WO2023231778A1 - 用于治疗粘多糖贮积症iiia型的转基因表达盒 - Google Patents

用于治疗粘多糖贮积症iiia型的转基因表达盒 Download PDF

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Definitions

  • MPS IIIA generally develops in infancy and is characterized by intellectual deterioration, behavioral and sleep disorders, loss of walking ability, and early death.
  • Central nervous system (CNS) degeneration is the main feature of MPS IIIA, but it also has physical disease manifestations. Symptoms include rough appearance, respiratory impairment, hepatosplenomegaly, skeletal dysplasia, etc. Without treatment, patients usually die within the second or third decade of life, even before puberty.
  • nucleotide sequence of the nucleic acid molecule encoding glucosamine sulfohydrolase (SGSH) is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the drug is administered by systemic or local routes, such as intravenous, intramuscular, subcutaneous, oral, topical, intraperitoneal, and intralesional administration.
  • systemic or local routes such as intravenous, intramuscular, subcutaneous, oral, topical, intraperitoneal, and intralesional administration.
  • Figure 1E shows the SGSH enzyme activity in the supernatant of Huh7 and HEK293 cells 48 h after vector transfection. *p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.001.
  • Figure 2B shows Western Blot results in Huh7 cell lysate and supernatant.
  • the promoter in the transgenic expression cassette of the present disclosure is the CB promoter or the MF3 promoter.
  • the CB promoter or MF3 promoter By using the CB promoter or MF3 promoter, the plasma SGSH enzyme activity of MPS IIIA patients can be maintained at physiological or even supraphysiological levels for a longer period of time, thereby achieving a more effective and stable therapeutic effect.
  • the disclosed medicine can stably express the SGSH protein in MPS IIIA patients and restore the central nervous system and physical diseases caused by enzyme deficiency, thereby achieving good therapeutic effects on mucopolysaccharidosis type IIIA.
  • the SGSH enzyme activity in the AAV9-CB-hSGSH1 treatment group achieved supraphysiological level expression in the spleen and heart, and the SGSH enzyme activity also increased in the kidney, lung and muscle.
  • the AAV9-CB-hSGSH1 treatment group showed a certain improvement in the level of SGSH activity in the body, achieving superphysiological level expression in the liver, heart and spleen, and significantly increasing the activity of SGSH in the brain ( Figure 5B, **p ⁇ 0.01).

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Abstract

提供可用于治疗粘多糖贮积症IIIA型的转基因表达盒及其应用、优化的编码氨基葡萄糖磺基水解酶（SGSH）的核酸分子、设计优化的新型组合型启动子、包含该转基因表达盒的基因递送系统和药物。转基因表达盒、基因递送系统和药物可以有效地恢复粘多糖贮积症患者体内的SGSH活性，同时降低糖胺聚糖的积累，对粘多糖贮积症IIIA型的外周躯体病症和中枢神经系统病症有良好的治疗效果。

Description

用于治疗粘多糖贮积症IIIA型的转基因表达盒 技术领域
本公开属于生物医学技术领域。本公开涉及可用于治疗粘多糖贮积症IIIA型的转基因表达盒及其应用、设计优化的编码氨基葡萄糖磺基水解酶(SGSH)的核酸分子、设计优化的新型组合型启动子、包含该转基因表达盒的基因递送系统和药物。
背景技术
粘多糖贮积症(mucopolysaccharidosis，MPS)是溶酶体贮积症中罕见的一种。根据致病基因与临床表现，临床上根据尿液中排出的糖胺聚糖(GAG)的种类不同，可将发现的粘多糖贮积症分为7大型，包括I、II、III、IV、VI、VII和IX型。MPS III是最常见的MPS亚型之一，患者均有硫酸乙酰肝素(HS)的先天代谢障碍。有四种不同的水解酶参与HS的代谢。依据缺乏的水解酶不同，可将粘多糖贮积症III型进一步分为A、B、C、D四种亚型。
MPS IIIA，也称为桑菲利波(Sanfilippo)综合征，是粘多糖贮积症中的一种，是由氨基葡萄糖磺基水解酶(SGSH)，一种硫酸酯酶的基因突变引起的常染色体隐性遗传病。目前，MPS IIIA型是粘多糖贮积症中相较而言略为常见的一种，约占MPS总例数的30％。
SGSH基因位于17q25.3，编码502个氨基酸。其突变造成SGSH酶活性的降低或缺失，进而引发HS的不正常累积，影响细胞与组织正常功能，过量的HS由尿排出，从而引发多种病症。
MPS IIIA一般在婴儿期发病，表现为智力退化、行为和睡眠障碍、行走能力丧失和早期死亡。中枢神经系统(CNS)退行性病变是MPS IIIA的主要特征，但其也有躯体疾病表现，症状包括面容粗糙、呼吸损害、肝脾肿大、骨骼发育不良等。如果不进行治疗，患者通常会在生命第二或第三个十年内，甚至青春期前死亡。
在临床应用中，酶替代疗法(ERT)和造血干细胞移植(HSCT)等治疗手段目前都可用于MPS IIIA患者。然而，ERT使用过程中大分子的酶不能穿过血脑屏障(Blood brain barrier，BBB)；而HSCT由于供体的局限性，无法适用于所有患者。因此，近年来，对MPS IIIA患者来说，更有效和可行的方法应当是基因治疗。
基因治疗修复酶缺陷是一次性且永久的治疗方案，尤其是应用AAV载体介导的基因 治疗。AAV安全性较高，宿主广泛，具有低致病性以及在各种器官组织中长期稳定表达蛋白的优点。目前，虽然已有一些基于AAV载体的基因治疗药物被应用于MPS IIIA的治疗，但仍存在诸多不足，如目的基因的表达水平低，启动子调控基因表达水平弱，目的基因递送至中枢神经系统的效率不高等，无法同时有效地兼顾MPS IIIA的外周躯体病症和中枢神经系统病症。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明人构建了一种新的转基因表达盒。
因此，在第一方面，本公开提供一种转基因表达盒，其包含：选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的启动子；和编码氨基葡萄糖磺基水解酶(SGSH)的核酸分子，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性，优选具有至少85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
在一个优选实施方式中，启动子选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9。通过使用SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9的启动子，可以调控SGSH更高效地表达，从而实现对MPS IIIA更好的治疗效果。
在一个更优选实施方式中，启动子为SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：7。通过使用SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：7的启动子，可以将MPS IIIA患者的血浆SGSH酶活性较长时间维持在生理水平甚至超生理水平，从而实现更有效且更稳定的治疗效果。
在一个最优选实施方式中，启动子为SEQ ID NO：7。通过使用SEQ ID NO：7的启动子，可以在MPS IIIA患者脑内实现更好的SGSH表达。
在一个优选实施方式中，编码氨基葡萄糖磺基水解酶(SGSH)的核酸分子包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
在一个更优选实施方式中，编码氨基葡萄糖磺基水解酶(SGSH)的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
在一个实施方式中，转基因表达盒还包括调控元件，例如位于两端的两个ITR；和/或复制起点；和/或猿猴病毒40内含子；和/或聚腺苷酸化信号。
在一个实施方式中，转基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21所示；优选地，转基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：21所示；更优选地，转基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO： 15或SEQ ID NO：19所示；最优选地，转基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示。
本公开的转基因表达盒包含具有改善的SGSH表达水平的优化的核酸序列，以及人工设计构造的6种新型组合型启动子和CB启动子中的一种。本公开的转基因表达盒可以有效地恢复粘多糖贮积症IIIA型患者体内的SGSH活性，同时降低GAG的积累，对MPS IIIA的外周躯体病症和中枢神经系统病症有良好的治疗效果。
在第二方面，本公开提供一种编码氨基葡萄糖磺基水解酶(SGSH)的核酸分子，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性，优选具有至少85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
在一个优选实施方式中，编码氨基葡萄糖磺基水解酶(SGSH)的核酸分子包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
在一个更优选实施方式中，编码氨基葡萄糖磺基水解酶(SGSH)的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本公开的优化的核酸分子具有更好的SGSH表达水平，由此可实现对粘多糖贮积症更好的治疗效果。
在第三方面，本公开提供一种组合型启动子，其选自：由CMV增强子、SYN1增强子和鸡β-肌动蛋白启动子组成的MF2启动子；由SYN1增强子、CMV增强子和鸡β-肌动蛋白启动子组成的MF3启动子；以及由LXP2.1增强子、SYN1增强子和鸡β-肌动蛋白启动子组成的MF5启动子。
在一个实施方式中，MF2启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，MF3启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，和/或MF5启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
本公开的新型组合型启动子具有优异的基因表达调控能力，可以调控SGSH更高效地表达，从而实现对MPS IIIA更好的治疗效果。
在一个优选的实施方式中，本公开的组合型启动子为MF3启动子。通过使用MF3启动子，可以同时实现SGSH在外周系统和神经系统的高表达。
在第四方面，本公开提供一种基因递送系统，其包括：根据第一方面所述的转基因表达盒和AAV衣壳蛋白。
在一个实施方式中，AAV衣壳蛋白为天然AAV衣壳蛋白或人工改造的AAV衣壳蛋白；优选地，所述AAV选自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、 AAV9、AAV10、AAV11，AAV12、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAV-DJ9、AAVrh8、AAVrh8R、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAV32.33、AAV3B、AAVv66、AAVXL32、AAV.PHP.B和AAV2.1。
在一个更优选实施方式中，AAV衣壳蛋白为AAV9衣壳蛋白。
在第五方面，本公开提供根据第一方面所述的转基因表达盒或根据第四方面所述的基因递送系统在制备用于治疗粘多糖贮积症IIIA型的药物中的应用。在第六方面，本公开提供一种药物，其包含：选自根据第一方面所述的转基因表达盒、根据第二方面所述的核酸分子以及根据第四方面所述的基因递送系统中的一种，以及赋形剂。
在一个实施方式中，本公开的药物用于治疗粘多糖贮积症IIIA型。
本公开的基因递送系统和药物能在维持SGSH在外周系统表达的同时，提高SGSH在神经系统的表达，从而有效地兼顾MPS IIIA患者的外周躯体病症和神经系统病症的治疗。
因此，在第七方面，本公开提供一种治疗粘多糖贮积症IIIA型的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据第六方面所述的药物。
在一个实施方式中，药物通过全身途径或局部途径施用，例如静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经口施用、局部接触、腹膜内施用和病灶内施用。
在一个优选实施方式中，药物通过全身途径施用，例如静脉内施用。
附图说明
图1A示出了包含hSGSH1、hSGSH2或hSGSH的质粒模式图。
图1B示出了Huh7细胞裂解液和上清液中的Western Blot结果。
图1C示出了HEK293细胞裂解液和上清液中的Western Blot结果。
图1D示出了载体转染48h后Huh7和HEK293细胞裂解液中的SGSH酶活性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图1E示出了载体转染48h后Huh7和HEK293细胞上清液中的SGSH酶活性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图2A显示了包含不同启动子(CB、MF至MF5)的质粒模式图。
图2B显示了Huh7细胞裂解液和上清液中的Western Blot结果。
图2C显示了HEK293细胞裂解液和上清液中的Western Blot结果。
图2D显示了载体转染48h后Huh7和HEK293细胞裂解液中的SGSH酶活性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图2E显示了载体转染48h后Huh7和HEK293细胞上清液中的SGSH酶活性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图3显示了AAV9-hSGSH1病毒感染72h后Huh7细胞裂解液和上清液中的SGSH酶活性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图4A显示了CRISPR/Cas9敲除小鼠SGSH基因示意图。
图4B显示了6月龄MPS IIIA小鼠(左)和野生型(WT)小鼠(右)外观对比照片。
图4C显示了6月龄MPS IIIA和WT小鼠组织中的SGSH酶活性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图4D显示了6月龄MPS IIIA和WT小鼠血浆中的SGSH酶活性。**p<0.01。
图4E显示了6月龄MPS IIIA和WT小鼠脑LAMP1免疫荧光染色。标尺＝50μm。
图4F显示了6月龄MPS IIIA和WT小鼠脑GFAP免疫荧光染色。标尺＝50μm。
图5A显示了病毒注射28天后MPS IIIA小鼠血浆中SGSH酶活性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图5B显示了病毒注射28天后MPS IIIA小鼠大脑、肝脏、脾脏、心脏、肾脏、肺和肌肉组织中SGSH酶活性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图6显示了病毒注射28天后MPS IIIA小鼠组织中的GAG含量，包括小鼠大脑、肝脏、脾脏、心脏、肾脏、肺和肌肉组织中的GAG含量。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图7A显示了病毒注射56天后MPS IIIA小鼠血浆中的SGSH酶活性。***p<0.001。
图7B显示了病毒注射56天后MPS IIIA小鼠大脑、肝脏、脾脏、心脏、肾脏、肺和肌肉组织中的SGSH酶活性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图8A显示了病毒注射56天后MPS IIIA小鼠大脑、肝脏、脾脏、心脏、肾脏、肺和肌肉组织中GAG含量。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图8B显示了病毒注射56天后MPS IIIA小鼠尿液中HS含量。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图9A显示了4天共16次训练中老年MPS IIIA小鼠寻找逃生舱的潜伏期和每次寻找的错误次数。
图9B显示了第5天和第12天测试时老年MPS IIIA小鼠在目标象限的停留时间。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图9C显示了第5天和第12天测试时老年MPS IIIA小鼠运动轨迹跟踪图。
图10显示病毒载体治疗5个月后老年MPS IIIA小鼠脑内溶酶体储存病理的改善。CBC： 大脑皮层；TH：丘脑；STR：纹状体；HP：海马；CB：小脑。标尺＝50μm。
图11显示病毒载体治疗5个月后老年MPS IIIA小鼠脑内神经炎症的改善。CBC：大脑皮层；TH：丘脑；STR：纹状体；HP：海马；CB：小脑；MY：延髓。标尺＝50μm。
图12显示了hSGSH1的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。
图13显示了hSGSH2的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。
缩略词索引

除非另有说明，否则本文列出的核酸或多核苷酸序列是单链形式，方向是从5'至3'，从左至右。本文提供的核苷酸和氨基酸采用IUPACIUB生化命名委员会建议的格式，对于氨基酸采用单字母代码或三字母代码。
除非另有说明，“多核苷酸”是“核酸”的同义词，指任何长度的核苷酸的聚合形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，它们的混合序列或类似物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，例如甲基化或限制的核苷酸和核苷酸类似物。
在本文中，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即意味着“包括但不限于”)。
在本文中，术语“患者”和“受试者”可互换使用并且以其常规意义使用，指患有或容易患有可通过施用本公开的药物进行预防或治疗的病症的生物体，并且包括人和非人动物(例如，啮齿动物或其他哺乳动物)。
在一个实施方式中，受试者是非人动物(例如，黑猩猩和其他猿和猴物种；农场动物，如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验动物包括啮齿类动物，如小鼠、大鼠和豚鼠；禽类，包括家禽、野禽和猎禽，如鸡、火鸡和其他鸡类、鸭、鹅等)。在一个实施方式中，受试者是哺乳动物。在一个实施方式中，受试者是人。
在本文中，术语“治疗”包括：(1)抑制病状、疾病或者病症，即，阻止、减少或者延迟疾病的发展或其复发或者其至少一种临床或者亚临床症状的发展；或者(2)缓解疾病，即，引起病状、疾病或者病症或者其临床或者亚临床症状中的至少一种消退。
在本文中，术语“治疗有效量”指产生施用它要达到的治疗效果的剂量。例如，适用于治疗肌营养不良症的药物的治疗有效量可为能够预防或改善与该肌营养不良症相关的一种或多种症状的量。
在本文中，术语“改善”指与疾病有关的症状的改善，并且可以指至少一种衡量或定量该症状的参数的改善。
在本文中，术语“预防”病状、疾病或者病症包括：预防、延迟或者减少受试者中发展的病状、疾病或者病症的至少一种临床或者亚临床症状出现的发生率和/或可能性，该受 试者可能患有或易患该病状、疾病或者病症但尚未经历或者表现出该病状、疾病或者病症的临床或亚临床症状。
在本文中，术语“局部施用”或“局部途径”是指具有局部作用的给药。
在本文中，术语“载体”是指包裹多核苷酸的一个或一系列大分子，其促进多核苷酸在体外或体内递送到靶细胞中。载体的分类包括但不限于质粒，病毒载体，脂质体和其他基因递送载体。待递送的多核苷酸有时被称为“转基因”，包含但不限于可以增强，抑制，削弱，保护，触发或预防某些生物学和生理学的某些蛋白质或合成多肽的编码序列，或疫苗开发中感兴趣的编码序列(例如表达适于在哺乳动物中引发免疫应答的蛋白，多肽或肽的多核苷酸)，RNAi组分的编码序列(例如，shRNA，siRNA，反义寡核苷酸)，或可选的标记。
在本文中，术语“转导”、“转染”或“转化”是指将外源多核苷酸传递导至宿主细胞，转录和翻译产生多肽产物的过程，包括利用重组病毒将外源多核苷酸引入宿主细胞。
在本文中，术语“基因递送”是指将外源多核苷酸引入细胞来进行基因递送，包括靶向、结合、摄取、转运、复制子整合和表达。
在本文中，术语“基因表达”或“表达”是指基因转录、翻译和翻译后修饰产生基因的RNA或蛋白产物的过程。
在本文中，术语“感染”是指包含多核苷酸组分的病毒或病毒颗粒将多核苷酸递送至细胞中并产生其RNA和蛋白质产物的过程，也可指病毒在宿主细胞中的复制过程。
在本文中，术语“表达盒”、“转基因盒”和“转基因表达盒”可互换地使用，指编码特定蛋白质、多肽或RNAi元件的多核苷酸片段，其可以克隆到质粒载体中。
在本文中，术语“密码子优化”是指从其天然形式修饰的多核苷酸序列。这样的修饰导致一个或多个碱基对的差异，其相应的氨基酸序列中有或没有改变，可能增强或抑制基因的表达和/或对修饰的多核苷酸序列的细胞应答。
术语“腺相关病毒(AAV)”包括天然的AAV(1-11型AAV，禽AAV，牛AAV，犬AAV，马AAV和绵羊AAV)，和已知的或后来发现或发明的其他人工改造的AAV。例如BERNARD N.FIELDS等，VIROLOGY，卷2，第69章(第四版，Lippincott-Raven Publishers以及例如Gao等，J.Virol(2004)78:6381-6388)。不同血清型AAV的基因组序列和ITR序列，Rep和Cap蛋白在本领域内是已知的。这些序列可以在文献或在公共数据库查找，例如GenBank(R)库，例如GenBank(R)登录号NC 002077、NC 001401、NC 001729、NC 001863、NC 001829、NC 001862、NC 000883、NC 001701、NC 001510、AF063497、 U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、JO1901、J02275、XO1457、AF288061、AHO09962、AY028226、AY028223、NC 001358、NC 001540、AF513851、AF513852、AY530579、AY631965、AY631966；其发明内容整体并入本文。例如Srivistava等，J.Virol(1983)45:555；Chiorini等，J.Virol(1998)71:6823；Chiorini等，J.Virol(1999)73:1309；Bantel-Schaal等，J.Virol(1999)73:939；Xiao等，J.Virol(1999)73:3994；Muramatsu等，Virology(1996)221:208；Choudhury SR等，2016，24(7):1247-57；Hsu HL.等，Nat Commun 11,3279(2020)；国际专利出版物WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244、WO 2021050970A1、US 2019/036676A1、美国专利号6,156.303。
在本文中，术语“反向末端重复”包含任意AAV病毒末端重复或合成序列，其组成发卡结构并作为顺式结构介导病毒的复制、包装和整合。本文的ITR包括但不限于1-11型AAV，禽AAV，牛AAV，犬AAV，马AAV和绵羊AAV的末端重复。另外，AAV末端重复不需要是天然的，只要可用于AAV的复制、包装和整合即可。
在本文中，术语“靶向”指病毒优先进入一些细胞或组织，然后进一步在细胞中表达病毒基因组或重组转基因携带的序列。
在一个实施方式中，本公开的转基因表达盒中的启动子选自：CB启动子、MF启动子(MHC增强子和SYN1启动子)、MF1启动子(MHC增强子、SYN1增强子和SYN1启动子)、MF2启动子(CMV增强子、SYN1增强子和鸡β-肌动蛋白启动子)、MF3启动子(SYN1增强子、CMV增强子和鸡β-肌动蛋白启动子)、MF4启动子(LXP2.1增强子、SYN1增强子和鸡SYN1启动子)和MF5启动子(LXP2.1增强子、SYN1增强子和鸡β-肌动蛋白启动子)。
在一个优选实施方式中，本公开的转基因表达盒中的启动子为CB启动子或MF3启动子。通过使用CB启动子或MF3启动子，可以将MPS IIIA患者的血浆SGSH酶活性较长时间维持在生理水平甚至超生理水平，从而实现更有效且更稳定的治疗效果。
在一个更优选实施方式中，本公开的转基因表达盒中的启动子为MF3启动子。与CB启动子相比，使用MF3启动子可以在MPS IIIA患者脑内实现更好的SGSH表达。
在一个实施方式中，本公开的转基因表达盒或基因递送系统被制成药物施用于人或其他哺乳动物。
本公开的药物可以在MPS IIIA患者体内稳定表达SGSH蛋白，恢复酶缺陷所带来的中枢神经系统和躯体病症，由此实现对粘多糖贮积症IIIA型良好的治疗效果。
下面结合附图和实施例对本公开作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本公开 而不用于限制本公开的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，系按照本领域已知的常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行操作。
实施例
实施例1：hSGSH序列的优化及筛选
首先，通过实验室现有保存的单链载体骨架pAAV2.1-CB-SV40-MCS，选择合适的酶切位点，插入hSGSH的cDNA原始序列，构建得到pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH，载体结构如图1A所示。
同时，对原始人源SGSH基因进行了密码子优化，以期筛选出表达更佳的目的基因序列。将经过不同密码子优化的人源SGSH基因克隆到单链rAAV载体骨架中，通过CB启动子驱动人SGSH基因表达。其中，CB启动子是包含巨细胞病毒(CMV)增强子和鸡β-肌动蛋白启动子(Chickenβ-actin promoter)的组合型启动子。hSGSH的cDNA序列由NCBI数据库查得，长度为1509bp，分别在其序列的5'端和3'端添加EcoRI和BglII的酶切位点(另一种情况下添加FseI以及BstbI的酶切位点)，并在对酶切位点进行保护的前提下，对hSGSH序列进行密码子优化。将不同优化方式得到的两种SGSH序列分别命名为hSGSH1(SEQ ID NO：1)和hSGSH2(SEQ ID NO：2)，未进行密码子优化的SGSH cDNA原序列编号为hSGSH(载体结构如图1A所示)。将hSGSH1、hSGSH2以及hSGSH进行人工基因合成后，经由双酶切反应得到双粘性末端的片段，其中hSGSH1通过EcoRI和BglII限制性核酸内切酶进行双酶切，hSGSH2和hSGSH通过FseI和BstbI限制性核酸内切酶进行双酶切，然后通过T4DNA连接酶将合成基因片段连接至pAAV2.1-CB-SV40-MCS载体上，分别得到pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH1、pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH2以及pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH载体，测序结果比对显示载体构建成功。
为验证构建的载体可以成功表达SGSH蛋白，本研究使用细胞生长状态良好的Huh7细胞以及HEK293细胞进行铺板，六孔板每孔细胞数1E6，12h后待细胞贴壁生长后，使用PEI转染试剂将pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH1、pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH2以及pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH质粒转入细胞内,每孔转染5μg质粒，按比例加入2倍体积的PEI试剂。转染后培养48h收取细胞及上清液，使用非变性细胞组织裂解液提取细胞中蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量，并进行Western blot分析和SGSH酶活性测定。
Western blot结果显示，与空白对照相比，3个载体转染组(pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH1、pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH2、pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH)的细胞裂解液以及细胞上清液中SGSH蛋白表达量都有显著提高(图1B和图1C)，其中，转染pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH1 载体的Huh7细胞以及上清液中SGSH蛋白表达量明显优于pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH2及pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH载体(图1B)；在HEK293细胞以及上清液中，3个载体转染组的SGSH蛋白表达量差别不明显(图1C)。
进一步，检测了转染载体后Huh7和HEK293细胞及上清液中SGSH的酶活性，其结果与Western blot结果相吻合，3个载体转染组的SGSH酶活性相比空白对照组都有显著提高(图1D和图1E)。在Huh7细胞中，转染载体pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH1的细胞裂解液中SGSH酶活性为66.05±7.5nmol/17h/mg，高于pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH2以及pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH载体转染的细胞裂解液，(SGSH酶活性分别为23.82±4.46nmol/17h/mg和57.44±2.75nmol/17h/mg)，并显著高于未转染质粒的空白对照组0.74±0.07nmol/17h/mg(图1D，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。进一步分析表明，在Huh7细胞中，转染载体pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH1细胞裂解液以及细胞上清液中SGSH酶活性分别提升至未转染对照组的88.96和52.58倍，转染载体pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH的SGSH酶活性次之，在Huh7细胞裂解液以及细胞上清液中分别提升至未转染对照组的77.36和42.43倍，而转染载体pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH2的SGSH酶活性仅提升至对照组的32.08和13.25倍；在HEK293细胞中，转染载体pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH1细胞裂解液以及细胞上清液中SGSH酶活性分别提升至未转染对照组的49.18和5.40倍，高于转染载体pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH2的47.77和4.59倍以及转染载体pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH的46.86和4.16倍。(图1D和图1E，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。总体上，酶活性测定结果与Western Blot结果相吻合，pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH1载体在Huh7细胞以及上清液的表达明显优于另两者。
综上所述，本研究构建的3个pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH载体在细胞水平成功表达hSGSH且被有效分泌到胞外。相比之下，第一种优化的hSGSH1序列可以表达大量高活性的SGSH蛋白，在这三者之中效果最优。因此，在后续的研究中，表达盒中均使用优化的hSGSH1序列。
实施例2.含新型组合型启动子的表达盒构建及其在细胞中的表达
本研究中，使用筛选得出的hSGSH1序列，并重新设计了6种不同的新型组合型启动子(MF、MF1、MF2、MF3、MF4、MF5)，以期得到能在维持SGSH在外周系统表达的同时提高SGSH在神经系统的表达的新型组合型启动子。
具体载体表达盒模式图如图2A所示，其中MF启动子由MHC增强子和SYN1启动子构成，MF1启动子由MHC增强子、SYN1增强子和SYN1启动子构成，MF2启动子由CMV 增强子、SYN1增强子和鸡β-肌动蛋白启动子构成，MF3启动子由SYN1增强子、CMV增强子和鸡β-肌动蛋白启动子构成，MF4启动子由LXP2.1增强子、SYN1增强子和SYN1启动子构成，MF5启动子由LXP2.1增强子、SYN1增强子和鸡β-肌动蛋白启动子构成。
用MF至MF5启动子分别替换pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH1载体中的CB启动子，得到6种新载体(图2A)，经测序结果比对显示载体构建成功。将6种新载体与已构建的pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH1载体分别转染细胞，验证载体在体外的表达。使用生长状态良好的Huh7细胞以及HEK293细胞在十二孔板中培养，每孔接种量为2.5E5个细胞，在12h细胞贴壁生长后使用2.5μg质粒通过PEI转染试剂进行转染，培养48h收取细胞及上清液，使用非变性细胞组织裂解液提取细胞中蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量，进行Western Blot分析和SGSH酶活性测定。
Western Blot结果显示，在Huh7细胞中，转染载体pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH1、pAAV2.1-MF2-SV40-hSGSH1和pAAV2.1-MF5-SV40-hSGSH1的细胞裂解液以及细胞上清液中SGSH蛋白表达量相比空白对照都有明显提高；转染载体pAAV2.1-MF-SV40-hSGSH1、pAAV2.1-MF3-SV40-hSGSH1和pAAV2.1-MF4-SV40-hSGSH1的细胞裂解液以及细胞上清液中SGSH蛋白表达量相比空白对照也有一定提高，但表达量略低于上述3个载体；相对而言，转染载体pAAV2.1-MF1-SV40-hSGSH1和pAAV2.1-MF4-SV40-hSGSH1的细胞裂解液以及细胞上清液中表达量提升并不明显(图2B)。
同样地，在HEK293细胞裂解液及上清液中，pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH1、pAAV2.1-MF2-SV40-hSGSH1、pAAV2.1-MF3-SV40-hSGSH1、pAAV2.1-MF5-SV40-hSGSH1载体的SGSH蛋白表达量明显优于pAAV2.1-MF-SV40-hSGSH1、pAAV2.1-MF1-SV40-hSGSH1、pAAV2.1-MF4-SV40-hSGSH1载体的SGSH蛋白表达量(图2C)。
进一步，对于SGSH的表达，利用SGSH酶活性检测实验进行定量分析。结果表明，转染载体的细胞裂解液和上清液中SGSH酶活性相比未转染载体的空白对照组都有显著提高。其中引人注目地是，转染载体pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH1在Huh7和HEK293细胞裂解液中SGSH酶活性为86.97±0.85nmol/17h/mg和46.31±0.4nmol/17h/mg，显著高于未转染对照组的0.69±0.03nmol/17h/mg和1.1±0.04nmol/17h/mg(图2D，**p<0.01，***p<0.001)，分别提升至未转染对照组的125.54和42.01倍，在Huh7和HEK293细胞上清液的SGSH酶活性分别提升至未转染对照组的44.75和8.15倍(图2E，*p<0.05，**p<0.01)。
综上所述，转染载体在细胞水平上表达的SGSH酶活性与其Western blot表达结果互 相佐证，并显示出本研究新构建的pAAV2.1-MF-SV40-hSGSH1、pAAV2.1-MF1-SV40-hSGSH1、pAAV2.1-MF2-SV40-hSGSH1、pAAV2.1-MF3-SV40-hSGSH1、pAAV2.1-MF4-SV40-hSGSH1和pAAV2.1-MF5-SV40-hSGSH1载体和已构建的pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH1载体在细胞水平均成功表达hSGSH且被有效分泌到胞外，其中新构建的pAAV2.1-MF2-SV40-hSGSH1、pAAV2.1-MF3-SV40-hSGSH1、pAAV2.1-MF5-SV40-hSGSH1载体与已构建的pAAV2.1-CB-SV40-hSGSH1载体在两种细胞水平上的表达都具有一定的优势。
实施例3.AAV9-hSGSH1病毒的包装与验证
进一步，本研究将构建完成并能成功表达SGSH的7种载体通过三质粒共转染的方法分别包装AAV9的病毒衣壳，并通过CsCl密度梯度离心纯化生产，制成AAV9-CB-hSGSH1、AAV9-MF-hSGSH1、AAV9-MF1-hSGSH1、AAV9-MF2-hSGSH1、AAV9-MF3-hSGSH1、AAV9-MF4-hSGSH1、AAV9-MF5-hSGSH1病毒载体。最终经由qPCR测定这些病毒滴度范围在8.7E12～2.2E13vg/mL。
为了验证这些病毒载体可以产生功能性的SGSH，将这7种不同启动子的AAV9-hSGSH1病毒载体、以及实验室已有的表达绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的AAV9-CB-GFP病毒载体感染12孔板中生长状态良好的Huh7细胞(MOI＝1E6)，AAV9-CB-GFP作为对照组，用于观察感染操作的成功与否。在感染72h后收集细胞，通过测定SGSH的酶活性确定其表达功能性SGSH的情况。
实验结果表明，使用这7种AAV9-hSGSH1病毒感染后Huh7细胞的SGSH酶活性水平是对照组的1.45-3.30倍，显著高于感染AAV9-CB-GFP对照组(图3，**p<0.01，***p<0.001)。其中，感染AAV9-CB-hSGSH1、AAV9-MF2-hSGSH1、AAV9-MF4-hSGSH1、AAV9-MF5-hSGSH1病毒的细胞裂解液中SGSH活性分别显著提升至对照组的3.06、3.30、3.00、2.42倍(图3，***p<0.001)，感染AAV9-MF-hSGSH1、AAV9-MF1-hSGSH1和AAV9-MF3-hSGSH1病毒的细胞裂解液提升至对照组的1.50、1.47和1.93倍(图3，**p<0.01，***p<0.001)。同样地，在Huh7细胞上清液中，感染AAV9-CB-hSGSH1、AAV9-MF2-hSGSH1、AAV9-MF3-hSGSH1、AAV9-MF4-hSGSH1和AAV9-MF5-hSGSH1病毒的上清液中SGSH酶活性提高至对照组的1.74、1.80、2.15、1.57和2.11倍(图3，*p<0.05，***p<0.001)，感染AAV9-MF-hSGSH1和AAV9-MF1-hSGSH1病毒的上清液中SGSH活性也提高至对照组的1.39和1.10倍。
综上所述，7种载体包装后的AAV9-hSGSH1病毒仍能在Huh7细胞中有效表达SGSH， 并分泌到胞外，成功验证了AAV9-hSGSH1病毒在体外的有效性。其中，AAV9-CB-hSGSH1、AAV9-MF2-hSGSH1、AAV9-MF3-hSGSH1、AAV9-MF4-hSGSH1、AAV9-MF5-hSGSH1病毒载体介导的SGSH的体外表达优于AAV9-MF-hSGSH1和AAV9-MF1-hSGSH1病毒载体。另外，引人注目的是，AAV9-MF3-hSGSH1病毒载体虽然在细胞中介导的SGSH表达程度略低于AAV9-CB-hSGSH1等4种载体，但是在Huh7上清液中AAV9-MF3-hSGSH1病毒介导的SGSH表达高于其他6种病毒载体，显示了更好的分泌能力。
实施例4.MPS IIIA小鼠模型建立与表型验证
根据Lau等人(DOI:10.1007/s10545-017-0044-4)的研究，本研究构建并使用的MPS IIIA模型小鼠是SGSH-KO基因敲除小鼠，通过CRISPR/Case9技术，使用2个预先设计的sgRNA敲除了C57BL/6N小鼠SGSH基因外显子2上约1kb的片段，从而引起DNA双链断裂以及非同源重组，实现SGSH基因的敲除(图4A)，该敲除过程委托北京百奥赛图生物技术有限公司进行。本研究获得经基因型鉴定后的纯合子F1代小鼠后，扩大繁殖并开展实验。该MPS IIIA模型小鼠可以真实反映MPS IIIA人类患者大部分病症情况，本研究对该种MPS IIIA模型小鼠的表型进行了初步验证，具体对血浆以及主要组织酶活性、其他疾病损伤包括脑内的溶酶体膜蛋白表达以及星型细胞增多情况进行分析，结果表明该小鼠模型构建成功。
本部分研究分为4组，分别为6月龄的MPS IIIA雄性和雌性小鼠，以及同品系同年龄的野生型(WT)雄性和雌性小鼠作为对照(n＝3)。首先，从外观和临床观察上分析，MPS IIIA小鼠体型与WT小鼠相比较为肥胖；毛发状态异常，表现为杂乱失去光泽；面部粗糙，具有典型的粘多糖面容特征；背部骨骼畸形凸起，成驼背状态(图4B)。并且MPS IIIA小鼠行为极度活跃，个别个体伴随有攻击性行为。此外在解剖过程中发现，MPS IIIA小鼠的肝脾肿大；多伴有严重膨胀的膀胱，有一定程度的排尿困难，个别个体出现血尿的症状。
通过对小鼠眼眶取血，分离外周血浆进行SGSH的酶活性测定，结果表明MPS IIIA雄性和雌性小鼠血浆中SGSH酶活性分别为0.03±0.04nmol/17h/mL和0.1±0.07nmol/17h/mL(图4D，**p<0.01)，几乎检测不到MPS IIIA小鼠血浆中SGSH酶活性，只有WT对照组小鼠的0.1％-0.2％，显著低于同品系同年龄的WT小鼠。此外，雌性和雄性MPS IIIA小鼠血浆中SGSH活性没有显著性差异。
对小鼠主要组织器官中的SGSH酶活性测定也表现出了相似的结果。在心、肾脏和肌肉组织中MPS IIIA小鼠的酶活性远低于WT水平(图4C，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)，且很大程度上低于检测限；对脾和肝脏组织而言，在MPS IIIA雄性小鼠体内几乎检测不到 其中的酶活性，MPS IIIA雌性小鼠脾和肝脏中酶活性略高于MPS IIIA雄性小鼠，但两者之间并未有显著性差异，并且无论雄性或是雌性MPS IIIA小鼠肝和脾脏中SGSH活性都显著低于WT小鼠(图4C，**p<0.01，***p<0.001)；在脑内，MPS IIIA雄性和雌性小鼠SGSH酶活性分别为0.05±0.01nmol/17h/mg和0.04±0.01nmol/17h/mg，显著低于WT对照组小鼠的0.34±0.10nmol/17h/mg和0.35±0.03nmol/17h/mg(图4C，*p<0.05，**p<0.01)。
进一步，为了评估MPS IIIA小鼠中枢神经系统中的神经炎症情况，本研究分别使用LAMP-1抗体以及GFAP抗体对6月龄MPS IIIA以及WT雄性小鼠脑切片进行免疫荧光染色，分别指示了MPS IIIA疾病中溶酶体储存的变化以及星形胶质细胞激活情况。结果显示，MPS IIIA小鼠脑内LAMP I的阳性信号在脑室周围纹状体部位表现明显多于WT小鼠(图4E)；而在海马区域，可以观察到MPS IIIA小鼠GFAP阳性信号明显多于WT小鼠(图4F)，显示了MPS IIIA小鼠在溶酶体储存病理学和神经炎症中的强烈表现。
综上所述，MPS IIIA小鼠具有表型明显的躯体病症，包括一些生长发育以及身体区域的表现、骨骼和毛发等组织的病症、泌尿以及肝胆系统的表型等。标志性地，MPS IIIA小鼠组织器官中的SGSH活性很低，血浆中SGSH酶活性甚至不足正常水平0.1％，显示了SGSH活性的丧失。在MPS IIIA小鼠中枢神经系统中表现出星型胶质细胞的异常激活的神经炎症和溶酶体储存的病理学特征。总得来说，本研究中使用的SGSH基因敲除的MPS IIIA小鼠模型建立成功，该模型小鼠能够在很大程度上反映MPS IIIA人类患者大部分病症情况，可用于后续体内研究。
实施例5.应用AAV9-hSGSH1病毒治疗MPS IIIA小鼠
为了比较这7种AAV9-hSGSH1病毒在MPS IIIA模型小鼠体内的治疗效果，本研究通过尾静脉注射的给药方式向2月龄MPS IIIA雄性小鼠体内注射剂量为5E13vg/kg(病毒基因组数/千克体重)的病毒。由于模型小鼠生殖能力不稳定，受到繁育数量的限制，本研究将包装纯化的7种AAV9-hSGSH1病毒分为两部分进行筛选。首先第一部分研究使用AAV9-CB-hSGSH1、AAV9-MF-hSGSH1、AAV9-MF1-hSGSH1病毒载体对MPS IIIA小鼠进行了短期治疗，筛选得到AAV9-CB-hSGSH1治疗效果在三者之间最优。接下来，第二部分研究使用了AAV9-CB-hSGSH1、AAV9-MF2-hSGSH1、AAV9-MF3-hSGSH1、AAV9-MF4-hSGSH1和AAV9-MF5-hSGSH1病毒载体对MPS IIIA小鼠进行了短期治疗，以期筛选出可同时纠正MPS IIIA患者躯体和神经病症的治疗载体。
AAV9-CB/-MF/-MF1-hSGSH1病毒治疗MPS IIIA小鼠
首先，为了研究病毒载体在MPS IIIA模型小鼠体内的治疗的情况，本研究通过尾静脉 注射对2月龄雄性MPSIIIA模型小鼠进行给药，注射剂量为5E13vg/kg。第一部分研究设置了3个治疗组，分别是AAV9-CB-hSGSH1(n＝5)、AAV9-MF-hSGSH1(n＝5)、AAV9-MF1-hSGSH1(n＝5)，同时设置未治疗同年龄MPS IIIA模型鼠(n＝5)以及同年龄同品系WT小鼠(n＝5)作为对照。其中，未治疗MPS IIIA模型鼠是施用了同体积的PBS的MPS IIIA模型小鼠。在病毒注射后3天、7天、14天、21天、28天眼眶取血，分离血浆用作SGSH酶活性分析。在给药28天后处死小鼠，取小鼠各组织器官进行分析检测。
血浆中SGSH酶活性结果显示，病毒注射7天后，SGSH表达达到峰值，在7天后表达略有下降，但一直保持在相对稳定的水平。在注射后28天，相比注射AAV9-MF-hSGSH1治疗组而言，AAV9-CB-hSGSH1治疗组血液循环中SGSH酶活性得到更为明显的提高，并且接近WT水平(图5A，**p＜0.01)。然而，AAV9-MF1-hSGSH1治疗组小鼠外周血浆中酶活性与未治疗模型组相比没有较大提高，一直都处于较低的水平。
组织中SGSH酶活性结果显示，AAV9-CB-hSGSH1、AAV9-MF-hSGSH1和AAV9-MF1-hSGSH1治疗组与未治疗模型小鼠相比，体内SGSH酶活性有所升高，呈现显著性差异(图5B，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。相比于未治疗模型小鼠，AAV9-CB-hSGSH1、AAV9-MF-hSGSH1和AAV9-MF1-hSGSH1治疗组在肝脏中的SGSH酶活性显著提高(图5B，*p＜0.05，***p＜0.001)，实现了超生理水平表达。其中，治疗效果较好的AAV9-CB-hSGSH1治疗组小鼠肝脏中的SGSH酶活性为未治疗模型小鼠的1942.52倍，而AAV9-MF-hSGSH1和AAV9-MF1-hSGSH1治疗组分别为未治疗组的1504.24倍和236.93倍(图5B，***p<0.001)。在脑中，AAV9-CB-hSGSH1(图5B，**p＜0.01)、AAV9-MF-hSGSH1和AAV9-MF1-hSGSH1(图5B，*p＜0.05)治疗组相比未治疗模型小鼠略有上升。其中，AAV9-CB-hSGSH1治疗组SGSH活性水平为未治疗模型小鼠的1.80倍(图5B，**p<0.01)，是WT小鼠的23.31％，高于AAV9-MF-hSGSH1和AAV9-MF1-hSGSH1治疗组，但均未恢复至WT水平。此外，在脾、心、肾、肺等被检测的主要组织中，3个AAV病毒的治疗组SGSH酶活性都有所增加(图5B)。其中，AAV9-CB-hSGSH1治疗组SGSH酶活性在脾脏和心脏中实现了超生理水平表达，肾、肺和肌肉中SGSH酶活性也有所上升。总的来说，在注射后28天，AAV9-CB-hSGSH1治疗组与未治疗模型小鼠相比体内SGSH活性水平得到了一定的提升，在肝脏、心脏和脾脏中实现了超生理水平表达，在脑内SGSH活性显著提高(图5B，**p<0.01)。
此外，为了评估全身给药在MPS IIIA模型小鼠中的治疗效果，进一步分析了AAV9-CB-hSGSH1、AAV9-MF-hSGSH1和AAV9-MF1-hSGSH1注射后底物GAG的降解情 况。结果显示GAG的降解程度与SGSH酶活性升高程度呈相同的趋势。这意味着，SGSH活性水平恢复越高，随之而来GAG累积的下降程度也越大。3个治疗组AAV9-CB-hSGSH1、AAV9-MF-hSGSH1和AAV9-MF1-hSGSH1与未治疗模型组小鼠相比，被检测组织中GAG累积情况均有缓解，其中，3个治疗组小鼠肝脏中GAG均降为WT水平，但在其他被检测组织中表现不一，治疗效果相对最佳的仍然是AAV9-CB-hSGSH1病毒。
结果显示，接受AAV9-CB-hSGSH1治疗的MPS IIIA小鼠的肝脏、脾脏、心脏、肾脏和肺组织中GAG含量均有明显的降低。其中，接受AAV9-CB-hSGSH1治疗后MPS IIIA小鼠肝脏中GAG含量降低至未治疗组的10.02％(图6，***p<0.001)，低于接受AAV9-MF-hSGSH1和AAV9-MF1-hSGSH1治疗后的10.96％和15.87％；接受AAV9-CB-hSGSH1治疗后MPS IIIA小鼠脾脏中GAG水平降低至未治疗组的5.56％(图6，*p<0.05)，心脏中GAG水平降低至未治疗组的27.09％(图6，*p<0.05)，肾脏中GAG含量降低至未治疗组的20.30％(图6，*p<0.05)，肺GAG含量降低至未治疗组的51.56％。接受AAV9-MF-hSGSH1治疗后的MPS IIIA小鼠脾脏、心脏、肾脏和肺组织中的GAG含量分别降至未治疗组的17.73％、18.05％、22.47％和39.46％。经AAV9-MF1-hSGSH1治疗后的MPS IIIA小鼠在脾脏、心脏和肾脏组织中GAG含量下降程度不高，分别降至86.56％、40.07％和71.16％，在肺中的GAG含量并未发现有所降低。引人注意的是接受AAV9-CB-hSGSH1治疗的小鼠脑中GAG水平降低至未治疗水平的25.32％(图6，**p<0.01)，达到正常生理水平，AAV9-MF-hSGSH1和AAV9-MF1-hSGSH1治疗组只降低至未治疗水平的66.55％和50.79％。对比之下，AAV9-CB-hSGSH1病毒治疗效果在三者中最为显著。
综上所述，AAV9-CB-hSGSH1、AAV9-MF-hSGSH1和AAV9-MF1-hSGSH1治疗组与未治疗模型小鼠相比体内SGSH活性水平得到了一定的提升，在被检测的主要组织器官中实现了生理水平或超生理水平表达，在脑内的表达也有所提升。治疗后模型小鼠GAG的累积情况都有一定程度的改善，这种治疗效果在肝脏中最为显著。
值得注意的是，虽然AAV9-CB-hSGSH1治疗组小鼠脑内SGSH酶活性仅恢复到MPS IIIA模型小鼠的1.80倍，但治疗后小鼠脑中底物GAG的累积显著降低至未治疗MPS IIIA模型小鼠的25.32％，说明AAV-CB-hSGSH1介导的SGSH在脑内的分布是均匀的，且由于小鼠脑内的交叉校正效应，成熟的SGSH分泌至细胞外区室后可以通过M6P受体被相邻细胞通过胞吞作用所吸收，因此小鼠脑中较少的SGSH酶活性的恢复就可以导致较大程度的底物累积情况的改善。AAV9-CB-hSGSH1对MPS IIIA模型小鼠有着显著的治疗恢复作用。
此外，在肝脏中AAV9-CB-hSGSH1和AAV9-MF1-hSGSH1治疗组SGSH酶活性分别恢复至MPS IIIA小鼠的1942.52倍和236.93倍。而在脑内，AAV9-CB-hSGSH1和AAV9-MF1-hSGSH1治疗组SGSH酶活性分别恢复至MPS IIIA模型小鼠的1.80和1.54倍(*p＜0.05，**p＜0.01)。虽然肝脏中两治疗组SGSH活性相比有近10倍的差距，但在脑中的差距并不明显，这说明中枢神经系统脑内SGSH表达的恢复与躯体SGSH表达关系并不明确。仅仅提高的0.3倍SGSH活性，在GAG的降解上多出约20％的差距。进一步说明了在脑内分布良好的SGSH交叉校正效应的改善作用。
AAV9-CB/-MF2/-MF3/-MF4/-MF5-hSGSH1载体治疗MPS IIIA小鼠
接下来本研究进行了第二部分的筛选。同样地，通过尾静脉注射对2月龄雄性MPS IIIA模型小鼠进行剂量为5E13vg/kg的全身给药，设置第一部分研究筛选出较优的AAV9-CB-hSGSH1(n＝3)、以及未进行体内实验验证的AAV9-MF2-hSGSH1(n＝3)、AAV9-MF3-hSGSH1(n＝3)、AAV9-MF4-hSGSH1(n＝3)、AAV9-MF5-hSGSH1(n＝3)共5个治疗组，并同时应用未治疗同年龄MPS IIIA模型鼠(n＝3)以及同年龄同品系WT小鼠(n＝3)作为对照。在病毒注射后3天、7天、14天、21天、28天以及56天眼眶取血，分离血浆用作SGSH酶活性分析。在给药2个月后处死小鼠，取小鼠各组织器官进行分析检测。
血浆SGSH酶活性结果显示，注射AAV病毒7天后，除AAV9-MF5-hSGSH1外的其他4个治疗组MPS IIIA小鼠血浆中SGSH活性达到第1个峰值，并在接下来的一周时间内略有下降。可以看出，在第1个峰值时，AAV9-CB-hSGSH1和AAV9-MF2-hSGSH1治疗组对MPS IIIA小鼠血浆中SGSH活性的恢复效果最为显著。然而病毒注射两周后，AAV9-MF2-hSGSH1治疗组的MPS IIIA小鼠血浆中酶活性降至很低，并在之后的时间内一直维持较低的水平(图7A)。AAV9-MF3-hSGSH1和AAV9-MF4-hSGSH1治疗组MPS IIIA小鼠在治疗后7天时，SGSH的血浆酶活有所提高，但并未恢复到WT小鼠的正常生理水平，而之后AAV9-MF4-hSGSH1治疗组MPS IIIA小鼠血浆中SGSH酶活性逐渐降低至较低值(图7A)。
在这些治疗组中，发明人惊喜地发现，AAV9-CB-hSGSH1治疗组MPS IIIA小鼠血浆中SGSH酶活性虽然在注射14天时略有下降，但在之后三周的时间内拥有了逐步恢复的SGSH酶活性，并在注射后42天迎来第2个表达峰值，实现了血浆中超生理水平的SGSH表达；并且，AAV9-MF3-hSGSH1治疗组MPS IIIA小鼠血浆中SGSH酶活性虽然在治疗后7天并未恢复至正常生理水平，但是其血浆中SGSH酶活性在接下来五周的治疗时间内 稳步提升，并逐渐接近正常生理水平(图7A)。也就是说，在注射后56天时，AAV9-CB-hSGSH1和AAV9-MF3-hSGSH1治疗组MPS IIIA小鼠血浆中SGSH酶活性仍处于较高的表达水平，分别达到未治疗MPS IIIA小鼠的366.97倍和249.53倍(图7A)。
总体来说，AAV9-CB-hSGSH1和AAV9-MF3-hSGSH1病毒具有将MPS IIIA小鼠的血浆SGSH酶活性较长时间维持在生理水平甚至超生理水平的潜力，表明两者的治疗效果相较其他治疗性病毒载体而言更为有效且稳定。相反地，并未观察到AAV9-MF5-hSGSH1治疗组MPS IIIA小鼠血浆中SGSH酶活性有所恢复，这在一定程度上暗示了其在组织上的SGSH表达也不尽如人意。
组织中SGSH酶活性分析显示，在注射后56天，AAV9-CB-hSGSH1、AAV9-MF2-hSGSH1、AAV9-MF3-hSGSH1、AAV9-MF4-hSGSH1、AAV9-MF5-hSGSH1这5个治疗组MPS IIIA小鼠肝脏中SGSH酶活性显著提高(图7B，*p＜0.05)，分别恢复至未治疗MPS IIIA小鼠的316.96、127.60、324.47、287.50和107.32倍，其中，AAV9-CB-hSGSH1和AAV9-MF3-hSGSH1治疗组小鼠肝脏中SGSH酶活性恢复最多，AAV9-MF4-hSGSH1治疗组次之，AAV9-MF2-hSGSH1和AAV9-MF5-hSGSH1治疗组相对较少，但这5个治疗组SGSH酶活性在肝脏中都实现了超生理水平的表达，并且SGSH在肝脏中的表达与外周血浆中的表达情况相一致。
在脑内，AAV9-CB-hSGSH1和AAV9-MF3-hSGSH1治疗组MPS IIIA模型小鼠SGSH的活性相比未治疗MPS IIIA模型小鼠有所恢复，分别上升至未治疗组的1.86和1.31倍(*p＜0.05)，是WT小鼠的38.68％和27.36％。遗憾地是，对于治疗组AAV9-MF2-hSGSH1、AAV9-MF4-hSGSH1和AAV9-MF5-hSGSH1来说，并未观察到这3个治疗组小鼠脑内SGSH与未治疗组的任何差别。
在脾脏中，观察到AAV9-CB-hSGSH1和AAV9-MF3-hSGSH1治疗组MPS IIIA模型小鼠SGSH酶活性实现了接近生理水平的表达，分别恢复至未治疗模型组的42.66倍和40.74倍，而且在脾脏中AAV9-MF2-hSGSH1、AAV9-MF4-hSGSH1和AAV9-MF5-hSGSH1治疗组的SGSH酶活性相较未治疗组也有提升，分别是未治疗的4.84倍、12.70倍和12.51倍(图7B，***p＜0.001)。在心脏中，AAV9-CB-hSGSH1、AAV9-MF2-hSGSH1和AAV9-MF3-hSGSH1治疗组小鼠的SGSH酶活性都在很大程度上得到恢复，依次上升至未治疗模型组的165.56、258.48和294.55倍(图7B，*p＜0.05)，实现了超生理水平的表达。同样地，在肾脏中，发现AAV9-CB-hSGSH1、AAV9-MF2-hSGSH1和AAV9-MF3-hSGSH1治疗组小鼠的SGSH酶活性显著提升至15.86、11.36和15.42倍(图7B，*p＜0.05)，但未 能实现与WT小鼠相等的生理水平的表达。在肺脏中，AAV9-CB-hSGSH1、AAV9-MF2-hSGSH1、AAV9-MF3-hSGSH1和AAV9-MF4-hSGSH1介导的SGSH表达提升至未治疗组的1.5-5倍(图7B，*p＜0.05)。在肌肉组织中，AAV9-CB-hSGSH1、AAV9-MF2-hSGSH1、AAV9-MF3-hSGSH1、AAV9-MF4-hSGSH1、AAV9-MF5-hSGSH15个治疗组SGSH酶活性恢复至未治疗组的6.65倍、11.02倍、11.61倍、1.84倍和2.91倍，其中AAV9-MF2-hSGSH1、AAV9-MF3-hSGSH1治疗组实现了接近生理水平的表达(图7B)。
然而，在心脏、肾脏和肌肉组织中，AAV9-MF4-hSGSH1和AAV9-MF5-hSGSH1治疗组小鼠的SGSH活性相较未治疗模型组并未得到有效恢复。此外，在肺和肾脏组织中，相较未治疗组而言，5个治疗组小鼠的SGSH酶活性虽然稍有上升，但与正常生理水平相差较远(图7B)。
接下来，同样为了评估治疗载体对于溶酶体病理学的影响，本研究对收取的小鼠组织中GAG的含量进行定量分析。结果表明，相比未治疗组MPS IIIA小鼠，AAV9-CB-hSGSH1、AAV9-MF2-hSGSH1、AAV9-MF3-hSGSH1、AAV9-MF4-hSGSH1、AAV9-MF5-hSGSH1 5个治疗组MPS IIIA小鼠在肝脏、脾脏和心脏组织中的GAG含量显著减少(图8A，***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05)，在肝脏中的GAG含量更是降低至接近WT水平，分别降低至未治疗MPS IIIA小鼠的11.36％、12.48％、7.99％、8.52％、9.38％。5个治疗组小鼠脾脏GAG含量降至未治疗组的15.70％-22.84％，心脏中降至7.86％-25.64％。在肺组织中，5个治疗组MPS IIIA小鼠的GAG含量相较未治疗组小鼠有所降低，分别降低至未治疗组的33.11％、54.30％、45.02％、47.10％、49.59％，但未降至WT水平，其中AAV9-CB-hSGSH1治疗组与未治疗组在数据上有显著差异(图8A，*p＜0.05)。在肾脏和肌肉组织中，治疗组MPS IIIA小鼠的GAG含量相较未治疗组略有下降，除AAV9-MF3-hSGSH1治疗组GAG含量在肌肉中降至未治疗组小鼠的32.60％外，其余4个治疗组在肾脏和肌肉组织中的溶酶体病理并未得到有效纠正。
脑中的GAG含量显示，AAV9-CB-hSGSH1、AAV9-MF2-hSGSH1、AAV9-MF3-hSGSH1治疗组对于改善GAG累积情况的效果是显著的，其治疗后的MPS IIIA小鼠脑内GAG含量分别降至未治疗MPS IIIA小鼠的24.58％(图8A，**p＜0.01)、37.57％(图8A，**p＜0.01)和26.95％(***p＜0.001)，并与WT小鼠没有显著差异(图8A，*p<0.05)，治疗效果可以达到正常生理水平的恢复。由于AAV9-MF3-hSGSH1治疗组内MPS IIIA小鼠治疗后脑内SGSH含量差异较小，分析可知AAV9-MF3-hSGSH1治疗载体对MPS IIIA小鼠脑内溶酶体病理的缓解治疗作用更为稳定和显著。但另外2个治疗组AAV9-MF4-hSGSH1、 AAV9-MF5-hSGSH1的GAG含量与未治疗组相比并未有显著下降(图8A)。
此外，对于粘多糖的累积情况，评估了另一个临床上常用的检测指标，即尿液中HS的含量。在MPS IIIA小鼠接受治疗56天后，收集小鼠尿液，通过LC-MS/MS定量尿液中的HS含量。结果表明，与未治疗MPS IIIA小鼠相比，5个治疗组MPS IIIA小鼠尿液中HS累积得到显著降低(图8B，*p＜0.05，***p＜0.001)，且AAV9-CB-hSGSH1和AAV9-MF3-hSGSH1治疗组小鼠尿液中HS含量已接近正常生理水平。以上结果表明治疗载体对机体内粘多糖累积病症具有一定的治疗作用。
综上显示，接受AAV9-CB-hSGSH1、AAV9-MF2-hSGSH1、AAV9-MF3-hSGSH1、AAV9-MF4-hSGSH1、AAV9-MF5-hSGSH1病毒载体治疗的MPS IIIA小鼠在治疗后56天时中枢神经系统和躯体病症得到了不同程度的缓解，表现为尿液中累积的HS得到有效的清除，肝脏中AAV载体介导的SGSH表达显著提升，从而导致肝脏中溶酶体病理得到有效缓解。但在其他组织器官中，不同AAV载体介导的SGSH表达水平有所不同，导致其GAG累积的减少程度不同。综合评估这5个治疗组，在肝脏和脾脏组织中，虽然不同AAV载体介导了不同程度的SGSH表达，但GAG降解情况相差不大。在肾脏和肺组织中，治疗效果皆不显著，没有具有突出优势的AAV载体。在心脏和肌肉组织中，SGSH表达水平较高的3个治疗组分别是AAV9-CB-hSGSH1、AAV9-MF2-hSGSH1、AAV9-MF3-hSGSH1。
值得注意地是，AAV9-CB-hSGSH1和AAV9-MF3-hSGSH1病毒载体在中枢神经系统中介导的SGSH表达相较其他组更为出色，这种优势通过交叉校正效应在脑组织累积GAG的清除方面被放大，即虽然AAV9-CB-hSGSH1和AAV9-MF3-hSGSH1治疗组SGSH表达在脑内仅上升至未治疗组的1.86和1.31倍，但已然可以实现75％和73％的GAG清除，表明AAV9-MF3-hSGSH1治疗组在中枢神经系统中的治疗效果更为稳定，可以在一定程度上克服个体差异。综上，AAV9-CB-hSGSH1和AAV9-MF3-hSGSH1载体在中枢神经系统病症的治疗上更为有效。
实施例6.在疾病晚期小鼠体内的治疗效果研究
为了评估本研究中筛选出的AAV9-CB-hSGSH1和拥有中枢神经系统病症治疗潜力的AAV9-MF3-hSGSH1病毒载体在疾病进展后期的模型小鼠中的治疗效果，通过尾静脉注射的方式向7月龄的MPS IIIA老年雄鼠注射了5E13vg/kg的病毒载体，共设置了2个治疗组，分别是AAV9-CB-hSGSH1治疗组(n＝3)和AAV9-MF3-hSGSH1治疗组(n＝3)，并采取同年龄未治疗的MPS IIIA雄鼠(n＝3)和同年龄的同品系的WT雄鼠(n＝3)作为对照。长期治疗5个月后，通过行为学实验评估MPS IIIA小鼠的记忆和学习能力；通过小鼠脑矢 状切片LAMP1免疫荧光染色评估脑内溶酶体病理的改善情况；并通过小鼠脑矢状切片GFAP免疫荧光染色评估脑内神经炎症的改善，以确定在疾病进展的晚期给药是否能改善甚至在一定程度上逆转严重的病理生理表型。
治疗后老年MPS IIIA小鼠的学习和记忆能力改善
在给药后5个月时，即小鼠12月龄时，通过行为学实验巴恩斯迷宫评估MPS IIIA小鼠的记忆和学习能力。在前4天，每天对小鼠进行四轮训练，训练其找到位于目标象限内的逃生舱，并统计小鼠找到逃生舱的时间和失败的次数。之后在第5天和第12天时分别统计90s内小鼠在平台上处于目标象限内的时间，分别显示小鼠的学习和记忆能力。
统计结果显示，在进行训练的4天时间内，未治疗的MPS IIIA小鼠寻找到逃生舱的潜伏期明显长于WT小鼠，同时错误寻找次数多于WT小鼠，而AAV9-CB-hSGSH1和AAV9-MF3-hSGSH1病毒载体治疗后的MPS IIIA小鼠的潜伏期则短于未治疗的MPS IIIA小鼠，错误寻找次数也随之减少，显示出类似WT的状态(错误寻找数波动较少)，表明治疗后MPS IIIA小鼠的学习能力得到提高(图9A)。
在第5天时，对4组小鼠进行测试，统计小鼠90s内在目标象限的停留时间，可以看出AAV9-CB-hSGSH1和AAV9-MF3-hSGSH1治疗组MPS IIIA小鼠在目标象限内的停留时间显著高于未治疗MPS IIIA小鼠，分别为未治疗小鼠的2.17和2.09倍(图9B，*p＜0.059)，并接近WT水平；同时小鼠的运动轨迹也显示了MPS IIIA小鼠无目的的运动状态，而治疗后MPS IIIA小鼠和WT小鼠更有趋向目标象限的活动特征(图9C)，显示载体药物治疗5个月后MPS IIIA老年小鼠受损的学习能力正常化。在第12天时对小鼠的测试结果显示，AAV9-CB-hSGSH1治疗组MPS IIIA小鼠在目标象限的停留时间延长至未治疗MPS IIIA小鼠的1.36倍(图9B，*p＜0.05)，AAV9-MF3-hSGSH1治疗组MPS IIIA小鼠在目标象限的停留时间延长至未治疗MPS IIIA小鼠的1.92倍。小鼠在平台上的行动轨迹同样显示治疗后的MPS IIIA小鼠相较未治疗MPS IIIA小鼠更趋向在目标象限内活动(图9C)，表明治疗后MPS IIIA小鼠的记忆能力也得到了改善。
以上数据表明，对于老年MPS IIIA小鼠而言，其学习和记忆能力都有一定程度上的降低，表现为退行性的行为症状，使用AAV9-CB-hSGSH1和AAV9-MF3-hSGSH1病毒载体治疗后，老年MPS IIIA小鼠的严重受损的学习和记忆能力都得到了恢复，表明这2个治疗性病毒载体都有足够改善MPS IIIA老年小鼠行为异常的能力，可以有效延缓疾病的发展进程。
治疗后老年MPS IIIA小鼠脑内溶酶体病理的改善
为了更具体地评估AAV病毒载体对于老年MPS IIIA小鼠溶酶体储存病症的清除作用，本研究通过对治疗5个月后的老年MPS IIIA小鼠脑矢状切片中LAMP1进行免疫荧光染色，LAMP1通常用于指示内体/溶酶体膜含量。结果显示，在不同的脑区中，相比于WT小鼠，未治疗的MPS IIIA小鼠LAMP1阳性信号明显增多，表明其存在溶酶体GAG储存的损伤；而相比于未治疗的MPS IIIA小鼠，经病毒载体治疗后的MPS IIIA小鼠LAMP1的阳性信号则相应地有不同程度的减少。
具体可以看出，在大脑皮层(Cerebral cortex，CBC)、丘脑(Thalamus，TH)和纹状体(Striatum，STR)区域细胞中，AAV9-CB-hSGSH1和AAV9-MF3-hSGSH1治疗组的MPS IIIA小鼠LAMP1阳性信号明显少于未治疗MPS IIIA小鼠(图10)，且AAV9-MF3-hSGSH1治疗组的MPS IIIA小鼠LAMP1阳性信号少于AAV9-CB-hSGSH1治疗组，说明在大脑皮层、丘脑以及纹状体区域溶酶体储存的病症得到改善，并且AAV9-MF3-hSGSH1治疗组改善效果更佳。此外，在海马(Hippocampus，HP)和小脑(Cerebellum，CB)的髓质区域，经由AAV9-CB-hSGSH1和AAV9-MF3-hSGSH1病毒载体治疗的MPS IIIA小鼠LAMP1阳性信号也明显少于未治疗MPS IIIA小鼠(图10)，然而在小脑区域的浦肯野氏细胞层中(浦肯野细胞是已知的唯一小脑皮质的传出神经元，对于个体的运动协调能力至关重要)，发现治疗后的MPS IIIA小鼠相较于未治疗小鼠LAMP1的阳性信号没有减少(图10)。
总的来说，治疗后MPS IIIA老年鼠的脑内LAMP1信号相较于未治疗MPS IIIA老年鼠明显减少，说明了其脑内溶酶体病理得到纠正，并且在某些脑区中，例如大脑皮层、丘脑和纹状体区域，AAV9-MF3-hSGSH1病毒载体对于溶酶体储存病理的纠正清除作用强于AAV9-CB-hSGSH1病毒载体。
治疗后老年MPS IIIA小鼠脑内神经炎症的改善
在MPS IIIA的疾病进展中，由于HS在神经系统中的大量累积激活了星形胶质细胞，引发星形细胞增多症，从而导致神经炎症的发生，而胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是星形胶质细胞的标志物。因此，为了可视化地显示治疗5个月后，AAV9-CB-hSGSH1和AAV9-MF3-hSGSH1病毒载体对于老年MPS IIIA小鼠脑中神经炎症的缓解作用，本研究对老年MPS IIIA小鼠脑矢状切片中GFAP进行免疫荧光染色。
结果显示，在被检测的几个脑区中，接受AAV9-CB-hSGSH1和AAV9-MF3-hSGSH1治疗的MPS IIIA老年鼠的GFAP阳性信号皆弱于未治疗的MPS IIIA老年鼠(图11)，说明治疗性病毒载体有效地缓解了MPS IIIA老年鼠的星形胶质细胞增多的情况，具有缓解模型小鼠中枢神经系统中神经炎症的能力。具体表现为在大脑皮层、丘脑、纹状体、海马和 延髓(Medulla，MY)区域，2组接受治疗的MPS IIIA老年鼠的GFAP阳性信号相比于未治疗组MPS IIIA老年鼠明显减少(图11)。GFAP的免疫荧光染色结果显示出了与LAMP1免疫荧光染色大体上相类似的结果。使用AAV9-MF3-hSGSH1载体进行治疗的MPS IIIA老年鼠在大脑皮层、丘脑、纹状体以及延髓区域中GFAP阳性信号强度皆少于使用AAV9-CB-hSGSH1治疗的MPS IIIA老年鼠，说明AAV9-MF3-hSGSH1病毒载体比AAV9-CB-hSGSH1病毒载体更能有效治疗MPS IIIA老年鼠脑内星形胶质细胞增多情况，缓解神经炎症；并且，在海马区域，不同于两种病毒载体在溶酶体病理学上相近水平的纠正效果，AAV9-MF3-hSGSH1载体治疗的MPS IIIA老年鼠的GFAP阳性细胞数目略少于AAV9-CB-hSGSH1载体，呈现出了较好的治疗效果；此外，在小脑区域的浦肯野氏细胞层和髓质中，GFAP的阳性信号强度在治疗组与未治疗组之间并未有明显的差别(图11)。
总而言之，AAV9-MF3-hSGSH1和AAV9-CB-hSGSH1治疗性载体能够渗透7月龄MPS IIIA老年雄性小鼠的BBB，并在大脑中广泛表达功能性的SGSH，减少多个脑区细胞中GAG的累积，纠正溶酶体累积病理学，并有效减少星形胶质细胞异常增多引发的神经炎症反应。
本公开中提及的所有出版物、专利申请、专利、核酸和氨基酸序列以及其他参考文献均通过引用全文的方式并入本文。
虽然通过参照本公开的某些优选实施方式，已经对本公开进行了图示和描述，但本领域的普通技术人员应该明白，以上内容是结合具体的实施方式对本公开所作的进一步详细说明，不能认定本公开的具体实施只局限于这些说明。本领域技术人员可以在形式上和细节上对其作各种改变，包括做出若干简单推演或替换，而不偏离本公开的精神和范围。

Claims (14)

  1. 转基因表达盒，其包含：
    启动子，其选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9，优选选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9，更优选为SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：7，最优选为SEQ ID NO：7；和
    编码氨基葡萄糖磺基水解酶(SGSH)的核酸分子，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性，优选具有至少85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
  2. 根据权利要求1所述的转基因表达盒，其中，所述核酸分子包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
  3. 根据权利要求1或2所述的转基因表达盒，其中，所述转基因表达盒还包括调控元件，例如位于两端的两个ITR；和/或复制起点；和/或猿猴病毒40内含子；和/或聚腺苷酸化信号。
  4. 根据权利要求1至3中任一项所述的转基因表达盒，其中，所述转基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21所示；优选地，所述转基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：21所示；更优选地，所述转基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：19所示；最优选地，所述转基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示。
  5. 编码氨基葡萄糖磺基水解酶(SGSH)的核酸分子，其中，所述核酸分子的核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性，优选具有至少85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
  6. 根据权利要求5所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含SEQ ID NO：1所示的 核苷酸序列；优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
  7. 组合型启动子，其选自：由CMV增强子、SYN1增强子和鸡β-肌动蛋白启动子组成的MF2启动子；由SYN1增强子、CMV增强子和鸡β-肌动蛋白启动子组成的MF3启动子；以及由LXP2.1增强子、SYN1增强子和鸡β-肌动蛋白启动子组成的MF5启动子；优选地，所述组合型启动子为MF3启动子。
  8. 根据权利要求7所述的组合型启动子，其中，所述MF2启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述MF3启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述MF5启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
  9. 基因递送系统，其包括：权利要求1至4中任一项所述的转基因表达盒和AAV衣壳蛋白。
  10. 根据权利要求9所述的基因递送系统，其中，所述AAV衣壳蛋白为天然AAV衣壳蛋白或人工改造的AAV衣壳蛋白；优选地，所述AAV选自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11，AAV12、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAV-DJ9、AAVrh8、AAVrh8R、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAV32.33、AAV3B、AAVv66、AAVXL32和AAV.PHP.B。
  11. 权利要求1至4中任一项所述的转基因表达盒或权利要求9或10所述的基因递送系统在制备用于治疗粘多糖贮积症IIIA型的药物中的应用。
  12. 药物，其包含：选自权利要求1至4中任一项所述的转基因表达盒、权利要求5或6所述的核酸分子以及权利要求9或10所述的基因递送系统中的一种，以及赋形剂。
  13. 治疗粘多糖贮积症IIIA型的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求12所述的药物。
  14. 根据权利要求13所述的方法，其中，所述药物通过全身途径或局部途径施用，例如静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经口施用、局部接触、腹膜内施用和病灶内施用； 优选地，所述药物通过全身途径施用，例如静脉内施用。
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