TW202400784A - 包含utr的核酸構建體及其應用 - Google Patents
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Abstract
本揭露關於包含UTR的核酸構建體及其應用，具體地，本揭露的UTR能夠顯著提高核酸構建體中目的基因的表達效率。該核酸構建體可包含表達例如人肝細胞生長因子(hHGF)的核酸序列，用於嚴重下肢缺血、糖尿病足等疾病的基因治療藥物。
Description
本揭露要求如下專利申請的優先權：於2022年05月13日提交，申請號為CN202210522056.8，發明名稱為“包含UTR的核酸構建體及其應用”的中國專利申請；上述專利申請的全部內容藉由引用結合在本揭露中。
本揭露屬於核酸領域，關於包含UTR的核酸構建體及其用於預防或治療疾病的用途。該核酸構建體可包含表達人肝細胞生長因子(hHGF)的核酸序列，用於嚴重下肢缺血、糖尿病足等疾病的基因治療藥物。
基因治療和基因接種疫苗可以為多種疾病提供高度特異性和個性化治療、預防方案，包括遺傳病、自身免疫疾病、癌或腫瘤相關疾病以及炎性疾病等。
DNA、RNA均可用作基因治療或基因接種疫苗。DNA穩定、易操作，但存在DNA片段插入患者基因組導致突變事件(如受損基因功能喪失)等的風險。RNA能避免不希望的基因組整合，但因為遍在的RNA酶，RNA易被降解。因此，需要提高RNA的穩定性，使其編碼的蛋白產物在體內積累，以實
現對疾病的治療或預防，以及，在儲存、施用的過程中保持RNA結構和功能的完整性。已經發現天然存在的真核mRNA分子中含有穩定化元件，例如，其5’端、3’端的非轉譯區(UTR)，以及如5’帽結構或3’多聚腺苷酸尾的其它結構特徵。5’UTR和3’UTR是成熟前(premature)mRNA元件，在mRNA加工過程中，成熟mRNA特有的結構特徵(如5’帽和3’多聚腺苷酸尾)被添加於轉錄的(成熟前)mRNA。關於UTR和mRNA穩定性的相關性，已有研究顯示，α-球蛋白mRNA的3’UTR是α-球蛋白mRNA穩定性的重要因素(Nancy D Rodgers et al,RNA.2002 Dec；8(12)：1526-37；Z Wang et al,Mol Cell Biol.1999 Jul；19(7)：4552-60.)。
外周動脈疾病(Peripheral artery disease,PAD)是指由一系列由供應肢體動脈、內臟器官及腦部的結構和功能異常導致的非冠狀動脈系統綜合症，其特徵在於非冠狀動脈血液循環發生狹窄、閉塞和瘤樣病變，累及主動脈及分支動脈。在PAD中，下肢缺血性疾病在臨床上最為常見，主要病因包括動脈粥樣硬化(Atherosclerosis obliterans,ASO)、糖尿病性動脈硬化閉塞症(Diabetic artery obliterans,DAO)和血栓閉塞性脈管炎(Thrombosis angiitis obliterans,TAO)。嚴重下肢缺血(Critical limb ischemia,CLI)屬於ASO發展的晚期階段，糖尿病足(Diabetic foot ulcer,DFU)屬於DAO的一種，兩者均屬於外周血管病變性疾病，其發病特徵均為下肢血管狹窄或閉塞、遠端血液灌注不足導致的下肢疼痛、潰瘍及壞死。目前治療CLI和DFU的有效措施是藉由手術或者腔內介入進行血運重建，但超40%的患者因為年齡、合併併發症等不滿足血運重建要求，只能藉由藥物保守治療。藥物治療僅能延緩疾病進程，無法治癒。
肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor,HGF)是一種多功能間質源性生長因子，當其與細胞膜表面受體c-met結合後，引起胞內酪胺酸殘基磷
酸化，招募銜接蛋白，促進激酶活性，進而激活下游信號通路。HGF是胚胎發育、組織器官再生、傷口癒合和血管發生等過程的重要調節因子，能促進內皮細胞和平滑肌細胞增殖和遷移，促進缺血部位微血管網絡重建，抑制細胞凋亡。研究結果顯示，裸質粒肌肉注射遞送hHGF-cDNA能有效促進鼠和家兔缺血下肢的血流灌注(Y Taniyama et al.Therapeutic angiogenesis induced by human hepatocyte growth factor gene in rat and rabbit hindlimb ischemia models：preclinical study for treatment of peripheral arterial disease.Gene Ther.2001 Feb；8(3)：181-9)。臨床數據顯示，小腿肌肉注射裸質粒可促進患者創面癒合(S Cui et al.Clinical Safety and Preliminary Efficacy of Plasmid pUDK-HGF Expressing Human Hepatocyte Growth Factor(HGF)in Patients with Critical Limb Ischemia.Eur J Vasc Endovasc Surg.2015 Oct；50(4)：494-501.)。但是，使用裸質粒遞送藥物存在體內轉染效率低、給藥劑量負擔大、DNA整合風險高及治療費用成本高等不足，且臨床數據顯示並未改善趾肱指數、經皮氧分壓及截肢率，因此藥物仍有較大提升空間。
本揭露提供這樣的mRNA，其含有新結構的5’UTR、3’UTR，降低mRNA的早期降解或穩定mRNA的降解，但不損失更或增強蛋白轉譯效率。該mRNA穩定性更高，可應用於基因治療、基因接種疫苗。以及，本揭露提供能夠表達人肝細胞生長因子(Human Hepatocyte growth factor,hHGF)的mRNA，及其脂質奈米顆粒(Lipid nanoparticles,LNP)遞送系統，可以實現外源hHGF蛋白在體內高效、快速轉化，具有無整合風險、易於工業級放大的優點，是較裸質粒更為理想的治療方案，可用作CLI、DFU等多種疾病的基因治療藥物。
本揭露提供一種核酸構建體，其包含至少一個可調節目的基因表達的核酸元件，該核酸元件為UTR。以及，該核酸構建體可含有一個或多個目的基因，該目的基因例如為HGF。
核酸構建體
本揭露提供核酸構建體，其包含：
(a)開放閱讀框(ORF)，和
(b)非轉譯區元件(UTR)。
一些實施方案中，核酸構建體為DNA分子；一些實施方案中，核酸構建體為RNA分子(例如，mRNA)。
一些實施方案中，該ORF為編碼目的基因的多核苷酸序列。
一些實施方案中，該目的基因為異源的。另一些實施方案中，該目的基因為內源的。一些實施方案中，該目的基因為一個或多個(例如，2、3、4個)。
一些實施方案中，該UTR源自基因ACTG1、ATP6V0B、ATP6V0E1、CFL1、COX4I1、CTSB、FAM166A、NDUFB9、CHCHD10、SLC38A2、NDUFA11、NDUFV3、PRDX5、GUK1、IAH1、ABHD16A、SLC25A39、ATPIF1、ANAPC11、CCDC12、MRPL14或APOA1BP的UTR。一些實施方案中，上述基因是人基因。
一些實施方案中，該UTR為3’非轉譯區元件(3’UTR)或5’非轉譯區元件(5’UTR)。
一些實施方案中，該3’UTR和5’UTR是相同或不同來源的，例如源自相同或不同的基因。例如，3’UTR源自基因ACTG1的3’UTR，5’UTR源自基因ACTG1的5’UTR。又例如，3’UTR源自基因CTSB的3’UTR，5’UTR源自基因CHCHD10的5’UTR。一些實施方案中，該5’UTR和3’UTR源自相同物種或不同物種。
一些實施方案中，該5’UTR位於ORF的上游。一些實施方案中，該核酸構建體中的5’UTR位於ORF的5’末端。一些實施方案中，該3’UTR位於ORF的下游。一些實施方案中，該核酸構建體中的3’UTR位於ORF的3’末端。
一些實施方案中，前述核酸構建體中，其包含：
(a)開放閱讀框(ORF)，
(b-1)3’UTR，該3’UTR源自基因ACTG1、ATP6V0B、ATP6V0E1、CFL1、COX4I1、CTSB、FAM166A或NDUFB9的3’UTR；和
(b-2)5’UTR，該5’UTR源自基因ACTG1、ATP6V0B、ATP6V0E1、CFL1、COX4I1、CTSB、FAM166A、NDUFB9、CHCHD10、SLC38A2、NDUFA11、NDUFV3、PRDX5、GUK1、IAH1、ABHD16A、SLC25A39、ATPIF1、ANAPC11、CCDC12、MRPL14或APOA1BP的5’UTR。
一些實施方案中，前述核酸構建體中，其包含：
(a)開放閱讀框(ORF)，
(b-1)3’UTR，該3’UTR源自基因CTSB、FAM166A或NDUFB9的3’UTR；和
(b-2)5’UTR，該5’UTR源自基因ACTG1、CHCHD10或NDUFA11的5’UTR。
一些實施方案中，前述核酸構建體(例如，DNA或RNA分子)中，該3’UTR源自基因ACTG1的3’UTR，其含有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：58所示或與之任一具有同一性的序列；
該3’UTR源自基因ATP6V0B的3’UTR，其含有SEQ ID NO：2、3或SEQ ID NO：59、60所示或與之任一具有同一性的序列；
該3’UTR源自基因ATP6V0E1的3’UTR，其含有SEQ ID NO：4、5或SEQ ID NO：61、62所示或與之任一具有同一性的序列；
該3’UTR源自基因CFL1的3’UTR，其含有SEQ ID NO：6、7、8或SEQ ID NO：63、64、65所示或與之任一具有同一性的序列；
該3’UTR源自基因COX4I1的3’UTR，其含有SEQ ID NO：9、10、11或SEQ ID NO：66、67、68所示或與之任一具有同一性的序列；
該3’UTR源自基因CTSB的3’UTR，其含有SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：69所示或與之任一具有同一性的序列；
該3’UTR源自基因FAM166A的3’UTR，其含有SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：70所示或與之任一具有同一性的序列；或
該3’UTR源自基因NDUFB9的3’UTR，其含有SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：71所示或與之任一具有同一性的序列。
一些實施方案中，前述核酸構建體(例如，DNA或RNA分子)中，該5’UTR源自基因ACTG1的5’UTR，其含有SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：72所示或與之任一具有同一性的序列；
該5’UTR源自基因ATP6V0B的5’UTR，其含有SEQ ID NO：16、17或SEQ ID NO：73、74所示或與之任一具有同一性的序列；
該5’UTR源自基因ATP6V0E1的5’UTR，其含有SEQ ID NO：18、19或SEQ ID NO：75、76所示或與之任一具有同一性的序列；
該5’UTR源自基因CFL1的5’UTR，其含有SEQ ID NO：20、21、22或SEQ ID NO：77、78、79所示或與之任一具有同一性的序列；
該5’UTR源自基因COX4I1的5’UTR，其含有SEQ ID NO：23、24、25或SEQ ID NO：80、81、82所示或與之任一具有同一性的序列；
該5’UTR源自基因CTSB的5’UTR，其含有SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：83所示或與之任一具有同一性的序列；
該5’UTR源自基因FAM166A的5’UTR，其含有SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：84所示或與之任一具有同一性的序列；
該5’UTR源自基因NDUFB9的5’UTR，其含有SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：85所示或與之任一具有同一性的序列；
該5’UTR源自基因CHCHD10的5’UTR，其含有SEQ ID NO：29、30或SEQ ID NO：86、87所示或與之任一具有同一性的序列；
該5’UTR源自基因SLC38A2的5’UTR，其含有SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：88所示或與之任一具有同一性的序列；
該5’UTR源自基因NDUFA11的5’UTR，其含有SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：89所示或與之任一具有同一性的序列；
該5’UTR源自基因NDUFV3的5’UTR，其含有SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：90所示或與之任一具有同一性的序列；
該5’UTR源自基因PRDX5的5’UTR，其含有SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：91所示的序列；
該5’UTR源自基因GUK1的5’UTR，其含有SEQ ID NO：35、36、37或SEQ ID NO：92、93、94所示或與之任一具有同一性的序列；
該5’UTR源自基因IAH1的5’UTR，其含有SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：95所示或與之任一具有同一性的序列；
該5’UTR源自基因ABHD16A的5’UTR，其含有SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：96所示或與之任一具有同一性的序列；
該5’UTR源自基因SLC25A39的5’UTR，其含有SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：97所示或與之任一具有同一性的序列；
該5’UTR源自基因ATPIF1的5’UTR，其含有SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：98所示或與之任一具有同一性的序列；
該5’UTR源自基因ANAPC11的5’UTR，其含有SEQ ID NO：42、43或SEQ ID NO：99、100所示或與之任一具有同一性的序列；
該5’UTR源自基因CCDC12的5’UTR，其含有SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：101所示或與之任一具有同一性的序列；
該5’UTR源自基因MRPL14的5’UTR，其含有SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：102所示或與之任一具有同一性的序列；或
該5’UTR源自基因APOA1BP的5’UTR，其含有SEQ ID NO：46、47或SEQ ID NO：103、104所示或與之任一具有同一性的序列。
一些實施方案中，提供核酸構建體(例如，DNA或RNA分子)，其包含：
(a)開放閱讀框(ORF)，
(b-1)3’UTR，和
(b-2)5’UTR；
其中，該3’UTR和5’UTR選自如下任一組合：
1)該3’UTR含有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：58所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一或SEQ ID NO：72-104任一所示或與之任一具有同一性的序列；
2)該3’UTR含有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：59所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一或SEQ ID NO：72-104任一所示或與之任一具有同一性的序列；
3)該3’UTR含有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：60所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一或SEQ ID NO：72-104任一所示或與之任一具有同一性的序列；
4)該3’UTR含有SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：61所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一或SEQ ID NO：72-104任一所示或與之任一具有同一性的序列；
5)該3’UTR含有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：62所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一或SEQ ID NO：72-104任一所示或與之任一具有同一性的序列；
6)該3’UTR含有SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：63所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一或SEQ ID NO：72-104任一所示或與之任一具有同一性的序列；
7)該3’UTR含有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：64所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一或SEQ ID NO：72-104任一所示或與之任一具有同一性的序列；
8)該3’UTR含有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：65所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一或SEQ ID NO：72-104任一所示或與之任一具有同一性的序列；
9)該3’UTR含有SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：66所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一或SEQ ID NO：72-104任一所示或與之任一具有同一性的序列；
10)該3’UTR含有SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：67所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一或SEQ ID NO：72-104任一所示或與之任一具有同一性的序列；
11)該3’UTR含有SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：68所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一或SEQ ID NO：72-104任一所示或與之任一具有同一性的序列；
12)該3’UTR含有SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：69所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一或SEQ ID NO：72-104任一所示或與之任一具有同一性的序列；
13)該3’UTR含有SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：70所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一或SEQ ID NO：72-104任一所示或與之任一具有同一性的序列；
14)該3’UTR含有SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：71所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一或SEQ ID NO：72-104任一所示或與之任一具有同一性的序列；
15)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：72所示或與之任一具有同一性的序列；
16)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：73所示或與之任一具有同一性的序列；
17)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：74所示或與之任一具有同一性的序列；
18)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：75所示或與之任一具有同一性的序列；
19)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：76所示或與之任一具有同一性的序列；
20)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：77所示或與之任一具有同一性的序列；
21)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：78所示或與之任一具有同一性的序列；
22)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：79所示或與之任一具有同一性的序列；
23)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：80所示或與之任一具有同一性的序列；
24)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：81所示或與之任一具有同一性的序列；
25)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：82所示或與之任一具有同一性的序列；
26)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：83所示或與之任一具有同一性的序列；
27)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：84所示或與之任一具有同一性的序列；
28)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：85所示或與之任一具有同一性的序列；
29)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：86所示或與之任一具有同一性的序列；
30)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：87所示或與之任一具有同一性的序列；
31)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：88所示或與之任一具有同一性的序列；
32)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：89所示或與之任一具有同一性的序列；
33)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：90所示或與之任一具有同一性的序列；
34)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：91所示或與之任一具有同一性的序列；
35)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：92所示或與之任一具有同一性的序列；
36)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：93所示或與之任一具有同一性的序列；
37)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：94所示或與之任一具有同一性的序列；
38)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：95所示或與之任一具有同一性的序列；
39)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：96所示或與之任一具有同一性的序列；
40)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：97所示或與之任一具有同一性的序列；
41)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：98所示或與之任一具有同一性的序列；
42)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：99所示或與之任一具有同一性的序列；
43)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：100所示或與之任一具有同一性的序列；
44)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：101所示或與之任一具有同一性的序列；
45)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：102所示或與之任一具有同一性的序列；
46)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：103所示或與之任一具有同一性的序列；或
47)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一或SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：104所示或與之任一具有同一性的序列。
一些實施方案中，提供核酸構建體(例如，DNA或RNA分子)，其包含：
(a)開放閱讀框(ORF)，
(b-1)3’UTR，和
(b-2)5’UTR；
該3’UTR源自基因CTSB、FAM166A或NDUFB9的3’UTR，該5’UTR源自基因ACTG1、CHCHD10或NDUFA11的5’UTR；
例如，該3’UTR包含SEQ ID NO：12、13、14任一或SEQ ID NO：69、70、71任一或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：15、29、30、32任一或SEQ ID NO：72、86、87、89任一或與之任一具有同一性的序列；
又例如，該3’UTR包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：69所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：72所示或與之任一具有同一性的序列，
該3’UTR包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：70所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：72所示或與之任一具有同一性的序列，
該3’UTR包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：71所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：72所示或與之任一具有同一性的序列，
該3’UTR包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：69所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：86所示或與之任一具有同一性的序列，
該3’UTR包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：70所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：86所示或與之任一具有同一性的序列，
該3’UTR包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：71所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：86所示或與之任一具有同一性的序列，
該3’UTR包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：69所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：87所示或與之任一具有同一性的序列，
該3’UTR包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：70所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：87所示或與之任一具有同一性的序列，
該3’UTR包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：71所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：87所示或與之任一具有同一性的序列，
該3’UTR包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：69所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：89所示或與之任一具有同一性的序列，
該3’UTR包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：70所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：89所示或與之任一具有同一性的序列，或
該3’UTR包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：71所示或與之任一具有同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：89所示或與之任一具有同一性的序列。
以上實施方案中，“具有同一性”涵蓋具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%同一性、以及前述任意兩個數值之間的範圍，包括整數和小數。例如“具有至少90%同一性”或“具有至少95%同一性”。
一些實施方案中，該3’UTR和/或5’UTR為上述3’UTR和/或5’UTR的變體，該變體例如為截短體、核苷酸突變體，該變體仍然保持與前述本揭露的3’UTR和/或5’UTR相似的活性或功能，例如仍然保持調控ORF編碼目的基因表達蛋白的功能。
一些實施方案中，前述本揭露提供的核酸構建體中，還包含：
(c)多聚腺苷酸(poly-A)尾。
一些具體實施方案中，該核酸構建體中的poly-A尾位於3’UTR的下游。一些具體實施方案中，該核酸構建體中的poly-A尾位於3’UTR的3’末端。一些具體實施方案中，該poly-A尾在該核酸構建體的3’末端。一些具體實施方案中，poly-A尾的長度為至少約50、100、150、200、300、400、500個核苷酸。
一些具體實施方案中，該poly-A尾選自A120、A30L70、HGH polyA、SV40polyA、BGH polyA、rbGlob polyA或SV40late polyA。例如，該A30L70為SEQ ID NO：52所示的序列。
一些實施方案中，前述本揭露提供的核酸構建體中，表達的目的基因(即，開放閱讀框ORF)為肝細胞生長因子(HGF)、抗體或其抗原結合片段。例如，與腫瘤抗原結合的抗體或其抗原結合片段、與病毒抗原結合的抗體或其抗原結合片段等。
一些具體實施方案中，該ORF編碼的多肽或蛋白是螢光蛋白或螢光素酶(luciferase)，例如SEQ ID NO：126所示的序列。
一些具體實施方案中，該HGF為人肝細胞生長因子(hHGF)。
一些具體實施方案中，hHGF的編碼序列包含選自如下1)-3)的任一項：
1)編碼如SEQ ID NO：109所示胺基酸序列的核酸序列或經密碼子優化的核酸序列；
2)如SEQ ID NO：110-113所示或與之具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%同一性的DNA序列；
3)如SEQ ID NO：128-131任一所示或與之具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%同一性的RNA序列。
一些具體實施方案中，該表達HGF作為目的基因的核酸構建體中包含SEQ ID NO：115、116、127任一所示或與之具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%同一性的序列。
一些具體實施方案中，該抗體或其抗原結合片段為抗PD-1抗體或其抗原結合片段。
一些具體實施方案中，該抗PD-1抗體或其抗原結合片段的編碼序列包含選自如下1)-4)的任一項：
1)編碼如SEQ ID NO：117所示重鏈胺基酸序列的核酸序列或經密碼子優化的核酸序列，和編碼如SEQ ID NO：118所示輕鏈胺基酸序列的核酸序列或經密碼子優化的核酸序列；
2)編碼如SEQ ID NO：117所示重鏈胺基酸序列中HCDR1、HCDR2和HCDR3的核酸序列或經密碼子優化的核酸序列，和編碼如SEQ ID NO：118所示輕鏈胺基酸序列中LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸序列或經密碼子優化的核酸序列，該CDR是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的，例如，是根據Kabat編號系統定義的；
3)如SEQ ID NO：119所示或與之具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%同一性的DNA序列，和如SEQ ID NO：120所示或與之具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%同一性的DNA序列；
4)如SEQ ID NO：121所示或與之具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%同一性的DNA序列，和如SEQ ID NO：122所示或與之具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%同一性的DNA序列。
一些具體實施方案中，該表達抗PD-1抗體或其抗原結合片段的核酸構建體中包含SEQ ID NO：124和125所示的序列，或與SEQ ID NO：124和125具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%同一性的序列。
一些實施方案中，前述本揭露提供的核酸構建體為DNA或RNA，例如，為mRNA。
一些實施方案中，從5’至3’方向上，前述本揭露提供的核酸構建體(DNA或RNA)含有如下1)-6)中任一：
1)5’UTR，和ORF；
2)ORF，和3’UTR；
3)5’UTR，ORF，和3’UTR；
4)5’UTR，ORF，3’UTR，和poly-A尾巴；
5)5’UTR，ORF，和poly-A尾巴；
6)ORF，3’UTR，和poly-A尾巴；
該5’UTR和3’UTR可以源自相同或不同的基因。
一些實施方案中，從5’至3’方向上，前述本揭露提供的核酸構建體(DNA)含有如下1)-4)中任一：
1)5’UTR，和ORF；
2)ORF，和3’UTR；
3)5’UTR，ORF，和3’UTR；
4)5’UTR，ORF，3’UTR，和poly-A尾巴；
該5’UTR和3’UTR可以源自相同或不同的基因。
一些具體實施方案中，該1)、3)、4)中的5’UTR包含或為如SEQ ID NO：15-47任一所示的核苷酸序列。一些具體實施方案中，該1)-4)中的ORF包含或為如SEQ ID NO：110所示或其密碼子優化的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：111-113)。一些具體實施方案中，該1)-4)中的ORF包含或為如SEQ ID NO：119和120所示的核苷酸序列。一些具體實施方案中，該2)-4)中的3’UTR包含或為如SEQ ID NO：1-14任一所示的核苷酸序列。
一些實施方案中，前述本揭露提供的核酸構建體(RNA或mRNA)還包含：
(d)5’帽結構(5’Cap)。
一些具體實施方案中，該RNA分子中的5’Cap結構位於5’UTR的上游。一些實施方案中，該RNA分子中的5’Cap結構位於5’UTR的5’末端。在一些實施方案中，5’帽結構是所屬技術領域具有通常知識者已知的帽結構，如Cap0(第一個核鹼基的甲基化，例如m7GpppN)、Cap1(m7GpppN的相鄰核苷酸的核糖的額外甲基化，例如m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG)、Cap2(m7GpppN下游第3個核苷酸的核糖的額外甲基化)、Cap3(m7GpppN下游第3個核苷酸的核糖的額外甲基化)、Cap4(m7GpppN下游第4個核苷酸的核糖的額外甲基化)、ARCA(抗反向帽類似物)、修飾的ARCA(例如，硫代磷酸酯修飾的ARCA)、肌苷、N1-甲基-鳥苷、2’-氟-鳥苷、7-脫氮-鳥苷、8-側氧-鳥苷、2-胺基-鳥苷、LNA-鳥苷和2-疊氮基-鳥苷。
一些具體實施方案中，使用化學RNA合成或RNA體外轉錄(共轉錄加帽)形成5’Cap結構(如Cap0或Cap1)。
一些具體實施方案中，使用加帽酶(例如牛痘病毒加帽酶和/或帽依賴性2’-O甲基轉移酶)經由酶促加帽來形成5’-帽結構(如Cap0或Cap1)。一些實施方案中，使用固定化加帽酶，添加5’帽結構(Cap0或Cap1)。此處全文引入WO2016/193226中的加帽方法和手段。
一些具體實施方案中，該5’Cap選自ARCA、3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pU、m7Gppp(A2’O-MOE)pG、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)pG、m7(3’OMeG)(5’)ppp(5’)(2’OMeG)pG或m7(3’OMeG)(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG。一些具體實施方案中，該5’Cap為3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G或m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG。
一些實施方案中，從5’至3’方向上，前述本揭露提供的核酸構建體(RNA或mRNA)含有如下1)-5)中任一：
1)5’UTR，和ORF；
2)ORF，和3’UTR；
3)5’UTR，ORF，和3’UTR；
4)5’UTR，ORF，3’UTR，和poly-A尾巴；
5)5’Cap，5’UTR，ORF，3’UTR，和poly-A尾；
該5’UTR和3’UTR可以源自相同或不同的基因。
一些具體實施方案中，該1)、3)、4)、5)中的5’UTR包含或為如SEQ ID NO：72-104任一所示的核苷酸序列。一些具體實施方案中，該1)-5)中的ORF包含或為如SEQ ID NO：128-131任一所示的核苷酸序列。一些具體實施方案中，該2)-5)中的3’UTR包含或為如SEQ ID NO：58-71任一所示的核苷酸序列。一些具體實施方案中，結構包括但不限於Cap0、Cap1(例如m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG)、Cap2、Cap3、Cap4、ARCA。
一些實施方案中，本揭露提供核酸構建體(DNA)，從5’至3’方向上，依次包含5’UTR、ORF、3’UTR，可選地，可在3’方向上進一步包含poly-A尾。一些實施方案中，該5’UTR包含或為如SEQ ID NO：15-47任一所示的核苷酸序列，該ORF包含或為如SEQ ID NO：110所示或其密碼子優化的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：111-113)，該3’UTR包含或為如SEQ ID NO：1-14任一所示的核苷酸序列。一些實施方案中，該5’UTR包含或為如SEQ ID NO：15-47任一所示的核苷酸序列，該ORF包含或為如SEQ ID NO：119和120所示的核苷酸序列，該3’UTR包含或為如SEQ ID NO：1-14任一所示的核苷酸序列。
一些實施方案中，本揭露提供核酸構建體(RNA或mRNA)，從5’至3’方向上，依次包含5’UTR、ORF、3’UTR，可選地，可在3’方向上進一步包含poly-A尾。一些實施方案中，該5’UTR包含或為如SEQ ID NO：72-104任一所示的核苷酸序列，該ORF包含或為如SEQ ID NO：128-131任一所示的核苷酸序列，該3’UTR包含或為如SEQ ID NO：58-71任一所示的核苷酸序列，和該poly-A尾巴包含或為120個連續的腺苷酸或如SEQ ID NO：52所示的核苷酸序列。一些具體實施方案中，該核酸構建體包含如SEQ ID NO：115、116或127所示的核苷酸序列。
一些實施方案中，該5’UTR包含或為如SEQ ID NO：72-104任一所示的核苷酸序列，該ORF包含或為如SEQ ID NO：121和122所示的核苷酸序列，該3’UTR包含或為如SEQ ID NO：58-71任一所示的核苷酸序列，和該poly-A尾巴包含或為120個連續的腺苷酸或如SEQ ID NO：52所示的核苷酸序列。一些具體實施方案中，該核酸構建體包含如SEQ ID NO：124或125所示的核苷酸序列。
一些實施方案中，前述任一種核酸構建體(DNA或RNA分子)，其中，該UTR用於提高該ORF表達蛋白的表達水平。示例性地，一些具體的實施方案中，與SEQ ID NO：48或50所示的5’UTR相比，本揭露中SEQ ID NO：15-47、72-104任一序列所示的5’UTR具有提高的調控ORF表達目標蛋白的表達量。一些具體的實施方案中，與SEQ ID NO：49或51所示的5’UTR相比，本揭露中SEQ ID NO：1-14、58-71任一序列所示的3’UTR具有提高的調控ORF表達目標蛋白的表達量。一些具體的實施方案中，與SEQ ID NO：48和49所示的5’UTR和3’UTR的組合相比，本揭露中SEQ ID NO：15-47、72-104任一序列所
示的5’UTR，與SEQ ID NO：1-14、58-71任一序列所示的3’UTR的組合，具有提高的調控ORF表達目標蛋白的表達量。一些具體的實施方案中，與SEQ ID NO：50和51所示的5’UTR和3’UTR的組合相比，本揭露中SEQ ID NO：15-47、72-104任一序列所示的5’UTR，與SEQ ID NO：1-14、58-71任一序列所示的3’UTR的組合，具有提高的調控ORF表達目標蛋白的表達量。
一些實施方案中，本揭露中的核酸構建體，其表達目標蛋白的表達量是BioN載體的約1-約20倍，例如約1倍、約1.1倍、約1.2倍、約1.3倍、約1.4倍、約1.5倍、約1.6倍、約1.7倍、約1.8倍、約1.9倍、約2倍、約2.1倍、約2.3倍、約2.5倍、約2.8倍、約3倍、約3.2倍、約3.4倍、約3.8倍、約4倍、約4.5倍、約5倍、約5.2倍、約5.5倍、約5.8倍、約6倍、約7倍、約8倍、約10倍、約12倍、約15倍等。一些具體的實施方案中，本揭露中的核酸構建體為表達目標蛋白的mRNA分子，該mRNA分子表達目標蛋白的表達量是BioN載體的約1-約20倍。一些具體的實施方案中，該BioN載體包含SEQ ID NO：50或107所示的5’UTR；和/或，包含SEQ ID NO：51或108所示的3’UTR。
一些實施方案中，本揭露中的核酸構建體，其表達目標蛋白的表達量是Mod載體的約1-約20倍，例如約1倍、約1.1倍、約1.2倍、約1.3倍、約1.4倍、約1.5倍、約1.6倍、約1.7倍、約1.8倍、約1.9倍、約2倍、約2.1倍、約2.3倍、約2.5倍、約2.8倍、約3倍、約3.2倍、約3.4倍、約3.8倍、約4倍、約4.5倍、約5倍、約5.2倍、約5.5倍、約5.8倍、約6倍、約7倍、約8倍、約10倍、約12倍、約15倍等。一些具體的實施方案中，本揭露中的核酸構建體為表達目標蛋白的mRNA分子，該mRNA分子表達目標蛋白的表達
量是BioN載體的約1-約20倍。一些具體的實施方案中，該Mod載體包含SEQ ID NO：48或105所示的5’UTR；和/或，包含SEQ ID NO：49或106所示的3’UTR。
一些實施方案中，本揭露中的核酸構建體被遞送於受試者體內，在約0.5-1.5h後表達目標蛋白(例如，hHGF蛋白)。一些實施方案中，本揭露中的核酸構建體被遞送於受試者體內，在約2h-10h(例如，約2h、約3h、約4h、約5h、約6h、約7h、約8h、約10h等)達到表達峰值。一些具體的實施方案中，本揭露中的核酸構建體為表達目標蛋白的mRNA分子，例如，該核苷酸構建體為表達hHGF蛋白的mRNA分子。
一些實施方案中，本揭露中的核酸構建體被遞送於受試者體內，具有高於Collategene質粒的藥物代謝動力學性能。一些具體的實施方案中，核酸構建體為mRNA分子，該mRNA分子與Collategene質粒相比，具有提高的藥物代謝動力學性能(例如，Cmax、AUC0-inf、MRT0-inf)。
一些實施方案中，本揭露中的核酸構建體(例如，表達hHGF蛋白的m-A16-B12(hHGF))，能夠改善缺受試者血下肢的血流灌注比率。示例性地，注射50ng/隻、500ng/隻的m-A16-B12(hHGF)的下肢缺血小鼠可實現改善的血流灌注比率。其中，注射約500ng/隻m-A16-B12(hHGF)的下肢缺血小鼠可實現恢復至約90%以上的血流灌注。
一些實施方案中，本揭露中的核酸構建體(例如，表達hHGF蛋白的m-A16-B12(hHGF))，能夠改善誘導下肢缺血的受試者的缺血性壞死。示例性地，注射50ng/隻、500ng/隻的m-A16-B12(hHGF)的下肢缺血小鼠的下肢均能保持良好的完整性且並未出現下肢壞死情況。
一些實施實施方案中，本揭露中的核酸構建體(例如，表達hHGF蛋白的m-A16-B12(hHGF))，可促進各組缺血下肢肌肉中的血管新生。示例性地，在給予50ng/隻、500ng/隻的m-A16-B12(hHGF)治療的情況下，均可顯著促進各組缺血下肢肌肉中的血管新生，且新生血管數量相對PBS組具有明顯的統計學差異(p<0.05)。
一些實施方案中，本揭露中的核酸構建體(例如，表達hHGF蛋白的m-A16-B12(hHGF))，能夠改善糖尿病受試者的創面癒合。示例性地，在注射50ng/隻、200ng/隻和500ng/隻m-A16-B12(hHGF)的Db/Db糖尿病小鼠模型，小鼠的創面均得到良好的癒合。其中，在第14天，50ng/隻劑量的m-A16-B12(hHGF)創面癒合率達66%，200ng/隻和500ng/隻劑量的m-A16-B12(hHGF)能實現100%的傷口癒合。
本揭露提供的mRNA，其含有新結構的5’UTR、3’UTR，使得mRNA的早期降解降低或穩定降解，但不損失更或增強蛋白轉譯效率。該mRNA穩定性更高，可應用於基因治療、基因接種疫苗。以及，本揭露提供能夠表達人肝細胞生長因子(Human Hepatocyte growth factor,hHGF)的mRNA，及其脂質奈米顆粒(Lipid nanoparticles,LNP)遞送系統，可以實現外源hHGF蛋白在體內高效、快速轉化，具有無整合風險、易於工業級放大的優點，是較裸質粒更為理想的治療方案，可用作CLI、DFU等多種疾病的基因治療藥物。
多核苷酸
本揭露還提供經分離的多核苷酸，其包含(a)開放閱讀框(ORF)。示例性地，開放閱讀框(ORF)編碼肝細胞生長因子(HGF)，例如人肝細胞生長因子(hHGF)。
一些實施方案中，該hHGF的編碼序列包含選自如下1)-3)的任一項：
1)編碼如SEQ ID NO：109所示胺基酸序列的核酸序列或其密碼子優化的序列；
2)如SEQ ID NO：110-113任一所示或與之具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%同一性的DNA序列；
3)如SEQ ID NO：128-131任一所示或與之具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%同一性的RNA序列。
一些具體實施方案中，該多核苷酸的5’端可以包含前述本揭露提供的任意5’UTR，和/或該多核苷酸的3’端可以包含前述本揭露提供的任意3’UTR。
一些具體實施方案中，該多核苷酸的5’端可以包含前述本揭露提供的任意5’Cap，和/或該多核苷酸的3’端可以包含前述本揭露提供的任意poly-A尾。
一些實施方案中，該多核苷酸是RNA，例如mRNA。
修飾
為了進一步改善本揭露的RNA或多核苷酸的關於蛋白質表達的穩定性，該RNA或多核苷酸可進一步包含一種或多種修飾(包括化學修飾)，例如骨架修飾、糖修飾、鹼基修飾和/或脂質修飾等。在一些實施方案中，該RNA或多核苷酸被均勻地修飾成某個特定修飾(例如，在整個序列中完全修飾)。例如，可以用假尿苷(例如，N1-甲基假尿苷)均勻地修飾RNA，使得序列中的每個U是假尿苷。
與本揭露有關的骨架修飾是指本揭露RNA或多核苷酸中包含的核苷酸的骨架的磷酸酯的化學修飾。一些實施方案中，該骨架修飾包括但不限於用修飾的磷酸酯完全取代骨架中未修飾的磷酸酯部分，例如可以藉由用不同的取代基取代一個或多個氧原子來修飾主鏈的磷酸基團。一些實施方案中，該修飾的磷酸酯包括但不限於硫代磷酸酯、亞磷酸硒酸酯、硼烷磷酸酯、硼烷磷酸酯、膦酸氫酯、胺基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。
與本揭露有關的糖修飾是指本揭露RNA或多核苷酸中包含的核苷酸的糖的化學修飾。一些實施方案中，該糖修飾包括但不限於將RNA分子的2’羥基(OH)修飾或替換為許多不同的”氧基”或”脫氧”取代基。一些實施方案中，該”氧基”修飾包括但不限於烷氧基、芳氧基、聚乙二醇(PEG)等的取代修飾。一些實施方案中，”脫氧”修飾包括但不限於氫、胺基(例如NH2、烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、二雜芳基胺基或胺基酸)修飾。
與本揭露有關的鹼基修飾是指本揭露RNA或多核苷酸中包含的核苷酸的鹼基部分的化學修飾。一些實施方案中，該鹼基修飾包括對核苷酸中腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶的修飾。例如，本文所述的核苷和核苷酸可在主凹槽表面上被化學修飾。一些實施方案中，主要的凹槽化學修飾可包括胺基、硫醇基、烷基或鹵素基團。一些實施方案中，該鹼基修飾包括但不限於用假尿苷、1-甲基-偽尿苷、5-氮雜胞苷、5-甲基胞嘧啶-5’-三磷酸或2-甲氧基腺嘌呤修飾。一些實施方案中，該鹼基修飾為假尿苷修飾。例如，可以用假尿苷均勻地修飾RNA，使得序列中的每個U是假尿苷。
與本揭露有關的脂質修飾是指本揭露RNA或多核苷酸中包含脂質修飾。一些實施方案中，該脂質修飾包括但不限於本揭露的RNA或多核苷酸共價連接至少一個接頭，以及相應的接頭與至少一個脂質共價連接。一些實施方案中，該脂質修飾包括但不限於本揭露的RNA或多核苷酸與至少一個脂質共價連接(無接頭)。
UTRs
UTRs(5’UTR和/或3’UTR)可以作為側翼區域提供給本揭露的核酸構建體、RNA或多核苷酸分子。UTRs可以與在本揭露的核酸構建體、RNA或多核苷酸分子中的編碼區同源或異源。側翼區域可以包含一個或多個5’UTR和/或3’UTR，該UTRs可以是相同的或不同的序列。側翼區域的任何部分可以進行密碼子優化。在密碼子優化之前和/或之後，側翼區域的任何部分可以獨立地包含一個或多個不同的結構或化學修飾。
為了改變本揭露的核酸構建體、RNA或多核苷酸的一種或多種特性，將與本揭露的ORF異源的UTRs引入或工程化合成到本揭露的核酸構建體、RNA或多核苷酸中。然後將該重組核酸構建體、RNA或多核苷酸施用於細胞、組織或生物體，並測量結果，如蛋白質水平、定位和/或半衰期，以評估異源UTR對本揭露的、RNA或多核苷酸產生的有益影響。一些實施方案中，該UTR包括野生UTR或其變體，該UTR變體包括在末端添加或去除一個或多個核苷酸，包括A、T、C或G。一些實施方案中，該UTR變體也包括任何方式進行的密碼子優化或修改。一些實施方案中，該UTR變體也包括本揭露任何實施方式的衍生序列，例如在天然UTR序列的基礎上，將部分核苷酸進行點突變，突變後的變
體的對目的基因表達量、穩定性維持不變或得到提高。該對目的基因表達量、穩定性的檢測方法是本領域常規的，例如本揭露實施例3、4中的檢測方法。
載體
本揭露還提供載體，其包含前述任一項所述的核酸構建體、RNA或多核苷酸。其中核酸構建體、RNA或多核苷酸可存在於載體中和/或可為載體的一部分，該載體例如質粒、黏端質粒、YAC或病毒載體。載體可為表達載體，即可提供核酸構建體、RNA或多核苷酸編碼多肽表達的載體。該表達載體通常包含至少一種本揭露的核酸，其可操作地連接至一個或多個適合的表達調控元件(例如啟動子、終止子等)。針對在特定宿主中的表達對該元件及其序列進行選擇為所屬技術領域具有通常知識者的常識。對本揭露的編碼多肽的表達有用或必需的調控元件及其他元件例如為啟動子、終止子、選擇標記物、前導序列、報告基因等。
一些實施方案中，該載體是能表達本揭露目的基因(例如HGF)的治療載體，例如質粒(例如裸質粒)，腺病毒載體，腺相關病毒載體，和慢病毒載體。
本揭露的核酸構建體可基於本揭露的核苷酸序列的信息藉由已知的方式(例如藉由自動DNA合成和/或重組DNA技術)製備或獲得，和/或可從適合的天然來源加以分離。
一些實施方案中，本揭露的載體還包含啟動子，例如該啟動子在該核酸構建體5’UTR的5’末端，例如該啟動子為T7啟動子、T7 lac啟動子、Tac啟動子、Lac啟動子、Trp啟動子。
宿主細胞
本揭露還提供一種宿主細胞，其包含前述任一項所述的核酸構建體、RNA或多核苷酸。一些實施方案中，該細胞能夠表達一種或多種本揭露核酸構建體、RNA或多核苷酸編碼的多肽。一些實施方案中，該宿主細胞為細菌細胞、真菌細胞或哺乳動物細胞。
細菌細胞例如包括革蘭氏陰性細菌菌株(例如大腸桿菌(Escherichia coli)菌株、變形桿菌屬(Proteus)菌株及假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株)及革蘭氏陽性細菌菌株(例如芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株、鏈黴菌屬(Streptomyces)菌株、葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌株及乳球菌屬(Lactococcus)菌株)的細胞。
真菌細胞例如包括木黴屬(Trichoderma)、脈孢菌屬(Neurospora)及麴菌屬(Aspergillus)的物種的細胞；或者包括酵母屬(Saccharomyces)(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、畢赤酵母屬(Pichia)(例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)及嗜甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica))及漢森酵母屬(HansenuLa)的物種的細胞。
哺乳動物細胞例如包括例如HEK293細胞、CHO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞等。
然而，本揭露也可使用兩栖類細胞、昆蟲細胞、植物細胞及本領域中用於表達異源蛋白的任何其他細胞。
生產或製備方法
本揭露提供一種製備本揭露核酸構建體、RNA或多核苷酸的方法，以及製備其編碼多肽的方法。
用於製備產生核酸構建體、RNA或多核苷酸，及其編碼多肽的方法及試劑，例如特定適合載體、轉化或轉染方法、選擇標記物、誘導蛋白表達的方法、培養條件等在本領域中是已知的。類似地，適用於製造本揭露的編碼多肽的方法中的蛋白分離及純化技術為所屬技術領域具有通常知識者所公知。
一些實施方案中，該製備核酸構建體或多核苷酸的方法包括培養前述的宿主細胞，並從培養物中回收產生的核酸構建體或多核苷酸。本揭露的核酸構建體或多核苷酸，及其編碼多肽也可以藉由本領域已知的其它產生方法獲得，例如化學合成，包括固相或液相合成。
一些實施方案中，製備RNA分子的方法包括：製備核酸構建體或載體，然後利用該核酸構建體或載體進行逆轉錄，得到RNA分子。一些具體的實施方案中，該方法還包括對該RNA分子的5’端添加5’Cap。
一些實施方案中，RNA可進一步包含一種或多種修飾(包括化學修飾)，例如骨架修飾、糖修飾、鹼基修飾和/或脂質修飾等。在一些實施方案中，該RNA或多核苷酸被均勻地修飾成某個特定修飾(例如，在整個序列中完全修飾)。例如，可以用假尿苷(例如，N1-甲基假尿苷)均勻地修飾RNA，使得序列中的每個U是假尿苷(例如，N1-甲基假尿苷)。
遞送媒介物
本揭露還提供遞送媒介物，其包含前述任一項所述的核酸構建體、前述任意的RNA分子、多核苷酸或載體，其中該遞送媒介物是陽離子脂質遞送顆粒。一些實施方案中，其中該顆粒是奈米顆粒。一些實施方案中，該遞送媒介物是奈米脂質顆粒。本揭露中的核酸構建體、RNA分子多核苷酸或載體可以使用本領域任意類型的奈米脂質顆粒實現向細胞內和/或體內的遞送，示例性地，
奈米脂質顆粒包括但不限於WO2017075531、WO2018081480A1、WO2017049245A2、WO2017099823A1、WO2022245888A1、WO2022150717A1、CN101291653A、CN102119217A、WO2011000107A1、CN107028886A、US9868692B2中所揭露的脂質顆粒，上述專利藉由引用全文併入本揭露。
一些實施方案中，遞送媒介物包含US9868692B2中示出的奈米脂質顆粒，例如，式B所示的可離子化脂質(又稱，SM-102)。一些實施方案中，遞送媒介物包含奈米脂質顆粒、磷脂、結構脂質、和/或PEG脂質。示例性地，遞送媒介物包含脂質組分包含約50mol%的該可電離脂質(例如，SM-102)、約10mol%的磷脂(例如，DSPC)、約38.5mol%的結構脂質(例如，膽固醇)和約1.5mol%的PEG脂質(例如，PEG-DMG)。
醫藥組成物
本揭露還提供醫藥組成物，其包含本揭露前述任意的核酸構建體、前述任意的RNA分子、前述任意的多核苷酸、前述任意的載體，和/或前述任意的遞送媒介物，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，具體地，該醫藥組成物為固體製劑、注射劑、外用製劑、噴劑、液體製劑、或複方製劑。
產品或試劑盒
本揭露提供產品或試劑盒，其包含前述任一項所述的核酸構建體、前述任意的RNA分子、前述任一項所述的多核苷酸、前述任一項所述的疫苗、前述任一項所述的載體、前述任一項所述的遞送媒介物，和/或前述任一項所述的醫藥組成物。該試劑盒可用於提供相關檢測或診斷用途。
治療和/或預防疾病的方法和製藥用途
本揭露還提供治療或預防疾病的方法，包括向有需要的受試者使用治療和/或預防有效量的前述任意的核酸構建體、前述任意的RNA分子、前述任意的多核苷酸、前述任意的載體、前述任意的遞送媒介物，前述任意的醫藥組成物，和/或前述任意的產品或試劑盒。
本揭露同時提供前述任意的核酸構建體、前述任意的RNA分子、前述任意的多核苷酸、前述任意的載體、前述任意的遞送媒介物，前述任意的醫藥組成物，和/或前述任意的產品或試劑盒用於製備治療和/或預防疾病的藥物的用途。
一些實施方案中，該疾病為受試者可受益於天然hHGF的活性的疾病。
一些實施方案中，該疾病選自缺血性疾病、代謝綜合症、糖尿病及其併發症、再狹窄，以及神經損傷。一些具體實施方案中，該疾病為缺血性疾病，例如冠狀動脈疾病(CAD)或外周動脈疾病(Peripheral artery disease,PAD)，例如心肌梗死或下肢動脈缺血。一些具體實施方案中，該疾病為糖尿病或其併發症，例如糖尿病周圍神經病變。一些具體實施方案中，該疾病為再狹窄，例如手術後再狹窄和灌注後再狹窄。一些具體實施方案中，該疾病為神經損傷，例如神經退行性疾病(例如肌萎縮性側索硬化(ALS)，帕金森氏病，癡呆病)、創傷性神經損傷、周圍神經病變(例如糖尿病周圍神經病變)。一些具體實施方案中，該疾病選自下肢動脈缺血、心肌梗死和糖尿病周圍神經病變。
一些實施方案中，該疾病選自外周動脈疾病(PAD)、動脈粥樣硬化(Atherosclerosis obliterans,ASO)、糖尿病性動脈硬化閉塞症(Diabetic artery obliterans,DAO)、血栓閉塞性脈管炎(Thrombosis angiitis obliterans,TAO)。一些
實施方案中，該疾病選自肢體缺血(例如，下肢缺血、嚴重下肢缺血(Critical limb ischemia,CLI))、糖尿病足(Diabetic foot ulcer,DFU)。
一些實施方案中，提供了促進內皮細胞(例如臍靜脈內皮細胞)生長和/或遷移的方法，包括向有需要的內皮細胞或受試者施用有效量的本揭露前述任意的多核苷酸、前述任意的載體、前述任意的遞送媒介物，前述任意的醫藥組成物，和/或前述任意的產品或試劑盒。同時提供相關製備促進內皮細胞生長和/或遷移藥物的製藥用途。
一些實施方案中，提供了促進血管發生的方法，包括向有需要的內皮細胞或受試者施用有效量的本揭露前述任意的多核苷酸、前述任意的載體、前述任意的遞送媒介物，前述任意的醫藥組成物，和/或前述任意的產品或試劑盒。一些實施方案中，該血管發生為微小血管發生。同時提供相關製備促進血管發生(例如微小血管發生)藥物的製藥用途。
有益效果
本揭露提供的目的基因為HGF的核酸構建體、載體、遞送媒介物、醫藥組成物、產品或試劑盒可有利地應用於以下一個或多個方面：促進內皮細胞生長和/或遷移；促進血管(例如微小血管)發生；治療缺血性疾病，例如冠狀動脈疾病(CAD)或外周動脈疾病(PAD)，例如肢體缺血(例如下肢缺血、嚴重下肢缺血)；治療代謝綜合症和糖尿病及其併發症(例如，糖尿病周圍神經病變、糖尿病足)；抑制再狹窄；和促進神經損傷(例如，神經退行性疾病，創傷性神經損傷，周圍神經病變)修復。
圖1A至圖1C為載體構建示意圖。其中，圖1A為5’UTR元件篩選載體構建的示意圖，對照為含有Moderna公司的5’UTR及3’UTR元件的mRNA序列，即5’UTR-Fluc-α球蛋白3’UTR-120A(簡稱為Mod.)，其5’-UTR為人工核酸序列，3’UTR源自人α球蛋白的mRNA。構建5’UTR篩選載體時，藉由合適的酶切位點替換5’UTR區域。PmeI為線性化酶切位點。圖1B為3’UTR元件篩選載體構建的示意圖，對照為Mod.，構建3’UTR篩選載體時，藉由合適的酶切位點替換3’UTR區域。圖1C為5’及3’UTR元件組合篩選載體構建的示意圖，對照為Mod.，構建5’UTR及3’UTR元件組合篩選載體時，藉由合適的酶切位點替換5’及3’UTR區域或全基因合成。
圖2為本揭露不同的3’UTR元件在不同細胞系中的效果評估結果。將含有不同3’UTR元件的mRNA轉染至HEK293、HeLa和A549細胞中，在轉染後24h檢測螢光素酶表達，評估3’UTR序列對蛋白表達量的影響。使用Mod.作為對照，並將Mod.的表達水平設為1。結果顯示，在不同細胞系中，3’UTR元件對蛋白表達量的影響具有一致性。
圖3為本揭露不同3’UTR元件對mRNA表達效率的影響結果。將含有不同3’UTR元件的mRNA藉由脂轉染轉導至HEK293細胞中，在轉染6h、24h、48h和72h後檢測螢光素酶的表達水平。使用Mod.作為對照，將其表達水平設為1。結果顯示，編號為B9、B10、B12、B13、B14的3’UTR元件可顯著提高蛋白的表達量。
圖4為本揭露不同5’UTR元件對mRNA表達效率的影響結果。將含有不同5’UTR元件的mRNA藉由脂轉染轉導至HEK293細胞中，在轉染6h、24h、48h和72h後檢測螢光素酶的表達水平。使用Mod.作為對照，將其表
達水平設為1。結果顯示，編號為A1、A3-A7、A9-A14的5’UTR元件可顯著提高蛋白的表達量。
圖5為本揭露不同5’UTR元件對mRNA表達效率的影響結果。將含有不同5’UTR元件的mRNA藉由脂轉染轉導至HEK293細胞中，在轉染6h、24h、48h和72h後檢測螢光素酶的表達水平。使用Mod.作為對照，將其表達水平設為1。結果顯示，編號為A15、A16、A18-A19、A21、A24、A27、A28、A30-A33的5’UTR元件可顯著提高蛋白的表達量。
圖6為本揭露不同5’UTR元件對mRNA表達效率的影響結果。將含有不同5’UTR元件的mRNA藉由脂轉染轉導至HEK293細胞中，在轉染6h、24h和48h後檢測螢光素酶的表達水平。使用BioN.作為對照，將其表達水平設為1。結果顯示，編號為A1、A15、A16和A18的5’UTR元件相較於對照的核酸分子均可顯著提高蛋白的表達量。
圖7為本揭露UTR元件組合對mRNA表達效率的影響結果。將含有不同5’UTR和3’UTR元件的mRNA藉由脂轉染轉導至HEK293細胞中，在轉染6h、24h、48h和72h後檢測螢光素酶的表達水平。使用Mod.作為對照，將其表達水平設為1。結果顯示，編號為A1、A15、A16、A18的5’UTR元件與編號為B12、B13、B14的3’UTR元件進行組合均可顯著提高蛋白的表達量。
圖8A至圖8B為本揭露UTR元件組合對不同目的蛋白的表達效率的影響結果。圖8A為HEK293細胞中，含有本揭露篩選出的5’UTR及3’UTR元件的mRNA對hHGF表達量的調控，結果顯示，相較於對照Mod.，編號為A1A15、A16、A18的5’UTR元件與編號為B12、B13、B14的3’UTR元件進行組合可顯著提高hHGF的表達量。圖8B為HEK293細胞中，含有本揭露篩選出的
5’UTR及3’UTR元件的mRNA對抗PD-1抗體表達量的調控，結果顯示，相較於對照Mod.，A1-B12、A15-B12的UTR組合可顯著提高抗PD-1抗體的表達量。
圖9為本揭露m-A16-B12(hHGF)及對照質粒在小鼠肌肉組織中hHGF蛋白表達水平隨時間變化的實驗結果示意圖。結果顯示，注射m-A16-B12(hHGF)及Collategene質粒均可有效表達hHGF蛋白，m-A16-B12(hHGF)於肌肉注射1h後即可表達hHGF，注射後6h，出現hHGF的表達峰值，呈劑量依賴，且低劑量的m-A16-B12(hHGF)即可達到與Collategene表達AUCinf(hr*pg/mg protein)相當的水平。
圖10A至圖10B為本揭露m-A16-B12(hHGF)及對照質粒對下肢缺血小鼠模型治療效果的結果。圖10A為表明m-A16-B12(hHGF)及Collategene質粒對下肢缺血小鼠模型血流灌注影響的研究方案示意圖及實驗結果照片。圖10B為表明m-A16-B12(hHGF)及Collategene質粒對下肢缺血小鼠模型血流灌注比率的統計結果。結果顯示，在50ng/隻、500ng/隻的m-A16-B12(hHGF)和200ng/隻的Collategene裸質粒進行治療的情況下，各小鼠缺血下肢的血流灌注比率相對於對照組有明顯的改善，且缺血下肢的血流灌注比率隨時間的進展逐漸得到恢復；50ng/隻m-A16-B12(hHGF)組表現出與200ng/隻Collategene裸質粒組相近的血流恢復效果；500ng/隻m-A16-B12(hHGF)組顯著優於200ng/隻Collategene裸質粒組的血流恢復效果，可實現恢復至90%以上的血流灌注情況。
圖11A至圖11B為本揭露m-A16-B12(hHGF)及對照質粒對下肢缺血小鼠模型治療效果的結果。圖11A為下肢缺血小鼠模型下肢壞死不同程度的評分標準及代表性照片。圖11B為表明m-A16-B12(hHGF)及Collategene質粒對下肢缺血小鼠模型下肢壞死影響的統計結果。實驗結果顯示，在注射m-A16-
B12(hHGF)和Collategene裸質粒治療組中，各小鼠的下肢均能保持良好的完整性且並未出現下肢壞死情況。
圖12為本揭露m-A16-B12(hHGF)及對照質粒對下肢缺血小鼠模型血管新生影響的代表性照片及統計結果。結果顯示，給予50ng/隻、500ng/隻的m-A16-B12(hHGF)和200ng/隻的Collategene裸質粒治療的情況下，均可顯著促進缺血下肢肌肉中的血管新生。
圖13為本揭露m-A16-B12(hHGF)及對照質粒對全皮層損傷的Db/Db小鼠模型創口影響的治療方案、代表性照片及統計結果。結果顯示，在50ng/隻、200ng/隻和500ng/隻m-A16-B12(hHGF)和200μg/隻Collategene裸質粒的處理下，相對於對照組，小鼠的創面均得到良好的癒合，且m-A16-B12(hHGF)的促創面癒合情況顯著優於200μg/隻Collategene裸質粒。
圖14為本揭露m-A16-B12(hHGF)及對照質粒對全皮層損傷的Db/Db小鼠模型組織重構影響的代表性照片。結果顯示，在m-A16-B12(hHGF)的治療下，各組小鼠創面上皮均完成上皮全覆蓋，完成組織重構。而對照組及200μg/隻Collategene裸質粒組均未完成上皮再覆蓋，創口處膠原蛋白異常增生，結構紊亂。
術語
為了更容易理解本揭露，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本揭露所屬技術領域具有通常知識者通常理解的含義。
本揭露的“HGF”涵蓋天然或野生型HGF及其不同物種來源的同源物，包括具有生物學活性的、天然存在的人肝細胞生長因子(human hepatocyte growth factor，hHGF)及其變體。可方便地從各種公共數據庫(例如，GenBank數據庫)獲得天然或野生型hHGF的胺基酸序列。例如，天然hHGF的胺基酸序列可見於GenBank數據庫登錄號：NP_000592.3。又例如，本揭露提供胺基酸序列如SEQ ID NO：109、DNA序列如SEQ ID NO：110、密碼子優化序列如SEQ ID NO：111-113所示的hHGF。HGF具有多種生物學活性，包括但不限於以下的一種或多種活性：(1)促進內皮細胞生長和/或遷移；(2)促進血管(例如微小血管)發生；和/或，(3)促進神經損傷(例如周圍神經病變，例如糖尿病周圍神經病變)修復。因此，HGF可在多個方面具有應用前景，包括但不限於：(1)促進內皮細胞生長和/或遷移；(2)促進血管(例如微小血管)發生；(3)治療缺血性疾病，例如冠狀動脈疾病(CAD)或外周動脈疾病(PAD)，例如下肢動脈缺血；(4)治療代謝綜合症和糖尿病及其併發症(例如，糖尿病周圍神經病變)；(5)抑制再狹窄；和(6)促進神經損傷(例如，神經退行性疾病，創傷性神經損傷，周圍神經病變)修復。因此，術語“可受益於天然hHGF的活性的疾病”的實例包括但不限於上述疾病，例如，缺血性疾病，代謝綜合症，糖尿病及其併發症，再狹窄，神經損傷等。
“核酸”或“核苷酸”包括RNA、DNA和cDNA分子。應當理解，由於遺傳密碼的簡並性，可以產生編碼給定蛋白質的大量核苷酸序列。術語核酸可以與術語“多核苷酸”互換使用。“寡核苷酸”是短鏈核酸分子。“引子”是寡核苷酸，無論是天然存在於純化的限制酶切消化中還是合成產生，當置於誘導與核酸鏈互補的引子延伸產物的合成的條件(即在核苷酸和誘導劑例如DNA聚合酶的存在下，並在合適的溫度和pH下)下能夠充當合成起始點。為了最大化擴增效率，
引子較佳是單鏈的，但另外可選地可以是雙鏈的。如果是雙鏈的，則在用於製備延伸產物之前，首先對引子進行處理以分離其鏈。較佳地，引子是脫氧核糖核苷酸。引子必須足夠長以在誘導劑的存在下引發延伸產物的合成。引子的確切長度將取決於許多因素，包括溫度、引子來源和使用的方法。
“載體”或“表達載體”是指複製子，例如質粒、杆粒、噬菌體、病毒、病毒體或黏粒，可連接另一個DNA區段，即“插入物”以實現連接區段在細胞中的複製。載體可以是設計用於遞送至宿主細胞或用於在不同宿主細胞之間轉移的核酸構建體。如本文所用，載體在起源和/或最終形式上可以是病毒或非病毒的，如本文所用的PUC57 DNA載體。術語“載體”涵蓋與適當的控制元件結合時能夠複製並且可以將基因序列轉移至細胞的任何遺傳元件。在一些實施方案中，載體可以是表達載體或重組載體。
“啟動子”是指藉由驅動核酸序列的轉錄來調節另一核酸序列表達的任何核酸序列，其可以是編碼蛋白質或RNA的異源靶基因。啟動子可以是組成型的、誘導型的、阻遏型的、組織特異性的或其任何組合。啟動子是核酸序列的控制區域，在此核酸序列的其餘部分的啟動和轉錄速率是受控的。
“基因”是指涉及產生多肽鏈的DNA片段，可以包括或不包括在前和在後的編碼區域，例如，5'非轉譯(5'UTR)或“先導”序列和3'UTR或“非轉錄尾區”序列，以及在各自編碼片段(外顯子)之間的插入序列(內含子)。
“重組”是指多核苷酸是選殖、限制或連接步驟的各種組合的產物，以及導致與天然存在的多核苷酸差異和/或不同的構建體的其他步驟的產物。
“引入”，在將核酸序列插入細胞的內容中，意思為“轉染”、“轉化”或“轉導”和包括參考核酸序列併入真核或原核細胞中，其中核酸序列可以併入細
胞的基因組(例如，染色體、質粒、質體，或線粒體DNA)，轉入自主複製，或暫時表達(例如，轉染mRNA)。
“核酸構建體”是指單鏈或雙鏈的核酸分子。一些實施方案中，核酸構建為DNA分子，其被修飾或合成為以天然本來不存在的方式包含核酸區段，該核酸分子包含一個或多個控制序列或調控元件。一些實施方案中，核酸構建為DNA轉錄後形成的RNA分子。在本揭露的上下文中，核酸構建體含有重組核苷酸序列，該重組核苷酸序列基本上由視需要地一個、兩個、三個或多個分離的核苷酸序列組成：包括5'UTR、開放閱讀框(ORF)、3'UTR。在涉及包括兩個或更多個序列的構建體的實施方式中，序列在構建體中彼此可操作地連接。
“衍生序列”是指與本揭露UTR序列高度同源(例如與本揭露UTR序列至少80%、85%、88%、90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%、100%同一性)且仍保留與本揭露UTR序列具有相似功能活性的核苷酸序列。一些實施方案中，該衍生序列為在天然UTR序列的基礎上經過一個或多個核苷酸的取代、缺失或添加得到的核苷酸序列。一些實施方案中，該衍生序列為在天然UTR序列的基礎上經過截短的得到的核苷酸序列。
“可操作地連接”在本文中定義為如下結構：其中控制序列即啟動子序列和/或5'UTR序列，被適當地置於相對於編碼DNA序列的位置處，使得控制序列指導編碼序列的轉錄和mRNA轉譯成由編碼DNA編碼的多肽序列。
“開放閱讀框架”縮寫為“ORF”，是指編碼多肽的核酸序列的片段或區域。ORF包括連續的非重疊的框架內密碼子，在mRNA序列中從起始密碼子開始並用終止密碼子結束，由核糖體轉譯。
“內源的”是指來自或在生物體、細胞、組織或系統內部產生的任何物質。
“外源的”是指從生物體、細胞、組織或系統外部引入或產生的任何物質。
“同一性的序列”或“序列同一性”是指基因或蛋白質之間分別在核苷酸或胺基酸水平上的序列同一性。“同一性的序列”或“序列同一性”是蛋白質之間在胺基酸水平上的同一性量度以及核酸之間在核苷酸水平上的同一性量度。蛋白質序列同一性可以藉由在比對序列時比較每個序列中給定位置的胺基酸序列來確定。類似地，核酸序列同一性可以藉由在比對序列時比較每個序列中給定位置的核苷酸序列來確定。用於比對序列以供比較的方法是本領域所熟知的，此類方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。一些實施方案中，比對序列的方法為BLAST，BLAST算法計算序列同一性百分比並對兩個序列之間的相似性進行統計學分析。用於進行BLAST分析的軟體可藉由國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)網站公開獲得。
“同源性”或“同源”定義為，在對準序列且必要時引入空位以實現最大序列一致性百分比之後，與靶染色體上的相應序列中的核苷酸殘基一致的核苷酸殘基的百分比。為了確定核苷酸序列同源性百分比的比對可以用本領域技術範圍內的各種方式來實現，例如使用公開可用的計算機軟體，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ClustalW2或Megalign(DNASTAR)軟體。所屬技術領域具有通常知識者可以確定用於比對序列的合適參數，包括在所比較的序列的全長上實現最大比對所需的任何算法。在一些實施方案中，當同源臂的例如核酸序列(例如DNA序列)與宿主細胞的相應原生或未經編輯的核酸序列(例如基因組序
列)至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更多一致時，該序列被視為“同源”。
“替換”定義為胺基酸或核苷酸序列的如下變化：與參比多肽的胺基酸序列或核苷酸序列相比，分別由不同胺基酸或核苷酸替換一個或多個胺基酸或核苷酸產生。如果替換是保守的，則替換成多肽的胺基酸具有與其替換的胺基酸相似的結構或化學性質(例如，電荷、極性、疏水性等)。在一些實施方案中，多肽變體可具有“非保守”變化，其中替換的胺基酸在結構和/或化學性質上不同。
“缺失”定義為胺基酸或核苷酸序列的如下變化：與參比多肽的胺基酸序列或核苷酸序列相比，分別缺少一個或多個胺基酸或核苷酸殘基。在多肽或多核苷酸序列的情況下，考慮到被修飾的多肽或多核苷酸序列的長度，缺失可涉及缺失2個、5個、10個、高至20個、高至30個或高至50個或更多個胺基酸或核苷酸殘基。
“插入”或“添加”是指胺基酸或核苷酸序列的如下變化：與參比多肽的胺基酸序列或核苷酸序列相比，該變化導致分別加入了一個或多個胺基酸或核苷酸殘基。”插入”通常是指在多肽的胺基酸序列內添加一個或多個胺基酸殘基(或多核苷酸內的核苷酸殘基)，而”添加”可以是插入或指在多肽的N-或C-末端添加的胺基酸殘基(或在多核苷酸的5'或3'末端添加的核苷酸殘基)。在多肽或多核苷酸序列的情況下，插入或添加可以是高至10個、高至20個、高至30個、高至50個或更多個胺基酸(或核苷酸殘基)。
“密碼子優化”是指將目標序列中存在的在給定物種的高度表達的基因中一般罕見的密碼子替換為在這類物種的高度表達的基因中一般常見的密
碼子，而替換前後的密碼子編碼相同的胺基酸。各種物種對特定胺基酸的某些密碼子表現出特定的偏好。密碼子偏好(生物體之間密碼子使用的差異)通常與信使RNA(mRNA)的轉譯效率相關，繼而認為該信使RNA尤其取決於轉譯的密碼子的特性和具體的轉運RNA(tRNA)分子的利用度。選擇的tRNA在細胞中的優勢通常是肽合成中最常使用的密碼子的反映。因此，基於密碼子優化，基因可以針對給定生物體中的最佳基因表達進行修改。因此，最佳密碼子的選擇取決於宿主基因組的密碼子使用偏好。
“細胞”或“宿主細胞”包括易於被本揭露內容的核酸構建體或載體轉化、轉染、轉導等的任何細胞類型。作為非限制性實例，宿主細胞可以是分離的原代細胞、多能幹細胞、CD34+細胞、誘導的多能幹細胞或許多永生化細胞系(例如HepG2細胞)中的任何一種。或者，宿主細胞可以是組織、器官或生物體中的原位或體內細胞。
“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，例如包含本揭露的任一種核酸構建體的組成物，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床可測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。
“有效量”或“藥物學上的有效量”包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫
學受試者的有效量可依據以下因素而變化：例如，待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。一些實施方案中，“有效量”是一種有效的RNA的劑量，可以產生抗原特異性免疫應答。
“藥學上可接受的”是指這些治療劑、材料、組成物和/或劑型，在合理的醫學判斷範圍內，適用於與患者組織接觸而沒有過度毒性、刺激性、過敏反應或其他問題或併發症，具有合理的獲益/風險比，並且對預期的用途是有效。
“多肽”和“蛋白質”具有相同的含義，可互換使用。
“受試者”是指哺乳動物，包括但不限於，人、齧齒類動物(小鼠、大鼠、豚鼠)、狗、馬、牛、貓、豬、猴、黑猩猩)等。較佳地，受試者是人。
實施例
以下結合實施例用於進一步描述本揭露，但這些實施例並非限制本揭露的範圍。本揭露實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例1. 5’UTR和3’UTR的篩選
為了篩選到可提高蛋白表達效率的3’-非轉譯區元件(3’UTR元件)、5’-非轉譯區元件(5’UTR元件)，本實施例篩選了管家基因mRNA中的UTR序列。
首先，藉由數據庫(https：//esbl.nhlbi.nih.gov/helixweb/Database/NephronRNAseq/Housekeeping_Genes.htmL)確定了包括Abhd16a等301個候選人管家基因。然後，藉由生物信息學方法對上述基因的表達水平進行分析及表達
量排序，並調取基因的轉錄本及UTR序列信息。進一步根據基因的表達水平及UTR序列長短對UTR元件進行篩選，獲得了多個候選UTR序列，從中篩選獲得了編號為A1至A33的33個5’UTR，和編號為B1至B14的14個3’UTR，基因來源和序列號如表1和表2所示。
表2. 篩選獲得的新5’UTR
實施例2. mRNA的製備
將實施例1篩選獲得的UTR構建至用於體外轉錄的DNA載體中，以獲得穩定表達5’UTR及3’UTR元件的mRNA。該載體含有T7啟動子，作為開放閱讀框(ORF)的編碼螢火蟲螢光素酶(Firefly Luciferase，Fluc)的序列(SEQ ID NO：126)，和多聚腺苷酸(polyA)序列，polyA序列後接用於線性化載體的限制性位點。該polyA選自A120(即，120個連續的腺苷酸)或A30L70(SEQ ID NO：52)。藉由合適的酶切位點將5’UTR及3’UTR元件構建分別構建至開放閱讀框ORF(Fluc)的5’端及3’端。構建好的載體示例如圖1A至圖1C，5’UTR和3’UTR的組合方式參見表3。
本實施例中所使用的對照載體包括polyA為A120 Mod.-120A(SEQ ID NO：53)、polyA為A30L70的Mod.-A30L70(SEQ ID NO：54)和BioN.-A30L70(SEQ ID NO：55)，目的基因均為Fluc，藉由全基因合成構建。不同UTR元件分別藉由酶切的方法構建至上述載體，其中，載體V-B1至V-B14的構建載體為Mod.-120A，選用酶切位點為AgeI和SacII，其polyA均為A120，其使用的對照為Mod.-120A(SEQ ID NO：53)；載體V-A1至V-A14的構建載體為Mod.-120A(SEQ ID NO：53)，選用酶切位點為BamHI和NheI，其polyA均為A120，其使用的對照也為Mod.-120A(SEQ ID NO：53)；V-A15至V-A33的構建載體為Mod.-A30L70(SEQ ID NO：54)，選用酶切位點為BamHI和NheI，其polyA均為A30L70，其使用的對照為Mod.-A30L70(SEQ ID NO：54)；載體V-A1-B12、V-A1-B13和V-A1-B14的構建載體為Mod.-A30L70(SEQ ID NO：54)，選用酶切位點為BamHI和SacII，其polyA均為A30L70，其使用的對照為Mod.-A30L70(SEQ ID NO：54)和BioN.-A30L70(SEQ ID NO：55)。插入的UTR元件基因片段均為全基因合成(蘇州金唯智生物科技有限公司)，片段藉由酶切連接構建至相應載體，載體構建完成後需進行酶切及測序鑑定，鑑定正確後用於下一步實驗。
將表3中的載體(即，DNA模板)藉由限制性內切酶處理消化，使DNA模板線性化，再使用T7-RNA聚合酶體外轉錄。對於體外轉錄，使用T7 RNA聚合酶(Roche)、相應的反應緩衝液、焦磷酸酶、RNase抑制劑和NTP。為了有效加帽RNA，向反應中加入過量的帽類似化合物ARCA(3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G，Trilink,N-7003-1)或CleanCap(m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG，Trilink,N-7113)，其中圖2至圖5中所用的RNA生產選用ARCA進行加帽，圖6至圖9中所用的RNA選用CleanCap進行加帽。同時，為了降低mRNA的免疫源性並提高轉譯效率，本揭露中的mRNA均進行了核酸修飾，將反應體系中的尿苷-三磷酸(Uridine triphosphate，簡稱為UTP)全部替換為N1-甲基-假尿苷-三磷酸(N1-methyl-pseudouridine triphosphate，簡稱為1m-ψUTP，購於
ThermoFisher)，該修飾方法參考專利US 2014/0194494 A1。體外轉錄體系在37℃下孵育2.5小時後，藉由羧化磁珠(Invitrogen)來純化RNA並重新懸浮於無核酶水中，藉由分光光度法和在5200生物分析儀(Agilent)上分析來評估RNA的濃度和質量。經檢測，獲得目的mRNA。
本揭露Mod.的5’UTR至polyA的序列如SEQ ID NO：53、54所示，BioN.的5’UTR至polyA的序列如SEQ ID NO：55所示。Mod.中的5’UTR及3’UTR序列與Moderna公司的專利及發表文獻中的序列一致(US10849920B2、WO2013151667A1、US10730924B2、DOI：10.1016/j.cell.2017.02.017)，BioN.的5’UTR及3’UTR序列源自於專利WO 2018/160540。
示例性的給出V-B1線性化後序列，5’UTR至polyA的序列如SEQ ID NO：56所示；V-A1線性化後的序列，5’UTR至polyA的序列如SEQ ID NO：57所示。
實施例3. 5’UTR、3’UTR及其組合的功能驗證
本實施例使用mRNA脂質轉染的螢光素酶表達系統進行UTR的功能驗證。
實驗方法：將人胚胎腎細胞(HEK293，購自ATCC)以4×104個細胞/孔的密度接種於96孔板。次日，藉由LipofectamineTM MessengerMAXTM mRNA轉染試劑進行轉染，每孔轉染100ng前述實施例2中製備獲得的加帽mRNA，轉染6小時後，更換新鮮培養基。吸出100μL培養基並加入50μL螢光素酶受質，使用PerkinElmer多功能酶標儀檢測發光強度。人宮頸癌細胞(HeLa，購自ATCC)和人肺癌細胞(A549，購自ATCC)的實驗方法同HEK293。
評估方法：表4至表7、表9至表11中，將參比的陽性對照Mod.在不同細胞系中的螢光素表達量設置為1，計算不同mRNA相對陽性對照Mod.的表達量倍數。表8中，將參比的陽性對照BioN.在不同細胞系中的螢光素表達量設置為1，計算不同mRNA相對陽性對照BioN.的表達量倍數。表格中的數值均為檢測平均值的倍數。
1)3’UTR在不同細胞系中調控目的基因表達能力的檢測
為驗證不同3’UTR在不同細胞系中調控目的基因的表達能力，用實施例2的方法生產表達螢光素酶(Fluc)的mRNA，將生產的RNA進行ARCA加帽，polyA尾結構為A120。將RNA轉染至人HeLa、HEK293和A549細胞染，並在轉染後24小時測量螢光素酶水平，結果參見表4和圖2。
結果顯示，在不同細胞系中，相較於Mod.陽性對照，B1至B14的3’UTR對蛋白表達量的影響具有一致性，不同細胞系間無顯著性差異(p>0.05)，說明本揭露篩選獲得的3’UTR元件對蛋白表達量的影響具有普適性，能夠用於提高目的基因的蛋白表達水平。
2)3’UTR在細胞中的調控目的基因表達時長的檢測
為檢測不同3’UTR在細胞中調控目的基因表達時間的能力，將表4中的mRNA轉染至HEK293細胞中，並在轉染後6h、24h、48h和72h測量螢光素酶表達水平，結果參見表5和圖3。
結果顯示，在HEK293細胞中，3’UTR元件的改變可影響目的蛋白的表達量，除B5-3’UTR元件，其他3’UTR元件均可提高蛋白表達量1.2倍以上，且在不同檢測時間點均具有顯著性差異(p<0.05)，其中B12、B13、B14的3’UTR元件效果最佳，可提高蛋白表達量2倍以上，且具有較好的時間延續性。
3)5’UTR在細胞中的調控目的基因表達的檢測
為檢測不同5’UTR在細胞中調控目的基因表達時間的能力，用前述方法製備獲得表達螢光素酶(Fluc)的mRNA，其中表6及圖4中所使用的RNA為ARCA加帽，polyA尾結構為A120，表7及圖5中所使用的RNA為CleanCap加帽，polyA尾結構為A30L70。將上述生產的RNA分別轉染至HEK293細胞中，在轉染後6h、24h、48h和72h測量螢光素酶表達水平，結果參見表6、表7和圖4、圖5。
圖4和圖5分別藉由不同的加帽方式和polyA尾結構進行篩選，結果顯示，在不同的篩選載體中，5’UTR元件的改變均可影響目的蛋白的表達
量，5’UTR元件對目標蛋白表達水平的提高具有通用性。其中，編號A1、A3至A7、A9至A16、A18、A21、A24、A27、A28、A32、A33的5’UTR元件，均可提高蛋白表達量1.2倍以上，且在24h、48h、72h的檢測時間點均具有顯著性差異(p<0.05)，其中A1、A15、A16、A18的5’UTR元件效果最佳，可提高蛋白表達量2倍以上，且具有較好的時間延續性。
4)候選5’UTR相較於陽性對照BioN.載體調控目的基因表達強度的檢測
為檢測不同候選5’UTR相較於陽性對照BioN.載體調控目的基因表達強度的能力，將前述篩選到的較佳的A1、A15、A16、A18的5’UTR元件構建至含有A30L70 polyA尾元件的載體中，用前述方法生產表達螢光素酶(Fluc)的mRNA並轉染至HEK293細胞中，在轉染後6h、24h、48h和72h測量螢光素酶表達水平，結果參見表8和圖6。
結果顯示，候選的5’UTR元件均相較於BioN.載體，在24h和48h時均可提高蛋白表達量至少高於1.2倍，且均具有顯著性差異(p<0.05)。
5)不同5’UTR和3’UTR組合在細胞中的調控目的基因表達的檢測
為了研究不同的5’-UTR和3’UTR組合對mRNA中目的蛋白表達的影響，將含有不同5’UTR和3’-UTR元件組合的mRNA與Moderna公司選用的5’UTR和3’UTR相比，結果參見表9和圖7。
結果顯示，本揭露篩選的5’UTR和3’-UTR元件組合相較於Moderna公司選用的5’UTR和3’UTR元件，在24h、48h及72h檢測時間點，均可提高蛋白表達量1.3倍以上，且均具有顯著性差異(p<0.05)。以上1)-5)中的目的蛋白均為螢光素酶(Fluc)，以下6)中的目的蛋白為分泌型蛋白(例如hHGF，抗PD-1抗體)。
6)不同5’UTR和3’UTR組合調控分泌型目的蛋白表達的檢測
為了研究不同的5’-UTR和3’UTR組合對mRNA表達分泌型蛋白的影響，這裡將mRNA構建為ORF表達的目的蛋白為人肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor,hHGE)或抗PD-1抗體。
該hHGF的胺基酸序列為SEQ ID NO：109所示，其DNA序列為SEQ ID NO：110所示，經密碼子優化後獲得mRNA OS1、OS2、OS3，其優化的密碼子序列為SEQ ID NO：129-131所示。
該PD-1抗體的重鏈和輕鏈的胺基酸序列分別為SEQ ID NO：117、118所示，重鏈和輕鏈的DNA序列分別為SEQ ID NO：119、120所示，重鏈和輕鏈的mRNA序列分別為SEQ ID NO：121、122所示。
首先，為了提高hHGF蛋白的轉譯效率，本揭露對野生型hHGF(SEQ ID NO：110)的核苷酸序列進行了密碼子優化，優化後的序列有hHGF-OS1(SEQ ID NO：111)、hHGF-OS2(SEQ ID NO：112)和hHGF-OS3(SEQ ID NO：113)，相應的mRNA序列分別為SEQ ID NO：129-131所示。將上述天然hHGF及密碼子序列優化後的hHGF序列構建至載體中，生產mRNA。藉由ELISA檢測hHGF蛋白的表達量，證明hHGF密碼子優化序列能夠提高hHGF蛋白的表達量。
將含有不同5’UTR和3’-UTR元件組合的表達hHGF-OS2的mRNA(對應的DNA序列為SEQ ID NO：112)，與含有Moderna公司的5’UTR和3’UTR元件組合的表達hHGF-OS2的mRNA Mod.(hHGF)(對應的DNA序列為SEQ ID NO：114)相比。用該編碼hHGF的mRNA轉染HEK293細胞，在轉染後6h、24h、48h和72h收集上清並藉由ELISA檢測hHGF蛋白的表達量，評估候選載體表達HGF的增加/延長。結果參見表10和圖8A。
將含有不同5’UTR和3’UTR元件組合的表達抗PD-1抗體全長的mRNA(對應的DNA序列為SEQ ID NO：124-125)，與含有Moderna公司的5’UTR和3’UTR元件組合的表達抗PD-1抗體的mRNA(對應的DNA序列為SEQ ID NO：123)相比。用編碼抗PD-1抗體全長的mRNA轉染HEK293細胞，在轉染後6h、24h、48h和72h收集上清並藉由ELISA檢測抗PD-1抗體的表達量，評估候選載體表達抗PD-1抗體的增加/延長，結果參見表11和圖8B。
以上結果顯示，持續表達分泌蛋白hHGF和抗PD-1抗體72小時後，本揭露篩選得到的5’UTR和3’UTR組合相較於Moderna公司選用的5’UTR和3’UTR元件能夠顯著提高分泌蛋白的表達量(p<0.05)。
實施例4. 表達hHGF的mRNA在小鼠體內表達hHGF蛋白的驗證
為了確定mRNA分子m-A16-B12(hHGF)(對應DNA序列為SEQ ID NO：127)在動物體內表達hHGF的能力，使用脂質奈米顆粒LNP(包含50mol%可離子化脂質(SM-102)，10mol% DSPC，38.5mol%膽固醇，1.5mol% PEG-DMG)進行mRNA的遞送，以下實施例5和實施例6中也使用相同的脂質奈米顆粒LNP。陽性對照為Collategene質粒(AnGes公司)，藉由裸質粒給藥方式。Balb/c小鼠(6-8w，雄)隨機分成4組，每組33隻，對小鼠腓腸肌肌肉注射不同劑量的m-A16-B12(hHGF)及Collategene質粒，而後按表12方案安排如下各實驗組：1)注射1.0μg/隻的m-A16-B12(hHGF)；2)注射0.3μg/隻的m-A16-B12(hHGF)；3)注射0.1μg/隻的m-A16-B12(hHGF)；4)注射200μg/隻的Collategene裸質粒。在1h、2h、4h、6h、24h、48h、72h、96h、168h、216h及336h獲取小鼠腓腸肌標本，使用含蛋白醇抑制劑的RIPA裂解液將肌肉組織勻漿裂解，離心取上清，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定hHGF蛋白濃度，使用ELISA方法評價hHGF的表達水平。各組數據用平均值±標準差(Mean±SD)表示，使用Graphpad Prism 9.0軟體作圖及統計。
實驗結果如圖9的A所示，m-A16-B12(hHGF)於肌肉注射1h後即可表達hHGF蛋白，注射後6h達到表達峰值，呈劑量依賴。如圖9的B所示，Collategene於注射後7天達到表達峰值；m-A16-B12(hHGF)遞送48h後蛋白表達量下降，1μg/隻劑量m-A16-B12(hHGF)在72h時的蛋白表達量與Collategene相當。同時，對各組PK數據進行統計發現，即使是最低劑量0.1μg的m-A16-B12(hHGF)，其Cmax也是Collategene的5倍以上，且0.1μg的m-A16-B12(hHGF)其AUCinf(hr*pg/mg protein)也與Collategene相當(表13)。因此，m-A16-B12(hHGF)可實現hHGF在動物體內的高效表達，且各時間點血漿中未檢測到hHGF表達。
實施例5. 表達hHGF的mRNA對下肢缺血小鼠模型的治療功能驗證
下肢缺血小鼠模型是模擬人的嚴重下肢缺血的經典小鼠模型，建模使用6-8週的雄性Balb/c小鼠，方法如下：1)麻醉動物，取仰臥位放置在手術臺上，後肢徹底脫毛，固定後肢，消毒手術部位皮膚；2)從膝蓋向大腿內側切開一個約1釐米長的皮膚切口，依次切開、解剖皮下脂肪組織，充分顯露股動脈；3)使用顯微彎鑷，輕輕刺穿膜狀股鞘，暴露神經血管包，分離股動脈與股靜脈和神經處腹股溝附近的近端位置，分離乾淨後，在股動脈近端下方用6-0縫合線結紮股動脈近端；4)在靠近膝蓋的遠端將股動脈和股靜脈分開，在遠端下方用6-0縫合線結紮股動脈的末端在膕動脈的近端；5)縫合創口。
使用實施例4中的LNP作為載體遞送m-A16-B12(hHGF)，Collategene以裸質粒形式給藥。將下肢缺血模型小鼠隨機分成4組，每組5隻，分別對小鼠腓腸肌進行肌肉注射m-A16-B12(hHGF)和Collategene裸質粒，實驗分組如下：1)注射500ng/隻的m-A16-B12(hHGF)；2)注射50ng/隻的m-A16-B12(hHGF)；3)注射200μg/隻的Collategene裸質粒；4)注射等體積PBS作為對照組。造模當日計為第0天，在進行各實驗組治療後的第0天、第4天、第7天、第10天、第12天以及第14天觀察腿部狀況，使用血流儀檢測小鼠下肢血流灌注情況，拍照記錄。
按以下公式計算各組的血流灌注比率：血流灌注比率=當日小鼠下肢血流灌注量/該小鼠第0天的下肢血流灌注量×100%；各組數據用平均值±標準差(Mean±SD)表示，使用Graphpad Prism 9.0軟體作圖及統計。
結果如圖10A和圖10B所示，在注射50ng/隻、500ng/隻的m-A16-B12(hHGF)和200ng/隻的Collategene裸質粒進行治療的情況下，各小鼠缺血下肢的血流灌注比率相對於對照組有明顯的改善，且缺血下肢的血流灌注比率隨時間的進展逐漸得到恢復。在其中，注射50ng/隻m-A16-B12(hHGF)組表現出與注射200ng/隻Collategene裸質粒組相近的血流恢復效果；尤其，注射500ng/隻m-A16-B12(hHGF)組顯著優於200ng/隻Collategene裸質粒組的血流恢復效果，可實現恢復至90%以上的血流灌注情況。
為了進一步確定m-A16-B12(hHGF)對下肢缺血小鼠模型下肢壞死程度的治療效果，在給藥之後的第14天，對小鼠的腿部狀況進行觀察，拍照記錄，並藉由如圖11A的基準對小鼠的下肢壞死程度進行評分，此時使用的基準如下：0=下肢自我脫離；1=腿部壞死；2=腳壞死；3=>2個腳趾變色；4=1個腳趾變色；5=>2個指甲變色；6=1個指甲變色；7=無壞死。各組數據用平均值±標準差(Mean±SD)表示，使用Graphpad Prism 9.0軟體作圖及統計。
結果如圖11B所示，在誘導小鼠下肢缺血後，對照組的小鼠在術後2週內，下肢發生明顯的缺血壞死情況，至第14天，部分小鼠的下肢發生完全脫落；而在注射m-A16-B12(hHGF)和Collategene裸質粒治療組中，各小鼠的下肢均能保持良好的完整性且並未出現下肢壞死情況，表明m-A16-B12(hHGF)具有與對照Collategene裸質粒相當的下肢缺血改善能力。
CD31是血管新生的中要標誌物，為了確定m-A16-B12(hHGF)在促進下肢缺血小鼠模型血管新生中的作用，在給藥後第14天，取小鼠缺血組織附近的腓腸肌樣本，製備石蠟切片，藉由CD31抗體對切片樣本中的CD31進行免疫組化染色，拍照，經ImageJ(NIH)軟體分析，計算CD31染色面積。各組數據用平均值±標準差(Mean±SD)表示，使用Graphpad Prism 9.0軟體作圖及統計。
結果如圖12所示，在給予50ng/隻、500ng/隻的m-A16-B12(hHGF)和200ng/隻的Collategene裸質粒治療的情況下，均可顯著促進各組缺血下肢肌肉中的血管新生，且新生血管數量相對PBS組具有明顯的統計學差異(p<0.05)，50ng/隻m-A16-B12(hHGF)組表現出與200ng/隻的Collategene裸質粒相當的促血管新生作用，且m-A16-B12(hHGF)給藥組表現出劑量依賴的促血管新生情況。
實施例6. 表達hHGF的mRNA對全皮層損傷Db/Db小鼠模型的治療功能驗證
Db/Db小鼠模型是經典的糖尿病小鼠模型，因其Leptin受體基因缺陷小鼠，致使小鼠隨週齡增長表現出與糖尿病病人相似的高血糖、高血脂及胰島素抵抗等特徵。本實驗藉由全皮層損傷模型模擬糖尿病足患者難以癒合的皮膚損傷。上述Db/Db小鼠模型的製造方法如下：小Db/Db鼠麻醉後脫毛膏脫毛，75%酒精棉球消毒。使用直徑8mm皮膚取材器biopunch在腰背部造成全層皮膚創傷。
為了確定m-A16-B12(hHGF)對全皮層損傷小鼠模型創面癒合的治療效果，而用實施例4中的LNP遞送m-A16-B12(hHGF)，對照Collategene以裸質粒形式給藥，給藥方式為分4點的皮下注射。將全皮層損傷模型的Db/Db
小鼠按體重及血糖水平分成5組，每組7隻。實驗分組如下：1)注射500ng/隻的m-A16-B12(hHGF)；2)注射200ng/隻的m-A16-B12(hHGF)；3)注射50ng/隻的m-A16-B12(hHGF)；4)注射200μg/隻的Collategene裸質粒；5)注射等體積PBS的對照組。造模當日計為第0天，在進行各實驗組治療後，分別在第0天、第3天、第5天、第7天、第10天、第12天以及第14天觀察瘡口恢復狀況，對創傷部位進行拍照，圖像經ImageJ(NIH)軟體分析，計算創面面積。
按以下公式計算創面癒合百分率：P=(AD-A0)/A0×100%(P：創口癒合百分率；AD：拍照日創口面積；A0：術後當日創口面積)。
各組創面癒合百分率用平均值±標準差(Mean±SD)表示，使用Graphpad Prism 9.0軟體作圖及統計。
結果如圖13所示，在注射50ng/隻、200ng/隻和500ng/隻m-A16-B12(hHGF)和200μg/隻Collategene裸質粒的處理下，相較於對照組，小鼠的創面均得到良好的癒合。而且，m-A16-B12(hHGF)對小鼠創面癒合情況的促進呈劑量依賴性，在第14天，50ng/隻劑量的m-A16-B12(hHGF)創面癒合率達66%，200ng/隻和500ng/隻劑量的m-A16-B12(hHGF)能實現100%的傷口癒合情況；同時，m-A16-B12(hHGF)的促創面癒合情況顯著優於200μg/隻Collategene裸質粒(p<0.05)，即使是較低劑量(50ng/隻)的m-A16-B12(hHGF)也表現出與200μg/隻Collategene裸質粒具有顯著性差異的創面癒合百分率(p<0.05)。
為了確定m-A16-B12(hHGF)對全皮層損傷小鼠模型組織重構的治療效果，而藉由馬松染色評價上皮再生、組織重構情況。在給藥之後第17天，獲取小鼠全皮層標本，製備石蠟切片，使用馬松染色對小鼠皮膚組織進行染色。
結果如圖14所示，在m-A16-B12(hHGF)的治療下，各組小鼠創面上皮均完成上皮全覆蓋，且低劑量組創口處上皮異常增厚，膠原蛋白增生；中高劑量組上皮恢復至正常厚度，膠原蛋白有序排列，完成組織重構。而對照組及200μg/隻Collategene裸質粒組均未完成上皮再覆蓋，創口處膠原蛋白異常增生，結構紊亂。
序列表
>B1(ACTG1 3’UTR)
>B2(ATP6V0B 3’UTR)
>B3(ATP6V0B 3’UTR)
>B4(ATP6V0E1 3’UTR)
>B5(ATP6V0E1 3’UTR)
>B6(CFL1 3’UTR)
>B7(CFL1 3’UTR)
>B8(CFL1 3’UTR)
>B9(COX4I1 3’UTR)
>B10(COX4I1 3’UTR)
>B11(COX4I1 3’UTR)
>B12(CTSB 3’UTR)
>B13(FAM166A 3’UTR)
>B14(NDUFB9 3’UTR)
>A1(ACTG1 5’UTR)
CTCTCGCACTCTGTTCTTCCGCCGCTCCGCCGTCGCGTTTCTCTGCCGGTCGCA
SEQ ID NO：15
>A2(ATP6V0B 5’UTR)
>A3(ATP6V0B 5’UTR)
AGACTGCGGGACGGACGGTGGACGCTGGGACGCGTTTGTAGCTCCGGCCCCGCCGTTCCGACCCCCGCCGCCGTCGCCGCC SEQ ID NO：17
>A4(ATP6V0E1 5’UTR)
GGGGTAGGGGTTGGCGCTCAGGCGGCGACC SEQ ID NO：18
>A5(ATP6V0E1 5’UTR)
GTCACGCGGTCAGCTATTGACACTTCCTGGTGGGATCCGAGTGAGGCGACGGGGTAGGGGTTGGCGCTCAGGCGGCGACC SEQ ID NO：19
>A6(CFL1 5’UTR)
>A7(CFL1 5’UTR)
>A8(CFL1 5’UTR)
>A9(COX4I1 5’UTR)
GCGGCCTTGCTCTCTTCCGGTCGCGGGACACCGGGTGTAGAGGGCGGTCGCGGCGGGCAGTGGCGGCAGA SEQ ID NO：23
>A10(COX4I1 5’UTR)
GGGACACCGGGTGTAGAGGGCGGTCGCGGCGGGCAGTGGCGGCAGA SEQ ID NO：24
>A11(COX4I1 5’UTR)
CGCGGCCTTGCTCTCTTCCGGTCGCGGGACACCGGGTGTAGAGGGCGGTCGCGGCGGGCAGTGGCGGCAGA SEQ ID NO：25
>A12(CTSB 5’UTR)
>A13(FAM166A 5’UTR)
AAGGGAGCTGGATGCCGGGAGGGACTGGAGCCAGCAAGGCCAGAGTGAAAGCAAA SEQ ID NO：27
>A14(NDUFB9 5’UTR)
GCAGCAGGCGTGCAGTTTCCCGGCTCTCCGCGCGGCCGGGGAAGGTCAGCGCCGTA SEQ ID NO：28
>A15(CHCHD10 5’UTR)
GGCATTTGTCCCCGCGACAGCACCGCTGCCGCCGTCTCTAAGGTCGCCCGGGTCCCACCGCCGCCACC SEQ ID NO：29
>A16(CHCHD10 5’UTR)
CCGCTGCCGCCGTCTCTAAGGTCGCCCGGGTCCCACCGCCGCCACC SEQ ID NO：30
>A17(SLC38A2 5’UTR)
ATGTCTTTTTTGTGTGTTTGTTTTCATGGTATTCCTATGAA SEQ ID NO：31
>A18(NDUFA11 5’UTR)
GCTTCCCGAGCTGGCGGGGTCCGTGGTGCGGGATCGAGATTGCGGGCT SEQ ID NO：32
>A19(NDUFV3 5’UTR)
GGCGGCTGTTCAGGCGCGGGTGCGCGCGCAGCTGCTGTGGCCCTGCTTGGTGCGCCCGCTGTCACCGCC SEQ ID NO：33
>A20(PRDX5 5’UTR)
>A21(GUK1 5’UTR)
CAGCAGATGGGGACTAGAGGCGCCACTCCTATCCACAGCCTCTCTTCTCACCCCCAGGC SEQ ID NO：35
>A22(GUK1 5’UTR)
GCTGGCCGGGCTGGCTGCGGCCGCCCTGGGCCGGGCCCCACCGGACGCCTCTCTTCTCACCCCCAGGC SEQ ID NO：36
>A23(GUK1 5’UTR)
AGAGGTGGCCCCGGATGCTGCGGCGCCCGCTGGCCGGGCTGGCTGCGGCCGCCCTGGGCCGGGCCCCACCGGACGCCTCTCTTCTCACCCCCAGGC SEQ ID NO：37
>A24(IAH1 5’UTR)
TGGCTGGCGGCCCCGCCCCGCCCCGCCCGGCTGCTCC SEQ ID NO：38
>A25(ABHD16A 5’UTR)
GGAGGGCGGGGCCGGCAGGGGGACCTGCTGCTGGAAGAGCAGCGGCCCGAGCCGGGGCC SEQ ID NO：39
>A26(SLC25A39 5’UTR)
>A27(ATPIF1 5’UTR)
CGAGAGACTGCTTGCTGCGGCAGAGACGCCAGAGGTGCAGCTCCAGCAGCA SEQ ID NO：41
>A28(ANAPC11 5’UTR)
CGGAGTTTCGTCATGTTGGCCAGGCCCATTTGAGATCTTTGAAGATATCCTCAACGTGAGGCTCTGCTGCC SEQ ID NO：42
>A29(ANAPC11 5’UTR)
GGGCGCGGCTTCGGCGGGCGGCAGCCGCTGCAGACGAGCTGCGGGCTCTGCTGCC SEQ ID NO：43
>A30(CCDC12 5’UTR)
GCCTGCGCGATGCAAGACGGGAGAAAAGGAGGGGCGTACGCGGGCAAG SEQ ID NO：44
>A31(MRPL14 5’UTR)
>A32(APOA1BP 5’UTR)
GCCGGGGGCGCGCGCTCTGCGAGCTGG SEQ ID NO：46
>A33(APOA1BP 5’UTR)
GCCGGGGCCGGGCCGGGCCGGGGGCGCGCGCTCTGCGAGCTGG SEQ ID NO：47
>Mod.5’UTR
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC SEQ ID NO：48
>α-球蛋白3’UTR
>α-1球蛋白5’UTR
AGACGAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACC SEQ ID NO：50
>haplogroup U8b1b1 mitochondrion 3’UTR
>A30L70 PolyA
>5’UTR-Fluc-α球蛋白3’UTR-120A(Mod.-120A)
>5’UTR-Fluc-α球蛋白3’UTR-A30L70(Mod.-A30L70)
>α-1-球蛋白5’UTR-Fluc-haplogroup U8b1b1 mitochondrion 3’UTR-A30L70(BioN.)
>5’UTR-Fluc-ACTG1 3’UTR-120A(B1)
>ACTG1 5’UTR-Fluc-α球蛋白3’UTR-120A(A1)
>B1 mRNA序列(ACTG1 3’UTR)
>B2 mRNA序列(ATP6V0B 3’UTR)
>B3 mRNA序列(ATP6V0B 3’UTR)
>B4 mRNA序列(ATP6V0E1 3’UTR)
>B5 mRNA序列(ATP6V0E1 3’UTR)
>B6 mRNA序列(CFL1 3’UTR)
>B7 mRNA序列(CFL1 3’UTR)
>B8 mRNA序列(CFL1 3’UTR)
>B9 mRNA序列(COX4I1 3’UTR)
>B10 mRNA序列(COX4I1 3’UTR)
>B11 mRNA序列(COX4I1 3’UTR)
>B12 mRNA序列(CTSB 3’UTR)
>B13 mRNA序列(FAM166A 3’UTR)
>B14 mRNA序列(NDUFB9 3’UTR)
>A1 mRNA序列(ACTG1 5’UTR)
CUCUCGCACUCUGUUCUUCCGCCGCUCCGCCGUCGCGUUUCUCUGCCGGUCGCA SEQ ID NO：72
>A2 mRNA序列(ATP6V0B 5’UTR)
>A3 mRNA序列(ATP6V0B 5’UTR)
AGACUGCGGGACGGACGGUGGACGCUGGGACGCGUUUGUAGCUCCGGCCCCGCCGUUCCGACCCCCGCCGCCGUCGCCGCC SEQ ID NO：74
>A4 mRNA序列(ATP6V0E1 5’UTR)
GGGGUAGGGGUUGGCGCUCAGGCGGCGACC SEQ ID NO：75
>A5 mRNA序列(ATP6V0E1 5’UTR)
GUCACGCGGUCAGCUAUUGACACUUCCUGGUGGGAUCCGAGUGAGGCGACGGGGUAGGGGUUGGCGCUCAGGCGGCGACC SEQ ID NO：76
>A6 mRNA序列(CFL1 5’UTR)
>A7 mRNA序列(CFL1 5’UTR)
>A8 mRNA序列(CFL1 5’UTR)
>A9 mRNA序列(COX4I1 5’UTR)
GCGGCCUUGCUCUCUUCCGGUCGCGGGACACCGGGUGUAGAGGGCGGUCGCGGCGGGCAGUGGCGGCAGA SEQ ID NO：80
>A10 mRNA序列(COX4I1 5’UTR)
GGGACACCGGGUGUAGAGGGCGGUCGCGGCGGGCAGUGGCGGCAGA SEQ ID NO：81
>A11 mRNA序列(COX4I1 5’UTR)
CGCGGCCUUGCUCUCUUCCGGUCGCGGGACACCGGGUGUAGAGGGCGGUCGCGGCGGGCAGUGGCGGCAGA SEQ ID NO：82
>A12 mRNA序列(CUSB 5’UTR)
>A13 mRNA序列(FAM166A 5’UTR)
AAGGGAGCUGGAUGCCGGGAGGGACUGGAGCCAGCAAGGCCAGAGUGAAAGCAAA SEQ ID NO：84
>A14 mRNA序列(NDUFB9 5’UTR)
GCAGCAGGCGUGCAGUUUCCCGGCUCUCCGCGCGGCCGGGGAAGGUCAGCGCCGUA SEQ ID NO：85
>A15 mRNA序列(CHCHD10 5’UTR)
GGCAUUUGUCCCCGCGACAGCACCGCUGCCGCCGUCUCUAAGGUCGCCCGGGUCCCACCGCCGCCACC SEQ ID NO：86
>A16 mRNA序列(CHCHD10 5’UTR)
CCGCUGCCGCCGUCUCUAAGGUCGCCCGGGUCCCACCGCCGCCACC SEQ ID NO：87
>A17 mRNA序列(SLC38A2 5’UTR)
AUGUCUUUUUUGUGUGUUUGUUUUCAUGGUAUUCCUAUGAA SEQ ID NO：88
>A18 mRNA序列(NDUFA11 5’UTR)
GCUUCCCGAGCUGGCGGGGUCCGUGGUGCGGGAUCGAGAUUGCGGGCU SEQ ID NO：89
>A19 mRNA序列(NDUFV3 5’UTR)
GGCGGCUGUUCAGGCGCGGGUGCGCGCGCAGCUGCUGUGGCCCUGCUUGGUGCGCCCGCUGUCACCGCC
SEQ ID NO：90
>A20 mRNA序列(PRDX5 5’UTR)
>A21 mRNA序列(GUK1 5’UTR)
CAGCAGAUGGGGACUAGAGGCCGCACUGCUAUCCACAGCCUCUCUUCUCACCCCCAGGC SEQ ID NO：92
>A22 mRNA序列(GUK1 5’UTR)
GCUGGCCGGGCUGGCUGCGGCCGCCCUGGGCCGGGCCCCACCGGACGCCUCUCUUCUCACCCCCAGGC SEQ ID NO：93
>A23 mRNA序列(GUK1 5’UTR)
AGAGGUGGCCCCGGAUGCUGCGGCGCCCGCUGGCCGGGCUGGCUGCGGCCGCCCUGGGCCGGGCCCCACCGGACGCCUCUCUUCUCACCCCCAGGC SEQ ID NO：94
>A24 mRNA序列(IAH1 5’UTR)
UGGCUGGCGGCCCCGCCCCGCCCCGCCCGGCUGCUCC SEQ ID NO：95
>A25 mRNA序列(ABHD16A 5’UTR)
GGAGGGCGGGGCCGGCAGGGGGACCUGCUGCUGGAAGAGCAGCGGCCCGAGCCGGGGCC SEQ ID NO：96
>A26 mRNA序列(SLC25A39 5’UTR)
>A27 mRNA序列(AUPIF1 5’UTR)
CGAGAGACUGCUUGCUGCGGCAGAGACGCCAGAGGUGCAGCUCCAGCAGCA SEQ ID NO：98
>A28 mRNA序列(ANAPC11 5’UTR)
CGGAGUUUCGUCAUGUUGGCCAGGCCCAUUUGAGAUCUUUGAAGAUAUCCUCAACGUGAGGCUCUGCUGCC SEQ ID NO：99
>A29 mRNA序列(ANAPC11 5’UTR)
GGGCGCGGCUUCGGCGGGCGGCAGCCGCUGCAGACGAGCUGCGGGCUCUGCUGCC SEQ ID NO：100
>A30 mRNA序列(CCDC12 5’UTR)
GCCUGCGCGAUGCAAGACGGGAGAAAAGGAGGGGCGUACGCGGGCAAG SEQ ID NO：101
>A31 mRNA序列(MRPL14 5’UTR)
>A32 mRNA序列(APOA1BP 5’UTR)
GCCGGGGGCGCGCGCUCUGCGAGCUGG SEQ ID NO：103
>A33 mRNA序列(APOA1BP 5’UTR)
GCCGGGGCCGGGCCGGGCCGGGGGCGCGCGCUCUGCGAGCUGG SEQ ID NO：104
>Mod.5’UTR mRNA序列
GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC SEQ ID NO：105
>α-球蛋白3’UTR mRNA序列
>α-1球蛋白5’UTR mRNA序列
AGACGAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACC SEQ ID NO：107
>haplogroup U8b1b1 mitochondrion 3’UTR mRNA序列
>hHGF胺基酸序列
>hHGF核苷酸序列
>hHGF密碼子優化序列1(hHGF-OS1)
>hHGF密碼子優化序列2(hHGF-OS2)
>hHGF密碼子優化序列3(hHGF-OS3)
>5’UTR-hHGF-α球蛋白3’UTR-A30L70(Mod.-hHGF-OS2)
>ACTG1 5’UTR-hHGF-CTSB 3’UTR-A30L70(A1B12-hHGF-OS2)
>CHCHD10 5’UTR-hHGF-CTSB 3’UTR-A30L70(A15B12-hHGF-OS2)
>PD-1抗體重鏈胺基酸序列
>PD-1抗體輕鏈胺基酸序列
>PD-1抗體重鏈DNA序列
>PD-1抗體輕鏈DNA序列
>PD-1抗體重鏈mRNA序列
>PD-1抗體輕鏈mRNA序列
>5’UTR-anti PD-1-α球蛋白3’UTR-A30L70(Mod.-anti PD-1)
>ACTG1 5’UTR-anti PD-1-CTSB 3’UTR-A30L70(A1B12-anti PD-1)
>CHCHD10 5’UTR-anti PD-1-CTSB 3’UTR-A30L70(A15B12-anti PD-1)
>螢火蟲螢光素酶核苷酸序列(Firefly Luciferase，Fluc)
>HGF-OS2表達載體CHCHD10 5’UTR-hHGF-CTSB 3’UTR-A30L70(A16B12-HGF-OS2)
>hHGF蛋白的mRNA序列
>hHGF密碼子優化mRNA序列1(hHGF-OS1)
>hHGF密碼子優化mRNA序列2(hHGF-OS2)
>hHGF密碼子優化mRNA序列3(hHGF-OS3)
TW202400784A_112117812_SEQL.xml
Claims (29)
- 一種核酸構建體，其包含：(a)開放閱讀框(ORF)，和(b)非轉譯區元件(UTR)，該UTR包含如下序列：SEQ ID NO：12、26任一或與之具有至少90%同一性的序列，SEQ ID NO：1、15任一或與之具有至少90%同一性的序列，SEQ ID NO：4-5、18-19任一或與之具有至少90%同一性的序列，SEQ ID NO：6-8、20-22任一或與之具有至少90%同一性的序列，SEQ ID NO：9-11、23-25任一或與之具有至少90%同一性的序列，SEQ ID NO：13、27任一或與之具有至少90%同一性的序列，SEQ ID NO：14、28任一或與之具有至少90%同一性的序列，SEQ ID NO：29、30任一或與之具有至少90%同一性的序列，SEQ ID NO：35-37任一或與之具有至少90%同一性的序列，SEQ ID NO：42、43任一或與之具有至少90%同一性的序列，SEQ ID NO：46、47任一或與之具有至少90%同一性的序列，或SEQ ID NO：31-34、38-41、44-45任一或與之具有至少90%同一性的序列。
- 如請求項1所述的核酸構建體，其中，(b)包含選自如下任一的3’非轉譯區元件(3’UTR)和5’非轉譯區元件(5’UTR)的組合：1)該3’UTR含有SEQ ID NO：1所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；2)該3’UTR含有SEQ ID NO：2所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；3)該3’UTR含有SEQ ID NO：3所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；4)該3’UTR含有SEQ ID NO：4所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；5)該3’UTR含有SEQ ID NO：5所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；6)該3’UTR含有SEQ ID NO：6所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；7)該3’UTR含有SEQ ID NO：7所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；8)該3’UTR含有SEQ ID NO：8所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；9)該3’UTR含有SEQ ID NO：9所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；10)該3’UTR含有SEQ ID NO：10所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；11)該3’UTR含有SEQ ID NO：11所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；12)該3’UTR含有SEQ ID NO：12所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；13)該3’UTR含有SEQ ID NO：13所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；14)該3’UTR含有SEQ ID NO：14所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15-47任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；15)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：15所示或與之具有至少90%同一性的序列；16)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：16所示或與之具有至少90%同一性的序列；17)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：17所示或與之具有至少90%同一性的序列；18)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：18所示或與之具有至少90%同一性的序列；19)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：19所示或與之具有至少90%同一性的序列；20)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：20所示或與之具有至少90%同一性的序列；21)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：21所示或與之具有至少90%同一性的序列；22)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：22所示或與之具有至少90%同一性的序列；23)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：23所示或與之具有至少90%同一性的序列；24)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：24所示或與之具有至少90%同一性的序列；25)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：25所示或與之具有至少90%同一性的序列；26)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：26所示或與之具有至少90%同一性的序列；27)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：27所示或與之具有至少90%同一性的序列；28)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：28所示或與之具有至少90%同一性的序列；29)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：29所示或與之具有至少90%同一性的序列；30)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：30所示或與之具有至少90%同一性的序列；31)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：31所示或與之具有至少90%同一性的序列；32)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：32所示或與之具有至少90%同一性的序列；33)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：33所示或與之具有至少90%同一性的序列；34)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：34所示或與之具有至少90%、95%同一性的序列；35)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：35所示或與之具有至少90%同一性的序列；36)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：36所示或與之具有至少90%同一性的序列；37)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：37所示或與之具有至少90%同一性的序列；38)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：38所示或與之具有至少90%同一性的序列；39)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：39所示或與之具有至少90%同一性的序列；40)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：40所示或與之具有至少90%同一性的序列；41)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：41所示或與之具有至少90%同一性的序列；42)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：42所示或與之具有至少90%同一性的序列；43)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：43所示或與之具有至少90%同一性的序列；44)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：44所示或與之具有至少90%同一性的序列；45)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：45所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；46)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：46所示或與之任一具有至少90%的序列；或47)該3’UTR含有SEQ ID NO：1-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：47所示或與之任一具有至少90%同一性的序列。
- 如請求項1所述的核酸構建體，其中，該3’UTR包含SEQ ID NO：12-14任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：15、29、30、32任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；較佳地，該3’UTR包含SEQ ID NO：12所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：15、29、30、32任一所示或與之具有至少90%同一性的序列，該3’UTR包含SEQ ID NO：13所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：15、29、30、32任一所示或與之具有至少90%同一性的序列，該3’UTR包含SEQ ID NO：14所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：15、29、30、32任一所示或與之具有至少90%同一性的序列，該3’UTR包含SEQ ID NO：12-14任一所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：15所示或與之具有至少90%同一性的序列，該3’UTR包含SEQ ID NO：12-14任一所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：29所示或與之具有至少90%同一性的序列，該3’UTR包含SEQ ID NO：12-14任一所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：30所示或與之具有至少90%同一性的序列，或該3’UTR包含SEQ ID NO：12-14任一所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：32所示或與之具有至少90%同一性的序列。
- 如請求項1至3中任一項所述的核酸構建體，其還包含：(c)多聚腺苷酸(poly-A)尾；較佳地，該poly-A尾選自A120、A30L70、HGH polyA、SV40polyA、BGH polyA、rbGlob polyA或SV40late polyA；較佳地，該poly-A尾選自A120或A30L70，該A120包含120個腺嘌呤核苷酸，該A30L70包含SEQ ID NO：52所示或與之具有至少90%同一性的序列。
- 如請求項1至4中任一項所述的核酸構建體，其中，該ORF編碼肝細胞生長因子(HGF)、抗體或其抗原結合片段，較佳為人肝細胞生長因子(hHGF)、抗PD-1抗體或其抗原結合片段。
- 如請求項5所述的核酸構建體，其中，該ORF包含選自如下1)-2)中的任一項：1)編碼如SEQ ID NO：109所示胺基酸序列的多核苷酸序列；2)如SEQ ID NO：110-113中任一項所示或與之具有至少90%同一性的多核苷酸序列；或者，該ORF包含選自如下1)-3)的任一項：1)編碼如SEQ ID NO：117所示重鏈胺基酸序列的多核苷酸序列，和/或編碼如SEQ ID NO：118所示輕鏈胺基酸序列的多核苷酸序列；2)編碼如SEQ ID NO：117所示重鏈胺基酸序列中HCDR1、HCDR2和HCDR3的多核苷酸序列，和編碼如SEQ ID NO：118所示輕鏈胺基酸序列中LCDR1、LCDR2和LCDR3的多核苷酸序列，該CDR是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的，較佳根據Kabat編號系統定義的；3)如SEQ ID NO：119所示或與之具有至少90%同一性的多核苷酸序列，和/或如SEQ ID NO：120所示或與之具有至少90%同一性的多核苷酸序列。
- 如請求項5或6所述的核酸構建體，其包含SEQ ID NO：115、116、127中任一所示或與之具有至少90%同一性的序列；或，包含SEQ ID NO：124所示或與之具有至少90%同一性的序列和/或SEQ ID NO：125所示或與之具有至少90%同一性的序列。
- 一種RNA分子，其包含：(a)開放閱讀框(ORF)，和(b)非轉譯區元件(UTR)，該UTR包含如下序列：SEQ ID NO：69、83任一或與之具有至少90%同一性的序列，SEQ ID NO：58、72任一或與之具有至少90%同一性的序列，SEQ ID NO：59-60、73-74任一或與之具有至少90%同一性的序列，SEQ ID NO：61-62、75-76任一或與之具有至少90%同一性的序列，SEQ ID NO：63-65、77-79任一或與之具有至少90%同一性的序列，SEQ ID NO：66-68、80-82任一或與之具有至少90%同一性的序列，SEQ ID NO：70、84任一或與之具有至少90%同一性的序列，SEQ ID NO：71、85任一或與之具有至少90%同一性的序列，SEQ ID NO：86、87任一或與之具有至少90%同一性的序列，SEQ ID NO：92-94任一或與之具有至少90%同一性的序列，SEQ ID NO：99、100任一或與之具有至少90%同一性的序列，SEQ ID NO：103、104任一或與之具有至少90%同一性的序列，或SEQ ID NO：88-91、95-98、101-102任一或與之具有至少90%同一性的序列。
- 如請求項8所述的RNA分子，其中，(b)包含選自如下任一的3’非轉譯區元件(3’UTR)和5’非轉譯區元件(5’UTR)的組合：1)該3’UTR含有SEQ ID NO：58所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：72-104所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；2)該3’UTR含有SEQ ID NO：59所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：72-104所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；3)該3’UTR含有SEQ ID NO：60所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：72-104所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；4)該3’UTR含有SEQ ID NO：61所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：72-104所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；5)該3’UTR含有SEQ ID NO：62所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：72-104所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；6)該3’UTR含有SEQ ID NO：63所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：72-104所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；7)該3’UTR含有SEQ ID NO：64所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：72-104所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；8)該3’UTR含有SEQ ID NO：65所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：72-104所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；9)該3’UTR含有SEQ ID NO：66所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：72-104所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；10)該3’UTR含有SEQ ID NO：67所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：72-104任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；11)該3’UTR含有SEQ ID NO：68所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：72-104所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；12)該3’UTR含有SEQ ID NO：69所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：72-104任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；13)該3’UTR含有SEQ ID NO：70所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：72-104任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；14)該3’UTR含有SEQ ID NO：71所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：72-104任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；15)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：72所示或與之具有至少90%同一性的序列；16)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：73所示或與之具有至少90%同一性的序列；17)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：74所示或與之具有至少90%同一性的序列；18)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：75所示或與之具有至少90%同一性的序列；19)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：76所示或與之具有至少90%同一性的序列；20)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：77所示或與之具有至少90%同一性的序列；21)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：78所示或與之具有至少90%同一性的序列；22)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：79所示或與之具有至少90%同一性的序列；23)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：80所示或與之具有至少90%同一性的序列；24)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：81所示或與之具有至少90%同一性的序列；25)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：82所示或與之具有至少90%同一性的序列；26)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：83所示或與之具有至少90%同一性的序列；27)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：84所示或與之具有至少90%同一性的序列；28)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：85所示或與之具有至少90%同一性的序列；29)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：86所示或與之具有至少90%同一性的序列；30)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：87所示或與之具有至少90%同一性的序列；31)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：88所示或與之具有至少90%同一性的序列；32)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：89所示或與之具有至少90%同一性的序列；33)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：90所示或與之具有至少90%同一性的序列；34)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：91所示或與之任一具有至少90%、95%同一性的序列；35)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：92所示或與之具有至少90%同一性的序列；36)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：93所示或與之具有至少90%同一性的序列；37)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：94所示或與之具有至少90%同一性的序列；38)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：95所示或與之具有至少90%同一性的序列；39)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：96所示或與之具有至少90%同一性的序列；40)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：97所示或與之具有至少90%同一性的序列；41)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：98所示或與之具有至少90%同一性的序列；42)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：99所示或與之具有至少90%同一性的序列；43)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：100所示或與之具有至少90%同一性的序列；44)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：101所示或與之具有至少90%同一性的序列；45)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：102所示或與之具有至少90%同一性的序列；46)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：103所示或與之具有至少90%同一性的序列；或47)該3’UTR含有SEQ ID NO：58-71任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列，該5’UTR含有SEQ ID NO：104所示或與之具有至少90%同一性的序列。
- 如請求項8所述的RNA分子，其中，該3’UTR包含SEQ IID NO：69-71任一所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR包含SEQ D NO：72、86、87、89任一所示或與之任一具有至少90%同一性的序列；較佳地，該3’UTR包含SEQ ID NO：69所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：72、86、87、89任一所示或與之具有至少90%同一性的序列，該3’UTR包含SEQ ID NO：70所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：72、86、87、89任一所示或與之具有至少90%同一性的序列，該3’UTR包含SEQ ID NO：71所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：72、86、87、89任一所示或與之具有至少90%同一性的序列，該3’UTR包含SEQ ID NO：69-71任一所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：72所示或與之具有至少90%同一性的序列，該3’UTR包含SEQ ID NO：69-71任一所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：86所示或與之具有至少90%同一性的序列，該3’UTR包含SEQ ID NO：69-71任一所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：87所示或與之具有至少90%同一性的序列，或該3’UTR包含SEQ ID NO：69-71任一所示或與之具有至少90%同一性的序列，該5’UTR包含SEQ ID NO：89所示或與之具有至少90%同一性的序列。
- 如請求項8至10中任一項所述的RNA分子，其還包含：(c)多聚腺苷酸(poly-A)尾；較佳地，該poly-A尾選自A120、A30L70、HGH polyA、SV40polyA、BGH polyA、rbGlob polyA或SV40late polyA；較佳地，該poly-A尾選自A120或A30L70，該A120包含120個腺嘌呤核苷酸，該A30L70包含SEQ ID NO：52所示或與之具有至少90%、95%同一性的序列。
- 如請求項8至11中任一項所述的RNA分子，其中，該ORF編碼肝細胞生長因子(HGF)、抗體或其抗原結合片段，較佳為人肝細胞生長因子(hHGF)、抗PD-1抗體或其抗原結合片段；較佳地，該ORF包含選自如下1)-2)中的任一項：1)編碼如SEQ ID NO：109所示胺基酸序列的核酸序列；或者，2)如SEQ ID NO：128-131中任一所示或與之具有至少90%，較佳至少95%同一性的RNA序列；或者，該ORF包含選自如下1)-3)的任一項：1)編碼如SEQ ID NO：117所示重鏈胺基酸序列的核酸序列，和/或編碼如SEQ ID NO：118所示輕鏈胺基酸序列的核酸序列；2)編碼如SEQ ID NO：117所示重鏈胺基酸序列中HCDR1、HCDR2和HCDR3的核酸序列，和編碼如SEQ ID NO：118所示輕鏈胺基酸序列中LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸序列，該CDR是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的，較佳根據Kabat編號系統定義的；3)如SEQ ID NO：121所示或與之具有至少90%同一性的RNA序列，和/或如SEQ ID NO：122所示或與之具有至少90%同一性的RNA序列。
- 如請求項8至12中任一項所述的RNA分子，其包含：(d)5’帽結構(5’Cap)；較佳地，該5’Cap選自Cap0、Cap1、Cap2、Cap3、Cap4、ARCA、修飾的ARCA、肌苷、N1-甲基-鳥苷、2’-氟-鳥苷、7-脫氮-鳥苷、8-側氧-鳥苷、2-胺基-鳥苷、LNA-鳥苷和2-疊氮基-鳥苷；更佳地，該5’Cap選自ARCA、3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pU、m7Gppp(A2’O-MOE)pG、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)pG、m7(3’OMeG)(5’)ppp(5’)(2’OMeG)pG或m7(3’OMeG)(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG。
- 如請求項8至13中任一項所述的RNA分子，其包含一種或多種修飾，較佳地，該修飾包括骨架修飾、糖修飾、鹼基修飾和/或脂質修飾；更佳地，該鹼基修飾為尿嘧啶修飾。
- 如請求項8至14中任一項所述的RNA分子，其中，該RNA分子用於提高該ORF表達目標蛋白的表達量。
- 一種經分離的多核苷酸，其包含(a)開放閱讀框(ORF)，該ORF包含SEQ ID NO：111-113和129-131中任一所示或與之具有至少90%同一性的序列；較佳地，該多核苷酸包含如下(b)-(d)中的任一項或其任意組合：(b)5’UTR和/或3’UTR，(c)poly-A尾，(d)5’Cap；較佳地，該poly-A尾選自A120、A30L70、HGH polyA、SV40polyA、BGH polyA、rbGlob polyA或SV40late polyA；更佳地，該poly-A尾為A120或A30L70；較佳地，該5’Cap選自ARCA、3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pU、m7Gppp(A2’O-MOE)pG、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)pG、m7(3’OMeG)(5’)ppp(5’)(2’OMeG)pG或m7(3’OMeG)(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG；較佳地，該多核苷酸包含選自骨架修飾、糖修飾、鹼基修飾和/或脂質修飾的一種或多種修飾，其中，該鹼基修飾較佳為假尿苷修飾。
- 一種核酸構建體，其包含：(a)開放閱讀框(ORF)，和(b)非轉譯區元件(UTR)，該UTR源自CTSB、FAM166A、NDUFB9、ACTG1、CHCHD10、NDUFA11、ATP6V0B、ATP6V0E1、CFL1、COX4I1、CTSB、SLC38A2、NDUFV3、PRDX5、GUK1、IAH1、ABHD16A、SLC25A39、ATPIF1、ANAPC11、CCDC12、MRPL14或APOA1BP的UTR，該UTR為3’非轉譯區元件(3’UTR)或5’非轉譯區元件(5’UTR)；較佳地，該UTR包含SEQ ID NO：1-47任一所示或與之具有至少90%同一性的序列。
- 一種RNA分子，其包含：(a)開放閱讀框(ORF)，和(b)非轉譯區元件(UTR)，該UTR源自CTSB、FAM166A、NDUFB9、ACTG1、CHCHD10、NDUFA11、ATP6V0B、ATP6V0E1、CFL1、COX4I1、CTSB、SLC38A2、NDUFV3、PRDX5、GUK1、IAH1、ABHD16A、SLC25A39、ATPIF1、ANAPC11、CCDC12、MRPL14或APOA1BP的UTR，該UTR為3’非轉譯區元件(3’UTR)或5’非轉譯區元件(5’UTR)；較佳地，該UTR包含SEQ ID NO：58-104任一所示或與之具有至少90%同一性的序列。
- 一種載體，其包含如請求項1至7和17中任一項所述的核酸構建體、如請求項8至15和18中任一項所述的RNA分子，或如請求項16所述的多核苷酸。
- 一種宿主細胞，其包含如請求項19所述的載體。
- 一種如請求項1至7和17中任一項所述的核酸構建體的製備方法，包括培養如請求項20所述的宿主細胞，並從培養物中回收產生的核酸構建體。
- 一種如請求項8至15和18中任一項所述的RNA分子的製備方法，包括將如請求項1至7和17中任一項所述的核酸構建體或如請求項19所述的載體進行逆轉錄，得到RNA分子；較佳地，該方法還包含對該RNA分子的5’端添加5’Cap。
- 一種遞送媒介物，其包含如請求項1至7和17中任一項所述的核酸構建體、如請求項8至15和18中任一項所述的RNA分子、如請求項16所述的多核苷酸或如請求項19所述的載體；該遞送媒介物較佳為陽離子脂質遞送顆粒或奈米脂質顆粒。
- 一種醫藥組成物，其包含藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，和選自如下的任一項或其任意組合：如請求項1至7和17中任一項所述的核酸構建體、如請求項8至15和18中任一項所述的RNA分子、如請求項16所述的多核苷酸、如請求項19所述的載體或如請求項23所述的遞送媒介物。
- 一種產品或試劑盒，其包含選自如下的任一項或其任意組合：如請求項1至7和17中任一項所述的核酸構建體、如請求項8至15和18中任一項所述的RNA分子、如請求項19所述的多核苷酸、如請求項23所述的遞送媒介物、如請求項24所述的醫藥組成物。
- 一種如請求項1至7和17中任一項所述的核酸構建體或如請求項8至15和18中任一項所述的RNA分子在用於提高ORF表達蛋白的表達量，或製備用於提高ORF表達蛋白的表達量的產品中的用途。
- 一種治療和/或預防疾病的方法，包括向有需要的受試者施用治療有效量的如請求項1至7和17中任一項所述的核酸構建體、如請求項8至15和18中任一項所述的RNA分子、如請求項16所述的多核苷酸、如請求項23所述的遞送媒介物和/或如請求項24所述的醫藥組成物，該疾病選自缺血性疾病、代謝綜合症、糖尿病及其併發症、再狹窄，以及神經損傷；較佳地，該缺血性疾病選自冠狀動脈疾病(CAD)、外周動脈疾病(PAD)、心肌梗死、肢體缺血、血栓閉塞性脈管炎(TAO)、糖尿病性動脈硬化閉塞症(DAO)；更佳地，該肢體缺血為下肢缺血，最佳地，該肢體缺血為嚴重下肢缺血(CLI)；較佳地，該糖尿病及其併發症選自糖尿病周圍神經病變、糖尿病足(DFU)、糖尿病性動脈硬化閉塞症(DAO)；較佳地，該再狹窄選自手術後再狹窄、灌注後再狹窄；較佳地，該神經損傷選自神經退行性疾病、創傷性神經損傷、周圍神經病變；更佳地，該神經退行性疾病選自肌萎縮性側索硬化(ALS)、帕金森氏病、癡呆病，該周圍神經病變為糖尿病周圍神經病變。
- 一種促進內皮細胞生長和/或遷移的方法，包括向有需要的受試者施用有效量的如請求項1至7和17中任一項所述的核酸構建體、如請求項8至15和18中任一項所述的RNA分子、如請求項16所述的多核苷酸、如請求項23所述的遞送媒介物和/或如請求項24所述的醫藥組成物。
- 一種促血管發生的方法，包括向有需要的受試者施用有效量的如請求項1至7和17中任一項所述的核酸構建體、如請求項8至15和18中任一項所述的RNA分子、如請求項16所述的多核苷酸、如請求項23所述的遞送媒介物和/或如請求項24所述的醫藥組成物。
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