihenfolge der Aminosäurereste dodlert, durchzunustern. Die Wahl der Reste, fur die die Sequenz dodiert, ist in gewisser Weise willkürlich, obwohl die ausgewählten Reste gewöhnlich so ausgewählt sein werden, daß die Anzahl unterschiedlicher Sequenzen, die synthetisiert werden nüssen, minimiert wird.
  • Für hSOD kann zweckdienlicherweise eine DNA-Sequenz verwendet werden, die für wenigstens die Aminosäurereste 19 bis 24 codiert, insbesondere eine Sonde, welche wenigstens etwa 15 Basen und nicht mehr als etwa 20 Basen enthält, zweckdienlicherweise etwa 17 Basen. Man kann dann die done, welche mit den markierten Sonden hybridisieren, mit Restriktionsenzymen spalten, die DNA-Fragmente fraktionieren und die Hybridisierung wiederholen, insbesondere durch das Verwenden einer zweiten Reine von Sonden, die mit den DNA-Sequenzen, welche für eine andere Reine von Aminosäureresten in hSOD codieren, hybridisieren. Zweckdienlicherweise können diese Aminosäurereste 109 bis 114 sein. Einer oder nehrere Clone können gefünden werden, die gegenüber beiden Sonden positiv sind, und diese können als Ausgangsmaterial für eine cDNA verwendet werden, die für wenigstens einen wesentlichen Teil der hSOD codiert.
  • Ganz überraschend wurde gefunden, daß sich die Aminosäuresequenzen, welche für hSOD publiziert worden waren, in einer signifikanten Anzahl an Resten von der Aminosäuresequenz, die von der cDNA codiert wird, unterscheiden. Insbesondere waren dort, wo die beiden publizierten Sequenzen sich unterschieden (Jabusch et al., Biochemistry (1980) 19:2310-2316 und Barra et al., FEBS Letters (1980) 120:153-156) die korrekten Zuordnungen wie folgt: Rest 11, Aspartat; Rest 17, Isoleucin; Rest 26, Asparagin; Rest 49, Glutamat; Rest 52, Aspartat; Rest 53, Asparagin; Rest 92, Aspartat; Rest 98, Serin (siehe Fig. 4).
  • Aufgrund der Unsicherheiten der Auswirkung des Abstandes zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und dem Translationsinitiationscodon, in der Regel AUG, auf die Translation, wird durch das erfindungsgemaße Verfahren eine Technik zur Variation des Abstandes und der Nucleotide, welche die ribosamale Bindungsstelle vom Initiationscodon trennen, bereitgestellt. In der Regel besteht der Spacer zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und dem Initiationscodon aus 6 bis 15, noch gebräuchlicher aus 6 bis 12, Nucleotiden. Da die Basensequenz stromabwärts van der Initiationsstelle ebenfalls die Effizienz der Translation beeinflussen kann, stellt das erfindungsgemäße Verfahren die Variation der Nucleotidsequenz (allerdings nicht der Länge) innerhalb mehrerer initialer 5'-Codons des Polypeptids bereit, soweit es die Beschränkung der Redundanz des genetischen Codes ermöglicht. Eine solche Degeneration kann bis zu 4 Codons, gewöhnlicher 2 Codons, strombwärts der Initiationsstelle betreffen.
  • Eine Vielzahl von Linkern wird hergestellt, in denen wenigstens 2 Nucleotide, gewöhnlich wenigstens 3 Nucleotide, aber nicht mens als 10 Nucleotide, gewöhnlicherweise nicht mehr als etwa 6 Nucleotide, variiert werden, um Mitglieder einzuschließen, die jedes der 4 Nucleotide enthalten, wenn sie innerhalb des Spacers liegen, oder 2, 3 oder 4 Nucleotide heben, falls es die Redundenz des genetischen Codes erlaubt, wenn sie innerhaib des Strukturgens des Polypeptids liegen. Zusätzlich werden die Linker so hergestellt, daß sie eine unterschiedliche Anzahl von Nucleotiden enthalten, um eine Reihe von Linkern bereitzustellen, die nicht nur in dar Sequenz sondern auch in dar Länge variieren. Der Längenunterschied kann dauurch erreicht werden, daß Teile des Trägers während dar Synthese der Linker entfernt werden, und, falls geeignet, die Synthese bei einer weiteren Stufe fortgesetzt wird, so daß dadurch Linker bereitgestellt werden, die eine abgestufte Anzahl an Sequenzlängen besitzen. Gewöhnlicherweise wird das Linkergemisch in dar Länge in wenigstens einem Nucleotid und nicht mehr als uber einen Bereich von sechs Nucleotiden, gewöhnlicherweise nicht mehr als vier Nucleotiden, variieren.
  • Dies kann zweckdienlicherweise an dem Fall erläutert werden, in dem fehlenden Basen am Ende liegen. Nach jeder Stufe wird ein Teil des Trägers entfernt, und die Synthese wird mit den Strängen, die an den Träger gebunden sind, fortgeführt, wobei alle vier Nucleotide (DNTP) bei jeder Stufe bereitgestellt werden. Diese Einzelstränge werden dann an einen Einzelstrang, der teilweise komplementär ist, hybridisiert, wobei die variable Region ein überhängendes Ende sein wird. Dadurch wird man eine abgestufte Reihe von linkern erzielen, die uberhängende Enden besitzen, die sowohl in ihrer Nucleotidsequenz als auch in ihrer Länge differieren. Zu einem geeigneten Zeitpunkt während dar folgenden Hybrisierung, Ligation oder Clonierungstätigkeit wird das überhänge Ende/werden die uberhängenden Enden aufgefüllt, um doppelsträngiges Material bereitzustellen, das weiteren Manipulationen zugänglich ist. Dies wird gewöhnlicherweise und vorzugsweise in vitro durchgeführt, z.B. durch Verwendung des Klenow- Fragments der DNA-Polymerase 1; alternativ könnte in manchen Konstrukten das überhängende Ende als ein Einzelstrang cloniert werden, wobei das Auffüllen in vivo in tranformierten oder transfizierten Wirt stattfindet. Die Hybridisierung an einen komplementären Strang kann dadurch erreicht werden, daß man eine 5'-Sequenz hat, die stromaufwärts der variablen Nucleotidreihe liegt, die komplementär zu einer Sequenz ist, die in der terminalen Sequenz vorkommt, an die der Linker geknüpft werden soll. Die fehlenden Basen können dann in vitro oder in vivo aufgefüllt werden.
  • Die Linker schiießen in ihrer Sequenz wenigstens einen Teil der Region zwischen der ribosamalen Bindungsstelle und dem Initiationscooon ein, vorzugsweise die Nucleotide, die proximal des Initiationscodons liegen. Der Linker kann auch das Initiationscodon einschließen sowie Teile des Strukturgens, der ribosamalen Bindungsstelle und Basen, die stromaufwärts der ribosomalen Bindungsstelle liegen, die transkriptionelle regulatorische Sequenzen enthalten können oder nicht enthalten können.
  • Gewöhnlicherweise wird der Linker aus wenigstens 5 Basen bestehen, in noch gewöhnlicherer Weise aus wenigstens 20 Basen und wird gewöhnlicherweise etwa 200 Basen nicht uberschreiten, in noch gewöhnlicherer Weise etwa 100 Basen nicht uberschreiten. Dort, wo der Linker größer als etwa 35 Basen ist, wird er gewöhnlicherweise durch Verwenden von einzelsträngigen Sequenzen von etwa 10 bis 35 Basen zusammengebaut werden, wobei diese mit lediglich einem Teil des komplementaren Stranges homolog sind, so daß komplementäre überlappende Sequenzen mit Überhängen entstehen, so daß die verschiedenen Einzelstränge hybridisiert, ligiert werden können und dar Überhang, der degeneriert ist und/oder eine variable Länge hat, wie oben angegeben, aufgefüllt werden kann, um die gewünschten Linker zu erzeugen, die kohäsive und/oder glatte Enden heben.
  • Wenn das Strukturgen eine geeignete Restriktionsstelle enthält, die gewöhnlich nicht mehr als etwa 50 Basen stromabwärts des Initiationscodons liegt, kann ein Fragment, welches das Strukturgen enthält, Restriktions-gespalten werden und mit einem komplementären kohäsiven Ende des Linkers verbunden werden oder aufgefüllt werden, um ein glattes Ende zu erzeugen, wobei das glatte Ende mit einem glatten Ende des Linkers ligiert werden kann. Der Linker wird so konzipiert, daß sichergestellt ist, daß das Strukturgen vollständig ist und im Leseraster mit dem Initiationscodon liegt.
  • Wie gezeigt, ergibt die Herstellung des Linkers eine Reihe von Linkern, die eine ramisierte Reihe von Nlicleotiden besitzen, d.h. jedes dar vier möglichen Nucleotide im codiereeden Strang (gemäß den oben gezeigten Bedingungen dar Beschränkung des genetischen Godes) und die in Bezug auf die Größe abgestuft sind und denen eines oder mehrere Nucleotid(e) fehlt/fehlen, welche(s) die Zwischenregion definiert/definieren oder die ribosamale Bindungsstelle und des Initiationscodon verbindet/verbinden. Diese Linker, die aus Einzelsträngen hergestellt werden, können mit anderen einzelnen oder doppelten DNA-Strängen verbunden werden, um verlängerte Linker bereitzustellen, die nicht nur die ribosomale Bindungsstelle einschließen sondern auch Basen, die stromaufwärts der ribosomalen Bindungsstelle liegen. Alternativ können die Linker relativ klein sein und an einer Stelle, die in der ribosomalen Bindungsstelle liegt oder neben der ribosomalen Bindungsstelle liegt, beginnen und sich stromabwärts bis zu einer Stelle am Initiationscodon oder im Inneren des Strukturgens erstrecken.
  • Obwohl die besondere Verknüpfungsreihenfolge der verschiedenen Fragmente zur Bildung der erfindungsgemäßen Konstrukte normalerweise nicht entscheidend sein wird, kann zweckdienlicherweise das Strukturgen zuerst mit dem Linker verbunden werden. Dieses DNA-Konstrukt wird nicht nur das Strukturgen sondern auch die ribosomale Bindungsstelle und alle weiteren Nucleotide stromaufwärts der ribosomalen Bindungsstelle einschließen. Zusätzlich wird es bei den Nucleotiden und der enzahl der Nucleotide zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und dem Initiationscodon eine beträchtliche Verschiedenheit geben. Das betreffende DNA-Konstrukt wird in einen geeigneten Expressionsvektor insertiert, der die notwendigen regulatorischen Sequenzen der Transkriptionsinitiation stromaufwärts enthält, ebenso wie die regulatorischen Sequenzen der transkriptionellen Termination stromabwärts der Insertionsstelle des betreffunden DNA-Konstruktes. Somit wird der Linker am 5'-Ende von regulatorischen Signalsequenzen der Transkriptionsinitiation und am 3'-Ende mit wenigstens dem Teil der endierenden Region und transkriptionellen und translationellen Terminationssequenzen flankiert sein (5' - und 3' - geben die Richtung der Transkription an.).
  • Nach dem Herstellen der Plasmid- oder viralen DNA zum Einführen in einen geeigneten Wirt (gewöhnlich schließt das zu einer geeigneten Stufe in der Manipulation das Auffüllen der variablen überhängenden Region ein) wird der Wirt tranformiert bzw. transfiziert, cloniert, die Clone werden ausgestrichen und Einzelclone werden auf die effiziente Expression durch Austesten der Produktion des gewünschten Produkts, z.B. hSOD, selektiert. Die Anzahl der zu screenenden Clone, um die verschiedenen Produktionshöhen des Produktes zu bestimmen, wird abhängen von und proportional sein zum Maß der Längenvariabilität und der Sequenzdegeneration, die in den synthetischen Linker eingeführt wurde. Wie durch die vorliegende Ausführungsform beispielhaft gezeigt, ist die Anzahl der möglichen rekombinanten Sequenzen bei vier Längenvariablen und einer vierfachen Sequenzdegeneration bei jedem der sechs Nucleotide des Linkers 5440. Gewöhnlich werden wenigstens einige wenige Hundert, vorzugsweise mehrere Tausend oder mehr Clone durchgemustert werden. Das Screenen kann in effizienter Weise unter Verwendung von Western-Blots (Antikörperbestimmung der Produktes) von Wirtszellkolonien oder viralen Plaques, die auf Filtern aus Nitrocellulose oder anderem geeigneten Material transferiert wurden, durchgeführt werden. Alternativ kann unter Verwendung von Elektrophorese mit einer Vielzahl von Spuren, wobei jede Spur eine individueller Clon ist, durch Sichtbarmachung der Färbeintensität, Autoradiographie oder Western-Blotting der Produktbande ein sofortiger und direkter Vergleich angestellt werden, welche Clone in Bezug auf die Expression am effizientesten sind. Dieser Test wird gewöhnlich ausreichend sein, obwohl quantitative Immunoassays oder Enzymassays, falls angemessen, verwendet werden können.
  • Ggf. können die Konstrukte in einen anderen Wirt transferiert werden, der die regulatorischen Signale des Expressionskonstruutes oder des Expressionkonstruktes, welches zur Bereitstellung einer effizienten Expression in einem anderen Wirt durch Einführen der notwendigen regulatorischen Signale an geeigneten Stellen modifiziert wurde, erkennt.
  • Ggf. kann das hSOD-Gen mit sekretorischen Leader und Prozessierungssignalen verbunden werden, um eine Sekretion und eine Prozessierung der hSOD zu ermöglichen. Verschiedene sekretorische Leader und Prozessierungssignale wurden in der Literatur beschrieben. Siehe z .B. die US- Patente 4 336 336, 4 338 397, 4 588 684 und 4 870 008.
  • Von besonderem Interesse als Wirte sind einzellige Mikroorganismenwirte sowohl Prokaryoten als auch Eukaryoten, wie z.B. Bakterien, Algen, Pilze etc. Insbesondere können E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, Streptomyces, Neurospora Wirte sein.
  • Für die Verwendung in einzelligen Mikroorganismen ist eine große Verschiedenheit von Vektoren verfügbar, wobei die Vektoren von Plasmiden und Viren abgeleitet sind. Die Vektoren können Einzelkopie- oder Niedrigoder Hochmultikopie-Vektoren sein. Die Vektoren können zur Clonierung und/oder Expression dienen. Im Hinblick auf die breite literatur über Vektoren, die kcomerzielle Verfügbarkeit vieler Vektoren und im Hinblick darauf, daß es sogar Handbücher gibt, welche Vektoren und ihre Restriktionskarten und Charakteristika beschreiben, ist keine ausführliche Diskussion an dieser Stelle notwendig. Wie allgemein bekannt, beinhalten die Vektoren normalerweise Marker, die eine Selektion ermöglichen, wobei diese Marker zur Resistenz gegenüber cytotoxischen Verbindungen, zu Prototrophie oder zur Immunität führen. Häufig ist eine Vielzahl von Markern vorhanden, die verschiedene Charakteristika heben.
  • Zusätzlich zu den Markern werden die Vektoren ein Replikationssystem besitzen und werden im Falle der Expressionsvektoren normalerweise sowohl die regulatorischen Signale der Initiation und Termination der Transkription beinhalten, wie z.B. Promotoren, die einfache oder multiple Promotoren sein können, eine mRNA-Capping-Sequenz, eine TATA-Box, Enhancer, Terminatoren, Polyadenylierungssequenzen und ein oder mehrere Stoppcodons, die mit dem Terminator assoziiert sind. Für die Translation wird haufig eine ribosomale Bindung sstelle vorhanden sein, ebenso wie ein oder mehrere Stoppcodons, obwohl in der Regel die Stoppcodons mit dem Strukturgen assoziiert sein werden. Alternativ können diese regulatorischen Sequenzen auf einem Fragment vorhanden sein, welches die Strukturgene enthält und welches in den Vektor insertiert wird.
  • Gewöhhlich werden eine oder mehrere Restriktionsstellen vorhanden sein, die zur Insertion des Strukturgens in den Expressionsvektor an geeigneter Stelle liegen. Nach der Insertion kann der Expressionsvektor, welcher das Strukturgen enthält, in einen geeigneten Wirt eingeführt werden, und der Wirt kann cloniert werden, um eine effiziente Expression der hSOD zu ermöglichen.
  • In bestimmten Fällen können für den Vektor spezialisierte Eigenschäften bereitgestellt werden, wie z.B. eine temperatursensitive Expression, Operatoren oder Aktivatoren zur Regulation der Transkription und dgl. Von besonderem Interesse ist die Fähigkeit, die Transkription durch exogene Mittel kontrollieren zu können, z.B. durch Temperatur, Induktoren, Gorepressoren etc., wo die Transkription durch eine exogene Verbindung, in der Regel eine organische Verbindung, induziert oder reprimiert werden kann.
  • Wird hSOD intrazellulär hergestellt, können die Zellen, wenn die Zellkultur eine hohe Dichte erreicht hat, zweckdienlicherweise durch Zentrifugation isoliert werden, lysiert werden und die hSOD kann mittels verschiedener Techniken, wie z.B. Extraktion, Affinitätschromatographie, Elektrophorese, Dialyse oder Kombinationen davon, isoliert werden. Wird das Produkt sekretiert, können ännliche Techniken für das Nährmedium angewendet werden, allerdings wird das gewünschte Produkt einen wesentlich höheren Anteil des Gesamtproteins im Nahrmium als im Zelllysat einnehmen.
  • Die gebildete hSOD hat im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie die naturlich vorkommende menschliche Superoxiddismutase und unterscheidet sich gewöhnlich in weniger als 5 Aminosäuren, noch gewöhnlicher unterscheidet sie sich in weniger als 2 Aminosäuren. Die rekombinante hSOD ("r-hSOD") zeigt im wesentlichen die gleichen biologischen Eigenschaften wie die naturlich vorkonmende hSOD. Die biologischen Eigenschaften schließen logische Eigenschaften ein, bei denen Antikörper, die gegen authentische hSOD erzeugt werden, mit r-hSOD, kreuzreagieren. Weiterhin zeigt, bezogen auf das Proteingewicht, das r-hSOD Produkt in den gebräuchlichen Bioassays, die für hSOD angewendet werden, einen wesentlichen Anteil der enzymatischen Aktivität der authentischen hSOD von gewöhnlich wenigstens etwa 10 %, bevorzugt wenigstens etwa 50 %, noch bevorzugter wenigstens etwa 80 %. Eine erläuternde Assaytechnik wird von Merklund und Merklund, Eur. J. Biochem. (1974) 47:469-474, beschrieben.
  • Die folgenden Beispiele werden zur Illustration und nicht zur Beschränkung gegeben.
    • Experimente Molekulare Clonierung der hSOD-cDNA
  • Gesamt-RNA wurde aus adulter menschlicher Leber mit Hilfe der Guanidiniumthiocyanat/Lithiumchlorid-Methode (Cathala et al., DNA (1983) 2:329-335) herstellt. polyA-RNA wurde dazu verwendet, um doppelsträngige cDNA (Maniatis et al., Molecular Cloning, 213-242, Cold Spring Harbor, 1982) zu synthetisieren und diese wurde uber eine Sepharose-CL4B-Säule geleitet, um cDNAs größer 350 bp anzureichern (Fiddes und Goodman, Nature (1979) 281:351-356). Die cDNA wurde in die PstI-Spaltstelle von plot4, einem pBR322-Derivat, in welchem die PstI-EcoRI-Erkennungsstelle durch folgende Sequenz ersetzt wurde, insertiert:
  • Für die Insertion der cDNA wurde die oligo-dG:dC-Tailing-Methode (Maniatis et al., a.a.O.) angewandt. E. coli-Stamm D1210 wurde mit diesem Gemisch transformiert, und die Transformanten wurden auf L-Agar, welcher 10 µg/ml Tetracyclin enthält, selektiert (Kushner, S.R. (1978) In: Genetic-Engineering, Hrg. Beyer, H.B. und Nicosia, 5., (Elsevier/North Holland, Amsterdam) S.17). Plasmid-DNA, welche eine Leber-cDNA-Genbank bildet, wurde direkt ausgehend von 62.000 rekombinanten Kolonien hergestellt (Maniatis et al., Molecular Cloning, S. 86-94, Cold Spring Harbor 1982), die in einer Dichte von etwa 3.000 Kolonien pro 9 cm Durchmesser Petri-Schale ausplattiert wurden
    • Isolation von r-hSOD-Clonen
  • Stamm D1210 wurde mit der Leber-cDNA-Geebank retransformiert, und etwa 40.000 Clone wurden auf neun 14 cm Durchmesser Petri-Schalen kultiviert. Nach dem Transfer der Kolonien auf Nitrocellulosepapier und nach Choramphenicolamplifikation der Plasmid-DNA wurden die Zellen lysiert, und die Filter wurden für eine Hybridisierung vorbereitet (Ish-Horowicz und Burke, Nucleic Acids Research (1981) 9:2989-2998). Oligonucleotidsonden wurden verwendet, um auf Hybridisierung abzusuchen, wobei die Sonden aus enzymatisch radioaktiv markierten, chemisch synthetisierten DNA-Mölekulen bestanden, welche zu der mRNA, die für die Aminosäurereste 19 bis 24 des Proteins endiert, komplementär sind (Jabusch et al., a.a.O.; Barra et al., a.a.O.); das Gemisch hatte die folgenden Sequenzen: wobei alle angegebenen Möglichkeiten für die Codierung der Peptidsequenz synthetisiert wurden (32fach degeneriert).
  • Die Sonden wurden mit ³²p zu einer spezifischen Aktivität von 1- 3x10&sup8; cpm/µg markiert und mit einem Millipore-Filter (0,45 µm) vor Gebrauch filtriert. Die Filter wurden während 6 h bei 30ºC in 4x SSC, 2x Dehardt-Lösung, 40 mM Natriumphosphat, pH 7,5, 300 µg/ml sonifizierter Lachsoden-DNA hybridisiert. Die Hybridisierung erfolgte während 20 h bei 30ºC in der gleichen Lösung, die 2x10&sup6; cpm/ml hSOD-DNA-Sonde (Reste 19 bis 24) enthielt. Die Filter wurden in 4x SSC, einmal für 15 min bei Raumtemperatur und zweimal während 15 min bei 30ºC, gewaschen, trocken geblottet und mit einem verstärkenden Schirm während 24 h bei -70ºC autoradiographiert.
  • Areale auf den Masterplatten, welche duplizierten positiven Signalen entsprachen, wurden in L-Brühe gegeben, und Plasmid-DNA wurde durch das Miniscreen-Verfahren hergestellt (Maniatis et al., Molecular Cloning, 178, 368-369, Gold Spring Harbor 1982). Diese DNA wurde mit PstI gespalten und einer Southern-Blot-Analyse unterzogen (Southern, J. Mol. Biol. (1975) 98:503-517), wobei anfänglich mit den vorherigen markierten Sonden (Aminosäurereste 19 bis 24) und dann mit weiteren radioaktiv markierten Sonden, welche von den Aminosäureresten 109-114 abgeleitet sind, und die folgenden Sequenzen heben (alle möglichen Variationen, 72fach degeneriert), die als Gemisch vorliegen, hybridisiert:
  • Ein Plasmid-Pool (pSOD1) enthielt eine cDNA-Insertion von 520 bp, welche mit beiden Sonden hybridisierte, und nach Koloniereinigung wurde Plasmid-DNA aus diesem Clon isoliert und mit der Maxam-und-Gilbert- Methode (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74:560-564) sequenziert, mit den Ergebnissen, welche in Fig. 4 gezeigt sind. Der hSOD-cDNA-Clon pSOD1 stellt die codierende Region für die Aminosäuren 10 bis 153 der hSOD, ein einzelnes Stoppcodon der Translation und eine 3'-nichttranslatierte Region dar. Aus diesem Grund ist in den Expressionvektorkonstrukten die Basensequenz der Region, welche für die Aminosäuren 1 bis 9 endiert, von der publizierten Aminosäuresequenz der hSOD (Jabusch et al., a.a.O; Barra et al., a.a.O.) abgeleitet und chemisch als ein Teil des variablen Linkersegnentes (siehe unten) synthetisiert.
    • Konstruktion des Plasmides plot5 - (Siehe Fig. 2 und 3) Plasmid plot1
  • Das mit plot1, welches einen hybriden trp-lac("tac")-Promotor (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80:21-25) enthält, wurde dadurch konstruiert, daß man das 180 bp HgiA-TagI-Fragment aus ptrpL1 (Edman et al., Nature (1981) 291: 503-506) und das 58 bp HpaII- EcoRI-Fragment aus pKB268 (Backman und Ptashne, Cell (1978) 13:65-71) tber ein Gel isolierte und diese Fragmente in pBR322, welche mit PstI und EcoRI gespalten worden waren, ligierte. Das entstehende Plasmid wurde dazu verwendet, den Stamm D1210 zu transformieren und die Clone wurden auf Tetracyciinresistenz hin selektioniert. Plasmid plot3 wurde durch Gelisolation des 155 bp Fnu4HI-EcoRI-Fragments aus plot1 konstruiert, welches den tac-Promotor, wobei die Fnu4HI-Stelle unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I ("pol I K" oder "Klen. Pol.") in ein glattes Ende ubergeführt wurde, und das 18 bp EcoRI-PstI- Polylinkerfragment aus ΠAN7 der folgenden Sequenz enthielt:
  • Diese Fragmente wurden mit gelgereleigtem pBR322 ligiert, das mit EcoRI gespalten worden war, dessen Enden unter Verwendung von pol I K geglättet wurden und der im folgenden mit PstI gespalten und gelgereinigt wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde dazu verwendet, um den Stamm D1210 zu transformieren und auf L-Agarplatten, die 10 µg/ml Tetracyclin enthielten, zu selektionieren.
  • Plasmid plots wurde dadurch hergestellt, daß zuerst ein Plasmid konstruiert wurde, das den ΠAN7-Polylinker als eine EcoRI-PvuII-Substitution in pBR322 enthielt. Dann wurde Plasmid ΠAN7 mit HindIII gespalten, durch Auffüllen mit pol I K wurden glatte Enden erzeugt, und ein synthetisches selbstkomplementäres PvuII-Linkermolekül (d(5'-CCAGGTGG-3')) wurde mit dem oben modifizierten Plasmid ΠAN7 ligiert. Nach Spalten mit EcoRI und PvuII wurde das resultierende 44 bp Polylinkerfragment (mit 4- Basenüberhängen) gelisoliert und in pBR322 als eine EcoRI-PvuII-Substitution cloniert.
  • Plasmid plot3 wurde mit EcoRI gespalten, und nach Phenol-Chloroformextraktion und Ethanolfallung wurden die überstehenden 5'-Enden durch Behandlung mit der S1-Nuclease (Palmiter, Biochemlstry (1974) 13:3606- 3615; Hallewell und Emtage, Gene (1980) 9:27-47) in glatte Enden überführt. Nach Phenol-chloroformextration und Ethanolfällung wurde die DNA mit ClaI gespalten, durch pol I K wurden glatte Enden erzeugt, und das 237 bp Fragment, das den tac-Promotor enthielt, wurde durch präparative Polyacrylamid-Gelelektrophorese isoliert. Dieses tac-Promotorfragment mit glatten Enden wurde dann in die PvuII-Spaltstelle des pBR322-Polylinkerplasmides (siehe Fig. 3) insertiert, und es wurden done erhalten, in denen der tac-Promotor die Transkription in Richtung des β-Lactamasegens des pBR322 steuerte.
    • Konstruktion von plot5-Derivaten, die r-hSOD exprimieren
  • Die synthetischen DNA-Molekule F(26), C(16), B(31), D(11), E(13) und 4(24), die in Fig. 1 gezeigt sind, wurden mit dem Phosphoramiditverfähren synthetisiert. Der Einzelstrang 4(24) wurde unter Verwendung aller vier Basen an den Stellen, an denen ein X angegeben ist, hergestellt. Weiterhin wurde Silica bei der Synthese der 24mere entfernt, so daß einzelsträngige 21mere, 22mere und 23mere zusätzlich zu den 24meren erhalten wurden. Nach Entfernung des Silicaträgers wurden die vier Gemische in geeigneten Verhältnissen kombiniert, um äquimolare Mengen jedes möglichen Einzelstranges bereitzustellen. Dieses Gemisch wurde als ein Einzelprodukt in den folgenden Stufen verwendet.
  • Molekule F(26), C(16), B(31) und D(11) wurden in äquimolaren Mengen zusammengemischt und 10 µg unter Verwendung der T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert. Nach Phenol-Etherextraktion wurden die weiteren nicht- phosphorylierten synthetischen DNA-Molekule 4(24) und E(13) zugegeben, so daß alle Fragmente äquimolar vorlagen. Des äquimolare Gemisch enthielt 13 µg DNA in 133 µl 0,3 x Kinasepuffer.
  • Nach der Reassoziation durch Abkühlen von 70ºC auf 20ºC während 60 min in einer gleichmäßigen Geschwindigkeit wurden die Einzelstränge zusammen mit T4-Ligase in 200 µl Ligationsgemisch bei 14ºC während 4 h ligiert, mit Phenol-Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und die 5'- Enden von 4(24) und E(13) unter Verwendung der T4-Polynucleotidkinase (Maniatis et al., a.a.O.) phosphoryliert. Präparative Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde dazu verwendet, das vollständig ligierte 53 bp Material, welches 5'- und 3'-überstehende Enden besitzt, zu isolieren.
  • Das obige gereinigte Fragmentgemisch wurde dann mit den 460 bp TagI-PstI-Segment der hSOD-cDNA, wie in Fig. 1 gezeigt, ligiert. Dieses Segment selbst wurde dadurch konstruiert, daß das 454 bp TagI-AluI hSOD- Fragment isoliert wurde, daß mit Hilfe der pol I K glatte Enden erzeugt wurden und daß es in plots zwischen die EcoRI und SalI-Erkennungssteilen (siehe Fig. 3), die ebenfalls in glatte Enden übergeführt wurden, insertiert wurde. Nach der Isolation der Plasmid-DNA aus dieser Rekombinante wurde das 460 bp TagI-PstI hSOD-Fragment durch präparative Polyacrylamid- Gelelektrophorese isoliert. Nach Extraktion und Fällung wurde das 515 bp Fragment, welches aus der Verbindung des synthetischen Fragments mit dem 460 bp TagI-PstI hSOD-Fragment entstand, mit pol I K aufgefüllt (525 bis 528 bp) und dann mit SalI gespalten, und das entstehende 519 bis 522 bp hSOD-Fragment wurde durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde dann in plot5, das mit PvuII und SalI gespalten und dann mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war, insertiert. Die entstehenden Plasmide wurden dazu verwendet, den Stamm D1210 zu transformieren. Die Rekombinanten, die nach der Transformation von Stamm D1210 erhalten wurden, wurden auf L-Agar, der 100 µg/ml Ampicillin enthielt, selektioniert, so daß eine Reihe von Clonen (als plot5/SOD bezeichnet) mit verschiedenar SOD-Expression entstand.
    • r-hSOD-Expression und plot5/SOD-Plasmidselektion
  • Zur Analyse der Gesamtproteine von E. coli durch SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese wurden über Nacht Kulturen 30fach in 1 mi L-Brühe verdunnt und unter Schütteln 90 min bei 37ºC bis zu einer O.D.&sub6;&sub5;&sub0; von etwa 0,2 kultiviert. IPTG (Isopropylthiogalactosid) wurde zu einer Endkonzentration von 2 mM zugegeben, und die Kulturen wurden weitere 3 h inkubiert. Nach Zentrifügation wurde das Zellpellet in 50 µl Gelladepuffer resuspendiert (Laemmli, Nature (1970) 227:680-685) und durch 3faches Wiederholen der folgenden Prozedur lysiert: Für 1 min Einfrieren, während 2 min Kochen, während 10 s Vortexen.
  • Nach elektrophoretischer Auftrennung (Laemmli, a.a.O.) wurden die Proteinbanden mit Coomasie-Blau gefärbt und die Menge an SOD, die von jedem Clon gebildet wurde, abgeschätzt; diese Ergebnisse wurden dann unter Verwendung von Western-Blots mit Antikorpern gegen authentisches menschliches SOD bestätigt. Mehr als 300 Clone wurden analysiert und zeigten SOD-Expressionsspiegel, die von niedrig oder gar nicht vorhanden bis zu Mengen variierten, die mit 5 bis 10 % des gesamten löslichen zellulären Proteins abgeschätzt wurden. Die Ergebnisse für sechs der über 300 Clone sind in Tabelle 1 gezeigt, zusammen mit der spezifischen Sequenz für DNA-Molekül 4(24), wie durch die Methode von Maxam und Gilbert, a.a.O., bestimmt. Tabelle 1: Sequenz und SOD-Spiegel Herstellung in E. coli
    • r-hSOD-Assays
  • Für Enzymassays wurden 100 ml Kulturen, wie oben beschrieben, induziert. Lösliche Zellextrakte wurden durch 10 x 20 s Vortexen der Zellpellets mit einem gleichen Volumen an 0,45 bis 0,5 mm Durchmesser Glaskügelchen (Braun AG) und einem gleichen Volumen an Assaypuffer (50 mM Tris- Cacodylat, pH 8,2, 1 mM Diethylentrianinpentaessigsäure) in einem 1,5 ml Mikroreaktionsgefäß bei 4ºC hergestellt. Zellbruchstücke wurden durch Zentrifügieren des Reaktionsgefäßes während 1 min in einer Mikrozentrifüge (Beckaan) sedimentiert. Die Überstände wurden gegen den Assaypuffer, welcher jeweils ein 1 mM Zinksulfat und Kupfersulfat enthielt, während 4 h bei 4ºC dialysiert.
  • SOD-Assays wurden unter Verwendung der Pyrogallolmethode (Marklund und Marklund, a.a.O.) durchgeführt. Die Reaktionsgemische enthielten 0,2 mM Pyrogallol im Assaypuffer, und die Reaktionsraten wurden während 5 min unter Verwendung eines Hewlett-Packard 8450-Spektrophotometers bei 420 nm bestimmt. Vier verschiedene Assayproben wurden hergestellt: lösliche E. coli-Extrakte; authentisches hSOD; und jede der vorherigen Proben vorinkubiert mit Kaninchen-Antikörpern gegen authentisches hSOD. Jede Probe wurde in einer Kuvette 1 min bei 25ºC inkubiert, bevor Pyrogallol zugegeben wurde und bei 25ºC der Assay durchgeführt wurde. Die Antikörperproben wurden 10 min bei Raumtemperatur in Assaypuffer mit 5 µl Antikörper präinkubiert. Es wurde gefunden, daß diese Bedingungen ausreichend sind, um 100 ng reinen hSOD zu inaktivieren.
  • Die folgende Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse for einen der untersuchten Clone (pSODx8): Tabelle 2: Enzymatische Aktivität der humanen Cu-Zn-SOD Hergestellt in E. coli (Stamm D1210 (pSODX8))
  • Diese Daten zeigen, daß etwä 15 % des gesamten löslichen zellulären Proteins hSOD war (unter der Annahme, daß die als Referenz verwendete reine humane Cu-Zn-SOD vollständig aktiv war). Zusammen mit den elektrophoretischen Daten genommen (siehe oben), die zeigten, daß 5 bis 10 % des gesamten löslichen zellulären Proteins als hSOD wanderte, erscheint es, daß ein wesentlicher Teil, wahrscheinlich ein Großteil des produzierten hSOD aktiv ist.
  • Die korrekte Sequenz des clonierten Gens wurde unter Verwendung der Maxam-und-Gilbert-Methode, a.a.O., bestimmt. Zusätzlich wurden die ersten zwölf Aminosäuren am N-Terminus durch automatischen Edman-Abbau bestimmt. Die bestimmte Aminosäuresequenz war wie folgt:
  • ALA-THR-LYS-ALA-VAL-(GYS)-VAL-LEU-LYS-GLY-ASP-GLY--
  • Der erste nachgewiesene ALA-Rest war in einer molaren Konzentration vorhanden, die etwä der des Input-Peptids gleich war, was auf die Abwesenheit eines blockierten Aminoterminus hindeutet. Der CYS-Rest wurde durch die verwendete Aminosäureanalysemethode nicht ermittelt, aber sein Vorhandensein wurde von der Nucleotidsequenz abgeleitet.
  • Daher wurde das (N-Formyl)methionin von dem bakteriellen Expressionsprodukt entfernt, und das Material hatte die körrekte Aminosäuresequenz, d.h. identisch mit der, welche für die cytoplasmatischen hSOD- Reste 1 bis 10 berichtet wurde, jedoch war der N-terminale ALA-Rest nicht acetyliert.
  • Weiterhin wanderte das in E. coli gebildete Polypeptid bei einer 1%igen Agarosegelelektrophorese (pH 8,6), die Ladungsunterschiede bestimmt (Corning Universal-Elektrophoresefilm, gefärbt nach Clausen, Immunochemical Technique, S. 530-531), langsamer als das natürliche Protein, was ebenso auf das Fehlen einer Acetylierung hindeutet. Außerdem ergab die Analyse der tryptischen Peptide sowohl des bakteriellen hSOD- Polypeptids als auch des gereinigten authentischen (acetylierten) natürlichen Proteins, daß alle tryptischen Peptide identisch waren, mit der Ausnahme des bakteriellen N-terminalen Peptids, welches auf eine andere Art und Weise wanderte, d.h. mit einer Ladung, die für ein Peptid erwartet wird, dem die N-Acetylgruppe fehlt.
    • Expression in Hefe
  • Für den Transfer des r-hSOD-Gens in einen Hefevektor wurden die plot5/SOD-Plasmidclone auf NcoI-Restriktionserkennungsstellen am 5'-Ende der codierenden Region hin untersucht. For diese Plasmide waren die variablen Nucleotide, welche 5' vom ATG-Initiations-Codon vorhanden sind, CC, die Sequenz CCATGG stellt eine NcoI-Erkennungsstelle dar. Die Clone wurden gescreent, und es wurde einer selektiert und mit phSOD bezeichnet.
  • Das Plasmid phSOD wurde mit NcoI und SalI gespalten, und es wurde ein 550 bp Fragment erhalten, welches ein nichttranslatiertes Nucleotid am 5'-Ende und die vollständige codierende Region für hSOD enthielt. pPGAP (ein Hefeexpressionsvektor, welcher den GAP-Promotor enthält, wie eben hergestellt) wurde mit NcoI und SalI, gefolgt von einer Behandlung mit alkalischer Phosphatase, gespalten, und das NcoI-SalI-Fragment in pPGAP wurde durch das SalI-NcoI-Fragment ersetzt, um pPGAPSOD zu erhalten. Die BamHI-Spaltung von pPGAPSOD führte zu einem 2 kb Fragment, welches gelisoliert wurde und in die BamHI-Spaltstelle von pC1/1 und pC1/1 GAL4/370 eingeführt wurde, um die Plasmide pC1/1GAPSOD bzw. pC1/1GALGAPSOD zu erhalten.
  • Plasmid pC1/1 ist ein pJDB219-Derivat (Beggs, Nature (1978) 275: 104), in dem die Region, welche dem baateriellen Plasmid pMB9 in pJDB219 entspricht, durch pBR322 in pC1/1 ersetzt wurde. Zur Herstellung eines Expressionsvektors, welcher sekretorische und Prozessierungssignale enthält, siehe US-A-4 870 008. Plasmid pC1/1GAL4/370, ein regulierbarer Hefeexpressionsvektor, der die GAL1/GAL10-regulatorische Region enthält (durch das GAL4-Genexpressionsprodukt kontrolliert), wird, wie unten beschrieben, hergestellt.
  • Plasmide pC1/1GAPSOD und pC1/1GALGAPSOD wurden in den Hefestamm 2150-2-3 (erhältlich von Lee Hartwell, University of Washington), wie zuvor (Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75:1929-1933) beschrieben, transformiert, mit dem Expressionsergebnis, welches in der folgenden Tabelle 3 gezeigt wird. Tabelle 3: Expression der humanen SOD im Hefestamm 2150
  • 1 Alle Kulturen wurden in Minus-Leucinmedium mit 2 % Milchsäure, 3 % Glycerin mit oder ohne 2 % Galactose bis zur späten logarithmischen oder frehen stationären Phase kultiviert.
  • 2 Durch RIA bestimmt.
  • hSOD-Spiegel wurden unter Verwendung eines Standard-Radioimmunassays mit iodiniertem authentischem hSOD als Standard gemessen. Die konstitutive Synthese von GAP-Promotor führt zu sehr hohen Spiegeln der hSOD-Produktion in der Größenordnung von 10 bis 30 % des gesamten zellulären Proteins. Die Induktion mit Galactose funktionierte fast ebenso gut und führte zu 7 % hSOD im zellulären Protein.
  • Wird hSOD in diesen hohen Spiegeln produziert, ist es gewöhnlich notwendig, Zink- und Kupferionen dem Produktprotein als prosthetische Gruppen zuzugeben, um die volle enzymatische Aktivität, z.B. die katalytische Aktivität, zu erhalten. Dies erfolgt z.B. durch Dialyse gegen 1 mM lösung sowohl an Zink als auch Kupfersulfat. Alternativ können Zinkund/oder Kupferionen dem Wachstumsmedium zugegeben werden; dieses Verfahren stellt ebenfalls Mittel zur Selektion von Stämmen bereit, die hohe Spiegel an hSOD bilden, und/oder Verfahren zur Vermeidung des Verlustes von Plasmidvektoren, welche hSOD in ansonsten nicht selektiven Medien exprimieren.
    • Konstruktion von pPGAP
  • pGAP1, ein Plasmid, das durch Insertion eines HindIII-Fragments, welches das GAPDH-Gen (GAP49 (Holland und Holland, J. Biol. Chem. (1979) 254: 5466-5474) in der HindIII-Erkennungsstelle von pBR322 inserttiert enthält, hergestellt wurde, wurde mit HinfI gespalten, und ein 500 bp Fragment wurde isoliert. Das Fragment wurde mit Bal31 bandelt, um etwa 50 oder 90 bp zu entfernen, gefolgt von einer Ligation mit HindIII-Linkern und einer HindIII-Spaltung. pBR322 wurde mit HindIII gespalten, gefolgt von einer Behandlung mit alkalischer Phosphatase, und das etwa 450 oder 410 bp große Fragment wurde insertiert, um pGAP128 zu erhalten.
  • pGAP128 wurde mit HindIII gespalten, mit dem Klenow-Fragment und dNTPS wurden glatte Enden des Fragments erzeugt, und das entstehende 450 bp Fragment wurde durch Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde in SmaI gespaltenes plot5 insertiert, das mit alkalischer Phosphatase besedelt worden war, um Plasmid plot5pGAP128 zu erhalten, das etwa -400 bis +27 bp des GAPDH-Promotors und der codierenden Region enthielt.
  • Der Hefeexpressionsvektor pPGAP, welcher einen Polyrestriktions-Erkennungsstellen-Linker zwischen dem GAPDH-Terminator und der kurzen Promotorregion besitzt, wurde wie folgt hergestellt. Plasmid plot5pGAP128 wurde mit BamHI und TagI gespalten, um ein etwa 390 bp BamHI-TagI-Fragment zu erhalten, welches -400 bis -26 bp des GAPDH-Promotors umfaßt. Das BamHI-TagI-Fragment wurde mit einem synthetischen Fragment ligiert, welches -25 bis -1 bp des GAPDH-Promotors sowie mehrere Restriktionserkennungsstellen einschließlich NcoI enthielt und folgende Sequenz hatte:
  • Dadurch entstand ein BamHI-SalI-Fragment, welches mit BamHI und SalI gespalten wurde und dazu verwendet wurde, das BamHI-SalI-Fragment des BamHI-SalI-gespaltenen pBR322, das mit alkalischer Phosphatase beandelt worden war, zu ersetzen. Nach der Ligation wurde das Plasmid pGAPNRS erhalten, das mit BamHI und SalI gespalten wurde, um ein 400 bp BamHI-SalI- Fragment zu erhalten, das gelisoliert wurde. Dieses Fragment wurde mit einem etwa 900 bp SalI-BamHI-Fragment ligiert, welches die GAPDH-Terminatorregion und ein kurzes Segnent der 3'-codierenden Region enthielt, und das entstehende 1,4 kb BamHI-BamHI-Fragment wurde mit BamHI gespalten. Das SalI-BamHI GAPDH-Terminatorfragment wurde durch SalI- und BamHI- Spaltung von pGAP2 erhalten, ein Plasmid, welches durch Insertion eines etwa 3,3 kb BamHI-Fragments, das das GAPDH-Gen GAP49 (Holland und Holland, a.a.O.) in der BamHI-Erkennungsstelle von pBR22 enthält, hergestellt wurde. Plasmide pGAP2 und pGAP1 wurden wie folgt erhalten: Eine Hefegenbank wurde durch Insertion von Fragmenten, die durch partielle Spaltung der Gesamthefe-DNA mit der Restriktionsendonuclease Sau3A erhalten wurde, in den lambda-Phagen Charon 28 hergestellt (Blattner et al., Science (1977) 196:161-169). Die Phagenbank wurde mit DNA, die kömplementär zu der Hefe-GAPDH-mRNA ist, gescreent, und das Hefe-GAPDH- Gen aus einem dieser Clone wurde entweder als ein etwa 3,3 kb BamHI-Fragment in die BamHI-Erkennungsstelle von pBR322 (pGAP-2) oder als ein etwa 2,1 kb HindIII-Fragment in die HindIII-Erkennungsstelle von pBR322 (pGAP-1) subcloniert.
  • pBR322 wurde mit EcoRI und SalI gespalten, es wurden glatte Enden erzeugt und mit BamHI-Linkern ligiert, gefolgt von einer BamHI-Spaltung; das 3,8 kb BamHI-BamHI-Fragment wurde aus dem Gel isoliert, durch Selbstligation reurkularisiert, cloniert und mit pBRΔR1-Sal bennt. Das 1,4 kb BamHI-BamHI-Fragment wurde in den BamHI-gespaltenen alkalische Phosphatase-beendelten Vektor pBRΔR1-Sal insertiert, um das Plasmid pPGAP von etwa 5,3 kb mit einer der Richtung von ampr entgegengerichteten Orientierung zu erhalten.
    • Konstruktion von GAL-regulierten Plasmiden.
  • Das Plasmid pLGSD5 wurde, wie in Guarente et al., (1982) a.a.O. beschrieben, hergestellt. Das Plasmid wurde wie folgt behandelt: Nach Restriktion mit XhoI wurden die überhangenden Enden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I ("Klenow-Fragment") aufgefüllt, mit EcoRI-Linkern (GGAATTCC) ligiert und dann vollständig mit EcoRI und Sau3A gespalten, um ein 370 bp Fragment zu erhalten, das durch Gelelektrophorese isoliert wurde und die intergenischen Sequenzen zwischen den GAL1- und den GAL10- Genen der Hefe enthielt und fur die GAL4-Regulationssequenzen der GAL1- und GAL10-Gene liefert.
  • Dieses Fragment wurde in pBR322 insertiert, das zuvor vollständig mit EcoRI und BamHI gespalten wurde, gefolgt von einer Bendlung mit der alkalischen Phosphatase, um eine Oligomerisierung zu verhindern; dadurch entstand Plasmid pBRGAL4.
  • Plasmid pBRGAL4 wurde vollständig mit Sau3A gespalten, die überhängenden Enden wurden mit dem Klenow-Fragment aufgefüllt, und das resultierende Fragment mit glatten Enden wurde mit SalI-Linkern (CGTCGACG) ligiert, gefolgt von einer Spaltung mit SalI und XhoI. Das entstehende 370 bp Fragment wurde durch Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment enthält die Original-370 bp-Hefe-GAL4-Regulatorsequenz mit XhoI- und SalI-Enden.
  • Das Fragment wurde dann in das Plasmid plot5 cloniert. plot5 wurde dadurch hergestellt, daß ein 40 bp Polylinkerfragment der folgenden Sequenz
  • als eine EcoRI-PvuII-Suostitution in pBR322 eingefügt wurde, gefolgt von der Insertion des trp-lac-Promotors (Russel und Bennett, Gene (1982) 20:231-245) in die PvuII-Erkennungsstelle, so daß die Transkription in Richtung der Polylinkersequenz orientiert ist. plot5 wurde vollständig mit SalI gespalten, gefolgt von einer Bendlung mit alkalischer Phosphatase, und das 370 bp Fragment wurde in plot5 insertiert, um Plasmid plot5GAL4/370 zu erhalten. Dieses Plasmid wurde dann vollständig mit BamHI und SalI gespalten, um das individuelle Fragment, das um 6 bp des Polylinkerfragments verlängert war, wieder zu erlangen. Dieses Fragment wurde dann in pC1/1, das vollständig mit BamHI und SalI gespalten worden war, gefolgt von einer Behandlung mit der alkalischen Phosphatase, um eine Rezirkularisierung zu verhindern, ligiert. Das entstehende Plasmid wurde mit pC1/1GAL4/370 bezeichnet. Das BamHI-SalI-Fragment befindet sich im pBR322-Anteil das Vektors pC1/1.
  • Es wurde gezeigt, daß das phSOD-Polypeptid, welches in der Hefe gebildet wird, identisch zum natürlichen humanen Protein ist. Sowohl bei der Polyacrylgelelektrophorese (mit und ohne Natriumodecylsulfat) als auch bei Agarosegelelektrophorese (siehe oben) war das Wanderungsverhalten des hSODs, welches in der Hefe hergestellt wurde, identisch zu dem Protein. Wurde hochgereinigtes Hefepolypeptid 12 Zyklen eines Edman-Abbaus unterzogen, so war die Sequenz die gleiche wie die for das menschliche Protein berichtete (Reste 1 bis 10), welches, wie oben gezeigt, in E. coli gebildet wurde. Der nachgewiesene Spiegel war jedech lediglich 5 bis 10 % des erwarteten Spiegels in Bezug auf die molare Basis relativ zum Protein-Input. Dieser erniedrigte Nachweisspiegel zeigte an, daß die N-terminale Aminosäure blockiert war, d.h. wahrscheinlich acetyliert. Das Ergebnis wurde durch vergleichende Analyse der tryptischen Peptide, welche von dem Hefe-produzierten hSOD und von authentischem acetyliertem menschlichem Material abgeleitet wurden, bestätigt; es zeigte sich, daß alle erwarteten tryptischen Proteine in den beiden Proben identisch waren einschließlich der N-terminalen, was das Vorhandensein des acetylierten N-terminalen ALA in dem Hefeexpressionsprodukt anzeigt.
    • Isolation des menschlichen SOD-Gens
  • Um das menschliche SOD-Gen zu isolieren, wurde eine Genbank im Bakteriophagen lambda, welche das menschliche Genom repräsentiert (R. Lawn et al. (1978), Cell 15:1157-1174) mit einer radioaktiv markierten DNA-Sonde, die aus der menschlichen SOD-cDNA hergestellt wurde, gescreent. Es wurde eine Million Phagenplaques gescreent, und 13 positive hybridisierende Plaques wurden gereinigt. Die Restriktionsendonuclease- Analyse der Phagen-DNAs zeigte, daß wenigstens 5 verschiedene Gene vorlagen, so daß man annehmen kann, daß es andere SOD-verwandte Gene und Genprodukte gibt. Ein Kandidat fur ein solches Gen ist die jüngst entdeckte extrazelluläre Cu/Zn-SOD (S. Marklund (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7634-7638). Um das authentische cytoplasmatische Cu/Zn-SODGen von den verwandten Genen zu unterscheiden, wurden synthetische DNA- Sonden 5'-AATGCTTCCCACACC-3' und 5'-CTCAGTTAAAATGTCTGTTTG-3' verwendet, die den Aminosäureresten 19 bis 26 bzw. den Nucleotiden 193 bis 213 3' des Terminations-Codons in der 3'-untranslatierten Region entsprechen. Lediglich eine dieser 13 genomischen DNAs hybridisierte mit diesen Sonden, was darauf hinweist, daß es sich um das authentische menschliche cytoplasmatische SOD-Gen handelt. Dies wurde durch DNA-Sequenzanalyse der N-terminalen Region bestätigt, wie in Fig. 5 gezeigt, in der die Aminosäuresequenz, die durch Proteinsequenzierung bestimmt wurde, bestätigt wurde. Dies zeigt außerdem, daß fur SOD kein Präprotein vorhanden ist, da ein In-Frame-Terminations-Codon neun Nucleotide 5' vom Initiationsmethionin-Codon vorhanden ist. Wie in Fig. 5 gezeigt, enthält das menschliche cu/Zn-SOD-Gen intervenierende Sequenzen. Die Karte des SOD-Gens, die in Fig. 6 gezeigt ist, zeigt, daß es mehr als eine intervenierende Sequenz gibt.
  • E. coli-Stamm D1210 (pSODX8) wurde bei der A.T.C.C. am 27. September 1983 hinterlegt und erhielt die Eintragungs-Nr. 39453. Hefestamm 2150-2-3 (pC1/1GAPSOD) und E. coli-Stämme D1210 (pSOD11) und D1210 (pS2OR) wurden bei der A.T.C.C. am 9. Mai 1984 hinterlegt und erhielten die Eintragungs-Nrn. 20708, 39679 bzw. 39.680.

Claims (10)

1. DNA-Konstrukt, welches einen Vektor umfaßt, der einen in Hefe funktionellen Promotor, der funktionell mit einem DNA-Abschnitt, welcher für das menschliche cytoplasmatische Cu/Zn-Superoxiddismutase-Polypeptid codiert, umfaßt, wobei das Polypeptid eine von der Hefe erkennbare N-terminale Acetylierungs-Signalsequenz enthält.
2. DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hefe S. cerevisiae ist.
3. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Vektor weiterhin ein 5'-DNA-Segment umfaßt, welches 5' zum genannten DNA-Segment, das für das menschliche cytoplasmatische Cu/Zn-Superoxiddismutase-Polypeptid codiert, liegt, wobei das genannte 5'-DNA-Segment ein regulatorisches Element der Transkriptionsinitiation ist.
4. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Vektor weiterhin ein 3'-DNA-Segment umfaßt, welches 3' zum genannten DNA-Segment, das für das menschliche cytoplasmatische Cu/Zn-Superoxiddismutase-Polypeptid codiert, liegt, wobei das genannte 3'-DNA-Segment ein regulatorisches Element der Transkriptionstermination ist.
5. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte DNA- Segment, das für die menschliche cytoplasmatische Cu/Zn-Superoxiddismutase codiert, cDNA enthält.
6. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte DNA- Segment, das für die menschliche cytoplasmatische Cu/Zn-Superoxiddismutase codiert, genomische DNA ist.
7. Transformierte Wirtszelle, welche ein wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiertes DNA-Konstrukt enthält.
8. Transformierte Wirtszelle, nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Wirtszelle S. cerevisiae ist.
9. Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle, die in der Lage ist, eine biologisch aktive acetylierte menschliche cytoplasmatische Cu/Zn-Superoxiddismutase (hSOD) herzustellen, wobei das Verfahren das Einführen eines wie in einem der Patentansprüche 1 bis 6 definierten Konstruktes in eine Wirtszelle beinhaltet.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Wirtszelle S. cerevisiae ist.
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