CN112813063A

CN112813063A - 脂代谢紊乱动物模型构建以及利用aav-crispr/cas9的修复

Info

Publication number: CN112813063A
Application number: CN201911119899.8A
Authority: CN
Inventors: 周斌; 赵欢
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Priority date: 2019-11-15
Filing date: 2019-11-15
Publication date: 2021-05-18

Abstract

本发明涉及脂代谢紊乱动物模型构建以及利用AAV‑CRISPR/CAS9的修复。本发明构建了具有典型脂代谢紊乱疾病症状的动物模型。本发明还构建了可以靶向性修复低密度脂蛋白受体并抑制脂代谢紊乱疾病的构建体，所包装获得的病毒可以持续有效地实现低密度脂蛋白受体的修复，作用时间长，稳定性好。

Description

脂代谢紊乱动物模型构建以及利用AAV-CRISPR/CAS9的修复

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体地，本发明涉及脂代谢紊乱动物模型构建以及利用AAV-CRISPR/CAS9的修复。

背景技术

心血管疾病是全世界危害最大的疾病之一，是导致人类疾病死亡的首要原因，尤其是动脉粥样硬化引起的心肌梗死和脑卒中已成为中国人最主要的死亡原因。家族性高胆固醇血症(familial hypercholesterolemia，FH)是一种有家族性特征的常染色体显性遗传疾病，发生率约为1/200-1/500，患者主要临床表现为血浆中低密度脂蛋白胆固醇数值(LDL-C)异常超高，使得胆固醇沉积在皮肤、肌腱和冠状动脉等位置，而引起黄斑瘤、黄色瘤和动脉粥样硬化，给患者带来生命威胁。家族性高胆固醇血症通常由LDLR、APOB和PCSK9三个基因中的一个发生致病变异引起的，其中最主要由LDLR基因突变所致。该疾病包含两种临床亚型，纯合型家族性高胆固醇血症患者在10岁左右甚至更小就出现冠心病的症状和体征，多在30岁前死于心血管疾病，而杂合型家族性高胆固醇血症患者多在30～40岁患冠心病，即使只是一个有缺陷的基因拷贝，也使患者更易受到高胆固醇水平影响，最终得心血管疾病。该病的临床治疗包括药物治疗(最大耐受剂量的他汀类药物、于依折麦布、盂胆汁酸螯合剂、米泊美生和洛美他派等)、血浆清除治疗和肝移植，但是这些治疗方法存在药物时效性和不良反应、费用昂贵、肝供体不足及排斥反应等现象。

CRISPR/Cas9系统，原本是存在于细菌和古细菌中的一种免疫机制，现已被成功地人工改造使其成为第三代人工核酸内切酶，由于其成本低、系统简单及突变效率高等特点，被认为是一种具有良好应用前景的基因组定点改造工具。但是，CRISPR/Cas9系统也存在诸多缺陷，包括：其质粒仍然较大，转染难度较大；该系统具有碱基识别偏好性，局限了基因编辑的运用范围，而且不同基因位点编辑效率不同。此外，CRISPR/Cas9存在的脱靶效应也是本领域的难题，即该技术可以发生非特异性切割，引起基因组非靶向位点的突变，造成研究结果的不确定性。上述的CRISPR/Cas9的技术缺陷，不仅对于CRISPR/Cas9系统的正确设计及应用提出了难题，同时也限制了其在临床药物研究中的广泛应用，目前临床上鲜少以基于CRISPR/Cas9的药物。

人类体内已命名基因有25000多个，目前已发现大约3000个基因的突变会引起各种遗传性疾病。但是，尽管有相当数量的基因与疾病的相关性已经被人们了解，但是却仍然鲜少靶向性治疗药物被成功开发，有一些仅在理论研究阶段。目前，利用CRISPR/Cas9成功建立动物模型也因脱靶等问题的存在而难以成功制备或稳定性差的问题。

综上，本领域尚没有开发出基于基因编辑技术且以脂代谢紊乱相关蛋白作为靶点的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供脂代谢紊乱动物模型构建以及利用AAV-CRISPR/CAS9的修复。

在本发明的第一方面，提供一种制备脂代谢紊乱疾病的啮齿类动物模型的方法，包括：针对啮齿类动物基因组中编码低密度脂蛋白受体第208位(其序列编号相应于或基于鼠源低密度脂蛋白受体)的密码子，利用CRISPR/Cas系统引入终止子；所述CRISPR/Cas系统包括：sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；和含有突变位点的外源模板链序列。

在一个优选例中，所述的含有突变位点的外源模板链序列将低密度脂蛋白受体第208位突变为终止子，其具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。

在另一优选例中，通过显微注射啮齿类动物受精卵来引入CRISPR/Cas系统，进而引入终止子。

在另一优选例中，在啮齿类动物生长后，进行高脂饮食诱导，获得脂代谢紊乱疾病的啮齿类动物模型。

在另一优选例中，所述的高脂饮食为食物中含有高于20％(如20～25％；w/w)的脂肪和高于0.2％(如0.20～0.25％；w/w)的胆固醇。

在本发明的另一方面，提供一种用于制备脂代谢紊乱疾病的啮齿类动物模型的试剂盒，其中包括：CRISPR/Cas系统，包括sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；和含有突变位点的外源模板链序列。

在一个优选例中，所述的含有突变位点的外源模板链具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：高脂饮食，所述高脂饮食为食物中含有高于20％(如20～25％；w/w)的脂肪和高于0.2％(如0.20～0.25％；w/w)的胆固醇。

在本发明的另一方面，提供所述的方法或所述的试剂盒在制备脂代谢紊乱疾病的啮齿类动物模型中的应用。

在本发明的另一方面，提供利用所述的方法或所述的试剂盒获得的脂代谢紊乱疾病的啮齿类动物模型的应用(较佳地，为非诊断或治疗性的应用)，用于：作为筛选缓解或治疗脂代谢紊乱疾病的候选药物或治疗剂的动物模型；或用于作为研究脂代谢紊乱疾病的动物模型；或用于作为研究脂代谢紊乱疾病的药物的动物模型。

在本发明的另一方面，提供一种靶向性修复低密度脂蛋白受体的方法，包括：以腺相关病毒递送Cas酶编码基因以及针对低密度脂蛋白受体基因的sgRNA至细胞内，从而靶向性修复低密度脂蛋白受体；所述腺相关病毒携带一供体序列，该供体序列来自低密度脂蛋白受体基因且包含编码野生型低密度脂蛋白受体第208位(其序列编号相应于或基于鼠源低密度脂蛋白受体，对于人的低密度脂蛋白受体同源序列而言为第207位)的密码子。

在一个优选例中，Cas酶的表达盒被置于腺相关病毒载体1中，sgRNA和供体序列片段的表达盒被置于腺相关病毒载体2中，分别包装为腺相关病毒1和腺相关病毒2；其中，所述Cas酶的表达盒中，包含TBG启动子，核定位信号序列，Cas酶编码核酸序列，末端反向重复序列；所述sgRNA和供体序列片段的表达盒中，包含U6启动子，sgRNA，供体序列，末端反向重复序列；所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在另一优选例中，以腺相关病毒感染细胞时，腺相关病毒1和腺相关病毒2按照滴度的比例为1:(7～15)；较佳地为1:(8～12)；更佳地为1:10。

在另一优选例中，所述靶向性修复低密度脂蛋白受体的方法为不以治疗为目的的方法。

在本发明的另一方面，提供一种试剂盒，其中包括腺相关病毒载体或由该载体包装而成的腺相关病毒，所述腺相关载体包含：Cas酶编码基因；针对低密度脂蛋白受体基因的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；供体序列，该供体序列来自低密度脂蛋白受体基因且包含编码野生型低密度脂蛋白受体第208位的密码子。

在一个优选例中，所述的供体序列长1800～2000bp；较佳地长1900±50bp；更佳地，所述的供体序列具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的腺相关病毒载体包括腺相关病毒载体1和腺相关病毒载体2；或，所述的腺相关病毒包括腺相关病毒1和腺相关病毒2；所述腺相关病毒载体1中包括Cas酶的表达盒，所述腺相关病毒载体2中包括sgRNA和供体序列片段的表达盒。

在另一优选例中，所述Cas酶的表达盒中，包含TBG启动子，核定位信号序列，Cas酶编码核酸序列，末端反向重复序列。

在另一优选例中，所述sgRNA和供体序列片段的表达盒中，包含U6启动子，sgRNA，供体序列，末端反向重复序列；所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在另一优选例中，按照病毒滴度，所述腺相关病毒载体1和腺相关病毒载体2的比例为1:(7～15)；较佳地为1:(8～12)；更佳地为1:10。

在本发明的另一方面，提供前一方面所述的试剂盒的用途，用于制备缓解或治疗脂代谢紊乱疾病的药物，所述脂代谢紊乱疾病由低密度脂蛋白受体第208位(其序列编号相应于或基于鼠源低密度脂蛋白受体，对于人的低密度脂蛋白受体同源序列而言为第207位)氨基酸的变异引起。

在一个优选例中，所述的脂代谢紊乱疾病包括：高胆固醇血症(如家族性高胆固醇血症)，高甘油三酯血症，动脉粥样硬化症，高血脂症，肥胖症，心肌梗死，脑卒中。

在另一优选例中，所述高胆固醇血症包括家族性高胆固醇血症。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、LDLR^E208X工具小鼠的构建及验证。

(A)病人家系中鉴定出低密度脂蛋白受体基因的无义变异。(B)小鼠和人的LDLR蛋白Blast结果。(C)LDLR^E208X工具小鼠的构建策略。(D)LDLR^E208X工具小鼠的Sanger测序结果。(E-F)LDLR^E208X小鼠肝脏组织反转PCR结果。(G-H)LDLR^E208X小鼠肝脏组织的western结果。(I-J)LDLR^E208X小鼠肝脏组织切片的免疫荧光组化结果。每个图片代表至少6个单独样本。

图2、LDLR^E208X工具小鼠经高脂诱导可产生动脉粥样硬化。

(A)LDLR^E208X小鼠和wild-type小鼠高脂饮食诱导策略。(B)LDLR^E208X小鼠和wild-type小鼠体重增长趋势。(C)LDLR^E208X小鼠和wild-type小鼠主动脉纵剖面油红染色结果。(D)LDLR^E208X小鼠和wild-type小鼠主动脉根切片油红染色结果。(E)主动脉纵剖面油红染色统计结果。(F)主动脉根切片油红染色结果统计。(G)左侧为LDLR^E208X小鼠和wild-type小鼠主动脉根切片SMC，Ve-cad免疫荧光染色结果，右侧为SMC，F4/80免疫荧光染色结果。(H)LDLR^E208X小鼠和wild-type小鼠主动脉根切片Sirus Red染色结果。(I)LDLR^E208X小鼠和wild-type小鼠肝脏切片肝脏切片油红染色结果。(J)肝脏切片油红染色统计结果。(K)不同组小鼠血浆中TC、TG、LDL-C统计结果。每个图片代表至少6个单独样本。

图3、AAC-CRISPR/Cas9系统可部分恢复LDLR蛋白表达。

(A)AAV-Cas9和AAV-sgRNA-Donor构建策略。(B)小鼠分组、AAV注射和小鼠分析策略。(C)不同组小鼠深度测序结果。(D-E)不同组小鼠肝脏组织的反转PCR结果。(F-G)不同组小鼠肝脏组织的western结果。(H-I)不同组小鼠肝脏组织切片的免疫荧光组化结果。每个图片代表至少6个单独样本。

图4、LDLR^E208X工具小鼠经AAV-CRISPR/Cas9治疗后动脉粥样硬化得到改善。

(A)不同组小鼠实验策略和高脂饮食诱导策略。(B)不同组小鼠体重增长趋势。(C)不同组小鼠主动脉纵剖面油红染色结果。(D)不同组小鼠主动脉根切片油红染色结果。(E)小鼠主动脉根切片SMC，Ve-cad免疫荧光染色结果。(F)主动脉纵剖面油红染色统计结果。(G)主动脉根切片油红染色结果统计。(H)不同组小鼠肝脏切片油红染色结果。(I)肝脏切片油红染色统计结果。(J)不同组小鼠血浆中TC、TG、LDL-C统计结果。每个图片代表至少6个单独样本。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，构建了能够呈现脂代谢紊乱症状(包括高脂血症和动脉粥样硬化)的动物模型，所述动物状态稳定可控，疾病症状典型。同时本发明人还建立了用于递送Cas酶以及针对低密度脂蛋白受体基因的sgRNA和供体序列的腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)，实现利用Cas酶、gRNA以及供体序列靶向性修复低密度脂蛋白受体并抑制脂代谢紊乱疾病；本发明获得的病毒可以持续有效地实现低密度脂蛋白受体的修复，作用时间长，稳定性好。

术语

如本文所用，所述的“元件”是指一些对于蛋白的表达有用的一系列功能性的核酸序列，本发明中，所述的“元件”被系统地构建以形成一种表达构建体。所述的“元件”的序列可以是本发明中所提供的那些，也包括它们的变体，只要这些变体基本上保留了所述“元件”的功能，其通过插入或删除一些碱基(如1-50bp；较佳地1-30bp，更佳地1-20bp，更佳地1-10bp)，或进行随机或定点突变等来获得。

如本文所用，所述的“操作性连接”或“可操作性相连”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的基因所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、目的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。

如本文所用，所述的“构建物(或称构建体)”指一种已经通过人为干预，使其含有按照自然界中不存在的序列所组合和排列的DNA片段的单链或者双链DNA分子。所述的“构建物”包括表达载体；或者，所述的“构建物”被包含在表达载体中、作为表达载体的一部分。

如本文所用，所述“sgRNA靶点”是指本发明中感兴趣的基因中适于进行基因编辑操作的目标区域。

如本文所用，术语“动物”较佳地为啮齿类动物；例如，包括(但并不限于)：大鼠、小鼠。

动物模型的制备及应用

本发明人致力于脂代谢紊乱动物模型的建立，在前期研究工作中进行了多靶点多方面的分析，最终定位于低密度脂蛋白受体(Low-density lipoprotein receptor，LDLR)基因的无义变异，以之作为靶标，再结合CRISPR/Cas技术来进行动物模型的制备。在设计动物模型的过程中，本发明人针对相应于该208位点附近的序列位置进行了反复分析研究和实验验证，发现在这一位点及其附近区域上，不合适的位置选择会导致靶向效率低、脱靶效率高，无法获得有用的动物模型、动物模型症状不典型或动物产生其它一些不正常反应。经过反复试验，本发明人最终确定了以外源模板链结合sgRNA靶向的方案，并且优化了模板链的序列和sgRNA序列。本发明首次基于基因编辑手段，通过优化设计成功建立了脂代谢紊乱疾病的动物模型。

因此，本发明提供了一种脂代谢紊乱疾病的动物模型，该动物模型的制备方法包括：针对鼠基因组中编码低密度脂蛋白受体第208位的密码子，利用CRISPR/Cas系统引入终止子。在本发明的优选方式中，所述CRISPR/Cas系统包括：sgRNA和含有突变位点的外源模板链序列。

本发明中，采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，作为构建动物模型的基础。合适的sgRNA靶位点，会带来更高的基因编辑效率，本发明人设计并找到了优选的靶位点，基于此设计了sgRNA。将sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸、Cas9 mRNA或能形成所述Cas9 mRNA的核酸共转入动物受精卵中，获得经基因编辑的动物。作为一种选择，所述的能形成所述sgRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，或所述的能形成所述Cas9 mRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，将这些表达载体导入到细胞内，从而在细胞内形成有活性的sgRNA及Cas9mRNA。此外，还可以体外转录获得Cas9 mRNA以及sgRNA。

本发明构建的动物模型可以用于特定药物的筛选和测试试验。药物筛选时，候选药物或治疗剂是指已知具有某种药理学活性或正在被检测的可能具有某种药理学活性的物质，包括但不限于核酸、蛋白、糖类、化学合成的小分子或大分子化合物、细胞等。候选药物或治疗剂的给药方式可以是口服、静脉注射、腹腔注射、皮下注射、椎管给药或直接脑内注射。

本领域技术人员均了解，由于机体基因的复杂性、疾病受多种信号通路影响、机体自身的代偿或修复机制等种种因素的存在，使得本领域中难以获得呈现典型的疾病症状的动物模型。而本发明经过优化设计，克服了此类技术难题。

本发明构建的动物模型可作为科学研究和新药评价的有力工具。

本发的制备动物模型的方法操作简单，获得的动物模型稳定性好，能够良好地模拟人体内的LDLR变异，其导致的疾病症状非常典型。本发明的动物模型为家族性高胆固醇血症等病症的致病机理的研究、药物筛选和临床治疗提供了新途径。

基于本发明的方法，本发明还提供了用于制备脂代谢紊乱疾病的动物模型的试剂盒，所述试剂盒中包括：使动物基因组中第208位密码子发生变异、形成终止子的密码子的CRISPR/Cas系统。优选地，所述CRISPR/Cas系统包括：sgRNA和含有突变位点的外源模板链序列。所述的试剂盒中，还可包括说明制备本发明的动物模型的方法的使用说明书，以便于本领域技术人员应用。

药物设计及LDLR修复

在获得了脂代谢紊乱的动物模型后，本发明人进一步研究靶向性修复低密度脂蛋白受体并抑制脂代谢紊乱疾病的试剂和方法。经过广泛而深入的研究后，本发明人多次改进前期设计方案，最终设计了利用AAV递送Cas酶、sgRNA和供体序列的方法和试剂，可高效精确地修复LDLR并抑制脂代谢紊乱疾病的形成和发展。对于该种疾病而言，本发明首次通过基因编辑的方式来实现有效的缓解或治疗。

AAV是一种不能自我复制的病毒，具有较低的免疫原性。但是AAV病毒载体装载容量是受限的，这限制了其使用。本领域中，能够以AAV病毒进行成功转染的实例相对并不多。本发明中，进行了适当的设计，从而使得AAV具有合适的装载量，确保了其高效的工作。

AAV载体是利用天然存在的AAV某些特性经过基因工程改造后产生的一种可供人工转基因的载体。在本发明的优选方式中，进行了优化构建。

本发明中，针对ldlr基因，给出了适用于进行靶向性操作的sgRNA，可实现针对ldlr的高效精确的靶向性操作，没有观测到脱靶效应以及其它不良副作用。

作为本发明的优选方式，提供了表达Cas酶的表达盒，包括如下操作性连接的序列元件：启动子序列，核定位信号1序列，Cas酶编码核酸序列，核定位信号2序列；较佳地，在启动子序列的5’端，还包括末端反向重复序列；较佳地，在核定位信号2序列的3’端，还包括末端反向重复序列。在优选的方式中，所述的启动子为TBG启动子，本发明人发现，将其应用于本发明中，其序列长度适当且驱动基因表达的活性很理想，可以在肝组织中特异性地驱动Cas酶的表达。

作为本发明的优选方式，提供了表达针对ldlr的sgRNA和供体序列片段的表达盒，包括如下操作性连接的序列元件：启动子序列，sgRNA，供体序列；较佳地，在启动子序列的5’端，还包括末端反向重复序列；较佳地，在供体序列的3’端，还包括末端反向重复序列。在优选的方式中，所述的启动子为U6启动子。本发明的构建中，对于sgRNA的靶向位点以及供体序列的位置及长度，进行了优化选择，同时考虑了AVV病毒载体的包装特点、装载量(需考虑序列的精简)，以及兼顾了sgRNA靶向位点、供体序列长度以及它们在基因编辑过程中的相互配合。

作为本发明的优选方式，Cas酶的表达盒被置于AVV载体1中，sgRNA和供体序列片段的表达盒被置于AVV载体2中，分别包装为AVV1和AVV2。本发明的设计保证了目的包装系统具有合适的大小，有效减小病毒的包装难度，提高AAV的包装效率。

本发明人还分析了包装获得的AVV1和AVV2的在感染细胞时的感染效率，作为本发明的优选方式，以腺相关病毒感染细胞时，腺相关病毒1和腺相关病毒2按照滴度的比例为1:(7～15)；较佳地为1:(8～12)；更佳地为1:10。本发明人发现，两者在约1:10左右的滴度比例，具有良好的感染效率。

本发明人的优化设计，克服了AAV包装容量有限、转染效率低等一系列问题，成功地获得理想的重组AAV，以适当的比例感染动物，从而获得疾病症状发生极为显著改善的动物。

在本发明的具体实施例中，本发明人利用CRISPR/Cas9系统，在LDLR基因第四外显子核心功能区设计靶标，通过体外转录Cas9酶和sgRNA并显微注射受试动物的受精卵进行基因定点无义突变，引起LDLR氨基酸编码提前终止，导致编码蛋白结构功能异常。取出生后抽提受试动物的DNA，Sanger测序法检测基因突变情况，详细观察分析正确基因突变的小鼠表型，比对病人临床症状，进而深入研究疾病的病理生理过程和参与调控的分子机制，实现了突变小鼠模型的基因回复和疾病纠正。

根据本发明中所提供的各个元件的信息，进行了适当的变化且仍然保留其原有功能的上述元件的变异体也包括在本发明中。例如，在严格条件下与本发明限定的序列杂交且具有相同功能的序列变异体。如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的同源性至少在70％以上、更佳地75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。例如，所述序列也可为这些所限定序列的互补序列。

本发明的各元件所指向的基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

所述的载体中上述元件的上游以及下游的位置，还可包括限制性的酶切位点、标签序列等，这样有利于各元件的有机连接以及鉴定。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于进行病毒的包装。

在本发明的具体实施例中，将包装好表达Cas酶、sgRNA和供体序列的AAV病毒以适当比例给予动物体时，成功地获得LDLR被修复的动物体，其脂代谢表型具有明显的改善。

本发明还提供了本发明还提供了一种组合物(如药物组合物)，它含有有效量的本发明包装获得的AVV1和AAV2，以及药学上可接受的载体。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的如本文所用。如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

通常，可将所述腺病毒配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为6-8。

本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。活性成分(腺病毒)的给药量是治疗有效量，这是熟练医师技能范围之内的。

本发明还提供了包含有所述AVV1载体和AAV2载体或由所述载体包装而成的病毒的试剂盒/药盒。

其它常用于进行病毒包装、转染、注射等的试剂也可被包含在所述的试剂盒/药盒中，以方便本领域技术人员使用。此外，所述试剂盒中还可包含有指导本领域技术人员操作的使用说明书。

本发明的技术方案，论证了基于CRISPR/CAS酶技术进行体内LDLR修复、进而缓解或治疗脂代谢紊乱相关疾病的可实施性，为临床脂代谢紊乱相关疾病提供了有效的、精确的新型治疗工具。

同时，本发明中首次使用AAV来运载高效精确的RNA编辑工具，靶向LDLR，治疗效果稳定。

本发明中，所述的脂代谢紊乱相关疾病是与LDLR第208位氨基酸的变异(蛋白编码提前终止)相关的疾病，可以包括：高胆固醇血症，高甘油三酯血症，动脉粥样硬化症，高血脂症，肥胖症，心肌梗死，脑卒中。更特别地，所述的疾病如家族性高胆固醇血症。家族性高胆固醇酯血症与LDLR的致病变异密切相关，其致病机理尚未完全阐述清楚，现有的药物和手术治疗方法都存在一些弊端，因此本发明构建的动物模型以及提供的药物设计方案，对该疾病的致病机理研究、药物筛选、药物应用方面有重要意义。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、低密度脂蛋白受体变异及其致病机制

本发明人从病人家系中鉴定出低密度脂蛋白受体(Low-density lipoproteinreceptor，ldlr)基因的无义变异，该变异发生在LDLR的第207位氨基酸的密码子上，该密码子由GAG突变为TAG，使得蛋白发生E207X突变(X表示密码子终止)，该位点的无义突变可以引起LDLR氨基酸编码和肽链合成提前终止(图1A)。这一突变为家族性高胆固醇酯血症的致病变异。鼠源LDLR与人源LDLR高度保守，在鼠源的LDLR中，该位点为第208位，如图1B。

LDLR的第207位氨基酸位置及其附近位置所对应的核苷酸序列如下(其中以下划线标示突变位置)：

TGTGGTAGCAGTTAGTGTATCCATCGC(SEQ ID NO:1)；

上述序列中，下划线位点即为突变位点。该位点的无义突变可以引起LDLR氨基酸编码和肽链合成提前终止，本发明人进一步研究这一提前终止是否导致LDLR蛋白功能异常。鉴于已发现LDLR+/-杂合敲除小鼠表型复杂且不稳定，因此本发明人利用LDLR^E208X雄性纯合小鼠进行研究。

利用CRISPR/Cas9系统，本发明人在ldlr基因(GenBank accession number:NM_010700.3；Ensembl:ENSMUSG00000032193)第四外显子核心功能区(208E→终止子)设计靶标，通过体外转录Cas9酶、含有突变位点的外源模板链(GAG>TAG)和sgRNA。在设计过程中，本发明人针对相应于该208位点附近的序列位置进行了反复分析研究和实验验证，设计了一系列的靶向方案。本发明人发现，在这一位点及其附近区域上，不合适的位置选择会导致靶向效率低、脱靶效率高，无法获得有用的动物模型、动物模型症状不典型或动物产生其它一些不正常反应。经过反复试验，本发明人最终确定了以外源模板链结合sgRNA靶向的方案，并且优化了模板链的序列和sgRNA序列。

含有突变位点的外源模板链序列如下(其中第61位为G→T突变位点)：

sgRNA序列：CGTCACAGACCCAGCTGCGATGG(SEQ ID NO:3)；

显微注射小鼠受精卵进行基因定点无义突变，显微注射后的小鼠受精卵送到代孕母鼠输卵管中，对F1代小鼠剪尾提取DNA后，使用特定引物PCR突变片度，然后Sanger测序，鉴定基因定点无义突变，成功构建LDLR^E208X小鼠(图1C)。取出生后小鼠尾尖抽提DNA，Sanger测序法检测基因突变情况确认E208X点突变成功敲入双链(图1D)，待成体后详细观察分析正确基因突变的小鼠表型，反转PCR证明没有ldlr RNA水平的表达，通过Western检测和免疫组化荧光染色发现LDLR^E208X纯合小鼠肝脏没有LDLR蛋白的表达(图1G-J)。

新生小鼠生长至6周，进行高脂饮食诱导，直至18周时进行分析(图2A)。

LDLR^E208X一段时间的高脂饮食(High fat diet，食物中含21％脂肪和0.21％胆固醇)诱导后体重增加(图2B)。

纵剖整根主动脉展开进行油红染色，野生型对照组未见红色中性脂质沉积，LDLR^E208X可以观察到明显的脂质斑块即动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)表型(图2C，E)。

对主动脉根部4％多聚甲醛固定，30％蔗糖脱水，冰冻切片油红染色，可以看到主动脉瓣膜处聚集脂质斑块(图2D，F)。

进行免疫荧光染色，可以看到血管炎症加重，平滑肌细胞成分减少(图2G，H)，肝脏中脂质堆积(图2I，J)。

血浆中胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(total triglyceride，TG)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-cholesterol，LDL-C)等指标的测定结果显示，这些指标均有明显上升(图2K)。

LDLR是血浆中重要的总胆固醇运输蛋白，它通过与载脂蛋白B及载脂蛋白E结合，介导清除血浆中的低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白，由于LDLR蛋白表达的缺失，大量中间密度脂蛋白转化为低密度脂蛋白，无法及时清出体内，导致低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和乳糜微粒增加，总胆固醇的浓度增加，高脂饮食诱导后，表现出明显的、典型的高脂血症和动脉粥样硬化。高脂血症和动脉粥样硬化是家族性高胆固醇血症的临床表型，因此所述动物为家族性高胆固醇血症的动物模型。

实施例2、基因回复及疾病纠正

在阐明疾病的病理过程和参与调控的病理分子机制之后，接着本发明人尝试进行基因回复及疾病纠正。

本发明人使用腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)包装Cas9，尝试点突变基因回复和疾病纠正。本发明人将Cas9质粒、sgRNA及Donor分别包装进腺相关病毒AAV8，获得AAV8-TBG-Cas9和AAV8-U6-sgRNA-Donor(图3A)，图中简称AAV8-Cas9和AAV8-sgRNA-Donor。Cas9质粒构建中，具体的元件及其连接顺序如下(图3A)：

ITR-TBG-Flag-NLS-Cas9-NLS-ITR；

ITR-U6-sgRNA-Donor-ITR；

其中sgRNA序列为：GGGCTGCTAACGCCTTTGGAGG(SEQ ID NO:4)；(其中下划线为sgRNA的PAM序列)

其中供体(Donor)序列如下(SEQ ID NO:5)：

TCACTAGGTGCCAGTGTGCTTCTCagcagtgtgtcctggtatcatactacttatgtgcagatccattcttaaggcccacagtggccgggcagtggtggtgcacgcctttaatcccagcactcgggaggcagaggcaggtagatttctgagttcgaggccagcctggtctacagagtgagttccgggatagccagggctacacagagaaaccctgtcttgaaaaaccaacaaccaaaacaaaacaaggcccacagtggatacttgggacacaagagtgcagaaccctgaatattatctctgtataatgtggtaatgtgggtctccctatatatacatgccctcactagagtataatttatacatttagcaagataagcagttcgcagcacaacctaaagcattaagatgtggctcaatacccaccccagtgaggggctcataggtacagaactggcttgatagttgaccatatggatgaggaaaccgaggcagaaaagggtgtgttgtagcttcctgagccctagtgtactaccacccatggctctgctaaatgggttgtgtgtttttgaagcacacggtcctgtctgcgaataggctggtgtaagccatagcctgacagggccctctcctccctgtgcacccctgcagCCCCCAAGACGTGCTCCCAGGATGACTTCCGATGCCAGGATGGCAAGTGCATCTCCCCGCAGTTTGTGTGTGATGGAGACCGAGATTGCCTAGATGGCTCTGATGAGGCCCACTGCCAGGCCACCACTTGTGGCCCCGCCCACTTCCGCTGCAACTCATCCATATGCATCCCCAGTCTTTGGGCCTGCGACGGGGATGTCGACTGTGTTGACGGCTCCGATGAGTGGCCACAGAACTGCCAGGGCCGAGACACGGCCTCCAAAGGCGTTAGCAGCCCCTGCTCCTCCCTGGAGTTCCACTGTGGTAGCAGTGAGTGTATCCATCGCAGCTGGGTCTGTGACGGCGAGGCAGACTGCAAGGACAAGTCAGATGAGGAGCACTGCGgtaaggccctggACTAGTggaggagggatggatgattggctccccaggccctgctggggagctttggggcttagcaataaccagactgcccagaaaggaagttgattggttttgggtaaggggctggttgggtaggtagagcgtctgctgccagagcacgaagtcctgagttcaaatctccagcagcacagccatgctgtggagacaggggcatggctggagcttgttggctcccagcctggttcccgattcattgagagaccctgactcggagaaggaggagccggaggagcacatacctgcatgggccccatactgcacacacaccgtgtaataaaattttaaaaattaactagagataagggctggatatgatggcacacacctttagaaacaggtgggtctcttgagttgaaggccagcctggtctacacagtgaattccaggaaagtcaggccacggagacagaacctgtctcaaataccaaaggaaataaattttttagaaaaactcaacctgccgggcagtggtggcgcatgccttaatcccagcacttgggaggcagaggcaggtggatttctgagttcaaagccaagcctggcctcctacagagtgagtagttccaggaaagccagggctacatacatacatacatacatacataagcaatcaaccaaagatgggctagaaaatgtttttatttctttggaacaatgaatttctaagagggccaagtccgtaggtcacttaccaagtgtcttagttttttgtggctgtgggcagtgaccaaggcaacttatagaagagagagtttagtgaggtttacagtttcttgaccagcatggtggggagcacggtagcagacagg(1.9kb)。

进行小鼠分组如图3B，在发生LDLR的E207X突变的P1新生小鼠皮下注射上述AAV8-TBG-Cas9和AAV8-U6-sgRNA-Donor(组3)，同时设置仅注射AAV8-TBG-Cas9的组(组1)、仅注射AAV8-U6-sgRNA-Donor的组(组2)以及野生型对照组(组4，注射PBS)。待各组小鼠成体后进行分析，由于新生小鼠肝脏具有增殖能力，所以可以通过HDR途径精确修复突变基因(图3C)，成体观察修复效果，反转PCR可以检测到RNA水平的恢复(图3D，E)，Western和免疫荧光染色可以检测到LDLR蛋白(图3F-I)。

新生小鼠生长至6周，进行高脂饮食诱导，直至18周时进行分析(图4A)。高脂饮食诱导后，治疗组体重增长显著低于对照组(图4B)。

纵剖整根主动脉展开进行油红染色，可以观察到LDLR^E208X targeted组脂质斑块明显小于LDLR^E208X untargeted对照组(组1和组2)(图4C，F)。

对主动脉根部4％多聚甲醛固定，30％蔗糖脱水，冰冻切片油红染色，可以看到主动脉瓣膜处聚集轻微的脂质沉积病变(图4D，G)，少于untargeted对照组。

进行免疫荧光染色，平滑肌细胞成分多于untargeted对照组(图4E)，肝脏切片发现脂质堆积减少(图4H，I)。

血浆中胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(total triglyceride，TG)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-cholesterol，LDL-C)等指标的测定显示，这些指标相对untargeted对照组明显降低(图4J)，动脉粥样硬化的表型得以明显地改善。

综上，论证了利用AAV-CRISPR/Cas9系统进行家族性高胆固醇血症临床治疗具有可行性，具有突出的技术效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 脂代谢紊乱动物模型构建以及利用AAV-CRISPR/CAS9的修复

<130> 195911

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(27)

<223> LDLR突变点附近序列

<400> 1

tgtggtagca gttagtgtat ccatcgc 27

<210> 2

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(123)

<223> 外源模板链序列

<400> 2

acggcctcca aaggcgttag cagcccctgc tcctccctgg agttccactg tggtagcagt 60

tagtgtatac atcgcagctg ggtctgtgac ggcgaggcag actgcaagga caagtcagat 120

gag 123

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(23)

<223> sgRNA序列

<400> 3

cgtcacagac ccagctgcga tgg 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(22)

<223> sgRNA序列

<400> 4

gggctgctaa cgcctttgga gg 22

<210> 5

<211> 1900

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1900)

<223> 供体序列

<400> 5

tcactaggtg ccagtgtgct tctcagcagt gtgtcctggt atcatactac ttatgtgcag 60

atccattctt aaggcccaca gtggccgggc agtggtggtg cacgccttta atcccagcac 120

tcgggaggca gaggcaggta gatttctgag ttcgaggcca gcctggtcta cagagtgagt 180

tccgggatag ccagggctac acagagaaac cctgtcttga aaaaccaaca accaaaacaa 240

aacaaggccc acagtggata cttgggacac aagagtgcag aaccctgaat attatctctg 300

tataatgtgg taatgtgggt ctccctatat atacatgccc tcactagagt ataatttata 360

catttagcaa gataagcagt tcgcagcaca acctaaagca ttaagatgtg gctcaatacc 420

caccccagtg aggggctcat aggtacagaa ctggcttgat agttgaccat atggatgagg 480

aaaccgaggc agaaaagggt gtgttgtagc ttcctgagcc ctagtgtact accacccatg 540

gctctgctaa atgggttgtg tgtttttgaa gcacacggtc ctgtctgcga ataggctggt 600

gtaagccata gcctgacagg gccctctcct ccctgtgcac ccctgcagcc cccaagacgt 660

gctcccagga tgacttccga tgccaggatg gcaagtgcat ctccccgcag tttgtgtgtg 720

atggagaccg agattgccta gatggctctg atgaggccca ctgccaggcc accacttgtg 780

gccccgccca cttccgctgc aactcatcca tatgcatccc cagtctttgg gcctgcgacg 840

gggatgtcga ctgtgttgac ggctccgatg agtggccaca gaactgccag ggccgagaca 900

cggcctccaa aggcgttagc agcccctgct cctccctgga gttccactgt ggtagcagtg 960

agtgtatcca tcgcagctgg gtctgtgacg gcgaggcaga ctgcaaggac aagtcagatg 1020

aggagcactg cggtaaggcc ctggactagt ggaggaggga tggatgattg gctccccagg 1080

ccctgctggg gagctttggg gcttagcaat aaccagactg cccagaaagg aagttgattg 1140

gttttgggta aggggctggt tgggtaggta gagcgtctgc tgccagagca cgaagtcctg 1200

agttcaaatc tccagcagca cagccatgct gtggagacag gggcatggct ggagcttgtt 1260

ggctcccagc ctggttcccg attcattgag agaccctgac tcggagaagg aggagccgga 1320

ggagcacata cctgcatggg ccccatactg cacacacacc gtgtaataaa attttaaaaa 1380

ttaactagag ataagggctg gatatgatgg cacacacctt tagaaacagg tgggtctctt 1440

gagttgaagg ccagcctggt ctacacagtg aattccagga aagtcaggcc acggagacag 1500

aacctgtctc aaataccaaa ggaaataaat tttttagaaa aactcaacct gccgggcagt 1560

ggtggcgcat gccttaatcc cagcacttgg gaggcagagg caggtggatt tctgagttca 1620

aagccaagcc tggcctccta cagagtgagt agttccagga aagccagggc tacatacata 1680

catacataca tacataagca atcaaccaaa gatgggctag aaaatgtttt tatttctttg 1740

gaacaatgaa tttctaagag ggccaagtcc gtaggtcact taccaagtgt cttagttttt 1800

tgtggctgtg ggcagtgacc aaggcaactt atagaagaga gagtttagtg aggtttacag 1860

tttcttgacc agcatggtgg ggagcacggt agcagacagg 1900

Claims

1.一种制备脂代谢紊乱疾病的啮齿类动物模型的方法，包括：针对啮齿类动物基因组中编码低密度脂蛋白受体第208位的密码子，利用CRISPR/Cas系统引入终止子；所述CRISPR/Cas系统包括：sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；和含有突变位点的外源模板链序列。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的含有突变位点的外源模板链序列将低密度脂蛋白受体第208位突变为终止子，其具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在啮齿类动物生长后，进行高脂饮食诱导，获得脂代谢紊乱疾病的啮齿类动物模型。

4.一种用于制备脂代谢紊乱疾病的啮齿类动物模型的试剂盒，其中包括：

CRISPR/Cas系统，包括sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；和

含有突变位点的外源模板链序列。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的含有突变位点的外源模板链具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：高脂饮食，所述高脂饮食为食物中含有高于20％的脂肪和高于0.2％的胆固醇。

7.权利要求1～3任一所述的方法或权利要求4～6任一所述的试剂盒在制备脂代谢紊乱疾病的啮齿类动物模型中的应用。

8.利用权利要求1～3任一所述的方法或权利要求4～6任一所述的试剂盒获得的脂代谢紊乱疾病的啮齿类动物模型的应用，用于：

作为筛选缓解或治疗脂代谢紊乱疾病的候选药物或治疗剂的动物模型；或

用于作为研究脂代谢紊乱疾病的动物模型；或

用于作为研究脂代谢紊乱疾病的药物的动物模型。

9.一种靶向性修复低密度脂蛋白受体的方法，包括：以腺相关病毒递送Cas酶编码基因以及针对低密度脂蛋白受体基因的sgRNA至细胞内，从而靶向性修复低密度脂蛋白受体；所述腺相关病毒携带一供体序列，该供体序列来自低密度脂蛋白受体基因且包含编码野生型低密度脂蛋白受体第208位的密码子。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，Cas酶的表达盒被置于腺相关病毒载体1中，sgRNA和供体序列片段的表达盒被置于腺相关病毒载体2中，分别包装为腺相关病毒1和腺相关病毒2；其中，

所述Cas酶的表达盒中，包含TBG启动子，核定位信号序列，Cas酶编码核酸序列，末端反向重复序列；

所述sgRNA和供体序列片段的表达盒中，包含U6启动子，sgRNA，供体序列，末端反向重复序列；所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，以腺相关病毒感染细胞时，腺相关病毒1和腺相关病毒2按照滴度的比例为1:(7～15)；较佳地为1:(8～12)；更佳地为1:10。

12.一种试剂盒，其中包括腺相关病毒载体或由该载体包装而成的腺相关病毒，所述腺相关载体包含：

Cas酶编码基因；

针对低密度脂蛋白受体基因的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

供体序列，该供体序列来自低密度脂蛋白受体基因且包含编码野生型低密度脂蛋白受体第208位的密码子。

13.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述的供体序列长1800～2000bp；较佳地长1900±50bp；更佳地，所述的供体序列具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。

14.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述的腺相关病毒载体包括腺相关病毒载体1和腺相关病毒载体2；或，所述的腺相关病毒包括腺相关病毒1和腺相关病毒2；所述腺相关病毒载体1中包括Cas酶的表达盒，所述腺相关病毒载体2中包括sgRNA和供体序列片段的表达盒。

15.如权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述Cas酶的表达盒中，包含TBG启动子，核定位信号序列，Cas酶编码核酸序列，末端反向重复序列；

16.如权利要求12～15任一所述的试剂盒，其特征在于，按照病毒滴度，所述腺相关病毒载体1和腺相关病毒载体2的比例为1:(7～15)；较佳地为1:(8～12)；更佳地为1:10。

17.如权利要求12～15任一所述的试剂盒的用途，用于制备缓解或治疗脂代谢紊乱疾病的药物，所述脂代谢紊乱疾病由低密度脂蛋白受体第208位氨基酸的变异引起。

18.如权利要求17所述的用途，其特征在于，所述的脂代谢紊乱疾病包括：高胆固醇血症，高甘油三酯血症，动脉粥样硬化症，高血脂症，肥胖症，心肌梗死，脑卒中；所述高胆固醇血症包括家族性高胆固醇血症。