HU215160B - Eljárás humán Cu/Zn szuperoxid dizmutáz előállítására és tisztítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás rekőmbináns hűmán Cű/Zn szűperőxid dizműtázvagy analógja hatékőny, rekőmbináns előállítására. A találmány szerinti eljárással előállítható enzim alkalmasőxigéntartalmú tőxikűs szabad gyökök győrs és hatékőny eltávőlításárabiőlógiai mintákból, alkalmazható példáűl átültetendő zervekkőnzerválására. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás rekombináns humán Cu/Zn szuperoxid dizmutáz vagy analógja hatékony, rekombináns előállítására.

A találmány szerinti eljárással előállítható enzim alkalmas oxigéntartalmú toxikus szabad gyökök gyors és hatékony eltávolítására biológiai mintákból, előnyösen alkalmazható például átültetendő szervek konzerválására.

A genetikai manipulációk egyik szempontja magában foglalja az eukarióta forrásokból származó idegen DNS szekvenciák beiktatását Escherichia coli-ba vagy más mikroorganizmusokba. A genetikai manipulációk egy további tökéletesítése az így létrejött mikroorganizmusok indukciójával az idegen DNS által kódolt polipeptidek termelésére vonatkozik. A polipeptidek termelését kétlépcsős folyamatnak lehet tekinteni, ahol mindegyik lépés számos allépést foglal magában. A két lépés az átírás (transzkripció) és transzláció. Hogy a polipeptidet hatékonyan és nagy mennyiségben állíthassuk elő, a folyamat mindkét lépésének hatékonynak kell lennie. Az átírás az mRNS termelése a génből (DNS). A transzláció a polipeptid termelése az mRNS-ből.

Az átírási folyamat kritikus allépése a beindítás (iniciáció), azaz, az RNS polimeráz kötődése egy promotor-operátor területhez. A dezoxiribonukleotid bázisok szekvenciája, amely kialakítja a promotor területet, változhat, és ezáltal hat a promotor relatív hatékonyságára. A hatékonyság függ az RNS polimeráz affinitásától a promotorhoz.

A transzláció hatékonyságára az mRNS stabilitása hat. Az mRNS megnövekedett stabilitása lehetővé teszi a megjavult transzlációt. Bár az mRNS stabilitás pontos determinánsai nem ismeretesek pontosan, ismeretes, hogy az mRNS szekunder szerkezete, amint ezt bázisainak szekvenciájával meghatározzuk, szereppel bír a stabilitásban.

A transzláció kezdeti allépése magában foglalja a riboszóma kötését egy bázis szekvenciához az mRNSen, amely szekvencia mint Shine-Dalgamo szekvencia vagy riboszomális kötőhely (RBS) ismeretes. A polipeptidek szintézise akkor kezdődik, amikor a riboszóma végigvándorol az mRNS mentén az AUG startkodonhoz a transzláció érdekében. Általában ezek a kodonok mintegy 10 bázissal „lefele” találhatók a ShineDalgamo helytől. Azok a faktorok, amelyek növelik a transzláció hatékonyságát, olyanok lehetnek, amelyek fokozzák a riboszómák kötését a Shine-Dalgamo helyhez. Kimutatták, hogy az mRNS szerkezete a ShineDalgamo szekvencia és az AUG kodon területében és a távolság a Shine-Dalgamo szekvencia és az AUG kodon között kritikus szerepet játszik a transzláció hatékonyságának megállapításában. További tényezők, amelyek hatnak a transzláció hatékonyságára, a korai befejezés és a legyengítés. A transzláció hatékonyságát lehet javítani a gyengítő (attenuáló) helyek eltávolításával.

Egy nehézség, amellyel szemben találjuk magunkat a nagy mennyiségű eukarióta polipeptid bakteriális sejtben való termelésére irányuló kísérletekben, a sejtek azon képességének hiánya, hogy nagy mennyiségű mRNS-t termeljenek, hogy hatékonyan nőjenek. Ezt a nehézséget el lehet tüntetni az átírás megelőzésével egy repressziónak ismert folyamattal. A repressziós gének kikapcsolódnak egy fehérje inhibitor (represszor fehérje) működése következtében, amely megakadályozza az átírást az operátor területhez való kötéssel. Miután a mikroorganizmus kinőtt a kívánt sejtsűrűségre, a represszált gén aktiválódik a represszor destrukciójával vagy egy induktomak ismert molekula hozzáadásával, amely felülmúlja a represszor hatását.

Számos közleményt lehet találni az irodalomban, amelyek az eukarióta gének klónozására vonatkoznak a Λ bakteriofágból származó P_L promotort tartalmazó plazmidokban [Bemard, Η. V. és munkatársai: Gene, 5, 59 (1979); Deron, C. és munkatársai: Gene, 17, 45 (1982); Gheysen, D. és munkatársai: Gene, 17, 55 (1982); Hedgpeth, J. és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 163, 197 (1978); Remuot, E. és munkatársai: Gene, 15, 81 (1981), és Dérynék, R. és munkatársai: Natúré, 287, 193 (1980)]. Ezeken kívül a 041,767 számú Európa szabadalmi bejelentés, amelyet 1981. december 16-án tettek közzé, leúja a λ-bakteriofágból származó P_L promotort tartalmazó kifejeződő vektorokat. Ezeknek az irodalmi hivatkozásoknak azonban egyike sem írja le a C_n riboszomális kötőhely alkalmazását.

A λ bakteriofágból származó P_L promotort és a C_n riboszomális kötőhelyet tartalmazó vektort már leírták [Oppenheim, A. B. és munkatársai: J. Mól. Bioi. 158, 327 (1982); és Shimatake, H. és Rosenberg, M.: Natúré, 292, 128 (1981)]. Ezek a közlemények leírták a C_n fehérje megnövekedett szintű termelését, de nem vonatkoztatták ezt eukarióta fehérjék termelésére, és nem írták le ezt.

Más vektorokat is írtak le, amelyek tartalmazzák a P_L promotort és a C_n riboszomális kötőhelyet [Courtney, M. és munkatársai: PNAS, 81, 669-673 (1984); Lautenberger, J. A. és munkatársai: Gene, 23, 75-84 (1983), és Lautenberger, J. A. és munkatársai: Science, 221, 858-860 (1983)]. Mindezek a vektorok azonban fúziós fehérjék termeléséhez vezetnek, amelyek a C_n fehéqe amino terminális részét tartalmazzák.

1982-ben Shatzman és Rosenberg mutattak be egy posztert a 14. Miami Téli Szimpóziumon [Shatzman, A. R. és Rosenberg, M.: 14. Miami Winter Symposium, Kivonatok, 98. oldal (1982)]. Ez a kivonat egy olyan vektor használatának kivitelre nem alkalmas bemutatását nyújtja, amely λ bakteriofágból származó P_L-t, Nutot és a C_n riboszomális kötőhelyet tartalmaz, azzal a céllal, hogy egy „eukarióta” polipeptidet (a SV40 kis T antigén valójában nem eukarióta polipeptid, hanem virális polipeptid) szintetizáljanak a sejtfehérje több, mint 5%-nyi mennyiségében, egy meg nem nevezett bakteriális gazdasejtben. Az alkalmazott operátor nincs meghatározva. Sem a replikáció kezdőpontja (origin), sem szelektálható fenotípushoz tartozó gén nincs azonosítva. Ez a rendszer, amellyel a vektort használjuk, úgy van leírva, hogy bizonyos gazdaszervezet lizogéneket foglal magában, amelyekbe a vektort stabilan lehet transzformálni.

A bejelentők tisztában vannak azzal, hogy létezik egy függőben levő szabadalmi bejelentés M. Rosenberg

HU 215 160 Β nevén, 457,352 bejelentési sorozatszámon [Bejelentő: National Institutes of Health, Department of Health and Humán Services (Nemzeti Egészségügyi Intézmények, Egészségügyi és Embervédelmi Osztály), USA]. Ennek a bejelentésnek a részletei hozzáférhetők a National Technical Information Service, US. Department of Commerce-nél (Egyesült Államok Kereskedelmi Minisztérium, Nemzeti Technikai Információs Szolgálat). Az igénypontok azonban nem hozzáférhetőek, és bizalmasan kezelik azokat. A bejelentés hozzáférhető részét átvizsgáltuk, ennek részletezése azonban nem kielégítő. Ez az ismertetés jelzi, hogy a gazdaszervezetnek fontos szerepe van (8. oldal, 17. sor), ugyanakkor nem nevez meg egyetlen megfelelő gazdaszervezetet sem. Ez az eljárás továbbá függ egy mutáns alkalmazásától, de ez nincs részletesen megnevezve (4. oldal, 20. sor). Ez az ismertetés azt is jelzi, hogy a gazdaszervezet lizogéneket tartalmaz (8. oldal, 18. sor), nem úgy, mint a jelen találmány, amelyben a gazdaszervezet nem lizogén. Ebben az említett leírásban egy eukarióta gén, a majom metallotionein gén klónozásáról és kifejeződéséről esik szó (7. oldal, 18. sor), de részleteket nem adnak meg. Ez az ismertetés megadja, hogy semmiféle nukleotidnak sem szekvenciája, sem helyzete a C_n riboszomális kötő területben nem változott (3. oldal, 27. sor).

A függőben levő 514,188 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (bejelentve 1983. július 15-én) új vektorokat ír le, amelyek polipeptidek kifejeződéséhez alkalmasak baktériumokban. Ezek a vektorok magukban foglalnak P_LO_L-t, Nhasznosító helyet antiterminátor N fehéije kötéséhez, riboszomális kötőhelyet, ATG kodont, restrikciós enzim-helyet a kívánt polipeptidet kódoló gén beiktatásához, egy replikácíós kiindulást (origót), és egy szelektálható markert. Ezekben a vektorokban a távolság az N hasznosító hely és a riboszomális kötőhely között nagyobb, mint körülbelül 300 bázispár. Ezen kívül ezeknek a vektoroknak mindegyike tartalmaz egy fajlagos riboszomális kötőhelyet, amelyet nem lehet könnyen helyettesíteni. Ezek a vektorok nem egyformán hasznosak különböző polipeptidek kifejeződéséhez.

T,T₂ rRNS átíró terminációs (befejező) szekvenciákat írtak le Brosius és társai [J. Mól. Bioi. 148, 107 (1981)]. A T)T₂ rRNS terminációs szekvenciáinak elhelyezését egy prokarióta gén 3 ’ végénél, és az ilyen gén kifejeződését egy promotor szabályozása alatt már leírták [Amann, E. és munkatársai: Gene, 25, 167 (1983); Zabeau, M. és munkatársai: The EMBO Journal, 1, 1217(1982)].

A 81304573.9 számú Európa-szabadalmi bejelentés, amelyet 1982. április 14-én publikáltak 049,619 Európaközrebocsátási számon, ismerteti a XcI857 hőindukálható represszomak, mint stabilizáló elemnek az alkalmazását. A represszor a plazmidon van klónozva. Xc l90 profágot, amely a represszor szintézisben hiányos, vezetnek be átfertőzéssel. A profágot a klónozott represszor segítségével tartják fenn 32 °C hőmérséklet alatt. Bármelyik sejt, amely a plazmidot elveszti, lizálódik. Ha a hőmérsékletet 38 °C fölé emelik, a represszor elroncsolódik vagy inaktiválódik, és a sejtek lizálódnak. Ez a stabilizáló rendszer nem fér össze a jelen találmány szerinti vektorokkal, amelyek XP_L promotor foglalnak magukban, és amelyek 38 °C fölötti hőmérsékleteknél polipeptideket fejeznek ki.

A replikáció origói a konstitutíven nagy kópiaszámú plazmidokból ismertek. így például a ColE 1-ből származó ρΟΡ1Δ6 replikácíós origót írták le Gelfand, D. H. és munkatársai: PNAS, 75, (12) 5869 (1978); és Muesing, M. és munkatársai: Cell, 45, 235 (1981). Ezen kívül ismeretesek a konstitutív nagy kópiaszámú plazmidoktól megkülönböztethető nagy kópiaszámú „elszabadult” (runaway) replikácíós plazmidok [Remaut, E. és munkatársai: Gene, 22, 103 (1983)].

A jelen találmány olyan kifejeződő vektorokra vonatkozik, amelyek váratlanul különböző polipeptidek megnövekedett kifejeződését nyújtják. A jelen találmány szerinti vektorokban különböző riboszomális kötőhelyek alkalmazásával lehetséges különböző polipeptidek megnövekedett kifejeződési szintjét elérni, a korábbi vektorokkal elért szintekhez viszonyítva. Ezen kívül azonos riboszomális kötőhelyeket alkalmazva, mint a korábbi vektorokban, lehetséges azonos polipeptidek megnövekedett kifejeződését elérni. Ezen túl egy polipeptidet, amelynek kifejeződése a célunk, kódoló gén 3’ végénél T^ rRNS terminációs szekvencia elhelyezésével lehetséges növelni a kívánt polipeptid mennyiségét, a bakteriális gazdaszervezet által termelt teljes polipeptidhez viszonyítva. Nagyjelentőségű, hogy a TjT₂ rRNS átíró terminációs szekvenciák jelenléte lehetővé teszi, hogy a konstitutív nagy kópiaszámú plazmidokból származó replikácíós origók beépüljenek a kifejeződő vektorokba anélkül, hogy csökkenne a képesség a replikációra konstitutíven nagy kópiaszámban.

A pBR322-ből, vagy nem konstitutíven nagy kópiaszámú, az „elszabadult” nagy kópiaszámú plazmidoktól eltérő vektorokból származó replikácíós origó, amikor egy vektorba építjük be, sejtenként csak bizonyos kópiaszám előállítására képes, ez tipikusan 40 kópia/sejt. Egy konstitutíven nagy kópiaszámú plazmidból eredő replikácíós origó helyettesítésével váratlanul azt találtuk, hogy a polipeptid kifejeződés szintje növekszik.

A jelen találmány szerinti vektorok stabilizálódnak a bakteriális gazdaszervezetben, és amikor a polipeptideket kódoló vektorokat és géneket magában foglaló plazmidokat tartalmazó baktériumokat növesztjük, a plazmidok nem vesznek el. Ezen az úton a plazmidok instabilitása által okozott kitermeléscsökkenést leküzdjük. Ezen túl az ilyen előnyös vektorok alkalmazása elkerüli az antibiotikum-rezisztencia, mint szelektálható marker alkalmazását, így lehetővé teszi a költségek alacsonyabb szinten tartását a polipeptidek előállításához.

A szuperoxid-diszmutáz (SÓD) és analógjaik azok közé a polipeptidek közé tartoznak, amelyeket elő lehet állítani a jelen találmány szerinti kifejeződő vektorokat alkalmazva.

A jelen találmány különösen olyan kifejeződő plazmidokra vonatkozik, amelyek nem várt módon szuperoxid-diszmutáz és analógjai megnövekedett kifejeződését nyújtják, ugyanazokat a riboszomális kötőhelyeket alkalmazva, mint a korábbi vektorokban, és al3

HU 215 160 Β kalmazva különböző riboszomális kötőhelyeket is, amint ezt a jelen találmányban leíijuk.

A jelen találmány olyan módszerekre is vonatkozik, amelyek az SÓD és analógjai megnövekedett termeléséhez vezetnek az ezeket a plazmidokat tartalmazó baktériumokban.

A szuperoxid-diszmutázt (SÓD) és az oxigén-szabadgyökök (O₂ ) jelenségét 1968-ban fedezte fel McCord és Fridovich [McCord, J. M. és Fridovich, I.: J. Bioi. Chem. 244, 6049-6055 (1969)]. Szuperoxid gyökök és más igen reaktív oxigén-fajták termelődnek minden lélegző sejtben, mint az oxidatív metabolizmus melléktermékei, és ezekről kimutatták, hogy kiterjedt kárt okoznak a makromolekulák és a sejtkomponensek széles választékában [erről szóló összefoglaló munkák: Fridovich, I. ismertetése az Advances in Inorganic Biochemistry című kiadvány (1970) 67-90 oldalán (szerkesztők: Eichhom, G. L. és Marzilli, L. G., kiadó: Elsevier (North Holland, New York); és Freeman, B. A. és Crapo, J. D.: Laboratory Investigation 47, 412-426 (1982)]. A metalloproteinek szuperoxiddiszmutázként ismert csoportja katalizálja a következő oxidációs-redukciós reakciót:

2O₂ —' + 2H+ —> H₂O₂ + O₂, és így védekező mechanizmust nyújt az oxigén toxicitása ellen. Az SOD-knek három formája ismeretes, ezek különböző fémeket tartalmaznak a fehéqe-molekulákban, nevezetesen vasat, mangánt, vagy mind rezet, mind cinket. Mindegyikük ugyanazt a reakciót katalizálják teljes hatékonysággal, és mind azonos mechanizmussal működnek, amelyben a fém a katalizáló tényező az aktív helyen. Ezek az enzimek különböző fejlődési csoportokba esnek. Az Mn és Fe-SOD-ket elsősorban a prokarióta sejtekben találjuk meg, míg a CuZn-SOD látszólag minden eukarióta organizmusban kimutatható [Steinman, H. M. közelménye a „Superoxide Dismutase” c. kiadványban (1982), a 11-68. oldalon (szerkesztő: Oberley, L. W.; kiadó: CRC Press, Florida)].

A humán Cu/Zn SOD-1 dimer metalloprotein, amely azonos, nem kovalensen kötött alegységekből tevődik össze, minden alegység 16000 dalton molekulasúlyú, és egy atom rezet, valamint 1 atom cinket tartalmaz [Hertz, J. W. és Deutsch, H. F.: J. Bioi. Chem. 247, 7043-7050 (1972)]. Minden alegység 153 aminosavból áll, amelyek szekvenciáját megállapították [Jabusch, J. R., Farb, D. L., Kerschensteiner, D. A. és Deutsch, H. F.: Biochemistry 19, 2310-2316 (1980); és Bárrá, D., Martini, F., Bannister, J. V., Schinina, M. W., Rotilio, W. H., Bannister, W. H. és Bossa, F.: FEBS Letters 120, 53-56 (1980)]. Ezen kívül a humán SOD-1 teljes kódoló területét tartalmazó cDNS kiónt nemrégiben izolálták, és szekvenciáját meghatározták [Lieman-Hurwitz, J., Dafni, N., Lavie, V. és Groner, Y.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79, 2808-2811 (1982) és Sherman, L., Dafni, N., Leiman-Hurwitz, J. és Groner, Y.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 5465-5469 (1983)].

A termelt humán Cu-Zn SÓD analóg különbözik a természetes humán Cu-Zn SOD-től annyiban, hogy az amino-terminálison az alanin nincs acetilezve. A természetes humán SOD-ben az amino-terminálison az alanin acetilezve van [Hartz, J. W. és Deutsch, H. F.: J. Bioi. Chem. 247, 7043-7050 (1972); Jabusch, J. R. és munkatársai: Biochemistry, 19, 2310-2316 (1980); Bárrá és munkatársai: FEBS Letters, 120, 53 (1980); és Oberly, L. W.: Superoxide Dismutase (1982), I. kötet, 32-33. oldal, kiadó: CRC Press, Florida)]. A természetes humán SÓD valószínűleg ugyanúgy glikozileződik, mint a bovin SÓD (Huber, W.: 3,579,495 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, kiadva 1971. május 18-án).

A bakteriális úton előállított SÓD csaknem biztosan nem glikozilezett, mivel az Escherichia coli nem glikozilezi azokat a fehéijéket, amelyeket termel. A bakteriális úton termelt SÓD analóg aminosav-szekvenciája azonos az érett humán SÓD aminosav-szekvenciájával, és nem tartalmaz metionin-gyököt N-terminálisánál.

A jelen találmány eljárást nyújt a humán Cu/Zn SÓD enzimatikusan aktív analógjának előállítására baktériumokban, és ennek tisztítására.

A szuperoxid diszmutáz nagy jelentőségű anyag farmakológiai tulajdonságai miatt. A bovin-eredetű, természetben előforduló szuperoxid diszmutázról (orgotein) felismerték, hogy gyulladásgátló tulajdonságokkal rendelkezik, és jelenleg már piaci forgalomban van néhány európai országban, például Nyugat-Németországban, gyulladások kezelésében való felhasználásra. Számos országban, köztük az Egyesült Államokban is, árusítják állatgyógyászati termékként gyulladások kezelésében, főleg begyulladt inak kezelésére lovakban. Ezen túl a tudományos irodalom azt sugallja, hogy az SÓD hasznos lehet klinikai alkalmazások hosszú sorában. Ezek lehetnek például a következők: a rák-kifejlődés és tumor-növekedés megelőzése, a rákellenes szerek citotoxikus és kardiotoxikus hatásainak csökkentése [Oberley, L. W. és Buettner, G. R.: Cancer Research 39, 1141-1149 (1979)]; az iszkémiás szövetek védelme [McCord, J. M. és Roy, R. S.: Can. J. Physiol. Pharm. 60, 1346-1352 (1982)], és ondószálak védelme [Alvarez, J. G. és Storey, Β. T.: Bioi. Repród. 28, 1129-1136 (1983)]. Ezen kívül nagy érdeklődés kíséri az SÓD hatásának tanulmányozását az öregedési folyamatokban [Talmasoff, J. Μ., Ono, T., és Cutler, R. G.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 2777-2782 (1980)].

A jelen találmány a rekombináns humán szuperoxid diszmutáz (hSOD) vagy analógjai felhasználására is vonatkozik a szuperoxid-gyökök redukciójának katalizálására H⁺jelenlétében hidrogén-peroxiddá és molekuláris oxigénné. A jelen találmány különösen vonatkozik hSOD analógok felhasználására az iszkémiát követő újabb perfüzió okozta sérülések csökkentésére és a kimetszett, izolált szervek túlélési idejének meghosszabbítására. A találmány vonatkozik még a hSOD vagy analógjai alkalmazására a szervátültetést és gerincvelő iszkémiát követő újabb perfúziók okozta sérülések csökkentésében.

A továbbiakban röviden összefoglaljuk a találmány lényegét.

A jelen találmány javított kifejeződő vektorral foglalkozik, amely megfelelő bakteriális gazdasejtbe, példá4

HU215 160 Β ul Escherichia coli-ba, amely a Cj termolabilis represszort tartalmazza, bevezetve a gazdasejtet, képessé teszi a vektorba beiktatott kívánt gén hatásos kifejezésére és a gén által kódolt polipeptid termelésére abban az esetben, ha a gazdasejt hőmérsékletét olyan hőmérsékletre emeljük, amelynél a represszor inaktiválódik; ez a vektor tartalmaz:

- egy kettős szálú DNS molekulát, amely 5’ —> 3’ sorrendben a következőket foglalja magában:

- egy DNS szekvenciát, amely tartalmazza a lambda bakteriofágból eredő P_LO_L promotort és operátort;

- az N hasznosító helyet az N antiterminátor fehérje kötéséhez;

- egy első restrikciós enzimhelyet, amely lehetővé teszi az ez után következő riboszomális kötőhelyet tartalmazó DNS szekvencia kicserélését;

- egy DNS szekvenciát, amely egy riboszomális kötőhelyet tartalmaz, hogy képessé tegye a kívánt gén mRNSét riboszómákhoz való kötésre a gazdasejten belül;

- egy ATG beindító (iniciációs) kodont vagy egy DNS szekvenciát, amely ATG iniciációs kodonná alakul át a kívánt génnek a vektorba való beiktatásával, és

- egy második restrikciós enzim-helyet a kívánt gén beiktatására a vektorba az ATG iniciációs kodonnal fázisban;

- és amely ezeken túl magában foglal egy olyan DNS szekvenciát, amely a gazdasejtben autonóm replikációra képes bakteriális plazmídból származó replikációs origót tartalmaz; - valamint egy szelekciós eszközt, amely olyan DNS szekvenciák közül választható ki, amelyekben szelektálható vagy azonosítható fenotípusos jellemzővel társult gén található, amely megnyilvánul, amikor a vektor jelen van a gazdaszervezetben;

- és olyan DNS szekvenciákat, amelyek a cl⁴³⁴-el jelölt fragmenst tartalmazzák, ez a fragmens magában foglalja a cl⁴³⁴ represszor fehétjéhez tartozó gént és az ehhez társuló promotor és operátor szekvenciákat, ahol a távolság a P_LO_L promotor és operátor szekvencia 3’ vége és az N hasznosító hely 5’ vége között kevesebb, mint 80 bázispár és a távolság az N hasznosító hely 3’ vége és a riboszomális kötőhely 5’ vége között kevesebb, mint 300 bázispár.

Az előnyös vektorok azok, ahol a szelekciós eszköz olyan gén, amely fenotípusos jellemzővel társult, ilyen például a pJH200 és pRO211.

A jelen találmány szerinti vektorok továbbá magukban foglalhatnak egy TjT₂ rRNS szekvenciát tartalmazó DNS szekvenciát a második restrikciós enzim-hely 3’ végénél elhelyezve. Kívánatos, hogy a T,T₂ rRNS átírásbefejező szekvencia kevesebb, mint mintegy 100 bázispárra legyen a második restrikciós enzim-hely 3’ végétől, és kívánatosabb, hogy ez kevesebb, mint mintegy 20 bázispárra legyen a nevezett hely 3’ végétől.

A jelenleg legelőnyösebb vektor, amely tartalmazza a TjT₂ rRNS átírás-befejező szekvenciát, a p579, ahol a szelekciós eszköz olyan gén, amely fenotípusos jellemzővel társul.

A jelen találmány szerinti, cl⁴³⁴ fragmenst tartalmazó vektorokban kívánatos, hogy a cl⁴³⁴ fragmens a TjT₂ rRNS befejező szekvencia 3’ végénél helyezkedjék el.

Kívánatosán a vektorok foglalják magukba mind a fenotípusos jellemzővel társult gént, mind a cl⁴³⁴ fragmenst. A jelenleg előnyös, mindkét gént tartalmazó vektor a p579, amely rendelkezik cl⁴³⁴ fragmenssel a

C/al helybe klónozva.

A jelen találmány szerinti vektorok tartalmazhatnak replikációs origót olyan bakteriális plazmídból, amely képes autonóm replikációra a gazdasejtben és képes a vektor legalább 400 konstitutív kópiáját előállítani.

A jelenleg előnyös replikációs origó a pODlA6, amely a col El plazmídból származik.

Előnyösek azok a vektorok, amelyek magukban foglalják a T[T₂ rRNS befejező szekvenciát, egy legalább 400 konstitutív kópiát a gazdasejtben előállítani képes replikációs origót, és amelyek tartalmaznak mind egy fenotípusos jellemzőhöz tartozó gént, mind a cl⁴³⁴ fragmenshez tartozó gént.

A kívánt polipeptideket, például növekedési hormonokat (szarvasmarha, sertés, csirke vagy emberi növekedési hormonok), humán szuperoxid diszmutázt, humán apolipoprotein E-t és ezek származékait kódoló géneket, például cDNS-eket, be lehet iktatni a vektor második restrikciós enzim-helyébe, így plazmidokat hozva létre. A plazmidokat viszont be lehet vezetni megfelelő gazdaszervezetekbe, ahol a géneket ki lehet fejezni és a kívánt polipeptideket termelni. A jelenleg előnyös plazmidok: bGH-hoz (bovin növekedési hormon): pR012, pSAL 5200-6, pHG44, pSAL 5600-1, p7200-22, pHG50, p8300-10A, pSAL-170/10, pSAL-210/4 és p9200; humán szuperoxid diszmutázhoz: pSODa2, ρΞΟϋβΙ, ρΞΟϋβΙ Tll, ρΞΟΏβΙΤΤ-Ι; pGH-hoz (sertés növekedési hormon): p3008 és p3009; cGH-hoz (csirke növekedési hormon): p5002 és p5003; hGH-hoz (humán növekedési hormon): pTV300; és humán apolipoprotein E-hez: pTV-188, pSAL 160-5, pTV-170, pTV-190, pTV-194, pTV-214 és pTVR-279-8.

Az előnyös gazdaszervezetek a következők lehetnek, ha a plazmid tartalmazza a cl⁴³⁴ fragmenst: Escherichia coli A1637, A1645, A2602, A2097, A1563 és A1645 (Xi434cil- miniTnlO). Előnyös prototróf gazdaszervezetek például az E. coli A4200, A4255 és A4346. Előnyös lizáló gazdaszervezet lehet például az E. coü A4048.

Az így létrejött gazda-vektor rendszereket lehet alkalmazni polipeptidek előállítására. A plazmidokat tartalmazó gazdasejteket megfelelő körülmények között növesztjük, amelyek lehetővé teszik a polipeptidek termelését, és az így létrejött polipeptideket kinyeijük. A gazdasejt vektor-rendszereket alkalmazva humán apolipoprotein E, szarvasmarha növekedési hormon, sertés növekedési hormon, csirke növekedési hormon, humán növekedési hormon és humán szuperoxid diszmutáz analógjait állítjuk elő.

Az így előállított SÓD analógokat állatorvosi és gyógyászati készítményekbe építjük be, amelyek az SÓD analógokból és megfelelő hordozókból állnak.

Ezeket a szuperoxid diszmutáz analógokat alkalmazzuk a következő reakció katalizálására:

2O₂ -+ 2H+ -> H₂O₂ + O₂

HU215 160Β

Részletesebben ezeket az analógokat az iszkémiát vagy szervátültetést követő újabb períúziók által okozott ártalmak csökkentésére alkalmazzuk, valamint a szívinfarktus mértékének csökkentésére vagy a kimetszett, izolált szervek túlélési idejének növelésére. Ezek az analógok szolgálhatnak arra a célra is, hogy csökkentsék a gerincvelő sérüléseit, és használhatók a légúti-tüdőrendszer zavari ellen is.

Feltárunk egy módszert is az enzimatikusan aktív eukarióta szuperoxid diszmutáz vagy analógjai termelésére bakteriális sejtekben. A bakteriális sejt tartalmaz egy, a szuperoxid diszmutázt vagy analógjait kódoló DNS szekvenciát, és képes is ennek kifejezésére. A módszer magában foglalja a bakteriális sejt fenntartását megfelelő körülmények között, megfelelő mennyiségű, Cu⁺⁺-val kiegészített termelő tápközegben úgy, hogy a sejt számára rendelkezésre álló Cu⁺⁺ koncentrációja a tápközegben nagyobb legyen, mint ~ 2 ppm.

A jelen módszer egyik előnyös kiviteli formájában a bakteriális sejt olyan plazmidot tartalmazó Escherichia coli, amely humán szuperoxid diszmutáz analógot kódoló DNS szekvenciát tartalmaz.

A találmány foglalkozik egy bakteriális sejtben termelt, tisztított, enzimesen aktív eukarióta szuperoxid diszmutáz vagy analóg jelen találmánnyal összhangban végzett kinyerésének módszerével is. A módszer tartalmazza a bakteriális sejt elkülönítését a növesztő tápközegtől és a bakteriális sejt szuszpendálását megfelelő oldatban, amelynek pH-ja kb. 7,0 és kb. 8,0 között van. A szuszpendált bakteriális sejt sejtfalát szétzúzzuk, és az így létrejött homogén oldatot ezután ultrahangos kezelésnek vetjük alá megfelelő körülmények között. Az ultrahanggal kezelt oldatot megfelelő körülmények között centrifugáljuk és a felülúszót kinyerjük, és mintegy 2 órán át 65 °C hőmérsékleten melegítjük. A felülúszót ezután lehűtjük, és megfelelő körülmények között centrifugáljuk, hogy tiszta felülúszó fehéijeoldatot nyerjünk. Az így létrejött felülúszót megfelelő térfogatra koncentráljuk és ioncserélő kromatográfíának vetjük alá megfelelő anioncserélő gyantán, amely kb. pH 7,0 és pH 8,0 közti értékre van kiegyensúlyozva. Az így létrejött, a szuperoxid-diszmutázt vagy analógját tartalmazó oldatot összegyűjtjük, megfelelő térfogatra koncentráljuk és kb. pH 7,0 és 8,0 közti pH értékű pufferolt oldattal szemben dializáljuk. Ezt a koncentrált, pufferolt oldatot ioncserélő kromatográfíának vetjük alá megfelelő, kb. pH 7,0-8,0 között kiegyensúlyozott anioncserélő gyantán, és az anioncserélő-fehérje komplext megfelelő só-gradiens kezelésnek vetjük alá. A szuperoxid-diszmutázt vagy analógját tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, koncentráljuk és desztillált vízzel szemben dializáljuk. A szóban forgó oldat pH-ját kb. 4,0 és 5,0 pH értékek közé állítjuk be megfelelő pufferral. A pufferolt oldatot azután ioncserélő kromatográfiának vetjük alá kb. pH 4,0 és 5,0 közti pH-ra kiegyensúlyozott, megfelelő kationcserélővei. A fehérje-kationcserélő komplexet megfelelő só-gradiens hatásának tesszük ki, és az így létrejött frakciókat, amelyek a tisztított szuperoxid-diszmutázt vagy analógját tartalmazzák, összegyűjtjük.

A találmány foglalkozik még a jelen módszerekkel előállított, tisztított, enzimesen aktív rekombináns eukarióta szuperoxid-diszmutázzal.

Az ábrák leírása:

Az egyes plazmidok restrikciós térképei, amelyeket az 1-31. ábrákban mutatunk be, nem azonosítják az összes restrikciós helyeket, amelyek az egyes plazmidokon jelen vannak. Bizonyos esetekben egyes restrikciós helyeket az egyik ábrában bemutatjuk, a másikban nem. Minden esetben bemutatjuk azonban azokat a restrikciós helyeket, amelyek szükségesek a találmány teljes megértéséhez.

1. ábra. pAL500 megalkotása

A bGH cDNS-t tartalmazó D4 plazmidot (ATCC 31 826) 7/oeII-vcl emésztjük. Az így létrejött 1600 bázispár nagyságú nagy fragmenst tisztítjuk, és 37 °C hőmérsékleten 5 percig emésztjük SÍ exonukleázzal.

GGAATTCC

CCTTAAGG szekvenciájú szintetikus EcoRI kapcsolót (linkért) kapcsolunk az így létrejött fragmens végeire ligálással. A ligáló keveréket EcoRI-vel hasítjuk és p3R322-be iktatjuk (ATCC 37017), amelyet előzőleg EcoRI-vel hasítottunk. A pALRI kiónt nyerjük, amely EcoRI-el végzett hasításra egy 1200 bázispáros fragmenst alakít ki, az 5’ végénél

AATTCCCAGCCATG...

GGGTCGGTAC...

szekvenciával. Ez a szekvencia azt demonstrálja, hogy a pALRI tartalmaz egy EcoRI restrikciós helyet, amely magában foglalja a természetes bGH 1. számú gyökéhez (fenil-alanin) szolgáló TTC kodont. Az emésztett anyagot DNS polimeráz I nagy fragmensével (Klenow) kezeljük és a

GAAGCTTC

CTTCGAAG

HindlII kapcsolókkal (linkerekkel) kapcsoljuk össze ligálással. A ligáló keveréket EcoRI-vel és HindlII-al hasítjuk. A bGH cDNS-t tartalmazó fragmenst izoláljuk, és pBR332-be szubklónozzuk az EcoRI és HindlII restrikciós helyek közé, így nyerve a pAL500-at (ATCC 39 782)

2. ábra. A pR0211 és pR012

A pJH200 plazmidot részlegesen emésztjük Ndelel, kezeljük DNS polimeráz I-el (Klenow), hogy a végeket kitöltsük, és az így létrejött végeket újra ligáljuk, hogy a pR0211 kifejeződő vektorokat képezzük. A pR0211 kifejeződő vektorokat Ndel-el és HindIII-aI emésztjük, a nagy fragmenst izoláljuk, és a pAL500-ból (ATCC 39782, 1984. aug. 2.) izolált Ndel-HindlII fragmenst úgy állítjuk elő pAL500-ból, hogy a pAL500-at EcoRI-vel emésztjük, és az emésztett termék végeihez a

TATGGATC

ACCTAGTTAA szekvenciájú szintetikus linkereket ligáljuk. A ligáló keveréket AWel-el és HindIII-aI emésztjük, és az így létrejött Ndel-Hindlll bGH fragmenst izoláljuk.

3. ábra. A pSAL 5200-6 megalkotása

HU 215 160 Β

A pR012-t (2. ábra) részben emésztjük EvwII-vel, ezt követi az emésztés Ndel-el, hogy eltávolítsunk egy 72 bázispáros fragmenst. Az autentikus bGH N-terminálisának első 24 aminosavát kódoló szintetikus DNS fragmenst ligáljuk az emésztett pRO 12-höz.

A szintetikus DNS fragmenst úgy alkotjuk meg, hogy két foszforilezett szintetikus egyszálú DNS-t összeforrasztunk, a DNS-ek szekvenciája a következő:

CCATATGTCCTTGTCCGGCCTGTTTTGCC AACGCTGTGCTC- 3 ’

3’ - GCGACACGAGGCCCGAGTCGTGGACGTGGTCGACG

Az összeforrasztott fragmenst DNS polimeráz I-el (Klenow) kezeljük a 4 dezoxiribonukleozid trifoszfát jelenlétében abból a célból, hogy a teljes hosszúságú kettős szálú DNS-t alakítsuk ki. A fragmenst PvwII-vel és TVűfel-el emésztjük a pR012-höz történő ligálás előtt, így képezzük a pSAL 5200-6-ot.

4. ábra. A p3008 megalkotása

A p3008-at (ATCC 39 804) úgy alkotjuk meg, hogy az Ariel-el emésztett pR0211-et (2. ábra) ligáljuk a ppGH-Atfel/RI plazmid Ndel-es emésztéséből izolált pGH fragmenssel.

A ppGH-Wel/RI tartalmazza a pGH cDNS-t teljes hosszúságban, amelynek mindkét végéhez Ndel helyek vannak hozzátéve szintetikus linkerek segítségével.

5. ábra. A p5002 megalkotása

A p5002-t úgy alkotjuk meg, hogy három résztvevővel ligálunk, vagyis egy dimerizált szintetikus linkért és két cGH fragmenst ligálunk, az utóbbiakat a pcGH-AWel/RI plazmid Ndel-es és Ea«II-s emésztésé15 vei nyeljük. A ligáló keveréket AWel-el emésztjük, és ez után a pR0211 kifejeződő vektorhoz (2. ábra) ligáljuk, miután azt előzőleg AWel-cl emésztettük. Egy telepet izolálunk, amely tartalmazza a p5002 plazmidot.

A szintetikus linkért a következő szekvenciájú egy20 szálú szintetikus DNS-ekből alkotjuk meg:

TATGTTCCCTGCCATGCCCCTCTCCAACCTGTTTGCCAACGCTGTGCTGAGGGCT

ACAAGGGACGGTACGGGGAGAGGTTGGACAAACGGTTGCGACACGACTC

A linkért ligálás előtt foszforilezzük. A linker az autotentikus cGH N-terminálisának első 18 aminosavát kódolja.

A pcGH-TVúfel/RI plazmid tartalmazza a cGH cDNS teljes hosszát, amelynek 5 ’ végénél egy EcoRI restrikciós hely van, és amelynek 3’ végénél egy Ndel restrikciós hely van. Ezeket a restrikciós helyeket szintetikus linkerek segítségével adjuk hozzá.

6. ábra. A pHG44 és pHG50 megalkotása pR012-t (2. ábra) emésztünk //ínt/HI-al. A lineáris formájú DNS-t (III. forma) agaróz gélről tisztítjuk és ligáljuk egy mintegy 1200 bázispáros Hindlll-Hindlll fragmenshez, amely tartalmazza a TjT₂ rRNS operon 40 átírás befejező szekvenciákat. A T_tT₂ Hindlll-HindlU fragmenst a pPSl píazmidból (ATCC 39 807) izoláljuk, amelyet HindiII-al emésztettünk. Az így létrejött pHG44 plazmid (ATCC 39 806) tartalmazza a T,T₂ szekvenciákat a rekombináns (rec) bGH szekvencia 3 ’ 45 végénél.

A pSK434 plazmidot (ATCC 39784), amely tartalmazza a Xcl⁴³⁴ represszor szekvenciákat, Hpall-vel emésztjük. A ?,cl⁴³⁴ Hpall-Hpall fragmenst izoláljuk és pHG44-hez ligáljuk, amelyet előzőleg Clal-el emész- 50 tettünk. Az így létrejött pHG50 plazmid (ATCC 39 805) tartalmazza a T]T₂ átírás befejező szekvenciákat és a Ácl⁴³⁴ represszor szekvenciát.

7. ábra. A p8300-10A megalkotása

A p8300-10A plazmidot (ATCC 39 785), amely a bGH természetes fenilalanin-formájának egy analógját fejezi ki, amely az N-terminálisnál metioninnal rendelkezik (met-phe bGH), a következő módon állítjuk elő.

A p7200-22 plazmid tartalmazza a ÁP_L promotort és a pJH200-ból (ATCC 39783) származó riboszomális kötőhelyet, met-phe bGH-t kódoló DNS-t, és a TjT₂ rRNS befejező szekvenciákat. A λΡ, promotort, a C_n 30 riboszomális kötőhelyet, a met-phe bGH gént és a TjT₂ átírás befejező szekvenciákat tartalmazó Clal-Clal fragmenst beiktatjuk a pORÍA6, egy konstitutíven nagy kópiaszámú plazmid, egyedi Clal helyébe, így képezzük a p8300-10A-t.

8. ábra. A pSAL-130/5 és pSAL-170/10 megalkotása

A pHG44 plazmidot (ATCC 39 806), amely a metasp-gln bGH fehéijét fejezi ki, emésztjük Mfel-el és H/nt/III-el. Az így létrejött Ndel-HindlU bGH fragmenst izoláljuk, és a p8300-l OA-ból (ATCC 39785) AWel-el és Hindlll-al végzett részleges emésztéssel készített fragmenshez ligáljuk. Ez a ligálás a met-phe bGH gén fragmenst a met-asp-gln bGH gén fragmenssel helyettesíti. Az így nyert pSAL-130/5 plazmid rec bGH-t fejez ki. A pSAL-170/10-et úgy nyerjük, hogy a pBR322 plazmid (ATCC 37017) Tet^R génjét tartalmazó EcoUl-Aval fragmenst DNS polimeráz I-el (Klenow) kezeljük, és ezt pSAL-13 0/5-be iktatjuk be, amelyet előzőleg BamHl-el emésztettünk, és DNS polimeráz I (Klenow) segítségével betöltöttük.

9. ábra. A pSAL-210/4 megalkotása

Lineáris formájú DNS-t (III. forma) készítünk pSAL-170/10 részleges Clal emésztésével. Ezt agaróz gélről tisztítjuk, és egy Hpall-Hpall cl⁴³⁴ gén fragmenshez ligáljuk, amelyet a pSK434 (ATCC 55 39784) plazmid Hpall-vel végzett emésztésének reakciókeverékéből izolálunk.

10. ábra. pSAL 5600-1 megalkotása pSAL 5200-6-ot (3. ábra) H/nriíII-al emésztünk. A DNS lineáris formáját (III. forma) agaróz gélről tisz60 títjuk, és egy mintegy 1200 bázispáros Hindlll-Hindlll

HU 215 160 Β fragmenshez ligáljuk, amely tartalmazza a 1jT₂ rRNS operon átírás befejező szekvenciákat. A TjT₂ HindlllHindlll fragmenst a pPSl plazmidból (ATCC 39807) izoláljuk, amelyet Hindlll-el emésztünk. Az így létrejött pSAL 5600-1 plazmid a T]T₂ szekvenciákat a metasp-gln bGH szekvencia 3 ’ végénél tartalmazza.

11. ábra. p3009 megalkotása

Az Ndel-Ndel pHG fragmenst a p3008 plazmidból izoláljuk (ATCC 39 804, 5. ábra). A fragmenst a p579 kifejeződő vektor (19. ábra) egyedi Ndel helyére iktatjuk, a vektort előzőleg AJel-el emésztve. Az így létrejött p3009 plazmid a természetes sertés növekedési hormon egy analógját fejezi ki, amely az N-terminálishoz hozzátéve egy metionin gyököt tartalmaz.

12. ábra. A p5003 megalkotása

Az Ndel-Ndel cHG fragmenst a p5002 plazmidból izoláljuk. A fragmenst a p579 kifejeződő vektor (19. ábra) egyedi Ndel helyébe iktatjuk, amely vektort előzőleg jVífel-el emésztettünk. Az így létrejött p5003 plazmid (ATCC 39 792) a természetes csirke növekedési hormon fehérje egy analógját fejezi ki, amely az N-terminálishoz hozzátéve egy metionin gyököt tartalmaz.

13. ábra. A pSODa2 megalkotása

A pJH200 kifejeződő vektort (ATCC 39783) Ndelel emésztjük. Az 550 bázispáros Ndel fragmenst, amely a λΡ_Ε promotort és C_n riboszomális kötőhelyet tartalmazza, izoláljuk, és beiktatjuk a pSOD NH-10 plazmid egyedi Ndel helyébe, amely plazmidot előzőleg Ndel-el emésztettünk, [A pSOD NH-10 plazmid humán SÓD egy cDNS kiónjából származik, lásd: Lieman-Hurwitz, J. és munkatársai: PNAS, 79, 2808 (1982)]. Az így létrejött pSOD NH-550 plazmidot 4/wI-el emésztjük (csak az ide vonatkozó Alul helyet tüntetjük fel az ábrán). A nagy Alul fragmenst, amely a λΡ_Ε promotort és az SÓD gént tartalmazza, izoláljuk. őawHI linkereket kapcsolunk hozzá, és az így létrejött fragmenst EawHIel emésztjük. A fiawlll emésztési terméket beiktatjuk a pBRM (ATCC 37 283) egyedi Bo/wHI helyébe, így képezve a pSODoc2-t.

14. ábra. A pSOD 13 és pSOD 1 megalkotása

A pSODoű plazmidot (ATCC 39786) részlegesen emésztjük .EcoRI-vel és az így létrejött lineáris formájú DNS-t agaróz gélről izoláljuk. A tisztított DNS-t betöltjük DNS polimerázl-el (Klenow) és újra ligáljuk. Az így létrejött pSODal3 tartalmaz egy EcoRI helyet a riboszomális kötőhely 5’ végénél. Egy fragmenst, amely tartalmazza a β-laktamáz promotort és riboszomális kötőhelyet, izolálunk a pBLAl 1 plazmidból (ATCC 39788), amelyet előzőleg EcoRI-vel és 4/wI-el emésztettünk. A 200 bázispáros fragmenst a pSODal 3-ból izolált nagy fragmenshez ligáljuk, ahol a pSODal3-at előzőleg TVcfel-el emésztettünk, DNS polimeráz I-el (Klenow) betöltöttük, majd EcoRI-vel emésztettük. Az így létrejött ρ80Οβ1 plazmid tartalmazza a β-laktamáz gén kötőhelyét és a λΡ_Ε promotort.

15. ábra. Αρ8ΟΏβ1Τ11 megalkotása pBR322 plazmidot (ATCC 37017) emésztünk EcoRI-vel és A val-el. Az így létrejött DNS-t betöltjük DNS polimeráz I-el (Klenow). A Tet^R gén-ffagmenst ezután izoláljuk és a ρΞΟϋβΙ plazmidból (14. ábra) izolált nagy fragmenshez ligáljuk, a ρ80ϋβ1 plazmidot előzőleg Eí/I-el emésztettük, ezt követően EawiHI-val részlegesen emésztettük, végül DNS polimeráz I-el (Klenow) betöltöttük. Az így létrejött ρ8ΟΟβ1ΤΤ11 plazmid tartalmazza a Tet^R gént.

16. ábra. Αρ8Οϋβ1ΤΤ-1 megalkotása.

A T]T₂ rRNS átírás befejezési fragmenst izoláljuk a pPSl plazmidból (ATCC 39 807), amelyet előzőleg Hindlll-al emésztettünk és DNS polimeráz I-el (Klenow) betöltöttünk. A fragmenst ρ80ϋβ1 TI 1 plazmidhoz (15. ábra) ligáljuk, amelyet előzőleg BamHI-vei részlegesen emésztettünk és DNS polimeráz I-el (Klenow) betöltöttünk.

17. ábra. A ρ8Οϋβ1-ΒΑ2 megalkotása

Az alábbi összetételű szintetikus DNS fragmenst:

5’ -AATTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAG-3’

GTTATTATAACTTTTTCCTTCTCAT, amely hasonló a természetes β-laktamáz riboszomális kötőhely szekvenciájához, foszforilezzük és a pSODal3 plazmid (14. ábra) nagy fragmenséhez ligáljuk, amely plazmidot előzőleg Ndel-el és EcoRI-vel emésztettünk.

18. ábra. pTV-188 megalkotása pApoE-EX2 plazmidot (ATCC 39787) emésztünk Ndel-el, majd a fragmenseket DNS polimeráz I-el (Klenow) betöltjük. Az így létrejött ApoE gén fragmenst izoláljuk, és beiktatjuk a ρ8ΟΏβ1Τ11 plazmid (15. ábra) egyedi, tompa végű Stul helyébe. Az így létrejött pTV-188 egy ApoE fúziós fehéqét fejez ki.

19. ábra. p579 megalkotása

A T|T₂ rRNS operon átírás befejező fragmenst izoláljuk a pPSl plazmidból (ATCC 39 807), amelyet előzőleg Hindlll-el emésztettünk. A T^ fragmenst beiktatjuk a pR0211 (2. ábra) egyedi HindlII helyébe. Az így létrejött kifejeződő vektor, a p579, tartalmazza a λΡ_Ε promotort, a C_n riboszomális kötőhelyet, amelyet a T_tT₂ átírás befejező szignálok követnek.

20. ábra. A pTV-170 megalkotása

Az Ndel-Ndel ApoE fragmenst izoláljuk a pApoE-EX2 plazmidból (ATCC 39787) és beiktatjuk a p579 kifejeződő vektor (19. ábra) egyedi Ndel helyébe, amely vektort előzőleg Wel-el emésztettünk. Az így létrejött pTV-170 plazmid természetes humán ApoE fehérje egy analógját fejezi ki, amelynek egy metioningyök van az N-terminálisához hozzáadva.

21. ábra. A pTV-190 megalkotása

A pTV-170 plazmidot (20. ábra) részlegesen emésztjük Acfel-el és betöltjük DNS polimeráz I-el (Klenow). Az izolált lineáris formájú DNS-t újra ligáljuk, a pTV-190 plazmidot termelve, amelyet elemzünk, és úgy találjuk, hogy csak egy Ndel helye van az ApoE gén 5 ’ végénél.

22. ábra. A pTV-194 megalkotása

A β-laktamáz promotort és riboszomális kötőhely fragmenst izoláljuk a pBLAl 1 plazmidból (ATCC 39788), EcoRI-el és Alul-e\ végzett emésztés után. Ezt a fragmenst ligáljuk a pTV-170 plazmid (20. ábra) nagy fragmenséhez, amelyet előzőleg M/cI-el emésztettünk, DNS polimeráz I-el (Klenow) betöltöttünk, majd EcoRI-vel emésztettünk.

HU 215 160 Β

23. ábra. ApSAL 160-5 megalkotása

Egy Aval-Aval fragmenst, amely tartalmazza az

ApoE DNS szekvenciát, izolálunk a pTV-170-ből (21. ábra), amelyet ζίναΐ-el emésztünk. A fragmenst DNS polimeráz I-el (Klenow) betöltjük, és agaróz gélen izoláljuk. A tisztított ApoE fragmenst beiktatjuk a pTV 104(2) plazmid (ATCC 39 384) Pstl helyébe, amelyet részlegesen emésztünk Ps/I-el és betöltünk DNS polimeráz I-el (Klenow). Az így létrejött plazmidot pSAL 160-5-nek nevezzük.

24. ábra. A pTV-214 megalkotása 5 A humán növekedési hormon első 14 aminosavát tartalmazó szintetikus fragmenst, amelynek szekvenciája a következő:

TATGTTCCCAACCATTCCATTATCCCGTCTGTTCGACAACGC

ACAAGGGTTGGTAAGGTAATAGGGCAGACAAGCTGTTGCGAT foszforilezünk, y¹²P-ATP-t és polinukleotid kinázt alkalmazva. A foszforilezett linkért beiktatjuk a pTV 190 plazmid egyedi Ndel helyébe, amely plazmidot előzőleg Aófel-el emésztettünk.

25. ábra. A pTVR 279-8 megalkotása

A pTVR 279-8-at a pTV 264—45-ből alkotjuk meg, amelyet viszont a pTV 190-ből alkotunk meg.

pTV 190 plazmidot, amely egy Met-ApoE3 analóg kifejeződését irányítja, részlegesen hasítunk yívűl-el, 20 „betöltjük” DNS polimeráz I Klenow-fragmensét alkalmazva, és újra ligáljuk. Az így létrejött plazmidot, amelyet pTV 264-45-nek nevezünk, hiányossá tesszük az Aval helyre nézve a gén 3’ végénél.

A pTV 264-45-öt teljes mértékben emésztjük Ndélel és a következő szekvenciájú, foszforilezett szintetikus linkerhez ligáljuk:

5’- TATGCTGCTGCT

ACGACGACGAAT - 5’.

Az így létrejött plazmid, amelyet pTVR 279-8-nek nevezünk, irányítja a met-leu-leu-leu-met-ApoE3 analóg kifejeződését.

26. ábra. A p92000 megalkotása

A p92000 plazmidot úgy alkotjuk meg, hogy a pHG44-ből az ampicillin rezisztencia gén nagy részét eltávolítjuk és helyettesítjük ezt a pHG44 tetraciklin rezisztencia génjével.

A pHG44-el C/al-el és AsVl-el hasítjuk, DNS polimeráz I Klenow-fragmensével kezeljük, és a nagy DNS fragmenst izoláljuk. Ezt a fragmenst ligáljuk a 40 pBR322 kis DNS fragmenséhez, amelyet a pBR322nek EcoRI-vei és Aval-el végzett hasítása és Klenowfragmenssel végzett kezelése után izolálunk.

A ligálásból létrejött plazmidot p92000-nak nevezzük.

A p92000 irányítja a met-asp-gln-bGH analóg kifeje- 45 ződését, és tetraciklin rezisztenciát ad át gazdasejtjének.

27. ábra. A pTV 300 megalkotása

A pTV 300 irányítja a met¹⁴-hGH analóg kifejeződését. A pTV 300-at úgy alkotjuk meg, hogy pTV 18(1)et hasítunk Ndel-el, és izoláljuk a met¹⁴-hGH DNS-t, és ezt Aűfel-el hasított p579-be (19. ábra) ligáljuk.

A pTV 18(l)-et úgy nyerhetjük, ahogyan ezt a 0131 843 Al sorszámú Európai Szabadalmi Közrebocsátási Irat (publikálva 1985. január 23-án) leírja, vagy ahogyan ezt az ennek megfelelő 514, 188 sorozatszámú 55 amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (bejelentve 1983. július 15-én) leírja, ez utóbbit ide referenciaként építjük be.

28. ábra. ApoE analóg sejten belüli felgyülemléséhez társult celluláris toxieitás.

C600 sejtek 5 ml tenyészeteit, amely sejtek pTV 194-et tartalmaznak vagy nem átfertőzött kontrollok, inkudáljuk, az inkubálás hőmérsékletét 30 °C-ról 42 °C15 ra emelve. A jelzett időpontokban 1 ml-es alikvotokat veszünk ki a tenyészetekből, jégen gyorsan lehűtjük, növesztő tápközegben sorozathígításokat végzünk, agarra szélesztjük, az agarban a megfelelő antibiotikum jelenlétében, és egy éjszakán át inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten. A telepek számát meghatározzuk párhuzamosan készített telepek átlagából. pl94-el átfertőzött és át nem fertőzött C600 sejtek párhuzamos tenyészeteit tartjuk 30 °C hőmérsékleteken, ezek szolgálnak nem indukált kontrollként.

29. ábra. Az ApoE DMPC komplexek kötése Apó—B, E(LDL) receptorokhoz fíbroblasztokon.

Biotechnológiai úton előállított (met-ApoE3 analóg) és autentikus ApoE foszfolipid komplexeit készítjük el a fehéije és DMPC inkubálásával 22 °C hőmérsékleten.

A komplexeket elkülönítjük a komplexxé nem alakult anyagoktól sűrűség-gradiens centrifugálással, amint ezt később leírjuk (30., majd 38. példa). Baloldalt: a biotechnológiai úton előállított és autentikus ApoE. DMPC komplexek képessége a ¹²⁵I-vel jelzett humán LDL-el való versengésre a tenyésztett fibroblaszt receptorokhoz való kötődésre 4 °C hőmérsékleten. Jobbra: A ¹²⁵I-vel jelzett ApoE analóg és autentikus ApoE.DMPC komplexek képessége a tenyésztett fíbroblasztokhoz való közvetlen kötődésre.

30. ábra. ¹²⁵I-ApoE.DMPC komplexek kötődése ApoE receptorokhoz máj-membránokon.

Foszfolipid (DMPC) komplexeket készítünk, amint ezt a 29. ábránál leírtuk. Felnőtt, koleszterinnel táplált kutyákból származó máj-membránok szolgálnak forrásként az ApoE receptorokhoz és a későbbiekben leírtak (32., majd 38. példák) szerint vannak elkészítve. A ¹²⁵Ivel jelzett, biotechnológiai úton előállított és autentikus ApoE.DMPC komplexek kötődését a membránokhoz 4 °C hőmérsékleten hajtjuk végre, amint ezt később le50 írjuk (32., majd 38. példák).

31. ábra. Ajódozott ApoE kiválasztása nyúl-plazmából.

Biotechnológiai úton előállított és autentikus

Apoe-t inkubálunk 37 °C hőmérsékleten 30 percen át 1 ml nyúl plazmával, mielőtt a keveréket egy nyúl vénájába injektálnánk. Mintegy 2 ml vért távolítunk el egy ampullába, amely EDTA-t tartalmaz, a jelzett időpontokban és a plazmát számoláshoz előkészítjük. A számokat korrigáljuk TCA (triklór-ecetsav) oldható bomlástermékekre, amint ezt később lenjük (33., majd 60 38. példa).

HU 215 160 Β

A továbbiakban részletesebben ismertetjük a találmányt.

Egy vektort fejlesztünk ki, amely lehetővé teszi a gén kifejeződés és a polipeptid-termelés magasabb szintjének elérését. A plazmid kettős szálú DNS molekula. Ennek bevezetésére egy megfelelő bakteriális gazdasejtbe, amely a termolabilis C[ represszort tartalmazza, a plazmid a gazdasejtet képessé teszi a plazmidba iktatott kívánt gén hatásos kifejezésére és a gén által kódolt polipeptid termelésére abban az esetben, amikor a gazdasejt hőmérsékletét arra a hőmérsékletre emeljük, amelynél a represszor inaktiválódik.

A vektor az 5’-3’ sorrendben a következőket foglalja magában:

- egy DNS szekvenciát, amely tartalmazza a lambda bakteriofágból származó P_LO_L promotort és operátort;

- az N-hasznosító helyet az antiterminátor N fehéqe kötéséhez;

- egy első restrikciós enzim helyet, amely lehetővé teszi az ez után következő riboszomális kötőhelyet tartalmazó DNS szekvencia helyettesítését.

- egy DNS szekvenciát, amely egy riboszomális kötőhelyet tartalmaz, amely a kívánt gén mRNS-ét képessé teszi a riboszómákhoz való kötődésre a gazdasejten belül;

- egy ATG iniciációs (kezdő) kodont, vagy egy olyan DNS szekvenciát, amely ATG iniciációs kodonná alakul a kívánt gén beiktatásakor a vektorba; és

- egy második restrikciós enzim-helyet a kívánt gén beiktatására a vektorba az ATG iniciációs kodonnal fázisban.

A vektor magában foglal a fentieken kívül egy olyan DNS szekvenciát, amely a gazdasejtben autonóm replikációra képes bakteriális plazmidból származó replikációs origót tartalmaz,

- valamint egy szelekciós eszközt, amely olyan DNS szekvenciák közül választható ki, amelyekben szelektálható vagy azonosítható fenotípusos jellemzővel társult gén található, amely megnyilvánul, amikor a vektor jelen van a gazdaszervezetben,

- és olyan DNS szekvenciákat, amelyek a cl⁴³⁴-el jelölt fragmenst tartalmazzák, ez a fragmens magában foglalja cl⁴³⁴ represszor fehéijéhez tartozó gént és az ehhez társuló promotor és operátor szekvenciákat, ahol a távolság a PlOl promotor és operátor szekvencia 3’ vége és az N hasznosító hely 5’ vége között kevesebb, mint 80 bázispár és a távolság az N hasznosító hely 3’ vége és a riboszomális kötőhely 5’ vége között kevesebb, mint 300 bázispár.

A vektor egy további fakultatív komponense egy T|T₂ rRNS átírás befejező szekvencia, amely a második restrikciós enzim hely 3’ végénél helyezkedik el. Előnyösen a T]T₂ rRNS átírás befejezési szekvencia kevesebb, mint mintegy 100 bázispárra van a második restrikciós enzim hely 3’ végétől. Még előnyösebben a T,T₂ mRNS átírás befejezési szekvencia kevesebb, mint mintegy 20 bázispárra helyezkedik el a második restrikciós enzim hely 3’ végétől.

A vektor magában foglal vagy egy szelektálható vagy azonosítható fenotípusos jellemzővel társult gént, amely manifesztálódik, amikor a vektor jelen van a gazdasejtben, vagy egy olyan DNS szekvenciát, amely a cl⁴³⁴ represszor gént tartalmazza, amely represszál egy λ imm 434cE lizogént, vagy mindkettőt magában foglalja.

A szelektálható vagy azonosítható jellemzőkkel társult megfelelő gének magukban foglalják azokat, amelyek hőmérséklet-érzékenységgel vagy gyógyszer-érzékenységgel, például ampicillin-, klóramfenikol vagy tetraciklin-rezisztenciával, társulnak. Amikor a gazdaszervezeten belül a cl⁴³⁴ represszor gén jelen van, a gazdaszervezetet meg lehet védeni a λ imm434cl“ profág indukciótól. így nincsen szükség drága antibiotikum-szelekciós sóoldatokra, amikor cl⁴³⁴ van jelen a gazdaszervezetben.

Előnyösen a vektor magában foglal mind egy DNS szekvenciát, amely tartalmaz egy szelektálható vagy azonosítható fenotípusos jellemzővel társult gént, mind egy olyan DNS szekvenciát, amely tartalmazza a cl⁴³⁴nek nevezett fragmenst.

Kívánatos, hogy amikor a cl⁴³⁴ gént a vektor tartalmazza, ez a T]T₂ rRNS szekvencia 3’ vége után helyezkedjék el.

A vektor magában foglal egy bakteriális plazmidból származó replikációs kiindulást (origót) is, amely plazmid autonóm replikációra képes a gazdasejtben. Ilyen megfelelő replikációs origók számos forrásból nyerhetők, például a pBR322-ből vagy pRl-ből.

Előnyös, ha a vektor olyan replikációs origóval rendelkezik, amely egy konstitutíven nagy kópiaszámú bakteriális plazmidból ered, amely plazmid képes autonóm replikációra a gazdasejtben legalább 400 konstitutív kópia/vektor mennyiségben. Még előnyösebben ez a replikációs origó ColEl. A legelőnyösebben az origó ρΟΡ1Δ6 plazmid, amelynek restrikciós térképét a 7. ábra mutatja be.

A vektor egy másik komponense egy első restrikciós enzim hely, amely lehetővé teszi az ezt követő riboszomális kötőhelyet tartalmazó DNS szekvencia helyettesítését. Számos ilyen helyet lehet alkalmazni. Megfelelő hely például az EcoRI hely.

A vektor egy másik komponense egy második restrikciós enzim hely a kívánt gén beiktatására a plazmidba az ATG iniciációs kodonnal fázisban. Számos ilyen helyet használhatunk. Megfelelő helyek lehetnek például az Ndel, Clal, HindlII, Smal, BgBl, Xbal, Sacl és Alul helyek.

Általában kívánatos, hogy a második restrikciós enzim hely úgy működjék, mint egy olyan második restrikciós enzim hely, amely szükséges a riboszomális kötőhelyet tartalmazó DNS szekvencia helyettesítésének lehetővé tételére. Ha a második restrikciós helyet erre a célra nem használjuk, akkor a jelen találmány szerinti vektor magában foglalhat egy harmadik restrikciós enzim helyet is a riboszomális kötőhely után, de a második restrikciós hely előtt.

Előnyösen a vektor két egyedi restrikciós enzim helyet tartalmaz. Az első hely lehetővé teszi a riboszomális kötőhelyet tartalmazó DNS szekvencia helyettesítését. A második hely lehetővé teszi a kívánt gén beiktatását a plazmidba az ATG iniciációs kodonnal fázisban. Az „egyedi restrikciós hely” kifejezést itt olyan értelemben használjuk, hogy ez egy olyan restrikciós enzim hely,

HU 215 160 Β amely csak egyszer fordul elő a plazmidban. Egy jelenleg előnyös kiviteli formában az EcoRI az első restrikciós enzim hely és NdA a második restrikciós enzim hely.

Előnyösen a vektor egy kovalensen zárt, kör alakú, kettős szálú molekula. Az azonban nem feltétlenül szükséges, hogy a plazmid kovalensen zárt legyen.

A plazmid akkor éri el megnövekedett kifejeződési szintjét, miután a gazdasejtet olyan hőmérsékletre melegítettük, amelynél a C_t represszor fehérje inaktiválódik. A mintegy 38 °C fölötti hőmérséklet hatásos ebből a célból, és mivel kívánatos, hogy elkerüljük a gazdasejt szükségtelen hő-károsodását olyan nagy mértékben, ahogy csak lehetséges, általában kívánatos, hogy a hőmérséklet ne haladja meg a 42 °C hőmérsékletet néhány foknál nagyobb mértékben.

A vektor egyik fontos komponense a riboszomális kötőhely. Megfelelő helyek a lambda bakteriofágból származó C_n helyek, amelyek szekvenciája a következő:

TAAGGAAATACTTACAT

ATTCCTTTATGAATGTA; a lambda bakteriofágból származó C_t[-nek egy mutánsa, amelynek szekvenciája a következő:

TAAGGAAGTACTTACAT

ATTCCTTCATGAATGTA; a lambda bakteriofág fő fej-fehérje génje, amelynek szekvenciája a következő:

_{TTTTTTTACGGGATTTTTTTATG}

AAAAAAATGCCCTAAAAAAATAC; a pBR322-ből származó természetes β-laktamáz kötőhely egy szintetikus oligonukleotid, amelynek szekvenciája a következő:

AATTCGAGCGCAAGGAAACAGGCTCA

GCTCGCGTTCCTTTGTCCGAGTAT;

egy szintetikus oligonukleotid, amelynek szekvenciája a következő:

AATTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAG

GTTATTATAACTTTTTCCTTCTCAT; és egy Bacillus thüringiensisből származó természetes riboszomális kötőhely.

A korábban leírt vektorokhoz viszonyítva a jelen találmány szerinti vektorokat lehet alkalmazni kívánt polipeptid terméket kódoló gének széles választékának megnövekedett kifejeződése eléréséhez. Megfelelő gének lehetnek azok, amelyek növekedési hormonokat, például a szarvasmarha, sertés, csirke vagy humán növekedési hormonokat; szuperoxid diszmutázt; apolipoprotein E-t, vagy az összes fentiek analógjait kódolják. Az analóg itt azt jelenti, hogy ez egy olyan polipeptid, amelynek aktivitása azonos a természetben előforduló polipeptidével, de egy vagy több különböző aminosav van hozzátéve vagy kihagyva (vagy mindkettő) a polipeptid N-terminálisánál.

A jelen találmány szerinti plazmidokkal való alkalmazásokhoz előnyös gazdaszervezet az Escherichia coli. A jelenleg előnyös törzsek az A1637, A1645, A2602, A2097, A1563 és A1645 (Xi434cUmini TnlO).

Az A1645 jelenleg a legelőnyösebb törzs a szuperoxid-diszmutáz vagy analógja kifejeződéséhez.

Az A1645 és A1645 (Xi434cl-mini TnlO) jelenleg a legelőnyösebb törzsek az állati növekedési hormon gének kifejeződéséhez.

Az A2097 jelenleg a legelőnyösebb törzsek az állati növekedési hormon gének kifejeződéséhez.

Az A2097 jelenleg a legelőnyösebb törzs azoknak a géneknek a kifejeződéséhez, amelyek a következőket termelik:

1. egy bGH analógot, amely met-asp-gln aminosavszekvenciával rendelkezik az autentikus bGH fenilalanin-formájának aminoterminálisához hozzáadva;

2. egy cGH analógot, amely egy metioninnal rendelkezik a természetes cGH fenilalanin formájának aminoterminálisához hozzáadva.

Az A1637-et C600-ból nyerjük, a galaktóz operonon belül tetraciklin rezisztencia gént, valamint a kifejeződéshez szükséges lambda rendszert - amely a galaktóz operonhoz közel van - tartalmazó transzpozon beiktatásával. A C600 az American Type Culture Collectionnál rendelkezésre áll ATCC 23 724 letéti számon. Az A1645öt az Al637-ből nyerjük Gal⁺-ra való szelekcióval (képesség a galaktóz fermentálására), valamint a tetraciklin rezisztencia elvesztésével. Ez még tartalmazza a lambda kifejeződő rendszert, de a transzpozon egy része el van távolítva a szelekcióval. Ennek fenotípusa C600 rrn+gal+thrleulacZ-b 1 (Ac 1857 ΔΗ 1 A/toraHI

N⁺). Az A1645 letétbe van helyezve az American Type Culture Collectionnál (Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok), különböző plazmidokat tartalmazó formákban, amint ezt később részletesebben leírjuk.

Az A1645 (Ái434cEmini TnlO) egy imm434cI3008 mini Τη10Δ16Δ17 plazmidot tartalmazó, 30 °C hőmérsékleten fertőzött A1645 Escherichia coli törzsből származik. A tetraciklinre rezisztens telepeket izoláljuk és tisztítjuk. Ez a pHG50 plazmidot tartalmazó törzs letétbe van helyezve az American Type Culture Collectionnál ATCC39805 letéti számon, 1984. augusztus 24-e óta.

Az A2602 és A1563 az SA500-ból származik. Ezek fenotípusa SA500 hisilegal+Δ8 (ÁcI857AHlABam N⁺), illetve SA500 hisrile-gal⁺A8 lacZ A21 (XcI857 int2 xisl nutL₃AHl).

Az A2097 az A1645-bői származik. Ennek fenotípusa A1645 lac K A21 proC::TnlO.

Prototróf Escherichia coli törzseket, amelyek képesek magas szintű polipeptid kifejeződésre, még amikor minimál tápközegben nőnek, akkor is, szintén lehet alkalmazni gazdaszervezetként a jelen találmány szerinti vektorokhoz. Előnyös prototróf törzsek például az A4200 és A4255. A p9200 plazmidot tartalmazó A4255 törzs az ATCC-nél letétbe van helyezve ATCC 53 215 letéti számon. Még előnyösebbek a biotintól független prototróf törzsek, mint például a pGH44 plazmidot tartalmazó A4346, amely szintén letétbe van helyezve az ATCC-nél ATCC 53 218 letéti számon.

Az Escherichia coli lizáló törzseit szintén lehet gazdaszervezetként használni a jelen találmány szerinti vektorokhoz. Megfelelő lizáló törzsek azok, amelyek termelnek egy anyagot, például egy enzimet, mint

HU 215 160 Β endolizint, amely a sejt lízisét okozhatja, olyan hőmérsékletnél, amelynél a polipeptid is termelődik, de sokkal kisebb sebességgel, mint ahogyan a polipeptid termelődik. Ez lehetővé teszi, hogy a sejt viszonylag nagy mennyiségű kívánt polipeptidet termeljen, mielőtt a termelt lizáló anyag mennyisége eléri azt a szintet, amely a saját lízisét okozza.

Alkalmas lizáló törzsekre példák azok, amelyek a Plcl^ts plazmidot tartalmazzák, ilyen például az A4048 törzs, amelynek pGH 44-et tartalmazó formája letétbe van helyezve az ATCC-nél, ATCC 53 217 letéti számon.

Minden letét a Mikroorganizmusok Letétbehelyezésének Nemzetközi Elismerésére vonatkozó Budapesti Szerződés (Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms) értelmében történt, kivéve a pBR322 és pBRM letétbehelyezését, amelyek mindenki számára hozzáférhetők az ATCC-nél 37017, illetve 37283 letéti számokon, és a D4 letétbe helyezését, amely ATCC 31 826 letéti számon van letétbe helyezve egy bejelentett amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentéssel kapcsolatban.

A vektorokat, amelyekre a találmány vonatkozik, ki lehet alakítani olyan módszerekkel, amelyek jól ismertek azok számára, akik a szakterületen átlagosan jártasak. Az ilyen módszereket nagy részletességgel írják le az itt is megnevezett különböző közleményekben, amelyek lényege a jelen leírásba referenciaként be van építve abból a célból, hogy teljes tájékoztatással szolgáljunk a technika állásával kapcsolatban.

Az egyik, jelenleg előnyös vektor a pJH200, amelynek restrikciós térképét a 2. ábra mutatja be. Ezt a vektort Escherichia coli-ba vezetjük be, az A1645 törzs hagyományos transzformálási módszerét alkalmazva. Az így létrejött gazdasejtvektor-rendszert ATCC 39 783 letéti számon helyeztük letétbe. Egy kívánt polipeptidet, például szarvasmarha növekedési hormont kódoló gént lehet beiktatni pJH200-ba.

Egy másik előnyös vektort, a pR0211-et pJH200 részleges Ndel emésztésével alkotjuk meg. A pRO211 restrikciós térképét a 2. ábrában mutatjuk be. A szarvasmarha növekedési hormon cDNS-t beiktatjuk pR0211-be a vektor emésztésével Wel-cl és ffmc/III-al, a nagy fragmens izolálásával, és ennek ligálásával a pAL5 00-ból (ATCC 39782) nyert bGH cDNS-hez. Az így létrejött plazmidot pRO 12-nek nevezzük. Ennek restrikciós térképe szintén a 2. ábrában található.

A pRO12 plazmidot részlegesen emésztjük Pvullvel, majd AWel-el. Egy, az autentikus bGH N-terminálisának első 24 aminosavát kódoló szintetikus fragmenst ligálunk az emésztett pRO12-höz. Az így létrejött plazmid, amelyet pSAL 5200-6-nak nevezünk, restrikciós térképét a 3. ábrában adjuk meg.

A jelen találmány szerinti vektorokat lehet úgy is tervezni, hogy olyan plazmidokat állítsunk elő, amelyek a humán szuperoxid diszmutázt (SÓD) vagy analógjait termelik. A pJH200-nak XP_L promotort és a C_n riboszomális kötőhelyet tartalmazó fragmensét izoláljuk, majd beiktatjuk pSOD NH-10 plazmidba, amely tartalmazza a humán SOD-hez tartozó gént, így képezzük a pSOD ΝΗ-550-nek nevezett plazmidot, amint ezt a 13. ábrán bemutatjuk. Egy mind a XP_L promotort, mind az SÓD gént tartalmazó fragmenst izolálunk a pSOD ΝΗ-550-ből ri/zd-el történt emésztést követően, BamHI linkerek hozzáadása és az ezt követő BamHI hasítás után a fragmenst beiktatjuk pBRM egyedi őawHI helyére. A pBRM nagy kópiaszámú plazmid, amelyet letétbe helyeztünk ATCC 37 283 letéti számon. Az így létrejött plazmidot pSODa2-nek nevezzük. Ennek restrikciós térképét a 13. ábrában mutatjuk be. Ezt a plazmidot E. coli A2097-ben helyeztük letétbe ATCC 39 786 letéti számon.

A pSODa2 (ATCC 39 786) tartalmazza a C_n riboszomális kötőhelyet. Ezt a riboszomális kötőhelyet helyettesítjük egy olyan fragmenssel, amely pBLAl 1 EcoRI-A/uI emésztéséből izolált β-laktamáz promotort és Shine-Dalgamo riboszomális kötőhelyet tartalmaz. (A pBLAll plazmid restrikciós térképét a 14. ábra mutatja be; ez a plazmid Escherichia coli A1645 törzsön belül letétbe van téve ATCC 39 788 letéti számon). A C_n riboszomális kötőhelyet eltávolítjuk a pSODoű plazmidból, ahogyan ezt a 14. ábrában bemutatjuk. A pSODa2-t részlegesen hasítjuk £coRI-val, betöltjük DNS polimeráz I-el (Klenow) és újra ligáljuk, úgy, hogy az egyedül megmaradó EcoRI hely a plazmidban a C_n RBS 5’ végénél helyezkedik el. Az így létrejött plazmidot, amelyet pSOD 13-nak nevezünk, Ariel-el emésztjük, DNS polimeráz I-el (Klenow) betöltjük, majd £coRI-vei emésztjük. A nagy fragmenst izoláljuk és ahhoz a fragmenshez ligáljuk, amely a pBLAl 1-ből izolált β-laktamáz promotort és riboszomális kötőhelyet tartalmazza. így alakítjuk ki a ρ80ϋβ1 plazmidot.

A ρβΟϋβΙ-εί módosíthatjuk úgy, hogy tetraciklin rezisztencia gén fragmenst foglaljon magában (Tet^R) ampicillin rezisztencia gén fragmens helyett (Amp^R). Az Amp^R fragmenst úgy távolítjuk el a ρδΟϋβΙ-όδΙ, hogy P.vZl-el, majd részlegesen őawHI-vel emésztjük. Az így létrejött plazmidot DNS polimeráz I-el (Klenow) betöltjük. A Tet^R gén fragmenst külön izoláljuk a pBR322 EcoRI-Aval emésztésével keletkezett keverékéből, betöltjük és ligáljuk a betöltött plazmidba. (A pBR322-t több helyről is beszerezhetjük, például az American Type Culture Collectiontól, ahol ATCC 37017 letéti számon található). Az így létrejött plazmidot ρΞΟΌβΙΤΙ 1-nek nevezzük. Ennek restrikciós térképét a 15. ábrán mutatjuk be.

Egy további plazmid, amelyet alkalmazhatunk humán szuperoxid-diszmutáz előállítására, a pSODβl-Ba2-nek nevezett plazmid. Ennek megalkotását pSODocl3-ból a 17. ábrán mutatjuk be.

A jelen találmány szerinti vektorokat, például a pRO211-et lehet tervezni sertés- vagy csirke növekedési hormonok termelésére is. így, amint a 4. ábrán látható, sertés növekedési hormon cDNS-t izolálunk ppGH-TVűfel/RI Mfel-cs emésztéséből. Az így létrejött, pGH gént tartalmazó fragmenst Wel-el emésztett pRO211-hez ligáljuk. Az így létrejött, p3OO8-nak nevezett plazmidot E. coli A2097 törzsbe foglalva deponáltuk ATCC 39 804 letéti számon.

HU 215 160 Β

A jelen találmány egy másik kiviteli formájában két csirke növekedési hormon fragmenst izolálunk pcGH-Mfel/RI Ndei-TtawII emésztéséből, amint ezt az 5. ábrán bemutatjuk. A két cGH fragmenst egy foszforilezett szintetikus linkerhez kapcsoljuk, amely kódolja az autentikus cGH N-terminálisának első 18 aminosavát. A linker szekvenciája a következő:

TATGTTCCCTGCCATGCCCCTCTCCAACCTGTTTGCCAACGCTGTGCTGAGGGCT

ACAAGGGACGGTACGGGGAGAGGTTGGACAAACGGTTGCGACACGACTC.

Az így létrejött fragmenst azután Wel-el emésztett pR0211-hez ligáljuk, a p5002-nek nevezett plazmidot képezve, amelynek restrikciós térképét az 5. ábrán mutatjuk be.

A jelen találmány szerinti vektorok úgy is tervezhetők, hogy humán apolipoprotein E-t állítsanak elő. A humán apolipoprotein E-he (ApoE) szolgáló gént a pApoE-EX2-ből lehet izolálni M/el-emésztéssel. A pApoE-EX2 restrikciós térképét a 18. ábrában mutatjuk be. Ez letétbe van helyezve, E. coli A1645 törzsbe foglalva, ATCC 39 787 letéti számon.

Az ApoE gént (cDNS) különböző plazmidokba lehet helyezni. Az előnyös megvalósítások egyike a pTV-188 plazmid, amelynek restrikciós térképét a 18. ábrában mutatjuk be. A pTV-Ι88-at úgy alkotjuk meg, hogy a pApoE-EX2-ből izolált ApoE gént ligáljuk Stulel emésztett ρΞΟϋβΙΤΙΙ plazmidhoz. A pTV-188 tartalmazza a Tet^R fragmenst, a P_L promotor szekvenciát, a β-laktamáz promotort és a Shine-Dalgamo szekvenciát. Ez a plazmid kifejez egy ApoE fúziós fehéijét.

Egy másik előnyös megvalósítása azoknak a plazmidoknak, amelyek ApoE gént tartalmaznak, a pSAL 160-5, amelynek restrikciós térképét a 23. ábrában mutatjuk be. A pSAL-160-5-öt pTV 104(2)-ből (ATCC 39 384) és pTV-170 plazmidból (lásd 20. ábra) alkotjuk meg. Az ApoE gént pTV 170-ből izoláljuk és beiktatjuk a pTV 104(2)-be a humán növekedési hormon gén szekvencián belül levő PstI helyre. Az így létrejött pSAL 160-5 tartalmazza az Amp^R fragmenst és a P_L promotor szekvenciát.

Az egyik jelenleg előnyös vektor a p579, amelynek restrikciós térképét a 19. ábrában mutatjuk be. Ezt a vektort be lehet vezetni megfelelő Escherichia coli törzsbe, például A1637, A2602, A1563, A1645 vagy A2097be, hagyományos transzformációs módszereket alkalmazva, amelyek ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak. Egy kívánt polipeptidet, például sertés növekedési hormont vagy csirke növekedési hormont kódoló gént be lehet iktatni p579-be.

Sertés növekedési hormon cDNS-t beiktatunk p579be olyan módon, hogy a vektort MVeT-el emésztjük és a nyitott szálas p3008-ból (ATCC 39804) nyert pGH cDNS-hez ligáljuk. Az így létrejött plazmidot p3009nek nevezzük. Ennek restrikciós térképét a 11. ábra mutatja be.

Csirke növekedési hormon cDNS-t beiktatunk p579-be olyan módon, hogy a vektort -Vt/el-el emésztjük és a nyitott szálat p5002-ből nyert cGH DNS-hez ligáljuk. Az így létrejött plazmidot p5003-nak nevezzük, ennek restrikciós térképét a 12. ábrában mutatjuk be. A p5003-at Escherichia coli A2097 törzsön belül letétbe helyeztük ATCC 39 792 letéti számon.

A humán apolipoprotein E (ApoE3) termeléséhez szolgáló gént, ahol a végtermék valószínűleg metionin aminosawal van kiegészítve az amino-terminálisnál, szintén be lehet iktatni p579-be. Az így létrejött plazmid, amelyet pTV-Ι70-nek nevezünk, megalkotását a 20. ábrában mutatjuk be. Ez a plazmid tartalmazza a pJH200-ból (ATCC 39783) származó C_n riboszomális kötőhelyet.

A pTV-170 plazmidot lehet módosítani az ApoE génhez kötődő Ndel helyek egyikének eltávolításával. Az így létrejött plazmidot, amelyet pTV-Ι 90-nek neve20 zünk, a 21. ábrán mutatjuk be.

A pTV-Ι70-et lehet olyan formában is módosítani, hogy pBLA 11-ből (ATCC 39788) izolált β-laktamáz promotorral és Shine-Dalgamo riboszomális kötőhely szekvenciával helyettesítjük a C_n riboszomális kötőhe25 lyet. Az így létrejött plazmid, amelyet pTV-Ι94-nek nevezünk, restrikciós térképét a 22. ábrán mutatjuk be.

A pTV-Ι90-et (21. ábra) úgy lehet módosítani, hogy ez olyan humán ApoE3 analógot termeljen, amely amino-terminálisánál humán növekedési hormon amino30 terminálisának 14 aminosavával rendelkezik, ezt követi egy metionin, amely az érett humán ApoE3 szekvenciájához van kötve. Egy ilyen plazmidnak, amelyet pTV-214-nek nevezünk, restrikciós térképét a 24. ábra mutatja be.

Olyan plazmidnak, amely ApoE3 gént tartalmaz, egy másik előnyös megvalósulása a pTVR 279-8, amelynek restrikciós térképét a 25. ábra mutatja be. A pTVR 279-8-at pTV 264-ből alkotjuk meg, amelyet viszont pTV 190-ből alkotunk meg. A pTV 190-et (21. ábra) részlegesen emésztünk Aval-el, „betöltjük” DNS polimeráz I Klenow-fragmenst alkalmazva, és újra ligáljuk. Az így létrejött plazmidot, amelyet pTV 264-45-nek nevezünk, megszabadítjuk az Aval helytől a gén 3’ végénél. A pTV 264N5 plazmidot teljes mérték45 ben emésztjük Msfel-el és ligáljuk egy foszforilezett szintetikus linkerrel, amelynek szekvenciája a következő:

5’- TATGCTGCTGCT

ACGACGACGAAT-5’

Az így létrejött plazmidot, amelyet pTV 279-8-nak ne50 vezünk, ATCC 53 216 letéti számon letétbe helyeztük. A jelen találmány szerinti vektorokat lehet úgy is tervezni, hogy olyan plazmidokat képezzenek, amelyek emberi növekedési hormonok termelésére képesek. Ilyen plazmidra példa a pTV 300, amelynek restrikciós térképét a 27. ábra mutatja be. A pTV 300-at úgy alkotjuk meg, hogy pTV 18(l)-et hasítunk AWel-el, a met¹⁴-hGH DNS-t izoláljuk és ezt AWel-el hasított p579-hez (19. ábra) ligáljuk. A pTV (18)1 -et úgy nyerhetjük, ahogyan ezt a 0131 843 Al Európai Szabadalmi

Közrebocsátási Irat (közölve 1985. január 23-án) leírja,

HU 215 160 Β vagy ahogyan ezt az ennek megfelelő 514,188 bejelentési sorszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (bejelentve 1983. július 15-én) leírja; ez utóbbit referenciaként beépítjük a jelen bejelentésbe.

A jelen találmány szerinti vektorokat lehet úgy is tervezni, hogy olyan plazmidokat állítsunk elő, amelyek egy humán Cu-Zn szuperoxid-diszmutáz analógot termelnek, amely a természetes humán SOD-től annyiban különbözik, hogy az amino-terminális nincs acilezve. Ilyen plazmidot alkotunk meg a 16. ábra szerint, ezt pSODβlTT-l-nek nevezzük.

A jelen találmány szerinti vektorokat lehet úgy is tervezni, hogy olyan plazmidokat állítsunk elő, amelyek egy rekombináns bovin növekedési hormont termelnek. Egy bGH analógnak termelésére példa egy olyan analóg, amely az autentikus bGH fenil-alanin formájának amino-terminálisához hozzátéve egy met-asp-gln aminosav-szekvenciát tartalmaz, ezt az analógot rec bGHnak is nevezzük. A pGH44 plazmidot, amely ilyen hormont termel, a 6. ábrában megadott vázlat szerint alkotjuk meg; ezt a plazmidot A2097 törzsön belül ATCC 39 806 letéti számon helyeztük letétbe.

Egy másik plazmid, amelyik met-asp-gln bovin növekedési hormont termel, a p9200. A p9200 plazmid hasonló a pHG44-hez (6. ábra), a plazmid azonban tetraciklin rezisztenciát ad át ampicillin rezisztencia helyett. A p9200 megalkotását a 26. ábra mutatja be. pHG44-et hasítunk C/al-cl és F.vZl-cl, „betöltjük” DNS polimeráz I Klenow-fragmensét alkalmazva, majd a nagy DNS fragmenst izoláljuk. Ezt a fragmenst pBR322 tetraciklin rezisztenciagént tartalmazó DNS fragmenséhez ligáljuk, amely fragmenst pBR322-nek AcoRI-vel és ^ναΙ-el végzett hasításával, majd DNS polimeráz I Klenow ffagmensét használó „betöltés”ével izolálunk. Az így létrejött p9200 plazmidot ATCC 53 215 letéti számon helyeztük letétbe.

Egy másik példa egy olyan bGH analóg termelése, amely egy metionin aminosavval rendelkezik a természetes bGH fenilalanin formájának amino-terminálisához hozzáadva. A pSAL 5600-1-et, amely ilyen hormont termel, a 10. ábrában megadott vázlat szerint alkotjuk meg. A p7200-22 plazmid szintén termel ilyen hormont. Ennek a plazmidnak a restrikciós térképét a 7. ábra mutatja be.

Egy jelenleg előnyös vektor a p579 egy olyan DNS szekvenciával, amely a Clal helyre klónozott cl⁴³⁴ fragmenst tartalmazza. A p579 restrikciós térképét a 19. ábra mutatja be.

Olyan plazmidokat alkotunk meg, amelyek egy szarvasmarha növekedési hormon analógot fejeznek ki, amely analóg a természetes szarvasmarha növekedési hormon fenilalanin formájának amino-terminálisához hozzáadva egy met-asp-gln aminosav-szekvenciával rendelkezik (ezt rec-bovin növekedési hormonnak is nevezzük). Egy ilyen plazmid a pHG 50, amelynek restrikciós térképét a 6. ábra mutatja be. Ezt a plazmidot A1645 (?J434cI mini TnlO) törzsön belül deponáltuk az American Type Culture Collectionnál, ATCC 37 805 letéti számon.

Másik ilyen plazmid a pSAL-210/4, amelynek restrikciós térképét a 9. ábrában mutatjuk be.

Egy jelenleg előnyös vektor a p8300-10A plazmidból származik, a met-phe bGH gén eltávolításával. A plazmid restrikciós térképét a 7. ábrában mutatjuk be, ezt a plazmidot A2097 törzsön belül az American Type Culture Collectionnál helyeztük letétbe, ATCC 39785 letéti számon.

Egy másik jelenleg előnyös gén a pSAL-170/10 plazmidból származik a rec bGH gén eltávolításával. A plazmid restrikciós térképét a 8. ábra mutatja be.

Egy harmadik, jelenleg előnyös gén a pSAL-210/4 plazmidból származik a rec bGH gén eltávolításával. A plazmid restrikciós térképét a 9. ábra mutatja be.

A jelen találmány szerinti vektorokat, amikor gazdaszervezetbe vezetjük be, lehet úgy is tervezni, hogy olyan plazmidot képezzenek, amelyek szarvasmarha növekedési hormon analógokat termelnek. A p8300-10 (ATCC 39 785)-öt, amely példa egy ilyen plazmidra, a 7. ábrában bemutatott vázlat szerint alkotjuk meg. Az analóg, amelyet ez termel, egy metioningyökkel rendelkezik a természetes bGH fenilalanin formájának amino-terminálisához hozzátéve.

Más plazmidok olyan analógokat termelnek, amelyek egy met-asp-gln aminosav-szekvenciával rendelkeznek a természetes bGH fenilalanin formájának N terminálisához hozzáadva. Ezek között a plazmidok között van a pSAL-130/4 (8. ábra), pSAL-170/10 (8. ábra) és SAL-210/4 (9. ábra).

Ugyanezt a megközelítést alkalmazva más plazmidokat is lehet készíteni, a kívánt polipeptidet kódoló gént behelyezve a plazmid második restrikciós enzim helyére.

Különböző gazdavektor-rendszerek lehetnek például az E. coli A1637, A1645, A2606, A2097 vagy A1563, ha a plazmid nem tartalmazza a cl⁴³⁴ fragmenst, és A1645 (Li434cL mini TnlO), ha a plazmid tartalmazza a cl⁴³⁴ fragmenst. A jelen találmány szerinti gazdaszervezetvektor-rendszerek magukban foglalhatnak prototróf E. coli-kat is, mint az A4200, A4255, és lehetnek biotintól független gazdaszervezetvektor-rendszerek is, mint az A4346. A jelen találmány szerinti lizáló gazdaszervezetvektor-rendszerek magukban foglalják azokat, ahol a gazdaszervezet A4048, de főleg A3111.

Az itt leírt gazdaszervezetvektor-rendszereket lehet alkalmazni különböző polipeptidek termelésére, ilyenek például a szarvasmarha, sertés, csirke és ember növekedési hormonok, humán szuperoxid diszmutáz és humán apolipoprotein E. Hogy termelhessünk, a gazdaszervezetvektor-rendszert megfelelő körülmények között növesztjük, amely lehetővé teszi annak a polipeptidnek a termelődését, amelyet azután kinyerünk.

A megfelelő körülmények magukban foglalják a gazdaszervezetvektor-rendszer növesztését megfelelő időtartamon át kb. 42 °C hőmérsékleten. Kívánatos, hogy a növekedési periódus 42 °C hőmérsékleten min14

HU215 160 Β den vektorgazdaszervezet-rendszerben - a humán apolipoprotein E termeléséhez tervezet művelet kivételével - mintegy 1 és 5 óra között legyen. A humán apolipoprotein E termeléséhez tervezett gazdaszervezetvektor-rendszemél a növekedési időtartam kívánatosán mintegy 15 perc. A megfelelő tápközeg kazein-hidrolizátumot is foglal magában.

Az előzőekben leírt módszerek segítségével egy sor bGH, pGH, cGH, hGH, ApoE és SÓD analógot készítünk.

Olyan ApoE analógokat készítünk, amelyeknek aminosav-szekvenciája azonos a természetes ApoE aminosav-szekvenciájával, azzal a kivétellel, hogy az N-terminálisnál változások vannak, például

1. metionin aminosav van hozzáadva a természetes humán apolipoprotein E N-terminálisához;

2. olyan természetes humán apolipoprotein E, amelynek N-terminálisához a humán szuperoxid diszmutáz 42 aminosavból álló N-terminálisa, majd metionin van hozzákapcsolva;

3. természetes humán apolipoprortein, amelyből az N terminális 11 aminosava el van távolítva, és az érett humán növekedési hormon 45 N-terminális aminosavával majd metioninnal van helyettesítve;

4. természetes humán apolipoprotein E aminosavszekvenciája, amelynek N-terminálisához a humán növekedési hormon N-terminális szekvenciájának 14 aminosava, majd metionin van kötve; és

5. természetes humán apolipoprotein E3, amely egy met-leu-leu-leu-met aminosav-szekvenciával rendelkezik az N-terminálishoz hozzákapcsolva.

Egy pGH analógot készítünk, amelyben metionin aminosav van hozzátéve a természetes sertés növekedési hormon N-terminálisához.

Egy cGH analógot készítünk, amelyben metionin aminosav van hozzátéve a természetes csirke növekedési hormon N-terminálisához.

Egy hGH analógot készítünk, amelyből a természetes humán növekedési hormon első 13 aminosava törölve van, vagyis met¹⁴ hGH-1.

SÓD analógokat készítünk, amelynek aminosavszekvenciája csaknem azonos a természetes SÓD aminosav-szekvenciájával, kivéve néhány változást az Nterminálison. Erre példák a következők:

1. természetes humán SÓD, amely nincs acetilezve; és

2. természetes humán SÓD, amely nincs acetilezve és nincs glikozilezve.

Ezeket az SÓD analógokat lehet alkalmazni a szuperoxid anion diszmutálására vagy egyértékű redukciójára proton jelenlétében, így hidrogén-peroxidot képezve, amint ezt a következő egyenletekben mutatjuk be:

2O₂ -+ 2H+ -ra SÓD H₂O₂ + O₂ Állatgyógyászati készítményeket lehet előállítani, amelyek egy vagy több bGH, cGH vagy pGH analóg hatásos mennyiségét tartalmazzák megfelelő hordozóval. Az ilyen hordozók jól ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak. Az analógokat lehet közvetlenül beadni vagy valamilyen kompozíció formájában szarvasmarháknak, hogy a tej- és hústermelés növekedjék; csirkéknek, hogy a hústermelés növekedjék; vagy sertéseknek, hogy a tej- vagy hústermelés növekedjék.

Gyógyászati készítményeket lehet előállítani, amelyek ApoE vagy hGH egy vagy több analógjának hatásos mennyiségét tartalmazzák megfelelő hordozóval. Az ilyen hordozók jól ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak. Az analógokat lehet közvetlenül beadni vagy valamilyen kompozíció formájában emberek kezelésére, például ApoE esetében a beteg ApoEtermelése hiányának kezelésére, vagy atheroszklerózis kezelésére; vagy hGH esetében a beteg hGH-termelése hiányának kezelésére.

Állatgyógyászati és gyógyászati készítményeket lehet előállítani, amelyek SÓD vagy egy vagy több SÓD analóg hatásos mennyiségét tartalmazzák megfelelő hordozóval. Az ilyen hordozók jól ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak. Az SOD-t vagy analógjait lehet közvetlenül vagy valamilyen kompozíció formájában beadni az állatnak vagy embernek, például gyulladásban szenvedő betegek kezelésére vagy a beteg olyan problémáinak csökkentésére, amelyeket az oxigén szabadgyökök idéznek elő az általános iszkémiát vagy szervátültetést, például veseátültetést követő újabb perfüzió esetében. Az SOD-t vagy analógját közvetlenül vagy valamilyen készítmény formájában lehet beadni egy izolált szerv perfúziós közegébe, hogy csökkentsük egy izolált szerv oxigén-szabadgyökök által előidézett problémáit a kimetszést követő perfüzió alkalmával, így meghosszabbítsuk a szerv, például szaruhártya túlélési idejét. Ezen kívül az SÓD vagy analógját lehet alkalmazni neurológiai panaszok csökkentésére is.

Enzimesen aktív eukarióta szuperoxid-diszmutáz (SÓD) vagy valamilyen analógja baktériumsejtekben való előállításának módszerét táljuk fel. A bakteriális sejt tartalmaz egy olyan DNS szekvenciát, amely a szuperoxid-diszmutázt vagy analógját kódolja, és képes kifejezni is ezt. A módszer a bakteriális sejt fenntartását tartalmazza a megfelelő körülmények között és a megfelelő termelő tápközegben. A termelő tápközeg ki van egészítve megfelelő mennyiségű Cu⁺⁺-al, úgy, hogy a Cu⁺⁺ koncentrációja a tápközegben több legyen, mint kb. 2 ppm.

A bakteriális sejt lehet bármilyen baktérium, amelybe eukarióta szuperoxid diszmutázt kódoló DNS-t be lehet vezetni rekombináns DNS technikákkal. A baktériumnak képesnek kell lennie a DNS szekvencia kifejezésére és a fehéqe-termék előállítására. A megfelelő körülmények és a termelő tápközegek változnak a baktériumfaj és törzs szerint.

A baktériumsejt tartalmazhatja a szuperoxiddiszmutázt vagy analógot kódoló DNS szekvenciát egy vektoron, például plazmid DNS molekulán belül. A vektort vagy plazmidot rekombináns DNS technikával alkotjuk meg olyan módon, hogy a beépített, SOD-t kódoló szekvenciával a molekula megfelelő helyzeténél rendelkezzék.

A találmány szerinti egyik előnyös kiviteli módban a bakteriális sejt valamilyen Escherichia coli sejt. Az előnyös E coli törzs az A1645 törzs. A jelen találmány szerinti E. coli sejt egy olyan plazmidot tartalmaz, amely az

HU 215 160 Β az SOD-t vagy analógját kódolja. A jelen találmány szerinti egyik előnyös kiviteli módban az SÓD humán szuperoxid diszmutáz vagy analógja.

A jelen találmány szerinti egyik előnyös kiviteli mód azokra az E. coli törzsekre vonatkozik, amelyek a ρ80ϋβί, pSOD«2, ρβΟϋβΤΙΙ, ρ80ϋβ1-ΒΑ2 vagy ρ8Οϋβ1ΤΤ1 plazmidokat tartalmazzák. Az ezeknek a plazmidoknak a megalkotására szolgáló módszereket az ábrák leírásánál ismertettük, és a plazmidok maguk a 3. példában vannak leírva. Ezeket a plazmidokat a rendelkezésre álló kiindulási anyagokból bárki meg tudja alkotni, aki a szakterületen átlagosan járatos. Azok az E. coli törzsek, amelyek az eukarióta szuperoxid diszmutázt kódoló plazmidok megalkotásában alkalmazható különböző plazmidokat tartalmazzák, letétbe vannak helyezve az American Type Culture Collectionnál (Rockville, Maryland 20 852), a mikroorganizmusok letétbe helyezése nemzetközi elismertetésének céljából létrehozott Budapesti Szerződés előírásai szerint, szabadalmi eljárás céljaira. Ezek a plazmidok és megfelelő ATCC letéti számaik a következők: pBRM, ATCC 37283; pSODoű, ATCC 39786; pBR322, ATCC 37017; pBLAll, ATCC 39788; pJH200, ATCC 39783, és pPSl, ATCC 39 807.

A jelen találmány egyik speciális megvalósításában enzimesen aktív humán szuperoxid diszmutázt állítunk elő E. coli A2097 sejt segítségével, amely a pSODa2 píazmidot tartalmazza. Ezt a sejtet az American Type Culture Collectionnál ATCC 39786 letéti számon helyeztük letétbe.

A megfelelő termelő tápközeg a bakteriális sejthez lehet bármilyen típusú elfogadható növesztő tápközeg, mint kazein-hidrolizátum, vagy LB (Luria-Broth) tápközeg. A megfelelő növesztési körülmények változhatnak az E. coli törzzsel és a plazmiddal, amelyet tartalmaz, például a ρ8ΟΏβ1Τ11-εί tartalmazó E. coli A1645-öt 42 °C hőmérsékleten indukáljuk, és ezen a hőmérsékleten tartjuk mintegy 1-5 órán át. A hőmérséklet, idő, keverés és levegőztetés megfelelő körülményeit az inokulum növesztéséhez és a tenyészet növesztéséhez a kívánt sűrűségre a termelő fázis előtt, valamint a tenyészet fenntartását a termelő periódusban a 26. példában újuk le.

A Cu⁺⁺ ionok koncentrációja, amely az enzimesen aktív SÓD termeléséhez szükséges, változik az alkalmazott tápközeg típusával. Egy kazein-hidrolizátumos tápközegben a Cu⁺⁺ ion-koncentrációt 200 ppm-nél találtuk hatékonynak.

LB tápközegben a Cu ⁺ ion-koncentrációt 75 ppmnél találtuk hatásosnak. Előnyös, ha a növesztő tápközegek mindegyik komplex típusában a Cu⁺⁺ koncentráció a tápközegben kb. 50 és 250 ppm között van.

A legtöbb eukarióta szuperoxid diszmutáz Cu/Zn metalloprotein. A találmány egyik speciális kiviteli módjában Zn⁺⁺ ionokat adunk kiegészítésként a tápközeghez, úgy, hogy a Zn⁺⁺ koncentrációja a tápközegben nagyobb, mint kb. 2 ppm. A találmány egyik előnyös kiviteli módjában a Cu⁺⁺ és Zn⁺⁺ koncentrációkat úgy egészítjük ki, hogy 0,8 g/1 CuSO₄.5H₂O-t és 10 mg/1 ZnSO₄.7H₂O-t adunk a tápközeghez.

A megfelelő törzs-, tenyésztő-, inokuláló-, és termelő tápközegek változhatnak, mindezek ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak. A megfelelő tápközegekre a jellemző példákat a 26. példában adjuk meg.

A találmány foglalkozik a baktérium-sejtekben előállított, tisztított, enzimatikusan aktív eukarióta SÓD vagy analógja kinyerésének módszerével, a találmány szerinti módszerekkel összhangban.

A bakteriális sejtet először a termelő tápközegből izoláljuk, miután a tenyészetet lehűtöttük. A sejtet lehet izolálni bármilyen nem roncsoló módszerrel, mint például centrifugálással vagy szűréssel. A sejtet azután megfelelő, 7,0 és 8,0 pH értékek közti pH-val rendelkező oldatban szuszpendáljuk. Előnyös, ha kb. 7,8 pH-jú, 50 mmol/literes nátrium-foszfát oldatot alkalmazunk. A sejtfalat elroncsoljuk megfelelő módszerrel, például keverővei vagy sejtzúzóval, és az így létrejött homogén szuszpenziót ultrahanggal kezeljük megfelelő körülmények között. Az ultrahangos kezelés egy folyamatos folyadékcella segítségével történhet. Az így létrejött, ultrahanggal kezelt oldatot azután megfelelő körülmények között centrifúgáljuk úgy, hogy a sejttörmelék elkülönüljön a fehérje felülúszó oldattól.

A felülúszót ezután 2 órán át melegítjük kb. 65 °C hőmérsékleten, majd hűtjük és centrifúgáljuk ugyanolyan körülmények között, mint amelyeket az előző centrifugálásnál alkalmaztunk, abból a célból, hogy felülúszóként tiszta fehéije-oldatot kapjunk. A felülúszót ezután megfelelő térfogatra besűrítjük (pl. 1 literre) ultraszűrő berendezéssel, 10000 molekulasúly kizárást alkalmazva.

A besűrített fehérjeoldatot azután ioncserélő kromatográfiának vetjük alá megfelelő anion-cserélőn, amely 7,0-8,0 közötti pH értéknél van kiegyensúlyozva. Előnyös, ha a kromatográfiát DEAE-Sephacel oszlopon hajtjuk végre, amely 150 mmol/liter nátrium-foszfát pufferral van kiegyensúlyozva. Az így létrejött átáramló oldatot, amely a szuperoxid-diszmutázt vagy analógot tartalmazza, ezután összegyűjtjük, besűrítjük megfelelő térfogatra és dializáljuk egy 7,0-8,0 pH közti pH-jú pufferolt oldattal szemben. Ezt megtehetjük ultraszűrő berendezésben 20 mmol/liter trisz-HCl oldattal (pH kb. 7,8) szemben.

Ezt a koncentrált oldatot ioncserélő kromatográfiának vetjük alá megfelelő, pH 7,0-8,0 között kiegyensúlyozott anioncserélőn. 20 mmol/liter trisz-HCl-el kiegyensúlyozott QAE-Sepharose oszlop, amelynek pHja kb. 7,8, megfelelő. Az anioncserélőhöz kötött fehérjét megfelelő só-gradiensnek vetjük alá, például 0-200 mmol/liter NaCl, 20 mmol/liter trisz-HCl-ben (pH 7,8). Az így létrejött, SOD-t vagy analógot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, sűrítjük például ultraszűrő berendezéssel, dializáljuk desztillált vízzel szemben, majd pH-ját kb. 4,0-5,0 közé állítjuk be megfelelő pufferral. Egy előnyös kiviteli módban a szóban forgó oldatot 100 mmol/literre állítjuk be nátrium-acetátra, 1 mol/literes, kb. 4,8 pH-jú nátrium-acetát hozzáadá-sával.

Ezt a pufferolt oldatot ismét ioncserélő kromatográfiának vetjük alá, de kationcserélővei. 100 mmol/lite16

HU 215 160 Β rés, mintegy 4,7 pH-jú nátrium-acetáttal kiegyensúlyozott CM-Sepharose oszlop megfelelő. A kationcserélőhöz kötött fehéqét megfelelő só-gradiensnek vetjük alá, ilyen például 100-500 mmol NaCl 100 mmol/liter nátrium-acetátban (pH 4,7), és az így létrejött, tisztított SODt vagy analógot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük.

A tisztított SOD-t tartalmazó frakciókat koncentrálhatjuk, például ultraszűréssel, és tároláshoz liofílezhetjük.

A találmány foglalkozik a tisztított, enzimesen aktív eukarióta szuperoxid-diszmutázzal vagy analógjaival is, amelyeket a jelen találmány szerinti módszerekkel állítanak elő és tisztítanak. A jelen találmány előnyös kiviteli formája tisztított, enzimesen aktív humán szuperoxid-diszmutázzal vagy analógjaival foglalkozik, amelyeket a jelen találmány szerinti módszerekkel állítanak elő és tisztítanak.

Kiviteli példák

A példák, amelyek itt következnek, azt a célt szolgálják, hogy segítsék a találmány megértését, de nem az a szándékuk, és nem is úgy vannak szerkesztve, hogy bármilyen módon korlátozzák a találmány oltalmi körét. A példák nem tartalmazzák az alkalmazott hagyományos módszerek leírását a vektorok megalkotásában, a szóban forgó polipeptideket kódoló gének beiktatásában az ilyen vektorokba, vagy az így létrejött plazmidok beiktatásában bakteriális gazdaszervezetbe. Az ilyen módszerek jól ismertek azok számára, akik a szakterületen átlagosan jártasak, és számos közleményben le vannak írva, beleértve például a következő körülményeket:

T. Maniatis, E. F. Fritsch és J. Sambrook: Molecular Cloning; A Laboratory Manual (Molekuláris klónozás; Laboratóriumi kézikönyv); Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982).

Methods in Enzimology, 65, „Nucleic Acids” (Nukleinsavak), 1. rész. Szerkesztette: Lawrence Grossman és Kivié Moldave, kiadó: Academic Press, New York (1980).

Methods in Enzimology, 68, „Recombinant DNA” (Rekombináns DNS). Szerkesztette: Ray Wu, kiadó: Academic Press, New York (1981).

Methods in Enzimology, 100, „Recombinant DNA” (Rekombináns DNS). B. rész. Szerkesztette: Ray Wu, Lawrence Grossman és Kivié Moldave, kiadó: Academic Press, New York (1983).

Methods in Enzimology, 101, „Recombinant DNA” (Rekombináns DNS). C. rész. Szerkesztette: Ray Wu, Lawrence Grossman és Kivié Moldave, kiadó: Academic Press, New York (1983).

Principles of Gene Manipulation, An Introduction to Genetic Engineering (A genetikai manipulációk elvei, bevezetés a genetikai mérnökségbe). 2. kiadás. Szerkesztette: R. W. Old és S. B. Primrose, kiadó: University of Califomia Press (1981).

Η. V. Bemard és munkatársai: Gene, 5, 59 (1979).

A. B. Oppenheim és munkatársai: J. Mól. Bioi. 158, 327 (1982).

E. Remsut és munkatársai: Gene, 15, 81 (1981).

1. példa

Kifejeződő vektorok

Ahogyan itt használjuk, a „kifejeződő vektor” kifejezés olyan plazmidok csoportjára vonatkozik, amelyek használhatók a kívánt gén kifejezésére baktériumokban, főleg E. coli-ban. A kívánt gént be lehet iktatni a kifejeződő vektorba, vagy más módszerrel a kifejeződő vektoron levő promotorokat ki lehet metszeni és behelyezni a kívánt gén elé.

pJH200

A 2. ábrában bemutatott pJH200 a pBR32 sok-kópiás plazmidba beiktatott DNS-ből tevődik össze. A /DNS kiemelkedő vonásai azok, hogy tartalmazza a λΡ_Ε promotort, a baloldali N hasznosító helyet (nut_L), egy EeoRI restrikciós helyet, a t_M befejező (terminációs) helyet, ezt követi a C_n riboszomális kötőhely és egy ATG beindító kodon, amely az Ndél restrikciós hely része. 116 bázispáron belül az Ndél restrikciós helytől „lefelé” négy egyedi restrikciós hely van, ahogyan ezt a

2. ábra bemutatja. A restrikciós helyek lehetővé teszik a kívánt gén könnyű beiktatását. A C_n riboszomális kötőhely különbözik a természetes riboszomális kötőhelytől, egyetlen pontmutációval.

A pJH200-at pOGl 1 -bői alkották meg [Oppenheim, A. és munkatársai: J. Mól. Bioi. 158, 327 (1982)], és ez tartalmazza a XP_L promotort és a pOG 11-ben található C_n riboszomális kötőhelyet. A λΡ, promotor és a C_n riboszomális kötőhely között elhelyezkedő XDNS 346 bp-ja azonban ki van iktatva, és egy EeoRI restrikciós hely van beiktatva e közt a két elem közt levő elágazásnál. Egy multi-restrikciós hely linkért is bevezettek a riboszomális kötőhelytől „lefelé”. A pJH200 deponálva van az American Type Culture Collectionnál, ATCC 39783 letéti számon, 1984. augusztus 2-a óta. pR0211

A pR0211, amelyet a 2. ábrában mutatunk be, és részletesen leírtunk az ábrák leírásában, a pJH200-ból származik olyan módon, hogy a két Ndel restrikciós hely egyikét eltüntetjük. A pJH200-t, pR0211-t és származékait, amelyek eukarióta géneket tartalmaznak, megfelelő E. coli gazdaszervezetben lehet fenntartani. A megfelelő gazdaszervezet legfontosabb vonása az, hogy a hőérzékeny cI857 represszort és az antiterminációs N-fehérjét (Guttesman, Μ. E. és munkatársai: J. Mól. Bioi. 140, 57-75 (1980) tartalmazza.

A pR0211-nek számos előnye van a korábban leírt kifejeződő vektorokkal szemben, ezek például a következők:

1. A kifejeződés különösen magas szintje.

A vektor képes az idegen fehérje kifejezésének irányítására E. coli-ban, akár a teljes sejtfehérje 35%-áig teqedő szinten.

2. Helyettesíthető riboszomális kötőhely.

A pR0211 tartalmaz egy egyedi EeoRI helyet, amely a riboszomális kötőhelytől „felfelé” helyezkedik el, és egy Ndel helyet, amely a riboszomális kötőhelytől „lefelé” helyezkedik el. így a riboszomális kötőhely két egyedi restrikciós helyhez van kötve. Ez lehetővé teszi a jelen riboszomális kötőhely (a ZC_n riboszomális kötőhely) kimetszését és tulajdonképpen bármilyen termé17

HU215 160 Β szetes vagy szintetikus riboszomális kötőhely helyettesítését anélkül, hogy a plazmid egyéb vonásait változtatnánk. Ez nagy mértékben megkönnyíti a kívánt polipeptid optimális kifejeződését.

3. A kifejeződés hővel indukálható szabályozása

A λΡ_Ε promotor inaktív, amikor a Cj represszor hozzá van kötve. A cI857 represszor hőérzékeny, azaz kötődik a promotorhoz 30 °C hőmérsékleten, de inaktivált 42 °C hőmérsékleten. így a fermentáció hőmérsékletének emelésével 42 °C hőmérsékletre, a gazda-baktériumok indukálódnak, hogy fehérjét termeljenek.

Az ilyen rendszer előnyei például a következők:

(a) Egy idegen fehérjét, amely toxikus Escherichia coli-ra, is elő lehet állítani a fermentációs folyamat késői szakaszában, így kerülve el a korai sejtpusztulást.

(b) Egy fehérje túltermelése stabilizálhatja a fehérjét és megelőzi a proteolitikus lebontást [Cheng, Y. E. és munkatársai: Gene, 14, 121 (1981)]. így az „azonnali” túltermelés, egy szigorúan szabályozott promotort, mint például λΡ, -t alkalmazva, előnyösebb lehet a folyamatos alacsonyszintű termelésnél.

4. Egyszerűsített indukciós munkamenet.

A jelen találmányi bejelentésben leírt és a még szintén függőben levő, együtt benyújtott 514,188 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben leírt plazmidok által történő fehérjetermelést a cI857 hőérzékeny represszor szabályozza.

A még szintén függőben levő, együtt benyújtott bejelentésben leírt plazmidok által igényelt indukciós munkamenet magában foglalja az indukciót 42 °C hőmérsékleten a 38 °C hőmérsékleten végzett növesztést követően. Ezzel ellentétben a fehérje-szintézis optimális indukciója, amikor pJEi200, pRO211 vektorokat vagy plazmid-származékaikat alkalmazzuk, indukciót foglal magában 42 °C hőmérsékleten, azonos hőmérsékleten, vagyis 42 °C-on végzett növesztés után. Ez szükségtelenné teszi a fermentor hűtését.

5. Kópiaszám

A λΡ_Ε promotor a pJH200-ban és pRO211-ben olyan plazmidon található, amelynek kópiaszáma nagyobb, mint a λ transzdukciós fág vektoroké, amelyek az E. coliban vannak jelen. Ez növeli a kifejeződés szintet.

6. Riboszóma kötőhely és beindító (iniciációs) kodon.

Ez a kifejeződő vektor tartalmaz egy erős prokarióta-riboszomális kötőhelyet (RBS), valamint egy transzlációs iniciációs kodont (ATG). így bármilyen eukarióta gént lehet klónozni az iniciációs kodon nélkül. Ezen túl a hatásos RBS növeli a kifejeződés szintjét. A riboszóma kötőhely a ÁC_n riboszomális kötőhely. A riboszomális kötőhely szekvenciája a következő:

TAAGGAAGTACTTACAT

ATTCCTTCATGAATGTA

Egy bázispár különbözik a vad típusú λ-ban található riboszomális kötőhelytől.

7. Kényelmes restrikciós hely.

A kifejeződő vektor egy egyedi Ndel restrikciós hellyel rendelkezik, amely tartalmazza a helyen belül az ATG iniciációs kodont. Ez lehetővé teszi a kívánt gén megfelelő elhelyezkedését. Az egyedi Ndel helyet közvetlenül a riboszomális kötőhely után találjuk.

8. Kényelmes restrikciós hely a gén-beiktatáshoz.

116 bázispáron belül az Ndel restrikciós helytől „lefelé” 4 másik egyedi restrikciós hely is van a következő sorrendben: BgM, Smal, HindlII és Cial. Az egyedi helyek sokfélesége lehetővé teszi a kívánt gének könnyű beiktatását.

9. nut hely

Az N fehérje, amelyet a gazdaszervezet szolgáltat, kötődik a nut helyhez a kifejeződő vektoron, és ezáltal meggátolja az átírás befejezését a ^lRI helynél vagy az érettség előtti átírási befejeződést a klónozott génen belül. Törzsek.

A megfelelő gazdaszervezetek a leírt vektorokhoz az E. coli transzformációra alkalmas törzsei, ilyenek például az A1637, A2602, A1563,

A1645 [c600 rm+gal+thrleu-lac-bl (kcI857AHlAbamhI N⁺) és A2097 (A1645 lacAKA21 proC::TnlO)].

2. példa

Állati növekedési hormonok

I. pRO12

A pRO12 megalkotását a 2. ábrában mutatjuk be, és leírtuk az „Ábrák ismertetése” című részben. pAL500ból származó bGH cDNS-t, amelynek megalkotását az

I. ábrában mutatjuk be, manipuláljuk a pRO211-be való beiktatás előtt, hogy a korrekt leolvasó keretet és egy Ndel restrikciós helyet nyújtsunk.

A pRO12-t Escherichia coli A1645 törzsbe vezetjük transzformációval, olyan módszerekkel, amelyek ismerősek azok számára, akik a szakterületen átlagosan járatosak. Ez a törzs növesztésre és indukcióra a szarvasmarha növekedési hormon (bGH) egy analógját termeli, amely a természetes bGH fenilalanin formájának N-terminálisához hozzátéve met-asp-gln aminosav-szekvenciával rendelkezik. A pRO12 által termelt bGH analóg mennyisége mintegy 30-36%-a a baktérium által termelt összes fehérje mennyiségének, amint ezt Coomassie kékkel festett SDS (nátrium-dodecil-szulfát) poliakril-amid gél átvizsgálása alapján kalkuláljuk (I. Táblázat).

II. pSAL 5200-6.

A pSAL 5200-6 megalkotását a 3. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák ismertetése” c. részben. A met-phe bGH-t kódoló DNS szekvenciát úgy nyerjük, hogy a pR012-t elhasítjuk PvwII-vel és Ndel-Sí és beiktatunk egy szintetikus DNS fragmenst, amely fragmenst két egyszálú, 10 bázispáros, átfedő szegmensekkel rendelkező szintetikus oligonukleotidokból nyerjük.

A pSAL 5200-6-ot Escherichia coli A1645 törzsbe vezetjük be transzformációval, ismert módszereket alkalmazva. Ez a törzs növesztésre és indukcióra olyan bGH analógot termel, amely egy metioninnal rendelkezik a phe-bGH amino-terminálisához hozzáadva. A pSAL 5200-6 által termelt met-phe bGH analóg mennyisége mintegy 18-20%-a a baktérium által termelt összes fehérjének, amint ezt Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid gél átvizsgálása alapján kalkuláljuk. A törzs növesztésére, a termelt bGH kinyerésére és a bGH tisztítására alkalmazott módszerek azonosak az18

HU 215 160 Β zal, amelyeket majd az 5. példában leírunk apRO 12-ben történő bGH termeléshez.

III. p3008

A p3008 megalkotását a 4. ábrában mutatjuk be, és le is íijuk az „Ábrák ismertetése” c. részben. A p3008at letétbe helyeztük az American Type Culture Collectionnál, ATCC 39 804 számon. A met-phe pGH-t (sertés növekedési hormon) kódoló DNS szekvenciát pGH cDNS beiktatásával nyerjük pRO211-ből.

A p3008-at bevezetjük Escherichia coli A1645 törzsbe transzformációval, olyan módszereket használva, amelyek ismerősek azok számára, akik a szakterületen átlagosan járatosak. Ez a törzs növesztésre és indukcióra olyan pGH-t termel, amely egy metioninnel rendelkezik a pGH amino-terminálishoz hozzátéve. A p3008 által termelt met-phe pGH analóg mennyisége kb. 18-20%-a a baktérium által termelt teljes fehérjének, amint ezt a Coomassie-val festett SDS poliakrilamid-gélek átvizsgálása alapján kalkuláljuk.

IV. p5002

A p5002 megalkotását az 5. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák ismertetése” című részben. A met-phe cGH-1 (csirke növekedési hormon) kódoló szekvenciát a cGH cDNS-t pRO211-be beiktatva és a gének 5’ végét szintetikus oligonukleotid linkerekkel kiegészítve nyerjük.

A p5002-t Escherichia coli A1645 törzsbe vezetjük be transzformációval, ismert módszereket használva. Ez a törzs növesztésre és indukcióra olyan cGH-t termel, amely egy metioninnal rendelkezik a phe-cGH amino5 terminálisához hozzátéve. A p5002 által termelt met-phe cGH analóg mennyisége mintegy 18-20%-a a baktérium által termelt összes fehérje mennyiségének, amint ezt a Coomassie-val festett SDS poliakrilamid-gélek átvizsgálása alapján kalkuláljuk. A törzs növesztésé10 re, a termelt cGH kinyerésére, és a cGH tisztítására alkalmazott módszerek azonosak azokkal, amelyeket majd az 5. példában írunk le bGH termelésére pRO 12-ből.

3. példa

Humán Cu-Zn szuperoxid-diszmutáz (SÓD)

A kiindulási pont a Cu-Zn SÓD cDNS módosításaihoz a Lieman-Hurwitz, J. és munkatársai által leírt pS61-10 plazmid [PNAS, 79, 2808 (1982)]. Az SÓD cDNS-t leírja a 489,786 sorozatszámú, függőben levő,

1983. április 29-én benyújtott amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás is. Az SÓD cDNS-t úgy módosítjuk, hogy bevezetünk egy Ndeí restrikciós helyet a gén 5’ végére és egy HindlII restrikciós helyet a gén 3’ végére. Az így létrejött plazmid, a pSOD NH-10, tartal25 mázzá az SÓD cDNS-t az egyedi restrikciós helyek által kötve.

I. táblázat¹

Plazmid	Gazdaszervezet	% bGH1 2	Megjegyzések
pRec 2/3	A1637	23	AmpR
pROll	A1637	28	AmpR
pRO12	A1645	30-36	AmpR
pHG44	A2097	37-42	AmpR, T,T2
pHG50	A1645	37-42	AmpR; TjT2; cl434
pSAL-130/5	A1645	39^44	AmpR; CHCN; UT,
pSAL-170/10	A1645	40-46	TetR; CHCN; T,T2

1. A Táblázat a pRO211-ből származó különböző plazmidok bGH kifejeződési szintjeit foglalja össze. A pRec 213 és pROl 1 plazmidokat a még függőben levő, együtt bejelentett 514,188 bejelentési számú, 1983. július 15-én benyújtott amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés írja le.

2. A termelt bGH mennyisége az összes bakteriális fehérje százalékában.

Rövidítések

CHCN = konstitutíven nagy kópiaszám

Amp^R = ampicillin-rezisztencia

Tet^R = tetraciklin-rezisztencia

T|T₂ = átírási befejeződést szekvenciák cl⁴³⁴ = cl⁴³⁴ plazmid stabilizációs rendszer

I. pSODa2

A pSODa2 megalkotását a 13. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák ismertetése” című részben. ApSODa2-t letétbe helyeztük az American Type Culture Collectionnál ATCC 39786 letéti számon.

Hogy a pSODa2-t megalkossuk, a XP_L promotort, a NutL-t és a C_u riboszomális kötőhelyet kimetsszük a pJH200 kifejeződő vektorból, és a pSOD

NH-10 plazmid SÓD génje elé helyezzük. Ezután a mind a promotort, mind az RBS-t, mind az SOD-gént tartalmazó fragmenst beiktatjuk a pBRM vektorba [Hartman, J. R. és munkatársai: PNAS 79, 233-237 (1982)]. A pBRM letétbe van helyezve az

5Q American Type Culture Collectionnál, ATCC 37 283 letéti számon. A pSODa2-t Escherichia coli A2097 törzsbe vezetjük be transzformálással, ismert módszereket alkalmazva. A nyert kiónok növesztésre és indukcióra egy SÓD analóg fehéijét termelnek. pSODa2 által termelt

SÓD analóg mennyisége mintegy 0,1-0,3%-a a baktérium által termelt összes fehérjének, amint ezt Coomassievel festett SDS poliakrilamid gél átvizsgálása alapján kalkuláljuk (II. Táblázat). A termelt SÓD analóg valószínűleg azonos azzal, amelyet a következő bekezdésben leírt pSODpi termel.

HU 215 160 Β

II. pSODpi

A ρΞΟΏβΙ megalkotását a 14. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák ismertetése” című részben. ApSODpl megalkotásához a pSODa2 C_n RBS-ét βlaktamáz promotorral és a pBLAl 1-ből származó RBS-el helyettesítjük. A pBLAl 1 letétbe van helyezve az American Type Culture Collectionnál ATCC 39 788 letéti számon. A pBLAl 1 tartalmazza a pBR322-ben található β-laktamáz gén riboszomális kötőhelyét és promotorját a 4157 és 4353 koordinátumok között. Egy EcoRI linkért adunk hozzá a promotortól lefelé, és egy multi-restrikciós linkért adunk hozzá közvetlenül az ATG iniciációs kodon után. így a kódoló szál szekvenciája az iniciációs kodonnal kezdve ATGAGCTCTAGAATTC.

A ρβΟϋβΙ-εί Escherichia coli A1645 törzsbejuttatjuk be transzformációval, ismert módszereket alkalmazva. A nyert kiónok növesztésre és indukcióra egy SÓD analógot termelnek. A termelt Cu-Zn SÓD analóg a természetes humán Cu-Zn SOD-től abban különbözik, hogy az amino-terminális alanin nincs acetilezve, amint ezt az aminosavszekvencia-elemzés szötchiometriájával demonstráljuk, míg a természetes humán SÓD acetilezve van az alanin amino-terminálisnál [Hartz, J. W. és Deutsch, H. F.: J. Bioi. Chem., 234, 7043-7050 (1972); Jabusch, J. R. és munkatársai: Biochemistry, 19, 2310-2316 (1980); Bárrá és munkatársai: FEBS Letters, 120, 53 (1980); és Oberley, L. W.: Superoxide Dismutase, I. kötet, 32-33, kiadó: CRC Press, Florida (1982)]. Ezen kívül a természetes humán SÓD glikozilezve is van (Huber, W.: 3,579,495 lajstomszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, nyilvánosságra került 1971. május 18-án), míg a baktériumok által termelt humán SÓD csaknem biztosan nincs glikozilezve, mivel az Escherichia coli nem glikozilezi azokat a fehérjéket, amelyeket termel. A baktériumok által termelt SÓD analóg aminosav-szekvenciája azonos az érett humán SÓD aminosav-szekvenciájával és nem tartalmaz metionin gyököt N-terminálisánál.

A ρ8Οϋβ1 által produkált SÓD mennyisége mintegy 3-8%-a a baktériumok által termelt összes fehérjének, amint ezt Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid gél átvizsgálása alapján kalkuláljuk (II. Táblázat). A törzs növesztésére, a termelt SÓD kinyerésére és az SÓD tisztítására alkalmazott módszerek azonosak azokkal, amelyeket majd a 7. példában írunk le a ρβΟϋβΙΤΙΙ-ηέΙ.

III. pStX^lTll

A ρΞΟϋβΙΤΙΙ megalkotását a 15. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák ismertetése” című részben. A ρ80ϋβ1 β-laktamáz gént helyettesítjük a pBR322-ből származó, tetraciklin-rezisztenciát kódoló génnel.

A ρ80ϋβ1Τ11 által termelt SÓD analóg mennyisége mintegy 8-13%-a a baktériumok által termelt összes fehérjének, amint ezt Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid-gél átvizsgálása alapján kalkuláljuk (II. Táblázat). A termelt SÓD analóg azonos a pSODpl által termelt SÓD analóggal.

IV. ρ8ΟΟβ1-ΒΑ2 (8. old.)

A pSODpl-BA2 megalkotását a 17. ábrában mutatjuk be, és le is íquk az „Ábrák ismertetése” című részben. A pSODocl3 C_n riboszomális kötőhelyét egy következő szintetikus DNS fragmenssel helyettesítjük

AATTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAG

GTTATTATAACTTTTTCCTTCTCAT, amely hasonló a természetes β-laktamáz RBS szekvenciájához. A ρ8ΟΟβ1-ΒΑ2Α Escherichia coli A1645 törzsbe vezetjük be transzformációval olyan módszereket alkalmazva, amelyek ismertek azok számára, akik a szakterületen átlagosan jártasak. A nyert kiónok növesztésre és indukcióra a humán SÓD egy analógját termelik. A ρ5ΟΠβ1-ΒΑ2-νε1 termelt SÓD mennyisége a baktérium által termelt összes fehérje mintegy 2-4%-a, amint ezt Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid-gél átvizsgálása alapján kalkuláljuk (II. Táblázat). A termelt SÓD analóg azonos azzal, amelyet a pSODjíl termel.

4. példa

Humán Apolipoprotein E (ApoE3)

Az ApoE3 cDNS módosításaihoz kiindulási pont a pNB178 plazmid, amelyet Dr. John Taylor bocsátott rendelkezésünkre (Gladstone Foundation, San Francisco, Kalifornia). Ez a plazmid a humán ApoE3 gén teljes hosszúságú cDNS kópiáját tartalmazza. A pNB178-ban levő cDNS-t úgy módosítjuk, hogy eltávolítjuk a nem kódoló DNS-t a gén 5’ végénél és Ndel restrikciós helyeket adunk hozzá a gén mindkét végénél. Ezt az ApoE3 cDNS fragmenst beiktatjuk a pNDS vektorba [ez utóbbi a függőben levő, együtt bejelentett 514,188 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben van leírva (bejelentve: 1983. július 15.)]. Az így létrejött plazmidot, a pApoE-EX2-t, amelyet a 18. ábrán mutatunk be, letétbe helyeztük az American Type Culture Collectionnál, ATCC 39787 letéti számon.

II. táblázat

Plazmid	RBS	Gazdaszervezet	% SÓD3	Megjegyzések
pSODal	CII	A2097	0,1-0,3	AmpR
pSODpi	BLA'	A1645	3-8	AmpR
pSODplTll	BLA1	A1645	8-13	TetR
pSODplTT-1	BLA1	A1645	10-15	TetR; T,T2
pSODpi-BA2	BLA2	A1645	2-4	AmpR

HU 215 160 Β ten. A fagyasztó tápközeg 500 ml-e a következőket tartalmazza:

1. β-laktamáz gén promotorja és riboszomális kötőhelye.

2. Szintetikus riboszomális kötőhely, amely a βlaktamáz gén riboszomális kötőhelyének felel meg.

3. A termelt SÓD analóg mennyisége a teljes bakteriális fehérje százalékában kifejezve

Rövidítések

Amp^R = ampicillin-rezisztencia

Tet^R = tetraciklin-rezisztencia T,T₂ = átírás befejezési szekvenciák I. pTV-188

A pTV-188 megalkotását a 18. ábrán mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák ismertetése” című részben. A pTV-188 plazmidot úgy nyerjük, hogy a betöltött, Ndel-Ndel ApoE3 fragmenst beiktatjuk Αρ8ΟΟβ1Τ11 Stuí egyedi tompavégű helyébe (lásd a 14. ábrát, és az „Ábrák ismertetésé”-t).

A pTV-188-at beiktatjuk Escherichia coli A1645 törzsbe transzformációval olyan módszerekkel, amelyek ismertek azok számára, akik a szakterületen átlagosan járatosak. A nyert kiónok a növesztésre és indukcióra olyan humán ApoE3 analógot termelnek, amely a humán szuperoxid diszmutáz N-terminálisának 42 aminosavával rendelkezik az autentikus humán ApoE3 N-terminálisához hozzákötve, ezt metionin követi az analóg N-terminálisánál. A termelt ApoE3 analóg mintegy 10%-a a baktériumok által termelt összes fehérjének, amint ezt Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid-gél átvizsgálása alapján kalkuláljuk. A törzsek növesztésére alkalmazott módszer azonos azzal, amelyet az 5. példában leírunk a bGH termeléséhez pRO 12-ből, kivéve azt, hogy 12,5 mg/liter tetraciklint alkalmazunk ampicillin helyett.

IL pSAL 160-5

A pSAL 160-5 megalkotását a 23. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák ismertetése” című részben. A pSAL 160-5 plazmidot a pTV-170-ből nyert Aval-Aval ApoE3 gén fragmens beiktatásával nyerjük (lásd 20. ábra).

A pSAL 160-5-öt Escherichia coli törzsbe vezetjük be transzformálással, olyan módszerekkel, amelyek ismertek azok számára, akik a szakterületen átlagosan járatosak. A nyert kiónok növesztésre és indukcióra olyan ApoE3 analógot termelnek, amely metionint tartalmaz amino-terminálisánál, majd 45 aminosavat a humán növekedési hormon N-terminálisából, fuzionálva ApoE3-hoz, amelyből all N-terminális aminosav ki van iktatva. A pSAL 160-5 által termelt ApoE3 analóg mennyisége a baktériumok által termelt összes fehérje mintegy 5%-a, amint ezt Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid-gél átvizsgálása alapján kalkuláljuk. A törzsek növesztésére alkalmazott módszer azonos azzal, amelyet az 5. példában leírunk a bGH termeléséhez pRO 12-ből.

5. példa pRO12 növesztése

1. Törzstenyészetek

A pRO12 törzstenyészetet kazeines tápközegen növesztjük (lásd az „Inokulum”-nál), majd kétszeresére hígítjuk fagyasztó tápközeggel és -80 °C hőmérsékle-

K2HPO4	6,3 g
kh2po4	1,8 g
Na-citrát	0,45 g
MgSO4.7H2O	0,09 g
(NH4)2SO4	0,9 g
Glicerin	44,0 g.
Inokulum
Az inokulumot olyan tápközegben szaporítjuk,

amely 20 g/liter kazein-hidrolizátumot, 10 g/liter élesztőkivonatot és 2 g/liter NaCl-t tartalmaz. Egy rázólombikban levő steril tápközeget inokulálunk a törzstenyészetből és inkubáljuk 15 órán át rázógépen, 30 °C hőmérsékleten, mintegy 200 fordulat/perccel. Amikor szükséges a későbbi stádiumoknál, az inokulum szaporítását kevert, levegőztetett fermentorokban hajtjuk végre. A steril tápközeget 2-10% inokulummal inokuláljuk és 15 órán át inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten, pH 7 ± 0,5-nél, kevertetéssel és levegőztetéssel olyan mértékig, hogy az oldott oxigén szintje 20%-os levegő-telítettség fölött legyen.

III. Termelés

A termelő tápközeg a következőket tartalmazza:

Kazein-hidrolizátum 20 g/1

Élesztő-kivonat 10 g/1

K₂HPO₄ 2,5 g/1

MgSO₄.7H₂O 1 g/1

NaCl 5 g/1

Biotin 0,1 mg/1

Tiamin 1 mg/1

Nyomelem-oldat 3 ml/1.

A tápközeg tartalmaz 100 mg/liter ampicillint is. Az ampicillin feltételesen alkalmazandó a termeléshez, de mindig megtalálható az inokulum növesztéséhez használt tápközegben.

A biotint, tiamint és az ampicillint koncentrált oldatban külön-külön szűréssel sterilezzük, és a steril termelő tápközeghez adjuk az inokulálás előtt. Annyi steril glükóz oldatot adunk hozzá kezdetben, hogy a koncentráció 10 g/liter legyen. Az indukciós lépés alkalmával további 10 g/1 glükózt adunk hozzá.

A nyomelem-oldat a következőket tartalmazza:
FeCl,	16 g/1
ZnCl2.4H2O	2 g/1
CoCl2.6H2O	2 g/1
Na2MoO4.2H2O	2 g/1
CaCl2.2H2O	lg/1
CuCl2 1 g/1
H3Bo3	0,5 g/1
Konc. HCI	100 ml/1.
A tápközeget 0,5-10%	inokulum-tenyészettel

inokuláljuk, és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A keverési-levegőztetési sebességeket úgy állítjuk be, hogy az oldott oxigén szintje mindig 20% levegő-telítettség fölött legyen. A pH-t 7,0 ± 0,2 értéken tartjuk NH₃-al. Amikor a sejtkoncentráció eléri a mintegy 3,5 g/litert (OD₆₆₀ = 10), elkezdjük az indukciót.

A hőmérsékletet 42 °C-ra emeljük és 1-5 órán át 42 °C hőmérsékleten tartjuk. A tenyészetet ezután le21

HU 215 160 Β hűtjük, és a sejteket centrifugáíássaí kinyerjük a hormon tisztításához.

A bGH kinyerése kb baktériumsejtet (nedves szűrőpogácsa) újra szuszpendálunk 5 térfogat oldatban, amely 50 mmol/liter nátrium-foszfát puffért (pH 7,4), 50 mmol/liter EDTA-t és 100 mmol/liter NaCl-t tartalmaz, a szuszpendáláshoz „Polytron (Kinematica) blender” keverőt alkalmazva, menet közben szabályozva a keverő sebességét, hogy a habzás minimális legyen. A homogén szuszpenziót folyamatosan átvisszük egy Dynomill sejtzúzón (KDS típus, Willy A. Bachofen, Basel) 80 liter/óra sebességgel, és a szétzúzott sejtek homogén szuszpenzióját centrifugáíássaí tisztítjuk CEPA 100 centrifugában 45 liter/óra átfolyási sebességgel. A centrifugálási lépésből a csapadékot kinyeijük, és újra szuszpendáljuk 15,8 liter 50 mmol/literes nátriumfoszfát pufferban (pH 7,4), amely 50 mmol/liter EDTAt is tartalmaz. Lizozimot adunk hozzá 0,05 mg/ml végső koncentrációig, és a szuszpenziót 16 órán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten. Triton Χ-100-at adunk hozzá 1% végső koncentrációig. A szuszpenziót azután 30 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten, ultrahanggal kezeljük folyamatos áramú sejt-ultrahangkezelőben (szonikátorban) (Heat System) 18 liter/óra sebességgel, és centrifugáljuk CEPA 101 centrifugában. A csapadékot összegyűjtjük, újra szuszpendáljuk 50 mmol/literes nátrium-foszfát pufferral (pH 7,4), ultrahanggal kezeljük a fentiek szerint, és centrifugáljuk CEPA 101 centrifugában. A sejteket újra szuszpendáljuk 15,5 liter 50 mmol/literes nátrium-foszfát pufferban (pH 7,4), amely 50 mmol/liter EDTA-t és 100 mmol/liter NaCl-t is tartalmaz, és kétszer kicsapjuk, és újra centrifugáljuk

15,5 liter desztillált vízzel. A csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, és -20 °C hőmérsékleten tároljuk, a bGH tisztítása

A csapadékot 30-40 liter desztillált vízben újra szuszpendáljuk és szolubilizáljuk 0,5 n NaOH-val pH 11,8-ra titrálva. Az oldatot azután folyamatosan ultrahang-kezelésnek vetjük alá, majd centrifugáíássaí tisztítjuk CEPA centrifugában, ha szükséges, vagy Whatman 1 papíron át szűrjük.

A tisztított fehérje-oldatot 32,6 liter, 297000 OD-t tartalmaz 280 nm-nél) külön részletekre osztjuk (6*5,4 liter), mindegyik részlet 50000 OD értéket tartalmaz. Mindegyik részletet külön-külön ultraszűrésnek vetjük alá Millipore Pellicon ultraszűrőn át, amely három, 100000 molekulasúly-kizárásos kazettával (PTHK típus) van ellátva, mindegyik kazetta 5 négyzetláb, vegyes 0,456 m² területű. Egy 5,4 literes adagot 1 liter visszamaradó térfogatra koncentrálunk. Az ultraszűrletet összegyűjtjük és félretesszük. A visszamaradó anyagot eredeti térfogatára hígítjuk vissza friss, 10 mmol/literes borát-pufferral (pH 11,8), és összekeverjük. Ezt az adagot újra ultraszűrésnek vetjük alá 1 liter visszamaradó térfogatig. Az ultraszűrletet összegyűjtjük, és egyesítjük az első ultraszűrlettel. Amikor az OD értékek meglevő értéke az ultraszűrletekben az ultraszűrőre eredetileg táplált OD értékek 20%-ával lesz egyenlő, a visszamaradó térfogatot a következő koncentrációs lépésnél 0,5 liternek vesszük 1 liter helyett. A koncentrálás és hígítás ciklusát 10 mmol/literes borát-pufferral addig folytatjuk, amíg a 0,5 liter visszamaradékból származó ultraszűrlet 280 nm-nél mért értéke (1 cm-es cellában) kevesebb, mint 0,1 lesz. Ez normálisan a 9-12-ig koncentrálás-hígítás ciklusban következik be. Az utolsó visszamaradt anyagot kidobjuk.

Az összes ultraszűrletet egyesítjük, és pH 9,0-ra állítjuk be 6 n HCl-el. A többi 5,4 literes adagokat ugyanolyan módon vetjük alá ultraszűrésnek, és az összes, pH-ra beállított ultraszűrletet egyesítjük. Egy tipikus műveleti lefutás 380 liter ultraszűrletet termel 0,26-os abszorbanciával, amely 100000 OD-val egyenértékű, ez a teljes műveletsor 24-40 órát igényel.

A kombinált ultraszűrleteket (380 liter, amely 100000 OD értéket tartalmaz, 280 nm-nél mérve) a 100K ultraszűrési lépésből Sepharose CL-6B DEAE ioncserélő oszlopra terheljük, 23 cm/óra (25 liter/óra) lineáris áramlási sebességgel. A 37 cm átmérőjű, 15 cm magas oszlopot két ágytérfogat (32 liter/10 mmol) literes borát-pufferral mossuk pH 9,0-nál. A ráterhelési és mosási lépés eluátumát eldobjuk. Egy eluálószer-váltási lépés 10 mmol/liter borátot és 100 mmol/liter nátriumkloridot tartalmazó oldatra (pH 9) a bGH-t leszorítja az oszlopról. Az eluálási áramlási sebesség 23 cm/óra. A lefutás előrehaladtát az eluátum abszorbanciáját 280 nm-nél követve ellenőrizhetjük. A bGH csúcsot összegyűjtjük 4-5 ágytérfogatban (84 liter, amely 280 nm-nél mérve 43 000 OD-egységet tartalmaz), majd mintegy 10 mg/ml-re koncentráljuk, Millipore Pellicon ultraszűrő berendezést alkalmazva 10000 molekulasúlykizárásos kazettával. Az oldatot ezután liofilezzük. A kitermelés mintegy 70 g tiszta bGH.

6. példa

A pRO12 által termelt bGH analóg aktivitása

1. A bGH analóg radioimmunassay-val végzett összehasonlítása a természetes bGH-val.

100 ng/ml bGH analógot tartalmazó oldatot készítünk foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldatban (1% BSA). Ebből az oldatból sorozathígítást készítünk 50; 25; 12,5; 6,25; 3,12; 1,56; és 0,78 ng/1 koncentrációkra. Ezekből az oldatokból 0,1 ml-es alikvotokat, két párhuzamossal, RIA mérésnek vetünk alá, kettős antitest eljárást alkalmazva. A hígítási görbét összehasonlítjuk a természetes bGH-val nyert hasonló görbével.

2. Radioreceptor-kötő mérés.

Radioreceptor-kötő mérést hajtunk végre nyúlmáj membránokkal, amint ezt Tushima, T. és Freisen, H. G. leírták [J. Clin. Endocr. Metab. 37, 3 (1973)], ¹²⁵I-bGH-t használva jelzőanyagként és autentikus bGH oldatot kalibrációs görbe megalkotásához. A mintákat három párhuzamosban inkubáljuk két órán át szobahőmérsékleten 0,3 ml vizsgáló pufferban (50 mmol/liter trisz, 15 mmol/liter CaCl₂ és 5 mg/ml bovin szérum albumin, pH 7,6). A csövek ¹²⁵I-bGH-t (30-60 pci/pg-os készítmény 20000 cpm-je), 150-250 pg máj-membrán fehéijét és/vagy természetes bGH-t (1-100 ng), vagy bakteriális bGH extraktumot tartalmaz. Az eredmények

HU 215 160 Β azt demonstrálják, hogy a bGH analóg bGH aktivitása jól összehasonlítható a természetes bGH aktivitásával.

3. Tibia vizsgálat

Az 5. példa szerinti, pRO12 által termelt, bakteriális sejtből kinyert bGH analóg bioaktivitását tibia (sípcsont) vizsgálattal értékeljük ki [Parlow, A. F. és munkatársai: Endocrinology, 77, 1126 (1965)]. Patkányok hipofízisét 28-30 napos korukban eltávolítjuk, majd 10-14 napig kezelés nélkül tartjuk ezeket. Szarvasmarha hipofízisből származó vagy rekombináns Escherichia coli-ból származó szarvasmarha növekedési hormont feloldunk 0,15 mol/liter NaCl-t és 0,01 mol/liter borát-puffert (pH 10,0) tartalmazó oldatban. 4—7 patkányt tartalmazó csoportok naponta szubkután bGH oldatot tartalmazó injekciókat (5-125 pg/nap, 0,2 ml koncentrációban) kapnak 5 napon át, miközben normális étrenden tartjuk ezeket (Purina Rat-Chow tápszer és víz, korlátlanul). Az állatokat a 6. napon leöljük, az első láb térdcsontjaikat kivesszük, hosszában elvágjuk, acetonnal rögzítjük, és 2% AgNO₃-al festjük. Az epifizeális lemezek szélességét televízióban kapcsolt binokuláron (Nikon) keresztül végzett megfigyeléssel méljük. Átlagértékeket (40 leolvasás patkányonként) alkalmazunk egy hosszú dózis-válaszgörbe megalkotásához. Az eredmények azt demonstrálják, hogy a pR012 által termelt bGH analóg bGH aktivitása jól összehasonlítható a természetes bGH aktivitással.

7. példa

SODfilT!! növesztése

I. Törzstenyészetek pSODplTll törzstenyészeteit kazein-tartalmú tápközegen (lásd „Inokulum”) tenyésztjük, majd kétszeresére hígítjuk fagyasztó tápközeggel és -80 °C hőmérsékleten tároljuk. A fagyasztó tápközeg 500 ml-e a következőket tartalmazza:

K2HPO4	6,3 g
kh2po4	1,8 g
Na-citrát	0,45 g
MgSO4.7H2O	0,09 g
(NH4)2SO4	0,9 g
Glicerin	44,0 g.

II. Inokulum

Az inokulumot 20 g/1 kazein-hidrolizátumot, 10 g/1 élesztőkivonatot és 2 g/1 NaCl-t tartalmazó oldatban szaporítjuk. Steril tápközeget inokulálunk a törzstenyészetből rázólombikban és 15 órán át inkubáljuk rázógépen 30 °C hőmérsékleten, mintegy 200 fordulat/perc nél. Amikor a következő lépésekben szükséges, az inokulum szaporítását kevert, levegőztetett fermentorokban végezzük. A steril tápközeget 2-10% inokulummal inokuláljuk, és 15 órán át inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten, pH 7 ± 0,5-nél olyan mértékű kevertetéssel és levegőztetéssel, hogy az oldott oxigén szintjét 20% levegőtelítettség fölött tartsuk.

III. Termelés

A termelő tápközeg a következőket tartalmazza:

Kazein hidrolizátum 20 g/1

Elesztőki vonat 10 g/1

K₂HPO₄ 2,5 g/1

MgSO₄.7H₂O 1 g/1

NaCl	5 g/1
Biotin	0,1 mg/1
Tiamin	1 mg/1
Nyomelem-oldat	3 ml/1
CuSO4	0,8 g/1
ZnSO4	10 mg/1.

Az oldat tartalmaz még 12,5 mg/liter tetraciklint is. A tetraciklin a termeléshez tetszőleges, de az inokulum növesztéséhez alkalmazott tápközegben mindig megtalálható.

A biotint, tiamint és tetraciklint külön-külön, koncentrált oldatban szűréssel sterilezzük, és a steril termelő tápközeghez az inokulálás előtt adjuk be. Steril glükóz oldatot is adunk a termelő tápközeghez olyan mennyiségben, hogy a kiindulási koncentráció 10 g/liter legyen. Az indukciós lépéshez további 10 g/liter glükózt adunk a közeghez.

A nyomelem-oldat a következőket tartalmazza:
FeCl3	16 g/1
ZnCl2.4H2O	2 g/1
CoC12.6H2O	2 g/1
Na2MoO4.2H2O	2 g/1
CaCl2.2H2O	1 g/i
CuCl2	1 g/i
H3BO3	0,5 g/1
Konc. HCI	100 ml/1.
tápközeget 0,5-10%	inokulum-tenyészettel ino-

kuláljuk, és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A kevertetési-levegőztetési sebességet úgy állítjuk be, hogy az oldott oxigén szintje 20% levegő-telítettség fölött legyen. A pH-t 7,0 ± 0,2 értéken tartjuk NH₃-al. Amikor a sejtkoncentráció eléri a mintegy 3,5 g/1 (OD₆₆₀ = 10) értéket, az indukciót elindítjuk.

A hőmérsékletet 42 °C-ra emeljük, és 1-5 órán át 42 °C-on tartjuk. A tenyészetet ezután lehűtjk, és a sejteket centrifugálással kinyeijük az enzim tisztításához. Az SÓD kinyerése

1,5 kg baktériumsejtet (nedves szűrőpogácsa) szuszpendálunk 12 liter 50 mmol/literes nátrium-foszfát oldatban (pH 7,8), Politron (Kinematica) keverővei, miközben a sebességet úgy szabályozzuk, hogy a habzás minimális legyen. A homogén szuszpenziót folyamatosan átjuttatjuk Dynomill sejtzúzón (KDS típus, Willy A. Bachofen, Basel). A szétzúzott sejtek homogén szuszpenzióját ultrahanggal kezeljük, folyamatos áramlású cellát alkalmazva, és CEPA 101 centrifugán centrifugáljuk. A felülúszót 2 órán át 65 °C hőmérsékleten hevítjük, majd hűtjük és centrifugáljuk az előzővel azonos módon. A tiszta felülúszót 1 literre koncentráljuk Millipore Pellicon ultraszűrő készüléken, 10 000 molekulasúly kizárásos kazettát (PTGC típus) alkalmazva. A koncentrált fehérjeoldatot átengedjük DEAE cellulóz oszlopon (2 kg DEAE Sepharose), amely 150 mmol/literes nátrium-foszfát pufferral van kiegyensúlyozva (pH 7,8). Az átáramlott oldatot összegyűjtjük, koncentráljuk és dializáljuk Pellicon ultraszűrő berendezésben 20 mmol/literes trisz-HCl-el (pH 7,8) szemben, majd QAE-Sepharose oszlopra visszük rá, amely 20 mmol/literes trisz-HCl pufferral van kiegyensúlyozva. Az oszlopot 20 mmol/literes trisz-HCl pufferral (pH 7,8) és só23

HU 215 160 Β gradienssel (0-200 mmol/liter NaCl) fejlesztjük ki. Az SOD-tartalmú frakciókat összegyűjtjük, Pellicon ultraszűrő berendezést alkalmazva koncentráljuk, desztillált vízzel szemben dializáljuk, majd nátriumacetátra 100 mmol/literessé tesszük 1 mol/literes nátrium-acetát puffer (pH 4,8) hozzáadásával. A fehérjeoldatot azután tovább szeparáljuk 100 mmol/literes nátrium-acetát-oldattal (pH 4,3) kiegyensúlyozott CM-Sepharose oszlopon. Az oszlopot ugyanezt a puffért és sógradienst (100-500 mmol/liter NaCl) alkalmazva fejlesztjük ki. Az SOD-t tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, Pellicon ultraszűrő berendezést alkalmazva koncentráljuk, majd liofilezzük.

8. példa

A pSODfilTl 1 által termelt SÓD aktivitása

A 7. példában készített pSODplTll által termelt SÓD analóg enzimes aktivitását a ferricitokróm-c redukciója gátlását követve mérjük, amint ezt McCord és Fridovich leírták [J. Bioi. Chem. 244, 6049-6055 (1969)]. Az eredmények azt bizonyítják, hogy a pSODplTl 1 által termelt SÓD analóg aktivitása jól összevethető a természetes humán SÓD (Sigma gyártmány) aktivitásával, és a szarvasmarha SÓD (Orgotein, Grünenthal GMBH) aktivitásával.

9. példa

Kifejeződő vektorok

I. p579

A p579 vektort a 19. ábrában mutatjuk be, és részletesen le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben. Ez a vektor egy P_L promotorból és N hasznosító helyből (NutL), az egyedi EcoRI és Ndel restrikciós helyek által kötött Cn riboszomális kötőhelyből, egy ATG iniciációs kodonból és az Escherichia coli rmB riboszomális RNS gén operonjának végéről származó T,T₂ átírás befejezési szignálokból tevődik össze. Ezek az elemek az ampicillin rezisztencia gént hordozó pBR332-n vannak klónozva. Az egyéb vonásokat a 19. ábra mutatja be.

A p579-et úgy készítjük, hogy a pPSl plazmidon elhelyezkedő TjT₂ átírás-befejezési szignálokat beiktatjuk a pR0211 vektor HindlII helyére. A pR0211-et a 2. ábrán mutatjuk be. A pPSl-et Sarmientos és társai írták le [Cell, 32, 1337-1346 (1983)], és ez a plazmid letétbe van helyezve az American Type Culture Collectionnál ATCC 39 807 letéti számon. Az eukarióta géneket tartalmazó p579-et és származékait a megfelelő Escherichia coli gazdaszervezetben lehet fenntartani. A gazdaszervezet legfontosabb jellemvonása, hogy a hőérzékeny cI857 represszort és az antiterminációs N fehérjét szolgáltatja [Gottesman, M. és munkatársai: J. Mól. Bioi., 140, 57-75 (1980)].

A p579-nek számos előnye van a korábban leírt kifejeződő vektorokkal szemben, ezek például a következők. 1. a kifejeződés rendkívül magas szintje.

Ez a vektor képes az idegen fehéijék kifejeződésének irányítására E. coliban olyan magas szinten, hogy ez elérheti a teljes sejtfehérje 42%-át. A kifejeződésnek ez a szintje magasabb, mint az, amelyet más hasonló λΡ[ plazmidoknál leírtak, amelyekben hiányoznak a

T]T₂ átírás befejezési szekvenciák.

2. Átírásbefejezési szignálok.

A p579 vektor tartalmazza a T]T₂ átírás befejezési szignálokat, amelyek a λΡ, promotorból és C_n riboszomális kötőhelytől „lefelé” vannak elhelyezve. A kifejeződés magas szintje, amelyet akkor nyerünk, amikor ezt a vektort alkalmazzuk, részben a T,T₂ átírásbefejezők jelenlétének tulajdonítható a beiktatott gén végénél, mivel a T,T₂ átírásbefejezők képesek az N módosított RNS polimeráz átírásának befejezésére. így az átírásbefejezők megakadályozzák a nem kívánt plazmid fehéijék XP_L által szabályozott átírását, ezáltal növelik a kívánt fehéijék relatív kitermelését.

3. Helyettesíthető riboszomális kötőhelyek.

A p579 egy egyedi EcoRI helyet tartalmaz, amely a riboszomális kötőhelytől „felfelé” van elhelyezve, és egy egyedi Ndel helyet az ATG iniciációs kodonnál elhelyezve. így a riboszomális kötőhelyet két egyedi restrikciós hely köti. Ez lehetővé teszi a jelen riboszomális kötőhely (a EC_n riboszomális kötőhely) könnyű kimetszését, és tulajdonképpen bármilyen más természetes vagy szintetikus riboszomális kötőhely behelyettesítését anélkül, hogy a plazmid egyéb jellemvonásai változnának. Ez nagymértékben megkönnyíti a kívánt polipeptidek optimális kifejeződését.

4. A kifejeződés hővel indukálható szabályozása.

A XP_L promotor inaktív, amikor a C_t represszor hozzá van kötve. A cI857 represszor hőérzékeny, azaz 30 °C hőmérsékleten kötődik a promotorhoz, de 42 °C hőmérsékleten inaktiválódik. így a fermentáció hőmérsékletét 42 °C-ra emelve a gazdabaktérium indukálódik, hogy a kívánt fehérjét termelje. Az ilyen rendszer előnyei a következők:

(a) egy idegen fehérjét, amely toxikus Escherichia coli-ra, a fermentációs folyamat késői szakaszában lehet termelni, így elkerülve a korai sejtpusztulást;

(b) egy fehérje túltermelése stabilizálhatja a fehéijét és megakadályozhatja a proteolitikus bomlást [Cheng, Y. E. és munkatársai: Gene, 14, 121 (1981)]. így a „hirtelen” túltermelés, olyan szorosan szabályozott promotort, mint a λΡ_Ε, használva, előnyös lehet a folyamatos alacsonyszintű termeléshez viszonyítva.

5. Egyszerűsített indukciós munkamenet.

A p579-ből származó plazmidokat mintegy 42 °C hőmérsékleten indukáljuk, és 42 °C-on tartjuk a fehérjeszintézis időtartama alatt. A pMGlOO és pND5-ből származó plazmidokhoz (amelyek a függőben lévő, együtt bejelentett 514,188 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben vannak leírva) tartozó indukciós munkamenet hőmérséklet-csúsztatást igényel 42 °C hőmérsékletre, amelyet a 38 °C hőmérsékleten végzett hosszú növesztési periódus követ. Az optimális indukciós munkamenet p579-hez nem igényli a hűtési lépést 38 °C hőmérsékletre, így a munkamenet egyszerűsödik.

6. Nagy kópiaszám.

A ZP_L promotort a p579-ben nagyobb kópiaszámú plazmidon találjuk, mint a λ transzdukáló fágok kópia24

HU 215 160 Β száma, amelyeket Escherichia coliban alkalmaznak. Ez növeli a kifejeződési szintet.

7. Riboszóma kötőhely és iniciációs kodon.

Ez a kifejeződő vektor erős prokarióta riboszomális kötőhelyet (RBS), valamint egy transzlációs iniciációs kodont tartalmaz. így bármilyen eukarióta gént lehet klónozni anélkül, hogy valamilyen iniciációs kodont kelljen hozzáadni. Ezen túl a hatékony RBS növeli a kifejeződési szinteket. A riboszóma kötőhely a XC_n riboszomális kötőhely, amelyet előzőleg klónozunk a pND 5 vektorba. A riboszomális kötőhely szekvenciája:

TAAGGAAGTACTTACAT

ATTCCTTCATGAATGTA

Egy bázispár különbözik a vad típusú λ-ben található riboszomális kötőhelytől.

8. Kényelmes restrikciós hely.

A kifejeződő vektor egy egyedi Ndel restrikciós hellyel bír, amely magán belül tartalmazza az ATG iniciációs kodont. Ez lehetővé teszi a kívánt gén megfelelő elhelyezkedését. Az egyedi Ndel helyet közvetlenül a riboszomális kötőhely után találjuk.

9. Kényelmes restrikciós helyek a génbeiktatáshoz.

Az Ndel restrikciós helytől lefelé 116 bázispáron belül elhelyezve vannak a Egűi és Smal egyedi restrikciós helyek, ebben a sorrendben. Ezek az egyedi restrikciós helyek lehetővé teszik a kívánt gének könnyű beiktatását.

10. nut hely

Az N fehérje, amelyet a gazdaszervezet szolgáltat, a kifejeződő vektoron levő Nut helyhez kötődik, és ezáltal megakadályozza az átírás befejeződését a t_RI helynél, vagy az érettség előtti átírási befejeződést a klónozott génen belül.

Törzsek.

A leírt vektorokhoz és plazmidokhoz való megfelelő gazdaszervezetek a transzformálásra alkalmas Escherichia coli törzsek, ilyenek például az A163 7, A2602, A1563, A1645 [c600 rm'gal'thrleuriacrbl (λ c1857AH1AőöwHI N⁺) és A2097/A1645 lacAKA21 proC::Tn 10)] törzsek.

10. példa

Állati növekedési hormonok

I. pHG44

A pHG44 megalkotását a 6. ábrán mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben, ezt a plazmidot ATCC 39 806 letéti számon helyeztük letétbe. A plazmid a pRO12 plazmidból származik (amelyet a 2. ábrában mutatunk be), olyan módon, hogy a 6. ábrában bemutaott pPSl plazmidból származó T]T₂ átírásbefejezési szekvenciákat beleiktatjuk. A pPSl plazmidot Sarmientos és munkatársai írták le [Cell, 32, 337-1346 (1983)], és ATCC 39807 számon ez a plazmid letétbe van helyezve. A TjT₂ befejezési szekvenciák jelenléte megakadályozza a hosszan futó mRNS átírásokat, és így megakadályozza a β-laktamáz gén és valószínűleg más nem kívánt fehéqék magasabb szintű kifejeződését a λΡ, promotor szabályozása alatt.

A pHG44 plazmidot Escherichia coli A2097 törzsbe vezetjük be transzformációval, olyan módszereket alkalmazva, amelyek ismerősek azok számára, akik a szakterületen átlagosan járatosak. A törzsnövesztésre és indukcióra a szarvasmarha növekedési hormon egy analógját termeli, hogy met-asp-gln aminosav-szekvenciával rendelkezik az autentikus bGH fenilalanin-formájának aminoterminálisához hozzátéve. A pHG44 által termelt bGH analóg mennyisége a baktérium által termelt fehérje mennyiségének mintegy 37-42%-a, amint ezt Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid gélek vizsgálatával kalkuláljuk.

A törzs növesztésére, a termelt bGH analóg kinyerésére és a bGH analóg tisztítására alkalmazott módszer a

13. példában van leírva. A kifejeződés szintje magasabb, mint amelyet pRO 12-ből nyerünk (I. Táblázat), ez a bGH gén 3’ terminálisánál levő T[T₂ befejezési szekvenciák bevezetése által befolyásolt β-laktamáz kifejeződésben előállott jelentős csökkenésnek tulajdonítható.

II. pSAL 5600-1

A pSAL 5600-1 megalkotását a 10. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben. A pSAL 5600—1 plazmid a pSAL 5200-6-ból származik (amelyet a 3. ábrában mutatunk be) olyan módon, hogy a pPSl plazmidból (ATCC 39 807) származó TjT₂ befejeződési szekvenciákat beleiktatjuk.

A pSAL 5600-1 plazmidot Escherichia coli A1645 törzsbe vezetjük be transzformálással, olyan módszereket alkalmazva, amelyek ismertek azok számára, akik a szakterületen átlagosan járatosak. Ez a törzs növesztésre és indukcióra egy bGH analógot termel, amely egy metionin aminosawal rendelkezik a természetes bGH fenilalanin formájának amino-terminálisához hozzátéve. A pSAL 5600-1 tartalmú törzsek által termelt bGH analóg mennyisége mintegy 22-28%-a a baktériumok által termelt összes fehérjének, amint ezt Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid-gél vizsgálatával kalkuláljuk. A törzs növesztéséhez, a termelt bGH analóg kinyeréséhez és a bGH analóg tisztításához alkalmazott módszerek azonosak azzal, amelyet majd a 13. példában leírunk a pHG44-hez.

A kifejeződés szintje magasabb, mint amelyet a pSAL 5200-6 tartalmú törzseknél nyertünk, ez a bGH gén 3’ terminálisánál a T|T₂ befejezési szekvenciák bevezetése által befolyásolt jelentős β-laktamáz kifejeződés-csökkenésnek tulajdonítható.

III. p3009

A p3009 megalkotását all. ábrán mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben. A p3009-et úgy nyerjük, hogy a sertés növekedési hormon Ndel-Ndel cDNS fragmensét beiktatjuk a p579 kifejeződő vektor (19. ábra) egyedi Ndel helyébe. A sertés növekedési hormon (pGH) fragmenst p3008-ból (ATCC 39 804) izoláljuk Ndel emésztéssel.

A p3009 plazmidot Escherichia coli A1645 törzsbe vezetjük be transzformálással olyan módszereket alkalmazva, amelyek ismeretesek azok számára, akik a szakterületen átlagosan jártasak. Ez a törzs növesztésre és indukcióra egy pGH analógot termel, amely egy metionin aminosawal rendelkezik a természetes pGH fenilalanin formájának amino-terminálisához hozzátéve. A termelt pGH analóg mennyisége mintegy 30-35%-a a baktériumok által termelt összes fehérjének, amint ezt

HU 215 160 Β

Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid-gél vizsgálatával kalkuláljuk. A törzs növesztéséhez, a termelt pGH analóg kinyeréséhez és a pGH analóg tisztításához alkalmazott módszerek azonosak azzal, amelyet majd a 13. példában leírunk a pHG44-hez.

A p3009 kifejeződésének szintje magasabb, mint amelyet a p3008 tartalmú törzseknél nyertünk, ez a pGH gén 3’ terminálisánál a T|T₂ befejezési szekvenciák bevezetése által befolyásolt jelentős β-laktamáz kifej eződéscsökkenésnek tulaj doni tható.

IV. p5003

A p5003 megalkotását a 12. ábrában mutatjuk be és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben. A p5OO3-at letétbe helyezzük az American Type Culture Collectionnál 39792 letéti számon. A p5003-at úgy nyeljük, hogy a csirke növekedési hormon Ndél-Ndel cDNS fragmensét beiktatjuk a p579 kifejeződő vektor egyedi Ndel helyébe.

A p5OO3 plazmidot Escherichia coli A2097 törzsbe vezetjük be transzformálással olyan módszereket alkalmazva, amelyek ismeretesek azok számára, akik a szakterületen átlagosan járatosak. Ez a törzs növesztésre és indukcióra egy cGH analógot termel, amely egy metionin aminosawal rendelkezik a természetes cGH fenilalanin-formájának amino-terminálisához hozzátéve. A termelt cGH analóg mennyisége mintegy 30-35%-a a baktériumok által termelt összes fehérjének, amint ezt Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid-gél vizsgálatával kalkuláljuk. A törzs növesztéséhez, a termelt cGH analóg kinyeréséhez és a cGH analóg tisztításához alkalmazott módszerek azonosak azzal, amelyet majd a 13. példában leírunk a pHG44-hez.

A p5003 kifejeződésének szintje magasabb, mint amelyet a p5002 tartalmú törzseknél nyertünk, ez a cGH gén 3’ terminálisánál a befejezési szekvenciák bevezetése által befolyásolt jelentős β-laktamáz kifejeződéscsökkenésnek tulajdonítható.

11. példa

Humán Cu—Zn szuper oxid diszmutáz (SÓD).

I. _Ρ8Οϋβ1ΤΤ-1

A ρ8ΟΏβ1ΤΤ-1 megalkotását a 16. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben. Αρ8Οϋβ1ΤΤ-1 plazmidot úgy nyeljük, hogy a T]T₂ befejezési szekvenciákat beiktatjuk a ρ8Οϋβ1 TI 1-ben (15. ábra) található SÓD gén 3’ végénél.

A ρ8Οϋβ1ΤΤ-1 plazmidot beiktatjuk Escherichia coli A1645 törzsbe transzformálással, olyan módszereket alkalmazva, amelyek ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak. Ez a törzs növesztésre egy SÓD analógot termel. A termelt SÓD analóg mennyisége 10-15%-a a baktériumok által termelt összes fehérje mennyiségének, Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid-gél vizsgálata alapján kalkulálva.

A törzs növesztéséhez, a termelt SÓD analóg kinyeréséhez és az SÓD analóg tisztításához alkalmazott módszereket a 15. példában írjuk le. Αρ8Οϋβ1ΤΤ-1 kifejeződésének szintje magasabb, mint amelyet ρ8Οϋβ1Τ11-nél nyertünk (IL Táblázat), ez a TjT₂ által indukált csökkenés következménye a nemkívánt DNS szekvenciák átírásában és transzlációjában.

A termelt humán Cu-Zn SÓD analóg abban különbözik a természetes humán Cu-Zn SOD-tól, hogy az alanin amino-terminális nincs acetilezve, amint ezt az aminosavszekvencia-elemzés sztöchiometriája igazolja. A természetes humán SÓD az alanin amino-terminálisnál acetilezve van [Hartz, J. W. és Deutsch, H. F.: J. Bioi. Chem. 247, 7043-7050 (1972); Jabusch, J. R. és munkatársai: Biochemistry, 19, 2310-2316 (1980); Bárrá és munkatársai: FEBS Letters 120, 53 (1980); és Oberley, L. W.: Superoxide Dismutase, I. kötet, 32-33, kiadó: CRC Press, Florida (1982)]. A természetes SÓD glikozilezve van (Huber, W. 3.579,495 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, megjelent 1971. május 18-án). A baktériumok által termelt humán SÓD csaknem biztos, hogy nincs glikozilezve, mivel az Escherichia coli nem glikozilezi azokat a fehérjéket, amelyeket termel. A baktériumok által termelt SÓD analóg aminosav-szekvenciája azonos az érett humán SÓD aminosav-szekvenciájával és nem tartalmaz metionin gyököt N-terminálisánál.

12. példa

Humán Apolipoprotein E3 (Apo-E3)

I. pTV-170

A pTV-170 megalkotását a 20. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben. A pTV-170 plazmidot úgy nyerjük, hogy a pApoE-EX2-ből (ATCC 39 787) származó Apo-E3 Ndél-Ndel fragmenst beiktatjuk a p579 kifejeződő vektor egyedi Ndel helyébe.

A pTV-Ι 70-et Escherichia coli A1645 törzsbe vezetjük be transzformációval, olyan módszereket használva, amelyek jól ismertek azok számára, akik a szakterületen átlagosan jártasak. A nyert klón növesztésre humán ApoE3-at termel, amely valószínűleg metioninnal rendelkezik a természetes humán ApoE3 amino-terminálisához hozzátéve. A termelt humán ApoE3 analóg mennyisége mintegy 1%-a a baktériumok által termelt összes fehérjének, amint ezt Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid-gél vizsgálatával kalkuláljuk. A törzs növesztéséhez alkalmazott módszert a 17. példában írjuk le.

II. pTV-194

A pTV-194 megalkotását a 22. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben. A pTV-194 a pTV-Ι 70-ből (20. ábra) származik olyan módon, hogy a C_n riboszomális kötőhelyet helyettesítjük a pBLAl 1-ból származó β-laktamáz promotorral és riboszomális kötőhellyel. A pBLAl 1 tartalmazza a pBR332-ben található β-laktamáz gén promotoiját és riboszomális kötőhelyét a 4157 és 4353 koordináták között. EcoRI linkért adunk hozzá a promotortól „fölfelé” és egy multi-restrikciós hely linkért adunk hozzá közvetlenül az ATG iniciációs kodon után. így a kódoló szál szekvenciája az iniciációs kodonnal kezdődően ATGAGCTCTAGAATTC. A pBLAl 1-et letétbe helyeztük az American Type Culture Collectionnál, ATCC 39788 letéti számon.

HU 215 160 Β zeget 2-10% inokulumtenyészettel inokuláljuk és órán át inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten, pH 7 ± 0,5nél olyan levegőztetés és kevertetés mellett, hogy az oldott oxigén szintje mindig 20%-os levegőtelítettség fölött maradjon.

III. Termelés

A termelő tápközeg a következőket tartalmazza

A pTV-194-et bejuttatjuk Eseherichia coli A1645 törzsbe transzformációval, olyan módszereket alkalmazva, amelyek jól ismertek azok számára, akik a szakterületen átlagosan jártasak. A nyert klón növesztésre a humán ApoE3 egy analógját termeli, amely valószínűleg egy metionin aminosavval rendelkezik a természetes humán ApoE3 amino-terminálisához hozzátéve. A termelt humán ApoE analóg mennyisége mintegy 3%-a a baktériumok által termelt összes fehérjének, amint ezt Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid-gél vizsgálatával kalkuláljuk. A törzs növesztéséhez alkalmazott módszer azonos azzal, amelyet a 17. példában pTV-170-hez leírunk.

III. pTV-214

A pTV-214 megalkotását a 24. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben. A pTV-214 a pTV-Ι 90-ből származik (amelyet a 21. ábrában mutatunk be, és az „Ábrák leírása” című részben írunk le) olyan módon, hogy a humán növekedési hormon amino-terminális szekvenciájának 14 aminosavát kódoló szintetikus DNS fragmenst beiktatjuk a pTV-190 egyedi Ndel helyébe.

A pTV-214-et Eseherichia coli A1645 törzsbe vezetjük be transzformációval, olyan módszereket alkalmazva, amelyek jól ismertek azok számára, akik a szakterületen átlagosan járatosak. A nyert klón növesztésre és indukcióra egy humán ApoE3 analógot termel, amely amino-terminálisánál a humán növekedési hormon amino-terminális szekvenciájának 14 aminosavával rendelkezik, ezt metionin követi, az érett humán ApoE3 szekvenciájához kötve. A termelt humán ApoE analóg mintegy 2%-a a baktériumok által termelt összes fehérjének, amint ezt Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid-gél vizsgálatával kalkuláljuk. A törzs növesztéséhez alkalmazott módszerek azonosak azzal, amelyet a pTV-170-hez leírunk a 17. példában.

13. példa

A pHG44 növesztése

I. Törzstenyészetek

A pHG44 törzstenyészeteit kazeines tápközegen növesztjük (lásd „Inokulum”), majd kétszeresére hígítjuk fagyasztó tápközeggel, és -80 °C hőmérsékleten tároljuk. A fagyasztó tápközeg 500 ml a következőket tartalmazza:

K2HPO4	6,3 g
kh2po4	1,8 g
Na-citrát	0,45 g
MgSO4.7H2O	0,09 g
(NH4)2SO4	0,9 g
Glicerin	44,0 g.

II. Inokulum

Az inokulumot 20 g/1 kazein-hidrolizátumot, 10 g/1 élesztőkivonatot és 2 g/1 NaCl-t tartalmazó oldatban szaporítjuk. Steril tápközeget rázólombikban inokulálunk a törzstenyészetből és 15 órán át inkubáljuk rázógépen 30 °C hőmérsékleten és mintegy 200 fordulat/percnél. Amikor további lépéseknél ez szükséges, az inokulum szaporítását kevertetett, levegőztetett fermentorokban hajtjuk végre. A steril tápköKazein-hidrolizátum 20 g/1

Élesztőkivonat 10 g/1

K₂HPO₄ 2,5 g/1

MgSO₄.7H₂O 1 g/1

NaCl 5 g/1

Biotin 0,1 mg/1

Tiamin 1 mg/1

Nyomelemoldat 3 ml/1.

A tápközeg tartalmaz még 100 mg/liter ampicillint is. Az ampicillin tetszőleges a termeléshez, de mindig megtalálható az inokulum növesztéséhez használt tápközegben.

A biotint, tiamint és ampicillint koncentrált oldatokban külön-külön szűréssel sterilezzük, és az inokulálás előtt adjuk hozzá a steril termelő tápközeghez. Kezdetben 10 g/1 eléréséhez elegendő steril glükóz oldatot is adagolunk. Az indukciós lépésnél további 10 g/1 glükózt adunk hozzá.

A nyomelemoldat a következőket tartalmazza:
FeCl3	16 g/1
ZnCl2.4H2O	2 g/1
CoCl2.6H2O	2 g/1
Na2MoO4.2H2O	2 g/1
CaCl2.2H2O	lg/1
CuCl2	lg/1
H3BO3	0,5 g/1
Konc. HCI	100 ml/1.
A tápközeget 0,5-10%	inokulumtenyészettel

inokuláljuk és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A kevertetési-levegőztetési sebességeket úgy állítjuk be, hogy az oldott oxigén szintje a 20%-os levegőtelítettség fölött maradjon. A pH-t 7,0 ± 0,2 értéken tartjuk NH₃-el. Amikor a sejtkoncentráció eléri a mintegy 3,5 g/1 (OD₆₆₀ = 10) értéket, az indukciót elindítjuk.

A hőmérsékletet 42 °C-ra emeljük és 42 °C-on tartjuk 1-5 órán át. A tenyészetet azután hűtjük és a sejteket centrifugálással kinyerjük a hormon tisztításához.

A bGH kinyerése kg baktériumsejtet (nyers szűrőpogácsa) újra szuszpendálunk 5 térfogat, 50 mmol/liter nátrium-foszfát puffért (pH 7,4), 50 mmol/liter EDTA-t és 100 mmol/liter NaCl-t tartalmazó oldatban, Polytron (Kinematika) blender keverőt alkalmazva, miközben a keverő sebességét úgy szabályozzuk, hogy a habképződés minimális legyen. A homogén szuszpenziót folyamatosan eresztjük keresztül Dynomill sejtzúzón (KD5 típus, Willy A. Bachofen, Basel), 80 liter/óra sebességgel, és a szétzúzott sejtek homogén szuszpenzióját CEPA 101 centrifugában végzett centrifugálással tisztítjuk, 45 liter/óra sebességgel. A centrifugálási lépésből nyert csapadékot összegyűjtjük és újra szuszpendáljuk

15,5 liter 50 mmol/literes foszfát-pufferban (pH 7,4), amely 50 mmol/liter EDTA-t is tartalmaz. Lizozimot

HU 215 160 Β adunk hozzá 0,05 mg/ml végső koncentrációban és a szuszpenziót 16 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. TritonX-100-at adunk hozzá 1% végső koncentrációig. A szuszpenziót ezután 30 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten, ultrahangos kezelésnek vetjük alá folyamatos átáramlású cellával rendelkező szonikátorberendezésben (Heat System) 18 liter/óra sebességgel, majd CEPA 101 centrifugában centrifugáljuk. A csapadékot összegyűjtjük, újra szuszpendáljuk 50 mmol/liter nátrium-foszfát pufferban (pH 7,4), a fentiek szerint újra ultrahangos kezelésnek vetjük alá, majd CEPA 101 centrifugában centrifugáljuk. A sejteket 15,5 liter 50 mmol/literes nátrium foszfát pufferben (pH 7,4), amely 50 mmol/liter EDTA-t és 100 mmol/liter NaCl-t is tartalmaz, újra szuszpendáljuk, és kétszer kicsapjuk és újra szuszpendáljuk 15,5 liter desztillált vízben. Az utolsó csapadékot centrifugálással összegyűjtjük és -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

A bGH tisztítása

A csapadékot újra szuszpendáljuk 30-AO liter desztillált vízben, és szolubilizáljuk pH 11,8-ra beállítva 0,5 n NaOH-val végzett titrálással. Az oldatot ezután folyamatos ultrahangkezelésnek vetjük alá és centrifugálással tisztítjuk CEPA 101 centrifugában, ha szükséges, vagy szűrjük Whatman 1 papíron át.

A tisztított fehérjeoldatot (32,6 liter, amely 297 000 OD értéket tartalmaz 280 nm-nél mérve) külön adagokba mérjük szét (6x5,4 liter), minden adag 50 000-60 000 OD értéket tartalmaz. Mindegyik adagot ultraszűrésnek vetjük alá Millipore Pellicon ultraszűrőn át, amely három, 100 000 molekulasúly kizárásos kazettával (PTHK típus) van felszerelve, az egyes kazetták területe 5 négyzetláb, vagyis 0,465 m².

Egy 5,4 literes adagot 1 liter visszamaradó térfogatig koncentrálunk. Az ultraszűrletet összegyűjtjük és félretesszük. A visszamaradó anyagot visszahígítjuk eredeti térfogatára friss, 10 mmol/literes borát pufferral, pH 11,8, és jól összekeverjük. Az adagot újra 1 liter visszamaradó térfogatig koncentráljuk. Az ultraszűrletet összegyűjtjük, és egyesítjük az első ultraszűrlettel. Amikor az OD értékek pillanatnyi összege az ultraszűrletben egyenlő a kezdetben az ultraszűrőre terhelt OD érték 20%-ával, a visszamaradó térfogatot a következő koncentráló lépésben 0,5 literre vesszük 1 liter helyett. A koncentrálás és 10 mmol/literes borát pufferral való hígítás ciklusát folytatjuk egészen addig, amíg a visszamaradó térfogat 0,5 literéből származó ultraszűrlet 280 nm-nél (1 cm-es cella) kevesebb, mint 0,1 lesz. Ez normálisan a koncentrálás-szűrés 9. és 12. ciklusa között következik be. Az utolsó visszamaradó oldatot eldobjuk.

Mindegyik ultraszűrletet egyesítjük és pH 9,0-ra állítjuk be 6 n HCl-el. A többi 5,4 literes adagokat is hasonló módon vetjük alá ultraszűrésnek, és az összes, pH-beállított ultraszűrletet egyesítjük. Egy tipikus műveleti lefutás összesen 380 liter ultraszűrletet termel 0,26 abszorbanciával, amely 100 000 OD egységgel egyenértékű, ez 24-40 órát igényel összességében.

A kombinált ultraszűrleteket (380 liter, amely 280 nm-nél mérve 100000 OD egységnek felel meg) a 100K ultraszűrési lépésekből Sepharose CL-6B DEAE ioncserélő oszlopra terheljük, 23 cm/óra (25 liter/óra) lineáris áramlási sebességnél. A 37 cm átmérőjű, 15 cm magas oszlopot két ágytérfogat (32 liter) 10 mmol/literes borát-pufferral (pH 9,0) mossuk. A ráterhelési és mosási lépésekből származó eluátumokat elöntjük. Az eluensekben végzett változási lépés, vagyis eluálás 10 mmol/liter borátot, és 100 mmol/liter nátrium-kloridot tartalmazó pufferral (pH 9) leszorítja a bGH-t az oszlopról. Az eluálás áramlási sebessége 23 cm/óra. A lefutás előrehaladását olyan módon észleljük, hogy követjük az eluátum abszorbanciáját 280 nm-nél. A bGH csúcsot összegyűjtjük 4-5 ágytérfogatban (84 liter, amely 280 nm-nél 43 000 OD egységet tartalmaz), majd mintegy 10 mg/ml-re koncentráljuk, Millipore Pellicon ultraszűrő berendezést alkalmazva 10 000 molekulasúly kizárású kazettákkal. A kitermelés mintegy 70 g tiszta bGH.

14. példa

A pHG44 által termelt bGH analóg aktivitása

1. A bGH analóg radioimmunassay összehasonlítása a természetes bGH-val.

100 ng/ml bGH analógot tartalmazó oldatot készítünk foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldatban (1% BSA). Ezt az oldatot sorozat-hígításnak vetjük alá 50; 25; 12,5; 6,25; 3,12; 1,56; és 0,78 ng/1 koncentrációkra. Ezeknek az oldatokban 0,1 ml alikvotjait két párhuzamosban RIA mérésnek vetjük alá, kettős antitest eljárást alkalmazva. A hígítási görbe jól összehasonlítható azzal, amelyet a természetes bGH-val nyerünk.

2. Radioreceptor kötési vizsgálat.

Radioreceptor kötési vizsgálatot hajtunk végre nyúlmáj membránokkal, amint ezt Tushima, T. és Freisen, H. G. leírták [J. Clin. Endocr. Metab. 37, 3 (1973)], ^l25I-bGH-t alkalmazva jelzőként és autentikus bGH oldatokat alkalmazva a kalibrációs görbe megalkotásához. A mintákat három párhuzamosban inkubáljuk két órán át szobahőmérsékleten 0,3 ml vizsgálati pufferban (50 mmol/liter trisz, 15 mmol/liter CaCl₂ és 5 mg/ml bovin szérum albumin, pH 7,6). A csövek ¹²⁵I-bGH-t (20000 cpm 30-60 pci/pg-os készítményből), 150-250 μg máj membrán fehéqét, és/vagy természetes bGH-t (1-100 ng), vagy bakteriális bGH kivonatait tartalmazzák. Az eredmények azt demonstrálják, hogy a bGH analóg bGH aktivitása összehasonlítható a természetes bGH aktivitásával.

3. Tibiavizsgálat.

A 13. példa szerint bakteriális sejtből kinyert, pR012 által termelt bGH analóg bioaktivitását tibiavizsgálattal értékeljük [Parlow, A. F. és munkatársai: Endocrinology, 77, 1126 (1965)]. Patkányok hipofízisét eltávolítjuk 28-30 napos korukban, majd 10-14 napig kezelés nélkül tartjuk ezeket. Szarvasmarha hipofízisből, vagy rekombináns Escherichia coli-ból származó szarvasmarha növekedési hormont oldunk 0,15 mol/liter NaCl-t és 0,01 mol/liter borátot tartalmazó oldatban (pH 10,0). Patkányok 4-7 tagú csoportjainak adunk naponta szubkután injekciókat bGH oldatokból (5-125 pg/nap, 0,2 ml-es adagokban) 5 napon át, miközben normál étrenden tartjuk ezeket (Purina

HU 215 160 Β

Rat-Chow tápszer és víz korlátlan mennyiségben). Az állatokat a 6. napon leöljük, első térdcsontjaikat kivesszük, hosszában elhasítjuk, acetonnal rögzítjük és 2%-os AgNO₃ oldattal megfestjük. Az epifizeális lemezek szélességét egy kivetítő binokuláron (Nikon) át figyeljük meg. Átlagértékeket (40 leolvasás patkányonként) alkalmazunk a hosszú dózísválasz-görbe megalkotásához. Az eredmények azt demonstrálják, hogy a pHG44 által termelt bGH analóg bGH aktivitása összemérhető a természetes bGH aktivitásával.

75. példa pSOD$lTT-l növesztése

I. Törzstenyészetek

A pSODplTl 1 törzstenyészeteit kazeines tápközegen növesztjük (lásd „Inokulum”), majd kétszeresére hígítjuk fagyasztó tápközeggel és -80 °C hőmérsékleten tároljuk. A fagyasztó tápközeg 500 ml-e a következőket tartalmazza:

K2HPO4	6,3 g
kh2po4	1,8 g
Na-citrát	0,45 g
MgSO4.7H2O	0,09 g
(NH4)2SO4	0,9 g
Glicerin	44,0 g.

II. Inokulum

Az inokulumot 20 g/1 kazein-hidrolizátumot, 10 g/1 élesztőkivonatot és 2 g/1 NaCl-t tartalmazó oldatban szaporítjuk. Steril tápközeget rázólombikban inokulálunk a törzstenyészetből és 15 órán át inkubáljuk rázógépen 30 °C hőmérsékleten és mintegy 200 fordulat/percnél. Amikor további lépéseknél ez szükséges, az inokulum szaporítását kevertetett, levegőztetett fermentorokban hajtjuk végre. A steril tápközeget 2-10% inokulumtenyészettel inokuláljuk és 15 órán át inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten, pH 7 ± 0,5-nél olyan levegőztetés és kevertetés mellett, hogy az oldott oxigén szintje mindig 20%-os levegőtelítettség fölött maradjon.

III. Termelés

A termelő tápközeg a következőket tartalmazza:
Kazein-hidrolizátum	20 g/1
Elesztőkivonat	10 g/1
K2HPO4	2,5 g/1
MgSO4.7H2O	1 g/1
NaCl	5 g/1
Biotin	0,1 mg/1
Tiamin	1 mg/1
Nyomelemoldat	3 ml/1
CuSO4	0,8 g/1
ZnSO4	10 mg/1.
A tápközeg tartalmaz még 12,5 mg/liter tetraciklint

is. A tetraciklin tetszőleges a termeléshez, de mindig megtalálható az inokulum növesztéséhez használt tápközegben.

A biotint, tiamint és tetraciklint koncentrált oldatokban külön-külön szűréssel sterilezzük, és az inokulálás előtt adjuk hozzá a steril termelő tápközeghez. Kezdetben 10 g/liter eléréséhez elegendő steril glükóz oldatot is adagolunk. Az indukciós lépésnél további 10 g/1 glükózt adunk hozzá.

A nyomelemoldat a következőket tartalmazza:
FeCl3	16 g/1
ZnCÍ2.4H2O	2 g/1
CoCl2.6H2O	2 g/1
Na2MoO4.2H2O	2 g/1
CaCl2.2H2O	1 g/i
CuCl2	1 g/i
H3BO3	0,5 g/1
Konc. HCI	100 ml/1
A tápközeget 0,5-10%	inokulumtenyészettel

inokuláljuk és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A kevertetési-levegőztetési sebességeket úgy állítjuk be, hogy az oldott oxigén szintje a 20%-os levegő telítettség fölött maradjon. A pH-t 7,0 ± 0,2 értéken tartjuk NH₃-al. Amikor a sejtkoncentráció eléri a mintegy 3,5 g/1 (OD₆₆₀ = 10) értéket, az indukciót elindítjuk.

A hőmérsékletet 42 °C-ra emeljük és 42 °C-on tartjuk 1-5 órán át. A tenyészetet azután hűtjük, és a sejteket centrifugálással kinyerjük az enzim tisztításához.

Az SÓD kinyerése

1,5 kg baktériumsejtet (nedves szűrőpogácsa) 12 liter, 50 mmol/liter nátrium-foszfátban (pH 7,8) szuszpendáljuk, Polytron (Kinematica) blender keverőben, miközben a sebességet úgy szabályozzuk, hogy a habképződés minimális legyen. A homogén szuszpenziót folyamatosan visszük Dynomill sejtzúzó berendezésen keresztül (KD5 típus, Willy A. Bachofen, Basel). A szétzúzott sejtek homogén szuszpenzióját ultrahanggal kezeljük, folyamatos áramlású cellákat alkalmazva, és CEPA 100 centrifugában centrifugáljuk. A felülúszót 2 órán át 65 °C hőmérsékleten melegítjük, majd lehűtjük és centrifúgáljuk az előzőek szerint. A tiszta felülúszót 1 literre koncentráljuk Millipore Pellicon ultraszűrő berendezésben, 10000 molekulasúly kizárásos kazettákat (PTGC típus) alkalmazva. A koncentrált fehérjeoldatot DEAE Sepharose oszlopon engedjük át (2 kg DEAE Sepharose), amely 150 mmol/literes nátrium-foszfát pufferral (pH

7.8) van kiegyensúlyozva. Az átáramló oldatot összegyűjtjük és dializáljuk Pellicon ultraszűrő berendezésben 20 mmol/liter trisz-HCl-el (pH 7,8) szemben, majd 20 mmol/liter trisz-HCl pufferral kiegyensúlyozott QAE-Sepharose oszlopra visszük fel. Az oszlopot 20 mmol/literes trisz-HCl pufferral (pH 7,8) és só-gradienssel (0-200 mmol/liter NaCl) fejlesztjük ki. Az SOD-t tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, Pellicon ultraszűrő berendezést alkalmazva koncentráljuk, desztillált vízzel szemben dializáljuk, majd 100 mmol/literesre állítjuk he nátrium-acetátra, 1 mol/liter nátrium-acetát puffer (pH

4.8) hozzáadásával. A fehérje-oldatot azután tovább szeparáljuk 100 mmol/liter nátrium-acetát pufferral (pH 4,7) kiegyensúlyozott CM-Sepharose oszlopon. Az oszlopot azonos puffért és só-gradienst (100-500 mmol/liter NaCl) alkalmazva fejlesztjük ki. Az SÓD tartalmú frakciókat összegyűjtjük, Pellicon ultraszűrő berendezést alkalmazva koncentráljuk, majd liofilezzük.

16. példa

A pSOD \11TT-I által termelt SÓD aktivitása

A 15. példa szerint készített, pSODpiTT-l által termelt SÓD analóg enzimes aktivitását ferricitokróm-c

HU 215 160 Β redukciója gátlásának megfigyelésével mérjük, amint ezt McCord és Fridovich leírták: J. Bioi. Chem. 244, 6049-6055 (1969). Az eredmények azt demonstrálják, hogy a pSODpiTT-l által termelt SÓD analóg aktivitása összemérhető a természetes humán SÓD aktivitásával és a szarvasmarha SÓD (Orgotein, Grunenthal GmBH) aktivitásával.

17. példa

A pTV—170 növesztése

I. Törzstenyészetek

A pTV-170 törzstenyészeteit kazeines tápközegen (lásd „Inokulum”) növesztjük, majd kétszeresére hígítjuk fagyasztó tápközegben és -80 °C hőmérsékleten tároljuk. A fagyasztó tápközeg 500 ml-e a következőket

tartalmazza:
K2HPO4	6,3 g
kh2po4	1,8 g
Na-citrát	0,45 g
MgSO4.7H2O	0,09 g
(NH4)2SO4	0,9 g
Glicerin	44,0 g.

II. Inokulum

Az inokulumot 20 g/liter kazein-hidrolizátumot, 10 g/1 élesztőkivonatot és 2 g/1 NaCl-t tartalmazó tápközegen szaporítjuk. Rázólombikban levő steril tápközeget inokulálunk törzstenyészetből, és 15 órán át rázógépen inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten, mintegy 200 ford./percnél. Amikor további lépéseknél szükséges, az inokulum szaporítását kevertetett, levegőztetett fermentorokban is kivitelezhetjük. A steril tápközeget 2-10% inokulummal inokuláljuk, és 15 órán át 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk, pH 7 ± 0,5-nél kevertetéssel és olyan mértékig levegőztetéssel, hogy az oldottoxigén-szint 20% levegőtelítettség fölött maradjon fenn. III, Termelés

A termelő tápközeg a következőket tartalmazza:
Kazein-hidrolizátum Elesztőkivonat	20 g/1 10 g/1
K2HPO4	2,5 g/1
MgSO4.7H2O	1 g/i
NaCl	5 g/1
Biotin	0,1 mg/1
Tiamin	1 mg/1
Nyomelem-oldat	3 ml/1.
A tápközeg tartalmaz 100 mg/liter ampicillint is

ampicillin tetszőlegesen használható a termeléshez, de mindig megtalálható az inokulum növesztéséhez használt tápközegben.

A biotint, tiamint és ampicillint koncentrált oldatokban külön-külön szűréssel sterilezzük és az inokulálás előtt adjuk hozzá a steril termelő tápközeghez. Steril glükóz oldatot is adunk hozzá kezdetben, hogy koncentrációja 10 g/liter legyen. Az indukciós lépésnél további 10 g/liter glükózt adunk hozzá.

A nyomelemoldat a következőket tartalmazza:
FeCl3	16 g/1
ZnCÍ2.4H2O	2 g/1
CoC12.6H2O	2 g/1
Na2MoO4.2H2O	2 g/1

CaCl₂.2H₂O 1 g/1

CuCl₂ 1 g/1

H₃BO₃ 0,5 g/1

Konc. HCI 100 ml/1.

A tápközeget 0,5-10% inokulum-tenyészettel inokuláljuk és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A kevertetési-levegőztetési sebességeket úgy állítjuk be, hogy 20% levegőtelítettség fölötti oldottoxigén-szintet tartsunk fenn. Amikor a sejtkoncentráció eléri a mintegy 3,5 g/1 (OD₆₆₀ = 10) értéket, az indukciót elindítjuk.

A hőmérsékletet 42 °C-ra emeljük, és 15 percen át ezen a hőmérsékleten tartjuk. A tenyészetet azután lehűtjük és a sejteket centrifugálással kinyeijük a fehéijetisztításhoz.

18. példa

Szarvasmarha növekedési hormon pHG50

A pHG50 megalkotását a 6. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben. A pHG50 plazmidot úgy nyerjük, hogy a pSK434 (ATCC 39784) Hpall-Hpáll Xcl⁴³⁴ fragmensét beiktatjuk a pHG44 (ATCC 39 806) egyedi Clal helyébe. A pHG51 plazmidot hasonló módon alkotjuk meg, ebben a plazmidban azonban a Ximm434ci^l fragmenst az ellenkező orientációban találjuk, mint a pHG50 plazmidban.

A pSK434-et (ATCC 39784) úgy alkotjuk meg, hogy λίπιπι434-6ΐ ŐííotI II-vcI emésztjük és a BawHI-vel emésztett pBR322 keverékhez ligáljuk. A ligáit keveréket Escherichia coli A2097-be transzformáljuk és a Ximm434cI300 fágra immunis telepeket izoláljuk. A pSK434, amelyet ezeknek a telepeknek egyikéből izoláltunk, egy 6 kb-s őcwiHI fragmenst tartalmaz, amely tartalmazza a Xci434 gént és kiterjed az N génen túli területtől a P génen túli területig. A pSK434 restrikciós térképét a 6. ábrában mutatjuk be.

A pHG50-et és pHG51-et Escherichia coli A1645-be vezetjük be transzformálással, olyan módszereket alkalmazva, amelyek ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak. A nyert kiónok, amelyeket A3108-nak, illetve A3112-nek jelölünk, növesztésre és indukcióra egy bGH analógot termelnek, amely egy met-asp-gln aminosav-szekvenciával rendelkezik a természetes bGH fenilalanin formájához hozzáadva. A termelt bGH analóg 37-42% mennyiségét képezi a baktériumok által termelt összes fehérének, amint ezt a Coomassie-vel festett poliakrilamid-gél átvizsgálásával kalkuláljuk (I. Táblázat).

Profág bevezetés

Abból a célból, hogy a Xcl⁴³⁴ szelekciós rendszert alkalmazzuk, a pHG50-et tartalmazó sejteknek tartalmazniuk kell a Ximm434cl profágot is. Profágként Ximm434cT3003miniTn 10Δ16Δ17- et alkalmazunk. A mini Tn 10 Δ16Δ17 tetraciklin rezisztencia markert [Foster és munkatársai: Cell, 23, 201-213 (1981)] azért vezetjük be a fágba, hogy megkönnyítsük a ritka és stabil profágbeiktatási események izolálását. Ez lehetővé teszi a profág jelenlétében egyszerű vizsgálatát is a tetraciklin rezisztencia megfigyelésével.

HU 215 160 Β

Escherichia coli A1645 törzset, amely a pHG50 píazmidot tartalmazza, és amely ampicillin jelenlétében nőtt, fertőzünk Ximm 434 ci 3003 mini Τη10Δ16Δ17 kis fertőző mennyiségével 30 °C hőmérsékleten. Tetraciklin-rezisztens telepeket izolálunk és tisztítunk. Ezt a törzset letétbe helyeztük az American Type Culture Collectionnál ATCC 39 805 letéti számon.

Egy másik módszer szerint a profágot úgy vezetjük be, hogy együttesen transzformáljuk az Escherichia coli A1645-öt pHG50-el és Ximm 434 ci 3003 mini Tnl0A16A17-el, és olyan telepeket választunk ki, amelyek rezisztensek mind ampicillinre, mind tetraciklinre. A megfelelő gazdaszervezetek a leírt vektorokhoz és plazmidokhoz az Escherichia coli törzsek közül azok, amelyek transzformálásra alkalmasak, ilyenek például az A1637, A2602, A1563, A1645/C600AHABawHI r m⁺ gal⁺ thr leu- Bl) vagy A2097/A1645 lacAKA21 proC:: TnlO). A kívánt profágokat be lehet vezetni a fenti törzsek mindegyikébe, a fentebb leírtakkal azonos módon.

A pHG50 és az a vektor, amely a bGH gén kimetszésével belőle származik, számos előnnyel bír a korábban leírt kifejeződő vektorokhoz viszonyítva, ilyenek pl.:

1. Megnövelt plazmid stabilitás.

A plazmid tartalmazza a cl⁴³⁴ represszor gént, amely represszál egy λίιηηι 434 cL· lizogént. A plazmid elvesztése a bakteriális sejtben lízist eredményez a kimm 434 cl* profág indukció következtében. így a plazmid stabilan fennmarad antibiotikumos szelekciós munkamenet igénybevétele nélkül, amely meglehetősen drága. A III. Táblázat mutatja meg a cl⁴³⁴ stabilizáló rendszert hordozó plazmid megnövekedett stabilitását.

A cl⁴³⁴ plazmid stabilizáló rendszer összeférhető a hőindukálható XP_L promotor kifejeződő rendszerrel, annak a ténynek ellenére, hogy a termolabilis represszor a λΡ] promotorhoz a C,.

Meg kell jegyeznünk, hogy bármilyen λίηηη 434 cE profág helyettesítheti a λίιηιη 434 cl 3003 profágot. Ezen kívül bármilyen antibiotikum rezisztencia marker helyettesítheti a tetraciklin rezisztencia markert, amelyet a mini Τη 10Δ16Δ 17-be bevezettünk. A λίιηιη 21 és kimm 22 represszor negatív mutánsok hozzáférhetősége lehetővé teszi a Á434 rendszer helyettesítését a 21. fág vagy 22. fág összeférhető rendszerével.

2. A kifejeződés rendkívül magas szintje.

Ez a plazmid képes idegen fehérjék kifejeződésének irányítására E. coli-ban olyan magas szinten, hogy ez elérheti a teljes sejtfehérje 42%-át. A kifejeződésnek ez a szintje nagyobb, mint amelyet más hasonló, TjT₂ átírásbefejezési szekvenciákat nélkülöző λΡ_Ε plazmidoknál leírtak.

3. Átírás befejezési szignálok.

A plazmid tartalmazza a TjT₂ átírás befejezési szignálokat a λΡ_Ε promotortól és a Cn riboszomális kötőhelytől „lefelé” elhelyezve. A kifejeződés magas szintje, amelyet akkor nyerünk, amikor ezt a píazmidot használjuk, részben a T]T₂ átírási terminátorok jelenlétében tulajdonítható a beiktatott gén végénél, mivel a T,T₂ átírási terminátorok képesek az N-módosított RNS polimeráz átírásának befejezésére. így az átírási terminátorok megakadályozzák a nem kívánatos fehéqék XP_L által szabályozott átírását, ezáltal megnövelik a kívánt fehéije relatív kitermelését.

4. Helyettesíthető riboszomális kötőhely.

A pHG50 tartalmaz egy egyedi EcoRI helyet, amely a riboszomális kötőhelytől „felfelé” helyezkedik el, és egy Nde\ helyet, amely az ATG iniciációs kodonnál helyezkedik el. így a riboszomális kötőhely két egyedi restrikciós hely révén kötődik. Ez lehetővé teszi a jelen riboszomális kötőhely (a ÁC^ riboszomális kötőhely) könnyű kimetszését és helyettesítését tulajdonképpen bármilyen más természetes vagy szintetikus riboszomális kötőhellyel anélkül, hogy a plazmid egyéb jellemvonásai változnának. Ez nagy mértékben megkönnyíti a kívánt polipeptid optimális kifejeződését.

5. A kifejeződés hőindukálható szabályozása.

A XP_L promotor inaktív, amikor a Q represszort hozzákötjük. A cI857 represszor hőérzékeny, vagyis ez 30 °C hőmérsékleten a promotorhoz kötődik, de inaktiválódik 42 °C hőmérsékleten. így a fermentáció hőmérsékletét 42 °C-ra emelve a gazdasejt indukálódik, hogy a kívánt fehérjét termelje.

Az ilyen rendszer előnyei a következők:

(a) Olyan idegen fehérjét, amely Escherichia coli-ra toxikus, is lehet termelni a késői fázisban, így elkerülve a korai sejtpusztulást a fermentációs folyamatban.

(b) Egy fehéije túltermelése stabilizálhatja a fehérjét, és megakadályozza a proteolitikus lebontást [Cheng, Y. E. és munkatársai: Gene, 14, 121 (1981)]. így a „pillanatnyi” túltermelés szorosan szabályozott promotort, például XP_L-t alkalmazva, előnyösebb lehet a folyamatos alacsony szintű termelésnél.

6. Egyszerűsített indukciós munkamenet.

A pHG50 mintegy 42 °C hőmérsékleten indukálódik a 42 °C-on tartjuk a fehéijeszintézis időtartam alatt. A pMGlOO-ból és pND5-ből származó plazmidok indukciós munkamenete a függőben levő, együtt bejelentett 514,188 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben van leírva, ez 42 °C hőmérsékleten végzett indukciót foglal magában, ezt követi egy kiteijedt növesztési periódus 38 °C hőmérsékleten. Az optimális indukciós munkamenet pHG50-hez nem igényli a 38 °C-ra való hűtési lépést, ezért egyszerűbb.

7. Nagy kópiaszám.

A λΡ₍ promotor a pHG50-ben egy olyan plazmidban található, amelynek kópiaszáma nagyobb, mint a λ transzdukáló vektoroké, amelyek az Escherichia coli-ban jelen vannak. Ez növeli a kifejeződési szintet.

8. Riboszóma kötőhely és iniciációs kodon.

Ez a kifejeződő vektor tartalmaz egy erős prokarióta riboszóma kötőhelyet (RBS), valamint egy transzlációs beindító (iniciációs) kodont (ATG). így bármilyen eukarióta gént lehet klónozni iniciációs kodon hozzáadása nélkül. Ezen túl a hatásos RBS növeli a kifejeződés szintjét. A riboszóma kötőhely a ÁC_n riboszomális kötőhely. A riboszomális kötőhely szekvenciája a következő:

TAAGGAAGTACTTACAT

ATTCCTTCATGAATGTA

HU 215 160 Β

Egy bázispár különbözik a vad típusú λ-ben található riboszomális kötőhelytől.

9. Kényelmes restrikciós hely.

A plazmidból származó kifejeződő vektornak egy egyedi NdA restrikciós helye van, amely a helyen belül tartalmazza az ATG iniciációs kodont. Az egyedi Nde helyet közvetlenül a riboszomális kötőhely után találjuk.

10. Nut hely.

Az N fehérje, amelyet a gazdaszervezet szolgáltat, a Nut helyen kötődik a kifejeződő vektoron és ezáltal megakadályozza az átírás befejeződését a t_RI helynél vagy megakadályozza az érés előtti átírási befejeződést a klónozott génen belül.

A3108 és A3112 törzseket fertőzünk Ximm 434 Imini TnlO-el 30 °C hőmérsékleten, és tetraciklin rezisztens telepeket izolálunk. A telepeket tisztítjuk és megvizsgáljuk ampicillin rezisztenciára. Egyedi telepeket választunk ki és növesztünk egy éjszakán át 30 °C hőmérsékleten LB tápközegben, amely 50 pg/ml ampicillint is tartalmaz. A tenyészeteket hígítjuk 1/1000 arányban LB tápközeggel, növesztjük kb. 510⁸/ml koncentrációig, és tovább hígítjuk 1/100000 arányban friss LB tápközeggel, és egy éjszakán át növesztjük. Mintákat szélesztünk LB lemezekre és olyan LB lemezekre, amelyek 50 pg/ml ampicillint is tartalmaznak. Mintegy 50 telepet az egyes LB lemezekről átellenőrzünk növekedésre ampicillint tartalmazó LB lemezeken. Az eredmények a kiválasztott kiónok plazmid-stabilitását demonstrálják.

III. táblázat

A cl⁴³⁴ rendszerből kialakuló plazmid stabilitása

Törzs	Plazmid	Gazdaszervezet	Sejtek%-a plazmid nélkül
A3102	pHG44	A2097	10-20
A3108	pHG50	A1645	10-20
A3109	pHG50	A1645 (Zi434cl miniTn 10)	1,0
A3112	pHG51	A1645	10-20
Α3113	pHG51	A1645 (Xi434cEmini Tn 10)	1,0

19. példa pHG50 növesztése

I. Törzstenyészetek pHG50 törzstenyészeteit kazeines tápközegben növesztjük (lásd „Inokulum”), majd kétszeresére hígítjuk 35 fagyasztó tápközeggel, és -80 °C hőmérsékleten tároljuk. A fagyasztó tápközeg 500 ml-e a következőket tartalmazza:

K2HPO4	6,3 g
kh2po4	1,8 g
Na-citrát	0,45 g
MgSO4.7H2O	0,09 g
(NH4)2SO4	0,9 g
Glicerin	44,0 g.

Kazein-hidrolizátum	20 g/1
Elesztőkivonat	10 g/1
K2HPO4	2,5 g/1
MgSO4.7H2O	1 g/i
NaCl	5 g/1
Biotin	0,1 mg/1
Tiamin	1 mg/1
Nyomelemoldat	3 ml/1.
A tápközeg tartalmaz 100 mg/liter ampicillint is. Az

II. Inokulum

Az inokulumot 20 g/1 kazein-hidrolizátumot, 10 g/1 élesztőkivonatot és 2 g/1 NaCl-t tartalmazó oldatban szaporítjuk. Rázólombikban steril tápközeget inokulálunk törzstenyészetből és inkubáljuk 15 órán át rázógépen 30 °C hőmérsékleten, mintegy 200 fordu- 50 lat/percnél. Amikor további fázisokhoz szükséges, az inokulum szaporítását kevertetett, levegőztetett fermentorokban is kivitelezhetjük. A steril tápközeget 2-10% inokulummal inokuláljuk és 15 órán át 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk, pH 7 ± 0,5-nél olyan mérté- 55 kű kevertetéssel és levegőztetéssel, hogy az oldott oxigén szintje a 20% levegő-telítettség fölött maradjon.

III. Termelés

A termelő tápközeg a következőket tartalmazza:

ampicillin a termeléshez tetszőleges, de az inokulum növesztéséhez használt tápközegben mindig megtalálható.

A biotint, tiamint és ampicillint koncentrált oldatban külön-külön szűréssel sterílezzük és az inokulálás előtt 45 adjuk hozzá a steril tápközeghez. Steril glükóz oldatot is adunk kezdetben 10 g/1 koncentráció elérésére. Az indukciós lépésnél további 10 g/1 glükózt adagolunk.

A nyomelem-oldat a következőket tartalmazza:
FeCl,	16 g/1
ZnCÍ2.4H2O	2 g/1
CoC12.6H2O	2 g/1
Na2MoO4 2H2O	2 g/1
CaCl2.2H2O	1 g/i
CuCl2	1 g/1
H3BO3	0,5 g/1
Konc. HCI	100 ml/1.
A tápközeget 0,5-10%	inokulum-tenyészettel

inokuláljuk, és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A kevertetési-levegőztetési sebességeket úgy állítjuk be,

HU 215 160 Β hogy az oldottoxigén-szint 20% levegőtelítettség fölött maradjon. A pH-t 7 ± 0,2 értéken tartjuk NH₃-al. Amikor a sejtkoncentráció eléri a mintegy 3,5 g/litert (OD₆₆₀ = 10), az indukciót elindítjuk.

A hőmérsékletet 42 °C-ra emeljük, és 42 °C hőmérsékleten tartjuk 1-5 órán át. A tenyészetet azután lehűtjük, és a sejteket centrifugálással kinyerjük a hormon tisztításához.

20. példa p8300-10A

A p8300-10A (ATCC 39785) megalkotását a 7. ábrán mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben. A p8300-10A plazmid a konstitutíven nagy kópiaszámú ρΟΡ1Δ6 plazmidból [Gelfand, D. H. és munkatársai: PNAS 75, 5869 (1978); Mensing és munkatársai: Cell, 24, 235-242 (1981)] származik. Ap7200-22-t, amelyet szintén a 7. ábrán mutatunk be, Clal-el emésztjük, és a Clal-Cláí fragmenst, amely tartalmazza a λΡ_Ε promotort, a bGH gént és a T|T₂ szekvenciákat, izoláljuk. A Clal-Clál fragmenst beiktatjuk a ρΟΡ1Δ6 egyedi Clal helyébe. [A p7200-22 plazmid a pSAL 5600-1 (10. ábra) egyik származéka, amelybe egy szintetikus Clal linkért vezetünk be a Bglll helynél, a λΡ_Ε promotortól „felfelé”].

A p8300-10A plazmidról úgy találjuk, hogy megtartja a konstitutíven nagy kópiaszámú fenotípusát még a λΡ, promotor indukciója után is mintegy 42 °C hőmérsékleten. Ez a T[T₂ befejezési szekvenciák jelenlétében tulajdonítható a bGH szekvencia 3’ végénél, amelyek megakadályozzák hosszú mRNS átiratok képződését a λΡ_Ε promotorból, amely hatást gyakorolhat más mRNS átiratokra is a ρΟΡ1Δ6 replikációjának origójánál.

A p8300-10A-t Escherichia coli A2097 törzsbe vezetjük be transzformációval, olyan módszereket alkalmazva, amelyek jól ismertek azok számára, akik a szakterületen átlagosan jártasak. Ez a törzs növesztésre és indukcióra egy szarvasmarha növekedési hormon analógot termel, amely metionin gyökkel bír a természetes bGH fenilalanin formájának alanin-terminálisához hozzátéve. A termelt bGH analóg mennyisége mintegy 37—43%-a a baktériumok által termelt összes fehérjének, amint ezt Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid-gél átvizsgálásával kalkuláljuk. A törzs növesztéséhez, a termelt bGH analóg kinyeréséhez és a bGH analóg tisztításához alkalmazott módszerek azonosak azzal, amelyeket a pSAL-170/10-hez leírunk a 24. példában.

21. példa

A p8300-10A plazmidból (7. ábra, ATCC 39 785) egy általános hasznosítású kifejeződő vektor származhat a bGH gén kimetszésével. Egy így származott vektor számos előnnyel bír a korábban leírt vektorokkal szemben, ilyen előnyök pl.:

1. A kifejeződés rendkívül magas szintje.

A vektor képes az idegen fehérje kifejeződésének irányítására Escherichia coli-ban olyan magas szinten, amely a teljes sejtfehérje 44%-át is elérheti.

2. Konstitutíven nagy kópiaszám.

A vektor konstitutíven nagy kópiaszámot, mintegy 200-300 kópiát sejtenként, tart fenn. Ez eltér a többi λΡ_Ε kifejeződő vektoroktól, amelyek kisebb kópiaszámmal vannak jelen. A nagy kópiaszám hozzájárul a kifejeződés magasabb szintjéhez.

3. Átírásbefejezési szignálok.

A vektor, amelyet a bGH szekvencia kimetszésével nyerhetünk p8300-10A-ból, tartalmazza a TjT₂ átírásbefejezési szignálokat a λΡ_Ε promotortól és a C_n riboszomális kötőhelytől „lefelé”. A kifejeződés magas szintje részben a T,T₂ átírási terminátorok jelenlétének tulajdonítható a beiktatott gén végénél, mivel a T|T₂ szignálok befejezik az N-módosított RNS polimeráz átírását. így az átírási terminátorok megakadályozzák a nem kívánt fehérjék relatív termelését. Ezen túl a T,T₂ átírási szignálok megakadályozzák a hosszú mRNS átiratokat a replikáció plazmid-origóján át. Ez növeli a nagy kópiaszámú fenotípus stabilitását.

Hasonló nagy kópiaszámú plazmidok, amelyek tartalmazzák a λΡ_Ε promotort, de nincsenek átírásbefejezési szekvenciáik, nem stabilak, és hajlamosak elveszíteni nagy kópiaszámú fenotípusukat.

4. Helyettesíthető riboszomális kötőhely.

A p8300-10A tartalmaz egy egyedi EcoRI helyet, amely a riboszomális kötőhelytől „felfelé” helyezkedik el, és egy Ndel helyet, amely a riboszomális kötőhelytől „lefelé” helyezkedik el. így a riboszomális kötőhely két egyedi restrikciós hely által van kötve. Ez lehetővé teszi a jelen riboszomális kötőhely (a λί), riboszomális kötőhely) könnyű kimetszését, és tulajdonképpen bármilyen más természetes vagy szintetikus riboszomális kötőhely behelyettesítését anélkül, hogy a plazmid más jellemvonásai változnának. Ez nagy mértékben megkönnyíti a kívánt polipeptid optimális kifejeződését.

5. A kifejeződés hővel indukálható szabályozása.

A λΡ_Ε promotor inaktív, amikor a Cj represszor kötődik hozzá. A cI857 represszor hőérzékeny, vagyis 30 °C hőmérsékleten kötődik a promotorhoz, de 42 °C hőmérsékleten inaktiválódik. így a fermentáció hőmérsékletének felemelésével 42 °C hőmérsékletre a gazdabaktériumok indukálódnak a kívánt fehérje termeléséhez.

Az ilyen rendszer előnyei a következők lehetnek.

(a) Olyan idegen fehérje, amely Escherichia coli-ra toxikus, is termelhető a fermentációs folyamat késői szakaszában, ilyen módon kerülve el a korai sejtpusztulást.

(b) A fehérje túltermelése stabilizálja a fehéijét, megakadályozhatja a proteolitikus lebomlást [Cheng, Y. E. és munkatársai: Gene, 14, 121 (1981)]. így a „pillanatnyi” túltermelés, egy olyan szorosan szabályozott promotort, mint a λΡ_Ε alkalmazva, előnyös lehet a folyamatosan alacsony szintű termeléshez viszonyítva.

6. Egyszerűsített indukciós munkamenet.

A jelen szabadalmi bejelentésben és a függőben levő, együtt bejelentett 514,188 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben leírt plazmidok által végzett fehérjetermelést a hőérzékeny cI857 represszor szabályozza.

A függőben levő, együtt bejelentett, fentebb említett bejelentésben leírt plazmidokhoz szükséges indukciós

HU215 160 Β munkamenet magában foglalja az indukciót 42 °C hőmérsékleten, ezt követi a növesztés 38 °C hőmérsékleten. Ezzel ellentétben a fehérjeszintézis optimális indukciója, amikor a p8300-10A plazmidot vagy pSAL 130/15 plazmidot, vagy plazmid-származékait alkalmazzuk, 42 °C-on történik, és ezt azonos hőmérsékleten, vagyis 42 °C-on végzett növesztés követi. Ez szükségtelenné teszi a fermentor hűtési igényét.

7. Riboszomális kötőhely és iniciációs kodon.

A kifejeződő vektor tartalmaz egy erős prokarióta riboszomális kötőhelyet (RBS), valamint egy transzlációs iniciációs kodont (ATG). így bármilyen eukarióta gént lehet klónozni anélkül, hogy iniciációs kodont kellene hozzáadni. Ezen túl a hatásos RBS növeli a kifejeződés szintjét. A riboszomális kötőhely a λϋ_π riboszomális kötőhely. A riboszomális kötőhely szekvenciája a következő:

TAAGGAAGTACTTACAT

ATTCCTTCATGAATGTA Egy bázispár különbözik a vad típusú λ-ban található riboszomális kötőhelytől.

8. Kényelmes restrikciós hely.

A kifejeződő vektornak egy egyedi Ndel restrikciós helye van, amely magán belül tartalmazza az ATG iniciációs kodont. Ez lehetővé teszi a kívánt gén megfelelő elhelyezkedését. Az egyedi Ndel hely közvetlenül a riboszomális kötőhely után található.

9. nut hely.

Az N fehérje, amelyet a gazdaszervezet szolgáltat, a Nut helyhez kötődik a kifejeződő vektoron, és ezáltal megakadályozza az átírás befejeződését a t_r<] helynél vagy az átírás befejeződését még nem érett állapotban a klónozott génen belül.

Törzsek

A leírt vektorokhoz és plazmidokhoz a megfelelő gazdaszervezetek azok az Escherichia coli törzsek, amelyek transzformálásra alkalmasak, ilyenek az A1637, A2602, A1563, A1645 [c600 m m⁺ gal+ thr~ leu- lac- bl (ÁcI857AHlA5<wnHI N+)] és A2097/A1645 lacAKA21 proC:: TnlO).

22. példa pSAL-130/5

A pSAL-130/5 megalkotását a 8. ábrában mutatjuk be, és le is ltjuk az „Ábrák leírása” című részben. A pSAL-130/5-öt a p8300-10A-ból nyeljük (ATCC 39 785) a met-phe bGH gént helyettesítve a met-asp-gln bGH génnel. A met-asp-gln bGH gént a pHG44 plazmidból (ATCC 39806) nyerjük Wel-el és Z/zWIlI-el végzett emésztéssel.

A pSAL-130/5-öt Escherichia coli A1645 törzsbe vezetjük be transzformációval, olyan módszereket alkalmazva, amelyek jól ismertek azok számára, akik a szakterületen átlagosan jártasak. Ez a törzs növesztésre és indukcióra egy szarvasmarha növekedési hormon (bGH) analógot termel, amely egy met-asp-gln aminosav-szekvenciával rendelkezik a természetes bGH fenilalanin-formájának N-terminálisához hozzáadva.

A pSAL-130/5 által termelt bGH analóg mennyisége mintegy 39^44%-a a baktériumok által termelt összes fehérjének, amint ezt Coomassie kékkel festett

SDS poliakrilamid-gél átvizsgálásával kalkuláljuk (I.

Táblázat).

A törzs növesztéséhez, a termelt bGH analóg kinyeréséhez, és a bGH analóg tisztításához alkalmazott módszerek azonosak azzal, amelyeket a 24. példában írunk le pSAL-170/10-hez.

23. példa pSAL-170/10

A pSAL 170/10 megalkotását a 8. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben.

A pSAL 170/10-et Escherichia coli A1645 törzsbe vezetjük be transzformálással, ismert módszereket alkalmazva. Ez a törzs növesztésre és indukcióra bGH analógot termel, amely met-asp-gln aminosav-szekvenciával rendelkezik a természetes bGH fenilalanin-formájának amino-terminálisához hozzátéve. A pSAL-170/10 által termelt bGH analóg mennyisége mintegy 40-26%-a a baktériumok által termelt összes fehérjének, mint ezt Coomassie-vel festett SDS poliakrilamid-gél átvizsgálásával kalkuláljuk (I. Táblázat).

24. példa pSAL-170/10 növesztése

I. Törzstenyészetek pSAL-170/10 törzstenyészeteit kazeines tápközegen (lásd inokulum) növesztjük, majd kétszeresére hígítjuk fagyasztó tápközegben, és -80 °C hőmérsékleten tároljuk. A fagyasztó tápközeg 500 ml-e a következőket

tartalmazza:
K2HPO4	6,3 g
kh2po4	1,8 g
Na-citrát	0,45 g
MgSO4.7H2O	0,09 g
(NH4)2SO4	0,9 g
Glicerin	44,0 g.

II. Inokulum

Az inokulumot 20 g/1 kazein-hidrolizátumot, 10 g/1 élesztőkivonatot és 2 g/1 NaCl-t tartalmazó tápközegben szaporítjuk. Rázólombikban steril tápközeget inokulálunk a törzstenyészetből, és 15 órán át inkubáljuk rázógépen, 30 °C hőmérsékleten, és mintegy 200 ford./percnél. Amikor ez további lépésekhez szükséges, az inokulum szaporítását kevertetett, levegőztetett fermentorokban hajtjuk végre. A steril tápközeget 2-10% inokulummal inokuláljuk, és 15 órán át inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten, pH 7 ± 0,5-nél, olyan mértékű levegőztetés és kevertetés mellett, hogy az oldottoxigén-szintje a 20%-os levegőtelítettség fölött legyen.

III. Termelés

A termelő tápközeg a következőket tartalmazza:

Kazein-hidrolizátum 20 g/1

Élesztőid vonat 10 g/1

K₂HPO₄ 2,5 g/1

MgSO₄.7H₂O 1 g/1

NaCl 5 g/1

Biotin 0,1 mg/1

Tiamin 1 mg/1

Nyomelemoldat 3 ml/1.

HU 215 160 Β

A tápközeg tartalmaz még 12,5 mg/liter tetraciklint is. A tetraciklin a termeléshez tetszőleges, de mindig megtalálható az inokulum növesztéséhez alkalmazott tápközegben.

A biotint, tiamint és az antibiotikumot koncentrált oldatban külön-külön sterilezzük, és az inokulálás előtt adjuk a steril termelő tápközeghez. Kezdetben 10 g/1 mennyiségben adunk steril glükózt a tápközegbe. Az indukciós lépésnél további 10 g/1 glükózt adagolunk.

A nyomelem-oldat a következőket tartalmazza:
FeCl3	16 g/1
ZnCl24H2O	2 g/1
CoCl2.6H2O	2 g/1
Na2MoO4.2H2O	2 g/1
CaCl2.2H2O	1 g/i
CuCl2	1 g/1
H3BO3	0,5 g/1
Konc. HCI	100 ml/1.
A tápközeget 0,5-10%	inokulum-tenyészettel

inokuláljuk és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A kevertetési és levegőztetési sebességeket úgy állítjuk be, hogy az oldott oxigén-szint 20% levegő-telítettség fölött legyen. A pH-t 7 ± 0,2-nél tartjuk NH₃-al. Amikor a sejt-koncentráció eléri a kb. 3,5 g/litert (OD₆₆₀ = 10), az indukciót elindítjuk.

A hőmérsékletet 42 °C-ra emeljük, és 42 °C hőmérsékleten tartjuk 1-5 órán át. A tenyészetet azután lehűtjük és a sejteket centrifugálással kinyerjük a hormon tisztításához.

A bGH kinyerése.

kg baktériumsejtet (nedves szűrőpogácsa) újra szuszpendálunk 5 térfogat, 50 mmol/liter nátrium-foszfát puffért (pH 7,4), 50 mmol/liter EDTA-t és 100 mmol/liter NaCl-t tartalmazó oldatban Polytron (Kinematica) blender keverőt alkalmazva, e közben a keverő sebességét úgy szabályozva, hogy a habképződés minimális legyen. A homogén szuszpenziót folyamatosan engedjük át Dynomill sejtzúzón (KDS típus, Willy A. Bachofen, Basel) 80 liter/óra sebességgel, és a szétzúzott sejtek homogén szuszpenzióját centrifugálással derítjük CEPA 101 centrifugában, 45 liter/óra áramlási sebességnél. A centrifugálási lépés csapadékát összegyűjtjük, és újra szuszpendáljuk 15,5 liter 50 mmol/literes foszfát pufferban (pH 7,4), amely 50 mmol/liter EDTA-t is tartalmaz. Lizozimot adunk hozzá 0,05 mg/ml végső koncentrációban, és a szuszpenziót 16 órán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten. A szuszpenziót ezután 30 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten, ultrahangos kezelésnek vetjük alá folyamatos átáramlású cellás készülékben (Heat System sonificator) 18 liter/óra sebességnél, és centrifugáljuk CEPA 101 centrifugában. A csapadékot összegyűjtjük, újra szuszpendáljuk 50 mmol/literes foszfátpufferban (pH 7,4), a fentiek szerint ultrahangos kezelésnek vetjük alá, és centrifugáljuk CEPA 101 centrifugában. A sejteket újra szuszpendáljuk 15,5 liter 50 mmol/literes foszfátpufferban (pH 7,4), amely 50 mmol/liter EDTA-t és 100 mmol/liter NaCl-t is tartalmaz, és kétszer kicsapjuk, majd kétszer újra szuszpendáljuk 15,5 liter desztillált vízben. A csapadékot centrifugálással összegyűjtjük és -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

A bGH tisztítása.

A csapadékot újra szuszpendáljuk 30-40 liter desztillált vízben és szolubilizáljuk a pH-t, 0,5 n NaOH-val titrálva, 11,8-ra beállítva. Az oldatot ezután folyamatosan ultrahangos kezelésnek vetjük alá, és centrifugálással tisztítjuk CEPA 101 centrifugában, ha szükséges, vagy szűrjük Whatman 1. papíron keresztül.

A tisztított fehéijeoldatot (32,6 liter, amely 280 nmnél mérve 297 000 OD egység értéket tartalmaz) külön részletekre osztjuk (6x5,4 liter), mindegyik részlet 50000-60000 OD egységet tartalmaz. Minden adagot külön-külön ultraszűrésnek vetünk alá Millipore Pellicon ultraszűrőn át, amely három, 100 000 molekulasúly-kizárásos kazettával (PTHK típus) van felszerelve, mindegyik kazetta 5 négyzetláb, vagyis 0,465 m² területű. Egy 5,4 literes adagot 1 liter visszamaradó térfogatig koncentrálunk. Az ultraszűrletet összegyűjtjük és tároljuk. A visszamaradt anyagot visszahígítjuk eredeti térfogatára friss 10 mmol/literes borát pufferral (pH 11,8), és alaposan összekeverjük. Az adagot ismét 1 liter visszamaradó térfogatig koncentráljuk. Az ultraszűrletet összegyűjtjük, és kombináljuk az első ultraszűrlettel. Amikor az éppen munkában levő összes OD mennyisége az ultraszűrletben egyenlő lesz a kiinduláskor az ultraszűrletbe táplált összes OD mennyiség 20%-ával, a visszamaradó térfogatot a következő lépésnél 0,5 liternek vesszük 1 liter helyett. A koncentrálás és 10 mmol/literes borátpufferral hígítás ciklusát addig folytatjuk, amíg a 0,5 literes visszamaradó térfogatból származó ultraszűrlet 280 nm-nél 0,1 egységnél kevesebb lesz (1 cm-es cellánál). Ez normálisan a 9. és 12. koncentrálási-hígítási ciklusnál következik be. A végső visszamaradó oldatot elöntjük.

Az összes ultraszűrletet egyesítjük és pH 9,0-ra állítjuk be 6 n HCl-el. A többi 5,4 literes adagokat is hasonló módon vetjük alá ultraszűrésnek, és az összes, pH-beállított ultraszűrleteket egyesítjük. Egy tipikus munkamenet összesen 380 liter ultraszűrletet termel 0,26-os abszorbanciával, ez 100000 OD értéknek felel meg, a művelet összesen 24-40 órát igényel.

A kombinált ultraszűrleteket (380 liter, amely 280 nm-nél mérve 100000 OD-t tartalmaz) a 100 K ultraszűrési lépésből Sepharose CL-6 B DEAE ioncserélő oszlopra terheljük 23 cm/óra (25 liter/óra) lineáris áramlási sebességgel. A 37 cm átmérőjű, 15 cm magas oszlopot két ágytérfogat (32 liter) 10 mmol/literes borátpufferral (pH 9,0) mossuk. A ráterhelési és mosási lépésekből eredő eluátumot elöntjük. Az eluensben történő lépésváltás 10 mmol/liter borátot és 100 mmol/liter nátriumkloridot tartalmazó oldatra (pH 9) leszorítja a bGH-t az oszlopról. Az eluciós áramlási sebesség 23 cm/óra. A munkamenet előrehaladását az eluátum abszorbanciájának követésével figyelhetjük 280 nm-nél. A bGH csúcsot 4—5 ágytérfogatba gyűjtjük össze (84 liter, amely 280 nm-nél mérve 43 000 OD egységet tartalmaz), majd mintegy 10 mg/ml-re koncentráljuk, Millipore Pellicon ultraszűrő berendezést alkalmazva,

HU 215 160 Β

10000 molekulasúly-kizárásos kazettákkal. Az oldatot azután liofilezzük. A kitermelés mintegy 70 g tiszta bGH.

25. példa

A pSAL-170/10 által termelt bGH analóg aktivitása

1. A bGH analóg radioimmunassay összehasonlítása a természetes bGH-vel.

100 ng/ml bGH analógot tartalmazó oldatot készítünk foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldatban (1% BSA). Ezt az oldatot sorozathígításnak vetjük alá 50; 25; 12,5; 6,25; 3,12; 1,56; és 0,78 ng/1 koncentrációkra. Ezeknek az oldatoknak 0,1 ml alikvotjait két párhuzamosban RIA mérésnek vetjük alá, kettős antitest eljárást alkalmazva. A hígítási görbe jól összevethető azzal, amelyet a természetes bGH-val nyerünk.

2. Radioreceptor-kötési vizsgálat.

Radioreceptor-kötési vizsgálatot hajtunk végre nyúlmáj membránokkal, amint ezt Tushima, T. és Freisen, H. G. leírták [J. Clin. Endocr. Metab. 37, 3 (1973)], ^l25I-bGH-t alkalmazva jelzőként és autentikus bGH oldatokat alkalmazva a kalibrációs görbe megalkotásához. A mintákat három párhuzamosban inkubáljuk két órán át szobahőmérsékleten 0,3 ml vizsgálati pufferban (50 mmol/liter trisz, 15 mmol/liter CaCl₂ és 5 mg/ml bovin szérum albumin, pH 7,6). A csövek ¹²⁵I-bGH-t (2000 cpm 30-60 pci/pg-os készítményből), 150-250 pg máj membrán fehéijét, és/vagy természetes bGH-t (1-100 ng/, vagy bakteriális bGH kivonatait tartalmazzák. Az eredmények azt demonstrálják, hogy a bGH analóg bGH aktivitása összevethető a természetes bGH aktivitásával.

3. Tibiavizsgálat.

A 24. példa szerint nyert bakteriális sejtekből kinyert, pSAL-170/10 által termelt bGH analóg bioaktivitását tibiavizsgálattal értékeljük [Parlow, A. F. és munkatársai: Endocrinology, 77, 1126 (1965)]. Patkányok hipofízisét eltávolítjuk 28-30 napos korukban, majd 10-14 napig kezelés nélkül tartjuk ezeket. Szarvasmarha hipofízisből, vagy rekombináns Escherichia coli-ból származó szarvasmarha növekedési hormont oldunk 0,15 mol/liter NaCl-t és 0,01 mol/liter borátot tartalmazó oldatban (pH 10,0). Patkányok 4-7 tagú csoportjainak adunk naponta szubkután injekciókat bGH oldatokból (5-125 pg/nap, 0,2 ml-es adagokban) 5 napon át, miközben normál étrenden tartjuk ezeket (Purina Rat-Chow tápszer és víz korlátlan mennyiségben). Az állatokat a 6. napon leöljük, első térdcsontjaikat kivesszük, hosszában elhasítjuk, acetonnal rögzítjük és 2%-os AgNO₃ oldattal megfestjük. Az epifizeális lemezek szélességét egy kivetítő binokuláron (Nikon) át figyeljük meg. Átlagértékeket (40 levolvasás patkányonként) alkalmazunk a hosszú dózisválasz-görbe megalkotásához. Az eredmények azt demonstrálják, hogy a pHG44 által termelt bGH analóg bGH aktivitása összemérhető a természetes bGH aktivitásával.

26. példa

A 3. példában leírt SÓD gazdaszervezetvektorrendszerek által termelt humán szuperoxid-diszmutáz kitermelése és aktivitása javítható a gazdaszervezetvektor-rendszerek növesztési körülményeinek módosításával. Amint a következő adatok demonstrálják, a gazdaszervezetvektor-rendszerhez szolgáló növesztő tápközeg kiegészítése Cu-val és/vagy Zn-el az enzim nagyobb kitermelését eredményezi aktív dimer formában.

A pSOD^tlTl 1-et tartalmazó baktériumok növesztése I. Törzstenyészetek pSODpiTl 1 törzstenyészeteit kazeines tápközegen (lásd „Inokulum”) növesztjük, majd fagyasztó tápközeggel kétszeresére hígítjuk, és -80 °C hőmérsékleten tároljuk. A fagyasztó tápközeg a következőket tartalmazza 500 ml-re:

K2HPO4	6,3 g
kh2po4	1,8 g
Na-citrát	0,45 g
MgSO4.7H2O	0,09 g
(NH4)2SO4	0,9 g
Glicerin	44 g.
Inokulum
Az inokulumot 20 g/1 kazein-hidrolizátumot, 10 g/1

élesztőkivonatot és 2 g/1 NaCl-t tartalmazó tápközegben szaporítjuk. A rázólombikban levő steril tápközeget a törzstenyészetből inokuláljuk és 15 órán át inkubáljuk rázógépen 30 °C hőmérsékleten, mintegy 200 fordulat/percnél. Ha a későbbi lépésekben szükséges, az inokulum szaporítását levegőztetett, kevertetett fermentorokban hajtjuk végre. A steril tápközeget 2-10% lombiktenyészettel oltjuk, és 15 órán át inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten, pH 7 ± 0,5-nél olyan mértékű levegőztetéssel és kevertetéssel, hogy az oldott-oxigén-szintje mindig 20% levegőtelítettség fölött legyen.

III. Termelés

A termelő tápközeg a következőket tartalmazza:

Kazein-hidrolizátum	20 g/1
Elesztőkivonat	10 g/1
K2HPO4	2,5 g/1
MgSO4.7H2O	1 g/1
NaCl	5 g/1
Biotin	0,1 g/1
Tiamin	1 mg/l
Nyomelemoldat	3 ml/1
Tetraciklin	12,5 mg/l.
Némelyik kísérletnél még	a következőket adjuk
hozzá:
CuSO4.5H2O	0,8 g/1
ZnSO4.7H2O	10 mg/l.
A biotint, tiamint és tetraciklint koncentrált oldatban
szűréssel sterilezzük, és az inokulálás előtt adjuk a steril
tápközeghez. Steril glükóz oldatot adunk hozzá a kiin-
duláskor, 10 g/1 koncentrációra beállítva. Az indukciós
lépéskor további 10 g/1 glükózt adunk hozzá.
A nyomelemoldat a következőket tartalmazza:
FeCl3	16 g/1
ZnCÍ2.4H2O	2 g/1
CoC12.6H2O	2 g/1
Na2MoO4.2H2O	2 g/1
CaCl2.2H2O	1 g/i

HU 215 160 Β

CuCl₂ 1 g/1

H₃BO₃ 0,5 g/1

Konc. HCl 100 ml/1

A tápközeget 0,3-10% inokulumtenyészettel inokuláljuk, és 30 °C hőmérsékleten ínkubáljuk. A levegőzte- 5 tési-kevertetési sebességeket úgy állítjuk be, hogy az oldottoxigén-szintje 20%-os levegőtelítettség fölött maradjon. A pH-t 7 ± 0,2 értéken tartjuk NH₃-al. Amikor a sejtkoncentráció eléri a mintegy 3,5 g/litert (OD₆₆₀ = 10), az indukciót elindítjuk.

A hőmérsékletet 42 °C-ra emeljük és 42 °C-on tartjuk 1-5 órán át. A tenyészetet ezután lehűtjük, és a sejteket centrifúgálással kinyerjük az enzim tisztításához.

Az SÓD kinyerése.

1,5 kg bakteriális sejtet (nedves szűrőpogácsa) szuszpendálunk 12 liter 50 mmol/liter nátrium-foszfát (pH 7,8) oldatban, Polytron (Kinematica) blender keverőben, miközben a sebességet úgy szabályozzuk, hogy a habképződés minimális legyen. A homogén szuszpenziót folyamatosan átengedjük Dynomill sejtzúzó berende- 20 zésen (KD5 típus, Willy A. Bachofen, Basel). A szétzúzott sejtek homogén szuszpenzióját ultrahangos kezelésnek vetjük alá, folyamatos átáramlású cellát alkalmazva, és CEPA 101 centrifugában centrifugáljuk. A felülúszót 2 órán át melegítjük 65 °C hőmérsékleten, lehűtjük, majd a fentiek szerint centrifugáljuk. A tiszta felülúszót 1 literre koncentráljuk Millipore Pellicon ultraszűrő berendezésen, 100000 molekulasúly-kizárásos kazettákat (PTGC) alkalmazva. A koncentrált fehéqeoldatot átengedjük DEAE Sephacel oszlopon (2 kg DEAE Sephacel), amely 150 mmol/literes nátrium-foszfát pufferrel (pH 7,8) van kiegyensúlyozva. Az átáramlott oldatot összegyűjtjük, koncentráljuk és dializáljuk Pellicon ultraszűrő berendezésen 20 mmol/literes trisz-HCl-el (pH 7,8) szemben, majd QAE Sepharose oszlopra 35 visszük fel, amely oszlop 20 mmol/liter trisz-HCl pufferrel van kiegyensúlyozva. Az oszlopot 20 mmol/liter trisz-HCl pufferral (pH 7,8) és só-gradienssel (0-200 mmol/liter NaCl) fejlesztjük ki. Az SOD-t tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, Pellicon ultraszűrő be- 40 rendezést alkalmazva koncentráljuk, desztillált vízzel szemben dializáljuk, majd nátrium-acetátra 100 mmol/literessé tesszük 1 mol/literes nátrium-acetát puffer (pH 4,8) hozzáadásával. A fehérjeoldatot azután tovább szeparáljuk 100 mmol/literes nátrium-acetát puf- 45 ferrel (pH 4,7) kiegyensúlyozott CM-Sepharose oszlopon. Az oszlopot azonos puffért, és egy só-gradienst (100-500 mmol/liter NaCl) alkalmazva fejlesztjük ki.

Az SOD-t tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, Pellicon ultraszűrő berendezést alkalmazva koncentráljuk és liofi-lezzük.

27. példa

A baktériumok által termelt SÓD enzimes aktivitása

A 26. példa szerint baktériumok által termelt tisztított humán SÓD (hSOD) standard növekedési körülmények között (azaz többlet-CuSO₄ hozzáadása nélkül) csak 5%os enzimaktivitással rendelkezik a szarvasmarha Cu/Zn 10 SOD-vel összehasonlítva. A fémtartalom elemzése arra a felismerésre vezet, hogy az enzim kevés Cu-t tartalmaz, és hogy ez csupán 8%-a az elvárt értéknek. Ezen kívül az is látszik, hogy a Cu~⁺ helyek jó részét Zn ionok helyettesítik, mivel a fehérje a szükséges Zn csaknem kétszeresét 15 tartalmazza. A teljesen fémmentes fehéqe, amelyet a bakteriálisán termelt hSOD-ből állítunk elő, azonban visszanyeri lényegében teljes enzimes aktivitását oldatban végzett helyreállításra. Az oldat mind Cu+M, mind Zn++-t tartalmaz, mindegyiket 1,2 mol-ion/mol aktív hely koncentrációban (IV. Táblázat).

A bemutatott adatok azt sugallják, hogy a Cu⁺⁺ sejten belüli koncentrációja korlátozott és nem elegendő, hogy telítse a termelt hSOD-t. Egy kísérletsorozatban demonstráljuk, hogy a megemelt Cu'¹ koncentrációk a növesztő 25 tápközegben növekedést okoznak a hSOD fajlagos aktivitásában. Sőt, a 200 ppm Cu⁺⁺-val kiegészített kazeinhidrolizátumon nőtt E. coli (26. példa) indukció után teljesen aktív hSOD-t termel, a fémek természetes összeállításával és teljes enzimes aktivitással (IV. Táblázat). To30 vábbi kísérletek azt demonstrálják, hogy a hatás azonos, amikor exogén Cu^f+ 50-250 ppm közti tartományban levő mennyiségét adjuk hozzá. Hasonló hatást látunk LB (Luria Broth) tápközeggel is, 75 ppm Cu⁺⁺-al kiegészítve.

Az SÓD koncentrációt Lowry módszerével határozzuk meg [Lowry, Ο. H., Rosebrough,wN. J., Faré, A. L. és Randall, R. J.: J. Bioi. Chem. 193, 265-275 (1951)], standardként bovin szérum albumint alkalmazva. A ferricitokróm-c redukciója gátlását megfigyelő aktivitásmérést úgy hajtjuk végre, ahogyan ezt McCord és Fridovich leírták [McCord, J. M. és Fridovich, I.: J. Bioi. Chem. 244, 6049-6055 (1969)]. A Cu és Zn tartalmat tiszta SÓD készítményekben atomabszorpcióval határozzuk meg. Az SOD-apo enzimet Weser és Hartmann szerint állítjuk elő [Weser, U. és Hartmann, H. J.: FEBS Lett. 17, 78-80 (1971)], és a helyreállítást Cu és Zn egyidejű hozzáadásával hajtjuk végre [Jewett, S. L.: Latrenta, G. S. és Beck, C. M.: Arch. Biochem. Biophys. 215, 116-128 (1982)].

IV. táblázat

SÓD készítmények aktivitása és fémtartalma

Fehérje	Mól/alegység	Aktivitás egység/mg
Cu	Zn
hSOD,	0,07	1,62	167
Apó enzim	0,01	0,02	0
Helyreállított SÓD	0,81	0,88	2931

HU 215 160 Β

IV. táblázat (folytatás)

Fehérje	Mól/alegység	Aktivitás egység/mg
Cu	Zn
hSOD2	0,88	0,90	2 730
szarvasmarha SÓD	0,97	1,01	2805
hSOD (Sigma)			1606

¹ A 26. példában leírt módon készített hSOD. Az alkalmazott tápközeg nem tartalmaz hozzáadott Cu⁺⁺-t és Zn⁺⁺-t.

² A 26. példában leírt módon készített hSOD. Az alkalmazott tápközeg tartalmaz hozzáadott Cu⁺⁺-t és Zn⁺⁺-t.

28. példa

A bakteriálisán termelt hSOD amino-terminális szekvenciája

A 26. példában leírt módon előállított tisztított SÓD amino-terminálisánál levő 5 aminosav szekvenciáját Edman-lebontással határozzuk meg. Ez az aminosavszekvencia azonos azzal, amelyet a humán Cu/Zn SÓD N-terminálisánál meghatároztak, vagyis Ala-ThrLys-Ala-Val. Ez bizonyítja a bakteriális termék autentikus voltát. Ennek megfelelően úgy tűnik, hogy az oldható hSOD hozzáférhető az E. coli működő enzimjei számára, amelyek eltávolítják az N-terminális metionint.

Az alábbiakban röviden megtárgyaljuk a bakteriális hSOD-vel kapcsolatos eredményeket.

Azt demonstráljuk, hogy a baktériumok, amelyek nagy mennyiségű hSOD termelésére vannak indukálva, amikor LB- vagy kazein-hidrolizátum tápközegen nőnek, enzimesen inaktív fehéijét termelnek. Az így nyert fehérje aktiválható helyreállítással és a hiányzó Cu⁺⁺, Zn⁺⁺ ionok visszaadásával. Nem várt módon a baktériumokat lehet indukálni enzimesen aktív hSOD termelésére olyan módon, hogy olyan tápközegen növesztünk, amely ki van egészítve Cu⁺⁺-val. Bár nem kívánjuk a kérdést elméleti megfontolásokhoz kötni, úgy hisszük, hogy a dús tápközegek (mint az LB és a kazeinhidrolizátum) bizonyos komponensei kelátot képeznek a rendelkezésre álló réz nagy részével, úgy, hogy a baktérium számára nem áll rendelkezésre elegendő réz, hogy betöltse az SÓD molekulákban, amelyek emelt szinten termelődnek, levő összes helyet. 50-250 ppm Cu⁺⁺ ion hozzáadása a tápközeghez nyilvánvalóan felemeli a Cu ^H koncentrációt a baktériumokon belül olyan szintre, amely elegendő az összes Cu⁺⁺ szolgáltatásához, amely a humán Cu/Zn SÓD túltermeléséhez szükséges.

29. példa

A re-perfüziök okozta sérülések csökkentése rekombináns humán szuperoxid-diszmutázzal általános iszkémiát követően

A gazdaszervezet- pSODpiTl 1 vektor rendszer által a 3. példában leírt E. coli 1645-ben termelt, a 26. példában leírt körülmények között növesztett és tisztított humán szuperoxid-diszmutázról kimutatható, hogy csökkenti az általános iszkémiát követő reperfüziók okozta sérüléseket.

Izolált, perfuziónak alávetett nyúlszív-készítmény.

New Zealand nőstény fehér nyulakat (1,5-2,0 kg) heparinnal kezelünk és érzéstelenítünk, szívüket eltávolítjuk és gyorsan hideg (4 °C) hőmérsékletű perfúziós oldatba helyezzük. A felmenő aortát kanüllel zárjuk és a szíveket állandó nyomás alatt (110 víz-centiméter) perfuziónak vetjük alá módosított Krebs-Ringer bikarbónát puffer oldatban, amely 117 mmol/liter nátriumkloridot, 6 mmol/liter kálium-kloridot, 3,0 mmol/liter kalcium-kloridot, 1,0 mmol/liter magnézium-szulfátot, 0,5 mmol/liter EDTA-t, és 16,7 mmol/liter glükózt tartalmaz, és a végső pH 7,40-re van beállítva mintegy 24 mmol/literes nátrium-bikarbonát hozzáadásával. A perfúziós oldatot folyamatosan buborékoltatjuk 95% oxigént és 5% széndioxidot tartalmazó gázkeverékkel. A koszorúér-átfolyást eltávolítjuk az NMR mintacsőből vákuumos leszívással. A szíveket beütemezzük 175 verés/percre jobb kamrai beütemezéssel, telített káliumkloridban áztatott gézzel, amely polietilén csőbe van illesztve és Grass SD-9 stimulátorral van összekötve. Hogy hozzámérjük a bal kamrai összehúzó frakciót, egy kaucsuk-gumiballont kötünk egy 100 cm hosszú PE 190 cső végére, gondosan megtisztítjuk a levegőbuborékoktól és egy háromutas záródugón keresztül összekötjük Statham P23Db transzduktorral. Izovolumetriás nyomást mérünk Brush kétcsatornás közvetlen írásrögzítővel. A ballont kezdetben egy fecskendőn keresztül olyan térfogatú fiziológiás sóoldattal fújjuk fel, amely elegendő 10 Hgmm (1,310³ Pa) végső diasztolés nyomás előállításához. A kifejlesztett nyomás összes ezt követő mérését ennél a végső diasztolés térfogatnál mérjük. Az összes szívet 30 perces általános iszkémiának vetjük alá, amely idő alatt a sziveket 37 °C hőmérsékleten tartjuk, meleg perfúziós oldatot áramoltatva a szív körül. Az aortás beáramlás teljes megszakítását végezzük el olyan módon, hogy keresztben leszorítjuk a perfúziós vonalat. 45 perces, normális hőmérsékletű újabb perfüzió követi az iszkémia periódusát. A bal kamrai kifejlődött nyomás visszaállását úgy kalkuláljuk, mint az iszkémia előtti kontroll százalékát. Az iszkémia kezdeténél a ballont leeresztjük és a beütemezőt elcsavarjuk. A ballont 15 perccel a kiindulási leapasztás után újra feltöltjük, éppen a működés első mérése előtt, ugyanolyan térfogattal, mint amelyet az iszkémia kezdeténél eltávolítottunk. A koszorúérvéráramot térfogatosan mérjük vákuum-leszívással az iszkémia előtt, 5 perccel a leapasztás után és 15, 30 és 40 perccel az újabb perfüzió után.

HU 215 160 Β

Mag-mágneses rezonanciás (NMR) módszerek.

³¹P NMR spektrumokat nyerünk Brucker WH 180 spektrométerben 4,23 Tesla-nál egy széles furatú szupravezető mágnesben. Ennél az erőtérnél a foszfor 72,89 MHz-nél rezonál. A foszfor-szonda átmérője 25 mm. Ez a berendezés lüktető Fourier-transzformált módon van irányítva és hozzá van illesztve egy Nocolet 1280 számítógéphez, és az adatok nagy sűrűségű mágneslemezen vannak összegyűjtve. A szupravezető mágnes térstabilitása miatt mező/frekvencia zár nem szükséges. 5 perces proton kioldott spektrumokat veszünk fel a tranziensekből a két másodperces intervallumoknál szolgáltatott 45°-os lüktetéseket követően, ezekről a körülményekről már korábban leírták, hogy minimális spektrális telítettséget eredményeznek. Az adatokat összegyűjtjük egy 2K táblán egy 3000 Hz-es spektrális szélességnél.

A szövet sejten belüli pH becslése az NMR spektrumokból.

A sejten belüli pH mértékét a szerves foszfát csúcs kémiai eltolódásából (δ_ο) határozzuk meg a következő egyenlet alapján:

δο ^— δη pH, =pK-log---— θΑ ~ θο abból a célból, hogy minimálissá tegyük a szövet inhomogenitásának hatásait, a kémiai eltolódási értékeket a foszfokreatin rezonanciájához viszonyítva mérjük, amely viszonylag független a pH-tól a jelen tanulmányokban előforduló pH-tartományban (pK_A = 4,6). Az ebben az egyenletben alkalmazott konstansok: pK = 6,90, δ_Α = 3,290 ppm és δ_Β = 5,805 ppm, amint ezt korábban leírták.

A metabolitok mennyiségi értékelése az NMR spektrumokból.

A szöveti foszfokreatin (PCr), adenozin trifoszfát (ATP), valamint szervetlen foszfát (Pi) becslését az egyedi csúcsok alatti terület planimetriás mérésével nyeljük, amely lehetővé teszi a számítógép számára, hogy meghatározza a normalizálási állandót vagy kalibrációs tényezőt. Hewlett-Packard digitális átalakítót alkalmazunk, hogy végrehajtsuk a terület integrálását. A PCr-hez, ATP-hez és Pi-hez tartozó, így létrejött kvantitatív adatokat az iszkémia előtti kontrolltartalom százalékában fejezzük ki.

Kísérleti munkamenet.

szívet két csoportra osztunk:

I. csoport (n = 8). Az ebben a csoportban levő szíveket 60000 egység humán rekombináns humán szuperoxid diszmutázzal kezeljük (hSOD, fajlagos aktivitás 3200 nemzetközi egység/mg), 10 ml-es kapszulában bezárva éppen a visszatöltés előtt, ezt követi 60000 egység folyamatos infúziója a visszatöltés első 15 percében; a hSOD-t meleg, 37 °C hőmérsékletű Krebs-Ringer bikarbónát pufferben oldjuk.

II. csoport (n = 9). Az ebben a csoportban levő szívek 10 ml-es kapszulában perfúziós oldatot kapnak éppen a visszatöltés előtt, ezt követi egy normál hőmérsékleten végzett reperfúzió.

Az eredményeket az alábbiakban szemléltetjük.

A bal kamrai működés visszaállítása.

A jelen tanulmányban alkalmazott kísérleti iszkémiás modellt speciálisan úgy választottuk ki előzetes tanulmányok sora után, hogy olyan szíveket szolgáltasson, amelyek mérsékleten súlyos irreverzibilis károsodásban szenvednek, és még megőrizték a lehetőséget a javulásra terápiás beavatkozásra. A visszatöltés 45 percének végén a bal kamra működés visszaállása (amint a kontroll kifejlesztett nyomás százalékos kinyerése alapján mérjük) 47 ± 5% a kontroll csoportnál 48 ± 7 Hgmm (6,24 ± 0,13-10³ Pa) diasztólés végnyomásnál [összehasonlítva az iszkémia előtti 10 Hgmm (1,3-10³ Pa) kontroll értékkel]. Ezek a paraméterek nem változnak lényegesen a reperfúzió 30. és 45. perce között, azt sugallva, hogy a gyógyulásnak viszonylag állandósult állapotát érjük el. A hSOD beadása éppen a visszatöltés előtt és a reperfúzió első 15 percében a szívműködés jelentősen megnövekedett megőrzését eredményezi, és a diasztólés végnyomás kisebb növekedését a kontroliszívekkel összehasonlítva; a hSOD-vel kezelt szívek a kontroll kifejlesztett nyomás 71,6%-át visszanyerik, mindössze 27 ± 4 Hgmm (3,12 ± 0,10-10³ Pa) diasztolés végnyomásnál (mindkét esetben P< 0,01 a kontrollal szemben).

A szívizom metabolizmusa az iszkémia és az ezt követő reperfúzió során.

A szívizom nagyenergiájú foszfáttartalmát méqük sorozatban az iszkémia és az ezt követő reperfúzió során, mind a kontroliban, mind a hSOD-val kezelt szívekben. A 30 perces iszkémiás periódus során fokozatos csökkenést figyelünk meg a szívizom kreatin-foszfát és ATP tartalmában. A foszfokreatin-tartalom leesik az iszkémiás periódus végén az iszkémia előtti alapvonal-érték 8,3%-ára a kontrollszívekben és 10,5%-ára azokban a szívekben, amelyeket majd hSOD-vei kezelünk; az ATP- tartalom az alapvonal-érték 36,6%-át éri el a kontrollszívekben és 33,6%-át a hSOD-vel kezelendő szívekben. Ezek az adatok világosan jelzik, hogy a szívek mindkét csoportja egyformán súlyos mértékű iszkémiának van kitéve. Ezek az adatok elvetik annak a lehetőségét, hogy a hSOD-t kapott szívek azért mutatnak jobb működési visszanyerést, mert a sejt-metabolizmus jobban megőrződik az iszkémiás időszak során bizonyos nem szabályozott mechanizmusok révén.

A 45 perces visszatöltési periódus végén a hSODval kezelt szívek közel normális foszfokreatin tartalmat mutatnak (93 ± 9%-a a kontrollnak), míg a kontrollszívek az eredeti értéknek csak 69 ± 7%-át nyerik vissza (P< 0,05). A visszatöltési periódus végén az ATP-tartalom azonos a szívek mindkét csoportjánál (41 ± 4% a kontroliban és 42,5 ± 5% a hSOD-vel kezelt szívekben). Ez az utóbbi eredmény tükrözheti a jobb-bal kamrai működést visszanyerő szívek megnövekedett energiaigényét a nagyenergiájú foszfát-termelés megnövekedett sebességére való korlátozott képesség jelenlétében. Ezzel ellentétben a működés szerényebb visszanyerése a kontrollszívekben a nagy energiájú foszfát-metabolitok kisebb hasznosítását eredményezi, valószínűleg palástolva a még súlyosabb korlátozást az energiatermelésben.

HU 215 160 Β

Következésképpen ezek az adatok azt demonstrálják, hogy a mérsékelten súlyos iszkémiás károsodásnak és az ezt követő reperfűziónak kitett szívekben a hSOD beadása éppen a reperfüzió előtt vagy annak korai szakaszában a szisztolés és diasztolés működés jobb visszanyerését, valamint a foszfokreatin nagyobb szívizombeli tartalmát eredményezi. Ezek az eredmények azt is sugallják, hogy az iszkémiás szívizom reperfúziója szerkezeti és/vagy működési károsodási tüneteket is idézhet elő, amelyet el lehet kerülni vagy csökkenteni lehet egy oxigén szabad gyököt eltüntető anyag, például hSOD beadásával a reperfüzió idején, így a visszatöltési sérülések azon komponensének korlátozásával, amely a korábban iszkémiás szívizom újra oxigénnek kitevésének eredménye, a hSOD értékes többletet nyújt a trombotikus terápiához és/vagy a szívkoszorúér angioplasztikához azokban a betegekben, akiket korábban akut szívizominfarktus után kezeltek.

30. példa

Csökkenés a kísérleti infarktus méretében rekombináns humán szuperoxid diszmutáz beadására a reperfüzió során

A 3. példában leírt, E. coli A1645-ben levő pSODfflTll gazdaszervezetvektor-rendszer által termelt humán szuperoxid diszmutázról, amelynél a növesztés és a tisztítás a 26. példában leírt módon történt, kimutatjuk, hogy csökkenti az infarktus méretét a szívben.

Az iszkémiás szívizom alkalmas reperfüziója csökkenti az infarktusméretet (IS); ez az előnyös hatás azonban eltompul a visszatöltési sérülés egyidejű előfordulása mellett, amelyet a toxikus oxigén szabadgyökök képződése idéz elő. Hogy megvizsgáljuk, vájjon a szabad gyökök felemésztése rekombináns humán szuperoxid diszmutázzal (hSOD) eredményezheti-e az IS csökkenését, összehasonlítva a reperfüzióval egyedül, 16 érzéstelenített kutyában a circumflexus szívkoszorúér artériát elzárjuk bármelyik oldal elágazás előtt 90 percre; a reperfüzió idejekor az állatokat injektáljuk vagy hSOD-vel (400 000 egység egy kapszulában a bal pitvarba, ezt követi 300 000 egység 1 órás intravénás infúzió formájában, n = 8), vagy hasonló mennyiségű sóoldattal (kontroll, n = 8). A mellkast ezután zárjuk, és az állatokat hagyjuk magukhoz térni. 48 óra múlva a kutyákat elpusztítjuk, és a szívüket vak módszerrel ISértékelésnek vetjük alá általános patológiai mérést és a károsodott terület mérését végezve post mortem angiográfiával. A circumflexus artéria proximális elzárása a bal szívkamra (LV) 40,8+2,3%-os iszkémiáját eredményezi a kontrollokban és 41,8+2,0%-os iszkémiáját a kezelt kutyákban. A kontroll kutyákban a reperfüzió 52,2+7%-os veszélyeztetett területű infarktussal társul; a hSOD kezelés azonban a nekrózis jelentős csökkenését idézi elő, az IS 33,6 + 2,1% veszélyeztetett területre terjed ki. A kontroll állatokban összefüggő, nem transzmurális infarktus fejlődik ki, amely kiterjed a veszélyeztetett terület legnagyobb részén keresztül, míg a kezelt állatokban az infarktus foltokban, nem összefüggően tűnik fel. Következésképpen a reperfüzió ideje alatt beadott hSOD által végzett szabadgyök-elnyelés jelentősen csökkenti a nekrózis kiterjedését, valószínűleg a visszatöltési sérülések megakadályozása révén.

31. példa

Az oxigén szabadgyökök szerepe a hideg, tartósított iszkémiás vesék reperfűziös sérüléseinek közvetítésében (Az ebben a példában alkalmazott rövidítések: C_CR: kreatinin felszabadulás; ATP: adenozin trifoszfát; ADP: adenozin difoszfát; AMP: adenozin monofoszfát).

Egy új alkalmazási területen a humán szuperoxid diszmutáz csökkentheti a reperfüziós sérüléseket a szervek transzplantációját követően. Az itt következő példa azt demonstrálja, hogy a szuperoxid diszmutáz enyhíti a vese transzplantációját követő reperfúziónál fellépő sérüléseket. Az ebben a példában alkalmazott humán szuperoxid diszmutázt a pSODpiTll gazdaszervezetvektor-rendszer termelte, a 3. példában leírt E. coli A1645-ben, a növesztés és tisztítás a 26. példában leírt módon történt.

A zárójelben levő arab számok, amelyek ebben a példában találhatók több helyütt, a jelen példa végén található bibliográfia számaira utalnak.

A vese tartósítási és átültetési iszkémia modellje sertésekben.

Nőstény, tenyésztett, 15-18 kg-os sertéseket előkezelünk acepromazinnal és atropinnal, és érzéstelenítünk ketaminnal és halotánnal. A donor sertésekben diurézist alakítunk ki 30 perccel a begyűjtés előtt 1500 ml Ringerféle laktát, 20 mg füroszemid és 12,5 g mannit beadásával. Fenoxi-benzamint (50 mg) adunk be intravénásán, hogy megakadályozzuk a vese-érgörcsöt, amely gyakran észlelhető sertésekben. Egy középvonali hasi metszésen át a disztális aortát és a véna cava-t mobilizáljuk, éppen proximálisan az elágazásuktól. Az urétereket elvágjuk és elosztjuk a húgyhólyag szintjénél. Beáramló katétert helyezünk az aortába, éppen az elágazás fölött, és egy kimenő katétert helyezünk el a felső véna cava-ba. 5000 egység heparint adunk be intravénásán, és folyamatos áramlást indítunk be Euro-Collins oldattal 4 °C hőmérsékleten a disztális aortán át, az aorta kereszt-leszorításával egybeesőén, éppen a vese-artéria fölött. Miután a veséket lehűtöttük in situ, eltávolítjuk mindenestől. A veséket ezután elkülönítjük, és egyet kontrollnak nevezünk ki, egyet vizsgálati vesének, így megkönnyítjük a párban történő tervezést. Ezután mindegyik vesét újra átáramoltatjuk 4 °C hőmérsékleten Euro-Collins oldattal. Amikor a munkamenet szükségessé teszi, vizsgálandó anyagokat adunk a második vese tartósító folyadékába ekkor. Mindkét vesét sterilen becsomagoljuk és 4 °C hőmérsékleten egy éjszakán át tároljuk.

órás hideg-iszkémia után friss befogadó állatot érzéstelenítünk, és a tartósított veséket transzplantáljuk ennek hasüregébe. Az egyes anasztomózisokhoz szükséges idő 25-30 perc. Mindig a kontroll (kezeletlen) veséket transzplantáljuk először, a vizsgálati vesét másodszor. A vizsgálati vese reperfüziója ezért összesen

HU 215 160 Β egy órával van a kontrollvese reperfüziója mögött. Ez azt jelenti, hogy a kontrollveséket 23 órás hidegiszkémiának tesszük ki, a vizsgálati veséket 24 órásnak. Az SÓD analógot intra-artériásan adjuk be, egy órával a kontrollvesék reperfúziója után kezdve, a vizsgálati vesék reperfuziójakor. így a kontrollveséket az újra melegítés és reperfuzió toxikus hatásának tesszük ki egy órával azelőtt, mielőtt a vizsgálati vese számára adandó szerek bármilyen lehetséges hatásának kitennénk. A második vese reperfúzióját követően a befogadó sertés natív veséit eltávolítjuk. További 10 g-os adag mannitot adunk először a kontroll reperfuziója előtt, majd a vizsgálati vese reperfuziója előtt újra, hogy utánozzuk a klinikai gyakorlatot. Ez lehetővé teszi a szabadgyök-módosító szerek hatásának értékelését, amelyek többletet jelentenek a hagyományos, optimális tartósítási/transzplantációs technikákhoz képest. Az urétert az egyes vesékből külön-külön kivezetjük, mint bőr alatti uréter-húgyvezetéket.

A transzplantáció után két nappal a befogadó sertést enyhén érzéstelenítjük, és vizeletet gyűjtünk egy órán át mindegyik veséből (uréter-húgyvezetéken át) külön-külön, és mérjük a térfogatot és a kreatinin-koncentrációt. Meghatározzuk a szérum kreatinin koncentrációját is, lehetővé téve a kreatinin-felszabadulás kiszámolását mindkét veséből külön-külön.

Mindegyik eredményt átlagban fejezzük ki ± SEM. Az adatokat Student t-vizsgálat (két-farkú) útján elemezzük. Legtöbb esetben a párban végzett vizsgálatot tudjuk alkalmazni a kísérletek páros tervezése következtében.

A kísérleti munkamenet a következő:

Szuperoxid diszmutáz (SÓD) és kataláz

Sigma-gyártmányú szarvasmarhavér szuperoxid diszmutázt, mint oxigén szabadgyökök elnyelőjét, vezetjük be a vizsgálati vesékbe négy sertésben. Egy 5 mg-ot tartalmazó ampullát adunk be a vese-artériába közvetlenül a reperfuzió előtt, és állandó intra-artériás infúziót tartunk fent 1 mg/perccel a reperfuzió első 15 percében. Ez 20 mg SÓD teljes dózisát nyújtja.

Egy négy sertésből álló második csoportban a vizsgálati vesék katalázt (Sigma Co. gyártmánya) kapnak azonos adagolási rendben az SOD-on kívül. A sertések mindegyikében a másik vese nem kap kezelést, ezek szolgálnak kontrollként.

Dózis-válasz SOD-re

Abból a célból, hogy meghatározzuk a maximális védelmet szolgáló minimális dózist, tanulmányozzuk a dózis-válasz kapcsolatot. Az érrendszer helyreállításánál az egyik vese két dózis kisebbikét jelentő infúziót kapja, míg a másik vese a következő magasabb dózist. A 9. példában leírt módon előállított humán rekombináns SOD-t adunk be, amint fentebb leírtuk. Mindegyik dózistartományban két összehasonlítást végzünk. Az elsőben 0,2 mg SOD-t hasonlítunk össze a kontrollal. Lépésről-lépésre haladva 0,2 mg-ot összehasonlítunk 2 mg-al, 2 mg-ot összehasonlítunk 20 mg-al, végül 20 mg-ot 100 mg-al. Mindegyik esetben úgy végezzük a transzplantálást, hogy a kisebb dózist befogadó vesét transzplantáljuk először, abból a célból, hogy elkerüljük az SÓD visszatartás lehetséges problémáját a vérkeringésben a második transzplantáció idejében.

Az eredményeket az alábbiakban szemléltetjük.

A szarvasmarha SÓD és kataláz hatása.

A kreatinin-felszabadulás egy normál egyedi vesénél a mi általunk alkalmazott méretű sertésekben az érzéstelenítés és vízfelvétel fenti körülményei között 25,5 ± 6,3 ml/perc (n = 8). Az SÓD beadása 20 mg-os adagban a vese-artériába a reperfúzió első 15 percében lényegesen javítja a veseműködés leromlását a hidegiszkémia után. Az SOD-vel egyedül kezelt négy vese kreatinin-felszabadulása 23,2 ± 4,5 ml/perc, amely csaknem háromszorosa a kontrollvesék hasonló értékeinek (8,4 ± 1,7 ml/perc, p 0,05). Az SÓD és kataláz kombinációja hasonló, de nem nagyobb, védelmet nyújt (C_Cr = 19,0 ± 4,5 ml/perc). A korai modell kísérletekben négy sertés elkülönített csoportját transzplantációnak vetjük alá 40 percet meghaladó anasztomózisos időn át. Bár a veseműködés SÓD és kataláz együttes beadására jelentősen növekedik ezekben az állatokban, mind a kezelt, mind a kontrollveséknek nagyon gyenge a működése (C_CR = 4,8 ± 0,8 az 1,6 ± 0,4 ml/perchez viszonyítva). Ezekben a vesékben, amelyek valószínűleg sokkal súlyosabb sérülésnek voltak kitéve magának a reperfúzió előtti iszkémiának következtében, a szabadgyökös sérülések módosítása már nem volt képes helyreállítani a normális veseműködést.

Humán SÓD analóg dózis-válasz összefüggése.

Humán SÓD analóg (0,2 mg és 2 mg) infúziója nem nyújt javulást a veseműködésben a kontrollokhoz viszonyítva. Azoknak a veséknek az átlagos kreatinin felszabadulása, amelyek 20 mg SÓD analógot kapnak, 14,2 + 1,1 ml/perc, ez lényegesen jobb, mint a párjaiké, amelyek 2 mg-os infúziót kapnak (7,7 ±1,0 ml/perc, p 0,05). További előnyök nem jelentkeznek 100 mg SÓD analógnál (C_CR = 16,1 ± 1,2 ml/perc). Ennél fogva az SÓD analóg minimális hatásos dózisának a több, mint 2 és kevesebb mint 20 mg bizonyul, amikor ilyen módon adagoljuk be. A humán SÓD analóg éppen olyan hatásos, mint a szarvasmarha SÓD.

Az alábbiakban megtárgyaljuk a fenti eredményeket.

A páros tervezést alkalmazzuk, hogy maximálisan kihozzuk a különbségeket, amelyek az alkalmazott kezelési menetrendnek tulajdoníthatók, és szabályozzuk a zavart keltő változókat, amelyek az egyes donor és befogadó állatokra vonatkozhatnak. így az eredmények páros statisztikai elemzését tudják adni, amely lehetővé teszi a viszonylag drága kísérleti állatok optimális alkalmazását.

Ezeknek a tanulmányoknak a feltűnő felfedezése a szabad gyökök által közvetített reperfúziós sérülések eltüntetése által nyújtott előny nagysága. Annak a ténynek ellenére, hogy a kontrollvesék a hagyományos optimális módszerek előnyeit kapták a szervtartósításhoz, beleértve az egészséges donor-veséket és befogadó állatokat, a vízellátást, az alfa-adrenerg blokkolókat, és a diurézist, ezek súlyos működési zavarokat mutatnak, a kreatinin felszabadulás szintje például a normális érték kevesebb, mint harmadára csökken. Az iszkémiás tárolásnak ez a 24 órás időtartama, amint ez

HU 215 160 Β gyakran megtörténik hagyományos klinikai körülmények között, meghaladja a hagyományos szervtartósítási képességeket. A kezelés hatásos dózisú szarvasmarha- vagy humán SÓD analóggal drámai hatású ennek a sérülésnek a megelőzésében, megőrizve a vesefunkciót csaknem normális szinten. Sőt, nem egy ilyen módon kezelt vese legalább kétszeres kreatinin-felszabadítási értéket mutat, mint a vele párban levő, kezeletlen kontroll, amikor a transzplantáció után 48 órával mérjük. Ennek az előnynek a nagyságrendje ezért kvantitatíven nagyobb, mint amelyet másoknál látunk 45-60 perces meleg iszkémiát követően, ez azt sugallja, hogy hagyományos optimális megőrzési technikákkal az önmagában való iszkémia következtében fellépő sérülés minimális lesz, lehetővé téve, hogy a reperfuziónál előállott sérülés váljon uralkodóvá. Ezt a szemléletet tovább támogatják a reperfúzió előtt 18 órával megőrzött vesékkel végzett tanulmányok. Ezekben a vesékben a működés kiváló mind a kontroliban, mind a kezelt csoportban, azt sugallva, hogy nem telik el elegendő idő, amely lehetővé teszi elég metabolit felhalmozódását, amely létrehozná a szabadgyökök képződéséhez kedvező feltételeket a reperfuziónál. Másrészt amikor a veséket súlyosabb mértékű önmagában való iszkémiának tesszük ki, mint a korai minta-kísérletekben megnyújtott anasztomózis (azaz meleg iszkémia) időkkel, az SÓD nem képes helyreállítani a működést a közel normális szintre, bár jelentős javulás látható azért. Ezek a vesék ezért inkább analógok azokkal a vesékkel, amelyeket meleg iszkémia rövidebb periódusai után tanulmányoztak (7, 8, 9). Mint más szervekben, a szabadgyök okozta sérülését elkerülésének előnyei elsősorban azoknak a sérüléseknek a relatív arányaira vonatkoznak, amelyek magának az iszkémiának tulajdoníthatók, összehasonlítva a reperfüziónak tulajdonítható sérülésekkel.

Ezen túl az előny ilyen növekedésének elérése, úgy tűnik, vagy teljes mértékben megvalósul, vagy egyáltalán nem. Az SOD-vel végzett dózisválasz tanulmányok vagy maximális védelmet mutatnak, vagy egyáltalán nincs semmiféle védelem. A kataláz nem nyújt további előnyöket, ha az SOD-hez, mint egyedi anyaghoz adjuk. A jelen találmány megoldásának kvantitatív korlátain belül a reperfüziós sérülés megelőzése, úgy tűnik, minden, vagy semmi jellegű tünet.

A jelen találmány felfedezései azonban, úgy tűnik, főleg a klinikai alkalmazáshoz lényegesek. A választott hideg iszkémia 24 órás periódusa jól megfelel a klinikai körülmények által megkövetelt tetem szövetátültetési megőrzési periódusnak. Ezen kívül a tanulmányok kiértékelik a szabadgyökös, reperfüziós sérülés eltüntetésének hatását a hagyományos optimális megőrzéssel és transzplantációs módszerekkel szemben. Ez utóbbi magában foglalja a mannit alkalmazását, amely maga egy hatásos hidroxil-gyök befogó. Ezek a tanulmányok ezért azt sugallják, hogy hasonló mértékű előnyt lehet nyerni a szabad gyökök eltüntetésének hozzátételével a jelen klinikai gyakorlathoz. Mivel az SÓD nem toxikus anyag, ez a megközelítés ígéretesnek látszik.

A fejezethez tartozó bibliográfiát az alábbiakban közöljük.

1. Parks, D. A., Bulkley, G. B., Granger, D. N., Hamilton, S. R., McCord, J. M.: Ischemic Injury to the Cat Small Intestine. Role of Superoxide Radicals (Iszkémiás sérülés macska vékonybeleknél: a szuperoxid gyökök szerepe). Gastroenterology, 82, 9 (1982).

2. Manson, P. N., Anthenelli, R. M., lm, M. J., Bulkley, G. B., Hoopes, J. E.: The Role of Free Oxygen Radicals in Ischemic Tissue in Island Skin Flaps (A szabad oxigéngyökök szerepe az iszkémiás szövetben, elszigetelt bőrlebenyekben). Ann. Surg. 198, 87 (1983).

3. Shlafter, M., Kané, P. F., Kirsh, Μ. M.: Superoxide Dismutase Plus Catalase Enhance the Efficiacy of Hypothermic Cardioplegia to Protect the Globally Ischemic, Reperfused Hearth (A szuperoxid-diszmutáz és kataláz növelik a hipotermikus kardioplegia hatásosságát, hogy megvédje az általánosan iszkémiás, reperfuziónak alávetett szívet). J. Torac. Cardiovasc. Surg. 83, 830 (1982).

4. Stuart, R. S., Baumgartner, W. A., Borkon, A. M. és munkatársaik: Five-Hour Hypothermic Lung Preservation With Oxygen Free-Radical Scavengers (Öt órás hipotermikus tüdő-megőrzés oxigén-szabadgyököt befogó anyagokkal). Transplant. Proc. 17, 1454(1985).

5. Sanfey, H., Bulkley, G. B., Cameron, J. L.: The Role of Oxygen Derived Free Radicals in the Pathogenesis of Acute Pancreatitis (A szabadgyökökből származó oxigén szerepe az akut hasnyálmirigy-gyulladás patogenezisében). Ann. Surg. 200, 405 (1984).

6. Hansson, R., Gustavsson, B., Johnsson, O. és munkatársaik: Effect of Xanthine Oxidase Inhibition on Renal Circulation Afiter Ischemia (A xantin-oxidáz gátlás hatása a vese cirkulációjára iszkémia után). Transplant Proc. 14,51 (1982).

7. Ouriel, U., Smedira, N. G., Ricotta, J. J.: Protection of the Kidney After Temporare Ischemia: Free Radical Scavangers (A vese védelme átmeneti iszkémia után: szabadgyök-befogók). J. Vasc. Surg. 2, 49 (1985).

8. Peller, M. S., Hoidal, Jr., Ferris, T. F.: Oxygen Free Radicals in Ischemic Acute Renal Failure in the Rat. (Oxigén szabadgyökök iszkémiás akut vese-elégtelenségben, patkányban). J. Clin. Invest. 74, 1156 (1984).

9. lm, M. J., Shen, W. H., Pák, C. I., Manson, P. N., Bulkley, G. B., Hoopes, J. E.: Effect of Allopurinol on the Survival of Hyperemic Island Skin Flaps (Az allopurinol hatása a hiperémiás, elszigetelt bőrlebenyekben). Plast. Recontr. Surg. 73, 276 (1984).

10. Parks, D. A., Bulkley, G. B., Granger, D. N.: Role of Oxygen Free Radicals in Shock, Ischemia, and Oxygen Preservation. (Az oxigén szabadgyökök szerepe sokkban, iszkémiában és szövet-tárolásban). Surgery 94, 428 (1983).

11. Toledo-Pareyra, L. H., Simmons, R. L., Najarian, J.

S.: Effect of Allopurinol on the Preservation of Ischemic Kidneys Perfused with Plasma or Plasma Substitutes (Az allopurinol hatása a plazmával vagy plazmapótlóval perfüziónak alávetett iszkémiás vesék megőrzésére). Ann. Surg. 180, 780 (1974).

HU 215 160 Β

12. Vasco, K. A., DeWall, R. A., Riley, A. M.: Effect of Allopurinol in Renal Ischemia (Az allopurinol hatása a vese-iszkémiára). Surgery, 71, 787 (1972).

13. Owens, M. L., Lazarus, Η. M., Wolcott, M. W., Maxwell, J, G., Taylor, J. B.: Allopurinol and Hypoxanthine Pretreatment of Canine Kidney Donors (Kutyavese donorok allopurinolos és hipoxantinos előkezelése). Transplantation, 17, 424 (1974).

14. Granger, D. N., Rutilli, G., McCord, J.: Superoxide Radicals in Feline Intestinal Ischemia (Szuperoxid diszmutáz a macskabél iszkémiában). Gastroenterology, 81, 22(1981).

15. Roy, R. S., McCord, J. M.: Superoxide and Ischemia: Conversion of Xanthine Dehydrogenese to Xanthine oxidase (Szuperoxid és iszkémia: a xantindehidrogenáz átalakulása xantin-oxidázzá). A Greenwald, R. és Cohen, G. szerkesztők által összeállított következő kiadványban: Oxyradical and Their Scavanger Systems (Vol. 2). Cellular and Molecular Aspects (Oxigén-gyökök és befogó rendszereik (2. kötet). Sejt- és molekuláris szempontok). Kiadó: Elsevier Science, 145, (1983), New York.

16. Toledo-Pareyra, L. H., Simmons, R. L., Olson, L.

C., Najarian, J. S.: Clinical Effect of Allopurinol on Preserved Kidneys: A Randomised Double—Blind Study. (Az allopurinol klinikai hatása a tárolt vesékre: véletlenszerű kettős vak tanulmány). Ann. Surg. 185, 128 (1977).

17. Parks, D. A., Granger, D. N., Bulkley, G. B.: Superoxide Radicals and Mucosal Lesions of the Ischemic Small Intestine (Abstract) (A szuperoxid diszmutáz és az iszkémiás vékonybél nyálka-elváltozásai (Kivonat) (Fed. Proc. 41, 1742 (1982).

18. Casale, A. S., Bulkley, G. B„ Bulkley, Β. H., Flaherty, J. T., Gott, V. L., Gardner, T. J.: Oxygen Free Radical Scavangers Protect the Arrested, Globally Ischemic Heart Upon Reperfusion (Az oxigén-szabadgyök befogók megvédik a rögzített teljesen iszkémiás szívet a reperfúzió alkalmával). Surg. Fórum 34, 313 (1983).

32. példa

Az izolált nyúl szaruhártya túlélése és a szabadgyök-befogók

A pSODplTll gazdaszervezetvektor-rendszer által, E. coli Al 645-ben a 3. példa szerint termelt, és a 26. példában leírt módon történő növesztéssel és tisztítással előállított humán szuperoxid diszmutázról azt mutatjuk be, hogy meghosszabbítja a kimetszett, izolált szaruhártyák túlélési idejét.

A jelen példa során található, zárójelben levő számok azokra a közleményekre vonatkoznak, amelyek a jelen példa végén található bibliográfia felsorol.

A korábbi tanulmányok megállapították az adenozin kis koncentrációjának előnyös hatásait a nyúl szaruhártya endotéliális „szivattyú”-jára in vitro (1). A folyadékszivattyú aktiválását úgy kapjuk meg, hogy az izolált szaruhártyát perfúziónak vetjük alá fiziológiás koncentrációjú glükózzal (5 mmol/1) és adenozinnal (10^-6 mol/l), kiegyenlített sóoldatban, a túlélési idő mintegy 7 óra.

Legközelebbi célunk az, hogy növeljük a túlélési időt. A szuperoxid-diszmutáz (SÓD) (2), befogja a szuperoxid szabadgyököt, katalizálva a következő reakciót:

O₂ ^— + O₂“ + 2H+ —> H₂O₂ + O₂

Az SÓD beadásáról ismeretes, hogy jelentősen növeli az iszkémiás szövetek túlélését részleges oxigénhiány után (3).

Az iszkémiából kialakuló szövetkárosodás jelentős mértéke következik be a reperfúzió és az izolált szövetek re-oxigenálásának időtartama alatt. A sérülések nagy részét a szuperoxid-gyök és származékai közvetítik. A jelen találmány célja, hogy meghatározza, vájjon a szuperoxid-diszmutáz vagy a kataláz képes-e megnyújtani az izolált szaruhártya túlélését.

Szaruhártyákat izolálunk 2,0-3,0 kg-os albínó nyulakból. Az alkalmazott technikák részleteit korábban leírták (1). Röviden, a szemeket kimetsszük és a szaruhártya epitheliumot levakarjuk, ezután a szaruhártyákat izoláljuk, amint leírtuk, majd perfüziónak vetjük alá. Az eredményeket az alábbiakban szemléltetjük. 2 pg/ml SÓD analóg hozzáadása az 5 mmol glükózt és 1 pg adenozint tartalmazó alap-sóoldathoz (Basal Salt) meghosszabbítja az izolált szaruhártya túlélési idejét 7 és 14 óra közé. Ha az adenozint eltüntetjük, a túlélési időt csupán 12 órára hosszabbíthatjuk meg.

Összefoglalva az SÓD analóg hasznosnak bizonyul az izolált szaruhártyák túlélési idejének meghosszabbításában. Az SÓD analóg fontos lehet a más izolált szervek túlélésének meghosszabbításában. Hasonló adatokat publikáltak szarvasmarha SOD-t alkalmazva, például az Experimental Eye Research, 4, 153-154 (1985) c. kiadványban.

Az alábbiakban közöljük a jelen példa bibliográfiáját.

1. Neuwirth, O. és Dikstein, S.: The effect of cyclic AMP on the rabbit comeal endothelial fluid pump. (A ciklikus AMP hatása a nyúl szaruhártya endotéliális folyadék-szivattyújára). Current Eye Rés. 2(8), 565-567 (1983).

2. Fridovich, I.: Superoxide dismutases (Szuperoxid diszmutázok). Ann. Rév. Biochem. 44, 147-159 (1975).

3. Manson, Ρ. N., Róbert, M., Anthenelli, Μ. M., Michael, J., Bulkley, G. B. és Hoopes, J. E.: The role of oxygen-free radicals in ischemic tissue injury in Island skin flaps (Az oxigén szabadgyökök szerepe az elszigetelt bőrlebenyekben levő iszkémiás szöveti sérülésekben). Ann. Surg. 198, 87-90 (1983)

4. Michaelson, A. M. és Puget, K.: Cell penetration by exogenous superoxide dismutase (Sejt-áthatolás az exogén szuperoxid diszmutáz révén). Acta Physiol. Scand. Suppl. 492, 67-80 (1980).

5. Perlman, M. és Baum, J. L.: The mass culture of rabbit comeal endothelial cells (Nyúl szaruhártya sejtek tömegtenyésztése). Arch. Ophtalmol. 92, 235-237 (1974).

6. Klyce, S. és Maurice, D. M.: Automatic recording of comeal thickness in vitro (Szaruhártya vastagság mérés automatikus rögzítése). Invest. Ophtalmol. 15, 550-553 (1976).

7. Neuwirth Lux, O.: Survival of rabbit corneal endothelial pump (Nyúl szaruhártya endotheliális szi43

HU 215 160 Β vattyú túlélése). Doktori értekezés. Benyújtva a Hebrew University (Jeruzsálem) Tanácsához (1984).

33. példa

A p9200 megalkotása és bGH előállítása p9200-at alkalmazva E. coli A1645-ben és A4255-ben

A p9200 megalkotását a 26. ábrában mutatjuk be és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben. pHG44-et hasítunk Clal-el és Pstl-el, „betöltjük” DNS polimeráz I Klenow-fragmenst alkalmazva, majd a nagy DNS fragmenst izoláljuk. Ezt a fragmenst olyan DNS fragmenshez ligáljuk, amely tartalmazza a pBR322 tetraciklin rezisztencia génjét; ez utóbbi fragmenst úgy izoláljuk, hogy pBR 322-t hasítunk EcoRI-vel és A val-el, majd „betöltjük” DNS polimeráz I Klenow-fragmensét alkalmazva. Az így létrejött p9200 plazmidot az ATCC-nél letétbe helyeztük ATCC 53 215 letéti számon.

A p9200 plazmid hasonló a pHG44-hez (6. ábra), a plazmid azonban tetraciklin rezisztenciát ad át ampicillin rezisztencia helyett. A p9200 plazmidot E. coli A1645 és A4255 törzsekbe vezetjük be transzformálással, olyan ismert módszereket alkalmazva, amelyek ismeretesek azok számára, akik a szakterületen átlagosan járatosak. Ezek a törzsek növesztésre és indukcióra egy szarvasmarha növekedési hormon (bGH) analógot termelnek, amely met-asp-gln aminosav-szekvenciával rendelkezik az autentikus bGH fenilalaninformájának amino-terminálisához hozzátéve. Az ezek által a törzsek által termelt bGH analóg mennyisége durván ekvivalens azzal, amelyet a pHG44 termel.

Az A1645/p9200 (A1645 gazdaszervezet p9200-al transzformálva) törzs növesztéséhez, a bGH analóg kinyeréséhez és a bGH analóg tisztításához alkalmazott módszer azonos azzal, amelyet a 13. példában a pHG44hez leírtunk, azzal a különbséggel, hogy 12,5 mg/1 tetraciklint adunk 100 mg/1 ampicillin helyett.

Az A4255/p9200 törzs, amelyet A4320-nak nevezünk, növesztéséhez és indukálásához alkalmazott módszerek a 36. példában vannak leírva. A bGH analóg tisztításához alkalmazott módszerek azonosak azzal, amelyeket a pHG44-hez a 13. példában leírtunk.

Az A4320 törzset (A4235 gazdaszervezet p9200 plazmiddal transzformálva) letétbe helyeztük az ATCC-nél ATCC 53 215 letéti számon.

Az ampicillin gén helyettesítése a tetraciklin génnel előnyös annyiban, hogy az ampicillint így ki lehet küszöbölni a termelési folyamatból, ezáltal ki lehet küszöbölni a végtermék lehetséges szennyezését ampicillinnel, amely súlyos allergiás reakciókat okozhatna.

34. példa met-leu-leu-leu-met humán ApoE-analóg termelése

A pTVR 279-8 plazmid irányítja egy új apolipoprotein E3 analóg kifejeződését. Ennek az analógnak az N-terminális szekvenciája met-leu-leu-leu-met, és ezt követő az érett apolipoprotein E3 szekvenciája.

A pTVR 279—8 megalkotása

A pTVR 279-8 megalkotását a 25. ábrában mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben.

A pTVR 279-8 plazmidot az ATCC-nél letétbe helyeztük ATCC 53216 letéti számon.

A pTV 190 plazmidot (21. ábra) részlegesen emésztjük Aval-el, „betöltjük”, DNS polimeráz I Klenow-fragmensét alkalmazva, ligáljuk, és E. coliba transzformáljuk. Az így létrejött plazmidot, amelyben a 3’ Aval hely el van tüntetve, pTV 264—45-nek jelöljük, ezt Ndel-el teljesen emésztjük, és a következő szintetikus oligo-nukleotidokhoz ligáljuk.

N° 1217 5-TATGCTGCTGCT

N° 1218 ACGACG ACG A AT-5 ’

Az így létrejött plazmidot, amelyet pTVR 279-8nak nevezünk, E. coli Al645-be transzformáljuk, olyan módszereket alkalmazva, amelyek ismeretesek azok számára, akik a szakterületen jártasak. A plazmidot tartalmazó törzseket telep-hibridizálással azonosítjuk, ³²Pvel jelzett N° 1218-as oligonukleotidot alkalmazva vizsgáló mintaként. A plazmid azonosságot DNS-szekvencia-analízissel igazoljuk. A pApoE Ex2-t tartalmazó A1645 törzset az ATCC-nél letétbe helyeztük ATCC 39 787 letéti számon.

A pTVR 279-8 növesztésre és indukcióra egy humán apolipoprotein E 3 analógot termel, amely met-leu-leu-leu-met aminosav-szekvenciával rendelkezik a természetes apolipoprotein E 3 N-terminálisához hozzátéve. A törzs növesztéséhez alkalmazott módszerek azonosak azzal, amelyeket a pTV-Ι 70-hez írtunk le a 17. példában, azzal a kivétellel, hogy az indukció időtartama 42 °C hőmérsékleten 1-5 óra, 15 perc helyett.

A pTVR 279-8 olyan ApoE3 analógot termel, amely a baktériumokra kevésbé toxikus, mint a pTV 170 és a pTV 190 által termelt met-ApoE3 analóg. A met-leu-leu-leu-met-ApoE3 analóg a sejtben még az indukció 60 perce után is folyamatosan akkumulálódik 42 °C hőmérsékleten, elérve a 400-600 mg/liter tenyészet szintet.

35. példa

Humán növekedési hormon analóg termelése pTV300 megalkotása

A pTV300 megalkotását a 27. ábrán mutatjuk be, és le is írjuk az „Ábrák leírása” című részben. A plazmidot úgy alkotjuk meg, hogy a pTV 18(1) plazmidból származó hGH gént beiktatjuk a p579 (19. ábra) Ndel helyébe. A pTV 18(1) megalkotása a 0 131 843 Al számú Európai szabadalmi közrebocsátási iratban van befoglalva (megjelent: 1985. január 23.), valamint az ennek megfelelő 514, 188 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben (benyújtva 1983. július 15-én); ezek ide referenciaként be vannak építve. hGH analóg szintézise

A pTV 300-at bevezetjük E. coli A1645 törzsbe transzformációval, olyan módszereket alkalmazva, amelyek ismertek azok számára, akik a szakterületen átlagosan jártasak. Ez a törzs növesztésre és indukcióra egy humán növekedési hormon analógot termel, amelyből törölve van a természetes növekedési hormon első 13 aminosava. A törzs növesztéséhez és a hGH tisztításához alkalmazott módszerek azonosak azzal, amelyeket a 13. példában leírtunk.

HU 215 160 Β

36. példa

Prototróf törzsek megalkotása, és bGH előállítása prototróf gazdaszervezetek alkalmazásával

E. coli prototróf törzseit alkotjuk meg, amelyek képesek magas szintű fehéqe-kifejeződésre több, korábban leírt plazmid segítségével abban az esetben is, amikor minimál tápközegen nőnek. A bakteriális növesztési munkamenet előnyei, amikor minimál tápközeget alkalmazunk, a következők:

a) a baktériumok nagyobb sejtsűrűségig képesek nőni;

b) a növesztési körülményeket könnyebb lemásolni, mivel a tápközeg-alkotórészek „egyszerűbbek” és ezért jobb minőségűek; és

c) a tápközeg gazdaságosabb.

A találmány szerinti előnyös prototróf törzsek az A4200, A4255 és A4346 jelűek. A p9200 plazmidot tartalmazó A4255 törzset az ATCC-nél letétbe helyeztük ATCC 53 215 letéti számon, ezt a következőkben A4320-nak hívjuk.

A prototróf törzsek kiválasztása és megalkotása.

A következő törzseket vizsgáljuk át minimál tápközegen való nagy növekedési sebességekre, valamint λ; Á434; és Pl fágokra való érzékenységre:

Törzs

1. ATCC 12435

2. ATCC 23 716

3. ATCC 27 662

4. ATCC 25404

5. ATCC 11775

6. ATCC 25254

7. HfrC = A4134

8. W3350 = A2509

9. A1645

Ezeknek a tanulmányoknak az eredményeire támaszkodva az ATCC 12 435 és ATCC 25 404 törzsekre alapozott prototróf törzsek kifejlesztését vesszük célba, mert ezek a törzsek érzékenyek a fentebb felsorolt fágokra és igen nagy növekedési sebességeket mutatnak. Ezt a két törzset alkalmazva új törzseket alkotunk meg, amelyek tartalmazzák a XcI857 represszort, a megalkotást olyan módon végezve, hogy átfertőzzük a törzseket XcI857 Δ Hl Δ BamHI:TnlO-et tartalmazó Pl-el. A tetraciklin-rezisztens telepeket tisztítjuk, és megszabadítjuk a Pl-től, ha szükséges.

Az így létrejött törzsek és genotípusaik a következők:

A4200 = ATCC 12 439 (LcI852DHlDBamHI):TnlO

A4206 = ATCC 25 404 (λοΙ85 ΔΗΔ ΒαμΗΙ):Τν10 Mindkét törzset pHG44-el transzformáljuk, így nyerve az A4202, illetve A4207 törzseket.

Növesztés és indukció

Az A4202 és A4207 törzseket a következő körülmények közt növesztjük és indukáljuk, és az alábbi módon mérjük a szarvasmarha növekedési hormon analóg termelését.

Tápközeg

Alkotórész Koncentráció

KH₂PO₄ 13,6 g/liter (NH₄)2SO₄ 2 g/liter

MgSO₄.7H₂O 0,2 g/liter

CaCl2	0,01 g/liter
FeSO4.7H2O	0,5 g/liter
pH 7,4
20%-os glükóz-oldat	25 ml/liter
20 mg/ml-es ampicillin-oldat	1 ml/liter
0,3%-os Bl oldat	1 ml/liter
0,3%-os biotin oldat	1 ml/liter.

Mind az A4202, mind az A4207 jól nő minimál tápközegben; csak az A4202 fejez ki azonban bGH analógot jelentős szinten. Az A4202 durván azonos szinten fejez ki bGH analógot, mint a pHG44, amely dús táptalajon nő, amint ezt a 13. példában leírtuk.

A tetraciklin rezisztencia eliminálása az A4200-ból.

Abból a célból, hogy hasznosítsuk az A4200 törzset, amely csupán tetraciklin rezisztenciamarkert hordoz, megalkotunk egy TnlO markertól megszabadított törzset. Az A4200 törzset MacConkey galaktóz lemezekre szélesztjük, gal⁺ revertánsokat választunk ki, és tetraciklin-érzékenységre, valamint lambda-fágra való érzékenységre vizsgáljuk. Ezt a törzset A4255-nek nevezzük.

Biotintól független prototróf törzsek megalkotása.

Az összes fenti prototróf törzsek tartalmazzák a lambda cI857 delta Hl delta BamHI defektív profágot. A delta Hl deléció kiterjed a bio uvr B területre, eltávolítóvá a biotin bioszintetizáló operonokat. így a törzsek biotin hozzáadását igénylik a növesztő tápközeghez.

Hogy megszüntessük az A4200-ból és A4255-ből származó törzsek biotin-igényét, az A89 törzsből származó F’ episzómát vezetjük be ezekbe a törzsekbe.

Az A89 törzs egy F’ gal plazmidot hordoz. Bemutatjuk, hogy ez az F’ plazmid hordozza az összes olyan gént, amely a biotin endogén szintéziséhez szükséges. Számos tulajdonsága teszi ezt a plazmidot a bio operonok kényelmes forrásává:

1. F’ gal egy egység kópia plazmid.

2. A plazmid rendkívül stabil E. coli-ban.

3. Az F’ plazmid összeférhető colEl plazmiddal, amelyre a mi kifejeződő vektoraink alapozódnak.

4. Az F’ gal konjugációs plazmid. Ennél fogva könnyen lehet átvinni sejtről sejtre.

5. Könnyen lehet átvizsgálni biotintól független sejtekre.

Az A4202 törzset 30 percig konjugáljuk A89-el, és a biotintól független telepeket kiválasztjuk. Az így létrejött A4346 törzs magas szinten termel szarvasmarha növekedési hormon analógot, biotin távollétében minimál glükóz tápközegben végzett indukciót követően. Más növekedési faktor sem szükséges.

Az A4346-ot megszabadíthatjuk a pHG44-től olyan standard módszerekkel, amelyek ismeretesek azok számára, akik a szakterületen jártasak. Az így létrejött prototróf gazda-törzseket transzformálhatjuk az összes plazmiddal, amelyet ebben a bejelentésben leírunk.

Minimál tápközeg

Az állandóan alkalmazott minimál tápközeg termelési célokra a prototróf törzsekkel a következő:

HU 215 160 Β

	Fermentorokhoz	Rázólombikokhoz
K2HPO4	6 g/l	6 g/l
kh2po4	4 g/l	4 g/l
nh4ci	1 g/i	lg/1
MgSO4.7H2O	3 g/l	0,2 g/l
10%Fe(NH4)- citrát	0,3 ml/1	0,1 ml/1
Nyomelemoldat	3 ml/1	1 ml/1
Szilikon-habgátló	0,5 ml/1	-

A tápközegeket autoklávozzuk.

Ampiciílint (100 mg/1) vagy tetraciklint (12,5 mg/1) adhatunk a tápközeghez, attól függően, vájjon a törzs ampicillin- vagy tetraciklin-rezisztens.

50%-os glükózoldatot külön sterilezzük és külön adjuk hozzá 20 g/l koncentrációig. 50%-os glükózt táplálunk be a fermentáció során mintegy 1,08 g glükóz/OD egység sebességgel az F’ episzóma nélküli sejtekbe, vagy 1,8 g glükóz/2,0 OD egység sebességgel az A4346 törzsnél. A pH-t 25%-os NH₃ oldat betáplálásával szabályozzuk. Habgátlót szükség esetén adagolunk. Az A4200-re, A4255-re és A4206-ra alapozott törzsekhez 15 mg/1 biotint is adunk.

A nyomelemoldat a következőket tartalmazza [Biotechn. Bioeng. 16, 933-941 (1974)].

H3BO3	g/l 0,57
CuC12(CuSO4.5H2O)	1,0 (0,04)
CaCl2.2H2O	1,0
MnSO44H2O	0,81
Na2MoO4.2H2O	2,0
CaCl2.6H2O	2,0
ZnCl24H2O(ZnSO4.7H2O)	2,0 (2,78)
Koncentrált sósav	100 ml
A zárójelben levő vegyületek egy másik változatot

jelentő vegyületek, amelyeket az őket megelőző vegyületek helyett lehet alkalmazni. A zárójelben levő mennyiség az ilyen másik változatot jelentő vegyület megfelelő mennyiségére vonatkozik. A korábban leírt plazmidok legtöbbjét levezetjük A4200-be és A4255be. Ezeknek a törzseknek a részleges listáját az alábbi táblázat tartalmazza.

Törzs jele	Gazda-törzs/Plazmid
A4202	A4200/pHG44
A4256	A4255/pHG44
A4320	A4255/p9200
Z1803	A4255/pSODpiTl 1
A4500	A4255/pTV194
A4336	A4200/pHG44, F’ Gal
3 7. példa

Lizáló gazdaszervezet megalkotása és bGH termelése ezeket a lizáló gazdaszervezeteket alkalmazva 1. Az A4048 és A3111 törzsek megalkotása.

A W3350 törzset alkalmazzák kiterjedten a lambda-fág növesztésére [lásd például Oppenheim és Salomon: Virology, 41, 151-159 (1970)]. Az A2509 törzset, amely a W3350 prototróf származéka, megfertőzzük A1637-en növő PlcITs-el és megfertőzzük λοΙ857ΔΗ1 ABamHI defektív profággal is, amely a TnlO markert hordozza. Az így létrejött A4048 törzsek tetraciklin rezisztens klónként szelektáljuk, amely a XcI857AHlABamHI defektív profágot hordozza. Ez a törzs hordoz Plclts plazmidot is. Ezt a törzset pHG44el transzformáljuk, így jutunk az A3111 törzshöz.

Hasonlóképpen az A4085 törzset A2509-ből alkotjuk meg olyan módon, hogy ZcI857AHlABamHI-t iktatunk be, a TnlO transzpozont eltávolítjuk, és a plclts plazmidot kiiktatjuk a pHG-vel végzett transzformálás előtt. Az A4085 hordozza a XcI857AHlABamHI defektív profágot és kontrollként szolgál a bGH termelés méréséhez, és a Pl plazmid jelenléte nélkül végbement autolízishez. Az A3111 törzset letétbe helyeztük az ATCC-nél ATCC 53 217 letéti számon.

2. A szarvasmarha növekedési hormon (bGH) szintézise

Törzstenyészetek. Az A3111 (pHG44, A4048 sejtekben) törzstenyészeteit egy éjszakán át növesztjük 30 °C hőmérsékleten LB tápközegben, amely 50 μ g/ml ampiciílint (Amp) is tartalmaz. A tenyészeteket 50%-os glicerinnel kétszeresére hígítjuk és -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

Inokulum: az inokulumot 100 gg/ml Amp-ot is tartalmazó LB agar lemezeken nőtt A3111 egyedi telepeiből nyerjük. Az LB lemezeket viszont olyan anyagból szélesztjük, amelyet a törzstenyészetből vettünk.

Steril, 3 ml-es, 50 gg/ml Amp-ot is tartalmazó LB tápközeget inokulálunk A3111 egyedi telepeivel és 18 órán át növesztjük 30 °C hőmérsékleten, rázógépen, fürdőben.

Termelés: A bGH termelését BHI tápközegben hajtjuk végre [37 gg/l agy-szív infúzió (DIFCO), amely 50 gg/ml Amp-ot is tartalmaz]. Az inokulumot 1:100-ra hígítjuk egy friss BHI-t + 50 gg/ml Amp-ot tartalmazó lombikban, majd rázógépen, fürdőben növesztjük 30 °C hőmérsékleten, amíg a sejtkoncentráció eléri a 4*10⁸ sejt/ml (OD₆₆₀ = 0,5) értéket.

A bGH termelés indukciójához a lombikot átvisszük egy rázógépre, amely 42 °C hőmérsékletre beállított fürdőben van. Sejtmintákat veszünk a 0. és 90. percben az indukció megkezdésétől számítva.

A bGH termelés elemzése. A bGH termelést 10-26% gradiens akrilamid gélen elemezzük. A sejtmintákat mikrocentrifugában forgatjuk, a felülúszót eltávolítjuk, és az üledéket minta-pufferban (2% SDS, 50 mmol/liter trisz, pH 7,0, 3% szacharóz, 5% merkapto-etanol) feloldjuk, majd a gélre terheljük. 200 volton, 2 órán át végzett elektroforézis után a géleket Coomassie-kékkel festjük, és a bGH mennyiségét letapogatással határozzuk meg gél-letapogató (scanner) segítségével.

A 42 °C-on végzett indukció 90. perce után a bGH a teljes A3111 fehérje mintegy 20%-át alkotja.

HU 215 160 Β

3. Autolízis.

Az A3111 törzs hordoz pHG44-et, a XcI857AHlABamHI defektív profágot és egy stabil Plclts plazmidot. 42 °C hőmérsékleten végzett meghosszabbított indukció után a sejtek lizálódni kezdenek a Pl által irányított endolizin termelődése következtében. A tenyészet teljes lízisét 2,5-3 óra után érjük el.

A szabályozott autolízis vizsgálata: 5 ml A3111 tenyészetet veszünk ki 42 °C hőmérsékleten végzett indukció előtt és után (90 perc), és forgatjuk Sorvall centrifugában 7000 fordulat/percnél 7 percen át. A felülúszókat eltávolítjuk és az üledékeket -20 °C hőmérsékleten fagyasztjuk egy éjszakán át. Az üledékeket ezután újra szuszpendáljuk 0,5 ml TE pufferban (10 mmol) liter trisz, pH 8,0, 1 mmol/liter EDTA), és

0,1 ml-t felhígítunk 1:10 arányban TE pufferral, és az OD₆₀₀ értéket meghatározzuk.

Ennek a kísérletnek a kontrolljaként az A4085 törzset használjuk, amely, az A3111-hez hasonlóan, tartal5 mázzá a pHG44-et és a XcI857AHlABamHI defektív profágot, de nem hordozza a plclts plazmidot.

Egy ilyen kísérlet eredményeit az V. Táblázatban tüntetjük fel, amely azt mutatja, hogy a Plclts plazmidot hordozó sejtek (A3111) a fagyasztásra azon10 nal lizálódnak. A fagyasztott keverék megvizsgálása feltárja, hogy a sejtek több, mint 95%-a lizálódik ez után a kezelés után.

A lizálási folyamat egyszerűsíti a bGH kivonását az indukált sejtekből anélkül, hogy hatással lenne a bGH termelésre.

V. táblázat

Törzs	Plclts	Fagyasztás előtt	Fagyasztás után	%-os veszteség
A4085	-	0,980	0,851	14
A3111	+	0,543	0,08	86

38. példa

A Met-ApoE3 analóg biológiai aktivitása pTV baktériumot növesztünk, ahogyan ezt a 17. példában leírtuk.

A zárójelben levő számok a jelen példa végén található irodalmi hivatkozásokra vonatkoznak.

A bakteriális extraktumok elemzése

A bakteriális sejteket centrifugálással kinyerjük, és 50 mmol/literes foszfát pufferban (pH 7,5), amely 5 mmol/liter EDTA-t és 2 mmol/liter fenil-metil-szulfonil-fluoridot is tartalmaz, feloldjuk. Alikvotokat lizálunk 1,5 x-ös minta-pufferban (15% glicerin, 4,5% SDS, 1 mmol/liter β-merkapto-etanol, 93,5 mmol/liter triszHC1,0,25% brómfenolkék, pH 6,8), 100 °C hőmérsékleten 10 percen át melegítjük és a fehéijét 10%-os SDSpoliakrilamid-gélen elemezzük (26). A poliakrilamidgélen elkülönített fehérjéket vagy Coomassie brillant kékkel festjük, vagy elektroforetikusan átvisszük nitrocellulóz lemezre (27) és reagáltatjuk ¹²⁵I-vel jelzett anti-humán ApoE monoklonális vagy poliklonális IgGvel. Az immuno-foltokat mossuk, levegőn szárítjuk és röntgenfilmre exponáljuk.

ApoE izolálása

Autentikus ApoE-t izolálunk egy hiper trigliceridémiás (E313 fenotípus) beteg d <1,02 plazma lipoproteinjéből Sephacryl S-300 oszlopkromatográfiával, amint ezt korábban leírták (14). Az E3 izo-formát preparatív Immobilin izoelektromos fókuszálással nyerjük (LKB Instruments, Bromma, Svédország; pH tartomány 4,9 és 5,9 között) (28).

Az ApoE analógot 33 g liofilezett sejtből izoláljuk, amely 5 liter fermentációs folyadékból származó sejttömeget képvisel. A sejteket finom porrá őröljük 22 g alumínium-oxid segítségével (Buehler Ltd, Evanston, Illinois) hűtött (4 °C) mozsárral és mozsártörővei. Az őrölt sejteket 300 ml 6 mol/literes karbamidoldattal (frissen ionmentesített) extraháljuk, az oldat tartalmaz még

0,1 mol/liter NH₄HCO₃-at, 2 mmol/liter PMSF-et, 0,1% Trasylol-t (Mobay Chemical Corp., New York, NY) (pH 7,8) is. Az oldhatatlan sejtmaradékot ultracentrifugával leülepítjük 4 °C hőmérsékleten, Beckman SW28 rotorban (25 000 fordulat/perc, 50 percen át), és újra extraháljuk 200 ml 6 mol/literes karbamid-pufferban. Az egyesített felülúszó frakciókat dializáljuk 2 mol/literes karbamidoldattal szemben, amely 25 mmol/liter NH₄HCO₃-at, 2 mmol/liter PMSF-et, 2 mmol/liter EDTA-t, 0,1% Trasylolt, 0,1% β-merkapto-etanolt is tartalmaz (pH 7,4), a dializáló oldatot háromszor cserélve. A dialízist követően az extraktum felülúszóját hozzáadjuk ~ 200 ml heparin- Sepharose-hoz, amelyet a (29) irodalmi hivatkozás szerint készítünk el, és 2 mol/literes karbamid-pufferral egyensúlyozunk ki. A gél-felülúszó keveréket egy éjszakán át inkubáljuk 4 °C hőmérsékleten, forgó lemezen, majd üvegoszlopba töltjük (4,0x3,5 cm, Kontes Glass, Vineland, New Yersey). A heparin-Sepharose-hoz nem kötött anyagot lemossuk az oszlopról ~ 300 ml 2 mol/literes karbamid-puffer átszivatásával 25 ml/óra sebességgel az oszlopon keresztül. A kötött anyagot azután 50 ml 1,0 mol/literes NH₄HCO₃ oldattal (2 mol/literes karbamid-oldatban) eluáljuk az oszlopról, majd dializáljuk 5 mmol/liter NH₃HCO₃-al szemben, és liofilezzük. Ezt a félig tisztított ApoE-t 15 ml 6 mol/literes guanidin-oldatban szolubilizáljuk, amely oldat 0,1 mol/liter trisz-HCl-t, 1 mmol/liter EDTA-t, 1,0% β-merkapto-etanolt is tartalmaz (pH 7,4), és Sephacryl S-300 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Svédország) oszlopra (2,5x300 cm) visszük, amely oszlopot előzőleg 4 mol/liter guanidint, 0,1 mol/liter trisz-HCl-t, 1 mmol/liter EDTA-t és 0,1% β-merkapto-etanolt tartalmazó oldattal (pH 7,4) egyensúlyoztunk ki. Az ApoE-t tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, kimerítően dializáljuk 5 mmol/literes NH₄HCO₃-al szemben, majd liofilezzük. A végső tisztítást preparatív izoelektromos fókuszálással hajtjuk végre Immobiline gélen (28).

HU 215 160 Β

Az ApoE analóg szerkezeti jellemzése

Aminosav-elemzéshez fehérje- vagy peptid-mintákat hidrolizálunk 6 n HCl-ben 20 órán át 110 °C hőmérsékleten lezárt, vákuummal leszívott csövekben. Az elemzést Beckman 121 MB Analyzer-ben hajtjuk végre, amely 126 Data System modellel van felszerelve.

Az aminosav- és szekvencia-elemzéshez a peptideket úgy hozzuk létre, hogy 3 mg Sephacryl S-300 oszlop-tisztított ApoE-t emésztünk 90 mg CNBrel 600 ml 70%-os hangyasavban 30 percig, szobahőmérsékleten. Az így létrejött peptideket Sephadex G-50 oszlopon elkülönítjük, amint ezt korábban az autentikus ApoE-nél leírták (4).

A szekvenciaanalízist korszerűsített Beckman 890C Sequenceren hajtjuk végre, standard 0,1 M Quadrol programot alkalmazva. Az intakt fehérjét lebontjuk 3 mg polibrén és 0,5% SDS jelenlétében; a peptidek csak a polibrén jelenlétében is lebomlanak. A fenil-tiohidantoin aminosavakat azonosítjuk, és mennyiségileg is meghatározzuk nagy felbontású folyadékkromatográfiával (HP_lC), amint ezt korábban leírták (14).

Analitikai izoelektromos fókuszálást és SDS poliakrilamid-gélelektroforézist hajtunk végre (14). A töltésváltást ciszteaminnal (β-merkapto-etanol-amin) végezzük (14).

Az ApoE analóg biológiai jellemzése

ApoE analóg és dimirisztoil-foszfatidil-kolin (DMPC) foszfolipid komplexeit készítjük el és izoláljuk, amint ezt korábban leírták (30). Lipoprotein receptor kötési méréseket hajtunk végre, amint ezt a fibroblasztoknál (31) és máj-membránoknál (32) leírták. Az ApoE jódozását 0,10 mol/literes NH₄HCO₃-ban hajtjuk végre Iodo Beads-ban (Pierce), a gyártó ajánlásai szerint.

Nyúl- és patkány in vivő tanulmányokhoz jódozott autentikus ApoE-t és ApoE-analógot (mindkettő 90 μg) inkubálunk 30 percig szobahőmérsékleten 1 ml nyúlvagy patkány-plazmával, mielőtt injektálnánk hím újzélandi fehér nyulakba. A plazma radioaktivitását mint triklórecetsawal kicsapható fehérjét adjuk meg, azt a kicsapási módszert alkalmazva, amelyet korábban leírtak (33). A különböző idő-intervallumoknál a plazmában maradó injektált dózis százalékának a kiszámítása azon a becslésen alapul, hogy a plazma térfogata a testsúly 4,5%-a.

Az alábbiakban megadjuk a fenti kísérletek eredményeit és megtárgyaljuk azokat.

A humán ApoE kifejeződése

A pTV194-el fertőzött sejtek indukcióját követően egy, az ApoE molekulatömegével azonos látszólagos molekulatömegű fehérje indukálódik fajlagosan. Ez az indukált fehérje reagál anti-humán ApoE antitestekkel (részletesen nem mutatjuk be).

perces vagy hosszabb indukciós időtartam után a sejtek lízisét figyeljük meg (28. ábra). Ez a sejtlízis az ApoE sejten belüli felgyülemlésével társul. A 30 °C hőmérsékleten tartott, nem indukált sejtek stabilak (28. ábra). Ez a celluláris toxicitású lízis nem általános vonása ennek a kifejeződő vektornak, mivel ugyanez a kifejeződő rendszer, amely humán növekedési hormon cDNS-t tartalmaz, nem mutatja ezt a hatást. Az ApoE elroncsolódik proteolízissel a sejt lízisét követően. Az ApoE felgyülemlés által okozott toxicitás problémáját le lehet gyűrni a sejteket rövid időtartamon át (~ 20 perc) indukálva, majd a sejteket lehűtve jég adagolásával a fermentorba.

Amint ezt szilárd fázisú radioimmunassayval meghatározzuk, az ApoE szint a rövid időtartamon át indukált sejtekben mintegy 1%-a az oldható sejtfehérjének. Az ApoE-t izoláljuk és a sejtkivonatból tisztítjuk heparin-Sepharose és Sephacryl S-300 kromatográfiával. Ez a két lépéses folyamat olyan ApoE készítményt eredményez, amely több, mint 90% tisztaságú, a sejtextraktumban jelen levő ApoE mintegy 20%-át képviselő kitermeléssel. A jellemzéshez szükséges végső tisztítást preparatív Immobiline izoelektromos fókuszálással hajtjuk végre. Ez esetben a tanulmányokban alkalmazott tisztítási művelet nem optimalizáltuk a teljes kinyerésre, inkább arra terveztük, hogy a jellemzéshez tiszta anyagot nyeljünk.

Az ApoE analóg szerkezeti jellemzése

Az Immobiline-vel tisztított ApoE analóg egyedi csíkként vándorol SDS gélen, az autentikus ApoE Mr értékével azonos látszólagos Mr értékkel. Izoelektromos fókuszáló gélen a biomémöki úton előállított ApoE egy fő csíkként fókuszálódik az Immobiline-vel tisztított ApoE3 pl-jével azonos pl-vel. Egy ciszteingyök jelenlétével egybevágóan az ApoE analóg egy töltésegységgel tolódik el az anód felé ciszteinaminos módosítás után. Az Immobiline-vel tisztított termék aminosav-elemzését összehasonlítjuk az azonos módszerrel tisztított autentikus humán ApoE3-al. Amint a VI. Táblázat bemutatja, az ApoE analóg és az autentikus ApoE elemzési eredményei csaknem azonosak egymással és a humán ApoE korábbi szekvencia-elemzéseiből eredő elméleti kompozícióéval. Az elemzések azonban azt sugallják, hogy az ApoE analóg termék tartalmaz egy további metionin gyököt az autentikus ApoE-hez hasonlítva. Ezen túl egy cisztein gyök jelenléte, amelyet a ciszteaminos kezelés sugall, is bizonyított.

Az intakt ApoE analóg (kb. 6 nmol) szekvenciaelemzése azt demonstrálja, hogy egy többlet metionin gyök van a fehéije NH₂-terminálisánál, és egy egyei Met-Lys-Val-Glu-Gln-Ála-Val-Glu-Thr-Glu-Pro-G lu-Pro-Gln-Leu-Arg-Gln-Gln-szekvencia termelődik. A metionint követő szekvencia megfelel a humán ApoE 1-17 gyökeinek. Ezek az eredmények megerősítik, hogy az ApoE NH₂-terminális kódoló részének helyreállításához használt szintetikus oligonukleotid korrektül átfordítódik, és hogy a többlet-metionin (amelynek kodonja hozzáadódik a bakteriális transzlációs-iniciációhoz) nem távolítódik el semmiféle feldolgozási mechanizmus során. A kezdeti kitermelés a szekvencia-elemzésben váratlanul alacsony (~ 20%), de ez valószínűleg nem annak tulajdonítható, hogy az NH₂-terminális metioninok egy része formileződik, mivel a formilezett fehéijék jelentősen eltérő pl értékekkel rendelkeznek a nem-formilezett polipeptidhez viszonyítva (és az autentikus ApoE-hez viszonyítva), ilyet pedig nem figyelünk meg.

A CNBr peptidek közül sokat jellemzünk aminosav összetételük szerint, és nem találunk eltérőket azoktól,

HU 215 160 Β amelyet autentikus ApoE-nél nyerünk (részletesen nem mutatjuk be). Ezen kívül a CB4 (109-125 gyökök az autentikus ApoE-ben) szekvenciaelemzése és a CB5 (az ApoE-ben a 164. helynek megfelelő helyen át) részleges szekvenciaelemzése megerősíti, hogy az ApoE analóg szekvenciája azonos az autentikus ApoE3-éval a kritikus receptor kötési tartományban. Mindezek az adatok azt jelzik, hogy az NH₂-nél levő többlet-metionin kivételével az ApoE analóg szerkezete azonos az autentikus ApoE3 szerkezetével.

Az ApoE analóg in vitro és in vivő metabolikus jellemzése

Az ApoE-DMPC komplexek receptor-kötési összehasonlítása azt demonstrálja, hogy az ApoE analóg olyan kötési tulajdonságokkal bír, amelyek azonosak az autentikus ApoE kötési tulajdonságaival. Kompetíciós tanulmányokban ¹²⁵I-LDL-lel ApoB, E(LDL) receptorhoz való kötődésnél tenyésztett fibroblasztokon, az ApoE analóghoz tartozó 50%-os helyettesítési koncentráció 0,019 pg/ml, összehasonlítva az autentikus ApoE 0,024 μg/ml-es értékével (29. ábra). Közvetlen, fibroblasztokhoz való kötési tanulmányokban mindkét ApoE készítmény hasonló módon kötődik (29. ábra). A közvetlen kötődési adatok Scatchard-elemzése feltárja, hogy a biomémöki úton előállított, valamint autentikus ApoE-hez tartozó Kds érték és maximális kötött mennyiség 0,93, illetve 0,96T0~¹⁰ mol/liter, és 29,4, illetve 34,2 pg/mg sejtfehérje. Ezen túl mindkét ApoE készítmény hasonlóan és hatásosan kötődik kutya májmembránokon levő ApoE receptorokhoz (30. ábra).

Az ApoE analóg és az autentikus ApoE in vivő metabolikus tulajdonságainak összehasonlítása szintén azt demonstrálja, hogy mindkét készítmény azonos módon viselkedik. Amikor ¹³ Ί-ApoE analógot és ¹²⁵I-autentikus ApoE-t összekeverünk, és normál nyúlplazmával inkubáljuk, majd a keveréket normál nyúlba injektáljuk, mindkét jelzés kiürül a vérkörből, azonos kinetikával (31. ábra). Mindkét jelzés injektált dózisainak 30%-os kiürülése az injektálástól számított mintegy 20 perc után következik be. Azonos eredményeket nyerünk reciprok módon jelzett fehérjékkel is, valamint akkor is, amikor tumover-tanulmányokat végzünk patkányokban (részletesen nem mutatjuk be), így mind az in vivő, mind az in vitro tanulmányokban a biomérnöki úton előállított és autentikus ApoE hasonló tulajdonságokat mutat, és lényegében azonos módon viselkedik.

Összefoglalva az izolált ApoE analóg szerkezeti jellemzése azt demonstrálja, hogy egy, az amino-terminálishoz hozzátett többlet metioningyök kivételével az ApoE analóg szerkezete azonos az autentikus ApoE25 ével. Ezen kívül az ApoE analóg és az autentikus ApoE mind in vitro, mind in vivő metabolikus tulajdonságai azonosak.

VI. táblázat

Az ApoE analóg és az autentikus ApoE3^z aminosav-összetétele

	ApoE3 analóg	Autentikus ApoE3	ApoE3 szekvencia
Lys	12,1	12,0	12
His	2,0	2,0	2
Arg	33,3	33,3	34
Cys	0,8	0,8	1
Asp	12,3	12,4	12
Thr	10,5	10,5	11
Ser	12,7	12,6	14
Glu	72,0	71,9	71
Pro	8,5	8,4	8
Gly	17,3	17,3	17
Alá	35,6	35,5	35
Val	21,9	22,3	22
Met	7,7	6,5	7
Ile	L9	1,9	2
Leu	37,0	37,3	37
Tyr	3,8	3,9	4
Phe	3,2	3,2	3
Trp	nem határoztuk meg	nem határoztuk meg	7

¹ Az eredmények két párhuzamosban végzett meghatározásból erednek és gyök/mólban vannak kifejezve. A ciszteint külön határozzuk meg perhangyasav oxidáció után. A treonint és szerint nem korrigáljuk a hidrolitikus veszteségre. A triptofánt nem határozzuk meg. Az ApoE3 szekvencia a 4. irodalmi hivatkozásból származik.

HU 215 160 Β

Az alábbiakban a példához tartozó bibliográfiát soroljuk fel.

1. Mahley, R. W.: a „Disturbances in lipid and Lipoprotein Metabolism” (Zavarok a lipid- és lipoprotein metabolizmusban) című kiadványban (szerkesztők: Dietschy, J. M., Gotto, A. M. Jr. és Ontko, J. A.) [Az American Physiological Society (Amerikai Fiziológiai Társaság) kiadványa], 181-197. (1978).

2. Mahley, R. W., Innerarity, T. L., Rali, S. C. Jr. és Weisgraber, K. H.: J. Lipid Rés. 25, 1277-1294. (1984).

3. Mahley, R. W. és Innerarity, T. L.: Biochim. Biophys. Acta, 737, 197-222. (1983).

4. Rali, S. C. Jr., Weisgraber, K. H. és Mahley, R. W.: J. Bioi. Chem. 257, 4171-4178. (1982).

5. McLean, J. W., Elshourbagy, N. A., Chang, D. J., Mahley, R. W. és Taylor, J. M.: J. Bioi. Chem. 259, 6498-6504. (1984).

6. Olaisen, B., Teisberg, P. és Gedde-Dahl, T. Jr.: Hűm. Gén. 62, 233-236. (1982).

7. Paik, Y. K., Chang, D. J., Reardon, C. A., Davies, G. E., Mahley, R. W. és Taylor, J. M.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, nyomdában.

8. Utermann, G., Langenbeck, U., Beisiegel, U. és Weber, W.: Am. J. Hűm. Génét. 32, 339-347. (1980).

9. Zannis, V. I. és Breslow, J. L.: Biochemistry, 20, 1033-1041.(1981).

10. Zannis, V. I., Breslow, J. L. Utermann, G., Manley, R. W., Weisgraber, K. H., Havel, R. J., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Schonfeld, G., Hazzard, W. R., Blum, C.: J. Lipid Rés. 23, 911-914(1982).

11. Utermann, G., Steinmetz, A. és Weber, W.: Hűm. Génét. 60, 344-351. (1982).

12. Havel, R. J.: Med. Clin. North Am. 66, 441-454. (1982).

13. Menzel, H. J., Kladetzky, R. G. és Assmann, G.: J. Bioi. Chem. 256, 9077-9083. (1983).

14. Weisgraber, K. H. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 256, 9077-9083. (1981).

15. Rali, S. C. Jr., Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L. és Mahley, R. W.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4696-4700. (1982).

16. Rali, S. C. Jr., Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. és Assmann, G.: J. Clin. Invest. 71, 1023-1031.(1983).

17. Weisgraber, K. H., Rali, S. C. Jr., Innerarity, T. L., Mahley, R. W., Kuusi, T. és Ehnholm, C.: J. Clin. Invest. 73, 1024-1033. (1984).

19. Mahley, R. W., Innerarity, T. L., Rali, S. C. Jr. és Weisgraber, K. H.: Ann. NY. Acad. Sci., nyomtatás alatt.

20. Innerarity, T. L., Friedlander, E. J., Rali, S. C. Jr., Weisgraber, K. H. és Mahley, R. W. (1983) J. Bioi. Chem. 258, 12 341-12 347.(1983).

20a Innerarity, T. L., Weisgraber, K. H., Amold, K. S., Rali, S. C. Jr., és Mahley, R. W.: J. Bioi. Chem. 259, 7261-7267.(1984).

21. Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Harder, K. J., Mahley, R. W., Milne, R. W., Marcel, Y. L. és Sparrow, J. T.: J. Bioi. Chem. 258, 12 348-12 354. (1983).

26. Laemmli, U. K.: Natúré (London) 227, 680-685. (1970).

27. Towbin, H., Staehelin, T. és Gordon, J.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 148, 107-127. (1979).

28. Manzel, H. J. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 254, 3070-3076. (1984).

29. Weisgraber, K. H. és Mahley, R. W.: J. Lipid Rés. 21, 316-325. (1980).

30. Innerarity, T. L., Pitas, R. E. és Mahley, R. W.: J. Bioi. Chem. 254, 4186-4190. (1979).

31. Innerarity, T. L. és Mahley, R. W.: Biochemistry, 77, 1440-1447.(1978).

32. Hűi, D. Y., Innerarity, T. L. és Mahley, R. W.: J. Bioi. Chem. 256, 5646-5655. (1981).

33. Mahley, R. W., Innerarity, T. L., Weisgraber, K. H. és Oh, S. Y.: J. Clin. Invest. 64, 743-750. (1979).

39. példa

A met-asp-gln—bGH analóg biológiai aktivitása

Egy nem régi tanulmány (P. J. Eppard és D. E. Bauman: Proceedings of 1984 Cornell Nutrition Conference fór Feed Manufacturers, 5-12. oldal) jelzi, hogy a metionil-szarvasmarha növekedési hormon folyamatos beadása egy 12 hetes időtartamon át növeli a tejtermelést 10—40%-kal a kontrolihoz viszonyítva. Hasonló eredményeket nyerünk a met-asp-gln-bGH analógot alkalmazva, amelyet a pHG44 plazmid kódol, és amely növesztése, kinyerése és tisztítása a 13. példában leírt módon történik.

40. példa

A met—pGH analóg biológiai aktivitása

Egy nem régi tanulmány [C. A. Spence és munkatársai: Az „Effect of Exogenous Growth Hormoné on Fetal Energy Storage and Lactation Performance in Sows” (Az exogén növekedési hormon hatása a magzati energia tárolásra és szoptatási hatásfokra anyakocákban) című előadás kivonata, elhangzott a „The Annual Meeting of The American Society of Animál Science” című tudományos találkozón, (Univ. of Missouri, 1984. aug. 7-10.) jelzi, hogy a hipofízis-eredetű sertés növekedési hormon növeli az anyakocák tejelválasztását és a malacalom túlélését. Egy szoptatási hatásfokra vonatkozó tanulmányban a met-pGH analóg beadása vemhes anyakocákban javítja az anyakocák tejelválasztását és a malacalom túlélését.

41. példa

Rekombináns SÓD alkalmazása gerincvelő iszkémia kezelésében

Érzéstelenített kutyákat összekapcsolunk Nicolet Compact 4-el kiváltott villamos feszültségi rendszerrel, és így nyerjük a SEP (szomatoszenzoros kiváltott feszültség) alapvonalat 250 gerjesztést alkalmazva megszakítás nélkül 4,7 gerjesztés/percnél a hátsó tibia-idegre. A 250 gerjesztés (stimulus) kiváltott feszültséget 2 elektródról rögzítjük az Fpz és Cz fölött (két specifikus pont az epikranon fölött), átlagoljuk jelátlagoló val (signal averager), hogy csökkentsük a jelet a jel-zaj-viszonyra, és a SEP-et képernyőre vetítjük ki.

Ezután bal mellkasfeltárást végzünk, a lemenő aortát éppen disztálisan a bal kulcscsont alatti osztóémél

HU 215 160 Β kipreparáljuk és izoláljuk a keresztcsiptető alkalmazásához előkészítve. Egy érkötőt iktatunk be proximálisan az aorta keresztcsiptető javasolt helyéhez, és egy 20 gauge méretű kanült iktatunk be a proximális aorta nyomásának mérésére, és a gyógyszerinfúzióhoz a kísérleti csoportban. Egy 14 gauge méretű kanült iktatunk be a jobb femorális artériába a vérnyomás megfigyelésére és a vér eltávolítására a vérnyomás szabályozásához a keresztcsiptető alkalmazása után. Sorozatosan vérgáz-mintákat veszünk, és a respirátort úgy állítjuk be, hogy a vérgázok a normális határok között maradjanak.

Ezután alkalmazzuk a keresztcsiptetőt éppen disztálisan a bal kulcscsont alatti osztóémél. A SEP-et ismételjük egy perces időközön át. A proximális aortás hipertenziót szabályozzuk vér eltávolításával a femorális artériából, a vérnyomást 90-110 Hgmm között (1,18· 10⁴—1,45-10⁴ Pa) tartva. Az aortás keresztcsiptetőt további tíz percig fenntartjuk azután, miután a SEP eltűnik. A SEP görbe eltűnése azt fejezi ki, hogy a mellkasi aorta keresztcsiptetővel elzárása által produkált iszkémia a gerincvelőn belül elég súlyos ahhoz, hogy veszélyeztesse az afferens impulzusok vezetését a gerincvelő dorzális oszlopon át. A SEP eltávolítása után 10 perccel a keresztcsiptetőket eltávolítjuk. A kutyák alacsony vémyomásúvá válhatnak, amely vér, Ringerféle laktát és nátrium-bikarbonát infúzióra helyreáll.

A kontroll kutyákban (n = 8) az állatok nem kapnak semennyi rekombináns SOD-ot. A kísérleti állatokban az egyik csoport (n = 8) egy ampullányi rekombináns SOD-t (25 000 egység) kap a kereszt-csiptető eltávolítása előtt, és ezt követi 5000 egység/perc beadása 10 percen át; a második kísérleti csoport (n = 7) 50 000 egység rekombináns SOD-t kap a kereszt-csiptető eltávolítása előtt, ezt követi 10 000 egység/perc beadagolása 10 percen keresztül.

A műtétek után a hátulsó láb neurológiai státusát a Tarlov-féle kritériumok alapján megítéljük: 0 = nincs mozgás a hátsó lábakban; 1 = gyenge mozgás a hátsó lábakban; 2 = jó mozgás a hátsó lábakban, de nem képes felállni; 3 = képes felállni, de nem normálisan; 4 = teljes gyógyulás. A 17. napon a műtét után a SEP-et megismételjük és rögzítjük az alapvonallal való összehasonlításhoz. Az állatokat ezután leöljük.

Az eredmények a következők.

Neurológiai státus a műtét után 17. nappal (POD). Kontrollállatok (n = 8)- 4 állat „0” fokozatú,

- 4 állat 2. vagy 3. fokozatú. Kísérleti állatok (I) - 25 000 SÓD egységet tartalmazó ampulla beadása először, majd 5000 egység/perc 10 percen át.

- 6 állat teljes felgyógyulást mutat,

- 2 állat 2. vagy 3. fokozatú.

Kísérleti állatok (II) - 50 000 SÓD egységet tartalmazó ampulla beadása először, majd 10000 egység/perc 10 percen át.

- mind a 7 állat teljes felgyógyulást mutat. Az idő, amely az SEP eltűnéséig eltelik az aortás keresztcsiptető alkalmazása után, 12 és 19 perc között változik. Mivel a keresztcsiptetőt még 10 percig fenntartjuk azután, hogy a SEP eltűnik, a teljes keresztcsiptetős idő több, mint 20 perc.

Az operáció utáni közvetlen időszakban a mellkasi seb lezárása után ismételt SEP-et végzünk. A kontrollállatokban nincs megfigyelhető SEP vonal, ezzel ellentétben a kezelt állatoknál a SEP vonal visszatérésére mutatkozik a hullámforma lappangási idejében való késleltetéssel.

Összegezve: a rekombináns SÓD hasznosnak bizonyul a gerincvelő iszkémiának tulajdonítható neurológiai sérülések megakadályozásában. A kezelésnek ez a módszere különösen fontos a mellkasi aorta értágulat sebészetében.

Claims (19)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás enzimatikusan aktív humán Cu/Zn szuperoxid dizmutáz polipeptid analógja előállítására, amelynek aminosavszekvenciája legalább 95%-ban azonos a természetben előforduló Cu/Zn szuperoxid dizmutázéval és Cu/Zn szuperoxid dizmutáz aktivitása van, azzal jellemezve, hogy transzformált bakteriális sejtek tenyészetét cinktartalmú, termelő tápközegben - amely annyi, nemgátló mennyiségű Cu⁺⁺-val van kiegészítve, hogy a Cu⁺⁺-koncentráció a tápközegben nagyobb, mint 2 mg/1 - növesztjük, és amely sejtek tartalmaznak és képesek expresszálni a humán Cu/Zn szuperoxid dizmutáz polipeptid analógját kódoló DNS-t és a tenyészet növesztését a bakteriális sejtben a DNS expresszálódását és a polipeptid termelését biztosító körülmények között végezzük, majd a kapott enzimatikusan aktív humán Cu/Zn szuperoxid dizmutáz analógot kinyerjük.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy termelő tápközegként kazein hidrolizátumot alkalmazunk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy termelő tápközegként LB tápközeget alkalmazunk.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a közegben 50-250 mg/1 Cu⁺⁺-koncentrációt alakítunk ki.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a közegben 200 mg/1 Cu⁺⁺-koncentrációt alakítunk ki.
6. 6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a közegben 75 mg/1 Cu⁺⁺-koncentrációt alakítunk ki.
7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a termelő közeget még olyan mennyiségű Zn⁺⁺ionnal is kiegészítjük, hogy a közegben a Zn⁺⁺-koncentráció nagyobb, mint 2 mg/1 legyen.
8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a termelő közeget 0,8 g/1 CuSO₄.5H₂O-val és 10 mg/1 ZnSO₄.7H₂O-val egészítjük ki.
9. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pSODpj, pSODa2, pSODpjTn, pSOD3]-BA2 vagy pSODp^T-l plazmidokkal transzformált bakteriális sejtet alkalmazunk.

   HU 215 160 Β
10. 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy bakteriális sejtként pSODcc2 plazmidot (ATCC 39 786) tartalmazó Escherichia coli A2097 törzset alkalmazunk.
11. 11. Eljárás az 1. igénypont szerint nyert enzimatikusan aktív humán Cu/Zn szuperoxid dizmutáz analóg kinyerésére, azzal jellemezve, hogy

    a) a bakteriális sejteket a termelő közegből elkülönítjük,

    b) a bakteriális sejteket szétzúzzuk, amikoris egy sejttörmelékből álló szuszpenziót és egy proteinből álló felülúszó oldatot nyerünk,

    c) a sejttörmeléket elválasztjuk az oldható protein felülúszó oldattól,

    d) az így elválasztott protein felülúszó oldatot 65 °C körüli hőmérsékleten mintegy 2 órán át melegítjük,

    e) a protein felülúszót lehűtjük,

    f) a kapott felülúszóból a szuperoxid dizmutáz analógot tartalmazó tiszta protein oldatot elválasztjuk, és

    g) az így kapott tiszta protein oldatból az enzimatikusan aktív humán Cu/Zn szuperoxid dizmutáz analógot kinyerjük.
12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a g) lépés szerinti kinyerést úgy végezzük, hogy

    a) a tiszta felülúszó protein oldatot betöményítjük,

    b) a kapott, szuperoxid dizmutázt tartalmazó koncentrált oldatot anion- és kationcserélő kromatográfiának vetjük alá, és

    c) a tisztított szuperoxid dizmutáz analógot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük.
13. 13. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejttenyészetet a DNS expresszálására és az enzimatikusan aktív humán Cu/Zn szuperoxid dizmutáz polipeptid analógjának termelődésére indukáljuk.
14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az indukálást melegítéssel végezzük.
15. 15. Eljárás enzimatikusan aktív humán Cu/Zn szuperoxid dizmutáz polipeptid analógja előállítására, amely nem-acilezett N-terminusú, de aminosavszekvenciája legalább 95%-ban azonos a természetben előforduló humán Cu/Zn szuperoxid dizmutázéval, és Cu/Zn szuperoxid dizmutáz aktivitása van, azzal jellemezve, hogy

    a) az említett humán Cu/Zn szuperoxid dizmutáz polipeptid analógot kódoló DNS-t tartalmazó plazmiddal transzformált bakteriális sejteket tartalmazó tenyészetet olyan körülmények között növesztjük, hogy a transzformált sejtek az említett humán Cu/Zn szuperoxid dizmutáz polipeptid analógot kódoló DNS-t expresszálják,

    b) a kapott sejttenyészetet a bakteriális sejtben a DNS expresszálására és a humán Cu/Zn szuperoxid dizmutáz polipeptid analóg termelésére indukálják,

    c) az így nyert humán Cu/Zn szuperoxid dizmutáz polipeptid analógot Cu⁺⁺- és Zn⁺⁺-ionnal érintkeztetjük, és így enzimatikusan aktív humán Cu/Zn szuperoxid dizmutáz polipeptid analógot állítunk elő, és

    d) a kapott enzimatikusan aktív humán Cu/Zn szuperoxid dizmutáz polipeptid analógot kinyerjük.
16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) pont szerinti érintkeztetést Cu⁺⁺- és Zn⁺⁺ionokat tartalmazó oldattal szembeni dialízissel végezzük.
17. 17. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) pont szerinti érintkeztetést a b) pont szerinti indukált bakteriális sejtek Cu⁺⁺- és Zn⁺⁺-ionokat tartalmazó pufferben történő szétzúzásával végezzük.
18. 18. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) pont szerint nyert humán Cu/Zn szuperoxid dizmutáz polipeptid analógot a c) lépés előtt apoenzimmé alakítjuk.
19. 19. Eljárás szuperoxid dizmutáz előállítására unicelluláris mikroorganizmusban, azzal jellemezve, hogy egy megfelelő unicelluláris mikroorganizmust egy, az unicelluláris mikroorganizmusban funkcionális DNS szerkezettel transzformáljuk, amely 5’ —> 3’ irányban, sorrendben a következőket tartalmazza:

    a) egy promoter,

    b) egy riboszomális kötőhely,

    c) egy iniciációs kodon,

    d) egy humán szuperoxid dizmutáz struktúrgén az iniciációs kodonnál azonos leolvasási fázisban, amely struktúrgén stopkodonnal rendelkezik a 3'-terminálison, és

    e) egy transzkripciós terminátor, és a transzformált unicelluláris mikroorganizmust a szuperoxid dizmutáz termelését biztosító körülmények között tenyésztjük, és a kapott szuperoxid dizmutázt kinyerjük.