KR20230053998A - mRNA 발현을 위한 유전자 구조체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 mRNA 발현을 위한 유전자 구조체, 상기 유전자 구조체를 포함하는 약제학적 조성물, 백신 조성물 및 유전자 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 코로나바이러스 (SARS-CoV-2: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 유래 5' 비번역 영역 (UTR) 및/또는 3' 비번역 영역 (UTR)을 포함하는 유전자 구조체, 상기 유전자 구조체를 포함하는 약제학적 조성물, 백신 조성물 및 유전자 치료용 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 mRNA 발현을 위한 유전자 구조체, 상기 유전자 구조체를 포함하는 약제학적 조성물, 백신 조성물 및 유전자 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 코로나바이러스 유래 5' 비번역 영역 (UTR) 및/또는 3' 비번역 영역 (UTR)을 포함하는 유전자 구조체, 상기 유전자 구조체를 포함하는 약제학적 조성물, 백신 조성물 및 유전자 치료용 조성물에 관한 것이다.
유전자 치료제는 기존의 유전자에 새로운 정보를 부가, 수정, 삭제하여 유전자를 환자의 세포에 플라스미드 DNA (plasmid DNA: pDNA), mRNA (messenger RNA) 상태로 전달해 병의 치료 또는 예방을 수행하는 치료제로써 개발되어 왔다 (Dunbar, C. E et al., Science 2018 1:12).
유전자 치료제의 목적은 유전 질환이나 희귀한 질병을 앓고 있는 사람의 유전적 결함을 교정해 병을 완치하는 것이다. 최근 기술 혁신과 연구개발 투자로 인해 전 세계 유전자 치료제 시장은 연평균 10% 수준으로 성장하고 있고 이에 유전자 치료제는 새로운 제약시장의 블루칩으로 부상하고 있으며 그 중 mRNA는 백신 개발 및 단백질 대체 치료제 분야에서 유망한 치료 도구로 떠오르고 있다. 유전자 치료제의 원리는 유전자를 pDNA, mRNA 상태로 바이러스, 리포좀, 안티-센스 기술 등을 이용해 세포 내에 유입시켜 치료제로써 기능을 하게 하는 것이다 (Dunbar, C. E et al., Science 2018 1:12).
mRNA 치료제는 안정성, 효율성, 생산성면에서 DNA 치료제나 virus 치료제 등을 능가하는 장점이 있다. 첫번째로 mRNA는 세포질에서 발생하기 때문에 감염 또는 genomic DNA 삽입에 의한 돌연변이가 발생할 확률이 낮아진다. 두번째, mRNA는 세포질 내에서 다양한 변형이 가능하기 때문에 반감기를 조절하거나 번역되는 단백질의 양을 증가시켜 세포내 안정성을 증가시킬 수 있다. 세번째로 mRNA는 in vitro 실험에 용이하기 때문에 신속한 개발 및 GMP 생산이 가능하며 대량 생산이 용이하다는 이점이 있다 (Wang, Y., Su et al. Molecular therapy 2013 358-367).
mRNA란 DNA의 유전정보를 리보솜에 전달하여 mRNA에 의한 번역 과정을 거쳐 단백질 발현을 시키는 RNA이다. 치료제 또는 백신 개발을 목적으로 재조합 되는 mRNA는 T7, SP6 등 (이에 한정되지는 않음) 프로모터와 RNA 중합효소에 의해 선형 DNA로부터 만들어진 후, 시험관 내 전사 (in vitro transcription)에 의해 5'캡핑 (capping) 과 폴리 A 아데닐화 (poly A tailing)이 일어난다. 이렇게 만들어진 mRNA는 세포질 내 성숙한 mRNA와 유사한 구조로 5'캡핑, 5' UTR (untranslated region), 3' UTR, poly A, 발현하고자 하는 표적 유전자로 구성된다. 이 중 비번역 부위 (5' 또는 3' untranslated region)는 이 서열이 무엇인지에 따라 mRNA의 안정성과 번역 활성화에 영향을 주어 반감기와 발현량이 증가한다. 또한, Poly A는 세포질 내 mRNA의 분해를 막아 안정성을 높이고 발현량을 증가시킨다. 따라서 mRNA 치료제가 체내에서 효율적이고 안정적으로 단백질을 발현하기 위해서는 최적의 비번역 부위 서열과 poly A 길이를 찾는 것이 중요하다 (Pardi, N et al,. Nature reviews 2018 261-279).
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 코로나바이러스 (SARS-CoV-2) 유래 5' 비번역 영역 (UTR) 및/또는 3' 비번역 영역 (UTR)을 포함하는 유전자 구조체를 개발하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 코로나바이러스 유래 5' 비번역 영역 (UTR) 및/또는 3' 비번역 영역 (UTR)을 포함하는 유전자 구조체를 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 상기 유전자 구조체를 포함하는 벡터를 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 상기 유전자 구조체를 포함하는 약제학적 조성물 을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 상기 유전자 구조체를 포함하는 백신 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적은 상기 유전자 구조체를 포함하는 유전자 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 타겟 유전자의 mRNA 발현을 위한 코딩 영역 (coding region); 상기 코딩 영역의 상류 (upstream)에 위치하는 5' 비번역 영역 (UTR); 및 상기 코딩 영역의 하류 (downstream)에 위치하는 3' 비번역 영역 (UTR)을 포함하는 유전자 구조체로, 상기 5' 비번역 영역 (UTR)은 코로나바이러스의 리더 서열을 포함하는 유전자 구조체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유전자 구조체를 포함하는 유전자 구조체를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유전자 구조체를 포함하는 유전자 구조체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 유전자 구조체를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유전자 구조체를 포함하는 유전자 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 유전자 구조체를 통해 증가된 단백질 생산을 제공할 수 있는 mRNA 발현할 수 있다. 이를 통해 백신 또는 유전자 치료에 사용할 수 있는 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 코로나 바이러스 구조 및 SARS-CoV-2 유전체 및 서브 게놈 (subgenomic) RNA 발현에 대한 모식도이다. (A)는 코로나 바이러스 외형 및 각 단백질의 mRNA 양을 노던블럿으로 분석한 것이다. (B)는 SARS-CoV-2의 게놈 (genomic) RNA 구조 및 이로부터 발현되는 대표적인 서브 게놈 RNA들을 나타낸 것이다.
도 2는 mRNA 발현을 위한 주형 DNA에 대한 모식도이다.
도 3은 EGFP 유전자의 mRNA 발현을 위해 주형 DNA를 PCR 방법으로 제작하는 과정을 나타낸 것이다.
도 4는 SARS-CoV-2 N 유전자의 mRNA 발현을 위해 주형 DNA를 PCR 방법으로 제작하는 과정을 나타낸 것이다.
도 5는 사람 ADCYAP1 유전자의 mRNA 발현을 위해 주형 DNA를 PCR 방법으로 제작하는 과정을 나타낸 것이다.
도 6은 IVT (In vitro transcription) 방법으로 대조군 (control), EGFP, ADCYAP1 및 N 유전자의 mRNA 발현을 확인한 것이다.
도 7은 도 6에서 제작된 GFP mRNA를 HeLa 세포주에 트랜스팩션하여 GFP 단백질 발현을 이미지와 웨스턴 블럿으로 확인한 것이다.
도 8은 도 6에서 제작된 ADCYAP1 유전자 mRNA를 HeLa 세포주에 트랜스팩션하여 ADCYAP1 단백질이 발현되어 자궁궁경부암 세포의 생장억제 및 웨스턴 블럿으로 확인한 것이다.
도 9는 도 6에서 제작된 N 유전자 mRNA를 HeLa 세포주에 트랜스팩션하여 ADCYAP1 단백질이 발현되어 자궁경부암 세포의 생장억제 및 웨스턴 블럿으로 확인한 것이다.
도 2는 mRNA 발현을 위한 주형 DNA에 대한 모식도이다.
도 3은 EGFP 유전자의 mRNA 발현을 위해 주형 DNA를 PCR 방법으로 제작하는 과정을 나타낸 것이다.
도 4는 SARS-CoV-2 N 유전자의 mRNA 발현을 위해 주형 DNA를 PCR 방법으로 제작하는 과정을 나타낸 것이다.
도 5는 사람 ADCYAP1 유전자의 mRNA 발현을 위해 주형 DNA를 PCR 방법으로 제작하는 과정을 나타낸 것이다.
도 6은 IVT (In vitro transcription) 방법으로 대조군 (control), EGFP, ADCYAP1 및 N 유전자의 mRNA 발현을 확인한 것이다.
도 7은 도 6에서 제작된 GFP mRNA를 HeLa 세포주에 트랜스팩션하여 GFP 단백질 발현을 이미지와 웨스턴 블럿으로 확인한 것이다.
도 8은 도 6에서 제작된 ADCYAP1 유전자 mRNA를 HeLa 세포주에 트랜스팩션하여 ADCYAP1 단백질이 발현되어 자궁궁경부암 세포의 생장억제 및 웨스턴 블럿으로 확인한 것이다.
도 9는 도 6에서 제작된 N 유전자 mRNA를 HeLa 세포주에 트랜스팩션하여 ADCYAP1 단백질이 발현되어 자궁경부암 세포의 생장억제 및 웨스턴 블럿으로 확인한 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
최근 전 세계적으로 유행하고 있는 COVID-19는 코로나바이러스의 변종인 SARS-CoV-2 감염에 의 한 것으로, 코로나바이러스는 N (nucleocapsid) 단백질이 감싸고 있는 약 30 kb 정도의 (+) RNA를 유전체로 지니고 있으며, 그 위를 M (membrane) 단백질과 E (envelope) 단백질이 지질과 함께 막을 이루고 있고 바깥쪽으로 스파이크 (spike) 단백질이 돌출되어 있어 흡사 왕관 모양과 같은 외형을 이루고 있다 (도 1).
코로나 바이러스 유전체 (Genomic RNA)는 감염 후 세포 속으로 들어가 곧바로 mRNA 역할을 수행하여 앞쪽 상단 부위에 위치하고 있는 orf1b (open reading frame 1b)에서 전사 (transcription)가 일어나 RdRP (RNA dependent RNA Polymerase)를 생산해 낸다. RdRP는 RNA를 주형으로 RNA를 합성할 수 있는 효소이다 (Imbert et al., EMBO Journal, 2006, 25:4933-4942).
따라서, RdRP는 세포로 들어간 게놈 RNA (genomic RNA)를 주형으로 삼아 복제 (replication) 과정을 거쳐 같은 길이의 음성 가닥 게놈 RNA (negative strand (-) genomic RNA)를 합성해 낸다. 이렇게 만들어진 (-) 게놈 RNA는 다시 전사를 위한 주형 (template) 역할을 하여 여러 가지 단백질을 생성해 낼 수 있는 각종 mRNA 만들어 낸다.
코로나 바이러스의 전사기전 (transcriptional mechanism) 모델은 아직도 분명히 확립되어 있지는 않았으나, 감염 후 바이러스 생활사를 보면 세포 안에는 필요한 단백질들 (S, E, M, N)을 만들어 내기 위해 필요한 mRNA 역할을 수행하는 여러 개의 서브게놈 RNA (subgenomic RNA)들이 존재하고 있다고 알려져 있다 (Krzysztof Pyrc et al., Virology Journal 2004, 1:7).
구조적 특징을 보면 모든 서브게놈 RNA들은 길이가 다르지만 뒤쪽 (3'말단) 부위는 모두가 게놈 RNA와 공통적인 3' UTR 부위를 지니고 있다.
또한, 게놈 RNA 앞쪽 (5'말단)에는 짧은 길이 (약 75 nucleotides)의 염기서열로 구성된 리더 서열 (Leader Sequence)이 존재하는데 이 또한 특징적으로 모든 서브게놈 RNA들의 앞쪽에 추가되어 있다. 특징적인 것은 모든 서브게놈 RNA들은 단백질을 만드는 코딩 서열과 리더 서열 사이에 유전자간 (intergenic) 서열을 가지고, 리더서열과 유전자간 (intergenic) 서열은 단백질 발현시에 리보좀이 인식할 수 있는 5' UTR로 작용하며, 모든 서브게놈 RNA들의 3' 말단에는 3' UTR 서열을 포함하고 있다.
따라서, 5' UTR로 작용할 수 있는 SARS-CoV-2 리더서열 및 유전자간 (intergenic) 서열을 연결하고, 바로 뒤에 발현하고자 하는 유전자의 코딩 서열 및 SARS-CoV-2의 3' UTR 서열 및 polyA 서열을 연결시킨 mRNA를 제작하여 세포에 도입시키면 원하는 단백질을 발현시킬 수 있음을 확인하였다 (도 1). 또한 사용가능한 5' UTR로는 인간 코로나바이러스 229E, OC43, HKU1, NL63, SARS-1, MERS 유래의 리더 서열도 가능하다.
이 때 in vitro에서 원하는 타겟 유전자의 mRNA의 발현을 위해 상기 서열의 5' 말단에 프로모터 서열 (T7, SP7 등)을 연결하여 IVT (in vitro transcription) 방법으로 타겟 유전자의 mRNA를 제작할 수 있다.
이를 바탕으로, 본 발명은 타겟 유전자의 mRNA 발현을 위한 코딩 영역 (coding region); 상기 코딩 영역의 상류 (upstream)에 위치하는 5' 비번역 영역 (UTR); 및 상기 코딩 영역의 하류 (downstream)에 위치하는 3' 비번역 영역 (UTR)을 포함하는 유전자 구조체로, 상기 5' 비번역 영역 (UTR)은 코로나바이러스의 리더 서열을 포함하는 유전자 구조체에 관한 것이다.
상기 리더 서열과 관련하여, 코로나바이러스 중 게놈 RNA와 전사 발현된 서브 게놈 mRNA (subgenomic mRNA)들은 5' 말단에 약 72~77 bp로 구성된 리더 서열을 공통으로 가지고 있으며, 이는 코로나바이러스의 독특한 특징으로서 바이러스 서열 중 감염세포에서 가장 풍부하게 존재하는 타겟이다. 이는 코로나바이러스의 모든 서브 게놈 RNA는 게놈 RNA의 5' 말단로부터 유도된 약 72 bp에 해당하는 리더 서열 (leader RNA)이 각 서브 게놈 RNA의 5' 말단에 결합하는 리더 조이닝 (leader joining) 현상을 나타내기 때문이다.
따라서, 리더 서열은 세포내에서 바이러스 유전자 중 가장 복제수가 높으며, N 단백질을 코딩하는 서브 게놈 RNA의 복제수가 그 다음으로 높다.
구체적으로, 상기 5' 비번역 영역 (UTR)은 서열번호 1로 표시되는 코로나바이러스 (SARS-CoV-2: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)의 리더 서열을 포함하는 유전자 구조체에 관한 것이다.
상기 리더 서열은 서열번호 1 (ATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAACAAACCAACCAACTTTCGATCTCTTGTAGATCTGTTCTCTAAACG)로 표시되는 서열을 포함한다.
본 명세서의 "핵산"은 바람직하게 DNA 또는 RNA를 의미한다. 상기 핵산과 관련하여, "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드", "뉴클레오티드 서열", 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용된다. 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머 형태, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이들의 유사체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며, 공지된 또는 비공지된 임의의 기능을 수행할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 예컨대, 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 폴리머의 어셈블리 전 또는 후에 가능할 수 있다.
바람직하게 핵산은 당/인산 백본의 포스포디에스터 결합에 의해 서로 공유결합된 뉴클레오티드 모노머를 포함 또는 이로 이루어진 폴리머이다. "핵산"은 염기 변형된, 당 변형된 또는 백본 변형된 DNA 또는 RNA 분자와 같은, 변형된 핵산을 포함한다.
상기 DNA는 디옥시리보핵산(deoxyribonucleicacid)에 대한 약어이다. 이는 핵산 분자, 즉 뉴클레오티드로 이루어진 폴리머이다. 이들 뉴클레오티드는 보통 디옥시-아데노신-모노포스페이트, 디옥시-티미딘-모노포스페이트, 디옥시-구아노신-모노포스페이트 및 디옥시-시티딘-모노포스페이트 모노머이며, 당 (디옥시리보스), 염기 및 포스페이트로 이루어지고, 특유의 백본(backbone) 구조에 의해 중합된다. 백본 구조는 전형적으로 첫째 뉴클레오티드의 당 일부, 즉 디옥시리보스 및 둘째 포스페이트 일부, 인접한 모노머 사이의포스포디에스터 결합에 의해 형성된다. 모노머의 특정한 순서, 즉 당/포스페이트 백본에 연결된 염기들의 순서는 DNA 서열로 불린다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥 형태에서 첫번째 가닥의 뉴클레오티드는 전형적으로 두번째 가닥의 뉴클레오티드와 혼성화하며, 예를 들어 A/T 염기쌍 및 G/C 염기쌍에 의한다.
상기 RNA는 예를 들어 mRNA를 포함한다. RNA는 보통 리보핵산의 약어이다. 이는 핵산 분자, 즉 뉴클레오티드로 이루어진 폴리머이다. 뉴클레오티드는 보통 소위 백본을 통해 서로 연결된 아데노신-모노포스페이트, 우리딘-모노포스페이트, 구아노신-모노포스페이트 및 시티딘 모노포스페이트 모노머이다. 백본은 첫번째로 당, 예를 들어 리보스 및 두번째로 인접 모노머, 포스페이트 일부 사이의 포스포디에스터 결합에 의해 형성된다. 모노머들의 특이적인 연속은 RNA 서열로 불린다. 보통 RNA는 DNA 서열의 전사에 의해, 예를 들어 세포 내에서 얻어질 수 있다. 진핵 세포에서, 전사는 전형적으로 핵 또는 미토콘드리아 내에서 수행된다. 체내에서, DNA의 전사는 보통 mRNA, 메신저 RNA로 가공될 수 있다. 예를 들어 진핵세포 내에서 RNA의 가공은 스플라이싱, 5'-캡핑, 폴리아데닐화, 핵 또는 미토콘드리아 및 그와 유사한 것으로부터 배출과 같은 다른 다양한 전사후 변형을 포함한다. 메신저 RNA는 보통 특정한 펩타이드 또는 단백질의 아미노산 서열로 번역될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 전형적으로, mRNA는 5'-캡, 5'UTR, 오픈 리딩 프레임, 3'UTR 및 폴리(A) 서열을 포함한다. 메신저 RNA를 제외하고, 전사 및/또는 번역의 조절에 포함될 수 있는 RNA의 몇몇 비코딩 형태가 존재한다.
5'UTR은 오픈 리딩 프레임의 5'에 위치한다. 5'UTR은 전사 시작 부위에서 시작하고 오픈 리딩 프레임의 시작 코돈 전 뉴클레오티드에서 종결된다. 5'UTR은 예를 들어 리보솜 결합 부위와 같은 유전자 발현을 조절하는 요소를 포함할 수 있다. 5'UTR은 예를 들어 5'-캡의 추가에 의해 전사후 변형될 수 있다. 5'UTR은 5'캡 및 시작 코돈 사이에 위치한 성숙 mRNA의 서열에 상응한다.
상기 5' 비번역 영역 (UTR)은 SARS-CoV-2 리더서열 및 유전자간 (intergenic) 서열을 연결한 것으로, 서열번호 2 내지 서열번호 4로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
3'UTR은 전형적으로 mRNA의 단백질 코딩 영역(즉 오픈 리딩 프레임) 및 폴리(A) 서열 사이에 위치한 mRNA의 일부이다. mRNA의 3'UTR은 아미노산 서열로 번역되지 않는다. 3'UTR 서열은 보통 유전자 발현 과정 중에 각각 mRNA로 전사되는 유전자에 의해 코딩된다. 유전체 서열은 선택적 인트론을 포함하는 mRNA로 우선 전사된다. mRNA는 이후 5'캡핑, 스플라이싱 및 3'-말단의 폴리아데닐화와 같은 3'-말단의 변형 및 선택적 엔도- 또는 엑소뉴클레아제 분해 등의 단계를 포함한다. 3'UTR은 단백질 코딩 영역의 정지 코돈 3' 바로 옆에 위치하고 폴리(A) 서열 5' 바로 옆의 뉴클레오티드를 포함한다.
상기 3' 비번역 영역 (UTR)은 SARS-CoV-2의 3' UTR 서열을 포함할 수 있으며, 서열번호 5의 서열을 포함할 수 있다.
전형적으로 펩타이드 또는 단백질로 번역될 수 있는 몇몇 뉴클레오티드 트리플렛(triplets)의 서열일 수 있다. 오픈 리딩 프레임은 바람직하게는 시작 코돈, 즉 이의 5'-말단에 아미노산 메티오닌(ATG 또는 AUG)을 일반적으로 코딩하는 세개의 후속 뉴클레오티드의 조합 및 보통 3 뉴클레오티드의 배수인 길이를 보이는 후속 영역을 포함한다. ORF는 바람직하게는 정지 코돈(예를 들어 TAA, TAG, TGA)에 의해 종결된다. 이는 오픈 리딩 프레임의 유일한 정지 코돈이다. 따라서 본 발명의 맥락에서 오픈 리딩 프레임은 바람직하게는 시작 코돈(예를 들어 ATG 또는 AUG)로 시작하고 바람직하게는 정지 코돈(예를 들어 TAA, TGA, 또는 TAG 또는 UAA, UAG, UGA, 각각)으로 종결되는, 세개로 나뉠 수 있는 뉴클레오티드의 수로 이루어진 뉴클레오티드 서열이다. 오픈 리딩 프레임은 분리 또는 보다 긴 핵산 서열, 예를 들어 벡터 또는 mRNA에 병합될 수 있다. 오픈 리딩 프레임은 또한 '폴리펩티드 또는 단백질 코딩 영역'으로 불릴 수 있다.
본 발명에 따르면, 프로모터 및/또는 폴리(A) 서열을 추가로 포함할 수 있다.
상기 프로모터는 5' 비번역 영역 (UTR)의 상류에 위치할 수 있다. 상기 프로모터는 예를 들어 RNA 중합효소 프로모터와 같은, 전사를 위해 필요한 요소를 포함할 수 있다. SP6 또는 T7과 같은 파지 RNA 중합효소 프로모터, 바람직하게는 mRNA 서열을 코딩하는 T7 프로모터를 포함할 수 있다.
상기 폴리(A) 서열의 길이는 다양할 수 있다. 예를 들어, 폴리(A) 서열은 약 20 아데닌 뉴클레오티드 내지 약 300 아데닌 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 40 내지 약 200 아데닌 뉴클레오티드, 약 60, 70, 80, 90 또는 100 아데닌 뉴클레오티드와 같이 더욱 바람직하게는 약 50 내지 약 100 아데닌 뉴클레오티드와 같이, 약 20 아데닌 뉴클레오티드 내지 약 400 아데닌 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다.
폴리(A) 서열은 3' 비번역 영역 (UTR)의 하류에 위치할 수 있다. 예를 들어, 폴리(A) 서열은 직접 또는 링커를 통해, 예를 들어 1-50, 바람직하게는 1-20 뉴클레오티드의 링커를 통해, 또는 2, 4, 6, 8, 10, 20 등 뉴클레오티드와 같은, 뉴클레오티드의 스트레치를 통해 연결될 수 있다.
구체적 실시예에서, 본 발명에 따른 유전자 구조체는 5'-에서-3'-방향으로 5'-프로모터-5'UTR-코딩 영역 (ORF)- 3'UTR-폴리(A)의 구조를 포함할 수 있다. 구체적으로, SARS-CoV-2의 5'UTR 및 3'UTR 서열을 이용해 타겟 유전자의 mRNA를 In vitro transcription (IVT) 방법으로 발현 시키기 위한 것으로 구체적으로는 5'-T7 프로모터-5'UTR-타겟 유전자-3'UTR-poly A의 서열로 구성된 주형 DNA를 제작할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 유전자 구조체를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 상기 벡터는 발현 벡터, 클로닝 벡터 등일 수 있다. 상기 벡터는 mRNA, 또는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질과 같은 발현 생산물의 생산에 사용될 수 있다. 상기 프로모터 서열, 예를 들어 RNA 프로모터 서열과 같은 벡터의 서열 스트레치의 전사에 필요한 서열을 포함할 수 있다. 상기 벡터는 예를 들어 RNA 벡터 또는 DNA 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터일 수 있다.
상기 벡터는 원형 분자일 수 있고, 벡터는 이중가닥 분자를 포함할 수 있다. 원형, 이중 가닥 DNA 분자는 독창적 인공 핵산 분자에 저장 형태로써 용이하게 사용될 수 있다. 세포, 예를 들어 배양된 세포의 형질전환에 사용될 수 있다. 인공 RNA 분자의 획득을 위해 체외 전사를 위해 사용될 수 있다. 상기 원형 벡터는 예를 들어 제한 효소 절단에 의해 선형화될 수 있다.
경우에 따라서, 상기 백터는 클로닝 부위, 항생제 저항성 인자와 같은 선별 마커, 및 복제 원점과 같은 벡터의 증폭에 적합한 서열을 포함할 수 있다.
상기 벡터는 진핵 세포, 원핵 세포, 또는 진핵, 원핵, 바이러스 또는 파지 체외 전사 시스템과 같은, 진핵 생물, 원핵 생물, 바이러스 또는 파지 전사 시스템을 사용하는 전사에 적합하다. 경우에 따라서, 벡터는 체외 전사 시스템에 기초한 T7 RNA 중합효소와 같은, 체외 전사 시스템에 기초한 파지를 사용하는 체외 전사에 적합하다.
상기 벡터는 미세주입법 (microinjection), 전기천공법 (electroporation), DEAE-덱스트란 처리, 리포펙션 (lipofection), 나노파티클-매개 형질주입, 단백질 전달 도메인 매개 도입, 및 PEG-매개 형질주입 등과 같은 당업계의 다양한 방법에 의해 세포로 전달될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 벡터로 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 등 공지의 발현 벡터를 사용할 수 있으며, 백터는 DNA 재조합 기술을 이용한 임의의 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 숙주세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태로 핵산을 포함할 수 있으며, 이는 재조합 발현 벡터가 발현을 위해 사용되도록 즉, 발현될 핵산 서열에 작동 가능하게-연결되도록 숙주세포를 기반을 선택될 수 있는 하나 이상의 조절 요소를 포함함을 의미한다.
재조합 발현 벡터 내에서, "작동 가능하게 연결된"은 관심 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로(예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 벡터가 숙주세포 내로 도입되는 경우 숙주세포에서) 조절 요소에 연결됨을 의미한다.
재조합 발현 벡터는 T7 promoter를 포함하여 메신저 RNA 합성에 적합한 형태를 포함할 수 있으며, 이는 기내에서 mRNA 합성을 할 수 있도록, 즉, T7 polymerase에 의해 메신저 RNA가 합성될 수 있는 하나 이상의 조절 요소를 포함함을 의미한다.
"조절 요소"는 프로모터, 인핸서, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 및 기타 발현 조정 요소(예를 들어, 전사 종결 신호 예컨대, 폴리아데닐화 신호 및 폴리-U 서열)을 포함할 수 있다. 조절 요소는 많은 유형의 숙주세포에서 뉴클레오티드 서열의 유도 또는 항상 발현을 지시하는 요소 및 특정 숙주세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 요소(예를 들어, 조직-특이적 조절 서열)를 포함한다.
구체적으로, 서열번호 18 또는 19의 서열을 포함하는 유전자 구조체를 포함할 수 있다.
상기 핵산은 리보핵산, 예를 들어 메신저 리보핵산 mRNA 형태로 주입될 수 있다. 본 발명에 따른 핵산은 mRNA 형태일 수 있다. 이를 통해 일시적 단백질 발현 (transient protein expression)될 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 유전자 구조체를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 유전자 구조체를 포함하는 유전자 치료용 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물에서 발현된 mRNA를 전달하기 위한 전달 수단을 포함할 수 있다.
발현된 mRNA는 나노입자를 통해 전달될 수 있다. 예를 들어, 금 나노입자를 통해 전달될 수 있다.
상기 금 나노입자는 표면이 변형될 수 있다. 변형에 대한 구체적 예시는 Acc Chem Res. 2019 June 18; 52(6): 1496-1506. 및 Pharmaceutics 2021, 13, 900. 등에 구체적으로 예시되어 있으며, 본 발명에 참조로서 도입될 수 있다.
상기 mRNA에 금 나노입자를 연결시키고 양이온성 endosomal disruptive polymer와 복합체를 형성하여, 세포에 전달할 수 있다 (Nature Biomedical Engineering volume 1, pages889-901(2017)). 상기 양이온성 endosomal disruptive polymer는 예를 들어, polyethylene imine, poly(arginine), poly(lysine), poly(histidine), poly-[2-{(2-aminoethyl)amino}-ethyl-aspartamide] (pAsp(DET)), poly(ethylene glycol) (PEG)와 poly(arginine)의 block co-polymer, PEG와 poly(lysine)의 block co-polymer, 또는 PEG와 poly{N-[N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl]aspartamide} (PEG-pAsp(DET))의 block co-polymer일 수 있다.
경우에 따라서 표면이, 아르기닌으로 변형된 금 입자를 사용할 수 있다.
아르기닌으로 변형된 금 입자를 핵산절단효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 절단인자 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 함께 조립할 수 있다. 이를 통해 타겟세포의 막과 융합하여, 세포질로 이동하게 된다 (ACS Nano. 2017, 11:2452-2458).
발현된 mRNA는 리포좀 (liposome), LNP(lipid Nano-Particle) 또는 다양한 나노입자를 통해 전달될 수 있다. 리포좀 또는 LNP는 양이온성 지질, 비양이온성 지질 또는 중성 지질 등을 포함하며, 추가적으로 PEG(polyethylene glycol) 또는 콜레스테롤 등의 다른 지질을 포함하는 경우도 있다. 이러한 mRNA 전달체는 미국특허공개 제2018/0311176호, 제2019/0032051호, 제2021/0046192호, 국제특허공개 제WO2018/081480호, 제WO2020/097540호, 제WO2020/097548호, 제WO2021/007278호 등에 구체적으로 기재되어 있으며, 본 발명에 참조로서 도입된다.
상기 양이온성 지질은 미국특허공개 제2018/0311176호, 제2019/0032051호 등을 통해 구체적으로 예시되어 있으며, 예를 들어 N,N-dioleyl-N,N-dimethylammonium chloride (DODAC), N,N-distearyl-N,N-dimethylammonium bromide (DDAB), N-(I-(2,3-dioleyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTAP), N-(I-(2,3-dioleyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA), N,N-dimethyl-2,3-dioleyloxy)propylamine (DODMA), 1,2-DiLinoleyloxy-N,N-dimethylaminopropane (DLinDMA), 1,2-Dilinolenyloxy-N,N-dimethylaminopropane (DLenDMA), 1,2-Dilinoleylcarbamoyloxy-3-dimethylaminopropane (DLin-C-DAP), 1,2-Dilinoleyoxy-3-(dimethylamino)acetoxypropane (DLin-DAC), 1,2-Dilinoleyoxy-3-morpholinopropane (DLin-MA), 1,2-Dilinoleoyl-3-dimethylaminopropane (DLinDAP), 1,2-Dilinoleylthio-3-dimethylaminopropane (DLin-S-DMA), 1-Linoleoyl-2-linoleyloxy-3-dimethylaminopropane (DLin-2-DMAP), 1,2-Dilinoleyloxy-3-trimethylaminopropane chloride salt (DLin-TMA.Cl), 1,2-Dilinoleoyl-3-trimethylaminopropane chloride salt (DLin-TAP.Cl), 1,2-Dilinoleyloxy-3-(N-methylpiperazino)propane (DLin-MPZ), or 3-(N,N-Dilinoleylamino)-1,2-propanediol (DLinAP), 3-(N,N-Dioleylamino)-1,2-propanedio (DOAP), 1,2-Dilinoleyloxo-3-(2-N,N-dimethylamino)ethoxypropane (DLin-EG-DMA), 1,2-Dilinolenyloxy-N,N-dimethylaminopropane (DLinDMA), 2,2-Dilinoleyl-4-dimethylaminomethyl-[1,3]-dioxolane (DLin-K-DMA) or analogs thereof, (3aR,5s,6aS)-N,N-dimethyl-2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9, 12-dienyl)tetrahydro-3aH-cyclopenta[d][1,3]dioxol-5-amine (ALN100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yl 4-(dimethylamino)butanoate (MC3), 1, 1′-(2-(4-(2-((2-(bis(2-hydroxydodecyl)amino)ethyl)(2-hydroxydodecyl)amino)ethyl)piperazin-1-yl)ethylazanediyl)didodecan-2-ol (Tech G1), 2,2-Dilinoleyl-4-dimethylaminoethyl-[1,3]-dioxolane, β-L-arginyl-2, 3-L-diaminopropionic acid-N-palmityl-N-oleylamide trihydrochloride, N′,N′-dioctadecyl-N-4, 8-diaza-10-aminodecanoylglycine amide[71], 1,2-dilinoleyloxy-3-dimethylaminopropane, DLin-KC2-DMA, amino lipid 2,2-dilinoleyl-4-dimethylaminoethyl-[1,3]-dioxolane (DLin-KC2-DMA, 1), 1,2-distearloxy-/V,N-dimethylaminopropane (DSDMA), dilinoleylmethyl-4-dimethylaminobutyrate (DLin-MC3-DMA), DLin-D-DMA, C12-200, 98N12-5, (20Z,23Z)-N,N-dimethylnonacosa-20,23-dien-10-amine, (17Z,20Z)-N,N-dimemylhexacosa-17,20-dien-9-amine, (1Z,19Z)-N5N-dimethylpentacosa-16,19-dien-8-amine, (13Z,16Z)-N,N-dimethyldocosa-13,16-dien-5-amine, (12Z,15Z)-N,N-dimethylhenicosa-12,15-dien-4-amine, (14Z,17Z)-N,N-dimethyltricosa-14,17-dien-6-amine, (15Z,18Z)-N,N-dimethyltetracosa-15,18-dien-7-amine, (18Z,21Z)-N,N-dimethylheptacosa-18,21-dien-10-amine, (15Z,18Z)-N,N-dimethyltetracosa-15,18-dien-5-amine, (14Z,17Z)-N,N-dimethyltricosa-14,17-dien-4-amine, (19Z,22Z)-N,N-dimethyloctacosa-19,22-dien-9-amine, (18Z,21Z)-N,N-dimethylheptacosa-18,21-dien-8-amine, (17Z,20Z)-N,N-dimethylhexacosa-17,20-dien-7-amine, (16Z,19Z)-N,N-dimethylpentacosa-16,19-dien-6-amine, (22Z,25Z)-N,N-dimethylhentriaconta-22,25-dien-10-amine, (21Z,24Z)-N,N-dimethyltriaconta-21,24-dien-9-amine, (18Z)-N,N-dimethylheptacos-18-en-10-amine, (17Z)-N,N-dimethylhexacos-17-en-9-amine, (19Z,22Z)-N,N-dimethyloctacosa-19,22-dien-7-amine, N,N-dimethylheptacosan-10-amine, (20Z,23Z)-N-ethyl-N-methylnonacosa-20,23-dien-10-amine, 1-[(11Z,14Z)-1-nonylicosa-11,14-dien-1-yl]pyrrolidine, (20Z)-N,N-dimethylheptacos-20-en-10-amine, (15Z)-N,N-dimethyleptacos-15-en-10-amine, (14Z)-N,N-dimethylnonacos-14-en-10-amine, (17Z)-N,N-dimethylnonacos-17-en-10-amine, (24Z)-N,N-dimethyltritriacont-24-en-10-amine, (20Z)-N,N-dimethylnonacos-20-en-10-amine, (22Z)-N,N-dimethylhentriacont-22-en-10-amine, (16Z)-N,N-dimethylpentacos-16-en-8-amine, (12Z,15Z)-N,N-dimethyl-2-nonylhenicosa-12,15-dien-1-amine, (13Z,16Z)-N,N-dimethyl-3-nonyldocosa-13,16-dien-1-amine, N,N-dimethyl-1-[(1S,2R)-2-octylcyclopropyl]eptadecan-8-amine, 1-[(1S,2R)-2-hexylcyclopropyl]-N,N-dimethylnonadecan-10-amine, N,N-dimethyl-1-[(1S,2R)-2-octylcyclopropyl]nonadecan-10-amine, N,N-dimethyl-21-[(1S,2R)-2-octylcyclopropyl]henicosan-10-amine,N,N-dimeth-yl-1-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-pentylcyclopropyl]methyl}cyclopropyl]nonadecan-10-amine,N,N-dimethyl-1-[(1S,2R)-2-octylcyclopropyl]hexadecan-8-amine, N,N-dimethyl-[(1R,2S)-2-undecylcyclopropyl]tetradecan-5-amine, N,N-dimethyl-3-{7-[(1 S,2R)-2-octylcyclopropyl]heptyl}dodecan-1-amine, 1-[(1R,2S)-2-heptylcyclopropyl]-N,N-dimethyloctadecan-9-amine, 1-[(1S,2R)-2-decylcyclopropyl]-N,N-dimethylpentadecan-6-amine, N,N-dimethyl-1-[(1S,2R)-2-octylcyclopropyl]pentadecan-8-amine, R-N,N-dimethyl-1-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yloxy]-3-(octyloxy)propa-n-2-amine, S-N,N-dimethyl-1-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yloxy]-3-(octy-loxy)propan-2-amine, 1-{2-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yloxy]-1-Roctyloxy)methyl]ethyl}pyrro-lidine, (2S)-N,N-dimethyl-1-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yloxy]-3-[(5Z)-oct-5-en-1-yloxy]propan-2-amine, 1-{2-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yloxy]-1-[(octyloxy)methyl]ethyl}azet-idine, (2S)-1-(hexyloxy)-N,N-dimethyl-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-ylo-xy]propan-2-amine, (2S)-1-(heptyloxy)-N,N-dimethyl-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yloxy]pr-opan-2-amine, N,N-dimethyl-1-(nonyloxy)-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yloxy]propan-2-amine, N,N-dimethyl-1-[(9Z)-octadec-9-en-1-yloxy]-3-(octyloxy)propan-2-am-ine; (2S)-N,N-dimethyl-1-[(6Z,9Z,12Z)-octadeca-6,9,12-trien-1-yloxy]-3-(o-ctyloxy)propan-2-amine, (2 S)-1-[(11Z,14Z)-icosa-11,14-dien-1-yloxy]-N,N-dimethyl-3-(pentyloxy)propa-n-2-amine, (2S)-1-(hexyloxy)-3-[(11Z,14Z)-icosa-11,14-dien-1-yloxy]-N,N-di-methylpropan-2-amine, 1-[(11Z,14Z)-icosa-11,14-dien-1-yloxy]-N,N-dimethyl-3-(octyloxy)propan-2-amine, 1-[(13Z,16Z)-docosa-13,16-dien-1-yloxy]-N,N-dimethyl-3-(octyloxy)pr-opan-2-amine, (2S)-1-[(13Z,16Z)-docosa-13,16-dien-1-yloxy]-3-(hexyloxy)-N,N-dimethylpro-pan-2-amine, (2S)-1-[(13Z)-docos-13-en-1-yloxy]-3-(hexyloxy)-N,N-dimethylpropan-2-amin-e, 1-[(13Z)-docos-13-en-1-yloxy]-N,N-dimethyl-3-(octyloxy)propan-2-amine, 1-[(9Z)-hexadec-9-en-1-yloxy]-N,N-dimethyl-3-(octyloxy)propan-2-amine, (2R)-N,N-dimethyl-H(1-metoyloctyl)oxy]-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yloxy]propan-2-amine, (2R)-1-[(3,7-dimethyloctyl)oxy]-N,N-dimethyl-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-di-en-1-yloxy]propan-2-amine, N,N-dimethyl-1-(octyloxy)-3-({8-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-pentylcyclopropyl]-methyl}cyclopropyl]octyl}oxy)propan-2-amine, N,N-dimethyl-1-{[8-(2-oclylcyclopropyl)octyl]oxy}-3-(octyloxy)propan-2-am-ine and (11E,20Z,23Z)-N,N-dimethylnonacosa-11,20,2-trien-10-amine, 5-carboxyspermylglycine dioctaoleoylamide ("DOGS"), dipalmitoylphosphatidylethanolamine 5-carboxyspermyl-amide ("DPPES"), 1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxy ethyl ammonium bromide (DMRIE), DMRIE-HP, Lipofectamine (DOSPA), 3b-(N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl)cholesterol ("DC-Choi"), N-(1,2-dimyhstyloxyprop-3-yl)-N,N-dimethyl-N-hydroxyethyl ammonium bromide ("DMRIE"), 1,2-Dioleoyl-3-dimethylammonium-propane ("DODAP"), DMDMA, cationic lipid-based transfection reagents TransIT-TKO, LIPOFECTIN, Lipofectamine, OLIGOFECTAMINE or DHARMAFECT, DSDMA, DODMA, DLinDMA, DLenDMA, gamma-DLenDMA, DLin-K-DMA, DLin-K-C2-DMA (also known as DLin-C2K-DMA, XTC2, and C2K), DLin-K-C3-DM A, DLin-K-C4-DMA, DLen-C2K-DMA, y-DLen-C2K-DMA, DLin-M-C2-DMA (also known as MC2), DLin-M-C3-DMA (also known as MC3) 또는 (DLin-MP-DMA)(also known as 1-B11), 또는 이의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 비양이온성 지질은 미국특허공개 제2018/0311176호, 제2019/0032051호 등을 통해 구체적으로 예시되어 있으며, 예를 들어, phosphatidylglycerol, cardiolipin, diacylphosphatidylserine, diacylphosphatidic acid, N-dodecanoyl phosphatidylethanoloamine, N-succinyl phosphatidylethanolamine, N-glutaryl phosphatidylethanolamine, 또는 lysylphosphatidylglycerol일 수 있다. 경우에 따라서, 상기 비양이온성 지질은 예를 들어, distearoylphosphatidylcholine (DSPC), dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG), dioleoyl-phosphatidylethanolamine (DOPE), palmitoyloleoylphosphatidylcholine (POPC), palmitoyloleoylphosphatidylethanolamine (POPE), dioleoyl-phosphatidylethanolamine 4-(-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate (DOPE-mal), dipalmitoyl phosphatidyl ethanolamine (DPPE), dimyristoylphosphoethanolamine (DMPE), distearoyl-phosphatidyl-ethanolamine (DSPE), 16-O-monomethyl PE, 16-O-dimethyl PE, 18-1-trans PE, 1-stearoyl-2-oleoyl-phosphatidyethanolamine (SOPE), cholesterol, phosphatidylglycerols, cardiolipins, diacylphosphatidylserines, diacylphosphatidic acids, N-dodecanoyl phosphatidylethanolamines, N-succinyl phosphatidylethanolamines, N-glutarylphosphatidylethanolamines, lysylphosphatidylglycerols, palmitoyloleyolphosphatidylglycerol (POPG)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 중성지방은 미국특허공개 제2018/0311176호, 제2019/0032051호 등을 통해 구체적으로 예시되어 있으며, 예를 들어, diacylphosphatidylcholine, diacylphosphatidylethanolamine, ceramide, sphingomyelin, dihydrosphingomyelin, cephalin, 또는 cerebrosides를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 mRNA 전달시 생성되는 입자의 응집을 방지하기 위해 PEG 지방을 포함할 수 있다. PEG 지방은 미국특허공개 제2018/0311176호, 제2019/0032051호 등을 통해 구체적으로 예시되어 있으며, 예를 들어, PEG-diacylglycerol (DAG), a PEG-dialkyloxypropyl (DAA), a PEG-phospholipid, a PEG-ceramide (Cer), or a mixture thereof. As a non-limiting example, PLGA may be conjugated to a lipid-terminating PEG forming PLGA-DSPE-PEG, PEG lipid is selected from PEG-c-DOMG and 1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol, methoxypolyethylene Glycol (PEG-DMG), 1,2-Distearoyl-sn-glycerol, methoxypolyethylene Glycol (PEG-DSG), PEG-c-DOMG, 1,2-Distearoyl-sn-glycerol, methoxypolyethylene glycol (PEG-DSG) 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerol, methoxypolyethylene glycol (PEG-DPG), PEG-lipid conjugates such as, e.g., PEG coupled to dialkyloxypropyls (e.g., PEG-DAA conjugates), PEG coupled to diacylglycerols (e.g., PEG-DAG conjugates), PEG coupled to cholesterol, PEG coupled to phosphatidylethanolamines, PEG conjugated to ceramides, cationic PEG lipids, polyoxazoline (POZ)-lipid conjugates, polyamide oligomers (e.g., ATTA-lipid conjugates), 및 이의 혼합물. 상기 PEG는 PEG-dilauryloxypropyl (C12), PEG-dimyristyloxypropyl (C14), PEG-dipalmityloxypropyl (C16), PEG-distearyloxypropyl (C18), PEG-c-DOMG, PEG-DMG 또는 이의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 mRNA 전달에 펩타이드가 사용될 수 있다. 펩타이드는 핵산의 음이온성 인산기와 정전기적 상호작용하기 양이온을 가져야 하고, 인산기와 정전기 상호 작용하기 위해 양으로 하전된 아미노산을 포함할 수 있다. mRNA 전달에 사용가능한 펩타이드 구체적 내용은 AIMS Biophysics, 7(4): 323-338.에 기재되어 있으며, 본 발명에 참조로서 도입될 수 있다.
상기 mRNA 전달에 사용가능한 펩타이드로 프로타민을 포함할 수 있다. 프로타민은 고환의 정자 형성중인 DNA의 안정성에 기여하는 양이온성 아르기닌이 풍부한 작은 핵 단백질로, 프로타민은 mRNA 분자를 안정화시켜 효율적으로 전달할 수 있다. 미국특허등록 제9352028호에 프로타민-mRNA 복합물이 구체적으로 기재되어 있으며, 본 발명에 참조로 도입될 수 있다.
세포 투과성 펩타이드 (CPP)도 mRNA의 전달에 유망한 양이온 분자일 수 있다. 아르기닌이 풍부 RALA 펩타이드 (WEARLARALARALARHLARALARALRACEA), RALA, LAH4 (KKALLALALHHLAHLALHLALALKKA) 및 LAH4-L1 (KKALLAHALHLLALLALHLAHALKKA)와 같은 양친매성 CPP를 사용하여 mRNA 분자를 전달할 수 있다.
경우에 따라서, 상기 리포좀 (liposome) 또는 LNP(lipid Nano-Particle) 이외에 mRNA 전달에 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 상기 펩타이드는 핵산 패키징 기능을 제공하고 DNA 또는 RNA를 세포 내 혹은 세포 외에서 분해되지 않도록 할 수 있다. 이러한 펩타이드의 예시는 미국특허공개 제2021/0170046호에 구체적으로 기재되어 있으며, 본 명세서에 참조로서 도입될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 조성물에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 또는 둘 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 특히, 동결건조(lyophilized)된 형태의 제형으로 제제화하여 제공하는 것이 바람직하다. 동결건조 제형 제조를 위해서 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려져 있는 방법이 사용될 수 있으며, 동결건조를 위한 안정화제가 추가될 수도 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍톤 약학 과학(Remington's pharmaceutical Science, Mack Publishing company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질병에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분 등의 함량 및 투여방법은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화 할 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공될 수도 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 기관지, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 또는 질병의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 임상 투여를 위해 공지의 기술을 이용하여 본 발명의 조성물을 적합한 제형으로 제제화할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. SARS-CoV-2 subgenomic RNA의 5' UTR 및 3' UTR 서열 규명을 위한 cDNA 합성
SARS-CoV-2의 subgenomic RNA의 5' UTR과 3' UTR 서열을 확인하기 위하여 Vero cell에 SARS-CoV-2를 감염시킨 후 배양한 후 분리한 전체 RNA를 충남대학교 수의과대학 (BSL3)으로부터 제공받았다. 이로부터 cDNA를 합성하기 위하여 추출한 전체 RNA 1 μg에 oligo-dT 0.5 μg을 첨가하여 총 12.5 ㎕를 만든 뒤 65℃ 5분, 얼음에 5 분간 반응시켰다. 위 반응액에 5X reaction buffer 4 uL, dNTP mix 1mM, RevertAid H Minus Reverse Transcriptase 1 ㎕ (Enzynomics, Daejeon, South Korea)를 첨가하여 총 20 ㎕ 반응액을 만들었다. 역전사반응 (reverse transcription) 반응은 42℃ 60분, 70℃ 10분 반응으로 단일 가닥 cDNA를 합성하였다.
제작된 cDNA로부터 SARS-CoV-2의 N, S, E 유전자들의 5' UTR과 3' UTR을 포함하는 cDNA를 증폭하기 위하여 PCR을 수행하였다. PCR에 사용한 프라이머 서열은 표 1과 같다.
표 1. 프라이머 서열
PCR 반응은 총 20 ㎕ 용액에서 진행하였으며, 합성된 cDNA 1 ng, 순방향 프라이머 (서열번호 7) 10 pmole, 역방향프라이머 (서열번호 7 내지 서열번호 9) 10 pmole, 2X pfu Master Mix 10 uL (Biofact, Daejeon, South Korea)를 첨가하였다. PCR 반응 조건은 다음과 같다: 95℃ 2분 (1 cycle); 95℃ 20초-60℃ 40초-72℃ 1 분 (30 cycles); 72℃ (5분). PCR 산물은 pTOP Blunt V2 vector (Enzynomics, Daejeon, South Korea)에 ligation 후 DH5α (Enzynomics, Daejeon, South Korea)에 형질전환 하였다. 형질전환 후 Ampicillin (50 μg/㎖, Sigma Aldrich, USA) 이 포함된 고체 배지 (Bioloard, Daejeon, South Korea)에 도말 후 37℃에서 8시간 배양 후 HiGeneTM Plasmid Mini Prep Kit(Ver.2.0) (Biofact, Daejeon, South Korea)를 이용해서 Plasmid DNA를 추출한 후 Sanger 시퀀싱을 진행하였다.
실시예 2. Sanger 시퀀싱을 통한 SARS-CoV-2의 N, S, E 유전자의 5' UTR 및 공통 3' UTR 서열 규명
표 2. 5' UTR 서열
3' UTR
5'-CAATCTTTAATCAGTGTGTAACATTAGGGAGGACTTGAAAGAGCCACCACATTTTCACCGAGGCCACGCGGAGTACGATCGAGTGTACAGTGAACAATGCTAGGGAGAGCTGCCTATATGGAAGAGCCCTAATGTGTAAAATTAATTTTAGTAGTGCTATCCCCATGTGATTTTAATAGCTTCTTAGGAGAATGAC-3' (서열번호 5)
실시예 3. GFP mRNA 발현을 위한 IVT 주형 제작
GFP mRNA 발현을 위한 IVT 주형을 제작하기 위하여 SARS-CoV-2의 N 유전자의 5' UTR 바로 뒤에 GFP 유전자 코딩 서열을 연결하고, 이어서 SARS-CoV-2 3' UTR 서열 및 polyA 서열 (65 nucleotide)을 PCR 방법으로 연결하였다 (도 3).
이를 위하여 N 유전자의 5' UTR에 T7 프로모터 서열 (서열번호 10: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3')을 PCR 방법으로 연결하였다. 상기 실시예 1에서 제작된 N 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA 1 ng을 주형으로 사용하여 순방향 프라이머 (서열번호 6) 10 pmole, 역방향프라이머 (서열번호 11) 10 pmole, 2X pfu Master Mix 10 uL (Biofact, Daejeon, South Korea)를 첨가하였다. PCR (Applied Biosystem)반응 조건은 다음과 같다: 95℃ 2분 (1 cycle); 95℃ 20초-60℃ 40초-72℃ 1 분 (30 cycles); 72℃ (5분). 제작된 PCR 산물은 아가로즈젤 (2%)에 전기영동하여 확인하였다. N 유전자의 3' UTR 서열은 상기 실시예 1에서 제작된 N 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA 1 ng을 사용하여 순방향 프라이머 (서열번호 12) 10 pmole, 역방향프라이머 (서열번호 13) 10 pmole, 2X pfu Master Mix 10 uL (Biofact, Daejeon, South Korea)를 첨가하였다. PCR (Applied Biosystem)반응 조건은 다음과 같다: 95℃ 2분 (1 cycle); 95℃ 20초-60℃ 40초-72℃ 1 분 (30 cycles); 72℃ (5분). 제작된 PCR 산물은 아가로즈젤 (2%)에 전기영동하여 확인하였다. GFP 유전자는 GFP 유전자를 포함하는 pEGFP N1 (Clontech) 1 ng을 주형으로 사용하여 5' UTR의 3' 말단 서열과 GFP 유전자의 5' 말단 서열이 연결된 정방향 프라이머 (서열번호 14) 10 pmole, GFP 유전자의 3' 말단서열과 3' UTR의 5' 말단 서열이 연결된 역방향 프라이머 (서열번호 15), 10 pmole, 2X pfu Master Mix 10 uL (Biofact, Daejeon, South Korea)를 첨가하였다. PCR (Applied Biosystem) 반응 조건은 다음과 같다: 95℃ 2분 (1 cycle); 95℃ 20초-60℃ 40초-72℃ 2 분 (30 cycles); 72℃ (5분). 제작된 PCR 산물을 아가로즈젤 (2%)에 전기영동하여 확인하였다.
T7 프로모터 서열, 5' UTR 서열, GFP 유전자 서열, 3' UTR 서열 그리고 65 뉴클레오타이드의 polyA 서열을 연결하기 위하여 PCR 방법을 사용하였다. 상기에서 제작된 각각의 PCR 산물 100pg씩 동량으로 혼합한 후 주형으로 사용하여 정방향 T7 프로모터 서열 프라이머 10 pmole (서열번호 6), 3' UTR 서열의 3' 말단의 20 뉴클레오타이드와 65 뉴클레오타이드의 polyA 서열을 연결한 역방향 프라이머 (서열번호 16) 10 pmole, 2X pfu Master Mix 10 uL (Biofact, Daejeon, South Korea)를 첨가하였다. PCR (Applied Biosystem) 반응 조건은 다음과 같다: 95℃ 2분 (1 cycle); 95℃ 20초-60℃ 40초-72℃ 2분 (30 cycles); 72℃ (5분). 제작된 PCR 산물을 아가로즈젤 (2%)에 전기영동하여 확인하였다. PCR 산물은 pTOP Blunt V2 vector (Enzynomics, Daejeon, South Korea)에 ligation 후 DH5α (Enzynomics, Daejeon, South Korea)에 형질전환 하였다. 형질전환 후 Ampicillin (50 μg/㎖, Sigma Aldrich, USA) 이 포함된 고체 배지 (Bioloard, Daejeon, South Korea)에 도말 후 37℃에서 8시간 배양 후 HiGeneTM Plasmid Mini Prep Kit (Ver.2.0) (Biofact, Daejeon, South Korea)를 이용해서 Plasmid DNA를 추출한 후 Sanger 시퀀싱으로 제작된 IVT 주형 서열을 확인하였다 (서열번호 18).
타겟 유전자가 포함되지 않은 대조군 control RNA 발현을 위한 IVT 주형 제작을 위하여 상기 제작된 3' UTR DNA 100pg을 주형으로 사용하여 5' UTR의 3' 말단 서열과 3' UTR의 5' 말단 서열이 연결된 정방향 프라이머 (서열번호 16) 10 pmole, 3' UTR의 3' 말단 서열과 65 뉴클레오타이드가 연결된 역방향 프라이머 (서열번호 17) 10 pmole, 2X pfu Master Mix 10 uL (Biofact, Daejeon, South Korea)를 첨가하였다. PCR (Applied Biosystem) 반응 조건은 다음과 같다: 95℃ 2분 (1 cycle); 95℃ 20초-60℃ 40초-72℃ 1분 (30 cycles); 72℃ (5분). 제작된 PCR 산물을 아가로즈젤 (2%)에 전기영동하여 확인하였다.
T7 프로모터 서열, 5' UTR 서열, 3' UTR 서열 그리고 65 뉴클레오타이드의 polyA 서열을 연결하기 위하여 PCR 방법을 사용하였다. 상기에서 제작된 각각의 PCR 산물 100pg씩 동량으로 혼합한 후 주형으로 사용하여 정방향 T7 프로모터 서열 프라이머 10 pmole (서열번호 6), 3' UTR 서열의 3' 말단의 20 뉴클레오타이드와 65 뉴클레오타이드의 polyA 서열을 연결한 역방향 프라이머 (서열번호 16) 10 pmole, 2X pfu Master Mix 10 uL (Biofact, Daejeon, South Korea)를 첨가하였다. PCR (Applied Biosystem) 반응 조건은 다음과 같다: 95℃ 2분 (1 cycle); 95℃ 20초-60℃ 40초-72℃ 1분 (30 cycles); 72℃ (5분). 제작된 PCR 산물을 아가로즈젤 (2%)에 전기영동하여 확인하였다.
PCR 산물은 pTOP Blunt V2 vector (Enzynomics, Daejeon, South Korea)에 ligation 후 DH5α (Enzynomics, Daejeon, South Korea)에 형질전환 하였다. 형질전환 후 Ampicillin (50 μg/㎖, Sigma Aldrich, USA)이 포함된 고체 배지 (Bioloard, Daejeon, South Korea)에 도말 후 37℃에서 8시간 배양 후 HiGeneTM Plasmid Mini Prep Kit(Ver.2.0) (Biofact, Daejeon, South Korea)를 이용해서 Plasmid DNA를 추출한 후 Sanger 시퀀싱으로 제작된 IVT 주형 서열을 확인하였다 (서열번호 19).
표 3. 프라이머 서열
[서열번호 18] T7 5UTR eGFP 3' UTR oligo dT (65)
TAATACGACTCACTATAGGGATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAACAAACCAACCAACTTTCGATCTCTTGTAGATCTGTTCTCTAAACGAACAAACTAAAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAACAATCTTTAATCAGTGTGTAACATTAGGGAGGACTTGAAAGAGCCACCACATTTTCACCGAGGCCACGCGGAGTACGATCGAGTGTACAGTGAACAATGCTAGGGAGAGCTGCCTATATGGAAGAGCCCTAATGTGTAAAATTAATTTTAGTAGTGCTATCCCCATGTGATTTTAATAGCTTCTTAGGAGAATGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
[서열번호 19] T7 5' UTR 3' UTR oligodT (65)
TAATACGACTCACTATAGGGATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAACAAACCAACCAACTTTCGATCTCTTGTAGATCTGTTCTCTAAACGAACAAACTAAACAATCTTTAATCAGTGTGTAACATTAGGGAGGACTTGAAAGAGCCACCACATTTTCACCGAGGCCACGCGGAGTACGATCGAGTGTACAGTGAACAATGCTAGGGAGAGCTGCCTATATGGAAGAGCCCTAATGTGTAAAATTAATTTTAGTAGTGCTATCCCCATGTGATTTTAATAGCTTCTTAGGAGAATGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
실시예 4. SARS-CoV-2 N 유전자 mRNA 발현을 위한 IVT 주형 제작
실시예 1에서 합성한 cDNA 1 ng을 사용해서 PCR 반응을 총 20uL 용액에서 진행하였으며, 순방향 프라이머 (서열번호 6) 10 pmole, 역방향 프라이머 (서열번호 16) 10 pmole, 2X pfu Master Mix 10 uL (Biofact, Daejeon, South Korea)를 첨가하였다. PCR 반응 조건은 다음과 같다: 95℃ 2분 (1 cycle); 95℃ 20초-60℃ 40초-72℃ 2분 30초 (30 cycles); 72℃ (5분). PCR 산물은 pTOP Blunt V2 vector (Enzynomics, Daejeon, South Korea)에 ligation 후 DH5α (Enzynomics, Daejeon, South Korea)에 형질전환 하였다. 형질전환 후 Ampicillin (50 μg/㎖, Sigma Aldrich, USA) 이 포함된 고체 배지 (Bioloard, Daejeon, South Korea)에 도말 후 37℃에서 8시간 배양 후 HiGeneTM Plasmid Mini Prep Kit(Ver.2.0) (Biofact, Daejeon, South Korea)를 이용해서 Plasmid DNA를 추출한 후 Sanger 시퀀싱을 진행하였다 (서열번호 20).
실시예 5. 사람 ADCYAP1 유전자 mRNA 발현을 위한 IVT 주형 제작
ADCYP1 mRNA 발현을 위한 IVT 주형을 제작하기 위하여 SARS-CoV-2의 N 유전자의 5' UTR 바로 뒤에 ADCYAP1 유전자 코딩 서열을 연결하고, 이어서 SARS-CoV-2 3' UTR 서열 그리고 polyA 서열 (65 nucleotide)을 PCR 방법으로 연결하였다 (도 3).
이를 위하여 ADCYAP1 유전자를 포함하는 pcDNA3 플라스미드 DNA (대한민국 등록특허 제1399077호) 1 ng을 주형으로 이용하여 5' UTR의 3' 말단 서열과 ADCYAP1 유전자의 5' 말단 서열이 연결된 정방향 프라이머 (서열번호 21) 10 pmole, ADCYAP1 유전자의 3' 말단서열과 3' UTR의 5' 말단 서열이 연결된 역방향 프라이머 (서열번호 22), 10 pmole, 2X pfu Master Mix 10 uL (Biofact, Daejeon, South Korea)를 첨가하였다. PCR 반응 조건은 다음과 같다: 95℃ 2분 (1 cycle); 95℃ 20초-60℃ 40초-72℃ 2분 (30 cycles); 72℃ (5분).
T7 프로모터 서열, 5' UTR 서열, ADCYAP1 유전자 서열, 3' UTR 서열 그리고 65 뉴클레오타이드의 polyA 서열을 연결하기 위하여 PCR 방법을 사용하였다. 상기에서 제작된 각각의 PCR 산물 10 pg씩 동량으로 혼합한 후 주형으로 사용하여 정방향 T7 프로모터 서열 프라이머 (서열번호 6) 10 pmole, 3' UTR 서열의 3' 말단의 20 뉴클레오타이드와 65 뉴클레오타이드의 polyA 서열을 연결한 역방향 프라이머 (서열번호 16) 10 pmole, 2X pfu Master Mix 10 uL (Biofact, Daejeon, South Korea)를 첨가하였다. PCR 반응 조건은 다음과 같다: 95℃ 2분 (1 cycle); 95℃ 20초-60℃ 40초-72℃ 2분 30초 (30 cycles); 72℃ (5분). 제작된 PCR 산물을 아가로즈젤 (2%)에 전기영동하여 확인하였다. PCR 산물은 pTOP Blunt V2 vector (Enzynomics, Daejeon, South Korea)에 ligation 후 DH5α (Enzynomics, Daejeon, South Korea)에 형질전환 하였다. 형질전환 후 Ampicillin (50 μg/㎖, Sigma Aldrich, USA)이 포함된 고체 배지 (Bioloard, Daejeon, South Korea)에 도말 후 37℃에서 8시간 배양 후 HiGeneTM Plasmid Mini Prep Kit(Ver.2.0) (Biofact, Daejeon, South Korea)를 이용해서 Plasmid DNA를 추출한 후 Sanger 시퀀싱을 진행하였다 (서열번호 23).
표 4. 프라이머 서열
[서열번호 23] T7 5' UTR ADCYAP1 3' UTR oligo dT (65)
TAATACGACTCACTATAGGGATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAACAAACCAACCAACTTTCGATCTCTTGTAGATCTGTTCTCTAAACGAACAAACTAAAATGACCATGTGTAGCGGAGCGAGGCTGGCCCTGCTGGTCTATGGGATAATCATGCACAGCAGCGTCTACAGCTCACCTGCCGCCGCCGGACTCCGGTTCCCCGGGATCAGGCCAGAGGAAGAGGCGTACGGCGAGGACGGAAACCCGCTGCCAGACTTCGATGGCTCGGAGCCGCCGGGCGCAGGGAGCCCCGCCTCCGCGCCGCGCGCCGCCGCCGCCTGGTACCGCCCGGCCGGGAGAAGAGATGTCGCCCACGGGATCCTTAACGAGGCCTACCGCAAAGTGCTGGACCAGCTGTCCGCCGGGAAGCACCTGCAGTCGCTCGTGGCCCGGGGCGTGGGTGGGAGCCTCGGCGGCGGCGCGGGGGACGACGCGGAGCCGCTCTCCAAGCGCCACTCGGACGGGATCTTCACGGACAGCTACAGCCGCTACCGGAAACAAATGGCTGTCAAGAAATACTTGGCGGCCGTCCTAGGGAAGAGGTATAAACAAAGGGTTAAAAACAAAGGACGCCGAATAGCTTATTTGTAGCAATCTTTAATCAGTGTGTAACATTAGGGAGGACTTGAAAGAGCCACCACATTTTCACCGAGGCCACGCGGAGTACGATCGAGTGTACAGTGAACAATGCTAGGGAGAGCTGCCTATATGGAAGAGCCCTAATGTGTAAAATTAATTTTAGTAGTGCTATCCCCATGTGATTTTAATAGCTTCTTAGGAGAATGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
실시예 6. IVT를 통한 GFP, N 유전자 및 ADCYAP1 mRNA 발현 확인
IVT 방법으로 각각의 mRNA를 제작하기 위하여 T7 프로모터 서열에 해당하는 정방향 프라이머 (서열번호 6) 10 pmole, 3' UTR과 65 뉴클레오타이드의 polyA가 연결된 역방향 프라이머 (서열번호 16) 10 pmole, 2X pfu Master Mix (Biofact, Daejeon, South Korea) 10 μl를 첨가하여 총 20 μL가 되게 PCR을 수행하였다. PCR 반응 조건은 다음과 같다: 95℃ 2분 (1 cycle); 95℃ 20초-60℃ 40초-72℃ 2분 30초 (30 cycles); 72℃ (5분). 증폭된 PCR 산물은 1% agarose gel로 전기영동 후 Qiaquick® Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)로 정제하여 IVT를 위한 주형으로 사용하였다.
IVT는 Hiscribeㅤ T7 ARCA mRNA kit (NEB)를 이용하여 제조사 지침에 따라 수행하였다. 상기 제작된 PCR 산물을 주형으로 1ug 사용하여, 2X ARCA/NTP MIX 10㎕, T7 polymerase 2㎕ 첨가하고 37oC에서 Control의 경우 16시간, GFP, ADCYAP, N gene의 경우 각각 1시간 반응시켜 mRNA 합성과 5' 말단에 항-역전 캡 유사체 (Anti-reverse cap analog; ARCA)가 추가 될 수 있도록 하였다. 반응 후 DNase I 2㎕ 첨가 후 37oC에서 15분간 반응 시켜 DNA 주형을 제거하였다. IVT 반응 후 반응 용액을 LiCl 용액 (NEB, Massachusetts, USA)과 (2:1 부피)으로 혼합 후 -20℃에서 30분간 배양 후 13000rpm 15분간 원심 분리하여 상층액을 제거하였다. 차가운 70% 에탄올 500uL 넣고 13000rpm 10분간 원심 분리한 후 상층액을 제거 하고 상온에서 10분간 배양하여 남은 용액을 제거하였고, 최총 50 uL의 RNase free 증류수에 용출하였다. 정제된 RNA는 Qubit을 이용하여 정량 하였고, 아가로즈젤 (1%, 0.5X TBE)에 전기영동하여 mRNA 산물을 확인하였다 (도 6). 전기영동 후 사이즈를 확인한 결과, 예상되는 사이즈와 일치하는 것을 확인하였다.
실시예 7. 사람 세포주 대상 GFP, N 유전자 및 ADCYAP1 단백질 발현 확인
7-1.트랜스펙션 (Transfection) 및 세포 수확
IVT 방법으로 합성된 mRNA를 Lipofectamineㅤ Messenger MAX와 (1:1,w:v)으로 섞은 후 자궁경부암 세포주인 HeLa 세포주에 트랜스펙션한 후 48시간 동안 CO2 배양기에서 배양하였다. GFP mRNA 트랜스펙션한 세포의 경우 트랜스펙션 48시간 후 형광현미경을 통해 GFP의 발현을 확인 후 세포를 수확하였다. ADCYAP1 mRNA transfected cell의 경우 트랜스펙션 48시간 후 cell imaging, hematocytometer로 counting하여 cell viability를 측정한 후 수확하였다. N gene mRNA transfected cell의 경우 transfection 48시간 후 cell imaging하고 수확하였다. 수확된 세포는 pro-prep (iNtRON biotechnology, Seongnam, South Korea)을 사용하여 제조사 지침에 따라 단백질을 추출하였다.
7-2.웨스턴 블럿 (Western blot)
추출한 단백질은 Mini-PROTEANㄾ Tetra Vertical Electrophoresis Cell (Bio-rad, California, USA) 장비를 이용하여 SDS-PAGE한 후 nitrocellulose membrane (Bio-rad, California, USA)으로 이동시켰다. Membrane으로 이동시킨 단백질은 5% skim milk (Biopure, Seoul, South Korea)로 1시간 동안 blocking한 후 5% skim milk에 각각 anti-GFP (Invitrogen, Massachusetts, USA), anti-ADCYAP1 (Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA), anti-SARS-CoV-2 Nucleocapsid (bioServUK, Sheffield, UK), anti-GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA) 항체를 희석한 용액에 membrane을 넣고 4oC에서 16시간 반응 시켰다. 1X TBS-T로 10분간 세번 세척하고 5% skim milk에 2차 항체인 goat anti-mouse IgG HRP, goat anti-rabbit IgG HRP (Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA)를 희석한 용액에 상온에서 두시간 반응하고 1X TBS-T로 10분간 세번 세척하였다. WesternBright Peroxide solution (Advansta, California, USA)과 WesternBright ECL solution (Advansta, California, USA)을 1:1 비율로 섞어 membrane에 처리하고 상온에서 1분간 반응 시킨 후 Chemidoc XRS+ (Bio-rad, California, USA) 장비를 이용하여 단백질 발현을 확인하였다.
7-3. 형광이미징과 웨스턴 블럿을 통한 GFP 단백질 발현 확인.
HeLa 세포주에 transfection 48시간 후 형광현미경을 통해 관찰한 결과 reagent와 control mRNA를 처리한 세포에서는 GFP의 발현을 확인할 수 없었으나, GFP mRNA를 처리한 세포에서는 GFP의 발현을 확인할 수 있었다. 세포를 수확하여 단백질 추출 후 western blot을 진행한 결과 또한 GFP mRNA를 처리한 세포에서만 GFP의 발현을 확인할 수 있었다 (도 7). 이를 통해 SARS-CoV-2의 5' UTR과 3 'UTR 서열을 이용하여 본 발명에서 제작한 mRNA가 세포 내로 들어가 단백질로 발현이 잘 된다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명을 통해 여타의 mRNA를 발현 시킬 수 있음을 제시해 준다.
7-4. ADCYAP1의 세포 증식 억제 효과 확인 및 웨스턴블럿을 통한 ADCYAP1 단백질 발현 확인
ADCYAP1은 자궁경부암 세포의 생장을 억제하는 것으로 알려져 있다 (대한민국 등록특허: 제1399077호). 자궁경부암 HeLa 세포주에 transfection 48시간 후 세포 생장을 확인한 결과 control mRNA를 transfection한 세포와 비교했을 때 ADCYAP mRNA를 transfection한 세포는 약 40% 감소가 되는 것을 확인할 수 있었다 (도 8). 또한 세포를 수확하여 단백질 추출 후 웨스턴블럿을 진행한 결과 ADCYAP1 mRNA를 처리한 세포에서 ADCYAP1 단백질 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 세포 내에서 발현된 ADCYAP1 단백질에 의해 세포의 증식이 억제된다는 것을 확인할 수 있었다 (도 8). 이러한 결과는 본 발명을 통해 제작되는 mRNA를 암 치료제 목적으로 활용할 수 있음을 제시해 준다.
7-5. 웨스턴블럿을 통한 Nucleocapsid 단백질 발현 확인
HeLa 세포주에 transfection 48시간 후 세포를 수확하여 단백질 추출 후 웨스턴블럿을 진행한 결과 N gene mRNA를 처리한 세포에서 SARS-CoV-2 Nucleocapsid 단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 9).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> GENOMICTREE, INC.
<120> Gene Construct for Expressing mRNA
<130> P21-B205
<160> 23
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Leader Sequence
<400> 1
attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct 60
gttctctaaa cg 72
<210> 2
<211> 83
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UTR
<400> 2
attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct 60
gttctctaaa cgaacaaact aaa 83
<210> 3
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UTR
<400> 3
attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct 60
gttctctaaa cgaaca 76
<210> 4
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UTR
<400> 4
attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct 60
gttctctaaa cgaactt 77
<210> 5
<211> 196
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UTR
<400> 5
caatctttaa tcagtgtgta acattaggga ggacttgaaa gagccaccac attttcaccg 60
aggccacgcg gagtacgatc gagtgtacag tgaacaatgc tagggagagc tgcctatatg 120
gaagagccct aatgtgtaaa attaatttta gtagtgctat ccccatgtga ttttaatagc 180
ttcttaggag aatgac 196
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 6
taatacgact cactataggg attaaaggtt tataccttcc cagg 44
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 7
tcttccttgc catgttgagt 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 8
tcaaacctct tagtaccatt gg 22
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 9
aagactcacg ttaacaatat tgc 23
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Promoter
<400> 10
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<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 11
tttagtttgt tcgtttagag aacagatc 28
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 12
caatctttaa tcagtgtgta acattagg 28
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 13
gtcattctcc taagaagcta ttaaaatcac 30
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 14
ctctaaacga acaaactaaa atggtgagca agggcgagga 40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 15
tacacactga ttaaagattg ttacttgtac agctcgtcca 40
<210> 16
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 16
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
tttttgtcat tctcctaaga agctattaa 89
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 17
ctctaaacga acaaactaaa caatctttaa tcagtgtgta 40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Gene Construct
<400> 18
taatacgact cactataggg attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac 60
tttcgatctc ttgtagatct gttctctaaa cgaacaaact aaaatggtga gcaagggcga 120
ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca 180
caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa 240
gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac 300
ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa 360
gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa 420
ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct 480
gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta 540
caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt 600
caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa 660
cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc 720
cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac 780
cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag taacaatctt taatcagtgt 840
gtaacattag ggaggacttg aaagagccac cacattttca ccgaggccac gcggagtacg 900
atcgagtgta cagtgaacaa tgctagggag agctgcctat atggaagagc cctaatgtgt 960
aaaattaatt ttagtagtgc tatccccatg tgattttaat agcttcttag gagaatgaca 1020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080
aaaa 1084
<210> 19
<211> 364
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Gene Construct
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taatacgact cactataggg attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac 60
tttcgatctc ttgtagatct gttctctaaa cgaacaaact aaacaatctt taatcagtgt 120
gtaacattag ggaggacttg aaagagccac cacattttca ccgaggccac gcggagtacg 180
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aaaa 364
<210> 20
<211> 1624
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Gene Construct
<400> 20
taatacgact cactataggg attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac 60
tttcgatctc ttgtagatct gttctctaaa cgaacaaact aaaatgtctg ataatggacc 120
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caataatact gcgtcttggt tcaccgctct cactcaacat ggcaaggaag accttaaatt 300
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caaagacggc atcatatggg ttgcaactga gggagccttg aatacaccaa aagatcacat 540
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gaagaaacag caaactgtga ctcttcttcc tgctgcagat ttggatgatt tctccaaaca 1320
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atcgagtgta cagtgaacaa tgctagggag agctgcctat atggaagagc cctaatgtgt 1500
aaaattaatt ttagtagtgc tatccccatg tgattttaat agcttcttag gagaatgaca 1560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620
aaaa 1624
<210> 21
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<212> DNA
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<220>
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<400> 21
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<223> Primer
<400> 22
gccgaatagc ttatttgtag caatctttaa tcagtgtgta 40
<210> 23
<211> 895
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Gene Construct
<400> 23
taatacgact cactataggg attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac 60
tttcgatctc ttgtagatct gttctctaaa cgaacaaact aaaatgacca tgtgtagcgg 120
agcgaggctg gccctgctgg tctatgggat aatcatgcac agcagcgtct acagctcacc 180
tgccgccgcc ggactccggt tccccgggat caggccagag gaagaggcgt acggcgagga 240
cggaaacccg ctgccagact tcgatggctc ggagccgccg ggcgcaggga gccccgcctc 300
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tttagtagtg ctatccccat gtgattttaa tagcttctta ggagaatgac aaaaaaaaaa 840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 895
Claims (13)
- 타겟 유전자의 mRNA 발현을 위한 코딩 영역 (coding region);
상기 코딩 영역의 상류 (upstream)에 위치하는 5' 비번역 영역 (UTR); 및
상기 코딩 영역의 하류 (downstream)에 위치하는 3' 비번역 영역 (UTR)을 포함하는 유전자 구조체로,
상기 5' 비번역 영역 (UTR)은 코로나바이러스의 리더 서열을 포함하는 유전자 구조체.
- 제1항에 있어서, 상기 5' 비번역 영역 (UTR)은 서열번호 1로 표시되는 코로나바이러스 (SARS-CoV-2: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)의 리더 서열을 포함하는 유전자 구조체.
- 제1항에 있어서, 상기 5' 비번역 영역 (UTR)은 인간 코로나바이러스 229E, OC43, HKU1, NL63, SARS-1, 또는 MERS 유래의 리더 서열을 포함하는 유전자 구조체.
- 제1항에 있어서, 상기 5' 비번역 영역 (UTR)은 서열번호 2 내지 서열번호 4로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 서열을 포함하는 유전자 구조체.
- 제1항에 있어서, 상기 3' 비번역 영역 (UTR)은 서열번호 5의 서열을 포함하는 유전자 구조체.
- 제1항에 있어서, 프로모터 및/또는 폴리(A) 서열을 추가로 포함하는 유전자 구조체.
- 제6항에 있어서, 상기 프로모터는 5' 비번역 영역 (UTR)의 상류에 위치하는 유전자 구조체.
- 제6항에 있어서, 상기 폴리(A) 서열은 3' 비번역 영역 (UTR)의 하류에 위치하는 유전자 구조체.
- 제1항에 있어서, 서열번호 18 또는 19의 서열을 포함하는 유전자 구조체.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 유전자 구조체를 포함하는 유전자 구조체를 포함하는 벡터
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 유전자 구조체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 유전자 구조체를 포함하는 백신 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 유전자 구조체를 포함하는 유전자 치료용 조성물.
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