HU214977B - Eljárás polipeptidek előállítására bakteriális gazdasejtekben javított tulajdonságú, lambda PL-promotort tartalmazó vektorok alkalmazásával - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás kívánt polipeptid előállítására bakteriális, termolabilis C_T represszort tartalmazó gazdasejtben, λ-fág eredetű P_LO_L-promotort, N-hasznosító helyet, riboszómakötő-helyet, szelekciós markert és klónozóhelyeket tartalmazó plazmid alkalmazásával.

A genetikai manipulációk egyik szempontja magában foglalja az eukarióta forrásokból származó idegen DNS-szekvenciák beiktatását Escherichia coli-ba vagy más mikroorganizmusokba. A genetikai manipulációk egy további tökéletesítése az így létrejött mikroorganizmusok indukciójával az idegen DNS által kódolt polipeptidek termelésére vonatkozik. A polipeptidek termelését kétlépcsős folyamatnak lehet tekinteni, ahol mindegyik lépés számos allépést foglal magában. A két lépés az átírás (transzkripció) és transzláció. Hogy a polipeptidet hatékonyan és nagy mennyiségben állíthassuk elő, a folyamat mindkét lépésének hatékonynak kell lennie. Az átírás az mRNS termelése a génből (DNS). A transzláció a polipeptid termelése az mRNS-ből.

Az átírási folyamat kritikus allépése a beindítás (iniciáció), azaz az RNS polimeráz kötődése egy promotor-operátor területhez. A dezoxiribonukleotid bázisok szekvenciája, amely kialakítja a promotor területet, változhat, és ezáltal hat a promotor relatív hatékonyságára. A hatékonyság függ az RNS polimeráz affinitásától a promotorhoz.

A transzláció hatékonyságára az mRNS-stabilitása hat. Az mRNS megnövekedett stabilitása lehetővé teszi a megjavult transzlációt. Bár az mRNS-stabilitás pontos determinánsai nem ismeretesek pontosan, ismeretes, hogy az mRNS szekunder szerkezete, amint ezt bázisainak szekvenciájával meghatározzuk, szereppel bír a stabilitásban.

A transzláció kezdeti allépése magában foglalja a riboszóma kötését egy bázisszekvenciához az mRNSen, amely szekvencia mint Shine-Dalgamo-szekvencia vagy riboszomális kötőhely (RBS) ismeretes. A polipeptidek szintézise akkor kezdődik, amikor a riboszóma végigvándorol az mRNS mentén az AUG start-kodonhoz a transzláció érdekében. Általában ezek a kodonok mintegy 10 bázissal „lefelé” találhatók a Shine-Dalgamo-helytől. Azok a faktorok, amelyek növelik a transzláció hatékonyságát, olyanok lehetnek, amelyek fokozzák a riboszómák kötését a Shine-Dalgamo-helyhez. Kimutatták, hogy az mRNS szerkezete a Shine-Dalgamo-szekvencia és az AUG-kodon területében és a távolság a Shine-Dalgamo-szekvencia és az AUG-kodon között kritikus szerepet játszik a transzláció hatékonyságának megállapításában. További tényezők, amelyek hatnak a transzláció hatékonyságára, a korai befejezés és a legyengítés. A transzláció hatékonyságát lehet javítani a gyengítő (attenuáló) helyek eltávolításával.

Egy nehézség, amellyel szemben találjuk magunkat a nagy mennyiségű eukarióta polipeptid bakteriális sejtben való termelésére irányuló kísérletekben, a sejtek azon képességének hiánya, hogy nagy mennyiségű mRNS-t termeljenek, hogy hatékonyan nőjenek. Ezt a nehézséget el lehet tüntetni az átírás megelőzésével egy repressziónak ismert folyamattal. A repressziós gének kikapcsolódnak egy fehérjeinhibitor (represszorfehéije) működése következtében, amely megakadályozza az átírást az operátor területhez való kötéssel. Miután a mikroorganizmus kinőtt a kívánt sejtsűrűségre, a represszált gén aktiválódik a represszor destrukciójával, vagy egy induktomak ismert molekula hozzáadásával, amely felülmúlja a represszor hatását.

Számos közleményt lehet találni az irodalomban, amelyek az eukarióta gének klónozására vonatkoznak a λ-bakteriofágból származó P_L-promotort tartalmazó plazmidokban [Bemard, Η. V. és munkatársai: Gene, 5, 59 (1979); Deron, C. és munkatársai: Gene, 17, 45 (1982); Gheysen, D. és munkatársai: Gene, 17, 55 (1982); Hedgpeht, J. és munkatársai: Mól. Gén. Génét., 163, 197 (1978); Rcmout, E. és munkatársai: Gene, 15, 81 (1981); és Derynck, R. és munkatársai: Natúré, 287,193 (1980)]. Ezeken kívül a 041,767 számú európai szabadalmi bejelentés, amelyet 1981. december 16-án tettek közzé, leírja a λ-bakteriofágból származó P_L-promotort tartalmazó kifejeződő vektorokat. Ezeknek az irodalmi hivatkozásoknak azonban egyike sem írja le a C_n riboszomális kötőhely alkalmazását.

A λ-bakteriofágból származó P_L-promotort és C_n riboszomális kötőhelyet tartalmazó vektort már leírták [Oppenheim, A. B. és munkatársai: J. Mól. Bioi, 158, 327 (1982); és Shimatake, H. és Rosenberg, M.: Natúré, 292, 128 (1981)]. Ezek a közlemények leírták a C_n-fehérje megnövekedett szintű termelését, de nem vonatkoztatták ezt eukarióta fehérjék termelésére, és nem írták le ezt.

Más vektorokat is írtak le, amelyek tartalmazzák a P_L-promotort és a C_n riboszomális kötőhelyet [Courtney, M. és munkatársai: PNAS, 81, 669-673. (1984); Lautenberger, J. A. és munkatársai: Gene, 23, 75-84 (1983); és Lautenberger, J. A. és munkatársai: Science, 221, 858-860. (1983)]. Mindezek a vektorok azonban fúziós fehéijék termeléséhez vezetnek, amelyek a C_n-fehérje aminoterminális részét tartalmazzák.

1982-ben Shatzman és Rosenberg mutattak be egy posztert a 14. Miami Téli Szimpóziumon [Shatzman, A. R. és Rosenberg, M.: 14. Miami Winter Symposium, Kivonatok, 98. oldal (1982)]. Ez a kivonat egy olyan vektor használatának kivitelre nem alkalmas bemutatását nyújtja, amely λ-bakteriofágból származó P_L-t, Nutot és a Cn riboszomális kötőhelyet tartalmaz, azzal a céllal, hogy egy „eukarióta” polipeptidet (a SV40 kis T antigén valójában nem eukarióta polipeptid, hanem virális polipeptid) szintetizáljanak a sejtfehérje több mint 5%-nyi mennyiségében, egy meg nem nevezett bakteriális gazdasejtben. Az alkalmazott operátor nincs meghatározva. Sem a replikáció kezdőpontja (origin), sem szelektálható fenotípushoz tartozó gén nincs azonosítva. Ez a rendszer, amellyel a vektort használjuk, úgy van leírva, hogy bizonyos gazdaszervezet lizogéneket foglal magában, amelyekbe a vektort stabilan lehet transzformálni.

A bejelentők tisztában vannak azzal, hogy létezik egy függőben lévő szabadalmi bejelentés M. Rosenberg nevén, 457,352 bejelentési sorozatszámon [Bejelentő: National Institues of Health, Department of Health and

HU 214 977 Β

Humán Services (Nemzeti Egészségügyi Intézmények, Egészségügyi és Embervédelmi Osztály), USA]. Ennek a bejelentésnek a részletei hozzáférhetők a National Technical Information Service, US Department of Commerce-nél (Egyesült Államok Kereskedelmi Minisztérium, Nemzeti Technikai Információs Szolgálat). Az igénypontok azonban nem hozzáférhetőek, és bizalmasan kezelik azokat. A bejelentés hozzáférhető részét átvizsgáltuk, ennek részletezése azonban nem kielégítő. Ez az ismertetés jelzi, hogy a gazdaszervezetnek fontos szerepe van (8. oldal, 17. sor), ugyanakkor nem nevez meg egyetlen megfelelő gazdaszervezetet sem. Ez az eljárás továbbá függ egy mutáns alkalmazásától, de ez nincs részletesen megnevezve (4. oldal, 20. sor). Ez az ismertetés azt is jelzi, hogy a gazdaszervezet lizogéneket tartalmaz (8. oldal, 18. sor), nem úgy, mint a jelen találmány, amelyben a gazdaszervezet nem lizogén. Ebben az említett leírásban egy eukarióta gén, a majom metallotionein gén klónozásáról és kifejeződéséről esik szó (7. oldal, 18. sor), de részleteket nem adnak meg. Ez az ismertetés megadja, hogy semmiféle nukleotidnak sem szekvenciája, sem helyzete a C_n riboszomális kötőterületben nem változott (3. oldal, 27. sor).

A függőben lévő 514,188 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (bejelentve 1983. július 15-én) új vektorokat ír le, amelyek polipeptidek kifejeződéséhez alkalmasak baktériumokban. Ezek a vektorok magukban foglalnak Pi Oj -t, Nhasznosító helyet antiterminátor N-fehérje kötéséhez, riboszomális kötőhelyet, ATG-kodont, restrikciós enzimhelyet a kívánt polipeptidet kódoló gén beiktatásához, egy replikációs kiindulást (origót), és egy szelektálható markert. Ezekben a vektorokban a távolság az N hasznosító hely és a riboszomális kötőhely között nagyobb, mint körülbelül 300 bázispár. Ezenkívül ezeknek a vektoroknak mindegyike tartalmaz egy fajlagos riboszomális kötőhelyet, amelyet nem lehet könnyen helyettesíteni. Ezek a vektorok nem egyformán hasznosak különböző polipeptidek kifejeződéséhez.

T)T₂ rRNS átíróterminációs (befejező) szekvenciákat írtak le Brosius és társai [J. Mól. Bioi., 148, 107 (1981)]. A T]T₂ rRNS terminációs szekvenciáinak elhelyezését egy prokarióta gén 3’-végénél, és az ilyen gén kifejeződését egy promotor szabályozása alatt már leírták [Amann, E. és munkatársai: Gene, 25, 167 (1983); Zabeau, M. és munkatársai: The EMBO Journal, 1, 1217(1982)].

A 81304573.9 számú európai szabadalmi bejelentés, amelyet 1982. április 14-én publikáltak 049,619 európai közrebocsátási számon, ismerteti a λεΙ857 hőindukálható represszomak mint stabilizáló elemnek az alkalmazását. A represszor a píazmidon van klónozva. Tel90 profágot, amely a represszorszintézisben hiányos, vezetnek be átfertőzéssel. A profágot a klónozott represszor segítségével tartják fenn 32 °C hőmérséklet alatt. Bármelyik sejt, amely a plazmidot elveszti, lizálódik. Ha a hőmérsékletet 38 °C fölé emelik, a represszor elroncsolódik vagy inaktiválódik, és a sejtek lizálódnak. Ez a stabilizáló rendszer nem fér össze a jelen találmány szerinti vektorokkal, amelyek ÁP_L-promotort foglalnak magukban, és amelyek 38 °C fölötti hőmérsékleteknél polipeptideket fejeznek ki.

A replikáció origói a konstitutíven nagy kópiaszámú plazmidokból ismertek. így például a ColEl-ből származó ρΟΡ1Δ6 replikációs origót írták le Gelfand, D. H. és munkatársai: PNAS, 75 (12) 5869 (1978), és Muesing, M. és munkatársai: Cell, 45, 235 (1981). Ezenkívül ismeretesek a konstitutív nagy kópiaszámú plazmidoktól megkülönböztethető nagy kópiaszámú „elszabadult” (runaway) replikációs plazmidok [Remaut, E. és munkatársai: Gene, 22,103 (1983)].

A jelen találmány olyan kifejeződő vektorokra vonatkozik, amelyek váratlanul különböző polipeptidek megnövekedett kifejeződését nyújtják. A jelen találmány szerinti vektorokban különböző riboszomális kötőhelyek alkalmazásával lehetséges különböző polipeptidek megnövekedett kifejeződési szintjét elérni a korábbi vektorokkal elért szintekhez viszonyítva. Ezenkívül azonos riboszomális kötőhelyeket alkalmazva, mint a korábbi vektorokban, lehetséges azonos polipeptidek megnövekedett kifejeződését elérni. Ezen túl egy polipeptidet, amelynek kifejeződése a célunk, kódoló gén 3’-végénél T_tT₂ rRNS terminációs szekvencia elhelyezésével lehetséges növelni a kívánt polipeptid mennyiségét, a bakteriális gazdaszervezet által termelt teljes polipeptidhez viszonyítva. Nagy jelentőségű, hogy a T_tT₂ rRNS átíróterminációs szekvenciák jelenléte lehetővé teszi, hogy a konstitutív nagy kópiaszámú plazmidokból származó replikációs origók beépüljenek a kifejeződő vektorokba anélkül, hogy csökkenne a képesség a replikációra konstitutíven nagy kópiaszámban.

A pBR322-ből, vagy nem konstitutíven nagy kópiaszámú, az „elszabadult” nagy kópiaszámú plazmidoktól eltérő vektorokból származó replikációs origó, amikor egy vektorba építjük be, sejtenként csak bizonyos kópiaszám előállítására képes, ez tipikusan 40 kópia/sejt. Egy konstitutíven nagy kópiaszámú plazmídból eredő replikációs origó helyettesítésével váratlanul azt találtuk, hogy a polipeptid kifejeződésszintje növekszik.

A jelen találmány szerinti vektorok stabilizálódnak a bakteriális gazdaszervezetben, és amikor a polipeptideket kódoló vektorokat és géneket magában foglaló plazmidokat tartalmazó baktériumokat növesztjük, a plazmidok nem vesznek el. Ezen az úton a plazmidok instabilitása által okozott kitermeléscsökkenést leküzdjük. Ezen túl az ilyen előnyös vektorok alkalmazása elkerüli az antibiotikum-rezisztencia, mint szelektálható marker alkalmazását, így lehetővé teszi a költségek alacsonyabb szinten tartását a polipeptidek előállításához.

A szuperoxid-diszmutáz (SÓD) és analógjaik azok közé a polipeptidek közé tartoznak, amelyeket elő lehet állítani a jelen találmány szerinti kifejeződő vektorokat alkalmazva.

A jelen találmány különösen olyan kifejeződő plazmidokra vonatkozik, amelyek nem várt módon szuperoxid-diszmutáz és analógjai megnövekedett kifejeződését nyújtják, ugyanazokat a riboszomális kötőhelyeket alkalmazva, mint a korábbi vektorokban, és alkalmazva különböző riboszomális kötőhelyeket is, amint ezt a jelen találmányban leírjuk.

HU 214 977 Β

A jelen találmány olyan módszerekre is vonatkozik, amelyek az SÓD és analógjai megnövekedett termeléséhez vezetnek az ezeket a plazmidokat alkalmazó baktériumokban.

A szuperoxid-diszmutázt (SÓD) és az oxigén-szabadgyökök (O₂.~) jelenséget 1968-ban fedezte fel McCord és Fridovich [McCord, J. M. és Fridovich, I.: J. Bioi. Chem., 244, 6049-6055. (1969)]. Szuperoxid-gyökök és más, igen reaktív oxigénfajták termelődnek minden lélegző sejtben, mint az oxidatív metabolizmus melléktermékei, és ezekről kimutatták, hogy kiterjedt kárt okoznak a makromolekulák és a sejtkomponensek széles választékában [erről szóló összefoglaló munkák: Fridovich, I. ismertetése az Advances in Inorganic Biochemistry című kiadvány (1970) 67—90. oldalán (szerkesztők: Eichhom, G. L. és Marzilli, L. G., kiadó: Elsevier/North Holland, New York), és Freeman, B. A. és Crapo, J. D.: Laboratory Investigation, 47, 412-426. (1982)]. A metalloproteinek szuperoxid-diszmutázként ismert csoportja katalizálja a következő oxidációs-redukciós reakciót:

2O₂ - + 2H⁺—> H₂O₂ + O₂, és így védekezőmechanizmust nyújt az oxigén toxieitása ellen. Az SOD-knek három formája ismeretes, ezek különböző fémeket tartalmaznak a fehérjemolekulákban, nevezetesen vasat, mangánt, vagy mind rezet, mind cinket. Mindegyikük ugyanazt a reakciót katalizálja teljes hatékonysággal, és mind azonos mechanizmussal működnek, amelyben a fém a katalizáló tényező az aktív helyen. Ezek az enzimek különböző fejlődési csoportokba esnek. Az Mn- és Fe-SOD-ket elsősorban a prokarióta sejtekben találjuk meg, míg a CuZn-SOD látszólag minden eukarióta organizmusban kimutatható [Steinman, Η. M. közleménye a „Superoxide Dismutase” c. kiadványban (1982), a 11-68. oldalon (szerkesztő: Oberley, L. W.; kiadó: CRC Press, Florida)].

A humán Cu/Zn SOD-1 dimer metalloprotein, amely azonos, nem kovalensen kötött alegységekből tevődik össze, minden alegység 16 000 dalton molekulasúlyú, és egy atom rezet, valamint 1 atom cinket tartalmaz [Hartz, J. W. és Deutsch, H. F.: J. Bioi. Chem., 247, 7043-7050. (1972)]. Minden alegység 153 aminosavból áll, amelyek szekvenciáját megállapították [Jabusch, J. R., Farb, D. L., Kerschensteiner, D. A. és Deutsch, H. F.: Biochemistry, 19, 2310-2316. (1980); és Bárrá, D., Martini, F., Bannister, J.V., Schinina, M. W., Rotilio, W.

H., Bannister, W. H. és Bossa, F.: FEBS Letters, 120, 53-56. (1980)]. Ezenkívül a humán SOD-1 teljes kódoló területét tartalmazó cDNS-klónt nemrégiben izolálták, és szekvenciáját meghatározták [Lieman-Hurwitz, J., Dafni, N., Lavie, V. és Groner, Y.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 2808—2811. (1982); és Sherman, L., Dafni, N., Leiman-Hurwitz, J. és Groner, Y.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 5465-5469. (1983)].

A termelt humán Cu-Zn SOD-analóg különbözik a természetes humán Cu-Zn SOD-től annyiban, hogy az aminoterminálison az alanin nincs acetilezve. A természetes humán SOD-ben az aminoterminálison az alanin acetilezve van [Hartz, J. W. és Deutsch, H. F.: J. Bioi. Chem., 247, 7043-7050. (1972); Jabusch, J. R. és munkatársai: Biochemistry, 19, 2310-2316. (1980); Bárrá és munkatársai: FEBS Letters, 120, 53 (1980); és Obelry, L. W.: Superoxide Dismutase (1982), I. kötet, 32-33. oldal (kiadó: CRC Press, Florida)]. A természetes humán SÓD valószínűleg ugyanúgy glikozileződik, mint a bovin SÓD (Huber, W.: 3,579,495 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, kiadva 1971. május 18-án).

A bakteriális úton előállított SÓD csaknem biztosan nem glikozilezett, mivel az Escherichia coli nem glikozilezi azokat a fehérjéket, amelyeket termel. A bakteriális úton termelt SOD-analóg aminosav-szekvenciája azonos az érett humán SÓD aminosav-szekvenciájával, és nem tartalmaz metionin-gyököt N-terminálisánál.

A jelen találmány eljárást nyújt a humán Cu/Zn SÓD enzimatikusan aktív analógjának előállítására baktériumokban, és ennek tisztítására.

A szuperoxid-diszmutáz nagy jelentőségű anyag farmakológiai tulajdonságai miatt. A bovin-eredetű, természetben előforduló szuperoxid-diszmutázról (orgotein) felismerték, hogy gyulladásgátló tulajdonságokkal rendelkezik, és jelenleg már piaci forgalomban van néhány európai országban, például Nyugat-Németországban, gyulladások kezelésében való felhasználásra. Számos országban, köztük az Egyesült Államokban is, árusítják állatgyógyászati termékként gyulladások kezelésére, főleg begyulladt inak kezelésére lovakban. Ezen túl a tudományos irodalom azt sugallja, hogy az SÓD hasznos lehet klinikai alkalmazások hosszú sorában. Ezek lehetnek például a következők: a rákkifejlődés és tumomövekedés megelőzése, a rákellenes szerek citotoxikus és kardiotoxikus hatásainak csökkentése [Oberley, L. W. és Buettner, G. R.: Cancer Research, 39, 1141-1149. (1979)]; az iszkémiás szövetek védelme [McCord, J. M. és Roy, R. S.: Can. J. Physiol. Pharma., 60, 1346-1352. (1982)]; és ondószálak védelme [Alvarez, J. G. és Storey, Β. T.: Bioi. Repród., 28, 1129-1136. (1983)]. Ezenkívül nagy érdeklődés kíséri az SÓD hatásának tanulmányozását az öregedési folyamatokban [Talmasoff, J. Μ., Ono, T. és Cutler, R. G.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77,2777-2782. (1980)].

A jelen találmány a rekombináns humán szuperoxid-diszmutáz (hSOD) vagy analógjai felhasználására is vonatkozik a szuperoxid-gyökök redukciójának katalizálására H⁺ jelenlétében hidrogén-peroxiddá és molekuláris oxigénné. A jelen találmány különösen vonatkozik hSOD-analógok felhasználására az iszkémiát követő újabb pertuzió okozta sérülések csökkentésére, és a kimetszett, izolált szervek túlélési idejének meghosszabbítására. A találmány vonatkozik még a hSOD vagy analógjai alkalmazására a szervátültetést és gerincvelő-iszkémiát követő újabb perfúziók okozta sérülések csökkentésében.

A továbbiakban röviden összefoglaljuk a találmány lényegét.

A jelen találmány javított kifejeződő vektorral foglalkozik, amely megfelelő bakteriális gazdasejtbe, például Escherichia coli-ba, amely a Q termolabilis represszort tartalmazza, bevezetve a gazdasejtet képessé teszi a vektorba beiktatott kívánt gén hatásos kifeje4

HU 214 977 Β zésére és a gén által kódolt polipeptid termelésére abban az esetben, ha a gazdasejt hőmérsékletét olyan hőmérsékletre emeljük, amelynél a represszor inaktiválódik; ez a vektor tartalmaz:

- egy kettős szálú DNS-molekulát, amely 5’—>3’ sorrendben a következőket foglalja magában:

- egy DNS-szekvenciát, amely tartalmazza a lambda bakteriofágból eredő P_LO_L-promotort és operátort;

- az N-hasznosító helyet az N antiterminátor fehéije kötéséhez;

- egy első restrikciós enzimhelyet, amely lehetővé teszi az ezután következő riboszomális kötőhelyet tartalmazó DNS-szekvencia kicserélését;

- egy DNS-szekvenciát, amely egy riboszomális kötőhelyet tartalmaz, hogy képessé tegye a kívánt gén mRNS-ét riboszómákhoz való kötésre a gazdasejten belül;

- egy ATG-beindító (iniciációs) kodont vagy egy DNS-szekvenciát, amely ATG iniciációs kodonná alakul át a kívánt génnek a vektorba való beiktatásával, és

- egy második restrikciós enzimhelyet a kívánt gén beiktatására a vektorba az ATG iniciációs kodonnal fázisban;

- és amely ezeken túl magában foglal egy olyan DNS-szekvenciát, amely a gazdasejtben autonóm replikációra képes bakteriális plazmidból származó replikációs origót tartalmaz; valamint egy szelekciós eszközt, amely olyan DNS-szekvenciák közül választható ki, amelyekben szelektálható vagy azonosítható fenotípusos jellemzővel társult gén található, amely megnyilvánul, amikor a vektorjelen van a gazdaszervezetben;

- és olyan DNS-szekvenciákat, amelyek a cl⁴³⁴gyel jelölt fragmenst tartalmazzák, ez a fragmens magában foglalja a cl⁴³⁴ represszorfehéqéhez tartozó gént, és az ehhez társuló promotor és operátor szekvenciákat, ahol a távolság a P_LO_L-promotor és operátor szekvencia 3’-vége és az Nhasznosító hely 5’-vége között kevesebb mint 80 bázispár, és a távolság az N-hasznosító hely 3’-vége és a riboszomális kötőhely 5’-vége között kevesebb mint 300 bázispár.

Az előnyös vektorok azok, ahol a szelekciós eszköz olyan gén, amely fenotípusos jellemzővel társult, ilyen például a pJH200 és pRO211.

A jelen találmány szerinti vektorok továbbá magukban foglalhatnak egy TjT₂ rRNS-szekvenciát tartalmazó DNS-szekvenciát a második restrikciós enzimhely 3’-végénél elhelyezve. Kívánatos, hogy a T|T₂ rRNS átírásbefejezőszekvencia kevesebb mint mintegy 100 bázispárra legyen a második restrikciós enzimhely 3’-végétől, még kívánatosabb, hogy ez kevesebb, mint mintegy 20 bázispárra legyen a nevezett hely 3’-végétől.

A jelenleg legelőnyösebb vektor, amely tartalmazza a T|T₂ rRNS átírásbefejezőszekvenciát, a p579, ahol a szelekciós eszköz olyan gén, amely fenotípusos jellemzővel társul.

A jelen találmány szerinti, cl⁴³⁴-fragmenst tartalmazó vektorokban kívánatos, hogy a cl⁴³⁴-fragmens a T,T₂ rRNS befejezőszekvencia 3’-végénél helyezkedjék el.

Kívánatosán a vektorok foglalják magukba mind a fenotípusos jellemzővel társult gént, mind a cl⁴³⁴fragmenst. A jelenleg előnyös, mindkét gént tartalmazó vektor a p579, amely rendelkezik cl⁴³⁴-fragmenssel a Clal helybe klónozva.

A jelen találmány szerinti vektorok tartalmazhatnak replikációs origót olyan bakteriális plazmidból, amely képes autonóm replikációra a gazdasejtben, és képes a vektor legalább 400 konstitutív kópiáját előállítani.

A jelenleg előnyös replikációs origó a pODlAő, amely a colEl-plazmidból származik.

Előnyösek azok a vektorok, amelyek magukban foglalják a T|T₂ rRNS befejezőszekvenciát, egy legalább 400 konstitutív kópiát a gazdasejtben előállítani képes replikációs origót, és amelyek tartalmaznak mind egy fenotípusos jellemzőhöz tartozó gént, mind a cl⁴³⁴fragmenshez tartozó gént.

A kívánt polipeptideket, például növekedési hormonokat (szarvasmarha, sertés, csirke vagy emberi növekedési hormonok), humán szuperoxid-diszmutázt, humán apolipoprotein E-t és ezek származékait kódoló géneket, például cDNS-eket, be lehet iktatni a vektor második restrikciós enzimhelyébe, így plazmidokat hozva létre. A plazmidokat viszont be lehet vezetni megfelelő gazdaszervezetekbe, ahol a géneket ki lehet fejezni és a kívánt polipeptideket termelni. A jelenleg előnyös plazmidok: bGH-hoz (bovin növekedési hormon): pRO12, pSAL 5200-6, pHG44, pSAL 5600-1, p7200-22, pHG50, p8300-10A, pSAL-170/10, pSAL-210/4 és p9200; humán szuperoxid-diszmutázhoz: pSODa2, pSODpl, pSODplTll, pSODplTT-l; pGH-hoz (sertés-növekedésihormon): p3008 és p3009; cGH-hoz (csirke növekedési hormon): p5002 és p5003; hGH-hoz (humán növekedési hormon): pTV300; és humán apolipoprotein Ehez: pTV-188, pSAL 160-5, pTV-170, pTV-190, pTV-194, pTV-214 és pTVR-279-8.

Az előnyös gazdaszervezetek a következők lehetnek, ha a plazmid tartalmazza a cl⁴³⁴-fragmenst: Escherichia coli A1637, A1645, A2602, A2097, A1563 és A1645 (Xi434cl miniTnlO). Előnyös prototróf gazdaszervezetek például az E. coli A4200, A4255 és A4346. Előnyös lizáló gazdaszervezet lehet például az E. coli A4048.

Az így létrejött gazdavektor-rendszereket lehet alkalmazni polipeptidek előállítására. A plazmidokat tartalmazó gazdasejteket megfelelő körülmények között növesztjük, amelyek lehetővé teszik a polipeptidek termelését, és az így létrejött polipeptideket kinyeijük. A gazdasejt vektor-rendszereket alkalmazva humán apolipoprotein E, szarvasmarhanövekedési-hormon, sertés-növekedésihormon, csirke növekedési hormon, humán növekedési hormon és humán szuperoxiddiszmutáz analógjait állítjuk elő.

Az így előállított SOD-analógokat állatorvosi és gyógyászati készítményekbe építik be, amelyek az SOD-analógokból és megfelelő hordozókból állnak.

HU 214 977 Β

Ezeket a szuperoxid-diszmutáz analógokat alkalmazzuk a következő reakció katalizálására:

2O₂ - + 2H+—> H₂O₂ + O₂

Részletesebben ezeket az analógokat az iszkémiát vagy szervátültetést követő újabb perfúziók által okozott ártalmak csökkentésére alkalmazzuk, valamint a szívinfarktus mértékének csökkentésére, vagy a kimetszett, izolált szervek túlélési idejének növelésére. Ezek az analógok szolgálhatnak arra a célra is, hogy csökkentsék a gerincvelő sérüléseit, és használhatók a légúti-tüdő rendszer zavarai ellen is.

Feltárunk egy módszert is az enzimatikusan aktív eukarióta szuperoxid-diszmutáz vagy analógjai termelésére bakteriális sejtekben. A bakteriális sejt tartalmaz egy, a szuperoxid-diszmutázt vagy analógjait kódoló DNS-szekvenciát, és képes is ennek kifejezésére. A módszer magában foglalja a bakteriális sejt fenntartását megfelelő körülmények között, megfelelő mennyiségű, Cu⁺⁺-val kiegészített termelő tápközegben úgy, hogy a sejt számára rendelkezésre álló Cu⁺⁺ koncentrációja a tápközegben nagyobb legyen mint ~2 ppm.

A jelen módszer egyik előnyös kiviteli formájában a bakteriális sejt olyan plazmidot tartalmazó Escherichia coli, amely humán szuperoxid-diszmutáz analógot kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz.

A találmány foglalkozik egy bakteriális sejtben termelt, tisztított, enzimesen aktív eukarióta szuperoxiddiszmutáz vagy analóg jelen találmánnyal összhangban végzett kinyerésének módszerével is. A módszer tartalmazza a bakteriális sejt elkülönítését a növesztő tápközegtől és a bakteriális sejt szuszpendálását megfelelő oldatban, amelynek pH-ja körülbelül 7,0 és körülbelül 8,0 között van. A szuszpendált bakterális sejt sejtfalát szétzúzzuk, és az így létrejött homogén oldatot ezután ultrahangos kezelésnek vetjük alá megfelelő körülmények között. Az ultrahanggal kezelt oldatot megfelelő körülmények között centrifugáljuk, és a felülúszót kinyerjük, és mintegy 2 órán át 65 °C hőmérsékleten melegítjük. A felülúszót ezután lehűtjük, és megfelelő körülmények között centrifugáljuk, hogy tiszta felülúszó fehérjeoldatot nyerjünk. Az így létrejött felülúszót megfelelő térfogatra koncentráljuk, és ioncserélő kromatográfiának vetjük alá megfelelő anioncserélő gyantán, amely körülbelül pH 7,0 és 8,0 közti értékre van kiegyensúlyozva. Az így létrejött, a szuperoxiddiszmutázt vagy analógját tartalmazó oldatot összegyűjtjük, megfelelő térfogatra koncentráljuk, és körülbelül pH 7,0 és 8,0 közti pH-értékű pufferolt oldattal szemben dializáljuk. A szóban forgó oldat pH-ját körülbelül 4,0 és 5,0 pH-értékek közé állítjuk be megfelelő pufferral. A pufferolt oldatot azután ioncserélő kromatográfiának vetjük alá körülbelül pH 4,0 és 5,0 közti pH-ra kiegyensúlyozott, megfelelő sógrandiens hatásának tesszük ki, és az így létrejött frakciókat, amelyek a tisztított szuperoxid-diszmutázt vagy analógját tartalmazzák, összegyűjtjük.

A találmány foglalkozik még a jelen módszerekkel előállított, tisztított, enzimesen aktív rekombináns eukarióta szuperoxid-diszmutázzal.

Az ábrák leírása:

Az egyes plazmidok restrikciós térképei, amelyeket az 1-31. ábrákban mutatunk be, nem azonosítják az összes restrikciós helyeket, amelyek az egyes plazmidokon jelen vannak. Bizonyos esetekben egyes restrikciós helyeket az egyik ábrában bemutatjuk, a másikban nem. Minden esetben bemutatjuk azonban azokat a restrikciós helyeket, amelyek szükségesek a találmány teljes megértéséhez.

1. ábra. A pAL500 megalkotása

A bGH cDNS-t tartalmazó D4-plazmidot (ATCC 31826) Haell-vel emésztjük. Az így létrejött 1600 bázispár nagyságú nagy fragmenst tisztítjuk, és 37 °C hőmérsékleten 5 percig emésztjük SÍ exonukleázzal.

GGAATTCC

CCTTAAGG szekvenciájú szintetikus EcoRI kapcsolót (linkért) kapcsolunk az így létrejött fragmens végeire ligálással. A ligálókeveréket EcoRI-vel hasítjuk, és p3R322-be iktatjuk (ATCC 37017), amelyet előzőleg EcoRI-vel hasítottunk. A pALRI kiónt nyerjük, amely EcoRI-vel végzett hasításra egy 1200 bázispáros fragmenst alakít ki, az 5’-végénél

AATTCCCAGCCATG...

GGGTCGGTAC...

szekvenciával. Ez a szekvencia azt demonstrálja, hogy a pALRI tartalmaz egy EcoRI restrikciós helyet, amely magában foglalja a természetes bGH 1. számú gyökéhez (fenil-alanin) szolgáló TTC kodont. Az emésztett anyagot DNS polimeráz I nagy fragmensével (Klenow) kezeljük, és a

GAAGCTTC

CTTCGAAG

HindlII kapcsolókkal (linkerekkel) kapcsoljuk össze ligálással. A ligálókeveréket EcoRI-vel és Hindíll-el hasítjuk. A bGH cDNS-t tartalmazó fragmenst izoláljuk, és pBR332-be szubklónozzuk az EcoRI és Hindin restrikciós helyek közé, így nyerve a pAL500-at (ATCC 39782).

2. ábra. A pRO211 és pRO12

A pJH200-plazmidot részlegesen emésztjük AWel-el, kezeljük DNS polimeráz I-el (Klenow), hogy a végeket kitöltsük, és az így létrejött végeket újra ligáljuk, hogy a pRO211 kifej eződő vektorokat képezzük. A pRO211 kifejeződő vektorokat AJel-el és ///«t/III-al emésztjük, a nagy fragmenst izoláljuk, és a pAL500-ból (ATCC 39782, 1984. augusztus 2.) izolált Ndel-HindlII-fragmenst úgy állítjuk elő pAL500-ból, hogy a pAL500-at EcoRI-vel emésztjük, és az emésztett termék végeihez a

TATGGATC

ACCTAGTTAA szekvenciájú szintetikus linkereket ligáljuk. A ligálókeveréket Afafel-el és Hindlll-al emésztjük, és az így létrejött Ndel-Hindlll bGH-fragmenst izoláljuk.

3. ábra. A pSAL 5200-6 megalkotása

A pRO12-t (2. ábra) részben emésztjük ΕνκΠ-vel, ezt követi az emésztés Ndel-el, hogy eltávolítsunk egy

HU 214 977 Β bázispáros fragmenst. Az autentikus bGH N-terminálisának első 24 aminosavát kódoló szintetikus DNSfragmenst ligáljuk az emésztett pRO 12-höz.

A szintetikus DNS-fragmenst úgy alkotjuk meg, hogy két foszforilezett szintetikus egyszálú DNS-t összeforrasztunk, a DNS-ek szekvenciája a következő:

CCATATGTCCTTGTCCGGCCTGTTTTGCCAACGCTGTGCTC-3’

3’-GCGACACGAGGCCCGAGTCGTGGACGTGGTCGACG

Az összeforrasztott fragmenst DNS polimeráz I-el (Klenow) kezeljük a 4 dezoxiribonukleozid trifoszfát jelenlétében abból a célból, hogy a teljes hosszúságú kettős szálú DNS-t alakítsuk ki. A fragmenst Pvz/II-vel és Ndel-el emésztjük a pRO 12-höz tartozó ligálás előtt, így képezzük a pSAL 5200-6-ot.

4. ábra. A p3008 megalkotása

A p3OO8-at (ATCC 39804) úgy alkotjuk meg, hogy az AWel-el emésztett pRO211-et (2. ábra) ligáljuk a ppGH-AWel/RI-plazmid Ndel-es emésztéséből izolált pGH-fragmenssel.

A ppGH-Ariel/RI tartalmazza a pGH cDNS-t teljes hosszúságban, amelynek mindkét végéhez At/el-helyek vannak hozzátéve szintetikus linkerek segítségével.

5. ábra. A p5002 megalkotása

A p5002-t úgy alkotjuk meg, hogy három résztvevővel ligálunk, vagyis egy dimerizált szintetikus linkért, és két cGH-fragmenst ligálunk, az utóbbiakat a pcGH—Adel/RI-plazmid Ndel-es és őawll-cs emésztésével nyeljük. A ligálókeveréket Wel-el emésztjük, és ezután a pRO211 kifejeződő vektorhoz (2. ábra) ligáljuk, miután azt előzőleg AT/cT-el emésztettük. Egy telepet izolálunk, amely tartalmazza a p5002-plazmidot.

A szintetikus linkért a következő szekvenciájú egyszálú szintetikus DNS-ekből alkotjuk meg:

TATGTTCCCTGCCATGCCCCTCTCCAACCTGTTTGCCAACGCTGTGCTGAGGGCT

ACAAGGGACGGTACGGGGAGAGGTTGGACAAACGGTTGCGACACGACTC

A linkért ligálás előtt foszforilezzük. A linker az autentikus cGH N-terminálisának első 18 aminosavát kódolja.

A pcGH-AWel/RI-plazmid tartalmazza a cGH cDNS teljes hosszát, amelynek 5’-végénél egy EcoRI restrikciós hely van, és amelynek 3’-végénél egy Ndel restrikciós hely van. Ezeket a restrikciós helyeket szintetikus linkerek segítségével adjuk hozzá.

6. ábra. A pHG44 és pHG50 megalkotása pRO12-t (2. ábra) emésztünk Hz'nűflII-al. A lineáris formájú DNS-t (III. forma) agaróz gélről tisztítjuk és ligáljuk egy mintegy 1200 bázispáros Hindlll—Hindlllfragmenshez, amely tartalmazza a T_tT₂ rRNS operon átírásbefejezőszekvenciákat. A T_tT₂ Hindlll-Hindlllffagmenst a pPSl-píazmidból (ATCC 39807) izoláljuk, amelyet Hindlll-al emésztettünk. Az így létrejött pHG44-plazmid (ATCC 39806) tartalmazza a TjT₂szekvenciákat a rekombináns (rec) bGH-szekvencia 3’végénél.

A pSK434-plazmidot (ATCC 39784), amely tartalmazza a Xcl⁴³⁴-represszorszekvenciákat, Hpall-vel emésztjük. A Xcl⁴³⁴ ΗραΙΙ-ΗραΙΙ-fragmenst izoláljuk, és pHG44-hez ligáljuk, amelyet előzőleg C/al-el emésztettünk. Az így létrejött pHG50-plazmid (ATCC 39805) tartalmazza a T[T₂ átírásbefejezőszekvenciákat, és a Lcl⁴³⁴-represszorszckvenciát.

7. ábra. A p8300-10A megalkotása

A p8300-l 0A-plazmidot (ATCC 39785), amely a bGH természetes fenilalanin-formájának egy analógját fejezi ki, amely az N-terminálisnál metioninnal rendelkezik (met-phe bGH), a következő módon állítjuk elő. A p7200-22-plazmid tartalmazza a ÁP_L-promotorot és a pJH200-ból (ATCC 39783) származó riboszomális kötőhelyet, met-phe bGH-t kódoló DNS-t, és a T,T₂ rRNS befejezőszekvenciákat. A XPj -promotort, a C_n riboszomális kötőhelyet, a met-phe bGH-gént és a T,T₂ átírásbefejezőszekvenciákat tartalmazó C/al-C/alfragmenst beiktatjuk a ρΟΡ1Δ6, egy konstitutíven nagy kópiaszámú plazmid egyedi C/al-helyébe, így képezzük a p8300-10A-t.

8. ábra. A pSAL-130/5 és pSAL-170/10 megalkotása A pHG44-plazmidot (ATCC 39806), amely a met-asp-gln bGH-fehérjét fejezi ki, emésztjük Wel-el és JfindlII-al. Az így létrejött Ndél-Hindftl bGHfragmenst izoláljuk, és a p8300-10A-ból (ATCC 39785) Arid-el és Hz«riIII-al végzett részleges emésztéssel készített fragmenshez ligáljuk. Ez a ligálás a met40 phe bGH-génfragmenst a met-asp-gln bGHgénfragmenssel helyettesíti. Az így nyert pSAL-130/5plazmid rec bGH-t fejez ki. A pSAL-170/10-et úgy nyequk, hogy a pBR322-plazmid (ATCC 37017) Tet^R génjét tartalmazó £coRI-^4vűI-fragmenst DNS polimeráz I-el (Klenow) kezeljük, és ezt pSAL-130/5be iktatjuk be, amelyet előzőleg ΒαζηΗΙ-el emésztettünk, és DNS polimeráz I (Klenow) segítségével betöltöttünk.

9. ábra. A pSAL-210/4 megalkotása

Lineáris formájú DNS-t (III. forma) készítünk pSAL-170/10 részleges Clal emésztésével. Ezt agaróz gélről tisztítjuk, és egy Hpall-Hpafl cl⁴³⁴-génfragmenshez ligáljuk, amelyet a pSK434 (ATCC 39784)55 plazmid ΗραΙΙ-vel végzett emésztésének reakciókeverékéből izolálunk.

10. ábra. ApSAL 5600-1 megalkotása pSAL 5200-6-ot (3. ábra) HznrilII-al emésztünk.

A DNS lineáris formáját (ΠΙ. forma) agaróz gélről tisz7

HU 214 977 Β títjuk, és egy mintegy 1200 bázispáros HindlTÍ-HindYllfragmenshez ligáljuk, amely tartalmazza a TjT₂ rRNS operon átírásbefejezőszekvenciákat. A TjT₂ /7/«í/(II-77/«í7fIT-fragmenst a pPSl-plazmidból (ATCC 39807) izoláljuk, amelyet Hindlll-aí emésztünk. Az így létrejött pSAL 5600-1-plazmid a Tszekvenciákat a met—asp-gln bGH-szekvencia 3 ’-végénél tartalmazza.

11. ábra. A p3009 megalkotása

Az Ndel-Ndel pHG-fragmenst a p3008-plazmidból izoláljuk (ATCC 39804, 5. ábra). A fragmenst a p579 kifejeződő vektor (19. ábra) egyedi AWel-helyére iktatjuk, a vektort előzőleg AWel-el emésztve. Az így létrejött p3009-plazmid a természetes sertés-növekedésihormon egy analógját fejezi ki, amely az N-terminálishoz hozzátéve egy metioningyököt tartalmaz.

12. ábra. A p5003 megalkotása

Az Ndel-Ndél cHG-fragmenst a p5002-plazmidból izoláljuk. A fragmenst a p579 kifejeződő vektor (19. ábra) egyedi Wel-helyébe iktatjuk, amely vektort előzőleg jVí/el-el emésztettünk. Az így létrejött p5003plazmid (ATCC 39792) a természetes csirke növekedési hormon fehéije egy analógját fejezi ki, amely az N-terminálishoz hozzátéve egy metioningyököt tartalmaz.

13. ábra. A pSODa2 megalkotása

A pJH200 kifejeződő vektort (ATCC 39783) Ndélel emésztjük. Az 550 bázispáros Aí/el-fragmenst, amely a XP_L-promotort és C_n riboszomális kötőhelyet tartalmazza izoláljuk, és beiktatjuk a pSOD ΝΗ-10-plazmid egyedi Wel-helyébe, amely plazmidot előzőleg Wel-cl emésztettünk. [A pSOD ΝΗ-10-plazmid humán SÓD egy cDNS-klónjából származik, lásd: Lieman-Hurwitz,

J. és munkatársai: PNAS, 79, 2808 (1982)]. Az így létrejött pSOD ΝΗ-440-plazmidot A/zd-el emésztjük (csak az ide vonatkozó Λ/wI-helyet tüntetjük fel az ábrán). A nagy Λ/wI-fragmenst, amely a ÁP_L-promotort és az SOD-gént tartalmazza, izoláljuk. BamHI-linkereket kapcsolunk hozzá, és az így létrejött fragmenst BamHIel emésztjük. A ŐíumHI emésztési terméket beiktatjuk a pBRM (ATCC 37283) egyedi PawHI-helyébe, így képezve a pSODa2-t.

14. ábra. A pSODal3 és pSODal megalkotása

A pSODoc2-plazmidot (ATCC 39786) részlegesen emésztjük EcoRI-vel, és az így létrejött lineáris formájú DNS-t agaróz gélről izoláljuk. A tisztított DNS-t betöltjük DNS polimeráz I-el (Klenow), és újra ligáljuk. Az így létrejött pSODal3 tartalmaz egy EcoRI-helyet a riboszomális kötőhely 5’-végénél. Egy fragmenst, amely tartalmazza a β-laktamáz promotort és riboszomális kötőhelyet izolálunk a pBLAl 1-plazmidból (ATCC 39788), amelyet előzőleg EcoRI-vei ésA/zd-el emésztettünk. A 200 bázispáros fragmenst a pSODa 13-ból izolált nagy fragmenshez ligáljuk, ahol a pSODal3-at előzőleg TVűfel-el emésztettük, DNS polimeráz I-el (Klenow) betöltöttük, majd EcoRI-vel emésztettük. Az így létrejött ρβΟϋβΙ-plazmid tartalmazza a β-laktamáz gén kötőhelyét és a XP_L-promotort.

15. ábra. Αρ8Οϋβ₁Τ₁₁ megalkotása pBR322-plazmidot (ATCC 37017) emésztünk

EcoRI-vel és Xval-el. Az így létrejött DNS-t betöltjük DNS polimeráz I-el (Klenow). A Tet^R-génfragmenst ezután izoláljuk, és a ρ80ϋβ1-plazmidból (14. ábra) izolált nagy fragmenshez ligáljuk, a ρ8Οϋβ1plazmidot előzőleg Ps/I-el emésztettük, ezt követően RawHI-val részlegesen emésztettük, végül DNS polimeráz I-el (Klenow) betöltöttük. Az így létrejött ρΞΟΟβ,ΤΤι [-plazmid tartalmazza a Tet^R-gént.

16. ábra. Αρ8Οϋβ1ΤΤ-1 megalkotása

A TjT₂ rRNS átírásbefejezési fragmenst izoláljuk a pPS 1-plazmidból (ATCC 39807), amelyet előzőleg 77z«í/III-al emésztettünk, és DNS polimeráz I-el (Klenow) betöltöttünk. A fragmenst ρ8Οϋβ₁Τ₁₁plazmidhoz (15. ábra) ligáljuk, amelyet előzőleg EíwwHI-vel részlegesen emésztettünk, és DNS polimeráz I-el (Klenow) betöltöttünk.

17. ábra. A ρ8Οϋβ1-ΒΑ2 megalkotása

Az alábbi összetételű szintetikus DNS-fragmenst:

’-AATTC AAT AATATTGAAAAAGGAAGAG-3 ’ GTTATTATAACTTTTTCCTTCTCAT, amely hasonló a természetes β-laktamáz riboszomális kötőhely szekvenciájához, foszforilezzük, és a pSODal3-plazmid (14. ábra) nagy fragmenséhez ligáljuk, amely plazmidot előzőleg ΛΤ/eI-el és EcoRIvel emésztettünk.

18. ábra. A pTV-188 megalkotása pApoE-EX2-plazmidot (ATCC 39787) emésztünk

Ndel-e\, majd a fragmenseket DNS polimeráz I-el (Klenow) betöltjük. Az így létrejött ApoE-génfragmenst izoláljuk, és beiktatjuk a ρ80ϋβ₁Τ₁₁plazmid (15. ábra) egyedi, tompa végű ő/wl-helyébe. Az így létrejött pTV-188 egy ApoE-fuziós fehérjét fejez ki.

19. ábra. A p579 megalkotása

A T[T₂ rRNS operon átírásbefejező fragmenst izoláljuk a pPSl-plazmidból (ATCC 39807), amelyet előzőleg HindlD-el emésztettünk. A TiT₂-fragmenst beiktatjuk a pRO211 (2. ábra) egyedi //znűttll-helyébe. Az így létrejött kifejeződő vektor, a P579 tartalmazza a CP[ -promotorot, a C_n riboszomális kötőhelyet, amelyet a TjT₂ átírásbefejező szignálok követnek.

20. ábra. A pTV-170 megalkotása

Az Ndel-Ndel ApoE-fragmenst izoláljuk a pApoE-EX2-plazmidból (ATCC 39787), és beiktatjuk a p579 kifejeződő vektor (19. ábra) egyedi AWel-helyébe, amely vektort előzőleg AWel-el emésztettünk. Az

HU 214 977 Β így létrejött pTV-170-plazmid természetes humán ApoE-fehérje egy analógját fejezi ki, amelynek egy metioningyök van az N-terminálisához hozzáadva.

21. ábra. A pTV-190 megalkotása

A pTV-170-plazmidot (20. ábra) részlegesen emésztjük Adel-el, és betöltjük DNS polimeráz I-el (Klenow). Az izolált lineáris formájú DNS-t újra ligáljuk a pTV-190-plazmidot termelve, amelyet elemzünk, és úgy találjuk, hogy csak egy Adel-helye van az ApoE-gén 5’-végénél.

22. ábra. A pTV-194 megalkotása

A β-laktamáz promotor és riboszomális kötőhelyframgenst izoláljuk a pBLA 11-plazmidból (ATCC 39788), FcoRI-el és 4/wIe-l végzett emésztés után. Ezt a fragmenst ligáljuk a pTV-170-plazmid (20. ábra) nagy ffagmenséhez, amelyet előzőleg Adel-el emésztettünk,

DNS polimeráz I-el (Klenow) betöltöttünk, majd £coRI-vel emésztettünk.

23. ábra. A pSAL 160-5 megalkotása

Egy rtval-Tval-fragmcnst, amely tartalmazza az ApoE DNS-szekvenciát, izolálunk a pTV-170-ből (21. ábra), amelyet 4ral-el emésztünk. A fragmenst DNS polimeráz I-el (Klenow) betöltjük, és agaróz gélen izoláljuk. A tisztított ApoE-fragmenst beiktatjuk a pTV

104(2)-plazmid (ATCC 39384) Λ/Ι-helyébe, amelyet részlegesen emésztünk Ps/I-el, és betöltünk DNS polimeráz I-el (Klenow). Az így létrejött plazmidot pSAL 160-5-nek nevezzük.

24. ábra. A pTV-214 megalkotása

A humán növekedési hormon első 14 aminosavát tartalmazó szintetikus fragmenst, amelynek szekvenciája a következő:

TATGTTCCCAACCATTCCATTATCCCGTCTGTTCGACAACGC

ACAAGGGTTGGTAAGGTAATAGGGCAGACAAGCTGTTGCGAT foszforilezünk, y ^{26 * * * * * 32}P-ATP-t és polinukleotid kinázt alkalmazva. A foszforilezett linkért beiktatjuk a pTV 190-plazmid egyedi Adel-helyébe, amely plazmidot előzőleg M/el-el emésztettünk.

25. ábra. A pTVR 279-8 megalkotása

A pTVR 279-8-at a pTV 264-45-ből alkotjuk meg, amelyet viszont a pTV 190-ből alkotunk meg.

pTV 190-plazmidot, amely egy Met-ApoE3 analóg kifejeződését irányítja, részlegesen hasítunk 4val-cl, „betöltjük” DNS polimeráz I Klenow-fragmensét alkalmazva, és újra ligáljuk. Az így létrejött plazmidot, amelyet pTV 264—45-nek nevezünk, hiányossá tesszük az Xral-helyre nézve a gén 3’-végénél.

A pTV 264-45-öt teljes mértékben emésztjük Adéléi, és a következő szekvenciájú, foszforilezett szintetikus linkerhez ligáljuk:

5’-TATGCTGCTGCT

ACGACGACGAAT-5’.

Az így létrejött plazmid, amelyet pTVR 279-8-nak nevezünk, irányítja a met-leu-leu-leu-met-ApoE3 analóg kifejeződését.

26. ábra. A p92000 megalkotása

A p92000-plazmidot úgy alkotjuk meg, hogy a pHG44-ből az ampicillinrezisztencia gén nagy részét eltávolítjuk, és helyettesítjük ezt a pHG44 tetraciklin rezisztencia génjével.

A pHG44-el C/al-el és Psíl-el hasítjuk, DNS polimeráz I Klenow-ffagmensével kezeljük, és a nagy DNS-ffamgenst izoláljuk. Ezt a fragmenst ligáljuk a pBR322 kis DNS-fragmenséhez, amelyet a pBR322nek £coRI-vel és Aral-el végzett hasítása és Klenowfragmenssel végzett kezelése után izolálunk. A ligálásból létrejött plazmidot p92000-nak nevezzük.

A p92000 irányítja a met-asp-gln-bGH-analóg kifejeződését, és tetraciklin rezisztenciát ad át gazdasejtjének.

27. ábra. A pTV 300 megalkotása

A pTV 300 irányítja a met¹⁴-hGH-analóg kifejeződését. A pTV 300-at úgy alkotjuk meg, hogy pTV 18(l)-et hasítunk Adel-el, és izoláljuk a met¹⁴-hGH DNS-t, és ezt Adel-el hasított p579-be (19. ábra) ligáljuk.

A pTV 18(l)-et úgy nyerhetjük, ahogyan ezt a 0 131 843 Al sorszámú Európai Szabadalmi Közrebocsátási Irat (publikálva 1985. január 23-án) leírja, vagy ahogyan ezt az ennek megfelelő 514,188 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (bejelentve 1983. július 15-én) leírja; ez utóbbit ide referenciaként építjük be.

28. ábra. ApoE-analóg sejten belüli felgyülemléséhez társult celluláris toxicitás

C600 sejtek 5 ml tenyészeteit, amely sejtek pTV 194-et tartalmaznak vagy nem átfertőzött kontrollok, indukáljuk az inkubálás hőmérsékletét 30 °C-ról 42 °Cra emelve. A jelzett időpontokban 1 ml-es alikvotokat veszünk ki a tenyészetekből, jégen gyorsan lehűtjük, növesztő tápközegben sorozathígításokat végzünk, agarra szélesztjük, az agarban a megfelelő antibiotikum jelenlétében, és egy éjszakán át inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten. A telepek számát meghatározzuk párhuzamosan készített telepek átlagából. P193-el átfertőzött és át nem fertőzött C600 sejtek párhuzamos tenyészeteit tartjuk 30 °C hőmérsékleten, ezek szolgálnak nem indukált kontrollként.

29. ábra. Az ApoE DMPC-komplexek kötése Apo-B, E(LDL)-receptorokhoz fíbroblasztokon

Biotechnológiai úton előállított (met-ApoE3 analóg) és autentikus ApoE foszfolipid komplexeit készítjük el a fehérje és DMPC inkubálásával 22 °C hőmérsékleten. A komplexeket elkülönítjük a komplexszé nem alakult anyagoktól sűrűséggradiens centrifugálással, amint ezt később leírjuk (30., majd 38. példa). Bal9

HU 214 977 Β oldalt: a biotechnológiai úton előállított és autentikus ApoE.DMPC-komplexek képessége a ¹²⁵I-vel jelzett humán LDL-el való versengésre a tenyésztett fibroblaszt receptorokban való kötődésre 4 °C hőmérsékleten. Jobbra: A ¹²⁵I-vel jelzett ApoE-analóg és autentikus ApoE.DMPC-komplexek képessége a tenyésztett fibroblasztokhoz való közvetlen kötődésre.

30. ábra. ¹²⁵I-ApoE.DMPC-komplexek kötődése ApoE-receptorokhoz májmembránokon

Foszfolipid (DMPC)-komplexeket készítünk, amint ezt a 29. ábránál leírtuk. Felnőtt, koleszterinnel táplált kutyákból származó májmembránok szolgálnak forrásként az ApoE-receptorokhoz, és a későbbiekben leírtak (32., majd 38. példa) szerint vannak elkészítve. A ^,25Ivel jelzett, biotechnológiai úton előállított és autentikus ApoE.DMPC-komplexek kötődését a membránokhoz 4 °C hőmérsékleten hajtjuk végre, amint ezt később lenjük (32., majd 38. példa).

31. ábra. A jódozott ApoE kiválasztása nyúlplazmából

Biotechnológiai úton előállított és autentikus

ApoE-t inkubálunk 37 °C hőmérsékleten 30 percen át 1 ml nyúlplazmával, mielőtt a keveréket egy nyúl vénájába injektálnánk. Mintegy 2 ml vért távolítunk el egy ampullába, amely EDTA-t tartalmaz, a jelzett időpontokban, és a plazmát számoláshoz előkészítjük. A számokat korrigáljuk TCA (triklór-ecetsav) oldható bomlástermékekre, amint ezt később leírjuk (33., majd 38. példa).

A továbbiakban részletesebben ismertetjük a találmányt.

Egy vektort fejlesztünk ki, amely lehetővé teszi a génkifejeződés és a polipeptid-termelés magasabb szintjének elérését. A plazmid kettős szálú DNS-molekula. Ennek bevezetésére egy megfelelő bakteriális gazdasejtbe, amely a termolabilis C_rrepresszort tartalmazza, a plazmid a gazdasejtet képessé teszi a plazmidba iktatott kívánt gén hatásos kifejezésére, és a gén által kódolt polipeptid termelésére abban az esetben, amikor a gazdasejt hőmérsékletét arra a hőmérsékletre emeljük, amelynél a represszor inaktiválódik.

A vektor az 5 3 * sorrendben a következőket foglalja magában:

- egy DNS-szekvenciát, amely tartalmazza a lambda-bakteriofágból származó P_LO_L-promotort és operátort;

- az N-hasznosító helyet az antiterminátor N-fehérje kötéséhez;

- egy első restrikciós enzimhelyet, amely lehetővé teszi az ezután következő riboszomális kötőhelyet tartalmazó DNS-szekvencia helyettesítését;

- egy DNS-szekvenciát, amely egy riboszomális kötőhelyet tartalmaz, amely a kívánt gén mRNSét képessé teszi a riboszómákhoz való kötődésre a gazdasejten belül;

- egy ATG iniciációs (kezdő) kodont, vagy egy olyan DNS-szekvenciát, amely ATG iniciációs kodonná alakul a kívánt gén beiktatásakor a vektorba; és

- egy második restrikciós enzimhelyet a kívánt gén beiktatására a vektorba az ATG iniciációs kodonnal fázisban.

A vektor magában foglal a fentieken kívül egy olyan DNS-szekvenciát, amely a gazdasejtben autonóm replikációra képes bakteriális plazmidból származó replikációs origót tartalmaz,

- valamint egy szelekciós eszközt, amely olyan DNS-szekvenciák közül választható ki, amelyekben szelektálható vagy azonosítható fenotípusos jellemzővel társult gén található, amely megnyilvánul, amikor a vektor jelen van a gazdaszervezetben;

- és olyan DNS-szekvenciákat, amelyek a cl⁴³⁴-el jelölt fragmenst tartalmazzák. Ez a fragmens magában foglalja cl⁴³⁴-represszorfehérjéhez tartozó gént és az ehhez társuló promotor- és operátorszekvenciákat, ahol a távolság a P_LO_L-promotorés operátor-szekvencia 3’-vége és az N-hasznosító hely 5’-vége között kevesebb, mint 80 bázispár, és a távolság az N-hasznosító hely 3 ’-vége és a riboszomális kötőhely 5’-vége között kevesebb, mint 300 bázispár.

A vektor egy további fakultatív komponense egy TjT₂ rRNS átírásbefejezőszekvencia, amely a második restrikciós enzimhely 3’-végénél helyezkedik el. Előnyösen a T|T₂ rRNS átírásbefejezési szekvencia kevesebb, mint mintegy 100 bázispárra van a második restrikciós enzimhely 3 ’-végétől. Még előnyösebben a TjT₂ rRNS átírásbefejezési szekvencia kevesebb, mint mintegy 20 bázispárra helyezkedik el a második restrikciós enzimhely 3’-végétől.

A vektor magában foglal vagy egy szelektálható vagy azonosítható fenotípusos jellemzővel társult gént, amely manifesztálódik, amikor a vektor jelen van a gazdasejtben, vagy egy olyan DNS-szekvenciát, amely a cl⁴³⁴-represszorgént tartalmazza, amely represszál egy λ imm 434cl -lizogént, vagy mindkettőt magában foglalja.

A szelektálható vagy azonosítható jellemzőkkel társult megfelelő gének magukban foglalják azokat, amelyek hőmérséklet-érzékenységgel vagy gyógyszerérzékenységgel, például ampicillin-, klóramfenikol- vagy tetraciklin-rezisztenciával társulnak. Amikor a gazdaszervezeten belül a cl⁴³⁴-represszorgén jelen van, a gazdaszervezetet meg lehet védeni a Ximm434cl profág indukciótól. így nincsen szükség drága antibiotikumszelekciós sóoldatokra, amikor cl⁴³⁴ van jelen a gazdaszervezetben.

Előnyösen a vektor magában foglal mind egy DNSszekvenciát, amely tartalmaz egy szelektálható vagy azonosítható fenotípusos jellemzővel társult gént, mind egy olyan DNS-szekvenciát, amely tartalmazza a cl⁴³⁴nek nevezett fragmenst.

Kívánatos, hogy amikor a cl⁴³⁴-gént a vektor tartalmazza, ez a TjT₂ rRNS-szekvencia 3’-vége után helyezkedjék el.

A vektor magában foglal egy bakteriális plazmidból származó replikációs kiindulást (origót) is, amely plazmid autonóm replikációra képes a gazdasejtben.

HU 214 977 Β

Ilyen megfelelő replikációs origók számos forrásból nyerhetők, például a pBr322-ből vagy pRl-ből.

Előnyös, ha a vektor olyan replikációs origóval rendelkezik, amely egy konstitutíven nagy kópiaszámú bakteriális plazmidból ered, amely plazmid képes autonóm replikációra a gazdasejtben legalább 400 konstitutív kópia/vektor mennyiségben. Még előnyösebben ez a replikációs origó ColEl. A legelőnyösebben az origó pOPIAó-plazmid, amelynek restrikciós térképét a 7. ábra mutatja be.

A vektor egy másik komponense egy első restrikciós enzimhely, amely lehetővé teszi az ezt követő riboszomális kötőhelyet tartalmazó DNS-szekvencia helyettesítését. Számos ilyen helyet lehet alkalmazni. Megfelelő hely például az EcoRI-hely.

A vektor egy másik komponense egy második restrikciós enzimhely a kívánt gén beiktatására a plazmidba az ATG iniciációs kodonnal fázisban. Számos ilyen helyet használhatunk. Megfelelő helyek lehetnek például az Ndel-, Clál-, Hindii!-, Smal-, Bglll-, Xbal-, SacI- és 4/MÍ-helyek.

Általában kívánatos, hogy a második restrikciós enzimhely úgy működjék, mint egy olyan második restrikciós enzimhely, amely szükséges a riboszomális kötőhelyet tartalmazó DNS-szekvencia helyettesítésének lehetővé tételére. Ha a második restrikciós helyet erre a célra nem használjuk, akkor a jelen találmány szerinti vektor magában foglalhat egy harmadik restrikciós enzimhelyet is a riboszomális kötőhely után, de a második restrikciós hely előtt.

Előnyösen a vektor két egyedi restrikciós enzimhelyet tartalmaz. Az első hely lehetővé teszi a riboszomális kötőhelyet tartalmazó DNS-szekvencia helyettesítését. A második hely lehetővé teszi a kívánt gén beiktatását a plazmidba az ATG iniciációs kodonnal fázisban. Az „egyedi restrikciós hely” kifejezést itt olyan értelemben használjuk, hogy ez egy olyan restrikciós enzimhely, amely csak egyszer fordul elő a plazmidban. Egy jelenleg előnyös kiviteli formában az EcoRI az első restrikciós enzimhely és Ndel a második restrikciós enzimhely.

Előnyösen a vektor egy kovalensen zárt, kör alakú, kettős szálú molekula. Az azonban nem feltétlenül szükséges, hogy a plazmid kovalensen zárt legyen.

A plazmid akkor éri el megnövekedett kifejeződési szintjét, miután a gazdasejtet olyan hőmérsékletre melegítettük, amelynél a C_rrepresszorfehérje inaktiválódik. A mintegy 38 °C fölötti hőmérséklet hatásos ebből a célból, és mivel kívánatos, hogy elkerüljük a gazdasejt szükségtelen hőkárosodását olyan nagy mértékben, ahogy csak lehetséges, általában kívánatos, hogy a hőmérséklet ne haladja meg a 42 °C hőmérsékletet néhány foknál nagyobb mértékben.

A vektor egyik fontos komponense a riboszomális kötőhely. Megfelelő helyek a lambda bakteriofágból szármrazó C_n-helyek., amelyek szekvenciája a következő:

TAAGGAAATACTTACAT

ATTCCTTTATGAATGTA; a lambda-bakteriofágból származó C_tI-nek egy mutánsa, amelynek szekvenciája a következő:

TAAGGAAGTACTTACAT

ATTCCTTCATGAATGTA; a lambda-bakteriofág fő fejfehétje génje, amelynek szekvenciája a következő:

_{TTTTTTTACGGGATTTTTTTATG}

AAAAAAATGCCCTAAAAAAATAC; a pBR322-ből származó természetes β-laktamáz kötőhely egy szintetikus oligonukleotid, amelynek szekvenciája a következő:

AATTCGAGCGCAAGGAAACAGGCTCA

GCTCGCGTTCCTTTGTCCGAGTAT; egy szintetikus oligonukleotid, amelynek szekvenciája a következő:

AATTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAG

GTTATTATAACTTTTTCCTTCTCAT; és egy Bacillus thüringiensisből származó természetes riboszomális kötőhely.

A korábban leírt vektorokhoz viszonyítva a jelen találmány szerinti vektorokat lehet alkalmazni kívánt polipeptid termékeket kódoló gének széles választékának megnövekedett kifejeződése eléréséhez. Megfelelő gének lehetnek azok, amelyek növekedési hormonokat, például szarvasmarha, sertés, csirke vagy humán növekedési hormonokat; szuperoxid-diszmutázt; apolipoprotein E-t, vagy az összes fentiek analógjait kódolják. Az analóg itt azt jelenti, hogy ez egy olyan polipeptid, amelynek aktivitása azonos a természetben előforduló polipeptidével, de egy vagy több különböző aminosav van hozzátéve vagy kihagyva (vagy mindkettő) a polipeptid N-terminálisánál.

A jelen találmány szerinti plazmidokkal való alkalmazásokhoz előnyös gazdaszervezet az Escherichia coli. A jelenleg előnyös törzsek az A1637, A1645, A2602, A2097, A1563 és A1645 (λΐ434οΓπιίηί TnlO).

Az A1645 jelenleg a legelőnyösebb törzs a szuperoxid-diszmutáz vagy analógja kifejeződéséhez.

Az A1645 és A1645(ki434cl mini TnlO) jelenleg a legelőnyösebb törzsek az állati növekedési hormongének kifejeződéséhez.

Az A2097 jelenleg a legelőnyösebb törzs azoknak a géneknek a kifejeződéséhez, amelyek a következőket termelik:

1. egy bGH-analógot, amely met-asp-gln aminosav-szekvenciával rendelkezik az autentikus bGH fenilalanin-formájának amino-terminálisához hozzáadva;

2. egy cGH-analógot, amely egy metioninnal rendelkezik a természetes cGH fenilalanin formájának amino-terminálisához hozzáadva.

Az A1637-et C600-ból nyerjük, a galaktóz operonon belül tetraciklin rezisztenciagént, valamint a kifejeződéshez szükséges lambda-rendszert - amely a galaktózoperonhoz közel van - tartalmazó transzpozon beiktatásával. A C600 az American Type Culture Collectionnál rendelkezésre áll ATCC 23724 letéti számon. Az A1645-öt az Al 637-ből nyerjük Gal⁺-ra való szelekcióval (képesség a galaktóz fermentálására), valamint a tetraciklin-rezisztencia elvesztésével. Ez még tartalmazza a lambdakifejeződő-rendszert, de a transzpozon egy része el van távolítva a szelekcióval.

HU 214 977 Β

Ennek fenotípusa C600 rm⁺gal⁺thrleu-lacZ-bl (Xcl857AHlABamHI N⁺). Az A1645 letétbe van helyezve az American Type Culture Collectionnál (Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) különböző plazmidokat tartalmazó formákban, amint ezt később részletesebben leírjuk.

Az A1645 (Xi434cl^-mini TnlO) egy imm434cI3008 mini TnlOA16A17-plazmidot tartalmazó, 30 °C hőmérsékleten fertőzött A1645 Escherichia coli-törzsből származik. A tetraciklinre rezisztens telepeket izoláljuk és tisztítjuk. Ez a pHG50-plazmidot tartalmazó törzs letétbe van helyezve az American Type Culture Collectionnál ATCC39805 letéti számon, 1984. augusztus 24. óta.

Az A2602 és A1563 az SA5OO-ból származik. Ezek fenotípusa SA500 his41e-gal⁺A8(ÁcI857AHlABam N⁺), illetve SA500 hisrile-gal⁺A81acZ-A21^cI857 int2 xisl nutL₃AHl).

Az A2097 az Al645-ből származik. Ennek fenotípusa A1645 lacKA21 proC::TnlO.

Prototróf Escherichia coli-törzseket, amelyek képesek magas szintű polipeptid-kifejeződésre, még amikor minimál tápközegben nőnek, akkor is szintén lehet alkalmazni gazdaszervezetként a jelen találmány szerinti vektorokhoz. Előnyös prototróf törzsek például az A4200 és A4255. A p9200-plazmidot tartalmazó A4255 törzs az ATCC-nél letétbe van helyezve ATCC 53215 letéti számon. Még előnyösebbek a biotintól független prototróf törzsek, mint például a pGH44plazmidot tartalmazó A4346, amely szintén letétbe van helyezve az ATCC-nél ATCC 53218 letéti számon.

Az Escherichia coli lizálótörzseit szintén lehet gazdaszervezetként használni a jelen találmány szerinti vektorokhoz. Megfelelő lizálótörzsek azok, amelyek termelnek egy anyagot, például egy enzimet, mint endolizint, amely a sejt lízisét okozhatja olyan hőmérsékletnél, amelynél a polipeptid is termelődik, de sokkal kisebb sebességgel, mint ahogyan a polipeptid termelődik. Ez lehetővé teszi, hogy a sejt viszonylag nagy mennyiségű kívánt polipeptidet termeljen, mielőtt a termelt lizálóanyag mennyisége eléri azt a szintet, amely a sejt lízisét okozza.

Alkalmas lízálótörzsekre példák azok, amelyek a Plcl^ts-plazmidot tartalmazzák, ilyen például az A4048 törzs, amelynek pGH 44-et tartalmazó formája letétbe van helyezve az ATCC-nél, ATCC 53217 letéti számon.

Minden letét a Mikroorganizmusok Letétbe Helyezésének Nemzetközi Elismerésére Vonatkozó Budapesti Szerződés (Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms) értelmében történt, kivéve a pBR322 és pBRM letétbe helyezését, amelyek mindenki számára hozzáférhetők az ATCC-nél 37017, illetve 37283 letéti számokon, és a D4 letétbe helyezését, amely ATCC 31826 letéti számon van letétbe helyezve egy bejelentett amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentéssel kapcsolatban.

A vektorokat, amelyekre a találmány vonatkozik, ki lehet alakítani olyan módszerekkel, amelyek jól ismertek azok számára, akik a szakterületen átlagosan jártasak. Az ilyen módszereket nagy részletességgel írják le az itt is megnevezett különböző közleményekben, amelyek lényege a jelen leírásba referenciaként be van építve abból a célból, hogy teljes tájékoztatással szolgáljunk a technika állásával kapcsolatban.

Az egyik, jelenleg előnyös vektor a pJH200, amelynek restrikciós térképét a 2. ábra mutatja be. Ezt a vektort Escherichia coli-ba vezetjük be, az A1645 törzs hagyományos transzformálási módszerét alkalmazva. Az így létrejött gazdasejtvektor-rendszert ATCC 39783 letéti számon helyeztük letétbe. Egy kívánt polipeptidet, például szarvasmarhanövekedési-hormont kódoló gént lehet beiktatni pJH200-ba.

Egy másik előnyös vektort, a pRO211-et pJH200 részleges Ndel emésztésével alkotjuk meg. A pRO211 restrikciós térképét a 2. ábrában mutatjuk be. A szarvasmarhanövekedési-hormon cDNS-t beiktatjuk pRO211-be a vektor emésztésével TVcfel-el és ffindlll-al, a nagy fragmens izolálásával, és ennek ligálásával a pAL500-ból (ATCC 39782) nyert bGH cDNS-hez. Az így létrejött plazmidot pRO12-nek nevezzük. Ennek restrikciós térképe szintén a 2. ábrában található.

A pRO12-plazmidot részlegesen emésztjük PvmIIvel, majd Ndel-el. Egy, az autentikus bGH N-terminálisának első 24 aminosavát kódoló szintetikus fragmenst ligálunk az emésztett pRO 12-höz. Az így létrejött plazmid, amelyet pSAL 5200-6-nak nevezünk, restrikciós térképét a 3. ábrában adjuk meg.

A jelen találmány szerinti vektorokat lehet úgy is tervezni, hogy olyan plazmidokat állítsunk elő, amelyek a humán szuperoxid-diszmutázt (SÓD) vagy analógjait termelik. A pJH200-nak XP_L-promotort és a C_n riboszomális kötőhelyet tartalmazó fragmensét izoláljuk, majd beiktatjuk pSOD ΝΗ-10-plazmidba, amely tartalmazza a humán SOD-hez tartozó gént, így képezzük a pSOD ΝΗ-550-nek nevezett plazmidot, amint ezt a 13. ábrán bemutatjuk. Egy mind a ZP_L-promotort, mind az SOD-gént tartalmazó fragmenst izolálunk a pSOD NH-5 50-ből rt/wl-el történt emésztést követően. BaznHIlinkerek hozzáadása és az eztkövető TtoraHI-hasítás után a fragmenst beiktatjuk pBRM egyedi őa/nHI-helyére. A pBRm nagy kópiaszámú plazmid, amelyet letétbe helyeztünk ATCC 37283 letéti számon. Az így létrejött plazmidot pSODa2-nek nevezzük. Ennek restrikciós térképét a 13. ábrában mutatjuk be. Ezt a plazmidot E. coli A2097-ben helyeztük letétbe ATCC 39786 letéti számon.

A pSODa2 (ATCC 39786) tartalmazza a C_n riboszomális kötőhelyet. Ezt a riboszomális kötőhelyet helyettesítjük egy olyan fragmenssel, amely pBLAl 1 EcoRl-Alu! emésztéséből izolált β-laktamázpromotort és Shine-Dalgamo riboszomális kötőhelyet tartalmaz. (A pBLAl 1-plazmid restrikciós térképét a 14. ábra mutatja be; ez a plazmid Escherichia coli A1645 törzsön belül letétbe van téve ATCC 39788 letéti számon.) A C_n riboszomális kötőhelyet eltávolítjuk a pSODa2 plazmidból, ahogyan ezt a 14. ábrában bemutatjuk. A pSODa2-t részlegesen hasítjuk EcoRI-val, betöltjük DNS polimeráz I-el (Klenow), és újra ligáljuk úgy, hogy az egyedül megmaradó EcoRI-hely a

HU 214 977 Β plazmidban a C_n RBS 5’-végénél helyezkedik el. Az így létrejött plazmidokat, amelyet pSOD 13-nak nevezünk, Aí/el-el emésztjük, DNS polimeráz I-el (Klenow) betöltjük, majd £coRI-vel emésztjük. A nagy fragmenst izoláljuk, és ahhoz a fragmenshez ligáljuk, amely a 5 pBLAl 1-ből izolált β-laktamázpromotort és riboszomális kötőhelyet tartalmazza. így alakítjuk ki a pSOD β 1 -píazmidot.

A ρ8ΟΟβ1-Λ módosíthatjuk úgy, hogy tetraciklin rezisztenciagén-fragmenst foglaljon magában (Tet^R) ampicillin rezisztenciagén-fragmens helyett (Amp^R).

Az Amp^R-fragmenst úgy távolítjuk el a ρΞΟϋβ 1-ból, hogy Ps/I-el, majd részlegesen BazwHI-vel emésztjük.

Az így létrejött píazmidot DNS polimeráz I-el (Klenow) betöltjük. A Tet^R-génfragmenst külön izolál- 15 juk a pBR322 EcoRI-Aval emésztésével keletkezett keverékéből, betöltjük és ligáljuk a betöltött plazmidba.

(A pBR322 több helyről is beszerezhető, például az American Type Culture Collection-tól, ahol ATCC 37017 letéti számon található.) Az így létrejött 20 píazmidot ρ8Οϋβ1Τ11-nek nevezzük. Ennek restrikciós térképét a 15. ábrán mutatjuk be.

Egy további plazmid, amelyet alkalmazhatunk humán szuperoxid-diszmutáz előállítására, a pS(ft^l-BA2-nek nevezett plazmid. Ennek megalkotását pSODa 13-ból a 17. ábrán mutatjuk be.

A jelen találmány szerinti vektorokat, például a pRO211-et lehet tervezni sertés vagy csirke növekedési hormonok termelésére is. így, amint a 4. ábrán látható, sertésnövekedésihormon-cDNS-t izolálunk ppGH-TVrfel/RI Ndél-es emésztéséből. Az így létrejött, 10 pGH-gént tartalmazó fragmenst Wd-el emésztett pRO211-hez ligáljuk. Az így létrejött, p3008-nak nevezett píazmidot E. coli A2097 törzsbe foglalva deponáltuk ATCC 39804 letéti számon.

A jelen találmány egy másik kiviteli formájában két csirke növekedésihormon-fragmenst izolálunk pcGH-Aűfel/RI Ndel-Bamll emésztéséből, amint ezt az 5. ábrán bemutatjuk. A két cGH-fragmenst egy foszforilezett szintetikus linkerhez kapcsoljuk, amely kódolja az autentikus cGH N-terminálisának első 18 aminosavát.

A linker szekvenciája a következő:

TATGTTCCCTGCCATGCCCCTCTCCAACCTGTTTGCCAACGCTGTGCTGAGGGCT

ACAAGGGACGGTACGGGGAGAGGTTGGACAAACGGTTGCGACACGACTC.

Az így létrejött fragmenst azután Ariel-el emésztett pRO211-hez ligáljuk, a p5002-nek nevezett píazmidot képezve, amelynek restrikciós térképét az 5. ábrán mutatjuk be.

A jelen találmány szerinti vektorok úgy is tervezhetők, hogy humán apolipoprotein E-t állítsanak elő. A humán apolipoprotein E-hez (ApoE) szolgáló gént a pApoE-EX2-ből lehet izolálni Ar/el-emésztéssel. A pApoE-EX2 restrikciós térképét a 18. ábrában mutatjuk be. Ez letétbe van helyezve, E. coli A1645 törzsbe foglalva, ATCC 39787 letéti számon.

Az ApoE-gént (cDNS) különböző plazmidokba lehet helyezni. Az előnyös megvalósítások egyike a pTV-188-plazmid, amelynek restrikciós térképét a 18. ábrában mutatjuk be. A pTV-188-at úgy alkotjuk meg, hogy a pApoE-EX2-ből izolált ApoE-gént ligáljuk SYwI-el emésztett ρ800β,Τιι-ρΐΒζπιίόΕοζ. A pTV-188 tartalmazza a Tet^R-fragmenst, a P_Lpromotorszekvenciát, a β-laktamázpromotort és a Shine-Dalgarno-szekvenciát. Ez a plazmid kifejez egy ApoE-füziós fehérjét.

Egy másik előnyös megvalósítása azoknak a plazmidoknak, amelyek ApoE-gént tartalmaznak, a pSAL 160-5, amelynek restrikciós térképét a 23. ábrában mutatjuk be. A pSAL-160-5-öt pTV104(2)-ből (ATCC 39384) és pTV-170-plazmidból (lásd 20. ábra) alkotjuk meg. Az ApoE-gént pTV 170-ből izoláljuk, és beiktatjuk a pTV 104(2)-be a humán növekedési hormon génszekvencián belül lévő E.v/I-helyre. Az így létrejött pSAL 160-5 tartalmazza az Amp^R-fragmenst és a P_L-promotorszekvenciát.

Az egyik jelenleg előnyös vektor a p579, amelynek restrikciós térképét a 19. ábrában mutatjuk be. Ezt a vektort be lehet vezetni megfelelő Escherichia colitörzsbe, például A1637, A2602, A1563, A1645 vagy A2097-be, hagyományos transzformációs módszereket alkalmazva, amelyek ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak. Egy kívánt polipeptidet, például sertés-növekedésihormont vagy csirke növekedési hormont kódoló gént be lehet iktatni p579-be.

Sertésnövekedésihormon-cDNS-t beiktatunk p579be olyan módon, hogy a vektort vVriel-cl emésztjük, és a nyitott szálat p3008-ból (ATCC 39804) nyert pGH cDNS-hez ligáljuk. Az így létrejött píazmidot p3009nek nevezzük. Ennek restrikciós térképét all. ábra mutatja be.

Csirkenövekedésihormon-cDNS-t beiktatunk p57940 be olyan módon, hogy a vektort Wel-el emésztjük, és a nyitott szálat p5002-ből nyert cGH DNS-hez ligáljuk. Az így létrejött píazmidot p5003-nak nevezzük, ennek restrikciós térképét a 12. ábrában mutatjuk be. A p5003-at Escherichia coli A2097 törzsön belül letét45 be helyeztük ATCC 39793 letéti számon.

A humán apolipoprotein E (ApoE3) termeléséhez szolgáló gént, ahol a végtermék valószínűleg metioninaminosavval van kiegészítve az amino-terminálisnál, szintén be lehet iktatni p579-be. Az így létrejött plaz50 mid, amelyet pTV-Ι 70-nek nevezünk, megalkotását a 20. ábrában mutatjuk be. Ez a plazmid tartalmazza a pJH200-ból (ATCC 39783) származó C_n riboszomális kötőhelyet.

A pTV-170-plazmidot lehet módosítani az ApoE55 génhez kötődő MfeThelyek egyikének eltávolításával. Az így létrejött píazmidot, amelyet pTV-Ι90-nek nevezünk, a 21. ábrán mutatjuk be.

A pTV-170-et lehet olyan formában is módosítani, hogy pBLA 11-ből (ATCC 39788) izolált β-laktamáz60 promotorral és Shine-Dalgamo riboszomális kötőhe13

HU 214 977 Β lyet. Az így létrejött plazmid, amelyet pTV-194-nek nevezünk, restrikciós térképét a 22. ábrán mutatjuk be.

A pTV-190-et (21. ábra) úgy lehet módosítani, hogy ez olyan humán ApoE3-analógot termeljen, amely amino-terminálisánál humán növekedési hormon amino-terminálisának 14 aminosavával rendelkezik, ezt követi egy metionin, amely az érett humán ApoE3szekvenciájához van kötve. Egy ilyen plazmidnak, amelyet pTV-214-nek nevezünk, restrikciós térképét a 24. ábra mutatja be.

Olyan plazmidnak, amely ApoE3-gént tartalmaz, egy másik előnyös megvalósulása a pTVR 279-8, amelynek restrikciós térképét a 25. ábra mutatja be. A pTVR 279-8-at pTV 264-ből alkotjuk meg, amelyet viszont pTV 190-ből alkotunk meg. PTV 190-et (21. ábra) részlegesen emésztünk Aval-el, „betöltjük” DNS polimeráz I Klenow-fragmenst alkalmazva, és újra ligáljuk. Az így létrejött plazmidot, amelyet pTV 264—45-nek nevezünk, megszabadítjuk az rival-helytől a gén 3’-végénél. A pTV 264—45-plazmidot teljes mértékben emésztjük TVofel-el, és ligáljuk egy foszforilezett szintetikus linkerrel, amelynek szekvenciája a következő:

5’-TATGCTGCTGCT

ACGACGACGAAT-5’.

Az így létrejött plazmidot, amelyet pTV 279-8-nak nevezünk, ATCC 53216 letéti számon letétbe helyeztük.

A jelen találmány szerinti vektorokat lehet úgy is tervezni, hogy olyan plazmidokat képezzenek, amelyek emberi növekedési hormonok termelésére képesek. Ilyen plazmidra példa a pTV 300, amelynek restrikciós térképét a 27. ábra mutatja be. A pTV 300-at úgy alkotjuk meg, hogy pTV 18(l)-et hasítunk Ndel-ei, a metl4-hGH DNS-t izoláljuk, és ezt Wel-el hasított p579-hez (19. ábra) ligáljuk. A pTV (18) 1 -et úgy nyerhetjük, ahogyan ezt a 0131 843 Al Európai Szabadalmi Közrebocsátási Irat (közölve 1985. január 23-án) leírja, vagy ahogyan ezt az ennek megfelelő 514,188 bejelentési sorszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (bejelentve 1983. július 15-én) leírja; ez utóbbit referenciaként beépítjük a jelen bejelentésbe.

A jelen találmány szerinti vektorokat lehet úgy is tervezni, hogy olyan plazmidokat állítsunk elő, amelyek egy humán Cu-Zn szuperoxid-diszmutáz analógot termelnek, amely a természetes humán SOD-től annyiban különbözik, hogy az amino-terminális nincs acilezve. Ilyen plazmidot alkotunk meg a 16. ábra szerint, ezt pSODp,TTl-nek nevezünk.

A jelen találmány szerinti vektorokat lehet úgy is tervezni, hogy olyan plazmidokat állítsunk elő, amelyek egy rekombináns bovin növekedési hormont termelnek. Egy bGH-analógnak termelésére példa egy olyan analóg, amely az autentikus bGH fenilalanin formájának amino-terminálisához hozzátéve egy met-asp-gln aminosav-szekvenciát tartalmaz, ezt az analógot rec bGHnak is nevezzük. A pGH44-plazmidot, amely ilyen hormont termel, a 6. ábrában megadott vázlat szerint alkotjuk meg; ezt a plazmidot A2097 törzsön belül ATCC 39806 letéti számon helyeztük letétbe.

Egy másik plazmid, amelyik met-asp-gln bovin növekedési hormont termel, a p9200. A p9200-plazmid hasonló a pHG44-hez (6. ábra), a plazmid azonban tetraciklin-rezisztenciát ad át ampicillin-rezisztencia helyett. A p9200 megalkotását a 26. ábra mutatja be. PHG44-et hasítunk C/al-el és E.s'Zl-el, „betöltjük” DNS polimeráz I Klenow-fragmensét alkalmazva, majd a nagy DNS-fragmenst izoláljuk. Ezt a fragmenst pBR322 tetraciklin-rezisztenciagént tartalmazó DNSfragmenséhez ligáljuk, amely fragmenst pBR322-nek £coRI-vel és rival-el végzett hasításával, majd DNS polimeráz I Klenow-fragmensét használó „betöltésével” izolálunk. Az így létrejött p9200-plazmidot ATCC 53215 letéti számon helyeztük letétbe.

Egy másik példa egy olyan bGH-analóg termelése, amely egy metionin-aminosavval rendelkezik a természetes bGH fenilalanin formájának amino-terminálisához hozzáadva. A pSAL 5 600-1-et, amely ilyen hormont termel, a 10. ábrában megadott vázlat szerint alkotjuk meg. A p7200-22-plazmid szintén termel ilyen hormont. Ennek a plazmidnak a restrikciós térképét a 7. ábra mutatja be.

Egy jelenleg előnyös vektor, a p579 egy olyan DNSszekvenciával, amely a C/al-helyre klónozott cl⁴³⁴fragmenst tartalmazza. A p579 restrikciós térképét a 19. ábra mutatja be.

Olyan plazmidokat alkotunk meg, amelyek egy szarvasmarhanövekedési-hormonanalógot fejeznek ki, amely analóg a természetes szarvasmarhanövekedésihormon fenilalanin formájának amino-terminálisához hozzáadva egy met-asp-gln aminosav-szekvenciával rendelkezik (ezt rec-bovin növekedési hormonnak is nevezzük). Egy ilyen plazmid a pGH 50, amelynek restrikciós térképét a 6. ábra mutatja be. Ezt a plazmidot A1645/Xi434cl mini TnlO) törzsön belül deponáltuk az American Type Culture Collectionnál, ATCC 37805 letéti számon.

Másik ilyen plazmid a pSAL-210/4, amelynek restrikciós térképét a 9. ábrában mutatjuk be.

Egy jelenleg előnyös vektor a p8300-10Aplazmidból származik, a met-phe bGH-gén eltávolításával. A plazmid restrikciós térképét a 7. ábrában mutatjuk be, ezt a plazmidot A2097 törzsön belül az American Type Culture Collectionnál helyeztük letétbe, ATCC 39785 letéti számon.

Egy másik jelenleg előnyös gén a pSAL-170/10plazmidból származik a rec bGH-gén eltávolításával. A plazmid restrikciós térképét a 8. ábra mutatja be.

Egy harmadik, jelenleg előnyös gén a pSAL-210/4plazmidból származik a rec bGH-gén eltávolításával. A plazmid restrikciós térképét a 9. ábra mutalja be.

A jelen találmány szerinti vektorokat, amikor gazdaszervezetbe vezetjük be, lehet úgy is tervezni, hogy olyan plazmidot képezzenek, amelyek szarvasmarhanövekedési-hormonanalógokat termelnek. A p8300-10A(ATCC 39785)-öt, amely példa egy ilyen plazmidra, a 7. ábrában bemutatott vázlat szerint alkotjuk meg. Az analóg, amelyet ez termel, egy metioningyökkel rendelkezik a természetes bGH fenilalanin formájának amino-terminálisához hozzátéve.

Más plazmidok olyan analógokat termelnek, amelyek egy met-asp-gln aminosav-szekvenciával ren14

HU 214 977 Β delkeznek a természetes bGH fenilalanin formájának N-terminálisához hozzáadva. Ezek között a plazmidok között van a pSAL-130/4 (8. ábra), a pSAL-170/10 (8. ábra) és a SAL-210/4 (9. ábra).

Ugyanezt a megközelítést alkalmazva más plazmidokat is lehet készíteni, a kívánt polipeptidet kódoló gént behelyezve a plazmid második restrikciós enzimhelyére.

Különböző gazdavektor-rendszerek lehetnek például az E. coli A1637, A1645, A2606, A2097 vagy A1563, ha a plazmid nem tartalmazza a cl⁴³⁴fragmenst, és A1645/Xi434cl mini TnlO), ha a plazmid tartalmazza a cl⁴³⁴-fragmenst. A jelen találmány szerinti gazdaszervezet-vektorrendszerek magukban foglalhatnak prototróf E. coli-kat is, mint az A4200, A4255, és lehetnek biotintól független gazdaszervezet-vektorrendszerek is, mint az A4346. A jelen találmány szerinti lizáló gazdaszervezet-vektorrendszerek magukban foglalják azokat, ahol a gazdaszervezet A4048, de főleg A3111.

Az itt leírt gazdaszervezet-vektorrendszereket lehet alkalmazni különböző polipeptidek termelésére, ilyenek például a szarvasmarha, sertés, csirke és ember növekedési hormonok, humán szuperoxid-diszmutáz és humán apolipoprotein E. Hogy termelhessünk, a gazdaszervezet-vektorrendszert megfelelő körülmények között növesztjük, amely lehetővé teszi annak a polipeptidnek a termelődését, amelyet azután kinyerünk.

A megfelelő körülmények magukban foglalják a gazdaszervezet-vektorrendszer növesztését megfelelő időtartamon át körülbelül 42 °C hőmérsékleten. Kívánatos, hogy a növekedési periódus 42 °C hőmérsékleten minden vektor-gazdaszervezet-rendszerben - a humán apolipoprotein E termeléséhez tervezett művelet kivételével - mintegy 1 és 5 óra között legyen. A humán apolipoprotein E termeléséhez tervezett gazdaszervezet-vektorrendszemél a növekedési időtartam kívánatosán mintegy 15 perc. A megfelelő tápközeg kazeinhidrolizátumot is foglal magában.

Az előzőekben leírt módszerek segítségével egy sor bGH-, pGH-, cGH-, hGH-, ApoE- és SOD-analógot készítünk.

Olyan ApoE-analógokat készítünk, amelyeknek aminosav-szekvenciája azonos a természetes ApoE aminosav-szekvenciájával, azzal a kivétellel, hogy az N-terminálisnál változások vannak, például

1. metionin-aminosav van hozzáadva a természetes humán apolipoprotein E N-terminálisához;

2. olyan természetes humán apolipoprotein E, amelynek N-terminálisához a humán szuperoxiddiszmutáz 42 aminosavból álló N-terminálisa, majd metionin van hozzákapcsolva;

3. természetes humán apolipoprotein, amelyből az N-terminális 11 aminosava el van távolítva, és az érett humán növekedési hormon 45 N-terminális aminosavával, majd metioninnal van helyettesítve;

4. természetes humán apolipoprotein E aminosavszekvenciája, amelynek N-terminálisához a humán növekedési hormon N-terminális szekvenciájának 14 aminosava, majd metionin van kötve; és

5. természetes humán apolipoprotein E3, amely egy met-leu-leu-leu-met aminosav-szekvenciával rendelkezik az N-terminálishoz hozzákapcsolva.

Egy pGH-analógot készítünk, amelyben metioninaminosav van hozzátéve a természetes sertésnövekedésihormon N-terminálisához. Egy cGH-analógot készítünk, amelyben metionin-aminosav van hozzátéve a természetes csirke növekedési hormon N-terminálisához. Egy hGH-analógot készítünk, amelyből a természetes humán növekedési hormon első 13 aminosava törölve van, vagyis met¹⁴ hGH-1.

SOD-analógokat készítünk, amelynek aminosavszekvenciája csaknem azonos a természetes SÓD aminosav-szekvenciájával, kivéve néhány változást az Nterminálison. Erre példák a következők:

1. természetes humán SÓD, amely nincs acetilezve; és

2. természetes humán SÓD, amely nincs acetilzeve és nincs glikozilezve.

Ezeket az SOD-analógokat lehet alkalmazni a szuperoxid-anion diszmutálására vagy egyértékű redukciójára proton jelenlétében, így hidrogén-peroxidot képezve, amint ezt a következő egyenletekben mutatjuk be:

2O₂ - + 2H+ ^S0D > H₂O₂ + O₂ Állatgyógyászati készítményeket lehet előállítani, amelyek egy vagy több bGH-, cGH- vagy pGH-analóg hatásos mennyiségét tartalmazzák megfelelő hordozóval. Az ilyen hordozók jól ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak. Az analógokat lehet közvetlenül beadni vagy valamilyen kompozíció formájában szarvasmarháknak, hogy a tej- és hústermelés növekedjék; csirkéknek, hogy a hústermelés növekedjék; vagy sertéseknek, hogy a tej- vagy hústermelés növekedjék.

Gyógyászati készítményeket lehet előállítani, amelyek ApoE vagy pGH egy vagy több analógjának hatásos mennyiségét tartalmazzák megfelelő hordozóval. Az ilyen hordozók jól ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak. Az analógokat lehet közvetlenül beadni vagy valamilyen kompozíció formájában emberek kezelésére, például ApoE esetében a beteg ApoEtermelése hiányának kezelésére, vagy artheroszklerózis kezelésére; vagy hGH esetében a beteg hGH-termelése hiányának kezelésére.

Állatgyógyászati és gyógyászati készítményeket lehet előállítani, amelyek SÓD vagy egy vagy több SODanalóg hatásos mennyiségét tartalmazzák megfelelő hordozóval. Az ilyen hordozók jól ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak. Az SOD-t vagy analógjait lehet közvetlenül vagy valamilyen kompozíció formájában beadni az állatnak vagy embernek, például gyulladásban szenvedő betegek kezelésére vagy a beteg olyan problémáinak csökkentésére, amelyeket az oxigén-szabadgyökök idéznek elő az általános íszkémíát vagy szervátültetést, például veseátültetést követő újabb perfüzió esetében. Az SOD-t vagy analógját közvetlenül vagy valamilyen készítmény formájában lehet beadni egy izolált szerv perfúziós közegébe, hogy csökkentsük egy izolált szerv oxigén-szabadgyökök által előidézett problémáit a kimetszést követő perfúzió alkalmá15

HU 214 977 Β val, így meghosszabbítsuk a szerv, például szaruhártya túlélési idejét. Ezenkívül az SÓD- vagy analógját lehet alkalmazni neurológiai panaszok csökkentésére is.

Enzimesen aktív eukarióta szuperoxid-diszmutáz (SÓD) vagy valamilyen analógja baktériumsejtekben való előállításának módszerét tárjuk fel. A bakteriális sejt tartalmaz egy olyan DNS-szekvenciát, amely a szuperoxid-diszmutázt vagy analógját kódolja, és képes kifejezni is ezt. A módszer a bakteriális sejt fenntartását tartalmazza a megfelelő körülmények között és a megfelelő termelő tápközegben. A termelő tápközeg ki van egészítve megfelelő mennyiségű Cu-al úgy, hogy a Cu⁺⁺ koncentrációja a tápközegben több legyen, mint körülbelül 2 ppm.

A bakteriális sejt lehet bármilyen baktérium, amelybe eukarióta szuperoxid-diszmutázt kódoló DNS-t be lehet vezetni rekombináns DNS-technikákkal. A baktériumnak képesnek kell lennie a DNS-szekvencia kifejezésére és a fehérjetermék előállítására. A megfelelő körülmények és a termelő tápközegek változnak a baktériumfaj és -törzs szerint.

A baktériumsejt tartalmazhatja a szuperoxiddiszmutázt vagy analógot kódoló DNS-szekvenciát egy vektoron, például plazmid DNS-molekulán belül. A vektort vagy plazmidot rekombináns DNS-technikával alkotjuk meg olyan módon, hogy a beépített, SOD-t kódoló szekvenciával a molekula megfelelő helyzeténél rendelkezzék.

A találmány szerinti egyik előnyös kiviteli módban a bakteriális sejt valamilyen Escherichia coli-sejt. Az előnyös E. coli-törzs az A1645 törzs. A jelen találmány szerinti E. coli-sejt egy olyan plazmidot tartalmaz, amely az SOD-t vagy analógját kódolja. A jelen találmány szerinti egyik előnyös kiviteli módban az SÓD humán szuperoxid-diszmutáz vagy analógja.

A jelen találmány szerinti egyik előnyös kiviteli mód azokra az E. coli-törzsekre vonatkozik, amelyek a pSODP,-, pSODoc2-, pSODp_iT„-, pSODp!-BA2vagy pSCX^TT-l-plazmidot tartalmazzák. Az ezeknek a plazmidoknak a megalkotására szolgáló módszereket az ábrák leírásánál ismertettük, és a plazmidok maguk a 3. példában vannak leírva. Ezeket a plazmidokat a rendelkezésre álló kiindulási anyagokból bárki meg tudja alkotni, aki a szakterületen átlagosan járatos. Azok az E. coli-törzsek, amelyek az eukarióta szuperoxid-diszmutázt kódoló plazmidok megalkotásában alkalmazható különböző plazmidokat tartalmazzák, letétbe vannak helyezve az American Type Culture Collectionnál (Rockville, Maryland 20852), a mikroorganizmusok letétbe helyezése nemzetközi elismertetésének céljából létrehozott Budapesti Szerződés előírásai szerint, szabadalmi eljárás céljaira. Ezek a plazmidok és megfelelő ATCC letéti számaik a következők: pBRM, ATCC 37283; pSODa2, ATCC 39786; pBR322, ATCC 37017; pBLAll, ATCC 39788; pJH200, ATCC 39783 és pPSl, ATCC 39807.

A jelen találmány egyik speciális megvalósításában enzimesen aktív humán szuperoxid-diszmutázt állítunk elő E. coli A2097 sejt segítségével, amely a pSODa2plazmidot tartalmazza. Ezt a sejtet az American Type

Culture Collectionnál ATCC 39786 letéti számon helyeztük letétbe.

A megfelelő termelő tápközeg a bakteriális sejthez lehet bármilyen típusú elfogadható növesztő tápközeg, mint kazein-hidrolizátum, vagy LB- (Luria-Broth) tápközeg. A megfelelő növesztési körülmények változhatnak az E. coli-törzzsel és a plazmiddal, amelyet tartalmaz, például a ρβΟΟβ,Τ,,-et tartalmazó E. coli A1645öt 42 °C hőmérsékleten indukáljuk, és ezen a hőmérsékleten tartjuk mintegy 1-5 órán át. A hőmérséklet, idő, keverés és levegőztetés megfelelő körülményeit az inokulum növesztéséhez és a tenyészet növesztéséhez a kívánt sűrűségre a termelőfázis előtt, valamint a tenyészet fenntartását a termelőperiódusban a 26. példában írjuk le.

A Cu⁺⁺-ionok koncentrációja, amely az enzimesen aktív SÓD termeléséhez szükséges, változik az alkalmazott tápközeg típusával. Egy kazein-hidrolizátumos tápközegben a Cu⁺⁺-ionkoncentrációt 200 ppm-nél találtuk hatékonynak.

LB tápközegben a Cu⁺⁺-ionkoncentrációt 75 ppmnél találtuk hatásosnak. Előnyös, ha a növesztő tápközegek mindegyik komplextípusában a Cu -koncentráció a tápközegben körülbelül 50 és 250 ppm között van.

A legtöbb eukarióta szuperoxid-diszmutáz Cu/Zn metalloprotein. A találmány egyik speciális kiviteli módjában Zn⁺⁺-ionokat adunk kiegészítésként a tápközeghez úgy, hogy a Zn koncentrációja a tápközegben nagyobb mint körülbelül 2 ppm. A találmány egyik előnyös kiviteli módjában a Cu⁺⁺- és Zn⁺⁺-koncentrációkat úgy egészítjük ki, hogy 0,8 g/1 CuSO₄-5H₂O-t és 10 mg/1 ZnSO₄-7H₂O-t adunk a tápközeghez.

A megfelelő törzs-, tenyésztő, inokuáló és termelő tápközegek változhatnak, mindezek ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak. A megfelelő tápközegekre a jellemző példákat a 26. példában adjuk meg.

A találmány foglalkozik a baktériumsejtekben előállított, tisztított, enzimatikusan aktív eukarióta SÓD vagy analógja kinyerésének módszerével, a találmány szerinti módszerekkel összhangban.

A bakteriális sejtet először a termelő tápközegből izoláljuk, miután a tenyészetet lehűtöttük. A sejtet lehet izolálni bármilyen nem roncsoló módszerrel, mint például centrifúgálással vagy szűréssel. A sejtet azután megfelelő, 7,0 és 8,0 pH-értékek közti pH-val rendelkező oldatban szuszpendáljuk. Előnyös, ha körülbelül 7,8 pH-jú, 50 mmol/literes nátrium-foszfát-oldatot alkalmazunk. A sejtfalat elroncsoljuk megfelelő módszerrel, például keverővei vagy sejtzúzóval, és az így létrejött homogén szuszpenziót ultrahanggal kezeljük megfelelő körülmények között. Az ultrahangos kezelés egy folyamatos folyadékcella segítségével történhet. Az így létrejött, ultrahanggal kezelt oldatot azután megfelelő körülmények között centrifugáljuk úgy, hogy a sejttörmelék elkülönüljön a fehéijefelülúszó-oldattól.

A felülúszót ezután 2 órán át melegítjük körülbelül 65 °C hőmérsékleten, majd hűtjük és centrifugáljuk ugyanolyan körülmények között, mint amelyeket az előző centrifugálásnál alkalmaztunk, abból a célból, hogy felülúszóként tiszta fehérjeoldatot kapjunk. A fe16

HU 214 977 Β lülúszót ezután megfelelő térfogatra besűrítjük (például 1 literre) ultraszűrő berendezéssel, 10 000 molekulasúly-kizárást alkalmazva.

A besűrített fehérjeoldatot azután ioncserélő kromatográfiának vetjük alá megfelelő anioncserélőn, amely 7,0-8,0 közötti pH-értéknél van kiegyensúlyozva. Előnyös, ha a kromatográfíát DEAE-Sephacel-oszlopon hajtjuk végre, amely 150 mmol/liter nátrium-foszfátpufferral van kiegyensúlyozva. Az így létrejött átáramló oldatot, amely a szuperoxid-diszmutázt vagy analógot tartalmazza, ezután összegyűjtjük, besűrítjük megfelelő térfogatra, és dializáljuk egy 7,0-8,0 pH közti pH-jú pufferolt oldattal szemben. Ezt megtehetjük ultraszűrő berendezésben 20 mmol/liter trisz-HCl-oldattal (pH körülbelül 7,8) szemben.

Ezt a koncentrált oldatot ioncserélő kromatográfiának vetjük alá megfelelő, pH 7,0-8,0 között kiegyensúlyozott anioncserélőn. 20 mmol/liter trisz-HCl-el kiegyensúlyozott QAE-Sepharose-oszlop, amelynek pHja körülbelül 7,8, megfelelő. Az anioncserélőhöz kötött fehérjét megfelelő sógrandiensnek vetjük alá, például 0-200 mmol/liter NaCl, 20 mmol/liter trisz-HCl-ben (pH 7,8). Az így létrejött, SOD-t vagy analógot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, sűrítjük például ultraszűrő berendezéssel, dializáljuk desztillált vízzel szemben, majd pH-ját körülbelül 4,0-5,0 közé állítjuk be megfelelő pufferral. Egy előnyös kiviteli módban a szóban forgó oldatot 100 mmol/literre állítjuk be nátriumacetátra, 1 mol/literes, körülbelül 4,8 pH-jú nátriumacetát hozzáadásával.

Ezt a pufferolt oldatot ismét ioncserélő kromatográfiának vetjük alá, de kationcserélővei. 100 mmol/literes, mintegy 4,7 pH-jú nátrium-acetáttal kiegyensúlyozott CM-Sepharose-oszlop megfelelő. A kationcserélőhöz kötött fehérjét megfelelő sógradiensnek vetjük alá, ilyen például 100-500 mmol NaCl 100 mmol/liter nátriumacetátban (pH 4,7), és az így létrejött, tisztított SOD-t vagy analógot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük.

A tisztított SOD-t tartalmazó frakciókat koncentrálhatjuk, például ultraszűréssel, és tároláshoz liofílezhetjük.

A találmány foglalkozik a tisztított, enzimesen aktív eukarióta szuperoxid-diszmutázzal vagy analógjaival is, amelyeket a jelen találmány szerinti módszerekkel állítanak elő és tisztítanak. A jelen találmány előnyös kiviteli formája tisztított, enzimesen aktív humán szuperoxid-diszmutázzal vagy analógjaival foglalkozik, amelyeket a jelen találmány szerinti módszerekkel állítanak elő és tisztítanak.

Kiviteli példák

A példák, amelyek itt következnek, azt a célt szolgálják, hogy segítsék a találmány megértését, de nem az a szándékuk, és nem is úgy vannak szerkesztve, hogy bármilyen módon korlátozzák a találmány oltalmi körét. A példák nem tartalmazzák az alkalmazott hagyományos módszerek leírását a vektorok megalkotásában, a szóban forgó polipeptideket kódoló gének beiktatásában az ilyen vektorokba, vagy az így létrejött plazmidok beiktatásában bakteriális gazdaszervezetbe. Az ilyen módszerek jól ismertek azok számára, akik a szakterületen átlagosan jártasak, és számos közleményben le vannak írva, beleértve például a következő körülményeket:

T. Maniatis, E. F. Fritsch és J. Sambrook: Molecular Cloning; A Laboratory Manual (Molekuláris klónozás; Laboratóriumi kézikönyv); Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982). Methods in Enzimology, 65, „Nucleic Acids” (Nukleinsavak), 1. rész. Szerkesztette: Lawrence Grossman és Kivié Moldave, kiadó: Academic Press, New York (1980). Methods in Enzimology, 68, „Recombinant DNA” (Rekombináns DNS). Szerkesztette: Ray Wu, kiadó: Academic Press, New York (1981).

Methods in Enzimology, 100, „Recombinant DNA” (Rekombináns DNS). B rész. Szerkesztette: Ray Wu, Lawrence Grossman és Kivié Moldave, kiadó: Academic Press, New York (1983).

Methods in Enzimology, 101, „Recombinant DNA” (Rekombináns DNS). C rész. Szerkesztette: Ray Wu, Lawrence Grossman és Kivié Moldave, kiadó: Academic Press, New York (1983).

Principles of Gene Manipulation, An Introduction to Genetic Engineering (A genetikai manipulációk elvei, bevezetés a genetikai mérnökségbe). 2. kiadás. Szerkesztette: R. W. Old és S. B. Primrose, kiadó: University of Califomia Press (1981).

Η. V. Bemard és munkatársai: Gene, 5, 59 (1979).

A. B. Oppenheím és munkatársai: J. Mól. Bioi., 158, 327(1982).

E. Remaut és munkatársai: Gene, 15, 81 (1981).

1. példa

Kifejeződő vektorok

Ahogyan itt használjuk, a „kifejeződő vektor” kifejezés olyan plazmidok csoportjára vonatkozik, amelyek használhatók a kívánt gén kifejezésére baktériumokban, főleg E. coli-ban. A kívánt gént be lehet iktatni a kifejeződő vektorba, vagy más módszerrel a kifejeződő vektoron lévő promotorokat ki lehet metszeni és behelyezni a kívánt gén elé.

pJH200

A 2. ábrában bemutatott pJH200 a pBR32 sokkópiás plazmidba beiktatott DNS-ből tevődik össze. A ZDNS kiemelkedő vonásai azok, hogy tartamazza a ÁP_L-promotort, a baloldali N-hasznosító helyet (nut_L), egy £coRI restrikciós helyet, ^a hu befejező (terminációs) helyet, ezt követi a Cn riboszomális kötőhely és egy ATG beindító kodon, amely az Ndél restrikciós hely része. 116 bázispáron belül az Ndel restrikciós helytől „lefelé” négy egyedi restrikciós hely van, ahogyan ezt a 2. ábra bemutatja. A restrikciós helyek lehetővé teszik a kívánt gén könnyű beiktatását. A C_n riboszomális kötőhely különbözik a természetes riboszomális kötőhelytől, egyetlen pontmutációval.

A pJH200-at pOGl 1-ből alkották meg [Oppenheím, A. és munkatársai: J. Mól. Bioi., 158, 327 (1982)], és ez tartalmazza a ÁP_L-promotort és a pOGl 1-ben található Cji riboszomális kötőhelyet.

A XP_L-promotor és a Cj_t riboszomális kötőhely között elhelyezkedő ÁDNS 346 bp-ja azonban ki van ik17

HU 214 977 Β tatva, és egy £coRI restrikciós hely van beiktatva e közt a két elem közt lévő elágazásnál. Egy multirestrikcióshely-linkert is bevezettek a riboszomális kötőhelytől „lefelé”. A pJH200 deponálva van az American Type Culture Collectionnál, ATCC 39783 letéti számon (1984. augusztus 2. óta).

pRO211

A pRO211, amelyet a 2. ábrában mutatunk be, és részletesen leírtunk az ábrák leírásában, a pJH200-ból származik olyan módon, hogy a két Ndel restrikciós hely egyikét eltüntetjük. A pJH 200-at, pRO211-et és származékait, amelyek eukarióta géneket tartalmaznak, megfelelő E. coli gazdaszervezetben lehet fenntartani. A megfelelő gazdaszervezet legfontosabb vonása az, hogy a hőérzékeny cI857 represszort és az antiterminációs N-fchérjét [Guttesman, Μ. E. és munkatársai: J. Mól. Bioi., 140, 57-75. (1980)] tartalmazza.

A pRO211-nek számos előnye van a korábban leírt kifejeződő vektorokkal szemben, ezek például a következők:

1. A kifejeződés különösen magas szintje

A vektor képes az idegen fehéije kifejezésének irányítására E. coli-ban, akár a teljes sejtfehérje 35%-áig terjedő szinten.

2. Helyettesíthető riboszomális kötőhely

A pRO211 tartalmaz egy egyedi EcoRI-helyet, amely a riboszomális kötőhelytől „felfelé” helyezkedik el, és egy AUel-helyet, amely a riboszomális kötőhelytől „lefelé” helyezkedik el. így a riboszomális kötőhely két egyedi restrikciós helyhez van kötve. Ez lehetővé teszi a jelen riboszomális kötőhely (a XC_n riboszomális kötőhely) kimetszését és tulajdonképpen bármilyen természetes vagy szintetikus kötőhely helyettesítését anélkül, hogy a plazmid egyéb vonásait változtatnánk. Ez nagymértékben megkönnyíti a kívánt polipeptid optimális kifejeződését.

3. A kifejeződés hővel indukálható szabályozása

A XP_L-promotor inaktív, amikor Q represszor hozzá van kötve. A cI857 represszor hőérzékeny, azaz kötődik a promotorhoz 30 °C hőmérsékleten, de inaktivált 42 °C hőmérsékleten. így a fermentáció hőmérsékletének emelésével 42 °C hőmérsékletre a gazdabaktériumok indukálódnak, hogy fehéijét termeljenek.

Az ilyen rendszer előnyei például a következők:

a) Egy idegen fehérjét, amely toxikus Escherichia colira, is elő lehet állítani a fermentációs folyamat késői szakaszában, így kerülve el a korai sejtpusztulást.

b) Egy fehéije túltermelése stabilizálhatja a fehérjét és megelőzi a proteolitikus lebontást [Cheng, Y. E. és munkatársai: Gene, 14, 121 (1981)]. így az „azonnali” túltermelés, egy szigorúan szabályozott promotort, mint például XP_L-t alkalmazva, előnyösebb lehet a folyamatos, alacsony szintű termelésnél.

4. Egyszerűsített indukciós munkamenet

A jelen találmányi bejelentésben leírt és a még szintén függőben lévő, együtt benyújtott 514,188 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben leírt plazmidok által történő fehéqetermelést a cI857 hőérzékeny represszor szabályozza.

A még szintén függőben lévő, együtt benyújtott bejelentésben leírt plazmidok által igényelt indukciós munkamenet magában foglalja az indukciót 42 °C hőmérsékleten a 38 °C hőmérsékleten végzett növesztést követően. Ezzel ellentétben a fehérjeszintézis optimális indukciója, amikor pJH200, pRO211 vektorokat vagy plazmidszármazékaikat alkalmazzuk, indukciót foglal magában 42 °C hőmérsékleten, azonos hőmérsékleten, vagyis 42 °C-on végzett növesztés után. Ez szükségtelenné teszi a fermentor hűtését.

5. Kópiaszám

A XP_L-promotor a pJH200-ban és pRO211-ben olyan plazmidon található, amelynek kópiaszáma nagyobb, mint a λ transzdukciós fágvektoroké, amelyek az E. coli-ban vannak jelen. Ez növeli a kifejeződési szintet.

6. Riboszómakötő-hely és beindító (iniciációs) kodon

Ez a kifejeződő vektor tartalmaz egy erős prokarióta-riboszomális kötőhelyet (RBS), valamint egy transzlációs iniciációs kodont (ATG). így bármilyen eukarióta gént lehet klónozni az iniciációs kodon nélkül. Ezen túl a hatásos RBS növeli a kifejeződés szintjét. A riboszómakötő-hely a ÁC_H riboszomális kötőhely. A riboszomális kötőhely szekvenciája a következő:

TAAGGAAGTACTTACAT

ATTCCTTCATGAATGTA

Egy bázispár különbözik a vad típusú λ-ban található riboszomális kötőhelytől.

7. Kényelmes restrikciós hely

A kifejeződő vektor egy egyedi Ndel restrikciós hellyel rendelkezik, amely tartalmazza a helyen belül az ATG iniciációs kodont. Ez lehetővé teszi a kívánt gén megfelelő elhelyezkedését. Az egyedi Aűfel-helyet közvetlenül a riboszomális kötőhely után találjuk.

8. Kényelmes restrikciós hely a génbeiktatáshoz

116 bázispáron belül az Ndel restrikciós helytől „lefelé” 4 másik egyedi restrikciós hely is van a következő sorrendben: Bg/II, Smal, HindlII és Clal. Az egyedi helyek sokfélesége lehetővé teszi a kívánt gének könnyű beiktatását.

9. Nut-hely

Az N-fehérje, amelyet a gazdaszervezet szolgáltat, kötődik a nut-helyhez a kifejeződő vektoron, és ezáltal meggátolja az átírás befejezését a ^lRI -helynél vagy az érettség előtti átírási befejeződést a klónozott génen belül.

Törzsek

A megfelelő gazdaszervezetek a leírt vektorokhoz az E. coli transzformációra alkalmas törzsei, ilyenek például az A1637, A2602, A1563, A1645 [c600 rm⁺ gal⁺thrteu-lac-bl-(XcI857AHlABamHI N⁺) és A2097 (A1645 1αοΔχΑ21 proC::TnlO)].

2. példa

Állati növekedési hormonok I. pRO12

A pRO12 megalkotását a 2. ábrában mutatjuk be, és leírtuk az „Ábrák ismertetése” című részben.

HU 214 977 Β

A pAL5 OO-ból származó bGH cDNS-t, amelynek megalkotása az 1. ábrában mutatjuk be, manipuláljuk a pRO211-be való beiktatás előtt, hogy a korrekt leolvasókeretet és egy Ndél restrikciós helyet nyújtsunk.

A pRO12-t Escherichia coli A1645 törzsbe vezetjük transzformációval, olyan módszerekkel, amelyek ismerősek azok számára, akik a szakterületen átlagosan járatosak. Ez a törzs növesztésre és indukcióra a szarvasmarhanövekedési-hormon (bGH) egy analógját termeli, amely a természetes bGH fenilalanin formájnak N-terminálisához hozzátéve met-asp—gin aminosavszekvenciával rendelkezik. A pRO12 által termelt bGH-analóg mennyisége mintegy 30-36%-a a baktérium által termelt összes fehéije mennyiségének, amint ezt Coomassie-kékkel festett SDS (nátrium-dodecilszulfát) poliakril-amid-gél átvizsgálása alapján kalkuláljuk (I. táblázat).

II. pSAL 5200-6

A pSAL 5200-6 megalkotását a 3. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák ismertetése” című részben. A met-phe bGH-t kódoló DNS-szekvenciát úgy nyerjük, hogy a pRO12-t elhasítjuk PvwII-vel és Ndelel, és beiktatunk egy szintetikus DNS-fragmenst, amely fragmenst két egyszáíú, 10 bázispáros, átfedő szegmensekkel rendelkező szintetikus oligonukleotidokból nyerjük.

A pSAL 5200-6-ot Escherichia coli A1645 törzsbe vezetjük be transzformációval, ismert módszereket alkalmazva. Ez a törzs növesztésre és indukcióra olyan bGH-analógot termel, amely egy metioninnal rendelkezik a phe-bGH amino-terminálisához hozzáadva. A pSAL 5200-6 által termelt met-phe bGH-analóg mennyisége mintegy 18-20%-a a baktérium által termelt összes fehérjének, amint ezt Coomassie-vei festett SDS poliakrilamid gél átvizsgálása alapján kalkuláljuk. A törzs növesztésére, a termelt bGH kinyerésére és a bGH tisztítására alkalmazott módszerek azonosak azzal, amelyeket majd az 5. példában leírunk a pRO12ben történő bGH-termeléshez.

III. p3008

A p3008 megalkotását a 4. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák ismertetése” című részben. A p3008-at letétbe helyeztük az American Type Culture Collectionnál, ATCC 39804 számon. A met-phe pGH-t (sertés-növekedésihormon) kódoló DNS-szekvenciát pGH cDNS beiktatásával nyerjük pRO211-ből.

A p3008-at bevezetjük Escherichia coli A1645 törzsbe transzformációval, olyan módszereket használva, amelyek ismerősek azok számára, akik a szakterületen átlagosan járatosak. Ez a törzs növesztésre és indukcióra olyan pGH-t termel, amely egy metioninnal rendelkezik a pGH amino-terminálishoz hozzátéve. A p3008 által termelt met-phe pGH-analóg mennyisége körülbelül 18-20%-a a baktérium által termelt teljes fehérjének, amint ezt a Coomassie-val festett SDS poliakrilamid gélek átvizsgálása alapján kalkuláljuk.

IV. p5002

A p5002 megalkotását az 5. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák ismertetése” című részben.

A met-phe cGH-1 (csirke növekedési hormon) kódoló szekvenciát a cGH cDNS-t pRO211-be beiktatva és a gének 5’-végét szintetikus oligonukleotid-linkerekkel kiegészítve nyeljük.

A p5002-t Escherichia coli A1645 törzsbe vezetjük be transzformációval, ismert módszereket használva. Ez a törzs növesztésre és indukcióra olyan cGH-t termel, amely egy metioninnal rendelkezik a phe—cGH amino-terminálisához hozzátéve. A p5002 által termelt met-phe cGH-analóg mennyisége mintegy 18-20%-a a baktérium által termelt összes fehérje mennyiségének, mint ezt a Coomassie-val festett SDS poliakrilamid-gélek átvizsgálása alapján kalkuláljuk. A törzs növesztésére, a termelt cGH kinyerésére, és a cGH tisztítására alkalmazott módszerek azonosak azokkal, amelyeket majd az 5. példában írunk le bGH termelésére pRO 12-ből.

3. példa

Humán Cu-Zn szuperoxid-diszmutáz (SÓD)

A kiindulási pont a Cu-Zn SÓD cDNS módosításaihoz a Lieman-Hurwitz, J. és munkatársai által leírt pS61-10-plazmid [PNAS, 79, 2808 (1982)]. Az SÓD cDNS-t leíqa a 489,786 sorozatszámú, függőben lévő, 1982. április 29-én benyújtott amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás is. Az SÓD cDNS-t úgy módosítjuk, hogy bevezetünk egy Ndél restrikciós helyet a gén 5’-végére és egy HindllI restrikciós helyet a gén 3’-végére. Az így létrejött plazmid, a pSOD NH-10 tartalmazza az SÓD cDNS-t az egyedi restrikciós helyek által kötve.

I. táblázat¹

Plazmid	Gazda- szerve- zet	% bGH2	Megjegyzések
pRec 2/3	A1637	23	AmpR
pROll	A1637	28	AmpR
PRO 12	A1645	30-36	AmpR
pHG44	A2097	37-42	AmpR, T,T2
pHG50	A1645	37-42	AmpR, T,T2, cl434
pSAL-130/5	A1645	39—44	AmpR, CHCN, T,T2
pSAL-170/10	A1645	40-46	TetR, CHCN, T,T2

¹ A táblázat a pRO211-ből származó különböző plazmidok bGH kifejeződési szintjeit foglalja össze. A pRec 213- és pROl 1plazmidokat a még függőben lévő, együtt bejelentett 514,188 bejelentési számú, 1983. július 15-én benyújtott amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés írja le.

² A termelt bGH mennyisége az összes bakteriális fehérje százalékában.

Rövidítések:

CHCN = konstitutíven nagy kópiaszám

Amp^R = ampicillin-rezisztencia

Tet^R = tetracikl in-rezisztencia

Τ]Ϊ2 = átírási befejeződési szekvenciák _cj434 = íj stabilizációs rendszer

HU 214 977 Β

I. pS0Da2

A pS0Da2 megalkotását a 13. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák ismertetése” című részben. ApSODa2-t letétbe helyeztük az American Type Culture Collectionnál ATCC 39786 letéti számon. Hogy a pSODa2-t megalkossuk, a XP_L-promotort, a Nut_L-t és a C_n riboszomális kötőhelyet kimetsszük a pJH200 kifejeződő vektorból, és a pSOD NH-10plazmid SOD-génje elé helyezzük. Ezután a mind a promotort, mind az RBS-t, mind az SOD-gént tartalmazó fragmenst beiktatjuk a pBRM-vektorba [Hartman, J. R. és munkatársai: PNAS, 79, 233-237. (1982)]. A pBRM letétbe van helyezve az American Type Culture Collectionnál, ATCC 37283 letéti számon. A pSODa2-t Escherichia coli A2097 törzsbe vezetjük be transzformálássá, ismert módszereket alkalmazva. A nyert kiónok növesztésre és indukcióra egy SODanalógfehérjét termelnek. PSODa2 által termelt SODanalóg mennyisége mintegy 0,1—0,3%-a a baktérium által termelt összes fehérjének, amint ezt Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid gél átvizsgálása alapján kalkuláljuk (II. táblázat). A termelt SOD-analóg valószínűleg azonos azzal, amelyet a következő bekezdésben leírt pSODPj termel.

II. pSODpj

A ρβΟϋβ, megalkotását a 14. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák ismertetése” című részben. A ρ8Οϋβ! megalkotásához a pSODa2 C_n RBS-ét βlaktamázpromotorral és a pBLA 11-ből származó RBS-sel helyettesítjük. A pBLAl 1 letétbe van helyezve az American Type Culture Collectionnál ATCC 39788 letéti számon. A pBLAll tartalmazza a pBR322-ben található β-laktamázgén riboszomális kötőhelyét és promotorját a 4157 és 4353 koordinátumok között. Egy EcoRI-linkert adunk hozzá a promotortól lefelé, és egy multi-restrikciós linkért adunk hozzá közvetlenül az ATG iniciációs kodon után. így a kódoló szál szekvenciája az iniciációs kodonnal kezdve ATGAGCTCTAGAATTC.

Αρ8Οϋβι-εί Escherichia coli A1645 törzsbejuttatjuk be transzformációval, ismert módszereket alkalmazva. A nyert kiónok növesztésre és indukcióra egy SODanalógot termelnek. A termelt Cu-Zn SOD-analóg a természetes humán Cu-Zn SOD-től abban különbözik, hogy az amino-terminális alanin nincs acetilezve, amint ezt az aminosavszekvencia-elemzés sztöchiometriájával demonstráljuk, míg a természetes humán SÓD acetilezve van az alanin amino-terminálisnál [Hartz, J. W. és Deutsch, H. F.: J. Bioi. Chem., 234, 7043-7050. (1972); Jabusch, J. R. és munkatársai: Biochemistry, 19, 2310-2316. (1980); Bárrá és munkatársai: FEBS Letters, 120, 53 (1980); és Oberley, L. W.: Superoxide Dismutase, I. kötet, 32-33., kiadó: CRC Press, Florida (1982)]. Ezenkívül a természetes humán SÓD glikozilezve is van (Huber, W.: 3,579,495 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, nyilvánosságra került 1971. május 18-án), míg a baktériumok által termelt humán SÓD csaknem biztosan nincs glikozilezve, mivel az Escherichia coli nem glikozilezi azokat a fehérjéket, amelyeket termel. A baktériumok által termelt SOD-analóg aminosav-szekvenciája azonos az érett humán SÓD aminosav-szekvenciájával, és nem tartalmaz metioningyököt N-terminálisánál.

A ρΞΟϋβ, által produkált SOD-mennyisége mintegy 3-8%-a a baktériumok által termelt összes fehérének, amint ezt Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid gél átvizsgálása alapján kalkuláljuk (II. táblázat). A törzs növesztésére, a termelt SÓD kinyerésére és az SÓD tisztítására alkalmazott módszerek azonosak azokkal, amelyeket majd a 7. példában íruk le a ρ80ϋβ₁Τ₁ι-ηέ1.

IILpSODfrTjj

A ρ80ϋβ₁Τ]₁ megalkotását a 15. ábrában mutatjuk be, és le is újuk az „Ábrák ismertetése” című részben. A ρ80Οβ] β-laktamázgént helyettesítjük apBR322-ből származó, tetraciklin-rezisztenciát kódoló génnel.

A ρ80ϋβ₁Τ₁₁ által termelt SOD-analóg mennyisége mintegy 8-13%-a a baktériumok által termelt összes fehérjének, amint ezt Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid gél átvizsgálása alapján kalkuláljuk (II. táblázat). A termelt SOD-analóg azonos a ρ8ΟΏβ, által termelt SOD-analóggal.

IV. ρ80ϋβ₁-ΒΑ2

A ρ80ϋβ|-ΒΑ2 megalkotását a 17. ábrában mutatjuk be, és le is újuk az „Ábrák ismertetése” című részben. A pSODal3 C_n riboszomális kötőhelyet egy következő szintetikus DNS-fragmenssel helyettesítjük:

AATTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAG

GTTATTATAACTTTTTCCTTCTCAT, amely hasonló a természetes β-laktamáz RBS-szekvenciájához. A ρ80ϋβ]-ΒΑ2-ί Escherichia coli A1645 törzsbe vezetjük be transzformációval, olyan módszereket alkalmazva, amelyek ismertek azok számára, akik a szakterületen átlagosan jártasak. A nyert kiónok növesztésére és indukcióra a humán SÓD egy analógját termelik. A ρ8ΟΟβι-ΒΑ2-νε1 termelt SODmennyisége a baktérium által termelt összes fehéije mintegy 2—4%-a, amint ezt a Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid gél átvizsgálása alapján kalkuláljuk (II. táblázat). A termelt SOD-analóg azonos azzal, amelyet a ρ8ΟΟβ] termel.

4. példa

Humán Apolipoprotein E (ApoE3)

Az ApoE3 cDNS-módosításaihoz kiindulási pont a pNB178-plazmid, amelyet dr. John Taylor bocsátott rendelkezésünkre (Gladstone Foundation, San Francisco, Kalifornia). Ez a plazmid a humán ApoE3-gén teljes hosszúságú cDNS-kópiáját tartalmazza. A pNB 178-ban lévő cDNS-t úgy módosítjuk, hogy eltávolítjuk a nem kódoló DNS-t a gén 5’-végénél, és Ndel restrikciós helyeket adunk hozzá a gén mindkét végénél. Ezt az ApoE3 cDNS-fragmenst beiktatjuk a pNDS-vektorba [ez utóbbi a függőben lévő, együtt bejelentett 514,188 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben van leírva (bejelentve: 1983. július 15.)]. Az így létrejött plazmidot, a pApoE-EX2-t, amelyet a 18. ábrán mutatunk be, letétbe helyeztük az American Type Culture Collectionnál, ATCC 39787 letéti számon.

HU 214 977 Β

II. táblázat

Plazmid	RBS	Gazda- szervezet	% SODJ	Megjegy- zések
pSOD«2	CII	A2097	0,1-0,3	AmpR
pSODPi	BLA1	A1645	3-8	AmpR
pSODpiT,,	BLA1	A1645	8-13	TetR
pSODp,TT-l	BLA1	A1645	10-15	TetR, T,T2
pSOD,-BA2	BLA2	A1645	2-4	AmpR

¹ β-laktamáz gén promotorja és riboszomális kötőhelye.

² Szintetikus riboszomális kötőhely, amely a β-laktamáz gén riboszomális kötőhelyének felel meg.

³ A termelt SOD-analóg mennyisége a teljes bakteriális fehérje százalékában kifejezve.

Rövidítések:

Amp^R= ampicillin-rezisztencia

Tet^R= tetraciklin-rezisztencia

T]T₂= átirásbefejezési szekvenciák

I. pTV-188

A pTV-188 megalkotását a 18. ábrán mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák ismertetése” című részben. A pTV-188-plazmidot úgy nyerjük, hogy a betöltött, Ndel-Ndel ApoE3-fragmenst beiktatjuk a pSODp^n 5/zd egyedi, tompa végű helyébe (lásd a 14. ábrát, és az „Ábrák ismertetése”-t).

A pTV-188-at beiktatjuk Escherichia coli A1645 törzsbe transzformációval olyan módszerekkel, amelyek ismertek azok számára, akik a szakterületen átlagosan járatosak. A nyert kiónok a növesztésre és indukcióra olyan humán ApoE3-analógot termelnek, amely a humán szuperoxid-diszmutáz N-terminálisának 42 aminosavával rendelkezik az autentikus humán ApoE3 N-terminálisához hozzákötve, ezt metionin követi az analóg N-terminálisánál. A termelt ApoE3-analóg mintegy 10%-a a baktériumok által termelt összes fehérjének, amint ezt Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid gél átvizsgálása alapján kalkuláljuk. A törzsek növesztésére alkalmazott módszer azonos azzal, amelyet az 5. példában leírunk a bGH termeléséhez pRO 12-ből, kivéve azt, hogy 12,5 mg/liter tetraciklint alkalmazunk ampicillin helyett.

II. pSAL 160-5

A pSAL 160-5 megalkotását a 23. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák ismertetése” című részben. A pSAL 160-5-plazmidot a pTV-170-ből nyert Aval-Aval ApoE3-génfragmens beiktatásával nyerjük (lásd 20. ábra).

A pSAL 160-5-öt Escherichia coli-törzsbe vezetjük be transzformálássá, olyan módszerekkel, amelyek ismertek azok számára, akik a szakterületen átlagosan járatosak. A nyert kiónok növesztésre és indukcióra olyan ApoE3-analógot termelnek, amely metionint tartalmaz amino-terminálisánál, majd 45 aminosavat a humán növekedési hormon N-terminálisából, majd 45 aminosavat a humán növekedési hormon N-terminálisából, fuzionálva ApoE3-hoz, amelyből a 11 N-terminális aminosav ki van iktatva. A pSAL 160-5 által termelt ApoE3-analóg mennyisége a baktériumok által termelt összes fehérje mintegy 5%-a, amint ezt a Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid gél átvizsgálása alapján kalkuláljuk. A törzsek növesztésére alkalmazott módszer azonos azzal, amelyet az 5. példában leírunk a bGH termeléséhez pRO 12-ből.

5. példa

A pRO12 növesztése

I. Törzstenyészetek

A pRO12 törzstenyészetet kazeines tápközegen növesztjük (lásd az ,,Inokulum”-nál), majd kétszeresére hígítjuk fagyasztó tápközeggel és -80 °C hőmérsékleten. A fagyasztó tápközeg 500 ml-e a következőket tartalmazza:

K2HPO4	6,3 g
kh2po4	1,8 g
Na-citrát	0,45 g
MgSO4-7H2O	0,09 g
(NH4)2SO4	0,9 g
Glicerin	44,0 g
Inokulum
Az inokulumot olyan tápközegben szaporítjuk, amely

g/liter kazein-hidrolizátumot, 10 g/liter élesztőkivonatot és 2 g/liter NaCl-t tartalmaz. Egy rázólombikban lévő steril tápközeget inokulálunk a törzstenyészetből és inkubáljunk 15 órán át rázógépen, 30 °C hőmérsékleten, mintegy 200 fordulat/perccel. Amikor szükséges a későbbi stádumoknál, az inokulum szaporítását kevert, levegőztetett fermentorokban hajtjuk végre. A steril tápközeget 2-10% inokulummal inokuláljuk, és 15 órán át inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten, pH 7±0,5-nél, kevertetéssel és levegőztetéssel olyan mértékig, hogy az oldott oxigén szintje 20%-os levegőtelítettség fölött legyen.

III. Termelés

A termelő tápközeg a következőket tartalmazza:

Kazein-hidrolizátum 20 g/1

Élesztőkivonat 10 g/1

K₂HPO₄ 2,5 g/1

MgSO₄-7H₂O 1 g/1

NaCl 5 g/1

Biotin 0,1 g/1

Tiamin 1 mg/1

Nyomelemoldat 3 ml/1

A tápközeg tartalmaz 100 mg/liter ampicillint is. Az ampicillin feltételesen alkalmazandó a termeléshez, de mindig megtalálható az inokulum növesztéséhez használt tápközegben.

A biotint, tiamint és az ampicillint koncentrált oldatban külön-külön szűréssel sterilezzük, és a steril termelő tápközeghez adjuk az inokulálás előtt. Annyi steril glükózoldatot adunk hozzá kezdetben, hogy a koncentráció 10 g/liter legyen. Az indukciós lépés alkalmával további 10 g/1 glükózt adunk hozzá.

A nyomelemoldat a következőket tartalmazza:

FeCl₃ 16 g/1

ZnCl₂-4H₂O 2 g/1

CoC1₂-6H₂O 2 g/1

HU 214 977 Β

Na2MoO4-2H2O	2 g/1
CaCl2-2H2O	1 g/1
CuCl2	1 g/1
H3BO3	0,5 g/1
Konc. HCI	100 ml/1
A tápközeget 0,5-10%	inokulumtenyészettel ino-

kuláljuk, és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A keverési-levegőztetési sebességeket úgy állítjuk be, hogy az oldott oxigén szintje mindig 20% levegőtelítettség fölött legyen. A pH-t 7,0±0,2 értéken tartjuk NH₃-al. Amikor a sejtkoncentráció eléri a mintegy 3,5 g/litert (OD₆₆₀=10), elkezdjük az indukciót.

A hőmérsékletet 42 °C-ra emeljük, és 1-5 órán át 42 °C hőmérsékleten tartjuk. A tenyészetet ezután lehűtjük, és a sejteket centrifugálással kinyerjük a hormon tisztításához.

A bGH kinyerése kg baktériumsejtet (nedves szűrőpogácsa) újra szuszpendálunk 5 térfogat oldatban, amely 50 mmol/liter nátrium-foszfát-puffert (pH 7,4), 50 mmol/liter EDTA-t és 100 mmol/liter NaCl-t tartalmaz, a szuszpendáláshoz „Polytron (Kinematica) blender”-keverőt alkalmazva, menet közben szabályozva a keverő sebességét, hogy a habzás minimális legyen. A homogén szuszpenziót folyamatosan átvisszük egy Dynomillsejtzúzón (KDS típus, Willy A. Bachofen, Basel) 80 liter/óra sebességgel, és a szétzúzott sejtek homogén szuszpenzióját centrifugálással tisztítjuk CEPA

100 centrifugában 45 liter/óra átfolyási sebességgel. A centrifugálási lépésből a csapadékot kinyeijük, és újra szuszpendáljuk 15,8 liter 50 mmol/literes nátriumfoszfát-pufferban (pH 7,4), amely 50 mmol/liter EDTA-t is tartalmaz. Lizozimot adunk hozzá 0,05 mg/ml végső koncentrációig, és a szuszpenziót 16 órán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten. Triton Χ-100-at adunk hozzá 1% végső koncentrációig. A szuszpenziót azután 30 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten, ultrahanggal kezeljük folyamatos áramú sejtultrahang-kezelőben (szonikátorban) (Heat System) 18 liter/óra sebességgel, és centrifugáljuk CEPA

101 centrifugában. A csapadékot összegyűjtjük, újra szuszpendáljuk 50 mmol/literes nátrium-foszfotpufferral (pH 7,4), ultrahanggal kezeljük a fentiek szerint, és centrifugáljuk CEPA 101 centrifugában. A sejteket újra szuszpendáljuk 15,5 liter 50 mmol/literes nátrium-foszfát-pufferban (pH 7,4), amely 50 mmol/liter EDTA-t és 100 mmol/liter NaCl-t is tartalmaz, és kétszer kicsapjuk és újra centrifugáljuk 15,5 liter desztillált vízzel. A csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, és -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

A bGH tisztítása

A csapadékot 30—40 liter desztillált vízben újra szuszpendáljuk és szolubilizáljuk 0,5 n NaOH-val pH 11,8-ra titrálva. Az oldatot azután folyamatos ultrahangkezelésnek vetjük alá, majd centrifugálással tisztítjuk CEPAcentrifugában, ha szükséges, vagy Whatman 1 papíron át szüljük.

A tisztított fehérjeoldatot (32,6 liter, 297 000 OD-t tartalmaz 280 nm-nél) külön részletekre osztjuk (6x5,4 liter), mindegyik részlet 50 000 OD értéket tartalmaz. Mindegyik részletet külön-külön ultraszűrésnek vetjük alá Millipore Pellicon ultraszűrőn át, amely három, 100 000 molekulasúly-kizárásos kazettával (PTHK típus) van ellátva, mindegyik kazetta 5 négyzetláb, vegyes 0,456 m² területű. Egy 5,4 literes adagot 1 liter visszamaradó térfogatra koncentrálunk. Az ultraszűrletet összegyűjtjük és félretesszük. A visszamaradó anyagot eredeti térfogatára hígítjuk vissza friss, 10 mmol/literes borát-pufferral (pH 11,8), és összekeverjük. Ezt az adagot újra ultraszűrésnek vetjük alá 1 liter visszamaradó térfogatig. Az ultraszűrletet összegyűjtjük, és egyesítjük az első ultraszűrlettel. Amikor az OD-értékek meglévő értéke az ultraszűrletekben az ultraszűrőre eredetileg táplált OD-értékek 20%-ával lesz egyenlő, a visszamaradó térfogatot a következő koncentrációs lépésnél 0,5 liternek vesszük 1 liter helyett. A koncentrálás és hígítás ciklusát 10 mmol/literes borát-pufferral addig folytatjuk, amíg a 0,5 literes visszamaradékból származó ultraszűrlet 280 nm-nél mért értéke (1 cm-es cellában) kevesebb mint 0,1 lesz. Ez normálisan a 9—12-ig koncentráláshígítás ciklusban következik be. Az utolsó visszamaradt anyagot kidobjuk.

Az összes ultraszűrletet egyesítjük, és pH 9,0-ra állítjuk be 6 n HCl-al. A többi 5,4 literes adagokat ugyanolyan módon vetjük alá ultraszűrésnek, és az összes, pH-ra beállított ultraszűrletet egyesítjük. Egy tipikus műveleti lefutás 380 liter ultraszűrletet termel 0,26-os abszorbanciával, amely 100000 OD-val egyenértékű, ez a teljes műveletsor 24-40 órát igényel.

A kombinált ultraszűrleteket (380 liter, amely 100 000 OD értéket tartalmaz, 280 nm-nél mérve) a 100K ultraszűrési lépésből Sepharose CL-6B DEAE ioncserélő oszlopra terheljük, 23 cm/óra (25 liter/óra) lineáris áramlási sebességgel. A 37 cm átmérőjű, 15 cm magas oszlopot két agytérfogat (32 liter/10 mmol) literes borát-pufferral mossuk pH 9,0nél. A ráterhelési és mosási lépés eluátumát eldobjuk. Egy eluálószer-váltási lépés 10 mmol/liter borátot és 100 mmol/liter nátrium-kloridot tartalmazó oldatra (pH 9) a bGH-t leszorítja az oszlopról. Az eluálási áramlási sebesség 23 cm/óra. A lefutás előrehaladtát az eluátum abszorbanciáját 280 nm-nél követve ellenőrizhetjük. A bGH-csúcsot összegyűjtjük 4-5 ágytérfogatban (84 liter, amely 280 nm-nél mérve 43 000 OD-egységet tartalmaz), majd mintegy 10 mg/ml-re koncentráljuk, Millipore Pellicon ultraszűrő berendezést alkalmazva 10 000 molekulasúlykizárásos kazettával. Az oldatot ezután liofílezzük. A kitermelés mintegy 70 g tiszta bGH.

6. példa

A pRO12 által termelt bGH-analóg aktivitása

1. A bGH-analóg radioimmunassay-val végzett összehasonlítása a természetes bGH-val

100 ng/ml bGH-analógot tartalmazó oldatot készítünk foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldatban (1% BSA). Ebből az oldatból sorozathígítást készítünk 50, 25, 12,5, 6,25, 3,12, 1,56 és 0,78 ng/1 koncentrációkra. Ezekből az oldatokból 0,1 ml-es alikvotokat, két

HU 214 977 Β párhuzamossal RIA-mérésnek vetünk alá, kettősantitest-eljárást alkalmazva. A hígítási görbét összehasonlítjuk a természetes bGH-val nyert hasonló görbével.

2. Radioreceptor-kötő mérés

Radioreceptor-kötö mérést hajtunk végre nyúlmájmembránokkal, amint ezt Tushima, T. és Freisen, H. G. leírták [J. Clin. Endocr. Metab., 37, 3 (1973)], ¹²⁵I-bGH-t használva jelzőanyagként és autentikus bGH-oldatot kalibrációs görbe megalkotásához. A mintákat három párhuzamosban inkubáljuk két órán át szobahőmérsékleten 0,3 ml vizsgáló pufferban (50 mmol/liter trisz, 15 mmol/liter CaCl₂ és 5 mg/ml bovin szérumalbumin, pH 7,6). A csövek ¹²⁵I-bGH-t (30-60 pci/pgos készítmény 20 000 cpm-je), 150-250 pg máj membrán-fehérjét és/vagy természetes bGH-t (1-100 ng), vagy bakteriális bGH-extraktumot tartalmaznak. Az eredmények azt demonstrálják, hogy a bGH-analóg bGH-aktivitása jól összehasonlítható a természetes bGH aktivitásával.

3. Tibia-vizsgálat

Az 5. példa szerinti, pRO12 által termelt bakteriális sejtből kinyert bGH-analóg bioaktivitását tibia- (sípcsont) vizsgálattal értékeljük ki [Parlow, A. F. és munkatársai: Endocrinology, 77, 1126 (1965)]. Patkányok hipofízisét 28—30 napos korukban eltávolítjuk, majd 10-14 napig kezelés nélkül tartjuk ezeket. Szarvasmarha hipofízisből származó vagy rekombináns Escherichia coli-ból származó szarvasmarhanövekedési-hormont feloldunk 0,15 mol/liter NaCl-t és 0,01 mol/liter borát-puffert (pH 10,0) tartalmazó oldatban. 4-7 patkányt tartalmazó csoportok naponta szubkután bGH-oldatot tartalmazó injekciókat (5-125 pg/nap, 0,2 ml koncentrációban) kapnak 5 napon át, miközben normális étrenden tartjuk ezeket (Purina Rat-Chow tápszer és víz, korlátlanul). Az állatokat a 6. napon leöljük, az első láb-térdcsontjaikat kivesszük, hosszában elvágjuk, acetonnal rögzítjük, és 2% AgNO₃-al festjük. Az epifízeális lemezek szélességét televízióhoz kapcsolt binokuláron (Nikon) keresztül végzett megfigyeléssel mérjük. Átlagértékeket (40 leolvasás patkányonként) alkalmazunk egy hosszú dózisválaszgörbe megalkotásához. Az eredmények azt demonstrálják, hogy a pRO12 által termelt bGH-analóg aktivitása jól összehasonlítható a természetes bGH aktivitásával.

7. példa

50£>β₁7’₁₁ növesztése 1. Törzstenyészetek

ΡδΟϋβ^υ törzstenyészeteit kazeintartalmú tápközegen (lásd „Inokulum”) tenyésztjük, majd kétszeresére hígítjuk fagyasztó tápközeggel és -80 °C hőmérsékleten tároljuk. A fagyasztó tápközeg 500 ml-e a következőket tartalmazza:

K2HPO4	6,3 g
kh2po4	1,8 g
Na-citrát	0,45 g
MgSO4-7H2O	0,09 g
(NH4)2SO4	0,9 g
Glicerin	44,0 g

II. Inokulum

Az inokulumot 20 g/1 kazein-hidrolizátumot, 10 g/1 élesztőkivonatot és 2 g/1 NaCl-t tartalmazó oldatban szaporítjuk. Steril tápközeget inokulálunk a törzstenyészetből rázólombikban és 15 órán át inkubáljuk rázógépen 30 °C hőmérsékleten, mintegy 200 fordulat/percnél. Amikor a következő lépésekben szükséges, az inokulum szaporítását kevert, levegőztetett fermentorokban végezzük. A steril tápközeget 2-10% inokulummal inokuláljuk, és 15 órán át inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten, pH 7±0,5-nél olyan mértékű kevertetéssel és levegőztetéssel, hogy az oldott oxigén szintjét 20% levegőtelítettség fölött tartsuk.

III. Termelés

A termelő tápközeg a következőket tartalmazza:

Kazein-hidrolizátum 20 g/1

Élesztőkivonat 10 g/1

K₂HPO₄ 2,5 g

MgSO₄-7H₂O 1 g/1

NaCl 5 g/1

Biotin 0,1 mg/1

Tiamin 1 mg/1

Nyomelemoldat 3 ml/1

CuSO₄ 0,8 g/1

ZnSO₄ 10 mg/1

Az oldat tartalmaz még 12,5 mg/liter tetraciklint is. A tetraciklin a termeléshez tetszőleges, de az inokulum növesztéséhez alkalmazott tápközegben mindig megtalálható.

A biotint, tiamint és tetraciklint külön-külön, koncentrált oldatban szűréssel sterilezzük, és a steril termelő tápközeghez az inokulálás előtt adjuk be. Steril glükózoldatot is adunk a termelő tápközeghez olyan mennyiségben, hogy a kiindulási koncentráció 10 g/liter legyen. Az indukciós lépéshez további 10 g/liter glükózt adunk a közeghez.

A nyomelemoldat a következőket tartalmazza:
FeCl3	16 g/1
ZnCl2-4H2O	2 g/1
CoC12-6H2O	2 g/1
Na2MoO4-2H2O	2 g/1
CaCl2-2H2O	1 g/1
CuCl2	1 g/1
H3BO3	0,5 g/1
Konc. HCI	100 ml/1
tápközeget 0,5-10%	inokulum-tenyészettel

inokuláljuk, és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A kevertetési-levegőztetési sebességet úgy állítjuk be, hogy az oldott oxigén szintje 20% levegőtelítettség fölött legyen. A pH-t 7,0±0,2 értéken tartjuk NH₃-al. Amikor a sejtkoncentráció eléri a mintegy 3,5 g/1 (OD₆₆₀=10) értéket, az indukciót elindítjuk.

A hőmérsékletet 42 °C-ra emeljük, és 1-5 órán át 42 °C-on tartjuk. A tenyészetet ezután lehűtjük, és a sejteket centrifúgálással kinyeqük az enzim tisztításához.

Az SÓD kinyerése

1,5 kg baktériumsejtet (nedves szűrőpogácsa) szuszpendálunk 12 liter 50 mmol/literes nátrium-foszfát-oldatban (pH 7,8), Politron- (Kinematica) keverőben, miközben a sebességet úgy szabályozzuk, hogy a

HU 214 977 Β habzás minimális legyen. A homogén szuszpenziót folyamatosan átjuttatjuk Dynomill-sejtzúzón (KDS típus, Willy A. Bachofen, Basel). A szétzúzott sejtek homogén szuszpenzióját ultrahanggal kezeljük, folyamatos áramlású cellát alkalmazva, és CEPA 101 centrifugán centrifugáljuk. A felülúszót 2 órán át 65 °C hőmérsékleten hevítjük, majd hűtjük és centrifugáljuk az előzővel azonos módon. A tiszta felülúszót 1 literre koncentráljuk Miilipore Pellicon ultraszűrő készüléken, 10000 molekulasúly-kizárásos kazettát (PTGC típus) alkalmazva. A koncentrált fehérjeoldatot átengedjük DEAE-cellulózoszlopon (2 kg DEAE Sepharose), amely 150 mmol/literes nátrium-foszfát-puferral van kiegyensúlyozva (pH 7,8). Az átáramlott oldatot összegyűjtjük, koncentráljuk, és dializáljuk Pellicon ultraszűrő berendezésben 20 mmol/literes trisz-HCl-el (pH 7,8) szemben, majd QAE-Sepharose-oszlopra visszük rá, amely 20 mmol/literes trisz-HCl-pufferral van kiegyensúlyozva. Az oszlopot 20 mmol/literes trísz-HCLpufferral (pH 7,8) és sógradienssel (0-200 mmol/liter NaCl) fejlesztjük ki. Az SOD-tartalmú frakciókat összegyűjtjük, Pellicon ultraszűrő berendezést alkalmazva koncentráljuk, desztillált vízzel szemben dializáljuk, majd nátrium-acetátra 100 mmol/literessé tesszük 1 mol/literes nátrium-acetát-puffer (pH 4,8) hozzáadásával. A fehéijeoldatot azután tovább szeparáljuk 100 mmol/literes nátrium-acetát-oldattal (pH 4,3) kiegyensúlyozott CM-Sepharose-oszlopon. Az oszlopot ugyanezt a puffért és sógradienst (100-500 mmol/liter NaCl) alkalmazva fejlesztjük ki. Az SOD-t tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, Pellicon ultraszűrő berendezést alkalmazva koncentráljuk, majd liofilezzük.

8. példa

ApSODfififi által termelt SÓD aktivitása

A 7. példában készített pSODPjTn által termelt SOD-analóg enzimes aktivitását a ferricitokróm-c redukciója gátlását követve mérjük, amint ezt McCord és Fridovich leírták [J. Bioi. Chem., 244, 6049-6055. (1969)]. Az eredmények azt bizonyítják, hogy a pSODpjTn által termelt SOD-analóg aktivitása jól összevehető a természetes humán SÓD (Sigma gyártmány) aktivitásával, és a szarvasmarha-SOD (Orgotein, Grünenthal GMBH) aktivitásával.

9. példa

Kifejeződő vektorok

I. p579

A p579-vektort a 19. ábrában mutatjuk be, és részletesen le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben. Ez a vektor egy P_L-promotorból és N-hasznosító helyből (Nut_L), az egyedi EcoRI és Ndel restrikciós helyek által kötött C_n riboszomális kötőhelyből, egy ATG iniciációs kodonból és az Escherichia coli rmB riboszomális RNSgén operonjának végéről származó T_tT₂ átírásbefejezési szignálokból tevődik össze. Ezek az elemek az ampicillin-rezisztencia gént hordozó pBR332-n vannak klónozva. Az egyéb vonásokat a 19. ábra mutatja be.

A p579-et úgy készítjük, hogy a pPSl-plazmidon elhelyezkedő T]T₂ átírásbefejezési szignálokat beiktatjuk a pRO211-vektor HindlII helyére. A pRO211-et a

2. ábrán mutatjuk be. A pPSl-et Sarmientos és társai írták le [Cell, 32, 1337—1346. (1983)], és ez a plazmid letétbe van helyezve az American Type Culture Collectionnál ATCC 39807 letéti számon. Az eukarióta géneket tartalmazó p579-et és származékait a megfelelő Escherichia coli gazdaszervezetben lehet fenntartani. A gazdaszervezet legfontosabb jellemvonása, hogy a hőérzékeny cI857-represszort és az antiterminációs Nfehéqét szolgáltatja [Gottesman, M. és munkatársai: J. Mól. Biok, 140, 57-75. (1980)].

A p579-nek számos előnye van a korábban leírt kifejeződő vektorokkal szemben, ezek például a következők.

1. A kifejeződés rendkívül magas szintje

Ez a vektor képes az idegen fehérjék kifejeződésének irányítására E. coliban olyan magas szinten, hogy az elérheti a teljes sejtfehérje 42%-át. A kifejeződésnek ez a szintje magasabb, mint az, amelyet más hasonló λΡ, -plazmidoknál leírtak, amelyekben hiányoznak a T]T₂ átírásbefejezési szekvenciák.

2. Átírásbefejezési szignálok

A p579-vektor tartalmazza a T,T₂ átírásbefejezési szignálokat, amelyek a λΡ^ρΓοιηοΙοΗόΙ és a C_n riboszomális kötőhelytől „lefelé” vannak elhelyezve. A kifejeződés magas szintje, amelyet akkor nyerünk, amikor ezt a vektort alkalmazzuk, részben a T]T₂ átírásbefejezők jelenlétének tulajdonítható a beiktatott gén végénél, mivel a T,T₂ átírásbefejezők képesek az N módosított RNS-polimeráz átírásának befejezésére. így az átírásbefejezők megakadályozzák a nem kívánt plazmidfehérjék λΡ_Ε által szabályozott átírását, ezáltal növelik a kívánt fehérjék relatív kitermelését.

3. Helyettesíthető riboszomális kötőhelyek

A p579 egy egyedi EcoRI-helyet tartalmaz, amely a riboszomális kötőhelytől „felfelé” van elhelyezve, és egy egyedi A'Jel-helyet az ATG iniciációs kodonnál elhelyezve. így a riboszomális kötőhelyet két egyedi restrikciós hely köti. Ez lehetővé teszi a jelen riboszomális kötőhely (a kCn riboszomális kötőhely) könnyű kimetszését, és tulajdonképpen bármilyen más természetes vagy szintetikus riboszomális kötőhely behelyettesítését anélkül, hogy a plazmid egyéb jellemvonásai változnának. Ez nagymértékben megkönnyíti a kívánt polipeptidek optimális kifejeződését.

4. A kifejeződés hővel indukálható szabályozása

A kP_L-promotor inaktív, amikor a C_T-represszor hozzá van kötve. A cI857-represszor hőérzékeny, azaz 30 °C hőmérsékleten kötődik a promotorhoz, de 42 °C hőmérsékleten inaktiválódik. így a fermentáció hőmérsékletét 42 °C-ra emelve a gazdabaktérium indukálódik, hogy a kívánt fehérjét termelje. Az ilyen rendszer előnyei a következők:

a) egy idegen feltétjét, amely toxikus Escherichia colira, a fermentációs folyamat késői szakaszában lehet termelni, így elkerülve a korai sejtpusztulást;

b) egy fehérje túltermelése stabilizálhatja a fehérjét és megakadályozhatja a proteolitikus bomlást [Cheng, Y. E. és munkatársai: Gene, 14, 121 (1981)]. így a

HU 214 977 Β „hirtelen” túltermelés olyan szorosan szabályozott promotort, mint a λΡ_Ε, használva előnyös lehet a folyamatos alacsony szintű termeléshez viszonyítva.

5. Egyszerűsített indukciós munkamenet

A p579-ből származó plazmidokat mintegy 42 °C hőmérsékleten indukáljuk, és 42 °C-on tartjuk a fehérjeszintézis időtartama alatt. A pMGlOO és pND5-ből származó plazmidokhoz (amelyek a függőben lévő, együtt bejelentett 514,188 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben vannak leírva) tartozó indukciós munkamenet hőmérséklet-csúsztatást igényel 42 °C hőmérsékletre, amelyet a 38 °C hőmérsékleten végzett hosszú növesztési periódus követ. Az optimális indukciós munkamenet p579-hez nem igényli a hűtési lépést 38 °C hőmérsékletre, így a munkamenet egyszerűsödik.

6. Nagy kópiaszám

A XP_L-promotort a p579-ben nagyobb kópiaszámú plazmidon találjuk, mint a λ transzdukálófágok kópiaszáma, amelyeket Eseherichia coli-ban alkalmaznak. Ez növeli a kifejeződési szintet.

7. Riboszómakötő-hely és iniciációs kodon

Ez a kifejeződő vektor erős prokarióta riboszomális kötőhelyet (RBS), valamint egy transzlációs iniciációs kodont tartalmaz. így bármilyen eukarióta gént lehet klónozni anélkül, hogy valamilyen iniciációs kodont kelljen hozzáadni. Ezen túl a hatékony RBS növeli a kifejeződési szinteket. A riboszómakötő-hely a ZC_n riboszomális kötőhely, amelyet előzőleg klónozunk a pND 5-vektorba. A riboszomális kötőhely szekvenciája:

TAAGGAAGTACTTACAT

ATTCCTTCATGAATGTA

Egy bázispár különbözik a vad típusú λ-ban található riboszomális kötőhelytől.

8. Kényelmes restrikciós hely

A kifejeződő vektor egy egyedi AWeI restrikciós hellyel bír, amely magán belül tartalmazza az ATG iniciációs kodont. Ez lehetővé teszi a kívánt gén megfelelő elhelyezkedését. Az egyedi Wel-helyet közvetlenül a riboszomális kötőhely után találjuk.

9. Kényelmes restrikciós helyek a génbeiktatáshoz

Az Ndel restrikciós helytől lefelé 116 bázispáron belül elhelyezve vannak a BgBl és Smal egyedi restrikciós helyek, ebben a sorrendben. Ezek az egyedi restrikciós helyek lehetővé teszik a kívánt gének könnyű beiktatását.

10. Nut-hely

Az N-fehérje, amelyet a gazdaszervezet szolgáltat, a kifejeződő vektoron lévő Nut-helyhez kötődik, és ezáltal megakadályozza az átírásbefejeződést a ^lRI -helynél, vagy az érettség előtti átírásbefejeződést a klónozott génen belül.

Törzsek

A leírt vektorokhoz és plazmidokhoz való megfelelő gazdaszervezetek a transzformálásra alkalmas Eseherichia coli-törzsek, ilyenek például az A1637, A2602, A1563, A1645 [c600 ππ+gal+thrleirlac bl (Xcl857AHlABamHI N+)] és A2097/A1645 lacAxA21 proC::TnlO) törzsek.

10. példa

Állati növekedési hormonok

I. pHG44

A pHG44 megalkotását a 6. ábrán mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben, ezt a plazmidot ATCC 39806 letéti számon helyeztük letétbe. A plazmid a pRO12-plazmidból származik (amelyet a 2. ábrában mutatunk be) olyan módon, hogy a 6. ábrában bemutatott pPSl-plazmidból származó T,T₂ átírásbefejezési szekvenciákat beleiktatjuk. A pPSlplazmidot Sarmientos és munkatársai írták le [Cell, 32, 337-1346. (1983)], és ATCC 39807 számon ez a plazmid letétbe van helyezve. A TjT₂ befejezési szekvenciák jelenléte megakadályozza a hosszan futó mRNS-átírásokat, és így megakadályozza a βlaktamáz gén és valószínűleg más nem kívánt fehérjék magasabb szintű kifejeződését a ÁP_L-promotor szabályozása alatt.

A pHG44-plazmidot Eseherichia coli A2097 törzsbe vezetjük be transzformációval, olyan módszereket alkalmazva, amelyek ismerősek azok számára, akik a szakterületen átlagosan járatosak. A törzs növesztésre és indukcióra a szarvasmarhanövekedési-hormon egy analógját termeli, amely met-asp-gln aminosav-szekvenciával rendelkezik az autentikus bGH fenilalanin-formájának amino-terminálisához hozzátéve. A pHG44 által termelt bGH-analóg mennyisége a baktérium által termelt fehérje mennyiségének mintegy 37-42%-a, amint ezt Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid gélek vizsgálatával kalkuláljuk.

A törzs növesztésére, a termelt bGH-analóg kinyerésére és a bGH-analóg tisztítására alkalmazott módszer a 13. példában van leírva. A kifejeződés szintje magasabb, mint amelyet pRO 12-ből nyerünk (I. táblázat), ez a bGH-gén 3'-terminálisánál lévő T]T₂ befejezési szekvenciák bevezetése által befolyásolt β-laktamáz kifejeződésben előállott jelentős csökkenésnek tulajdonítható.

11. pSAL 5600-1

A pSAL 5600-1 megalkotását a 10. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben. A pSAL 5600-1-plazmid a pSAL 5200-6-ból származik (amelyet a 3. ábrában mutatunk be) olyan módon, hogy a pPSl-plazmidból (ATCC 39807) származó T,T₂ befej eződési szekvenciákat beleiktatjuk.

A pSAL 5600-1-plazmidot Eseherichia coli A1645 törzsbe vezetjük be transzformálással, olyan módszereket alkalmazva, amelyek ismertek azok számára, akik a szakterületen átlagosan járatosak. Ez a törzs növesztésre és indukcióra egy bGH-analógot termel, amely egy metionin-aminosawal rendelkezik a természetes bGH fenilalanin formájának amino-terminálisához hozzátéve. A pSAL 5600-1-tartalmú törzsek által termelt bGH-analóg mennyisége mintegy 22-28%-a a baktériumok által termelt összes fehérjének, amint ezt Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid gél vizsgálatával kalkuláljuk. A törzs növesztéséhez, a termelt bGHanalóg kinyeréséhez és a bGH-analóg tisztításához alkalmazott módszerek azonosak azzal, amelyet majd a 13. példában leírunk a pHG44-hez.

HU 214 977 Β

A kifejeződés szintje magasabb, mint amelyet a pSAL 5200-6-tartalmú törzseknél nyertünk, ez a bGHgén 3’-terminálisánál a T,T₂ befejezési szekvenciák bevezetése által befolyásolt jelentős β-laktamáz kifejeződéscsökkenésnek tulajdonítható.

III. p3009

A p3009 megalkotását all. ábrán mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben. A p3009-et úgy nyerjük, hogy a sertés-növekedésihormon Nde\-Nde\ cDNS-fragmensét beiktatjuk a p579 kifejeződő vektor (19. ábra) egyedi M/el-helyébe. A sertésnövekedésihormon (pGH)-fragmenst p3008-ból (ATCC 39804) izoláljuk Nde\ emésztéssel.

A p3009-plazmidot Escherichia coli A1645 törzsbe vezetjük be transzformálással olyan módszereket alkalmazva, amelyek ismeretesek azok számára, akik a szakterületen átlagosan jártasak. Ez a törzs növesztésre és indukcióra egy pGH-analógot termel, amely egy metionin-aminosavval rendelkezik a természetes pGH fenilalanin formájának amino-terminálisához hozzátéve. A termelt pGH-analóg mennyisége mintegy 30-35%-a a baktériumok által termelt összes fehéqének, amint ezt Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid gél vizsgálatával kalkuláljuk. A törzs növesztéséhez, a termelt pGHanalóg kinyeréséhez és a pGH-analóg tisztításához alkalmazott módszerek azonosak azzal, amelyet majd a 13. példában leírunk a pHG44-hez.

A p3009 kifejeződésének szintje magasabb, mint amelyet a p3008-tartalmú törzseknél nyertünk, ez a pGH-gén 3’-terminálisánál a T,T₂ befejezési szekvenciák bevezetése által befolyásolt jelentős β-laktamáz kifejeződéscsökkenésnek tulajdonítható.

IV. p5003

A p5003 megalkotását a 12. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben. A p5003-at letétbe helyeztük az American Type Culture Collectionnál 39792 letéti számon. A p5003-at úgy nyeljük, hogy a csirke növekedési hormon Nde\-Nde\ cDNS-fragmensét beiktatjuk a p579 kifejeződő vektor (19. ábra) egyedi Nde\-helyébe.

A p5003-plazmidot Escherichia coli A2097 törzsbe vezetjük be transzformálással olyan módszereket alkalmazva, amelyek ismeretesek azok számára, akik a szakterületen átlagosan jártasak. Ez a törzs növesztésre és indukcióra egy cGH-analógot termel, amely egy metionin-aminosavval rendelkezik a természetes cGH fenilalanin formájának amino-terminálisához hozzátéve. A termelt cGH-analóg mennyisége mintegy 30-35%-a a baktériumok által termelt összes fehérjének, amint ezt Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid gél vizsgálatával kalkuláljuk. A törzs növesztéséhez, a termelt cGH-analóg kinyeréséhez és a cGH-analóg tisztításához alkalmazott módszerek azonosak azzal, amelyet majd a 13. példában leírunk a pHG44-hez.

A p5003 kifejeződésének szintje magasabb, mint amelyet a p5002-tartalmú törzseknél nyertünk, ez a cGH-gén 3’-terminálisánál a T,T₂ befejezési szekvenciák bevezetése által befolyásolt jelentős β-laktamáz kifej eződéscsökkenésnek tulaj donítható.

11. példa

Humán Cu-Zn szuperoxid-diszmutáz (SÓD)

I. ρ8ΟΟβ,ΤΤ-1

Αρ8ΟΟβ]ΤΤ-1 megalkotását a 16. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben. A ρ80Οβ,ΤΤ-1-plazmidot úgy nyerjük, hogy a T,T₂ befejezési szekvenciákat beiktatjuk a pSOD3|TT-l-ben (15. ábra) található SOD-gén 3’végénél.

A ρ8Οϋβ₁ΤΤ-1-ρ1₃ζιηϊόοΐ beiktatjuk Escherichia coli A1645 törzsbe transzformálással olyan módszereket alkalmazva, amelyek ismeretesek azok számára, akik a szakterületen jártasak. Ez a törzs növesztésre egy SOD-analógot termel. A termelt SODanalóg mennyisége 10-15%-a a baktériumok által termelt összes fehérje mennyiségének, Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid gél vizsgálata alapján kalkulálva.

A törzs növesztéséhez, a termelt SOD-analóg kinyeréséhez és az SOD-analóg tisztításához alkalmazott módszerek a 15. példában írjuk le. A ρ8ΟΟβ!ΤΤ-1 kifejeződésének szintje magasabb, mint amelyet ρ8Οϋβ₁Τ₁₁-ηό1 nyertünk (II. táblázat), ez a T,T₂ által indukált csökkenés következménye a nem kívánt DNSszekvenciák átírásában és transzlációjában.

A termelt humán Cu-Zn SOD-analóg abban különbözik a természetes humán Cu-Zn SOD-tól, hogy az alanin amino-terminális nincs acetilezve, amint ezt az aminosavszekvencia-elemzés sztöchiometriája igazolja. A természetes humán SÓD az alanin amino-terminálisnál acetilezve van [Hartz, J, W. és Deutsch, H. F.: J. Bioi. Chem., 247, 7043-7050. (1972); Jabusch, J. R. és munkatársai: Biochemistry, 19, 2310-2316. (1980); Bárrá és munkatársai: FEBS Letters, 120, 53 (1980); és Oberley, L. W.: Superoxide Dismutase, I. kötet, 32-33., kiadó: CRC Press, Florida (1982)]. A természetes SÓD glikozilezve van (Huber, W. 3.579,495 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, megjelent 1971. május 18-án). A baktériumok által termelt humán SÓD csaknem biztos, hogy nincs glikozilezve, mivel az Escherichia coli nem glikozilezi azokat a fehérjéket, amelyeket termel. A baktériumok által termelt SOD-analóg aminosav-szekvenciája azonos az érett humán SÓD aminosav-szekvenciájával és nem tartalmaz metionin-gyököt N-terminálisánál.

12. példa

Humán Apolipoproíein E3 (ApoE3)

1. pTV-170

A pTV-170 megalkotását a 20. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben. A pTV-170-plazmidot úgy nyerjük, hogy a pApoE-EX2-ből (ATCC 39787) származó ApoE3 Ndel-Aűfel-fragmenst beiktatjuk a p579 kifejeződő vektor egyedi M/el-helyébe.

A pTV-170-et Escherichia coli A1645 törzsbe vezetjük be transzformációval olyan módszereket használva, amelyek jól ismertek azok számára, akik a szakterületen átlagosan jártasak. A nyert klón növesztésre humán ApoE3-at termel, amely valószínűleg

HU 214 977 Β metioninnal rendelkezik a természetes ApoE3-analóg amino-terminálisához hozzátéve. A termelt ApoE3analóg mennyisége mintegy 1 %-a a baktériumok által termelt összes fehérjének, amint ezt Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid gél vizsgálatával kalkuláljuk. A törzs növesztéséhez alkalmazott módszert az

17. példában írjuk le.

II. pTV-194

A pTV-194 megalkotását a 22. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben. A pTV-194 a pTV-170-ből (20. ábra) származik olyan módon, hogy a C_n riboszomális kötőhelyet helyettesítjük a pBLAl 1-ből származó β-laktamáz-promotorral és riboszomális kötőhellyel. A pBLAl 1 tartalmazza a pBR 332-ben található β-laktamáz gén promotoqát és riboszomális kötőhelyét a 4157 és 4353 koordináták között. E'coRI-linkert adunk hozzá a promotortól „fölfelé” és egy multirestrikcióshely-linkert adunk hozzá közvetlenül az ATG iniciációs kodon után. így a kódoló szál szekvenciája az iniciációs kodonnál kezdődően ATGAGCTCTAGAATTC. A pBLAl l-et letétbe helyeztük az American Type Culture Collectionnál, ATCC 39788 letéti számon.

A pTV-194-et bejuttatjuk Escherichia coli A1645 törzsbe transzformációval olyan módszereket alkalmazva, amelyek jól ismertek azok számára, akik a szakterületen átlagosan jártasak. A nyert klón növesztésre a humán ApoE3 egy analógját termeli, amely valószínűleg egy metionin-aminosawal rendelkezik a természetes humán ApoE3 amino-terminálisához hozzátéve. A termelt humán ApoE-analóg mennyisége mintegy 3%-a a baktériumok által termelt összes fehérjének, amint ezt Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid gél vizsgálatával kalkuláljuk. A törzs növesztéséhez alkalmazott módszer azonos azzal, amelyet a 17. példában pTV-170-hez leírunk.

III. pTV-214

A pTV-214 megalkotását a 24. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben. A pTV-214 a pTV-190-ből származik (amelyet a 21. ábrában mutatunk be, és az „Ábrák leírása” című részben írunk le) olyan módon, hogy a humán növekedési hormok amini-terminális szekvenciájának 14 aminosavát kódoló szintetikus DNS-fragmenst beiktatjuk a pTV-190 egyedi AWel-hclyébe.

A pTV-214-et Escherichia coli A1645 törzsbe vezetjük be transzformációval olyan módszereket alkalmazva, amelyek jól ismertek azok számára, akik a szakterületen átlagosan jártasak. A nyert klón növesztésre és indukcióra egy humán ApoE3-analógot termel, amely amino-terminálisánál a humán növekedési hormon amino-terminális szekvenciájának 14 aminosavával rendelkezik, ezt metionin követi, az érett humán ApoE3 szekvenciájához kötve.. A termelt humán ApoE-analóg mintegy 2%-a a baktériumok által termelt összes fehérjének, amint ezt Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid gél vizsgálatával kalkuláljuk. A törzs növesztéséhez alkalmazott módszerek azonosak azzal, amelyet a pTV-Ι 70-hez leírunk a 17. példában.

13. példa

A pHG44 növesztése

I. Törzstenyészetek

A pHG44 törzstenyészeteit kazeines tápközegben növesztjük (lásd „Inokulum”), majd kétszeresére hígítjuk fagyasztó tápközeggel és -80 °C hőmérsékleten tároljuk. A fagyasztó tápközeg 500 ml-e a következőket

tartalmazza:
K2HPO4	6,3 g
kh2po4	1,8 g
Na-citrát	0,45 g
MgSO4-7H2O	0,09 g
(NH4)2SO4	0,9 g
Glicerin	44,0 g

II. Inokulum

Az inokulumot 20 g/1 kazein-hidrolizátumot, 10 g/1 élesztőkivonatot és 2 g/1 NaCl-t tartalmazó oldatban szaporítjuk. Steril tápközeget rázólombikban inokulálunk a törzstenyészetből, és 15 órán át inkubáljuk rázógépen 30 °C hőmérsékleten mintegy 200 fordulat/percnél. Amikor további lépéseknél ez szükséges, az inokulum szaporítását kevertetett, levegőztetett fermentorokban hajtjuk végre. A steril tápközeget 2-10% inokulum-tenyészettel inokuláljuk, és 15 órán át inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten, pH 7±0,5nél olyan levezőtetés és kevertetés mellett, hogy az oldott oxigén szintje mindig 20%-os levegőtelítettség fölött maradjon.

III. Termelés

A termelő tápközeg a következőket tartalmazza:

Kazein-hidrolizátum 20 g/1

Elesztőkivonat 10 g/1

K₂HPO₄ 2,5 g/1

MgSO₄-7H₂O 1 g/1

NaCl 5 g/1

Biotin 0,1 mg/1

Tiamin 1 mg/1

Nyomelemoldat 3 ml/1

A tápközeg tartalmaz még 100 mg/liter ampicillint is. Az ampicillin tetszőleges a termeléshez, de mindig megtalálható az inokulum növesztéséhez használt tápközegben.

A biotint, tiamint és ampicillint koncentrált oldatokban külön-külön szűréssel sterílezzük, és az inokulálás előtt adjuk hozzá a steril termelő tápközeghez. Kezdetben 10 g/1 eléréséhez elegendő steril glükózoldatot is adagolunk. Az indukciós lépésnél további 10 g/1 glükózt adunk hozzá.

A nyomelemoldat a következőket tartalmazza:
FeCl3	16 g/1
ZnCl2-4H2O	2 g/1
CoCl2-6H2O	2 g/1
Na2MoO4-2H2O	2 g/1
CaCl2-2H2O	1 g/i
CuCl2	1 g/i
H3BO3	0,5 g/1
Konc. HCI	100 ml/1
A tápközeget 0,5-10%	inokulum-tenyészettel

inokuláljuk, és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A kevertetési-levegőztetési sebességeket úgy állítjuk be,

HU 214 977 Β hogy az oldott oxigén szintje a 20%-os levegőtelítettség fölött maradjon. A pH-t 7,0±0,2 értéken tartjuk NH₃-al. Amikor a sejtkoncentráció eléri a mintegy 3,5 g/1 (OD₆₆₀=10) értéket, az indukciót elindítjuk.

A hőmérsékletet 42 °C-ra emeljük, és 42 °C-on tartjuk 1-5 órán át. A tenyészetet azután hűtjük, és a sejteket centrifugálással kinyerjük a hormon tisztításához.

A bGH kinyerése kg baktériumsejtet (nyers szűrőpogácsa) újra szuszpendálunk 5 térfogat 50 mmol/liter nátrium-foszfát-puffert (pH 7,4), 50 mmol/liter EDTA-t és

100 mmol/liter NaCl-t tartalmazó oldatban, Polytron (Kinematika) blender-keverőt alkalmazva, miközben a keverő sebességét úgy szabályozzuk, hogy a habképződés minimális legyen. A homogén szuszpenziót folyamatosan eresztjük keresztül sejtzúzón (KD5 típus, Willy A. Bachofen, Basel), 80 liter/óra sebességgel, és a szétzúzott sejtek homogén szuszpenzióját CEPA

101 centrifugában végzett centrifugálással tisztítjuk, 45 liter/óra sebességgel. A centrifugálási lépésből nyert csapadékot összegyűjtjük, és újra szuszpendáljuk

15,5 liter 50 mmol/literes foszfát-pufferban (pH 7,4), amely 50 mmol/liter EDTA-t is tartalmaz. Lizozimot adunk hozzá 0,05 mg/ml végső koncentrációban, és a szuszpenziót 16 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. TritonX-100-at adunk hozzá 1% végső koncentrációig. A szuszpenziót ezután 30 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten, ultrahangos kezelésnek vetjük alá folyamatos átáramlású cellával rendelkező szonikátorberendezésben (Heat System) 18 liter/óra sebességgel, majd CEPA 101 centrifugában centrifugáljuk. A csapadékot összegyűjtjük, újra szuszpendáljuk 50 mmol/liter nátrium-foszfát-pufferban (pH 7,4), a fentiek szerint újra ultrahangos kezelésnek vetjük alá, majd CEPA 101 centrifugában centrifugáljuk. A sejteket 15,5 liter 50 mmol/literes nátrium-foszfát-pufferban (pH 7,4), amely 50 mmol/liter EDTA-t és 100 mmol/liter NaCl-t is tartalmaz, újra szuszpendáljuk, és kétszer kicsapjuk és újra szuszpendáljuk 15,5 liter desztillált vízben. Az utolsó csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, és -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

A bGH tisztítása

A csapadékot újra szuszpendáljuk 30-40 liter desztillált vízben, és szolubilizáljuk pH 11,8-ra beállítva 0,5 n NaOH-val végzett titrálással. Az oldatot ezután folyamatos ultrahangkezelésnek vetjük alá és centrifugálással tisztítjuk CEPA 101 centrifugában, ha szükséges, vagy szűrjük Whatman 1 papíron át.

A tisztított fehérjeoldatot (32,6 liter, amely 297 000 OD értéket tartalmaz 280 nm-nél mérve) külön adagokba mérjük szét (6*5,4 liter), minden adag 50 000-60 000 OD értéket tartalmaz. Mindegyik adagot ultraszűrésnek vetjük alá Millipore Pellicon ultraszűrőn át, amely három, 100000 molekulasúly-kizárásos kazettával (PTHK típus) van felszerelve, az egyes kazetták területe 5 négyzetláb, vagyis 0,465 m².

Egy 5,4 literes adagot 1 liter visszamaradó térfogatig koncentrálunk. Az ultraszűrletet összegyűjtjük és félretesszük. A visszamaradó anyagot visszahígítjuk eredeti térfogatára friss, 10 mmol/literes borát-pufferral, pH

11,8, és jól összekeveijük. Az adagot újra 1 liter visszamaradó térfogatig koncentráljuk. Az ultraszűrletet összegyűjtjük, és egyesítjük az első ultraszűrlettel. Amikor az OD-értékek pillanatnyi összege az ultraszűrletben egyenlő a kezdetben az ultraszűrőre terhelt OD-érték 20%-ával, a visszamaradó térfogatot a következő koncentráló lépésben 0,5 literre vesszük 1 liter helyett. A koncentrálás és 10 mmol/literes borát-pufferral való hígítás ciklusát folytatjuk egészen addig, amíg a visszamaradó térfogat 0,5 literéből származó ultraszűrlet 280 nm-nél (1 cm-es cella) kevesebb mint 0,1 lesz. Ez normálisan a koncentrálásszűrés 9. és 12. ciklusa között következik be. Az utolsó visszamaradó oldatot eldobjuk.

Mindegyik ultraszűrletet egyesítjük és pH 9,0-ra állítjuk be 6 n HCl-el. A többi 5,4 literes adagokat is hasonló módon vetjük alá ultraszűrésnek, és az összes, pH-beállított ultraszűrletet egyesítjük. Egy tipikus műveleti lefutás összesen 380 liter ultraszűrletet termel 0,26 abszorbanciával, amely 100000 OD-egységgel egyenértékű, ez 24-40 órát igényel összességében.

A kombinált ultraszűrleteket (380 liter, amely 280 nm-nél mérve 100000 OD egységnek felel meg) a 100K ultraszűrési lépésekből Sepharose CL-6B DEAE ioncserélő oszlopokra terheljük, 23 cm/óra (25 liter/óra) lineáris áramlási sebességnél. A 37 cm átmérőjű, 15 cm magas oszlopot két ágytérfogat (32 liter) 10 mmol/literes borát-pufferral (pH 9,0) mossuk. Az eluensekben végzett változási lépés, vagyis eluálás 10 mmol/liter borátot, és 100 mmol/liter nátrium-kloridot tartalmazó pufferral (pH 9) leszorítja a bGH-t az oszlopról. Az eluálás áramlási sebessége 23 cm/óra. A lefutás előrehaladását olyan módon észleljük, hogy követjük az eluátum abszorbanciáját 280 nm-nél. A bGH-csúcsot összegyűjtjük 4-5 ágytérfogatban (84 liter, amely 280 nm-nél 43 000 OD-egységet tartalmaz), majd mintegy 10 mg/ml-re koncentráljuk, Millipore Pellicon ultraszűrő berendezést alkalmazva 10 000 molekulasúly-kizárású kazettákkal. A kitermelés mintegy 70 g tiszta bGH.

14. példa

A pHG44 által termelt bGH-analóg aktivitása

1. A bGH-analóg radioimmunassay összehasonlítása a természetes bGH-val

100 ng/ml bGH-analógot tartalmazó oldatot készítünk foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldatban (1% BSA). Ezt az oldatot sorozathígításnak vetjük alá 50, 25, 12,5, 6,25, 3,12, 1,56 és 0,78 ng/1 koncentrációkra. Ezeknek az oldatoknak 0,1 ml alikvotjait két párhuzamosban RIA-mérésnek vetjük alá, kettősantitesteljárást alkalmazva. A hígítási görbe jól összehasonlítható azzal, amelyet a természetes bGH-val nyerünk.

2. Radioreceptor-kötési vizsgálat

Radioreceptor-kötési vizsgálatot hajtunk végre nyúlmájmembránokkal, amint ezt Tushima, T. és Freisen, H. G. leírták [J. Clin. Endocr. Metab., 37, 3 (1973)], ¹²⁵I-bGH-t alkalmazva jelzőként és autentikus bGH-oldatokat alkalmazva a kalibrációs görbe megalkotásához. A mintákat három párhuzamosban inkubáljuk két órán át szobahőmérsékleten 0,3 ml vizs28

HU 214 977 Β

III. Termelés

A termelő tápközeg a következőket tartalmazza:

gálati pufferban (50 mmol/liter trisz, 15 mmol/liter CaCl₂ és 5 mg/ml bovin-szérumalbumin, pH 7,6). A csövek ¹²⁵I-bGH-t (20 000 cpm 30-60 pci/pg-os készítményből), 150-250 pg máj membránfehérjét, és vagy természetes bGH-t (1-100 ng), vagy bakteriális bGH kivonatait tartalmazzák. Az eredmények azt demonstrálják, hogy a bGH-analóg bGH-aktivitása összehasonlítható a természetes bGH aktivitásával.

3. Tibia-vizsgálat

A 13. példa szerint bakteriális sejtből kinyert, pRO12 által termelt bGH-analóg bioaktivitását tibiavizsgálattal értékeljük [Parlow, A. F. és munkatársai: Endocrinology, 77, 1126 (1965)]. Patkányok hipofízisét eltávolítjuk 28-30 napos korukban, majd 10-14 napig kezelés nélkül tartjuk ezeket. Szarvasmarha-hipofízisből vagy rekombináns Escherichia coli-ból származó szarvasmarhanövekedési-hormont oldunk 0,15 mol/liter NaCl-t és 0,01 mol/liter borátot tartalmazó oldatban (pH 10,0). Patkányok 4-7 tagú csoportjainak adunk naponta szubkután injekciókat bGH-oldatokból (5-125 pg/nap, 0,2 ml-es adagokban) 5 napon át, miközben normál étrenden tartjuk ezeket (Purina Rat-Chow tápszer és víz korlátlan mennyiségben). Az állatokat a 6. napon leöljük, első térdcsontjaikat kivesszük, hosszában elhasítjuk, acetonnal rögzítjük, és 2%-os AgNO₃-oldattal megfestjük. Az epifizeális lemezek szélességét egy kivetítő binokuláron (Nikon) át figyeljük meg. Átlagértékeket (40 leolvasás patkányonként) alkalmazunk a hosszú dózisválaszgörbe megalkotásához. Az eredmények azt demonstrálják, hogy a pHG44 által termelt bGH-analóg bGH-aktivitása összemérhető a természetes bGH aktivitásával.

75. példa pSOD(]TT-l növesztése

I. Törzstenyészetek

A ρ8ΟΟβ|Τ|! törzstenyészeteit kazeines tápközegen növesztjük (lásd „Inokulum”), majd kétszeresére hígítjuk fagyasztó tápközeggel, és -80 °C hőmérsékleten tároljuk. A fagyasztó tápközeg 500 ml-e a következőket tartalmazza:

K2HPO4	6,3 g
kh2po4	1,8 g
Na-citrát	0,45 g
MgSO4-7H2O	0,09 g
(NH4)2SO4	0,9 g
Glicerin	44,0 g

II. Inokulum

Az inokulumot 20 g/1 kazein-hidrolizátumot, 10 g/1 élesztőkivonatot és 2 g/1 NaCl-t tartalmazó oldatban szaporítjuk. Steril tápközeget rázólombikban inokulálunk a törzstenyészetből, és 15 órán át inkubáljuk rázógépen 30 °C hőmérsékleten és mintegy 200 fordulat/percnél. Amikor további lépéseknél ez szükséges, az inokulum szaporítását kevertetett, levegőztetett fermentorokban hajtjuk végre. A steril tápközeget 2-10% inokulum-tenyészettel inokuláljuk, és 15 órán át inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten, pH 7±0,5-nél olyan levegőztetés és kevertetés mellett, hogy az oldott oxigén szintje mindig 20%-os levegőtelítettség fölött maradjon.

Kazein-hidrolizátum 20 g/1

Elesztőkivonat 10 g/1

K₂HPO₄ 2,5 g/1

MgSO₄-7H₂O 1 g/1

NaCl 5 g/1

Biotin 0,1 mg/1

Tiamin 1 mg/1

Nyomelemoldat 3 ml/1

CuSO₄ 0,8 g/1

ZnSO₄ 10 mg/1

A tápközeg tartalmaz még 12,5 mg/liter tetraciklint is. A tetraciklin tetszőleges a termeléshez, de mindig megtalálható az inokulum növesztéséhez használt tápközegben.

A biotint, tiamint és tetraciklint koncentrált oldatokban külön-külön szűréssel sterilezzük, és az inokulálás előtt adjuk hozzá a steril termelő tápközeghez. Kezdetben 10 g/liter eléréséhez elegendő steril glükózoldatot is adagolunk. Az indukciós lépésnél további 10 g/1 glükózt adunk hozzá.

A nyomelemoldat a következőket tartalmazza:
FeCl3	16 g/1
ZnCl2-4H2O	2 g/1
CoCl2-6H2O	2 g/1
Na2MoO4-2H2O	2 g/1
CaCl2-2H2O	1 g/1
CuCl2	1 g/1
H3BO3	0,5 g/1
Konc. HCI	100 ml/1
A tápközeget 0,5-10%	inokulum-tenyészettel

inokuláljuk, és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A kevertetési-levegőztetési sebességeket úgy állítjuk be, hogy az oldott oxigén szintje a 20%-os levegőtelítettség fölött maradjon. A pH-t 7,0±0,2 értéken tartjuk NH₃-al. Amikor a sejtkoncentráció eléri a mintegy 3,5 g/1 (OD₆₆₀=10) értéket, az indukciót elindítjuk.

A hőmérsékletet 42 °C-ra emeljük, és 42 °C-on tartjuk 1-5 órán át. A tenyészetet azután hűtjük, és a sejteket centrifugáíássaí kinyerjük az enzim tisztításához.

Az SÓD kinyerése

1,5 kg baktériumsejtet (nedves szűrőpogácsa) 12 liter, 50 mmol/liter nátrium-foszfátban (pH 7,8) szuszpendáljuk, Polytron (Kinematica) blenderkeverőben, miközben a sebességet úgy szabályozzuk, hogy a habképződés minimális legyen. A homogén szuszpenziót folyamatosan visszük Dynomill sejtzúzó berendezésen keresztül (KD5 típus, Willy A. Bachofen, Basel). A szétzúzott sejtek homogén szuszpenzióját ultrahanggal kezeljük, folyamatos áramlású cellákat alkalmazva, és CEPA 100 centrifugában centrifugáljuk. A felülúszót 2 órán át 65 °C hőmérsékleten melegítjük, majd lehűtjük és centrifugáljuk az előzőek szerint. A tiszta felülúszót 1 literre koncentráljuk Millipore Pellicon ultraszűrő berendezésben, 10 000 molekulasúly-kizárásos kazettákat (PTGG típus) alkalmazva. A koncentrált fehérjeoldatot DEAE Sepharose-oszlopon engedjük át (2 kg DEAE Sepharose), amely 150 mmol/literes nátrium-foszfát29

HU 214 977 Β pufferral (pH 7,8) van kiegyensúlyozva. Az átáramló oldatot összegyűjtjük és dializáljuk Pellicon ultraszűrő berendezésen 20 mmol/liter trisz-HCl-el (pH 7,8) szemben, majd 20 mmol/liter trisz-HCl-pufferral kiegyensúlyozott QAE-Sepharose-oszlopra visszük fel. Az oszlopot 20 mmol/literes trisz-HCl-pufferral (pH 7,8) és sógradienssel (0-200 mmol/liter NaCl) fejlesztjük ki. Az SOD-t tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, Pellicon ultraszűrő berendezést alkalmazva koncentráljuk, desztillált vízzel szemben dializáljuk, majd 100 mmol/literesre állítjuk be nátrium-acetátra, 1 mol/liter nátrium-acetát-puffer (pH 4,8) hozzáadásával. A fehérjeoldatot azután tovább szeparáljuk 100 mmol/liter nátrium-acetát-pufferral (pH 4,7) kiegyensúlyozott CM-Speharose-oszlopon. Az oszlopot azonos pufferrt és sógradienst (100-500 mmol/liter NaCl) alkalmazva fejlesztjük ki. Az SOD-tartalmú frakciókat összegyűjtjük, Pellicon ultraszűrő berendezést alkalmazva koncentráljuk, majd liofilezzük.

16. példa

A pSODfi^TT-l állal termelt SÓD aktivitása

A 15. példa szerint készített, pSODp|TT-l által termelt SOD-analóg enzimes aktivitását ferricitokróm-c redukciója gátlásának megfigyelésével mérjük, amint ezt McCord és Fridovich leírták: J. Bioi. Chem., 244, 6049-6055. (1969). Az eredmények azt demonstrálják, hogy a pSOD3|TT-l által termelt SOD-analóg aktivitása összemérhető a természetes humán SÓD aktivitásával és a szarvasmarha SÓD (Orgotein, Grunenthal GmbH) aktivitásával.

17. példa

A pTV-170 növesztése

I. Törzstenyészetek

A pTV-170 törzstenyészeteit kazeines tápközegen növesztjük (lásd „Inokulum”), majd kétszeresére hígítjuk fagyasztó tápközeggel és -80 °C hőmérsékleten tároljuk. A fagyasztó tápközeg 500 ml-e a következőket

tartalmazza:
K2HPO4	6,3 g
kh2po4	1,8 g
Na-citrát	0,45 g
MgSO4-7H2O	0,09 g
(NH4)2SO4	0,9 g
Glicerin	44,0 g

II. Inokulum

Az inokulumot 20 g/l kazein-hidrolizátumot, 10 g/l élesztőkivonatot és 2 g/l NaCl-t tartalmazó tápközegen szaporítjuk. Rázólombikban lévő steril tápközeget inokulálunk a törzstenyészetből, és 15 órán át rázógépen inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten, mintegy 200 fordulat/percnél. Amikor további lépéseknél szükséges, az inokulum szaporítását kevertetett, levegőztetett fermentorokban is kivitelezhetjük. A steril tápközeget 2-10% inokulummal inokuláljuk, és 15 órán át inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten, pH 7±0,5-nél kevertetéssel és olyan mértékig levegőztetéssel, hogy az oldott oxigénszint 20%-os levegőtelítettség fölött maradjon fenn.

III. Termelés

A termelő tápközeg a következőket tartalmazza:
Kazein-hidrolizátum	20 g/l
Elesztőkivonat	10 g/l
K2HPO4	2,5 g/l
MgSO4-7H2O	lg/1
NaCl	5 g/l
Biotin	0,1 mg/1
Tiamin	1 mg/1
Nyomelemoldat	3 ml/1
A tápközeg tartalmaz 100 mg/liter ampicillint is.

A ampicillin tetszőlegesen használható a termeléshez, de mindig megtalálható az inokulum növesztéséhez használt tápközegben.

A biotint, tiamint és ampicillint koncentrált oldatokban külön-külön szűréssel sterilezzük, és az inokulálás előtt adjuk hozzá a steril termelő tápközeghez. Steril glükózoldatot is adunk hozzá kezdetben, hogy koncentrációja 10 g/l legyen. Az indukciós lépésnél további 10 g/l glükózt adunk hozzá.

A nyomelemoldat a következőket tartalmazza:
FeCl3	16 g/l
ZnCl2-4H2O	2 g/l
CoCl2-6H20	2 g/l
Na2MoO4-2H2O	2 g/l
CaCl2-2H2O	lg/1
CuCl2	lg/1
H3BO3	0,5 g/l
Konc. HCI	100 ml/1
A tápközeget 0,5-10%	inokulum-tenyészettel

inokuláljuk, és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A kevertetési-levegőztetési sebességeket úgy állítjuk be, hogy 20% levegőtelítettség fölötti oldott oxigénszintet tartsunk fenn. Amikor a sejtkoncentráció eléri a mintegy

3,5 g/l (OD₆₆₀=10) értéket, az indukciót elindítjuk.

A hőmérsékletet 42 °C-ra emeljük, és 15 percen át ezen a hőmérsékleten tartjuk. A tenyészetet azután hűtjük, és a sejteket centrifugálással kinyerjük a fehérjetisztításához.

18. példa szarvasmarhanövekedési-hormon pHG50

A pHG50 megalkotását a 6. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben. A pGH50plazmidot úgy nyerjük, hogy aa pSK434 (ATCC 39784) Hpall-HpaYl Xcl⁴³⁴-fragmensét beiktatjuk a pHG44 (ATCC 39806) egyedi C/al-helyébe. A pHG51-plazmidot hasonló módon alkotjuk meg, ebben a plazmidban azonban a Ximm434ci⁺-ffagmenst az ellenkező orientációban találjuk, mint a pHG50plazmidban.

A pSK434-et (ATCC 39784) úgy alkotjuk meg, hogy Ximm434-et RaznHI-vel emésztjük, és a BazwHIvel emésztett pBR322 keverékéhez ligáljuk. A ligáit keveréket Escherichia coli A2097-be transzformáljuk, és a Ximm434cI300-fágra immunis telepeket izoláljuk. A pSK434, amelyet ezeknek a telepeknek egyikéből izoláltunk, egy 6 kb-s RamHI-fragmenst tartalmaz, amely tartalmazza a Xci434-gént, és kiterjed az N-génen túli

HU 214 977 Β területtől a P-génen túli területig. A pSK434 restrikciós térképét a 6. ábrában mutatjuk be.

A pGH50-et és pHG51-et Escherichia coli A1645be vezetjük be transzformálással olyan módszereket alkalmazva, amelyek ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak. A nyert kiónok, amelyeket A3108nak, illetve A3112-nek jelölünk, növesztésre és indukcióra egy bGH-analógot termelnek, amely egy met-asp-gln aminosav-szekvenciával rendelkezik a természetes bGH fenilalanin formájához hozzáadva. A termelt bGH-analóg 37-42% mennyiségét képezi a baktériumok által termelt összes fehérjének, amint ezt a Coomassie-vel festett poliakrilamid gél átvizsgálásával kalkuláljuk (I. táblázat).

Profág-bevezetés

Abból a célból, hogy a XcI434 szelekciós rendszert alkalmazzuk, a pHG50-et tartalmazó sejteknek tartalmazniuk kell a Ximm434cU-profágot is. Profágként Ximm434cI3003miniTnl0A16A17-et alkalmazunk. A miniTnlOA16A17 tetraciklin-rezisztencia markert [Foster és munkatársai: Cell, 23, 201-213. (1981)] azért vezetjük be a fágba, hogy megkönnyítsük a ritka és stabil profág beiktatási események izolálását. Ez lehetővé teszi a profág jelenlétének egyszerű vizsgálatát is a tetraciklin-rezisztencia megfigyelésével.

Escherichia coli A1645 törzset, amely a pGH50plazmidot tartalmazza, és amely ampicillin jelenlétében nőtt, fertőzünk Ximm434ci3003miniTnl0A16A17 kis, fertőző mennyiségével 30 °C hőmérsékleten. Tetraciklin-rezisztens telepeket izolálunk és tisztítunk. Ezt a törzset letétbe helyeztük az American Type Culture Collectionnál ATCC 39805 letéti számon.

Egy másik módszer szerint a profágot úgy vezetjük be, hogy együttesen transzformáljuk az Escherichia coli A1645-öt pHG50-el és Áimm434ci3003miniTnlOA16A17-el, és olyan telepeket választunk ki, amelyek rezisztensek mind ampicillinre, mind tetraciklinre. A megfelelő gazdaszervezetek a leírt vektorokhoz és plazmidokhoz az Escherichia coli-törzsek közül azok, amelyek transzformálásra alkalmasak, ilyenek például az A1637, A2602, A1563, A1645/C600AHABamHI rm⁺gal⁺thHeu Bl) vagy A2097/A1645 lacA%A21 proC::Tnl0). A kívánt profágokat be lehet vezetni a fenti törzsek mindegyikébe, a fentebb leírtakkal azonos módon.

A pHG50 és az a vektor, amely a bGH-gén kimetszésével belőle származik, számos előnnyel bír a korábban leírt kifejeződő vektorokhoz viszonyítva, ilyenek például:

1. Megnövelt plazmid-stabilitás

A plazmid tartalmazza a cl⁴³⁴-represszor gént, amely represszorszál egy ?dmm434ci^_ lizogént. A plazmid elvesztése a bakteriális sejtben lízist eredményez a Ximm434cl^_-profágindukció következtében. így a plazmid stabilan fennmarad antibiotikumos szelekciós munkamenet igénybevétele nélkül, amely meglehetősen drága. A ΠΕ táblázat mutatja meg a cl⁴³⁴ stabilizáló rendszert hordozó plazmid megnövekedett stabilitását.

A cl⁴³⁴-plazmid stabilizáló rendszer összeférhető a hőindukálható ?Jj -promotor kifejeződő rendszerrel, annak a ténynek ellenére, hogy a termolabilis represszor Ximm434cU-profág helyettesítheti a Ximm434cI3003-profágot. Ezenkívül bármilyen antibiotikum-rezisztencia marker helyettesítheti a tetraciklin-rezisztencia markert, amelyet a miniTnl0A16A17be bevezettünk. A Ximm21 - és Ximm22-repressozr negatív mutánsok hozzáférhetősége lehetővé teszi a A434-rendszer helyettesítését a 21. fág vagy 22. fág összeférhető rendszerével.

2. A kifejeződés rendkívül magas szintje

Ez a plazmid képes idegen fehéijék kifejeződésének irányítására E. coli-ban olyan magas szinten, hogy ez elérheti a teljes sejtfehérje 42%-át. A kifejeződésnek ez a szintje nagyobb, mint amelyet más hasonló, T₃T₂ átírásbefejezési szekvenciákat nélkülöző XP_L-plazmidoknál leírtak.

3. Átírásbefejezési szignálok

A plazmid tartalmazza a T[T₂ átírásbefejezési szignálokat a ÁP_L-promotortól és a Cn riboszomális kötőhelytől „lefelé” elhelyezve. A kifejeződés magas szintje, amelyet akkor nyerünk, amikor ezt a plazmidot használjuk, részben a TjT₂ átírási terminátorok jelenlétének tulajdonítható a beiktatott gén végénél, mivel a TjT₂ átírási terminátorok képesek az N-módosított RNS polimeráz átírásának befejezésére. így az átírási terminátorok megakadályozzák a nemkívánatos fehérjék XP_L által szabályozott átírását, ezáltal megnövelik a kívánt fehéije relatív kitermelését.

4. Helyettesíthető riboszomális kötőhely

A pHG50 tartalmaz egy egyedi TscoRI-helyet, amely a riboszomális kötőhelytől „felfelé” helyezkedik el, és egy Ndel helyet, amely az ATG iniciációs kodonnál helyezkedik el. így a riboszomális kötőhely két egyedi restrikciós hely révén kötődik. Ez lehetővé teszi a jelen riboszomális kötőhely (a λϋ_π riboszomális kötőhely) könnyű kimetszését és helyettesítését tulajdonképpen bármilyen más természetes vagy szintetikus riboszomális kötőhellyel anélkül, hogy a plazmid egyéb jellemvonásai változnának. Ez nagymértékben megkönnyíti a kívánt polipeptid optimális kifejeződését.

5. A kifejeződés hőindukálható szabályozása

A ZP_L-promotor inaktív, amikor a C_rrepresszort hozzákötjük. A cI857-represszor hőérzékeny, vagyis ez 30 °C hőmérsékleten a promotorhoz kötődik, de inaktiválódik 42 °C hőmérsékleten. így a fermentáció hőmérsékletét 42 °C-ra emelve a gazdasejt indukálódik, hogy a kívánt fehérjét termelje.

Az ilyen rendszer előnyei a következők:

a) Olyan idegen fehérjét, amely Escherichia coli-ra toxikus, is lehet termelni a késői fázisban, így elkerülve a korai sejtpusztulást a fermentációs folyamatban.

b) Egy fehérje túltermelése stabilizálhatja a fehérjét, és megakadályozza a proteolitikus lebontást [Cheng, Y. E. és munkatársai: Gene, 14, 121 (1981)]. így a „pillanatnyi” túltermelés szorosan szabályozott promotort, például XP_L-t alkalmazva, előnyösebb lehet a folyamatos alacsony szintű termelésnél.

HU 214 977 Β

III. táblázat

A cl⁴³⁴-rendszerből kialakuló plazmid stabilitása

6. Egyszerűsített indukciós munkamenet

A pGH50 mintegy 42 °C hőmérsékleten indukálódik, és 42 °C-on tartjuk a fehérjeszintézis időtartama alatt. A pMGlOO-ból és pND5-ből származó plazmidok indukciós munkamenete a függőben levő, együtt bejelentett 514,188 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben van leírva, ez 42 °C hőmérsékleten végzett indukciót foglal magában, ezt követi egy kiterjedt növesztési periódus 38 °C hőmérsékleten. Az optimális indukciós munkamenet pHG50hez nem igényli a 38 °C-ra való hűtési lépést, ezért egyszerűbb.

7. Nagy kópiaszám

A λ P_L-promotor a pHG50-ben egy olyan plazmidban található, amelynek kópiaszáma nagyobb, mint a λ transzdukáló vektoroké, amelyek az Escherichia coli-ban jelen vannak. Ez növeli a kifejeződési szintet.

8. Riboszómakötő-hely és iniciációs kodon

Ez a kifejeződő vektor tartalmaz egy erős, prokarióta riboszómakötő-helyet (RBS), valamint egy transzlációs beindító (iniciációs) kodont (ATG). így bármilyen eukarióta gént lehet klónozni iniciációs kodon hozzáadása nélkül. Ezen túl a hatásos RBS növeli a kifejeződés szintjét. A riboszómakötő-hely a XC_n riboszomális kötőhely. A riboszomális kötőhely szekvenciája a következő:

TAAGGAAGTACTTACAT

ATTCCTTCATGAATGTA

Egy bázispár különbözik a vad típusú λ-ban található riboszomális kötőhelytől.

9. Kényelmes restrikciós hely

A plazmidból származó kifejeződő vektornak egy egyedi Ndel restrikciós helye van, amely a helyen belül tartalmazza az ATG iniciációs kodont. Az egyedi Ndehelyet közvetlenül a riboszomális kötőhely után találjuk.

10. Nut-hely

Az N-fehéqe, amelyet a gazdaszervezet szolgáltat, a Nut-helyen kötődik a kifejeződő vektoron, és ezáltal megakadályozza az átírás befejeződését a t_RI-helynél, vagy megakadályoza az érés előtti átírási befejeződést a klónozott génen belül.

A3108 és A3112 törzseket fertőzünk Ximm434I^_miniTnlO-zel 30 °C hőmérsékleten, és tetraciklin-rezisztens telepeket izolálunk. A telepeket tisztítjuk, és megvizsgáljuk ampicillin-rezisztenciára. Egyedi telepeket választunk ki és növesztünk egy éjszakán át 30 °C hőmérsékleten LB-tápközegben, amely 50 pg/ml ampicillint is tartalmaz. A tenyészeteket hígítjuk 1/1000 arányban LB-tápközeggel, növesztjük körülbelül 5-10⁸/ml koncentrációig, és tovább hígítjuk 1/100000 arányban friss LB-tápközeggel, és egy éjszakán át növesztjük. Mintákat szélesztünk LB-lemezekre és olyan LB-lemezekre, amelyek 50 pg/ml ampicillint is tartalmaznak. Mintegy 50 telepet az egyes LB-lemezekről átellenőrzünk növekedésre ampicillint tartalmazó LB-lemezeken. Az eredmények a kiválasztott kiónok plazmidstabilitását demonstrálják.

Törzs	Plazmid	Gazdaszervezet	Sejtek %-a plazmid nélkül
A3102	pHG44	A2097	10-20
A3108	pHG50	A1645	10-20
A3109	pHG50	A1645 (Xi434cl miníTnlO)	1,0
A3112	pHG51	A1645	10-20
A3113	pHG51	A1645 (Xi434cl miníTnlO)	1,0

19. példa pHG50 növesztése

I. Törzstenyészetek

PHG50 törzstenyészeteit kazeines tápközegben növesztjük (lásd „Inokulum”), majd kétszeresére hígítjuk fagyasztó tápközeggel és -80 °C hőmérsékleten tároljuk. A fagyasztó tápközeg 500 ml-e a következőket tartalmazza:

K2HPO4	6,3 g
kh2po4	1,8 g
Na-citrát	0,45 g
MgSO4-7H2O	0,09 g
(NH4)2SO4	0,9 g
Glicerin	44,0 g
Inokulum
Az inokulumot 20 g/1 kazein-hidrolizátumot, 10 g/1

élesztőkivonatot és 2 g/1 NaCl-t tartalmazó oldatban szaporítjuk. Rázólombikban steril tápközeget inokulálunk a törzstenyészetből, és inkubáljuk 15 órán át rázógépen 30 °C hőmérsékleten és mintegy 200 fordulat/percnél. Amikor további fázisokhoz szükséges, az inokulum szaporítását kevertetett, levegőztetett fermentorokban is kivitelezhetjük. A steril tápközeget 2-10% inokulummal inokuláljuk, és 15 órán át 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk, pH 7±0,5-nél olyan mértékű kevertetéssel és levegőztetéssel, hogy az oldott oxigén szintje a 20%-os levegőtelítettség fölött maradjon.

III. Termelés

A termelő tápközeg a következőket tartalmazza:

Kazein-hidrolizátum 20 g/1

Élesztőkivonat 10 g/1

K₂HPO₄ 2,5 g/1

MgSO₄-7H₂O 1 g/1

NaCl 5 g/1

Biotin 0,1 mg/1

Tiamin 1 mg/1

Nyomelemoldat 3 ml/1

A tápközeg tartalmaz 100 mg/liter ampicillint is. Az ampicillin a termeléshez tetszőleges, de az inokulum növesztéséhez használt tápközegben mindig megtalálható.

A biotint, tiamint és ampicillint koncentrált oldatban külön-külön szűréssel sterilezzük, és az inokulálás előtt adjuk hozzá a steril tápközeghez. Steril glükóz32

HU 214 977 Β oldatot is adunk kezdetben 10 g/liter koncentráció elérésére. Az indukciós lépésnél további 10 g/1 glükózt adagolunk.

A nyomelemoldat a következőket tartalmazza:
FeCl3	16 g/1
ZnCl2-4H2O	2 g/1
CoC12-6H2O	2 g/1
Na2MoO4'2H2O	2 g/1
CaCl2-2H2O	1 g/1
CuCl2	1 g/1
h3bo3	0,5 g/1
Konc. HC1	100 ml/1
A tápközeget 0,5-10%	inokulum-tenyészettel

inokuláljuk, és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A kevertetési-levegőztetési sebességeket úgy állítjuk be, hogy az oldott oxigénszint 20%-os levegőtelítettség fölött maradjon. A pH-t 7,0±0,2 értéken tartjuk NH₃-zal. Amikor a sejtkoncentráció eléri a mintegy 3,5 g/litert (OD₆₆₀=10), az indukciót elindítjuk.

A hőmérsékletet 42 °C-ra emeljük, és 42 °C-on tartjuk 1-5 órán át. A tenyészetet azután hűtjük, és a sejteket centrifugálással kinyerjük a hormon tisztításához.

20. példa p8300-10A

A p8300-10A (ATCC 39785) megalkotását a 7. ábrán mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben. A p8300-10A-plazmid a konstitutíven nagy kópiaszámú pOPlAő-plazmidból [Gelfand, D. H. és munkatársai: PNAS, 75, 5869 (1978); Mensing és munkatársai: Cell, 24, 235-242. (1981)] származik. A p7200-22-t, amelyet szintén a 7. ábrán mutatunk be, Clal-el emésztjük, és a C/al-C/al-íragmenst, amely tartalmazza a XP_L-promotort, a bGH-gént és a T_tT₂ szekvenciákat, izoláljuk. A C/al-C/al-fragmenst beiktatjuk a ρΟΡ1Δ6 egyedi CVűt-helyébe. [A p7200-22-plazmid a pSAL 5600-1 (10. ábra) egyik származéka, amelybe egy szintetikus C/al-linkert vezetünk be a 5g/II-helynél, a kP_L-promotortól „felfelé”.]

A p8300-10A-plazmidról úgy találjuk, hogy megtartja a konstitutíven nagy kópiaszámú fenotípusát még a XP_L-promotor indukciója után is mintegy 42 °C hőmérsékleten. Ez a T,T₂ befejezési szekvenciák jelenlétének tulajdonítható a bGH-szekvencia 3’-végénél, amelyek megakadályozzák hosszú mRNS-átiratok képződését a XP_L-promotorból, amely hatást gyakorolhat más mRNS-átiratokra is a ρΟΡ1Δ6 replikációjának origójánál.

A p8300-10A-t Escherichia coli A2097 törzsbe vezetjük be transzformációval, olyan módszereket alkalmazva, amelyek jól ismertek azok számára, akik a szakterületen átlagosan jártasak. Ez a törzs növesztésre és indukcióra egy szarvasmarhanövekedési-hormonanalógot termel, amely metionin-gyökkel bír a természetes bGH fenilalanin formájának alanin-terminálisához hozzátéve. A termelt bGH-analóg mennyisége mintegy 37-43%;a a baktériumok által termelt összes fehérjének, amint ezt Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid gél átvizsgálásával kalkuláljuk. A törzs növesztéséhez, a termelt bGH-analóg kinyeréséhez és a bGH-analóg tisztításához alkalmazott módszerek azonosak azzal, amelyeket a pSAL-170/10-hez leírunk a 24. példában.

21. példa

A p8300-10A-plazmidból (7. ábra, ATCC 39785) egy általános hasznosítású kifejeződő vektor származhat a bGH-gén kimetszésével. Egy így származott vektor számos előnnyel bír a korábban leírt vektorokkal szemben, ilyen előnyök például:

1. A kifejeződés rendkívül magas szintje

A vektor képes az idegen fehérje kifejeződésének irányítására Escherichia coli-ban olyan magas szinten, amely a teljes sejtfehérje 44%-át is elérheti.

2. Konstitutíven nagy kópiaszám

A vektor konstitutíven nagy kópiaszámot, mintegy 200-300 kópiát sejtenként tart fenn. Ez eltér a többi λΡ] kifejeződő vektoroktól, amelyek kisebb kópiaszámmal vannak jelen. A nagy kópiaszám hozzájárul a kifejeződés magasabb szintjéhez.

3. Átírásbefejezési szignálok

A vektor, amelyet a bGH-szekvencia kimetszésével nyerhetünk p8300-10A-ból, tartalmazza a T,T₂ átírásbefejezési szignálokat a XP_L-promotortól és a C_n riboszomális kötőhelytől „lefelé”. A kifejeződés magas szintje részben a T]T₂ átírási terminátorok jelenlétének tulajdonítható a beiktatott gén végénél, mivel a TjT^szignálok befejezik az N-módosított RNSpolimeráz átírását. így az átírási terminátorok megakadályozzák a nem kívánt fehérjék λΡ_Ε által szabályozott átírását, ezáltal növelik a kívánt fehérjék relatív termelését. Ezen túl a T,T₂ átírási szignálok megakadályozzák a hosszú mRNS-átiratokat a replikáció plazmidorigóján át. Ez növeli a nagy kópiaszámú fenotípus stabilitását.

Hasonló nagy kópiaszámú plazmidok, amelyek tartalmazzák a λΡ, -promotort, de nincsenek átírásbefejezési szekvenciáik, nem stabilak, és hajlamosak elveszíteni nagy kópiaszámú fenotípusukat.

4. Helyettesíthető riboszomális kötőhely

A p8300-10A tartalmaz egy egyedi £coRI-helyet, amely a riboszomális kötőhelytől „felfelé” helyezkedik el, és egy Ndel-helyet, amely a riboszomális kötőhelytől „lefelé” helyezkedik el. így a riboszomális kötőhely két egyedi restrikció hely által van kötve. Ez lehetővé teszi a jelen riboszomális kötőhely (a XC_n riboszomális kötőhely) könnyű kimetszését és tulajdonképpen bármilyen más természetes vagy szintetikus riboszomális kötőhely behelyettesítését anélkül, hogy a plazmid más jellemvonásai változnának. Ez nagymértékben megkönnyíti a kívánt polipeptid optimális kifejeződését.

5. A kifejeződés hővel indukálható szabályozása

A ZP_L-promotor inaktív, amikor a Cj-represszor kötődik hozzá. A cI857-represszor hőérzékeny, vagyis 30 °C hőmérsékleten kötődik a promotorhoz, de 42 °C hőmérsékleten inaktiválódik. így a fermentáció hőmérsékletének felemelésével 42 °C hőmérsékletre a gazdabaktériumok indukálódnak a kívánt fehérje termeléséhez.

HU 214 977 Β

Az ilyen rendszer előnyei a következők lehetnek:

a) Olyan idegen fehérje, amely Escherichia coli-ra toxikus, és termelhető a fermentációs folyamat késői fázisában, ilyen módon kerülve el a korai sejtpusztulást.

b) A fehérje túltermelése stabilizálhatja a fehéijét, megakadályozhatja a proteolitikus lebomlást [Cheng, Y. E. és munkatársai: Gene, 14, 121 (1981)]. így a „pillanatnyi” túltermelés egy olyan szorosan szabályozott promotort, mint a λΡ[ alkalmazva, előnyösebb lehet a folyamatosan alacsony szintű termeléshez viszonyítva.

6. Egyszerűsített indukciós munkamenet

A jelen szabadalmi bejelentésben és a függőben lévő, együtt bejelentett 514,188 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben leírt plazmidok által végzett fehérjetermelést a hőérzékeny cI857-represszor szabályozza.

A függőben lévő, együtt bejelentett, fentebb említett bejelentésben leírt plazmidokhoz szükséges indukciós munkamenet magában foglalja az indukciót 42 °C hőmérsékleten, ezt követi a növesztés 38 °C hőmérsékleten. Ezzel ellentétben a fehéijeszintézis optimális indukciója, amikor a p8300-10A-plazmidot vagy pSAL 130/15-plazmidot, vagy plazmidszármazékait alkalmazzuk, 42 °C-on történik, és ezt azonos hőmérsékleten, vagyis 42 °C-on végzett növesztés követi. Ez szükségtelenné teszi a fermentor hűtési igényét.

7. Riboszomális kötőhely és iniciációs kodon

A kifejeződő vektor tartalmaz egy erős prokarióta riboszomális kötőhelyet (RBS), valamint egy transzlációs iniciációs kodont (ATG). így bármilyen eukarióta gént lehet klónozni anélkül, hogy iniciációs kodont kellene hozzáadni. Ezen túl a hatásos RBS növeli a kifejeződés szintjét. A riboszomális kötőhely a kC_n riboszomális kötőhely. A riboszomális kötőhely szekvenciája a következő:

TAAGGAAGTACTTACAT

ATTCCTTCATGAATGTA Egy bázispár különbözik a vad típusú λ-ban található riboszomális kötőhelytől.

8. Kényelmes restrikciós hely

A kifejeződő vektornak egy egyedi Ndel restrikciós helye van, amely magán belül tartalmazza az ATG iniciációs kodont. Ez lehetővé teszi a kívánt gén megfelelő elhelyezkedését. Az egyedi Mfel-hely közvetlenül a riboszomális kötőhely után található.

9. Nut-hely

Az N-fehérje, amelyet a gazdaszervezet szolgáltat, a Nut-helyhez kötődik a kifejeződő vektoron, és ezáltal megakadályozza az átírás befejeződését a ÍRI -helynél vagy az átírás befejeződését még nem érett állapotban a klónozott génen belül.

Törzsek

A leírt vektorokhoz és plazmidokhoz a megfelelő gazdaszervezetek azok az Escherichia coli-törzsek, amelyek transzformálásra alkalmasak, ilyenek az A1637, A2602, A1563, A1645 [c600 mrgal'thrleulac-bl(kcI857AHlABamHI N⁺)] és A2097(A1645 lacAxA21 proC::TnlO).

22. példa pSAL-130/5

A pSAL-130/5 megalkotását a 8. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben. A pSAL-130/5-öt a p8300-10A-ból nyeljük (ATCC 39785) a met-phe bGH-gént helyettesítve a met-asp-gln bGH-génnel. A met-asp-gln bGH-gént a pGH44-plazmidból (ATCC 39806) nyerjük Wel-el és HindllI-al végzett emésztéssel.

A pSAL-130/5-öt Escherichia coli A1645 törzsbe vezetjük be transzformációval, olyan módszereket alkalmazva, amelyek jól ismertek azok számára, akik a szakterületen átlagosan jártasak. A törzs növesztésre és indukcióra egy szarvasmarhanövekedési-hormonanalógot (bGH) termel, amely egy met-asp-gln aminosavszekvenciával rendelkezik a természetes bGH fenilalanin formájának N-terminálisához hozzáadva.

A pSAL-130/5 által termelt bGH-analóg mennyisége mintegy 39-44%-a a baktériumok által termelt összes fehérjének, amint ezt Coomassie-kékkel festett SDS poliakrilamid gél átvizsgálásával kalkuláljuk (I. táblázat).

A törzs növesztéséhez, a termelt bGH-analóg kinyeréséhez, és a bGH-analóg tisztításához alkalmazott módszerek azonosak azzal, amelyeket a 24. példában írunk le pSAL-170/10-hez.

23. példa pSAL-170/10

A pSAL 170/10 megalkotását a 8. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben.

A pSAL-170/10-et Escherichia coli A1645 törzsbe vezetjük be transzformálással, ismert módszereket alkalmazva. Ez a törzs növesztésre és indukcióra pGHanalógot termel, amely met-asp-gln aminosav-szekvenciával rendelkezik a természetes bGH fenilalanin formájának N-terminálisához hozzátéve.

A pSAL-170/10 által termelt bGH-analóg mennyisége mintegy 40-26%-a a baktériumok által termelt összes fehérjének, amint ezt Coomassie-val festett SDS poliakrilamid gél átvizsgálásával kalkuláljuk (I. táblázat).

24. példa

A pSAL-170/10 növesztése

I. Törzstenyészetek

A pSAL-170/10 törzstenyészetet kazeines tápközegen (lásd az „Inokulum”-nál) növesztjük, majd kétszeresére hígítjuk fagyasztó tápközeggel és -80 °C hőmérsékleten tároljuk. A fagyasztó tápközeg 500 ml-e a következőket tartalmazza:

K2HPO4	6,3 g
kh2po4	1,8 g
Na-citrát	0,45 g
MgSO4-7H2O	0,09 g
(NH4)2SO4	0,9 g
Glicerin	44,0 g

II. Inokulum

Az inokulumot 20 g/1 kazein-hidrolizátumot, 10 g/1 élesztőkivonatot és 2 g/1 NaCl-t tartalmazó tápközeg34

HU 214 977 Β ben szaporítjuk. Rázólombikban steril tápközeget inokulálunk a törzstenyészetből, és 15 órán át inkubáljuk rázógépen, 30 °C hőmérsékleten, és mintegy 200 fordulat/perccel. Amikor ez további lépésekhez szükséges, az inokulum szaporítását kevertetett, levegőztetett fermentorokban hajtjuk végre. A steril tápközeget 2-10% inokulummal inokuláljuk, és 15 órán át inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten, pH 7±0,5-nél, olyan mértékű levegőztetés és kevertetés mellett, hogy az oldott oxigén szintje 20%-os levegőtelítettség fölött legyen.

III. Termelés

A termelő tápközeg a következőket tartalmazza:
Kazein-hidrolizátum	20 g/1
Élesztőkivonat	10 g/1
K2HPO4	2,5 g/1
MgSO4-7H2O	1 g/i
NaCl	5 g/1
Biotin	0,1 g/1
Tiamin	1 mg/1
Nyomelemoldat	3 ml/1
A tápközeg tartalmaz 12,5 mg/liter tetraciklint

A tetraciklin a termeléshez tetszőleges, de mindig megtalálható az inokulum növesztéséhez alkalmazott tápközegben.

A biotint, tiamint és az antibiotikumot koncentrált oldatban külön-külön sterilezzük, és az inokulálás előtt adjuk a steril termelő tápközeghez.. Kezdetben 10 g/1 mennyiésgben adunk steril glükózt a tápközegbe. Az indukciós lépésnél további 10 g/1 glükózt adagolunk.

A nyomelemoldat a következőket tartalmazza:
FeCl3	16 g/1
ZnCl2-4H2O	2 g/1
CoCl2-6H2O	2 g/1
Na2Mo04-2H20	2 g/1
CaCl2-2H2O	lg/1
CuCl2	lg/1
H3BO3	0,5 g/1
Konc. HCI	100 ml/1
A tápközeget 0,5-10%	inokulum-tenyészettel

inokuláljuk, és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A kevertetési-levegőztetési sebességeket úgy állítjuk be, hogy az oldott oxigénszint mindig 20% levegőtelítettség fölött legyen. A pH-t 7,0±0,2 értéken tartjuk NH₃al. Amikor a sejtkoncentráció eléri a mintegy 3,5 g/litert (OD₆₆₀=10), az indukciót elindítjuk.

A hőmérsékletet 42 °C-ra emeljük, és 42 °C hőmérsékleten tartjuk 1-5 órán át. A tenyészetet azután lehűtjük, és a sejteket centrifugálással kinyerjük a hormon tisztításához.

A bGH kinyerése kg baktériumsejtet (nedves szűrőpogácsa) újra szuszpendálunk 5 térfogat, 50 mmol/liter nátrium-foszfát-puffert (pH 7,4), 50 mmol/liter EDTA-t és 100 mmol/liter NaCl-t tartalmazó oldatban Polytron (Kinematica) blenderkeverőt alkalmazva, e közben a keverő sebességét úgy szabályozva, hogy a habképződés minimális legyen. A homogén szuszpenziót folyamatosan engedjük át Dynomill-sejtzúzón (KDS típus, Willy A. Bachofen, Basel) 80 liter/óra sebességgel, és a szétzúzott sejtek homogén szuszpenzióját centrifugálással derítjük CEPA 100 centrifugában 45 liter/óra áramlási sebességnél. A centrifugálási lépés csapadékát összegyűjtjük, és újra szuszpendáljuk 15,5 liter 50 mmol/literes foszfát-pufferban (pH 7,4), amely 50 mmol/liter EDTA-t is tartalmaz. Lizozimot adunk hozzá 0,05 mg/ml végső koncentrációig, és a szuszpenziót 16 órán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten. A szuszpenziót azután 30 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten, ultrahangos kezelésnek vetjük alá folyamatos átáramlású cellás készülékben (Heat System sonificator) 18 liter/óra sebességnél, és centrifugáljuk CEPA 101 centrifugában. A csapadékot összegyűjtjük, újra szuszpendáljuk 50 mmol/literes foszfot-pufferban (pH 7,4), a fentiek szerint ultrahangos kezelésnek vetjük alá, és centrifugáljuk CEPA 101 centrifugában. A sejteket újra szuszpendáljuk 15,5 liter 50 mmol/literes foszfát-pufferban (pH 7,4), amely 50 mmol/liter EDTA-t és 100 mmol/liter NaCl-t is tartalmaz, és kétszer kicsapjuk, majd kétszer újra szuszpendáljuk 15,5 liter desztillált vízben. A csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, és -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

A bGH tisztítása

A csapadékot újra szuszpendáljuk 30—40 liter desztillált vízben, és szolubilizáljuk 0,5 n NaOH-val titrálva, 11,8-ra beállítva. Az oldatot ezután folyamatos ultrahangkezelésnek vetjük alá, és centrifugálással tisztítjuk CEPA 101 centrifugában, ha szükséges, vagy szűrjük Whatman 1-papíron keresztül.

A tisztított fehéijeoldatot (32,6 liter, amely 280 nmnél mérve 297 000 OD egységértéket tartalmaz) külön részletekre osztjuk (6*5,4 liter), mindegyik részlet 50000-60 000 OD egységet tartalmaz. Mindegyik adagot külön-külön ultraszűrésnek vetjük alá Millipore Pellicon ultraszűrőn át, amely három, 100000 molekulasúly-kizárásos kazettával (PTHK típus) van felszerelve, mindegyik kazetta 5 négyzetláb, vagyis 0,456 m² területű. Egy 5,4 literes adagot 1 liter visszamaradó térfogatig koncentrálunk. Az ultraszűrletet összegyűjtjük és tároljuk. A visszamaradt anyagot visszahígítjuk eredeti térfogatára friss, 10 mmol/literes borát-pufferral (pH 11,8), és alaposan összekeveijük. Az adagot ismét 1 liter visszamaradó térfogatig koncentráljuk. Az ultraszűrletet összegyűjtjük, és kombináljuk az első ultraszűrlettel. Amikor az éppen munkában lévő összes ODmennyisége az ultraszűrletben egyenlő lesz a kiinduláskor az ultraszűrletbe táplált összes OD-mennyiség 20%-ával, a visszamaradó térfogatot a következő lépésnél 0,5 liternek vesszük 1 liter helyett. A koncentrálás és 10 mmol/literes borát-pufferral a hígítás ciklusát addig folytatjuk, amíg a 0,5 literes visszamaradó térfogatból származó ultraszűrlet 280 nm-nél 0,1 egységnél kevesebb lesz. Ez normálisan a 9. és 12. koncetrálási-hígítási ciklusnál következik be. A végső visszamaradó oldatot elöntjük.

Az összes ultraszűrletet egyesítjük, és pH 9,0-ra állítjuk be 6 n HCl-al. A többi 5,4 literes adagokat hasonló módon vetjük alá ultraszűrésnek, és az összes, pH-ra beállított ultraszűrletet egyesítjük. Egy tipikus munkamenet összesen 380 liter ultraszűrletet termel 0,26-os

HU 214 977 Β abszorbanciával, ez 100000 OD értéknek felel meg, a művelet összesen 24—40 órát igényel.

A kombinált ultraszűrleteket (380 liter, amely 180 n-mél mérve 100 000 OD-t tartalmaz) a 100K ultraszűrési lépésből Sepharose C1-6B DEAE ioncserélő oszlopra terheljük 23 cm/óra (25 liter/óra) lineáris áramlási sebességgel. A 37 cm átmérőjű, 15 cm magas oszlopot két ágy térfogat (32 liter/10 mmol) literes borát-pufferral (pH 9,0) mossuk. A ráterhelési és mosási lépésekből eredő eluátumát elöntjük. Az eluensben történő lépésváltás 10 mmol/liter borátot és 100 mmol/liter nátrium-kloridot tartalmazó oldatra (pH 9) leszorítja a bGH-t az oszlopról. Az eluálási áramlási sebesség 23 cm/óra. A munkamenet előrehaladását az eluátum abszorbanciájának követésével figyelhetjük 280 nm-nél. A bGH-csúcsot 4-5 ágytérfogatba gyűjtjük össze (84 liter, amely 280 nm-nél mérve 43 000 OD-egységet tartalmaz), majd mintegy 10 mg/ml-re koncentráljuk, Millipore Pellicon ultraszűrő berendezést alkalmazva 10 000 molekulasúlykizárásos kazettával. Az oldatot ezután liofilezzük. A kitermelés mintegy 70 g tiszta bGH.

25. példa

A pSAL-170/10 által termelt bGH-analóg aktivitása

1. A bGH-analóg radioimmunassay összehasonlítása a természetes bGH-val

100 ng/ml bGH-analógot tartalmazó oldatot készítünk foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldatban (1% BSA). Ezt az oldatot sorozathígításnak vetjük alá 50, 25, 12,5, 6,25, 3,12, 1,56 és 0,78 ng/1 koncentrációkra. Ezeknek az oldatoknak 0,1 ml alikvotjait két párhuzamosban RIA-mérésnek vetjük alá, kettősantitest-eljárást alkalmazva. A hígítási görbe jól összevethető azzal, amelyet a természetes bGH-val nyerünk.

2. Radioreceptor-kötési vizsgálat

Radioreceptor-kötési vizsgálatot hajtunk végre nyúlmáj-membránokkal, amint ezt Tushima, T. és Freisen, H. G. leírták [J. Clin. Endocr. Metab., 37, 3 (1973)], ¹²⁵I-bGH-t alkalmazva jelzőként és autentikus bGH-oldatokat alkalmazva a kalibrációs görbe megalkotásához. A mintákat három párhuzamosban inkubáljuk két órán át szobahőmérsékleten 0,3 ml vizsgálati pufferban (50 mmol/liter trisz, 15 mmol/liter CaCl₂ és 5 mg/ml bovin-szérumalbumin, pH 7,6). A csövek ^l25I-bGH-t (20 000 cpm 30-60 pci/pg-os készítményből), 150-250 pg májmembránfehérjét, és vagy természetes bGH-t (1-100 ng), vagy bakteriális bGH kivonatait tartalmazzák. Az eredmények azt demonstrálják, hogy a bGH-analóg bGH-aktivitása összehasonlítható a természetes bGH aktivitásával.

3. Tibia-vizsgálat

A 24. példa szerint nyert bakteriális sejtekből kinyert, pSAL-170/10 által termelt bGH-analóg bioaktivitását tibia-vizsgálattal értékeljük [Parlow, A. F. és munkatársai: Endocrinology, 77, 1126 (1965)]. Patkányok hipofízisét eltávolítjuk 28-30 napos korukban, majd 10-14 napig kezelés nélkül tartjuk ezeket. Szarvasmarha-hipofízisből vagy rekombináns Escherichia coli-ból származó szarvasmarhanövekedési-hormont oldunk 0,15 mol/liter NaCl-t és 0,01 mol/liter borátot tartalmazó oldatban (pH 10,0). Patkányok 4—7 tagú csoportjainak adunk naponta szubkután injekciókat bGHoldatokból (5-125 pg/nap, 0,2 ml-es adagokban) 5 napon át, miközben normál étrenden tartjuk ezeket (Purina Rat-Chow tápszer és víz korlátlan mennyiségben). Az állatokat a 6. napon leöljük, első térdcsontjaikat kivesszük, hosszában elhasítjuk, acetonnal rögzítjük, és 2%-os AgNO₃-oldattal megfestjük. Az epifizeális lemezek szélességét egy kivetítő binokuláron (Nikon) át figyeljük meg. Átlagértékeket (40 leolvasás patkányonként) alkalmazunk a hosszú dózisválaszgörbe megalkotásához. Az eredmények azt demonstrálják, hogy a pHG44 által termelt bGH-analóg bGH-aktivitása összemérhető a természetes bGH aktivitásával.

26. példa

A 3. példában leírt SÓD gazdaszervezetvektorendszerek által termelt humán szuperoxiddiszmutáz kitermelése és aktivitása javítható a gazdaszervezet-vektorrendszerek növesztési körülményeinek módosításával. Amint a következő adatok demonstrálják, a gazdaszervezet-vektorrendszerhez szolgáló növesztő tápközeg kiegészítése Cu-val és/vagy Zn-nel az enzim nagyobb kitermelését eredményezi aktív dimer formában.

A pSOD^(T_n-et tartalmazó baktériumok növesztése I. Törzstenyészetek

A pSODPjTn törzstenyészetet kazeines tápközegen (lásd az ,,Inokulum”-nál) növesztjük, majd fagyasztó tápközeggel kétszeresére hígítjuk, és -80 °C hőmérsékleten tároljuk. A fagyasztó tápközeg a következőket tartalmazza 500 ml-re:

K2HPO4	6,3 g
kh2po4	1,8 g
Na-citrát	0,45 g
MgSO4-7H2O	0,09 g
(NH4)2SO4	0,9 g
Glicerin	44,0 g

II. Inokulum

Az inokulumot 20 g/1 kazein-hidrolizátumot, 10 g/1 élesztőkivonatot és 2 g/1 NaCl-t tartalmazó tápközegben szaporítjuk. A rázólombikban lévő steril tápközeget a törzstenyészetből inokuláljuk, és 15 órán át inkubáljuk rázógépen, 30 °C hőmérsékleten, és mintegy 200 fordulat/perccel. Ha a későbbi lépésekben szükséges, az inokulum szaporítását kevertetett, levegőztetett fermentorokban hajtjuk végre. A steril tápközeget 2-10% lombiktenyészettel oltjuk, és 15 órán át inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten, pH 7±0,5-nél, olyan mértékű levegőztetéssel és kevertetéssel, hogy az oldott oxigén szintje 20% levegőtelítettség fölött legyen.

III. Termelés

A termelő tápközeg a következőket tartalmazza:

Kazein-hidrolizátum 20 g/1

Élesztőkivonat 10 g/1

K₂HPO₄ 2,5 g/1

MgSO₄-7H₂O 1 g/1

NaCl 5 g/1

Biotin 0,1 g/1

HU 214 977 Β

Tiamin 1 mg/1

Nyomelemoldat 3 ml/1

Tetraciklin 12,5 mg/1

Némelyik kísérletnél még a következőket adjuk hozzá:

CuSO₄-5H₂O 0,8 g/1

ZnSO₄-7H₂O 10 mg/1

A biotint, tiamint és a tetraciklint koncentrált oldatban szűréssel sterilezzük, és az inokulálás előtt adjuk a steril tápközeghez. Steril gükózoldatot adunk hozzá a kiinduláskor, 10 g/1 koncentrációra beállítva. Az indukciós lépéskor további 10 g/1 glükózt adunk hozzá.

A nyomelemoldat a következőket tartalmazza:
FeCl3	16 g/1
ZnCl2-4H2O	2 g/1
CoC12-6H2O	2 g/1
Na2Mo04-2H20	2 g/1
CaCl2-2H2O	lg/1
CuCl2	1 g/1
H3BO3	0,5 g/1
Konc. HCI	100 ml/1

A tápközeget 0,3-10% inokulum-tenyészettel inokuláljuk, és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A levegőztetési-kevertetési sebességeket úgy állítjuk be, hogy az oldott oxigén szintje 20% levegőtelítettség fölött maradjon. A pH-t 7,0+0,2 értéken tartjuk NH₃-al. Amikor a sejtkoncentráció eléri a mintegy 3,5 g/litert (OD₆₆₀=10), az indukciót elindítjuk.

A hőmérsékletet 42 °C-ra emeljük, és 42 °C hőmérsékleten tartajuk 1-5 órán át. A tenyészetet azután lehűtjük, és a sejteket centrifugálással kinyerjük az enzim tisztításához.

Az SÓD kinyerése

1,5 kg baktériumsejtet (nedves szűrőpogácsa) szuszpendálunk 12 liter 50 mmol/literes nátrium-foszfát-oldatban (pH 7,8), Politron- (Kinematica) keverőben, miközben a sebességet úgy szabályozzuk, hogy a habképzés minimális legyen. A homogén szuszpenziót folyamatosan átengedjük Dynomill-sej tzúzó berendezésen (KDS típus, Willy A. Bachofen, Basel). A szétzúzott sejtek homogén szuszpenzióját ultrahangos kezelésnek vetjük alá, folyamatos átáramlású cellát alkalmazva, és CEPA 101 centrifugán centrifugáljuk. A felülúszót 2 órán át 65 °C hőmérsékleten hevítjük, majd hűtjük és centrifugáljuk az előzővel azonos módon. A tiszta felülúszót 1 literre koncentráljuk Millipore Pellicon ultraszűrő készüléken, 100000 molekulasúlykizárásos kazettát (PTGC típus) alkalmazva. A koncentrált fehérjeoldatot átengedjük DEAE-cellulózoszlopon (2 kg DEAE Sepharose), amely 150 mmol/literes nátrium-foszfát-puferral van kiegyensúlyozva (pH 7,8). Az átáramlott oldatot összegyűjtjük, koncentráljuk, és dializáljuk Pellicon ultraszűrő berendezésben 20 mmol/literes trisz-HCl-el (pH 7,8) szemben, majd QAE-Sepharose-oszlopra visszük rá, amely 20 mmol/literes trisz-HCl-pufferral van kiegyensúlyozva. Az oszlopot 20 mmol/literes trisz-HCLpufferral (pH 7,8) és sógradienssel (0-200 mmol/liter NaCl) fejlesztjük ki. Az SOD-tartalmú frakciókat összegyűjtjük, Pellicon ultraszűrő berendezést alkalmazva koncentráljuk, desztillált vízzel szemben dializáljuk, majd nátrium-acetátra 100 mmol/literessé tesszük 1 mol/literes nátrium-acetát-puffer (pH 4,8) hozzáadásával. A fehérjeoldatot azután tovább szeparáljuk 100 mmol/literes nátrium-acetát-oldattal (pH 4,3) kiegyensúlyozott CM-Sepharose-oszlopon. Az oszlopot ugyanezt a puffért és sógradienst (100-500 mmol/liter NaCl) alkalmazva fejlesztjük ki. Az SOD-t tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, Pellicon ultraszűrő berendezést alkalmazva koncentráljuk és liofílezzük.

27. példa

A baktériumok által termelt SÓD enzimes aktivitása

A 26. példa szerint baktériumok által termelt tisztított humán SÓD (hSOD) standard növekedési körülmények között (azaz többlet-CuSO₄ hozzáadása nélkül) csak 5%-os enzimaktivitással rendelkezik a szarvasmarha Cu/Zn SOD-vel összehasonlítva. A fémtartalom elemzése arra a felismerésre vezet, hogy az enzim kevés Cu-t tartalmaz, és hogy ez csupán 8%-a az elvárt értéknek. Ezenkívül az is látszik, hogy a Cu⁺⁺-helyek jó részét Zn-ionok helyettesítik, mivel a fehérje a szükséges Zn csaknem kétszeresét tartalmazza. A teljesen fémmentes fehérje, amelyet a bakteriálisán termelt hSOD-ből állítunk elő, azonban visszanyeri lényegében teljes enzimes aktivitását oldatban végzett helyreállításra. Az oldat mind Cu⁺⁺-t, mind Zn⁺⁺-t tartalmaz, mindegyiket 1,2 molion/mol aktívhely-koncentrációban (IV. táblázat).

A bemutatott adatok azt sugallják, hogy a Cu⁺⁺sejten belüli koncentrációja korlátozott és nem elegendő, hogy telítse a termelt hSOD-t. Egy kísérletsorozatban demonstráljuk, hogy a megemelt Cu⁺⁺-koncentrációk a növesztő tápközegben növekedést okoznak a hSOD fajlagos aktivitásában. Sőt, a 200 ppm Cu⁺⁺-val kiegészített kazein-hidrolizátumon nőtt E. coli (26. példa) indukció után teljesen aktív hSOD-t termel, a fémek természetes összeállításával és teljes enzimes aktivitással (IV. táblázat). További kísérletek azt demonstrálják, hogy a hatás azonos, amikor exogén Cu⁺⁺ 50-250 ppm közti tartományban lévő mennyiségét adjuk hozzá. Hasonló hatást látunk LB(Luria Broth) tápközeggel is, 75 ppm Cu⁺⁺-al kiegészítve.

Az SOD-koncentrációt Lowry módszerével határozzuk meg [Lowry, Ο. H., Rosebrough, N. J., Faré, A. L. ésRandall, R. J.: J. Bioi. Chem., 193,265-275. (1951)], standardként bovin szérumalbumint alkalmazva. A ferricitokróm-c redukciója gátlását megfigyelő aktivitásmérést úgy hajtjuk végre, ahogyan ezt McCord és Fridovich leírták [McCord, J. M. és Fridovich, I.: J. Bioi. Chem., 244, 6049-6055. (1969)]. A Cu- és Zntartalmat tiszta SOD-készítményekben atomabszorpcióval határozzuk meg. Az SOD-apo enzimet Weser és Hartmann szerint állítjuk elő [Weser, U. és Hartmann, H. J.: FEBS Lett., 17, 78-80. (1971)], és a helyreállítást Cu és Zn egyidejű hozzáadásával hajtjuk végre [Jewett, S. L., Latrenta, G. S. és Beck, C. M.: Arch. Biochem. Biophys., 215, 116-128. (1982)].

HU 214 977 Β

IV. táblázat

SOD-készítmények aktivitása és fémtartalma

	Mol/alegység	Aktivitás, egység/mg
Fehérje	Cu	Zn
hSOD'	0,07	1,62	167
Apo-enzim	0,01	0,02	0
Helyreállított SÓD	0,81	0,88	2931
hSOD2	0,88	0,90	2730
szarvasmarha SÓD	0,97	1,01	2805
hSOD (Sigma)			1606

¹ A 26. példában leírt módon készített hSOD. Az alkalmazott tápközeg nem tartalmaz hozzáadott Cu⁺⁺-t és Zn⁺⁺-t.

² A 26. példában leírt módon készített hSOD. Az alkalmazott tápközeg tartalmaz hozzáadott Cu⁺⁺-t és Zn^{1 +}-t.

28. példa

A bakteriálisán termelt hSOD amino-terminális szekvenciája

A 26. példában leírt módon előállított tisztított SÓD amino-terminálisánál lévő 5 aminosav-szekvenciáját Edman-lebontással határozzuk meg. Ez az aminosavszekvencia azonos azzal, amelyet a humán Cu/Zn SÓD N-terminálisánál meghatároztak, vagyis Als-Thr-LysAla-Val. Ez bizonyítja a bakteriális termék autentikus voltát. Ennek megfelelően úgy tűnik, hogy az oldható hSOD hozzáférhető az E. coli működő enzimjei számára, amelyek eltávolítják az N-terminális metionint.

Az alábbiakban röviden megtárgyaljuk a bakteriális hSOD-vel kapcsolatos eredményeket.

Azt demonstráljuk, hogy a baktériumok, amelyek nagy mennyiségű hSOD termelésére vannak indukálva, amikor LB- vagy kazein-hidrolizátum tápközegen nőnek, enzimesen inaktív feltétjét termelnek. Az így nyert fehéije aktiválható helyreállítással és a hiányzó Cu'+-, Zn⁺⁺-ionok visszaadásával. Nem várt módon a baktériumokat lehet indukálni enzimesen aktív hSOD termelésére olyan módon, hogy olyan tápközegen növesztünk, amely ki van egészítve Cu⁺⁺-val. Bár nem kívánjuk a kérdést elméleti megfontolásokhoz kötni, úgy hisszük, hogy a dús tápközegek (mint az LB- és a kazeinhidrolizátum) bizonyos komponensei kelátot képeznek a rendelkezésre álló réz nagy részével úgy, hogy a baktérium számára nem áll rendelkezésre elegendő réz, hogy betöltse az SOD-molekulákban, amelyek emelt szinten termelődnek, levő összes helyet. 50-250 ppm Cu⁺⁺-ion hozzáadása a baktériumokon belül olyan szintre, amely elegendő az összes Cu¹+ szolgáltatásához, amely a humán Cu/Zn SÓD túltermeléséhez szükséges.

29. példa

A reperfúziók okozta sérülések csökkentése rekombináns humán szuperoxid-diszmutázzal általános iszkémiát követően

A gazdaszervezet-pSODP|T_lrvektorrendszer által a 3. példában leírt E. coli 1645-ben termelt, a 26. példában leírt körülmények között növesztett és tisztított humán szuperoxid-diszmutázról kimutatható, hogy csökkenti az általános iszkémiát követő reperfúziók okozta sérüléseket.

Izolált, perfúziónak alávetett nyúlszívkészítmény

New Zealand nőstény fehér nyulakat (1,5-2,0 kg) heparinnal kezelünk és érzéstelenítünk, szívüket eltávolítjuk és gyorsan hideg (4 °C) hőmérsékletű perfúziós oldatba helyezzük. A felmenő aortát kanüllel zárjuk, és a szíveket állandó nyomás alatt (110 vízcentiméter) perfúziónak vetjük alá módosított Krebs-Ringer bikarbonát-puffer-oldatban, amely 117 mmol/liter nátrium-kloridot, 6 mmol/liter kálium-kloridot, 3,0 mmol/liter kalcium-kloridot, 1,0 mmol/liter magnézium-szulfátot, 0,5 mmol/liter EDTA-t és 16,7 mmol/liter glükózt tartalmaz, és a végső pH 7,40-re van beállítva mintegy mmol/literes nátrium-bikarbonát hozzáadásával. A perfúziós oldatot folyamatosan buborékoltatjuk 95% oxigént és 5% széndioxidot tartalmazó gázkeverékkel. A koszorúér-átfolyást eltávolítjuk az NMR mintacsőből vákuumos leszívással. A szíveket beütemezzük 175 verés/percre jobbkamrai beütemezéssel, telített káliumkloridban áztatott gézzel, amely polietiléncsőbe van illesztve és Grass SD-9 stimulátorral van összekötve. Hogy hozzámérjük a balkamrai összehúzó frakciót, egy kaucsuk-gumiballont kötünk egy 100 cm hosszú PE 190 cső végére, gondosan megtisztítjuk a levegőbuborékoktól, és egy háromutas záródugón keresztül összekötjük Statham P23Db transzduktoral. Izovolumetriás nyomást mérünk Brush kétcsatornás közvetlen írásrögzítővel. A ballont kezdetben egy fecskendőn keresztül olyan térfogatú fiziológiás sóoldattal fújjuk fel, amely elegendő 10 Hgmm (1,3 · 10³ Pa) végső diasztolés nyomás előállításához. A kifejlesztett nyomás összes ezt követő mérését ennél a végső diasztolés térfogatnál méijük. Az összes szívet 30 perces általános iszkémiának vetjük alá, amely idő alatt a szíveket 37 °C hőmérsékleten tartjuk, meleg perfúziós oldatot áramoltatva a szív körül. Az aortás beáramlás teljes megszakítását végezzük el olyan módon, hogy keresztben leszorítjuk a perfúziós vonalat. 45 perces, normális hőmérsékletű újabb perfúzió követi az iszkémia periódusát. A balkamrai kifejlődött nyomás visszaállását úgy kalkuláljuk, mint az iszkémia előtti kontroll százalékát. Az iszkémia kezdeténél a ballont leeresztjük, és a beütemezőt elcsavatjuk. A ballont 15 perccel a kiindulási leapasztás után újra feltöltjük, éppen a működés első mérése előtt, ugyanolyan térfogattal, mint amelyet az iszkémia kezdeténél eltávolítottunk. A koszorúér-véráramot térfogatosan mérjük vákuumleszívással az iszkémia előtt, 5 perccel a leapasztás után és 15, 30 és 40 perccel az újabb perfuzió után.

Magmágneses rezonanciás (NMR) módszerek ³¹P NMR-spektrumokat nyerünk Brucker WH

180 spektrométerben 4,23 Teslánál egy széles furatú szupravezető mágnesben. Ennél az erőtérnél a foszfor 72,89 MHz-nél rezonál. A foszforszonda átmérője mm. Ez a berendezés lüktető Fourier-transzformált módon van irányítva, és hozzá van illesztve egy Nocolet 1280 számítógéphez, és az adatok nagy sűrűsé38

HU 214 977 Β gű mágneslemezen vannak összegyűjtve. A szupravezető mágnes térstabilitása miatt mező/frekvenciazár nem szükséges. 5 perces proton kioldott spektrumokat veszünk fel a tranziensekből a két másodperces intervallumoknál szolgáltatott 45°-os lüktetéseket követően, ezekről a körülményekről már korábban leírták, hogy minimális spektrális telítettséget eredményeznek. Az adatokat összegyűjtjük egy 2K táblán egy 3000 Hz-es spektrális sebességnél.

A szövet sejten belüli pH becslése az NMRsepktrumokból:

A sejten belüli pH mértékét a szerves foszfátcsúcs kémiai eldolódásából (δ_ο) határozzuk meg a következő egyenlet alapján:

δ_ο-δ_Β pH, = pK - lóg —— θΑ-θΟ

Abból a célból, hogy minimálissá tegyük a szövet inhomogenitásának hatásait, a kémiai eltolódási értékeket a foszfokreatin rezonanciájához viszonyítva mérjük, amely viszonylag független a pH-tól a jelen tanulmányokban előforduló pH-tartományban (pK_A=4,6). Az ebben az egyenletben alkalmazott konstansok: pK=6,90, δ_Α=3,290 ppm és δ_Β=5,805 ppm, amint ezt korábban leírták.

A metabolitok mennyiségi értékelése az NMRspektrumokból:

A szöveti foszfokreatin (PCr), adenozin-trifoszfát (ATP), valamint szervetlen foszfát (Pi) becslését az egyedi csúcsok alatti terület planimetriás mérésével nyerjük, amely lehetővé teszi a számítógép számára, hogy meghatározza a normalizálási állandót vagy kalibrációs tényezőt. Heweltt-Packard digitális átalakítót alkalmazunk, hogy végrehajtsuk a terület integrálását. A PCr-hez, ATP-hez és Pi-hez tartozó, így létrejött kvantitatív adatokat az iszkémia előtti kontrolltartalom százalékában fejezzük ki.

Kísérleti munkamenet szívet két csoportra osztunk:

I. csoport (n=8). Az ebben a csoportban lévő szíveket 60 000 egység humán rekombináns humán szuperoxiddiszmutázzal kezeljük (hSOD, fajlagos aktivitás 3200 nemzetközi egység/mg), 10 ml-es kapszulában bezárva éppen a visszatöltés előtt, ezt követi 60000 egység folyamatos infúziója a visszatöltés első 15 percében; a hSOD-t meleg, 37 °C hőmérsékletű Krebs-Ringer bikarbonát-pufferban oldjuk.

II. csoport (n=9). Az ebben a csoportban lévő szívek 10 ml-es kapszulában perfúziós oldatot kapnak éppen a visszatöltés előtt, ezt követi egy normál hőmérsékleten végzett reperfüzió.

Az eredményeket az alábbiakban szemlétetjük.

A balkamrai működés visszaállítása

A jelen tanulmányban alkalmazott kísérleti iszkémiás modellt speciálisan úgy választottuk ki előzetes tanulmányok sora után, hogy olyan szíveket szolgáltasson, amelyek mérsékelten súlyos irreverzibilis károsodásban szenvednek, és még megőrizték a lehetőséget a javulásra, terápiás beavatkozásra. A visszatöltés 45 percének végén a balkamrai működés visszaállása (amint a kontroll kifejlesztett nyomás százalékos kinyerése alapján mérjük) 47±5% a kontrollcsoportnál 48±7 Hgmm (6,244±0,13T0³ Pa) diasztolés végnyomásnál [összehasonlítva az iszkémia előtti 10 Hgmm (1,3-10³ Pa) kontrollértékkel]. Ezek a paraméterek nem változnak lényegesen a reprefúzió 30. és 45. perce között, azt sugallva, hogy a gyógyulásnak viszonylag állandósult állapotát érjük el. A hSOD beadása éppen a visszatöltés előtt és a reperfüzió első 15 percében a szívműködés jelentősen megnövekedett megőrzését eredményezi, és a diasztolés végnyomás kisebb növekedését a kontrollszívekkel összehasonlítva; a hSOD-vel kezelt szívek a kontroli kifejlesztett nyomás 71,6%-át visszanyerik, mindössze 27±4 Hgmm (3,12±0,1010³ Pa) diasztolés végnyomásnál (mindkét esetben P<0,01 a kontrollal szemben).

A szívizom metabolizmusa az iszkémia és az ezt követő reperfüzió során

A szívizom nagy energiájú foszfáttartalmát méljük sorozatban az iszkémia és az ezt követő reperfüzió során mind a kontroliban, mind a hSOD-vel kezelt szívekben. A 30 perces iszkémiás periódus során fokozatos csökkenést figyelünk meg a szívizom kreatin-foszfát- és ATPtartalmában. A foszfokreatin-tartalom leesik az iszkémiás periódus végén az iszkémia előtti alapvonal-érték 8,3%-ára a kontrollszívekben és 10,5%-ára azokban a szívekben, amelyeket majd hSOD-vel kezelünk; az ATP-tartalom az alapvonal-érték 36,6%-át éri el a kontrollszívekben és 33,6%-át a hSOD-vel kezelendő szívekben. Ezek az adatok világosan világosan jelzik, hogy a szívek mindkét csportja egyformán súlyos mértékű iszkémiának van kitéve. Ezek az adatok elvetik annak a lehetőségét, hogy a hSOD-t kapott szívek azért mutatnak jobb működési visszanyerést, mert a sejt-metabolizmus jobban megőrződik az iszkémiás időszak során bizonyos nem szabályozott mechanizmusok révén.

A 45 perces visszatöltési periódus végén a hSOD-vel kezelt szívek közel normális foszfokreatin-tartalmat mutatnak (93±9%-a a kontrollnak), míg a kontrollszívek az eredeti értéknek csak 69±7%-át nyerik vissza (P<0,05). A visszatöltési periódus végén az ATP-tartalom azonos a szívek mindkét csoportjánál (41±4% a kontroliban és 42,5±5% a hSOD-vel kezelt szívekben). Ez az utóbbi eredmény tükrözheti a jobb balkamrai működést visszanyerő szívek megnövekedett energiaigényét a nagy energiájú foszfáttermelés megnövekedett sebességére való korlátozott képesség jelenlétében. Ezzel elleniében a működés szerényebb visszanyerése a kontrollszívekben a nagy energiájú foszfát-metabolitok kisebb hasznosítását eredményezi, valószínűleg palástolva a még súlyosabb korlátozást az energiatermelésben.

Következésképpen ezek az adatok azt demonstrálják, hogy a mérsékelten súlyos iszkémiás károsodásnak és az ezt követő reperfűziónak kitett szívekben a hSOD beadása éppen a reperfüzió előtt vagy annak korai szakaszában a szisztolés és diasztolés működés jobb visszanyerését, valamint a foszfokreatin nagyobb szívizombeli tartalmát eredményezi. Ezek az eredmények azt is sugallják, hogy az iszkémiás szívizom reperfüziója szerkezeti és/vagy működési károsodási tüneteket is idézhet elő, amelyet el lehet kerülni vagy csökkenteni

HU 214 977 Β lehet egy oxigén-szabadgyököt eltüntető anyag, például hSOD beadásával a reperfúzió idején. így a visszatöltési iszkémiás szívizom újra oxigénnek kitevésének eredménye, a hSOD értékes többletet nyújt a trombotikus terápiához és/vagy a szívkoszorúér angioplasztikához azokban a betegekben, akiket korábban akut szívizominfarktus során kezeltek.

30. példa

Csökkenés a kísérleti infarktus méretében rekombináns humán szuperoxid-diszmutáz beadására a reperfuzió során

A 3. példában leírt, E. coli A1645-ben lévő pSODp₁T₁₁ gazdaszervezet-vektorrendszer által termelt humán szuperoxid-diszmutázról, amelynél a növesztés és a tisztítás a 26. példában leírt módon történt, kimutatjuk, hogy csökkenti az infarktus méretét a szívben.

Az iszkémiás szívizom alkalmas reperfúziója csökkenti az infarktus-méretet (IS); ez az előnyös hatás azonban eltompul a visszatöltési sérülés egyidejű előfordulása mellett, amelyet a toxikus oxigén-szabadgyökök képződése idéz elő. Hogy megvizsgáljuk, vajon a szabadgyökök felemésztése rekombináns humán szuperoxid-diszmutázzal (hSOD) eredményezheti-e az IS csökkenését, összehasonlítva a reperfuzióval egyedül, érzéstelenített kutyában a circumflexus szívkoszorúér artériát elzárjuk bármelyik oldalelágazás előtt 90 percre; a reperfúzió idejekor az állatokat injektáljuk vagy hSOD-vel (400 000 egység egy kapszulában a bal pitvarba, ezt követi 300000 egység 1 órás intravénás infúzió formájában, n=8), vagy hasonló mennyiségű sóoldattal (kontroll, n=8). A mellkast ezután záquk, és az állatokat hagyjuk magukhoz térni. 48 óra múlva a kutyákat elpusztítjuk, és a szívüket vak módszerrel IS-értékelésnek vetjük alá általános patológiás mérést és a károsodott terület mérését végezve post mortem angiográfiával. A circumflexus artéria proximális elzárása a bal szívkamra (LV) 40,8+2,3%-os iszkémiáját eredményezi a kontroliokban és 41,8+2,0%-os iszkémiáját a kezelt kutyákban. A kontrollkutyákban a reperfuzió 52,2+7%-os veszélyeztetett területű infarktussal társul; a hSOD-kezelés azonban a nekrózis jelentős csökkenését idézi elő, az IS 33,6+2,1% veszélyeztetett területre terjed ki. A kontrollállatokban összefüggő, nem transzmurális infarktus fejlődik ki, amely kiterjed a veszélyeztetett terület legnagyobb részén keresztül, míg a kezelt állatokban az infarktus foltokban, nem összefüggően tűnik fel. Következésképpen a reperfúzió ideje alatt beadott hSOD által végzett szabadgyök-elnyelés jelentősen csökkenti a nekrózis kiterjedését, valószínűleg a visszatöltési sérülések megakadályozása révén.

31. példa

Az oxigén-szabadgyökök szerepe a hideg, tartósított, iszkémiás vesék reperfúziós sérüléseinek közvetítésében (Az ebben a példában alkalmazott rövidítések: C_CR: kreatinin-felszabadulás; ATP: adenozin-trifoszfát; ADP: adenozin-difoszfát; AMP: adenozin-monofoszfát.)

Egy új alkalmazási területen a humán szuperoxiddiszmutáz csökkentheti a reperfúziós sérüléseket a szervek transzplantációját követően. Az itt következő példa azt demonstrálja, hogy a szuperoxid-diszmutáz enyhíti a vese transzplantációját követő reperfüziónál fellépő sérüléseket. Az ebben a példában alkalmazott humán szuperoxid-diszmutázt a pSODpjTn gazdaszervezetvektorrendszer termelte, a 3. példában leírt E. coli A1645-ben, a növesztés és tisztítás a 26. példában leírt módon történt.

A zárójelben lévő arab számok, amelyek ebben a példában találhatók több helyütt, a jelen példa végén található bibliográfia számaira utalnak.

A vese tartósítási és átültetési iszkémia modellje sertésekben

Nőstény, tenyésztett, 15-18 kg-os sertéseket előkezelünk acepromazinnal és atropinnal, és érzéstelenítünk ketaminnal és halotánnal. A donorsertésekben diurézist alakítunk ki 30 perccel a begyűjtés előtt 1500 ml Ringer-féle laktát, 20 mg furoszemid és 12,5 g mannit beadásával. Fenoxi-benzamint (50 mg) adunk be intravénásán, hogy megakadályozzuk a vese-érgörcsöt, amely gyakran észlelhető sertésekben. Egy középvonali hasi metszésen át a disztális aortát és a véna cava-t mobilizáljuk, éppen proximálisan az elágazásuktól. Az ur tereket elvágjuk és elosztjuk a húgyhólyag szintjénél. Beáramló katétert helyezünk az aortába, éppen az elágazás fölött, és egy kimenő katétert helyezünk el a felső véna cava-ba. 5000 egység heparint adunk be intravénásán és folyamatos áramlást indítunk be Euro-Collins-oldattal 4 °C hőmérsékleten a disztális aortán át, az aorta kereszt-leszorításával egybeesőén, éppen a veseartéria fölött. Miután a veséket lehűtöttük in situ, eltávolítjuk mindenestől. A veséket ezután elkülönítjük, és egyet kontrollnak nevezünk ki, egyet vizsgálati vesének, így megkönnyítjük a párban történő tervezést. Ezután mindegyik vesét újra átáramoltatjuk 4 °C hőmérsékleten Euro-Collins-oldattal. Amikor a munkamenet szükségessé teszi, vizsgálandó anyagokat adunk a második vese tartósítófolyadékába ekkor. Mindkét vesét sterilen becsomagoljuk, és 4 °C hőmérsékleten egy éjszakán át tároljuk.

órás hideg-iszkémia után friss befogadó állatot érzéstelenítünk, és a tartósított veséket transzplantáljuk ennek hasüregébe. Az egyes anasztomózisokhoz szükséges idő 25-30 perc. Mindig a kontroll (kezeletlen) veséket transzplantáljuk először, a vizsgálati vesét másodszor. A vizsgálati vese reperfuziója ezért összesen egy órával van a kontrollvese reperfuziója mögött. Ez azt jelenti, hogy a kontrollveséket 23 órás hidegiszkémiának tesszük ki, a vizsgálati veséket 24 órásnak. Az SOD-analógot íntra-artériásan adjuk be, egy órával a kontrollvesék reperfuziója után kezdve, a vizsgálati vesék reperfüziójakor. így a kontrollveséket az újramelegítés és reperfúzió toxikus hatásának tesszük ki egy órával azelőtt, mielőtt a vizsgálati vese számára adandó szerek bármilyen lehetséges hatásának kitennénk. A második vese reperfüzióját követően a befogadó sertés natív veséit eltávolítjuk. További 10 g-os adag mannitot adunk először a kontroll reperfúziója előtt,

HU 214 977 Β majd a vizsgálati vese reperíüziója előtt újra, hogy utánozzuk a klinikai gyakorlatot. Ez lehetővé teszi a szabadgyök-módosító szerek hatásának értékelését, amelyek többletet jelentenek a hagyományos, optimális tartósítási/transzplantációs technikákhoz képest. Az urétert az egyes vesékből külön-külön kivezetjük, mint bőr alatti uréter-hugyvezetéket.

A transzplantáció után két nappal a befogadó sertést enyhén érzéstelenítjük, és vizeletet gyűjtünk egy órán át mindegyik veséből (uréter-hugyvezetéken át) külön-külön, és mérjük a térfogatot és a kreatinin-koncentrációt. Meghatározzuk a szérum kreatinin koncentrációjtá is, lehetővé téve a kreatinin-felszabadulás kiszámolását mindkét veséből külön-külön.

Mindegyik eredményt átlagban fejezzük ki ±SEM. Az adatokat Student t-vizsgálat (kétfarkú) útján elemezzük. Legtöbb esetben a párban végzett vizsgálatot tudjuk alkalmazni a kísérletek páros tervezése következtében.

A kísérleti munkamenet a következő:

Szuperoxid-diszmutáz (SÓD) és kataláz

Sigma-gyártmányú szarvasmarhavér szuperoxiddiszmutázt, mint oxigén-szabadgyökök elnyelőjét, vezetjük be a vizsgálati vesékbe négy sertésben. Egy 5 mg-ot tartalmazó ampullát adunk be a veseartériába közvetlenül a reperfúzió előtt, és állandó intra-artériás infúziót tartunk fent 1 mg/perccel a reperíüzió első 15 percében. Ez 20 mg SÓD teljes dózisát nyújtja.

Egy négy sertésből álló második csoportban a vizsgálati vesék katalázt (Sigma Co. gyártmánya) kapnak azonos adagolási rendben az SOD-n kívül. A sertések mindegyikében a másik vese nem kap kezelést, ezek szolgálnak kontrollként.

Dózisválasz SOD-re

Abból a célból, hogy meghatározzuk a maximális védelmet szolgáló minimális dózist, tanulmányozzuk a dózisválasz kapcsolatot. Az érrendszer helyreállításánál az egyik vese két dózis kisebbikét jelentő infúziót kapja, míg a másik vese a következő magasabb dózist. A 9. példában leírt módon előállított humán rekombináns SOD-t adunk be, amint fentebb leírtuk. Mindegyik dózistartományban két összehasonlítást végzünk. Az elsőben 0,2 mg SOD-t hasonlítunk össze a kontrollal. Lépésről-lépésre haladva 0,2 mg-ot összehasonlítunk 2 mg-al, 2 mg-ot összehasonlítunk 20 mgal, végül 20 mg-ot 100 mg-al. Mindegyik esetben úgy végezzük a transzplantálást, hogy a kisebb dózist befogadó vesét transzplantáljuk először, abból a célból, hogy elkerüljük az SOD-visszatartás lehetséges problémáját a vérkeringésben a második transzplantáció idejében.

Az eredményeket az alábbiakban szemléltetjük.

A szarvasmarha SÓD és kataláz hatása

A kreatinin-felszabadulás egy normál egyedi vesénél a miáltalunk alkalmazott méretű sertésekben az érzéstelenítés és vízfelvétel fenti körülményei között 25,5±6,3 ml/perc (N=8). Az SÓD beadása 20 mg-os adagban a veseartériába a reperfúzió első 15 percében lényegesen javítja a veseműködés leromlását a hidegiszkémia után. Az SOD-vel egyedül kezelt négy vese kreatinin-felszabadulása 23,2±4,5 ml/perc, amely csaknem háromszorosa a kontrollvesék hasonló értékeinek (8,4±1,7 ml/perc, p<0,05). Az SÓD és kataláz kombinációja hasonló, de nem nagyobb, védelmet nyújt (C_Cr=19,0±4,5 ml/perc). A korai modellkísérletekben négy sertés elkülönített csoportját transzplantációnak vetjük alá 40 percet meghaladó anasztomózisos időn át. Bár a veseműködés SÓD és kataláz együttes beadásráa jelentősen növekedik ezekben az állatokban, mind a kezelt, mind a kontrollveséknek nagyon gyenge a működése (C_cr=4,8±0,8 az l,6±0,4 ml/perchez viszonyítva). Ezekben a vesékben, amelyek valószínűleg sokkal súlyosabb sérülésnek voltak kitéve magának a reperfúzió előtti iszkémiának következtében, a szabadgyökös sérülések módosítása már nem volt képes helyreállítani a normális veseműködést.

Humán SOD-analóg dózisválasz összefüggése

Humán SOD-analóg (0,2 mg és 2 mg) infúziója nem nyújt javulást a veseműködésben a kontrollokhoz viszonyítva. Azoknak a veséknek az átlagos kreatininfelszabadulása, amelyek 20 mg SOD-analógot kapnak, 14,2±1,1 ml/perc, ez lényegesen jobb, mint a páijaiké, amelyek 2 mg-os infúziót kapnak (7,7±l,0 ml/perc, p<0,05). További előnyök nem jelentkeznek 100 mg SOD-analógnál (C_cr=16,1±1,2 ml/perc). Ennél fogva az SOD-analóg minimális hatásos dózisának a több mint 2, és kevesebb mint 20 mg bizonyul, amikor ilyen módon adagoljuk be. A humán SOD-analóg éppen olyan hatásos, mint a szarvasmarha-SOD.

Az alábbiakban megtárgyaljuk a fenti eredményeket.

A páros tervezést alkalmazzuk, hogy maximálisan kihozzuk a különbségeket, amelyek az alkalmazott kezelési menetrendnek tulajdoníthatók, és szabályozzuk a zavart keltő változókat, amelyek az egyes donor- és befogadó állatokra vonatkozhatnak. így az eredmények páros statisztikai elemzését tudjuk adni, amely lehetővé teszi a viszonylag drága kísérleti állatok optimális alkalmazását.

Ezeknek a tanulmányoknak a feltűnő felfedezése a szabadgyökök által közvetített reperfüziós sérülések eltüntetése által nyújtott előny nagysága. Annak a ténynek ellenére, hogy a kontrollvesék a hagyományos optimális módszerek előnyeit kapták a szervtartósításhoz, beleértve az egészséges donorveséket és befogadó állatokat, a vízellátást, az alfa-adrenerg blokkolókat és a diurézist, ezek súlyos működési zavarokat mutatnak, a kreatinin-felszabadulás szintje például a normális érték kevesebb, mint harmadára csökken. Az iszkémiás tárolásnak ez a 24 órás időtartama, amint ez gyakran megtörténik hagyományos klinikai körülmények között, meghaladja a hagyományos szervtartósítási képességeket. A kezelés hatásos dózisú szarvasmarha- vagy humán SOD-analóggal drámai hatású ennek a sérülésnek a megelőzésében, megőrizve a vesefunkciót csaknem normális szinten. Sőt, nem egy ilyen módon kezelt vese legalább kétszeres kreatinin-felszabadítási értéket mutat, mint a vele párban lévő kezeletlen kontroll, amikor a transzplantáció után 48 órával méijük. Ennek az előnynek a nagyságrendje ezért kvantitatíven nagyobb,

HU 214 977 Β mint amelyet másoknál látunk 45-60 perces meleg íszkémiát követően. Ez azt sugallja, hogy hagyományos optimális megőrzési technikákkal az önmagában való iszkémia következtében fellépő sérülés minimális lesz, lehetővé téve, hogy a reperíüziónál előállított sérülés váljon uralkodóvá. Ezt a szemléletet tovább támogatják a reperfuzió előtt 18 órával megőrzött vesékkel végzett tanulmányok. Ezekben a vesékben a működés kiváló mind a kontroliban, mind a kezelt csoportban, azt sugallva, hogy nem telik el elegendő idő, amely lehetővé teszi elég metabolit felhalmozódását, amely létrehozná a szabadgyökök képződéséhez kedvező feltételeket a reperfuziónál. Másrészt, amikor a veséket súlyosabb mértékű, önmagában való iszkémiának tesszük ki, mint a korai mintakísérletekben megnyújtott anasztomózis (azaz meleg iszkémia) időkkel, az SÓD nem képes helyreállítani a működést a közel normális szintre, bár jelentős javulás látható azért. Ezek a vesék ezért inkább analógok azokkal a vesékkel, amelyeket meleg iszkémia rövidebb periódusai után tanulmányoztak (7, 8, 9). Mint más szervekben, a szabadgyök okozta sérülések elkerülésének előnyei elsősorban azoknak a sérüléseknek a relatív arányaira vonatkoznak, amelyek magának az iszkémiának tulajdoníthatók, összehasonlítva a reperfüziónak tulajdonítható sérülésekkel.

Ezen túl az előny ilyen növekedésének elérése, úgy tűnik vagy teljes mértékben megvalósul, vagy egyáltalán nem. Az SOD-vel végzett dózisválasz-tanulmányok vagy maximális védelmet mutatnak, vagy egyáltalán nincs semmiféle védelem. A kataláz nem nyújt további előnyöket, ha az SOD-hez mint egyedi anyaghoz adjuk. A jelen találmány megoldásának kvantitatív korlátain belül a reperfiíziós sérülés megelőzése, úgy tűnik, minden vagy semmi jellegű tünet.

A jelen találmány felfedezései azonban, úgy tűnik, főleg a klinikai alkalmazáshoz lényegesek. A választott hideg iszkémia 24 órás periódusa jól megfelel a klinikai körülmények által megkövetelt tetem szövetátültetési megőrzési periódusnak. Ezenkívül a találmányok kiértékelik a szabadgyökös, reperfúziós sérülés eltüntetésének hatását a hagyományos optimális megőrzéssel és transzplantációs módszerekkel szemben. Ez utóbbi magában foglalja a mannit alkalmazását, amely maga egy hatásos hidroxilgyök-befogó. Ezek a tanulmányok ezért azt sugallják, hogy hasonló mértékű előnyt lehet nyerni a szabadgyökök eltüntetésének hozzátételével a jelen klinikai gyakorlathoz. Mivel az SÓD nem toxikus anyag, ez a megközelítés ígéretesnek látszik.

A fejezethez tartozó bibliográfiát az alábbiakban közöljük.

1. Parks, D. A., Bulkley, G. B., Granger, D. N., Hamilton, S. R., McCord, J. M.: Ischemic Injury to the Cat Small Intestine. Role of Superoxide Radicals (Iszkémiás sérülés macska vékonybeleknél: a szuperoxidgyökök szerepe). Gastroenterology, 82, 9 (1982).

2. Manson, P. N., Anthenelli, R. M., lm, M. J., Bulkley, G. B., Hoopes, J. E.: The Role of Free Oxygen Radicals in Ischemic Tissue in Island Skin Flaps (A szabad oxigéngyökök szerepe az iszkémiás szövetben, elszigetelt bőrlebenyekben). Ann. Surg., 198, 87 (1983).

3. Shlafter, M., Kané, P. F., Kirsh, Μ. M.: Superoxide Dismutase Plus Catalase Enhance the Effíciacy of Hypothermic Cardioplegia to Protect the Globally Ischemic, Reperfüsed Hearth (A szuperoxid-diszmutáz és kataláz növelik a hipotermikus kardioplegia hatásosságát, hogy megvédje az általános iszkémiás, reperfúziónak alávetett szívet). J. Torac. Cardiovasc. Surg., 83, 830(1982).

4. Stuart, R. S., Baumgartner, W. A., Borkon, A. M. és munkatársaik: Five-Hour Hypothermic Lung Preservation With Oxygen Free-Radical Scavengers (Öt órás hipotermikus tüdőmegőrzés oxigén-szabadgyököt befogó anyagokkal). Transplant. Proc., 17, 1454 (1985).

5. Sanfey, H., Bulkley, G. B., Cameron, J. L.: The Role of Oxygen Derived Free Radicals in the Pathogenesis of Acute Pancreatitis (A szabadgyökökből származó oxigén szerepe az akut hasnyálmirigy-gyulladás patogenezisében). Ann. Surg., 200,405 (1984).

6. Hansson, R., Gustavsson, B., Johnsson, O. és munkatársai: Effect of Xanthine Oxidase Inhibition on Renal Circulation After Ischemia (A xantin-oxidáz gátlás hatása a vese cirkulációjára iszkémia után). Transplant Proc., 14, 51 (1982).

7. Ouriel, U., Smedira, N. G., Ricotta, J. J.: Protection of the Kidney After Temporare Ischemie: Free Radical Scavangers (A vese védelme átmeneti iszkémia után: szabadgyök-befogók). J. Vasé. Surg., 2, 49 (1985).

8. Peller, M. S., Hoidal, Jr., Ferris, T. F.: Oxygen Free Radicals in Ischemic Acute Renal Failure in the Rat. (Oxigén-szabadgyökök iszkémiás akut veseelégtelenségben, patkányban). J. Clin. Invest., 74, 1156 (1984).

9. lm., M. J., Shen, W. H., Pák, C. I., Manson, P. N., Bulkley, G. B., Hoopes, J. E.: Effect of Allopurinol on the Survival of Hyperemic Island Skin Flaps (Az allopurinol hatása a hiperémiás, elszigetelt bőrlebenyekben). Plast. Reconstr. Surg., 73,276 (1984).

10. Pakrs, D. A., Bulkley, G. B., Granger, D. N.: Role of Oxygen Free Radicals in Shock, Ischemia, and Oxygen Preservation. (Az oxigén-szabadgyökök szerepe sokkban, iszkémiában és szövettárolásban). Surgery, 94,428 (1983).

11. Toledo-Pareyra, L. H., Simmons, R. L., Najardan, J.

S.: Effect of Allopurinol on the Preservation of Ischemia Kidneys Perfused with Plasma or Plasma Substitutes (Az allopurinol hatása a plazmával vagy plazmapótlóval perfüziónak alávetett iszkémiás vesék megőrzésére). Ann. Surg., 180, 780 (1974).

12. Vasco, K. A., DeWall, R. A., Riley, A. M.: Effect of Allopurinol in Renal Ischemia (Az allopurinol hatása a veseiszkémiára). Surgery, 71, 787 (1972).

13. Owens, M. L., Lazarus, Η. M., Wolcott, M. W., Maxwell, J. G., Taylor, J. B.: Allopurinol and Hypoxanthine Pretreatment of Canine Kidney Donors (Kutyavese-donorok allopurinolos és hipoxantinos előkezelése). Transplantation, 17, 424 (1974).

14. Granger, D. N., Rutilli, G., McCord, J.: Superoxide Radicals in Feline Intestinal Ischemia (Szuperoxiddiszmutáz a macskabél iszkémiában). Gastroenterology, 81, 22 (1981).

HU 214 977 Β

15. Roy, R. S., McCord, J. M.: Superoxide and Ischemia: Conversion of Xanthine Dehydrogenese to Xanthine oxidase (Szuperoxid és iszkémia: a xantindehidrogenáz átalakulása xantin-oxidázzá). A Greenwald, R. és Cohen, G. szerkesztők által összeállított következő kiadványban: Oxyradical and Their Scavanger Systems (Vol. 2). Cellular and Molecular Aspects (Oxigéngyökök és befogó rendszereik. 2. kötet, Sejt- és molekuláris szempontok. Kiadó: Elsevier Science, 145 (1983), New York.

16. Toledo-Pareyra, L. H., Simmons, R. L., Olson, L. C., Najarian, J. S.: Clinical Effect of Allopurinol on Preserved Kidneys: A Randomised Double-Blind Study (Az allopurinol klinikai hatása a tárolt vesékre: véletlenszerű kettős vaktanulmány). Ann. Surg., 185, 128 (1977).

17. Parks, D. A., Granger, D. N., Bulkley, G. B.: Superoxide Radicals and Mucosal Lesions of the Ischemic Small Intestine (Abstract) [A szuperoxiddiszmutáz és az iszkémiás vékonybél nyálkaelváltozásai (Kivonat)]. Fed. Proc., 41,1742 (1982).

18. Casale, A. S:, Bulkley, G. B., Bulkley, Β. H., Flaherty, J. T., Gott, V. L., Gardner, T. J.: Oxygen Free Radical Scavangers Protect the Arrested, Globally Ischemic Heart Upon Reperfusion (Az oxigénszabadgyök-befogók megvédik a rögzített teljesen iszkémiás szívet a reperfúzió alkalmával). Surg., Fórum, 34, 313 (1983).

32. példa

Az izolált nyúlszaruhártya túlélése és a szabadgyök-befogók

A pSODp₁T_N gazdaszervezet-vektorrendszer által, E. coli A1645-ben a 3. példa szerint termelt és a 26. példában leírt módon történő növesztéssel és tisztítással előállított humán szuperoxid-diszmutázról azt mutatjuk ki, hogy meghosszabbítja a kimetszett, izolált szaruhártyák túlélési idejét.

A jelen példa során található, zárójelben lévő számok azokra a közleményekre vonatkoznak, amelyeket a jelen példa végén található bibliográfia felsorol.

A korábbi tanulmányok megállapították az adenozin kis koncentrációjának előnyös hatásait a nyúlszaruhártya endotéliális „szivattyújára” in vitro (1). A folyadékszivattyú aktiválását úgy kapjuk meg, hogy az izolált szaruhártyát perfuziónak vetjük alá fiziológiás koncentrációjú glükózzal (5 mmol/1) és adenozinnal (l(h⁶ mol/1), kiegyenlített sóoldatban, a túlélési idő mintegy 7 óra.

Legközelebbi célunk az, hogy növeljük a túlélési időt. A szuperoxid-diszmutáz (SÓD) (2) befogja a szuperoxid-szabadgyököt, katalizálva a következő reakciót:

O₂ + O₂ 2H⁺ —> H₂O₂ + O₂

Az SÓD beadásáról ismeretes, hogy jelentősen növeli az iszkémiás szövetek túlélését részleges oxigénhiány után (3).

Az iszkémiából kialakuló szövetkárosodás jelentős mértéke következik be a reperfúzió és az izolált szövetek reoxigenálásának időtartama alatt. A sérülések nagy részét a szuperoxid-gyök és származékai közvetítik.

A jelen tanulmány célja, hogy meghatározza, vajon a szuperoxid-diszmutáz vagy a kataláz képes-e megnyújtani az izolált szaruhártya túlélését.

Szaruhártyákat izolálunk 2,0-3,0 kg-os albínó nyulakból. Az alkalmazott technikák részleteit korábban leírták (1). Röviden, a szemeket kimetsszük és a szaruhártya-epitheliumot levakarjuk, ezután a szaruhártyákat izoláljuk, amint leírtuk, majd perfuziónak vetjük alá. Az eredményeket az alábbiakban szemléltetjük.

pg/ml SOD-analóg hozzáadása az 5 mmol glükózt és 1 pg adenozint tartalmazó alap-sóoldathoz (Basal Salt) meghosszabbítja az izolált szaruhártya túlélési idejét 7 és 14 óra közé. Ha az adenozint eltüntetjük, a túlélési időt csupán 12 órára hosszabbíthatjuk meg.

Összefoglalva, az SOD-analóg hasznosnak bizonyul az izolált szaruhártyák túlélési idejének meghosszabbításában. Az SOD-analóg fontos lehet a más izolált szervek túlélésének meghosszabbításában. Hasonló adatokat publikáltak szarvasmarha SOD-t alkalmazva, például az Experimental Eye Research, 4, 153-154. (1985) című kiadványban.

Az alábbiakban közöljük a jelen példa bibliográfiáját.

1. Neuwirth, O. és Dikstein, S.: The effect of cyclic AMP on the rabbit comeal endothelial fluid pump. (A ciklikus AMP hatása a nyúlszaruhártya endotéliális folyadékszivattyújára). Current Eye Rés., 2(8), 565-567. (1983).

2. Fridovich, I.: Superoxide dismutases (Szuperoxiddiszmutázok). Ann. Rév. Biochem., 44, 147-159. (1975).

3. Manson, Ρ. N., Róbert, M., Anthenelli, Μ. M., Michael, J., Bulkley, G. B. és Hoopes, J. E.: The role of oxygen-free radicals in ischemic tissue injury in Island skin flaps (Az oxigén-szabadgyökök szerepe az elszigetelt bőrlebenyekben lévő iszkémiás szöveti sérülésekben). Ann. Surg., 198, 87-90. (1983).

4. Michaelson, A: M. és Puget, K.: Cell penetration by exogenous superoxide dismutase (Sejtáthatolás az exogén szuperoxid-diszmutáz révén). Acta Physiol. Scand. Suppl., 492, 67-80. (1980).

5. Perlman, M. és Baum, J. L.: The mass culture of rabbit comeal endothelial cells (Nyúlszaruhártyasejtek tömegtenyésztése). Arch. Ophtalmol., 92, 235-237(1974).

6. Klyce, S. és Maurice, D. M.: Automatic recording of comeal thickness in vitro (Szaruhártyavastagság-mérés automatikus rögzítése). Invest. Ophtalmol., 15, 550-553. (1976).

7. Neuwirth Lux, O.: Survival of rabbit corneal endothelial pump (Nyúlszaruhártya endotheliális szivattyú túlélése). Doktori értekezés. Benyújtva a Hebrew University (Jeruzsálem) Tanácsához (1984).

33. példa

A p9200 megalkotása és bGH előállítása p9200-at alkalmazva E. coli Al645-ben és A4255-ben

A p9200 megalkotását a 26. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben. PHG44-et

HU 214 977 Β hasítunk C/nl-el és P.?Zl-el, „betöltjük” DNS polimeráz I Klenow-fragmenst alkalmazva, majd a nagy DNSfragmenst izoláljuk. Ezt a fragmenst olyan DNSfragmenshez Egáljuk, amely tartalmazza a pBR322 tetraciklin-rezisztencia génjét; ez utóbbi fragmenst úgy izoláljuk, hogy pBR322-t hasítunk £coRI-vel és Aval-el, majd „betöltjük” DNS polimeráz I Klenow-fragmensét alkalmazva. Az így létrejött p9200-plazmidot az ATCC-nél letétbe helyeztük ATCC 53215 letéti számon.

A p9200-plazmid hasonló a pHG44-hez (6. ábra), a plazmid azonban tetraciklin-rezisztenciát ad át ampicillin-rezisztencia helyett. A p9200-plazmidot E. coli A1645 és A4255 törzsekbe vezetjük be transzformálással, olyan ismert módszereket alkalmazva, amelyek ismeretesek azok számára, akik a szakterületen átlagosan járatosak. Ezek a törzsek növesztésre és indukcióra egy szarvasmarhanövekedési-hormonanalógot (bGH) termelnek, amely met-asp-gln aminosav-szekvenciával rendelkezik az autentikus bGH fenilalanin formájának amino-terminálisához hozzátéve. Az ezek által a törzsek által termelt bGH-analóg mennyisége durván ekvivalens azzal, amelyet a pHG44 termel.

Az A1645/p9200 (A1645 gazdaszervezet p9200-al transzformálva) törzs növesztéséhez, a bGH-analóg kinyeréséhez és a bGH-analóg tisztításához alkalmazott módszer azonos azzal, amelyet a 13. példában a pHG44-hez leírtunk, azzal a különbséggel, hogy 12,5 mg/1 tetraciklint adunk 100 mg/1 ampicillin helyett.

Az A4255/p9200 törzs, amelyet A4320-nak nevezünk, növesztéséhez és indukálásához alkalmazott módszerek a 36. példában vannak leírva. A bGH-analóg tisztításához alkalmazott módszerek azonosak azzal, amelyeket a pHG44-hez a 13. példában leírtunk.

Az A4320 törzset (A4235 gazdaszervezet p9200plazmiddal transzformálva) letétbe helyeztük az ATCC-nél ATCC 53215 letéti számon.

Az ampicillingén helyettesítése a tetraciklingénnel előnyös annyiban, hogy az ampicillint így ki lehet küszöbölni a termelési folyamatból, ezáltal ki lehet küszöbölni a végtermék lehetséges szennyezését ampicillinnel, amely súlyos allergiás reakciókat okozhatna.

34. példa

Met-leu-leu-leu-met humán ApoE-analóg termelése

A pTVR 279-8-plazmíd irányítja egy új apolipoprotein E3-analóg kifejeződését. Ennek az analógnak az N-terminális szekvenciája met-leu-leu-leu-met, és ezt követi az érett apolipoprotein E3 szekvenciája.

A pTVR 279-8 megalkotása

A pTVR 279-8 megalkotását a 25. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben. A pTVR 279-8-plazmidot az ATCC-nél letétbe helyeztük ATCC 53216 letéti számon.

A pTV 190-plazmidot (21. ábra) részlegesen emésztjük 4ral-el, „betöltjük” DNS polimeráz I Klenow-fragmensét alkalmazva, ligáljuk, és E. coliba transzformáljuk. Az így létrejött plazmidot, amelyben a 3’ dvol-hely el van tüntetve, pTV 264—45-nek jelöljük, ezt AWel-el teljesen emésztjük, és a következő szintetikus oligonukleotidokhoz ligáljuk.

N° 1217 5-TATGCTGCTGCT

N° 1218 ACGACGACGAAT-5’

Az így létrejött plazmidot, amelyet pTVR 279-8nak nevezünk, E. coli Al645-be transzformáljuk, olyan módszereket alkalmazva, amelyek ismeretesek azok számára, akik a szakterületen jártasak. A plazmidot tartalmazó törzseket telephibridizálással azonosítjuk, ³²Pvel jelzett N° 1218-as oligonukleotidot alkalmazva vizsgáló mintaként. A plazmidazonosságot DNSszekvenciaanalízissel igazoljuk. A pApoE-EX2-t tartalmazó A1645 törzset az ATCC-nél letétbe helyeztük ATCC 39787 letéti számon.

A pTVR 279-8 növesztésre és indukcióra egy humán apolipoprotein E3-analógot termel, amely met-leu-leu-leu-met aminosav-szekvenciával rendelkezik a természetes apolipoprotein E3 N-terminálisához hozzátéve. A törzs növesztéséhez alkalmazott módszerek azonosak azzal, amelyeket a pTV-Ι 70-hez írtunk le a 17. példában, azzal a kivétellel, hogy az indukció időtartama 42 °C hőmérsékleten 1-5 óra, 15 perc helyett.

A pTVR 279-8 olyan ApoE3-analógot termel, amely a baktériumokra kevésbé toxikus, mint a pTV 170 és a pTV 190 által termelt met-ApoE3-analóg. A met-leu-leu-leu-met-ApoE3-analóg a sejtben még az indukció 60 perce után is folyamatosan akkumulálódik 42 °C hőmérsékleten, elérve a 400-600 mg/liter tenyészetszintet.

35. példa

Humán növekedésihormon-analög termelése A pTV300 megalkotása

A pTV300 megalkotását a 27. ábrán mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben. A plazmidot úgy alkotjuk meg, hogy a pTV 18(l)-plazmidból származó hGH-gént beiktatjuk a p579 (19. ábra) M/el-helyébe. A pTV 18(1) megalkotása a 0131 843 Al számú európai szabadalmi közrebocsátási iratban van belefoglalva (megjelent: 1985. január 23.), valamint az ennek megfelelő 515,188 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben (benyújtva: 1983. július 15-én); ezek ide referenciaként be vannak építve. A hGH-analóg szintézise

A pTV 300-at bevezetjük E. coli A1645 törzsbe transzformációval, olyan módszereket alkalmazva, amelyek ismertek azok számára, akik a szakterületen átlagosan jártasak. Ez a törzs növesztésre és indukcióra egy humán növekedésihormon-analógot termel, amelyből törölve van a természetes növekedési hormon első 13 aminosava. A törzs növesztéséhez és a hGh tisztításához alkalmazott módszerek azonosak azzal, amelyeket a 13. példában leírtunk.

36. példa

Prototróf törzsek megalkotása és bGH előállítása prototróf gazdaszervezetek alkalmazásával

E. coli prototróf törzseit alkotjuk meg, amelyek képesek magas szintű fehérjekifejeződésre több, korábban

HU 214 977 Β leírt plazmid segítségével abban az esetben is, amikor minimál tápközegen nőnek. A bakteriális növesztési munkamenet előnyei, amikor minimál tápközeget alkalmazunk, a következők:

a) a baktériumok nagyobb sejtsűrűségig képesek nőni;

b) a növesztési körülményeket könnyebb lemásolni, mivel a tápközeg-alkotórészek „egyszerűbbek”, és ezért jobb minőségűek; és

c) a tápközeg gazdaságosabb.

A találmány szerinti előnyös prototróf törzsek az

A4200, A4255 és A4346 jelűek. A p9200-plazmidot tartalmazó A4255 törzset az ATCC-nél letétbe helyeztük ATCC 53215 letéti számon, ezt a következőkben A4320-nak hívjuk.

A prototróf törzsek kiválasztása és megalkotása A következő törzseket vizsgáljuk át minimál tápközegen való nagy növekedési sebességekre, valamint λ, λ434 és Pl fágokra való érzékenységre:

Törzs

1. ATCC 12435

2. ATCC 23716

3. ATCC 27662

4. ATCC 25404

5. ATCC 11775

6. ATCC 25254

7. HffC = A4134

8. W3350 = A2509

9. A1645

Ezeknek a tanulmányoknak az eredményeire támaszkodva az ATCC 12435 és ATCC 25404 törzsekre alapozott prototróf törzsek kifejlesztését vesszük célba, mert ezek a törzsek érzékenyek a fentebb felsorolt fágokra, és igen nagy növekedési sebességeket mutatnak. Ezt a két törzset alkalmazva új törzseket alkotunk meg, amelyet tartalmazzák a kcI857-represszort, a megalkotást olyan módon végezve, hogy átfertőzzük a törzseket kcI857AHlABamHI:Tnl0-et tartalmazó Pl-el. A tetraciklin-rezisztens telepeket tisztítjuk, és megszabadítjuk a Pl-tői, ha szükséges.

Az így létrejött törzsek és genotípusaik a következők:

A4200 = ATCC 12439 (XcI852AHlABamHI):TnlO

A4206 = ATCC 25404 (ÁcI857AHlABamHI):TnlO

Mindkét törzset pHG44-el transzformáljuk, így nyerve az A4202, illetve A4207 törzseket.

Növesztés és indukció

Az A4202 és A4207 törzseket a következő körülmények közt növesztjük és indukáljuk, és az alábbi módon mérjük a szarvasmarhanövekedési-hormonanalóg termelését.

Tápközeg

Alkotórész Koncentráció

KH₂PO₄ 13,6 g/liter (NH₄)₂SO₄ 2 g/liter

MgSO₄-7H₂O 0,2 g/liter

CaCl₂ 0,01 g/liter

FeSO₄-7H₂O 0,5 g/liter pH 7,4

Kiegészítők:

20%-os glükózoldat 25 ml/liter mg/ml-es ampicillin-oldat 1 ml/liter

0,3%;os Bl-oldat 1 ml/liter

0,3%-os biotinoldat 1 ml/liter

Mind az A4202, mind az A4207 jól nő minimál tápközegben; csak az A4202 fejez ki azonban bGHanalógot jelentős szinten. Az A4202 durván azonos szinten fejez ki bGH-analógot, mint a pHG44, amely dús táptalajon nő, amint ezt a 13. példában leírtuk.

A tetraciklin-rezisztencia eliminálása az A4200-ból

Abból a célból, hogy hasznosítsuk az A4200 törzset, amely csupán tetraciklin-rezisztencia markert hordoz, megalkotunk egy TnlO-markertól megszabadított törzset. Az A4200 törszet MacConkey galaktózlemezekre szélesztjük, gal⁺ revertánsokat választunk ki, és tetraciklin-érzékenységre, valamint lambda-fágra való érzékenységre vizsgáljuk. Ezt a törzset A4255-nek nevezzük.

Biotintól független prototróf törzsek megalkotása

Az összes fenti prototróf törzsek tartalmazzák a lambda cI857AHIABamHI defektív profágot. A delta Hl deléció kiterjed a bio uvr B területre, eltávolítva a biotin bioszintetizáló operonokat. így a törzsek biotin hozzáadását igénylik a növesztő tápközeghez.

Hogy megszüntessük az A4200-ből és A4255-ből származó törzsek biotinigényét, az A89 törzsből származó F’ episzómát vezetjük be ezekbe a törzsekbe.

Az A89 törzs egy F’ ga/-plazmidot hordoz. Bemutatjuk, hogy ez az F’-plazmid hordozza az összes olyan gént, amely a biotin endogén szintéziséhez szükséges. Számos tulajdonsága teszi ezt a plazmidot a bio operonok kényelmes forrásává:

1. F’ gal egy egység kópiaplazmid;

2. a plazmid rendkívül stabil E. coli-ban;

3. az F’-plazmid összeférhető colEl-plazmiddal, amelyre a mi kifejeződő vektoraink alapozódnak;

4. az F’ gal konjugációs plazmid. Ennél fogva könnyen lehet átvinni sejtről sejtre.

5. Könnyen lehet ávizsgálni biotintól független sejtekre.

Az A4202 törzset 30 percig konjugáljuk A89-el, és a biotintól független telepeket kiválasztjuk. Az így létrejött A4346 törzs magas szinten termel szarvasmarhanövekedésihormon-analógot, biotin távollétében minimál glükóz tápközegben végzett indukciót követően. Más növekedési faktor sem szükséges.

Az A4346-ot megszabadíthatjuk a pHG44-től olyan standard műszerekkel, amelyek ismeretesek azok számára, akik a szakterületen jártasak. Az így létrejött prototróf gazdatörzseket transzformálhatjuk az összes plazmiddal, amelyet ebben a bejelentésben leírunk. Minimál tápközeg

Az állandóan alkalmazott minimál tápközeg termelési célokra a prototróf törzsekkel a következő:

Fermento- Rázólombirokhoz kokhoz

K₂HPO₄ 6 g/l 6 g/l

KH₂PO₄ 4 g/l 4 g/l

NH₄C1 1 g/l 1 g/l

HU 214 977 Β

MgSO4-7H2O	3 g/1	0,2 g/1
10% Fe(NH4)-citrát	0,3 ml/1	0,1 ml/1
Nyomelemoldat	3 ml/1	1 ml/1
Szilikon-habgátló	0,5 ml/1	-

A tápközegeket autoklávozzuk,

Ampicillint (100 mg/1) vagy tetraciklint (12,5 mg/1) adhatunk a tápközeghez, attól függően, vajon a törzs ampieiílin- vagy tetraciklin-rezisztens.

50%-os glükózoldatot külön sterilezzűk és külön adjuk hozzá 20 g/1 koncentrációig. 50%-os glükózt táplálunk be a fermentáció során mintegy 10,8 glükóz/OD egység sebességgel az F’ episzóma nélküli sejtekbe, vagy 1,8 g glükóz/2,0 OD egység sebességgel az A4346 törzsnél. A pH-t 25%-os NH₃-oldat betáplálásával szabályozzuk. Habgátlót szükség esetén adagolunk. Az A4200-re, A4255-re és A4206-ra alapozott törzsekhez 15 mg/1 biotint is adunk.

A nyomelemoldat a következőket tartalmazza [Biotechn. Bioeng., 16, 933-941. (1974)].

g/1

H₃BO₃ 0,57

CuC1₂(CuSO₄-5H₂O) 1,0(0,04)

CaCl₂-2H₂O 1,0

MnSO₄-4H₂O 0,81

Na₂Mo0₄-2H₂0 2,0

CaCl₂-6H₂O 2,0

ZnCl₂-4H₂O(ZnSO₄-7H₂O) 2,0 (2,78)

Koncentrált sósav 100 ml

A zárójelben lévő vegyületek egy másik változatot jelentő vegyületek, amelyeket az őket megelőző vegyületek helyett lehet alkalmazni. A zárójelben lévő mennyiség az ilyen, másik változatot jelentő vegyület megfelelő mennyiségére vonatkozik. A korábban leírt plazmidok legtöbbjét levezetjük A4200-be és A4255be. Ezeknek a törzseknek a részleges listáját az alábbi táblázat tartalmazza:

Törzs jele	Gazdatörzs/Plazmid
A4202	A4200/pHG44
A4256	A4255/pHG44
A4320	A4255/p9200
Z1803	A4255/pSODplT11
A4500	A4255/pTV194
A4336	A4200/pHG44, F’Gal
37. példa

Lizáló gazdaszervezet megalkotása és bGH termelése ezeket a lizáló gazdaszervezeteket alkalmazva

1. Az A4048 és A3111 törzsek megalkotása

A W3350 törzset alkalmazzák kiterjedten a lambda-fág növesztésére [lásd például Oppenheim és Salomon: Virology, 41, 151-159. (1970)]. Az A2509 törzset, amely a W3350 prototróf származéka, megfertőzzük A1637-en növő Plclts-el és megfertőzzük XcI857AHlABamHI defektív profággal is, amely a TnlO-markert hordozza. Az így létrejött A4048 törzset tetraciklin-rezisztens klónként szelektáljuk, amely a ÁcI857AHlABamHI defektív profágot hordozza. Ez a törzs hordoz Plclts-plazmidot is. Ezt a törzset pHG44-el transzformáljuk, így jutunk az A3111 törzshöz.

Hasonlóképpen az A4085 törzset A2509-ből alkotjuk meg olyan módon, hogy kcí857AHlABamHI-t iktatunk be, a TnlO-transzpozont eltávolítjuk, és a Plcltsplazmidot kiiktatjuk a pHG-vel végzett transzformálás előtt. Az A4085 hordozza a kcI857AHlABamHI defektív profágot és kontrollként szolgál a bGH-termelés méréséhez, és a Pl-plazmid jelenléte nélkül végbement autolízishez. Az A3111 törzset letétbe helyeztük az ATCC-nél ATCC 53217 letéti számon.

2. A szarvasmarhanövekedési-hormon (bGH) szintézise

Törzstenyészetek: Az A3111 (pHG44, A4048 sejtekben) törzstenyészeteit egy éjszakán át növesztjük 30 °C hőmérsékleten LB-tápközegben, amely 50 pg/ml ampicillint (Amp) is tartalmaz. A tenyészeteket 50%-os glicerinnel kétszeresére hígítjuk, és -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

Inokulum: Az inokulumot 100 pg/ml Amp-ot is tartalmazó LB-agarlemezeken nőtt A3111 egyedi telepeiből nyeljük. Az LB-lemezeket viszont olyan anyagból széiesztjük, amelyet a törzstenyészetből vettünk.

Steril, 3 ml-es, 50 pg/ml Amp-ot is tartalmazó LBtápközeget inokulálunk A3111 egyedi telepeivel, és 18 órán át növesztjük 30 °C hőmérsékleten, rázógépen, fürdőben.

Termelés: A bGH termelését BHI-tápközegben hajtjuk végre [37 pg/l agy-szív-infuzió (DIFCO), amely 50 pg/ml Amp-ot is tartalmaz]. Az inokulumot 1:100-ra hígítjuk egy friss BHI-t + 50 μg/ml Amp-ot tartalmazó lombikban, majd rázógépen, fürdőben növesztjük 30 °C hőmérsékleten, amíg a sejtkoncentráció eléri a 4x10⁸ sejt/ml (OD₆₀₀=0,5) értéket.

A bGH-termelés indukciójához a lombikot átvisszük egy rázógépre, amely 42 °C hőmérsékletre beállított fürdőben van. Sejtmintákat veszünk a 0. és 90. percben az indukció megkezdésétől számítva.

A bGH-termelés elemzése: A bGH-termelést 10-26% gradiens akrilamidgélen elemezzük. A sejtmintákat mikrocentrifiigában forgatjuk, a felülúszót eltávolítjuk, és az üledéket mintapufferban (2% SDS, 50 mmol/liter trisz, pH 7,0, 3% szarcharóz, 5% merkapto-etanol) feloldjuk, majd a gélre terheljük. 200 volton, 2½ órán át végzett elektroforézis után a géleket Coomassie-kékkel festjük, és a bGH mennyiségét letapogatással határozzuk meg gélletapogató (scanner) segítségével.

A 42 °C-on végzett indukció 90. perce után a bGH a teljes A3111-fehérje mintegy 20%-át alkotja.

3. Autolízis

Az A3111 törzs hordoz pHG44-et, a XcI857AHlABamHI defektív profágot és egy stabil Plclts-plazmidot. 42 °C hőmérsékleten végzett meghosszabbított indukció után a sejtek lizálódni kezdenek a Pl által irányított endolizin termelődése következtében. A tenyészet teljes lízisét 2,5-3 óra után éljük el.

A szabályozott autolízis vizsgálata: 5 ml A3111 tenyészetet veszünk ki 42 °C hőmérsékleten végzett indukció előtt és után (90 perc), és forgatjuk Sorvall-centrifugában 7000 fordulat/percnél 7 percen át. A felülúszókat eltávolítjuk, és az üledékeket -20 °C hőmérsék46

HU 214 977 Β létén fagyasztjuk egy éjszakán át. Az üledékeket ezután újra szuszpendáljuk 0,5 ml TE-pufferban (10 mmol) liter trisz, pH 8,0, 1 mmol/liter EDTA és 0,1 ml-t felhígítunk l.TO arányban TE-pufferral, és az OD₆₀₀-értéket meghatározzuk.

Ennek a kísérletnek a kontrolljaként az A4085 törzset használjuk, amely az A3111-hez hasonlóan tartalmazza a pHG44-et és a XcI857AHIABamHI defektív profágot, de nem hordozza a Plclts-plazmidot.

Egy ilyen kísérlet eredményeit az V. táblázatban tüntetjük fel, amely azt mutatja, hogy a Plcltsplazmidot hordozó sejtek (A3111) a fagyasztásra azonnal lizálódnak. A fagyasztott keverék megvizsgálása feltárja, hogy a sejtek több mint 95%-a lizálódik ez után a kezelés után.

V. táblázat

Törzs	Plclts	Fagyasztás előtt	Fagyasztás után	%-os veszteség
A4085	-	0,980	0,851	14
A3111	+	0,543	0,08	86

A lizálási folyamat egyszerűsíti a bGH kivonását az indukált sejtekből anélkül, hogy hatással lenne a bGHtermelésre.

38. példa

A met-ApoE3-analóg biológiai aktivitása

PTV baktériumot növesztünk, ahogyan ezt a 17. példában leírtuk.

A zárójelben lévő számok a jelen példa végén található irodalmi hivatkozásra vonatkoznak.

A bakteriális extraktumok elemzése

A bakteriális sejteket centrifügálással kinyerjük, és 50 mmol/literes foszfát-pufferban (pH 7,5), amely 5 mmol/liter EDTA-t és 2 mmol/liter fenil-metilszulfonil-fluoridot is tartalmaz, feloldjuk. Alikvotokat lizálunk, 1,5-szörös mintapufferban (15% glicerin, 4,5% SDS, 1 mmol/liter β-merkapto-etanol, 93,5 mmol/liter trisz-HCl, 0,25% brómfenolkék, pH 6,8), 100 °C hőmérsékleten 10 percen át melegítjük, és a fehérjét 10%-os SDS-poliakrilamid gélen elemezzük (26). A poliakrilamid gélen elkülönített fehéqéket vagy Coomassiebrillantkékkel festjük, vagy elektroforetikusan átvisszük nitrocellulóz lemezre (27) és reagáltatjuk ¹²⁵I-vel jelzett antihumán Apoe monoklonális vagy poliklonális IgGvel. Az immuno-foltokat mossuk, levegőn szárítjuk és röntgenfilmre exponáljuk.

ApoE izolálása

Autentikus ApoE-t izolálunk egy hiper trigliceridémiás (E313 fenotípus) beteg d<l,02 plazma lipoproteinjéből Sephacryl S-300 oszlopkromatográfiával, amint ezt korábban leírták (14). Az E3 izoformát preparatív Immobílin ízoelektromos fókuszálással nyerjük (LKB Instruments, Bromma, Svédország; pH-tartomány 4,9 és 5,9 között) (28).

Az ApoE-analógot 33 g liofilezett sejtből izoláljuk, amely 5 liter fermentációs folyadékból származó sejttömeget képvisel. A sejteket finom porrá őröljük 22 g alumínium-oxid segítségével (Buehler Ltd., Evanston, Illinois) hűtött (4 °C) mozsárral és mozsártörővei. Az őrölt sejteket 300 ml 6 mol/literes karbamid-oldattal (frissen ionmentesített) extraháljuk, az oldat tartalmaz még 0,1 mol/liter NH₄HCO₃-at, 2 mmol/liter PMSF-et, 0,1% Trasylol-t (Mobay Chemical Corp., New York, NY) (pH 7,8) is. Az oldhatatlan sejtmaradékot ultracentrifugával leülepítjük 4 °C hőmérsékleten, Beckman SW28-rotorban (25 000 fordulat/perc, 50 percen át), és újra extraháljuk 200 ml 6 mol/literes karbamidpufferban. Az egyesített felülúszó-frakciókat dializáljuk 2 mol/literes karbamidoldattal szemben, amely 25 mmol/liter NH₄HCO₃-at, 2 mmol/liter PMSF-et, 2 mmol/liter EDTA-t, 0,1% Trasylolt-, 0,1% βmerkapto-etanolt is tartalmaz (pH 7,4), a dializáló oldatot háromszor cserélve. A dialízist követően az extraktum felülúszóját hozzáadjuk ~200 ml heparinSepharose-hoz, amelyet a (29) irodalmi hivatkozás szerint készítünk el, és 2 mol/literes karbamid-pufferral egyensúlyozunk ki. A gél-felülúszó keveréket egy éjszakán át inkubáljuk 4 °C hőmérsékleten, forgó lemezen, majd üvegoszlopba töltjük (4,0x3,5 cm, Kontes Glass, Vineland, New Yersey). A heparin-Sepharosehoz nem kötött anyagot lemossuk az oszlopról -300 ml mol/litercs karbamidpuffer átszívatásával 25 ml/óra sebességgel az oszlopon keresztül. A kötött anyagot azután 50 ml 1,0 mol/literes NH₄HCO₃-oldattal (2 mol/literes karbamidoldatban) eluáljuk az oszlopról, majd dializáljuk 5 mmol/liter NH₄HCO₃-al szemben, és liofilezzük. Ezt a félig tisztított ApoE-t 15 ml 6 mol/literes guanidinoldatban szolubilizáljuk, amely oldat 0,1 mol/liter trisz-HCl-t, 1 mmol/liter EDTA-t, 1,0% β-merkapto-etanolt is tartalmaz (pH 7,4), és Sephacryl S-300 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Svédország) oszlopra (2,5*300 cm) visszük, amely oszlopot előzőleg 4 mol/liter guanidint, 0,1 mol/liter trisz-HCl-t, mmol/liter EDTA-t és 0,1% β-merkapto-etanolt tartalmazó oldattal (pH 7,4) egyensúlyoztunk ki. Az ApoE-t tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, kimerítően dializáljuk 5 mmol/literes NH₄HCO₃-al szemben, majd liofilezzük. A végső tisztítást preparatív Ízoelektromos fókuszálással hajtjuk végre Immobiline gélen (28).

Az ApoE-analóg szerkezeti jellemzése

Aminosav-elemzéshez fehérje- vagy peptid-mintákat hidrolizálunk 6 n HCl-ben 20 órán át 110 °C hőmérsékleten lezárt, vákuummal leszívott csövekben. Az elemzést Beckman 121 MB Analyzerben hajtjuk végre, amely 126 Data System Modellel van felszerelve.

Az aminosav- és szekvenciaelemzéshez a peptideket úgy hozzuk létre, hogy 3 mg Sephacryl S-300 oszloptisztított ApoE-t emésztünk 90 mg CNBr-el 600 ml 70%-os hangyasavban 30 percig, szobahőmérsékleten. Az így létrejött peptideket Sephadex G-50-oszlopon elkülönítjük, amint ezt korábban az autentikus ApoEnél leírták (4).

A szekvenciaanalízist korszerűsített Beckman 890C Sequenceren hajtjuk végre, standard 0,1 M Quadrol programot alkalmazva. Az intakt fehérjét lebontjuk mg polibrén és 0,5% SDS jelenlétében; a peptidek csak a polibrén jelenlétében is lebomlanak. A fentiltio47

HU 214 977 Β hidantion aminosavakat azonosítjuk, és mennyiségileg is meghatározzuk nagy felbontású folyadékkromatográfiával (HPLC), amint ezt korábban leírták (14).

Analitikai izoelektromos fókuszálást és SDS poliakrilamid-gélelektroforézist hajtunk vége (14). A töltésváltást ciszteaminnal (β-merkapto-etanol-amin) végezzük (14).

Az ApoE-analóg biológiai jellemzése

ApoE-analóg és dimirisztoil-foszfatidil-kolin (DMPC) foszfolipid komplexeit készítjük el és izoláljuk, amint ezt korábban leírták (30). Lipoproteinreceptorkötési méréseket hajtunk végre, amint ezt a fibroblasztoknál (31) és máj membránoknál (32) leírták. Az ApoE jódozását 0,10 mol/literes NH₄HCO₃-ban hajtjuk végre Iodo Beadsben (Pierce), a gyártó ajánlásai szerint.

Nyúl és patkány in vivő tanulmányokhoz jódozott autentikus ApoE-t és ApoE-analógot (mindkettő 90 pg) inkubálunk 30 percig szobahőmérsékleten 1 ml nyúlvagy patkányplazmával, mielőtt injektálnánk hím újzélandi fehér nyulakba. A plazma radioaktivitását mint triklórecetsavval kicsapható fehérjét adjuk meg, azt a kicsapási módszert alkalmazva, amelyet korábban leírtak (33). A különböző időintervallumoknál a plazmában maradó injektált dózis százalékának a kiszámítása azon a becslésen alapul, hogy a plazma térfogata a testsúly 4,5%-a.

Az alábbiakban megadjuk a fenti kísérletek eredményeit és megtárgyaljuk azokat.

A humán ApoE kifejeződése

A pTV194-el fertőzött sejtek indukcióját követően egy, az ApoE molekulatömegével azonos látszólagos molekulatömegű fehérje indukálódik fajlagosan. Ez az indukált fehérje reagál antihumán ApoE-antitestekkel (részletesen nem mutatjuk be).

perces vagy hosszabb indukciós időtartam után a sejtek lízisét figyeljük meg (28. ábra). Ez a sejtlízis az ΑροΕ-sejten belüli felgyülemlésével társul. A 30 °C hőmérsékleten tartott, nem indukált sejtek stabilak (28. ábra). Ez a celluláris toxicitású lízis nem általános vonása ennek a kifejeződő vektornak, mivel ugyanez a kifejeződő rendszer, amely humán növekedési hormon cDNS-t tartalmaz, nem mutatja ezt a hatást. Az ApoE felgyülemlés által okozott toxicitás problémáját le lehet gyűrni a sejteket rövid időtartamon át (₂0 perc) indukálva, majd a sejteket lehűtve jég adagolásával a fermentorba.

Amint ezt szilárd fázisú radioimmunassay-val meghatározzuk, az ApoE-szint a rövid időtartamon át indukált sejtekben mintegy 1%-a az oldható sejtfehéqének. Az ApoE-t izoláljuk, és a sejtkivonatból tisztítjuk heparin-Sepharose és Sephacryl S-300 kromatográfiával. Ez a kétlépéses folyamat olyan ApoE-készítményt eredményez, amely több mint 90% tisztaságú, a sejtextraktumban jelenlévő ApoE mintegy 20%-át képviselő kitermeléssel. A jellemzéshez szükséges végső tisztítást preparatív Immobiline izoelektromos fókuszálással hajtjuk végre. Ez esetben a tanulmányokban alkalmazott tisztítási műveletet nem optimalizáltuk a teljes kinyerésre, inkább arra terveztük, hogy a jellemzéshez tiszta anyagot nyeljünk.

Az ApoE-analóg szerkezeti jellemzése

Az Immobiline-nal tisztított ApoE-analóg egyedi csikként vándorol SDS-gélen, az autentikus ApoE hírértékével azonos látszólagos Mr-értékkel. Izoelektromos fókuszálógélen a biomémöki úton előállított ApoE egy fő csikként fókuszálódik az Immobiline-nal tisztított ApoE3 pl-jével azoos pl-vel. Egy ciszteingyök jelenlétével egybevágóan az ApoE-analóg egy töltésegységgel tolódik el az anód felé cisztenaminos módosítás után. Az Immobiline-nal tisztított termék aminosavelemzését összehasonlítjuk az azonos módszerrel tisztított autentikus humán ApoE3-al. Amint a VI. táblázat bemutatja, az ApoE-analóg és az autentikus ApoE elemzési eredményei csaknem azonosak egymással és a humán ApoE korábbi szekvenciaelemzéseiből eredő elméleti kompozícióéval. Az elemzések azonban azt sugallják, hogy az ApoE-analóg termék tartalmaz egy további metionin-gyököt az autentikus ApoE-hez hasonlítva. Ezen túl egy cisztein-gyök jelenléte, amelyet a ciszteaminos kezelés sugall, is bizonyított.

Az intakt ApoE-analóg (körülbelül 6 mmol) szekvenciaelemzése azt demonstrálja, hogy egy többietmetioningyök van a fehérje NH₂-terminálisánál, és egy egyedi Met-Ly s-Val-Glu-Gln-Ala-Val-Glu-ThrGlu-Pro-Glu-Pro-Gln-Leu-Arg-Gln-Gln-szekvencia termelődik. A metionint követő szekvencia megeflel a humán ApoE 1-17 gyökeinek. Ezek az eredmények megerősítik, hogy az ApoE NH₂-terminális kódoló részének helyreállításához használt szintetikus oligonukleotid korrektül átfordítódik, és hogy a többletmetionin (amelynek kodonja hozzáadódik a bakteriális transzlációs iniciációhoz) nem távolítódik el semmiféle feldolgozási mechanizmus során. A kezdeti kitermelés a szekvenciaelemzésben váratlanul alacsony (20%), de ez valószínűleg nem annak tulajdonítható, hogy az NH₂-terminális metioninok egy része formileződik, mivel a formilezett fehéijék jelentősen eltérő pl-értékekkel rendelkeznek a nemformilezett polipeptidhez viszonyítva (és az autentikus ApoE-hez viszonyítva), ilyet pedig nem figyelünk meg.

A CNBr-peptidek közül sokat jellemzünk aminosav-összetételük szerint, és nem találunk eltérőket azoktól, amelyet autentikus ApoE-nél nyerünk (részletesen nem mutatjuk be). Ezenkívül a CB4 (109-125 gyökök az autentikus ApoE-ben) szekvenciaelemzése és a CB5 (az ApoE-ben a 164. helynek megfelelő helyen át) részleges szekvenciaelemzése megerősíti, hogy az ApoE-analóg szekvenciája azonos az autentikus ApoE3-éval a kritikus receptorkötési tartományban. Mindezek az adatok azt jelzik, hogy az NH₂-nél levő többletmetionin kivételével az ApoE-analóg szerkezete azonos az autentikus ApoE3 szerkezetével.

Az ApoE-analóg in vitro és in vivő metabolikus jellemzése

Az ApoE-DMPC-komplexek receptorkötési összehasonlítása azt demonstrálja, hogy az ApoE-analóg olyan kötési tulajdonságokkal bír, amelyek azonosak az autentikus ApoE kötési tulajdonságaival. Kompetíciós tanulmányokban ¹²⁵I-LDL-lel ApoB, E(LDL)-receptorhoz való kötődésnél tenyésztett fibroblasztokon, az

HU 214 977 Β

ApoE-analóghoz tartozó 50%-os helyettesítési koncentráció 0,019 pg/ml, összehasonlítva az autentikus ApoE 0,024 pg/ml-es értékével (29. ábra). Közvetlen, fibroblasztokhoz való kötési tanulmányokban mindkét ApoE-készítmény hasonló módon kötődik (29. ábra). A közvetlen kötődési adatok Scatchard-elemzése feltárja, hogy a biomémöki úton előállított, valamint autentikus ApoE-hez tartozó Kds-érték és maximális kötött mennyiség 0,93, illetve 0,96-10¹⁰ mol/liter, és 29,4, illetve 34,2 pg/mg sejtfehérje. Ezen túl mindkét ApoEkészítmény hasonlóan és hatásosan kötődik kutyamájmembránokon lévő ApoE-receptorokhoz (30. ábra).

Az ApoE-analóg és az autentikus ApoE in vivő metabolikus tulajdonságainak összehasonlítása szintén azt demonstrálja, hogy mindkét készítmény azonos módon viselkedik. Amikor ¹³¹I-ApoE-analógot és ¹²⁵I-autentikus ApoE-t összekeverünk, és normál nyúlplazmával inkubáljuk, majd a keveréket normál nyúlba injektáljuk, mindkét jelzés kiürül a vérkörből, azonos kinetikával (31. ábra). Mindkét jelzés injektált dózisainak 30%-os kiürülése az injektálástól számított mintegy 20 perc után következik be. Azonos eredményeket nyerünk reciprok módon jelzett fehérjékkel is, valamint akkor is, amikor tumovertanulmányokat végzünk patkányokban (részletesen nem mutatjuk be). így mind az in vivő, mind az in vitro tanulmányokban a biomémöki úton előállított és autentikus ApoE hasonló tulajdonságokat mutat, és lényegében azonos módon viselkedik.

Összefoglalva: az izolált ApoE-analóg szerkezeti jellemzése azt demonstrálja, hogy egy, az amino-terminálishoz hozzátett többlet-metioningyök kivételével az ApoE-analóg szerkezete azonos az autentikus ApoEével. Ezenkívül az ApoE-analóg és az autentikus ApoE mind in vitro, mind in vivő metabolikus tulajdonságai azonosak.

VI. táblázat

Az ApoE-analóg és az autentikus ApoE3^] aminosav-összetétele

	ApoE3- analóg	Autentikus ApoE3	ApoE3- szekvencia
Lys	12,1	12,0	12
His	2,0	2,0	2
Arg	33,3	33,3	34
Cys	0,8	0,8	1
Asp	12,3	12,4	12
Thr	10,5	10,5	11
Ser	12,7	12,6	14
Glu	72,0	71,9	71
Pro	8,5	8,4	8
Gly	17,3	17,3	17
Alá	35,6	35,5	35
Val	21,9	22,3	22
Met	7,7	6,5	7

	ApoE3- analóg	Autentikus ApoE3	ApoE3- szekvencia
Ile	L9	1,9	2
Leu	37,0	37,3	37
Tyr	3,8	3,9	4
Phe	3,2	3,2	3
Trp	nem határoztuk meg	nem határoztuk meg	7

¹ Az eredmények két párhuzamosban végzett meghatározásból erednek, és gyök/mólban vannak kifejezve. A ciszteint külön határozzuk meg perhangyasav-oxidáció után. A treonint és szerint nem korrigáljuk a hidrolitikus veszteségre. A triptofánt nem határozzuk meg. Az ApoE3-szekvencia a 4. irodalmi hivatkozásból származik.

Az alábbiakban a példához tartozó bibliográfiát soroljuk fel.

1. Mahley, R. W.: A „Disturbances in lipid and Lipoprotein Metabolism” (Zavarok a lipid- és lipoprotein metabolizmusban) című kiadványban (szerkesztők: Dietschy, J. M., Gotto, A. M. Jr. és Ontko, J. A.) [Az American Physiological Society (Amerikai Fiziológiai Társaság) kiadványa], 181-197. (1978).

2. Mahley, R. W., Innerarity, T. L., Rali, S. C. Jr. és Weisgraber, K. H.: J. Lipid Rés., 25, 1277-1294. (1984).

3. Mahley, R. W. és Innerarity, T. L.: Biochim. Biophys. Acta, 737, 197-222. (1983).

4. Rali, S. C. Jr., Weisgraber, K. H. és Mahley, R. W.: J. Bioi. Chem., 257, 4171^1178. (1982).

5. McLean, J. W., Elshourbagy, N. A., Chang, D. J., Mahley, R. W. és Taylor, J. M.: J. Bioi. Chem., 259, 6498-6504. (1984).

6. Olaisen, B., Teisberg, P. és Gedde-Dahl, T. Jr.: Hűm. Gén., 62, 233-236. (1982).

7. Paik, Y. K., Chang, D. J., Reardon, C. A., Davies, G. E., Mahley, R. W. és Taylor, J. M.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, nyomdában.

8. Utermann, G., Langenbeck, U., Beisiegel, U. és Weber, W.: Am. J. Hűm. Génét., 32, 339-347. (1980).

9. Zannis, V. I. és Breslow, J. L.: Biochemistry, 20, 1033-1041. (1981).

10. Zannis, V. I., Breslow, J. L., Utermann, G., Manley, R. W., Weisgraber, K. H., Havel, R. J., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Schonfeld, G., Hazzard, W. R., Blum, C.: J. Lipid Rés., 23, 911-914. (1982).

11. Utermann, G., Steinmetz, A. és Weber, W.: Hűm. Génét, 60, 344-351. (1982).

12. Havel, R. J.: Med. Clin. North Am., 66, 441-454. (1982).

13. Menzel, H. J., Kladetzky, R. G. és Assmann, G.: J. Bioi. Chem., 256, 9077-9083. (1981).

14. Weisgraber, K. H. és munkatársai: J. Bioi. Chem., 256, 9077-9083. (1981).

15. Rali, S. C. Jr., Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L. és Mahley, R. W.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 4696-4700. (1982).

HU 214 977 Β

16. Rali, S. C. Jr., Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. és Assmann, G.: J. Clin. Invest., 71, 1023-1031.(1983).

17. Weisgraber, K. H., Rali, S. C. Jr., Innerarity, T. L., Mahley, R. W,, Kuusi, T. és Ehnholm, C.: J. Clin. Invest., 73,1024-1033. (1984).

19. Mahley, R. W., Innerarity, T. L., Rali, S. C. Jr. és Weisgraber, K. H.: Ann. NY. Acad. Sci., nyomtatás alatt.

20. Innerarity, T. L., Friedlander, E. J., Rali, S. C. Jr., Weisgraber, K. H. és Mahley, R. W. (1983) J. Bioi. Chem., 258, 12 341-12 347. (1983).

20. Innerarity, T. L., Weisgraber, K. H., Amold, K. S:, Rali, S. C. Jr. és Mahley, R. W.: J. Bioi. Chem., 259, 7261-7267(1984).

21. Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Harder, K. J., Mahley, R. W., Milne, R. W., Marcel, Y. L. és Sparrow, J. T.: J. Bioi. Chem., 258, 12 348-12354. (1983).

26. Laemmli, U. K.: Natúré (London), 227, 680-685 (1970).

27. Towbin, H., Staehelin, T. és Gordon, J.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 148, 107-127. (1979).

28. Manzel, H. J. és munkatársai: J. Bioi. Chem., 254, 3070-3076. (1984).

29. Weisgraber, K. H. és Mahley, R. W.: J. Lipid Rés., 27,316-325 (1980).

30. Innerarity, T. L., Pitas, R. E. és Mahley, R. W.: J. Bioi. Chem., 254,4186-4190. (1979).

31. Innerarity, T. L. és Mahley, R. W.: Biochemistry, 17, 1440-1447. (1978).

32. Hűi, D. Y., Innerarity, T. L. és Mahley, R. W.: J. Bioi. Chem., 256, 5646-5655. (1981).

33. Mahley, R. W., Innerarity, T. L., Weisgraber, K. H. és Oh, S. Y.: J. Clin, Invest., 64, 743-750. (1979).

39. példa

A met-asp-gln-bGH-analóg biológiai aktivitása

Egy nem régi tanulmány (P. J. Eppard és D. E.

Bauman: Proceedings of 1984 Cornell Nutrition Conference fór Feed Manufacturers, 5-12. oldal) jelzi, hogy a metionil-szarvasmarhanövekedési-hormon folyamatos beadása egy 12 hetes időtartamon át növeli a tejtermelést 10-40%-kal a kontrolihoz viszonyítva. Hasonló eredményeket nyerünk a met-asp-gln-bGH-analógot alkalmazva, amelyet a pHG44-plazmid kódol, és amely növesztése, kinyerése és tisztítása a 13. példában leírt módon történik.

40. példa

A met-pGH-analóg biológiai aktivitása

Egy nem régi tanulmány [C. A. Spence és munkatársai: Az „Effect of Exogenous Growth Hormoné on Fetal Energy Storage and Lactation Performance in Sows” (Az exogén növekedési hormon hatása a magzatienergia-tárolásra és szoptatási hatásfokra anyakocákban) című előadás kivonata, elhangzott a „The Annual Meeting of The American Society of Animál Science” című tudományos találkozón, Univ. of Missouri, 1984. augusztus 7-10.] jelzi, hogy a hipofíziseredetű sertésnövekedésihormon növeli az anyakocák tejelválasztását és a malacalom túlélését. Egy szoptatási hatásfokra vonatkozó tanulmányban a met-pGH-analóg beadása vemhes anyakocákban javítja az anyakocák tejelválasztását és a malacalom túlélését.

41. példa

Rekombináns SÓD alkalmazása gerincveló-iszkémia kezelésében

Érzéstelenített kutyákat összekapcsolunk Nicolet Compact 4-el kiváltott villamos feszültségi rendszerrel, és így nyeqük a SEP (szomatoszenzoros kiváltott feszültség) alapvonalat 250 gerjesztést alkalmazva megszakítás nélkül 4,7 geqesztés/percnél a hátsó tibia-idegre. A 250 gerjesztés (stimulus) kiváltott feszültséget 2 elektródról rögzítjük az Fpz és Cz fölött (két specifikus pont az epikranon fölött), átlagoljuk jelátlagoló val (signal averager), hogy csökkentsük a jelet a jel-zaj-viszonyra, és a SEP-et képernyőre vetítjük ki.

Ezután balmellkasfeltárást végzünk, a lemenő aortát éppen disztálisan a bal kulcscsont alatti osztóémél kipreparáljuk és izoláljuk a keresztcsíptető alkalmazásához előkészítve. Egy érkötőt iktatunk be proximálisan az aorta keresztcsíptető javasolt helyéhez, és egy 20 gauge méretű kanült iktatunk be a proximális aorta nyomásának mérésére és a gyógyszerinfüzióhoz a kísérleti csoportban. Egy 14 gauge méretű kanült iktatunk be a jobb femorális artériába a vérnyomás megfigyelésére és a vér eltávolítására a vérnyomás szabályozásához a keresztcsíptető alkalmazása után. Sorozatosan vérgázmintákat veszünk, de a respirátort úgy állítjuk be, hogy a vérgázok a normális határok között maradjanak.

Ezután alkalmazzuk a keresztcsíptetőt éppen disztálisan a bal kulcscsont alatti osztóémél. A SEP-et ismételjük egyperces időközön át. A proximális aortás hipertenziót szabályozzuk vér eltávolításával a femorális artériából, a vérnyomást 90-110 Hgmm között (l,18T0⁴-l,45 10⁴ Pa) tartva. Az aortás keresztcsíptetőt további tíz percig fenntartjuk azután, miután a SEP eltűnik. A SEP-görbe eltűnése azt fejezi ki, hogy a mellkasi aorta keresztcsíptetővel elzárása által produkált iszkémia a gerincvelőn belül elég súlyos ahhoz, hogy veszélyeztesse az afferens impulzusok vezetését a gerincvelő dorzális oszlopon át. A SEP eltávolítása után 10 perccel a keresztcsíptetőket eltávolítjuk. A kutyák alacsony vérnyomásává válhatnak, amely vér Ringer-féle laktátés nátrium-bikarbonát-infuzióra helyreáll.

A kontrollkutyákban (n=8) az állatok nem kapnak semennyi rekombináns SOD-ot. A kísérleti állatokban az egyik csoport (n=8) egyampullányi rekombináns SOD-t (25 000 egység) kap a keresztcsíptető eltávolítása előtt, és ezt követi 5000 egység/perc beadása 10 percen át; a második kísérleti csoport (n=7) 50 000 egység rekombináns SOD-t kap a keresztcsíptető eltávolítása előtt, ezt követi 10 000 egység/perc beadagolása 10 percen keresztül.

A műtétek után a hátulsó láb neurológiai státusát a Tarlov-féle kritériumok alapján megítéljük: 0 = nincs mozgás a hátsó lábakban; 1 = gyenge mozgás a hátsó lábakban; 2 = jó mozgás a hátsó lábakban, de nem képes felállni; 3 = képes felállni, de nem normálisan; 4

HU 214 977 Β = teljes gyógyulás. A 17. napon a műtét után a SEP-et megismételjük és rögzítjük az alapvonallal való összehasonlításhoz. Az állatokat ezután leöljük.

Az eredmények a következők:

Neurológiai státus a műtét után 17. nappal (POD): Kontrollállatok (n=8) - 4 állat „0” fokozatú,

- 4 állat 2. vagy 3. fokozatú. Kísérleti állatok (I) - 25 000 SÓD egységet tartalmazó ampulla beadása először, majd 5000 egység/perc 10 percen át:

- 6 állat teljes felgyógyulást mutat,

- 2 állat 2. vagy 3. fokozatú. Kísérleti állatok (II) - 50000 SÓD egységet tartalmazó ampulla beadása először, majd 10000 egység/perc 10 percen át.

- mind a 7 állat teljes felgyógyulást mutat.

Az idő, amely az SEP eltűnéséig eltelik az aortás keresztcsíptető alkalmazása után, 12 és 19 perc között változik. Mivel a keresztcsíptetőt még 10 percig fenntartjuk azután, hogy a SEP eltűnik, a teljes keresztcsíptetős idő több mint 20 perc.

Az operáció utáni közvetlen időszakban a mellkasi seb lezárása után ismételt SEP-et végzünk. A kontroliállatokban nincs megfigyelhető SEP-vonal, ezzel ellentétben a kezelt állatoknál a SEP-vonal visszatérésére mutatkozik a hullámforma lappangási idejében való késleltetéssel.

Összegezve: A rekombináns SÓD hasznosnak bizonyul a gerincvelő-iszkémiának tulajdonítható neurológiai sérülések megakadályozásában. A kezelésnek ez a módszere különösen fontos a mellkasi aorta-értágulat sebészetében.

Claims (70)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás kívánt polipeptid előállítására bakteriális gazdasejtekben, amely eljárás szerint termolabilis C_r represszort tartalmazó gazdasejtbe javított vektort magába foglaló píazmidot juttatunk, amely plazmidba a kívánt polipeptidet kódoló gént tartalmazó DNS-szekvencia be van építve, azzal jellemezve, hogy javított vektorként egy kettős szálú DNS-molekulát tartalmazó vektort alkalmazunk, amely DNS 5’—>3’ irányban, sorrendben a következőket foglalja magában:

   a) egy lambda bakteriofágból eredő P_LO_L-promotert és -operátort tartalmazó DNS-szekvenciát;

   b) egy N-hasznosító helyet az N antiterminátor fehérje kötéséhez;

   c) egy első restrikciós hasítóhelyet, amely lehetővé teszi az utána következő riboszomális kötőhelyet tartalmazó DNS-szekvencia helyettesítését;

   d) egy DNS-szekvenciát, amely egy riboszomális kötőhelyet tartalmaz, és elősegíti a kívánt gén mRNS-ének riboszómákhoz történő kötődését a gazdasejten belül;

   e) egy ATG iniciációs kodont vagy egy DNS-szekvenciát, amely ATG iniciációs kodonná alakul át a kívánt gén vektorba építése folytán; és

   f) egy második restrikciós hasítóhelyet, melynek felhasználásával a kívánt polipeptidet kódoló gén be van építve a vektorba az ATG iniciációs kodonnal azonos leolvasási fázisban;

   g) és amely DNS ezenfelül magában foglal egy olyan DNS-szekvenciát, amely egy, a gazdasejtben autonóm replikációra képes bakteriális plazmidból származó replikációs origót tartalmaz; továbbá egy szelekciós eszközt, amely olyan DNS-szekvencia, amely egy szelektálható vagy azonosítható fenotípusos jellemzővel társult gént tartalmaz, amely manifesztálódik, amikor a vektor jelen van a gazdasejtben, és/vagy olyan DNS-szekvencia, amely a cl⁴³⁴-nek nevezett fragmenst tartalmazza, ahol ez a fragmens magában foglalja a d⁴³⁴-represszorfehérjéhez szolgáló gént és ennek társult promoter- és operátor-szekvenciáját; a távolság a P_LO_Lpromoter- és operátor-szekvencia 3’-vége és azN-hasznosító hely 5’-vége között kevesebb mint 80 bázispár, és a távolság az N-hasznosító hely 3’-vége és a riboszomális kötőhely 5’-vége között kevesebb mint 300 bázispár, és a transzformált gazdasejteket tenyésztjük, majd a kapott polipeptidet kinyeqük.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort alkalmazunk, amelyben a g) pont szerinti szelekciós eszköz egy olyan DNS-szekvencia, amely egy szelektálható vagy azonosítható fenotípusos jellemzővel társult gént tartalmaz.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fenotípusos jellemző gyógyszer-rezisztencia.
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gyógyszer-rezisztencia ampicillin- vagy tetraciklin-rezisztencia.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort alkalmazunk, amely magában foglal még egy olyan DNS-szekvenciát, amely egy T)T₂ rRNS-szekvenciát tartalmaz a második restrikciós hasítóhelytől 3’-irányban elhelyezve.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort alkalmazunk, amelyben a T,T₂ rRNS-szekvencia kevesebb mint 100 bázispárra van a második restrikciós hasítóhely 3’-végétől.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort alkalmazunk, amelyben a TjT₂ rRNS-szekvencia kevesebb mint 20 bázispárra van a második restrikciós hasítóhely 3’-végétől.
8. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort alkalmazunk, amelyben a g) pont szerinti szelekciós eszköz egy olyan DNS-szekvencia, amely a cl⁴³⁴-nek nevezett fragmenst tartalmazza.
9. 9. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort alkalmazunk, amelyben a cl⁴³⁴fragmens a TjT₂ rRNS-szekvencia 3’-vége után helyezkedik el.
10. 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort alkalmazunk, amelyben a g) pont szerinti replikációs origó pBR322-ből (ATCC 37017) származik.
11. 11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort alkalmazunk, amelyben a g) pont

    HU 214 977 Β szerinti replikációs origó egy, a gazdasejtben autonóm reprodukcióra és legalább 400 konstitutív vektorkópia előállítására képes bakteriális plazmidból származik.
12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort alkalmazunk, amelyben a replikációs origó ColEl-bői származik.
13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort alkalmazunk, amelyben a replikációs origó pOPIAó.
14. 14. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort alkalmazunk, amely tartalmaz még egy harmadik restrikciós helyet a riboszomális kötőhelyet tartalmazó DNS-szekvencia és az ATG iniciációs kodon között elhelyezve.
15. 15. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort alkalmazunk, amelyben a c) pont szerinti első restrikciós hasítóhely egy egyedi hely a vektoron belül.
16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort alkalmazunk, amelyben az első restrikciós hasítóhely EcoRI-hasítóhely.
17. 17. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort alkalmazunk, amelyben az f) pont szerinti második restrikciós hasítóhely egy egyedi hasítóhely a vektoron belül.
18. 18. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort alkalmazunk, amelyben a második restrikciós hasítóhely Ndel-, Bglll- vagy Smalhasítóhely.
19. 19. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort alkalmazunk, amelyben a d) pont szerinti riboszomális kötőhely lambda-bakteriofágból származó C_n és a

    TAAGGAAATACTTACAT

    ATTCCTTTATGAATGTA szekvenciával rendelkezik.
20. 20. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort alkalmazunk, amelyben a d) pont szerinti riboszomális kötőhely lambda-bakteriofágból származó C_n-mutánsa, és a

    TAAGGAAGTACTTACAT

    ATTCCTTCATGAATGTA szekvenciával rendelkezik.
21. 21. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort alkalmazunk, amelyben a d) pont szerinti riboszomális kötőhely a pBR322-ből (ATCC 37017) származó természetes β-laktamáz riboszomális kötőhely.
22. 22. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort alkalmazunk, amelyben a d) pont szerinti riboszomális kötőhely az

    AATTCGAGCGCAAGGAAACAGGCTCA

    GCTCGCGTTCCTTTGTCCGAGTAT szekvenciával rendelkező szintetikus oligomer.
23. 23. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort alkalmazunk, amelyben a d) pont szerinti riboszomális kötőhely az

    AATTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAG

    GTTATTATAACTTTTTCCTTCTCAT szekvenciával rendelkező szintetikus oligomer.
24. 24. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vektorként pJH200 (ATCC 39783) jelű vektort alkalmazunk.
25. 25. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vektorként pRO211 jelű vektort alkalmazunk.
26. 26. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vektorként a p579 jelű vektort vagy származékát alkalmazzuk.
27. 27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort alkalmazunk, amelyben a cl⁴³⁴fragmenst tartalmazó DNS-szekvencia a p579 vektor Clal-hasítóhelyére van klónozva.
28. 28. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort alkalmazunk, amely a p8300-10Aplazmidból (ATCC 39785) a met-phe-bGH-gén eltávolításával keletkezik.
29. 29. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort alkalmazunk, amely a pSAL-170/10-plazmidból a rec bGH-gén eltávolításával keletkezik.
30. 30. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort alkalmazunk, amely pSAL-210/4plazmidból a rec bGH-gén eltávolításával keletkezik.
31. 31. Az 1. igénypont szerinti eljárás polipeptidként szarvasmarhanövekedési-hormon vagy valamely analógja előállítására, azzal jellemezve, hogy olyan plazmidot alkalmazunk, amely egy szarvasmarhanövekedési-hormont vagy valamely analógját kódoló gént tartalmaz a vektor második restrikciós hasítóhelyébe inszertálva.
32. 32. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szarvasmarhanövekedési-hormont kódoló gént tartalmazó plazmidként pRO12 jelű plazmidot alkalmazunk.
33. 33. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szarvasmarhanövekedési-hormont kódoló gént tartalmazó plazmidként pSAL 5200-6 jelű plazmidot alkalmazunk.
34. 34. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szarvasmarhanövekedési-hormont kódoló gént tartalmazó plazmidként pHG44 jelű plazmidot (ATCC 39806) alkalmazunk.
35. 35. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szarvasmarhanövekedési-hormont kódoló gént tartalmazó plazmidként pSAL 5600-1 jelű plazmidot alkalmazunk.
36. 36. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szarvasmarhanövekedési-hormont kódoló gént tartalmazó vektorként p7200-22 jelű vektort alkalmazunk.
37. 37. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szarvasmarhanövekedési-hormont kódoló gént tartalmazó plazmidként pHG50 jelű plazmidot (ATCC 39805) alkalmazunk.
38. 38. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szarvasmarhanövekedési-hormont kódoló gént tartalmazó plazmidként pSAL-210/4 jelű plazmidot alkalmazunk.
39. 39. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szarvasmarhanövekedési-hormont kódoló gént

    HU 214 977 Β tartalmazó plazmidként p8300-10A jelű plazmidot (ATCC 39785) alkalmazunk.
40. 40. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szarvasmarhanövekedési-hormont kódoló gént tartalmazó plazmidként pSAL-130/5 jelű plazmidot alkalmazunk.
41. 41. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szarvasmarhanövekedési-hormont kódoló gént tartalmazó plazmidként pSAL-170/10 jelű plazmidot alkalmazunk.
42. 42. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szarvasmarhanövekedési-hormont kódoló gént tartalmazó plazmidként p9200 jelű plazmidot (ATCC 53215) alkalmazunk.
43. 43. Azl. igénypont szerinti eljárás polipeptidként humán növekedési hormon vagy valamely analógja előállítására, azzal jellemezve, hogy olyan plazmidot alkalmazunk, amely egy humán növekedési hormont vagy valamely analógját kódoló gént tartalmaz a vektor második restrikciós hasítóhelyébe inszertálva.
44. 44. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán növekedési hormont kódoló gént tartalmazó plazmidként pTV300 jelű plazmidot alkalmazunk.
45. 45. Az 1. igénypont szerinti eljárás polipeptidként szuperoxid-diszmutáz vagy valamely analógja előállítására, azzal jellemezve, hogy olyan plazmidot alkalmazunk, amely egy szuperoxid-diszmutázt vagy valamely analógját kódoló gént tartalmaz a vektor második restrikciós hasítóhelyébe inszertálva.
46. 46. A 45. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szuperoxid-diszmutázt kódoló gént tartalmazó plazmidként pSODa2 jelű plazmidot (ATCC 39786) alkalmazunk.
47. 47. A 45. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szuperoxid-diszmutázt kódoló gént tartalmazó plazmidként pSODpl jelű plazmidot alkalmazunk.
48. 48. A 45. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szuperoxid-diszmutázt kódoló gént tartalmazó plazmidként pSODP]T_n jelű plazmidot alkalmazunk.
49. 49. A 45. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szuperoxid-diszmutázt kódoló gént tartalmazó plazmidként pSODPjBA2 jelű plazmidot alkalmazunk.
50. 50. A 45. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szuperoxid-diszmutázt kódoló gént tartalmazó plazmidként pSODP]TT—1 jelű plazmidot alkalmazunk.
51. 51. Az 1. igénypont szerinti eljárás polipeptidként sertés-növekedésihormon vagy valamely analógja előállítására, azzal jellemezve, hogy olyan plazmidot alkalmazunk, amely egy sertés-növekedésihormont vagy valamely analógját kódoló gént tartalmaz a vektor második restrikciós hasítóhelyébe inszertálva.
52. 52. Az 51. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy sertés-növekedésihormont kódoló gént tartalmazó plazmidként p3008 jelű plazmidot (ATCC 39804) alkalmazunk.
53. 53. Az 51. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy sertés-növekedésihormont kódoló gént tartalmazó plazmidként p3009 jelű plazmidot alkalmazunk.
54. 54. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdaszervezetként E. coli-t alkalmazunk.
55. 55. Az 54. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy E. coli gazdaszervezetként pRec 2/3-plazmidot tartalmazó A1637 törzset alkalmazunk (ATCC 39385).
56. 56. Az 54. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy E. coli gazdaszervezetként pApoE-Ex.2plazmidot tartalmazó A1645 törzset alkalmazunk (ATCC 39787).
57. 57. Az 54. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy E. coli gazdaszervezetként pSODoc2-plazmidot tartalmazó A2097 törzset alkalmazunk (ATCC 39786).
58. 58. Az 54. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy E. coli gazdaszervezetként SA500 his ile gal⁺A8 (λοΙ857ΔΗ1ΔΒΑΜΝ⁺) fenotípusú vagy SA500 his ilc-gal'AS lacZ A21 (ÁcI857 int2 xisl nutL₃AHl) fenotípusú törzset alkalmazunk.
59. 59. Az 54. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort alkalmazunk, amely tartalmaz még egy cl⁴³⁴-fragmenst és E. coli gazdaszervezetként pHG50-et tartalmazó E. coli Α1645(λϊ434οΓ mini TnlO) törzset (ATCC 39805) alkalmazunk.
60. 60. Az 54. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy E. coli gazdaszervezetként prototróf gazdaszervezetet alkalmazunk.
61. 61. A 60. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy E. coli gazdaszervezetként pHG44-et és az F’gal-plazmidot tartalmazó, A4346-nak is nevezett E. coli A4200 (ATCC 53218) törzset alkalmazunk.
62. 62. A 60. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy E. coli gazdaszervezetként p9200-at tartalmazó, és A4320-nak is nevezett E. coli A4255 (ATCC 53215) törzset alkalmazunk.
63. 63. A 60. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdaszervezetként biotin-független gazdaszervezetet alkalmazunk.
64. 64. Az 54. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdaszervezetként egy lizálható törzset alkalmazunk.
65. 65. A 64. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy E. coli gazdaszervezetként pGH44-et tartalmazó, A3111-nek is nevezett E. coli A4048 (ATCC 53217) törzset alkalmazunk.
66. 66. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzformált gazdasejteket megfelelő tápközegben 42 °C körüli hőmérsékleten növesztjük.
67. 67. A 66. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növesztést 42 °C hőmérsékleten, 1-5 órán át végezzük.
68. 68. A 66. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növesztést kazein-hidrolizátum tápközegben végezzük.
69. 69. Eljárás egy kívánt polipeptid előállítására egy bakteriális gazdasejtben egy termolabilis C_rrepresszort tartalmazó megfelelő bakteriális gazdasejtnek egy javított vektorral való transzformálásával, amely vektorba egy, a kívánt polipeptidet kódoló gént magában foglaló DNS-szekvencia van inszertálva, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtet egy kettős szálú DNS-molekulát tar53

    HU 214 977 Β talmazó vektorral transzformáljuk, amely molekula a következőket foglalja magában 5’—>3’ sorrendben:

    a) egy DNS-szekvencia, amely tartalmazza a lambdabakteriofágból származó P_L0_L-promotert és -operátort;

    b) egy DNS-szekvencia, amely tartalmaz egy riboszomális kötőhelyet, hogy a kívánt gén mRNS-ét képessé tegye a riboszómához kötődni a gazdasejten belül;

    c) egy ATG iniciációs kodon, vagy egy olyan DNSszekvencia, amely ATG iniciációs kodonná alakul át a kívánt génnek a vektorba való beiktatása folyamán;

    d) egy restrikciós hasítóhely, a kívánt génnek a vektorba való beiktatására, az ATG iniciációs kodonnál fázisban;

    e) egy DNS-szekvencia, amely tartalmaz egy T,T₂ rRNS transzkripciós terminációs szekvenciát;

    f) és még egy DNS-szekvencia, amely tartalmaz egy, a gazdasejtben autonóm replikációra képes plazmidból származó replikációs origót, valamint magában foglal még egy olyan DNS-szekvenciát, amely tartalmaz egy gént, összekapcsolódva egy szelektálható vagy azonosítható fenotípussal, amely manifesztálódik, ha a vektor jelen van a gazdasejtben, és a transzformált gazdasejteket a kívánt polipeptid termelésére alkalmas körülmények között tenyésztjük, és a kapott polipeptidet kinyerjük.
70. 70. Eljárás egy kívánt polipeptid előállítására egy bakteriális gazdasejtben egy termolabilis C_rrepreszszort tartalmazó megfelelő bakteriális gazdasejtnek egy javított vektorral való transzformálásával, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtet egy kettős szálú DNSmolekulát tartalmazó vektorral transzformáljuk, amely molekula a következőket foglalja magában 5’—>3’ sorrendben:

    a) egy DNS-szekvencia, amely tartalmazza a lambdabakteriofágból származó P_LO_L-promotert és -operátort;

    b) egy DNS-szekvencia, amely tartalmaz egy riboszomális kötőhelyet, hogy a kívánt gén mRNS-ét alkalmassá teszi a riboszómához történő kötődésre a gazdasejten belül;

    c) egy ATG iniciációs kodon, vagy egy olyan DNSszekvencia, amely ATG iniciációs kodonná alakul át a kívánt génnek a vektorba való beiktatása folytán;

    d) egy restrikciós hasítóhely, a kívánt génnek a vektorba való beiktatására, az ATG iniciációs kodonnál azonos leolvasási fázisban;

    e) és még egy DNS-szekvencia, amely tartalmaz egy, a gazdasejtben autonóm replikációra képes plazmidból származó replikációs origót, valamint magában foglal még egy olyan DNS-szekvenciát, amely tartalmaz egy cl⁴³⁴-nek nevezett fragmenst, amely fragmens magában foglalja a cl⁴³⁴-represszorfehéije génjét, és ehhez társult promotert és operátort, és a transzformált gazdasejtet a kívánt polipeptid termelésére alkalmas körülmények között tenyésztjük, és a kapott polipeptidet kinyeijük.