JPH08283296A - ヒトアポリポプロテインｅアナログ及びヒトスーパーオキシドジスムターゼアナログ - Google Patents

ヒトアポリポプロテインｅアナログ及びヒトスーパーオキシドジスムターゼアナログ

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JPH08283296A
JPH08283296A JP8095694A JP9569496A JPH08283296A JP H08283296 A JPH08283296 A JP H08283296A JP 8095694 A JP8095694 A JP 8095694A JP 9569496 A JP9569496 A JP 9569496A JP H08283296 A JPH08283296 A JP H08283296A
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superoxide dismutase
gene
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ハイム・アヴイヴ
Daniel Bartfeld
ダニエル・バートフエルド
Marian Gorecki
マリアン・ゴレツキ
Jacob R Hartman
ヤコブ・アール・ハートマン
Dov Kanner
ドヴ・カナー
Avigdor Levanon
アヴイグドル・レヴアノン
Hilla Locker-Giladi
ヒラ・ロツカー−ギラデイ
Amos B Oppenheim
アモス・ビー・オツペンハイム
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトアポリポプロテインＥアナログ及びヒト
スーパーオキシドジスムターゼアナログを提供する。 【解決手段】 天然のヒトアポリポプロテインＥのＮ末
端にアミノ酸の付加したアナログ及び天然のヒトスーパ
ーオキシドジスムターゼの非アセチル化形又は非グリコ
シル化形からなるアナログ。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 遺伝子工学の１つの特徴は、真核生物起源に由来する外
来DNA 配列を大腸菌（Escherichia coli）又はその他
の微生物に挿入することにある。遺伝子工学で得られる
別の優れた特徴は、外来DNA がコードしているポリペプ
チドの産生をこれら微生物中で誘導することにある。ポ
リペプチドの産生は２段階プロセスで生じ、各段階が多
数のサブステップを含むと考えられている。２つの段階
は転写段階と翻訳段階である。ポリペプチドを効率的に
量産するためにはプロセスの２つの段階が共に効率的に
行なわれる必要がある。転写によって遺伝子（DNA ）か
らmRNAが生成し、翻訳によってmRNAからポリペプチドが
生成する。
【０００２】転写プロセスの重要なサブステップは開
始、即ちプロモーター−オペレーター領域へのRNA ポリ
メラーゼの結合である。プロモーター領域を構成するデ
オキシリボヌクレオチド塩基の配列を変更し、これによ
ってプロモーターの相対的効率を加減し得る。この効率
はRNA ポリメラーゼのプロモーターに対する親和性に左
右される。
【０００３】翻訳効率はmRNAの安定性に影響される。mR
NA安定性が増すと翻訳効率が上がる。mRNA安定性の正確
な決定因子は正確にはわかっていないが、その塩基の配
列によって決定されるmRNAの二次構造が安定性に寄与す
ることが判明している。
【０００４】翻訳の最初のサブステップでは、シャイン
−ダルガルノ（Shine-Dalgarno）配列又はリボソーム結
合部位（RBS ）として知られるmRNA上の塩基配列にリボ
ソームが結合する。リボソームがmRNAに沿ってAUG 翻訳
開始コドンまで移動するとポリペプチド合成が開始され
る。これらのコドンは通常、シャイン−ダルガルノ（Sh
ine-Dalgarno）部位から約１０塩基“下流に”存在す
る。翻訳効率を高める要因の１つに、シャイン−ダルガ
ルノ（Shine-Dalgarno）部位へのリボソームの結合を増
強することが含まれる。シャイン−ダルガルノ（Shine-
Dalgarno）配列及びAUG コドンの領域でのmRNAの構造と
シャイン−ダルガルノ（Shine-Dalgarno）配列からAUG
コドンまでの間隔とは、夫々、翻訳効率の決定に関して
重要な役割を果たすことが判明している。翻訳効率に影
響を与える別の要因は、早期終結（premature terminat
ion ）及び転写減衰（attenuation ）である。減衰部位
を除去することによって翻訳効率を向上させることが可
能である。
【０００５】細菌細胞中で真核生物ポリペプチドを多量
に産生する計画の障害となるのは、多量のmRNAを生成す
る細胞が効率良く増殖できないことである。このような
障害は、抑制というプロセスにより転写を阻害すること
によって除去することができる。抑制に於いては、オペ
レーター領域に結合して転写を阻害するタンパク阻害剤
（リプレッサータンパク）の作用によって遺伝子がスイ
ッチオフされている。微生物が所望の細胞密度まで増殖
した後に、リプレッサーを破壊するか又はリプレッサー
の効果を凌駕し得る誘導物質として知られる分子を添加
することによって抑制されている遺伝子を活性化する。
【０００６】λバクテリオファージ由来のＰL プロモー
ターを含むプラスミド中での真核生物遺伝子のクローニ
ングに関しては文献中に多くの報告が見られる［エッ
チ．ブイ．バーナード（H.V.Bernard ）らジーン（Gen
e）（１９７９）５，５９；シー．デロム（C.Derom ）
ら、ジーン（Gene）（１９８２）１７，４５；ディー．
ゲイセン（D.Gheysen ）ら、ジーン（Gene）（１９８
２）１７，５５；ジェー．ヘジペス（J.Hedgpeth）ら、
モル．ジエン．ジエネット．（Mol.Gen.Genet.）（１９
７８）１６３，１９７；イー．レマート（E.Remaut）
ら、ジーン（Gene）（１９８１）１５，８１；アール．
デリンク（R.Derynck ）ら、ネーチャー（Nature）（１
９８０）２８７，１９３）］。更に、１９８１年１２月
１６日公開の欧州特許出願第０４１，７６７号は、λバ
クテリオファージ由来のＰL プロモーターを含む発現ベ
クターを記載している。しかしながら、これらの文献は
いずれもＣIIリボソーム結合部位の使用については記載
していない。
【０００７】λバクテリオファージ由来のＰL プロモー
ターとＣIIリボソーム結合部位とを含むベクターの使用
については、エー．ビー．オッペンハイム（A.B.Oppenh
eim)ら、ジェー．モル．バイオロ．（J.Mol.Biol.)（１
９８２）１５８，３２７並びにエッチ．シマタケ（H.Sh
imatake ）及びエム．ローゼンベルグ（M.Rosenberg)，
ネーチャー（Nature）（１９８１）２９２，１２８に記
載されている。これらの刊行物は、高レベルのＣIIタン
パクの産生について記載しているが、真核生物タンパク
の産生を包含又は記載していない。
【０００８】ＰL プロモーターとＣIIリボソーム結合部
位を含む他のベクターも以下の文献に記載されている。
カーンティ・エム等（Courntey,M.,et al.) ，PNAS（１
９８４）８１，６６９−６７３；ラウテンベルガー・ジ
ェイ・エー等(Lautenberger,J.A.，et al.），遺伝子
（Gene），１９８３，２３，７５−８４及びラウテンベ
ルガー・ジェイ・エー等，サイエンス（１９８３），２
２１，８５８−８６０。しかしながら、これらに記載さ
れたベクターではいずれもＣIIプロテインのアミノ末端
部分を含む融合タンパク質が産生する。
【０００９】１９８２年にシャッマン（Shatzman）及び
ローゼンバーグ（Rosenberg ）は第１４回マイアミ．ウ
インター．シンポジウム（Miami Winter Symposium）に
ポスターを提出した［エー．アール．シャッマン（A.R.
Shatzman）及びエム．ローゼンバーグ（M.Rosenberg
），第１４回マイアミウインターシンポジウム（Miami
Winter Symposium）抄録９８頁［１９８２］］。この抄
録には、λバクテリオファージ由来のＰL とNut とＣII
リボソーム結合部位とを含むベクターを使用して“真核
生物”ポリペプチドを細菌宿主中で細胞タンパクの５％
より高い量で合成することが開示されているが、（SV４
０小Ｔ（small Ｔ）抗原は実際には真核生物ポリペプチ
ドでなくウイルスタンパクであるし）、細菌宿主名が示
されていない、使用したオペレーターが定義されていな
い、複製起点（開始点）も選択可能な表現型の遺伝子も
同定されていない等の理由によって上記の開示は実施不
能である。このようなベクターを使用するこの系は、こ
のベクターを安定に形質転換し得るような或る種の宿主
溶原菌（host lysogen）を含むと記載されている。
【００１０】本出願人は、国立保健協会（National Ins
titutes of Health ），ヘルス及びヒューマンサービス
部門（Dept.of Health and Human Services ），米国，
によるエム．ローゼンベルグ（M.Rosenberg)名義で係属
中の米国特許出願第４５７，３５２号の存在を知ってい
る。この出願の一部は国立技術情報サービス（National
Technical Information Service），米国通常部門（U.
S.Dept.of Commerce）から入手できたが、特許請求の範
囲はまだ機密であり入手不能である。本出願人は該出願
の入手し得た部分について検討し、この開示も実施不能
であるとの結論を得た。即ち、この開示によれば宿主が
重要であるのに（８頁１７行）いかなる適当な宿主も同
定されていない。更に該出願はλ突然変異体の使用を基
盤とするのにこの突然変異体が特定されていない（４頁
２０行）。更に該出願では宿主が溶原（lysogen ）を含
む（８頁１８行）が、本発明では宿主が溶原菌でない。
該出願は真核生物遺伝子、すなわちサルメタロチオネイ
ン遺伝子のクローニング及び発現に言及しているが（７
頁１８行）、これらについて詳細に説明していない。該
出願ではＣIIリボソーム結合領域のいかなるヌクレオチ
ドの配列も位置も変更していないと述べられている（３
頁２７行）。
【００１１】１９８３年７月１５日出願の、本発明と同
様に譲渡されている係属中の米国特許出願第５１４，１
８８号中に細菌中に於けるポリペプチドの発現に有用な
新規なベクターについて記載がある。これらのベクター
は、ＰL ＯL ，抗転写終結因子Ｎタンパクを結合するＮ
利用部位（Nutilization site ），リボソーム結合部
位，ATG コドン，所望のポリペプチドをコードしている
遺伝子を挿入する為の制限酵素部位，複製起点及び選択
可能なマーカーを含んでいる。これらのベクターに於い
て、Ｎ利用部位とリボソーム結合部位間の距離は約３０
０塩基対より大きい。更に、それぞれのベクターには、
容易に置換され得ない特異的リボソーム結合部位が含ま
れている。これらのベクターは様々なポリペプチドの発
現にどれも同様に用い得るということはできない。
【００１２】Ｔ1 Ｔ2 rRNA転写終結配列が、ブロシウス
・ジェイ等（Brosius,J.,et al.)ジェイ・モル・バイオ
ル（J.Mol.Biol.)１４８，１０７，（１９８１）に記載
されている。このＴ1 Ｔ2 rRNA終結配列を原核生物遺伝
子の３′末端につなぎ、該遺伝子をプロモーターによる
コントロール下で発現させることが記載されている（ア
マン・イー等（Amann,E.,et al.)遺伝子（Gene）１９８
３，２５，１６７；ザビュー・エム等（Zabeau,M.,et a
l.）エムボ・ジャーナル（The EMBO Journal）１９８
２，１，１２１７）。
【００１３】欧州特許出願第８１３０４５７３．９号で
１９８２年４月１４日に公開された欧州特許公開第０４
９，６１９号には、安定化因子として熱誘導性リプレッ
サー（thermoinducible repressor ）λｃＩ８５７の使
用が記載されている。このリプレッサーをプラスミド上
にクローニングする。リプレッサー合成を欠陥している
プロファージλｃＩ９０に感染によって導入する。この
プロファージは３２℃より低い温度ではクローン化リプ
レッサーによって維持される。前記プラスミドを失った
細胞はいずれも溶菌する。温度を３８℃よりも高くする
と、該リプレッサーが破壊されあるいは不活化されて細
胞が溶菌する。この安定化システムはλＰL プロモータ
ーを含み３８℃より高温でポリペプチドを発現する本発
明のベクターには用いることはできない。
【００１４】コピー数の多い構成プラスミド（constitu
tive high copy number plasmids）に由来する複製起点
は公知である。例えば、Col Ｅ１由来の pOP１Δ６複製
起点は、ゲルファンド・デー・エイチ等（Gelfand,D.
H.,et al.)PNAS（１９７８）７５，(12)，５８６９及び
ミューシング・エム等（Muesing,M.,et al.)Cell（１９
８１）４５，２３５に記載されている。更に、コピー数
の多い脱落性（run-away）複製プラスミド（これはコピ
ー数の多い構成プラスミドとは区別される）も公知であ
る（レマント・イー等（Remant,E.,et al.）遺伝子（Ge
ne）１９８３，２２，１０３）。
【００１５】本発明は様々なポリペプチドの発現を予期
せぬ程高める発現ベクターに係わる。本発明のベクター
中に異なるリボソーム結合部位を採用することで、従来
のベクターを用いて達成されるレベルと比較して高い発
現レベルの様々なポリペプチドを生産することが可能に
なる。加えて、従来のベクターと全く同じリボソーム結
合部位を用いても同じポリペプチドを高い発現レベルで
生産することが可能である。更に、Ｔ1 Ｔ2 rRNA終結配
列を発現させたいポリペプチドがコードされている遺伝
子の３′末端に結げることによって、細菌宿主によって
生産される総ポリペプチドに比べてその所望のポリペプ
チドの量を増やすことが可能である。重要なことに、Ｔ
1 Ｔ2 rRNA転写終結配列が存在すると、コピー数の多い
構成プラスミド由来の複製起点を、数多くのコピーを構
成的（constitutive）に複製する能力を失なうことなく
発現ベクター中に組み込むことが可能になる。
【００１６】pBR ３２２又はコピー数の多い脱落性（ru
naway ）プラスミド以外のコピー数の多い非構成プラス
ミド（non constitutive high copy number plasmids）
由来の複製起点はこれをベクター中に組み込んだとき細
胞当りほんの限られた数の、代表的には細胞当り４０コ
ピーより少ない数を生産することができる。コピー数の
多い構成プラスミド由来の複製起点に代えることによっ
て、ポリペプチドの発現レベルが予期せぬ程高くなるこ
とが判明した。
【００１７】本発明の好適なベクターは細菌宿主内で安
定化されており、ベクター及びポリペプチドをコードし
た遺伝子を含むプラスミドを含有する細菌が増殖する際
にそのプラスミドは失なわれることがない。こうして、
プラスミドの不安定性に帰因するところの収率低下が克
服される。更に、このような好適ベクターを用いること
で選択マーカーとして抗生物質抵抗性を用いる必要がな
く、従ってポリペプチドを低コストで生産することが可
能になる。
【００１８】本発明の新規な発現ベクターを用いて生産
され得る幾つかのポリペプチドのうちのあるものはスー
パーオキシドジスムターゼ（SOD ）及びそのアナログ
（類似体）である。
【００１９】本発明は特に、従来のベクターと全く同じ
リボソーム結合部位を用いても、また本明細書中に記載
されている前記RBS と異なるリボソーム結合部位を用い
ても、スーパーオキシドジスムターゼ及びそのアナログ
の予期せぬ程の高められた発現を催す発現プラスミドに
係わる。
【００２０】本発明はまた、前記プラスミドを利用して
細菌内でSOD 及びそのアナログの高効率に産生する方法
に係わる。
【００２１】スーパーオキシドジスムターゼ（SOD ）及
び酸素フリーラジカル（Ｏ2 ・- ）の現象は１９６８年
にマッコード及びフリードヴィッヒによって発見された
（マッコード・ジェイ・エム（McCord,J.M.)及びフリー
ドヴィッヒ・アイ（Fridovich,I.）ジェイ・バイオル・
ケミ（J.Biol.Chem.）２４４，６０４９−６０５５（１
９６９))。スーパーオキシドラジカル及び他の高反応性
酸素種は全ての呼吸細胞に於いて酸化的代謝の副生成物
として産生し、広範囲の細胞成分及び高分子に多大の損
傷を与えることが判った（フリードヴィッヒ・アイ(Fri
dovich,I.)，アドバンス・イン・イン・オーガニック・
バイオケミストリー，アイクホーン・ジー・エル（Eich
horn，G.L.）版及びマルチリ・エル・ジー（Marzilli,
L.G.)，エルセヴィア／北オランダ，ニューヨーク，６
７−９０頁（１９７０）並びにフリーマン・ビー・エー
（Freeman,B.A.）及びクラポ・ジェイ・デー（Crapo,J,
D,）ラボラトリー・インベスティゲーション，４７，４
１２−４２６（１９８２）参照）。スーパーオキシドジ
スムターゼとして知られる金属プロテイン類は酸化−還
元反応２Ｏ2 - ＋２Ｈ+ →Ｈ2 Ｏ2 ＋Ｏ2 を触媒し、酸
素毒性に対する防御機構を形成する。タンパク分子中に
異なる金属を含有する３種類のSOD が知られている。即
ち、鉄，マンガン及び銅と亜鉛の両者を含有するもので
ある。これらの酵素は全て同じ反応を究極的な効率で触
媒し、金属が活性部位の触媒因子であるような類似の機
構で作用する。これらの酵素は幾つかの進化論上の群に
分類される。Ｍｎ−SOD 及びＦｅ−SOD は主に原核細胞
中に見られ、一方ＣｕＺｎ−SODは事実上全ての真核生
物中に認められる（シュタインマン・エイチ・エム（St
einman,H.M）スーパーオキシドジスムターゼ，オバーレ
イ・エル・エム（Oberley,L.M.）版，シーアールシープ
レス，フロリダ，１１−６８頁（１９８２））。
【００２２】ヒトＣｕ／Ｚｎ SOD −１は同一の非共有
結合サブユニットからなる金属−蛋白質二量体であり、
各サブユニットは銅１原子と亜鉛１原子とを含有し、１
６０００ダルトンの分子量を持つ（ハーツ，ジェー，ダ
ブリュ（Hartz,J.W.）及びドイッチェ，エイチ．エフ．
（Deutsch,H.F.）、ジェー．バイオール．ケム．（J.Bi
ol.Chem.）２４７，７０４３−７０５０（１９７
２））。各サブユニットは配列が確定された１５３個の
アミノ酸からなる（ジャブッシュ，ジェー．アール．
（Jabusch,J.R.）、ファーブ，ディー．エル．（Farb,
D.L.)、ケルシェンスタイナー，ディー．エー．（Kersc
hensteiner,D.A.）及びドイッチェ，エイチ．エフ．（D
eutsch,H.F.）、バイオケミストリー（Biochemistry）
１９：２３１０〜２３１６（１９８０）及びバーラ，デ
ィ．（Barra,D.），マルチニ，エフ．（Martini,F.）、
バニスター，ジェー．ブイ．（Bannister,J.V.）、シニ
ーナ，エム．ダブリュ．（Schinina,M.W.)、ロチリオ，
ダブリュー．エイチ．（Rotilio,W.H.）、バニスター，
ダブリュー．エイチ．（Bannister,W.H.）及びボッサ，
エフ．（Bossa,F)、FEBSレターズ（FEBS Letters）１２
０，５３−５６（１９８０））。更に、近年、ヒトSOD
−１の全コード領域を含有するcDNAクローンが単離され
その配列が決定された（リーマン−フルウィッツ，ジェ
ー．（Lieman-Hurwitz,J.)、ダフニ，エヌ．（Dafni,
N.）、ラヴィエ，ブイ．（Lavie,V.）及びグローナー，
ワイ．（Groner,Y.)、プロク．ナットル．アカデ．サ
イ．USA （Proc.Natl.Acad．Sci.USA ）７９，２８０８
−２８１１（１９８２）及びシャーマン，エル．（Sher
man,L.），ダフニ，エヌ．（Dafni,N.）、ライマン−フ
ルヴィッツ，ジェー．（Leiman-Hurwitz,J.)及びグロー
ナー，ワイ．（Groner,Y.)、プロク．ナットル．アカ
デ．サイ．USA （Proc.Natl.Acad.Sci.USA）８０，５４
６５−５４６９（１９８３））。
【００２３】産生したヒトＣｕ−Ｚｎ SODアナログはそ
のアミノ末端アラニンがアセチル化されていない点で天
然のヒトＣｕ−Ｚｎ SODと異なる。天然のヒトSOD はア
ミノ末端アラニンがアセチル化されている（ハーツ，ジ
ェー，ダブリュー．(Hartz，J.W.）及びドイッチェ，エ
イチ．エフ．（Deutsch,H.F.）、ジェー．バイオール．
ケム．（J.Biol.Chem.）（１９７２）２４７，７０４３
−７０５０；ジャブッシュ，ジェー．アール．（Jabusc
h,J.R.）ら、バイオケミストリー（Biochemistry）（１
９８０）１９，２３１０−２３１６；バーラ（Barra ）
ら、FEBSレターズ（FEBS Letters）（１９８０）１２
０，５３及びオバーリー，エル．ダブリュ．（Oberly,
L.W.)、スーパーオキシドジスムターゼ（Superoxide D
ismutase ）、第１巻、CRC プレス（CRC Press ）、フ
ロリダ（Florida ）、（１９８２）、（３２頁−３３
頁）。ウシSOD と同様に天然のヒトSOD はグリコシル化
されていると思われる（ヒューバー，ダブリュ．（Hube
r,W.）、米国特許第３，５７９，４９５号明細書、１９
７１年５月１８日発行）。大腸菌（ Escherichia col
i）が自分で産生した蛋白質をグリコシル化しないよう
に、細菌が産生したヒトSODはほとんどグリコシル化さ
れない。細菌が産生したSOD アナログのアミノ酸配列は
成熟ヒトSOD と同じであるが、Ｎ−末端にメチオニン残
基を持たない。
【００２４】本発明はヒトＣｕ／Ｚｎ SODの酵素学的に
活性なアナログを細菌内で産生し精製する方法を提供す
る。
【００２５】スーパーオキシドジスムターゼはその薬理
学的特性から非常に興味深い。ウシ由来の天然にみられ
るスーパーオキシドジスムターゼ（オルゴテイン，orgo
tein）は抗炎症作用を持つことが知られており、欧州、
例えば西独で炎症の治療用に最近市販されている。米国
を含む多くの国でも炎症治療用特に馬の腱の炎症の治療
用に動物薬として販売されている。
【００２６】又、科学論文はSOD が広範囲に亘り臨床的
に使用できるであろうことを示唆している。これには腫
瘍形成や腫瘍増大を防止することや抗癌剤の細胞毒作用
や心臓毒作用を軽減すること（オバーレイ，エル．ダブ
リュ．（Oberley,L.W.）及びビューエトナー，ジー．ア
ール．（Buettner,G.R. ）、キャンサー リサーチ（Ca
ncer Research ）３９，１１４１−１１４９（１９７
９）；虚血組織の保護（マクコード，ジェー．エム．
（McCord,J.M.)及びロイ，アール．エス．(Roy,R．
S.）、カン．ジェー．フィジオール．ファーム．（Can.
J.Physiol.Pharm.）６０，１３４６−１３５２（１９８
２））；及び精子の保護（アルバーレッツ，ジェー．ジ
ー．（Alvarez,J.G.）及びストーレイ，ビー．ティー．
（Storey,B.T.)、バイオール．リプロダ．（Biol.Repro
d.）２８，１１２９−１１３６（１９８３））が包含さ
れる。更に、加令過程に対するSOD の作用の研究も非常
に興味深い（タルマソッフ，ジェー．エム．（Talmasof
f,J.M.）、オノ，ディー．（Ono,T.）及びカトラー，ア
ール．ジー．（Cutler,R.G.)、プロク．ナットル．アカ
デ．サイ．USA （Proc.Natl.Acad.Sci.USA）７７，２７
７７−２７８２（１９８０））。
【００２７】本発明は、Ｈ+ の存在下でのスーパーオキ
シドラジカルの過酸化水素と分子状酸素への還元を触媒
するために組換えヒトスーパーオキシドジスムターゼ(h
SOD)またはそのアナログを使用することにも係る。特
に、本発明は虚血（ischemia）に伴う再灌流（reperfus
ion ）時の損傷を減少させ、切除した摘出臓器の生存期
間（survival period ）を延長するためのhSODアナログ
の使用に関する。本発明は臓器移植に伴う再灌流時の損
傷や脊髄虚血（spinal cord ischemia）を減少させるた
めにhSOD又はそのアナログを使用することにも係る。
【００２８】発明の要約 本発明は、非耐熱性（thermolabile）リプレッサーＣI
を含有する適切な細菌宿主細胞例えば大腸菌（ Escheri
chia coli）に導入すると、この宿主細胞が、宿主細胞
の温度がリプレッサー不活化温度まで上昇した際、前記
ベクターに挿入されている所望遺伝子を発現し得かつ前
記遺伝子がコードしているポリペプチドを産生し得るよ
うになる改良発現ベクターに係り、このベクターは、
５′から３′に向かって、λバクテリオファージ由来の
プロモーター−オペレーターＰL ＯL を含有するDNA 配
列と、抗転写終結因子Ｎタンパク質を結合するためのＮ
利用部位と、この後に続くリボソーム結合部位を含有す
るDNA 配列の置換（replacement ）を可能にする第１の
制限酵素部位と、所望遺伝子のmRNAが宿主細胞内のリボ
ソームに結合し得るようにするためのリボソーム結合部
位を含有するDNA 配列と、ATG 開始コドン、または所望
遺伝子をベクター内に挿入するとATG 開始コドンに変換
されるDNA 配列と、ATG 開始コドンと位相を合わせて
（in phase）所望遺伝子をベクター内に挿入するための
第２の制限酵素部位と、をこの順に含む二本鎖DNA 分子
を含んでおり、さらに、宿主細胞中で自律複製し得る細
菌プラスミド由来複製起点を含有するDNA 配列と、この
ベクターが宿主細胞中に存在するときに現れる選択可能
または同定可能な表現形質に関連する遺伝子を含有する
DNA 配列ならびにｃＩ434 という断片（このような断片
はｃＩ434 リプレッサータンパク質に対する遺伝子とこ
れに関連したプロモーター−オペレーター配列とを含
む）を含有するDNA 配列から成る群から選択される選択
手段と、を含んでおり、ＰL ＯL プロモーターオペレー
ター配列の３′末端とＮ利用部位の５′末端との間の距
離が約８０塩基対未満であり、Ｎ利用部位の３′末端と
リボソーム結合部位の５′末端との間の距離が約３００
塩基対未満である。
【００２９】選択手段がpJH ２００及びpRO ２１１の如
き表現形質に関連する遺伝子であるベクターが好まし
い。
【００３０】本発明ベクターは第２の制限酵素部位の
３′にＴ1 Ｔ2 rRNA配列を含有するDNA を更に含んでい
てもよい。Ｔ1 Ｔ2 rRNA転写終結配列は第２の制限酵素
部位の３′末端から約１００塩基対未満であることが望
ましく、約２０塩基対未満であることがより望ましい。
【００３１】Ｔ1 Ｔ2 rRNA転写終結配列を含んでいる現
状の好ましいベクターはその選択手段が表現形質に関連
する遺伝子であるｐ５７９である。
【００３２】ｃＩ434 フラグメント（断片）を含有する
本発明ベクター中で、ｃＩ434 フラグメントはＴ1 Ｔ2
rRNA終結配列の３′にあることが望ましい。
【００３３】ベクターが表現形質に関連する遺伝子とｃ
Ｉ434 フラグメントとの両者を含有していることが望ま
しい。両方の遺伝子を含有している現状で好ましいベク
ターはCla Ｉ部位にｃＩ434 フラグメントをクローニン
グしたｐ５７９である。
【００３４】本発明ベクターは、宿主細胞中で自律複製
し得、少なくとも４００個のベクターの構成コピーを生
成し得る細菌のプラスミド由来の複製起点をも含有して
いてもよい。
【００３５】現状で好ましい複製起点はcol Ｅ１プラス
ミド由来のpOP １Δ６である。
【００３６】Ｔ1 Ｔ2 rRNA終結配列、宿主細胞内でベク
ターの構成コピーを少なくとも４００個生成し得る複製
起点を含み且つ表現形質遺伝子とｃＩ434 フラグメント
の遺伝子との両者を含有しているベクターが好ましい。
【００３７】所望のポリペプチド例えばウシ、ブタ、ニ
ワトリ又はヒトの成長ホルモンの如き成長ホルモン、ヒ
トスーパーオキシドジスムターゼ、ヒトアポリポプロテ
インＥ又はこれらのアナログをコードするcDNAのような
遺伝子をベクターの第２の制限酵素部位に挿入してプラ
スミドを作ってもよい。このプラスミドはその後、遺伝
子が発現され所望のポリペプチドを生成することのでき
る適切な宿主に導入することができる。現状で好ましい
プラスミドは、bGH 用には、pRO １２，pSAL５２００−
６，pHG ４４，pSAL５６００−１，ｐ７２００−２２，
pHG ５０，ｐ８３００−１０Ａ，pSAL−１７０／１０
pSAL−２１０／４及びｐ９２００；ヒトスーパーオキシ
ドジスムターゼ用には、pSODα２，pSODβ１，pSODβ1
Ｔ11，pSODβ1 −BA２及びpSODβ1 TT−１；pGH 用に
は、ｐ３００８及びｐ３００９；cGH 用には、ｐ５００
２及びｐ５００３；hGH 用には、pTV ３００；ヒトアポ
リポプロテインＥ用には、pTV −１８８，pSAL１６０−
５，pTV −１７０，pTV −１９０，pTV −１９４，pTV
−２１４及びpTVR２７９−８である。
【００３８】好ましい宿主は大腸菌（ Escherichia co
li）Ａ１６３７，Ａ１６４５，Ａ２６０２，Ａ２０９７
及びＡ１５６３並びにプラスミドがｃＩ434 フラグメン
トを含有しているときには、Ａ１６４５（λｉ４３４ｃ
Ｉ- mini Tn １０）を包含する。好ましい原栄養性宿主
（prototrophic hosts）は大腸菌（E. coli）Ａ４２０
０，Ａ４２５５及びＡ４３４６を包含する。好ましい溶
解性宿主（lytic hosts ）は大腸菌（E. coli）Ａ４０
４８を包含する。
【００３９】得られた宿主ベクター系はポリペプチドの
製造に用いることができる。プラスミドを含有する宿主
細胞をポリペプチドを生成しうる適切な条件下で増殖さ
せ、得られたポリペプチドを回収する。宿主ベクター系
を用いて、ヒトアポリポプロテインＥ、ウシ成長ホルモ
ン、ブタ成長ホルモン、ニワトリ成長ホルモン、ヒト成
長ホルモン及びヒトスーパーオキシドジスムターゼのア
ナログが製造される。このように得られたSOD アナログ
はSOD アナログと適当なキャリアー（担体，carrier ）
とを含有する動物薬及び医薬組成物に配合される。
【００４０】これらのスーパーオキシドジスムターゼア
ナログは次の反応：２Ｏ2 - ＋２Ｈ+ →Ｈ2 Ｏ2 ＋Ｏ2
を触媒するのに用いられる。
【００４１】より特定的には、このようなアナログは虚
血又は臓器移植に伴う再灌流による損傷を減少させ、心
筋梗塞の大きさを減少させ、切除した摘出臓器の生存時
間（有効保存期間）を増加させるために用いられた。こ
れらのアナログは脊髄損傷を減少させるために又気管支
肺異形成（bronchial pulmonary dysplasia ）に用いる
こともできる。
【００４２】酵素学的に活性な真核生物のスーパーオキ
シドジスムターゼ又はそのアナログを細菌細胞中で生成
する方法も発見された。細菌細胞はスーパーオキシドジ
スムターゼ又はアナログをコードするDNA 配列を含有し
ており、このDNA 配列を発現させることができる。この
方法は、適切な条件下で、培地中の細胞が利用しうるＣ
ｕ++濃度が約２ppm 以上となるような量のＣｕ++を添加
した生成（産生）培地中に細菌細胞を維持することから
なる。
【００４３】この方法の好ましい具体例では、細菌細胞
はヒトスーパーオキシドジスムターゼのアナログをコー
ドするDNA 配列を含有するプラスミドを持つ大腸菌（ E
scherichia coli）細胞である。
【００４４】本発明は又、本発明方法により細菌細胞内
で生成された、精製された酵素学的に活性な真核生物の
スーパーオキシドジスムターゼ又はそのアナログを回収
する方法にも係る。この方法は、成長（増殖）培地から
細菌細胞を単離し、pHが約7.0 〜約8.0 の適切な溶液中
に細菌細胞を懸濁することからなる。懸濁した細菌細胞
の細胞壁を破砕し、次に、得られた均質な溶液を適切な
条件下で音波処理する。音波処理した溶液を適切な条件
下で遠心する。上清部を移して、約２時間約６５℃に加
熱する。次に、上清部を冷却し、適切な条件下で遠心し
て上清部に清澄な蛋白質溶液を得る。得られた上清部を
適切な容量まで濃縮し、pH約7.0 〜約8.0 で平衡化した
適切なアニオン交換体でのイオン交換クロマトグラフィ
ーにかける。スーパーオキシドジスムターゼ又はアナロ
グを含有する得られた溶液を集めて適切な容量まで濃縮
し、pH約 7.0〜約8.0 の緩衝溶液に対して透析する。こ
の濃縮した緩衝溶液をpH約 7.0〜約8.0 で平衡化した適
切なアニオン交換体でのイオン交換クロマトグラフィー
にかける。アニオン交換体−蛋白質複合体を適切な塩勾
配にかける。スーパーオキシドジスムターゼまたはアナ
ログを含有する画分を集めて濃縮し、蒸留水に対して透
析する。適当なバッファーでこの溶液のpHを約4.0 〜約
5.0 に調整する。次に、緩衝化した溶液をpH約 4.0〜約
5.0 で平衡化した適切なカチオン交換体でのイオン交換
クロマトグラフィーにかける。蛋白質−カチオン交換体
複合体を適切な塩勾配にかけ、精製されたスーパーオキ
シドジスムターゼ又はアナログを含有する得られた画分
を集める。
【００４５】本発明はこれらの方法で生成された、精製
された酵素学的に活性な組換え体の真核性スーパーオキ
シドジスムターゼ又はそのアナログにも係る。
【００４６】図面の説明 第１図乃至第３１図に示した各プラスミドの制限地図は
各プラスミドに存在する全ての制限部位を同定するもの
ではない。制限部位が１つの図には示されているが、も
う１つの図には示されていない場合もある。しかしなが
ら、本発明を完全に理解するために必要な制限部位は全
て示している。
【００４７】第１図：pAL ５００の構築 bGH cDNAを含むプラスミドＤ4 （ATCC No.３１８２６）
をHae IIで消化した。得られた１６００塩基対の大フラ
グメントを精製し、Ｓ１エキソヌクレアーゼで３７℃で
５分間消化した。得られたフラグメントの末端に配列： ＧＧＡＡＴＴＣＣ ＣＣＴＴＡＡＧＧ の合成Eco ＲＩリンカーを連結した。連結混合物をEco
ＲＩで開裂し、Eco ＲＩで開裂してあるpBR ３２２（AT
CC No.３７０１７）中に挿入した。Eco ＲＩで開裂する
と５′端に配列： ＡＡＴＴＣＣＣＡＧＣＣＡＴＧ… ＧＧＧＴＣＧＧＴＡＣ… を有する１２００塩基対フラグメントを遊離するクロー
ンpALRI が得られた。この配列が生成するということ
は、pALRI が天然bGH の１番目の残基（フェニルアラニ
ン）をコードするTTC コドンを含むEco ＲＩ制限部位を
含有することを示している。pALRI をPst Ｉで部分開裂
した。消化物をDNA ポリメラーゼＩの大フラグメント
（クレノウ）で処理し、配列： ＧＡＡＧＣＴＴＣ ＣＴＴＣＧＡＡＧ のHind IIIリンカーを連結した。連結混合物をEco ＲＩ
とHind IIIとで開裂した。bGH cDNAを含むフラグメント
を単離し、Eco ＲＩ及びHind IIIの制限部位間でpBR ３
２２にサブクローニングしてpAL ５００（ATCC No.３９
７８２）を得た。
【００４８】第２図：pRO ２１１及びpRO １２の構築 プラスミドpJH ２００（ATCC No.３９７８３）をNde Ｉ
で部分消化し、末端を充填（fill in ）するためにDNA
ポリメラーゼＩ（クレノウ）で処理した。得られた末端
を再び連結させて発現ベクターpRO ２１１を形成した。
発現ベクターpRO ２１１をNde Ｉ及びHind IIIで消化し
た。大フラグメントを単離し、pAL ５００（ATCC No.３
９７８２）から単離したNde Ｉ−Hind III bGHフラグメ
ントと連結してpRO １２を得た。（Nde Ｉ−Hind IIIフ
ラグメントはpAL ５００をEco ＲＩで消化し、消化産物
の末端に配列： ＴＡＴＧＧＡＴＣ ＡＣＣＴＡＧＴＴＡＡ の合成リンカーを連結させて生成した。連結混合物をNd
e Ｉ及びHind IIIで消化し、得られたNde Ｉ−Hind III
bGHフラグメントを単離した。）第３図：pSAL５２００−６の構築 pRO １２（第２図）をPvu IIで部分消化し、次いでNde
Ｉで消化することにより７２塩基対フラグメントを除去
した。消化したpRO １２に真正（authentic)bGH のＮ−
末端の最初の２４個のアミノ酸をコードする合成DNA フ
ラグメントを連結した。
【００４９】合成DNA フラグメントは配列：
【００５０】
【化１】
【００５１】の２つのリン酸化した合成一本鎖DNA をア
ニールして構築した。アニールしたフラグメントを４つ
のデオキシリボヌクレオシド三リン酸全ての存在下にDN
A ポリメラーゼＩ（クレノウ）で処理して、完全長（fu
ll length ）の二本鎖DNA を形成した。フラグメントを
Pvu IIとNde Ｉとで消化した後にpRO １２と連結させて
pSAL５２００−６を形成した。
【００５２】第４図：ｐ３００８の構築 ｐ３００８（ATCC No.３９８０４）は、プラスミドppGH
−Nde Ｉ／ＲＩのNdeＩ消化物から単離したpGH フラグ
メントとNde Ｉで消化したpRO ２１１（第２図）とを連
結して構築した。
【００５３】ppGH−Nde Ｉ／ＲＩは完全長のpGH cDNAを
含有しており、この両末端には合成リンカーによってNd
e Ｉ部位が付加されている。
【００５４】第５図：ｐ５００２の構築 二量体化した合成リンカーと、プラスミドpcGH−Nde Ｉ
／ＲＩのNde Ｉ及びBan II消化物から単離した２つのcG
H フラグメントとを３点連結（tripartite Ligation ）
してｐ５００２を構築した。連結混合物をNde Ｉで消化
し、次いで、予めNde Ｉで制限してある発現ベクターpR
O ２１１（第２図）と連結した。プラスミドｐ５００２
を含むコロニーを単離した。
【００５５】合成リンカーは配列：
【００５６】
【化２】
【００５７】を有する２つの一本鎖合成DNA から構築し
た。連結前にリンカーをリン酸化した。このリンカーは
真正cGH のＮ−末端の初めの１８個のアミノ酸をコード
する。
【００５８】プラスミドpcGH−Nde Ｉ／ＲＩは完全長cG
H cDNAを含有し、その５′端はEcoＲＩ制限部位であ
り、３′端はNde Ｉ制限部位である。これら制限部位は
合成リンカーを用いて付加した。
【００５９】第６図：pHG ４４及びpHG ５０の構築 pRO １２（第２図）をHind IIIで消化した。アガロース
ゲルで線状DNA (III型）を精製し、rRNAオペロン転写終
結配列Ｔ1 Ｔ2 を含有する約１２００塩基対のHind III
−Hind IIIフラグメントに連結した。Ｔ1 Ｔ 2 Hind III
−Hind IIIフラグメントは、Hind IIIで消化してあるプ
ラスミドpPS １（ATCC No.３９８０７）から単離した。
得られたプラスミドpHG ４４（ATCC No.３９８０６）は
組換え体（rec ）bGH 配列の３′端にＴ1 Ｔ2 配列を含
有している。
【００６０】λｃＩ434 リプレッサー配列を含有するプ
ラスミドpSK ４３４（ATCC No.３９７８４）をHpa IIで
消化した。λｃＩ 434 Hpa II−Hpa IIフラグメントを単
離し、Cla Ｉで消化してあるpHG ４４と連結した。得ら
れたプラスミドpHG ５０（ATCC No.３９８０５）はＴ1
Ｔ2 転写終結配列とλｃＩ434 リプレッサー配列とを含
有する。
【００６１】第７図：ｐ８３００−１０Ａの構築 Ｎ−末端にメチオニンを有する天然のフェニルアラニン
型bGH （met-phe bGH)のアナログを発現するプラスミド
ｐ８３００−１０Ａ（ATCC No.３９７８５）を次のよう
に製造した。プラスミドｐ７２００−２２はpJH ２００
（ATCC No.３９７８３）由来のλＰL プロモーターとリ
ボソーム結合部位と、met-phe bGH をコードするDNA
と、Ｔ1 Ｔ2 rRNA終結配列とを含有している。λＰL プ
ロモーター、ＣIIリボソーム結合部位、met-phe bGH 遺
伝子及びＴ1 Ｔ2 転写終結配列を有するCla Ｉ−Cla Ｉ
フラグメントをプラスミドpOP １Δ６の唯一（単一）の
ClaＩ部位に挿入してｐ８３００−１０Ａを形成した。
このプラスミドpOP １Δ６は高いコピー数を有する構成
プラスミド（constitutive high copy number plasmid)
である。
【００６２】第８図：pSAL−１３０／５及びpSAL−１７
０／１０の構築 met-asp-gln bGH 蛋白質を発現するプラスミドpHG ４４
（ATCC No.３９８０６）をNde Ｉ及びHind IIIで消化し
た。得られたNde Ｉ及びHind III bGHフラグメントを単
離し、ｐ８３００−１０Ａ（ATCC No.３９７８５）をNd
e ＩとHind IIIの両者で部分消化して調製したフラグメ
ントに連結した。このような連結により、met-phe bGH
遺伝子フラグメントをmet-asp-gln bGH 遺伝子フラグメ
ントに置換する。このようにして得たプラスミドpSAL−
１３０／５はrec bGH を発現する。pBR ３２２プラスミ
ド（ATCC No.３７０１７）の TetR 遺伝子を含有するEc
oＲＩ−Ava ＩフラグメントをDNA ポリメラーゼＩ（ク
レノウ）で処理し、予めBam ＨＩで消化しDNA ポリメラ
ーゼＩ（クレノウ）で充填したpSAL−１３０／５に挿入
することによりpSAL−１７０／１０を得た。
【００６３】第９図：pSAL−２１０／４の構築 pSAL−１７０／１０をCla Ｉで部分消化することにより
線状DNA (III型）を調製した。これをアガロースゲルで
精製し、プラスミドpSK ４３４（ATCC No.３９７８４）
のHpa II消化物から単離したHpa II−Hpa II ｃＩ434
遺伝子フラグメントに連結した。
【００６４】第１０図：pSAL５６００−１の構築 pSAL５２００−６（第３図）をHind IIIで消化した。ア
ガロースゲルで線状DNA (III型）を精製し、rRNAオペロ
ン転写終結配列Ｔ1 Ｔ2 を含有する約１２００塩基対の
Hind III−Hind IIIフラグメントに連結した。このＴ1
Ｔ 2 Hind III−Hind IIIフラグメントはHind IIIで消化
してあるプラスミドpPS １（ATCC No.３９８０７）から
単離した。得られたプラスミドpSAL５６００−１はmet-
asp-glnbGH 配列の３′端にＴ1 Ｔ2 配列を含有する。
【００６５】第１１図：ｐ３００９の構築 プラスミドｐ３００８（ATCC No.３９８０４）（第５
図）からNde Ｉ−Nde ＩpGHフラグメントを単離した。
予めNde Ｉで消化した発現ベクターｐ５７９（第１９
図）の唯一のNde Ｉ部位にこのフラグメントを挿入し
た。得られたプラスミドｐ３００９はＮ−末端に付加し
たメチオニン残基を有する天然のブタ成長ホルモン蛋白
質のアナログを発現する。
【００６６】第１２図：ｐ５００３の構築 プラスミドｐ５００２からNde Ｉ−Nde Ｉ cGHフラグメ
ントを単離した。予めNde Ｉで消化した発現ベクターｐ
５７９（第１９図）の唯一のNde Ｉ部位にこのフラグメ
ントを挿入した。得られたプラスミドｐ５００３（ATCC
No.３９７９２）はＮ−末端にメチオニン残基を付加し
た天然のニワトリ成長ホルモン蛋白質のアナログを発現
する。
【００６７】第１３図：pSODα２の構築 pJH ２００（ATCC No.３９７８３）発現ベクターをNde
Ｉで消化した。λＰLプロモーターとＣIIリボソーム結
合部位とを含有する５５０塩基対Nde Ｉフラグメントを
単離し、予めNde Ｉで消化したプラスミド pSOD ＮＨ−
１０の唯一のNde Ｉ部位に挿入した。（プラスミド pSO
D ＮＨ−１０はヒトSOD のcDNAクローン由来のものであ
る［リーマン−フルヴィッツ，ジェー．（Lieman-Hurwi
tz,J.)ら、PNAS（１９８２）７９：２８０８］。得られ
たプラスミド pSOD ＮＨ−５５０をAlu Ｉで消化した。
（関連Alu Ｉ部位のみを図示する。）λＰL プロモータ
ー及びSOD 遺伝子を含有する大Alu Ｉフラグメントを単
離した。Bam ＨＩリンカーを結合し、得られたフラグメ
ントをBam ＨＩで消化した。Bam ＨＩで消化産物をpBRM
（ATCC No.３７２８３）の唯一のBam ＨＩ部位に挿入し
てpSODα２（ATCC No.３９７８６）を形成した。
【００６８】第１４図：pSODα１３及びpSODβ１の構築 プラスミドpSODα２（ATCC No.３９７８６）をEco ＲＩ
で部分消化し、得られた線状DNA をアガロースゲルによ
り単離した。精製DNA をDNA ポリメラーゼＩ（クレノ
ウ）で充填し、再び連結した。得られたクローンpSODα
１３はリボソーム結合部位の５′端にEco ＲＩ部位を１
個有する。Eco ＲＩ及びAle Ｉで消化してあるプラスミ
ドpBLA１１（ATCC No.３９７８８）からβ−ラクタマー
ゼプロモーター及びリボソーム結合部位を含有するフラ
グメントを単離した。２００塩基対（bp）フラグメント
をpSODα１３から単離した大きなフラグメントに連結し
た。このpSODα１３はNde Ｉで消化し、DNA ポリメラー
ゼＩ（Klenow）で充填し、次いでEco ＲＩで消化してあ
った。得られたプラスミドpSODβ１はβ−ラクタマーゼ
遺伝子のリボソーム結合部位とλＰL プロモーターとを
含有している。
【００６９】第１５図：pSODβ 1 Ｔ 11の構築 プラスミドpBR ３２２（ATCC No.３７０１７）をEco Ｒ
ＩとAva Ｉで消化した。得られたDNA をDNA ポリメラー
ゼＩ（クレノウ）で充填した。その後、 TetR遺伝子フ
ラグメントを単離し、pSODβ１（第１４図）プラスミド
から単離した大フラグメントに連結した。このpSODβ１
プラスミドは予め、Pst Ｉで消化した後Bam ＨＩで部分
消化し、次いでDNA ポリメラーゼＩ（クレノウ）て充填
しておいた。得られたプラスミドpSODβ1 Ｔ11は TetR
遺伝子を含有している。
【００７０】第１６図：pSODβ 1 TT−１の構築 Hind IIIで消化し、DNA ポリメラーゼＩ（クレノウ）で
充填してあるプラスミドpPSI（ATCC No.３９８０７）か
らrRNAＴ1 Ｔ2 転写終結フラグメントを単離した。この
フラグメントを、Bam ＨＩで部分消化しDNA ポリメラー
ゼＩ（クレノウ）で充填してあるプラスミドpSODβ1 Ｔ
11（第１５図）に連結した。
【００７１】第１７図：pSODβ１−BA２の構築 天然のβ−ラクタマーゼリボソーム結合部位の配列に類
似の配列：
【００７２】
【化３】
【００７３】を有する合成DNA フラグメントをリン酸化
し、Nde Ｉ及びEco ＲＩで消化してあるpSODα１３プラ
スミド（第１４図）の大フラグメントに連結した。
【００７４】第１８図：pTV −１８８の構築 プラスミド pApo Ｅ−EX２（ATCC No.３９７８７）をNd
e Ｉで消化し、次いでフラグメントをDNA ポリメラーゼ
Ｉ（クレノウ）で充填した。得られたApo Ｅ遺伝子フラ
グメントを単離し、pSODβ1 Ｔ11プラスミド（第１５
図）の唯一のブラントエンド（平滑端）Stu Ｉ部位に挿
入した。得られたプラスミドpTV −１８８はApo Ｅ融合
蛋白質を発現する。
【００７５】第１９図：ｐ５７９の構築 Hind IIIで消化してあるプラスミドpPS １（ATCC No.３
９８０７）からrRNAオペロンＴ1 Ｔ2 転写終結フラグメ
ントを単離した。Ｔ1 Ｔ2 フラグメントを、Hind IIIで
消化してあるpRO ２１１（第２図）の唯一のHind III部
位に挿入した。得られた発現ベクターｐ５７９はλＰL
プロモーター、ＣIIリボソーム結合部位そしてＴ1 Ｔ2
転写終結信号を有している。
【００７６】第２０図：pTV −１７０の構築 Nde Ｉ−Nde Ｉ Apo ＥフラグメントをプラスミドpApo
Ｅ−EX２（ATCC No.３９７８７）から単離し、Nde Ｉで
消化してある発現ベクターｐ５７９（第１９図）の唯一
のNde Ｉ部位に挿入した。得られたプラスミドpTV −１
７０はＮ末端にメチオニン残基を付加した天然のヒトAp
o Ｅ蛋白質のアナログを発現する。
【００７７】第２１図：pTV −１９０の構築 プラスミドpTV −１７０（第２０図）をNde Ｉで部分消
化し、DNA ポリメラーゼＩ（クレノウ）で充填した。単
離した線状DNA を再連結してプラスミドpTV −１９０を
得た。プラスミドpTV −１９０を分析したところApo Ｅ
遺伝子の５′端に唯一のNde Ｉ部位を持つことが判っ
た。
【００７８】第２２図：pTV −１９４の構築 Eco ＲＩとAlu Ｉで消化した後プラスミドpBLA１１（AT
CC No.３９７８８）からβ−ラクタマーゼプロモーター
とリボソーム結合部位のフラグメントを単離した。この
フラグメントを、Nde Ｉで消化し、DNA ポリメラーゼＩ
（クレノウ）で充填した後Eco ＲＩで消化してあるpTV
−１７０（第２０図）プラスミドの大フラグメトに連結
した。
【００７９】第２３図：pSAL１６０−５の構築 Apo Ｅ DNA配列を有するAva Ｉ−Ava Ｉフラグメント
を、Ava Ｉで消化したpTV −１７０（第２１図）から単
離した。このフラグメントをDNA ポリメラーゼＩ（クレ
ノウ）で充填し、アガロースゲルで単離した。精製Apo
Ｅフラグメントを、Pst Ｉで部分消化しDNA ポリメラー
ゼＩ（クレノウ）で充填してあるpTV １０４(2) プラス
ミド（ATCC No.３９３８４）のPst Ｉ部位に挿入した。
得られたプラスミドをpSAL１６０−５と表わす。
【００８０】第２４図：pTV −２１４の構築 配列：
【００８１】
【化４】
【００８２】のヒト成長ホルモンの最初の１４個のアミ
ノ酸を含む合成フラグメントをγ−32Ｐ−ATP とポリヌ
クレオチドキナーゼでリン酸化した。リン酸化したリン
カーを、Nde Ｉで消化してあるpTV １９０プラスミドの
唯一のNde Ｉ部位に挿入した。
【００８３】第２５図：pTVR２７９−８の構築 pTVR２７９−８はpTV １９０から構築したpTV ２６４−
４５から構築した。
【００８４】Met −Apo Ｅ３アナログの発現を支配する
プラスミドpTV １９０をAva Ｉで部分開裂し、DNA ポリ
メラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて「充填」
し、再連結した。得られたプラスミドpTV ２６４−４５
には遺伝子の３′端のAva Ｉ部位がない。
【００８５】プラスミドpTV ２６４−４５をNde Ｉで完
全に消化し、配列： ５′−ＴＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴ ＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＡＴ−５′ のリン酸化した合成リンカーに連結した。pTVR２７９−
８と表わされる得られたプラスミドはmet −leu −leu
−leu −met −Apo Ｅ３アナログの発現を支配する。
【００８６】第２６図：ｐ９２００の構築 pHG ４４からアンピシリン耐性遺伝子のほとんどを除去
しpHG ４４のテトラサイクリン耐性遺伝子で置き換える
ことによりプラスミドｐ９２００を構築した。pHG ４４
をGla ＩとPst Ｉで開裂し、DNA ポリメラーゼＩのクレ
ノウフラグメントで処理し、DNA 大フラグメントを単離
した。このフラグメントを、Eco ＲＩとAva ＩでpBR ３
２２を開裂し、クレノウフラグメントで処理した後に単
離したpBR ３２２のDNA 小フラグメントに連結した。連
結で得たプラスミドをｐ９２００と表わした。
【００８７】プラスミドｐ９２００はmet −asp −gln
−bGH アナログの発現を支配し、宿主細胞をテトラサイ
クリン耐性とする。
【００８８】第２７図：pTV ３００の構築 pTV ３００は met14−hGH アナログの発現を支配する。
【００８９】pTV １８(1) をNde Ｉで開裂し、 met14−
hGH DNA を単離し、Nde Ｉで開裂したｐ５７９（第１９
図）に連結することによりpTV ３００を構築した。
【００９０】pTV １８(1) は１９８５年１月２３日に公
開された欧州特許出願公開第０１３１８４３Ａｌ明細書
又は対応の１９８３年７月１５日出願の米国特許出願番
号第５１４，１８８号明細書（援用して本明細書に包含
する）に記載されたようにして得ることができる。
【００９１】第２８図：Apo Ｅアナログの細胞内蓄積に
伴う細胞毒性 pTV １９４を含有するｃ６００細胞（５ml）又はトラン
スフェクションしていない対照（コントロール）細胞を
培養し、インキュベーション温度を３０℃から４２℃に
上昇させることにより誘導した。図に示した時間に、培
養物の１mlアリコートを取り、氷で急冷し、成長培地で
段階的に希釈し、適当な抗生物質の存在下に寒天上に置
き、３０℃で一晩インキュベートした。コロニー数は２
つのプレートの平均から決定した。pTV １９４をトラン
スフェクトしたｃ６００細胞とトランスフェクトしてい
ないｃ６００細胞とを３０℃に維持した対応培養物（pa
rallel culture）を非誘導対照とした。
【００９２】第２９図：線維芽細胞のApo −Ｂ，Ｅ（LD
L)レセプターへのApo Ｅ DMPC 複合体の結合 生物工学処理したApo Ｅ（met −Apo Ｅ ３アナログ）
と真正Apo Ｅのリン脂質複合体は、蛋白質とDMPCとを２
２℃でインキュベートすることによって調製した。（実
施例３８の後の参考文献３０に）記載したように、密度
勾配超遠心で非複合物質から複合体を分離した。左：４
℃において、培養した線維芽細胞レセプターとの結合に
ついて 125Ｉ標識ヒトLDL と競合する生物工学処理Apo
Ｅ及び真正Apo Ｅ・DMPC複合体の能力。右： 125Ｉ−標
識Apo Ｅアナログ及び真正Apo Ｅ・DMPC複合体の培養線
維芽細胞と直接結合する能力。
【００９３】第３０図：肝臓の膜のApo Ｅレセプターに
対する 125Ｉ−Apo Ｅ・DMPC複合体の結合 第２９図に記載の通りにリン脂質（DMPC）複合体を調製
した。コレステロールを与えた成犬の肝臓の膜をApo Ｅ
レセプター源として用い、（実施例３８の後の参考文献
３２に）記載の如く調製した。 125Ｉ−標識した生物工
学処理した及び真正Apo Ｅ DMPC 複合体を、（実施例３
８の後の参考文献３２）に記載の如く４℃で膜に結合さ
せた。
【００９４】第３１図：ウサギ血漿からのヨウ素化Apo
Ｅのクリアランス 生物工学処理した及び真正Apo Ｅをウサギ血漿１mlと共
に３７℃で３０分間インキュベートした後、この混合物
をウサギの静脈に注射した。図に示す時間に、約２mlの
血液をEDTAを含有するバイアル中に採取し、計数測定用
血漿を調製した。（実施例３８の後の参考文献３３に）
記載されているように、測定値（カウント）はTCA 可溶
分解産物に対して補正する。
【００９５】発明の詳細な説明 遺伝子の発現とポリペプチドの産生を増強しうるベクタ
ーが開発された。このプラスミドは２本鎖DNA 分子であ
る。このプラスミドを非耐熱性リプレッサーＣI を含有
する適切な細菌の宿主細胞に導入すると、この細胞は、
宿主細胞の温度がリプレッサー不活性化温度まで上昇し
たときに、プラスミドに挿入された所望の遺伝子を発現
して、遺伝子がコードするポリペプチドを産生させるこ
とができる。
【００９６】前記ベクターは５′から３′に向って次の
ものを順に含んでいる。
【００９７】・ラムダバクテリオファージ由来のプロモ
ーターとオペレーターＰL ＯL を含有するDNA 配列； ・抗転写終結因子Ｎ蛋白質を結合するためのＮ利用部
位； ・その後に続くリボソーム結合部位を含有するDNA 配列
を置換できる第１の制限酵素部位； ・所望遺伝子のmRNAが宿主細胞内のリボソームと結合し
うるようにするためのリボソーム結合部位を含有するDN
A 配列； ・ATG 開始コドン、又はベクターに所望遺伝子を挿入す
るときにATG 開始コドンに変換されるDNA 配列；及び ・ATG 開始コドンと位相を合わせてベクター内に所望遺
伝子を挿入するための第２の制限酵素部位。
【００９８】前記ベクターは、又、宿主細胞内で自律複
製できる細菌プラスミド由来の複製起点を含有するDNA
配列と、ベクターが宿主細胞中に存在するときに現われ
る選択可能な又は同定可能な表現形質に関連する遺伝子
を含有するDNA 配列とｃＩ434 と表わされるフラグメン
トを含有するDNA 配列とからなる群から選択される選択
手段とを含んでいる。このようなｃＩ434 フラグメント
はｃＩ434 リプレッサー蛋白質の遺伝子とそれに関連す
るプロモーター及びオペレーター配列とを含んでいる。
ｃＩ434 はｃＩ434 −溶原素（lysogen ）を抑制するの
で、このプラスミドを損失すると細胞融解（lysis ）が
起こるであろう。ＰL ＯL プロモーター及びオペレータ
ー配列の３′末端とＮ利用部位の５′末端との間の距離
は約８０塩基対未満であり、Ｎ利用部位の３′末端とリ
ボソーム結合部位の５′末端との間の距離は約３００塩
基対未満である。
【００９９】ベクターの適宜付加成分は第２の制限酵素
部位の３′末端に位置するＴ1 Ｔ2rRNA転写終結配列で
ある。Ｔ1 Ｔ2 rRNA転写終結配列が第２の制限酵素部位
の３′末端から約１００塩基対未満であると好ましい。
より好ましくは、Ｔ1 Ｔ2 rRNA転写終結配列が第２の制
限酵素部分の３′末端から約２０塩基対未満である。ベ
クターは、このベクターが宿主細胞内に存在するときに
現われる選択可能な又は同定可能な表現形質に関連して
いる遺伝子を含有しているDNA 配列か、λｉmm４３４ｃ
Ｉ- 溶原素を抑制するｃＩ434 リプレッサー遺伝子を含
有しているDNA 配列のいずれか、又は両者を含んでい
る。
【０１００】選択可能な又は同定可能な表現形質に関連
する適切な遺伝子は温度感受性又は薬剤耐性例えばアン
ピシリン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン
に対する耐性に関連するものを包含する。宿主がｃＩ
434 リプレッサー遺伝子を含有しているときには、この
宿主内でλｉmm４３４ｃＩ- プロファージが誘発されな
い。従って、ｃＩ434 が存在するときには高価な抗生物
質選択用生理食塩水を使う必要はない。
【０１０１】ベクターは、選択可能な又は同定可能な表
現形質に関連する遺伝子を含有しているDNA 配列と、ｃ
Ｉ434 と表わされるフラグメントを含有するDNA 配列と
の両方を含んでいるのが好ましい。
【０１０２】ｃＩ434 遺伝子がベクターに含まれている
ときにはＴ1 Ｔ2 rRNA配列の３′末端の後に位置してい
ることが望ましい。
【０１０３】ベクターは、宿主細胞内で自律複製しうる
細菌プラスミド由来の複製起点をも含んでいる。このよ
うな複製起点の適切なものは多くの源、例えばpBR ３２
２又はpRI から得ることができる。
【０１０４】好ましくは、ベクターは、宿主細胞内でベ
クターの構成コピーを少なくとも４００個自律複製しう
る高い構成コピー数の細菌プラスミド由来の複製起点を
有している。より好ましくは、この複製起点がCol Ｅ１
である。最も好ましくは、起点は第７図に示す制限地図
を有するプラスミドpOP １Δ６である。
【０１０５】ベクターのもう１つの成分は、その後に続
くリボソーム結合部位を含有するDNA 配列を置換させう
る第１の制限酵素部位である。多数のこのような部位が
使用できる。Eco ＲＩが適切である。
【０１０６】ベクターのもう１つの成分は、ATG 開始コ
ドンと位相を合わせてプラスミドに所望遺伝子を挿入す
るための第２の制限酵素部位である。多数のこのような
部位を使用しうる。適切部位はNde Ｉ，Cla Ｉ，Hind I
II，Sma Ｉ，Bgl II，Xba Ｉ，Sac Ｉ及びAlu Ｉを包含
する。
【０１０７】一般的に、第２の制限酵素部位がリボソー
ム結合部位を含有するDNA 配列を置換させうるに必要な
第２の制限部位としても機能することが好ましい。第２
の制限酵素部位をこの目的にも用いることができないと
きには、本発明ベクターはリボソーム結合部位の後且つ
第２の制限部位の前に第３の制限酵素部位をも含んでい
なければならない。
【０１０８】好ましくは、ベクターは２つの非反復（un
ique）制限酵素部位を含有している。第１の部位はリボ
ソーム結合部位を含有するDNA 配列を置換させることが
できる。第２の部位はATG 開始コドンと位相を合せてプ
ラスミドに所望遺伝子を挿入させることができる。本明
細書中で用いられている「非反復（唯一の，単一の）制
限酵素」という用語はプラスミド中に１つだけある制限
酵素部位を意味している。現状での好ましい具体例にお
いては、Eco ＲＩが第１の制限酵素部位であり、Nde Ｉ
が第２の制限酵素部位である。
【０１０９】好ましくは、ベクターは共有結合で閉じた
環状二本鎖の分子である。しかしながら、プラスミドが
共有結合で閉じていることは必須ではない。
【０１１０】宿主細胞をＣI リプレッサー蛋白質の不活
化温度まで加熱した後に、プラスミドの発現レベルが上
昇する。この目的のためには約３８℃以上の温度が有効
である。又、宿主細胞に対する不必要な熱損傷を最小限
にすることが望ましいので、温度は４２℃を数度以上超
えないことが一般的に好ましい。
【０１１１】ベクターの１つの重要な成分はリボソーム
結合部位である。適切な部位は、 配列：
【０１１２】
【化５】
【０１１３】を有するラムダバクテリオファージ由来の
ＣII； 配列：
【０１１４】
【化６】
【０１１５】を有するラムダバクテリオファージ由来の
ＣIIの変異体； 配列：
【０１１６】
【化７】
【０１１７】を有するバクテリオファージラムダの主要
頭部蛋白質遺伝子； pBR ３２２由来の天然のβ−ラクタマーゼリボソーム結
合部位； 配列：
【０１１８】
【化８】
【０１１９】を有する合成オリゴヌクレオチド； 配列：
【０１２０】
【化９】
【０１２１】を有する合成オリゴヌクレオチド；及びバ
シラスツレンゲンシス（Bacillus thurengensis）由来
の天然のリボソーム結合部位である。
【０１２２】以前に記載されたベクターと比較して、本
発明ベクターは所望のポリペプチド生成物をコードする
広範囲の遺伝子の発現を増強するために使用することが
できる。成長ホルモン例えばウシ、ブタ、ニワトリ又は
ヒトの成長ホルモンや、スーパーオキシドジスムターゼ
やアポリポプロテインＥ又はそれらいずれかのアナログ
をコードする遺伝子が適切な遺伝子に含まれる。アナロ
グ（アナログ、類似体）とは天然のポリペプチドと同じ
活性を有しているが、ポリペプチドのＮ末端で１つ以上
の異なるアミノ酸が付加されているか、欠失しているか
又はその両者であるポリペプチドを意味している。
【０１２３】本発明のプラスミドと共に用いる好ましい
宿主は大腸菌（ Escherichia coli）である。現状で好
ましい株はＡ１６３７，Ａ１６４５，Ａ２６０２，Ａ２
０９７，Ａ１５６３及びＡ１６４５（λｉ４３４ｃＩ-
mini Tn １０）である。
【０１２４】スーパーオキシドジスムターゼ又はそのア
ナログの発現のために現状で最も好ましい株はＡ１６４
５である。
【０１２５】Ａ１６４５及びＡ１６４５（λｉ４３４ｃ
Ｉ- mini Tn １０）が動物の成長ホルモン遺伝子を発現
するための現状でより好ましい株である。
【０１２６】(1) フェニルアラニン型真正bGH のアミノ
末端にアミノ酸配列met −asp −gln がついているbGH
アナログ、又は(2) フェニルアラニン型天然cGH のアミ
ノ末端にアミノ酸、メチオニンがついているcGH のアナ
ログを産生する遺伝子の発現のための現状で最も好まし
い株はＡ２０９７である。
【０１２７】テトラサイクリン耐性遺伝子を含有するト
ランスポゾンをガラクトースオペロン内に挿入し、ガラ
クトースオペロンに近い所で発現用のラムダ系を挿入す
ることによってｃ６００からＡ１６３７を得た。Ｃ６０
０はアメリカンタイプカルチャーコレクションからATCC
受託番号２３７２４号として入手できる。
【０１２８】Gal+ （ガラクトース発酵能）に関して選
択し、テトラサイクリン耐性を失わせることにより、Ａ
１６３７からＡ１６４５を得た。Ａ１６４５はラムダ発
現系を含有しているが選択によってトランスポゾンの一
部は取り除かれている。この表現型はＣ６００ｒ- ｍ+
gal+ thr- leu- lac Ｚ- bl（λｃＩ８５７ΔＨＩΔ
Bam ＨＩ Ｎ+ ）である。以下により詳細に記載した種
々のプラスミドも含み、Ａ１６４５は米国（U.S.A.）、
マリーランド（Maryland）、ロックビル（Rockville ）
のアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託され
ている。
【０１２９】Ａ１６４５（λｉ４３４ｃＩ- mini Tn １
０）は３０℃でｉmm４３４ｃＩ３００８mini Tn １０Δ
１６Δ１７をプラスミド含有大腸菌（ Escherichia co
li）株Ａ１６４５に感染させることにより得た。テトラ
サイクリン耐性コロニーを単離精製した。プラスミドpH
G ５０を含有するこの株はATCC受託番号３９８０５とし
てアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託して
ある。
【０１３０】Ａ２６０２及びＡ１５６３はSA５００由来
である。これらの表現型は各々SA５００ his- ile- g
al+ Δ８（λｃＩ８５７ΔＨＩΔBam Ｎ+ ）及びSA５０
０ his- ile- gal+ Δ８ lac Ｚ- Ａ２１（λｃＩ８
５７ int２ xis１ nutＬ3 ΔＨＩ）である。Ａ２０９７
はＡ１６４５由来である。この表現型はＡ１６４５ lac
Δx Ａ２１ prc Ｃ::Tn１０である。
【０１３１】最少必須培地中で増殖させたときでさえ高
いレベルでポリペプチドを発現することができる大腸菌
（ Escherichia coli）の原栄養株も又、本発明ベクタ
ーの宿主として使用できる。好ましい原栄養株はＡ４２
００とＡ４２５５とを包含する。プラスミドｐ９２００
を含有する株Ａ４２５５は受託番号５３２１５号として
ATCCに寄託してある。プラスミドpGH ４４を含有するＡ
４３４６のようなビオチン非要求（依存）性原栄養株が
更に好ましい。Ａ４３４６は受託番号５３２１８号とし
てATCCに寄託してある。
【０１３２】大腸菌（ Escherichia coli）の溶原株も
本発明のベクターの宿主として使用できる。ポリペプチ
ドが産生する温度において、ポリペプチドが産生する速
度よりゆっくりと、例えば細胞を融解させるエンドリシ
ンのような物質を産生する溶原株が適切な溶原株に含ま
れる。これにより、産生された溶解物質の量が細胞融解
を起こすレベルに達する前に、細胞が比較的大量の所望
ポリペプチドを産生することができる。適切な溶原菌の
例には、pGH ４４を含有する株Ａ４０４８のようなPlc
Ｉtsプラスミドを含有するものが含まれる。Ａ４０４８
は受託番号５３２１７号でATCCに寄託してある。
【０１３３】pBR ３２２とpBRMは各々ATCC受託番号３７
０１７号及び３７２８３号としてアメリカンタイプカル
チャーコレクションから入手でき、Ｄ4 は米国特許出願
と関連してATCC受託番号３１８２６号として寄託した以
外、全ての寄託は微生物の寄託の国際的承認に関するブ
ダペスト条約に従った。
【０１３４】ベクターは本発明が関連する分野の当業者
には公知の方法で形成できる。これらの方法については
本明細書中に記載した種々の文献中により詳細に記載さ
れており、従来技術に関する完全な情報を提供するため
に本明細書中に参考としてそれらの内容を包含する。
【０１３５】現状の好ましいベクターの１つは第２図に
示す制限地図を有するpJH ２００である。Ａ１６４５株
を用い、従来の形質転換法により大腸菌（ Escherichia
coli）にこのベクターを導入した。得られた宿主ベク
ター系はATCC受託番号第３９７８３号として寄託してあ
る。所望のポリペプチド例えばウシ成長ホルモンをコー
トする遺伝子をpJH ２００に挿入できる。
【０１３６】２番目の好ましいベクターpRO ２１１はpJ
H ２００のNde Ｉ部分消化物から構築した。pRO ２１１
は第２図に示す制限地図を有する。このベクターをNde
Ｉ及びHind IIIで消化し、大フラグメントを単離し、こ
れをpAL ５００（ATCC受託番号３９７８２号）から得た
bGH cDNAに連結することによりウシ成長ホルモンcDNAを
pRO ２１１に挿入した。得られたプラスミドはpRO １２
と表わす。これの制限地図も第２図に示す。
【０１３７】プラスミドpRO １２をPvu IIで部分消化
し、続いてNde Ｉにより消化する。真正bGH のＮ末端の
最初の２４個のアミノ酸をコードする合成DNA フラグメ
ントを消化したpRO １２に連結する。得られたプラスミ
ドはpSAL５２００−６と称し、その制限地図を第３図に
示す。
【０１３８】本発明のベクターはまた、ヒトスーパーオ
キシドジスムターゼ（SOD ）あるいはその類似物（アナ
ログ）を生産するプラスミドを生成するように工学処理
し得る。λＰL プロモーター及びＣIIリボソーム結合部
位を有するpJH ２００（ATCC受託番号３９７８３）のフ
ラグメントを、第１３図に示すように、単離した後ヒト
SOD 遺伝子を含むプラスミド pSOD ＮＨ−１０に挿入し
て、 pSOD ＮＨ−５５０と称するプラスミドを形成し
た。λＰL プロモーター及びSOD 遺伝子を含むフラグメ
ントを pSOD ＮＨ−５５０のAlu Ｉによる消化後単離し
た。Bam ＨＩリンカーの添加及びその後のBam ＨＩによ
る制限の後、フラグメントをpBRMの唯一のBam ＨＩ部位
に挿入した。pBRMはATCC受託番号３７２８３で寄託され
ている高コピー数プラスミドである。得られたプラスミ
ドをpSODα２と称する。その制限地図を第１３図に示し
た。このプラスミドは E. coli株Ａ２０９７中に入れて
ATCC受託番号３９７８６で寄託されている。
【０１３９】プラスミドpSODα２（ATCC受託番号３９７
８６）はＣIIリボソーム結合部位を含んでいる。このリ
ボソーム結合部位を、pBLA１１のEco ＲＩ−Alu Ｉダイ
ジェスト（消化物）から単離したβ−ラクタマーゼプロ
モーター及びシャイン−ダルガーノ（Shine-Dalgarno）
リボソーム結合部位を含有するフラグメントにより置き
換える。（プラスミドpBLA１１は第１４図に示す制限地
図を有するものであり、 Escherichia coli株Ａ１６４
５中に入れてATCC受託番号３９７８８により寄託されて
いる。）ＣIIリボソーム結合部位を第１４図に示すよう
にプラスミドpSODα２から除去する。pSODα２をEco Ｒ
Ｉにより部分的に制限しDNA ポリメラーゼＩ（Klenow）
で充填し再連結すると、該プラスミド中に残る唯一のEc
o ＲＩ部位がＣIIRBS の５′末端となる。得られたpSOD
α１３と称するプラスミドをNdeＩで消化し、DNA ポリ
メラーゼＩ（Klenow）で充填し、次にEco ＲＩにより消
化する。大フラグメントを単離し、pBLA１１より単離さ
れたβ−ラクタマーゼプロモーター及びリボソーム結合
部位を含むフラグメントに連結してプラスミド pSOD β
１を構築する。
【０１４０】pSOD β１はアンピシリン抵抗性遺伝子フ
ラグメント（ AmpR ）の替りにテトラサイクリン抵抗性
遺伝子フラグメント（ TetR ）を含むように改変し得
る。 AmpR フラグメントをPst Ｉ引き続きBam ＨＩ（部
分的）による消化によりpSODβ１から除去した。得られ
たプラスミドをDNA ポリメラーゼＩ（Klenow）で充填し
た。別に TetR 遺伝子フラグメントをpBR ３２２のEco
ＲＩ−Ava Ｉダイジェストから単離し、充填し、上で充
填したプラスミドに連結した。（プラスミドpBR３２２
は広く入手可能で、例えばアメリカンタイプカルチュア
コレクションからATCC受託番号３７０１７として入手可
能である。）得られたプラスミドをpSODβ1 Ｔ11と称す
る。その制限地図を第１５図に示す。
【０１４１】ヒトスーパーオキシドジスムターゼを生産
するのに使用し得るもう１つのプラスミドをpSODβ１−
BA２と称する。そのpSODα１３からの構築を第１７図に
示す。
【０１４２】本発明のベクター、例えばpRO ２１１はま
たブタあるいはニワトリ成長ホルモンを生産するように
処理することもできる。即ち第４図に示すように、ブタ
成長ホルモンcDNAをppGH−Nde Ｉ／ＲＩのNde Ｉダイジ
ェストから単離した。得られたpGH 遺伝子を含むフラグ
メントをpRO ２１１のNde Ｉダイジェストに連結した。
得られたプラスミドはｐ３００８と称し、 E. Coli株Ａ
２０９７中に入れてATCC受託番号３９８０４で寄託され
ている。
【０１４３】本発明の他の実施態様においては、第５図
に示すようにpcGH−Nde Ｉ／ＲＩのNde Ｉ−Ban IIダイ
ジェストから２つのニワトリ成長ホルモンフラグメント
を単離した。２つのcGH フラグメントを、真正cGH のＮ
末端の最初の１８個のアミノ酸をコードするリン酸化合
成リンカーに連結した。リンカーの配列は下記の通りで
ある。
【０１４４】
【化１０】
【０１４５】得られたフラグメントを次にpRO ２１１の
Nde Ｉダイジェストに連結し、ｐ５００２と称するプラ
スミドを形成した。その制限地図を第５図に示す。
【０１４６】本発明のベクターはまた、ヒトアポリポプ
ロテインＥを生産するように工学処理することもでき
る。ヒトアポリポプロテインＥ（Apo Ｅ）遺伝子はプラ
スミドpApo Ｅ−EX２からNde Ｉ消化により単離され
る。 pApo Ｅ−EX２は第１８図に示す制限地図を有し、
E. coli株Ａ１６４５中に入れてATCC受託番号３９７８
７で寄託されている。
【０１４７】Apo Ｅ遺伝子（cDNA）は種々のプラスミド
中に配置し得る。好ましい具体例はプラスミドpTV −１
８８であり、その制限地図を第１８図に示す。pTV −１
８８は、 pApo Ｅ−EX２から単離されたApo Ｅ遺伝子を
プラスミドpSODβ1 Ｔ11のStu Ｉダイジェストに連結す
ることにより構築した。pTV −１８８は TetR フラグメ
ント、ＰL プロモータ配列、β−ラクタマーゼプロモー
ター及びシャイン−ダルガーノ配列を含む。このプラス
ミドはApo Ｅ融合プロテインを発現する。
【０１４８】Apo Ｅ遺伝子を含むプラスミドのもう１つ
の好ましい具体例は第２３図に示した制限地図を有する
pSAL１６０−５である。pSAL１６０−５はpTV １０４
(2) （ATCC受託番号３９３８４）及びプラスミドpTV −
１７０（第２０図参照）から構築した。Apo Ｅ遺伝子は
pTV −１７０から単離し、pTV １０４(2) のPst Ｉ部位
のヒト成長ホルモン遺伝子配列内に挿入した。得られた
プラスミドpSAL１６０−５は AmpR フラグメント及びＰ
L プロモーター配列を含む。
【０１４９】現状での好ましいベクターの一つは、第１
９図に示す制限地図を有するｐ５７９である。このベク
ターは適当な Escherichia coli株、例えばＡ１６３
７，Ａ２６０２，Ａ１５６３，Ａ１６４５あるいはＡ２
０９７に、当業者にとっては公知の慣用の形質転換法に
より導入し得る。所望のポリペクチド、例えばブタ成長
ホルモンあるいはニワトリ成長ホルモンをコードした遺
伝子をｐ５７９に挿入し得る。
【０１５０】ブタ成長ホルモンcDNAを、ベクターｐ５７
９をNde Ｉにより消化し、このオープンストランドをｐ
３００８（ATCC受託番号３９８０４）より得たpGH cDNA
に連結することによって、ｐ５７９に挿入した。得られ
たプラスミドをｐ３００９と称し、その制限地図を第１
１図に示す。
【０１５１】ベクターｐ５７９をNde Ｉで消化し、この
オープンストランドをｐ５００２から得たcGH cDNAに連
結することによって、ニワトリ成長ホルモンcDNAをｐ５
７９に挿入した。得られたプラスミドをｐ５００３と称
し、その制限地図を第１２図に示す。ｐ５００３は Esc
herichia coliＡ２０９７株中に入れてATCC受託番号３
９７９２で寄託されている。
【０１５２】ヒトアポリポプロテインＥ（Apo Ｅ３）産
生遺伝子はおそらくその最終産物のアミノ末端にアミノ
酸メチオニンが付加しているであろうが、これもｐ５７
９に挿入し得る。得られたpTV −１７０と称するプラス
ミドの構築を第２０図に示す。このプラスミドはpJH ２
００（ATCC受託番号３９７８３）由来のＣIIリボソーム
結合部位を有する。
【０１５３】プラスミドpTV −１７０はApo Ｅ遺伝子の
両端を区切っているNde Ｉ部位の一つを除去することに
よって改変し得る。得られたプラスミドはpTV −１９０
と称し、第２１図に示す。
【０１５４】pTV −１７０はまた、ＣIIリボソーム結合
部位をpBLA１１（ATCC受託番号No.３９７８８）から単
離されたβ−ラクタマーゼプロモーター及びシャイン−
ダルガーノリボソーム結合部位配列と置き替えることに
より改変し得る。得られたプラスミドはpTV −１９４と
称し、第２２図に示した制限地図を有する。
【０１５５】pTV −１９０（第２１図）はまた、ヒトAp
o Ｅ３のアナログを生産するように改変することもで
き、このアナログはそのアミノ末端において、成熟ヒト
Apo Ｅ３の配列に結合した、ヒト成長ホルモンの１４個
のアミノ酸のアミノ末端配列及びそれに続くメチオニン
を有する。このプラスミドをpTV −２１４と称し、第２
４図に示した制限地図を有する。
【０１５６】Apo Ｅ３遺伝子を含むプラスミドのもう一
つの好ましい具体例は第２５図に示した制限地図を有す
るpTVR２７９−８である。pTVR２７９−８はpTV １９０
から構築されたpTV ２６４−４５から構築される。プラ
スミドpTV １９０（第２１図）をAva Ｉにより部分的に
開裂し、DNA ポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを
使用して“充填”し、再連結する。得られたプラスミド
はpTV ２６４−４５と称し、遺伝子の３′末端においAv
a Ｉ部位を欠除している。プラスミドpTV ２６４−４５
をNde Ｉにより完全に消化し、下記の配列を有するリン
酸化合成リンカーに連結する。
【０１５７】５′−ＴＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴ ＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＡＴ−５′ 得られたプラスミドはpTVR２７９−８と称しATCCに受託
番号５３２１６で寄託されている。
【０１５８】本発明のベクターはまた、ヒト成長ホルモ
ンを産生することができるプラスミドを形成するように
工学処理することもできる。このようなプラスミドの１
つの例はpTV ３００であり、第２７図に示した制限地図
を有している。pTV ３００は、pTV １８(1) をNde Ｉに
より開裂し、 met14−hGH DNA を単離し、それをNdeＩ
で開裂したｐ５７９（第１９図）に連結することによっ
て構築した。pTV １８(1）は、１９８５年１月２３日公
開のヨーロッパ特許出願公開No. ０１３１８４３Ａ１号
あるいは対応する１９８３年７月１５日出願のアメリカ
特許出願５１４，１８８号（援用して本明細書に包含す
る）に記載されているようにして得られる。
【０１５９】本発明のベクターはまた、アミノ末端がア
セチル化されていないという点において天然のヒトSOD
と異なっているヒトＣｕ−Ｚｎスーパーオキシドジスム
ターゼ(SOD) のアナログを産生するプラスミドを生成す
るように工学処理することもできる。このようなプラス
ミドは第１６図に従って構築され、pSODβ１TT−１と称
する。
【０１６０】本発明のベクターは組換えウシ成長ホルモ
ンを産生するプラスミドを生成するように処理し得る。
１つの例として、真正pGH のフェニルアラニン形のアミ
ノ末端に付加されたアミノ酸配列met −asp −gln を有
するbGH アナログの生産があり、このアナログはrec bG
H とも称される。そのようなホルモンを産生するプラス
ミドpGH ４４は第６図の図式に従って構築されるもので
あり、Ａ２０９７株に入れてATCC受託番号３９８０６で
寄託されている。
【０１６１】met −asp −gln ウシ成長ホルモンを生産
するもう一つのプラスミドはｐ９２００である。このプ
ラスミドｐ９２００はpHG ４４（第６図）に似ている
が、アンピシリン抵抗性の替りにテトラサイクリン抵抗
性を与える。ｐ９２００の構築は第２６図に示した。pH
G ４４をCla Ｉ及びPst Ｉにより開裂し、DNA ポリメラ
ーゼＩのクレノウフラグメントを使用して“充填”し、
次いで大DNA フラグメントを単離した。このフラグメン
トを、pBR ３２２をEco ＲＩ及びAva Ｉにより開裂しDN
A ポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを使用して
“充填”することにより単離したpBR ３２２のテトラサ
イクリン抵抗性遺伝子を含むDNA フラグメントに連結し
た。得られたプラスミドｐ９２００はATCCに受託番号５
３２１５で寄託されている。
【０１６２】もう一つの例は、天然bGH のフェニルアラ
ニン形のアミノ末端につけ加えられたアミノ酸メチオニ
ンを有するbGH アナログの生産である。このようなホル
モンを産生するプラスミドpSAL５６００−１は第１０図
に示したように構築した。プラスミドｐ７２００−２２
もこのようなホルモンを産生する。このプラスミドは第
７図に示した制限地図を有する。
【０１６３】現状で好ましいベクターの一つは、Cla Ｉ
部位にクローニングされたｃＩ434フラグメントを含有
するDNA 配列を持ったベクターｐ５７９である。ｐ５７
９は第１９図に示した制限地図を有する。
【０１６４】天然のウシ成長ホルモンのフェニルアラニ
ン形のアミノ末端につけ加えられたmet −asp −gln の
アミノ酸配列を有するウシ成長ホルモンのアナログ（re
c −ウシ成長ホルモンとも称する）を発現するプラスミ
ドを構築した。このようなプラスミドの１つはpHG ５０
であり、第６図に示した制限地図を有する。このプラス
ミドはＡ１６４５株（λｉ４３４ｃＩ- mini Tn １０）
中に入れてATCC受託番号３７８０５でアメリカンタイプ
カルチュアコレクションに寄託されている。
【０１６５】もう一つのこのようなプラスミドはpSAL−
２１０／４であり、第９図に示した制限地図を有する。
【０１６６】現状での好ましいベクターの１つはプラス
ミドｐ８３００−１０Ａからmet −phe bGH を除去する
ことによって得られる。このプラスミドｐ８３００−１
０Ａは第７図に示した制限地図を有し、Ａ２０９７株中
に入れてATCC受託番号３９７８５でアメリカンタイプカ
ルチュアコレクションに寄託されている。
【０１６７】現状でのもう一つの好ましいベクターは、
プラスミドpSAL−１７０／１０からrec bGH 遺伝子を除
去して得られる。このプラスミドpSAL−１７０／１０の
制限地図を第８図に示した。
【０１６８】現状での好ましい第３のベクターはプラス
ミドpSAL−２１０／４からｒｅｃ ｂＧＨ遺伝子を除去
して得られる。このプラスミドｐＳＡＬ−２１０／４の
制限地図を第９図に示した。
【０１６９】本発明のベクターは、宿主に導入すること
によりウシ成長ホルモンのアナログを産生するプラスミ
ドを生成するようにも工学処理し得る。ｐ８３００−１
０Ａ（ATCC受託番号３９７８５）はこのようなプラスミ
ドの１例であるが、第７図に示したようにして構築し
た。それにより生産されたこのアナログは、天然bGH の
フェニルアラニン形のアミノ末端につけ加えられたメチ
オニン残基を有する。
【０１７０】他のプラスミドも、天然bGH のフェニルア
ラニン形のＮ末端につけ加えられたmet −asp −gln の
アミノ酸配列を有するアナログを産生する。それ等のプ
ラスミドにはpSAL−１３０／４（第８図）、pSAL−１７
０／１０（第８図）及びpSAL−２１０／４（第９図）が
包含される。
【０１７１】同じ方法により、プラスミドの第２制限酵
素部位において所望のポリペプチドをコードした遺伝子
に置きかえることにより他のプラスミドを調製し得る。
【０１７２】種々の宿主ベクター系としては、 E. coli
Ａ１６３７，Ａ１６４５，Ａ２６０６，Ａ２０９７ある
いはプラスミドがｃＩ434 フラグメントを含んでいない
場合はＡ１５６３及びプラスミドがｃＩ434 フラグメン
トを含む場合はＡ１６４５株（ｉ４３４ｃＩ- mini Tn
１０）が包含される。本発明の宿主ベクター系として
は、例えばＡ４２００，Ａ４２５５のような原栄養体
E. coli及び例えばＡ４３４６のようなビオチン非依存
宿主ベクター系が包含される。本発明の溶解性宿主ベク
ター系としては宿主がＡ４０４８、特にＡ３１１１であ
るものが包含される。
【０１７３】本明細書に記載する宿主ベクター系及びプ
ラスミドは、例えばウシ，ブタ，ニワトリ及びヒトの成
長ホルモン、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ及びヒ
トアポリポプロテインＥのような異なるポリペプチドを
生産するのに使用できる。そうするためには宿主ベクタ
ー系をポリペプチドを生産し得る適当条件下で成長さ
せ、次いでポリペプチドを回収する。
【０１７４】宿主ベクター系の至適生育条件は約４２℃
に適当な時間を保つことである。望ましくは、ヒトアポ
リポプロテインＥを生産しようとするもの以外の全ての
宿主ベクター系に対しては４２℃で生育させる時間は約
１〜５時間である。ヒトアポリポプロテインＥを生産し
ようとする宿主ベクター系の場合の生育時間は望ましく
は約１５分である。至適培地は加水分解物を含む。
【０１７５】上記の方法により多数のbGH ，pGH ，cGH
，hGH ，Apo Ｅ及びSOD アナログを調製した。
【０１７６】Ｎ末端における変化以外は天然Apo Ｅのも
のと同一のアミノ酸配列を有するApo Ｅアナログを調製
した。例としては下記のものがある。
【０１７７】１) 天然ヒトアポリポプロテインＥのＮ末
端に付け加えられたアミノ酸メチオニン、 ２) ヒトスーパーオキシドジスムターゼのＮ末端の４２
のアミノ酸配列、次いでメチオニンをＮ末端に付加され
た天然ヒトアポリポプロテインＥ、 ３) Ｎ末端の１１個のアミノ酸を取り除き、成熟ヒト成
長ホルモンのＮ末端の４５個のアミノ酸配列とそれに続
くメチオニンに置き換えた天然ヒトアポリポプロテイ
ン、 ４) ヒト成長ホルモンのＮ末端の１４個のアミノ酸、続
いてメチオニンをＮ末端に結合した天然ヒトアポリポプ
テインＥのアミノ酸配列、及び ５) Ｎ末端にmet −leu −leu −met のアミノ酸配列を
結合した天然ヒトアポリポプロテインＥ３。
【０１７８】調製したpGH アナログでは天然ブタ成長ホ
ルモンのＮ末端にアミノ酸メチオニンが結合していた。
【０１７９】天然ニワトリ成長ホルモンのＮ末端にアミ
ノ酸メチオニンが結合したcGH アナログを調製した。
【０１８０】天然ヒト成長ホルモンの最初の１３個のア
ミノ酸が欠失されているhGH アナログ、即ち met14hGH
を調製した。
【０１８１】Ｎ末端における変化以外は天然SOD と同一
のアミノ酸配列を有するSOD アナログを調製した。例と
しては下記のものがある。
【０１８２】１) アセチル化されていない天然ヒトSOD
及び ２) アセチル化及びグリコシル化されていない天然ヒト
SOD 。
【０１８３】これ等のSOD アナログは陽子（プロトン）
の存在下で超酸化物（スーパーオキシド）アニオンの不
均化（dismutation ）あるいは等価（univalent ）還元
を触媒して下記式に従い過酸化水素を生成する。
【０１８４】
【化１１】
【０１８５】bGH ，cGH あるいはpGH アナログの一つ以
上の有効量及び適当なキャリアーを含有する獣医学的組
成物を調製し得る。キャリアーは当業者にとって公知の
ものである。アナログは直接、あるいは組成物の形状
で、ミルクや肉の生産を増加させるためにウシあるいは
ブタに投与したり、肉の生産を増加させるためにニワト
リに投与し得る。
【０１８６】Apo ＥあるいはhGH のアナログの一つ以上
の有効量及び適当なキャリアーを含有する薬剤（医薬）
組成物を調製し得る。キャリアーは当業者にとって公知
のものである。アナログは直接あるいは組成物の形状
で、例えばApo Ｅの場合はApoＥ生産不全あるいは動脈
硬化（atherioscelerosis)の患者の治療のために、hGH
の場合はhGH 生産不全の患者の治療のためにヒトに投与
し得る。
【０１８７】SOD あるいは一種以上のSOD アナログの有
効量及び適当なキャリアーを含有する獣医学的及び薬剤
組成物も調製し得る。キャリアーは当業者にとって公知
のものである。SOD あるいはアナログは直接あるいは組
成物の形状で、例えば炎症羅患々者の治療や、全体的虚
血症（globol ischemia ）あるいは腎移植のような臓器
移植の後の再灌注における酸素−フリーラジカルによる
損傷の軽減のために、動物あるいはヒトに投与できる。
SOD あるいはアナログはまた、直接あるいは組成物の形
状で、例えば切除の後の灌注におけるフリーラジカル酸
素による単離臓器の損傷を軽減し、角膜のような臓器の
生存時間（survival time ）を延長するために、単離臓
器灌注媒体に加えることもできる。さらにはSOD あるい
はアナログは神経学的損傷の軽減にも使用できる。
【０１８８】酵素的活性真核生物スーパーオキシドジス
ムターゼ（SOD ）またはそのアナログを細菌細胞中で産
生する方法を発見した。このバクテリア（細菌）細胞が
スーパーオキシドジスムターゼあるいはアナログをコー
ドしたDNA 配列を含有しておりかつ発現し得る。該方法
はそのバクテリア細胞を適当な条件下、適当な生産培地
中に生育維持することから成る。生産培地中には、濃度
が約２ppm 以上となるようなＣｕ++量を添加する。
【０１８９】バクテリア細胞は、組換えDNA 技術により
真核細胞スーパーオキシドジスムターゼをコードしたDN
A 配列を導入できるものならば何でもよい。該バクテリ
アはこのDNA 配列を発現し、タンパク生成物を生産でき
なければならない。バクテリアの種及び株により、至適
条件及び生産培地は異なる。
【０１９０】バクテリア細胞は例えばプラスミドのよう
なベクターDNA 分子中に、スーパーオキシドジスムター
ゼあるいはアナログをコードするDNA 配列を含有しても
よい。ベクターあるいはプラスミドは、組換えDNA 技術
によりSOD をコードする配列を分子内の適当な位置に取
り組み込むように構築される。
【０１９１】本発明の好ましい具体例においてはバクテ
リア細胞は Escherichia coli細胞である。 E. coliの
好ましい株はＡ１６４５株である。本発明の E. coli細
胞はSOD あるいはそのアナログをコードするプラスミド
を含有する。本発明の好ましい具体例においてはSOD は
ヒトスーパーオキシドジスムターゼあるいはそのアナロ
グである。
【０１９２】本発明の好ましい具体例は、プラスミドpS
ODβ１，pSODα２，pSODβＴ１１，pSODβ１−BA２ある
いはpSODβ１TT１を含有する E. coli株に関する。これ
等のプラスミドの構築方法は前記図面の説明において記
載し、プラスミド自体は後記実施例３に記載した。これ
等のプラスミドは通常の当業者であれば利用可能な出発
物質から構築し得る。真核細胞スーパーオキシドジスム
ターゼをコードするプラスミドを構築するのに有用な種
々のプラスミドを含有する E. coli株は、特許手続上の
微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規
定に従い、アメリカンタイプカルチュアコレクション
（ロックビル、メリーランド２０８５２）に寄託してあ
る。これ等のプラスミドのATCC受託番号は、pBRMがATCC
３７２８３、pSODα２がATCC３９７８６、pBR ３２２が
ATCC３７０１７、pBLA１１がATCC３９７８８、pJH ２０
０がATCC３９７８３、pPSIがATCC３９８０７である。
【０１９３】本発明の１つの特定具体例においては、プ
ラスミドpSODα２を含有する E. coliＡ２０９７株によ
り酵素的活性ヒトスーパーオキシドジスムターゼアナロ
グを産生する。この細胞はアメリカンタイプカルチャー
コレクションに寄託番号３９７８６で寄託されている。
【０１９４】バクテリア細胞の適当な産生培地は、例え
ばカゼイン加水分解物あるいはLB（Luria Broth ）培地
のような許容可能成長培地であればどのようなものでも
よい。適当な生育条件は E. coli株及びそれに含まれる
プラスミドにより変化し、例えばプラスミドpSODβ1 Ｔ
11を含有する E. coliＡ１６４５は４２℃で誘導し、そ
の温度で約１〜５時間維持する。接種物の生育、生産段
階前での培養の所望密度までの生育及び生産期間中の培
養の維持に対する温度、時間、撹拌及び通気の至適条件
は後記実施例２６に記載した。
【０１９５】酵素的活性SOD の生成に必要なＣｕ++イオ
ンの培地中の濃度は、使用培地のタイプにより変化す
る。カゼイン加水分解物培地の場合、２００ppm のＣｕ
++イオン濃度が有効であることが判明した。
【０１９６】LB培地の場合、Ｃｕ++濃度は７５ppm が有
効であることが判明した。全ての複合型の成長培地にお
いては、培地中のＣｕ++濃度が約５０〜２５０ppm であ
ることが好ましい。
【０１９７】ほとんどの真核細胞スーパーオキシドジス
ムターゼはＣｕ／Ｚｎ金属タンパク質である。本発明の
一つの特定具体例においては、培地中のＺｎ++濃度が約
２ppm 以上となるように添加物（supplement）としてＺ
ｎ++を加える。本発明の好ましい具体例においては、Ｃ
ｕ++及びＺｎ++の濃度は0.8 ｇ／ｌのＣｕＳＯ4 ・５Ｈ
2 Ｏ及び１０mg／ｌのＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏを加えるこ
とにより補給する。
【０１９８】適切な保存、培養、接種及び生産培地の特
定成分は変化し得るが、当業者にとっては公知のもので
ある。至適培地の特定例は実施例２６に記載した。
【０１９９】本発明は、本発明の方法に従って生成した
バクテリア細胞中の生成された酵素的活性真核細胞SOD
あるいはそのアナログの回収方法にも係る。
【０２００】培養物を急冷した後、バクテリア細胞を先
ず生産培地から単離する。細胞の単離は、遠心分離や濾
過のように細胞を破壊しない方法であれば何によっても
行なえる。次に細胞をpH約7.0 〜約8.0 の適当な溶液に
懸濁する。pHが約7.8 の５０mMリン酸ナトリウム溶液を
使用することが好ましい。ブレンダーあるいは細胞破砕
機のような適当な手段により細胞壁を破棄し、得られた
均一懸濁液を至適条件下で超音波処理する。超音波処理
は連続流型セルを用いて行なう。得られた超音波処理溶
液を適当な条件下で遠心分離し、細胞破片と上清タンパ
ク質溶液を分離する。
【０２０１】次に上清液を約２時間、約６５℃に加熱
し、冷却して先の遠心分離ステップと同じ条件において
遠心分離して上清液として清澄タンパク質溶液を得る。
次に上清液を適当な容量に濃縮する。例えば分子量10.0
00カットオフの限外濾過装置を用いて１ｌに濃縮する。
【０２０２】次に濃縮タンパク質溶液を、pHを約7.0 〜
約8.0 に平衡させた適当なアニオン交換物質上のイオン
交換クロマトグラフィーにかける。pH約7.8 の１５０mM
リン酸ナトリウムバッファーにより平衡化したDEAE−セ
ファセル（Sephacel）カラム上でクロマトグラフィーを
行なうことが好ましい。得られたスーパーオキシドジス
ムターゼあるいはアナログを含有する通過溶液を収集
し、適当な容量に濃縮してpH約7.0 〜約8.0 のバッファ
ー溶液に対して透析する。この操作は限外濾過装置中で
pH約7.8 の２０mMトリス−ＨＣｌ溶液に対して行うこと
ができる。
【０２０３】この濃縮溶液を次に、pH約7.0 〜約8.0 に
平衡化した適当なアニオン交換物質上のイオン交換クロ
マトグラフィーにかける。pH約7.8 の２０mMトリス−Ｈ
Ｃｌにより平衡化したQAE −セファロースカラムが適当
である。アニオン交換物質に結合したタンパク質を、例
えばpH7.8 の２０mMトリス−ＨＣｌ中の０〜２００mMＮ
ａＣｌのような適当な塩勾配にかける。得られたSOD あ
るいはアナログを含有するフラクション（画分）を回収
し、例えば限外濾過装置により濃縮し、蒸留水に対して
透析し、適当なバッファーによりpHを約4.0 〜約5.0 に
調整する。好ましい具体例においては、対象溶液はpH約
4.8 の１Ｍ酢酸ナトリウムを加えて１００mM酢酸ナトリ
ウム溶液とした。
【０２０４】この緩衝した溶液を今度はカチオン交換物
質のイオン交換クロマトグラフィーにかける。ｐＨ約4.
7 の１００mM酢酸ナトリウムバッファーにより平衡化し
たCM−セファロースカラムが適当である。カチオン交換
物質に結合したタンパク質を、例えばｐＨ4.7 の１００
mM酢酸ナトリウム中の１００〜５００mM ＮａＣｌのよ
うな適当な塩勾配にかけ、得られる精製SOD あるいはア
ナログを含有するフラクションを回収する。
【０２０５】精製SOD を含有するフラクションは例えば
限外濾過によって濃縮しかつ貯蔵のために凍結乾燥を行
なってもよい。
【０２０６】本発明はまた、本発明の方法により生産及
び精製された精製酵素的活性真核細胞スーパーオキシド
ジスムターゼあるいはそのアナログにも係る。本発明の
好ましい具体例は、本発明の方法により調製及び精製さ
れた精製酵素的活性ヒトスーパーオキシドジスムターゼ
に係る。
【０２０７】
【実施例】以下の実施例は本発明の理解を助けるために
提示されたものであり、本発明の範囲を限定する意図は
なく、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきもので
はない。実施例においては、ベクターの構築、該当ポリ
ペプチドをコードする遺伝子のベクター内挿入、得られ
たプラスミドの細菌宿主内導入等のために使用された従
来方法について詳細に説明していないが、これらの方法
は当業者に公知であり、以下の如き多数の刊行物に記載
されている。
【０２０８】Ｔ．マニアティス（T.Maniatis）、Ｅ．
Ｆ．フリッチ（E.F.Fritsch)及びＪ．サンブルーク（J.
Sambrook）、モレキュラークローニング；アラボラトリ
ーマニュアル（Molecular Cloning ；A Laboratory Man
ual)、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold
Spring Harbor Laboratory ）、ニューヨーク（１９８
２）。
【０２０９】メソッドインエンザイモロジー(Methods i
n Enzymology）、６５巻、“ニュークレイックアシード
（パート１）(Nucleic Acids) ”、ローレンスグロスマ
ン(Lawrence Grossman) 及びキビーモルダブ(Kivie Mol
dave) 編、アカデミックプレス（Academic Press）、ニ
ューヨーク（１９８０）。
【０２１０】メソッドインエンザイモロジー、６８巻、
“リコンビナントDNA （Recombinant DNA)”、レイウー
（Ray Wu）編、アカデミックプレス、ニューヨーク（１
９８１）。
【０２１１】メソッドインエンザイモロジー、１００
巻、“リコンビナントDNA （パートＢ）”、レイウー、
ローレンスグロスマン及びキビーモルダブ編、アカデミ
ックプレス、ニューヨーク（１９８３）。
【０２１２】メソッドインエンザイモロジー、１０１
巻、“リコンビナントDNA （パートＣ）”、レイウー、
ローレンスグロスマン及びキビーモルダブ編、アカデミ
ックプレス、ニューヨーク（１９８３）。
【０２１３】プリンシプルズオブジーンマニピュレーシ
ョン、マンイントロダクションツージェネティックエン
ジニアリング（Principles of Gene Manipulation 、An
Introduction to Genetic Engineering）、第２版、
Ｒ．Ｗ．オールド(R.W.Old) 及びＳ．Ｂ．プリムローズ
（S.B.Primrose）編、ユニバーシティーオブカルフォル
ニアプレス（University of California Press）（１９
８１）。
【０２１４】Ｈ．Ｖ．バーナード(H.V.Bernard) 他、ジ
ーン（Gene）（１９７９）５，５９。
【０２１５】Ａ．Ｂ．オッペンハイム(A.B.Oppenheim）
他、Ｊ．モル．バイオル（J.Mol.Biol）（１９８２）１
５８，３２７。
【０２１６】Ｅ．ルモー（E.Remaut）他、ジーン（１９
８１）１５，８１。
【０２１７】実施例１ 発現ベクター 本明細書中で使用される「発現ベクター」という用語
は、細菌、特に大腸菌（E.coli）中で所望の遺伝子を発
現させるのに有用な１群のプラスミドを意味する。所望
遺伝子を発現ベクター内に挿入してもよく、又は発現ベ
クターのプロモーターを切除して所望遺伝子の手前に入
れてもよい。
【０２１８】pJH ２００ 第２図に示したpJH ２００は、マルチコピー プラスミ
ドpBR ３２２に挿入されたDNA から成る。λDNA の顕著
な特徴は、λDNA がλＰL プロモーター，左側のＮ利用
部位 ( nutL ），Eco ＲＩ制限部位，ｔRI終結部位，そ
れに続くＣIIリボソーム結合部位およびNde Ｉ制限部位
の一部であるATG 開始コドンを含むことである。第２図
に示すように、Nde Ｉ制限部位の下流の１１６塩基対は
４個の単一（非反復、unique）制限部位である。これら
の制限部位により所望遺伝子が容易に挿入されうる。Ｃ
IIリボソーム結合部位は天然のリボソーム結合部位とた
だ１個の点変異で異なる。
【０２１９】pJH ２００はpOG １１［エー．オッペンハ
イム（A.Oppen heim）ら、ジェー．モル．バイオル．
（J.Mol.Biol）、（１９８２）１５８；３２７］から構
築され、pOG １１中に認められたＣIIリボソーム結合部
位とλＰL プロモーターとを含む。しかしながら、λＰ
L プロモーターとＣIIリボソーム結合部位の間に位置す
るλDNA の３４６bpは欠失しており、Eco ＲＩ制限部位
がこれら２つの要素間の接合点に導入されている。ま
た、マルチ制限部位リンカーをリボソーム結合部位の
“下流に（downstream）”挿入した。pJH ２００はアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクションにATCC No.
３９７８３で寄託されている。
【０２２０】pRO ２１１ 第２図に示し、前記図面の説明中で詳細に記載したよう
にpRO ２１１は、ｐＪＨ２００から２個のＮｄｅ Ｉ制
限部位の１個を脱離させて誘導された。
【０２２１】pJH ２００，pRO ２１１および真核遺伝子
を含有するそれらの誘導体を適当な大腸菌（E.coli）宿
主中に維持させてもよい。適当な宿主の最も重要な特徴
は、この宿主が熱感受性リプレッサーｃI ８５７および
抗転写終結Ｎタンパクを与えることである。［エム．イ
ー．ゴッテスマン(M.E.Gottesman) ら、ジェー．モル．
バイオロ．(J.Mol.Biol.) 、（１９８０）１４０；５７
−７５］。
【０２２２】pRO ２１１は従来の発現ベクターに比して
下記する多くの利点を有する。
【０２２３】１．発現レベルが極めて高いこと このベクターは、総細胞タンパクの３５％という高レベ
ルで大腸菌（E.coli）中に外来タンパクを発現させるこ
とができる。
【０２２４】２．リボソーム結合部位を置換しうること pRO ２１１は、リボソーム結合部位の“上流に”位置す
る非反復Eco ＲＩ部位とリボソーム結合部位の“下流”
に位置する１個のNde Ｉ部位とを含む。従って、リボソ
ーム結合部位の境界は２個の非反復制限部位である。こ
うして、プラスミドの他の特徴を変えることなく、現在
のリボソーム結合部位（λＣIIリボソーム結合部位）を
簡単に切除して他の天然あるいは合成リボソーム結合部
位のほとんどいずれとも置換することができる。これは
所望のポリペプチドの至適発現を大きく助長する。
【０２２５】３．発現を熱感応的に調節し得ること λＰL プロモーターは、ＣＩリプレッサーが結合してい
るときは不活性である。ｃＩ８５７リプレッサーは熱感
受性である。即ち、このリプレッサーは３０℃ではプロ
モーターに結合するが、４２℃で失活する。従って、発
酵温度を４２℃に上げることにより宿主細菌で所望タン
パクの産生が誘発（誘導）される。
【０２２６】そのような系は以下の利点を有する。
【０２２７】(a) 大腸菌（Escherichia coli）に毒性の
外来タンパクを発酵過程の遅くに産生させることができ
るので、早期の細胞死が避けられる。
【０２２８】(b) タンパクの産生亢進（Overproductio
n）は、プロテインを安定にしかつタンパク分解を回避
しうる。［チエン，ワイ．イー（Cheng,Y.E.）ら、ジー
ン（Gene）（１９８１）１４，１２１］。従って、λＰ
L の如き厳密に調節されたプロモーターを使用する“瞬
間的”産生亢進は、連続的な低レベル産生より好ましい
であろう。
【０２２９】４．単純化された誘発プロトコール 本願並びに係属中の米国特許出願第５１４，１８８号に
記載されているプラスミドによるタンパク産生は、熱感
受性ｃI ８５７リプレッサーにより調節される。
【０２３０】上記係属中の出願に記載されているプラス
ミドで必要とされる誘発プロトコールは、４２℃におけ
る誘発とそれに続く３８℃における増殖を含んでいた。
対照的に、ベクターpJH ２００，pRO ２１１あるいはそ
れらのプラスミド誘導体を使用するときには、タンパク
合成の至適誘発は４２℃における誘発と同温度（４２
℃）における増殖とを含んでいた。これにより、発酵器
を冷却する必要がなくなる。
【０２３１】５．コピー数 pJH ２００およびpRO ２１１中のλＰL プロモーター
は、大腸菌（E.coli）中に存在するλ形質導入ファージ
ベクターよりも高いコピー数をプラスミド上で示した。
これにより発現レベルが高くなる。
【０２３２】６．リボソーム結合部位と開始コドン この発現ベクターは、強力な原核生物リボソーム結合部
位(RBS) と翻訳開始コドン(ATG）とを含む。従って、い
ずれの真核遺伝子も開始コドンを付加せずにクローン化
されうる。また、有効なRBS は発現レベルを増加させ
る。リボソーム結合部位はλＣIIリボソーム結合部位で
ある。リボソーム結合部位の配列は次の通りである。
【０２３３】
【化１２】
【０２３４】１個の塩基対が野生型λにみられるリボソ
ーム結合部位と異なる。
【０２３５】７．適当な制限部位 発現ベクターは唯一のNde Ｉ制限部位を有し、前記部位
内にATG 開始コドンを含む。これにより、所望の遺伝子
を適正に位置付けることができる。唯一のNdeI 部位が
リボソーム結合部位の直後にみとめられる。
【０２３６】８．遺伝子挿入のための適当な制限部位 Nde I 制限部位の下流に配置された１１６塩基対は、次
の順番で４個の他の非反復制限部位である。Bgl II，Sm
a Ｉ，Hind IIIおよびCla Ｉ。非反復制限部位が複数個
あるため、所望の遺伝子が容易に挿入されうる。
【０２３７】９．Nut 部位 宿主から与えられるＮタンパクは発現ベクター上のNut
部位に結合し、それによってｔRI部位での転写終結ある
いはクローン化された遺伝子内での早期転写終結が阻止
される。
【０２３８】菌株 所望のベクターおよびプラスミドに対する適切な宿主
は、形質転換に適した大腸菌（E.coli）の菌株であり、
前記菌株はＡ１６３７，Ａ２６０２，Ａ１５６３，Ａ１
６４５（c ６００ｒ- ｍ+ gal+ thr- leu- lac- bl
（λｃＩ８５７ΔＨＩΔBam ＨＩ Ｎ+ ））およびＡ２
０９７（Ａ１６４５ lac Δx Ａ２１ proＣ:: Tn １
０）を含む。
【０２３９】実施例２ 動物成長ホルモン Ｉ pRO １２ pRO １２の構築は、第２図に示されかつ図面の説明に記
載されている。第１図に示した構築手順を有するpAL ５
００からのbGH cDNAをpRO ２１１に挿入する前に処理し
て、適切な解読枠とNde Ｉ制限部位を作成した。
【０２４０】pRO １２を、当業者に公知の方法を用いる
形質転換によって大腸菌（Escherichia coli）Ａ１６４
５株に導入した。この菌株は増殖および誘発されるとウ
シ成長ホルモン(bGH) のアナログを産生する。前記bGH
アナログは、フェニルアラニン型天然bGH のＮ−末端に
付加されたアミノ酸配列のmet −asp −gln を有する。
pRO １２により産生されるbGH アナログの量は、クーマ
シーブルー染色SDS ポリアクリルアミドゲルを走査して
計算すると、細菌により産生される総タンパクの約３０
〜３６％であった（表Ｉ）。
【０２４１】II pSAL５２００−６ pSAL５２００−６の構築は第３図に示されかつ図面の説
明に記載されている。met −phe bGH をコードするDNA
配列を、pRO １２をPvu IIおよびNde Ｉで制限し、１０
塩基対が重複したセグメントを有する２個の一重鎖合成
オリゴヌクレオチドから形成された合成DNA フラグメン
ト（断片）を挿入して得た。
【０２４２】pSAL５２００−６を、公知の方法を使用す
る形質転換によって大腸菌（Escherichia coli）Ａ１６
４５株に導入した。この菌株は、増殖および誘発で、ph
e bGH のアミノ末端に付加されたメチオニンを有するbG
H アナログを産生する。pSAL５２００−６により産生さ
れるmet-phe bGH アナログの量は、クーマシー染色SDS
ポリアクリルアミドゲルを走査して計算すると、細菌に
より産生される総タンパクの約１８−２０％であった。
菌株を増殖させ、産生されたbGH を回収しそしてbGH を
精製するために使用した方法は、pRO １２からのbGH 産
生のための実施例５に後記する方法と同じである。
【０２４３】III ｐ３００８ ｐ３００８の構築は、第４図に示されかつ図面の説明に
記載されている。ｐ３００８は、アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクションにATCC No.３９８０４で寄託
されている。met-phe pGH （豚成長ホルモン）をコード
するDNA 配列を、pGH cDNAをpRO ２１１に挿入して得
た。
【０２４４】ｐ３００８を、当業者に公知の方法を用い
る形質転換により大腸菌（Escherichia coli）菌株Ａ１
６４５株に導入した。この菌株は増殖および誘発によ
り、phe pGH のアミノ末端に付加されたメチオニンを有
するpGH を産生する。ｐ３００８により産生されるmet-
phe pGH アナログの量は、クーマシー染色SDS ポリアク
リルアミドゲルを走査して計算すると、細菌により産生
される総タンパクの約１８−２０％であった。菌株を増
殖させ、産生されたpGH を回収しかつpGH を精製するた
めに使用した方法は、pRO １２からのbGH 産生のための
実施例５に後記する方法と同じであった。
【０２４５】IV ｐ５００２ ｐ５００２の構築は第５図に示されかつ図面の説明に記
載されている。met-phe cGH （ニワトリ成長ホルモン）
をコードするDNA 配列を、cGH cDNAをpRO ２１１に挿入
し、次いで遺伝子の５′末端を合成オリゴヌクレオチド
リンカーで完成させることにより得た。
【０２４６】ｐ５００２を、公知の方法を用いる形質転
換により大腸菌（Escherichia coli）Ａ１６４５株に挿
入した。この菌株は増殖および誘発により、phe cGH の
アミノ末端に付加されたメチオニンを有するcGH を産生
する。ｐ５００２により産生されたmet-phe cGH の量
は、クーマシー染色SDS ポリアクリルアミドゲルを走査
して計算すると、細菌により産生された総タンパクの約
１８−２０％であった。菌株を増殖させ、産生されたcG
H を回収し、cGH を精製するために使用された方法は、
pRO １２からのbGH 産生のための実施例５に後記する方
法と同じである。
【０２４７】
【表１】
【０２４８】１．表は、pRO ２１１由来の各種プラスミ
ドのbGH 発現レベルを示す。プラスミドpRec２／３およ
びpRO １１は、１９８３年７月１５日出願の係属中の米
国特許出願第５１４，１８８号に記載されている。
【０２４９】２．産生されたbGH の量は総バクテリアプ
ロテインに対するパーセンテージで表示した。
【０２５０】略 号 CHCN ＝構成高コピー数(constitutive high copy numbe
r) AmpR ＝アンピシリン耐性 TetR ＝テトラサイクリン耐性 Ｔ1 Ｔ2 ＝転写終結配列 ｃＩ434 ＝プラスミド安定化ｃＩ434 系。
【０２５１】実施例３ ヒトＣｕ−Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ(SOD) Ｃｕ−Ｚｎ SOD cDNA 修飾の出発点は、リーマン−ハー
ビッツ，ジェー．(Lieman-Hurwitz,J.) ら、PNAS（１９
８２），７９：２８０８に記載されているプラスミドpS
６１−１０である。SOD cDNAは、１９８３年４月２９日
に出願された係属中の米国特許出願第４８９，７８６号
明細書にも記載されている。SOD cDNAを修飾すると、遺
伝子の５′末端にNde Ｉ制限部位が、遺伝子の３′末端
にHind III制限部位が導入された。得られたプラスミド
pSOD ＮＨ−１０は両端が非反復制限部位になっている
SOD cDNAを含んでいる。
【０２５２】Ｉ．pSODα２ pSODα２の構築は第１３図に示されかつ前記図面の説明
中に記載されている。pSODα２はアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクションにATCC No.３９７８６で寄託
されている。pSODα２を構築するために、λＰL プロモ
ーターと NutLとＣIIリボソーム結合部位とを発現ベク
ターpJH ２００から切り取り、プラスミド pSOD ＮＨ−
１０のSOD 遺伝子の手前に配置した。次いでプロモータ
ーとRBSとSOD 遺伝子とを含有するフラグメントをベク
ター pBRM に挿入した［ハートマン，ジェー・アール．
（Hartman,J.R.）ら，PN AS ７９：２３３−２３７（１
９８２）］。pBRMはアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションに ATCC No.３７２８３で寄託されてい
る。
【０２５３】pSODα２を、公知の方法を用いる形質転換
で大腸菌（Escherichia coli）Ａ２０９７株に導入し
た。得られたクローンを増殖および誘発させるとSOD ア
ナログタンパクが産生した。pSODα２により産生された
SOD アナログの量は、クーマシー染色SDS ポリアクリル
アミドゲルの走査によって計算すると、細菌により産生
された総タンパクの約0.1 −0.3 ％であった（表２）。
産生されたSOD アナログは、下記のpSODβ１により産生
されたアナログと多分同一であろう。
【０２５４】II. pSODβ１ pSODβ１の構築は、第１４図に示しかつ前記図面の説明
中に記載されている。pSODβ１を構築するために、pSOD
α２のＣII RBSを、pBLA１１由来のRBS およびβ−ラク
タマーゼプロモーター（β-lac-prom)で置換した。pBLA
１１はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
にATCC No.３９７８８で寄託されている。
【０２５５】pBLA１１はpBR ３２２中の座標(coordinat
es) ４１５７と４３５３との間にあるβ−ラクタマーゼ
遺伝子のプロモーターと、リボソーム結合部位とを含
む。Eco ＲＩリンカーをプロモーターの上流に付加し、
マルチ制限部位リンカーを開始コドンATG の直後に付加
した。従って、開始コドンで始まるコード鎖の配列はAT
GAGCTCTAGAATTCである。
【０２５６】pSODβ１を、公知の方法を用いる形質転換
によって大腸菌（Escherichia coli）菌株Ａ１６４５に
導入した。得られたクローンを増殖および誘発させると
SODアナログを産生する。産生されるヒトＣｕ−Ｚｎ SO
Dアナログは、天然ヒトSODがアミノ末端アラニンでアセ
チル化されているのに対して［ハーツ，ジェー．ダブリ
ュー．（Hartz,J.W.）及びドイッチン，エッチ．エフ．
（Deutsch,H.F.）、ジェー．バイオロ．ケム．（J.Bio
l.Chem)（１９７２）２３４：７０４３−７０５０；ヤ
ーブッシュ，ジェー．アール．（Jabusch,J.R.）らバイ
ロケミストリー（Biochemistry）（１９８０）１９：２
３１０−２３１６；バラ(Barra）ら、FEBS］レターズ(L
etters) （１９８０）１２０：５３及びオバーレイ，エ
ル．ダブリュ．（Oberley,L.W.）スーパーオキシドジス
ムターゼ（Superoxide Dismutase），vol.Ｉ, （１９８
２），CRC プレス，フロリダ，pp. ３２−３３］、アミ
ノ酸配列解析化学量論で示されるようにアミノ末端アラ
ニンがアセチル化されていない点で天然ヒトＣｕ−Ｚｎ
SODと異なる。更に、天然ヒトSOD はグリコシル化され
ている［ヒューバー，ダブリュー．（Huber,W.）、１９
７１年５月１８日付発行USP No. ３，５７９，４９５〕
のに対して、細菌産生ヒトSOD はほとんど全くグリコシ
ル化されていない。なぜなら、大腸菌（Escherichia co
li）は自身が産生するタンパクをグリコシル化しないか
らである。細菌産生SOD アナログのアミノ酸配列は成熟
ヒトSOD の配列と同一であり、そのＮ−末端にメチオニ
ン残基を含まない。
【０２５７】pSODβ１により産生されるSOD の量は、ク
ーマシー染色SDS ポリアクリルアミドゲルの走査により
計算すると、細菌により産生された総タンパクの約３−
８％であった（表II）。菌株の増殖、産生されたSOD の
回収およびSOD の精製のために用いた方法は、pSODβ1
Ｔ11のための後記実施例７の方法と同じである。
【０２５８】III.pSODβ1 Ｔ11 pSODβ1 Ｔ11構築は第１５図に示されかつ前記図面の説
明中に記載されている。pSODβ1 のβ−ラクタマーゼ遺
伝子を、pBR ３２２由来のテトラサイクリン耐性をコー
ドする遺伝子で置換した。
【０２５９】pSODβ1 Ｔ11より産生されるSOD アナログ
の量は、クーマシー染色SDS ポリアクリルアミドゲルの
走査により計算すると、細菌により産生された総タンパ
クの約８−１３％であった（表II）。産生されたSOD ア
ナログは、pSODβ１により産生されるアナログと同一で
ある。
【０２６０】IV. pSODβ1 −BA2 pSODβ1 −BA2 の構築は第１７図に示されかつ前記図面
の説明中に記載されている。pSODα13のＣIIリボソーム
結合部位を、配列
【０２６１】
【化１３】
【０２６２】を有する合成DNA フラグメントで置換し
た。前記配列は天然β−ラクタマーゼRBS の配列と類似
している。
【０２６３】pSODβ1 −BA2 を当業者に公知の方法を用
いる形質転換によって、大腸菌（Escherichia coli）菌
株Ａ１６４５に導入した。得られたクローンを増殖およ
び誘発させると、ヒトSOD アナログを産生する。pSODβ
1 −BA2 により産生されるSOD の量は、クーマシー染色
SDS ポリアクリルアミドゲルの走査により計算すると、
細菌により産生された総タンパクの約２−４％であった
（表II）。産生されたSOD アナログは、pSODβ1 により
産生されたアナログと同一である。
【０２６４】
【表２】
【０２６５】１．β−ラクタマーゼ遺伝子のプロモータ
ー及びリボソーム結合部位 ２．β−ラクタマーゼ遺伝子のリボソーム結合部位に相
当する合成リボソーム結合部位 ３．総細菌性タンパクのパーセンテージとして表示した
産生SOD アナログの量略 号 AmpR ＝アンピシリン耐性 TetR ＝テトラサイクリン耐性 Ｔ1 Ｔ2 ＝転写終結配列。
【０２６６】実施例４ ヒトアポリポプロテインＥ（Apo Ｅ３） Apo Ｅ３ cDNA 修飾の出発点は、カリホルニア，サンフ
ランシスコのグラッドストン財団（Gladstone Foundati
on）のジョーンテイラー(John Taylor) 博士により提供
されたプラスミドpNB １７８であった。このプラスミド
は、ヒトApo Ｅ３遺伝子の完全長cDNAコピーを含む。pN
B １７８中のcDNAを修飾して、遺伝子の５′末端の非コ
ード化DNA を除去しかつ遺伝子の両末端にNde Ｉ制限部
位を付加した。このApo Ｅ３ cDNA フラグメントを（１
９８３年７月１５日に出願された係属中の米国特許出願
第５１４，１８８号に記載されている）ベクターpND ５
中に挿入した。得られたプラスミドpApoＥ−Ex２を第１
８図に示す。これはアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションにATCC No.３９７８７で寄託されている。
【０２６７】Ｉ．pTV −１８８ pTV −１８８の構築は第１８図に示されかつ前記図面の
説明に記載されている。プラスミドpTV −１８８は、pA
poＥ−Ex２のNde Ｉ−Nde Ｉフラグメントを充填（fill
ed−in）して得たApo Ｅ３フラグメントを（第１４図に
示しかつ図面の説明中に記載されている）pSODβ1 Ｔ11
の唯一のブラント末端Stu Ｉ部位に挿入して得た。
【０２６８】pTV −１８８を当業者に公知の方法を用い
る形質転換により、大腸菌（Escherichia coli）菌株Ａ
１６４５に導入した。得られたクローンを増殖及び誘発
させると、ヒトApo Ｅ３のアナログを産生する。前記ア
ナログは、真正ヒトApo Ｅ３のＮ−末端に結合したヒト
スーパーオキシドジスムターゼのＮ−末端配列の４２個
のアミノ酸を有し、かつそのＮ−末端にはメチオニンを
有する。産生されたApo Ｅ３アナログは、クーマシー染
色SDS ポリアクリルアミドゲルの走査によって計算する
と、細菌により産生される総タンパクの約１０％であっ
た。菌株の増殖のために使用した方法は、12.5mg／ｌの
テトラサイクリンをアンピシリンの代わりに使用する以
外はpRO １２からのbGH 産生のための実施例５に記載の
方法と同じである。
【０２６９】II．pSAL１６０−５ pSAL１６０−５の構築は第２３図に示されかつ前記図面
の説明中に記載されている。プラスミドpSAL１６０−５
を、pTV −１７０（第２０図参照）のAva I −Ava I Ap
o Ｅ３遺伝子フラグメントに挿入して得た。
【０２７０】pSAL１６０−５を、当業者に公知の方法を
用いる形質転換によって大腸菌（Escherichia coli）菌
株Ａ１６４５に導入した。得られたクローンを増殖およ
び誘発させると、アミノ末端にメチオニンと１１個のＮ
−末端アミノ酸が欠失しているApo Ｅ３に融合したヒト
成長ホルモンのＮ−末端由来の４５個のアミノ酸とを含
むApo Ｅ３のアナログが産生される。pSAL１６０−５に
より産生されるApo Ｅ３アナログの量は、クーマシー染
色SDS ポリアクリルアミドゲルの走査により計算する
と、細菌により産生される総タンパクの約５％であっ
た。菌株の増殖するために使用した方法は、pRO １２か
らのbGH 産生のための実施例５に記載されている方法と
同じである。
【０２７１】実施例５ pRO １２の増殖 Ｉ．保存培養物 pRO １２の保存培養物（stock culture ）をカゼイン培
地で増殖し（接種物参照）、次に凍結培地で２倍に希釈
し、−８０℃で保存する。凍結培地は５００ｍｌあたり
以下の物質を含む。
【０２７２】 Ｋ２ ＨＰＯ4 6.3 ｇ ＫＨ2 ＰＯ4 1.8 ｇ クエン酸Ｎａ 0.45ｇ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ 0.09ｇ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 0.9 ｇ グリセロール 44.0ｇ II．接種物 接種物を２０ｇ／ｌカゼイン水解物，１０ｇ／ｌ酵母抽
出物および２ｇ／ｌＮａＣｌ中で増殖させた。振盪フラ
スコ中の無菌培地に保存培養物を接種し、３０℃，約２
００r.p.m.のシェーカー上で１５時間インキュベートし
た。必要に応じ、以後の接種物増殖段階は撹拌通気した
発酵槽で行なった。無菌培地に２−１０％接種物を接種
し、３０℃，pH７±0.5 で撹拌通気して溶存酸素レベル
を空気飽和の２０％より高く維持しながら１５時間イン
キュベートした。
【０２７３】III ．産生 産生培地は以下の物質を含む。
【０２７４】 カゼイン水解物 ２０ｇ／ｌ 酵母抽出物 １０ｇ／ｌ Ｋ2 ＨＰＯ4 2.5 ｇ／ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ １ｇ／ｌ ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ ビオチン 0.1 mg／ｌ チアミン １mg／ｌ 微量元素溶液 ３ml／ｌ 培地は１００mg／ｌのアンピシリンも含む。アンピシリ
ンは産生のためには任意成分であるが、通常接種物の増
殖用培地には添加されている。
【０２７５】濃縮溶液中のビオチン，チアミン及びアン
ピシリンを別々にフィルター滅菌し、接種以前に無菌産
生培地に加えた。無菌ブドウ糖溶液を最初に１０ｇ／ｌ
になるように添加した。誘発の過程ではブドウ糖を更に
１０ｇ／ｌ添加した。
【０２７６】微量元素溶液は以下の物質を含む。
【０２７７】 ＦｅＣｌ3 １６ｇ／ｌ ＺｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ １ｇ／ｌ ＣｕＣｌ2 １ｇ／ｌ Ｈ3 ＢＯ3 0.5 ｇ／ｌ 濃ＨＣｌ １００ml／ｌ 培地に0.5 −１０％の接種培養物を接種し、３０℃でイ
ンキュベートする。撹拌−通気速度は、空気飽和の２０
％より高い溶存酸素レベルが維持されるように設定され
る。ＮＨ3 でpHを７±0.2 に維持する。細胞濃度が約3.
5 ｇ／ｌ（OD660 ＝１０）に到達したら誘発を始める。
【０２７８】温度を４２℃に上げ、４２℃で１−５時間
維持する。次いで培養物を急冷し、ホルモン精製のため
に遠心分離によって細胞を回収する。
【０２７９】bGH の回収 ポリトロン（Kinematica）配合装置を用い、５０mMリン
酸ナトリウム緩衝液（pH7.4 ）と５０mM EDTA と１００
mM ＮａＣｌとを含む５倍容の溶液に１３kgの細菌細胞
（湿潤ケーキ）を再懸濁させる。配合装置の速度は泡立
ちを最小に抑えるように調整する。均質懸濁液をダイノ
ミル細胞破砕装置KD５（Willy A. Bachofen,バーゼル）
に８０ｌ／時の速度で連続的に通し、破砕細胞の均質懸
濁液をCEPA１０１遠心機で４５ｌ／時の流速で遠心して
清澄化する。遠心ステップで得られた沈殿物を回収し、
５０mM EDTA 含有５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
4）15.5ｌに再懸濁させる。終濃度0.05mg／mlまでリゾ
チームを加え、懸濁液を３７℃で１６時間インキュベー
トした。トリトン（Triton）Ｘ−１００を終濃度１％ま
で加える。次に、懸濁液を室温で３０分間インキュベー
トし、連続流式細胞超音波処理装置（加熱システム）内
で１８ｌ／時の速度で超音波処理し、CEPA１０１遠心機
で遠心する。沈殿物を収集し、５０mMリン酸ナトリウム
緩衝液（pH7.4 ）に再懸濁し、前記同様に超音波処理
し、CEPA１０１遠心機で遠心した。細胞を５０mM EDTA
および１００ mM ＮａＣｌを含む５０mMリン酸ナトリウ
ム緩衝液(pH7.4) 15.5ｌに再懸濁し、２回沈殿させ、蒸
留水15.5ｌに再懸濁させる。沈殿物を遠心によって収集
し、−２０℃で保存する。
【０２８０】bGH の精製 沈殿物を３０−４０ｌの蒸留水に再懸濁させ、0.5 Ｎの
ＮａＯＨでpH11.8に滴定して可溶化する。次に溶液を連
続的に超音波処理し、所要によりCEPA１０１遠心機で遠
心して清澄化するか、またはワットマンNo. １濾紙を通
して濾過する。清澄化プロテイン溶液（32.6ｌ、２９
７，０００のOD280nm を含む）を各部分が５０，０００
−６０，０００ODを含むように分ける（６×5.4 ｌ）。
各部分を夫々、５ft2 面積の１００，０００分子量カッ
トオフカセット（タイプPTHK）を３個備えたミリポア
（Millipore ）ペリコン（Pellicon）限外濾過装置を通
して限外濾過する。5.4 ｌ部分を１ｌ保留分（retentat
e ）容量に濃縮する。限外濾液を収集し保存する。保留
分を再び新鮮な１０mMホウ酸塩緩衝液，pH11.8でもとの
容量にまで希釈し、十分に混合する。バッチを再び１ｌ
保留分容量に濃縮する。限外濾液を集め、はじめの限外
濾液と合わせる。限外濾液中のOD分の流出総量が限外濾
過装置に最初に充填されたOD分の２０％に等しくなると
き、次の濃縮ステップでの保留分を１ｌではなく0.5 ｌ
にする。濃縮および１０mMホウ酸塩緩衝液による希釈の
サイクルを、0.5 ｌの保留分からの限外濾液の２８０nm
（１cmセル）での吸光度が0.1 未満になるまで継続す
る。これは通常９−１２回の濃縮・希釈サイクルを要す
る。最終保留分は捨てる。
【０２８１】全ての限外濾液を合せ、６Ｎ ＨＣｌでpH
9.0 に調節した。他の5.4 ｌ部分を同様に限外濾過し、
pH調節した限外濾液を全て一緒にする。典型的な流出物
は0.26の吸光度を有する限外濾液を総量３８０ｌ（１０
０，０００ODに等しい）生じ、完結するには２４−４０
時間を要する。
【０２８２】１００Ｋ限外濾過工程からの合した限外濾
液（２８０nmで１００，０００ODを含む３８０ｌ）を、
２３cm／時（２５ｌ／時）の線流速でセファロースCL−
６ＢDEAEイオン交換カラムに充填する。直径３７cm、高
さ１５cmのカラムをpH9.0 で１０mMホウ酸塩緩衝液の２
ベット容量（３２Ｌ）で洗浄する。充填および洗浄ステ
ップからの溶出物は捨てる。１０mMホウ酸塩、１００mM
塩化ナトリウム，pH９に溶離液を変えると、カラムから
bGH が排出される。溶離流速は２３cm／時である。流出
の進行を２８０nmでの溶出物の吸光度を追跡してモニタ
ーする。bGH ピークを４乃至５ベット容量（２８０nmで
４３，０００ODを含む８４ｌ）で収集し、１０，０００
分子量カットオフカセットを備えたミリポアペリコン限
外濾過装置を用いて約１０mg／mlに濃縮する。次いで、
溶液を凍結乾燥する。収量は純bGH 約７０ｇである。
【０２８３】実施例６ pRO １２により産生されるbGH アナログの活性 １．bGH アナログと天然bGH とのラジオイムノアツセイ
比較 リン酸塩緩衝生理食塩水（１％BSA ）中に１００ng／ml
のbGH アナログを含む溶液を調製した。この溶液を濃度
５０，２５，12.5，6.25，3.12，1.56及び0.78ng／l ま
で順序希釈した。これらの溶液について各0.1ml のサン
プル群２組を、二抗体法を用いるRIA にかけた。希釈曲
線は天然bGH で得られる曲線と同等であった。
【０２８４】２．ラジオレセプター結合アッセイ ウサギ肝膜に対するラジオレセプター結合アッセイを、
ツシマティー（Tushima T.）及びフライセンエッチ．ジ
ー．（Freisen H.G.）［ワイ．チン（Y.Chin.)，エンド
クル．メタボ．(Endocr.Metab9）（１９７３），３７，
３］に記載の方法で、 125Ｉ−bGH をトレーサーとし、
真正bGH 溶液を校正曲線用に用いて実施した。３組のサ
ンプルを0.3ml のアッセイバッファ（５０mM Tris,１５
mM ＣａＣｌ2 及び５mg／mlウシ血清アルブミン，pH7.
6 ）中、室温で２時間インキユベートした。試験管は、
125Ｉ−bGH （３０−６０μＣｉ／μg の調製物２０，
０００cpm)と、１５０−２５０μg の肝膜タンパクと、
天然bGH （１−１００ng）又は細菌bGH の抽出物のいず
れかとを収容していた。結果は、bGH アナログのbGH 活
性が天然bGH の同じ活性に匹敵することを示した。
【０２８５】３．脛骨テスト 実施例５の細菌細胞から回収されたpRO １２産生bGH ア
ナログの生物活性を脛骨テストで測定した。［パルロ
ー，エー．エフ．（Parlow A.F. ）ら、エンドクリノロ
ジー(Endocrinology) （１９６５）７７，１１２６］。
生後２８〜３０日のラットを下垂体切除し、次に処理し
ないで１０−１４日間維持した。ウシ下垂体又は組換体
大腸菌（Escherichia coli）から誘導したウシ成長ホル
モンを0.15Ｍ ＮａＣｌ＋0.01Ｍホウ酸塩，pH10.0に溶
解した。ラット（１群４−７匹ずつ）を正常食［プリナ
ラット餌(Purina Rat-Chow) 及び任意量の水］で維持
し、bGH 溶液の皮下注射（0.2cc 中、５−１２５μg ／
日）を５日間毎日続けた。６日目に動物を殺し、前肢膝
骨を取り出して長手方向に切開し、アセトンで固定して
２％ＡｇＮＯ3 で染色した。解剖双眼顕微鏡（ニコン）
で観察して骨端プレートの幅を測定した。（ラットあた
り４０回の読み取りを行なった）平均値を用いて長期投
与−応答曲線を抽いた。結果は、pRO １２産生bGH アナ
ログのbGH 活性が天然bGH の同じ活性に匹敵することを
示した。
【０２８６】実施例７ SOD β 1 Ｔ 11の増殖 Ｉ．保存培養物 pSODβ1 Ｔ11の保存培養物をカゼイン培地で増殖し（接
種物参照）、凍結培地で２倍に希釈し、−８０℃で保存
した。凍結培地は５００mlあたり次の物質を含む。
【０２８７】 Ｋ2 ＨＰＯ4 6.3 ｇ ＫＨ2 ＰＯ4 1.8 ｇ クエン酸Ｎａ 0.45ｇ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ 0.09ｇ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 0.9 ｇ グリセロール 44.0ｇ II．接種物 接種物を２０ｇ／ｌカゼイン水解物，１０ｇ／ｌ酵母抽
出物及び２ｇ／ｌ ＮａＣｌの中で増殖させた。振盪フ
ラスコ中の無菌培地に保存培養物を接種し、３０℃、約
２００r.p.m.のシェーカー上で１５時間インキュベート
した。必要に応じ、以後の接種物増殖段階は撹拌通気し
た発酵槽で行なった。無菌培地に２〜１０％接種物を接
種し、３０℃，pH７±0.5 で撹拌通気して溶存酸素レベ
ルを空気飽和の２０％より高く維持しながら１５時間イ
ンキュベートした。
【０２８８】III ．産生 産生培地は次の物質を含む。
【０２８９】 カゼイン水解物 ２０ｇ／ｌ 酵母抽出物 １０ｇ／ｌ Ｋ2 ＨＰＯ4 2.5 ｇ／ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ １ｇ／ｌ ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ ビオチン 0.1 mg／ｌ チアミン １mg／ｌ 微量元素溶液 ３ml／ｌ ＣｕＳＯ4 0.8 ｇ／ｌ ＺｎＳＯ4 １０mg/l 培地には、12.5mg／l のテトラサイクリンも含まれる。
テトラサイクリンは産生のためには任意成分であるが、
通常接種物を増殖させるために使用される培地には添加
されている。
【０２９０】濃縮溶液中のビオチン，チアミン及びテト
ラサイクリンを別々にフイルター滅菌し、接種以前に無
菌産生培地に加えた。無菌ブドウ糖溶液を最初に１０ｇ
／ｌになるように添加した。誘発の段階で更に１０ｇ／
ｌのブドウ糖を添加した。
【０２９１】微量元素溶液は次の物質を含む。
【０２９２】 ＦｅＣｌ3 １６ｇ／ｌ ＺｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ １ｇ／ｌ ＣｕＣｌ2 １ｇ／ｌ Ｈ3 ＢＯ3 0.5 ｇ／ｌ 濃ＨＣｌ １００ml／ｌ 培地に0.5 〜１０％の接種培養物を接種し、３０℃でイ
ンキュベートした。撹拌−通気速度は、空気飽和の２０
％より高い溶存酸素レベルが維持されるように設定され
る。ＮＨ3 でpHを７±0.2 に維持する。細胞濃度が約3.
5 ｇ／ｌ（OD660 ＝１０）に達すると誘発が始まる。
【０２９３】温度を４２℃に上げ、４２℃で１〜５時間
維持する。次いで培養物を急冷し、酵素精製のために遠
心分離によって細胞を回収する。
【０２９４】SOD の回収 ポリトロン（Kinematica）配合装置を用い、５０mMリン
酸ナトリウム（ｐＨ７．８）１２ｌ中に１．５ｋｇ の
細菌細胞（ウェットケーキ）を懸濁させる。配合装置の
速度は泡立ちを最小に抑えるように調整した。均質懸濁
液をダイノミル（Dynomill）細胞破砕装置KD５（Willy,
A.Bachofen, バーゼル）に連続的に通す。破砕細胞の均
質懸濁液を連続流細胞を用いて超音波処理し、CEPA１０
１遠心機で遠心した。上清を６５℃で２時間加熱し、冷
却し、前記処理と同様にして遠心した、清澄な上清を１
０，０００分子量カットオフカセット（PTGC型）を備え
たミリポアペリコン限外濾過装置で１ｌに濃縮する。濃
縮されたタンパク溶液を、１５０mMリン酸ナトリウム緩
衝液（pH7.8 ）で平衡したDEAE−セファロースカラム
（２kg DEAE セファロース）に流す。流出液を収集し、
濃縮し、２０mMトリス−ＨＣｌ，pH7.8 に対してペリコ
ン限外濾過装置で透析し、次いで２０mMトリス−ＨＣｌ
緩衝液で平衡したQAE −セファロースカラムに通す。２
０mMトリス−ＨＣｌ緩衝液，pH7.8 と塩勾配（０〜２０
０ mM ＮａＣｌ）でカラムを展開する。SOD 含有画分を
収集し、ペリコン限外濾過装置を用いて濃縮し、蒸留水
に対して透析し、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液，pH4.8 を
添加して１００mM酢酸ナトリウムとする。タンパク溶液
を更に１００mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.7 で平衡し
たCM−セファロースカラムで分離する。カラムを同じ緩
衝液および塩勾配（１００〜５００ mM ＮａＣｌ）で展
開する。SOD 含有画分を収集し、ペリコン限外濾過装置
を用いて濃縮し、凍結乾燥する。
【０２９５】実施例８ pSODβ 1 Ｔ 11により産生されるSOD の活性 実施例７で調製したpSODβ1 Ｔ11より産生されるSOD ア
ナログの酵素活性を、マックコード（McCord）及びフラ
イドビッチ（Fridovich ），ジェー・バイオロ・ケム
（J.Biol.Chem.）（１９６９），２４４：６０４９−６
０５５に記載された如く、フエリシトクロム−ｃの還元
抑制をモニターしてアッセイした。得られた結果は、pS
ODβ1 Ｔ11生SOD アナログの活性は天然ヒトSOD ［シグ
マ（Sigma)］の活性に匹敵し、ウシSOD ［オルゴテイン
（Orgotein）：グリューネンタールGMBH］の活性にも匹
敵していることを示した。
【０２９６】実施例９ 発現ベクター Ｉ．ｐ５７９ 第１９図に示し前記図面の説明中で詳細に説明したベク
ターｐ５７９は、ＰLプロモーターとＮ利用部位(Nu
tL ）及び非反復ECo ＲＩおよびNde Ｉ制限部位で境界
付けられるＣIIリボソーム結合部位とATG 開始コドンと
大腸菌（Escherichia coli）のrrn ＢリボソームRNA 遺
伝子オペロンの末端に由来するＴ1 Ｔ2 転写終結シグナ
ルとから成る。これらの要素は、アンピシリン耐性遺伝
子を有するpBR ３２２上でクローンされる。他の特徴は
第１９図に示されている。
【０２９７】ｐ５７９は、プラスミドpPS １上に含まれ
るＴ1 Ｔ2 転写終結シグナルをベクターpRO ２１１のHi
nd III部位に挿入して調製される。pRO ２１１は第２図
に示されている。pPS １はサルミエントス（Sarmiento
s）ら、セル（Cell）（１９８３）３２，１３３７−１
３４６に記載され、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションにATCC No.３９８０７で寄託されている。
ｐ５７９および真核生物遺伝子を含むその誘導体を適当
な大腸菌（Escherichia coli）宿主中に維持することも
できる。宿主の最も重要な特徴は、この宿主が熱感受性
リプレッサーｃＩ８５７と抗転写終結Ｎタンパクを与え
ることである。［ゴーテスマン，エム．（Gottesman,
M.）ら、ジェー．モル．バイオロ．(J.Mol.Biol.) （１
９８０）１４０，５７−７５］。
【０２９８】ｐ５７９は、従来の発現ベクターに比較し
て以下の如き多くの利点を有する。 １．発現レベルが極めて高いこと このベクターは、大腸菌（E. coli ）中の外来タンパク
の発現を総細胞タンパクの４２％という高レベルで誘発
しうる。この発現レベルは、Ｔ1 Ｔ2 転写終結配列を欠
く他の類似のλＰL プラスミドの発現レベルよりも高
い。
【０２９９】２．転写終結シグナル ベクターｐ５７９はλＰL プロモータとＣIIリボソーム
結合部位の下流に位置するＴ1 Ｔ2 転写終結シグナルを
含む。このベクターを用いて得られる高発現レベルは挿
入された遺伝子の末端にＴ1 Ｔ2 転写終結因子が存在し
ていることに部分的に起因している。すなわち、このＴ
1 Ｔ2 転写終結因子はＮ修飾RNA ポリメラーゼの転写を
集結しうるからである。
【０３００】このように、転写終結因子はプラスミドの
非所望タンパクのλＰL 制御転写を阻止し、これにより
所望のタンパクの相対収量を高める。
【０３０１】３．リボソーム結合部位が交換しうること ｐ５７９は、リボソーム結合部位の上流に位置する唯一
のEco ＲＩ部位とATG開始コドンの所に位置する唯一のN
de Ｉ部位とを含む。従って、リボソーム結合部位の両
境界は２個の非反復制限部位である。これにより、現在
のリボソーム結合部位（λＣIIリボソーム結合部位）の
切除とプラスミドの他の特徴を変えることなく他の天然
または合成リボソーム結合部位の実質的な置換を容易に
行ない得る。こうして所望ポリペプチドの至適発現が大
いに促進される。
【０３０２】４．発現を熱誘導的に調節し得ること λＰL プロモーターは、ＣＩリプレッサーが結合してい
るときは不活性である。ｃＩ８５７リプレッサーは熱感
受性である。即ち、３０℃ではプロモーターに結合する
が、４２℃で失活する。従って、発酵温度を４２℃に上
げることにより宿主細菌で所望タンパクの産生が誘発さ
れる。
【０３０３】そのような系は以下の利点を含む。
【０３０４】(a) 大腸菌（Escherichia coli）に毒性の
外来タンパクを発酵プロセスの後期に産生することがで
き、これにより早期の細胞死を回避しうる。
【０３０５】(b) タンパクの産生亢進がこのタンパクを
安定させ、タンパク分解を阻止する［チエン，ワイ．イ
ー（Cheng,Y.E.）ら、ジーン（Gene）（１９８１）１
４，１２１］。従って厳密に調節されたプロモーター例
えばλＰL を使用する“瞬間的”産生亢進は連続的な低
レベル産生よりも好ましいであろう。
【０３０６】５．誘発プロトコールを簡略化しうること ｐ５７９由来のプラスミドを約４２℃で誘発し、タンパ
ク合成中４２℃に保持する。係属中の米国特許出願第５
１４，１８８号に記載のpMG １００およびpND５から誘
導したプラスミドの誘発プロトコールでは、４２℃への
温度変化が必要であり、その後の増殖は３８℃で長時間
要する。ｐ５７９の至適誘発プロトコールは３８℃への
冷却ステップが不要であり、簡略化される。
【０３０７】６．コピー数が多いこと ｐ５７９のλＰL プロモーターは、大腸菌（Escherichi
a coli）中に使用されるλ導入ファージベクターに比較
してプラスミド上に多いコピー数を示す。これにより発
現レベルが増加する。
【０３０８】７．リボソーム結合部位及び開始コドンを
有すること この発現ベクターは強力な原核生物リボソーム結合部位
(RBS) と翻訳開始コドン(ATG) とを含む。従って、開始
コドンの付加を要せずにいかなる真核生物遺伝子のクロ
ーニングも可能である。さらに効率の良いRBS によって
発現レベルが増大する。リボソーム結合部位は我々がす
でにベクターpND ５にクローン化したλＣIIリボソーム
結合部位である。リボソーム結合部位の配列は次の通り
である。
【０３０９】
【化１４】
【０３１０】１塩基対が野生型λで認められるリボソー
ム結合部位と異なる。
【０３１１】８．適当な制限部位が存在すること 発現ベクターは、ATG 開始コドンを含む唯一のNde Ｉ制
限部位を有する。これにより、所望の遺伝子を適正に配
置し得る。この唯一のNde Ｉ部位がリボソーム結合部位
の直後にある。
【０３１２】９．遺伝子挿入のための適当な制限部位が
存在すること Nde Ｉ制限部位の下流に位置する１１６塩基対には、順
次Bgl II、 Sma Iという非反復制限部位がある。これら
非反復制限部位により、所望遺伝子の挿入が容易に行な
い得る。
【０３１３】１０．Nut 部位を有すること 宿主によって与えられるＮタンパクは発現ベクター上の
Nut 部位に結合し、これによりｔRI部位での転写終結ま
たはクローン化された遺伝子内の早期転写終結が阻止す
る。
【０３１４】菌株 記載されたベクター及びプラスミドに対する適当な宿主
は、Ａ１６３７，Ａ２６０２，Ａ１５６３，Ａ１６４５
（ｃ６００ｒ- ｍ + gal+ thr- leu- lac-bl（λｃ
Ｉ８５７ΔＨＩΔBam ＨＩ Ｎ+ ））及びＡ２０９７
（Ａ１６４５ lacΔx Ａ２１ proＣ::Tn１０）を含む形
質転換用に適当な大腸菌（Escherichiacoli）の菌株で
ある。
【０３１５】実施例１０ 動物成長ホルモン Ｉ pHG ４４ pHG ４４の構築は、第６図に示されかつ前記図面の説明
中に記載され、ATCC No.３９８０６で寄託されている。
このプラスミドは第２図に示すpRO １２プラスミドに、
第６図に示されサーミエントス（Sarmientos）ら、セル
（Cell）（１９８３）３２，３３７−１３４６に記載さ
れ、ATCC No.３９８０７で寄託されているプラスミドpP
S １のＴ1 Ｔ2 転写終結配列を挿入して得られた。Ｔ1
Ｔ2 転写終結配列の存在により、mRNA転写の長期間継続
（long run-on ）が阻止され、よってλＰL プロモータ
ーのコントロール下でのβ−ラクタマーゼ遺伝子と多分
他の非所望タンパクの高レベル発現が阻止される。
【０３１６】プラスミドpHG ４４を、当業者に公知の方
法を用いる形質転換によって大腸菌（Escherichia col
i）Ａ２０９７株中に導入した。この菌株を増殖及び誘
発すると、フェニルアラニン形真正ウシ成長ホルモン(b
GH) のアミノ末端に付加されたアミノ酸配列met-asp-gl
n を有するbGH のアナログが産生する。pHG ４４により
産生されるbGH アナログの量は、クーマシー染色SDS ポ
リアクリルアミドゲルの走査により計算すると、細菌に
より産生される総タンパクの約３７−４２％であった。
【０３１７】菌株の増殖、産生されたbGH アナログの回
収及びbGH アナログの精製に使用した方法は実施例１３
に記載されている。bGH 遺伝子の３′末端にＴ1 Ｔ2 転
写終結配列を導入することによりβ−ラクタマーゼ発現
が顕著に抑えられているため、発現レベルはpRO １２か
ら得られる発現レベル（表Ｉ）より高い。
【０３１８】II pSAL５６００−１ pSAL５６００−１の構築は第１０図に示されかつ前記図
面の説明中に記載されている。プラスミドpSAL５６００
−１は（第３図に示されている）pSAL５２００−６から
プラスミドpPS １（ATCC No.３９８０７）のＴ1 Ｔ2 転
写終結配列を挿入して得られた。
【０３１９】プラスミドpSAL５６００−１を、当業者に
公知の方法を用いる形質転換により大腸菌（Escherichi
a coli）菌株Ａ１６４５に導入した。この菌株を増殖及
び誘発すると、フェニルアラニン型天然bGH のアミノ末
端に付加されたアミノ酸メチオニンを有するbGH のアナ
ログが産生された。pSAL５６００−１菌株により産生さ
れたbGH アナログの量は、クーマシー染色SDS ポリアク
リルアミドゲルの走査により計算すると、細菌により産
生される総タンパクの約２２−２８％であった。菌株の
増殖、産生されたbGH アナログの回収及びbGH アナログ
の精製に使用した方法は、実施例１３に記載のpHG ４４
に対する方法と同じである。
【０３２０】bGH 遺伝子の３′末端にＴ1 Ｔ2 転写終結
配列を導入することによりβ−ラクタマーゼ発現が大き
く抑えられているため、発現レベルはpSAL５２００−６
菌株から得られるレベルよりも高かった。
【０３２１】III ｐ３００９ ｐ３００９の構築は、第１１図に示されかつ前記図面の
説明に記載されている。ｐ５７９発現ベクター（第１９
図）の唯一のNde Ｉ部位にNde Ｉ−Nde Ｉブタ成長ホル
モンcDNAフラグメントを挿入して、プラスミドｐ３００
９を得た。ブタ成長ホルモン(pGH) フラグメントはNde
Ｉ消化によりｐ３００８（ATCC No.３９８０４）から単
離した。
【０３２２】プラスミドｐ３００９を、当業者に公知の
方法を用いる形質転換により大腸菌（Escherichia col
i）菌株Ａ１６４５に導入した。この菌株は増殖及び誘
発すると、フェニルアラニン形天然 pGHのアミノ末端に
付加されたアミノ酸メチオニンを有するpGH のアナログ
が産生された。産生されたpGH アナログの量は、クーマ
シー染色SDS ポリアクリルアミドゲルの走査により計算
すると、細菌により産生される総タンパクの約３０−３
５％であった。菌株を増殖、産生されたpGH アナログの
回収及びpGH アナログの精製に使用した方法は、実施例
１３に記載されているpHG ４４に対する方法と同じであ
る。
【０３２３】pHG 遺伝子の３′末端にＴ1 Ｔ2 転写終結
配列が導入されてβ−ラクタマーゼ発現が大きく抑えら
れているために、ｐ３００９の発現レベルはｐ３００８
菌株から得られるレベルに比して高かった。
【０３２４】IV ｐ５００３ ｐ５００３の構築は第１２図に示されかつ前記図面の説
明中に記載されている。ｐ５００３はアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクションにATCC No.３９７９２で
寄託されている。ｐ５７９発現ベクターの非反復Nde Ｉ
部位にNde Ｉ−Nde Ｉニワトリ成長ホルモンcDNAフラグ
メントを挿入して、プラスミドｐ５００３を得た。
【０３２５】プラスミドｐ５００３を、当業者に公知の
方法を用いる形質転換により大腸菌（Escherichia col
i）菌株Ａ２０９７に導入した。この菌株は増殖及び誘
発すると、フェニルアラニン形天然ニワトリ成長ホルモ
ン(cGH) のアミノ末端に付加されたアミノ酸メチオニン
を有するcGH のアナログが産生された。産生された cGH
アナログの量は、クーマシー染色SDS ポリアクリルアミ
ドゲルの走査により計算すると、細菌により産生される
総タンパクの約３０−３５％であった。菌株を増殖、産
生されるcGH アナログの回収及びcGH アナログを精製す
るために使用した方法は、実施例１３に記載したpHG ４
４に対する方法と同じである。
【０３２６】ある。
【０３２７】cGH 遺伝子の３′末端にＴ1 Ｔ2 転写終結
配列が導入することによりβ−ラクタマーゼの発現が大
きく抑えられているため、ｐ５００３の発現レベルはｐ
５００２菌株から得られるレベルよりも高かった。
【０３２８】実施例１１ ヒトＣｕ−Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ(SOD) Ｉ pSODβ1 ＴＴ−１ pSODβ1 ＴＴ−１構築は第１６図に示されかつ図面の説
明中に記載されている。プラスミドpSODβ1 ＴＴ−１
は、pSODβ1 Ｔ11（第１５図）のSOD 遺伝子の３′末端
にＴ1 Ｔ2 終結配列を挿入した得た。
【０３２９】プラスミドpSODβ1 ＴＴ−１を、当業者に
公知の方法を用いる形質転換で大腸菌（Escherichia co
li）菌株Ａ１６４５に導入した。この菌株を増殖すると
SODアナログを産生した。産生したSOD アナログの量
は、クーマシー染色SDS ポリアクリルアミドゲルの走査
により計算すると、細菌により産生される総タンパクの
約１０−１５％であった。
【０３３０】菌株の増殖、産生されるSOD アナログの回
収及びSOD アナログの精製に使用した方法は実施例１５
に記載されている。
【０３３１】非所望DNA 配列の転写及び翻訳がＴ1 Ｔ2
誘発で抑えられているために、pSODβ1 ＴＴ−１の発現
レベルはpSODβ1 Ｔ11（表II）から得られるレベルより
高かった。
【０３３２】アミノ酸配列解析化学量論により示される
如くアミノ末端アラニンがアセチル化されていない点
で、産生されたヒトＣｕ−ＺｎSOD アナログは天然ヒト
Ｃｕ−ＺｎSOD とは異なる。天然ヒトSOD はアミノ末端
アラニンでアセチル化されている［ハーツ，ジェー．ダ
ブリュー．（Hartz,J.W.）及びドイッチェ，エィチ．エ
フ．（Deutsch,H.F.）、ジェー．バイオロ．ケム．(J.B
iol.Chem) （１９７２）２４７：７０４３−７０５０、
ヤーブッシュ，ジェー．アール．（Jabusch,J.R.）ら、
バイオケミストリー（Biochemistry）（１９８０）１
９：２３１０−２３１６；バーラ(Barra) ら、FEBSレタ
ーズ(Letters) （１９８０）１２０，５３及びオバーレ
イ，エル．ダブリュ．（Oberley,L.W.），スーパーオキ
シドジスムターゼ（Superoxide Dismutase）VoL.I,CRC
プレス，フロリダ，（１９８２），pp. ３２−３３］。
天然ヒト SODはグリコシル化されている［ヒューバー，
ダブリュ．（Huber,W.）、１９７１年５月１８日付発刊
米国特許第３，５７９，４９５号］。大腸菌（Escheric
hia coli）は自身が産生するタンパクをグリコシル化し
ないので、細菌産生ヒトSOD は殆んど全くグリコシル化
されていない。細菌産生SOD アナログのアミノ酸配列は
成熟ヒトSOD のアミノ酸配列と同一であり、Ｎ−末端に
メチオニン残基を含まない。
【０３３３】実施例１２ ヒトアポリポプロテインＥ３（Apo −Ｅ３） Ｉ pTV −１７０ pTV −１７０の構築は第２０図に示されかつ前記図面の
説明中に記載されている。pApoＥ−EX２（ATCC No.３９
７８７）由来のNde Ｉ−Nde Ｉ Apo−Ｅ３フラグメント
を発現ベクターｐ５７９の非反復Nde Ｉ部位に挿入し
て、プラスミドpTV −１７０を得た。
【０３３４】pTV −１７０を当業者に公知の方法を使用
する形質転換により大腸菌（Escherichia coli）菌株Ａ
１６４５に導入した。得られたクローンを増殖させる
と、多分天然ヒトApo Ｅ３のアミノ末端に付加されたア
ミノ酸メチオニンを有するヒトApo Ｅ３が産生された。
産生されたヒトApo Ｅ３アナログの量は、クーマシー染
色SDS ポリアクリルアミドゲルの走査により計算する
と、細菌により産生される総タンパクの約１％であっ
た。菌株を増殖するのに使用した方法は実施例１７に記
載されている。
【０３３５】II pTV −１９４ pTV −１９４の構築は第２２図に示されかつ前記図面の
説明中に記載されている。pTV −１７０（第２０図）か
ら、ＣIIリボソーム結合部位をpBLA１１由来のβ−ラク
タマーゼプロモーターとリボソーム結合部位で置換する
と、pTV −１９４が誘導された。pBLA１１は、pBR ３２
２中の座標４１５７と４３５３の間にあるβ−ラクタマ
ーゼ遺伝子のプロモーターとリボソーム結合部位とを含
む。EcoＲＩリンカーをプロモーターの上流に付加し、
マルチ制限部位リンカーを開始コドンATG の直後に付加
した。従って、開始コドンを始めとするコード鎖の配列
は、ATGAGCTCTAGAATTCである。pBLA１１はアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションにATCC No.３９７８
８として寄託された。
【０３３６】pTV −１９４を、当業者に公知の方法を用
いる形質転換によって大腸菌（Escherichia coli）菌株
Ａ１６４５に導入した。得られたクローンを増殖する
と、多分天然ヒトApo Ｅ３のアミノ末端に付加されたア
ミノ酸メチオニンを有するヒトApo Ｅ３のアナログが産
生された。産生されたヒトApo −Ｅアナログの量は、ク
ーマシー染色SDS ポリアクリルアミドゲルの走査により
計算すると、細菌により産生される総タンパクの約３％
であった。菌株を増殖するのに使用された方法は実施例
１７に記載されているpTV −１７０に対する方法と同じ
である。
【０３３７】III pTV −２１４ pTV −２１４の構築は第２４図に示されかつ前記図面の
説明中に記載されている。ヒト成長ホルモンの１４個の
アミノ酸アミノ末端配列をコードする合成DNAフラグメ
ントをpTV −１９０の非反復Nde Ｉ部位に挿入すること
により、（第２１図に示されかつ前記図面の説明中に記
載されている）pTV −１９０からpTV −２１４を誘導し
た。
【０３３８】pTV −２１４を、当業者に公知の方法を用
いる形質転換により大腸菌（Escherichia coli）菌株Ａ
１６４５に導入した。得られたクローンを増殖及び誘発
すると、ヒトApo Ｅ３のアナログが産生された。前記ア
ナログは、アミノ末端にヒト成長ホルモンの１４個のア
ミノ酸アミノ末端配列とそれに続く成熟ヒトApo Ｅ３の
配列に付随したメチオニンとを有する。産生されたヒト
Apo Ｅアナログの量は、クーマシー染色SDS ポリアクリ
ルアミドゲルの走査により計算すると、細菌により産生
された総タンパクの約２％であった。菌株を増殖するた
めに使用した方法は実施例１７に記載されているpTV −
１７０に対する方法と同じである。
【０３３９】実施例１３ pHG ４４の増殖 Ｉ．保存培養株 pHG ４４の保存株をカゼイン培地（接種材料の項参照）
上で増殖させた後、凍結培地で２倍に希釈し、−８０℃
で保存した。凍結培地は５００ml中の含有成分を以下に
示す。
【０３４０】 Ｋ2 ＨＰＯ4 6.3 ｇ ＫＨ2 ＰＯ4 1.8 ｇ クエン酸Ｎａ 0.45ｇ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ 0.09ｇ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 0.9 ｇ グリセロール 44.0 ｇ II．接種材料 接種材料を、カゼイン水解物２０ｇ／ｌ、酵母エキス１
０ｇ／ｌ及びＮａＣｌ２ｇ／ｌ中で増殖させた。振盪フ
ラスコ内の滅菌培地に保存株を接種し、振盪器上で３０
℃及び約２００r.p.m で１５時間培養した。必要に応
じ、撹拌通気発酵器中で接種材料増殖の後続段階を実施
した。滅菌培地に２−１０％の接種材料培養株を接種
し、空気飽和の２０％を越えるような溶存酸素濃度を保
つように撹拌及び通気しながら３０℃、pH７±0.5 で１
５時間培養した。
【０３４１】III ．産生 産生用培地の含有成分を以下に示す。
【０３４２】 カゼイン水解物 ２０ｇ／ｌ 酵母エキス １０ｇ／ｌ Ｋ2 ＨＰＯ4 2.5 ｇ／ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ １ｇ／ｌ ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ ビオチン 0.1 mg／ｌ チアミン １mg／ｌ 微量元素溶液 ３ml／ｌ 培地には更にアンピシリン１００mg／ｌを含有させた。
アンピシリンは産生に任意の成分であるが、接種材料の
増殖用に使用される培地中で常に見出されるものであ
る。
【０３４３】ビオチン、チアミン及びアンピシリンの濃
縮溶液をそれぞれ濾過滅菌し、接種以前の滅菌産生用培
地に添加した。まず１０ｇ／ｌまで滅菌グルコース溶液
を添加した。誘導段階で更に１０ｇ／ｌのグルコースを
添加した。
【０３４４】微量元素溶液の含有成分を以下に示す。
【０３４５】 ＦｅＣｌ3 １６ｇ／ｌ ＺｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ １ｇ／ｌ ＣｕＣｌ2 １ｇ／ｌ Ｈ3 ＢＯ3 0.5 ｇ／ｌ 濃ＨＣｌ １００ml／ｌ 培地に 0.5−１０％の接種材料培養株を接種し、３０℃
で培養した。空気飽和の２０％を越えるような溶存酸素
濃度を保つように撹拌通気率を設定した。pHはＮＨ3 で
７±0.2 に維持した。細胞濃度が約3.5 ｇ／ｌ（OD660
＝１０）に達してから誘導を開始した。
【０３４６】温度を４２℃まで上昇させ、４２℃を１−
５時間維持した。次に培養株を冷却し、ホルモン精製用
に遠心分離法により細胞を回収した。
【０３４７】bGH の回収 ポリトロン（キネマテイカ）（Polytron（Kinematic
a））混合機を使用し、発泡を最小化するように該混合
機の速度を調節しながら、５０mMリン酸ナトリウム緩衝
液(pH7.4) 、５０mM EDTA 及び１００mMＮａＣｌを含有
する溶液５容量中に、細菌細胞１３kg（湿潤ケーキ）を
再懸濁させた。均質な懸濁液を８０ｌ／時でダイノミル
細胞破砕器ケー．ディー・５（ウイリー・エイ・バシヨ
フエン、バーゼル）（Dynomill cell disruptor KD５
（Willy A.Bachofen,Basel））に連続的に通し、破砕し
た細胞の均質懸濁液を、流量４５ｌ／時でシー・イー・
ピー・エイ（CEPA）１０１遠心機で遠心分離により清澄
化させた。遠心分離段階で分離された沈殿物を収集し、
５０mM EDTA を含有する５０mMリン酸ナトリウム緩衝液
(pH7.4)15.5 ｌ中に再懸濁させた。最終濃度が0.05mg／
mlになるまでリゾチームを添加し、懸濁液を３７℃で１
６時間インキュベートした。最終濃度が１％になるまで
トリトン・エックス（Triton X）−１００を添加した。
次に懸濁液を室温で３０分間インキュベートし、連続フ
ローセル音波処理装置（熱システム）内で１８ｌ／時で
音波処理し、シー・イー・ピー・エイ・１０１遠心機内
で遠心分離した。沈殿物を収集し、５０mMリン酸ナトリ
ウム緩衝液(pH7.4) 中に再懸濁させ、前記と同様に音波
処理し、シー・イー・ピー・エイ・１０１遠心機内で遠
心分離した。５０mM EDTA 及び１００mMＮａＣｌを含有
する５０mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)15.5 ｌ中に
細胞を再懸濁させ、２度沈殿させ、蒸留水 15.5 ｌ中に
再懸濁させた。遠心分離により沈殿物を収集し、−２０
℃で保存した。
【０３４８】bGH の精製 沈殿物を蒸留水３０−４０ｌ中に再懸濁させ、0.5 ＮＮ
ａＯＨでpH11.8に滴定して可溶化させた。次に溶液を連
続的に音波処理し、必要に応じてシー・イー・ピー・エ
イ・１０１遠心機内で遠心分離により清澄化させ、又は
ワットマン（Whatman ）No. １濾紙で濾過した。
【０３４９】清澄化させた蛋白質溶液（２８０nm OD ＝
２９７０００の溶液32.6ｌ）を、それぞれ５００００−
６００００ODの各部分（６×5.4 ｌ）に分割した。各面
積５ft2 の３個の１０００００分子量カットオフカセッ
ト（ピー・ティー・エイチ・ケーPTHK型）を備えるミリ
ポア・ペリコン（Millipore Pellicon）限外濾過器で各
部分をそれぞれ限外濾過した。5.4 ｌ部分を保持物(ret
entate) 容量１ｌまで濃縮した。限外濾過物を収集し、
保存した。保持物をpH11.8の別の１０mMホウ酸塩緩衝液
で当初の容量まで希釈し、十分混合した。バッチを保持
物容量１ｌまで再び濃縮した。限外濾過物を収集し、先
の限界濾過物と混合した。両者の限外濾過物中のODの合
計値が、限外濾過器に初期にチャージされたODの２０％
になったら、次の濃縮段階の保持物容量を１ｌでなく0.
5 ｌとした。0.5 ｌの保持物容量からの限外濾過物の吸
光度が２８０nm（１cmセル）で0.1 より小さくなるま
で、濃縮及び１０mMホウ酸塩緩衝液による希釈のサイク
ルを継続した。一般に、濃縮及び希釈サイクル数は９か
ら１２の範囲とした。最終保持物を排出した。
【０３５０】全限外濾過物を合し、６ＮＨＣｌでpH9.0
に調整した。別の5.4 ｌ部分を同様に限外濾過し、pH調
整済みの全限外濾過物を合した。代表的な一工程から、
OD＝１０００００に相当する吸光度0.26の限外濾過物総
量３８０ｌが産生され、所要時間は２４から４０時間で
あった。
【０３５１】１００Ｋ限外濾過段階で合した限外濾過物
（２８０nmでOD＝１０００００の濾過物３８０ｌ）を、
線流速２３cm／時（２５ｌ／時）でセファロース・シー
・エル・６・ビー、ディー・イー・エー・イー（Sephar
ose CL−６Ｂ DEAE ）イオン交換カラムに通した。直径
３７cm、高さ１５cmのカラムを、pH9.0 の１０mMホウ酸
塩緩衝液２床容量（３２Ｌ）で洗浄した。充填及び洗浄
段階からの溶出液を排出した。溶離液を段階的に１０mM
ホウ酸塩、１０mM塩化ナトリウム、pH９に変化させ、bG
H をカラムから排出した。溶出流速は２３cm／時とし
た。２８０nmにおける溶出液の吸光度を追跡することに
より、工程の進行を監視した。bGH ピークを４から５床
容量（２８０nmでOD＝４３０００の容量８４ｌ）収集し
た後、１００００分子量カットオフカセットを有するミ
リポア・ペリコン限外濾過器を使用して約１０mg／mlに
濃縮した。次に溶液を凍結乾燥した。収量は、純粋bGH
約７０ｇであった。
【０３５２】実施例１４ pHG ４４により産生されるbGH アナログの活性 １．天然bGH に対するbGH アナログのラジオイムノアッ
セイ比較 リン酸塩でpHを調節した食塩水（１％BSA ）中にbGH ア
ナログ１００ng／mlを含有する溶液を調製した。該溶液
を逐次、濃度５０，２５，12.5，6.25，3.12，1.56及び
0.78ng／ｌに希釈した。これらの溶液の0.1ml アリコー
ト１対に対して、二抗体法によりRIA を行った。希釈曲
線は、天然bGH で得られる場合と同等であった。
【０３５３】２．ラジオレセプタ結合アッセイ トレーサとして 125Ｉ−bGH 及び較正曲線用として真正
bGH 溶液を使用し、ツシマ・ティーTushima,T 及びフレ
イセン・エイチ・ジーFreisen,H.G.（ワイ・チン「内分
泌代謝」Y.Chin.,Endocr Metab. （１９７３），３７，
３）により記載されているように、ウサギ肝臓膜でラジ
オレセプタ結合アッセイを行った。アッセイ用緩衝液0.
3ml （５０mMトリス、１５mMＣａＣｌ2 及びウシ血清ア
ルブミン５mg／ml、pH7.6 ）中で室温で３組の試料を２
時間インキュベートした。管には、 125Ｉ−bGH （３０
−６０μＣｉ／μg の調製に２００００cpm ）、肝臓膜
蛋白質１５０−２５０μg 、及び天然bGH （１−１００
ng）又は細菌bGH エキスのいずれかを充填した。その結
果、bGH アナログのbGH 活性は天然bGH のbGH 活性と同
等であることが認められた。
【０３５４】３．脛骨試験 実施例１３に従い細菌細胞から回収したpRO １２から産
生したbGH アナログの生物活性を脛骨試験により評価し
た。（パーロウ・エイ．エフ他「分泌学」Parlow, A.
F.,et al.,Endocrinology （１９６５）７７，１１２６
参照。）ラットの下垂体を２８−３０日齢で切除した
後、無処置で１０−１４日間置いた。ウシ下垂体又は組
換体大腸菌（Escherichia coli）から誘導されたウシ成
長ホルモンをpH10.0の0.01Ｍホウ酸塩と共に0.15ＭＮａ
Ｃｌに溶解させた。ラット（１群４−７匹）に毎日bGH
溶液（0.2cc 中に５−１２５μg ／日）を５日間皮下注
射し、この間常用飼料（プリナラットチャウ及び任意に
水）を与え続けた。動物を６日目に殺し、前脚膝骨を取
出し、長手方向に切断し、アセトンで固定し、２％Ａｇ
ＮＯ3 で染色した。解剖双眼鏡（ニコン）で観察するこ
とにより骨端板の幅を測定した。平均値（ラット１匹当
たりの読み４０回）を使用して長い投与−応答曲線を形
成した。この結果、bHG ４４から産生したbGH アナログ
のbGH 活性が天然bGH のbGH 活性と同等であることが認
められた。
【０３５５】実施例１５ pSODβ1 ＴＴ−１の増殖 Ｉ．保存培養株 pSODβ1 Ｔ11の保存株をカゼイン培地（接種材料の項参
照）上で増殖させた後、凍結培地で２倍に希釈し、−８
０℃で保存した。凍結培地５００ml中の含有成分を以下
に示す。
【０３５６】 Ｋ2 ＨＰＯ4 6.3 ｇ ＫＨ2 ＰＯ4 1.8 ｇ クエン酸Ｎａ 0.45ｇ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ 0.09ｇ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 0.9 ｇ グリセロール 44.0 ｇ II．接種材料 カゼイン水解物２０ｇ／ｌ、酵母エキス１０ｇ／ｌ及び
ＮａＣｌ2 ｇ／ｌ中で接種材料を増殖させた。振盪フラ
スコ内の滅菌培地に保存株を接種し、３０℃及び約２０
０r.p.m で振盪器上で１５時間培養した。必要に応じて
撹拌通気発酵器中で接種材料増殖の後続段階を実施し
た。滅菌培地に２−１０％の接種材料を接種し、空気飽
和の２０％を越えるような溶存酸素濃度を維持するよう
に撹拌及び通気しながら３０℃、pH７±0.5 で１５時間
培養した。
【０３５７】III ．産生 産生用培地の含有成分を以下に示す。
【０３５８】 カゼイン水解物 ２０ｇ／ｌ 酵母エキス １０ｇ／ｌ Ｋ2 ＨＰＯ4 2.5 ｇ／ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ １ｇ／ｌ ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ ビオチン 0.1 mg／ｌ チアミン １mg／ｌ 微量元素溶液 ３ml／ｌ ＣｕＳＯ4 0.8 ｇ／ｌ ＺｎＳＯ4 １０mg／ｌ 培地には更にテトラサイクリン12.5mg／ｌを含有させ
た。テトラサイクリンは産生に任意の成分であるが、接
種材料の増殖用に使用される培地中には常に含有されて
いる。
【０３５９】ビオチン、チアミン及びテトラサイクリン
の濃度溶液をそれぞれ濾過滅菌し、接種以前の滅菌産生
用培地に添加した。滅菌グルコース溶液をまず１０ｇ／
ｌまで添加した。誘導段階で更に１０ｇ／ｌのグルコー
スを添加した。
【０３６０】微量元素溶液の含有成分を以下に示す。
【０３６１】 ＦｅＣｌ3 １６ｇ／ｌ ＺｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ １ｇ／ｌ ＣｕＣｌ2 １ｇ／ｌ Ｈ3 ＢＯ3 0.5 ｇ／ｌ 濃ＨＣｌ １００ml／ｌ 培地に 0.5−１０％の接種材料培養株を接種し、３０℃
で培養した。空気飽和の２０％を越えるような溶存酸素
濃度を維持するように撹拌通気率を設定した。pHをＮＨ
3 で７±0.2 に保った。細胞濃度が約3.5 ｇ／ｌ（OD
660 ＝１０）に達してから誘導を開始した。
【０３６２】温度を４２℃まで上昇させ、１−５時間４
２℃を保った。次に培養株を冷却し、酵素精製用に遠心
分離法により細胞を回収した。
【０３６３】SOD の回収 発泡を最小化するように速度を調節しながらポリトロン
（キネマテイカ）混合機内で５０mMリン酸ナトリウム(p
H7.8) １２ｌ中に細菌細胞1.5kg （湿潤ケーキ）を懸濁
させた。均質懸濁液をダイノミル細胞破砕器ケー・ディ
ー・５（ウイリー・エイ・バシヨフエン、バーゼル）に
連続的に通過させた。連続フローセルを使用して破砕細
胞の均質懸濁液を音波処理し、シー・イー・ピー・エイ
・１０１遠心機内で遠心分離した。上清を６５℃で２時
間加熱し、冷却して前記と同様に遠心分離した、１００
００分子量カットオフカセット（ピー・ティー・ジー・
シー型）を使用するミリポアペリコン限外濾過装置内で
清澄な上清を１ｌまで濃縮した。濃縮された蛋白質溶液
を、１５０mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.8) で平衡化
されたディー・イー・エイ・イー・セファロースカラム
（２kgディー・イー・エイ・イー・セファロース）に通
した。溶液中の流れを収集し、濃縮し、ペリコン限外濾
過装置内でpH7.8 の２０mMトリスＨＣｌで透析してか
ら、２０mMトリスＨＣｌ緩衝液で平衡化されたキュー・
エイ・イー・セファロースカラム上に置いた。pH7.8 の
２０mMトリスＨＣｌ緩衝液及び塩勾配（０−２００mMＮ
ａＣｌ）でカラムを展開させた。SOD 含有フラクション
を収集し、ペリコン限外濾過装置で濃縮し、蒸留水で透
析した後、pH4.8 の１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液を添加す
ることにより１００mM酢酸ナトリウムとした。pH4.7 の
１００mM酢酸ナトリウム緩衝液で平衡化されたシー・エ
ム・セファロースカラム上で蛋白質溶液を更に分離し
た。同一緩衝液及び塩勾配（１００−５００mMＮａＣ
ｌ）を使用してカラムを展開させた。SOD 含有フラクシ
ョンを収集し、ペリコン限外濾過装置で濃縮し、凍結乾
燥した。
【０３６４】実施例１６ pSODβ1 ＴＴ−１により産生されるSOD の活性 マックコード及びフリドヴィチ、生化学誌（McCord and
Fridovich, J.Biol.Chem.）（１９６９），２４４，６
０４９−６０５５に記載されているようにフエリシトク
ロム・シーの還元抑制を監視することにより、実施例１
５のpSODβ1 ＴＴ−１により産生されたSOD アナログの
酵素活性を分析した。その結果、pSODβ1 ＴＴ−１から
産生されたSOD アナログの活性は、天然のヒトSOD の活
性及びウシSOD （オルゴテイン：グルネンタール・ゲー
・エム・ベー・ハーOrgotein：Grunenthal GMBH ）の活
性と同等であると認められた。
【０３６５】実施例１７ pTV −１７０の増殖 Ｉ．保存培養株 pTV −１７０の保存株をカゼイン培地（接種材料の項参
照）上で増殖させ、凍結培地で２倍に希釈し、−８０℃
で保存した。凍結培地５００ml中の含有成分を以下に示
す。
【０３６６】 Ｋ2 ＨＰＯ4 6.3 ｇ ＫＨ2 ＰＯ4 1.8 ｇ クエン酸Ｎａ 0.45ｇ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ 0.09ｇ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 0.9 ｇ グリセロール 44.0 ｇ II．接種材料 カゼイン水解物２０ｇ／ｌ、酵母エキス１０ｇ／ｌ及び
ＮａＣｌ２ｇ／ｌ中で接種材料を増殖させた。振盪フラ
スコ内の滅菌培地に保存株を接種し、振盪器上で３０℃
及び約２００r.p.m で１５時間培養した。必要に応じ
て、撹拌通気発酵器内で接種材料増殖の後続段階を実施
した。滅菌培地に２−１０％の接種材料を接種し、空気
飽和の２０％を越えるような溶存酸素濃度を保つように
撹拌及び通気しながら３０℃、pH７±0.5 で１５時間培
養した。
【０３６７】III ．産生 産生用培地の含有成分を以下に示す。
【０３６８】 カゼイン水解物 ２０ｇ／ｌ 酵母エキス １０ｇ／ｌ Ｋ2 ＨＰＯ4 2.5 ｇ／ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ １ｇ／ｌ ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ ビオチン 0.1 mg／ｌ チアミン １mg／ｌ 微量元素溶液 ３ml／ｌ 培地には更にアンピシリン１００mg／ｌを含有させた。
アンピシリンは産生に任意の成分であるが、接種材料の
増殖用として使用される培地中には常に見出される。
【０３６９】ビオチン、チアミン及びアンピシリンの濃
度溶液をそれぞれ濾過滅菌し、接種以前の滅菌産生用培
地に添加した。滅菌グルコース溶液をまず１０ｇ／ｌま
で添加した。誘導段階で更に１０ｇ／ｌのグルコースを
添加した。
【０３７０】微量元素溶液の含有成分を以下に示す。
【０３７１】 ＦｅＣｌ3 １６ｇ／ｌ ＺｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ １ｇ／ｌ ＣｕＣｌ2 １ｇ／ｌ Ｈ3 ＢＯ3 0.5 ｇ／ｌ 濃ＨＣｌ １００ml／ｌ 培地に 0.5−１０％の接種材料培養株を接種し、３０℃
で培養した。空気飽和の２０％を越えるような溶存酸素
濃度を保つように撹拌通気率を設定した。pHをＮＨ3 で
７±0.2 に維持した。細胞濃度が約3.5 ｇ／ｌ（OD660
＝１０）に達してから誘導を開始した。
【０３７２】温度を４２℃まで上昇させ、１５時間４２
℃を保った。次に培養株を冷却し、蛋白質精製用に遠心
分離法により細胞を回収した。
【０３７３】実施例１８ ウシ成長ホルモン pHG ５０ pHG ５０の構築は第６図に示され図面の説明中に説明し
てある。pHG ４４（エイ・ティー・シー・シー・ATCC番
号３９８０６）の単一Ｃｌa Ｉ部位にpSK ４３４（ATCC
番号３９７８４）のHpa II−Hpa IIλｃＩ434 フラグメ
ントを挿入することによりプラスミドpHG ５０を得た。
同様にしてプラスミドpHG ５１を構築した。しかし乍
ら、プラスミドpHG ５０と比較してλｉmm４３４ｃＩ+
フラグメントはプラスミド内で逆配向（opposite orien
tation）に見出された。
【０３７４】λｉmm４３４をBam ＨＩで消化し、Bam Ｈ
Ｉで消化されたpBR ３２２に混合物を連結させることに
よりpSK ４３４（ATCC番号３９７８４）を構築した。連
結された混合物で大腸菌Ａ２０９７を形質転換し、λｉ
mm４３４ｃＩ３００３ファージに免疫性のコロニーを単
離した。これらのコロニーの１個から単離したプラスミ
ドpSK ４３４は６kb Bam ＨＩフラグメントを含んでお
り、該フラグメントはλｃＩ４３４遺伝子を含んでおり
かつＮ遺伝子外からＰ遺伝子外に伸びていた。pSK ４３
４は第６図の制限地図を有する。
【０３７５】当業者に公知の方法を使用する形質転換に
より、pHG ５０及びpHG ５１を大腸菌菌株Ａ１６４５に
導入した。得られたクローン、それぞれＡ３１０８及び
Ａ３１１２は、増殖及び誘導後、フェニルアラニン形天
然bGH のアミノ末端に付加されたアミノ酸配列met-asp-
gln を有するbGH アナログを産生した。産生されたbGH
アナログの量を、クーマシーで染色したエス・ディー・
エス・ポリアクリルアミドゲルを走査することにより計
算した処、細菌により産生される総蛋白質量の３７−４
２％の範囲であった（第Ｉ表）。
【０３７６】プロファージ導入 λｃＩ４３４選択系を使用するためには、pHG ５０を含
有する細胞がプロファージλｉmm４３４ｃＩ- をも含有
していなければならない。本発明者はプロファージとし
てλｉmm４３４ｃＩ３００３mini Tn １０Δ１６Δ１７
を使用した。まれに起こる安定的なプロファージ挿入現
象の単離を容易にするために、mini Tn１０Δ１６Δ１
７テトラサイクリン耐性マーカ（フォスター他、細胞
（Foster,et al.,Cell）（１９８１）２３，２０１−２
１３）をファージ中に導入した。他方、この結果、テト
ラサイクリン耐性を監視することにより、プロファージ
の存在を簡単に試験することも可能になった。
【０３７７】アンピシリンの存在下で増殖したプラスミ
ドpHG ５０を含有する大腸菌菌株Ａ１６４５に、３０℃
で低感染多重度でλｉmm４３４ｃＩ３００３mini Tn １
０Δ１６Δ１７を感染させた。テトラサイクリン耐性コ
ロニーを単離し、精製した。前記菌株はアメリカ菌寄託
センター(American Type Collection Center) にATCC番
号３９８０５で寄託されている。
【０３７８】別の方法として、大腸菌１６４５をpHG ５
０及びλｉmm４３４ｃＩ３００３mini Tn １０Δ１６Δ
１７で同時に形質転換し、アンピシリン及びテトラサイ
クリンの双方に耐性のコロニーを選択することにより、
プロファージを導入した。ベクター及びプラスミドに好
適な宿主は、Ａ１６３７，Ａ２６０２，Ａ１５６３，Ａ
１６４５（Ｃ６００ΔＨΔBam ＨＩｒ- ｍ+ gal+ thr
- leu-Bl）又はＡ２０９７（Ａ１６４５ lacΔx Ａ２
１，pro Ｃ::Tn１０）を包含する形質転換に好適な大腸
菌の菌株である。上記と同様にして所望のプロファージ
を全菌株に導入することができる。
【０３７９】pHG 及びbGH 遺伝子の切除により該pHG か
ら誘導され得るベクターは、従来開示されている発現ベ
クターに対して、以下の点を含む多くの利点を有する。
【０３８０】１．プラスミド安定性の改良 プラスミドは、λｉmm４３４ｃＩ- 溶原素を抑制するｃ
Ｉ434 リプレッサ遺伝子を含んでいる。プラスミドが損
失すると、λｉmm４３４ｃＩ- プロファージ誘導により
細菌細胞溶菌が生じる。従って、高価な抗生物質選択系
を使用しなくてもプラスミドは安定的に保たれる。第II
I 表は、ｃＩ434 安定化系を有するプラスミドの高安定
性を示している。
【０３８１】λＰL プロモーターの不耐熱性リプレッサ
ーがＣI であるにも拘らず、ｃＩ434 プラスミド安定化
系は、熱誘導性λＰL プロモータ発現系と同時に利用す
ることができる。
【０３８２】λｉmm４３４ｃＩ- プロファージはいずれ
もλｉmm４３４ｃＩ３００３プロファージと置換できる
ことに留意すべきである。又、任意の抗生物質耐性マー
カを先にmini Tn １０Δ１６Δ１７に導入したテトラサ
イクリン耐性マーカと置換することができる。
【０３８３】λｉmm２１及びλｉmm２２のリプレッサー
マイナス突然変異体が入手できるので、λ４３４系の代
わりにファージ２１又はファージ２２の同等の系を使用
することができる。
【０３８４】２．非常に高い発現レベル このプラスミドは、総細胞蛋白質の４２％という高レベ
ルで大腸菌中に外来蛋白質を発現させることが可能であ
る。この発現レベルは、Ｔ1 Ｔ2 転写終結配列を含まな
い他の同様のλＰL プラスミドについて記載されている
発現レベルよりも高い。
【０３８５】３．転写終結暗号 プラスミドは、λＰL プロモーター及びＣIIリボソーム
結合部位の「下流」に配置されたＴ1 Ｔ2 転写終結暗号
を含んでいる。Ｔ1 Ｔ2 転写ターミネータはＮ修飾RNA
ポリメラーゼの転写を終結させ得るので、このプラスミ
ドを使用する場合に得られる高発現レベルは部分的に、
挿入遺伝子の端部にあるＴ1 Ｔ2 転写ターミネータの存
在に起因し得る。従って、この転写ターミネータは好ま
しくないプラスミド蛋白質のλＰL 制御転写を阻止し、
その結果、所望の蛋白質の相対収量を向上させる。
【０３８６】４．置換可能なリボソーム結合部位 pHG ５０は、リボソーム結合部位の「上流」に位置する
１個のEco ＲＩ部位と、ATG 開始コドンに位置するNde
I 部位1 個とを含んでいる。従って、リボソーム結合部
位は２個の別々の制限部位によりその両端が定められて
いる。このため、プラスミドの他の特徴を変えることな
く、容易に現在のリボソーム結合部位（λＣIIリボソー
ム結合部位）を切除して別のほとんどあらゆる天然又は
合成リボソーム結合部位に置換することができる。こう
して、所望のポリペチドの最適発現が著しく容易にな
る。
【０３８７】５．発現の熱誘導調節 λＰL プロモーターは、ＣI リプレッサーが結合してい
るときは不活性である。ｃＩ８５７リプレッサーは熱感
受性である。即ち該リプレッサーは３０℃ではプロモー
ターに結合するが、４２℃では不活性化する。従って、
発酵温度を４２℃に上昇させることにより、宿主細菌は
所望の蛋白質を産生するように誘導される。
【０３８８】このような系の利点を以下に述べる。
【０３８９】(a) 大腸菌に対して毒性の外来蛋白質が後
期に産生され得るので、発酵プロセス中における初期細
胞死が避けられる。
【０３９０】(b) 蛋白質の過剰産生により蛋白質が安定
化し、蛋白質分解が阻止され得る。（チエン、ワイ・イ
ー他、遺伝子(Cheng,Y.E.,etal.,Gene) （１９８１）１
４，１２１）。従って、λＰL のような厳密に調整され
たプロモーターを使用する「一時的」過剰産生の方が、
連続的低レベル産生よりも好適である。
【０３９１】６．誘導プロトコールの単純化 pHG ５０は約４２℃で誘導され、蛋白質合成期間を通し
て４２℃に保たれる。本願出願人名義の米国特許出願第
５１４１８８号に記載されているpMG １００及びpND ５
から誘導されたプラスミドの誘導プロトコールは、４２
℃で誘導後、３８℃の増殖期間を設けることを定めてい
る。pHG ５０の最適誘導プロトコールは３８℃まで冷却
する段階を必要としないので単純である。
【０３９２】７．高コピー数 プラスミド上に見出されるpHG ５０中のλＰL プロモー
ターは、大腸菌中のλ形質導入ファージベクターよりも
コピー数が多い。従って、発現レベルが向上する。
【０３９３】８．リボソーム結合部位及び開始コドン この発現ベクターは、強力な原核性リボソーム結合部位
(RBS) 及び翻訳開始コドン(ATG) を含んでいる。従っ
て、開始コドンを添加することなくあらゆる真核性遺伝
子がクローン化され得る。更に、高効率のRBS は発現レ
ベルを向上させる。リボソーム結合部位はλＣIIリボソ
ーム結合部位である。リボソーム結合部位の配列を以下
に示す。
【０３９４】
【化１５】
【０３９５】１個の塩基対が、野性型λに見出されるリ
ボソーム結合部位と異なっている。 ９．好適な制限部位 プラスミドから誘導される発現ベクターは、部位内にAT
G 開始コドンを含む１個のNde Ｉ制限部位を有してい
る。従って、所望の遺伝子の適正な配置が可能になる。
該１個のNde Ｉ部位は、リボソーム結合部位のすぐ後に
見出される。
【０３９６】１０．Nut 部位 宿主により供給されるＮ蛋白質は発現ベクター上のNut
部位に結合し、従って、ｔRI部位における転写終結又は
クローン化遺伝子内の早期転写終結を阻止する。
【０３９７】
【表３】
【０３９８】菌株Ａ３１０８及びＡ３１１２に３０℃で
λｉmm４３４Ｉ- mini Tn １０を感染させ、テトラサイ
クリン耐性コロニーを分離した。コロニーを精製し、ア
ンピシリン耐性を試験した。単一のコロニーを選択し、
アンピリン５０μg ／mlを含有するLB培地中で３０℃で
一晩増殖させた。培養株をLB培地で１／１０００に希釈
し、約５×１０8 株／mlに増殖させ、更に別のLBで１／
１０００００に希釈し、一晩増殖させた。LBプレート上
及びアンピシリン５０μg ／mlを含有するLBプレート上
に試料を展開させた。各LBプレートから約５０コロニー
を抽出し、アンピシリンを含有するLBプレート上の増殖
について調査した。その結果、選択されたクローンのプ
ラスミド安定性が確認された。
【０３９９】実施例１９ pHG ５０の増殖 Ｉ．保存培養株 pHG ５０の保存株をカゼイン培地（接種材料の項参照）
上で増殖させた後、凍結培地で２倍に希釈し、−８０℃
で保存した。凍結培地５００ml中の含有成分を以下に示
す。
【０４００】 Ｋ2 ＨＰＯ4 6.3 ｇ ＫＨ2 ＰＯ4 1.8 ｇ クエン酸Ｎａ 0.45ｇ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ 0.09ｇ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 0.9 ｇ グリセロール 44.0 ｇ II．接種材料 カゼイン水解物２０ｇ／ｌ、酵母エキス１０／ｌ及びＮ
ａＣｌ２ｇ／ｌ中で接種材料を増殖させた。振盪フラス
コ内の滅菌培地に保存株を接種し、振盪器上で３０℃及
び約２００r.p.m.で１５時間培養した。必要に応じて撹
拌通気発酵器中で接種材料増殖の後続段階を実施した。
滅菌培地に２−１０％の接種材料を接種し、空気飽和の
２０％を越えるような溶存酸素濃度を保つように撹拌及
び通気しながら３０℃、pH７±0.5 で１５時間培養し
た。
【０４０１】III.産生 産生用培地の含有成分を以下に示す。
【０４０２】 カゼイン水解物 ２０ｇ／ｌ 酵母エキス １０ｇ／ｌ Ｋ2 ＨＰＯ4 2.5 ｇ／ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ １ｇ／ｌ ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ ビチオン 0.1 mg／ｌ チアミン １mg／ｌ 微量元素溶液 ３ml／ｌ 培地にはアンピシリン１００mg／ｌを更に含有させた。
アンピシリンは産生に任意の成分であるが、接種材料の
増殖用として使用される培地中に常に見出される。
【０４０３】ピチオン、チアミン及びアンピシリンの濃
縮溶液をそれぞれ濾過滅菌し、接種以前の滅菌産生用培
地に添加した。滅菌グルコース溶液をまず１０ｇ／ｌま
で添加した。誘導段階で更に１０ｇ／ｌのグルコースを
添加した。
【０４０４】微量元素溶液の含有成分を以下に示す。
【０４０５】 ＦｅＣｌ3 １６ｇ／ｌ ＺｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ １ｇ／ｌ ＣｕＣｌ2 １ｇ／ｌ Ｈ3 ＢＯ3 0.5 ｇ／ｌ 濃ＨＣｌ １００ml／ｌ 培地に 0.5−１０％の接種材料培養株を接種し、３０℃
で培養した。空気飽和の２０％を越えるような溶存酸素
濃度を保つように撹拌通気率を設定した。pHをＮＨ3 で
７±0.2 に維持した。細胞濃度が約3.5 ｇ／ｌ（OD660
＝１０）に達してから誘導を開始した。
【０４０６】温度を４２℃に上昇させ、４２℃を１−５
時間維持した。次に培養株を冷却し、ホルモン精製用に
遠心分離法により細胞を回収した。
【０４０７】実施例２０ ｐ８３００−１０Ａ ｐ８３００−１０Ａ（ATCC番号３９７８５）の構築は第
７図に示され図面の説明中に説明されている。構成多コ
ピー数プラスミドpOP1Δ６（ゲルファンド、ディー・エ
イチ他、ピー・エヌ・エイ・エス（Gelfand,D.H.,et a
l.,PNAS（１９７８）７５，５８６９）；ミュージング
他、細胞(Meusing,et al.,Cell) （１９８１）２４，２
３５−２４２）からプラスミドｐ８３００−１０Ａを誘
導した。同じく第７図に示すｐ７２００−２２をCla Ｉ
で消化し、λＰL プロモーター、bGH 遺伝子及びＴ1 Ｔ
2 配列を含むCla Ｉ−Cla Ｉフラグメントを単離した。
ClaＩ−Cla ＩフラグメントをpOP1Δ６の単一Cla Ｉ部
位に挿入した。（プラスミドｐ７２００−２２は、λＰ
L プロモーターの「上流」のBgl II部位に合成Cla Ｉリ
ンカーを導入させたpSAL５６００−１（第１０図）の誘
導体である。） プラスミドｐ８３００−１０Ａは、約４２℃におけるλ
ＰL プロモーターの誘導後も構成高コピー数表現型を維
持することが認められた。これは、bGH 配列の３′末満
にＴ1 Ｔ2 終結配列が存在することに起因すると思わ
れ、この存在により、pOP1Δ６の複製起点で他のmRNA転
写体に干渉し得るλＰL プロモーターからの長鎖mRNA転
写体が形成されるのを阻止する。
【０４０８】当業者に公知の方法を使用する形質転換に
より、ｐ８３００−１０Ａを大腸菌株Ａ２０９７に導入
した。増殖及び誘導後にこの菌株から、フェニルアラニ
ン形の天然bGH のアミノ末端に付加されたメチオニン残
基を有するウシ成長ホルモンのアナログが産生された。
bGH アナログの産生量は、クーマシー染色エス・ディー
・エス・ポリアクリルアミドゲルの走査により計算した
処、細菌により産生される総蛋白質の約３７−４３％で
あった。菌株の増殖、産生されたbGH アナログの回収、
及びbGH アナログの精製に使用した方法は、実施例２４
でpSAL−１７０／１０について記載する方法と同様であ
る。
【０４０９】実施例２１ 一般用発現ベクターは、bGH 遺伝子の切除によりプラス
ミドｐ８３００−１０Ａ（第７図、ATCC番号３９７８
５）から誘導され得る。こうして誘導されたベクター
は、従来開示の発現ベクターに較べて以下に示すような
多くの利点を有する。
【０４１０】１．著しく高い発現レベル ベクターは、総細胞蛋白質の４４％程度の高レベルで大
腸菌中に外来蛋白質を発現させることが可能である。
【０４１１】２．構成高コピー数 ベクターは、細胞１個当たり約２００−３００コピーの
構成高コピー数を維持する。この点は、低コピー数の他
のλＰL 発現ベクターと区別される。高コピー数は発現
レベルの向上をもたらす。
【０４１２】３．転写終結暗号 ｐ８３００−１０ＡからbGH 配列の切除により得られる
ベクターは、λＰL プロモーター及びＣIIリボソーム結
合部位から「下流」に配置されたＴ1 Ｔ2 転写終結暗号
を含んでいる。高発現レベルの一因は、挿入遺伝子の端
部にＴ1 Ｔ2 転写ターミネータが存在するという点にあ
る。というのは、Ｔ1 Ｔ2 暗号はＮ修飾RNA ポリメラー
ゼの転写を終結させるからである。従って、転写ターミ
ネータは、好ましくないプラスミド蛋白質のλＰL 制御
転写を阻止し、その結果、所望の蛋白質の相対収量を増
加させる。更に、Ｔ1 Ｔ2 転写終結暗号の存在は、プラ
スミドの複製起点を通って続く長鎖mRNA転写体を阻止す
る。従って、高コピー表現型の安定性が向上する。
【０４１３】λＰL プロモーターを含んでいながら転写
終結配列を含まない同様の高コピー数プラスミドは不安
定であり、高コピー数表現型を失い易い。
【０４１４】４．置換可能なリボソーム結合部位 ｐ８３００−１０Ａは、リボソーム結合部位の「上流」
に配置された単一EcoＲＩ部位と、リボソーム結合部位
の「下流」に配置されたNde Ｉ部位とを含んでいる。従
って、リボソーム結合部位は２個の単一制限部位により
その境界が定められている。従って、プラスミドの他の
特徴を変えることなく、容易に現在のリボソーム結合部
位（λＣIIリボソーム結合部位）を切除、かつほとんど
の他のあらゆる天然又は合成リボソーム結合部位と置換
することができる。その結果、所望のポリペプチドの最
適発現が著しく促進される。
【０４１５】５．発現の熱誘導調節 λＰL プロモーターは、ｃＩリプレッサーが結合してい
るときは不活性である。ｃＩ８５７リプレッサーは熱感
受性である。即ち該リプレッサーは３０℃でプロモータ
ーと結合するが、４２℃では不活性化される。従って、
発酵温度を４２℃まで増加させることにより、宿主細菌
は所望の蛋白質を産生するように誘導される。
【０４１６】このような系の利点を以下に述べる。
【０４１７】(a) 大腸菌に対して毒性の外来蛋白質が発
酵プロセスの後期に産生され得るので、早期の細菌死が
避けられる。
【０４１８】(b) 蛋白質の過剰産生により蛋白質が安定
化され、蛋白質分解が阻止される。（チエン、ワイ・イ
ー他、遺伝子（１９８１）１４，１２１）。従って、λ
ＰLのような厳密に調整されたプロモーターを使用する
「一時的」過剰産生の方が、連続的低レベル産生よりも
好適である。
【０４１９】６．誘導プロトコールの単純化 本願明細書及び本出願人名義の米国特許出願第５１４１
８８号中に記載のプラスミドによる蛋白質産生は、熱感
受性ｃＩ８５７リプレッサーにより調節される。
【０４２０】前記米国特許出願中に記載のプラスミドに
必要な誘導プロトコールは、４２℃の誘導後に３８℃で
増殖させることを定めている。一方、プラスミドｐ８３
００−１０Ａ又はpSAL−１３０／１５又はそれらのプラ
スミド誘導体を使用する場合の蛋白質合成の最適誘導で
は、４２℃で誘導後、同一温度、即ち４２℃で増殖を行
った。従って、発酵器を冷却する必要がなくなる。
【０４２１】７．リボソーム結合部位及び開始コドン この発現ベクターは、強力な原核性リボソーム結合部位
(RBS) と翻訳開始コドン(ATG) とを含んでいる。従っ
て、開始コドンを添加しなくてもあらゆる真核性遺伝子
をクローン化できる。更に、高効率のRBS により発現レ
ベルが向上する。リボソーム結合部位はλＣIIリボソー
ム結合部位である。リボソーム結合部位の配列を以下に
示す。
【０４２２】
【化１６】
【０４２３】野性型λに見出されるリボソーム結合部位
とは塩基対１個が異なっている。
【０４２４】８．好適な制限部位 発現ベクターは、部位内にATG 開始コドンを含む単一の
Nde Ｉ制限部位を有している。このため、所望の遺伝子
の適正な配置が可能になる。単一Nde Ｉ部位は、リボソ
ーム結合部位のすぐ後に見出される。
【０４２５】９．Nut 部位 宿主により供給されるＮ蛋白質は、発現のベクター上の
Nut 部位に結合し、その結果、ｔRI部位における転写の
終結又はクローン化遺伝子内における早期転写終結を阻
止する。
【０４２６】菌株 ベクター及びプラスミドに好適な宿主は、Ａ１６３７，
Ａ２６０２，Ａ１５６３，Ａ１６４５（ｃ６００ｒ- ｍ
+ gal+ thr- leu- lac- bl（λｃＩ８５７ΔＨＩΔ
Bam ＨＩ Ｎ+ ））及びＡ２０９７（Ａ１６４５lac Δ
x Ａ２１pro Ｃ::Tn１０）を包含する形質転換に好適な
大腸菌の菌株である。
【０４２７】実施例２２ pSAL−１３０／５ pSAL−１３０／５の構築は第８図に示され図面の説明中
に説明してある。met-phe bGH 遺伝子をmet-asp-gln bG
H 遺伝子に置換することにより、ｐ８３００−１０Ａ
（ATCC番号３９７８５）からpSAL−１３０／５を得た。
met-asp-gln bGH遺伝子は、Ned Ｉ及びHind III消化に
よりプラスミドpHG ４４（第６図）（ATCC番号３９８０
６）から得た。
【０４２８】当業者に公知の方法を使用する形質転換に
より、pSAL−１３０／５を大腸菌菌株Ａ１６４５に導入
した。この菌株は、増殖及び誘導後、フェニルアラニン
形の天然bGH のＮ末端に付加されたアミノ酸配列met-as
p-gln を有するウシ成長ホルモン(bGH) のアナログを産
生した。pSAL−１３０／５により産生されたbGH アナロ
グの量は、クーマシー・ブルー染色エス・ディ・エスポ
リアクリルアミドゲルの走査により計算した処、細菌に
より産生される総蛋白質の約３９−４４％であった（第
Ｉ表）。菌株の増殖、産生されたbGH アナログの回収、
及びbGH アナログの精製に使用した方法は、実施例２４
でpSAL−１７０／１０について記載する方法と同様であ
る。
【０４２９】実施例２３ pSAL−１７０／１０ pSAL−１７０／１０の構築は第８図に示され図面の説明
中に説明されている。
【０４３０】公知方法を使用する形質転換によりpSAL−
１７０／１０を大腸菌菌株Ａ１６４５に導入した。この
菌株は、増殖及び誘導後、フェニルアラニン形の天然bG
H のアミノ末端に加えられたアミノ酸配列met-asp-gln
を有するbGH のアナログを産生する。pSAL−１７０／１
０により産生されたbGH アナログの量を、クーマシー染
色エス・ディー・エス・ポリアクリルアミドゲルの走査
により計算した処、細菌により産生される総蛋白質の約
４０−４６％であった（第Ｉ表）。
【０４３１】実施例２４ pSAL−１７０／１０の増殖 Ｉ．保存培養株 pSAL−１７０／１０の保存株をカゼイン培地（接種材料
の項参照）上で増殖させた後、凍結培地で２倍に希釈
し、−８０℃で保存した。凍結培地５００ml中の含有成
分を以下に示す。
【０４３２】 Ｋ2 ＨＰＯ4 6.3 gr ＫＨ2 ＰＯ4 1.8 gr クエン酸Ｎａ 0.45gr ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ 0.09gr （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 0.9 gr グリセロール 44.0 gr II．接種材料 カゼイン水解物２０ｇ／ｌ、酵母エキス１０ｇ／ｌ及び
ＮａＣｌ2 ｇ／ｌ中で接種材料を増殖させた。振盪フラ
スコ内の滅菌培地に保存培養株を接種し、振盪器上で３
０℃及び約２００r.p.m.で１５時間培養した。必要に応
じて撹拌通気発酵器内で接種材料増殖の後続段階を実施
した。滅菌培地に２−１０％の接種材料を接種し、空気
飽和の２０％を越えるような溶存酸素濃度を保つように
撹拌及び通気しながら３０℃、pH７±0.5 で１５時間培
養した。
【０４３３】III.産生 産生用培地の含有成分を以下に示す。
【０４３４】 カゼイン水解物 ２０ｇ／ｌ 酵母エキス １０ｇ／ｌ Ｋ2 ＨＰＯ4 2.5 ｇ／ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ １ｇ／ｌ ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ ビチオン 0.1 mg／ｌ チアミン １mg／ｌ 微量元素溶液 ３ml／ｌ 培地には、更にテトラサイクリン12.5mg／ｌを含有させ
た。テトラサイクリンは産生に任意の成分であるが、接
種材料の増殖用に使用される培地中に常に見出されるも
のである。
【０４３５】ピオチン、チアミン及び抗生物質の濃縮溶
液をそれぞれ濾過滅菌し、接種以前の滅菌産生用培地に
添加した。滅菌グルコース溶液をまず１０ｇ／ｌまで添
加した。誘導段階で更に１０ｇ／ｌのグルコースを添加
した。
【０４３６】微量元素溶液の含有成分を以下に示す。
【０４３７】 ＦｅＣｌ3 １６ｇ／ｌ ＺｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ １ｇ／ｌ ＣｕＣｌ2 １ｇ／ｌ Ｈ3 ＢＯ3 0.5 ｇ／ｌ 濃ＨＣｌ １００ml／ｌ 培地に0.5 −１０％の接種材料培養株を接種し、３０℃
で培養した。空気飽和の２０％を越えるような溶存酸素
濃度を保つように撹拌通気率を設定した。pHはＮＨ3 で
７±0.2 に保った。細胞濃度が約3.5 ｇ／ｌ（OD660 ＝
１０）に達してから誘導を開始した。
【０４３８】温度を４２℃に上昇させ、４２℃を１−５
時間維持した。次に培養株を冷却し、ホルモン精製用に
遠心分離法により細胞を回収した。
【０４３９】bGH の回収 ポリトロン（キネマテイカ）混合機を使用し、発砲を最
小にするように混合機の速度を調節しながら、５０mMリ
ン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4) 、５０mM EDTA及び１０
０ mM ＮａＣｌを含有する溶液５容量中に細菌細胞１３
kg（湿潤ケーキ）を懸濁させた。均質懸濁液を８０ｌ／
時で連続的にダイノミル細胞破砕器ケー・ディー・５
（ウイリー・エイ・バシヨフエン、バーゼル）中に通過
させ、破砕細胞の均質懸濁液をシー・イー・ピー・エイ
・１０１遠心機内で４５ｌ／時の流量で遠心分離により
清澄化させた。遠心分離段階から得られた沈殿物を収集
し、５０mM EDTA を含有する５０mMリン酸ナトリウム緩
衝液(pH7.4) 15.5l 中に再懸濁させた。最終濃度が0.05
mg／mlになるまでリゾチームを添加し、懸濁液を３７℃
で１６時間インキュベートした。最終濃度が１％になる
までトリトン・エックス・１００を添加した。次に懸濁
液を室温で３０分間インキュベートし、連続フローセル
音波処理器（熱システム）内で１８ｌ／時で音波処理
し、シー・イー・ピー・エイ・１０１遠心機内で遠心分
離した。沈殿物を収集し、５０mMリン酸ナトリウム緩衝
液(pH7.4) に再懸濁させ、上記同様に音波処理し、シー
・イー・ピー・エイ・１０１遠心機内で遠心分離した。
５０mM EDTA 及び１００ mM ＮａＣｌを含有する５０mM
リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)15.5 ｌ中に細胞を再懸
濁させ、２度沈殿させ、蒸溜水 15.5 ｌ中に再懸濁させ
た。遠心分離により沈殿物を収集し、−２０℃で保存し
た。
【０４４０】bGH の精製 沈殿物を蒸溜水３０−４０ｌ中に再懸濁させ、0.5 Ｎ
ＮａＯＨの滴定によりpH11.8として可溶化させた。次に
溶液を連続的に音波処理し、必要に応じてシー・イー・
ピー・エイ・１０１遠心機内で遠心分離により清澄化さ
せるか又はワットマンNo．１濾紙で濾過した。
【０４４１】清澄化蛋白質溶液（２８０nmでOD＝２９７
０００の溶液32.6l ）を、それぞれ５００００−６００
００ODの各部分（６×5.4 ｌ）に分割した。各面積５ft
2 の３個の１０００００分子量カットオフカセット（ビ
ー・ティー・エイチ・ケー型）を備えるミリポア・ペリ
コン限外濾過器で各部分をそれぞれ限外濾過した。5.4
ｌ部分を１ｌの保持物容量まで濃縮した。限外濾過物を
収集し、保存した。保持物をpH11.8の別の１０mMホウ酸
塩緩衝液で当初の容量まで希釈し、十分混合した。保持
物容量が１ｌになるまでバッチを更に濃縮した。限外濾
過物を収集し、最初の限外濾過物と混合した。限外濾過
物中のODの経常合計値が、限外濾過器に最初にチャージ
したODの２０％になったら、次の濃縮段階の保持物容量
を１ｌでなく0.5 ｌとした。0.5 ｌの保持物容量からの
限界濾過物の２８０nm（１cmセル）における吸光度が0.
1 より小さくなるまで濃縮及び１０mMホウ酸塩緩衝液に
よる希釈サイクルを継続した。一般に濃縮及び希釈サイ
クルは９から１２サイクルとした。最終保持物を排出し
た。
【０４４２】全限界濾過物を混合し、６Ｎ ＨＣｌでpH
9.0 に調整した。別の5.4 ｌ部分を同様に限界濾過し、
pHを調整された全限界濾過物を混合した。代表的な一工
程から、OD＝１０００００に相当する吸光度0.26の限界
濾過物総量３８０ｌが産生され、所要時間は２４から４
０時間であった。
【０４４３】１００Ｋ限界濾過段階からの混合された限
界濾過物（２８０nmでOD＝１０００００の濾過物３８０
ｌ）を、線流速２３cm／時（２５ｌ／時）でセファロー
ス・シー・エル・６・ビー・ディー・イー・エイ・イー
・イオン交換カラムに通した。直径３７cm、高さ１５cm
のカラムを、pH9.0 の１０mMホウ酸塩緩衝液２床容量
（３２Ｌ）で洗浄した。充填及び洗浄段階から得た溶出
液を廃棄した。溶離液を段階的に１０mMホウ酸塩、１０
０mM塩化ナトリウム、pH９に変化させ、bGH をカラムか
ら排出させた。溶出流速は２３cm／時であった。２８０
nmにおける溶出液の吸光度を追跡することにより工程の
進行を監視した。bGH ピークを４から５床容量（２８０
nmでOD＝４３０００の容量８４ｌ）収集した後、１００
００分子量切断カセットを備えるミリポア・ペリコン限
界濾過装置を使用して約１０mg／mlに濃縮した。次に溶
液を凍結乾燥した。収量は純粋bGH 約７０ｇであった。
【０４４４】実施例２５ pSAL−１７０／１０により産生されるbGH アナログの活
性 １．bGH アナログ及び天然bGH 間のラジオイムノアッセ
イ比較 リン酸塩で緩衝した食塩水（１％BSA ）を用いて１００
ng／mlのbGH アナログを含む溶液を調製した。この溶液
を５０，２５，12.5，6.25，3.12，1.56及び0.78ng／ｌ
の濃度に逐次希釈した。これら溶液の0.1ml アリコート
を夫々一対ずつ用意し、二抗体法を用いるRIA にかけ
た。希釈曲線は天然bGH の場合とほぼ同じであった。
【０４４５】２．放射線受容体結合アッセイ トレーサとしての 125Ｉ− bGHとカリブレーション曲線
を形成するための真正bGH 溶液とを使用し、ツシマ，テ
ィー（Tushima,T.）及びフライセン，エッチ・ジー（Fr
eisen,H.G.）の方法（ワイ．シン(Y.Chin.) ，内分泌物
代謝(Endocr.Metab.) （１９７３年），３７；３）に従
ってウサギ肝臓膜での放射線受容体結合アッセイ(radio
receptor binding assay) を行なった。試料を各３部ず
つ０．３ｍｌのアッセイ緩衝液（５０ｍＭのトリス，１
５mMのＣａＣｌ2 及び５mg／mlのウシ血清アルブミン，
pH7.6 ）中で室温で２時間インキュベートした。管には
125Ｉ−bGH （２０，０００cpm の３０〜６０μＣi ／
μg 試料）、１５０〜２５０μgの肝臓膜タンパク質及
び天然bGH （１〜１００ng）又はバクテリアbGH 抽出物
のいずれかを入れた。アッセイの結果このbGH アナログ
のbGH 活性は天然bGH に比肩することが判明した。
【０４４６】３．脛骨テスト 実施例５に従いバクテリア細胞から回収したpRO １２産
生bGH アナログの生物学的活性を脛骨テストにより測定
した（パーロー，エー・エフ(Parlow,A.F.) 他，内分泌
学(Endocrinology) （１９６５年）７７：１１２６参
照）。ラットを生後２８〜３０日で下垂体切除し、その
後無処理で１０〜１４日間放置した。ウシ下垂体又は組
換え体大腸菌（Escherichia Coli）から得たウシ成長ホ
ルモンをpH10.0の0.15Ｍ ＮａＣｌ＋0.01Ｍホウ酸塩に
溶解した。ラット（４〜７匹／グループ）にbGH 溶液
（0.2cc で５〜１２５μg ／日）を５日間毎日皮下注射
し、その間食餌は普通に与えた（プリナ ラット チャ
ウ(Purina Rat-Chow) 及び任意に水）。６日目にラット
を殺して前脚膝骨を取り出し、長手方向に切断し、アセ
トンで固定し且つ２％ＡｇＮＯ3 で染色した。解剖用双
眼顕微鏡（ニコン）での観察により骨端板の幅を測定し
た。平均値（４０記録／ラット）を用いて長い用量−応
答曲線を形成した。テストの結果pSAL−１７０／１０産
生bGH アナログのbGH 活性は天然bGH と比肩することが
判明した。
【０４４７】実施例２６ 実施例３のSOD 宿主−ベクター系により産生されるヒト
超酸化物ジスムターゼの収率及び活性は前記宿主−ベク
ター系の成長条件の改変により向上し得る。下記のデー
タが示すように、前記宿主−ベクター系の成長培地にＣ
ｕ及び／又はＺｎを補足すると活性ダイマー形状の前記
酵素の収率が増大する。
【０４４８】バクテリア含有pSODβ 1 Ｔ 11の成長 Ｉ．保存培養株 保存培養pSODβ1 Ｔ11をカゼイン培地（接種材料の項参
照）で成長させ、次いで凍結用培地(freezing medium)
で２倍に希釈し−８０℃で保存した。前記凍結用培地の
組成は次の通りである。
【０４４９】 Ｋ2 ＨＰＯ4 6.3 ｇ／５００ml ＫＨ2 ＰＯ4 1.8 ｇ／５００ml クエン酸Ｎａ 0.45ｇ／５００ml ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ 0.09ｇ／５００ml （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 0.9 ｇ／５００ml グリセロール ４４ｇ／５００ml II．接種材料 接種材料を２０ｇ／ｌのカゼイン水解物、１０ｇ／ｌの
イースト抽出物及び２ｇ／ｌのＮａＣｌ中で増殖させ
た。シェークフラスコ内の無菌培地に保存培養物を接種
し、シェーカー内３０℃で且つ約２００r.p.m.で１５時
間インキュベートした。必要に応じ、接種材料増殖過程
におけるその後のステップは撹拌曝気発酵槽中で実施し
た。無菌培地に２−１０％のフラスコ培養物を接種し、
溶存酸素レベルを２０％空気飽和以上に保持すべく撹拌
及びアエレーションを行ないながらpH７±0.5 ，３０℃
で１５時間インキュベートする。
【０４５０】III.産生 産生培地は下記の物質を含む。
【０４５１】 カゼイン水解物 ２０ｇ／ｌ イースト抽出物 １０ｇ／ｌ Ｋ2 ＨＰＯ4 2.5 ｇ／ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ １ｇ／ｌ ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ ビチオン 0.1 mg／ｌ チアミン １mg／ｌ トレース元素溶液 ３ml／ｌ テトラサイクリン 12.5 mg／ｌ 幾つかの実験では次の成分も加えた。
【０４５２】 ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ 0.8 ｇ／ｌ ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ １０mg／ｌ 濃縮溶液状のビオチン、チアミン及びテトラサイクリン
は別個にフイルタ滅菌処理し、接種前の無菌産生培地に
加えた。無菌グルコース溶液を最初に１０ｇ／ｌとなる
ように加えた。誘導(induction) ステップで更に１０ｇ
／ｌのグルコースを加えた。
【０４５３】トレース微量元素溶液は下記の成分を含
む。
【０４５４】 ＦｅＣｌ3 １６ｇ／ｌ ＺｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ １ｇ／ｌ ＣｕＣｌ2 １ｇ／ｌ Ｈ3 ＢＯ3 0.5 ｇ／ｌ 濃ＨＣｌ １００ml／ｌ この培地に0.3 −１０％の接種材料培養物を接種し、３
０℃でインキュベートする。撹拌−通気は溶存酸素レベ
ルを２０％空気飽和以上に維持すべく調整する。pHはＮ
Ｈ3 で７±0.2 に維持する。細胞濃度が約3.5 ｇ／ｌ
（OD660 ＝１０）に達すると誘導が開始される。
【０４５５】温度を４２℃に上げ、１−５時間４２℃に
維持する。次いで培養物を冷却し、細胞を遠心分離によ
り回収することによって酵素精製用とする。
【０４５６】SOD の回収 ポリトロン(Polytron)ブレンダー（キネマチカ）を用
い、起泡を最小限に抑えるべく速度調整しながら1.5kg
のバクテリア細胞（ウェットケーキ）を１２ｌの５０mM
リン酸ナトリウム(pH7.8) に懸濁させる。この均質懸濁
液をダイノミル細胞破砕器(Dynomill cell disrupter)
KD５（ウイリー，エー。バシヨフエン，バーゼル（Will
y,A.Bachofen,Basel）に連続的に通す。連続フローセル
（エン，バーゼル（Willy,A.Bachofen,Basel）に連続的
に通す。連続フローセル（continuous flow cell）を使
用して該破砕細胞均質懸濁液を超音波処理し、CEPA１０
１遠心分離器で分離処理する。上澄みを２時間６５℃に
加熱し、冷却後前述の如く遠心分離にかける。１０，０
００分子量カットオフカセット（PTGCタイプ）を用いる
ミリポア ペリコン（Millipore Pellicon）限外濾過装
置で前記の透明な上澄みを１ｌまで濃縮する。この濃縮
されたタンパク質溶液を１５０mMリン酸ナトリウム緩衝
液(pH7.8) で平衝化したDEAE−セファセル（Sephacel）
カラム（２kgのDEAEセファセル）に通す。通過溶液を回
収し濃縮してペリコン限外濾過器によりpH7.8 の２０mM
トリス−ＨＣｌに対して透析し、その後２０mMトリス−
ＨＣｌ緩衝液で平衝化したQAE −セファローズ(Sepharo
se) カラムに通す。このカラムをpH7.8 の２０mMトリス
−ＨＣｌ緩衝液と塩グラジエント（０〜２００ mM Ｎａ
Ｃｌ）とで展開する。SOD 含有分画を集め、ペリコン限
外濾過装置を用いて濃縮し、蒸留水に対して透析し、そ
の後pH4.8 の１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液を加えて１００
mM酢酸ナトリウムにする。このタンパク質溶液をpH4.7
の１００mM酢酸ナトリウムで平衝化したＣＭ−セファロ
ーズカラムで更に分離処理する。同一の緩衝液と塩グラ
ジエント（１００〜５００ mM ＮａＣｌ）とを用いて前
記カラムを展開する。SOD 含有分画を集め、ペリコン限
外濾過装置を用いて濃縮し、凍結乾燥する。
【０４５７】実施例２７ バクテリアにより産生されるSOD の酵素活性 標準的成長条件（即ちＣｕＳＯ4 を補足しない）では実
施例２６のバクテリアにより産生される精製ヒトSOD
（hSOD）はウシＣｕ／ＺｎSOD と比べて５％の酵素活性
しか示さなかった。金属含量分析の結果、該酵素はＣｕ
を予定値の８％に過ぎない極めて少量しか含まないこと
が判明した。更に、該タンパク質はＺｎを必要量のほぼ
２倍も含んでいることから、大部分のＣｕ++部位がＺｎ
イオンにより置換されているものと考えられる。
【０４５８】これに対し、バクテリア産生hSODから製造
される金属を全く含まないアポプロテインは溶液中で再
構成（reconstitute）すると本質的に完全な酵素活性を
回復する。この溶液はＣｕ++及びＺｎ++を双方共モル活
性部位当り1.2 モルの濃度で含む（表IV参照）。
【０４５９】前述のデータは細胞内Ｃｕ++濃度が限定さ
れており、産生されたhSODを飽和するには不十分である
ことを示唆している。
【０４６０】一連の実験から、成長培地のＣｕ++濃度を
増加するとhSODの比活性が増加することが判明した。実
際、２００ppm Ｃｕ++を補足したカゼイン水解物（実施
例２６）中で増殖した大腸菌は誘導後天然金属組成と十
分な酵素活性とをもつ極めて活性の高いhSODを産生した
（表IV参照）。更に実験を続けた結果、添加される外因
性Ｃｕ++が５０〜２５０ppm であると同様の効果が得ら
れることが判明した。７５ppm のＣｕ++を補足したLB
（ルリアブロス(Luria Broth) ）培地でも同様の効果が
観察された。
【０４６１】
【表４】
【０４６２】Ｃｕ++及びＺｎ++を補足しない培地を使用
した。
【０４６３】hSOD2 は実施例２６に従い製造。
【０４６４】Ｃｕ++及びＺｎ++を補足した培地を使用し
た。
【０４６５】基準としてウシ血清アルブミンを使用し、
ロウリー(Lowry) の方法によってSOD 濃度を測定した
（ローリー，オー・エッチ（Lowry,O.H.），ローズブロ
ー，エヌ・ジェー(Rosebrough N.J.) , ファー，エー・
エル(Farr,A.L.) 及びランドール，アール・ジェー(Ran
dall R.J.), 生物学化学誌（J.Biol.Chem.）, １９３，
２６５〜２７５（１９５１年）参照）。フエリシトクロ
ム−ｃの還元阻止を検査すべく、マッコード（McCord）
及びフリドビッチ（Fridovich ）の方法で活性測定を行
なった（マッコード，Ｊ．Ｍ．及びフリドビッチ，I.,B
iol.Chem誌，２４４，６０４９−６０５５（１９６９
年）参照）。原子吸収により精製SOD 試料のＣｕ及びＺ
ｎ含量を測定した。ウィーザー(Weser) 及びハートマン
(Hartman) に従ってSOD アポ酵素を製造し（ウィーザ
ー，Ｕ．及びハートマン，Ｈ．ｊ．,FEBS レター（FEBS
Lett.）, １７，７８−８０（１９７１年）参照）、Ｃ
ｕ及びＺｎの同時添加によって再構成した（ジュウェッ
ト，エス・エル(Jewett,S.L.) ,ラトレンタ，ジー・エ
ス(Latrenta,G.S.) 及びベック，シー・エム(Beck,C.
M.), 生化学生物物理学誌（Arc.Biochem.Biophys.）２
１５，１１６−１２８（１９８２年）参照）。
【０４６６】実施例２８ バクテリア産生hSODのアミノ末端配列 実施例２６に従い製造した精製SOD のアミノ末端の５つ
のアミノ酸の配列をエドマンデグラデーション（Edmann
degradation）により検査した。このアミノ酸配列はヒ
トＣｕ／ＺｎSOD のＮ末端と同一、即ちAla-Thr-Lys-Al
a-Val である。これは該バクテリア産生物の真正を立証
するものである。従って可溶性hSODはＮ末端メチオニン
を除去する大腸菌処理酵素を受入れ易いと考えられる。
【０４６７】論 考 我々は、LB又はカゼイン水解物培地で成長すると多量の
hSODを産生すべく誘導されるバクテリアが酵素活性をも
たないタンパク質を産生することを確認した。このよう
にして産生されたタンパク質は再構成と消失Ｃｕ++，Ｚ
ｎ++イオンの補足とによって活性化することができる。
意外なことに、このバクテリアはＣｕ++を補足した培地
で成長させると酵素活性をもつhSODを産生すべく誘導さ
れ得る。理論として決めつけるつもりはないが、我々は
肥沃培地（例えばLB及びカゼイン水解物）の或る種の成
分が有効銅の大部分と結合してキレートを形成し、その
ためバクテリアが高レベルで産生されるSOD 分子の全て
の部位を満たす程十分な遊離銅を持たないのだと考え
る。培地に５０〜２５０ppm のＣｕ++イオンを加える
と、バクテリア内部のＣｕ++イオン濃度は明らかに増加
し、過剰産生されるヒトＣｕ／ＺｎSOD に必要な全ての
Ｃｕ++を提供するに十分なレベルに到達する。
【０４６８】実施例２９ 組換型ヒト超酸化物ジスムターゼによる全体的虚血後の
再灌流傷害の減少 実施例３の如く大腸菌Ａ１６４５内の宿主−ベクター系
pSODβ1 Ｔ11により産生し、実施例２６の条件下で成長
させ且つ精製したヒト超酸化物ジスムターゼは全体的虚
血後の再灌流傷害（損傷）を減少させることが判明し
た。
【０４６９】摘出し灌流したウサギ心臓 1.2 〜2.0 kgの雌ニュージーランド白ウサギをヘパリン
化し、麻酔をかけて心臓を取出し、低温（４℃）灌流液
中に即刻配置した。上行大動脈にカニューレを挿入し、
１１７mM塩化ナトリウム、６mM塩化カリウム、3.0 mM塩
化カルシウム、1.0mM 硫酸マグネシウム、0.5mM EDTA及
び16.7mMグルコースを含み最終pHが約２４mMの炭酸水素
ナトリウムの添加により7.40に調整された改質クレブス
−リンガーズ(Krebs-Ringers) 緩衝溶液により一定圧力
（水１１０cm）下でこれら心臓の灌流を行なった。前記
灌流液には９５％の酸素及び５％の二酸化炭素で連続的
に気泡を与えた。真空吸引によりNMR 試料管から冠状流
(coronary flow) を除去した。飽和塩化カリウムに浸漬
しポリエチレン管に入れてグラス(Grass) SD−９ステイ
ミュレータに接続したガーゼ（wick）を用い、右心室ペ
ーシングによってこれらの心臓に１７５指動／分のペー
スを与えた。左心室収縮機能を定量すべく、空気泡を入
念に除去し３路ストップコックを介してステイサム(Sta
tham) Ｐ２３Db変換器に接続した長さ１００cmのPE１９
０管の先端にラテックスラバーバルーンを取付けた。等
容量圧(isovolumic pressure) をブラッシュ(Brush) ２
チャネル直接書込みレコーダにより記録した。前記バル
ーンは注入器により１０mmHgの末端拡張期圧を得るに足
る十分な量の食塩水を注入して膨満させた。発生圧力の
以後の測定はこの末端拡張期圧で行った。全ての心臓を
３０分間全体的虚血状態におき、その間温灌流液を周囲
に流すことにより３７℃に保持した。灌流線のクロスク
ランピングにより大動脈流入を完全に遮断した。前記虚
血時間終了後４５分間の正常温度再灌流（３７±２℃）
を行なった。左心室に発生する圧力の回復を虚血前対照
のパーセンテージとして計算した。虚血開始時にはバル
ーンを収縮させペーサーを切断した。再流（reflow）開
始１５分後、第１回目の機能測定直前にバルーンを虚血
時に除去した量と同量だけ再膨満させた。虚血の前と、
再流後５分の時点と、再灌流開始後１５分，３０分及び
４５分の時点とにおいて真空吸引により冠状血液流の体
積測定を行なった。
【０４７０】核磁気共鳴法 内径の大きい超伝導磁石内で4.23テルサ（Telsa ）でブ
ラッカー(Brucher) WH１８０スペクトロメータによりリ
ン−３１NMR スペクトルを得た。この磁界強さでは前記
リンは72.89MHzで共鳴する。リンプローブの直径は２５
mmである。この道具はパルス状フーリエ変換モードで作
動させ、ノコレット(Nocolet) １２８０コンピュータと
インタフェース接続させた。データは高密度磁気ディス
クに記録した。超伝導磁石の磁界は安定しているため磁
界／周波数ロックは不要である。２秒間隔で送出される
４５°パルスに続く過渡電流から５分間プロトン減結合
スペクトル（five minute proton decoupled spectra）
を集めた。これらはスペクトル飽和を最小にするための
既に立証された条件である。
【０４７１】データは３，０００Hzのスペクトル幅で２
Ｋテーブルを用いて保持した。
【０４７２】NMR スペクトルに基づく組織細胞内pHの測
定 細胞内pHの測定値は次の方程式 pH1 ＝pK−log （δＯ−δＢ／δＡ−δＯ） により無機リン酸塩ピークの化学シフト（δＯ）から求
められる。
【０４７３】組織異種効果（tissue inhomogeneity eff
ects）を最小限に抑えるべく、化学シフト値はこれらの
研究で見られるpH範囲内では比較的低いpH依存度を示す
ホスホクレアチンの共鳴に関して測定した（pKA ＝4.6
）。この方程式で使用する定数は既に知られているよ
うにpK＝6.90, δＡ＝3.290PPM及びδＢ＝5.805PPMであ
る。
【０４７４】NMR スペクトルに基づく代謝産物の定量 コンピュータで決定される標準化定数又は規準化ファク
タを考慮に入れて個々のピーク下の面積をプラニメータ
測定することにより組織のホスホクレアチン（ＰＣ
ｒ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及び無機リン酸塩
（Ｐｉ）を測定した。面積積分の実施にはヒューレット
−パッカード(Hewlett-Packard) デジタル化装置を使用
した。このようにして得られるPCr 、ATP 及びPiの定量
データは虚血前対照含量のパーセントテージとして表わ
される。
【０４７５】実験プロトコール １７個の心臓を次の２グループに分割した。
【０４７６】グループＩ （ｎ＝８）このグループの心
臓は６０，０００単位のヒト組換型超酸化物ジスムター
ゼ（hSOD, 比活性３，２００IU/mg ）を１０mlの濃縮塊
(bolus) として再流の直前に投与し、次いで再流の最初
の１５分間の間６０，０００単位を連続注入することに
より処理した。hSODは３７℃のクレブス−リンガーズ重
炭酸塩灌流液に溶解した。
【０４７７】グループII （ｎ＝９）このグループの心
臓には再流の直前に１０mlの灌流液濃縮塊を投与し、次
いで正常温度再灌流を行なった。
【０４７８】結 果左心室機能の回復 この研究で使用した虚血実験モデルは中程度のひどさの
回復不能傷害を受け且つ治療によって改善する可能性を
保持するような心臓を得るべく一連の予備研究に基づい
て特別に選択したものである。４５分間の再流終了後の
左心室機能回復は（対照発生圧力のパーセンテージとし
て測定）対照グループの場合４７±５％であり、末端拡
張期圧は４８±７mmHgであった（１０mmHgの虚血前対照
値と比較）。これらのパラメータは３０分間及び４５分
間の再灌流の間に余り変化しなかった。これは比較的安
定した回復状態が得られたことを意味する。再流直前と
最初の１５分間の再灌流の間とにhSODを投与した結果、
心臓機能保存状態が著しく改善され、対照心臓と比較し
て末端拡張期圧の増加が減少した。hSODで処理した心臓
は対照発生圧力の７１±６％を回復し、末端拡張期圧は
僅か２７±４mmHgであった（いずれも対照に対し、Ｐ＜
0.01）。
【０４７９】虚血の間及びこれに続く再灌流の間の心筋
代謝 心筋の高エネルギーリン酸塩含量を対照心臓及びhSOD処
理心臓に関して虚血の間及びその後の再灌流の間に順次
測定した。３０分間の虚血期間では心筋クレアチンホス
フエート及びATP 含量の漸減が観察された。ホスホクレ
アチン含量は虚血期間終了までに対照心臓では虚血前基
線量値の８±３％に減少し、hSOD処理心臓では対照の１
０±５％に減少した。ATP 含量は対照心臓では基線量の
３６±６％に達し、hSOD処理心臓では３３±６％に達し
た。これらのデータは２つのグループの心臓がいずれも
同程度の虚血を受けたことを明示している。これらのデ
ータはまた、メカニズム制御されないものによって細胞
代謝が虚血期間の間より良く保存されるがために、hSOD
受容心臓がより良い機能回復を示したという可能性を否
定する。
【０４８０】４５分間の再流後にhSOD処理心臓がほぼ正
常なホスホクレアチン含量（対照の９３±９％）を示し
たのに対し、対照心臓は元の値の６９±７％しか回復し
なかった（Ｐ＜0.05）。この再流期間終了時のATP 含量
はどちらのグループの心臓でも同等であった（対照心臓
では４１±４％、hSOD処理心臓では４２±５％）。この
ATP 含量に関する結果は、高エネルギーリン酸塩産生率
を増加させる能力が制限されている場合に心臓がより良
い左心室機能回復を得るにはより多くのエネルギーを必
要とすることを示唆していると考えられる。これに対し
対照心臓のより低い機能回復は高エネルギーリン酸塩代
謝産物のより低い使用度につながり、場合によってはエ
ネルギー生産のより厳しい制限さえ遮蔽し得る。
【０４８１】結論としてこれらのデータは、中程度の虚
血傷害を受け次いで再灌流処理される心臓では、再灌流
の前と初期とにhSODを投与すると収縮機能及び拡張機能
がより良く回復し且つ心筋のホスホクレアチン含量が増
加することを示している。これらのデータはまた、虚血
心筋の再灌流の結果構造的及び／又は機能的損傷成分が
生じるが、この成分は再灌流時にhSODの如き酸素遊離基
スカベンジャーを投与すれば除去又は減少し得ることも
示唆している。従って虚血心筋の再酸素付加に起因する
前記再流傷害成分を抑制することにより、hSODは急性心
筋梗塞後早期に治療を受ける患者の血栓融解療法及び／
又は冠状血管形成に加えて更に別の利益をもたらし得
る。
【０４８２】実施例３０ 再灌流中の組換型ヒト超酸化物ジスムターゼ投与による
実験的梗塞サイズの縮小 実施例３に記載の大腸菌Ａ１６４５中のｐSOD β1 Ｔ11
宿主−ベクター系により産生され、実施例２６の条件で
成長及び精製したヒト超酸化物ジスムターゼは心臓の梗
塞サイズを縮小させることが判明した。
【０４８３】虚血性心筋の時を得た再灌流は梗塞サイズ
（IS）を縮小せしめる。しかしながらこの有益な効果
は、有害酸素遊離基の発生により媒介される再流傷害の
同時発生によって低減し得る。組換型ヒト超酸化物ジス
ムターゼ（hSOD）による遊離基の除去が再灌流のみの場
合と比較してISを縮小させる結果をもたらし得るか否か
をテストすべく、１６匹のイヌに麻酔をかけ、どの辺縁
枝よりも手前で回旋冠動脈を９０分間閉塞した。再灌流
時にこれら動物にhSOD（４００，０００単位を濃縮塊と
して左心房投与し、次いで３００，０００単位を１時間
静脈内注入；ｎ＝８）又は同量の食塩水（対照，ｎ＝
８）を投与した。胸部を閉鎖して動物を回復させた。４
８時間後にこれら犬を殺し、一般病理学によるISの測定
と死後血管造影法による危険領域の測定とを行なうべく
心臓を盲検法(blinded fashion) で処理した。回旋動脈
を中心に近い方で閉塞した結果、対照グループでは左心
室（LV）の40.8＋2.3 ％、処理グループでは41.8＋2.0
％が虚血状態になった。対照グループのイヌでは再灌流
に伴い危険領域52.2＋７％の梗塞が生じた。これに対し
hSOD処理は壊死を著しく減少させ、ISは危険領域が33.6
＋2.1 ％であった（Ｐ＜0.05）。対照動物では危険領域
の大部分に亘って広がる壁を越えない（non-transmura
l）融合性梗塞が発生したのに対し、処理動物ではより
不統一（patchy）な非融合性梗塞が現われた。結論すれ
ば、再灌流時に投与されるhSODによる遊離基除去は、恐
らくは再流傷害の回避によって、壊死の規模を著しく縮
小させた。
【０４８４】実施例３１ 低温保存虚血腎臓の再灌流傷害の媒介における酸素遊離
基の役割 1 最近の指摘によれば、ヒト超酸化物ジスムターゼは臓器
移植後の再灌流傷害を減少させ得る。次の実施例は腎臓
移植後の再灌流に伴う障害が前記超酸化物ジスムターゼ
により改善されることを示す。この実施例で使用したヒ
ト超酸化物ジスムターゼは実施例３の大腸菌Ａ１６４５
中のｐSOD β1 Ｔ11宿主−ベクター系により産生され、
実施例２６の条件で成長させ且つ精製したものである。
【０４８５】この実施例で括弧内に記されているアラビ
ア数字は該実施例の後の参考文献表に列挙されている文
献を示す。
【０４８６】ブタにおける腎臓の保存及び移植虚血のモ
デル 体重１５〜１８kgの異系交配雌ブタをアセプロマジン及
びアトロピンで薬剤前処理し、ケタミン及びハロタンで
麻酔した。１５００ccのリンガー乳酸塩(Ringers'lacta
te) 、フロセミド（２０mg）及びマンニトール（12.5
ｇ）の静脈内投与により、採取３０分前にドナーのブタ
に利尿作用を与えた。ブタにしばしば見られる腎臓血管
痙攣を回避すべくフエノキシベンザミン（５０mg）を静
脈内投与した。正中線に沿って腹部を切開し、末端大動
脈及び大静脈を分岐の直ぐ近傍まで可動化した。尿管を
剥離し膀胱レベルで分割した。分岐の直ぐ上の大動脈に
導入用カテーテルを配置し、下方大静脈に導出カテーテ
ルを配置した。ヘパリン（５，０００単位）を静脈内投
与し、腎臓動脈の直ぐ上の大動脈のクロスクランピング
と合致する末端大動脈を介して４℃のユーロ−コリンズ
（Euro-Collins）溶液での連続的フラッシュ(flush) を
開始した。腎臓をその場で冷却した後一括して取出し
た。次いで腎臓を分離し、一方を対照他方をテスト腎臓
として使用した。これは対による実験法を容易にするた
めである。各腎臓を４℃のユーロ−コリンズ液で再度フ
ラッシュした。プロトコールにより必要とされる場合に
はテスト物質をこの時点で第２腎臓の保存液に加えた。
これら腎臓は双方共無菌状態で包装し４℃で一晩保存し
た。
【０４８７】２４時間の低温虚血の後、新たなレシピエ
ント動物に麻酔をかけ、保存腎臓を腸骨管に移植した。
各吻合に要した時間は２５〜３０分であった。対照（未
処理）腎臓を必ず最初に移植し、テスト腎臓を次に移植
した。従ってテスト腎臓の再灌流は常に対照腎臓の再灌
流より合計１時間遅れた。これは対照腎臓が低温虚血状
態に２３時間おかれたのに対し、テスト腎臓は２４時間
おかれたことを意味する。SOD アナログの動脈内投与を
対照腎臓の再灌流の１時間後に当たるテスト腎臓の再灌
流時に開始した。従って対照腎臓はテスト腎臓に与えら
れる全ての物質効果に曝される１時間前に再加熱及び再
灌流の有害効果に曝されたことになる。第２腎臓の再灌
流に次いでレシピエントたるブタ自体の腎臓を除去し
た。臨床操作を模倣して更に１０ｇのマンニトールを先
ず対照腎臓の再灌流前に投与し、次いでテスト腎臓の再
灌流前に再び投与した。これによって従来の最適保存／
移植技術に加えられる遊離基改変物質の効果を測定し得
た。各腎臓からの尿管は皮膚尿管瘻造設術として別個に
取出した。
【０４８８】移植後２日間レシピエントを軽く麻酔して
各腎臓（尿管造瘻術）から別個に尿を１時間収集し、量
とクレアチニン濃度とを測定した。血清クレアチニンも
測定した。これは各腎臓毎にクレアアチニンクリアラン
スを計算するためである。
【０４８９】全ての結果は平均値±SEM で表わされる。
スチューデントt −テスト（両側検定）の間にデータを
分析した。実験が対で行なわれるため、殆んどの場合に
対テストを適用し得た。
【０４９０】１ この実施例で使用した略号： ＣCR クレスチニンクリアランス ATP アデノシン三リン酸 ADP アデノシンニリン酸 AMP アデノシン一リン酸 実験プロトコール超酸化物ジスムターゼ(SOD) 及びカタラーゼ ４匹のブタのテスト腎臓にシグマウシ血液超酸化物ジス
ムターゼ、酸素遊離基スカベンジャーを投与した。再灌
流の直前に腎臓動脈に５mgの濃縮塊を投与し、再灌流開
始後１５分間１mg／分で一定の動脈内注入を続けた。そ
の結果合計２０mgのSOD が与えられたことになる。４匹
のブタからなる第２グループではSOD に加えてカタラー
ゼ（シグマ社）を同一投与量でテスト腎臓に与えた。こ
れら各ブタの他方の腎臓は処理せずに対照として使用し
た。
【０４９１】SOD に対する用量応答 最大の保護を得るための最小限の用量を決定すべく用量
応答関係（dose response relationship）を調べた。血
管再分布(revascularization) 時に一方の腎臓には２種
類の用量のうち少ない方のSOD を注入し他方には多い方
のSOD を注入した。実施例９に従い製造したヒト組換型
SOD を前述の如く投与した。各用量範囲内で２つの比較
を行なった。最初の比較では0.2mg のSOD を対照たる食
塩水と比較した。段階的に0.2mg を２mgと比較し、２mg
を２０mgと比較し、２０mgを１００mgと比較した。いず
れの場合も少ない方の用量を受容する腎臓を最初に移植
した。これは第２移植時にSOD の循環が滞留し得るとい
う問題を回避するためである。
【０４９２】結 果ウシSOD 及びカタラーゼの効果 我々が使用した大きさのブタの単一正常腎臓のクレアチ
ニンクリアランスは、前述の麻酔及び水分補給(hydrati
on) 条件下では25.5＋6.3ml ／分であった（ｎ＝８）。
２０mgのSOD を再灌流の最初の１５分間に亘って腎臓動
脈内に投与すると低温虚血後の腎機能減損が実質的に改
善された。SOD のみで処理した４つの腎臓は平均クレア
チニンクリアランスが23.2±4.5 ml／分であった。これ
は対照腎臓（8.4 ±1.7 ml／分，ｐ＜0.05）のほぼ３倍
に当たる。SOD 及びカタラーゼを組合わせて使用した場
合にも同程度の保護が得られ、それ以上の効果は見られ
なかった（ＣCR＝19.0±4.5 ml／分）。先に行なった予
備実験では４匹のブタからなる別のグループを４０分を
越える吻合時間をかけて移植処理した。
【０４９３】SOD 及びカタラーゼにより腎機能は著しく
向上したが、これらの動物では処理腎臓も対照腎臓も極
めて低い機能を示した（ＣCR＝4.8 ±0.8 対1.6 ±0.4
ml／分）。それ自体再灌流に先立つ虚血に起因してより
重大な傷害を受けたと思われるこれらの腎臓では、遊離
基の危害を改変しても正常腎機能を回復することはでき
なかった。
【０４９４】ヒトSOD アナログ用量応答関係 ヒトSOD アナログ（0.2mg 及び２mg）を注入しても対照
と比較して腎機能には何らの改善も見られなかった。し
かしながら２０mgのSOD アナログを投与した腎臓の平均
クレアチニンクリアランスは14.2±1.1 ml／分であり、
２mg注入した腎臓（7.7 ±1.0 ml／分，ｐ＜0.05）を遥
かに上回っていた。１００mgのSOD アナログを投与して
もそれ以上の効果は得られなかった（ＣCR＝16.1±1.2
ml／分）。従ってSOD アナログの最小有効量はこのよう
な方法で投与する場合には２mgより多く２０mgより少な
い量であることが判明した。ヒトSOD アナログはウシSO
Dと同程度の効力を示した。
【０４９５】論 考 使用処理法に起因する差異を最大限にし且つ特定ドナー
又はレシピエント動物に係る種々の変数に関する制御を
行なうべく対で実験する方式を用いた。この対方式では
結果の統計分析を対で行なうこともでき、従って少数の
比較的高価な実験動物の最適利用を可能にするものであ
った。
【０４９６】これらの研究における重要な発見は遊離基
媒介再灌流傷害の除去によって得られる利益の大きさで
あった。対照腎臓は健康なドナー腎臓及びレシピエント
動物、水分補給、αアドレナリン作用阻害、抗凝血並び
に利尿を含む従来の最適臓器保存法の利益を受けたにも
拘らず重大な機能障害を示し、クレアチニンクリアラン
スのレベルが正常レベルの１／３以下に低下した。この
２４時間の虚血状態保持は、同様の臨床的状況下でしば
しば見られるように従来の臓器保存能力を越えるもので
ある。有効量のウシSOD 又はヒトSOD アナログで処理す
るとこの障害が驚く程効果的に回避され、腎機能がほぼ
正常レベルに維持される。実際、このように処理した腎
臓で、移植後４８時間目に測定した時に、対をなすもう
一方の未処理対照腎臓の少なくとも２倍のクレアチニン
クリアランスを示さなかったものは１つもない。この利
益の大きさは従って４５〜６０分の温暖虚血後に見られ
るものより量的に大きかった。これは、従来の最適保存
技術を用いると虚血自体に起因する障害は最小化され、
再灌流時に発生する障害が優勢になることを示唆する。
この解釈は更に、再灌流に先立ち１８時間保存しておい
た腎臓についての研究によっても裏付けられる。これら
の腎臓では対照グループ及び処理グループの双方共優れ
た機能を示した。これは、再灌流時の遊離基発生に適し
た条件を設定するだけの十分な代謝産物の蓄積に必要な
時間が未だ十分に経過していなかったことを意味する。
一方、腎臓を吻合時間のより長い（即ち温暖虚血）前記
予備実験の場合のようにより重大な虚血状態におくと、
SOD を投与しても明らかな改善は見られたものの機能を
正常レベルまで回復させることはできなかった。従って
これらの腎臓はより短時間の温暖虚血（７，８，９）後
に調べたものにより類似していると言えよう。他の器官
と同様に、遊離基傷害除去の利益は主として、再灌流に
起因する傷害と比較した虚血自体に起因する傷害の相対
比に関連する。
【０４９７】更にこの利益増加の達成は悉無律的である
と考えられる。SOD に関する用量応答検査は、最大限の
保護が得られるか又は保護が全く得られないかのいずれ
かを示した。カタラーゼはSOD のみに加えてもそれ以上
の利益はもたらさなかった。この研究を定量的に分析し
た限りでは、再灌流傷害防止は悉無律的現象であったと
思われる。
【０４９８】しかしながら、この研究における諸発見事
項は臨床的用途に特に適していると考えられる。ここで
選択した２４時間の低温虚血は臨床状況で必要とされる
死体移植組織保存期間に十分該当する。更にこれらの研
究では、従来の最適保存及び移植法に対して遊離基によ
る再灌流時傷害の除去の効果が立証された。これにはそ
れ自体効果的なヒドロキシル基スカベンジャーであるマ
ンニトールの使用が含まれる。従ってこれらの研究は、
遊離基除去を現在使用されている臨床的方法に加えて用
いれば同程度の効果が得られることを示唆する。
【０４９９】SOD は無毒化合物であるため、この方法は
有望と思われる。
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cal Scavengers Protect the Arrested,Globally Ische
mic Heart Upon Reperfusion）。サージュリーフォーラ
ム（Surg Forum）３４：３１３（１９８３年）。
【０５１５】実施例３２ 摘出ウサギ角膜の生存と遊離基スカベンジャー 実施例３の大腸菌Ａ１６４５中pSODβ1 Ｔ11宿主ベクタ
ー系により産生し、実施例２６の条件下で成長させ且つ
精製したヒト超酸化物ジスムターゼは切除した摘出（単
離）角膜の生存期間を長くすることが判明した。
【０５１６】この実施例で括弧内に記されたアラビア数
字は該実施例の説明の後に列挙された参考文献を示す。
【０５１７】in vitroのウサギ角膜内皮ポンプに対する
低濃度アデノシンの有益な効果は種々の研究で既に立証
されている(1) 。前記流体ポンプの作動は単離角膜に平
衡食塩水中生理濃度グルコース（５mM）及びアデノシン
（１０-6Ｍ）を灌流させることによって実現された。生
存時間は約７時間であった。
【０５１８】我々の次の目標は生存時間の延長であっ
た。超酸化物ジスムターゼ(SOD) (2)は反応Ｏ2 ・- ＋
Ｏ2 ・- ＋２Ｈ+ →Ｈ2 Ｏ2 ＋Ｏ2 を促進することによ
り超酸化物遊離基を除去する。
【０５１９】SOD 投与は部分的酸素欠乏後の虚血組織の
生存を著しく高めることが知られている(3) 。虚血に起
因するかなりの程度の組織破壊は単離組織の再灌流及び
再酸素付加の間に生じる。この危害の大部分は超酸化物
ラジカルとその一族とによって媒介される。本研究の目
的は超酸化物ジスムターゼ(SOD) 又はカタラーゼが単離
角膜の生存期間を延長させ得るか否かを調べることにあ
る。
【０５２０】体重2.0 〜3.0kg のシロウサギから角膜を
単離した。その技術としては既に詳述されているものを
使用した(1) 。要約すれば、眼を切除して角膜上皮を剥
離し、次いで角膜を記載の如く単離し、灌流処理した。
【０５２１】結 果 ５mMグルコース及び１μアデノシンを含む基礎食塩水に
SOD アナログを２μ／mlで加えると単離角膜の生存時間
が７時間から１４時間まで延びた。アデノシンを除外す
ると生存時間は１２時間までしか延長されなかった。
【０５２２】結論としては、SOD アナログは単離角膜の
生存時間の延長に有効であることが判明した。SOD アナ
ログは他の単離（摘出）臓器の生存時間延長でも重要な
役割を果たし得る。ウシSOD を用いて得た同様のデータ
がエクスペリメンタルアイリサーチ(Experimental Eye
Research) ４：１５３−１５４（１９８５年）に発表さ
れている。
【０５２３】参考文献 １．ニューワース，オー(Neuwirth,O.）及びディクスタ
イン，エス(Dikstein,S.）（１９８３年）ウサギ角膜内
皮流体ポンプに対する環状AMP の効果(The effect of c
yclic AMP on the rabbit corneal endothelial fluid
pump) 。カレントアイリサーチ（Current Eye Res.）２
(8) ，５６５−５６７。
【０５２４】２．フリドビッチ，アイ(Fidovich,I.)
（１９７５年）超酸化物ジスムターゼ（Superoxide dis
mutase）。生化学年刊誌（Ann.Rev.Biochem.）４４，１
４７−１５９。
【０５２５】３．マンソン，ピー・エヌ（Manson,P.N.
），ロパート，エム(Robert M.) ，アンテネリ，エム
・エム(Anthenelli,M.M.) ，マイケル，ジェ−(Michael
J.)，バルクレー，ジー・ビー（Bulkley G.B.）及びフ
ープス，ジェー・イー(Hoopes,J.E.) （１９８３年）ア
イランド皮弁の虚血組織損傷における酸素遊離基の役割
(The role of oxygen-free radicals in ischemic tiss
ue injury in Island skinflaps) 。年刊サージュリー
(Ann.Surg.) １９８，８７−９０。
【０５２６】４．マイケルソン，エー・エム(Michaelso
n,A.M.) 及びピュゲット，ケー（Puget,K.）（１９８０
年）外因性超酸化物ジスムターゼによる細胞侵入（Cell
penetration by exogenous superoxide dismutase）。
アクタフイジオロジースカンジナビアサプルメント(Act
a Physiol.Scand.Suppl.) ４９２，６７−８０。
【０５２７】５．パールマン，エム（Perlman,M.）及び
ボーム，ジェー・エル(Baum,J.L.) （１９７４年）ウサ
ギ角膜内皮細胞の大量培養（The mass culture of rabb
it corneal endothelial cells）。眼科学会誌（Arch.O
phthalmol.）９２，２３５−２３７。
【０５２８】６．クライス，エス（Klyce,S.）及びモー
リス，デイー・エム（Maurice,D.M.）（１９７６年）in
vitroでの角膜厚さの自動記録(Automatic recording o
f corneal thickness in vitro) 。眼科学研究(Invest.
Opthalmol.) １５，５５０−５５３。
【０５２９】７．ニューワースリュクス，オー(Neuwirt
h Lux,O.) （１９８４年）ウサギ角膜内皮ポンプの生存
(Survival of rabbit corneal endothelial pump) 。エ
ルサレムヘブライ大学理事会（the Senate of the Hebr
ew University of Jerusalem）に提出された博士論文。
【０５３０】実施例３３ ｐ９２００の構築とｐ９２００を用いる大腸菌Ａ１６４
５及びＡ４２５５内でのbGH の産生 ｐ９２００の構築は第２６図に示されており図面の説明
の項で説明されている。pHG ４４をCla Ｉ及びＰstＩで
分割し、DNA ポリメラーゼＩのクレノー（Klenow）断片
を用いて「フィル イン(fill in) 」し、次いで大きな
DNA 断片を単離した。Eco ＲＩ及びAva ＩでpBR ３２２
を開裂し次いでDNA ポリメラーゼＩのクレノー断片を用
いて「フィルイン」することにより単離したpBR ３２２
のテトラサイクリン耐性遺伝子を含むDNA 断片に前記断
片を結びつけた。その結果得られたプラスミドｐ９２０
０を受託番号（Accession Number）ATCC５３２１５とし
てATCCに寄託した。
【０５３１】プラスミドｐ９２００はpHG ４４（第６
図）に類似しているが、このプラスミドはアンピシリン
耐性ではなくテトラサイクリン耐性を付与する。プラス
ミドｐ９２００を普通の知識をもつ当業者に公知の方法
を用いる形質転換により大腸菌株Ａ１６４５及びＡ４２
５５内に導入した。これらの株は成長及び誘導時に、真
正bGH のフェニルアラニン形状のアミノ末端に加えられ
たアミノ酸配列met-asp-gln を有するウシ成長ホルモン
(bGH) のアナログを産生した。これらの株によって産生
されたbGH アナログの量はpHG ４４により産生されたも
のとほぼ同等であった。
【０５３２】菌株Ａ１６４５／ｐ９２００（ｐ９２００
で形質転換した宿主株Ａ１６４５）の成長（増殖）、bG
H アナログの回収及びbGH アナログの精製に使用した方
法は１００mg／ｌのアンピシリンに代えて12.5mg／ｌの
テトラサイクリンを加えた以外はpHG ４４に関する実施
例１３と同一である。
【０５３３】Ａ４３２０と称されてきた株Ａ４２５５／
ｐ９２００の成長及び誘導に使用した方法は実施例３６
に記載の方法である。bGH アナログの精製に使用した方
法は実施例１３のpHG ４４の場合と同じである。
【０５３４】菌株Ａ４３２０（プラスミドｐ９２００で
形質転換した宿主株Ａ４２５５）を受託番号ATCC５３２
１５としてATCCに寄託した。
【０５３５】アンピシリン遺伝子をテトラサイクリン遺
伝子で代換すると、アンピシリンを産生プロセスから除
外し得、そのため重大なアレルギー反応の原因となり得
る最終産生物のアンピシリン汚染の可能性が回避される
という利点が得られる。
【０５３６】実施例３４ met-leu-leu-leu-met ヒトApo Ｅアナログの産生 プラスミドpTVRは新規なアポリポタンパク質Ｅ３アナロ
グの発現を支配する。このアナログのＮ−末端配列はme
t-leu-leu-leu-met であり、この直後に成熟アポリポタ
ンパク質Ｅ３の配列が存在する。
【０５３７】pTVR２７９−８の組立（構築） pTVR２７９−８の組立は第２５図及び図面説明に示され
ている。プラスミドpTVR２７９−８は受託番号５３２１
６号でATCCに寄託済である。
【０５３８】プラスミドpTV １９０（第２１図）をAva
Ｉで部分消化し、DNA ポリメラーゼＩのKlenow断片で
「埋め戻し(till in) 」，連結してE.coliを形質転換さ
せた。得られたプラスミドは３′Ava Ｉ部位が除去され
ておりこれをpTV ２６４−４５と命名した。pTV ２６４
−４５をNde Ｉで完全に消化し以下の合成オリゴヌクレ
オチドに結合（連結）した。
【０５３９】
【化１７】
【０５４０】得られたプラスミドをpTVR２７９−８と命
名し、当業者に公知の方法でE.coli. Ａ１６４５を形質
転換した。このプラスミドを含む細胞を、32Ｐ−標識オ
リゴヌクレオチドNo. １２１８をプローブとしてコロニ
ーハイブリダイゼーションによって同定した。DNA 配列
決定によって間違いなくこのプラスミドであることが確
認された。pApoEE２を含むＡ１６４５株は受託番号３９
７８７号でATCCに寄託済である。
【０５４１】pTVR２７９−８は増殖及び誘発によって天
然アポリポタンパク質Ｅ３のＮ−末端に付加アミノ酸配
列met-leu-leu-leu-met をもつヒトアポリポタンパク質
Ｅ３のアナログを産生する。菌株の増殖に使用される方
法は、実施例１７に記載のpTV −１７０の増殖方法に等
しいが、但し４２℃での誘発期間が１５分でなく１〜５
時間である。
【０５４２】pTVR２７９−８が産生するApo Ｅ３アナロ
グはpTV １７０及びpTV １９０によって産生されたmet-
Apo Ｅ３アナログよりも細菌に対する毒性が小さい。me
t-leu-leu-leu-met-Apo Ｅ３アナログは４２℃での誘発
後６０分を経過したときも細胞内に蓄積し続けて、培養
物１ｌ当り４００〜６００mgのレベルに到達する。
【０５４３】実施例３５ ヒト成長ホルモンアナログの産生pTV ３００の組立 pTV ３００の組立については第２７図及び図面説明に示
した。プラスミドpTV１８(1) に由来のhGH 遺伝子をｐ
５７９（第１９図）のNde Ｉ部位に挿入してプラスミド
pTV ３００を構築した。pTV １８(1) の組立は、１９８
５年１月２３日付の欧州特許公開第０１３１８４３Ａ１
号及び対応する１９８３年７月１５日付の米国特許出願
第５１４１８８号に開示されている。引用した特許出願
は本明細書に含まれるものとする。
【０５４４】hGH アナログの合成 当業者に公知の方法を用いpTV ３００をE.coliＡ１６４
５菌株に形質転換によって導入した。この菌株は増殖及
び誘発によって天然成長ホルモンの最初の１３個のアミ
ノ酸が欠失したヒト成長ホルモンアナログを産生した。
菌株の増殖とhGH アナログの精製とのために実施例１３
と等しい方法を使用した。
【０５４５】実施例３６ 原栄養菌株の組立及び原栄養宿主を用いたbGH の産生 最小培地で増殖させた場合であっても多くの前記プラス
ミドによって高レベルにタンパク質を発現し得るE.coli
の原栄養株を構築した。最小培地を使用する細菌増殖プ
ロトコールの利点は、(a) 細菌を高い細胞密度に増殖で
きること、(b) 培地成分が「より簡単であり」従って高
品質なので増殖条件を再現し易いこと、及び、(c) 培地
がより安価なことである。
【０５４６】本発明の好ましい原栄養株はＡ４２００，
Ａ４２５５及びＡ４３４６と命名されている。プラスミ
ドｐ９２００を含む菌株Ａ４２５５は受託番号５３２１
５号でATCCに寄託済である。これをＡ４３２０と指称す
る。
【０５４７】原栄養株の選択及び組立 最小培地での増殖率とファージλ，λ４３４及びファー
ジＰ１に対する感受性とに基いて以下の菌株をスクリー
ニングした。
【０５４８】菌 株 １．ATCC １２４３５ ２．ATCC ２３７１６ ３．ATCC ２７６６２ ４．ATCC ２５４０４ ５．ATCC １１７７５ ６．ATCC ２５２５４ ７．ＨｆｒＣ＝Ａ４１３４ ８．Ｗ３３５０＝Ａ２５０９ ９．Ａ１６４５ テストの結果より、上記ファージに感受性で増殖率が最
も高い菌株ATCC１２４３５とATCC２５４０４とに基いた
原栄養株を主として開発することに決定した。これらの
２種の菌株を使用し、λｃＩ８５７ΔＨＩΔBam ＨＩ：
Tn１０を含むＰ１を形質導入してλｃＩ８５７リプレッ
サーを含有する新しい菌株を構築した。テトラサイクリ
ン耐性コロニーを精製し、必要な場合はＰ１を除去し
た。
【０５４９】得られた菌株とその遺伝子型とを以下に示
す。
【０５５０】Ａ４２００＝ATCC１２４３９（λｃＩ８５
２ΔＨＩΔBam ＨＩ）：Tn１０ Ａ４２０６＝ATCC２５４０４（λｃＩ８５７ΔＨＩΔBa
m ＨＩ）：Tn１０ 双方の菌株をpHG ４４で形質転換して菌株Ａ４２０２及
びＡ４２０７を夫々得た。
【０５５１】増殖及び誘発 以下の条件で菌株Ａ４２０２とＡ４２０７とを増殖及び
誘発させ、ウシ成長ホルモンアナログの産生をアッセイ
した。
【０５５２】培地 成 分 濃 度 ＫＨ2 ＰＯ4 13.6 gm／ｌ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 2 gm／ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ 0.2 gm／ｌ ＣａＣｌ2 0.01 gm／ｌ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ 0.5 ｇ／ｌ pH7.4添加物質 グルコース２０％溶液 25 ml／ｌ アンピシリン２０mg／ml溶液 1 ml／ｌ Ｂ１ 0.3 ％溶液 1 ml／ｌ ピオチン 0.3％溶液 1 ml／ｌ Ａ４２０２とＡ４２０７との双方共が最小培地で十分に
増殖する。しかし乍らＡ４２０２だけが有意レベルのbG
H アナログを発現する。Ａ４２０２は、実施例１３に記
載の濃厚培地(rich medium) で増殖したpHG ４４とほぼ
同じレベルでbGH アナログを発現する。
【０５５３】Ａ４２００からのテトラサイクリン耐性の
除去 テトラサイクリン耐性マーカーのみを含むプラスミドで
原栄養株Ａ４２００を利用するために、Tn１０マーカー
を除去した菌株を構築した。Ａ４２００株をマッコンキ
ー（MacConky）ガラクトースプレートに画線し、 gal+
復帰細胞を選択しテトラサイクリン感受性とλファージ
に対する免疫性とをテストした。この菌株をＡ４２５５
と命名した。
【０５５４】ビオチン独立性（非依存性）原栄養株の組
立 前記原栄養株は全てλｃＩ８５７ΔＨＩΔBam ＨＩ欠損
プロファージを含む。ΔＨＩ欠失はbio uvr Ｂ領域に及
び、ビチオン生合成オペロンが除去されている。従っ
て、菌株の増殖培地にビオチンを加える必要がある。
【０５５５】Ａ４２００及びＡ４２５５由来の菌株のビ
オチン要求を除去するために、これら菌株にＡ８９株の
Ｆ′エピソームを導入した。
【０５５６】Ａ８９株はＦ′gal プラスミドを含んでい
る。このＦ′プラスミドがビオチンの内因合成に必要な
全ての遺伝子を含むことが判明した。このプラスミドは
bioオペロンの好適ソースとなり得る特性をいくつか備
えている。
【０５５７】１．Ｆ′gal はユニットコピー(unit cop
y) プラスミドである； ２．このプラスミドはE. coli 中で極めて安定である； ３．Ｆ′プラスミドは、出願人等の発現ベクターのベー
スとなるcol Ｅ１プラスミドと適合性である； ４．Ｆ′gal は接合性プラスミドである。従って細胞間
を容易に移動し得る； ５．ビオチン独立性菌株のスクリーニングが容易であ
る。
【０５５８】Ａ４２０２株をＡ８９と３０分間接合し、
ビオチン独立性コロニーを選択した。得られたＡ４３４
６株を、ビオチンを含まない最小グルコース培地で誘発
させると高レベルのウシ成長ホルモンアナログが産生し
た。他の増殖因子は不要である。
【０５５９】当業者に公知の標準方法でＡ４３４６から
pHG ４４を除去し得る。得られた原栄養宿主菌株は、本
出願に記載の全てのプラスミドによって形質転換され得
る。
【０５６０】最小培地 原栄養株による産生のために以下の最小培地を標準的に
使用した。
【０５６１】 発酵槽用 振盪フラスコ用 Ｋ2 ＨＰＯ4 ６ｇ／ｌ ６ｇ／ｌ ＫＨ2 ＰＯ4 ４ｇ／ｌ ４ｇ／ｌ ＮＨ4 Ｃｌ １ｇ／ｌ １ｇ／ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ３ｇ／ｌ 0.2ｇ／ｌ １０％ ＦｅＮＨ4 シトレート 0.3 ml／ｌ 0.1 ml／ｌ 微量元素溶液 ３ml／ｌ １ ml／ｌ 消泡剤，シリコーン 0.5 ml／ｌ オートクレーブ 菌株がアンピシリン耐性又はテトラサイクリン耐性のい
ずれであるかに従ってアンピシリン（１００mg／ｌ）又
はテトラサイクリン（12.5mg／ｌ）を培地に添加し得
る。
【０５６２】別に５０％グルコースをオートクレーブ処
理し２０gm／ｌまで加えた。発酵中に５０％グルコース
を、Ｆ′エピソームを含まない菌株に対してはO.D.単位
当りグルコース1.08gmの割合で加え、Ａ４３４６株に対
してはO.D.単位当りグルコース1.8gm の割合で加えた。
２５％ＮＨ4 を送ってpHを調節した。必要に応じて消泡
剤を加えた。
【０５６３】Ａ４２００，Ａ４２５５及びＡ４２０６を
ベースとする菌株にビオチンを１５mg／ｌの割合で添加
した。
【０５６４】溶液は以下の微量元素を含有するバイオテ
クノロジカル・バイオエンジニアリング（Biotechnol.B
ioeng.）１６：９３３−９４１（１９７４）： ｇ／ｌ Ｈ3 ＢＯ3 0.57 ＣｕＣｌ2 （ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ） 1.0 （0.04） ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ 1.0 ＭｎＳＯ4 ・４Ｈ2 Ｏ 0.81 Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ 2.0 ＣａＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ 2.0 ＺｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ（ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ） 2.0 （2.78） 濃ＨＣｌ １００ml かっこ内の化合物は、かっこの前の化合物の代りに使用
し得る代替化合物である。かっこ内の数値はこの代替化
合物の量である。前出のプラスミドの多くを、原栄養株
Ａ４２００とＡ４２５５とに導入した。これら菌株の一
部のリストを次表に示す。
【０５６５】菌株名 宿主菌株／プラスミド Ａ４２０２＝Ａ４２００／pHG ４４ Ａ４２５６＝Ａ４２５５／pHG ４４ Ａ４３２０＝Ａ４２５５／ｐ９２００ Ｚ１８０３＝Ａ４２５５／pSOD1 Ｔ11 Ａ４５００＝Ａ４２５５／pTV １９４ Ａ４３４６＝Ａ４２００／pHG ４４，Ｆ′Gal実施例３７ 溶菌宿主の組立及びこれら溶菌宿主を使用するbGH の産
生 １．菌株Ａ４０４８及びＡ３１１１の組立 λファージの増殖には多くの場合Ｗ３３５０株が使用さ
れている（例えばオッペンハイム(Oppenheim) 及びサロ
モン(Salomon) （１９７０），４１ヴィロロジイ（Viro
logy），１５１−１５９参照）。Ｗ３３５０の原栄養誘
導体たるＡ２５０９株にＡ１６３７で増殖したPlcItsを
形質導入し、また、Tn１０マーカーを含むλｃＩ８５７
ΔＨＩΔBam ＨＩ欠損プロファージを形質導入した。得
られたＡ４０４８菌株を、欠損プロファージλｃＩ８５
７ΔＨＩΔBam ＨＩを含むテトラサイクリン耐性クロー
ンとして選択した。この菌株はまたPlcItsプラスミドを
含んでいた。この菌株をpHG ４４で形質転換してＡ３１
１１株を作成した。
【０５６６】同様にして、同じくＡ２５０９株を用いこ
の菌株にλｃＩ８５７ΔＨＩΔBamＨを挿入しpHG ４４
で形質転換する前にTn１０トランスポゾンを除去し且つ
PlcItsプラスミドを除去してＡ４０８５株を構築した。
Ａ４０８５株は欠損プロファージλｃＩ８５７ΔＨＩΔ
Bam Ｈを含んでおり、ＰＩプラスミドを存在させずに行
なわれるbGH 産生と自己溶菌とを測定するためのコント
ロールとして作用する。Ａ３１１１株は受託番号５３２
１７号でATCCに寄託されている。
【０５６７】２．ウシ成長ホルモン(bGH) の合成 保存培養物 ５０μg ／mlのアンピシリン(Amp) を含む
LB培地でＡ３１１１株（Ａ４０４８細胞中のpHG ４４）
の保存培養物を３０℃で一晩増殖した。培養物を５０％
グリセロールで２倍に希釈し−２０℃で保存した。
【０５６８】接種物 接種物は１００μg ／mlのAmp を
含むLB寒天プレートで増殖したＡ３１１１の単一コロニ
ーから得られた。次に、保存培養物から採取した材料を
LBプレートに塗抹した。
【０５６９】５０μg ／mlのAmp を含む３mlの無菌LB培
地にＡ３１１１の単一コロニーを接種し３０℃の振盪浴
で１８時間増殖させた。
【０５７０】産生 ５０μg ／mlのAmp を含むBHI 培地
（脳心インフュージョン培地（Difco），３７μg ／
ｌ）でbGH を産生した。新鮮BHI ＋５０μg ／mlのAmp
を収容したフラスコで接種物を１００倍に希釈し、細胞
濃度が約４×１０8 細胞／ml（OD600 ＝0.5 ）になるま
で３０℃の振盪浴で増殖させた。
【０５７１】bGH 産生を誘発するために、フラスコを４
２℃に調温した振盪浴に移した。誘発開始後０分と９０
分との時点で細胞サンプルを採取した。
【０５７２】bGH 産生の分析 １０〜２６％の濃度勾配
のアクリルアミドゲルでbGH 産生を分析した。細胞サン
プルをマイクロ遠心機で回転させ上清を除去してペレッ
トをサンプルバッファ（２％SDS ，５０mMトリスpH7.0
，３％ショ糖、５％β−メルカプトエタノール）に溶
解し、ゲルにロードした。２００ボルトで２−1/2 時間
電気泳動にかけ、ゲルをクーマシーブルー(Coomasseibl
ue) で染色し、ゲルスキャナーで走査してbGH の量を測
定した。
【０５７３】４２０℃での誘発の９０分後にbGH はＡ３
１１１の総タンパクの約２０％を含む。
【０５７４】３．自己溶菌 Ａ３１１１株は、pHG ４４と欠損プロファージλｃＩ８
５７ΔＨＩΔBam ＨＩと安定なPlcItsプラスミドとを含
む。４２℃で長時間誘発すると、Ｐ１によって支配され
るエンドリシンの産生によって細胞の溶解が始まる。2.
5 〜３時間後に培養物が完全に溶解する。
【０５７５】調節自己溶解テスト ４２℃で（９０分
間）の誘発の以前及び以後に５mlのＡ３１１１培養物を
採取し、ソーバル(Sorvall) 遠心機に入れ７０００rpm
で７分間回転させた。上清を除去しペレットを−２０℃
で一晩冷凍した。次にペレットを0.5ml のＴ．Ｅ．バッ
ファ（１０mMのトリス、pH8.0 ，１mMのEDTA）に再懸濁
させ、0.1ml をＴ．Ｅ．で１０倍に希釈し、OD600 を測
定した。
【０５７６】この実験のコントロールとして、Ａ３１１
１と同様にpHG ４４と欠損プロファージλｃＩ８５７Δ
ＨＩΔBam ＨＩを含むがPlcItsプラスミドを含まないＡ
４０８５株を使用した。
【０５７７】この実験の結果を表Ｖに示す。この表の結
果より、PlcItsプラスミドを含む細胞（Ａ３１１１）が
解凍直後に溶解することが判明した。解凍混合物の検査
により、この処理後に細胞の９５％以上が溶解すること
も判明した。
【０５７８】
【表５】
【０５７９】この溶菌手順を用いると、bGH 産生を妨害
すること無く誘発細胞からbGH を簡単に抽出できる。
【０５８０】実施例３８ Met-Apo Ｅ３アナログの生物学的活性 実施例１７の方法で細菌pTV １９４を増殖させた。
【０５８１】かっこ内の数字は実施例末尾に列記した参
考文献の参照番号を示す。
【０５８２】細菌抽出物の分析 細菌細胞を遠心採取し、５mMのEDTAと２mMのフェニルメ
チルスルホニルフルオリドとを含む５０mMのリン酸カリ
ウムバッファ、pH7.5 に懸濁させた。分取サンプルを1.
5 倍量のバッファ（１５％グリセロール、4.5 ％ＮａＤ
ｏｄＳＯ4 ，１mMのβ−メルカプトエタノール、93.5mM
のトリス、ＨＣｌ，0.25％のブロモフェノールブルー、
pH6.8 ）に溶解し、１００℃で１０分間加熱し、１０％
ＮａＤｏｄＳＯ4 ポリアクリルアミドゲルでタンパク質
を分析した(26)。ポリアクリルアミドゲルで分離したタ
ンパク質をクーマシー・ブリリアント・ブルーで染色す
るか、又は、ニトロセルロールシートに電気泳動させ(2
7) 125Ｉ標識抗ヒトApoEモノクローナル又はポリクロー
ナルIgG と反応させた。免疫ブロットを洗い、風乾しＸ
線フイルムに露光した。
【０５８３】Apo Ｅの単離 従来技術のセフアクリル(Sephacryl) Ｓ−３００カラム
クロマトグラフィー(14)を用い、高トリグリセライド血
症患者のｄ＜1.02血漿リポタンパク質（Ｅ３／３表現
型）から真正Apo Ｅを単離した。プレパラティブインモ
ビリン等電点電気泳動法(preparative Immobiline isoe
lectric focusing) （エル・ケー・ビー・インストルメ
ンツLKB Intruments, ブロンマ（Bromma），スエーデ
ン，pH4.9 〜5.9 ）(28)を用いＥ３のアイソフォーム
（isoform ）を得た。Apo Ｅアナログを３３ｇの凍結乾
燥細胞から単離した。後者は５ｌ発酵で得られる細胞量
である。（４℃に）冷した乳鉢と乳棒とを用い２２ｇの
アルミナ（ベーラー・リミテッド（Buehler Ltd.），エ
バンストン市、イリノイ州）によって細胞を微粉に粉砕
した。0.1 ＭのＮＨ4 ＨＣＯ3 と２mMのPMSFと0.1 ％ト
ラシロール（モベー・ケミカル・コーポレーション（Mo
bay Chemical Corp.），ニューヨーク市、ニューヨーク
州）とを含む（脱イオン直後の）６Ｍの尿素（pH7.8 ）
３００mlで粉砕細胞を抽出した。不溶細胞残渣をベック
マン(Beckman) SW２８ロータ内で（２５，０００rpm で
５０分間）４℃で超遠心して沈降させ、２００mlの６Ｍ
尿素バッファで再抽出した。上清画分を合せて透析し
た。透析には、２５mMのＮＨ4 ＨＣＯ3と２mMのPMSFと
２mMのEDTAと0.1 ％のトラシロールと0.1 ％のβ−メル
カプトエタノールとを含む２Ｍ尿素(pH7.4) を３回交換
して用いた。透析後、抽出上清に〜２００mlのヘパリン
−セファロースを加えた。後者は従来通りに(29)調製
し、２Ｍ尿素バッファで平衡させておく。ゲルと上清と
の混合物を回転台に載せ４℃で一晩インキュベートし、
次にガラスカラム（4.0 ×3.5cm 、コンテス・ガラス
（Kontes Glass）、ヴアインランド（Vineland）、ニュ
ー・ジャーシ（NJ））に充填した。〜３００mlの２Ｍ尿
素バッファを２５ml／時の速度でカラムに流してヘパリ
ン−セファロースに結合しなかった物質をカラムから洗
い流した。次に、２Ｍ尿素に入れた５０mlの1.0 Ｍ Ｎ
Ｈ4 ＨＣＯ3 で結合した物質をカラムから溶出し、５mM
のＮＨ4 ＨＣＯ3 に透析して凍結乾燥した。この半精製
Apo Ｅを0.1 ＭのトリスＨＣｌと１mMのEDTAと1.0 ％の
β−メルカプトエタノールとを含む１５mlの６Ｍグアニ
ジン（pH7.4 ）に可溶化し、セファクリルＳ−３００
（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ(Pharmacia Fin
e Chemicals ，ウプサラ（Uppsala)，スエーデン（Swed
en））カラム（2.5 ×３００cm）にかけ、４Ｍのグアニ
ジンと0.1 Ｍのトリス．ＨＣｌと１mMのEDTAと0.1 ％の
β−メルカプトエタノールと(pH7.4) によって平衡させ
た。Apo Ｅを含む画分をプールし、５mMのＮＨ4ＨＣＯ
3 に完全に透析して凍結乾燥した。固定ゲル上の分取形
等電点電気泳動法(28)を用いて最終精製を終了した。
【０５８４】Apo Ｅアナログの構造的特性決定 アミノ酸解析用のタンパク質又はペプチドサンプルを密
封減圧管内で１１０℃の６Ｎ ＨＣｌ中で２０時間加水
分解した。標準的１２６データシステムを備えたベック
マン(Beckman) １２１MBアナライザーで分析を実施し
た。
【０５８５】セフアクリルＳ−３００カラムで精製した
３mgのApo Ｅを６００μl の７０％ＨＣＯＯＨに入れた
９０mgのＣＮＢｒにより室温で３０時間消化してアミノ
酸及びその配列を解析するためのペプチドを得た。得ら
れたペプチドを前述の真正ApoEと同様に(4) セフアデッ
クスＧ−５０カラムで分離した。
【０５８６】最新型ベックマン８９０Ｃシーケンサ(Bec
kman８９０Ｃ Sequencer)を用い標準0.1 Ｍカドロール
(Quadrol) プログラムで配列解析を実施した。３mgのポ
リブレンと0.5 ％のＮａＤｏｄＳＯ4 との存在中で完全
形タンパク質を分解し、ポリブレンのみを存在させてペ
プチドを分解した。従来の高性能液体クロマトグラフィ
ー(14)を用いてフェニルチオヒダントインアミノ酸の同
定及び定量を実施した。 分析用等電点電気泳動法とＮ
ａＤｏｄＳＯ4 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(14)
とを実施した。システアミン（β−メルカプトエタノー
ルアミン）による電荷修正を行なった(14)。
【０５８７】Apo Ｅアナログの生物学的特性決定 Apo Ｅアナログとジミリストイルホスファチジルコリン
（DMPC）とのリン脂質複合体を従来通りに調製し単離し
た(14)。従来の線維芽細胞(31)及び肝膜(32)の場合に準
じてリポタンパク質レセプター結合アッセイを実施し
た。ヨード−ビーズ（Iode-Beads）（ピアス（Pierc
e））を製造業者の指示通りに用い0.10ＭのＮＨ4 ＨＣ
Ｏ3 中でApoEをヨウ素化した。
【０５８８】ウサギ及びラットのインビボテストのため
にヨウ素化した真正ApoEとApoEアナログ（各９０μg ）
とを１mlのウサギ又はラットの血漿と共に室温で３０分
間インキュベートし、ニュージーランド白ウサギの雄に
注射した。従来の沈殿(33)を使用し血漿放射能によって
TCA 沈殿可能タンパク質を測定する。血漿量を体重の4.
5 ％と仮定し、種々の経過時間での注射物質の血漿中残
存パーセントを計算する。
【０５８９】結果及びその考察 ヒトApo Ｅの発現 pTV １９４でトランスフエクトした細胞の誘発により、
ApoEに等しい見掛け分子量をもつタンパク質が特異的に
誘発された。この誘発タンパク質は抗ヒトApoE抗体と反
応した（図示せず）。
【０５９０】誘発期間が３０分以上の場合細胞溶解が観
察された（第２８図）。この細胞溶解はApoEの細胞内蓄
積と関係がある。３０℃に維持された非誘発細胞は安定
であった（第２８図）。このような崩壊性（toxicity）
細胞溶解はこの発現ベクターの一般的特徴ではない。何
故ならヒト成長ホルモンcDNAを含むとき同じ発現系が同
じ結果を生じないからである。細胞溶解後のタンパク分
解によってApoEは破壊された。ApoE蓄積によって生じる
毒性の問題を解決するために、細胞の誘発を短時間にし
（〜２０分）次に発酵槽に氷を加えて細胞を冷却した。
【０５９１】固相ラジオイムノアッセイで定量すると短
時間誘発細胞中のApo Ｅレベルは可溶細胞タンパクの約
１％であった。Apo Ｅを単離し、ヘパリンセファロース
とセファクリルＳ−３００クロマトグラフィーとによっ
て細胞抽出物から精製した。この２段階プロセスで９０
％より高純度のApo Ｅ調製物が細胞抽出物中のApo Ｅ存
在量の約２０％に相当する収率で得られた。特性決定す
るための最終精製には分取型インモビリン等電点電気泳
動を用いた。これらのテストで用いた精製手順は総回収
率を最も良くするように設計されたものでなく特性決定
のための純粋物質が得られるように設計されたものであ
る。
【０５９２】Apo Ｅアナログの構造的特性決定 インモビリン精製Apo ＥアナログはSDS ゲル上で真正Ap
o Ｅに等しい見掛けMrをもつ単一バンドとして泳動し
た。生物工学的（bio-engineered）Apo Ｅは等電点電気
泳動にかけるとインモビリン精製Apo Ｅ３と等しいｐＩ
をもつ１つの主要バンドとして集束した。１つのシステ
イン残基の存在に対応してApo Ｅアナログはシステアミ
ン修飾後にアノード側に１電荷ユニットだけシフトし
た。イモビリン精製産物のアミノ酸解析を同じ方法で精
製した真正ヒトApo Ｅ３に比較した。表VIに示す如くAp
o Ｅアナログと真正Apo Ｅとの分析結果は互いにほぼ等
しくヒトApo Ｅの従来の配列解析から得られた理論組成
にもほぼ等しい。しかし乍らこの分析結果は、Apo Ｅア
ナログが真正Apo Ｅに比較して付加的なメチオニン残基
を含むことを示唆している。更に、システアミン処理に
よって示唆された１つのシステイン残基の存在も確認さ
れた。
【０５９３】完全形Apo Ｅアナログ（約６ナノモル）の
配列解析の結果、付加メチオニン残基がタンパク質のＮ
Ｈ2 末端に存在し、単鎖配列
【０５９４】
【化１８】
【０５９５】を形成することが判明した。メチオニン以
後の配列はヒトApo Ｅの残基１−１７に対応する。これ
らの結果より、Apo ＥのＮＨ2 末端をコードする部分を
再構築する合成オリゴヌクレオチドが正しく翻訳された
こと及び（細菌による翻訳開始コドンとして付加され
た）付加的メチオニンがプロセシングメカニズムによっ
て除去されなかったことが判明した。配列解析に於いて
初期収率は予想外に低かったが（約２０％）、その理由
は恐らく、ＮＨ2 −末端メチオニンの一部分がホルミル
化されたためでなく、ホルミル化タンパク質が非ホルミ
ル化ポリペプチド（及び真正Apo Ｅ）とは明らかに異な
るｐＩを有しこれが観察されなかったためであろう。
【０５９６】いくつかのＣＮＢｒペプチドをそれらのア
ミノ酸組成に関して特性決定し、（図示しないが）真正
Apo Ｅとの間に違いはないことを知見した。更にCB４
（真正Apo Ｅの残基１０９−１２５）の配列解析とCB５
の（Apo Ｅの１６４位に対応する残基までの）部分配列
解析とによって、Apo Ｅアナログが重要なレセプター結
合領域に於いては真正Apo Ｅ３と等しい配列を有するこ
とを確認した。これらのデータは全て、ＮＨ2 末端の付
加メチオニンを除くとApo ＥアナログがApo Ｅ３と等し
い構造を有することを示す。
【０５９７】Apo Ｅアナログのインビトロ及びインビボ
代謝の特性決定 Apo Ｅ．DMPC複合体のレセプター結合の比較により、Ap
o Ｅアナログが真正Apo Ｅと本質的に等しい結合特性を
有することが判明した。培養線維芽細胞上でのApoB,E(L
DL) レセプターの結合を測定をするために 125Ｉ−LDL
を用いた競合テストを行なうと、５０％置換濃度はApo
Ｅアナログで0.019 μg ／ml、真正ApoＥで0.024 μg
／mlであった（第２９図）。線維芽細胞への直接結合テ
ストでは、双方のApo Ｅ調製物が同様に結合した（第２
９図）。直接結合データのスキャッチャード(Scatchar
d) 分析によれば、生物工学Apo Ｅと真正Apo Ｅとの夫
々に対するKds 及び最大結合量は各々0.93及び0.96×１
０-10 Ｍ、並びに、29.4及び34.2μg ／mg細胞タンパク
質であった。更に、双方のApo Ｅ調製物はイヌ肝膜上の
Apo Ｅレセプターにも同様に効率良く結合した（第３０
図）。
【０５９８】Apo Ｅアナログと真正Apo Ｅとのインビボ
代謝特性とを比較すると、双方の調製物が同様の挙動を
示すことが判明した。 131Ｉ標識Apo Ｅアナログと 125
Ｉ標識真正Apo Ｅとを混合し正常ウサギ血漿と共にイン
キュベートし次に混合物を正常ウサギに注射すると双方
のラベルは等しい反応速度論に従って血液から除去され
た（第３１図）。注射後約２０分で双方のラベルの注射
量の５０％が除去された。ラベルを互いに交換して標識
したタンパク質に関しても等しい結果が得られた。また
ラットを用いたターンオーバーテストでも等しい結果が
得られた（図示せず）。従って、インビトロ及びインビ
ボのテストの双方に於いて生物工学ApoＥと真正Apo Ｅ
とは同様の特性を示し、本質的に同様に作用する。
【０５９９】要約すれば、単離Apo Ｅアナログの構造的
特性決定の結果、Apo Ｅアナログはアミノ末端の付加メ
チオニン残基を除いて真正Apo Ｅに等しい構造を有する
ことが判明した。更にインビトロ及びインビボの双方に
於いてApo Ｅアナログと真正Apo Ｅとは等しい代謝特性
を有していた。
【０６００】
【表６】
【０６０１】（注）結果は重複定量（duplicate determ
iuationg）から得られるものでありモル当りの残基とし
て示される。システインは過ギ酸酸化後別個に定量され
た。スレオニンとセリンとの値は加水分解損を補正して
いない。トリプトファンは測定されなかった。Apo Ｅ３
配列は参考文献４による。
【０６０２】参考文献目録 １．アール・ダブリュ・マーレイ（R.W.Mahley）（１９
７８）脂質及びリポタンパク質の代謝障害（Disturbanc
es in Lipid and Lipoprotein Metabolism），ジェー・
エム・ディッチー（J.M.Dietschy），エー・エム・ゴッ
トー・ジュニア(A.M.Gotto Jr.) 及びジェー・エー・オ
ント(J.A.Ontko) （米国生理学協会（Americal Physiol
ogical Society），ベセズダ（Bethesda），メリーラン
ド（MD），１８１〜１９７ページ。
【０６０３】２．アール・ダブリュ・マーレイ（R.W.Ma
hley），ティー・エル・イネラリティ（T.L.Innerarit
y），エス・シー・ラール・ジュニア(S.C.Rall Jr) 及
びケー・エッチ・ワイスグレーバー（K.H.Weisgraber）
（１９８４）ジャーナル・オブ・リピド・リサーチ（J.
Lipid Res.）２５，１２７７−１２９４。
【０６０４】３．アール・ダブリュ・マーレイ（R.W.Ma
hley）及びティー・エル・イネラリティ（T.L.Innerari
ty）（１９８３）バイオシミカ・バイオケミカ・アクタ
（Biochim.Biopys. Acta）７３７，１９７−２２２。
【０６０５】４．エス・シー・ラール・ジュニア(S.C.R
all Jr) ，ケー・エッチ・ワイスグレーバー（K.H.Weis
graber）及びアール・ダブリュ・マーレイ（R.W.Mahle
y）（１９８２）生化学会報(J.Biol. Chem.) ２５７，
４１７１−４１７８。
【０６０６】５．ジェー・ダブリュ・マクリーン（J.W.
Mclean），エヌ・エー・エルズアワバギー(N.A.Elshour
bagy) ，ディー・ジェー・チャン(D.J.Chang) , アール
・ダブリュ・マーレイ（R.W.Mahley）及びジェー・エム
・テイラー（J.M.Taylor）（１９８４）生化学会報（J.
Biol.Chem.）２５９，６４９８−６５０４。
【０６０７】６．ビー・オライゼン(B.Olaisen) ，ピー
・テイスバーグ（P.Teisherg）及びティー・ゲッドーダ
ールジュニア(T.Gedde-Dahl Jr) （１９８２）ヒューマ
ン・ジェネテイクス(Hum. Genet.) ６２，２３３−２３
６。
【０６０８】７．ワイ・ケー・ペイク（Y.K.Paik），デ
ィー・ジェー・チャン（D.J.Chang ），シー・エー・リ
アドン(C.A.Reardon) ，ジェー・イー・ダビー（J.E.Da
vies），アール・ダブリュ・マーレイ（R.W.Mahley）及
びジェー・エム・テイラー（J.M.Tayler）プロシーディ
ング・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス(P
roc.Nath.Acad.Sci.) ，米国，投稿中。
【０６０９】８．ジー・ユターマン(G.Uterman) ，ユー
・ランゲンベック（U.Langenbeck），ユー・ベイジーゲ
ル(U.Beisiegel) 及びダブリュ・ウェーバー(W.Weber)
（１９８０）アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒューマ
ン・ジェネテイクス(Am.J.Hum.Genet.) ３２，３３９−
３４７。
【０６１０】９．ヴィ・アイ・ザンス（V.I.Zannis）及
びジェー・エル・ブレスロウ(J.L.Breslew) （１９８
１）バイオケミストリイ（Biochemistry）２０，１０３
３〜１０４１。
【０６１１】１０．ヴィ・アイ・ザンス（V.I.Zanni
s），ジェー・エル・ブレスロウ(J.L.Breslew) ，ジー
・ユターマン(G.Uterman) ，アール・ダブリュ・マーレ
イ（R.W.Mahley），ケー・エッチ・ワイスグレーバー
（K.H.Weisgraber），アール・ジェー・ハーヴェル(R.
J.Havei) ，ジェー・エル・ゴールドシュタイン(J.L.Go
ldstein) ，エム・エス・ブラウン(M.S.Brown) ，ジー
・ションフェルド(G.Schonfeld)，ダブリュ・アール・
ハザード(W.R.Hazzard) ，シー・ブラン（C.Blum）（１
９８２）ジャーナル・オブ・リピド・リサーチ（J.Lipi
d Res.）２３，９１１−９１４。
【０６１２】１１．ジー・ユターマン(G.Uterman) ，エ
ー・シュタインメッツ（A.Steinmets）及びダブリュ・
ウェーバー(W.Weber) （１９８２）ヒューマン・ジェネ
テイクス（Hum.Genet.）６０，３４４−３５１。
【０６１３】１２．アール・ジェー・ハーベル(R.J.Hav
el) （１９８２）米国医学講座（Med.Clin.North Am.）
６６，４４１−４５４。
【０６１４】１３．エッチ・ジェー・メンゼル（H.J.Me
nzel），アール・ジー・クラデッキー(R.G.Kladetzky)
及びジー・アスマン(G.Assman)（１９８３）ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリイ（J.Biol.Che
m.）２５６，９０７７−ｄ９０８３。
【０６１５】１４．ケー・エッチ・ワイスグレーバー
（K.H.Weisgraber）等，ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリイ（J.Biol.Chem.）２５６，９０７７
−９０８３。
【０６１６】１５．エス・シー・ラール・ジュニア(S.
C.Rall Jr) ，ケー・エッチ・ワイスグレーバー（K.H.W
eisgraber），ティー・エル・イネラリティ（T.L.Inner
arity）及びアール・ダブリュ・マーレイ（R.W.Mahle
y）（１９８２）プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミック・サイエンス(Proc.Patl.Acad.Sci.) ，
米国，７９，４６９６〜４７００。
【０６１７】１６．エス・シー・ラール・ジュニア(S.
C.Rall Jr) ，ケー・エッチ・ワイスグレーバー（K.H.W
eisgraber），ティー・エル・イネラリティ（T.L.Inner
arity），アール・ダブリュ・マーレイ（R.W.Mahley）
及びジー・アスマン(G.Assman)（１９８３）臨床研究会
報（J.Clin.Invest.）７１，１０２３−１０３１。
【０６１８】１７．ケー・エッチ・ワイスグレーバー
（K.H.Weisgraber），エス・シー・ラール・ジュニア
(S.C.Rall Jr) ，ティー・エル・イネラリティ（T.L.In
nerarity），アール・ダブリュ・マーレイ（R.W.Mahle
y），ティー・クーシ(T.Kuusi) 及びシー・エーンホル
ム（C.Ehnholm ）（１９８４）臨床研究会報（J.Clin.I
nnest.）７３，１０２４−１０３３。
【０６１９】１９．アール・ダブリュ・マーレイ（R.W.
Mahley），ティー・エル・イネラリティ（T.L.Innerari
ty），エス・シー・ラール・ジュニア(S.C.Rall Jr) 及
びケー・エッチ・ワイスグレーバー（K.H.Weisgraber）
ニューヨーク科学学会年報（Ann.NY Acad.Sci.）投稿
中。
【０６２０】２０．ティー・エル・イネラリティ（T.L.
Innerarity），イー・ジェー・フリードランダー(E.J.F
riedlander) ，エス・シー・ラール・ジュニア(S.C.Ral
l Jr)，ケー・エッチ・ワイスグレーバー（K.H.Weisgra
ber）及びアール・ダブリュ・マーレイ（R.W.Mahley）
（１９８３）生化学会報（J.Biol.Chem.）２５８，１２
３４１−１２３４７。
【０６２１】２０ａ．ティー・エル・イネラリティ（T.
L.Innerarity），ケー・エッチ・ワイスグレーバー（K.
H.Weisgraber），ケー・エス・アーノルド（K.S.Arnol
d），エス・シー・ラール・ジュニア（S.C.Rall Jr ）
及びアール・ダブリュ・マーレイ（R.W.Mahley）（１９
８４）生化学会報（J.Biol.Chem.）２５９，７２６１−
７２６７。
【０６２２】２１．ケー・エッチ・ワイスグレーバー
（K・H・Weisgraber），ティー・エル・イネラリティ（T.
L.Innerarity），ケー・ジェー・ハーダー（K.J.Harde
r），アール・ダブリュ・マーレイ（R.W.Mahley），ア
ール・ダブリュ・ミルン(R.W.Milne) ，ワイ・エル・マ
ーセル（Y.L.Marcel）及びジェー・ティー・スパロウ
(J.T.Sparrow) （１９８３）生化学会報（J.Biol.Che
m.）２５９，１２３４８−１２３５４。
【０６２３】２６．ユー・ケー・レムリ(U.K.Laemmli)
（１９７０）ネイチャー（Nature）（ロンドン）２２
７：６８０−６８５。
【０６２４】２７．エッチ・タウビン（H.Towbin），テ
ィー・スターヘリン（T.Staehelin ）及びジェー・ゴー
ドン（J.Gordon）（１９７９）プロシーディング・オブ
・ナショナル・アカデミック・サイエンス(Proc.Natl.A
cad.Sci.) 米国１４８：１０７−１２７。
【０６２５】２８．エッチ・ジェー・マンゼル（H.J.Ma
nzel）等（１９８４），生化学会報（J.Biol.Chem.）２
５４：３０７０−３０７６（１９８４）。
【０６２６】２９．ケー・エッチ・ワイスグレーバー
（K.H.Weisgraber）及びアール・ダブリュ・マーレイ
（R.W.Mahley）（１９８０）ジャーナル・オブ・リピド
・リサーチ（J.Lipid.Res.）２１，３１６−３２５。
【０６２７】３０．ティー・エル・イネラリティ（T.L.
Innerarity），アール・イー・パイタス(R.E.Pitas) 及
びアール・ダブリュ・マーレイ（R.W.Mahley）（１９７
９）生化学会報（J.Biol.Chem.）２５４，４１８６−４
１９０。
【０６２８】３１．ティー・エル・イネラリティ（T.L.
Innerarity）及びアール・ダブリュ・マーレイ（R.W.Ma
hley）（１９７８）バイオケミストリイ（Biochemistr
y）１７，１４４０−１４４７。
【０６２９】３２．ディー・ワイ・ヒューイ(D.Y.Hui)
，ティー・エル・イネラリティ（T.L.Innerarity）及
びアール・ダブリュ・マーレイ（R.W.Mahley）（１９８
１）生化学会報（J.Biol.Chem.）２５６，５６４６−５
６５５。
【０６３０】３３．アール・ダブリュ・マーレイ（R.W.
Mahley），ティー・エル・イネラリティ（T.L.Innerari
ty），ケー・エッチ・ワイスグレーバー（K.H.Weisgrab
er）及びエス・ワイ・オ（S.Y.Oh）（１９７９）臨床研
究会報（J.Clin.Iuvest.）６４，７４３−７５０。
【０６３１】実施例３９ met-asp-gln-bGH アナログの生物学的活性 最近の研究によれば（ピー・ジェー・エパード（P.J.Ep
pard）及びディー・イー・バウマン（D.E.Bauman）、１
９８４年コーネル食品製造業者用栄養学会会報(Proceed
ings of １９８４ Cornell Nutrition Conference for
Food Manufacturers）５〜１２ページ）、メチオニル−
ウシ成長ホルモンを１２時間に亘り連続投与すると、コ
ントロールに比較して１０〜４０％の産乳量の増加が得
られた。実施例１３に記載の如く増殖、回収及び精製さ
れたpHG ４４プラスミドでコードされたmet-asp-gln-bG
H アナログを使用しても同様の結果が得られた。
【０６３２】実施例４０ met-pGH アナログの生物学的活性 最近の研究（シー・エー・スペンスC.A.Spence等の論文
「雌ブタの胎児内エネルギ蓄積及び乳汗分泌性能に関す
る外因性成長ホルモンの効果(Fffect of Exogeneous Gr
owth Hormone On Fetal Energy Storage and Lactation
Performance in Sows) 」、米国動物科学協会年例会
（The Annual Meeting of The American Society of An
imal Science）、ミズーリ大学、１９８４年８月７〜１
０日）によれば、下垂体由来のブタ成長ホルモンは雌ブ
タの乳汗分泌と同産仔ブタの生存率とを向上させること
が判明している。乳汗分泌性能テストに於いて、met-pG
H アナログを妊娠ブタに投与すると、雌ブタの乳汗分泌
と同産仔ブタの生存率とが改良された。
【０６３３】実施例４１ 脊髄虚血の治療に於ける組換SOD の使用 麻酔をかけた犬をニコレットコンパクト(Nicolet Compa
ct) ４励起ポテンシャルシステムにつなぎ、後脳骨神経
に4.7 回／秒の割合で連続的に２５０回の刺激を与えて
基準量SEP （体感励起ポテンシャル（Somatosensory Ev
oked Potentials ））を得た。２５０回の刺激に関する
励起ポテンシャルをFpz とCz（頭皮上の２つの特異点）
での２つの電極から記録し、信号平均化装置で平均化し
て信号対ノイズ比を低減し、SEP をスクリーンにディス
プレイした。
【０６３４】次に、左胸部を切開し、左鎖骨下動脈の真
向いの遠位の下行大動脈を解剖単離してクロスクランプ
ができるように準備した。動脈のクロスクランプを行な
う予定部位の近傍に巾着縫合糸を挿入した。また、近位
の動脈血圧をモニターし同時に実験グループについては
投与薬剤の注入をモニターするために２０ゲージサイズ
のカニューレを挿入した。更に、動脈のクロスクランプ
後の血圧のモニターと血圧調節用の瀉血とを行なうため
に１４ゲージサイズのカニューレを右大腿動脈に挿入し
た。溶血ガスを連続的に採取し、溶血ガスが正常範囲内
に維持されるようにしスピレータを調節した。
【０６３５】次に左鎖骨下動脈の真向の遠位の動脈のク
ロスクランプを実施した。SEP は１分間隔でリピートし
た。近位動脈の高血圧をコントロールするために、平均
血圧を９０〜１１０mmHgに維持するように大腿動脈から
瀉血した。SEP 消滅後、動脈クロスクランプを１０分間
維持した。SEP 追跡図の消滅は、胸大動脈のクロスクラ
ンプによって生じた脊髄内部の虚血が、脊髄の背柱内部
の求心性インパルスの伝達を調節できないほど重症にな
ったことを意味する。SEP 消滅の１０分後にクロスクラ
ンプを中止した。犬が低血圧状態になったため、血液、
リンガー（Ringer）乳酸塩及び炭酸水素ナトリウムを注
入した。
【０６３６】コントロールグループ（８頭）に対しては
組換SOD を与えなかった。１つの実験グループ（８頭）
に対しては、クロスクランプ中止以前に組換SOD ２５，
０００単位の丸塊を投与し以後１０分間は５，０００単
位／分ずつ投与した。第２の実験グループ（７頭）に対
しては、クロスクランプ中止以前に組換SOD を５０，０
００単位投与し、以後１０分間は１０，０００単位／分
ずつ投与した。
【０６３７】手術後、後肢の神経状態をターロブ（Tarl
ov）の判定基準によって採点した。この判定基準では、
０＝後肢麻痺、１＝後肢が僅かに運動可、２＝後肢が十
分に動けるが起立が不可、３＝立てるが正常ではない、
４＝完全回復を示す。手術の７日後、基準量と比較する
ためにSEP をリピートし記録した。その後、動物を殺し
た。結果は以下の通りである。
【０６３８】手術後７日目の神経状態、(POD) ：コント
ロールグループ（８頭） −４頭が評点０ −４頭が評点２又は３ 第１実験グループ−２５，０００単位のSOD 丸塊プラス
５，０００単位／分×１０回の投与 −６頭が完全回復 −２頭が評点２又は３ 第２実験グループ−５０，０００単位のSOD 丸塊プラス
１０，０００単位／分×１０回の投与 −７頭全部が完全回復。
【０６３９】動脈クロスクランプの開始後、SEP 消滅ま
でに要する時間は１２〜１９分である。SEP 消滅後にク
ロスクランプを十分間継続したので、クロスクランプの
総継続時間は２０分より長くなる。
【０６４０】切開胸部の縫合後の手術直後期間内に再度
SEP を検査した。
【０６４１】コントロール動物ではSEP 追跡図が得られ
なかった。対照的に処置動物では潜伏期間の波形遅れを
伴なうSEP 追跡図が回復していた。
【０６４２】要約すれば、組換SOD は脊髄虚血による神
経障害を防止するために有効である。この処置方法は胸
大動脈瘤の外科手術の際に特に重要である。
【図面の簡単な説明】
【図１】pAL ５００の構築説明図。
【図２】pRO ２１１とpRO １２の構築説明図。
【図３】pSAL５２００−６の構築説明図。
【図４】ｐ３００８の構築説明図。
【図５】ｐ５００２の構築説明図。
【図６】pHG ４４とpHG ５０の構築説明図。
【図７】ｐ８３００−１０Ａの構築説明図。
【図８】pSAL−１３０／５とpSAL−１７０／１０の構築
説明図。
【図９】pSAL−２１０／４の構築説明図。
【図１０】pSAL５６００−１の構築説明図。
【図１１】ｐ３００９の構築説明図。
【図１２】ｐ５００３の構築説明図。
【図１３】pSODα２の構築説明図。
【図１４】pSODα１３とpSODβ1 の構築説明図。
【図１５】pSODβ1 Ｔ11の構築説明図。
【図１６】pSODβ1 Ｔ ＬＴ−１の構築説明図。
【図１７】pSODβ1 −ＢＡ２の構築説明図。
【図１８】pTV −１８８の構築説明図。
【図１９】ｐ５７９の構築説明図。
【図２０】pTV −１７０の構築説明図。
【図２１】pTV −１９０の構築説明図。
【図２２】pTV −１９４の構築説明図。
【図２３】pSAL１６０−５の構築説明図。
【図２４】pTV −２１４の構築説明図。
【図２５】pTV ２７９−８の構築説明図。
【図２６】ｐ９２００の構築説明図。
【図２７】pTV ３００の構築説明図である。
【図２８】Apo Ｅアナログの細胞内蓄積に伴う細胞毒性
を示し、横軸は培養時間を、縦軸はコロニー数を表わ
す。
【図２９】線維芽細胞のApo-B,E (LDL) レセプターに対
するApo Ｅ・DMPC複合体の結合を示し、左図は培養線維
芽細胞レセプターに対する結合能、右図は培養線維芽細
胞に対する直接結合能を表わす。横軸はApo Ｅ・DMPC複
合体の濃度、縦軸は結合率を表わす。
【図３０】肝臓膜のApo Ｅレセプターに対する 125Ｉ−
Apo Ｅ・DMPC複合体の結合を示す。横軸は 125Ｉ−Apo
Ｅ・DMPC複合体の濃度、縦軸は結合の量を表わす。
【図３１】ウサギ血漿からのヨウ素化Apo Ｅのクリアラ
ンスを示す。横軸は時間、縦軸は血漿中の放射活性の％
を表わす。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 8828−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/21 // Ａ６１Ｋ 38/00 9162−4Ｂ 15/00 ＺＮＡＡ 38/44 Ａ６１Ｋ 37/22 Ｃ１２Ｎ 1/21 37/50 (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 ６４４６７１ (32)優先日 1984年８月27日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６４５１１９ (32)優先日 1984年８月27日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 マリアン・ゴレツキ イスラエル国、レホヴオツト、ハナシ・ハ リシヨン・ストリート・５ (72)発明者 ヤコブ・アール・ハートマン イスラエル国、ホロン、ケドシエイ・カヒ ール・ストリート・30 (72)発明者 ドヴ・カナー イスラエル国、レホヴオツト、ゴードン・ ストリート・21 (72)発明者 アヴイグドル・レヴアノン イスラエル国、ネタンヤ、ボロデツキイ・ ストリート・３ (72)発明者 ヒラ・ロツカー−ギラデイ イスラエル国、エルサレム、ハーラツプ・ ストリート・39 (72)発明者 アモス・ビー・オツペンハイム イスラエル国、エルサレム、シユレム・ス トリート・５／12

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 天然のヒトアポリポプロテインＥのＮ−
    末端に付加されたアミノ酸メチオニンを有する、ヒトア
    ポリポプロテインＥのアナログ。
  2. 【請求項２】 天然のヒトアポリポプロテインＥのＮ−
    末端に付加されたアミノ酸ｍｅｔ−ｌｅｕ−ｌｅｕ−ｌ
    ｅｕ−ｍｅｔを有する、ヒトアポリポプロテインＥのア
    ナログ。
  3. 【請求項３】 天然のヒトスーパーオキシドジスムター
    ゼまたはそのアナログの非アセチル化形からなる、ヒト
    スーパーオキシドジスムターゼのアナログ。
  4. 【請求項４】 天然のヒトスーパーオキシドジスムター
    ゼのアナログの非グリコシル化形からなる、ヒトスーパ
    ーオキシドジスムターゼのアナログ。
  5. 【請求項５】 ヒトＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスム
    ターゼアポ酵素を酵素的に活性な酵素を生成するのに有
    効な量のＣｕ++イオンおよびＺｎ++イオンと接触させる
    ことからなる酵素的に活性なヒトＣｕ／Ｚｎスーパーオ
    キシドジスムターゼ酵素を生成する方法であって、Ｃｕ
    ++イオンおよびＺｎ++イオンの各量が酵素の活性サイト
    あたり１モルを超える量であることを特徴とする方法。
  6. 【請求項６】 Ｎ末端がアセチル化されていない、天然
    のヒトＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼと実質
    的に同じアミノ酸配列および天然のヒトＣｕ／Ｚｎスー
    パーオキシドジスムターゼと実質的に同じ生物学的活性
    を有する酵素的に活性なヒトＣｕ／Ｚｎスーパーオキシ
    ドジスムターゼのポリペプチドアナログを産生する方法
    であって、(a) 前記ヒトＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジ
    スムターゼのポリペプチドアナログをコードするＤＮＡ
    を含むプラスミドで形質転換された細菌細胞の培養物
    を、形質転換された細胞がヒトＣｕ／Ｚｎスーパーオキ
    シドジスムターゼのポリペプチドアナログをコードする
    ＤＮＡを発現し得る条件下で増殖させ、(b) 得られた細
    胞培養物を誘導してＤＮＡを発現させ、細菌細胞中でヒ
    トＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼのポリペプ
    チドアナログを産生させ、(c) 産生されたヒトＣｕ／Ｚ
    ｎスーパーオキシドジスムターゼのポリペプチドアナロ
    グを十分なＣｕ++イオンおよびＺｎ++イオンと接触させ
    て酵素的に活性なヒトＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジス
    ムターゼのポリペプチドアナログを得、(d) 酵素的に活
    性なヒトＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼのポ
    リペプチドアナログを回収することからなることを特徴
    とする方法。
  7. 【請求項７】 前記接触がＣｕ++イオンおよびＺｎ++イ
    オンを含む溶液に対する透析からなる請求項６の方法。
  8. 【請求項８】 前記接触が工程(b) の誘導された細菌細
    胞Ｃｕ++イオンおよびＺｎ++イオンを含む緩衝液中で破
    砕することからなる請求項６の方法。
  9. 【請求項９】 工程(c) の接触の前に工程(b) のヒトＣ
    ｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼのポリペプチド
    アナログをアポ酵素に変換する請求項６の方法。
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