KR102075581B1 - 바이러스성 발현 조절 서열이 삽입된 핵산 분자를 포함하는 면역보강제 및 이를 포함하는 약학 조성물 - Google Patents

바이러스성 발현 조절 서열이 삽입된 핵산 분자를 포함하는 면역보강제 및 이를 포함하는 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 내부리보솜결합부위 (IRES)를 가지는 적어도 하나의 바이러스성 발현 조절 서열과, 상기 발현 조절 서열과 작동 가능하게 연결되며 면역원성 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 코딩 영역을 가지는 핵산 분자를 포함하는 면역보강제 및 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 핵산 분자에 의하여, 면역원이 야기하는 면역 반응과 다른 면역 반응을 유도할 수 있으므로, 상기 핵산 분자는 면역 반응을 향상시키는 효율적인 면역보강제로 작용할 수 있다. 이에 따라, 감염성 질병을 방어하기 위한 백신은 물론이고, 다양한 질병 치료 및/또는 예방을 위한 약학 조성물 중에 본 발명의 핵산 분자가 활용될 수 있다.

Description

바이러스성 발현 조절 서열이 삽입된 핵산 분자를 포함하는 면역보강제 및 이를 포함하는 약학 조성물 {ADJUVANT COMPRISING NUCLEIC ACID MOLECULE INSERTED VIRAL EXPRESSION REGULATION SEQUENCE AND PHAMRACEUTICAL COMPOSITION HAVING THE ADJUVANT}
본 발명은 면역보강제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항원 특이적인 면역 반응을 효율적으로 유도할 수 있도록 설계된 핵산 분자를 포함하는 면역보강제 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
면역 체계(immune system)는 생명체 내에서 병원체와 종양 세포 등을 탐지하여 이들을 제거함으로서 질병으로부터 생명체를 보호하는 생물학적인 구조 및 과정을 의미한다. 면역 체계는 크게 내재 면역 체계(선천 면역 체계, 자연 면역 체계; innate immune system)과 적응 면역 체계(후천 면역 체계, 획득 면역 체계; adaptive immune system)으로 구분될 수 있다.
내재 면역 체계는 비특이적인 방법으로 숙주가 감염되지 않도록 방어하는 세포나 기전으로서, 특정의 병원체 등을 기억하지 않고 즉각적으로 반응하는 면역 체계다. 모든 종류의 동물과 식물은 내재 면역 체계를 가지고 있으며, 식물, 곰팡이, 곤충 등은 내재 면역 체계만을 가지고 있다. 반면, 적응면역 체계는 항원이나 병원체에 특이적이며 항원 제시 과정을 통한 비-자기 항원의 인지가 필요하다. 이에 따라, 적응 면역 체계에서 특정 항원 또는 항원에 감염된 세포에 대한 특이적인 면역 반응이 가능하다. 또한, 적응 면역 체계를 구성하는 기억 세포 (memory cell)는 이미 수행된 면역 반응을 불러들일 수 있기 대문에, 동일한 병원체가 여러 번 체내에 침입하였을 때, 이들을 신속하게 제거할 수 있다.
또한, 면역 체계는 체액성 면역과 세포성 면역으로 구분될 수 있다. 체액성 면역(항체성 면역; humoral immunity)에서 골수에서 유래한 B 림포사이트가 항원을 인진한 후 분화되어 면역글로불린(Ig)이라는 당단백질로 이루어지는 항체를 분비하고, 분비된 항체에 의하여 감염된 병원균이 제거되는 면역 반응이 일어난다. 반면, 세포성 면역(cell mediated immunity, CMI)은 흉선에서 유래한 T 림포사이트가 항원을 인지하여 림포카인(lymphokine)을 분비하거나 직접 감염된 세포를 죽이는 면역 반응이다.
병원균 등에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 병원균의 전체 또는 일부를 접종하는 백신 항원이 다양한 질병의 예방이나 치료에 사용된다. 이때, 백신 항원에 의하여 야기될 수 있는 다양한 면역 반응이 유도되는 것이 바람직하다. 초기에 개발된 약독화 생균 백신이나 불활화 사균 백신을 대신하여 최근에는 구조와 성분이 면확한 서브유닛 백신이 주로 개발되고 있는데, 서브유닛 백신은 기존 백신에 비하여 면역원성이 낮기 때문에 면역 반응을 증가시키기 위하여 면역보강제(adjuvant)를 사용한다.
대부분의 병원성 세균이나 바이러스 감염에는 항체가 기본적인 방어 작용을 담당하므로 백신 항원에 의해 유도되는 항체만으로도 예방 효과가 충분한 경우가 많다. 그러나 지금까지 백신이 개발되지 못한 감염병은 예방이나 치료에 세포성 면역반응이 중요한 작용을 하는 경우가 많으므로 세포성 면역반응을 유도하는 면역보강제를 사용하면 개발 성공가능성을 높일 수 있다.
현재 인간 백신에 사용되고 있는 면역보강제는 1) 수산화알루미늄/인산알루미늄/수산화인산황산 알루미늄과 같은 금속 염인 alum, 2) 스쿠알렌을 기반으로 하는 oil in water emulsion 형태의 면역보강제인 MF59 등이 사용되고 있다. 하지만, 이들 종래의 면역보강제는 주로 체액성 면역 반응 활성은 우수한 반면, 세포성 면역 유도 활성은 매우 낮다. 따라서, 이들 종래의 면역보강제는 항체만으로 감염 방어가 가능한 경우에만 활용될 수 있을 뿐이고, 세포성 면역 반응이 요구되는 백신에 사용하기는 적합하지 못하다는 한계가 있다.
대표적인 병원체인 미생물의 세포벽에는 지질다당류 (lipopolysaccharides; LPS), 베타-1,3-글루칸 (β-1,3-glucan) 및 펩티도글리칸 (peptidoglycans)과 같은 당단백질로 이루어진 병원성 관련 분자 유형 (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)을 가지고 있다. 이러한 병원성 관련 분자 유형 (PAMPs)은 숙주의 면역 체계를 구성하는 특정 단백질, 예를 들어 유형인식수용체 (PRRs, pattern recognition receptors) 또는 유형인식단백질 (PRPs, pattern recognition proteins)
에 의해 인식된다. 즉, 각각의 PRPs는 병원체 표면에 존재하는 적절한 PAMPs를 인식하여 복합체를 형성하여, 식균작용 (phagocytosis), 노듈 형성 (nodule formation), 피포화 (encapsulation), 단백질분해효소 케스케이드 (proteinase cascade) 활성화, 및 항균 펩타이드의 합성 등과 같은 일련의 면역 반응을 유발시킨다. Toll-유사 수용체 (Toll-like receptors, TLRs)은 대표적인 PRR로서 TLR agonisit는 면역 세포에 대한 활성이 강하기 때문에 백신 면역보강제로 개발되고 있다. 예를 들어, 내독소인 LPS는 면역 세포의 TLR4에 작용하여 강력한 면역 활성을 보이고 있다.
한편, 인간과 같은 고등 생명체의 게놈 DNA와 달리, 세균의 DNA는 CpG motif의 사이토신이 메틸화 (methylation)되어 있지 않다. 따라서 고등 생명체의 면역 세포는 CpG motif의 사이토신이 메틸화되지 않은 세균의 DNA를 비-자기 항원으로 인식할 수 있는데, 이를 인식하는 수용체가 TLR9이다. TLR9 agonist는 다양한 면역 반응을 증강시킬 수 있는데, TLR9 agonist로서 CpG motif를 포함한 올리고뉴클레오타이드가 면역보강제로 개발되고 있다. 하지만, TLR agonist로 사용되는 LPS와 CpG motif는 독성이 매우 강하고 생체 내에서 염증 반응을 야기하는 등의 부작용이 있어서 안전성이라는 측면에서 문제가 있다.
본 발명의 목적은 상이한 면역 반응, 예를 들어 체액성 면역 및 세포성 면역을 모두 유도할 수 있도록 설계된 면역보강제 및 이를 포함하는 약학 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 생체에 주입되었을 때 생체에 대한 독성 및 부작용을 야기하지 않아 안전하게 사용될 수 있는 면역보강제 및 이를 포함하는 약학 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 바이러스성 내부리보솜결합부위 (Internal Ribosomal Entry Site; IRES) 활성을 가지는 염기 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 조절 서열과, 상기 적어도 하나의 발현 조절 서열과 작동 가능하게 연결되며, 면역원성 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 (encoding) 적어도 하나의 코딩 영역을 가지는 핵산 분자를 포함하는 면역보강제를 제공한다.
상기 적어도 하나의 발현 조절 서열은 5'-비번역영역 (5' untranslated Region; 5'-UTR)을 형성하고, 상기 핵산 분자는 상기 5'-UTR의 3'쪽에 위치하는 3'-비번역영역 (3'-UTR)을 더욱 포함하며, 상기 코딩 영역은 상기 5'-UTR과 상기 3'-UTR 사이에 위치할 수 있다.
상기 바이러스성 내부리보솜결합부위 활성을 가지는 염기 서열은, 피코나바이러스과 (Picornaviridae) 바이러스, 토가바이러스과 (Togaviridae) 바이러스, 디시스트로바이러스과 (Dicistroviridae) 바이러스, 플라비바이러스과(Flaviridae) 바이러스, 레트로바이러스과 (Retroviridae) 바이러스, 헤르페스바이러스과 (Herpesviridae) 바이러스 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 바이러스 유래의 내부리보솜결합부위 염기 서열을 포함할 수 있다.
상기 바이러스성 내부리보솜결합부위 활성을 가지는 염기 서열은 피코나바이러스과 (Picornaviridae) 바이러스, 디시스트로바이러스과(Dicistroviridae) 바이러스 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 바이러스에서 유래의 내부리보솜결합부위 염기 서열을 포함할 수 있다.
일례로, 상기 피코나바이러스과 (Picornaviridae) 바이러스 유래의 상기 바이러스성 내부리보솜결합부위 염기 서열은, 엔테로바이러스속 (Enterovirus) 바이러스, 카디오바이러스속 (Cardiovirus) 바이러스, 아프토바이러스속 (Aptovirus) 바이러스, 헤파토바이러스속 (Hepatovirus) 바이러스, 테스코바이러스속 (Teschovirus) 바이러스 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 바이러스 유래의 내부리보솜결합부위 염기 서열을 포함할 수 있고, 상기 디시스트로바이러스과 (Dicistroviridae) 바이러스 유래의 상기 바이러스성 내부리보솜결합부위 염기 서열은, 크리파바이러스속 (Cripavirus) 바이러스 유래의 내부리보솜결합부위 염기 서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 피코나바이러스과 (Picornaviridae) 바이러스 유래의 상기 바이러스성 내부리보솜결합부위 염기 서열은, 콕사키바이러스 (Coxsachie virus), 뇌신근염바이러스 (Encephalomyocarditis virus) 및 이들의 조합으로 구성되는 바이러스 유래의 내부리보솜결합부위 염기 서열을 포함하고, 상기 디시스트로바이러스과 바이러스 유래의 상기 바이러스성 내부리보솜결합부위 염기 서열은 귀뚜라미 마비바이러스 (Cricket paralysis virus, CrPV) 유래의 내부리보솜결합부위 염기 서열을 포함할 수 있다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 상기 발현 조절 서열에 인접하여 20 내지 400개의 아데노신 또는 20 내지 400개의 아데노신으로 전사될 수 있는 뉴클레오티드가 삽입될 수 있다.
한편, 상기 핵산 분자는, 제 1 바이러스성 내부리보솜결합부위 염기 서열을 포함하는 제 1 발현 조절 서열과, 상기 제 1 발현 조절 서열과 작동 가능하게 연결되며, 면역원성 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 제 1 코딩 영역으로 이루어진 제 1 발현 유닛과, 상기 제 1 발현 조절 서열의 3'쪽에 위치하며, 제 2 바이러스성 내부리보솜결합부위 염기 서열을 포함하는 제 2 발현 조절 서열과, 상기 제 2 발현 조절 서열과 작동 가능하게 연결되며, 면역원성 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 제 2 코딩 영역으로 이루어진 제 2 발현 유닛을 포함할 수 있다.
일례로, 상기 제 1 발현 조절 서열과, 상기 제 2 발현 조절 서열 중에서 선택되는 적어도 하나의 발현 조절 서열에 인접하여 20 내지 400개의 아데노신 또는 아데노신으로 전사될 수 있는 뉴클레오티드가 삽입될 수 있다.
상기 코딩 영역은, 감염성 질병에 의한 면역 반응을 유도하는 단백질 또는 펩타이드, 자가면역성 질병에 의한 면역 반응을 유도하는 단백질 또는 펩타이드, 알레르기 반응을 유도하는 단백질 또는 펩타이드, 항암용 단백질 또는 펩타이드 및 이들의 조합으로 구성되는 단백질 또는 펩타이드를 암호화할 수 있다.
또한, 상기 코딩 영역은 바이러스 병원체, 바이러스 항원 및 이들의 조합으로 구성되는 펩타이드 또는 단백질을 암호화할 수 있다.
일례로, 상기 핵산 분자는 RNA일 수 있다.
예를 들어, 상기 코딩 영역은 클로닝 사이트를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 전술한 면역보강제와, 약학적으로 허용되는 담체 (carrier)를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 상기 약학 조성물은 백신인 것을 특징으로 한다.
일례로, 상기 약학 조성물은 바이러스성 질병을 치료 또는 예방할 수 있다.
본 발명에 따르면, 바이러스성 발현 조절 서열에 의하여 발현될 수 있는 면역원성 표적 서열을 포함하는 핵산 분자는, 면역원성 물질에 의하여 야기되는 면역 반응을 강화시킬 수 있다. 따라서 본 발명에 따라 제작된 핵산 분자는 면역원성 물질에 의한 면역 반응을 증대시키는 면역보강제로 활용될 수 있다.
특히, 본 발명의 핵산 분자는 면역원성 물질에 의해 야기되는 면역 반응과 다른 경로의 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 발명의 핵산 분자를 면역보강제로 사용하면, 면역원성 물질에 의해 야기되는 전체 면역 반응이 생체 내에서 균형 있게 일어날 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 발현 조절 서열을 포함하는 핵산 분자는 생체 내에서 독성이나 부작용이 없어 안전성이 담보된다.
따라서 본 발명에 따른 핵산 분자를 면역보강제로 사용하여, 암, 감염성 질병, 자가 면역성 질병 등을 치료 및/또는 예방하기 위한 약학 조성물로 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 예시적인 실시형태에 따라, 면역보강제로 활용될 수 있는 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드로서, 하나의 발현 카세트 또는 하나으 발현 유닛으로 이루어진 핵산 분자의 구성을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 다른 예시적인 실시형태에 따라, 면역보강제로 활용될 수 있는 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드로서, 다수의 발현 카세트 또는 다수의 발현 유닛으로 이루어진 핵산 분자의 구성을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 3a와 도 3b는 각각 본 발명의 예시적인 실시예에 따라, 귀뚜라미마비 바이러스 (CrPV)의 IRES 서열을 발현 조절 서열로 사용하고, Renilla luciferase를 코딩하는 서열이 표적 서열로 삽입된 핵산 분자를 사용하였을 때의 면역 반응 유도 효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 3a는 세포성 면역과 관련하여 CD4+ T-세포의 증식을 촉진하는 분자들인 CD80, CD40, CD386의 발현 정도를 측정한 Flow Cyotometer 분석 결과를 나타낸 그래프이고, 도 3b는 세포성 면역과 관련하여 Th1 (T helper type 1) 세포로의 분화에 관여하는 사이토카인인 IL-12와 IL-6의 발현 정도를 측정한 ELISA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 제작된 핵산 분자의 농도를 달리하여 마우스에 투여하였을 때, 농도에 따른 해당 조직의 변화를 측정한 결과를 나타낸 사진이다.
도 5는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 귀뚜라미마비 바이러스 (CrPV)의 IRES 서열을 발현 조절 서열로 사용하고, 표적 서열로 MERS 바이러스의 spike 단백질을 코딩하는 서열이 표적 서열로 삽입된 단일 발현 카세트인 핵산 분자를 면역보강제로 마우스에 투여하여 면역 반응을 측정하기 위한 면역 스케줄을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 6은 도 5에 제시된 면역 스케줄에서, 2회째와 3회째 채취한 마우스의 혈청에서 체액성 면역과 관련하여 Th2 (T helper type 2) 세포에 의하여 유도되는 면역글로뷸린인 IgG1의 농도를 측정한 ELISA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 도 5에 제시된 면역 스케줄에 따라 면역된 마우스에서 채취한 혈청 중에 세포성 면역과 관련하여 Th1 세포에 의하여 유도되는 면역글로뷸린인 IgG2a의 농도를 측정한 ELISA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 도 5에 제시된 면역 스케줄에 따라 면역된 마우스 비장세포에서 Th1 세포의 분화를 촉진하는 사이토카인인 interferon-gamma (IFN-γ)를 생성하는 세포의 개수를 측정한 ELISPOT 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 귀뚜라미마비 바이러스 (CrPV)의 IRES 서열을 발현 조절 서열로 사용하고, 표적 서열로 MERS 바이러스의 spike 단백질을 코딩하는 서열이 표적 서열로 삽입된 제 1 발현 카세트와, 뇌심근염바이러스 (EMCV)의 IRES 서열을 발현 조절 서열로 사용하고, 표적 서열로 MERS 바이러스의 spike 단백질을 코딩하는 서열이 표적 서열로 삽입된 제 2 발현 카세트로 이루어진 핵산 분자를 면역보강제로 마우스에 투여하여 면역 반응을 측정하기 위한 면역 스케줄을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 10은 도 9에 제시된 면역 스케줄에 따라 면역된 마우스의 혈청에서 중화항체가를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 도 9에 제시된 면역 스케줄에 따라 면역된 마우스에서 채취한 혈청 중에 체액성 면역과 관련하여 Th2 세포에 의하여 유도되는 면역글로뷸린인 IgG1의 농도를 측정한 ELISA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 도 9에 제시된 면역 스케줄에 따라 면역된 마우스에서 채취한 혈청 중에 세포성 면역과 관련하여 Th1 세포에 의하여 유도되는 면역글로뷸린인 IgG2a의 농도를 측정한 ELISA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 귀뚜라미마비 바이러스 (CrPV)의 IRES 서열을 발현 조절 서열로 사용하고, 표적 서열로 인유두종바이러스 (HPV)의 L2 영역을 코딩하는 서열이 표적 서열로 삽입된 단일 발현 카세트인 핵산 분자를 면역보강제로 마우스에 투여하여 면역 반응을 측정하기 위한 면역 스케줄을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 14는 도 13에 제시된 면역 스케줄에 따라 채취한 마우스의 혈청에서 전체 IgG의 농도와, Th2 세포에 유도되는 IgG1의 농도와, Th1 세포에 의해 유도되는 IgG2a의 농도를 측정한 ELISA 분석 결과를 각각 나타낸 그래프이다. 본 발명에 따라 사용된 핵산 분자를 pCrPV로 표시하고 있다.
도 15a 내지 도 15c는 각각 도 13에 제시된 면역 스케줄에 따라 1차 vaccination 후에 채취한 마우스의 혈청 중에 전체 IgG의 농도, Th2 세포에 유도되는 IgG1의 농도, Th1 세포에 의해 유도되는 IgG2a의 농도를 측정한 ELISA 결과를 각각 나타낸 그래프이다. 항원으로 사용된 HPV 타입에 따른 결과를 나타내며, alum만을 투여한 비교군을 Alum adjuvant로, 본 발명에 따른 핵산 분자가 alum과 함께 투여된 실험군을 RNA adjuvant로 나타낸다.
도 15a 내지 도 15c는 각각 도 13에 제시된 면역 스케줄에 따라 2차 vaccination 후에 채취한 마우스의 혈청 중에 전체 IgG의 농도, Th2 세포에 유도되는 IgG1의 농도, Th1 세포에 의해 유도되는 IgG2a의 농도를 측정한 ELISA 결과를 각각 나타낸 그래프이다. 항원으로 사용된 HPV 타입에 따른 결과를 나타내며, alum만을 투여한 비교군을 Alum adjuvatn로, 본 발명에 따른 핵산 분자가 alum과 함께 투여된 실험군을 RNA adjuvant로 나타낸다.
도 16a 내지 도 16c는 각각 도 13에 제시된 면역 스케줄에서 2차 vaccination 후에 채취한 마우스의 혈청에서 전체 IgG의 농도와, Th2 세포에 유도되는 IgG1의 농도와, Th1 세포에 의해 유도되는 IgG2a의 농도를 측정한 결과를 각각 나타낸 그래프이다. 항원으로 사용된 HPV 타입에 따른 결과를 나타내며, alum만을 투여한 비교군을 Alum adjuvatn로, 본 발명에 따른 핵산 분자가 alum과 함께 투여된 실험군을 RNA adjuvant로 나타낸다.
도 17은 도 13에 도시된 면역 스케줄에 따라 면역된 마우스 비장세포에서 Th1 세포의 분화를 촉진하는 사이토카인인 interferon-gamma (IFN-γ)를 생성하는 세포의 개수를 측정한 ELISPOT 분석 결과를 나타낸 그래프와, 분석 결과를 나타낸 사진이다. 항원으로 사용된 HPV 타입에 따른 결과를 나타내며, alum만을 투여한 비교군을 Alum adjuvatn로, 본 발명에 따른 핵산 분자가 alum과 함께 투여된 실험군을 RNA adjuvant로 나타낸다.
도 17은 도 13에 도시된 면역 스케줄에 따라 면역된 마우스 비장세포에서 세포성 면역과 관련하여 Th1 세포의 분화를 촉진하는 것으로 알려진 사이토카인인 IL-2, IL-6, IFN-γ, tumor-necrosis factor-alpha (TNF-α)의 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 19는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 귀뚜라미마비 바이러스 (CrPV) 또는 콕사키바이러스B3 (CVB3)의 IRES 서열을 발현 조절 서열로 사용하고, 표적 서열로 인플루엔자 바이러스의 Haemagglutin (HA) 펩타이드를 코딩하는 서열이 표적 서열로 삽입된 제 1 발현 카세트와, 뇌심근염바이러스 (EMCV)의 IRES 서열을 발현 조절 서열로 사용하고, 표적 서열로 HA 펩타이드를 코딩하는 서열이 표적 서열로 삽입된 제 2 발현 카세트로 이루어진 핵산 분자를 면역보강제로 마우스에 투여하여 면역 반응을 측정하기 위한 면역 스케줄을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 20은 도 19에 제시된 면역 스케줄에 따라 면역된 마우스의 혈청에서 중화항체가를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 21은 도 19에 제시된 면역 스케줄에 따라 면역된 마우스의 비장세포에서 Th1 세포로의 분화를 촉진하는 사이토카인인 IFN-γ를 생성하는 세포의 개수를 측정한 ELISPOT 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 22는 도 19에 제시된 면역 스케줄에 따라 면역된 마우스의 비장세포에서 Th1 세포로의 분화를 촉진하는 사이토카인인 IL-4를 생성하는 세포의 개수를 측정한 ELISPOT 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 23은 도 19에 제시된 면역 스케줄에 따라 면역된 마우스의 비장세포에서 Th1 세포로의 분화를 촉진하는 사이토카인인 IL-6의 농도를 측정한 ELISA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 24는 도 19에 제시된 면역 스케줄에 따라 면역된 마우스의 비장세포에서 Th1 세포로의 분화를 촉진하는 사이토카인인 IFN-γ의 농도를 측정한 ELISA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 필요한 경우에 첨부하는 도면을 참조하면서 본 발명을 설명한다.
용어의 정의
본 명세서에서 용어 "아미노산"은 가장 넓은 의미로 사용되고, 자연-발생 L-아미노산 또는 잔기를 포함하는 것으로 의도된다. 자연-발생 아미노산에 대해 통상적으로 사용되는 1-문자 약어 및/또는 3-문자 약어가 본 명세서에 사용될 수 있다. 아미노산은 D-아미노산뿐만 아니라 화학적으로-변형된 아미노산, 예컨대 아미노산 유사체, 단백질에 통상적으로 혼입되지 않는 자연-발생 아미노산, 예컨대 노르류신, 및 아미노산의 특징인 것으로 당업계에 공지된 특성을 갖는 화학적으로-합성된 화합물을 포함한다. 예를 들어, 천연 Phe 또는 Pro와 동일한 펩타이드 화합물의 입체형태 제한을 허용하는 페닐알라닌 또는 프롤린의 유사체 또는 모방체가 아미노산의 정의 내에 포함된다. 이러한 유사체 및 모방체는 본 명세서에서 아미노산의 "기능적 균등물"로서 지칭된다. 아미노산의 다른 예는 문헌 [Roberts and Vellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Eds. Gross and Meiehofer, Vol. 5, p. 341 (Academic Press, Inc.: N.Y. 1983)]에 열거되어 있다.
예를 들어, 표준 고체-상 합성 기술에 의해 합성된 합성 펩타이드는 유전자에 의해 코딩되는 아미노산으로 제한되지 않으며, 이에 따라 주어진 아미노산에 대해 보다 광범위하게 다양한 치환을 허용한다. 유전자 코드에 의해 코딩되지 않은 아미노산은 본 명세서에서 "아미노산 유사체"로서 지칭되며, 예를 들어 WO 90/01940에 기재되어 있다. 예를 들어, 아미노산 유사체는 Glu 및 Asp에 대한 2-아미노 아디프산 (Aad); Glu 및 Asp에 대한 2-아미노피멜산 (Apm); Met, Leu 및 다른 지방족 아미노산에 대한 2-아미노부티르산 (Abu); Met, Leu 및 다른 지방족 아미노산에 대한 2-아미노헵탄산 (Ahe); Gly에 대한 2-아미노부티르산 (Aib); Val, Leu 및 Ile에 대한 시클로헥실알라닌 (Cha); Arg 및 Lys에 대한 호모아르기닌 (Har); Lys, Arg 및 His에 대한 2,3-디아미노프로피온산 (Dap); Gly, Pro 및 Ala에 대한 N-에틸글리신 (EtGly); Gly, Pro 및 Ala에 대한 N-에틸글리신 (EtGly); Asn 및 Gln에 대한 N-에틸아스파라긴 (EtAsn); Lys에 대한 히드록시리신 (Hyl); Lys에 대한 알로히드록시리신 (AHyl); Pro, Ser 및 Thr에 대한 3-(및 4-)히드록시프롤린 (3Hyp, 4Hyp); Ile, Leu 및 Val에 대한 알로-이소류신 (AIle); Arg에 대한 4-아미디노페닐알라닌; Gly, Pro 및 Ala에 대한 N-메틸글리신 (MeGly, 사르코신); Ile에 대한 N-메틸이소류신 (MeIle); Met 및 다른 지방족 아미노산에 대한 노르발린 (Nva); Met 및 다른 지방족 아미노산을 위한 노르류신 (Nle); Lys, Arg 및 His에 대한 오르니틴 (Orn); Thr, Asn및 Gln에 대한 시트룰린 (Cit) 및 메티오닌 술폭시드 (MSO); 및 Phe에 대한 N-메틸페닐알라닌 (MePhe), 트리메틸페닐알라닌, 할로-(F-, Cl-, Br- 또는 I-)페닐알라닌 또는 트리플루오릴페닐알라닌을 포함한다.
본 명세서에서 용어 “펩타이드”는 자연적으로 존재하는 것으로부터 분리하였거나, 재조합 기술 (recombinant technique)에 의하여 또는 화학적으로 합성된 단백질, 단백질 단편 및 펩타이드를 모두 포함한다. 예를 들어 본 발명의 펩타이드는 적어도 5개, 바람직하게는 10개의 아미노산으로 구성되어 있다.
특정 실시양태에서, 화합물의 변이체, 예컨대 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 펩타이드 변이체가 제공된다. 본 명세서에서 "펩타이드 변이체(peptide variants)"란 하나 또는 그 이상의 아미노산이 펩타이드의 아미노산 서열에 치환 (substitutions), 결실 (deletions), 첨가 (additions) 및/또는 삽입 (insertions)되어 있으면서, 원래의 아미노산으로 구성된 펩타이드와 거의 동일한 생물학적 기능을 발휘하는 것을 말한다. 펩타이드 변이체는 원래의 펩타이드와 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성 (identity)을 가지고 있어야 한다. 이러한 치환체로서 "보존성"이라고 알려진 아미노산 치환제가 포함될 수 있다. 변이체는 또한 비보존성 (nonconservative)의 변화를 포함할 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 변이체 폴리펩타이드의 서열은 5개 또는 그 이하의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 삽입됨으로서 원래의 서열과 달라진다. 변이체들은 또한 펩타이드의 면역원성 (immunogenicity), 2차 구조 (secondary structure) 및 수치료성 (hydropathic nature)에 최소한의 영향을 주는 아미노산들의 결실 또는 부가에 의해 변화될 수 있다.
"보존성" 치환이란 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되었을 때에도 폴리펩타이드의 2차 구조 및 수치료성 (hydropathic nature) 등의 특성에 큰 변화가 없는 것을 의미한다. 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대 극성(polarity), 전하(charge), 수용성(solubility), 소수성(hydrophobicity), 친수성(hydrophilicity) 및/또는 양친화성(amphipathic nature) 등의 유사성을 기초로 하여 얻어질 수 있다.
예를 들어 아미노산은 공통적인 곁사슬 특성에 따라 ⅰ) 소수성 (노르류신, 메티오닌, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신) ⅱ) 중성 친수성 (시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파라진, 글루타민), ⅲ) 산성 (아스파르트산, 글루탐산), ⅳ) 염기성 (히스티딘, 리신, 아르기닌), ⅴ) 쇄 방향에 영향을 미치는 잔기 (글리신, 프롤린), ⅵ) 방향족 (트립토판, 티로신, 페닐알라닌)으로 분류될 수 있다. 보존적 치환은 이들 각각의 클래스 중 하나의 구성원을 동일한 클래스의 다른 구성원으로 교환하는 것을 수반할 것이다.
아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 리신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글리신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글리신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루탐산 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르트산 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능 (interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값 (hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 리신 (+3.0); 아스파르트산 (+3.0±1); 글루탐산 (+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 리신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4). 친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
일반적으로, 본 명세서상에 언급되어 있는 펩타이드들 (융합 단백질 포함) 및 폴리뉴클레오티드들은 분리된 (isolated) 것이다. “분리된 (isolated)” 펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드란 원래의 환경으로부터 제거된 것이다. 예를 들어, 자연 상태로 존재하는 단백질은 그 상태에서 함께 존재하는 물질들 전부 혹은 일부를 제거함으로써 분리되는 것이다. 이러한 폴리펩타이드는 적어도 90% 이상의 순도를 지녀야 하며, 바람직하게는 95%, 더욱 바람직하게는 99% 이상의 순도를 가져야 한다. 폴리뉴클레오티드는 벡터 내에서 클로닝 시킴으로써 분리된다.
본 명세서에서 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 교환 가능하게 사용되며, 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고 DNA (예컨대 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함한다. 핵산 분자의 구성 단위인 "뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해, 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 당 또는 염기가 변형된 유사체 (analogue), 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 그 유사체를 포함할 수 있다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584 (1990)).
뉴클레오티드에서의 변이는 단백질에서 변이를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다. 또한, 뉴클레오티드에서의 변이가 단백질 자체에 변화를 가져올 수도 있다. 단백질의 아미노산에 변화를 가져오는 변이인 경우에도 본 발명의 단백질과 거의 동일한 활성을 나타내는 것이 얻어질 수 있다.
본 발명의 핵산 또는 폴리뉴클레오티드가 가지는 특징, 예를 들어 면역보강제로서의 효과를 갖는 범위에서, 본 발명의 펩타이드 및 핵산 분자는 서열목록에 기재된 아미노산 서열 또는 염기 서열에 한정되지 않는다는 것은 통상의 기술자에게 명확하다. 예를 들어, 발현 조절 서열과 작동 가능하게 연결되는 코딩 영역 및/또는 이로부터 발현되는 재조합 단백질/펩타이드에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 전술한 코딩 영역 및/재조합 단백질과 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 염기 서열의 변이를 가지는 폴리뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열의 변이를 가지는 단백질/펩타이드일 수 있다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에 따른 펩타이드 및/또는 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "벡터"는 숙주 세포에 전달이 가능하며 바람직하게는 하나 이상의 목적 유전자 또는 서열의 발현이 가능하도록 만들어진 구조물을 의미한다. 예를 들면 벡터에는 바이러스 벡터 (viral vectors), DNA 또는 RNA 발현 벡터 (expression vectors), 플라스미드 (plasmid), 코스미드 (cosmid) 또는 파지벡터 (phage vectors), CCA (cationic condensing agents)와 연결된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포좀 (liposomes)으로 포장된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 프로듀서 세포 (producer cells)와 같은 특정 진핵세포 (eukaryotic cells) 등이 포함된다.
본 명세서에서 "발현 조절 서열 (expression control/regulation sequence)" 또는 "발현 조절 요소 (expression control/regulation element)"는 핵산의 전사 (transcription) 및/또는 전사체 형태의 핵산으로부터 번역 (translation)을 조절하는 핵산 서열을 의미할 수 있다. 한편, "전사 조절 서열 (transcription control/regulation sequence)" 또는 "전사 조절 요소 (trnacription control/regulation element)"는 핵산의 전사를 조절하는 핵산 서열을 의미한다. 전사 조절 서열은 구조 프로모터 (constitutie promoter) 또는 유도 프로모터 (inducible promoter)와 같은 프로모터 또는 인핸서 (enhancer) 등이 있다. 또한, 전사체 형태의 핵산으로부터 단백질 또는 펩타이드로의 번역을 조절하는 핵산 서열에 대해서 "번역 조절 서열 (translation control/regulation sequence)" 또는 "번역 조절 요소 (translation control/regulation element)"라는 용어가 사용될 수 있다. 이들 발현 조절 서열/요소, 전사 조절 서열/요소 및/또는 번역 조절 서열/요소는 발현될 서열, 예를 들어 전사 또는 번역될 핵산 서열에 작동적으로 연결 (operatively linked)되어 있다.
본 명세서에서 용어 "작동 가능하게 연결된 (operatively linked)"은 핵산 발현 조절서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 라이보좀 결합부위, 전사 종결서열 등)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
면역보강제로서의 핵산 분자
본 발명은 발현 조절 서열과 작동 가능하게 연결된 면역원성 표적 서열을 포함하는 핵산 분자가 면역원에 의한 면역 반응을 효율적으로 향상시켜 면역보강제로서 활용될 수 있다는 점에 근거한다. 도 1은 본 발명의 예시적인 실시형태에 따라, 면역보강제로 활용될 수 있는 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드로서, 하나의 발현 유닛으로 이루어진 핵산 분자의 구성을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 핵산 분자는 바이러스성 내부리보솜결합부위 (Internal Ribosomal Entry Site; IRES)의 염기 서열을 포함하는 발현 조절 서열 (expression control sequence, ECS로 표시)과, 상기 발현 조절 서열 (ECS)과 작동 가능하게 연결되며, 면역원성 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 열린해독틀 (open reading frame; ORF)로 이루어진 코딩 영역 (coding region, CR)을 포함할 수 있다.
일례로, 코딩 영역 (CR)은 발현 조절 서열 (ECS), 예를 들어 IRES 서열 또는 IRES 서열을 포함하는 5'-UTR의 3'쪽에 위치할 수 있으며, 면역원으로 사용될 수 있는 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 표적 서열 (target sequence, TS)을 형성한다. 핵산 분자는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 핵산 분자는 RNA 형태를 가질 수 있다. 핵산 분자가 RNA 형태인 경우, 코딩 영역 (CR)은 면역원성 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 열린해독틀의 전사체 서열로 이루어질 수 있다.
발현 조절 서열 (ECS)은 열린해독틀 형태로 삽입되는 코딩 영역 (CR)과 작동 가능하게 연결되는 IRES 염기 서열을 포함하고 있다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 발현 조절 서열 (ECS)은 IRES 서열을 포함하는 5'-비번역영역 (5'Untranslated Region, 5'-UTR)을 형성할 수 있다.
5'-UTR은 코딩 영역 (CR)으로부터 발현되는 펩타이드 및/또는 단백질의 번역 과정에서 번역개시복합체 (translational initiation complex)가 결합하는 영역이며, IRES는 2차 및 3차 구조를 복잡하게 형성하여 코딩 영역 (CR)의 번역을 유도하는 cis-acting 염기 서열이다. IRES 염기 서열을 가지는 발현 조절 서열 (ECS)은 바이러스에서 유래한 (바이러스성) IRES 염기 서열을 포함할 수 있다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 바이러스성 IRES 염기 서열은 피코나바이러스과 (Picornaviridae), 토가바이러스과 (Togaviridae), 디시스트로바이러스과 (Dicistroviridae), 플라비바이러스과 (Flaviridae), 레트로바이러스과 (Retroviridae) 및/또는 헤르페스바이러스과 (Herpesviridae)의 바이러스에서 유래한 것일 수 있다.
예를 들어, 피코나바이러스과에 속하는 바이러스성 IRES 염기 서열은 엔테로바이러스속 (Enterovirus) 바이러스, 카디오바이러스속 (Cardiovirus) 바이러스, 아프토바이러스속 (Apthovirus) 바이러스, 헤파토바이러스속 (Hepatovirus) 바이러스 및/또는 테스코바이러스속 (Teschovirus) 바이러스에 유래한 것일 수 있다. 일례로, 엔테로바이러스속 바이러스는 엔테로바이러스 A 내지 엔테로바이러스 J 유형과, 리노바이러스 (Rhinovirus) A 내지 리노바이러스 C형으로 분류되는 바이러스에서 유래할 수 있다.
비제한적인 실시형태에서, 피코나바이러스과 바이러스 유래의 IRES 염기 서열은 1) 폴리오바이러스 (Poliovirus, PV), 리노바이러스 (Rhinovirus, RV), 콕사키바이러스 (Cossachievirus), 예를 들면, 콕사키바이러스B3 (Coxsachie virus B3, CVB3) 및/또는 엔테로바이러스71 (Enterovirus71, EV71)와 같은 엔테로바이러스속 바이러스, 2) 뇌심근염바이러스 (Encephalomyocarditis virus, EMCV) 및/또는 마우스뇌척수염바이러스 (Theiler murine encephalomyelitis virus, TMEV) 카디오바이러스속 바이러스, 3) 구제역 질병 바이러스 (Foot-and-mouth disease virus, FMDV)와 같은 아프토바이러스속 바이러스, 4) A형 간염바이러스 (Hepatitis A Virus, HAV)와 같은 헤파토바이러스속 바이러스, 및/또는 5) 돼지테스코바이러스 (Porcine teschovirus, PTV, 예를 들어 PTV-1)와 같은 테스코바이러스속 바이러스에서 유래할 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 선택적인 실시형태에서, 토가바이러스과 바이러스에서 유래하는 IRES 염기 서열은 알파바이러스속 (Alphavirus) 바이러스, 예를 들어, 신드비스 바이러스 (Sindbis virus, SV)에서 유래할 수 있다. 또한, 디스스트로바이러스과 바이러스에서 유래한 IRES 염기 서열은 크리파바이러스속 (Cripavirus) 바이러스, 예를 들어, 갈색날개노린재장내바이러스 (Plautia stali intestine virus, PSIV), 귀뚜라미 마비바이러스 (Cricket paralysis virus, CrPV), 트리아토마바이러스 (Triatoma virus), 및/또는 기장테두리진딧물바이러스 (Rhopalosiphum padi virus, RXPD)에서 유래할 수 있다.
한편, 예시적인 실시형태에서, 플라비바이러스과에 속하는 바이러스성 IRES 염기 서열은 1) 헤파시바이러스속 (Hepacivirus) 바이러스, 예를 들어, C형 간염바이러스 (Hepatitis C virus, HCV), 2) 플라비바이러스속 (Flavivirus) 바이러스, 예를 들어, 일본뇌염바이러스 (Japanese Encephalitis Virus, JEV), 및/또는 3) 페스티바이러스속 (Pestivirus) 바이러스, 예를 들어, 돼지열병바이러스 (Classical swine fever virus, CSFV) 및/또는 소바이러스성설사병바이러스 (Bovine viral diarrhea virus, BVDV)에서 유래할 수 있다.
다른 예시적인 실시형태에서, 레트로바이러스과에 속하는 바이러스성 IRES 염기 서열은 1) 감마레트로바이러스속 (Gammaretrovirus) 바이러스, 예를 들어, 프렌드 마우스레트로바이러스 (Friend murine leukemia virus, FMLV) 및/또는 몰로니마우스레트로바이러스 (Moloney murine leukemia virus, MMLV), 및/또는 2) 알파레트로바이러스속 (Alpharetrovirus) 바이러스, 예를 들어, 라우스 육종바이러스 (Rous sarcoma virus, RSV)에서 유래할 수 있다. 또한, 헤르페스바이러스과에 속하는 바이러스성 IRES 염기 서열은 마디바이러스속 (Mardivirus)에 속하는 마렉병바이러스 (Marek's disease virus, MDV)에서 유래할 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
일례로, 발현 조절 서열 (ECS)을 구성하는 바이러스성 IRES 염기 서열은 피코나바이러스과 (Picornaviridae) 바이러스 및/또는 디시스트로바이러스과(Dicistroviridae) 바이러스에서 유래한 것일 수 있다. 일례로, 피코나바이러스과 바이러스에서 유래한 IRES 염기 서열은 엔테로바이러스속 바이러스, 카디오바이러스속 바이러스 및/또는 아프토바이러스속 바이러스에서 유래할 수 있으며, 특히 바람직하게는 엔테로바이러스속 바이러스 및/또는 카이도바이러스속 바이러스에 유래할 수 있다. 예를 들어, 엔테로바이러스속 바이러스에서 유래한 IRES 염기 서열은 CVB3와 같은 콕사키바이러스 등의 엔테로바이러스속 바이러스 및/또는 EMCV와 같은 카디오바이러스속 바이러스에서 유래할 수 있다. 또한, 디시스트로바이러스과 바이러스에서 유래한 IRES 염기 서열은 크리파바이러스속 바이러스인 PSIV 및/또는 CrPV, 바람직하게는 CrPV에서 유래한 것일 수 있다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 발현 조절 서열 (ECS)은 CrPV, EMCV, CVB3 및 이들의 종합으로 구성되는 군에서 선택되는 바이러스 유래의 IRES 염기 서열을 가질 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되지 않는다. 일례로, 발현 조절 서열 (ECS)은 CrPV에서 유래한 IRES 염기 서열을 포함하는 5'-UTR (서열식별번호: 1), EMCV에서 유래한 IRES 염기 서열을 포함하는 5'-UTR (서열식별번호: 2) 및/또는 CVB3에서 유래한 IRES 염기 서열을 포함하는 5'-UTR (서열식별번호: 3)로 이루어질 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되지 않는다.
IRES는 독특한 2차 구조 (secondary structure) 또는 3차 구조 (tertiary structure)를 가지고 있으며, 번역에 필요한 특별한 번역 인자의 필요 유무 및 번역 개시 코돈의 위치 등을 기준으로 Group 1 내지 Group 4로 구분될 수 있다. 예를 들어, 바이러스에서 유래한 IRES로서 Group 1 IRES는 가장 간단한 구조이며, 번역 인자 및 번역 개시 tRNA인 methyonyl-tRNA (Met-tRNAi)가 필요 없는 IRES로서, CrPV 및 PSIV 등의 바이러스에서 유래한 IRES를 포함한다. Group 2 IRES는 eIF2, eIF3와 같은 원래의 번역 개시 인자 및 Met-tRNAi를 이용하며, 아프토바이러스속 (Apthovirus) 바이러스인 HCV, 테스코바이러스속 (Teschovirus) 바이러스인 PTV-1, 플라비바이러스속 (Flavivirus) 바이러스인 CSFV 등의 바이러스에서 유래한 IRES 구조를 포함한다. 또한, Group 3 IRES는 번역 개시 인자로서 eIFs, Met-tRNAi 이외에도 IRES trans-activating factors (ITAFs)를 필요로 하고, IRES의 3' 말단에서 번역을 개시하는데, 아프토바이러스속 바이러스인 FMDV 또는 카디오바이러스속 (Cardiovirs) 바이러스인 EMCV나 TMEV 등의 바이러스에서 유래한 IRES를 포함한다. 마지막으로, Group 4 IRES는 IRES의 하류에 위치한 AUG 코돈에서 번역을 개시하며, 헤파토바이러스속 (Hepatovirus) 바이러스인 HAV, 엔테로바이러스속 (Enterovirus) 바이러스인 소아마비바이러스 (PV), 리노바이러스 (RV) 등의 바이러스에서 유래한 IRES를 포함한다. 필요한 경우, 일부 바이러스에서 유래한 IRES의 5' 말단은 바이러스 단백질에서 유래한 Cap-유사 구조를 가지도록 변형될 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
선택적인 실시형태에서, 핵산 분자는 열린해독틀 (ORF) 형태로 연결되는 코딩 영역 (CR)의 발현 효율을 증가시킬 수 있는 핵산 서열이 더욱 삽입될 수 있다. 발현 조절 서열 (ECS)에 인접하여 다수의 아데노신 또는 다수의 아데노신으로 전사될 수 있는 뉴클레오티드 (multiple adenosine; MA)가 삽입될 수 있다. 일례로, 도 1에서는 RNA 형태의 전사체 핵산 분자의 발현 조절 서열 (ECS)의 5'쪽에 다수의 아데노신 (MA)이 삽입된 것을 예시하고 있다.
발현 조절 서열 (ECS)에 인접하여 삽입될 수 있는 다수의 아데노신 (MA)은 전사체 형태를 나타낸 것이다. 하나의 예시적인 실시형태에서, IRES 염기 서열을 가지는 발현 조절 서열 (ECS)에 인접하여 20 내지 400개, 바람직하게는 30 내지 300개, 더욱 바람직하게는 30 내지 200개, 가장 바람직하게는 30 내지 100개의 연속적인 아데노신 또는 아데노신으로 전사될 수 있는 뉴클레오티드가 삽입될 수 있다.
다수의 아데노신 또는 아데노신으로 전사될 수 있는 뉴클레오티드 (MA)가 삽입될 수 있는 발현 조절 서열 (ECS)은 전술한 바이러스성 IRES를 포함한다. 일례로, 다수의 아데노신 또는 아데노신으로 전사될 수 있는 다수의 뉴클레오티드 (MA)에 인접하게 위치하는 발현 조절 서열 (ECS)은 피코나바이러스과 (Picornaviridae) 바이러스, 토가바이러스과 (Togaviridae) 바이러스, 디시스트로바이러스과 (Dicistroviridae) 바이러스, 플라비바이러스과 (Flaviridae) 바이러스, 레트로바이러스과 (Retroviridae) 바이러스 및/또는 헤르페스바이러스과 (Herpesviridae) 바이러스에서 유래한 IRES 염기 서열을 포함할 수 있다.
예시적인 실시형태에서, 다수의 아데노신 또는 아데노신으로 전사될 수 있는 뉴클레오티드가 삽입될 수 있는 바이러스성 IRES 염기 서열은 피코나바이러스과 바이러스 및/또는 디시스트로바이러스과 바이러스에서 유래한 IRES 염기 서열일 수 있다. 예를 들어, CVB3와 같은 엔테로바이러스속 바이러스 및/또는 EMVC와 같은 카디오바이러스속 바이러스 등의 피코나바이러스과 바이러스에서 유래한 IRES 염기 서열 및/또는 CrPV와 같은 크리파바이러스속 바이러스 등의 디시스트로바이러스과 바이러스에서 유래한 IRES 염기 서열을 가지는 발현 조절 서열 (ECS)의 5'쪽에 다수의 아데노신 또는 다수의 아데노신으로 전사될 수 있는 뉴클레오티드가 삽입될 수 있다.
한편, 코딩 영역 (CR)은 면역원성 단백질 또는 펩타이드로 발현될 수 있는 열린해독틀 형태의 핵산 서열로 이루어질 수 있으며, 발현 조절 서열 (ECS)과 작동 가능하게 연결될 수 있다. 하나의 예시적인 실시형태에서 코딩 영역 (CR)은 발현 조절 서열 (ECS)의 3'쪽에 위치할 수 있지만, 코딩 영역 (CR)의 위치가 이에 한정되는 것은 아니다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 면역원성 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 표적 서열 (TS)로서의 코딩 영역 (CR)은 항원, 항체, 펩타이드 또는 단백질로 이루어지는 치료제, 이들의 단편, 이들의 변이체 및/또는 이들의 유도체를 암호화하는 열린해독틀로 이루어질 수 있다. 일례로, 코딩 영역 (CR)은 항원 또는 이들의 에피토프와 같은 단편을 암호화하는 열린해독틀인 염기 서열을 가질 수 있다.
예를 들어, 코딩 영역 (CR)으로부터 발현될 수 있는 항원은 종양 (tumour) 항원, 동물 항원, 초목 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 곰팡이 항원 및 원생동물 항원, 자가면역 항원 또는 알레르기 항원을 고려할 수 있다. 종양 세포의 표면 항원 및 표면 항원, 특히, 바이러스 병원균, 박테리아 병원균, 곰팡이 병원균 또는 원생동물 병원균의, 분비된 형태가 바람직하다.
코딩 영역 (CR)으로부터 발현될 수 있는 종양 항원의 특정한 예는 그 중에서도 종양-특이성 표면 항원 (tumor-specific surface antigens, TSSA)이다. 예를 들어, 종양 항원은 5T4, 707-AP, 9D7, AFP, AlbZIP HPG1, 알파-5-베타-1-인테그린, 알파-5-베타-6-인테그린, 알파-액티닌-4/m, 알파-메틸아실-코엔자임 A 라세미화 효소 (racemase), ART-4, ARTC1/m, B7H4, BAGE-1, BCL-2, bcr/abl, 베타-카테닌/m, BING-4, BRCA1/m, BRCA2/m, CA 15-3/CA 27-29, CA 19-9, CA72-4, CA125, 칼레티큘린(calreticulin), CAMEL, CASP-8/m, 카텝신 B, 카텝신 L, CD19, CD20, CD22, CD25, CDE30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CEA, CLCA2, CML28, CML66, COA-1/m, 코액토신(coactosin)-유사 단백질, 콜라주 XXIII, COX-2, CT-9/BRD6, Cten, 싸이클린 B1, 싸이클린 D1, cyp-B, CYPB1, DAM-10, DAM-6, DEK-CAN, EFTUD2/m, EGFR, ELF2/m, EMMPRIN, EpCam, EphA2, EphA3, ErbB3, ETV6-AML1, EZH2, FGF-5, FN, Frau-1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE7b, GAGE-8, GDEP, GnT-V, gp100, GPC3, GPNMB/m, HAGE, HAST-2, 헵신, Her2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A*0201-R17I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HNE, 호메오박스 NKX3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT, iCE, IGF-1R, IL-13Ra2, IL-2R, IL-5, 미성숙 라미닌 수용체, 칼리크레인-2, 칼리크레인-4, Ki67, KIAA0205, KIAA0205/m, KK-LC-1, K-Ras/m, LAGE-A1, LDLR-FUT, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2, 마마글로빈 A, MART-1/멜란(melan)-A, MART-2, MART-2/m, 바탕질 단백질(matrix protein) 22, MC1R, M-CSF, ME1/m, 메소텔린, MG50/PXDN, MMP11, MN/CA IX-항원, MRP-3, MUC-1, MUC-2, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, myosin class I/m, NA88-A, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제-V(글루코사미닐transferase-V), Neo-PAP, Neo-PAP/m, NFYC/m, NGEP, NMP22, NPM/ALK, N-Ras/m, NSE, NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1, OFA-iLRP, OGT, OGT/m, OS-9, OS-9/m, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, p15, p190 minor bcr-abl, p53, p53/m, PAGE-4, PAI-1, PAI-2, PART-1, PATE, PDEF, Pim-1-키나아제, Pin-1, Pml/PAR알파, POTE, PRAME, PRDX5/m, 프로스테인, 프로테이나아제-3, PSA, PSCA, PSGR, PSM, PSMA, PTPRK/m, RAGE-1, RBAF600/m, RHAMM/CD168, RU1, RU2, S-100, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SCC, SIRT2/m, Sp17, SSX-1, SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1, STEAP, 서바이빈, 서바이빈-2B, SYT-SSX-1, SYT-SSX-2, TA-90, TAG-72, TARP, TEL-AML1, TGF베타, TGF베타RII, TGM-4, TPI/m, TRAG-3, TRG, TRP-1, TRP-2/6b, TRP/INT2, TRP-p8, 티로시나아제, UPA, VEGF, VEGFR-2/FLK-1 및 WT1이다. 종양 (tumor) 항원의 계열은 본 발명의 목적, 예를 들면, 세포외 매트릭스 (matrix) 구조 등에 영향을 미치는, 신혈관형성 (neovascularization)에 관여하는 것으로 알려진 종양 (tumor) 항원에 적당하다.
다른 예시적인 실시형태에서, 코딩 영역 (CR)으로부터 발현될 수 있는 병원성 항원은 개체, 예를 들어 포유류 개체, 특히 인간에 의해 면역 반응을 유도하는 병원성 유기체로부터 유래될 수 있다. 일례로, 병원성 항원은 박테리아성, 바이러스성 또는 원생동물학적 (다세포성) 병원성 유기체들로부터 유래될 수 있다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 병원성 항원은 바이러스, 박테리아 또는 원생동물과 같은 유기체의 표면에 위치한 표면 항원 (surface antigens), 예를 들어 단백질 (또는 단백질의 단편, 예를 들어 표면 하원의 외부 일부분)일 수 있다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 코딩 영역 (CR)에 의해 암호화될 수 있는 병원성 항원들은 감염성 질병 (infectious diseae)와 관련된 병원균으로부터 유래되는 펩타이드 또는 단백질 항원이다. 감염성 질병과 관련된 병원균의 비-제한적인 예는 다음과 같다: 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 아나플라스마 속 (Anaplasma genus), 아나플라스마 파고사이토필럼 (Anaplasma phagocytophilum), 브라질 구충 (Ancylostoma braziliense), 십이지장충 (Ancylostoma duodenale), 용혈성 아카노박테리아균 (Arcanobacterium haemolyticum), 아스카리스 룸브리코이데스 (Ascaris lumbricoides), 아스퍼질러스 속 (Aspergillus genus), 아스트로비리다에 (Astroviridae), 바베시아 속 (Babesia genus), 바실러스 앤스래시스 (Bacillus anthracis), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 바르토넬라 헨셀라에 (Bartonella henselae), BK 바이러스 (BK virus), 블라스토시스티스 호미니스 (Blastocystis hominis), 블라스토미세스 더마티티디스 (Blastomyces dermatitidis), 보르데텔라 퍼터시스 (Bordetella pertussis), 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi), 보렐리아 속 (Borrelia genus), 보렐리아 종들 (Borrelia spp), 브루셀라 속 (Brucella genus), 말레이 사상충 (Brugia malayi), 분야비리대 과 (Bunyaviridae family), 부르크홀데리아 세파시아 (Burkholderia cepacia) 및 다른 부르크홀데리아 종들, 부르크홀데리아 말레이 (Burkholderia mallei), 부르크홀데리아 슈도말레이 (Burkholderia pseudomallei), 칼리시비리다에 과 (Caliciviridae family), 캄필로박터 속 (Campylobacter genus), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 칸디다 종들 (Candida spp), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 클라미도필라 뉴모니아 (Chlamydophila pneumonia), 클라미도필라 프시타시 (Chlamydophila psittaci), CJD 프리온 (CJD prion), 간흡충 (Clonorchis sinensis), 클로스트리듐 보툴리눔 (Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실레 (Clostridium difficile), 클로스트리듐 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens), 클로스트리듐 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens), 클로스트리듐 종들 (Clostridium spp), 클로스트리듐 테타니 (Clostridium tetani), 콕시디오이데스 종들 (Coccidioides spp), 코로나바이러스 (coronaviruses), 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheria), 콕시엘라 부르네티 (Coxiella burnetii), 크리민 콩고 출혈열 바이러스 (Crimean-Congo hemorrhagic fever virus), 크립토코커스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 크립토스포리디움 속 (Cryptosporidium genus), 거대세포바이러스 (Cytomegalovirus (CMV)), 뎅기열 바이러스 (Dengue viruses (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4)), 이핵아메바 (Dientamoeba fragilis), 에볼라바이러스 (Ebolavirus (EBOV)), 에키노코쿠스 (Echinococcus genus), 에를리키아 샤펜시스 (Ehrlichia chaffeensis), 에를리키아 에인지 (Ehrlichia ewingii), 에를리키아 속 (Ehrlichia genus), 이질아메바 (Entamoeba histolytica), 엔테로코쿠스 속 (Enterococcus genus), 엔테로바이러스 속 (Enterovirus genus), 엔테로바이러스 (Enteroviruses), 주로 콕사키 A 바이러스 및 엔테로바이러스 71 (Coxsackie A virus 및 Enterovirus 71 (EV71)), 에피더모파이톤 종들 (Epidermophyton spp), 에프스타인-바바이러스 (Epstein-Barr Virus (EBV)), 대장균 O157:H7, O111 및 O104:H4 (Escherichia coli O157:H7, O111 and O104:H4), 파시올라 헤파티카 (Fasciola hepatica) 및 파시올라 기간티카 (Fasciola gigantica), FFI 프리온 (FFI prion), 필라리오데아상과 (Filarioidea superfamily), 플라비바이러스 (Flaviviruses), 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis), 푸소박테륨 속 (Fusobacterium genus), 게오트리쿰 칸디둠 (Geotrichum candidum), 기아르디아 인테스티날리스 (Giardia intestinalis), 악구충 종들 (Gnathostoma spp), GSS 프리온 (GSS prion), 구아나리토 바이러스 (Guanarito virus), 헤모필러스 듀크레이 (Haemophilus ducreyi), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenza), 헬리코박터 파이로리 (Helicobacter pylori), 헤니파바이러스 (Henipavirus (헨드라 바이러스 니파바이러스 (Hendra virus Nipah virus)), A형 간염 바이러스 (Hepatitis A Virus), B형 간염 바이러스 (Hepatitis B Virus (HBV)), C형 간염 바이러스 (Hepatitis C Virus (HCV)), D형 간염 바이러스 (Hepatitis D Virus), E형 간염 바이러스 (Hepatitis E Virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스 1 및 2 (Herpes simplex virus 1 and 2 (HSV-1 및 HSV-2)), 히스토플라스마 캅술라튬 (Histoplasma capsulatum), HIV (인간 면역결핍 바이러스(Human immunodeficiency virus)), 호르테아 워넥키 (Hortaea werneckii), 인간 보카바이러스 (Human bocavirus (HBoV)), 인간 헤르페스바이러스 6 (Human herpesvirus 6 (HHV-6)) 및 인간 헤르페스바이러스 7 (Human herpesvirus 7 (HHV-7)), 인간 메타뉴모바이러스 (Human metapneumovirus (Hmpv)), 인유두종 바이러스 (Human papillomavirus (HPV)), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (Human parainfluenza viruses (HPIV)), 일본 뇌염 바이러스 (Japanese encephalitis virus), JC 바이러스 (JC virus), 후닌 바이러스 (Junin virus), 킨젤라 킨가에 (Kingella kingae), 클렙시엘라 그래뉼로마티스 (Klebsiella granulomatis), 쿠루 프리온 (Kuru prion), 라사 바이러스 (Lassa virus), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 리슈마니아 속 (Leishmania genus), 렙토스피라 속 (Leptospira genus), 리스테리아 모노사이토제니스 (Listeria monocytogenes), 림프구성 맥락수막염 바이러스 (Lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV)), 마츄포 바이러스 (Machupo virus), 말라세지아 종들 (Malassezia spp), 마부르크 바이러스 (Marburg virus), 홍역 바이러스 (Measles virus), 요코가와 흡충 (Metagonimus yokagawai), 마이크로스포리디아 필룸 (Microsporidia phylum), 중동호흡기증후군 코로나바이러스 (Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV), 몰루스쿰 콘타기오숨 바이러스 (Molluscum contagiosum virus (MCV)), 유행성이하선염 바이러스 (Mumps virus), 미코박테리움 레프라에 (Mycobacterium leprae) 및 미코박테리움 레프로마토시스 (Mycobacterium lepromatosis), 미코박테리움 튜버큘로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 미코박테리움 울서란스 (Mycobacterium ulcerans), 폐렴 미코플라스마 (Mycoplasma pneumonia), 네글레리아 파울러리 (Naegleria fowleri), 아메리카 구충 (Necator americanus), 임균 (Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닝지티디스 (Neisseria meningitides), 노카디아 아스테로이드 (Nocardia asteroids), 노카디아 종들 (Nocardia spp), 온코세르카 볼부루스 (Onchocerca volvulus), 오리엔티아 쯔쯔가무시 (Orientia tsutsugamushi), 오르소믹소 바이러스과 (Orthomyxoviridae family (인플루엔자(Influenza)), 브라질 파라콕시디오이디즈 (Paracoccidioides brasiliensis), 폐흡충 종들 (Paragonimus spp), 웨스터만 폐흡충 (Paragonimus westermani), 파보바이러스 B19 (Parvovirus B19), 파스튜렐라 속 (Pasteurella genus), 플라스모디움 속 (Plasmodium genus), 뉴모시스티스 지로베시 (Pneumocystis jirovecii), 폴리오바이러스 (Poliovirus), 광견병 바이러스 (Rabies virus), 호흡기 세포 융합 바이러스 (Respiratory syncytial virus (RSV)), 리노바이러스(Rhinovirus), 리노바이러스들 (rhinoviruses), 리케치아 아카리 (Rickettsia akari), 리케치아 속 (Rickettsia genus), 리케치아 프로바제키 (Rickettsia prowazekii), 리케치아 리케치 (Rickettsia rickettsia), 리케치아 티피 (Rickettsia typhi), 리프트 밸리 열 바이러스 (Rift Valley fever virus), 로타바이러스 (Rotavirus), 루벨라 바이러스 (Rubella virus), 사비아 바이러스 (Sabia virus), 살모넬라 속 (Salmonella genus), 사콥테스 스카비에이 (Sarcoptes scabiei), SARS 코로나바이러스 (SARS coronavirus), 주혈흡충 속 (Schistosoma genus), 쉬겔라 속 (Shigella genus), 신 놈브레 바이러스 (Sin Nombre virus), 한타바이러스 (Hantavirus), 스포로트릭스 쉔키 (Sporothrix schenckii), 스타필로코쿠스 속 (Staphylococcus genus), 스타필로코쿠스 속 (Staphylococcus genus), 스트렙토코쿠스 아갈락티아 (Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 뉴모니아 (Streptococcus pneumonia), 스트렙토코쿠스 피오제네스 (Streptococcus pyogenes), 스트롱일로이드 스 테콜라리스 (Strongyloides stercoralis), 타이니아 속 (Taenia genus), 타이니아 솔리움 (Taenia solium), 진드기 매개 뇌염 바이러스 (Tick-borne encephalitis virus (TBEV)), 개회충 (Toxocara canis) 또는 고양이 회충 (Toxocara cati), 톡소플라스마 곤디 (Toxoplasma gondii), 트레포네마 팔리둠 (Treponema pallidum), 트리키넬라 스피랄리스 (Trichinella spiralis), 트리코모나스 바지날리스 (Trichomonas vaginalis), 트리코파이톤 종들 (Trichophyton spp), 트리쿠리스 트리치우라 (Trichuris trichiura), 트리파노소마 브루세이 (Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지 (Trypanosoma cruzi), 우레아플라즈마 우레알리티쿰 (Ureaplasma urealyticum), 수두 대상 포진 바이러스 (Varicella zoster virus (VZV)), 수두 대상 포진 바이러스 (Varicella zoster virus (VZV)), 대두창 (Variola major) 또는 소두창 (Variola minor), vCJD 프리온 (vCJD prion), 베네주엘라 이콰인 뇌염 바이러스 (Venezuelan equine encephalitis virus), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholera), 웨스트 나일 바이러스 (West Nile virus), 웨스턴 말 뇌염 바이러스 (Western equine encephalitis virus), 반크로프트 사상충 (Wuchereria bancrofti), 황열병 바이러스 (Yellow fever virus), 여시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica), 여시니아 페스티스 (Yersinia pestis), 여시니아 슈도투베르쿨로시스 (Yersinia pseudotuberculosis) 및 지카바이러스 (Zika virus).
병원균에서 유래한 항원과 관련해서, 특히 본 발명의 핵산 분자의 코딩 영역 (CR)으로부터 발현되는 항원은 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 헤르페스 심플렉스바이러스 (HSV), 인유두종 바이러스 (HPV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 플라스모디움, 스타필로코쿠스 아우레우스, 뎅기열 바이러스, 클라미디아 트라코마티스, 거대세포바이러스 (CMV), B형 간염 바이러스 (HBV), 미코박테리움 튜버큘로시스, 광견병 바이러스, 황열병 바이러스, 중동호흡기증후군 코로나바이러스 (MERS-CoV) 및/또는 지카바이러스로부터 선택된 병원균으로부터 유래한 항원들이다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 코딩 영역 (CR)으로부터 발현될 수 있는 펩타이드 또는 단백질은, 항원이나 항체 등과 같이 생체 내에서 면역 반응을 유도할 수 있는 펩타이드 또는 단백질이다. 다시 말하면, 코딩 영역 (CR)은 항원이나 항체 등과 같은 면역원성 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 열린해독틀 (ORF)로 이루어질 수 있다. 일례로, 코딩 영역 (CR)은 면역원성 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 유전자의 염기 서열 또는 유전자의 전사체 서열로 이루어질 수 있다.
예시적인 실시예에 따르면, 핵산 분자를 구성하는 코딩 영역 (CR)은, 중동호흡기증후군코로나바이러스 (Middle East Respiratory Syndorme-coronavirus; MERS-CoV)의 스파이크 펩타이드를 암호화하는 열린해독틀 (서열식별번호: 10), MERS-CoV의 스파이크 펩타이드의 단편을 암호화하는 열린해독틀 (서열식별번호: 12), 인유두종바이러스 (Human papilomavirus; HPV)의 L1 영역 또는 그 단편을 암호화하는 열린해독틀, 예를 들어 HPV 타입 16의 L1 영역 또는 그 단편을 암호화하는 열린해독틀 (서열식별번호: 13)이나 HPV 타입 18의 L1 또는 그 단편을 암호화하는 열린해독틀 (서열식별번호: 14), 인플루엔자 바이러스의 Haemagglutin (HA) 또는 그 단편을 암호화하는 열린해독틀 (서열식별번호: 25) 및/또는 이들의 균등 핵산 서열을 포함할 수 있지만, 본 발명이 이에 제한되지 않는다.
또한, 하나의 예시적인 실시형태에 따르면, 본 발명에 따른 핵산 분자는 RNA 형태를 가질 수 있다. 이때, 코딩 영역 (CR)이 전술한 병원성 항원과 같이 생체 내에서 면역 반응을 유발할 수 있는 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 열린해독틀 (ORF)의 전사체 서열로 이루어지는 등 핵산 분자가 RNA 형태로 이루어지는 경우, DNA 형태의 핵산 분자에 비하여 유리하다.
첫째, RNA 형태의 핵산 분자는 그 특성상 DNA 형태의 핵산 분자와 달리, mRNA로의 전사를 위해서 숙주 세포의 핵 안으로 진입할 필요가 없다. RNA 형태의 핵산 분자는 세포질 내에서 원하는 펩타이드 또는 단백질을 합성할 수 있으므로, RNA 형태의 핵산 분자는 DNA 형태의 핵산 분자에 비하여 인체에 대하여 유리하다. 즉, RNA 형태의 핵산 분자는 핵 내에서 숙주의 염색체 내로 끼어들어갈 가능성이 없으며, 숙주 세포에서 선별 생산하기 위해 사용하는 선별 마커인 항생제 저항 유전자가 RNA 핵산 분자의 제작에 불필요하고, RNA는 DNA에 비하여 반감기가 짧기 때문에 장기 유전자 변형 (presistenec genetic transformation)을 유도하지 ?는다. 즉, 일반적인 형태의 핵산 분자는 세포 안에 전달되어 단기간만 활성화되어 표적 펩타이드/단백질을 발현하고 수일 안에 효소학적 반응으로 파괴되지만, 최초 발현한 표적 펩타이드/단백질에 대한 특이적인 면역 반응은 남아 있다.
둘째, RNA 형태의 핵산 분자는 상대적으로 DNA 형태의 핵산 분자에 비하여 적은 양을 사용하더라도 원하는 생체내 면역 반응을 유도할 수 있다. 전술한 바와 같이, RNA 형태의 핵산 분자는 DNA 형태의 핵산 분자와 달리, 핵으로 들어갈 필요가 없고, 세포막만을 통과하면 된다. 따라서, RNA 형태의 핵산 분자를 사용하면, DNA 형태의 핵산 분자보다 적은 양을 사용하더라도 같은 정도의 표적 펩타이드/단백질을 발현시킬 수 있다.
셋째, 모든 제작 공정을 인공적으로 제어할 수 있기 때문에, 생물학적 오염에 대한 위험 없이 소규모 GMP (good manufacturing practice) 생산 시설에서 안전하게 백신을 생산할 수 있다. 즉, RNA 형태의 핵산 분자는 소규모 GMP 실험실 수준의 시설만이 필요하며, 직접 감염원 (바이러스 혹은 병원성 미생물)을 다루지 않아도 되기 때문에 신속하게 다양한 백신을 제조, 생산할 수 있다.
넷째, RNA 형태의 핵산 분자는 naked DNA 핵산 분자에 비하여 더욱 강한 면역 반응을 유도할 수 있다. 이는 RNA 핵산 분자의 스템-루프 (stem-loop) 구조 및 RNA 자체 특성으로 인해 유도된 선천성 면역 반응과, 면역된 숙주 세포에서 발현된 표적 펩타이드/단백질에 의해 유도된 후천성 면역 반응이 상호 협력하여 나타내는 것으로 생각된다. 또한 RNA 핵산 분자 자체가 세포 내에서 복잡한 항원 복합체 (complex antigen)을 생산하고 이것이 항원 제시 세포의 MHC (major histocompatiblity complex; 주조직적합성복합체) class Ⅱ에 접근하여 이상적인 백신으로 작용할 수 있다.
다섯째, RNA 핵산 분자는 기존의 DNA 핵산 분자에 비하여 생산이 용이하다. 전술한 바와 같이, RNA 핵산 분자를 생산할 때 감염원을 직접 다룰 필요가 없으며, 대신 발현하고자 하는 감염원의 중화항체 유도 관련 부분 (중화 epitope)의 핵산 서열만을 인공적으로 합성하고, 시험관내 전사 (in vitro transcription, IVT)만으로 대량의 RNA 핵산 분자를 생산할 수 있다. 최근에는 IVT 반응과 관련된 시약, 특히 DNA-의존성 RNA 중합효소가 개선되어 소량의 DNA 주형 (template)을 이용하여 대량의 RNA를 1~2주 안에 신속하게 생산할 수 있다. 또한, 면역 반응을 유도하고자 하는 다수의 항원을 동시에 제작하여 혼합한 후 면역할 수 있으며, 발현하고자 하는 항원의 유전자 길이에 특별한 제약이 없어 RNA 핵산 분자 제작의 응용성 및 간편성이 증가하였다.
다른 예시적인 실시형태에서, 코딩 영역 (CR)은 질병 치료와 관련된 펩타이드 및/또는 단백질을 암호화하는 핵산의 염기 서열, 일례로 전사체 서열을 포함할 수 있다. 이에 따라, 본 발명에 따른 핵산 분자는 질병 치료와 관련된 면역 반응을 강화시킬 수 있는 면역보강제로 활용될 수 있다.
예시적인 실시형태에서, 질병 치료와 관련된 펩타이드 또는 단백질은 대사 또는 내분비 질환 치료에 사용되는 치료 펩타이드/단백질; 혈액 질환, 순환계 질환, 호흡계 질환, 암 또는 종양 질환, 감염성 질환 또는 면역 결핍증 치료에 사용되는 치료 펩타이드/단백질; 호르몬 대체 요법에 사용되는 치료 펩타이드/단백질; 체세포를 만능 줄기 세포 또는 전능 줄기 세포로 역분화하는데 사용되는 치료 펩타이드/단백질; 보조제 또는 면역 자극 단백질로부터 선택되는 치료 펩타이드/단백질 및/또는 항체를 포함할 수 있다. 이들 질병 치료와 관련된 펩타이드 또는 단백질은 후술하는 약학 조성물 중에 약학적으로 활성인 물질을 구성할 수 있다.
일례로, 대사 또는 내분비 질환의 치료에 사용되는 펩타이드 또는 단백질은 산 스핑고마이엘리나제, 아디포타이드, 아갈시다제-베타, 알글루코시다제, 알파-갈락토시다제 A, 알파-글루코시다제, 알파-L-이듀로니다제, 알파-N-아세틸글루코사미니다제, 암피레귤린, 안지오포이에틴 (Ang1, Ang2, Ang3, Ang4, ANGPTL2, ANGPTL3, ANGPTL4, ANGPTL5, ANGPTL6, ANGPTL7), 베타셀룰린, 베타-글루쿠로니다제, 골 형성 단백질 BMP (BMP1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP10, BMP15), CLN6 단백질, 상피 성장 인자 (EGF), 에피젠, 에피레귤린, 섬유아세포 성장 인자 (FGF, FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13, FGF-14, FGF-16, FGF-17, FGF-17, FGF-18, FGF-19, FGF-20, FGF-21, FGF-22, FGF-23), 갈설파제, 그렐린, 글루코세레브로시다제, GM-CSF, 헤파린-결합 EGF 유사 성장 인자 (HB-EGF), 간세포 성장 인자 HGF, 헵시딘, 사람 알부민, 알부민 소실 증가, 이듀르설파제 (이듀로네이트-2-설파타제), 인테그린 αVβ3, αVβ5 및 αVβ1, 이듀로네이트 설파타제, 라로니다제, N-아세틸
갈락토사민-4-설파타제 (rhASB; 갈설파제, 아릴설파타제 A(ARSA), 아릴설파타제 B (ARSB)), N-아세틸글루코사민-6-설파타제, 신경 성장 인자 (NGF, 뇌 유래 신경영양인자(BDNF), 뉴로트로핀-3 (NT-3), 뉴로트로핀 4/5 (NT-4/5), 뉴레귤린 (NRG1, NRG2, NRG3, NRG4), 뉴로필린 (NRP-1, NRP-2), 오베스타틴, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF (PDFF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D), TGF 베타 수용체 (엔도글린, TGF-베타 1 수용체, TGF-베타 2 수용체, TGF-베타 3 수용체), 트롬보포이에틴 (THPO) (거핵구 성장 및 발달 인자(MGDF)), 종양 증식 인자 (TGF (TGF-a, TGF-베타(TGF베타1, TGF베타2 및 TGF베타3))), VEGF (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F 및 PIGF), 네시리타이드, 트립신, 부신피질자극 호르몬 (ACTH), 심방 나트륨이뇨펩타이드 (ANP), 콜레시스토키닌, 가스트린, 렙틴, 옥시토신, 소마토스타틴, 바소프레신 (항이뇨 호르몬), 칼시토닌, 엑세나타이드, 성장 호르몬 (GH), 소마토트로핀, 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF-1), 메카서민 린파베이트, IGF-1 유사체, 메카서민, IGF-1 유사체, 페그비소만트, 프람린타이드, 테리파라타이드 (사람 부갑상선 호르몬 잔기 1~34), 베카플러민, 디보터민-알파 (골 형성 단백질 2), 히스트렐린 아세테이트 (생식선 자극 호르몬 방출 호르몬; GnRH), 옥트레오타이드 및 팔리퍼민(각질 세포 성장 인자; KGF)를 포함할 수 있다.
혈액 질환, 순환계 질환, 호흡계 질환, 암 또는 종양 질환, 감염성 질환 또는 면역 결핍증의 치료에 사용되는 펩타이드 또는 단백질은, 알테플라제(조직 플라스미노겐 활성 인자; tPA), 아니스트레플라제, 항트롬빈 Ⅲ(AT-Ⅲ), 비발리루딘, 다르베포에틴-알파, 드로트레코긴-알파 (활성화된 단백질 C), 에리스로포이에틴, 에포에틴-알파, 에리스로포에틴, 에르스로포이에틴, 인자 Ⅶa, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 레피루딘, 단백질 C 농축물, 레테플라제 (tPA의 결실 돌연 변이 단백질), 스트렙토키나제, 테넥테플라제, 유로키나제, 안지오스타틴, 항CD22 면역독소, 데니루킨 디프티톡스, 이뮤노시아닌, MPS (메탈로판스티뮬린), 아플리버셉트, 엔도스타틴, 콜라게나제, 사람 데옥시리보뉴클레아제 I, 도르나제, 히알루로니다제, 파페인, L-아스파라기나제, Peg-아스파라기나제, 라스부리카제, 사람 융모성 생식선 자극 호르몬 (HCG), 사람 여포 자극 호르몬 (FSH), 루트로핀-알파, 프로락틴, 알파-1-프로티나제 억제 인자, 락타제, 췌장 효소 (리파제, 아밀라제, 프로테아제), 아데노신 디아미나제 (소 페가데마제, PEG-ADA), 아바타셉트, 알레파셉트, 아나킨라, 에타너셉트, 인터루킨-1(IL-1) 수용체 길항제, 아나킨라, 티뮬린, TNF-알파 길항제, 엔푸비르타이드 및 티모신 α1를 포함할 수 있다.
그 외에도, 사람 보조제 단백질, 특히 패턴 인지 수용체인 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11; NOD1, NOD2, NOD3, NOD4, NOD5, NALP1, NALP2, NALP3, NALP4, NALP5, NALP6, NALP6, NALP7, NALP7, NALP8, NALP9, NALP10, NALP11, NALP12, NALP13, NALP14, IIPAF, NAIP, CIITA, RIG-I, MDA5 및 LGP2, 예를 들어 Trif 및 Cardif를 포함하는 어댑터 단백질을 포함하는 TLR 신호 전달의 신호 전달 물질; 소형-GTPase 신호 전달의 구성 성분 (RhoA, Ras, Rac1, Cdc42, Rab 등), PIP 신호 전달의 구성 성분 (PI3K, Src-키나제 등), MyD88-의존적 신호 전달의 구성 성분 (MyD88, IRAK1, IRAK2, IRAK4, TIRAP, TRAF6 등), MyD88-독립적 신호 전달의 구성 성분 (TICAM1, TICAM2, TRAF6, TBK1, IRF3, TAK1, IRAK1 등); 예를 들어 Akt, MEKK1, MKK1, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, ERK1, ERK2, GSK3, PKC 키나제, PKD 키나제, GSK3 키나제, JNK, p38MAPK, TAK1, IKK 및 TAK1를 포함하는 활성화된 키나제; 예를 들어 NF-κB, c-Fos, c-Jun, c-Myc, CREB, AP-1, Elk-1, ATF2, IRF-3, IRF-7, HSP10, HSP60, HSP65, HSP70, HSP75 및 HSP90와 같은 열 충격 단백질, gp96, 피브리노겐, 피브로넥틴의 Typ Ⅲ 반복 여분 도메인 A를 포함하는 활성화된 전사 인자; 또는 C1q, MBL, C1r, C1s, C2b, Bb, D, MASP-1, MASP-2, C4b, C3b, C5a, C3a, C4a, C5b, C6, C7, C8, C9, CR1, CR2, CR3, CR4, C1qR, C1INH, C4bp, MCP, DAF, H, I, P 및 CD59를 포함하는 보체계의 구성 성분, 또는 예를 들어 베타-데펜신, 세포 표면 단백질을 포함하는 유도성 표적 유전자; 또는 trif, flt-3 리간드, Gp96 또는 피브로넥틴, IL-1 알파, IL-1 베타, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, IL-23, TNF알파, IFN알파, IFN베타, IFN감마, GM-CSF, G-CSF, M-CSF를 포함하는, 선청성 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 시토킨을 포함하는 사람 보조제 단백질; IL-8, IP-10, MCP-1, MIP-1알파, RANTES, 에오탁신, CCL21을 포함하는 케모카인; IL-1, IL-6, IL-8, IL-12 및 TNF-알파를 포함하는, 대식 세포로부터 방출되는 시토킨; 그리고 IL-1R1 및 IL-1알파; 박테리아 (보조제) 단백질, 특히 Hsp60, Hsp70, Hsp90, Hsp100을 포함하는 박테리아 열 충격 단백질 또는 샤페론; 그람-음성 박테리아 유래 OmpA (외막 단백질); OmpF를 포함하는 박테리아 포린; 보르데텔라 페르투시스 유래 백일해 독소 (PT), 보르데텔라 페르투시스 유래 백일해균 아데닐레이트 사이클라제 독소 CyaA 및 CyaC, 백일해 독소 유래 PT-9K/129G 돌연 변이체, 보르데텔라 페르투시스 유래 백일해균 아데닐레이트 사이클라제 독소 CyaA 및 CyaC, 파상풍 독소, 콜레라 독소 (CT), 콜레라 독소 B 서브유닛, 콜레라 독소 유래 CTK63 돌연 변이체, CT 유래 CTE112K 돌연 변이체, 에스케리치아 콜라이 열 불안정 장내 독소(LT), 열 불안정 장내 독소 유래 B 서브유닛 (LTB), LTK63와 LTR72을 포함하는, 독성이 감소된 에스케리치아 콜라이 열 불안정 장내 독소 돌연 변이체를 포함하는, 박테리아 독소; 페놀 가용성 모듈린; 헬리코박터 파일로리 유래 호중구 활성화 단백질 (HP-NAP); 계면활성 단백질 D; 보렐리아 버그도르페리 유래 외표면 단백질 A 지단백, 마이코박테리움 투버큘로시스 유래 Ag38 (38kDa 항원); 박테리아 섬모 유래 단백질; 비브리오 콜레라에 장내 독소 CT, 그람 음성 박테리아 선모 유래 필린, 그리고 계면활성 단백질 A 및 박테리아 플라젤린, 원생 동물 (보조제) 단백질, 특히 트리파노소마 크루지 유래 Tc52, 트리파노소마 곤디 유래 PFTG, 원생 동물 열충격 단백질, 레이슈마니아 종 유래 LeIF, 톡소플라즈마 곤디 유래 프로필링 유사 단백질, 바이러스 (보조제) 단백질, 특히 호흡기 세포 융합 바이러스 융합 당단백질 (F-단백질), MMT 바이러스 유래 외피 단백질, 마우스 백혈병 바이러스 단백질, 야생형 홍역 바이러스의 헤마글루티닌 단백질, 진균 (보조제) 단백질, 특히 진균 면역 조절 단백질(FIP; LZ-8); 및 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), OspA를 포함하는, 보조제 또는 면역 자극 단백질로부터 선택되는 치료 단백질; 호르몬 대체 요법에 사용되는 치료 단백질, 특히 에스트로겐, 프로게스테론 또는 프로게스틴, 그리고 테스토스테론; 체세포를 만능 줄기 세포 또는 전능 줄기 세포로 역분화하는데 사용되는 치료 단백질, 특히 Oct-3/4, Sox 유전자 군 (Sox1, Sox2, Sox3 및 Sox15), Klf 군 (Klf1, Klf2, Klf4 및 Klf5), Myc 군 (c-myc, L-myc 및 N-myc), Nanog 및 LIN28; 그리고 암 또는 종양 질환의 치료에 사용되는 항체들로부터 선택되는 치료 항체, 특히 131I-토시투모맵, 3F8, 8H9, 아바고보맵, 아데카투무맵, 아푸투주맵, 알라시주맵 피골, 알렘투주맵, 아마툭시맵, AME-133v, AMG 102, 아나투모맵 마페나톡스, 아폴리주맵, 바비툭시맵, 벡투모맵, 벨리무맵, 베바시주맵, 비바투주맵 메르탄신, 블리나투모맵, 브렌툭시맵 베도틴, 칸투주맵, 칸투주맵 메르탄신, 칸투주맵 라브탄신, 카프로맵 펜데타이드, 칼루맵, 카투막소맵, 세툭시맵, 시타투주맵 보가톡스, 식수투무맵, 클리바투주맵 테트락세탄, CNTO 328, CNTO 95, 코나투무맵, 다세투주맵, 달로투주맵, 데노수맵, 데투모맵, 드로지투맵, 에크로멕시맵, 에드레콜로맵, 엘로투주맵, 엘실리모맵, 에나바투주맵, 엔시툭시맵, 에프라투주맵, 에르투막소맵, 에르투막소맵, 에타라시주맵, 팔레투주맵, FBTA05, 피클라투주맵, 피기투무맵, 플란보투맵, 갈릭시맵, 갈릭시맵, 가니투맵, GC1008, 겜투주맵, 겜투주맵 오조가미신, 기렌툭시맵, 글렘바투무맵 베도틴, GS6624, HuC242-DM4, HuHMFG1, HuN901-DM1, 이브리투모맵, 이크루쿠맵, ID09C3, 인다툭시맵 라브탄신, 이노투주맵 오조가미신, 인테투무맵, 이필리무맵, 이라투무맵, 라베투주맵, 렉사투무맵, 린투주맵, 로보투주맵 메르탄신, 루카투무맵, 루밀릭시맵, 마파투무맵, 마투주맵, MDX-060, MEDI 522, 미투모맵, 모가물리주맵, MORab-003, MORab-009, 목세투모맵 파수도톡스, MT103, 나콜로맵 타페나톡스, 납투모맵 에스타페나톡스, 나르나투맵, 네시투무맵, 니모투주맵, 니모투주맵, 올라라투맵, 오나르투주맵, 오포르투주맵 모나톡스, 오레고보맵, 오레고보맵, PAM4, 파니투무맵, 파트리투맵, 펨투모맵, 페르투주맵, 프리투무맵, 라코투모맵, 라드레투맵, 라무시루맵, 릴로투무맵, 리툭시맵, 로바투무맵, 사말리주맵, SGN-30, SGN-40, 시브로투주맵, 실툭시맵, 타발루맵, 타카투주맵 테트락세탄, 타플리투모맵 팝톡스, 테나투모맵, 테프로투무맵, TGN1412, 티실리무맵(= 트레멜리무맵), 티가투주맵, TNX-650, 토시투모맵, 트라스투주맵, TRBS07, 트레멜리무맵, TRU-016, TRU-016, 투코투주맵 셀모루킨, 유블리툭시맵, 유렐루맵, 벨투주맵, 벨투주맵 (IMMU-106), 볼로식시맵, 보투무맵, WX-G250, 잘루투무맵 및 자놀리무맵; 면역 질환의 치료에 사용되는 항체, 특히 에팔리주맵, 에프라투주맵, 에트롤리주맵, 폰톨리주맵, 익세키주맵, 메폴리주맵, 밀라투주맵, 풀링된 면역 글로불린, 프릴릭시맵, 리툭시맵, 론탈리주맵, 루플리주맵, 사릴루맵, 베돌리주맵, 비실리주맵, 레슬리주맵, 아달리무맵, 아셀리주맵, 아티누맵, 아틀리주맵, 버틸리무맵, 베실레소맵, BMS-945429, 브리아키누맵, 브로달루맵, 카나키누맵, 카나키누맵, 서톨리주맵 피골, 얼리주맵, 페자키누맵, 골리무맵, 고밀릭시맵, 인플릭시맵, 마브릴리무맵, 나탈리주맵, 오크렐리주맵, 오듈리모맵, 오파투무맵, 오조랄리주맵, 펙셀리주맵, 로벨리주맵, SBI-087, SBI-087, 세큐키누맵, 시루쿠맵, 탈리주맵, 토실리주맵, 토랄리주맵, TRU-015, TRU-016, 유스테키누맵, 유스테키누맵, 베팔리모맵, 졸리모맵 아리톡스, 시팔리무맵, 루밀릭시맵 등의 면역 글루불린; 감염성 질환의 치료에 사용되는 항체, 특히 아펠리모맵, CR6261, 에도바코맵, 에펀구맵, 엑스비비루맵, 펠비주맵, 포라비루맵, 이발리주맵, 리비비루맵, 모타비주맵, 네바쿠맵, 투비루맵, 얼톡사주맵, 바비툭시맵, 파기박시맵, 팔리비주맵, 파노바쿠맵, PRO 140, 라피비루맵, 락시바쿠맵, 레가비루맵, 세비루맵, 수비주맵 및 테피바주맵; 혈액 질환의 치료에 사용되는 항체, 특히 앱식시맵, 아토롤리무맵, 에쿨리주맵, 메폴리주맵 및 밀라투주맵; 면역 조절에 사용되는 항체, 특히 항흉선세포 글로불린, 바실릭시맵, 세델리주맵, 다클리주맵, 가빌리모맵, 이놀리모맵, 뮤로모냅-CD3, 뮤로모냅-CD3, 오듈리모맵 및 시플리주맵; 당뇨병의 치료에 사용되는 항체, 특히 게보키주맵, 오텔릭시주맵 및 테플리주맵; 알츠하이머병의 치료에 사용되는 항체, 특히 바피뉴주맵, 크레네주맵, 간테네루맵, 포네주맵, R1450 및 솔라네주맵; 천식의 치료에 사용되는 항체, 특히 벤랄리주맵, 에노키주맵, 켈릭시맵, 레브리키주맵, 오말리주맵, 옥셀루맵, 파스콜리주맵 및 트랄로키누맵; 그리고 다양한 질환의 치료에 사용되는 항체, 특히 블로소주맵, 카로Rx, 프레솔리무맵, 풀라누맵, 로모소주맵, 스타물루맵, 타네주맵 및 라니비주맵으로부터 선택되는 치료 단백질, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함할 수 있다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 코딩 영역 (CR)은 후술하는 약학 조성물 중에서 약학적으로 활성인 물질에 대응되는, 즉 약학적으로 활성인 물질 또는 그 일부를 암호화하는 핵산의 열린해독틀을 포함할 수 있다. 예를 들어, 약학적으로 활성인 물질이 항원 또는 항체와 같은 펩타이드 또는 단백질로 이루어지는 경우, 코딩 영역 (CR)은 이들 항원 또는 항체, 또는 이들의 단편을 암호화하는 열린해독틀로 이루어질 수 있다.
코딩 영역 (CR)을 구성하는 열린해독틀 (ORF)의 길이는 제한이 없으며, 열린해독틀 (ORF)의 길이에 따른 발현 효율은 본 발명에 따른 핵산 분자, 이를 이용한 재조합 발현 벡터 및 치료 또는 예방을 위한 핵산 백신 등의 개발에서 큰 고려 대상이 아니다. Codon usage는 보통 다양한 종에서 단백질/펩타이드 발현에 영향을 미칠 수 있으나, 인간의 codon usage bias는 보통 단백질/펩타이드 발현에 큰 영향을 미치지 않는다고 알려져 있으므로, 인간을 대상으로 하는 핵산 백신이나 유전자 치료제를 개발할 때 고려 대상이 아니다. 다만, 시작 코돈은 Kozak 서열을 가지고 있어야 하며, 종결 코돈 근처의 염기서열도 최적화할 필요가 있다. 필요한 경우, 코딩 영역 (CR)에서 발현하고자 하는 유전자 또는 이의 전사체인 mRNA의 코돈 서열 중 세 번째 부분을 GC로 바꾸어 아미노산의 변화 없이 타켓 유전자의 GC%를 증가시켜 mRNA의 안정성을 높일수도 있다.
핵산 분자에 코딩 영역 (CR)을 삽입하기 위하여 핵산 분자는 하나 이상의 클로닝 사이트, 바람직하게는 멀티플 클로닝 사이트 (Multiple Cloning Site; MCS)를 포함할 수 있다. 하나 이상의 클로닝 사이트는 하나 이상의 제한효소 (restriction endonucelase) 인식 서열 (recognition site) 및/또는 제한효소에 의해 절단되는 서열을 포함할 수 있다. 제한효소는 박테리아나 고세균 등에서 발견되는 자연적인 제한효소는 물론이고, 인위적으로 제조된 제한효소 (예를 들어, Zinc finger nuclease이나 TAL effector의 DNA 결합 부위에 근거한 제한효소 또는 PNA-기반의 PNAznymes 등)를 포함할 수 있다.
예를 들어, 자연적으로 일어나는 제한효소는 1) Type Ⅰ 제한효소 (인식 부위와 떨어지는 부위를 절단하고, ATP, S-adenoxyl-L-methionine 및 마그네슘 이온을 필요로 함), 2) Type Ⅱ 제한효소 (인식부위 내부 또는 인식부위에서 약간 떨어진 특정 부위를 절단하며, 대부분 마그네슘 이온을 필요로 함), 3) Type Ⅲ 제한효소 (인식 부위로에서 약간 떨어진 부위를 절단하며, ATP는 필요하지만, ATP의 가수분해는 필요 없음), 4) Type Ⅳ 제한효소 (메틸화, 하이드록시메틸화 또는 글루코실-하이드록시메틸화 등 변형된 부위를 표적으로 함), 5) Type Ⅴ 제한효소 (CRISPRsdml cas9-gRNA complex) 등으로 구분될 수 있다.
예를 들어, 다음과 같은 제한효소 인식 부위 및/또는 제한효소 절단 부위 (제한효소)를 사용할 수 있다. 5'-ATCGAT-3'(AngⅠ), 5'-AGGCCT-3'(AatⅠ), 5'-TGATCA-3'(AbaⅠ), 5'-GGATCC-3'(BamHⅠ), 5'-GCAGC(N)8-3'(BbvⅠ), 5'-(N)10CGA(N)6TGC(N)12-3'(BcgⅠ), 5'-(N)8GAG(N)5CTC(N)13-3'(BplⅠ), 5'-GTCTC(N)-3'(BsmAⅠ; Alw26Ⅰ), 5'-ACTGGN-3'(BsrⅠ), 5'-ATCGAT-3'(ClaⅠ), 5'-CTCTTCN-3'(EarⅠ), 5'-CTGAAG(N)16-3'(Eco57Ⅰ), 5'-GAATTC-3'(EcoRⅠ), 5'-CCWGG-3'(EcoRⅡ; W는 A 또는 T), 5'-GATATC-3'(EcoRⅤ), 5'-GGATG(N)9-3'(FokⅠ), 5'-GGCC-3'(HaeⅢ), 5'-AAGCTT-3'(HindⅢ), 5'-CCGG-3'(HpaⅢ), 5'-GGTGA(N)8-3'(HphⅠ), 5'-GGTACC-3'(KpnⅠ), 5'-GATC-3'(MboⅠ), 5'-ACGCGT-3'(MluⅠ), 5'-GCCGGC-3'(NaeⅠ), 5'-GATATG-3'(NdeⅡ), 5'-GCCGGC-3'(NgoMⅣ), 5'-CATG-3'(NlaⅢ), 5'-GCGGCCGC-3'(NotⅠ), 5'-TTAATTAA-3'(PacⅠ), 5'-CTGCAG-3'(PstⅠ), 5'-GAGCTC-3'(SacⅠ), 5'-CCGCGG-3'(SacⅡ), 5'-GTCGAC-3'(SalⅠ), 5'-GCATC(N)5-3'(SfaNⅠ), 5'-CCCGGG-3'(SmaⅠ), 5'-TCGA-3'(TaqⅠ), 5'-TCTAGA-3'(XbaⅠ), 5'-CTCGAG-3'(XhoⅠ) 및 이들의 조합. 하나의 예시적인 실시형태에서, 클로닝 사이트는 서열식별번호:27 내지 서열식별번호:29 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되지 않는다.
한편, 발현 조절 서열 (ECS)로서 IRES 염기 서열을 포함하는 5'-UTR이 사용되는 경우, 본 발명의 핵산 분자는 선택적으로 코딩 영역(CR)을 구성하는 열린해독틀 (ORF)의 발현 효율을 향상시키기 위하여 3'-UTR을 더욱 포함할 수 있다. 이때, 코딩 영역 (CR)은 5'-UTR과 3'-UTR 사이에 위치할 수 있다. 3'-UTR은 5'-UTR과 함께 코딩 영역 (CR)을 형성하는 유전자 또는 이의 전사체의 번역 효율을 향상시키고, 전사체인 mRNA가 세포 내에서 파괴되지 않고 안정적으로 유지되는데 중요한 역할을 한다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 3'-UTR로서 전술한 IRES 염기 서열을 가지는 바이러스성 5'-UTR과 같은 발현 조절 서열 (ECS)과 동일한 바이러스에서 유래한 3'-UTR을 사용할 수 있다. 이때, 3'-UTR은 전술한 IRES를 가지는 5'-UTR과 동일하거나 상이한 소스로부터 유래한 것일 수 있다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 바이러스성 3'-UTR은 피코나바이러스과 (Picornaviridae) 바이러스, 토가바이러스과 (Togaviridae) 바이러스, 디시스트로
바이러스과 (Dicistroviridae) 바이러스, 플라비바이러스과 (Flaviridae) 바이러스, 레트로바이러스과 (Retroviridae) 바이러스 및/또는 헤르페스바이러스과(Herpesviridae) 바이러스에서 유래한 것일 수 있다.
일례로, 피코나바이러스과 바이러스 유래의 3'-UTR은 엔테로바이러스속 바이러스 (예: PV, RV, CVB3와 같은 콕사키바이러스 및/또는 EV71), 카디오바이러스속 바이러스 (예: EMCV 및/또는 TMEV), 아프토바이러스속 바이러스 (예: FMDV), 헤파토바이러스속 바이러스 (예: HAV) 및/또는 테스코바이러스속 바이러스 (예: PTV-1과 같은 PTV) 등의 3'-UTR을 포함하지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 토가바이러스과 바이러스 유래의 3'-UTR은 알파바이러스속 바이러스 (예: SV 바이러스)의 바이러스성 3'-UTR을 포함하고, 디스스트로바이러스과 바이러스의 유래의 3-UTR은 크리파바이러스속 바이러스 (예: PSIV, CrPV, 트리아토마바이러스 (Triatoma virus) 및/또는 RXPD)의 바이러스성 3'-UTR을 포함하지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 선택적인 실시형태에 따라, 플라비바이러스과 바이러스 유래의 3'-UTR은 헤파시바이러스속 바이러스 (예: HCV), 플라비바이러스속 바이러스 (예: JEV) 및/또는 페스티바이러스속 바이러스 (예: CSFV 및/또는 BVDV) 등의 3'-UTR을 포함할 수 있다. 다른 예시적인 실시형태에서, 레트로바이러스과 바이러스 유래의 3'-UTR은 감마레트로바이러스속 바이러스 (예: FMLV 및/또는 MMLV) 및/또는 알파레트로바이러스속 바이러스(예: RSV) 등의 3'-UTR을 포함할 수 있다. 또한, 헤르페스바이러스과 바이러스 유래의 3'-UTR 은 마디바이러스속 바이러스 (예: MDV)의 3'-UTR을 포함할 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
일례로, 바이러스성 3'-UTR은 CrPV에서 유래한 3'-UTR (서열식별번호: 4), EMCV에서 유래한 3'-UTR (서열식별번호: 5) 및/또는 CVB3에서 유래한 3'-UTR (서열식별번호: 6)로 이루어질 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되지 않는다.
한편, 핵산 분자는 발현 조절 서열 (ECS)에 인접하여 폴리뉴클레오티드의 전사를 촉진하는 전사 조절 서열 (Transcritpion control sequence, TCS)을 가질 수 있다. 일례로, 전사 조절 서열 (TCS)은 발현 조절 서열 (ECS)의 5'쪽에 위치할 수 있다. 이러한 전사 조절 서열 (TCS)은 특별히 제한되는 것은 아니며, 설명의 중복을 피하기 위해서 후술하는 재조합 발현 벡터 부분에서 상세히 설명한다.
그 외에도 핵산 분자는 전술한 발현 조절 서열 (ECS), 코딩 영역 (CR), 3'-UTR 및 전사 조절 서열 (TCS) 이외에도 코딩 영역 (CR)을 구성하는 유전자 또는 이의 전사체 서열로 이루어진 열린해독틀 (ORF)의 발현을 유도할 수 있는 핵산 서열이 삽입될 수 있다. 하나의 예시적인 실시형태에서, IRES 염기 서열을 가지는 발현 조절 서열 (ECS, 예: IRES 염기 서열을 가지는 5'-UTR)과 코딩 영역 (CR)의 개시 코돈 사이에 Kozak 서열이 삽입될 수 있다. 필요한 경우에, 발현 조절 서열 (ECS)의 3'쪽에 downstream hairpin structur (DLP)가 위치할 수 있다. 일례로, 발현 조절 서열 (ECS)로서 SV 유래의 5'-UTR을 적용할 때, SV 유래의 DLP 핵산 서열이 발현 조절 서열 (ECS)과 코딩 영역 (CR) 사이에 삽입될 수 있다.
다른 선택적인 실시형태에서, 발현 조절 서열 (ECS)의 3'쪽에 개시 코돈으로 작용할 수 있는 염기 서열 (예: CCTGCT)이 삽입되고/삽입되거나, 발현 조절 서열 (ECS)의 3'쪽에 코딩 영역 (CR)을 구성하는 열린해독틀 (ORF)의 발현 효율을 향상시킬 수 있는 인식 서열 (예: ATGGCAGCTCAA) 등이 삽입될 수 있다.
아울러, 코딩 영역 (CR)의 3'쪽, 만약 3'-UTR이 사용되는 경우라면 3'-UTR의 3'쪽에 전사된 핵산 분자를 안정화시키면서, 코딩 영역 (CR)에 존재하는 유전자 또는 이의 전사체 서열로 이루어지는 열린해독틀 (ORF)의 번역 효율을 더욱 향상시킬 수 있는 폴리아데닐레이션 신호 서열 및/또는 폴리아데노신 서열 (PA)이 더욱 삽입될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵산 분자가 RNA 형태의 전사체 서열로 이루어지는 경우, 폴리아데노신 서열 (PA)은 대략 25개 내지 대략 400개, 바람직하게는 30개 내지 400개, 더욱 바람직하게는 50 내지 250개, 가장 바람직하게는 60 내지 250개의 아데노신 뉴클레오티드로 이루어진 핵산 서열일 수 있다.
다른 예시적인 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자가 DNA 형태의 뉴클레오티드로 이루어지는 경우, 폴리아데닐레이션 신호 서열이 코딩 영역 (CR)의 3'쪽에 위치할 수 있다. 폴리아데닐레이션 신호 서열은 5'-NNUANA-3' 모티프의 공통 서열 (N은 아데닌, 사이토신, 티민, 구아닌, 우라실 및 이들의 변이체에서 선택될 수 있는 임의의 염기 또는 뉴클레오티드) 가질 수 있다. 예를 들어, 폴리아데닐레이션 신호 서열은 5'- AAUAAA-3' 또는 5'-AUUAAA-3'와 같은 공통 서열을 가질 수 있다. 일례로, 폴리아데닐레이션 신호 서열은 SV40, 인간 성장호르몬 (human growth factor, hGH), 소 성장 호르몬 (Bovine Growth hormone, BGH) 또는 토끼 베타-글로빈 (rabbit beta-globine, rbGlob) 등에서 유래한 것을 사용할 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되지 않는다.
한편, 도 1에서는 하나의 발현 조절 서열과, 하나의 코딩 영역을 포함하는 핵산 분자를 도시하였다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 IRES 염기 서열을 가지는 다수의 발현 조절 서열과, 어느 하나의 발현 조절 서열에 의하여 발현될 수 있는 단백질 및/또는 펩타이드를 암호화하는 다수의 코딩 영역을 포함할 수 있다. 도 2는 다수의 발현 조절 서열 및 다수의 코딩 영역을 포함하는 핵산 분자를 개략적으로 나타낸다.
도 2에 도시한 바와 같이, 본 발명의 다른 실시형태에 따른 핵산 분자는 2개의 발현 카세트 (expresson cassette, EC1, EC2) 또는 발현 유닛을 포함하고 있다. 제 1 발현 카세트 (EC1)는 바이러스성 IRES 염기 서열을 가지는 제 1 발현 조절 서열 (ECS1; 예: 5'-UTR 1)과, 제 1 발현 조절 서열 (ECS1)과 작동 가능하게 연결되며 제 1 표적 서열 (TS1)로서 면역원성 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 제 1 코딩 영역 (CR1)을 포함한다. 제 2 발현 카세트 (EC2)는 바이러스성 염기 서열을 가지는 제 2 발현 조절 서열 (ECS2; 예: 5'-UTR2)과, 제 2 발현 조절 서열 (ECS2)과 작동 가능하게 연결되며 제 2 표적 서열 (TS2)로서 면역원성 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 제 2 코딩 영역 (CR2)을 포함한다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 제 2 발현 조절 서열 (ECS2)은 제 1 발현 조절 서열 (ECS1)의 3'쪽에 위치할 수 있으며, 제 1 코딩 영역 (CR1)은 제 1 발현 조절 서열 (ECS1)과 제 2 발현 조절 서열 (ECS2) 사이에 위치하고, 제 2 코딩 영역 (CR2)은 제 2 발현 조절 서열 (ECS2)의 3'쪽에 위치할 수 있다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 상기 제 1 발현 조절 서열 (ECS1) 및 제 2 발현 조절 서열 (ECS2)은 각각 전술한 바이러스성 IRES 염기 서열 또는 바이러스렁 IRES 염기 서열을 가지는 5'-UTR 일 수 있다. 이때, 제 1 발현 발현 조절 서열 (ECS1)과 제 2 발현 조절 서열 (ECS2)은 동일한 소스로부터 유래할 수도 있고, 상이한 소스로부터 유래할 수도 있다.
선택적인 실시형태에서, 핵산 분자는 다수의 발현 조절 서열 (ECS1, ECS2) 중 적어도 어느 하나의 발현 조절 서열에 인접하여 다수의 아데노신 또는 다수의 아데노신으로 전사될 수 있는 뉴클레오티드 (MA)가 삽입될 수 있다. 예를 들어, 다수의 발현 조절 서열 (ECS1, ECS2) 중에서 적어도 어느 하나의 발현 조절 서열의 5'쪽에 다수의 아데노신 또는 다수의 아데노신으로 전사될 수 있는 뉴클레오티드 (MA)가 위치할 수 있다. 일례로, 도 2에서는 전사 조절 서열 (TCS)에 근접하게 위치하는 제 1 발현 조절 서열 (ECS1)의 5'쪽과, 제 2 발현 조절 서열 (ECS2)의 5'쪽에 다수의 아데노신 (또는 다수의 아데노신으로 전사될 수 있는 뉴클레오티드, MA)가 모두 삽입된 것을 도시하고 있다. 하지만, 코딩 영역 (CR1, CR2)을 구성하는 각각의 열린해독틀 (ORF)의 발현 효율을 향상시킬 수 있는 다수의 아데노신 (또는 다수의 아데노신으로 전사될 수 있는 뉴클레오티드)는 제 1 발현 조절 서열 (ECS1) 및 제 2 발현 조절 서열 (ECS2) 중에서 어느 하나에 인접하여 (즉, 이들 발현 조절 서열 중에서 어느 하나의 발현 조절 서열의 5'쪽에), 삽입될 수도 있다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 제 1 발현 조절 서열 (ECS1) 및 제 2 발현 조절 서열 (ECS2)은 바이러스에서 유래한 IRES 염기 서열을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 제 1 발현 조절 서열 (ECS1) 및/또는 제 2 발현 조절 서열 (ECS2)은 피코나바이러스과 (Picornaviridae), 토가바이러스과 (Togaviridae), 디시스트로
바이러스과 (Dicistroviridae), 플라비바이러스과 (Flaviridae), 레트로바이러스과 (Retroviridae) 및/또는 헤르페스바이러스과 (Herpesviridae)의 바이러스에서 유래한 IRES 염기 서열을 포함할 수 있다. IRES를 가지는 바이러스성 발현 조절 서열의 종류 및 형태에 대해서는 도 1을 참조하면서 설명한 것과 중복되므로 상세한 설명은 생략한다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 바이러스성 IRES 염기 서열을 가지는 제 1 발현 조절 서열 (ECS1) 및/또는 제 2 발현 조절 서열 (ECS2)은 피코나바이러스과 (Picornaviridae) 바이러스 및/또는 디시스트로바이러스과 (Dicistroviridae) 바이러스에서 유래한 IRES 염기 서열을 가질 수 있다.
일례로, 피코나바이러스과 바이러스 유래의 IRES 염기 서열을 가지는 제 1 발현 조절 서열 (ECS1) 및/또는 제 2 발현 조절 서열 (ECS2) 중에서 적어도 하나의 발현 조절 서열은 엔테로바이러스속 바이러스, 카디오바이러스속 바이러스 및/또는 아프토바이러스속 바이러스 유래의 IRES 염기 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 제 1 발현 조절 서열 (ECS1) 및/또는 제 2 발현 조절 서열 (ECS2)은 CVB3와 같은 콕사키바이러스 등의 엔테로바이러스속 바이러스 및/또는 EMCV와 같은 카디오바이러스속 바이러스 유래의 IRES 염기 서열을 가질 수 있다.
선택적으로, 디시스트로바이러스과 바이러스 유래의 IRES 염기 서열을 가지는 제 1 발현 조절 서열 (ECS1) 및/또는 제 2 발현 조절 서열 (ECS2)은 PSIV 및/또는 CrPV 등의 크리파바이러스속 바이러스 및/또는 EMCV와 같은 카디오바이러스속 바이러스 유래의 IRES 염기 서열을 가질 수 있다.
한편, 예시적인 실시형태에서, 코딩 영역은 상기 제 1 발현 조절 서열 (ECS1)과 상기 제 2 발현 조절 서열 (ECS2) 사이에 위치하는 제 1 코딩 영역 (CR1)과, 제 2 발현 조절 서열 (ECS2)의 3'쪽에 위치하는 제 2 코딩 영역 (CR2)을 포함할 수 있다. 일례로, 제 1 코딩 영역 (CR1)과 제 2 코딩 영역 (CR2)는 각각 면역원성 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 유전자 또는 이의 전사체인 열린해독틀 (ORF)로 이루어질 수 있다.
제 1 코딩 영역 (CR1) 및/또는 제 2 코딩 영역 (CR2)은 도 1의 코딩 영역 (CR)에서 설명한 것과 같은 항원 및/또는 질병 치료와 관련된 펩타이드 또는 단백질 등을 각각 암호화하는 유전자 또는 이의 전사체인 열린해독틀 (ORF)로 이루어질 수 있다. 하나의 예시적인 실시형태에 따르면, 제 1 코딩 영역 (CR1)은 제 1 발현 조절 서열 (ECS1; 예: 5'-UTR 1)과 작동 가능하게 연결되고, 제 2 코딩 영역 (CR2)은 제 2 발현 조절 서열 (ECS2; 예: 5'-UTR 2)과 작동 가능하게 연결될 수 있다.
제 1 코딩 영역 (CR1)을 구성하는 유전자 또는 이의 전사체인 열린해독틀인 제 1 표적 서열 (TS1)과, 제 2 코딩 영역 (CR2)을 구성하는 유전자 또는 이의 전사체인 열린해독틀인 제 2 표적 서열 (TS2)은 동일하거나 상이한 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 열린해독틀로 이루어질 수 있다. 이 경우, 하나의 핵산 분자에서 상이한 면역원성 펩타이드 또는 단백질이 발현될 수 있다 있다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 제 1 코딩 영역 (CR1)과 제 2 코딩 영역 (CR2)이 각각 상이한 항원, 치료용 펩타이드 또는 이들의 단편 단편 등을 암호화하는 열린해독틀로 이루어진 경우, 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 재조합 발현 벡터를 사용하여 상이한 항원이나 치료용 펩타이드가 발현되어, 암, 감염성 질병 등을 예방 또는 치료하기 위한 목적에 활용될 수 있다.
도 1에서 설명한 것과 유사하게, 도 2에 도시된 다수의 발현 조절 서열 (ECS1, ECS2)과 다수의 코딩 영역 (CR1, CR2)을 포함하는 핵산 분자는 발현 조절 서열 (ECS1, ECS2)과 작동 가능하게 연결된 코딩 영역 (CR1, CR2)의 표적 서열 (TS1, TS2)의 발현을 향상시킬 수 있는 핵산 서열을 더욱 포함할 수 있다. 일례로, 제 1 발현 조절 서열 (ECS1) 및/또는 제 2 발현 조절 서열 (ECS2)이 각각 IRES 염기 서열을 가지는 바이러스성 5'-UTR인 경우, 핵산 분자는 3'-UTR을 더욱 포함할 수 있다. 이때, 3'-UTR은 바람직하게는 제 2 코딩 영역 (CR2)의 3'쪽에 위치할 수 있다. 3'-UTR은 특별히 한정되지는 않지만, 도 1을 참조하면서 설명한 바 있는 바이러스성 3'-UTR을 사용할 수 있다.
예를 들어, 3'-UTR은 제 1 발현 조절 서열 (ECS1)을 구성하는 5'-UTR 1 또는 제 2 발현 조절 서열 (ECS2)을 구성하는 5'-UTR 2에서 유래한 것을 사용할 수 있다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 3'-UTR은 5'-UTR1과 동일한 소스에서 유래한 것을 사용할 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되지 않는다.
그 외에도, 도 2에 도시된 핵산 분자는 발현 조절 서열 (ECS1, ECS2)에 인접하게 위치하는 전사 조절 서열 (TCS), 각각의 발현 조절 서열 (ECS1, ECS2)에 각각 작동 가능하게 연결된 코딩 영역 사이 (CR1, CR2)의 Kozak 서열을 포함할 수 있다. 아울러, 필요한 경우 각각의 발현 조절 서열 (ECS1, ECS2)의 3'쪽에 각각 DLP 핵산 서열, 개시 코돈으로 작용할 수 있는 서열 및/또는 발현 효율을 향상시킬 수 있는 인식 서열 등이 삽입될 수 있다. 또한, 하나의 예시적인 실시형태에서, 제 2 코딩 영역 (CR2)의 3'쪽, 일례로 3'-UTR이 삽입된다면 3'-UTR의 3'쪽에 폴리 아데노신 서열 또는 폴리아데닐레이션 신호 서열 (PA)이 위치할 수 있다.
도 2에서 발현 조절 서열 (ECS1, ECS2)과 코딩 영역 (CR1, CR2)이 각각 2개로 구분된 것으로 도시하고 있으나, IRES 염기 조절 서열을 가지는 발현 조절 서열의 개수 및/또는 이들 발현 조절 서열과 작동 가능하게 연결되는 코딩 영역의 개수는 2개를 초과할 수 있다.
발현 컨스트럭트 및 핵산 분자 주입
도 1 및 도 2에 도시된 핵산 분자는 벡터 내에 삽입될 수 있다. 벡터는 또한 본 발명의 핵산 분자와 연결된 발현 조절 서열 (expression control sequence), 예를 들어 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 벡터는 도 1 및 도 2를 참조하면서 설멸한 핵산 분자를 포함할 수 있는데, 이 핵산 분자는 다른 핵산과 결합하여 융합 단백질 또는 융합 펩타이드를 암호화할 수도 있다.
예를 들면 벡터에는 바이러스 벡터 (viral vectors), DNA 또는 RNA 발현 벡터 (expression vectors), 플라스미드 (plasmid), 코스미드 (cosmid) 또는 파지벡터 (phage vectors), CCA (cationic condensing agents)와 연결된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포좀 (liposomes)으로 포장된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 프로듀서 세포 (producer cells)와 같은 특정 진핵세포 (eukaryotic cells) 등이 포함된다.
예시적으로, 본 발명의 핵산 분자는 포유동물 세포내로 들어가서 발현되도록 조성되어 있다. 이러한 조성은 질병의 치료 및/또는 예방 목적에 사용하는데에 특히 유용할 수 있다. 핵산 분자를 숙주 세포 내에서 발현시키는 데에는 많은 방법이 있으며 적절한 어느 방법도 사용 가능하다. 예를 들어, 본 발명에 따른 핵산 분자는 아데노바이러스 (adenovirus), 아데노-연관 바이러스 (adeno-associated virus), 레트로 바이러스 (retrovirus), 백시니아 (vaccinia) 또는 다른 폭스 바이러스 (e.q., avian pox virus) 등의 바이러스 벡터에 삽입이 가능하다. 하나의 예시적인 실시형태에 따르면, 전술한 핵산 분자를 적절한 벡터에 삽입한 뒤에 시험관내 전사 (in vitro transcription, IVT)를 통하여 RNA 형태의 핵산 분자로 변형될 수 있다.
핵산 분자, 예컨대 DNA를 이러한 벡터에 삽입시키는 기술에 관해서는 이미 잘 알려져 있다. 레트로 바이러스 벡터에는 형질도입된 세포들의 확인 또는 선택을 쉽게 해 주는 선택 마커 (selectable marker)에 대한 유전자 및/또는 특정한 타겟 세포에 대한 수용체 역할을 하는 리간드 (ligand)를 암호화하는 유전자와 같은 타겟팅 부위 (targeting moiety)를 부가적으로 삽입시킬 수 있다. 타겟팅은 또한 항체를 이용한 공지의 방법에 의해서도 이루어질 수 있다.
입수 가능하고 당업계에 공지된 다수의 벡터를 본 발명의 목적에 사용할 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 주로 벡터에 삽입되는 핵산 분자의 크기 및 벡터로 형질전환되는 특정한 숙주 세포에 따라 달라질 것이다. 각각의 벡터는 그의 기능 (이종 폴리뉴클레오티드의 증폭 또는 발현, 또는 둘 다) 및 벡터가 존재하는 특정한 숙주 세포와의 상용성에 따라 다양한 성분을 함유한다. 벡터 성분은 일반적으로 복제 기점 (특히 벡터가 원핵세포에 삽입되는 경우), 선별 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위 (RBS), 신호 서열, 이종 핵산 삽입물 및/또는 전사 종결 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
예를 들어, 본 발명에 따른 발현 벡터는 코딩 영역 (CR/CR1/CR2)에 의해 암호화된 면역원성 펩타이드 또는 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있는 발현 조절 서열, 예를 들어, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐레이션 신호 서열, 인핸서, 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 등을 포함할 수 있다. 폴리아데닐레이션 신호 서열은 전사체의 안정성을 증가시키거나 세포질 수송을 용이하게 한다. 인핸서 서열은 프로모터에서 다양한 부위에 위치하여 인핸서 서열이 없을 때의 프로모터에 의한 전사 활성과 비교하여, 전사 활성을 증가시키는 핵산 염기서열이다. 신호서열에는 숙주가 에스케리키아 (Escherichia) 속 균인 경우에는 PhoA 신호서열, OmpA 신호서열 등이, 숙주가 바실러스 (Bacillus)속 균인 경우에는 α-아밀라아제 신호서열, 서브틸리신 신호서열 등이, 숙주가 효모인 경우에는 MF-α 신호서열, SUC2 신호서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 신호서열, a-인터페론 신호서열, 항체 분자 신호서열 등을 이용할 수 있으나, 본 발명이 이에 제한되지 않는다.
벡터의 한 유형은 벡터의 한 유형은 추가의 DNA 절편이 그 내부에 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 한 특정 벡터는 그것이 도입된 숙주 세포 내에서 자율 복제가 가능하다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주의 게놈과 함께 복제된다. 또한, 한 특정 벡터는 벡터가 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터가 본 명세에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히, "재조합 벡터")로서 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다.
본 발명의 구체적인 실시형태에서, 핵산 분자는 바이러스 발현 시스템 (백시니아 또는 다른 폭스 바이러스, 레트로 바이러스 또는 아데노바이러스)을 이용하여 숙주 세포로 삽입될 수 있다. 예시적으로, 바이러스 벡터에는 HIV, SIV, 설치류 레트로 바이러스 (murine retroviruses), 기본 백혈병 바이러스 (gibbon ape leukemia virus), AAVs (adeno-associate viruses) 및 아데노바이러스 (adenoviruses) 등에서 유래된 레트로 바이러스 벡터가 포함되나 여기에 한정되는 것은 아니다 (Miller et al., 1990, Mol. Cell Biol. 10:4239; J. Kolberg 1992, NIH Res. 4:43; Cornetta et al., 1991, Hum. Gene Ther. 2:215). 설치류 백혈병 바이러스 (murine leukemia virus, MuLV), 기본 백혈병 바이러스 (gibbon ape leukemia virus, GaLV), 에코트로픽 레트로바이러스 (ecotropic retroviruses), SIV (simian immunodeficiency virus), HIV (human immunodeficiency virus) 등에서 유래된 레트로 바이러스 벡터들이 널리 사용되고 있다(Buchscher et al., 1992, J. Virol, 66(5):2731-2739; Johann et al., 1992, J. Virol. 66(5):1635-1640; Sommerfelt et al., 1990, Virol. 176:58-59; Wilson et al., 1989, J. Virol. 63:2374-2378; Miller et al., 1991, J. Virol. 65:2220-2224; Rosenberg and Fauci 1993 in Fundermental Immunology, Third Edition, W. E. Paul(ed.) Raven Press, Ltd., New York and the references therein; Miller et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10:4239; R. Kolberg 1992, J. NIH Res. 4:43; Cornetta et al., 1991, Hum. Gene Ther.2:215).
본 발명에 따른 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
예를 들어, 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지 (예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1, λGEM.TM.-11 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
구성적 또는 유도성 프로모터는 당업자에 의해 확인될 수 있는 특정한 상황의 필요에 따라 본 발명에 사용될 수 있다. 다양한 가능한 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 널리 공지되어 있다. 선택된 프로모터는 제한 효소 소화를 통해 공급원 핵산 분자로부터 프로모터를 제거하고 단리된 프로모터 서열을 선택 벡터 내로 삽입함으로써, 면역원성 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 유전자 또는 전사체의 열린해독틀 (ORF)로 이루어진 코딩 영역 (CR)을 가지는 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열 및 다수의 이종 프로모터를 둘 다 사용하여 코딩 영역 (CR)을 구성하는 유전자 또는 전사체의 증폭 및/또는 발현을 지시할 수 있다. 그러나, 이종 프로모터는 일반적으로 천연 프로모터와 비교하여 발현된 관심유전자의 보다 큰 전사 및 보다 높은 수율을 허용하게 하기 때문에 바람직하다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 번역을 개시하기 위한 IRES를 가지는 발현 조절 서열 (ECS) 및 전사/번역 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J.Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터) 또는 박테리오파지에서 유래한 프로모터 (예: T7 프로모터, T3 프로모터, SM6 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
또한, 본 발명의 재조합 벡터가 복제 가능한 발현 벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점 (replication origin)을 포함할 수 있다. 또한, 재조합 벡터는 선별 마커 (selection marker)를 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 본 발명의 벡터는 선별 표지로서, 해당 기술분야에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다. 선별제 (selective agent)로 처리된 환경에서 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질전환된 세포를 선별할 수 있다. 선별 마커의 대표적인 예로써, 영양 요구 마커 (auxotrophic marker)인 ura4, leu1, his3 등을 들 수 있으나 상기 예에 의해 본 발명에서 사용될 수 있는 선별 마커의 종류가 제한되는 것은 아니다.
발현 벡터에 서브클론된 서열을 증폭시키는 여러 가지 시험관내 증폭 기법들 (in vitro amplification techniques)이 알려져 있다. 이러한 기법에는 PCR (polymerase chain reaction), LCR (ligase chain reaction), Qβ-복제효소 증폭 (replicase amplification) 및 다른 RNA 중합효소를 이용한 기법들이 있다 (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual (2nd Ed) 1-3; U.S. Patent No. 4,683,202; PCR protocols A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds. Academic Press Inc. San Diego, CA 1990. Improved methods of cloning in vitro amplified nucleic acids are described in U.S. Patent No. 5,426,039).
본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 재조합 단백질 또는 펩타이드의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6 x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 6 x His이다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다. 필요한 경우에 이들 재조합 단백질의 세포외 분비를 촉진할 수 있도록 Fc 절편을 코딩하는 서열이 융합될 수도 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 융합 서열이 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6 x His이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼 (Novagen, USA)을 이용하여 소망하는 재조합 단백질을 신속하고 용이하게 얻을 수 있다.
전술한 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. 또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포(예컨대 SF9 세포) 및 사람 세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 벡터는 세포를 세포내외 (in vivo, ex vivo) 또는 시험관 내 (in vitro)에서 유전적으로 변형시키는데 이용될 수 있다. 세포를 유전적으로 변형시키는 방법으로는 세포를 바이러스 벡터로 감염 또는 형질도입 시키는 방법, 인산칼슘 침전법 (calcium phosphate precipitation), 수용체 세포 (recipient cells)를 DNA를 포함하는 세균 프로토플라스트 (bacterial protoplasts)와 융합시키는 방법, 수용체 세포에 DNA를 포함하고 있는 리포좀 (liposome) 또는 미세소구 (microspheres)를 처리하는 방법, 엔도사이토시스 (DEAE dextran, receptor-mediated endocytosis), 일렉트로포레이션 (electroporation), 마이크로인젝션 (micro-injection) 등을 포함한 여러 가지 방법이 알려져 있다.
예를 들어 숙주 세포가 원핵세포인 경우, CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114, 1973), 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580, 1983) 및/또는 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145, 1988) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479, 1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456, 11973), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1: 841, 1982), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10: 87, 1980), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188-1190, 1985), 및/또는 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 9568-9572, 1990) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다. 숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 재조합 단백질 또는 재조합 펩타이드를 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.
약학 조성물
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 면역보강제로서의 전술한 핵산 분자 또는 전술한 핵산 분자를 포함하는 유전자 전달체와, 약학적으로 허용되는 담체(carrier)를 포함하고, 선택적으로 약학적으로 활성인 물질을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 일례로, 전술한 핵산 분자는 직접적으로 피대상체에 투여되거나 또는 유전자 전달체의 형태로 투여될 수 있다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 전술한 핵산 분자는 양이온성 폴리머, 양이온성 펩타이드 또는 양이오선 폴리펩타이드를 이용하여 약학 조성물 중에 안정화될 수 있다. 안정화제로 사용될 수 있는 양이온성 (폴리)펩타이드는 폴리라이신 또는 폴리아르기닌과 같은 다중 양이온성 폴리머, 양이온성 지질 또는 리포펙턴트 (lipofectant)일 수 있다. 보다 구체적으로, 안정화제는 히스톤, 뉴클레오린, 프로타민, 올리고펙타민, 스페르민 또는 스페르미딘 및 양이온성 다당류, 특히 키토산, TDM, MDP, 뮤라밀 디펩타이드, 플루로닉 및/또는 이들의 유도체일 수 있다. 히스톤 및 프로타민은 DNA를 천연적으로 컴팩트하게 하는 양이온성 단백질이다. 본 발명에 따라 면역보강제로 사용되는 핵산 분자와 함께 복합체를 형성할 수 있는 히스톤은 히스톤 H1, H2a, H3 및 H4를 포함하며, 프로타민은 프로타민 P1 또는 P2, 특히 프로타민의 양이온성 부분 서열이 바람직하다. 필요한 경우, 본 발명에 따른 핵산 분자와 함께 복합체를 형성할 수 있는 다른 화합물은 추가적으로 사용되는 면역보강제 (adjuvant)일 수 있다.
면역보강제로서 사용될 수 있는 본 발명의 핵산 분자는 비-항원 특이적인 면역 반응을 유발할 수 있다. 면역 반응과 관련해서 T-림포사이트는 T-헬퍼 1 (Th1) 세포 및 T-헬퍼 2 (Th2) 세포로 분화되며, 면역 체계는 세포내 (Th1) 및 세포외 (Th2) 병원균 (예를 들면 항원)을 파괴할 수 있다. Th1 세포는 대식세포 및 세포독성 T-세포의 활성에 의해 세포성 면역 반응을 돕는다. 한편, Th2 세포는, 원형질 세포로의 전환을 위한 B-세포의 증강 및 항체 (예를 들면 항원에 대항하는)의 형성에 의해 체액성 면역 반응을 촉진한다. Th1/Th2 비율은 면역 반응에서 매우 중요한데, 본 발명의 핵산 분자는 Th1 면역 반응, 즉 세포 매개성 변역 반응을 강화, 유도한다. 따라서 본 발명에 따른 핵산 분자가 약학적으로 활성인 물질, 예를 들ㄹ어 면역 증강 성분과 함께 생체에 투여되면, 본 발명의 핵산 분자는 약학적으로 활성인 물질에 의해 유발된 특정한 면역 반응을 강화하는 면역보강제 (adjuvant)로서의 역할을 수행할 수 있다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 약학 조성물은 면역보강제로서의 전술한 핵산 분자 이외에 약학적으로 활성인 물질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 약학적으로 활성인 물질은 면역원과 같은 면역 증강 성분이다. 일례로, 약학적으로 활성인 물질은 암, 전염병, 자가면역 질환 또는 알레르기에 대한 치료 및/또는 예방 효과를 가지는 화합물일 수 있다. 예를 들어, 약학적으로 활성인 물질은 펩타이드, 단백질, 핵산, 치료적으로 활성있는 저분자량의 유기 또는 무기 화합물, 당, 항원 또는 항체, 당업계에서 공지된 치료제, 항원 세포, 항원 세포의 절편, 세포 조각, 화학적 또는 광선 조사에 의하여 변형된 (예를 들어 약독화되거나 비활성화된) 병원균 (바이러스 또는 박테리아 등)을 포함한다. 일례로, 약학적으로 활성인 물질의 하나인 항원은 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 세포, 세포 추출물, 다당류, 복합 다당류, 지질, 글리코리피드 및 탄수화물일 수 있다. 구체적으로, 약학적으로 활성인 물질의 하나인 항원은 코딩 영역 (CR/CR1/CR2)에 의하여 발현되는 종양 항원, 동물 항원, 초목 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 곰팡이 항원, 원생동물 항원, 자가면역 항원 또는 알레르기 항원을 포함할 수 있다.
예를 들어, 종양 세포의 표면 항원 및 표면 항원, 특히, 바이러스 병원균, 박테리아 병원균, 곰팡이 병원균 또는 원생 동물 병원균의, 분비된 형태가 바람직하다. 물론 항원은, 예를 들어 본 발명에 따른 핵신 분자 내부에 존재할 수 있고, 또한, 적당한 담체 (carrier)에 결합된 햅텐 (haptene)으로 존재할 수 있다. 다른 항원 성분, 비활성화되거나 약독화된 병원균이 또한 사용될 수 있다.
다른 선택적인 실시형태에서, 약학적으로 활성인 물질은 항체, 바람직하게는 치료적으로 유효한 항체가 사용될 수 있다. 본 발명에 따르면 암 (cancer) 또는 전염병, 예를 들어 세포 표면 단백질, 종양 억제 유전자 또는 이의 저해제, 성장 인자 및 신장인자 (elongation factor), 아폽토시스-관련 단백질, 종양 항원, 또는 앞에서 설명한 항원 등에서 중요한 역할을 하는 항원, 단백질 또는 핵산에 대한 항체가 특히 바람직하다.
이들 항원 및/또는 항체의 종류 및 성분에 대해서는 상기에서 기술하였으므로 상세한 설명은 생략한다. 예를 들어, 약학적으로 활성인 물질이 항원인 경우, 약학 조성물은 백신으로 적용될 수 있으며, 약학적으로 활성인 물질이 치료용 항체인 경우, 약학 조성물은 질병 치료제로 적용될 수 있다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 면역보강제로 사용되는 핵산 분자의 코딩 영역 (CR)이 항원, 항체 또는 이들의 단편을 암호화하는 경우, 약학적으로 활성인 물질은 이들 항원, 항체 또는 이들의 단편일 수 있다. 예를 들어, 약학적으로 활성인 물질은, MERS-CoV의 스파이크 펩타이드 (서열식별번호: 11), HPV L1 영역, 예를 들어, HPV 타입 6의 L1 영역 (서열식별번호: 15), HPV 타입 11의 L1 영역 (서열식별번호: 16), HPV 타입 16의 L1 영역 (서열식별번호: 17), HPV 타입 18의 L1 영역 (서열식별번호: 18), HPV 타입 31의 L1 영역 (서열식별번호: 19), HPV 타입 33의 L1 영역 (서열식별번호: 20), HPV 타입 35의 L1 영역 (서열식별번호: 21), HPV 타입 45의 L1 영역 (서열식별번호: 22), HPV 타입 52의 L1 영역 (서열식별번호: 23), HPV 타입 58의 L1 영역 (서열식별번호: 24), Haemagglutin과 같은 인플루엔자 바이러스의 표면 항원, 예를 들어 iPR8 (influenza A/Puerto Rico/08/34; 서열식별번호: 26), 이들의 단편 및/또는 이들의 균등물을 포함하지만, 본 발명이 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 면역보강제로서 사용되는 핵산 분자, 약학적으로 활성인 물질 이외에 약학적으로 허용되는 담체 (carrier)를 포함한다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 약학 조성물이 액체 형태인 경우, 약학적으로 허용되는 담체는 예를 들어, 발열원이 없는 물 (pyrogen-free water); 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 등등, 완충 용액과 같은 등장액 (isotonic saline) 또는 완충 (수)용액, 예를 들어, 땅콩유, 면실유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 카카오 열매의 오일과 같은 식물성 기름; 예를 들어, 폴리프로필렌 글리콜, 글리세롤, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 알기닌산 등과 같은 폴리올을 포함할 수 있다. 액체의 약학 조성물을 생체에 주입하기 위하여 나트륨염, 칼슘염 및 선택적으로 칼륨염을 포함하는 수성 버퍼가 사용될 수 있다. 나트륨염, 칼슘염 및 칼륨염은 염소, 요오드 또는 브롬과 같은 할로겐의 형태, 또는 수산화물, 탄산염, 탄산수소염, 또는 황산염 등의 형태로 존재할 수 있다.
또한, 약학 조성물이 고체 형태인 경우, 약학적으로 허용되는 담체는 고체 필러, 액체 필러 또는 희석제와 같은 고체 담체를 포함할 수 있으며, 생체에 투여하기 적당한 캡슐화 (encapsulating) 화합물이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 약학적으로 허용되는 고체 담체는, 락토오스, 글루코오스 및 수크로오스와 같은 당; 예를 들어, 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 전분; 예를 들어, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 및 이의 유도체; 분말화된 트래거캔스; 엿기름 (malt); 젤라틴; 수지 (tallow); 예를 들어, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트와 같은 고체 활택제; 칼슘 설페이트 등등.
약학적으로 허용되는 담체는 본 발명에 따른 약학 조성물이 투여되는 방식에 따라 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은, 예를 들어, 전신으로 (systemically) 투여될 수 있다. 투여 경로는, 예를 들어, 경구 (oral), 피하내, 정맥내, 근육내, 관절내 (intra-articular), 활액내 (intrasynovial), 흉골내, 경막내 (intrathecal), 간내 (intrahepatic), 병변내 (intralesional), 두개내 (intracranial), 경피 (transdermal), 진피내 (intradermal), 폐내 (intrapulmonal), 복강내 (intraperitoneal), 심장내 (intracardial), 동맥내 (intraarterial), 및 설하 국소 (sublingual topical) 및/또는 비강내 (intranasal) 경로를 포함한다.
사용되어야 하는 약학 조성물의 적당한 양은 동물 모델을 이용한 통상의 실험에 의해 결정될 수 있다. 그러한 모델은, 어떠한 제한을 내포함이 없이, 토끼, 양, 마우스, 쥐, 개 및 인간이 아닌 영장류 모델을 포함한다. 바람직한 주사용 단위 투여 형태는 멸균 수용액, 생리 식염수, 또는 이의 혼합물을 포함한다. 그러한 용액의 pH는 약 7.4로 조정되어야 한다.
주사용으로 적당한 담체는 히드로젤, 조절된 방출용 장치, 지연된 방출용 (delayed release) 장치, 폴리젖산 (polylactic acid) 및 콜라겐 매트릭스를 포함한다. 국소 용도로 적당한 약학적으로 허용되는 담체는 로션, 크림, 젤 및 이와 유사한 것에 사용되는데 적당한 것을 포함한다. 만약 화합물이 경구로 (perorally) 투여된다면, 태블릿, 캡슐 및 이와 유사한 것은 바람직한 단위 투여 형태이다. 구강 투여를 위하여 사용될 수 있는, 단위 투여 형태의 제조를 위한 약학적으로 허용되는 담체는 당업계에 잘 알려져 있다.
필요한 경우, 약학적으로 활성인 물질 및/또는 면역보강제로서의 핵산 분자에 의하여 유도되는 면역원성을 더욱 증가시키기 위하여, 본 발명에 따른 약학 조성물은 하나 이상의 보조 물질을 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 보조 물질의 비제한적인 예는 수지상 세포 (DC)의 성숙을 허용하는 화합물, 예를 들어 리포다당질, TNF-알파 또는 CD40 리간드, GM-CFS 및/또는 사이토카인이다. 구체적으로, 다양한 인터루킨류, 인터페론류, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-베타, TNF-알파, hGH와 같은 성장 인자와 같은, 면역 반응을 촉진하는, 모노킨, 림포킨, 인터류킨 또는 케오카인과 같은 사이토카인이다.
본 발명에 따른 약학 조성물에 추가적으로 하나 이상의 완충제, 안정화제, 계면활성제, 습윤제, 윤활제, 유화제, 현탁화제, 보존제, 항산화제, 불투명화제, 활택제, 가공 보조제, 착색제, 감미제, 향료, 향미제, 희석제, 및 약물 (즉, 본 발명의 유효 성분인 핵산 분자, 유전자 전달체 또는 이의 약학 조성물)의 멋진 외양을 제공하거나 제약 제품 (즉, 의약)의 제조에 도움이 되는 다른 공지된 첨가제를 포함할 수 있다. 일례로, Tween과 같은 같은 유화제; 예를 들어, 소듐 라우릴 설페이트와 같은 습윤제; 착색제; 맛을 부여하는 제제 (taste-imparting agent), 태블릿을 형성하는 제제; 안정화제; 항산화제; 보존제이다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 면역보강제로서의 핵산 분자 이외에 다른 추가적인 면역보강제를 포함할 수 있다. 추가적인 면역보강제는 약학적으로 활성인 물질 및/또는 면역보강제로서 사용된 핵산 분자의 면역학적 활성을 강화시킨다.
약학 조성물에 첨가될 수 있는 추가적인 면역보강제는 프로타민, 뉴클레오린, 스페르민, 스페르미딘 및 양이온성 다당류와, 안정화 양이온성 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 특히 키토산, TDM, MDP, 뮤라밀 디펩타이드, 플루로닉, 백반 (alum) 용액, 알루미늄 히드록시드, ADJUMER (폴리포스파젠); 알루미늄 포스페이트 겔; 조류 (algae)의 글루칸; 알가뮬린 (algammulin); 알루미늄 히드록시드 겔 (백반(alum)); 높은 단백질-흡착성 알루미늄 히드록시드 겔; 낮은 점성의 알루미늄 히드록시드 겔; AF 또는 SPT (스쿠알란(5%)의 에멀젼, Tween-80(0.2%), PLURONIC-L121(1.25%), 포스페이트-완충 식염수, pH 7.4); AVRIDINE (프로판디아민); BAY R1005 ((N-(2-데옥시-2-L-류실아미노-b-D-글루코피라노실)-N-옥타데실도데카노일-아미드 히드로아세테이트); CALCITRIOL (1α,25-디히드록시-비타민 D3); 칼슘 포스페이트 겔; CAPTM (칼슘 포스페이트 나노입자); 콜레라홀로톡신, 콜레라-독소-A1-단백질-A-D-절편 융합 단백질, 콜레라 독소의 서브 유닛 B; CRL 1005 (블록 코폴리머 P1205); 싸이토카인-포함 리포솜; DDA (디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드); DHEA (디히드로에피안드로스테론); DMPC (디미리스토일 포스파티딜콜린); DMPG (디미리스토일 포스파티딜글리세롤); DOC/백반 (alum) 복합체 (데옥시콜린산 소듐염); Freund 완전 애주번트; Freund 불완전 애주번트; 감마 이눌린; Gerbu 애주번트(N-아세틸글루코사미닐-(P1-4)-N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-글루타민 (GMDP), 디메틸디옥타데실암모늄 클로라이드(DDA), 징크-L-프롤린염 복합체 (ZnPro-8)의 혼합물; GM-CSF); GMDP (N-아세틸글루코사미닐-(b1-4)-N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민); 미퀴모드 (1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민); ImmTher(N-아세틸글루코사미닐-N-아세틸뮤라밀-L-Ala-D-이소Glu-L-Ala-글리세롤디팔미테이트); DRV(탈수-재수화 (re-hydration) 비히클 (vesicle)로부터 제조된 면역리포솜); 인터페론-감마; 인터류킨-1베타; 인터류킨-2; 인터류킨-7; 인터류킨-12; ISCOMS("면역증강 복합체 (Immunostimulating Complexes)"); ISCOPREP 7.0.3.; 리포솜; LOXORIBINE (7-알릴-8-옥소구아노신(구아닌)); LT 경구 애주번트 (E.coli 라이어블 (labile) 엔테로톡신-프로톡신); 조성물의 마이크로스피어 및 마이크로입자; MF59; (스쿠알렌-물의 에멀젼); MONTANIDE ISA 51 (정제된 불완전 Freund 애주번트); MONTANIDE ISA 720 (대사작용이 가능한 오일 애주번트); MPL (3-Q-데사실(desacyl)-4'-모노포스포릴 지질 A); MTP-PE 및 MTP-PE 리포솜 ((N-아세틸-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-(히드록시포스포릴옥시))-에틸아미드, 모노소듐염); MURAMETIDE (Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3); MURA PALMITINE 및 D-MURAPALMITINE (Nac-Mur-L-Thr-D-이소GIn-sn-글리세롤디팔미토일); NAGO (뉴라미니다아제-갈락토오스 옥시다아제); 조성물의 나노스피어 또는 나노 입자; NISV (비이온성 계면활성제 비히클(vesicle)); PLEURAN (베타-글루칸); PLGA, PGA 및 PLA (젖산과 글리콜산의 호모폴리머 및 코폴리머; 마이크로스피어/
나노스피어); PLURONIC L121; PMMA (폴리메틸 메타크릴레이트); PODDS (프로테노이드 마이크로스피어); 폴리에틸렌 카바메이트 유도체; 폴리-rA: 폴리-rU (폴리아데닐산-폴리우리딜산 복합체); 폴리소르베이트 80 (Tween 80); 단백질 코크리트 (cochleate)(Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL); STIMULON (QS-21); Quil-A (Quil-A 사포닌); S-28463 (4-아미노-otec-디메틸-2-에톡시메틸-1H-이미다조[4,5-c]-퀴놀린-1-에탄올); SAF-1 ("신텍스 애주번트(adjuvant) 제제"); 센다이
(Sendai) 프로테오리포솜 및 센다이 (Sendai)-함유 지질 매트릭스; Span-85 (소르비탄 트리올레이트); Specol (Marcol 52, Span 85 및 Tween 85의 에멀젼); 스쿠알렌 또는 Robane (2,6,10,15,19,23-헥사메틸테트라코산 및 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥산); 스테아릴티로신 (옥타데실티로신 히드로클로라이드); Theramid (N-아세틸글루코사미닐-N-아세틸뮤라밀-L-Ala-D-이소Glu-L-Ala-디팔미톡시프로필아미드); 트레오닐-MDP (Termurtide 또는 [thr-1]-MDP; N-아세틸뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민); Ty 입자 (Ty-VLP 또는 바이러스-유사 입자); Walter-Reed 리포솜 (수산화 알루미늄에 흡착된 지질 A를 포함하는 리포솜), 및 이와 유사한 것 등을 포함한다.
위에서 언급한 면역보강제 또는 애주번트는 데포 (depot) 및 전달에 적당한 애주번트 (adjuvant), 공자극 (costimulation)에 적당한 애주번트 (adjuvant), 길항제로서 적당한 애주번트 (adjuvant) 등을 포함하는, 여러 계열로 분류될 수 있다. 데포 (depot) 및 전달에 적당한 바람직한 애주번트 (adjuvant)는 Adju-phos, Alhydrogel, Rehydragel 등과 같은 알루미늄염, CFA, SAF, IFA, MF59, Provax, TiterMax, Montanide, Vaxfectin 등과 같은 에멀젼, Optivax (CRL1005), L121, 폴록사머4010) 등과 같은 코폴리머, Stealth 등과 같은 리포솜, BIORAL 등과 같은 코크리트 (cochleate), QS21, Quil A, 이스코매트릭스, ISCOM 등과 같은 식물 유래 애주번트를 포함할 수 있다. 공자극 (costimulation)에 적당한 바람직한 애주번트 (adjuvant)는 예를 들어, Tomatine; PLG, PMM, 이눌린 등과 같은 바이오폴리머; Romurtide, DETOX, MPL, CWS, 만노스, CpG7909, ISS-1018, IC31, 이미다조퀴놀린, 암플리겐, Ribi529, IMOxine, IRIV, VLP, 콜레라 독소, 열 민감성 독소, Pam3Cys, 플라겔린, GPI 앵커 (anchor), LNFPIII/Lewis X, 항균성 펩타이드, UC-1V150, RSV 융합 단백질, cdiGMP 등과 같은 미생물성 애주번트를 포함할 수 있다. 길항제로서 적당한 바람직한 애주번트는 예를 들어, CGRP 뉴로펩타이드 등을 포함할 수 있다.
데포 (depot) 및 전달에 적당한 애주번트로서 특히 바람직한 것은 양이온성 화합물 또는 다중양이온성 화합물이며, 상기 양이온성 화합물 또는 다중양이온성 화합물은 프로타민; 뉴클레오린; 스페르민 또는 스페르미딘을 포함하거나, 또는 폴리-L-라이신 (PLL); 폴리-아르기닌; 염기성 폴리펩타이드; HIV-결합 펩타이드, Tat, HIV-1, Tat (HIV), Tat-유래 펩타이드, 페네트라틴, VP22 유래 펩타이드 또는 VP22 유사 펩타이드, HSV VP22 (단순포진), MAP, KALA 또는 단백질 형질도입 도메인 (PTD), PpT620, 프롤린-풍부 펩타이드, 아르기닌-풍부 펩타이드, 라이신-풍부 펩타이드, MPG-펩타이드(들), Pep-1, L-올리고머, 칼시토닌 펩타이드(들), 안테나페디아-유래 펩타이드 (특히 초파리의 안테나페디아 (Drosophila antennapedIa)로부터), pAntp, pIsl, FGF, 락토페린, 트랜스포탄 (Transportan), 부포린-2, Bac715-24, SynB, SynB(1), pVEC, hCT-유래 펩타이드, SAP, 프로타민, 스페르민, 스페르미딘을 포함하는 세포 투과성 펩타이드 (CPP) 또는 히스톤과 같은 것을 포함한다.
이와 관련하여 특히 바람직한 올리고아르기닌의 예를 들면, Arg7, Arg8, Arg9, Arg7, H3R9, R9H3, H3R9H3, YSSR9SSY, (RKH)4, Y(RKH)2R 등이다. 애주번트로서 사용될 수 있는, 더욱 바람직한 양이온성 또는 다중 양이온성 화합물은, 예를 들어 키토산인 양이온성 다당류; 폴리브렌; 예를 들어 폴리에틸렌이민 (PEI)과 같은 양이온성 폴리머; 예를 들어 DOTMA ([1-(2,3-디올레일옥시)프로필)]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드), DMRIE, 디-C14-아미딘, DOTIM, SAINT, DC-Chol, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE (디올레일 포스파티딜에탄올-아민), DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS (디옥타데실아미도글리실스페르민), DIMRI (디미리스토-옥시프로필 디메틸 히드록시에틸 암모늄 브로마이드), DOTAP (디올레오일옥시-3-(트리메틸암모니오)프로판), DC-6-14 (O,O-디테트라데카노일-N-(α-트리메틸암모니오아세틸)디에탄올아민클로라이드), CLIP1 (rac-[(2,3-디옥타데실옥시프로필)(2-히드록시에틸)]-디메틸암모늄 클로라이드), LIP6 (rac-[2(2,3-디헥사데실옥시프로필-옥시메틸옥시)에틸]트리메틸암모늄), CLIP9 (rac-[2(2,3-디헥사데실옥시프로필-옥시숙시닐옥시)에틸]-트리메틸암모늄), 올리고펙타민과 같은 양이온성 지질을 포함할 수 있거나, 예를 들어, β-아미노산-폴리머와 같은 변형된 폴리아미노산 또는 역 (reversed) 폴리아미드 등등; PVP (폴리(N-에틸-4-비닐피리디늄 브로마이드)) 등등과 같은, 변형된 폴리에틸렌; pDMAEMA (폴리(디메틸아미노에틸 메틸아크릴레이트)) 등등과 같은, 변형된 아크릴레이트, pAMAM (폴리(아미도아민)) 등등과 같은, 변형된 아미도아민; 디아민 말단이 변형된 1,4 부탄디올 디아크릴레이트-코-5-아미노-1-펜탄올 폴리머 등등과 같은, 변형된 폴리베타아미노에스테르 (PBAE); 폴리프로필아민 덴드리머 또는 pAMAM계 덴드리머 등등과 같은, 덴드리머; PEI (폴리(에틸렌이민)), 폴리 (프로필렌이민) 등등과 같은, 폴리이민(들); 폴리알릴아민; 시클로덱스트린계 폴리머, 덱스트란계 폴리머등등과 같은 당 골격계 (sugar backbone based) 폴리머; 키토산; PMOXA-PDMS 코폴리머 등등과 같은, 실란 골격계 폴리머; 하나 이상의 양이온성 블록 (예를 들어, 상기에서 언급된 바와 같은 양이온성 폴리머로부터 선택된)의 조합으로 구성된 블록폴리머 및 하나 이상의 친수성 블록 또는 소수성 블록 (예를 들어 폴리에틸렌글리콜)의 조합으로 구성된 블록폴리머; 등등과 같은 양이온성 폴리머 또는 다중양이온성 폴리머를 포함할 수 있다. 양이온성 화합물 또는 다중양이온성 화합물을 가지는 핵산 분자를 회합 (association) 또는 복합체화하는 것은 바람직하게 애주번트 성질을 핵산에 제공하며, 복합체화에 의해 안정화 효과를 핵산에 수여한다.
특히 양이온성 화합물 또는 다중양이온성 화합물로 바람직한 것은 프로타민, 뉴클레오린, 스페르민, 스페르미딘과, Arg7, Arg8, Arg9, Arg7, H3R9, R9H3, H3R9H3, YSSR9SSY, (RKH)4, Y(RKH)2R 등과 같이 상기 정의된 바와 같은 올리고아르기닌으로 구성된 그룹으로부터 선택된 화합물이다.
또한, Toll-유사 수용체: TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 또는 TLR13에 대한 (리간드로서의) 결합 친화성에 기인되어 면역증강하는 것으로 알려진, 화합물은 신규한 약학 조성물의 본 발명의 핵산에 의해 유도된 면역 반응을 더욱 증강시키기 위한 추가적 성분으로서 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 첨가될 수 있는 다른 계열의 화합물은, CpG 핵산이며, 특히 CpG-RNA 또는 CpG-DNA이다. CpG-RNA 또는 CpG-DNA는 단일 가닥 CpG-DNA (ss CpG-DNA), 이중 가닥의 CpG-DNA (dsDNA), 단일 가닥 CpG-RNA (ss CpG-RNA) 또는 이중 가닥의 CpG-RNA (ds CpG-RNA)일 수 있다. CpG 핵산은 바람직하게 CpG-RNA의 형태이며, 더욱 바람직하게 단일 가닥 CpG-RNA (ss CpG-RNA)의 형태이다. CpG 핵산은 바람직하게 적어도 하나 이상의 (분열 유발성) 시티딘(시토신)/구아닌 디뉴클레오티드 서열(들)(CpG 모티프(들))을 포함한다. 바람직한 첫 번째 대안에 따르면, 상기 서열에 포함된 적어도 하나의 CpG 모티프 (motif), 말하자면 CpG 모티프의 C (시티딘(시토신)) 및 G (구아닌)는, 탈메틸 (unmethylated)이다. 상기 서열에 선택적으로 포함된 모든 추가적인 시티딘 (시토신) 또는 구아닌은 메틸화되거나 탈메틸화 (unmethylated) 될 수 있다. 그러나, 더욱 바람직한 방법에 따르면, CpG 모티프 (motif)의 C (시티딘(시토신)) 및 G (구아닌)는 또한 메틸화된 형태로 존재할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 분자와, 다른 면역보강제를 혼합하는 경우에 이들의 배합 비율은 특별히 한정되지 않는다. 일례로, 본 발명에 따른 핵산 분자와 다른 면역보강제는 100:1 내지 1:100, 바람직하게는 10:1 내지 1:10, 더욱 바람직하게는 5:1 내지 1:5, 가장 바람직하게는 3:1 내지 1:3의 중량 비율로 배합될 수 있다.
본 발명에 따라 면역보강제로 사용되는 핵산 분자의 함량이나 농도는 특별히 제한되지 않는다. 특히, RNA 플랫폼 형태의 핵산 분자를 사용하는 경우, 생체 내에서 신속하게 분해되기 때문에 안전성 및 안정성을 확보할 수 있다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 백신과 같은 약학 조성물 중에 1 내지 1000 ug/mL, 바람직하게는 10 내지 1000 ug/mL의 농도로 사용될 수 있다.
특히 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 또한 백신으로서 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 그러한 백신의 조성물은 백신 조성물에 포함된 약학적으로 활성있는 성분의 특정한 계열에 의해 특징 지어진다. 전형적으로, 약학적으로 활성있는 화합물은 면역증강 물질이 될 것이며, 이것은 특정한 항원에 대해 특정한 (조정된) 면역 반응을 유발한다. 특정한 (조정된) 유도된 면역 반응은 개체로 하여금 예를 들어, 특정한 병원균 또는 특정한 종양 (tumor)에 대해 (활성적이거나 수동적 모드에 의해 유발된) 면역 반응을 발달하게 한다.
한편, 본 발명의 약학 조성물로 사용될 수 있는 백신은 하기에서 예시한 증상의 치료를 위하여 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물, 특히 바람직하게 신규한 백신을 사용하여, 예를 들어 종양-특이성 (tumour-specific) 질병 또는 병원균-특이성 질병, 전염병 또는 알레르기 또는 자가면역성 질병 (자가면역 질환)을 치료 및/또는 예방하는데 활용될 수 있다.
적절한 면역 반응에 중요한 요인은 다른 T-세포 아집단 (sub-population)의 증강이다. T-림프구는 전형적으로 2개의 아집단, 즉 T-헬퍼 1 (Th1) 세포 및 T-헬퍼 2 (Th2) 세포로 분화되며, 상기 아집단은 세포내 (Th1) 병원균 및 세포외 (Th2) 병원균 (예를 들면, 항원)을 파괴할 수 있는 면역계를 가지고 있다. 상기 2개의 Th 세포 집단은, 그들에 의해 생산된 이펙터 단백질 (사이토카인)의 패턴에 있어서 차이가 있다. 일반적으로, Th1 세포는 주로 체액성 면역과 관련하여 대식세포 및 세포독성이 있는 T-세포의 활성에 의한 세포 면역 반응을 돕는다. 한편, Th2 세포는 주로 세포성 면역과 관련하여 원형질 세포로의 전환을 위한 B-세포의 증강에 의해, 그리고 항체 (예를 들면, 항원에 대한 항체)의 형성에 의해, 체액성 면역 반응을 촉진시킨다. 따라서 Th1/Th2 비율은 면역 반응에서 상당히 중요하다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 특히 Th1 면역 반응을 강화한다. 일례로, 본 발명에 따른 약학 조성물은 종양-특이성 (tumour-specific) 또는 병원균-특이성 면역 반응을 유발하기 위하여 사용된다. 본 발명에 따른 그러한 약학 조성물 또는 백신은 항원을 제시하는 세포 (APC)의 면역 반응을 증가시키는데 특히 바람직하게 사용될 수 있다. 이와 같이 특히 바람직하게, 본 발명에 따른 약학 조성물 또는 백신은 암 (cancer) 또는 종양 (tumor)의 치료를 위하여 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 약학 조성물을 이용하여 치료 또는 예방될 수 있는 암 또는 종양은, 결장 선암 (colon carcinomas), 흑색종, 신장암, 림프종, 급성 골수성 백혈병 (AML), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 위 종양 (gastrointestinal tumour), 폐 암종 (pulmonary carcinomas), 신경교종 (gliomas), 갑상샘 종양, 젖샘 암종 (mammary carcinomas), 전립선 종양, 간암 (hepatomas); 예를 들어, 유두종 바이러스성 암종 (예를 들어 자궁경부 암종), 선암종 (adenocarcinomas), 헤르페스 바이러스성 종양 (예를 들어, 버거트 림프종, EBV-유발성 B-세포 림프종), 헵타티티스 (heptatitis) B-유발성 종양 (간세포암종), HTLV-1-유발성 림프종 및 HTLV-2-유발성 림프종과 같은 다양한 바이러스성 종양; 청신경초종 (acoustic neuromas)/신경초종 (neurinomas), 자궁경부암, 폐암, 인두암 (pharyngeal cancer), 항문 암종 (anal carcinomas), 교아세포종 (glioblastomas), 림프종, 직장 암종 (rectal carcinomas), 성상세포종 (astrocytomas), 뇌 종양, 위암 (stomach cancer), 망막모세포종 (retinoblastomas), 암종 (basaliomas), 뇌 전이 (brain metastases), 수모 세포종 (medulloblastoma), 질암 (vaginal cancer), 췌장암, 고환암, 흑색종, 갑상선 암종 (thyroidal carcinomas), 방광암, 호지킨 증후군, 수막종, 슈네베르거 병(Schneeberger disease), 기관지 암종 (bronchial carcinomas), 뇌하수체 종양, 균상식육종 (Mycosis fungoides), 식도암, 유방암, 카르시노이드, 신경초종 (neurinomas), 척추종 (spinaliomas), 버거트 림프종, 후두암, 신장암, 흉선종, 자궁체부암 (corpus carcinomas), 뼈암 (bone cancer), 비-호지킨 림프종, 요도암, CUP 증후군, 두경부 종양 (head/neck tumour), 핍돌기신경교종 (oligodendroglioma), 음문암 (vulval cancer), 창자암 (intestinal cancer), 결장 선암 (colon carcinomas), 식도 암종 (oesophageal carcinomas), 사마귀 병발 (wart involvement), 소장의 종양, 두개인두종 (craniopharyngeomas), 자궁 암종 (ovarian carcinomas), 연조직 종양/육종 (sarcomas), 난소암, 간암, 췌장 암종 (pancreatic carcinomas), 자궁경부 암종 (cervical carcinomas), 자궁내막 암종 (endometrial carcinomas), 간 전이 (liver metastases), 음경암 (penile cancer), 설암(tongue cancer), 담낭암, 백혈병, 형질세포종 (plasmocytomas), 자궁암, 눈꺼플 종양 (lid tumour), 전립선암 등으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 약학 조성물은 전염병을 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다. 상기 전염병은 인플루엔자, 말라리아, SARS, 황열 (yellow fever), AIDS, 라임보렐리오시스, 리슈만편모충증, 수막염, MERS, ZIKA, 첨형 콘딜로마 (Condyloma acuminata), 우묵한 사마귀 (hollow wart), 뎅기열, 3일 열 (three-day fever), 에볼라바이러스, 감기, 초여름 뇌염 (FSME), 독감 (flu), 대상포진 (shingles), 간염, 단순포진 타입 I, 단순포진 타입 Ⅱ, 대상 포진 (herpes zoster), 일본 뇌염, 라사열 (Lassa fever), 마르부르크 바이러스, 홍역, 수족구병, 단핵구증, 볼거리 (mumps), 노르워크 바이러스 감염, 파이퍼 선열 (Pfeiffer's glandular fever), 천연두, 회색질척수염 (아동기 절름발이), 가막성 후두염 (pseudo-croup), 제 5 전염성 홍반병, 광견병, 사마귀, 웨스트 나일 열 (West Nile fever), 수두, 거세포성 (cytomegalic) 바이러스 (CMV)로부터 선택되거나, 유산 (전립선 염증), 탄저병, 충수염, 보렐리아증, 보툴리눔독소증, 캄필로박터 감염증 (Camphylobacter), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis)(요도의 염증, 결막염), 콜레라, 디프테리아, 도너반증, 후두개염, 발진티푸스, 가스 괴저 (gas gangrene), 임질, 야생토끼병, 헬리코박터 파일로리, 백일해, 풍토 가래톳 (climatic bubo), 골수염, 리지오넬라 병, 나병, 리스테리아증, 폐렴, 수막염, 박테리아성 수막염, 탄저병, 중이염, 마이코플라스마 호미니스 (Mycoplasma hominis), 신생아 패혈증 (융모양막염), 괴저구내염, 파라티푸스, 플라그, 라이터 증후군, 록키산 홍반열, 살모넬라 파라티푸스, 살모넬라 티푸스, 성홍열, 매독, 파상풍, 트리퍼 (tripper), 쯔쯔가무시 병, 결핵, 티푸스, 질염, 연성 궤양과 같은 박테리아성 전염병으로부터 선택되거나; 및 아메바증 (amoebiasis), 주혈흡충증 (bilharziosis), 샤가스 병 (Chagas disease), 무좀, 효모 곰팡이 반점 (yeast fungus spot), 옴 (scabies), 말라리아, 회선사상충증 (onchocercosis)(사상충증 (river blindness)), 또는 곰팡이성 질병, 톡소포자충증, 트리코모나스증, 파동편모충증 (trypanosomiasis)(수면병), 내장 리슈마니아증, 기저귀 피부염, 주혈흡충병(schistosomiasis), 어독 (시가테라 독), 칸디다증, 피부 리슈마니아증, 람블편모충증 (giardiasis), 또는 수면병과 같은 기생충, 원충 또는 곰팡이에 의해 생긴 전염병으로부터 선택되거나; 또는 포낭충, 어조충 (fish tapeworm), 여우의 촌충 (fox tapeworm), 개의 촌충 (canine tapeworm), 이 (lice), 소의 촌충 (bovine tapeworm), 돼지의 촌충 (porcine tapeworm), 아주 작은 촌충 (miniature tapeworm)에 의해 생긴 전염병으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 약학 조성물은 알레르기성 장애 또는 질병을 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다. 알레르기는 어떠한 외부의 항원 또는 알레르기 항원에 대한 비정상적인, 후천적인 면역학적 과민성을 전형적으로 포함하는 상태이다. 알레르기는 이러한 항원 또는 알레르기 항원에 대한 국부성 또는 전신성 염증 반응을 정상적으로 유발하며, 이러한 알레르기 항원에 대해 체내에서 면역을 유도한다. 이와 관련된 알레르기 항원은 예를 들어, 잔디, 꽃가루, 곰팡이, 약물, 또는 수많은 환경적 유발 등을 포함한다. 이론에 구애됨이 없이, 여러 다른 질병의 메커니즘이 알레르기의 발달에 관련된 것 같다. P. Gell 및 R. Coombs에 의한 분류 방법에 따르면, 용어 "알레르기"는 고전적 IgE 메커니즘에 의해 야기된, 타입 I 과민성에 한정된다. 타입 I 과민성은 IgE에 의한 비만 세포 및 호염기의 과도한 활동에 의해 특징지어지며, 생명을 위협하는 아나필락시스 쇼크 및 죽음에 대해, 코감기로서 양성 (benign)인 증상을 유발할 수 있는 전신성 염증 반응을 유발한다. 알레르기의 타입으로 잘 알려진 것은, 이들에 제한되지 않는, 알레르기성 천식 (비강 점막의 부기를 유발함), 알레르기성 결막염 (결막의 발적 및 가려움을 유발함), 알레르기성 비염 ("건초열"), 아나필락시스, 혈관 부종, 아토피성 피부염 (습진), 두드러기, 호산구증가증, 호흡, 곤충 자상 (insect stings)에 대한 알레르기, 피부 알레르기 (습진, 두드러기 및 (접촉) 피부염과 같은, 다양한 발진을 유발하며, 이들을 포함함), 음식 알레르기, 약에 대한 알레르기 등을 포함한다.
예를 들어, 본 발명에 따른 약학 조성물은 단백질인 알레르기 항원 (예를 들면 고양이 알레르기 항원, 먼지 알레르기 항원, 좀진드기 (mite) 항원, 식물 항원 (예를 들면 자작나무 항원) 등으로부터 유래하는 알레르기성 장애 또는 질환을 치료 및/또는 예방할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 과도한 면역 반응을 더 강한 Th1 반응으로 바꿀 수 있으며, 그에 따라 원하지 않는 IgE 반응을 억제하거나 약화시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 약학 조성물은 자가면역성 질병의 치료 및/또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 자가면역성 질병은 전신적 또는 기관-특이적 자가면역 질병 또는 국부적 자가면역성 질병으로 나뉘어질 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 의하여 치료 및/또는 예방될 수 있는 자가면역성 질병은 쇼그렌 증후군, 공피증, 류마티스 관절염 및 다발근육염을 포함하는 전신 증후군, 또는 내분비계 (DM 타입 1, 하시모토 갑상선염, 에디손 병 등), 피부과 (심상성 천포창), 혈액학의 (자가면역성 용혈성 빈혈), 신경의 (다발경화증)이 될 수 있는 국소 적응 증후군의 카테고리로 나뉘어질 수 있거나, 또는 체조직의 외접 물질 (circumscribed mass)을 포함할 수 있다. 치료되어야 하는 자가면역성 질병은 타입 I 자가면역성 질병, 타입 Ⅱ 자가면역성 질병, 타입 Ⅲ 자가면역성 질병 또는 타입 Ⅳ 자가면역성 질병으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 다발경화증 (MS), 류마티스 관절염, 당뇨병, 타입 I 당뇨병 (diabetes mellitus), 전신 홍반성 루프스 (SLE), 만성 다발성관절염, 바세도우 병, 만성 간염의 자가면역 형태, 궤양성 대장염, 타입 I 알레르기 질병, 타입 Ⅱ 알레르기 질병, 타입 Ⅲ 알레르기 질병, 타입 Ⅳ 알레르기 질병, 섬유근육통, 탈모, 베크테레프 병, 크론 병, 중증 근육 무력증, 신경성 피부염, 류마티스 다발성 근통, 진행성 전신성 경화증 (PSS), 건선, 라이터 증후군, 류마티스성 관절염, 건선, 혈관염 등 또는 타입 Ⅱ 당뇨병을 들 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 분자 또는 핵산 분자가 삽입된 유전자 전달체를 포함하는 약학적 조성물 (핵산 백신 및/또는 유전자 치료제)은 바람직하게 전신으로 투여된다. 그러한 약학적 조성물/백신의 투여 경로는 전형적으로 경구 (oral), 피하내, 정맥내, 근육내, 관절내 (intra-articular), 활액내 (intra-synovial), 흉골내, 경막내 (intrathecal), 간내 (intrahepatic), 병변내 (intralesional), 두개내 (intracranial), 경피 (transdermal), 진피내 (intradermal), 폐내 (intrapulmonal), 복강내 (intraperitoneal), 심장내 (intracardial), 동맥내 (intraarterial), 설하 국소 (sublingual topical) 및/또는비강내 (intranasal) 경로를 포함한다. 선택적으로, 본 발명의 백신 또는 약학 조성물은 진피내 (intradermal), 피하내 또는 근육내의 경로에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 약학적 조성물/백신은 일반적으로 약학적 조성물에 대해, 상기 정의된 바와 같은 액체 또는 고체 형태로 바람직하게 제형화된다.
필요한 경우, 백신의 면역원성을 증강시킬 수 있도록 면역보강제가 약학적 조성물에 포함될 수 있다. 면역보강제는 본 발명에 따른 백신에 통합될 수 있다. 이러한 면역보강제 등의 보조 성분들은 면역원성 (immunogenicity) 및 본 발명에 따른 백신의 약학적으로 활성있는 성분의 다른 성질에 따라서 선택된다.
본 발명의 핵산 분자 또는 재조합 발현 벡터와 같은 유전자 전달체는 임의의 적합한 수단, 예를 들어 경구, 국소 (협측 및 설하 포함), 직장, 질, 경피, 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 피내, 경막내 및 경막외 및 비강내, 및 원하는 경우에 국부 치료, 병변내 투여를 위한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 임의의 편리한 투여 형태, 예를 들어 정제, 분말, 캡슐, 용액, 분산액, 현탁액, 시럽, 분무제, 좌제, 겔, 에멀젼, 패치 등으로 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 제약 제제에 통상적인 성분, 예를 들어 희석제, 담체, pH 조정제, 감미제, 벌킹제 및 추가의 활성제를 함유할 수 있다.
예를 들어, 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐
피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
한편, 본 명세서에서 제제는 또한 치료할 특정한 적응증에 필요한 경우에는 하나 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 미치지 않는 보완적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 조성물은 그의 기능을 증진시키는 작용제, 예컨대 예를 들어 세포독성제, 사이토카인, 화학요법제, 또는 성장-억제제, 또는 성장-증진제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.
또한, 관심유전자를 암호화하는 코딩 영역을 포함하는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 유전자 전달체가 약학적 조성물에 포함될 수 있다. 유전자 전달체는 목적의 핵산분자를 운반 및 발현시키기 위하여 제작된 것으로서, 운반 객체인 목적의 핵산 분자에 대한 상세한 내용은 위에 기재된 내용과의 중복기재를 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
유전자 전달체를 제조하기 위해, 관심 유전자의 전사체는 적합한 발현 컨스트럭트 (expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 컨스트럭트에서, 관심유전자의 전사체는 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서, 관심유전자의 전사체에 결합된 프로모터는, 바람직하게는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포에서 작동하여 목적의 핵산분자의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터, 또는 박테리오파지에서 유래한 프로모터를 포함한다. 예를 들어, CMV (cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터, SM6 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 암세포 특이적 프로모터 (예컨대, TERT 프로모터, PSA 프로모터, PSMA 프로모터, CEA 프로모터, E2F 프로모터 및 AFP 프로모터) 및 조직 특이적 프로모터 (예컨대, 알부민 프로모터)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 발현 컨스트럭트는 폴리아네닐화 서열을 포함한다 (예: 소성장 호르몬 터미네이터 및 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열).
예를 들어, 본 발명에 따른 핵산 분자를 사용하여 RNA 백신으로 활용하고자 하는 경우, 선택적으로 발현 조절 서열 (ECE)의 5'쪽에 IVT를 가능하게 하는 적절한 전사 조절 서열이 위치할 수 있다. 전술한 바와 같이, RNA 백신 등으로 활용될 수 있는 RNA 형태의 핵산 분자는 IVT 과정을 통해서 합성될 수 있기 때문에, 일반적인 생백신이나 사백신 제조에 사용되는 살아 있는 바이러스나 병원성 미생물을 직접 다룰 필요가 없으며, 재조합 단백질/펩타이드를 생산하기 위하여 반드시 사용해야 하는 효모, 대장균, 곤충 세포와 같은 숙주 세포의 배양 등이 불필요하다.
예를 들어, 본 발명에 따른 핵산 분자를 이용한 RNA 백신을 제조하기 위하여, DNA 형태로 플라스미드에 삽입된 폴리뉴클레오티드를 IVT 과정을 통해 mRNA 형태로 전사할 때, 제한효소 등으로 말단이 전달되어 선형화된 DNA를 주형으로 이용하여 RNA 중합효소 (RNA polymerase)에 의해 RNA를 시험관에서 합성한다. 선형화된 DNA로부터 RNA로의 전사를 위해서 예를 들어 박테리오파지 등에서 유래한 프로모터 서열과 같은 전사 조절 서열이 5'-UTR의 5'쪽에 위치할 수 있다. 이러한 전사 조절 서열로서 T7 박테리오파지 유래의 프로모터 이외에도 T3 박테리오파지 유래의 프로모터, SP6 박테리오 파지 유래의 프로모터 등 선형화된 DNA 주형으로부터 mRNA를 전사할 수 있는 임의의 전사 조절 서열 (TES)이 발현 조절 서열 (ECS) 인근에 위치할 수 있다.
유전자 전달체는 다양한 형태로 제작할 수 있는 데, 플라스미드, 바이러스 벡터, 또는 플라스미드를 내포하는 리포좀 또는 니오좀의 형태로 제작할 수 있다. 일례로, 관심유전자의 전사체는 통상적인 유전자 치료에 이용되는 모든 유전자 전달 시스템에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 플라스미드, 아데노바이러스 (Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080, 1997)), 아데노-관련 바이러스 (Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 레트로 바이러스 (Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11): R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Chamber R., et al., Proc. Natl.Acad. Sci USA 92:1411-1415, 1995), 백시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657, 1999)), 리포좀 (Methods in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) 또는 니오좀에 적용될 수 있다.
한편, 상술한 유전자 전달체를 세포내로 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 본 발명에서, 유전자 전달체가 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는, 당업계에 공지된 바이러스 감염 방법에 따라 실시된다. 바이러스 벡터를 이용한 숙주 세포의 감염은 상술한 인용문헌에 기재되어 있다.
또한, 본 발명에서 유전자 전달 시스템이 내이키드 (naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드인 경우에는, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479, 1980); 및 Harland와 Weintraub, J. Cell Biol., 101:1094-1099, 1985), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456, 1973); 및 Chen과 Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752, 1987), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J.,1:841, 1982; 및 Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87, 1980); Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190, 1982; 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176, 1987)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188-1190, 1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 9568-9572, 1990)) 방법에 의해 유전자를 세포내로 이입시킬 수 있다.
이하, 예시적인 실시형태를 통하여 본 발명을 설명하지만, 본 발명이 하기 실시예에 기재된 기술사상으로 한정되지 않는다.
실시예 1: RNA 플랫폼의 핵산 분자 제작
귀뚜라미마비바이러스(CrPV) 유래의 IRES를 가지는 RNA 핵산 분자를 제작하였다. 주형 DNA 서열은 다음과 같이 설계하였다.
5'- T7 프로모터 (서열식별번호: 7) - CrPV 유래의 IRES 서열(서열식별번호: 1) - CrPV의 개시코돈 서열 (CCTGCT) -코딩 영역의 ORF로서 Renilla Luciferase (R/L) 암호화 서열 (서열식별번호: 9) - SV40 폴리아데닐레이션 신호 서열 (서열식별번호: 8). 코딩 영역을 삽입하기 위하여 서열식별번호: 27의 멀티플 클로닝 사이트를 사용하였다.
주형 DNA를 pGH 벡터에 클로닝하고 제한효소로 linearization시켜, in vitro trasncrption (IVT)를 통해 RNA 플랫폼 형태의 핵산 분자 (pCrPV-Renilla)를 제조하였다.
실험예 1: 핵산 분자의 면역보강제로의 기능 분석
실시예 1과 비교예 1에서 각각 제작된 핵산 분자가 면역 반응을 유도하는지를 분석, 측정하였다. 마우스 골수의 수지상 세포의 분화를 다음과 같이 측정하였다. C57BL/6 5주령 마우스의 양쪽 뒷다리를 부검하고, 살과 털을 모두 분리하여 뼈만 남겼다. 골수에 존재하는 세포의 PBS를 주사기에 넣고, 뼈 사이로 흘러내려 골수 안에 있는 수지상 세포를 분리하였다. 획득한 마우스의 수지상 세포를 100 파이 dish에 3 X 107으로 분주하고, IL-4와 GM-CSF (granulocyte-
macrophage colony stimulating factor) 사이토카인을 넣은 배지를 부검 후로부터 3일과 5일째에 교체하였다. 부검 7 ~ 8일 후에 수지상 세포 분화가 완료되었으며, 분화가 완료된 수지상 세포 5 X 106 cells/mL을 6 well plate에 다시 분주하였다.
다양한 adjuvant 후보를 pCRPV-renilla 유래 RNA에 protamine을 2:1로 배합한 뒤, 수지상 세포의 활성화 및 상층액 내에 존재하는 사이토카인을 분석하였다. 비교예로서 PBS (phosphoate-buffered saline), LPS (lipo-
polysaccharide), protamine을 단독 처리한 것을 사용하였다. 이들을 각각 골수 수지상 세포에 처리하고, 24시간 후에 flow cytometer로 BMDC의 활성을 분석하였고, Th1 분화를 유도하는 사이토카인으로서 상층액에 존재하는 IL-6, IL-12의 농도를 ELISA를 이용하여 분석하였다. Flow cytomer 분석 결과를 도 3a에, ELISA 분석 결과를 도 3b에 각각 나타낸다. 이들 도면에 나타낸 바와 같이, pCrPV-renilla 유래 RNA 핵산 분에서 골수 수지상 세포가 활성화되었고, Th1 분화에 관여하는 사이토카인의 분비가 증가하였다. 이러한 결과는 바이러스 유래의 IRES 서열을 이용한 핵산 분자가 LPS만큼 강력한 adjuvant 효과가 있음을 의미한다.
한편, LPS는 매우 강력한 adjuvant 기능을 가지고 있음에도 불구하고 인체에 매우 강력한 염증을 유도하기 때문에 실제 adjuvant로 사용할 수 없다. 하지만, 도 4에 도시한 바와 같이 바이러스 유래의 IRES 서열을 가지는 핵산 분자는 LPS처럼 면역 세포 활성 기능이 있음에도 불구하고 면역된 숙주 안에서 빠르게 분해되어 안전성이 매우 우수한 것을 확인하였다.
실시예 2: MERS 핵산 서열이 삽입된 RNA 플랫폼의 핵산 분자 제작
Renilla luciferase를 암호화하는 핵산 서열을 대신하여 MERS-CoV (Middle East repiratory syndrome-Coronavirus)의 스파이크 펩타이드 (MERS S peptide)를 암호화하는 핵산 서열 (서열식별번호: 10)을 코딩 영역에 삽입한 것을 제외하고 실시예 1의 절차를 반복하여 CrPV 유래의 IRES 서열을 가지는 핵산 분자 (pCrPV-MERS)를 제작하였다.
비교예 1: RNA 플랫폼의 핵산 분자 제작
Renila luciferase를 암호화하는 핵산 서열을 대신하여 Multi cloning site (서열식별번호: 27)를 코딩 영역에 삽입한 것을 제외하고 실시예 1의 절차를 반복하였다.
실험예 2: MERS 스파이크 펩타이드를 암호화하는 서열이 삽입된 핵산 분자의 면역 반응 분석
도 5에 도시한 면역 스케줄에 따라, 실시예 2에서 제작된 핵산 분자 (pCrPV-MERS RNA)를 마우스에 주입하고, 면역 스케줄에 따라 마우스로부터 혈액을 채취하여 면역 반응을 검토하였다. MERS 스파이크 단백질(서열식별번호: 11)을 약학적으로 활성인 항원으로 사용하였다. 비교를 위하여, 서열식별번호: 11의 MERS 스파이크 단백질만을 주입, 종래 면역보강제로 사용된 Alum (aluminium hydroxide), 실시예 1에서 제작된 핵산 분자 (pCrPV-Renilla RNA)도 동일한 면역 스케줄에 따라 마우스에 주입하였다.
총 3회의 면역을 수행하였고, MERS spike 단백질은 5 ug/mice로 처리하였으며, alum을 처리한 그룹에서 alum은 MERS spike protein 5 ug 당 120 ug /mice을 넣어 formulation하여 마우스에 면역하였다. 면역에 사용된 RNA 플랫폼 형태의 폴리뉴클레오티드는 각각 20 ug/mice로 면역하였으며, RNA는 10 ug의 protamine으로 formulation하여 (RNA: Protamine ratio = 2:1) 마우스에 면역에 이용하였다. 또한, 근육 주사에서 면역 물질의 부피 (volume)는 100 ul/mice이었고, 비강 주사에서 부피는 45 ul/mice로 수행되었다.
총 12개의 그룹으로 구분하였으며, 그 중에서 일부의 그룹에 대하여 각각의 그룹에서 주입된 물질을 하기 표 1에 나타낸다. 표 1 및 도 5에서 I.M은 근육주사 (Intramuscular Injection)를 통하여 마우스에 주입한 것을 의미하고, 표 1에서 I.N은 비강주사 (Intranasal Injection)을 통하여 마우스에 주입한 것을 의미한다.
표 1. 그룹 별 주입된 화합물
Figure 112018042249240-pat00001
(1) 면역글로뷸린(IgG) 항체가 측정
본 실시예에 따라 면역된 마우스의 혈청 중에서 Th2 면역 반응에 의해 유도되는 IgG1의 양을 ELISA로 분석한 결과를 도 6에, Th1 면역 반응에 의해 유도되는 IgG2a의 양을 ELISA로 분석한 결과를 도 7에 각각 나타낸다. 또한, 면역된 마우스의 비장세포에서 Th1 면역 반응을 유도하는 사이토카인 IFN-γ를 분비하는 세포수를 측정한 ELISPOT 분석 결과를 도 8에 나타낸다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 마우스의 2차 혈청에서, I.N.으로 면역한 그룹에 비해서 I.M.으로 면역 한 그룹에서 IgG1 항체가가 약간 높았으며, 음성 컨트롤린 PBS로 처리한 그룹은 항체가 유도되지 않았다. 또한, 마우스의 3차 혈청에서, I.N.으로 면역한 그룹에 비해서 I.M.으로 면역한 그룹의 경우가 1.5 ~ 2배 가량 높은 항체가를 보여주었다. 특히, 3차 혈청에서는 pCrPV-MERS RNA를 면역증강제로 사용한 경우에 모두 높은 항체가를 나타냈다.
한편, 도 7에 나타낸 바와 같이, 마우스의 2차 혈청에서, I.N.으로 면역한 그룹에 비하여 I.M.으로 면역한 그룹에서 IgG2a에 대한 항체가가 월등히 증가하였다. 반면, MERS 스파이크 단백질만으로 면역한 그룹 (G1, G7)은 IgG2a 항체가가 매우 낮았다. 이는, 단백질 또는 펩타이드를 alum으로 formulation하여 면역하면, Th1 면역 반응, 즉, 세포성 면역 반응은 거의 유도되지 않는다는 것을 의미한다.
또한, 1회 면역, 2회 boosting한 3차 면역 혈청에서는 2차 혈청의 IgG2a의 항체가와 전체적인 패턴이 매우 유사하였다. 그러나 IgG1과 달리 I.N.으로 면역한 그룹에 비해서 I.M.으로 면역한 것이 월등히 높은 항체가를 보여주었다. 아울러, MERS 스파이크 단백질만을 면역한 그룹 (G1, G7)에서는 여전히 IgG2a 항체가가 매우 낮아서, 단백질만 alum으로 formulation 하여 면역하면 Th1 반응이, 즉 세포성 면역 반응은 거의 유도되지 않는다는 것을 재확인해 주었다.
결론적으로, 이러한 결과들은 일반적으로 단백질 백신이나 항원은 체액성 면역 반응과 관련한 Th2 면역 반응만을 주로 유도하여 항체는 잘 생성하지만, 세포성 면역 반응과 관련한 Th1 면역 반응을 잘 유도하지 못한다는 것을 보여준다. 하지만, 단백질 또는 펩타이드 백신이나 항원 등의 약학적으로 활성인 물질과, 본 발명에 따른 핵산 분자를 면역보강제로 함께 생체에 주입하여 면역하면, 본 발명에 따른 핵산 분자에 의하여 Th1 반응도 잘 유도된다. 따라서, 본 발명에 따른 핵산 분자를 단백질 또는 펩타이드로 이루어진 물질과 함께 면역하면, 약학적으로 활성인 물질에 의한 면역 반응을 균형있게 유도할 수 있는 좋은 전략임을 의미한다.
(2) ELISPOT 분석
3차 면역 후 희생시킨 마우스의 비장으로부터 얻은 비장 세포 1 X 106 cells/100 ul/well을 96 well plate에 분주하고, MERS 스파이크 펩타이드를 각각 2 ug(well 당) 처리하여 자극을 준 뒤에 ELISPOT 분석을 수행하여, Th1 면역 반응을 유도하는 사이토카인인 IFN-γ를 분비하는 T-세포의 개수를 측정하였다. 분석 결과를 도 8에 나타낸다. 펩타이드는 MERS 스파이크 단백질에 있는 T-cell epitope를 이용하였다. MERS 스파이크 단백질, alum과 pCrPV-MERS RNA 핵산 분자를 함께 처리한 그룹 (G2, G8)에서 가장 높은 수치의 MERS spike T cell epitope specific IFN-γ secreted T cell population을 보여 주었다. 이러한 결과는, 면역한 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 코딩 영역에 삽입된 핵산 분자를 면역보강제로 사용할 경우, 약학적으로 활성인 물질인 MERS spike T cell epitope specific IFN-γ secreted T cell population이 높아지며, 이는 RNA 핵산 분자에 존재하는 MERS 스파이크 유전자가 MERS spike 단백질에서 유래한 cytotoxic T-cell (CTL) 반응을 유도한다는 것을 의미한다.
실시예 3: 이중 발현 카세트를 가지는 핵산 분자 제작
본 실시에에서는 도 2에 도시된 것과 같이 2개의 발현 카세트를 가지는 핵산 분자를 제작하였다. 주형 DNA 서열은 다음과 같이 설계하였다.
5'- T7 프로모터 (서열식별번호: 7) - 제 1 IRES로서 CrPV 유래의 IRES 서열 (서열식별번호: 1) - CrPV의 개시코돈 서열 (CCTGCT) -제 1 코딩 영역의 ORF로서 MERS 스파이크 단백질의 단편 (서열식별번호: 12) - 제 2 IRES로서 뇌심근염바이러스 (EMCV) 유래의 5'-UTR(서열식별번호: 2) - Kozak 서열 (GACC) - 제 2 코딩 영역의 ORF로서 MERS 스파이크 단백질의 단편 (서열식별번호: 12) - SV40 폴리아데닐레이션 신호 서열 (서열식별번호: 8). 제 1 코딩 영역을 삽입하기 위하여 서열식별번호: 28의 멀티플 클로닝 사이트를 사용하고, 제 2 코딩 영역을 사입하기 위하여 서열식별번호: 29의 멀티플 클로닝 사이트를 사용하였다.
주형 DNA를 실시예 1에 제시된 것과 동일한 절차를 반복하여 RNA 플랫폼 형태의 핵산 분자 (pCrPV-MERS-EMCV-MERS)를 제작하였다.
실험예 3: 면역 반응 분석
2회의 면역만으로도 면역 반응을 유도할 수 있는지를 확인하기 위한 면역 실험을 수행하였다. 도 9에 도시한 면역 스케줄에 따라, 실시예 3에서 제작된 핵산 분자 (pCrPV-MERS-EMCV-MERS RNA)를 마우스에 주입하고, 면역 스케줄에 따라 마우스로부터 혈액을 채취하여 면역 반응을 검토하였다. 크게 2개의 그룹으로 구분하였으며, 각각의 그룹에서 주입한 물질을 하기 표 2에 나타낸다. 표 2에서 I.M.은 근육주사 (Intramuscular Injection)을 통하여 해당 물질을 마우스에 주입한 것을 나타낸다. 표 2에서 protein은 항원으로 사용된 MERS 스파이크 단백질 (서열식별번호: 11), A는 alum, RNA는 pCrpV-MERS-EMCV-MERS에 protamine (2:1)을 혼합한 것을 의미한다.
표 2. 그룹 별 주입된 화합물
Figure 112018042249240-pat00002
도 9에 나타낸 면역 스케줄에 따라 면역된 마우스의 혈청에서 측정한 중화항체가 분석 결과를 도 10에, IgG1 항체가의 분석 결과를 도 11에, IgG2a 항체가의 분석 결과를 도 12에 각각 나타낸다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 1회 면역 후에 가장 높은 MERS 스파이크 단백질에 특이적인 항체가를 보여주는 것은 alum formulation된 MERS 스파이크 단백질과, RNA 핵산 분자를 함께 면역한 그룹이었다. 1회 boosting 후에 가장 높은 항체가를 보여주는 것은 단백질과 RNA 핵산 분자를 함께 면역한 그룹이었다.
특히, 도 12에 나타낸 바와 같이, Th1 면역 반응을 의미하는 IgG2a 항체가는 alum formulation 된 MERS 스파이크 단백질과, pCrPV-MERS-EMCV-MERS RNA를 함께 면역한 S1-4 그룹은 1회 면역만으로도 높은 항체가를 보여주고 있다. Boosting 이후에는 S1-4 그룹이 가장 높은 항체가를 보이고, 다음으로는 단백질로만 면역한 S1-2그룹이었다. 이러한 결과는 본 발명에 따라 제작된 RNA 핵산 분자가 매우 우수한 Th1 반응 유도를 하고 있음을 의미한다.
실시예 4: HPV 16 L1 영역을 삽입한 핵산 분자 제작
Renilla luciferase를 암호화하는 핵산 서열을 대신하여 인유두종바이러스 (Human Papillomavirus; HPV) 타입 16의 L1 영역을 암호하하는 핵산 서열 (서열식별번호: 13)을 코딩 영역에 삽입한 것을 제외하고 실시예 1의 절차를 반복하여 CrPV 유래의 IRES 서열을 가지는 핵산 분자 (pCrPV-HPV 16)를 제작하였다.
실시예 5: HPV 16 L1 영역을 삽입한 핵산 분자 제작
Renilla luciferase를 암호화하는 핵산 서열을 대신하여 인유두종바이러스 (Human Papillomavirus; HPV) 타입 18의 L1 영역을 암호하하는 핵산 서열 (서열식별번호: 14)을 코딩 영역에 삽입한 것을 제외하고 실시예 1의 절차를 반복하여 CrPV 유래의 IRES 서열을 가지는 핵산 분자 (pCrPV-HPV 18)를 제작하였다.
실험예 4: 면역 반응 분석
도 13에 도시한 면역 스케줄에 따라, 실시예 4와 실시예 5에서 제작된 핵산 분자를 마우스에 주입하고, 면역 스케줄에 따라 마우스로부터 혈액을 채취하여 면역 반응을 검토하였다. 크게 3개의 그룹으로 구분하였으며, 각각의 그룹에서 주입한 물질을 하기 표 3에 나타낸다. 10 가지 유형 (type 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52, 58)의 HPV capsid 단백질 (L1) 6 ug/mouse으로 formulation하여 mice에 면역하였다. 실시예 4와 5에서 각각 제작된 RNA 핵산 분자는 모두 20 ug/mouse로 면역하였으며, 모든 RNA는 10 ug의 protamine으로 formulation하여 (RNA: Protamine ratio = 2:1), 마우스에 면역하였다. 근육주사 (I.M.)시 volume은 100 ul/mouse 로 면역 (HPV 16형, 18형 L1 10 ug씩 섞음)하였다.
표 3. 그룹 별 주입된 화합물
Figure 112018042249240-pat00003
(1) 항체가 분석
이어서, 실험예 2 및 실험예 3과 동일한 절차에 따라 마우스 혈청 중에 항체가를 ELISA 기기를 이용하여 분석하였다. 분석 결과를 도 14, 15a 내지 15c, 16a 내지 16c에 나타낸다. 총 IgG 항체는 Th1 면역 반응의 유도를 의미한다 (innate immune response). pCrPV-HPV 16, 18을 혼합한 RNA 핵산 분자를 마우스에 면역하였고, 항원으로 사용한 HPV 타입에 관계 없이 10 가지 종류의 모든 HPV L1 단백질과 alum을 혼합하였을 때 면역하면 항체가가 보다 높게 관찰되었다.
(2) ELISPOT 분석
도 13에 도시된 면역 스케줄에 따라 2차 면역 후에 희생시킨 마우스의 비장에서 얻은 비장 세포 (1 x 106/100 ul/well/96 well plate)에 10 가지 타입의 human papillomavirus capsid protein (L1)과 16형, 18형 L1 protein을 각각 1 ug (well당)을 처리하여 stimulation한 후 2일 후 얻은 ELISPOT 분석하여, IFN-γ를 분비하는 T-세포의 개수를 측정하였다. 분석 결과를 도 17에 나타낸다. Protein stimulated IFN-γ ELISPOT 결과에서는 HPV L1 protein (+Alum)과 pCrPV-16,18 L1 RNA를 함께 처리하였을 때 I.M.으로 면역한 그룹 에서 HPV L1 protein specific IFN-γ secreted T cell population을 보여 주었다. 이는 RNA 핵산 분자를 주입한 그룹에서 CTL반응을 더 많이 일으킨다는 것을 의미한다.
한편, 도 18은 면역 스케줄에 따라 면역된 마우스의 혈청에서 Th1 면역 반응을 유도하는 사이토카인의 분비량을 ELISA로 분석한 결과를 나타낸다. RNA 핵산 분자로 면역한 그룹에서 Th1 면역 반응과 관련한 사이토카인의 분비량이 크게 증가한 것을 알 수 있다.
실시예 6: 이중 발현 카세트를 가지는 핵산 분자 제작
제 1 코딩 영역 및 제 2 코딩 영역의 ORF로서 MERS 스파이크 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 대신하여, 인플루엔자 바이러스의 Haemagglutin을 암호화하는 핵산 서열 (서열식별번호: 25)를 각각 사용한 것을 제외하고, 실시예 3의 절차를 반복하여 2개의 발현 카세트를 가지는 RNA 핵산 분자 (pCrPV-HA-EMCV-HA)를 제작하였다.
실시예 7: 이중 발현 카세트를 가지는 핵산 분자 제작
제 1 코딩 영역 및 제 2 코딩 영역의 ORF로서 MERS 스파이크 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 대신하여, 인플루엔자 바이러스의 Haemagglutin을 암호화하는 핵산 서열 (서열식별번호: 25)를 각각 사용하고, 제 1 IRES 서열로서 CrPV 유래의 IRES를 대신하여, CVB3 유래의 IRES를 포함하는 5'-UTR (서열식별번호: 3)을 사용하고, T7 promoter와 CVB3 유래의 5'-UTR 사이에 50개의 아데노신으로 전사될 수 있는 핵산 서열을 삽입하고, 2번째 코딩 영역의 3'쪽에 SV-40 폴리아데닐레이션 신호 서열을 대신하여 50개의 아데노신으로 전사될 수 있는 서열을 삽입한 것을 제외하고 실시예 3의 절차를 반복하여 2개의 발현 카세트를 가지는 RNA 핵산 분자 (pMA-CVB3-HA-EMCV-HA)를 제작하였다.
실험예 5: 면역 반응 검토
도 19에 도시한 바와 같은 면역 스케줄에 따라, 실시예 6에서 제작된 RNA 플랫폼의 핵산 분자 (pCrPV-HA-EMVC-HA)와 실시예 7에서 제작된 RNA 플랫폼의 핵산 분자 (pMA-CVB3-HA-EMCV-HA)를 마우스에 주입하고, 면역 스케줄에 따라 마우스로부터 혈액을 채취하여 면역 반응을 검토하였다. 비교를 위하여 PBS, inactivated PR8 influenza virus (iPR8; 서열식별번호: 26), Alum (aluminium hydroxide), protamine, LNP (lipid nano particle, 지질나노입자)도 동일한 면역 스케줄에 따라 마우스에 주입하였다.
면역 그룹은 하기 표 4와 같인 총 11개의 그룹으로 구분하였다. 2주 간격으로 총 3회의 면역을 수행하였고, ipR8 virus는 2.5 X 105 pfu/50 ul/mice로 처리하였고, alum은 5 ug 당 120 ug/mice을 넣어 formulation하여 마우스에 면역하였다. 면역에 사용된 RNA 플랫폼 형태의 폴리뉴클레오티드는 각각 50 ug/mice로 면역하였으며, 모든 RNA는 25 ug의 protamine으로 formulation하여 (RNA : Protamine ratio = 2 : 1) 마우스에 면역에 이용하였다. 또한, 근육 주사에서 면역 물질의 부피 (volume)는 LNP를 주입할 때 120 ul/mice인 것을 제외하면 모두 100 ul/mice이었고, 비강 주사에서 부피는 45 ul/mice로 수행되었다. 표 2 및 도 10에서 I.M은 근육주사 (Intramuscular Injection)를 통하여 마우스에 주입한 것을 의미하고, 표 2에서 I.N은 비강주사 (Intranasal Injection)를 통하여 마우스에 주입한 것을 의미하며, EP는 전기천공 (electroporation)을 통하여 마우스에 주입한 것을 의미한다.
표 4. 그룹 별 주입된 화합물
Figure 112018042249240-pat00004
(1) 중화항체가 측정
1차, 2차, 3차의 혈액 샘플에서 얻은 혈청 중의 면역 중화항체의 양을 실험예 2 내지 4에서 제시된 것과 동일한 방법을 사용하여 분석, 측정하였다. 각각의 그룹에서 생성된 전체 중화항체 (IgG)의 양을 ELISA를 통하여 분석하여 측정한 결과를 도 20에 나타낸다. 도 20을 참조하면, 1차 면역 후 2주 후에 채혈한 혈액에서는 ipR8 virus에 alum으로 formulation한 HA2를 제외하고는 1회 면역으로는 높은 항체가가 유도되지 않았다. 2차 면역 후 2주 후에 채혈한 혈액에 있는 항체가에서는 여전히 ipR8 virus에 alum으로 formulation한 HA2 그룹이 높은 항체가를 보여 주었으나, 2차 면역 (1차 boosting)에 의해서 ipR8 virus (HA1), ipR8 virus에 pCrPV-HA-EMCV-HA, pMA-CVB3-HA-EMCV-HA RNA를 adjuvant로 함께 면역한 HA3, HA4 그룹의 경우 항체가가 증가한 것을 알 수 있다. 3차 면역 후 8일 후 (약 2주 후)에 채혈한 혈액에 있는 항체가에서도 역시 HA1, HA2, HA3, HA4 그룹에서 높은 항체가를 나타내었다. 따라서, RNA 플랫폼 형태의 폴리뉴클레오티드를 adjuvant처럼 활용하여 alum이 formulation된 ipR8 virus과 함께 I.M.으로 면역하면 2회 면역 (1차 boosting)만으로도 충분한 항체가 유도될 수 있다는 것을 알 수 있다.
(2) ELISPOT 분석 (INF-γ)
3차 면역 8일 후 (약 2주) challenge를 수행하였고, challenge 4일 후 (확연한 체중감소가 일어났을 때) sacrifice한 마우스의 spleen으로부터 얻은 splenocyte (1 x 106/100 ul/well; 96 well plate)에 MHC I peptide와 recombinant pR8 protein을 2 ug (well당)을 처리하여 stimulation한 후 2일 후 얻은 HA specific TH1 cell (IFN-γ secretion)을 ELISPOT 분석하였다. Peptide는 pR8에 있는 T cell epitope 서열로서, 이 결과는 IFN-γ를 secretion하는 T cell의 population을 의미한다. 분석 결과를 도 19에 나타낸다. MHC I peptide로 stimulation 한 경우 ipR8 virus에 alum을 formulation한 HA2, ipR8 virus에 RNA를 adjuvant로써 함께 처리한 HA3, HA4 그룹의 경우 높은 수치의 IFN-γ secreted T cell population을 보여 주었다. RNA 단독으로 처리 (HA5, HA6)하거나 RNA에 protamine (HA 7, HA8)와 함께 처리한 경우 보다는 LNP (HA9, HA10)로 formulation을 한 경우에 RNA를 adjuvant로 ipR8 virus와 함께 처리한 경우에 비해서는 조금 낮은 수치이지만 높은 수치의 IFN-γ secreted T cell population을 보여 주었다.
(3) ELISPOT 분석 (IL-4)
3차 면역 8일 후 (약 2주) challenge를 수행하였고, challenge 4일 후 (확연한 체중감소가 일어났을 때) sacrifice한 마우스의 spleen으로부터 얻은 splenocyte (1 x 106/100 ul/well; 96 well plate)에 MHC I peptide와 recombinant pR8 protein을 2 ug (well당) 처리하여 stimulation한 후 2일 후 얻은 HA specific TH1 cell (IL-4 secretion) ELISPOT 분석하였다. 분석 결과를 도 22에 나타낸다. MHC I peptide stimulation한 경우 ipR8 virus에 alum을 formulation한 HA2 보다 ipR8 virus에 RNA를 adjuvant로써 함께 처리한 HA3, HA4 그룹의 경우 더 높은 수치의 IL-4 secreted T cell population을 보여 주었다.
(4) ELISPOT 분석 (IL-6)
3차 면역 8일 후 (약 2주) challenge를 수행하였고, challenge 4일 후 (확연한 체중감소가 일어났을 때) sacrifice한 마우스의 spleen으로부터 얻은 splenocyte (1 x 106/100 ul/well; 96 well plate)에 MHC I peptide와 recombinant pR8 protein을 2 ug (well당) 처리하여 stimulation한 후 2일 후 얻은 HA specific TH1 cell (IL-6 secretion)을 ELISPOT 분석하였다. 분석 결과를 도 23에 나타낸다. MHC I specific peptide mixture로 stimulation 하였을 때에, ipR8 virus에 RNA를 adjuvant로써 함께 처리한 경우에 RNA 단독으로 처리 (HA5, HA6)하거나 RNA에 protamine (HA 7, HA8)와 함께 처리한 경우보다 높은 수치의 IL-6 값을 나타내었다. LNP (HA9, HA10)로 formulation을 한 경우에는 아주 낮은 IL-6 값을 나타내었다. 특히, peptide stimulation 하였을 때는 positive control인 ipR8 virus를 alum과 함께 formulation을 이룬 그룹 (HA2)의 경우에는 IL-6 수치가 높지 않았다.
(5) ELISA 분석(INF-γ)
3차 면역 8일 후 (약 2주) challenge를 수행하였고, challenge 4일 후 (확연한 체중감소가 일어났을 때) sacrifice한 마우스의 spleen으로부터 얻은 splenocyte (2 x 106/200 ul/well; 96 well plate)에 MHC I specific peptide mixture, recombinant pR8 protein을 2 ug (well당) 처리하여 stimulation한 후 3일 후 얻은 culture supernant를 이용하여 cytokine ELISA를 수행하였다. 분석 결과를 도 24에 나타낸다. MHC I specific peptide mixture로 stimulation 하였을 때에는 ipR8 virus에 alum을 함께 formulation한 positive control 그룹보다 ipR8 virus와 함께 formulation하여 RNA adjuvant로서 작용하였을 때 월등히 높은 수치의 IFN-γ 값을 나타내었다. 즉, MHC I specific peptide mixturefh stimulation 하였을 때는 positive control인 iPR8 바이러스를 alum과 함께 formulation을 이룬 그룹의 경우에는 IFN-γ 수치가 높지 않았다. RNA에 protamine (HA 7, HA8)와 함께 처리 또는 LNP로 formulation 시에는 IFN-γ가 거의 secretion 되지 않았다.
상기에서는 본 발명의 예시적인 실시형태 및 실시예에 기초하여 본 발명을 설명하였으나, 본 발명이 상기 실시형태 및 실시예에 기재된 기술사상으로 한정되는 것은 아니다. 오히려 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 전술한 실시형태 및 실시예를 토대로 다양한 변형과 변경을 용이하게 추고할 수 있다. 하지만, 이러한 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 점은, 첨부하는 청구범위에서 분명하다.
<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> ADJUVANT COMPRISING NUCLEIC ACID MOLECULE INSERTED VIRAL EXPRESSION REGULATION SEQUENCE AND PHAMRACEUTICAL COMPOSITION HAVING THE ADJUVANT <130> 2463 <160> 29 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 189 <212> DNA <213> Cricket paralysis virus <400> 1 aaagcaaaaa tgtgatcttg cttgtaaata caattttgag aggttaataa attacaagta 60 gtgctatttt tgtatttagg ttagctattt agctttacgt tccaggatgc ctagtggcag 120 ccccacaata tccaggaagc cctctctgcg gtttttcaga ttaggtagtc gaaaaaccta 180 agaaattta 189 <210> 2 <211> 574 <212> DNA <213> Encephalomyocarditis virus <400> 2 cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 60 tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 120 gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 180 aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 240 aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 300 ctgcggccaa aagccacgtg 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tgggtgtccg tgtttcattt tattcctata ctggctgctt atggtgacaa 600 ttgagagatt gttaccatat agctattgga ttggccatcc ggtgtctaat agagctatta 660 tatatctctt tgttggattt ataccactta gcttgagaga ggttaaaaca ttacaattca 720 ttgttaaatt gaatacaaca aa 742 <210> 4 <211> 221 <212> DNA <213> Cricket paralysis virus <400> 4 agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca acaagaatgc agtgaaaaaa 60 atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa 120 taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggagatgtg 180 ggaggttttt taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt a 221 <210> 5 <211> 123 <212> DNA <213> Encephalomyocarditis virus <400> 5 tagtgtagtc actggcacaa cgcgttaccc ggtaagccaa tcgggtatac acggtcgtca 60 tactgcagac agggttcttc tactttgcaa gatagtctag agtagtaaaa taaatagata 120 gag 123 <210> 6 <211> 103 <212> DNA <213> Coxsackievirus B <400> 6 taaattagag acaatttgat ctgatttgaa ttggcttaac cctactgtac taaccgaact 60 agacaacggt gcagtagggg taaattctcc gcattcggtg cgg 103 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Bacteriophage T7 <400> 7 taatacgact cactatag 18 <210> 8 <211> 221 <212> DNA <213> Simian virus 40 <400> 8 agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca acaagaatgc agtgaaaaaa 60 atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa 120 taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggagatgtg 180 ggaggttttt taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt a 221 <210> 9 <211> 936 <212> DNA <213> Renilla reniformis <400> 9 atgacttcga aagtttatga tccagaacaa aggaaacgga tgataactgg tccgcagtgg 60 tgggccagat gtaaacaaat gaatgttctt gattcattta ttaattatta tgattcagaa 120 aaacatgcag aaaatgctgt tattttttta catggtaacg cggcctcttc ttatttatgg 180 cgacatgttg tgccacatat tgagccagta gcgcggtgta ttataccaga ccttattggt 240 atgggcaaat caggcaaatc tggtaatggt tcttataggt tacttgatca ttacaaatat 300 cttactgcat ggtttgaact tcttaattta ccaaagaaga tcatttttgt cggccatgat 360 tggggtgctt gtttggcatt tcattatagc tatgagcatc aagataagat caaagcaata 420 gttcacgctg aaagtgtagt agatgtgatt gaatcatggg atgaatggcc tgatattgaa 480 gaagatattg cgttgatcaa atctgaagaa ggagaaaaaa tggttttgga gaataacttc 540 ttcgtggaaa ccatgttgcc atcaaaaatc atgagaaagt tagaaccaga agaatttgca 600 gcatatcttg aaccattcaa agagaaaggt gaagttcgtc gtccaacatt atcatggcct 660 cgtgaaatcc cgttagtaaa aggtggtaaa cctgacgttg tacaaattgt taggaattat 720 aatgcttatc tacgtgcaag tgatgattta ccaaaaatgt ttattgaatc ggacccagga 780 ttcttttcca atgctattgt tgaaggtgcc aagaagtttc ctaatactga atttgtcaaa 840 gtaaaaggtc ttcatttttc gcaagaagat gcacctgatg aaatgggaaa atatatcaaa 900 tcgttcgttg agcgagttct caaaaatgaa caataa 936 <210> 10 <211> 4017 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MERS spike protein <400> 10 atgattcact ctgtgttcct gctgatgttc ctgctgacac caacagagtc ctatgtggat 60 gtgggacctg actctgtgaa gtctgcctgt attgaggtgg acatccaaca gaccttcttt 120 gacaagacct ggccaagacc aattgatgtg agcaaggctg atggcatcat ctacccacag 180 ggcaggacct acagcaacat caccatcacc taccagggac tgtttccata ccagggagat 240 catggagata tgtatgtcta ctctgctggt catgccacag gcaccacacc acagaaactg 300 tttgtggcta actacagcca ggatgtgaag cagtttgcca atggctttgt ggtgaggatt 360 ggagcagcag ccaacagcac aggcacagtg attatcagcc caagcacctc tgccaccatc 420 aggaagattt accctgcctt tatgctgggc tcctctgtgg gcaacttctc tgatggcaag 480 atgggcaggt tcttcaacca caccctggtg ctgctgcctg atggctgtgg caccctgctg 540 agggctttct actgtatctt ggaaccaagg tctggcaacc actgtcctgc tggcaactcc 600 tacacctcct ttgccaccta ccacacacct gccacagact gttctgatgg caactacaac 660 aggaatgcct ccctgaactc cttcaaggaa tacttcaacc tgaggaactg tacctttatg 720 tacacctaca acatcacaga ggatgagatt ttggagtggt ttggcatcac ccagacagcc 780 cagggagtgc atctgttctc gagcagatat gtggacctct atggaggcaa tatgttccag 840 tttgccaccc tgcctgtcta tgacaccatc aaatactaca gcatcatccc acacagcatc 900 aggagcatcc agtctgacag gaaggcttgg gctgccttct atgtctacaa actccaacca 960 ctgaccttcc tgctggactt ctctgtggat ggctacatca ggagggctat tgactgtggc 1020 ttcaatgacc tgagccaact tcactgttcc tatgagtcct ttgatgtgga gtctggagtc 1080 tactctgtgt cctcctttga ggctaagcca tctggctctg tggtggaaca ggctgaggga 1140 gtggagtgtg acttcagccc actgctgtct ggcacacctc cacaggtcta caacttcaag 1200 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actgcaggac tgtcctcctt tgctgccatc ccatttgccc agagcatctt ctacagactg 2940 aatggagtgg gcatcaccca acaggtgctg tctgagaacc agaaactgat tgccaacaag 3000 ttcaaccagg ctctgggagc tatgcagaca ggcttcacca ccaccaatga ggctttccag 3060 aaggtccagg atgctgtgaa caacaatgcc caggctctga gcaaactggc atctgaactg 3120 agcaacacct ttggagccat ctctgctagc attggagaca tcatccagag actggatgtg 3180 ttggaacagg atgcccagat tgacagactg ataaatggca gactgaccac cctgaatgcc 3240 tttgtggctc aacaacttgt gaggtctgag tctgctgccc tgtctgccca acttgccaag 3300 gacaaggtga atgagtgtgt gaaggctcaa agcaagaggt ctggcttctg tggacaaggc 3360 acccacattg tgtcctttgt ggtgaatgcc ccaaatggac tctactttat gcatgtgggc 3420 tactacccaa gcaaccacat tgaggtggtg tctgcctatg gactgtgtga tgctgccaac 3480 ccaaccaact gtattgcccc tgtgaatggc tacttcatca agaccaacaa caccaggatt 3540 gtggatgagt ggtcctacac aggctcctcc ttctatgccc ctgaaccaat cacctccctg 3600 aacaccaaat atgtggctcc acaggtgacc taccagaaca tcagcaccaa cctgcctcct 3660 ccactgctgg gcaacagcac aggcattgac ttccaggatg aactggatga gttcttcaag 3720 aatgtgagca ccagcatccc aaactttggc tccctgaccc agataaacac caccctgctg 3780 gacctgacct atgagatgct gtccctccaa caggtggtga aggctctgaa tgagtcctac 3840 attgacctga aagaactggg caactacacc tactacaaca agtggccatg gtacatctgg 3900 ctgggcttca tcgctggcct ggtggccctg gcgctgtgcg tgttcttcat cctgtgctgc 3960 accggctgcg gcaccaactg catgggcaag ctgaagtgca acaggtgctg cgactaa 4017 <210> 11 <211> 1338 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MERS spike protein <400> 11 Met Ile His Ser Val Phe Leu Leu Met Phe Leu Leu Thr Pro Thr Glu 1 5 10 15 Ser Tyr Val Asp Val Gly Pro Asp Ser Val Lys Ser Ala Cys Ile Glu 20 25 30 Val Asp Ile Gln Gln Thr Phe Phe Asp Lys Thr Trp Pro Arg Pro Ile 35 40 45 Asp Val Ser Lys Ala Asp Gly Ile Ile Tyr Pro Gln Gly Arg Thr Tyr 50 55 60 Ser Asn Ile Thr Ile Thr Tyr Gln Gly Leu Phe Pro Tyr Gln Gly Asp 65 70 75 80 His Gly Asp Met Tyr Val Tyr Ser Ala Gly His Ala Thr Gly Thr Thr 85 90 95 Pro Gln Lys Leu Phe Val Ala Asn Tyr Ser Gln Asp Val Lys Gln Phe 100 105 110 Ala Asn Gly Phe Val Val Arg Ile 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protein <400> 12 atgattcact ctgtgttcct gctgatgttc ctgctgacac caacagagtc ctatgtggat 60 gtgggacctg actctgtgaa gtctgcctgt attgaggtgg acatccaaca gaccttcttt 120 gacaagacct ggccaagacc aattgatgtg agcaaggctg atggcatcat ctacccacag 180 ggcaggacct acagcaacat caccatcacc taccagggac tgtttccata ccagggagat 240 catggagata tgtatgtcta ctctgctggt catgccacag gcaccacacc acagaaactg 300 tttgtggcta actacagcca ggatgtgaag cagtttgcca atggctttgt ggtgaggatt 360 ggagcagcag ccaacagcac aggcacagtg attatcagcc caagcacctc tgccaccatc 420 aggaagattt accctgcctt tatgctgggc tcctctgtgg gcaacttctc tgatggcaag 480 atgggcaggt tcttcaacca caccctggtg ctgctgcctg atggctgtgg caccctgctg 540 agggctttct actgtatctt ggaaccaagg tctggcaacc actgtcctgc tggcaactcc 600 tacacctcct ttgccaccta ccacacacct gccacagact gttctgatgg caactacaac 660 aggaatgcct ccctgaactc cttcaaggaa tacttcaacc tgaggaactg tacctttatg 720 tacacctaca acatcacaga ggatgagatt ttggagtggt ttggcatcac ccagacagcc 780 cagggagtgc atctgttctc gagcagatat gtggacctct atggaggcaa tatgttccag 840 tttgccaccc tgcctgtcta tgacaccatc aaatactaca gcatcatccc acacagcatc 900 aggagcatcc agtctgacag gaaggcttgg gctgccttct atgtctacaa actccaacca 960 ctgaccttcc tgctggactt ctctgtggat ggctacatca ggagggctat tgactgtggc 1020 ttcaatgacc tgagccaact tcactgttcc tatgagtcct ttgatgtgga gtctggagtc 1080 tactctgtgt cctcctttga ggctaagcca tctggctctg tggtggaaca ggctgaggga 1140 gtggagtgtg acttcagccc actgctgtct ggcacacctc cacaggtcta caacttcaag 1200 agactggtgt tcaccaactg taactacaac ctgaccaaac tgctgtccct gttctctgtg 1260 aatgacttca cttgtagcca gattagccct gctgccattg ccagcaactg ttactcctcc 1320 ctgattctgg actacttctc ctacccactg agtatgaagt ctgacctgtc tgtgtcctct 1380 gctggaccaa tcagccagtt caactacaag cagtccttca gcaacccaac ttgtctgatt 1440 ctggctacag tgccacacaa cctgaccacc atcaccaagc cactgaaata ctcctacatc 1500 aacaagtgta gcagactgct gtctgatgac aggacagagg tgccacaact agtgaatgcc 1560 aaccaataca gcccatgtgt gagcattgtg ccaagcacag tgtgggagga tggagactac 1620 tacaggaagc aacttagccc attggaggga ggaggctggc tggtggcatc tggcagcaca 1680 gtggctatga cagaacaact ccaaatgggc tttggcatca cagtccaata tggcacagac 1740 accaactctg tgtgtccaaa attggagttt gccaatgaca ccaagattgc cagccaactt 1800 ggcaactgtg tggaatactc cctctatgga gtgtctggca ggggagtgtt ccagaactgt 1860 actgctgtgg gagtgagaca acagaggttt gtctatgatg cctaccagaa cctggtgggc 1920 tactactctg atgatggcaa ctactactgt ctgagggctt gtgtgtctgt gcctgtgtct 1980 gtgatttatg acaaggagac caagacccat gccaccctgt ttggctctgt ggcttgtgaa 2040 cacatctcca gcacaatgag tcaatacagc aggagcacca ggagtatgct gaaaaggagg 2100 gacagcacat atggaccact ccaaacacct gtgggctgtg tgctgggact ggtgaactcc 2160 tccctgtttg tggaggactg taaactgcca ctgggacaat ccctgtgtgc cctgcctgac 2220 acaccaagca ccctgacacc aaggtctgtg aggtaa 2256 <210> 13 <211> 1564 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 16 <400> 13 atgagcctgt ggctgcccag cgaggccacc gtgtacctgc cccccgtgcc cgtgagcaag 60 gtggtgagca ccgacgagta cgtggccagg accaacatct actaccacgc cggcaccagc 120 aggctgctgg ccgtgggcca cccctacttc cccatcaaga agcccaacaa caacaagatc 180 ctggtgccca aggtgagcgg cctgcagtac 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11 <400> 16 Met Trp Arg Pro Ser Asp Ser Thr Val Tyr Val Pro Pro Pro Asn Pro 1 5 10 15 Val Ser Lys Val Val Ala Thr Asp Ala Tyr Val Lys Arg Thr Asn Ile 20 25 30 Phe Tyr His Ala Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr 35 40 45 Tyr Ser Ile Lys Lys Val Asn Lys Thr Val Val Pro Lys Val Ser Gly 50 55 60 Tyr Gln Tyr Arg Val Phe Lys Val Val Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe 65 70 75 80 Ala Leu Pro Asp Ser Ser Leu Phe Asp Pro Thr Thr Gln Arg Leu Val 85 90 95 Trp Ala Cys Thr Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val 100 105 110 Gly Val Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Tyr Asp Asp Val Glu Asn 115 120 125 Ser Gly Gly Tyr Gly Gly Asn Pro Gly Gln Asp Asn Arg Val Asn Val 130 135 140 Gly Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Met Val Gly Cys Ala Pro 145 150 155 160 Pro Leu Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Thr Gln Cys Ser Asn Thr Ser 165 170 175 Val Gln Asn Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Thr Ser Val Ile 180 185 190 Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asn Phe Ala 195 200 205 Asp Leu 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Gly Lys Tyr Thr Phe Trp Glu Val 435 440 445 Asp Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly 450 455 460 Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lys Ala Lys Pro Lys Leu Lys 465 470 475 480 Arg Ala Ala Pro Thr Ser Thr Arg Thr Ser Ser Ala Lys Arg Arg Lys 485 490 495 Val Lys Lys <210> 21 <211> 502 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 35 <400> 21 Met Ser Leu Trp Arg Ser Asn Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val 1 5 10 15 Ser Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Thr Arg Thr Asn 20 25 30 Ile Tyr Tyr His Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ile Lys Lys Gln Asp Ser Asn Lys Ile Ala Val Pro Lys 50 55 60 Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Lys Leu Pro Asp Pro 65 70 75 80 Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asp Pro Ala Ser Gln 85 90 95 Arg Leu Val Trp Ala Cys Thr Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro 100 105 110 Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp 115 120 125 Thr Glu Asn Ser Asn Lys Tyr Val Gly Asn Ser Gly Thr Asp Asn Arg 130 135 140 Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly 145 150 155 160 Cys Arg Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Thr Pro Cys Asn 165 170 175 Ala Asn Gln Val Lys Ala Gly Glu Cys Pro Pro Leu Glu Leu Leu Asn 180 185 190 Thr Val Leu Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met 195 200 205 Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Asp Val Pro Leu Asp Ile 210 215 220 Cys Ser Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Lys Met Val Ser Glu 225 230 235 240 Pro Tyr Gly Asp Met Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe 245 250 255 Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Thr Val Gly Glu Thr Val Pro 260 265 270 Ala Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Thr Thr Gly Thr Leu Pro Ser Thr Ser 275 280 285 Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala Gln Ile 290 295 300 Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn Asn Gly 305 310 315 320 Ile Cys Trp Ser Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg 325 330 335 Ser Thr Asn Met Ser Val Cys Ser Ala Val Ser 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Pro Pro Pro Ser Val Ala Arg Val Val 35 40 45 Asn Thr Asp Asp Tyr Val Ser Arg Thr Ser Ile Phe Tyr His Ala Gly 50 55 60 Ser Ser Arg Leu Leu Thr Val Gly Asn Pro Tyr Phe Arg Val Val Pro 65 70 75 80 Ser Gly Ala Gly Asn Lys Gln Ala Val Pro Lys Val Ser Ala Tyr Gln 85 90 95 Tyr Arg Val Phe Arg Val Ala Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Gly Leu 100 105 110 Pro Asp Ser Thr Ile Tyr Asn Pro Glu Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala 115 120 125 Cys Val Gly Met Glu Ile Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Ile Gly Leu 130 135 140 Ser Gly His Pro Phe Tyr Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Ser Ala His 145 150 155 160 Ala Ala Thr Ala Val Val Thr Gln Asp Val Arg Asp Asn Val Ser Val 165 170 175 Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile Leu Gly Cys Val Pro Ala Ile 180 185 190 Gly Glu His Trp Ala Lys Gly Thr Leu Cys Lys Pro Ala Gln Leu Gln 195 200 205 Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Lys Asn Thr Ile Ile Glu Asp 210 215 220 Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Tyr Gly Ala Met Asp Phe Ser Thr Leu 225 230 235 240 Gln Asp Thr Lys Cys Glu Val Pro Leu Asp 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<213> Human papillomavirus type 58 <400> 24 Met Val Leu Ile Leu Cys Cys Thr Leu Ala Ile Leu Phe Cys Val Ala 1 5 10 15 Asp Val Asn Val Phe His Ile Phe Leu Gln Met Ser Val Trp Arg Pro 20 25 30 Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val Pro Val Ser Lys Val Val 35 40 45 Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ser Arg Thr Ser Ile Tyr Tyr Tyr Ala Gly 50 55 60 Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly Asn Pro Tyr Phe Ser Ile Lys Ser 65 70 75 80 Pro Asn Asn Asn Lys Lys Val Leu Val Pro Lys Val Ser Gly Leu Gln 85 90 95 Tyr Arg Val Phe Arg Val Arg Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Gly Phe 100 105 110 Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala 115 120 125 Cys Val Gly Leu Glu Ile Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Val 130 135 140 Ser Gly His Pro Tyr Leu Asn Lys Phe Asp Asp Thr Glu Thr Ser Asn 145 150 155 160 Arg Tyr Pro Ala Gln Pro Gly Ser Asp Asn Arg Glu Cys Leu Ser Met 165 170 175 Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly Cys Lys Pro Pro Thr 180 185 190 Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Asn Asn 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Thr Tyr Ile 405 410 415 His Thr Met Asp Ser Asn Ile Leu Glu Asp Trp Gln Phe Gly Leu Thr 420 425 430 Pro Pro Pro Ser Ala Ser Leu Gln Asp Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser 435 440 445 Gln Ala Ile Thr Cys Gln Lys Thr Ala Pro Pro Lys Glu Lys Glu Asp 450 455 460 Pro Leu Asn Lys Tyr Thr Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe 465 470 475 480 Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln 485 490 495 Ser Gly Leu Lys Ala Lys Pro Arg Leu Lys Arg Ser Ala Pro Thr Thr 500 505 510 Arg Ala Pro Ser Thr Lys Arg Lys Lys Val Lys Lys 515 520 <210> 25 <211> 1698 <212> DNA <213> Influenza virus <400> 25 atgaaggcca acctgctcgt gctgctgtgc gccctcgcgg ccgccgacgc cgacaccatc 60 tgcatcggct accacgccaa caacagcacc gacacggtcg acaccgtgct ggagaagaac 120 gtgaccgtca cccactccgt gaacctgctc gaggacagcc acaacgggaa gctgtgccgg 180 ctgaagggca tcgcgcccct ccagctgggg aagtgcaaca tcgccggctg gctgctcggg 240 aacccggagt gcgaccccct gctgcccgtg cgctcctgga gctacatcgt cgagacgccc 300 aactccgaga acggcatctg ctacccgggc gacttcatcg actacgagga actccgggag 360 cagctgagtt ccgtgagttc cttcgagcgc ttcgagatct tccccaagga gagttcctgg 420 cccaaccaca acaccaacgg ggtgaccgcc gcctgcagcc acgagggcaa gtccagcttc 480 taccggaacc tgctctggct gaccgagaag gaggggtcct accccaagct gaagaacagc 540 tacgtcaaca agaagggcaa ggaggtgctc gtgctgtggg ggatccacca cccgcccaac 600 tccaaggagc agcagaacct gtaccagaac gagaacgcgt acgtcagcgt ggtgacgtcc 660 aactacaacc gccggttcac ccccgagatc gccgagcgcc ccaaggtccg ggaccaggcc 720 ggccgcatga actactactg gaccctcctg aagccgggcg acaccatcat cttcgaggcc 780 aacgggaacc tgatcgcccc gatgtacgcg ttcgccctca gccggggctt cgggagcggc 840 atcatcacgt ccaacgccag catgcacgag tgcaacacca agtgccagac ccccctgggc 900 gccatcaact ccagcctgcc ctaccagaac atccacccgg tgaccatcgg ggagtgcccc 960 aagtacgtgc gctccgccaa gctccggatg gtcacgggcc tgcgcaacaa ccccagcatc 1020 cagtcccggg ggctgttcgg cgcgatcgcc gggttcatcg agggcggctg gaccgggatg 1080 atcgacggct ggtacgggta ccaccaccag aacgagcagg gcagcgggta cgccgccgac 1140 cagaagtcca cccagaacgc catcaacggc atcaccaaca aggtgaacac ggtgatcgag 1200 aagatgaaca tccagttcac cgcggtcggc aaggagttca acaagctcga gaagcgcatg 1260 gagaacctga acaagaaggt ggacgacggg ttcctggaca tctggaccta caacgccgaa 1320 ctcctggtgc tgctcgagaa cgagcggacc ctggacttcc acgacagcaa cgtcaagaac 1380 ctgtacgaga aggtgaagtc ccagctcaag aacaacgcca aggagatcgg caacgggtgc 1440 ttcgagttct accacaagtg cgacaacgag tgcatggaga gcgtccgcaa cggcacgtac 1500 gactacccca agtactccga ggagagcaag ctgaaccggg agaaggtgga cggggtgaag 1560 ctggagtcca tgggcatcta ccagatcctc gccatctaca gcaccgtcgc ctccagcctg 1620 gtgctgctgg tgtccctcgg cgcgatcagc ttctggatgt gcagcaacgg gtccctgcag 1680 tgccgcatct gcatctga 1698 <210> 26 <211> 565 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 26 Met Lys Ala Asn Leu Leu Val Leu Leu Cys Ala Leu Ala Ala Ala Asp 1 5 10 15 Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Arg Leu Lys Gly Ile 50 55 60 Ala Pro Leu Gln Leu Gly Lys Cys Asn 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Claims (15)

  1. 귀뚜라미 마비바이러스(CrPV), 뇌심근염바이러스(EMCV), 콕사키바이러스B3(CVB3) 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 바이러스 유래의 내부리보솜결합부위 (Internal Ribosomal Entry Site; IRES) 활성을 가지는 염기 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 조절 서열과, 상기 적어도 하나의 발현 조절 서열과 작동 가능하게 연결되며, 바이러스성 항원을 암호화하는 (encoding) 적어도 하나의 코딩 영역을 가지는 핵산 분자를 포함하는 면역보강제.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 발현 조절 서열은 5‘-비번역영역 (5’untranslated Region; 5'-UTR)을 형성하고, 상기 핵산 분자는 상기 5'-UTR의 3'쪽에 위치하는 3'-비번역영역 (3‘-UTR)을 더욱 포함하며, 상기 코딩 영역은 상기 5'-UTR과 상기 3'-UTR 사이에 위치하는 면역보강제.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 바이러스 유래의 내부리보솜결합부위 활성을 가지는 염기 서열은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2 및 서열식별번호:3으로 구성되는 어느 하나의 염기 서열을 포함하는 면역보강제.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 바이러스성 항원은 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV), 인유두종바이러스(HPV) 및 인플루엔자바이러스로 구성되는 군에서 선택되는 바이러스에서 유래하는 면역보강제.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 발현 조절 서열의 5' 말단에 인접하여 20 내지 400개의 아데노신 또는 20 내지 400개의 아데노신으로 전사될 수 있는 뉴클레오티드가 삽입되어 있는 면역보강제.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 핵산 분자는,
    귀뚜라미 마비바이러스(CrPV), 뇌심근염바이러스(EMCV), 콕사키바이러스B3(CVB3) 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 바이러스 유래의 제 1 바이러스성 내부리보솜결합부위 염기 서열을 포함하는 제 1 발현 조절 서열과, 상기 제 1 발현 조절 서열과 작동 가능하게 연결되며, 바이러스성 항원을 암호화하는 제 1 코딩 영역으로 이루어진 제 1 발현 유닛과,
    상기 제 1 발현 조절 서열의 3'쪽에 위치하며, 귀뚜라미 마비바이러스(CrPV), 뇌심근염바이러스(EMCV), 콕사키바이러스B3(CVB3) 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 바이러스 유래의 제 2 바이러스성 내부리보솜결합부위 염기 서열을 포함하는 제 2 발현 조절 서열과, 상기 제 2 발현 조절 서열과 작동 가능하게 연결되며, 바이러스성 항원을 암호화하는 제 2 코딩 영역으로 이루어진 제 2 발현 유닛을 포함하는 면역보강제.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 제 1 발현 조절 서열과, 상기 제 2 발현 조절 서열 중에서 선택되는 적어도 하나의 발현 조절 서열의 5' 말단에 인접하여 20 내지 400개의 아데노신 또는 아데노신으로 전사될 수 있는 뉴클레오티드가 삽입되어 있는 면역보강제.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 RNA인 면역보강제.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 코딩 영역은 클로닝 사이트를 포함하는 면역보강제.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 코딩 영역은 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 12, 서열식별번호:13, 서열식별번호:14 및 서열식별번호:25로 구성되는 어느 하나의 염기서열을 포함하는 면역보강제.
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