JPS60137286A - ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） スーツや−オキシドジスムターゼ（５ｕｐｅｒ　ｏｘｉ
ｄｅｄｉｓｍｕｔａａｅ　）　（ｒｓＯＤＪ）は確かに
、はとんどの生物において見出される種々の異る酵素で
ある。哺乳動物における１つの機能は、食作用中に天然
に産生される物質であるスーパーオキシドを破壊するこ
とである。スーパーオキシドジスムターゼは、酵素と会
合した金属に基礎を置くファミリーとして特徴付けられ
、この金属は鉄、マンガン、銅、及び銅−亜鉛の間で異
る。例えばウシ−肝臓からのスーパーオキシドジスムタ
ーゼは臨床的に使用されておシ、特に、ヒ）ｋ含む動物
における抗炎症剤として使用されてい４゜他の用途には
、宿主が種々のスーパーオキシド導発剤、例えは放射線
、パラコート等に暴露されることによって生ずるスーパ
ーオキシドイオンの除去、るる種の変性疾患、例えば気
腫の予防又は治療、食物の防腐、等が含まれろ。

従って、特に、抗炎症剤として又は他の医療目的のため
に生体内で使用するために、生理的に許容されるスーパ
ーオキシ、（ジスムターゼが安定供給されることが重要
である。ヒトに適用するためには、生ずる可能性がある
免疫応答を回避し又は最小にするために均質な酵素を用
いるのが好ましい。組換ＤＮＡ技法を用いることによシ
、スーツや−オキシドジスムターゼの所望の生物学的活
性、例えば免疫活性及び酵素活性を有する生成物を効率
的に製造する機会が存在する。

（従来の技術） ヒト−赤血球Ｃｕ　−Ｚｎスーツや−オキシドジスムタ
ーゼのアミノ酸配列は、Ｊａｂｕｓｃｈ等、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ（１９８０）１９：２３１０−２３１６
；及びＢａｒｒａ等、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９
８０）１２０：５３−５５に記載されている。ウシ−赤
血球Ｃｕ−Ｚｎ５ＯＤがＳｔｅｉｎｍａｎ等、Ｊ、Ｂｉ
ｏｌ、Ｃｈｅｍ、（１９７４）２４９　：　７３２６−
７３３８に記載されている。

ＳＯＤ　−１ｃＤＮＡクローンがＬｉｎａｍａｎ　−Ｈ
ｕｒｗｉｔｚ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｃ
ｉ、ＵＳＡ（１９８２）　７９　：２８０８−２８１１
に記載されている。開始コドンから上流の非翻訳領域の
変化が翻訳の効率に及ばず影響については、Ｇｈｅｙａ
ｅｎ等、Ｇｅｎｅ（１９８２）１７　：　５５−６３　
；　Ｔｈｕｍｍｅｌ等、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、（１９８１）
３７：６８３−６９７：及びＭａｔｔｅｕｃｃｉ　及び
Ｈｅｙｎｅｋｅｒ、　Ｎｕｃｌ　、Ａｅｉｄｓ　Ｒｅｓ
、　（１９８３月」：３１１３−３１２１全参照のこと
。

（発明の概要） ヒ）　−Ｃｕ　−Ｚｎ　ス−ｚｆ−オキシドジスムター
ゼの生物学的活性を示すポリペプチドの効率的な産生が
、構造遺伝子の大部分のｃＤＮＡ　ｆ調製し、す７」ト
ゾーム結合部位からコード領域中の退化ヌクレオチドに
伸びる種々の配列をもたらすアダプターの混合物に連結
し、そして翻訳シグナルを有する完全遺伝子全発現ベク
ターに挿入することにより示される。微生物を形質転換
することにより、ヒト−Ｃｕ−Ｚｎスーパーオキシドジ
スムターゼの生物学的活性ケ示す有効なポリ（プテドの
効率的な生産がもたらされる。遺伝子はさらに、適当な
宿主における分泌のための分泌及びプロセシングシグナ
ルと結合するために使用することができる。

ポリペプチドの発現を増強するための新規な方法が提供
され、この方法においては、翻訳開始領域の種々の配列
、すなわちリポゾーム結合部位と翻訳開始′部位との間
の領域及びポリペプチドの最初の幾つかの５′−コドン
中の糊々の配列（遺伝的コードの冗長な制約によシ許容
される場合において）を有するアダプターの混合物が使
用される。

Ｎ−末端においてアセチル化されたポリペプチド、及び
このアセチル化ポリペプチドの製造方法も提供される。

目的ポリペプチドの構造遺伝子の５′末端に特定のアセ
チル化シグナル配列全設けることにより、この遺伝子が
酵母中で発現される場合にＮ−末端アミノ酸がアセチル
化されるであろう。アセチル化シグナル配列は、少なく
とも最初の２個のＮ−末端アミノ酸をコードし、ここで
第１のアミノ酸はアラニン又はグリシンのいずれかでお
シ、そして第２のアミノ酸は極性アミノ酸であって、通
常はスレオニン、セリン又はアスｚ４　ラギン酸である
。酵母中で産生されるヒト−スーパーオキシドジスムタ
ーゼのアセチル化は最初の２個のアミノ酸がそれぞれア
ラニン及びスレオニンである場合に示される。

（具体的な貌明） ヒト−Ｃｕ　−Ｚｎスーツや−オキシドジスムターゼ（
ｈｓＯＤ　）の生物学的活性を有するポリペプチドの効
率的ガ発現のための方法及び構成物が提供される。この
方法は、発現宿主における発現のために最適化された翻
訳開始領域と共にｈｓＯＤのアミノ酸配列の実質的な部
分全コードするＤＮＡ配列（ｈｓＯＤ遺伝子）を使用す
る、。このｈｓＯＤ遺伝子は、便利には細胞外培地から
ＳＯＤ生底物を回収するために分泌を可能にする条件の
もとで、宿主中での発現に適するベクターに挿入する。

ｈ　ＳＯＤ及び他のポリペプチドのＮ−末端アセチル化
のための方法及び構成物も提供される。これ以後、アセ
チル化とはポリペプチド及び蛋白質のアミン末端への付
加を意味し、天然にも観察されるようなアミノ酸側鎖、
例えばリジンの修飾と対照される。ポリペプチド及び蛋
白質のアセチル化は多くの理由によシ有用である。細胞
質ｈｓＯＤの場合のようにポリペプチドの天然状態がア
セチル化を含む場合、アセチル化を含む発現法は、望ま
しい天然構造及び配置を有する生成物を提供てろ。

生成物が医療として使用され、そして／又は試験管内も
しくは生体内診断に使用される場合、アセチル化物は、
宿主に投与され、そして／又は生物学的サンプルに暴露
された場合に、免疫原性を最小にし又は除去するであろ
う。さらに、アセチル化ポリペプチドは一層安定であシ
そしてプロテアーゼによる分解に対して一層耐性であり
、それ故に細胞、血液、体液及び組織液中に長時間存在
するであろう。

ｈｓＯＤ又は他のポリペプチドの構造遺伝子はその５′
−末端にアセチル化シグナル配列を含有し、このシグナ
ル配列は酵母発現宿主にアセチル化を行わせる。アセチ
ル化シグナル配列はポリペプチド中の少なくとも最初の
２個のＮ−末端アミノ酸ヲコードする。第１のアミノ酸
はアラニン、グリシン又はセリンであり、第２のアミノ
酸は極性アミノ酸又は芳香族アミノ酸であシ、通常はス
レオニン、セリン、アスノクラギン酸又はフェニルアラ
ニンである。

これらのアミノ酸は、発現されるべきポリペプチド中に
天然に存在する天然Ｎ−末端アミノ酸であってよい。こ
れは、第１アミノ酸及び第２アミノ酸がそれぞれアラニ
ン及びスレオニンでおるｈｓＯＤの場合である。酵母中
で発現されそしてアセチル化されるであろう他の天然ア
セチル化蛋白質には次のものが含まれる。

チトクロームＣヒト、赤毛ザル、ＧＬＹ−ＡＳＰイヌ、
ウマ等 チトクロームＣヒマ、ゴマ、　ＡＬＡ−８ＥＲヤエナリ
等 グルタメートデヒ　ニューロスポーラ　５ＥＲ−ＡＳＮ
ドロダナーゼ カルモジュリン　ブタ　５ＤＲ−ＡＬＡミオシン　□　
５ＥＲ−ＰＨＥ （ライト鎖Ａ２） ＡＤＨショウジヨウバエ　５ＥＲ−ＰＨＥこの発明はま
た、天然にはアセチル化されないポリペプチド及び蛋白
質をアセチル化するためにも有用である。アセチル化は
、ポリペプチドの構造遺伝子の５′−末端にアセチル化
シグナル配列を連結することによって達成されろ。この
アセチル化シグナル配列は少なくとも２個のアミノ酸（
上に記載した）をコードし、そして１０個まで又はそれ
以上のアミノ酸、好ましくは５個よシ少ないアミノ酸を
コードすることができる。ポリペプチドの目的とする活
性の妨害又は喪失を制限するために追加されるアミノ酸
が少ない方が一般に望ましい。便利には、よく知られて
いる方法に従ってシグナル配列を合成し、そして構造遺
伝子に連結する。

アセチル化シグナル配列全構造遺伝子に付加する代りに
、ポリペプチドの最初の２個のアミノ酸の内の１個又は
両者を置き換えるために構造遺伝子の５７−末端を変形
することも場合によっては可能であろう。このような変
形は種々の常法に従って行うことができる。例えば、構
造遺伝子をその５′−末端の近傍で切断して既知数のヌ
クレオチドを除去する。次に、切断後の接着末端に合成
オリゴヌクレオチドを連結する。このオリゴヌクレオチ
ドは塩基対を復元しそして置き換えて所望のアセチル化
シグナル配列金もたらすでおろう。この方法に代えて、
例えばファージＭ１３’に用いる部位特定変異誘発法を
用いて構造遺伝子の５７−末端に適当々変形を行うこと
ができる。

ｈｓＯＤを製造するためにはｈｓＯＤ全コードするＤＮ
Ａ配列配列心得とが必要でちる。このような耽。

列を完成するための１つの方法は、ｈｓＯＤを産生する
細胞由来のメツセンジャーＲＮＡからｃＤＮＡをクロー
ニングする方法である。便利には、この目的のためにヒ
ト肝臓細胞音用いることができる。

ＤＮＡコード配列は未知であるが少なくとも一部分のア
ミノ酸配列が知られている場合、　ｃＤＮＡ　ｆクロー
ニングした後、このｃＤＮＡ　ｆ、アミノ酸残基の特定
の連鎖全コードするヌクレオチドの可能性のあるすべて
の配列を有するグローブ混合物を用いてスクリーニング
する。合成すべき異るヌクレオチド配列の数を最少にす
るようにアミノ酸残基を選択するのが一般的であるが、
ヌクレオチドがコードするアミノ酸残基の選択は幾分任
意である。

ｈｓＯＤ’については、少々くとも１９−２４位のアミ
ノ酸残基金コードするＤＮＡ配列を便利に使用すること
ができ、特に、約１５以上で且つ約２０以下の塩基を有
するグローブ、さらに便利には約１７塩基を有するプロ
ーブを使用する。次に、ラベルされたプローブとバイブ
リド形成したと思われるクローン全制限酵素で消化し、
ＤＮＡ断片を画分し、そしてｈｓＯＤ中のアミノ酸残基
の前記の場合と異る連鎖をコードする第２シリーズのグ
ローブを特に用いてバイブリド形成金繰シ返す。便利に
は、これらのアミノ酸残基は１０９−１１４位の残基で
ある。両ゾローブに陽性でおる１個又は被数個のクロー
ンを見出し、そしてこれ’ｅ％ｈｓＯＤの少なくとも実
質的な部分をコードするｃＤＮＡの入手源として使用す
ることができよう。

全く驚くべきことに、ｈｓＯＤについて発表されている
アミノ酸配列とｃ　ＤＮＡによってコードされているア
ミノ酸配列とが、有意々個数の残基において異ることが
見出された。具体的には、２つの公表された配列［Ｊａ
ｈｕｓｃｈ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８０）
１且：２３１０−２３１６；及びＢａｒｒａ等、ＦＥＢ
Ｓ　Ｌｅｔ’ｔｅｒｓ（１９８０）　１２０　：１５３
−１５６）が異っている場合、正しい帰属は１１位の残
基がアスパラギン酸；　１７位ｏ残ｘがイソロイシン；
２６位の残基がアスノやラギン；４９位の残基がグルタ
ミン酸；５２位の残基がアスパラギン酸１５３位の残基
がアスノ臂うギン；９２位の残基がアスパラギン酸１５
３位の残基がセリンである（第４図参照のこと）。

リボゾーム結合部位と一般にＡＵＧである翻訳開始コド
ンとの間の分離が翻訳に及はす影響かはつきシしないた
め、この発明の方法は、す？シーム結合部位と開始コド
ンと全分離する距離及びヌクレオチド全変える技法全提
供する。リボゾーム結合部位と開始コドンとの間のスペ
ーサー中に、一般に約６〜１５個、さらに一般には約６
〜１２個のヌクレオチドが存在する。開始コドンから下
流の塩基配列もまた翻訳効率に影響するから、この発明
の方法はさらに、遺伝的コードの冗長な制限によって許
容されるように、ポリペプチドの最初の数個の５′−コ
ドンの範囲内でヌクレオチド配列の変化（但し長さの変
化ではない）全提供する。

この変形は、開始部位から下流の４コドン以下、さらに
一般には２コＰンを意図する。

以下余白 多数のリンカ−を調製する。このリンカ−においては、
２個以上のヌクレオチド、通常は３個以上のヌクレオチ
ドであって１０個以下のヌクレオチド、通常は約６個以
下のヌクレオチドが異なシ、これには、スペーサー内で
あれば４ヌクレオチドのそれぞれ、あるいはポリペプチ
ド構造遺伝子内であれば遺伝的コードの冗長性によって
許容されるように２個、３個又は４個のヌクレオチドの
構成員が含まれる。さらにヌクレオチＰの構成員を異に
するリンカ−を調製して配列のみならず長さも異る１群
のリンカ−を得る。長さの相違は、リンカ−の合成中に
支持体の一部を取多出し、そして適当であれば次の段階
において合成を継続し、種々の配列長さを有するリンカ
−を得る。通常、リンカ−混合物は１個以上６個以下、
通常は４個以下のヌクレオチドによシ長さを異にするで
あろうＯ これは、不存在塩基が末端にある場合に便利に例示する
ことができる。各段階の支持体の一部分を取シ出し、そ
して各段階において４種類すべてのヌクレオチド（ｄＮ
ＴＰ　）を与えながら、支持体に結合した鎖を用いなが
ら合成を続ける。次に、これらの単鎖を部分的に相補的
な単鎖にノ司ブリド形成せしめる。この場合可変佃域は
オーバーハングとなるであろう。こうして、ヌクレオチ
ド及び長さの両方において異るオーバハングを有する種
々な一連のリンカ−が得られるであろう。この後のバイ
ブリド形成操作、連結操作又はクローニング操作中の適
当な時点でオーバーハング領域を満たしくｆｉｌｌ　ｉ
ｎ）て、さらに操作することができる二重鎖材料を得る
。この方法は一般に、そして好ましくは試験管内におい
て、ＤＮＡポリメラーゼ■のに１ｅｎＯＷ断片を用いて
行う。この方法に代えて、ある場合には、オーバハング
を単鎖としてクローニングし、形質転換（ｔｒａｎＢｆ
ｏｒｍ又はｔｒａｎｓｆｅｃｔ）された轍主中で満たす
（ｔｔｔｔ　ｓｎ）することができる。相補鎖へのバイ
ブリド形成は、可変ヌクレオチド連鎖から上流に、リン
カ−が連結されるべき末端配列中に存在する配列に相補
的である５′−配列を有することによって達成すること
ができる。

次に、欠損塩基を試験管内又は生体内において満たす。

リンカ−はその配列内に、りがシーム結合部位と開始コ
ドンとの間の領域の少なくとも一部分を含有し、好まし
くは開始コドンに近い側のヌクレオチドを含有する。リ
ンカ−はさらに、開始コドン及び構造遺伝子の部分、リ
ボゾーム結合部位、並びにＩＪ　＆シーム結合部位から
上流の塩基（転写制御配列を含み又は含１ない）を含有
することができる。

通常、リンカ−は約５塩基以上、さらに一般的には約２
０塩基以上であ多、そして通常約２００塩基以下、さら
に一般的には約１００塩基以下である。リンカ−が約３
５塩基よシ大である場合、これは通常は次のようにして
集成されるであろう。

すなわち、相補鎖の一部分のみと相同な約１０〜３５塩
基の単鎖配列を用い、すなわちオーバハングを有する相
補的なオーバーラツプ配列を得、そして種々の単鎖をバ
イブリド形成し、連結し、そして変化及び／又は種々の
長さのオーバーハングを上記のようにして満たして接着
末端及び／又は平滑末端を有する所望のリンカ−を調製
する。

構造遺伝子が、開始コドンから通常約５０塩基以下下流
に便利な制限部位を有する場合には、構造遺伝子を含有
する断片を制限酵素処理し、そしてリンカ−の相補的な
接着末端に連結し、又は平滑末端に満たしてこの平滑末
端をリンカ−の平滑末端に連結する。構造遺伝子が完全
であシ、そしてリーディングフレームが開始コドンと整
合することを保証するようにリンカ−を工夫する。

前記のように、リンカ−の調製において、ヌクレオチド
、すなわちコード鎖中０４種顛の可能なヌクレオチドの
そ牡ぞれの無作為な連鎖（前記の遺伝的コードの制限の
規則に従う）を有し、そしてリボゾーム結合部位と開始
コドンを中介又は架橋する領域を規定するヌクレオチド
の１個又は複数個が欠けて種々の長さを有する一連のリ
ンカ−を得る。単鎖から調製されるこれらのリンカ−を
他の単鎖又は二重鎖ＤＮＡ鎖に連結して、リポゾーム結
合部位のみならずＩＪ　ｉｅシーム結合部位から上流の
塩基も含むことができる延長されたリンカ−を得ること
ができる。これに代えて、リンカ−は比較的小形であシ
、リポゾーム結合部位の内側又はこれに隣接する部位か
ら始まヤ開始コドン部位又は構造遺伝子の内側に延びる
ものであってもよい。

以下余白 この発明の構成物を得るために棟々の断片を連結する特
定の順番は臨界的ではないが、便利にはまず構造遺伝子
をリンカ−に連結する。このＤＮＡ構成物は、構造遺伝
子のみならず、リボゾーム結合部位及びＩ）　ｇシーム
結合部位から上流の任意の追加のヌクレオチドを含むで
あろう。さらに、リバーシーム結合部位と開始コドンと
の間のヌクレオチド鎖のヌクレオチドの種類及び個数に
実質的な多様性が存在するであろう。この発明のＤＮＡ
構成物は、該ＤＮＡ構成物挿入部位から上流に必要な転
写開始制御配列を有し、下流に転写停止制御配列を有す
る適当な発現ベクターに挿入される。すなわち、リンカ
−はその５′末端において転写開始制御シグナル配列に
接しそしてその３′においてコード領域の少なくとも一
部分、及び転写及び抽訳停止配列に接して位置するであ
ろう。（５′−及び３′−は転写の方向を意味する。） 適当な宿主に導入するためのプラスミド又はウィルスＤ
ＮＡを調製した後（通常、操作の適当な段階において柚
々のｉ−バーハング領域を満たすことを含む）、宿主を
形質転換（それぞれ、ｔｒａｎｓ−ｆｏｒｍ又はｔｒａ
ｎｓｆｅｃｔ　）　Ｌ／、クローニングし、クローンを
ストリークし、そして目的生成物、例えばｈｓＯＤの産
生を測定することによって効率的な発現について個々の
クローンを選択する。生成物の種々の産生レベルを決定
するためにスクリーニングすべきクローンの数は、合成
リンカ−に導入された長さの多様性及び配列の変化の程
度に依存し、そして比例するであろう。例えばこの発明
の具体例において、４種類の長さの変化、及びリンカ−
中の６個のヌクレオチドの各々における４重の変化が存
在すれば、可能な組換配列の数は５４４０である。連通
、少なくとも数百、好ましくは数千又はそれより多くの
クローンをスクリーニングするテアロウ。スクリーニン
グハ、ニトロセルロース又は他の適当な材料のＰ紙に移
した宿主細胞コロニー又はウィルスプラークのウェスタ
ンプロット法（生成物の抗体検出）を用いて効率的に行
うことができる。この方法に代えて、電気泳動法によシ
、多数のレーンを用意して各レーンに個々のりローンを
割シ合て、生成物のバンドの染色強度、オートラジオグ
ラフィー又はウェスタンプロットの観察により、直接的
に比較して最も効率的に発現するクローンを見出すこと
ができる。適当であれば、さらに定量的な免疫測定又は
酵素測定を使用することができるが、通常は前記のスク
リーニング法で十分である。

所望により、この構成物を、この発現構成物の制御シグ
ナルを認識する他の宿主に移すことができ、あるいは他
の宿主における効率的な発現を得るために必要な制御シ
グナルを適当な部位に導入することによって発現構成物
を変形することができる。

所望により、ｈｓＯＤを第２のリーダー及びプロセシン
グシグナルに連結して、ｈｓＯＤの分泌及びプロセシン
グを得ることができる。種々の分泌リーグ−及びプロセ
シングシグナルが文献に記載さＪｚている。例えば、米
国特許槙４，３３６，３３６号、及び同第４，３３８．
３９７号、並びに１９８３年８月１２日に出願された係
属中の米国特許出願第５２２，９０９号、及び１９８３
年４月２６日に出願された係属中の米国特許出願第４８
８，８５７号を参照のこと。

これらの対応部分を引用にょシこの明細書に組み入れる
。

宿主として特に好ましいものは、細菌、藻類、菌類等の
どとき原核生物及び真核生物の両者を含む単細胞微生物
である。特に、ム１支（４）辺」）、■阻）が宿主とな
シ得る。

単細胞微生物中で用いるために広範囲の？ｆｆＷ４のベ
クターを使用することができ、ベクターはプラスミド及
びウィルスから誘導することができる。

ベクターは単コピーベクター、又は低コピーもしくは高
コピーベクターのいずれであってもよい。

ベクターはクローニング及び／又は発現のために機能す
るであろう。ベクターに関する多くの文献が存在し、多
くのベクターを商業的に入手することができ、そしてベ
クター及びその制限地図並びに特性を記載した手引書ま
で存在するから、ここでさらに検討する必要はない。よ
く知られているように、ベクターは選択を可能にするマ
ーカーを含有するのが普通であり、とのマーカーは細胞
毒剤耐性、栄養袂求性又は免疫性をもたらすであろう。

しばしば、異る特性をもたらす多数のマーカーが使用さ
れる。

マーカーのほかに、ベクターは複製糸を有し、そして発
現ベクターの場合には通常、転写開始及び停止の両制御
シグナル、例えばプロモーター（単一７’ロモーター又
は多数縦列ｆｏモモ−−）、ｍＲＮＡキャッフ配列、Ｔ
ＡＴＡ　、＋ζワックスエンハンザ−、ターミネータ−
、ポリアデニル化配列、及びターミネータ−と関連する
１個又は複数個の終止コドンを含有するであろう。翻訳
のためには、リボゾニム結合部位及び１個又は複数個の
終止コドンがしばしば存在するであろう。もつとも、終
ｊ１：コドンは通常は構造遺伝子と関連しているであろ
う。これとは異って、これらの制御配列は、ベクターに
導入される構造遺伝子を含有する断片上に存在すること
もできる。

通常、構造遺伝子を発現ベクターに挿入するために便利
な位置に１個又は複数個の制限部位が存在するであろう
。一旦挿入した後、構造遺伝子を含有する発現ベクター
を適当なベクターに導入し、そして宿主をクローニング
してｈｓＯＤの効率的な発現を得ることができよう。

ある場合には、特殊な性質、例えば発現の温度感受性、
転写制御のためのオペレーター又はアクチペーター等を
ベクターに備えることができる。

特に有利なものは、外的手段、例えば温度、インデー−
ザー、コンプレッサー等によシ転写を制御することがで
きる能力であり、この能力がある場合には外的化合物、
通常は有機化合物により転写を誘導し又は抑制すること
ができる。

ｈｓＯＤが細胞内に産生される場合には、細胞培養物が
高濃度に達した時に便利には遠心分離によシ細胞を分離
し、溶解し、そして種々の方法、例えば抽出、アフィニ
ティークロマトグラフィー、電気泳動、透析、又はこれ
らの組合わせにょシｈｓＯＤを分離する。生成物が分泌
される場合には、培地について上記と同様の方法を用い
る。しかしながらこの場合、細胞溶解物の場合に比べて
、培地中の全蛋白質に対する目的生成物の割合が実質上
高いであろう。

産生されたｈｓＯＤは天然のヒト−スーパーオキシドジ
スムターゼと実質上同一のアミノ酸配列を有し、アミノ
酸の相違は一般に５個よシ少なく、さらに一般的には２
個よシ少ない。組換ｈ　５ＯＤ（ｒ−ｈｓＯＤ　）は、
天然のｈｓＯＤと実質上同一の生物学的性質を有する。

生物学的性質には免疫的性質が含まれ、真正なｈｓＯＤ
に対して生じた抗体がｒ−ｈｓＯＤと交差反応する。さ
らに、ｈ　ＳＯＤについて用いる一般的なバイオアッセ
イにおいて、ｒ−ｈｓＯＤ生成物は蛋白質重量に対して
実質的な比率を示し、通常は真正なｈｓＯＤの約１０チ
以上、好ましくは約５０チ以上、さらに好ましくは約８
０−以上である。代表的な測定法がＭａｒｋｌｕｎｄ及
びＭａｒｋｌｕｎｄ、　Ｅｕｒ、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　（１９７４）４７　：４６９−４７４に記載されて
いる。

次に、例によりこの発明をさらに詳細に説明する。但し
、これによシこの発明の範囲を限定するものではない。

実験 ｈｓＯＤ　ｃＤＮＡの分子クローニング成人の肝臓から
、グアニジニウムチオシアナート／塩化リチウム法ＣＣ
ａｔｈａｌｔ等、四人（１９８３）２：３２９−３３５
　：ｌによシ全ＲＮＡを調製した。ポリＡ　ＲＮＡを用
いて２重鎖ｃＤＮＡを合成しくＭａｎ　ｉ　ａｔ　ｉ　
ｓ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　＋　２１
３−２４２　＋Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
＋　１９８２　）、そしてこれヲセファロースＣＬ４Ｂ
カラムに通して３５０　ｂｐより大きいｃ　ＤＮＡを濃
縮した［：　Ｆｉｄｄｅｓ及びＧｏｏｄｒｎａｎ、　Ｎ
ａｔｕｒｅ　（１９７９）２８１　：３５１−３５６〕
。ｃ　ＤＮＡをｐ　ｌｏｔ　４のＰｓｊ　Ｉ部位に挿入
した。ｐｌｏｊ４は、ｐＢＲ３２２の誘導体であって、
ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ部位に代えて次の配列を有する。

以下余白 ｃ　ＤＮＡの挿入にはオリゴｄＧ　：　ｄＣテーリング
法（Ｍａｎｉａｔｌｓ等、前掲）を使用した。この混合
物によ、！１１　Ｅ、　王！Ｊ　Ｄ１２１０　株を形質
転換し、そして形質転換体を１０μ、９／ｒｕｅのテト
ラサイクリンを含有するＬ−寒天（Ｋｕｓｈｎｅｒ　Ｓ
、　Ｒ，（１９７８）Ｉｎ　：　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ＋　Ｂｏｙｅｒ　Ｈ，Ｂ、及びＮ１
ｃｏｓｉａ　Ｓ、編、（エルゼビル／北オランダ、アム
ステルダム）１７頁〕上で選択した。肝臓ａ　ＤＮＡ　
ライブラリーを構成するプラスミドＤＮＡを、直径９　
ｃｍの０）９皿当り約３，０００コロニーの密度でプレ
ートした約６２，０００個の組換コロニーから直接に調
製した（　Ｍａｎｉａｔｌｓ　等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ　、　８６〜９４頁、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　１９８２　）。

ｒ−ｈｓＯＤクローンの分離 菌株Ｄ１２１Ｏを肝臓ｃＤＮＡライブラリーにより形質
転換し、そして約４０，０００のクローンが直径１４ｃ
ａ＋のｄ　）り皿９枚の上に増殖した。コロニーをニト
ロセルロース紙上に移し、そしてシラスミドＤＮＡのク
ロラムフェニコール増幅を行った後、細胞を溶解し、そ
して濾紙を・・イブリド形成のために調５製した［　ｌ
５ｈ−Ｈｏｒｏ＊ｉｃｚ及びＢｕｒｋｅ　＋１ｉｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９８１）
　９　：２９８９−２９９８　）。オリゴヌクレオチド
プローブを使用してバイブリド形成によるスクリーニン
グを行った。このプローブは、蛋白質のアミノ酸残基第
１９−２４位をコードするｍＲＮＡに相補的な酵素的に
放射性ラベルした化学合ＤＮＡ分子から成ｐ　（Ｊａｂ
ｕｓｃｈ等、前掲：　Ｂａｒｒａ等、前掲）、このプロ
ーブ混合物は次の配列を有する。

３’　ＴＴＡ　ＡＡＡ　ＣＴＴ　ＧＴＴ　ＴＴＴ　ＣＴ
　５’ＧＣＣＣ ４プチドをコードするために示された可能性のすべて（
３２種類）をｇｌ、Ｇｉ製した。

プローブを、５２Ｐを用いて比活性が１〜３×１１０８
ｃｐ／μｇ　となるようにラベルし、そしてミリポアフ
ィルタ−（０，４５μｍ　）で濾過して使用した。

濾紙を、３０℃にて６時間、４ＸＳＳＣ１２×デン／％
−ト溶液、４０ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐ）Ｉ　７．５゜
３００μ９７ｍｌ　超音波処理したサケ試験ＤＮＡ中で
前バイブリド形成した。バイブリド形成は、２　Ｘ　１
’０６ｃｐｍ／ｍ１ｈｓＯＤ　ＤＮＡ　７　ｏ−ブを含
有する上記と同じ溶液中で３０℃にて２０時間行った。

濾紙を、ｄＸＳＳＣ中で１５分間室淵にて１回洗浄し、
そして１５分間ずつ２回３０℃にて洗浄し、吸取紙を用
いて乾燥し、そして増強スクリーンを用いて一７０℃に
て２４時間オートラジオグラフ処理した。二重陽性シグ
ナルに対応するマスタープレート上の領域をＬ−ブロス
に拾い上げ、そしてミニヌクリーン法（Ｍａｎｔａｔｉ
ｓ　ｓ、蜘セ猥旦坪ＪＣＩｏｎｉｎｇ、１７８，３６８
−３６９．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　＋　
１９８２　）によりプラスミドＤＮＡを調製した。この
ＤＮＡをＰｓｔＩで切断し、そしてサザンブロセット分
析（５ｏｕｔｈｅｒｎ　Ｊ、　、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ
。

（１９７５）Ｓす：５０３−５１７　］にかけた。この
方法においては、まず、あらかじめラベルしたプローブ
（アミノ酸残基第１９−２４位に対応）とバイブリド形
成せしめ、そして次に追加の放射性う４ルデロープとバ
イブリド形成せしめた。このプローブはアミノ酸残基第
１０９−１１４位に対応し、そして次の配列を有する（
可能なすべての変形。

すなわち７２柚類の変形が存在する）。

３’　ＣＴＡ　ＧＴＡ　ＡＣＡ　ＴＡＡ　ＴＡＡ　ＣＣ
５’ＧＧＧＧ Ｔ １つのプラスミドゾール（ｐｓＯＤｌ　）が両プローブ
とバイブリド形成する５２０ｂｐのｃＤＮＡ挿入部を含
有していた。コロニーを′＃製し、そしてこのクローン
からプラスミドＤＮＡを調製した後、Ｍａｘａｍ及びＧ
ｉ　１ｂｅｒｔの方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ。

胆へ（，１９７７）入迭：５６０−５６４　）によシ配
列決定した。結果を第４図に示す。ｈｓＯＤ　ｃＤＮＡ
　クローンｐ　ＳＯＤ　１は、ｈｓＯＤのアミノ酸ｔｏ
−１５３位のコード領域、１個の翔訳終止コドン、及び
３′非翻訳領域を構成する。従うて、発現ベクター構成
物においては、アミノ酸１−９位をコードする領域の塩
基配列はｈｓＯＤの公表されているアミノ酸配列（Ｊａ
ｂｕｓｃｈ　等、前掲：　Ｂａｒｒａ　’％、前掲）か
ら導き、そして多様なリンカ−セグメントの部分として
化学的に合成する（下記を参照のこと）。

シラスミドｐｌｏｔ５の造成（第２図及び第３図参照の
こと） バイブリドｔｒｐ−ｊａｃ　（ｔａａ　）ブロモ−ター
［ＤｅＢｏｅｒ等、ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ（１９８３）ジ０：２１−２５］
を含有するプラスミドｐ　ｌ　ｏ　ｔ、　１　を次のよ
うにして造成した。ｐｔｒ工Ｌ１　［：Ｅｄｍａｎ等、
Ｎａｔｕｒｅ、（１９８１）２９１　：５０３−５０６
）の１８０ｂｐ　Ｈｇ１Ａ−ＴａｑＩ断片、及びｐＫＢ
２６８　［Ｂａｃｈｍａｎ及びＰｔａｓｈｎｅ、　Ｃｅ
１ｌ　（１９７８）１３　：６５−７１）からの５８ｂ
ｐ湛旺■−とｏＲＩ断片をグル分離し、そしてこれらの
断片を、Ｐｓｊｌ及びＥｃｏＲＩによシ消化したｐＢＲ
３２２に連結する。

得られたプラスミドを用いてＤＩ２１０株を形質転換し
、そしてテトラサイクリン耐性についてクローンを選択
した。プラスミドｐ、１ｏｔ３を次のようにして造成し
た。ｔａｅプロモーターを含有するｐ独」１の１５５　
ｂｐ　Ｆｎｕ　４ＨＩ−ヱ並ＲＩ断片Ｃ魚４ＨＩ部位は
ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌ　ｅ　ｎ　ｏｗ断片（ｒ　
ｐ、ｏｌ　ＩＫ　Ｊ又はｒ　ｐｏｔ、　Ｋｌｅｎ、　Ｊ
　）を用いて平滑末端化したもの〕、及び次の配列、以
下余白 を准する１ＩＡＮ７の１８　ｂｐ杓逮ＲＩ−片り■ポリ
リンが断片なケゞル分離した。ｐＢＲ３２２をＥｃｏＲ
Ｉで消化し、ｐＯＩＩＫを用いて平滑末端化し、次に！
’＝ｔ■で消化し、そしてグルｒｌ製して得た断片に、
上記２個の断片を連結した。この連結混合物を用いてＤ
１２１０株を形質転換し、そして１０μ９／ｍｌのテト
ラサイクリンを含有するし一プレート上で選択しブこ。

プラスミドｐｌｏｔ　５を次のようにして造成した。

１ず、ｐＢＲ３２２中のハ逮ＲＩ−均１■間をＨＡＮ　
７のポリリンカーで換き代えたプラスミドを造成した。

これを行うために、プラスミドＨｋＮ７をＨｉｎｄＩＩ
ｌで消化し、ｐｏｌＩＫを用いて満たすことによって平
滑末端化し、そしてこうして変形したシラスミドＩＩｋ
Ｎ７に、合成した自己相補的Ｐｖｕ　Ｉｆ　’）ンカー
分子（ｄ（５’　−ＣＣＡＧＣＴＧＧ−３’　））を連
結した。旺９ＲＩ及びＰｖｕ’　ＩＩで消化した後、得
られた４４ｂｐのポリリンカー断片（４塩基のオーバー
ハングを有する）をダル分離し、そしてＥｃｏ　ＲＩ−
均１■置換体としてｐＢＲ３２２にクローニングした。

シラスミドｐｌｏｊ３をＥｃｏＲＩ−で消化し、そして
フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行
った後、突出している５′−末端をＳｔ　ヌクレアーゼ
ＣＰａ１ｍ１ｔｅｒ＋　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１
９７４）１３　：　３６０６−３６１５　：Ｈａｌｌｅ
ｗｅｌｌ及びＥｍｔａｇｅ、　Ｇｅｎｅ　（１９８０）
９　：２７−４７）で処理することによって平滑末端化
した。フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈
澱を行った後、ＤＮＡをＣ１ａＩで消化し、ｐｏＩＩＫ
によシ平滑末端化し、そして調製用ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により用プロモーターを含有する２３７ｂ
ｐ断片を分離した。次に、この平滑末端…プロモーター
断片をｐＢＲ３２２ポリリンカーシラスミド（第３図参
照）のＰｖｕ　ｎ部位に挿入し、そしてり！プロモータ
ーがｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子の方向に転
写を指令するクローンを得た。

ビド９Ｄを発埠す擾ｐｌｏｔ　５輯導体の造成第１図に
示す合成りＮＡ分子Ｆ（２６）、Ｃ（１６）、Ｂ　（３
１）　、　Ｄ（１１）、Ｅ（１３）　、及び４（２４）
をホスホルアミダイト法によシ合成した。単鎖４　（２
４）は、Ｘで示されている各部位において４種類すべて
の塩基を用いて合成した。さらに、２４７−の他に２１
マー、２２７−１及び２３マーが得られる様に２・１７
−の合成からシリカを除去した。シリカ支持体から取り
出した後、４袖類の混合物を適当な比率で混合して可能
な単鎖のそれぞれが等モル量となるようにした。この混
合物を次の段階において単一生成物として処理した。

分子Ｆ（２６）　、Ｃ（１６）、Ｂ（３１）、及びＤ（
１１）を等モル′量に混合し、そして１０μｇをＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼを用いて燐酸化した。フェノー
ル／エーテル抽出の俵、追加の非燐酸化合成りＮＡ分子
４．　（２４）、及びＥ（１３）を力ｎえ、すべての断
片が等モル量となるようにした。この等モル混合物は、
１３３μｌの０．３Ｘキナーゼ緩衝液中に１ａＩｇのＤ
ＮＡを含有する。

一定速度で７０℃から２０℃に６０分間にわたって冷却
することによりアニーリングした後、２００μｌの連結
混合物中１４℃にて４時間単鎖を連結Ｌ、フェノール／
クロロホルム抽出、及ヒエタノール沈澱を行い、そして
４（２４）及びＥ（１３）の５７−末端をＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、前掲）を用い
て燐酸化した。調製用ダル電気泳動を用いて、５′−及
び３′。−オーバーハングを有する完全に連結された５
　３　ｂｐ　の材料を分離した。

次に、上記の精製断片混合物を、第１図に示すようにｂ
ｓＯＤ’　ｃＤＮＡの４６０　ｂｐ　（ｉＩ一旦りＩ断
片に連結した。この断片自体は、４５４ｂｐηｚｑＩ−
へり４ＩｈＳＯＤ　断片を分離し、これをｐｏｌＩＫを
用いて平滑末端化し、そしてこれをｐ　ｌｏｔ　５のＥ
ｅ、ｏ　ＲＩ　−Ｅｉａｌ　ｎ部位（第３図）（同様に
して平滑末端化しておく）に挿入することによし造成し
た。

この組換体からプラスミドＤＮＡを調製した後、４６０
　ｂｐ　Ｔａｑ　Ｉ−Ｐｓｔ　Ｉ　ｈｓＯＤ　断片を調
製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動によシ分離した。

抽出及び沈澱を行った後、４６０ｂｐＴａ旦Ｉ−均１１
ｈ　ＳＯＤ断片に合成断片を連結することによって得ら
れた５１５ｂｐ断片をｐｏｌＩＫによシ満たしく５２５
−５２８ｂｐ）、そして次にＡＩで消化し、そして得ら
れた５　１９−５２２　ｂｐ　ｈｓＯＤ断片をポリアク
リルアミドゲル電気泳動により分離した。次に、この断
片を、Ｐ憇■及びミリ■で消化しそして次にアルカリホ
スファターゼで処理したｐｌｏ−ｔ５に挿入した。こう
して得られたプラスミドを使用してＤＩ２１０株を形質
転換した。Ｄ１２！０株の形質転換後に得られた組換体
を１００　ｌｔ９　／ｒｎｌのアンピシリンを含有する
し一寒天上で選択して、種種のＳＯＤ発現を行う１群の
クローン（ｐ　１ｏｔ５／ＳＯＤと称する″）を得た。

ｒ−ｈ明以ｐ発現及びｐｌｏｔｓ／ＳＯＤデ礼不斗尤ｐ
勇沢 全Ｅ、コリ蛋白質を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により分析するために、１夜培養したものをｌ　
ｍｌのＬ−プロス中に３０倍に稀釈し、そして３７℃に
て９０分間振とうして増殖せしめＯｏＤ、６５ｏを約０
，２とした。ＩＰＴＧ　（イソプロピルチオガラクトシ
ド）を最終濃度が２　ｍＭとなるように加え、そして培
養物をさらに３時間インキ−ベートした。遠心分離した
後、細胞ペレットを５０μｌのグルローディング緩衝液
［：　Ｌａｅｍｍｌ　ｉ　＋下ａｔｕｒｅ　（１９７０
）写げ：６８０−６８５〕に再懸濁し、そして１分間凍
結し、２分間煮沸し、そして１０秒間渦流攪拌する操作
を３回反復することによって溶解した。

電気泳動による分離（Ｌａｅｍｍ’ｌｉ　＋　前掲）を
行った後、蛋白質バンドをクーマシーブルーニヨリ染色
し、そして各クローンによシ産生されたＳＯＤの量を算
出した。次にこの結果を、真正ヒトＳＯＤに対する抗体
を用いるウェスタンプロット法により確認した。３００
を超えるクローンを分析した。

示されたＳＯＤ発現レベルは、はとんど又は全く発現し
ないものから全可溶性細胞蛋白質の５〜１０チに達する
ものまで多様であった。３００以上のクローンの内６ク
ローンについての結果を、Ｍａｘａｍ及びＧ１１ｂｅｒ
ｔの方法（前掲）によシ決定したＤＮＡ分子４（２４）
の特定の配列と共に第１表に示す。

第１表 Ｅ、コリにおけるＳＯＤ産生レベルと配列ｐｓＯＤＸ８
　ＡＡＣＡ　Ａ　Ｇ　５　％ｐｓＯＤ１１　ＧＴＡＴ　
Ｔ　Ｇ　１０　チｐｓＯＤｘ１６　ＡＣＡＴ　Ａ　Ａ　
５　％ｐｓＯＤ５　ＡＡＴＣＡ　Ａ、１０　チｐｓＯＤ
１６　ＡＴＴＴ　Ｔ　Ｔ　１０　％以下余白 γ−ｈｓＯＤの測定 酵素測定を行うため、１００−の培養物を上記のように
してインキュベートした。細胞ペレットを同容量の直径
０．４５〜０．５　ｔａｎのガラスピーズ（Ｂｒａｕｎ
　ＡＧ　）及び同容量の測定緩衝液（５０ｒｒＭＴｒｉ
ｓ−カコジレート、ｐＨ８，２，１’ｍＭジエチレント
リアミンペンタ酢酸）と共に１．５ｄのミクロフユージ
チューブ中４℃にて渦流攪拌する（１０×２０秒間）こ
とによシ可溶性細胞抽出物を調製した。このチューブを
ミクロフユージ（Ｂｅｃｋｍａｎ）中で１分間回転せし
めることによシ細胞片をペレット化した。上清液を、１
ｍＭ硫酸亜鉛及び１−硫酸銅を含有する測定緩衝液に対
して、４℃にて４時間透析した。

ピロガロール法（Ｍａｒｋｌｕｎｄ及びＭａｒｋｌｕｎ
ｄ　ｓ前掲）の方法を用いてＳＯＤの測定を行った。反
応混合物として測定緩衝液中０゜２ｍＭピロガロールを
用い、５分間にわたって反応速度を測定した。

この測定においては、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ
　８４５０分光光度計を４２０　ｎｍにて使用した。４
種類の異る測定サンプル、すなわちＥ、コリ抽出物、真
正ｈｓＯＤ、及び真正ｈｓＯＤに対するラビット抗体と
共に前インキュベートした前記２種類のサンプルを調製
した。各サンプルをキュベツト中で２５℃にて１分間イ
ンキュベートした後、ピロガロールを加え、そして２５
℃において測定した。抗体サンプルは、測定緩衝液中で
５μノの抗体と共に室温にて１０分間前インキュベート
した。これらの条件は、１１００ｎの純ｈｓＯＤを不活
性化するのに十分であることが見出された。

次の第２表に試験したクローンの１つ（ｐＳＯＤＸ８）
の結果を示す。

以下余白 第　２　表 Ｅ、コリ［Ｄ１２１０（ｐＳＯＤＸ８）株〕にお込て産
生されたヒト−Ｃ１ｌ−Ｚｎ　５Ｏｒ）の酵素活性酵　
素　標　品　ＳＯＤユニッ）殉蛋白質純−ヒトＣｕ−Ｚ
ｎ　ＳＯＤ　１５，３８４ｐｓＯＤＸ８蛋白質抽出物　
３，０１７抗−ヒトＳＯＤ抗体と共に前　６８５ インキユベートしたｐ堕ＤＸ８ 蛋白質抽出物 ｐｌｏｔ５蛋白質抽出物　４７０ 抗−ヒトＳＯＤ抗体と共に前　４８５ インキユベートしたｐｌｏｔ　５ 蛋白質抽出物 これらのデータは、全可溶性細胞蛋白質の約１５チがｈ
ｓＯＤであることを示している（対照として使用した純
−ヒ）　Ｃｕ−Ｚｎ　ＳＯＤが十分に活性であると仮定
する）。全可溶性細胞蛋白質の５〜１（ｌがｈｓＯＤと
して移動することを示す前記の電気泳動データと相まっ
て、実質的な両分、おそらく産生され九ｈｓＯＤの大部
分が活性であることが明らかである。

クローニングされた遺伝子の正しい配列をＭａｘａｍ及
びＧ１１ｂｅｒｔ　（前掲）の方法によシ決定した。さ
らに、Ｎ−末端の最初の１２アミノ酸を自動エドマン分
解法によシ決定した。検出されたアミノ酸酸列な次に示
す。

ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＬＹＳ　−ＡＬＡ−ＶＡＬ−（ＣＹＳ
　）　−ＶＡＬ−ＬＥＵ−ＬＹＳ−ＧＬＹ−ＡＳＰ−Ｇ
ＬＹ− 検出された第１　ＡＬＡ残本はインプットしたペプチド
の濃度とおよそ等モルの濃度で存在し、ブロックされた
アミノ酸末端が存在しないことが示された。使用したア
ミノ酸分析法によってはＣＹＳ残基は検出されなかった
が、この存在はヌクレオチド配列から推定された。

すなわち、（Ｎ−ホルミル）メチオニンは細菌発現生成
物から除去されており、そしてこの物質は正しいアミノ
酸配列、すなわち、細胞質ｈｓＯＤ残基１−１０につい
て報告されている配列と同一であったが、Ｎ−末端ＡＬ
Ａ残基はアセチル化されてい力かった。さらに、Ｅ、コ
リ中で産生されたポリペブチｒは、荷電の相違を検出す
る１チアガロースグル（ＰＨ８，６）電気泳動（コーニ
ングユニバーサル電気泳動フィルム：　Ｃ１ａｕｓｅｎ
　＊Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅ　ｒ　５３０−５３１頁に従って染色）において天然
蛋白質よりゆっくシと移動し、やはりアセチル化の不存
在が示された。さらに、細菌ｈｓＯＤポリペプチド及び
精製された真正な（アセチル化された）天然蛋白質の両
者のトリプシン分解ペプチドの分析から、スヘてのトリ
プシン分解ペプチＰは同一であるが、細菌Ｎ−末端ペブ
チＰのみは異る移動、すなわちＮ−アセチル基が欠けて
いる（プチドについて予想される荷電を伴う移動をする
ことが示された。

γ−ｈｓＯＤ遺伝子を酵母ベクターに移すために、ｐｌ
ｏｔ５／ＳＯＤプラスミＰクローンを、コード領域の５
′−末端におけるＮｃｏＩ制限部位についてスクリーニ
ングした。ＡＴＧ開始コドンの５′に存在する可変ヌク
レオチドがＣＣであるシラスミドにおいて、配列ＣＣＡ
ＴＧＧがＮｃｏＩ部位を与える。クローンなスクリーニ
ングし、そして１個を選択し、そしてｐｈｓＯＤと命名
した。

プラスミドｐ　ｈ　ＳＯＤをＮｃｏＩ及び５ａｌＩで消
化し、そして５５０　ｂｐの断片を得た。この断片は、
５′−末端の１個の非翻訳ヌクレオチド、及びｈｓＯＤ
の完全なコード領域を含有する。ｐＰＧＡＰ　（ＧＡＰ
プロモーターを担持する酵母発現ベクター、後記の方法
により調製）をＮｃｏＩ及びＳａｌ　Ｉにより消化し、
そしてアルカリホスファターゼで処理し、そしてｐ　Ｐ
ＧＡＰ中のＮｅｏ　Ｉ　−Ｓａｌ　Ｉ断片を前記の５ａ
ｌＩ−ＮｃｏＩ断片で置換してｐＰＧＡＰｓＯＤを得た
。ｐＰＧＡＰｓＯＤをＢａｍ　ＨＩで消化して２ｋｂ断
片を得、これをグル分離し、これをｐｃｔ／１．及びｐ
ｅｔ／１ＧＡＬ４／３７０のＢａｍＨＩ部位に挿°入し
、それぞれプラスミドｐｃ　ｌ／ＩＧＡＰＳＯＤ。

及びｐｃｔ／ＩＧＡＬＧＡＰＳＯＤを得た。

シラスミドｐｃｌ／１はｐＪＤＢ　２１９　［Ｂｅｇｇ
ｓ　。

Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７５　：１０４）の誘導体
であり、ｐＪＤＢ２１９中の細菌プラスミドｐＭＢ９に
対応する領域が、ｐＣ１／ｌにおいてはｐＢＲ３２２に
よシ置き換えられてｂる。分泌及びプロセシングシグナ
ルを有する発現ベクターの調製については米国特許出願
箱５２２，９０９号を参照のこと。

ＧＡＬＩ／ＧＡＬＩＯ制御領域（ＧＡＬ４遺伝子発現生
成物により制御される）を含有する制御され得る酵母発
現ベクターであるシラスミドｐｃ　１／ＩＧＡＬ４／３
７０は後記のようにして調製する。

プラスミドＩ）Ｃｌ／ＩＧＡＰＳＯＤ　、及びｐｃ　ｌ
／ＩＧＡＬＧＡＰｓＯＤを、すでに記載されているよう
にして［、Ｈｉｎｎｅｎ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｅａｄ。

Ｓｅｉ、ＵＳＡ（１９７８）７５　：１９２９−１９３
３］、酵母２１５０−２−３株（ワシントン大学、Ｌｅ
ｅＨａ　ｒ　ｔｗｅ　１１から入手できる）に形質転換
した。次の第３表に示す発現結果が得られた。

以下余白 第３表 酵母２１５０株におけるヒ）　ＳＯＤの発現ｐｃｉ／１
　ｇ　、　Ｌ（１）Ｏ ｐＣｌ／ＩＧＡＰＳＯＤ　ｇ　、　Ｌ　１４８ｐｃｔ／
１ＧＡＬＧＡＰｓＯＤ　ｇ、Ｌ　Ｏ，４ｇａｌ　６ｇ 注（１）　すべての培養物は、ロイシンを含有せず、２
％の乳酸及び３％のグリセリンを含有し、２チのガラク
トースを含有し又は含有しない培地において、対数後期
又は定常初期ｉで増殖せしめた。

（２）　ＲＩＡによシ測定した。

ｈｓＯＤレベルを、標準として真正ｈｓＯＤを用りる標
準的放射免疫測定法によシ測定した。ＧＡＰプロモータ
ーからの構成的合成は全細胞蛋白質の１０〜３０チのオ
ーダーの非常に高レベルのｈｓＯＤの産生な導いた。ガ
ラクトースによる誘導もほとんど同様に機能し細胞蛋白
質の約７チをｈｓＯＤとして産生した。

ｈ８０Ｄがこのような高レベルで産生される場合には、
完全々酵素的すなわち触媒的活性を回収するために、補
欠群として亜鉛イオン及び銅イオ、ンを、生成蛋白質に
、硫酸亜鉛及び硫酸銅の両者の１ｍＭ溶液に対する透析
によシ与えることが必要である。この方法に代えて、亜
鉛イオン及び／又は銅イオンを１０の増殖培地に含有せ
しめることができ、この方法はさらに、高レベルのｈｓ
ＯＤを産生ずる菌株を選択するための手段、及び／又は
非選択培地でのｈｓＯＤを発現するプラスミドベクター
の喪失を回避するだめの手段を提供する。

ｐＰＧＡＰの造成 ｐＢＲ３２２の嬰ｎｄｌ１１部位にＧＡＰＤＨ遺伝子Ｇ
ＡＰ４９［Ｈｏ１ｌａｎｄ及びＨｏ１ｌａｎｄ、　Ｊ、
　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

（１９７９）２５４：５４６６−５４７４）を含有する
Ｈｉｎｄ　［１断片を挿入することによシ調製されたシ
ラスミドｐＧＡＰ１をＨｌｎｆＩで消化し、そして５０
０　ｂｐ断片を分離した。この断片なりａ１３１で切断
して約５０　ｂｐ又は９０　ｂｐを除去し、次にＴ（ｉ
ｎｄ　ＩＩＩ　’）ンカーに連結し、そしてＨｌｎｄｌ
ｌで消化した。ｐＢＲ３２２を）（ｉｎｄｌ［Ｉで消化
し、次にアルカリホスファターゼで処理し、そして約４
５　ｏｂｐ又は４１０　ｂｐの断片を挿入してｐＧＡＰ
１２８を得た。

ｐＧＡＰ　１２８を１４３−Ｑ　ＩＩＩで消化し、この
断片をＫｌｅｎｏｗ断片及びｄＮＴＰにより平滑末端化
し、そして生成した４　５０　ｂｐ断片をグル電気泳動
により分離した。この断片をＳｍ、ａ　ｌで消化し、ア
ルカリホスファターゼで処理したｐｌｏｔ５に挿入して
プラスミドｐｌｏｔ５ｐＧＡＰ１２８を得た。このプラ
スミドは約−４・００〜＋２７ｂｐのＧＡＰＤＨプロモ
ーター及びコード領域を含有する。

ＧＡＰＤＨターミネータ−とショートプロモーター領域
の間”に多制限部位リンカ−を有する酵母発現ベクター
ｐＰＧＡＰを次のようにして調製した。プラスミドｐｌ
ｏｔ５ｐＧＡＰ１２８を４ｔｍＨＩ及びｐツＩで消化し
て−４００〜−２６ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターを有
する約３９０　ｂｐ　ＢａｍＨＩ　−Ｔａｑ　Ｉ［片を
得た。

り凹ＨＩ−リリＩ断片を、−２５〜−１ｂｐのＧＡＰＤ
Ｈプロモーター及びＮｅｏＩを含む幾つかの制限部位を
含有し、そして次の配列、 ＣＧＡ２ＴＡ３（ＣＡ）３ＴＡ３ＣＡ、ＣＡＣＣＡＴＧ
３Ａ２Ｔ２ＣＧＴ２ＡＧ２Ｔ２ＡＴ３（ＧＴ）３ＡＴ３
ＧＴ３ＧＴＧＧＴＡＣ３Ｔ２Ａ２ＧＣＡ２ＴＣ２ＡＧρ
Ｔを有する合成断片に連結してＢ　ｈｍＨＩ　−８ａ　
Ｉ　Ｉ断片を得、これをＢａｍＨＩ及び５ａｌＩによシ
消化し、そしてこれを用いて、Ｂａｍ１（Ｉ−８ａｌＩ
消化されアルカリホスファターゼ処理されたｐＢＲ３２
２のＢａｍＨＩ−８ａｉｌ断片と置き換えた。連結した
後、プラスミ）　ｐＧＡＰＮＲ８を得、これをＢ　ａｍ
ＨＩ及び５ａｉｌで消化して４００　ｂｐ　Ｂａｍｌ−
８ａｌ　Ｉ断片を生成せしめ、これをゲル分離した。こ
の断片を、ＧＡＰＤＴ（ターミネータ−領域及び３′コ
ード領域のショートセグメントを含有する約９００　ｂ
ｐ　Ｓａｌ　Ｉ　＝　ＢａｍＨＩ断片に連結し、そして
生成した１、４　ｋｂ　ＢａｍＨＩ　−ＢａｍＨＩ断片
をＢａｍＨＩで消化した。ＧＡＰＤＩ（遺伝子ＧＡＰ４
９　（Ｈｏ１ｌａｎｄ及びＨｏ１ｌａｎｄ、前掲）を含
有する３、３　ｋｈ　ＢａｍＨＩ断片をｐＢＲ３２２の
ＢａｍＨ１部位に挿入することによって得られたプラス
ミドであるｐＧＡＰ２を５ａｊＩ及びＢａｍ）ＴＩで消
化すること、によシ、Ｓａｌ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ　ＧＡ
ＰＤＨターミネータ−断片を得た。プラスミドｐＧＡＰ
２及びｐＧＡＰｌは次のようにして得た。全酵母■勢を
制限酵素５ａｕ３Ａによ逆部分消化した後に得られた断
片をλ−ファージＣｈａｒｏ−ｎ　２８　［Ｂｌａｔｔ
ｎ、ａｒ等ｓ　Ｓ、ｅ、；ｅｎ−ｃｅ　−（１９７７）
１−リ：１６１−１６９　）に挿入することによシ酵母
遺伝子ライブラリーを調製した０このファージライブラ
リーを、酵母ＧＡＰＤＨｍＲＮＡに相補的なりＮＡを用
いてスクリーニングし、そしてこれらのクローンの１つ
からの酵母ＧＡＰＤＨ遺伝子を、ｐＢＲ３２２のＢａｍ
ＨＩ部位における約３．３ｋｂＢａｍ）（Ｉ断片（ＰＧ
ＡＰ−２）として、又はｐＢＲ３２２のＨｉｎｄＩ１１
部位における約２．１　ｋｂ　Ｈｉｎｄ　Ｉｌｌ断片（
ｐＧＡＰ−１）としてサブクローニングした。

ｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩ及びＳａｌ　Ｉで消化し、平
滑末端化し、そしてＢａｍＨＩリンカ−に連結し、次に
ＢａｍＨＩで消化し、そし、てＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ
　３．８ｋｂ断片なグル分離し、自己連結によ多回環化
し、クローニングし、そしてｐＢＲΔＲ１−８ａ　ｌと
命名した。

１．４ｋｂ月遇μＨＩ　−Ｂ　ａｒｐ　ＨＩ断片を、引
明ＨＩで消化されそしてアルカリホスファターゼで処理
されたｐＢＲΔＲ１−８ａｌベクターに挿入して、ｙす
７の逆向きに方向付けられた約５．３ｋｂのプラスミド
ｐＰＧＡＰを得た。

制御されたＧＡＬを含有するプラスミドの造成プラスミ
ドｐＬＧＳＤ５はＧｕａｒｅｎｔｅ等、（１９８２）前
掲に記載されている方法により調製する。このプラスミ
ドを次のようにして操作した。ＸｈｏＩによシ制限処理
した後、オーパーツ・ングをＤＮＡポリメラーゼ■のＫ
ｌｅｎｏｗ断片（Ｋｌｅｎｏｗ断片）を用いて満たし、
旦ｇ−ｏＲＩリンカ−（ＧＧＡＡＴＴＣＣ）と連結し、
そして次にＥｃｏＲＩ及びＳ！Ｌ！　３Ａを用いて完全
消化して３７０　ｂｐ断片を得、そしてダル電気泳動に
よシ分離した。この断片は、酵母のＧＡＬＩ遺伝子及び
ＧＡＬＩＯ遺伝子の間に遺伝子間配列（ｉｎｔｅｒｇＦ
ｎｉｃ　Ｌｅｑｕｅｎｅｅ　）を含み１τしてＧＡＬ１
遺伝子及びＧＡＬ　１０遺伝子のＧＡＬ４制御配列を備
える。

れそして次にアルカリホスファターゼで処理してオリゴ
ツー化を防止したｐＢＲ３２２に挿入し、プラスミドｐ
ＢＲＧＡＬ４を得た。

プラスミドｐＢＲＧＡＬ４を一８ａｕ３Ａによシ完全消
化し、オーバーハングをＫｌａｎｏｖ断片で満たし、そ
して得られた平滑末端化断片を岬りＩ　ＩＪンカー（Ｃ
ＧＴＣＧＡＣＧ　）に連結し、次にシリエ及びηリエで
消化した。得られた３　７０　ｂｐ断片をケ゛ル電気泳
動により分離した。この断片は、Ｘｈｏ及びＳａｌ　Ｉ
末端を伴ってもとの３７０　ｂｐ酵母ＧＡＬ４制御配列
を有する。

次に、この断片をプラスミドｐｌｏｔ５にクローニング
した。次の配列・ 以下余白 ＣＴＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴＣＡＧ ＧＡＧＡＴＣＴＴＣＧＡＡＧＴＣ ｖｕｎ を有する４０ｂｐボＩＪ　ＩＪンカー断片をＥｃ　ｏ　
ＲＩ　７−Ｐｖｕ　ＩＩ置換体としてｐＢＲ３２２に挿
入し、次にｔｒｐ−１ａｃプロそ一ター［：Ｒｕ５ａｅ
ｌｌ及びＢｅｎｎｅｔｔ　、　Ｇｅｎｅ（１９８２）２
０　：２３０−２４５１をＰｖｕ　１部位中に、転写の
方向がホリリンター配列に向けられるように挿入するこ
とによってｐｌｏｔ５を調製した。ｐｌｏｔ５を５ａｉ
ｌによシ完全に消化し、次にアルカリホスファターゼで
処理し、そして３７０ｂｐ断片をｐｌｏｔ　５に挿入す
ることによってプラスミドｐ　ｌ　ｏ　ｔ５ＧＡＬ４／
３７０を得た。次に、このプラスミドをＢａｍＨＩ及び
５ａｉｌによシ完全に消化して、ポリリンカー断片の６
ｂｐによって延長され九個有の断片を得た。

次にこの断片を、１３ａｍＨＩ及び胚りで完全に消化さ
れそして再環化な防止するためにアルカリホスファター
ゼで処理されたｐｃｔ／１に連結した。得られたプラス
ミドをｐｃ１／ＩＧＡＬ４／３７０と命名した。

貼戸ＨＩ−斗五ＩＩ断片はベクターｐｃｌ／ｌのｐＢＲ
３２２部分中に位着する。

酵母において産生されたｐｈｓＯＤ　、Ｊ？　ＩＪペプ
チドは天然のヒト−蛋白質と同一でおることが示された
。

酵母において産生されたｈｓＯＤの移動は、ポリアクリ
ルアミドケゝル電気泳動（ドデシル硫酸ナトリウムを用
いる又は用いない）、及びアガロースゲル電気泳動（前
記参照）のいずれにおしてもヒト−蛋白質と同一であっ
た。さらに、高度に精製した酵母ポリペプチドを１２サ
イクルの工ｒマン分解にかゆ゛た場合、その配列はＥ、
コリにおいて産生された前記のヒト蛋白質（残基１−３
０）について報告されている配列と同一であった。しか
１−ながら、検出レベルは蛋白質インプットについての
モル基準で期待されるレベルの５〜１０％ニ過ぎなかっ
た。この低下した検出レベルは、Ｎ−末端アミノ酸がブ
ロックされていること、すなわちおそらくアセチル化さ
れていることを示している。

この結果を、酵母産生ｈｓＯＤ及び真正アセチル化ヒト
物質からのトリプシン分解ペプチＶの比較分析によシ確
認した。この結果によシ、すべての予想されたトリプシ
ン分解蛋白質はＮ−末端の分解物を含む２つのサンプル
において同一であ）、従って酵母発現生成物中にアセチ
ル化Ｎ−末端ＡＬＡが存在することが示された。

ヒトＳＯＤ遺伝子の分離 ヒ）　ＳＯＤ遺伝子を分離するために、ヒトゲノムを代
表するバクテリオファージスライブラリ−［Ｒ，Ｌａｗ
ｎ等、（１，９７８）Ｃｅｌｌ　１５　：１１５７−１
１７４）を、ヒトＳＯＤ　ｃ　ＤＮＡから作られた放射
性ラベルＤＮＡプローブを用いてスクリーニングした。

１００万個のファーソゾラークをスクリーニングし、１
３個のバイブリド形成陽性のプラークを精製した。ファ
ージ鳳の制限エンドヌクレオチド分析により、少なくと
も５つの異る遺伝子が存在することが示され、他のＳＯ
Ｄ関連遺伝子及び遺伝子生成物が存在することが示唆さ
れた。このよう々遺伝子の１つの候補は最近発見された
細胞外Ｃ１４ｎ５ＯＤ　［：　Ｓ、　Ｍａｒｋｌｕｎｄ
　ｓ　（１９８２）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７９　ニア６３４−７６３８〕である
。真正細胞質Ｃｕ／Ｚｎ　ＳＯＤ遺伝子を関連遺伝子か
ら区別するために、本発明者等は、アミノ酸残基１９−
２６、及び３′非翻訳領域中のターミネータ−コドンか
ら３′のヌクレオチド１９３−２１３に対応する合成り
ＮＡプローブ５’　−ＡＡＴＧＣＴＴＣＣＣＣＡＣＡＣ
Ｃ−３’、及び５’−ＣＴＣＡＧＴＴＡＡＡＡＴＧＴＣ
ＴＧＴＴＴＧ−３’を用いた。１３のゲノムＤＮＡの内
の１個のみがこれらのプローブとバイブリド形成し、こ
れが真正なヒト細胞質ＳＯＤ遺伝子であることが示され
た。このことは、第５図に示すように、Ｎ−末端領域の
ＤＮＡ配列分析によち確認された。この場合、蛋白質配
列によシ決定されたアミノ酸酸列が確認される。これは
また、ＳＯＤについてプレ蛋白質が存在しないことを示
している。開始メチオニンコドンから９ヌクレオチド５
′側にイン−フレームターミネーションコドンが存在す
るからである。第５図に示すように、ヒ）　Ｃｕ／Ｚｎ
　ＳＯＤ遺伝子は介在配列を含有する。第６図に示すＳ
ＯＤ遺伝子の地図は、１個よシ多くの介在配列が存在す
ることを示す。

以上、例示及び例によシこの発明の詳細な説明したが、
との発明の範囲内において多くの変化・変法が考えられ
よう。

々お、Ｅ、コリＤ１２１０　（ｐｓＯＤＸ８　）株は１
９８３年９月２７日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣＮ
ｏ３９４５３の受託番号が与えられた。酵母２１５０−
２−３（ｐＣ１／ＩＧＡＰＳＯＤ　）株、並びにＥ、コ
リＤ１２１０（ｐｓＯＤｌｌ　）株及びＤ１２１０（ｐ
ｓ２０Ｒ）株が１９８４年５月９日にＡＴＣＣに寄託さ
れ、それぞれ受託番号ＡＴＣＣＮ。

２０７０８　、Ｎｏ　３９６７９　、及びＮｏ３９６８
０が与えられた。

なお、この発明は次の方法を含む。

微生物においてスーパーオキシドジスムターゼを製造す
る方法であって、該微生物を栄養培地中で増殖せしめる
ことを含んで成り、該微生物が微生物中で機能するＤＮ
Ａ　＠放物を含有し、該）込構放物が転写の下流方向に
、 （１）　プロモーター； （２）　りがシーム結合部位； （３）開始コドン； （４）　前記間にコドンとリーディングフレームが整合
しており、そして３′−末端に終止コドンを有スルヒト
ースーパーオキシドジスムターゼ構造遺伝子；及び （５）転写ターミネータ−； を含有し、これによって前記スーツや−オキシドジスム
ターゼを産生することを特徴とする方法。

【図面の簡単な説明】

第１図はＤＮＡ　ＩＪンカー配列及びその使用を示す流
れ図であ夛；第２図及び第３図はｐ　１　ｏ　ｔ　５／
ＳＯＤの調製を示す流れ図であシ；第４図はヒ）　５Ｏ
ＤｃＤＮＡのコード鎖（５′→３′）及び得られる翻訳
生成物のそれぞれの配列を示し；第５図は分離されたヒ
）　ＳＯＤ遺伝子の配列を示し；そして第６図は分離さ
れたＳＯＤ遺伝子の制限地図を示す。 −１＜ｃ　よ’ｉｔｓ　ｋご　と百　８台　！に０１Ｌ
！ｌ　←く　←く　〜＜　−１−拳−くｌｌＩＣり　コ
ｔＤ　Ｃ）−ＬＬＩ　ＣＬ（Ｊ　ｕｌ−ご〉　ま♂　賎
　年　韮　呟 ＣΦ　λく　ヘト　コ＜　＞＜　−ｔｖ−＜　−ｃｔ　
ｔｎ＜　ＩＩ＋１−−（り　１０）−０１ＬＩ−ｏｌａ
　ｔｏΦ　−ｕ　ｏ’＋ｏ　シロコａｃｒ　ｉｌｌ＜　
＞＜　ｏＩ−−＋　へ←−−ＣＩｏ　＞＜　−ロ　（０
ヘト　ψくＯｆ口ｔ−−＜　ｃｎａ　ａｇ　＞Φ　５ｉ
ｕｒｏａｌ□　ａｌｌ−０ａ）−ｅ）−０１１１１−Ｉ
ＱυＮ、：　二（”’Ｃｈ、＝ａ３　”：；ｕ　”Ｅ！
ｊ■　陪ミ　誌　舗　＝ｘ　＝旨 ？！偶　洩り♀ミ３　市ｇ昼ミ　誌 ０’１ｌｌｌ−ａＬ）Ｏ＃＋−２ ＝＝５　℃ｊ　ヱ；８　屍 １冷　甜　’！’ｇｌ　’ｊｎ　’ａ 手続補正書（方式） 昭和６０年１　月７日 特許庁長官　志　賀　学　殿 １、事件の表示 昭和５９年　特許願　第２０６４３４号２、発明の名称 スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　チロン　コーｙＫレイジョン ６、補正の対象 （１）願誓の「出願人の代表者」の欄 （２）委　任　状 （３１図　面 ７、　補正の内容 ＋１１＋２１　別紙の通り （３）図面の＃曹（内容に変更なし） ８、添附書類の目録 （１）訂正ｌａ書　１通 （２）委任状及び訳文　各１通 （３）浄簀図面　１通

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　ヒトースーパーオキシドジスムターゼト実質上同
   一のアミノ酸配列を有し、単細胞微生物中で産生される
   ポリペプチド。 ２、前記単細胞微生物が細菌である特許請求の範囲第１
   項記載のポリペプチド。 ３、前記単細胞微生物が酵母である特許請求の範囲第１
   項記載のポリペプチド。 ４、微生物中で機能するＤＮＡ構成物であって、転写の
   下流方向への順に、 （１）　プロモーター； （２）　りがシーム結合部位； （３）　脂始コドン； （４）　リーディングフレームが前記開始コドンと整合
   しておシ、３′−末端に終止コドンを有するヒト−スー
   パーオキシドジスムターゼ構造遺伝子：及び （５）転写ターミネータ−； を含んで成るＤＮＡ構成物。 ５、前記リボゾーム結合部位と開始コドンとの間の距離
   が、該リボゾーム結合部位と該開始コドンとの間の長さ
   及び組成において異る種々のＤＮＡブリッジを調製し、
   そして最適化された発現について選択することによって
   最適化されている特許請求の範囲第４項記載のＤＮＡ　
   ｓ放物。 ６、染色体外での複製及び維持のための複製糸に連結さ
   れている特許請求の範囲第４項記載のＤＮＡ構成物。 ７、　リボゾーム結合部位、及びポリヌクレオチドスペ
   ーサーによって分離された開始コドンを含有するＤＮＡ
   構成物においてポリペプチドをコードする遺伝子の転写
   効率を増強する方法であって、長さが異る突出部を有し
   、前記スペーサーの少なくとも一部分を含み、そして該
   ス檀−サーの領域における組成が異る複数のリンカ−の
   混合物を合成し； 咳リンカー混合物を周縁領域に連結することによって、
   前記遺伝子から上流及び下流に、それぞれ転写及び翻訳
   開始、並びに終止制御シグナル配列を有し、そして前記
   リテゾーム結合部位と前記開始コドンとの間のスペーサ
   ー領域が多様なりＮＡ構成物を得； 前記突出部を満たし；そして、 この構成物全クローニングし、そしてこのクローンを翻
   訳効率についてスクリーニングする；ことを含んで成る
   方法。 ８、　ヒト−スーパーオキシド・シスムターゼと実質上
   同一のアミノ酸配列を有し、酵母において産生されるア
   セチル化されたポリペプチド。 ９、　ヒト−スーツ４−オキシドジスムターゼと芙質上
   同−のアミノ酸配列を有するアセチル化されたポリペプ
   チドであって、酵母宿主全適当な培地中で増殖□せしめ
   、該酵母宿主にヒト−スーパーオキシドジスムターゼを
   コードしそして５′末端にアセチル化シグナル配列￥ｉ
   −有するＤＮＡ配列全発現せしめ、そして該酵母からア
   セチル化されたポリペプチドを分離することによって製
   造されたポリペプチド。 １０、アセチル化されたポリペプチドの製造方法であっ
   て、該ポリペプチド全コードし、そして第１位にグリシ
   ン又はアラニンを含みこれに続く第２位に極性アミノ酸
   を含んで成るアセチル化シグナル配列（このアセチル化
   シグナル配列は酵母全してポリペプチドのＮ末端アミノ
   酸全アセチル化せしめる）全５′末端に有するＤＮＡ配
   列を導入することを含んで成る方法。 １１、前記極性アミノ酸がアスパラギン酸、セリン及び
   スレオニンから成る群から選ばれる特許請求の範囲第１
   ０項記載の方法。