KR102629418B1 - 최적화된 cln1 유전자 및 발현 카세트 및 그의 용도 - Google Patents

최적화된 cln1 유전자 및 발현 카세트 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PPT1 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터 (바이러스 또는 비-바이러스 벡터), 및 세포 또는 대상체에의 오픈 리딩 프레임의 전달 및 영아 신경 리포푸신증 (영아 배튼병)의 치료를 위해 이를 사용하는 방법에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드는 최적화된 CLN1 오픈 리딩 프레임을 포함한다.

Description

최적화된 CLN1 유전자 및 발현 카세트 및 그의 용도
우선권의 진술
본 출원은 2016년 6월 13일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/349,411의 이익을 주장하며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 최적화된 CLN1 오픈 리딩 프레임 (ORF) 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 (바이러스 또는 비-바이러스 벡터), 및 세포 또는 대상체에의 CLN1 ORF의 전달을 위해 상기 폴리뉴클레오티드를 사용하는 방법 및 영아 신경 리포푸신증 (영아 배튼병)을 치료하기 위해 상기 폴리뉴클레오티드를 사용하는 방법에 관한 것이다.
신경 세로이드 리포푸신증 (NCL)은 신체 조직 내 지질색소 (리포푸신)의 과도한 축적으로 인해 발생하는 적어도 8종의 유전학적으로 상이한 신경변성 장애의 패밀리를 지칭한다. 이들 지질색소는 지방 및 단백질로 구성된다. 리포푸신 물질은 뉴런 세포 및 간, 비장, 심근 및 신장을 포함한 많은 기관에서 증강된다.
영아 신경 세로이드 리포푸신증 (INCL) 또는 영아 배튼병으로 공지되어 있는 질환의 영아 형태는 CLN1 유전자에서의 돌연변이에 의해 유발되고, 상염색체 열성 장애이다. CLN1에서 돌연변이를 갖는 일부 소아는 증상의 추후 발병 및 보다 느린 질환 진행을 갖고, 이는 소아 발병 질환과 유사하며, 보다 전형적으로 CLN3 유전자에서의 돌연변이와 연관된다. 1p32에 위치한 CLN1 유전자는 팔미토일 단백질 티오에스테라제 1 (PPT1)로 불리는 리소솜 효소를 코딩한다. PPT1의 결핍은 뉴런 및 다른 세포에서의 단백질 및 지질의 비정상적 저장 및 손상된 세포 기능을 야기한다.
효소 대체 요법 (예를 들어 미국 특허 번호 7,442,372 참조) 및 유전자 요법에 의한 시도가 있었지만, INCL에 대한 어떠한 유효 치료도 존재하지 않는다. 신경 줄기 세포 및 다른 작용제의 투여가 또한 시험되었지만 (예를 들어 미국 특허 번호 8,242,086, 미국 공개 번호 2015/0313863 참조), 이러한 방법의 임상 효능은 여전히 연구 중이다.
따라서, CLN1 발현과 연관된 장애 예컨대 INCL을 치료하기 위한 새로운 유효 요법에 대한 필요가 존재한다.
본 발명은, 적어도 부분적으로, CLN1 발현과 연관된 장애 예컨대 INCL을 치료하기 위한 치료 수준의 CLN1 발현을 제공할 수 있는 최적화된 CLN1 유전자, 발현 카세트, 및 벡터의 개발을 기초로 한다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 PPT1 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 인간 CLN1 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
본 발명의 추가 측면은 PPT1 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 형질전환된 세포, 및 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 트랜스제닉 동물에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 인간 CLN1 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 제약상 허용되는 담체 중 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 벡터, 및/또는 형질전환된 세포를 포함하는 제약 제제에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 세포를 본 발명의 PPT1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 및/또는 벡터와 접촉시켜, 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편을 발현시키는 것을 포함하는, 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편을 발현시키는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 CLN1 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CLN1 오픈 리딩 프레임은 인간 CLN1 오픈 리딩 프레임이다. 또 다른 실시양태에서, CLN1 오픈 리딩 프레임은 인간 세포에서 발현을 위해 코돈-최적화된다.
본 발명의 추가 측면은 대상체에게 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 벡터, 및/또는 형질전환된 세포를 전달하여, 대상체에서 PPT1 폴리펩티드 또는 그의 단편을 발현시키는 것을 포함하는, 대상체에서 PPT1 폴리펩티드 또는 그의 단편을 발현시키는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 CLN1 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CLN1 오픈 리딩 프레임은 인간 CLN1 오픈 리딩 프레임이다.
본 발명의 추가의 측면은 CLN1 유전자 또는 PPT1 폴리펩티드의 이상 발현 또는 CLN1 유전자 생성물의 이상 활성과 연관된 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 벡터, 및/또는 형질전환된 세포를 전달하여, 대상체에서 CLN1 유전자 또는 PPT1 폴리펩티드의 이상 발현과 연관된 장애를 치료하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 CLN1 유전자 또는 PPT1 폴리펩티드의 이상 발현 또는 CLN1 유전자 생성물의 이상 활성과 연관된 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 CLN1 유전자의 이상 발현과 연관된 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 벡터 및/또는 형질전환된 세포에 관한 것이다.
본 발명의 이들 및 다른 측면은 하기 발명의 설명에서 보다 상세하게 제시된다.
도 1은 CLN1 발현 카세트의 지도를 보여준다.
도 2는 본 발명의 CLN1 AAV 벡터로 처리된 CLN1 녹아웃 마우스의 모든 코호트에 대한 생존 곡선을 보여준다. NIV = 신생아 IV; IT = 요추 척수강내 주사; IV = 정맥내 주사; ICM = 대수조 주사; d.o. = 일령; w.o. = 주령; KO = 녹-아웃. 연령은 주사된 때의 연령이다. "사망"은 체중의 20% 감소 또는 안락사를 필요로 하는 유의한 이환율에 의해 스코어링된다.
도 3은 4주령에 본 발명의 CLN1 AAV 벡터로 처리된 CLN1 녹아웃 마우스의 코호트에 대한 생존 곡선을 보여준다.
도 4는 26주령에 본 발명의 CLN1 AAV 벡터로 처리된 CLN1 녹아웃 마우스의 코호트에 대한 생존 곡선을 보여준다.
도 5는 본 발명의 CLN1 AAV 벡터로 처리된 CLN1 녹아웃 마우스의 정맥내 코호트에 대한 생존 곡선을 보여준다.
도 6은 본 발명의 CLN1 AAV 벡터로 처리된 CLN1 녹아웃 마우스의 척수강내 코호트에 대한 생존 곡선을 보여준다.
도 7a-7b는 scAAV9/CLN1 요법이 혈청 PPT1 수준을 증가시키고 생존을 구제한다는 것을 보여준다. a. CLN1 마우스에게 요법을 표시된 연령에 i.t.로 제공하고, 3개월 후 또는 인도적 종점에서 혈청을 채취하였다. 데이터는 mL 혈청당 시간당 프로세싱된 nmol 기질로서 보고된다. 비처리된 KO 마우스는 스케일이 하강하여 (값 <1) 제시되지 않았다. b. 상이한 연령에 저용량 요법 (상부 패널) 및 고용량 요법 (하부 패널)으로 처리한 마우스를 비교한 카플란-마이어 플롯. 비처리된 KO 마우스가 둘 다의 패널에서 참조로 제시된다.
도 8a-8b는 가속화된 로타로드 수행을 보여준다. 각 지점은 주어진 시험 연령에서의 2회-시험에 걸친 주어진 마우스에 대한 떨어질 때까지의 평균 지연시간을 나타낸다. a. 행동 시험이 <1년령에 시작된 코호트. b. 행동 시험이 >1년령에 시작된 코호트. 일원 ANOVA 및 터키 사후 다중 비교를 사용하여 군 평균에서의 차이를 비처리 HET (*) 또는 비처리 KO (#)와 비교하여 평가하였다: */#p < 0.05, **/##p<0.01, ***/###p < 0.001.
도 9a-9b는 모리스 수중 미로에서의 수영 속도 평가를 보여준다. 각 지점은 1일 4회 시험에 의해 2-3일에 걸쳐 평균화된, 시험 연령에서의 주어진 마우스에 대한 수영 속도를 나타낸다. a. 행동 시험이 <1년령에 시작된 코호트. 일원 ANOVA 및 터키 사후 다중 비교를 사용하여 군 평균에서의 차이를 비처리 HET (*) 또는 비처리 KO (#)와 비교하여 평가하였다: */#p < 0.05, **/##p<0.01, ***/###p < 0.001. b. 행동 시험이 >1년령에 시작된 코호트. 군 평균에서의 차이를 독립표본 스튜던트 t 검정에 의해 결정하였다: **p < 0.01.
도 10a-10b는 모리스 수중 미로에서 플랫폼을 찾아낼 때까지의 시간을 보여준다. 각 지점은 1일 4회 시험에 의해 2-3일에 걸쳐 평균화된, 시험 연령에서의 주어진 마우스에 대한 플랫폼을 찾아낼 때까지의 시간을 나타낸다. a. 행동 시험이 <1년령에 시작된 코호트. 일원 ANOVA 및 터키 사후 다중 비교를 사용하여 군 평균에서의 차이를 비처리 HET (*) 또는 비처리 KO (#)와 비교하여 평가하였다: */#p < 0.05, **/##p<0.01, ***/###p < 0.001. b. 행동 시험이 >1년령에 시작된 코호트. 군 평균에서의 차이를 독립표본 스튜던트 t 검정에 의해 결정하였다: **p < 0.01, ***p < 0.001.
도 11a-11b는 모리스 수중 미로에서 수영한 거리를 보여준다. 각 지점은 1일 4회 시험에 의해 2-3일에 걸쳐 평균화된, 시험 연령에서의 주어진 마우스에 대한 수영한 거리를 나타낸다. a. 행동 시험이 <1년령에 시작된 코호트. 일원 ANOVA 및 터키 사후 다중 비교를 사용하여 군 평균에서의 차이를 비처리 HET (*) 또는 비처리 KO (#)와 비교하여 평가하였다: **/##p<0.01, ***/###p < 0.001. b. 행동 시험이 >1년령에 시작된 코호트. 군 평균에서의 차이를 독립표본 스튜던트 t 검정에 의해 결정하였다: **p < 0.01.
도 12a-12b는 거꾸로 와이어-매달리기로부터 떨어질 때까지의 시간을 보여준다. 각 지점은 주어진 시험 연령에서의 단일 마우스에 대한 데이터를 나타낸다. a. 행동 시험이 <1년령에 시작된 코호트. 일원 ANOVA 및 터키 사후 다중 비교를 사용하여 군 평균에서의 차이를 비처리 HET (*) 또는 비처리 KO (#)와 비교하여 평가하였다:***/###p < 0.001. b. 행동 시험이 >1년령에 시작된 코호트. 군 평균에서의 차이를 독립표본 스튜던트 t 검정에 의해 결정하였다.
도 13a-13b는 거꾸로 와이어-매달리기에 대한 협응 스코어를 보여준다. 각 지점은 주어진 시험 연령에서의 단일 마우스에 대한 데이터를 나타낸다. a. 행동 시험이 <1년령에 시작된 코호트. 일원 ANOVA 및 터키 사후 다중 비교를 사용하여 군 평균에서의 차이를 비처리 HET (*) 또는 비처리 KO (#)와 비교하여 평가하였다:***/###p < 0.001. b. 행동 시험이 >1년령에 시작된 코호트. 군 평균에서의 차이를 독립표본 스튜던트 t 검정에 의해 결정하였다.
도 14a-14h는 신생아 시에 i.v. 처리된 CLN KO 및 HET 마우스가 정상 수명 및 행동을 갖는다는 것을 보여준다. 모든 플롯은 신생아 시에 처리된 마우스를 검사한 것이다. a. 카플란-마이어 플롯. §는 NIV-처리된 HET 동물이 건강하지만, 분석을 위해 18개월에 희생시켰음을 나타낸다. b. NIV-처리된 HET 마우스를 비처리된 HET와 비교하여 보여주는 혈청 PPT1 활성 검정. c. 가속화된 로타로드 수행. d. 모리스 수중 미로에서 플랫폼을 발견할 때까지의 시간. e. 모리스 수중 미로에서의 수영 속도 평가. f. 모리스 수중 미로에서 수영한 거리. g. 거꾸로 와이어-매달리기로부터 떨어질 때까지의 시간. h. 거꾸로 와이어-매달리기에 대한 협응 스코어. 처리된 군과 비처리된 HET에 대한 평균 사이의 차이는 독립표본 스튜던트 t 검정에 의해 결정되었다: *p < 0.05.
하기에서 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 본 상세한 설명은 본 발명이 구현될 수 있는 모든 상이한 방식, 또는 본 발명에 부가될 수 있는 모든 특색의 세부 카탈로그인 것으로 의도되지 않는다. 예를 들어, 한 실시양태와 관련하여 예시된 특색은 다른 실시양태에 혼입될 수 있으며, 특정한 실시양태와 관련하여 예시된 특색이 그러한 실시양태로부터 삭제될 수도 있다. 또한, 본 발명에서 벗어나지 않는, 본 개시내용에 비추어 본원에서 제안되는 다양한 실시양태에 대한 수많은 변형 및 부가가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이다. 따라서, 하기 명세서는 본 발명의 일부 특정한 실시양태를 예시하는 것으로 의도되나, 그의 모든 순열, 조합 및 변경을 포괄적으로 명시하는 것으로 의도되지 않는다.
문맥상 달리 나타내지 않는 한, 본원에 기재된 본 발명의 다양한 특색은 임의의 조합으로 사용될 수 있는 것으로 구체적으로 의도된다. 더욱이, 본 발명은 또한 본 발명의 일부 실시양태에서 본원에 제시된 임의의 특색 또는 특색의 조합이 배제 또는 생략될 수 있다는 것도 고려한다. 예시를 위해, 명세서에서 복합체가 성분 A, B 및 C를 포함하는 것으로 언급된 경우에, A, B 또는 C 중 어느 것, 또는 그의 조합이 단독으로 또는 임의의 조합으로 생략 및 포기될 수 있는 것으로 구체적으로 의도된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 본 발명의 설명에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태만을 기재하기 위한 목적이고, 본 발명을 제한하고자 의도되는 것은 아니다.
뉴클레오티드 서열은 달리 구체적으로 나타내지 않는 한 좌측에서 우측으로 5'에서 3' 방향으로 단일 가닥으로만 본원에 제시된다. 뉴클레오티드 및 아미노산은 IUPAC-IUB 생화학적 명명 위원회 또는 (아미노산의 경우) 1-문자 코드 또는 3 문자 코드에 의해 둘 다 37 C.F.R. §1.822 및 확립된 용법에 따라 권장된 방식으로 본원에 나타내어진다.
달리 나타내는 것을 제외하고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 방법은 재조합 및 합성 폴리펩티드, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 생산, 핵산 서열의 조작, 형질전환된 세포의 생산, rAAV 구축물, 변형된 캡시드 단백질, AAV rep 및/또는 cap 서열을 발현하는 패키징 벡터, 및 일시적으로 및 안정하게 형질감염된 패키징 세포의 구축에 사용될 수 있다. 이러한 기술은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [SAMBROOK et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd Ed. (Cold Spring Harbor, NY, 1989); F. M. AUSUBEL et al. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York)]을 참조한다.
본원에 언급된 모든 공개, 특허 출원, 특허, 뉴클레오티드 서열, 아미노산 서열 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.
정의
본 발명 및 첨부된 청구범위의 기재에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 나타내지 않는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 "및/또는"은 연관되어 있는 열거된 항목 중 1개 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합, 뿐만 아니라 대안적인 것 ("또는")으로 해석되는 경우에 조합의 결여를 지칭하고 포괄한다.
더욱이, 본 발명은 또한 본 발명의 일부 실시양태에서 본원에 제시된 임의의 특색 또는 특색의 조합이 배제 또는 생략될 수 있다는 것을 고려한다.
게다가, 측정가능한 값, 예컨대 본 발명의 화합물 또는 작용제의 양, 용량, 시간, 온도 등을 언급하는 경우에 본원에 사용된 용어 "약"은 명시된 양의 ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0.5% 또는 심지어 ±0.1%의 변경을 포괄한다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 연결 어구 "로 본질적으로 이루어진"은 언급된 물질 또는 단계 및 청구된 본 발명의 기초 및 신규 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "로 본질적으로 이루어진"은 "포함하는"과 등가로서 해석되지 않을 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 적용된 용어 "로 본질적으로 이루어지다" (및 문법적 변형)는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 언급된 서열 (예를 들어, 서열식별번호(SEQ ID NO)) 및 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 기능이 실질적으로 변경되지 않도록 하는 언급된 서열의 5' 및/또는 3' 또는 N-말단 및/또는 C-말단 단부 또는 2개의 단부 사이 (예를 들어, 도메인 사이)의 총 10개 이하 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 추가의 뉴클레오티드 또는 아미노산 둘 다로 이루어진 것을 의미한다. 총 10개 이하의 추가의 뉴클레오티드 또는 아미노산은 함께 부가된 추가의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 총수를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 적용된 용어 "실질적으로 변경된"은 코딩된 폴리펩티드를 발현하는 능력에 있어서 언급된 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 발현 수준과 비교하여 적어도 약 50% 이상의 증가 또는 감소를 지칭한다. 본 발명의 폴리펩티드에 적용된 용어 "실질적으로 변경된"은 생물학적 활성에 있어서 언급된 서열로 이루어진 폴리펩티드의 활성과 비교하여 적어도 약 50% 이상의 증가 또는 감소를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "파르보바이러스(parvovirus)"는 자율-복제 파르보바이러스 및 데펜도바이러스(dependovirus)를 포함한, 패밀리 파르보비리다에(Parvoviridae)를 포괄한다. 자율 파르보바이러스는 속 파르보바이러스, 에리트로바이러스(Erythrovirus), 덴소바이러스(Densovirus), 이테라바이러스(Iteravirus) 및 콘트라바이러스(Contravirus)의 구성원을 포함한다. 예시적인 자율 파르보바이러스는 마우스 미세 바이러스, 소 파르보바이러스, 개 파르보바이러스, 닭 파르보바이러스, 고양이 범백혈구감소증 바이러스, 고양이 파르보바이러스, 거위 파르보바이러스, H1 파르보바이러스, 무스코비 오리 파르보바이러스, 뱀 파르보바이러스, 및 B19 바이러스를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 자율 파르보바이러스가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)]을 참조한다.
속 데펜도바이러스는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 유형 1, AAV 유형 2, AAV 유형 3 (유형 3A 및 3B 포함), AAV 유형 4, AAV 유형 5, AAV 유형 6, AAV 유형 7, AAV 유형 8, AAV 유형 9, AAV 유형 10, AAV 유형 11, AAV 유형 12, AAV 유형 13, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 염소 AAV, 뱀 AAV, 말 AAV 및 양 AAV를 포함하나 이에 제한되지는 않는, AAV를 함유한다. 예를 들어, 문헌 [FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)]; 및 표 1을 참조한다.
본 발명의 문맥에서 용어 "아데노-연관 바이러스" (AAV)는 비제한적으로 AAV 유형 1, AAV 유형 2, AAV 유형 3 (유형 3A 및 3B를 포함함), AAV 유형 4, AAV 유형 5, AAV 유형 6, AAV 유형 7, AAV 유형 8, AAV 유형 9, AAV 유형 10, AAV 유형 11, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV 및 양 AAV, 및 현재 공지되어 있거나 나중에 발견될 임의의 다른 AAV를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)]을 참조한다. 다수의 추가의 AAV 혈청형 및 계통군이 확인되었으며 (예를 들어, 문헌 [Gao et al., (2004) J. Virol. 78:6381-6388] 및 표 1 참조), 이는 또한 용어 "AAV"에 포괄된다.
본 발명의 파르보바이러스 입자 및 게놈은 AAV로부터의 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 다양한 혈청형의 AAV 및 자율 파르보바이러스의 게놈 서열, 뿐만 아니라 천연 ITR, Rep 단백질 및 캡시드 서브유닛의 서열이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 서열은 문헌 또는 공중 데이터베이스, 예컨대 진뱅크(GenBank)에서 찾아볼 수 있다. 예를 들어, 진뱅크 수탁 번호 NC_002077, NC_001401, NC_001729, NC_001863, NC_001829, NC_001862, NC_000883, NC_001701, NC_001510, NC_006152, NC_006261, AF063497, U89790, AF043303, AF028705, AF028704, J02275, J01901, J02275, X01457, AF288061, AH009962, AY028226, AY028223, AY631966, AX753250, EU285562, NC_001358, NC_001540, AF513851, AF513852 및 AY530579를 참조하고; 파르보바이러스 및 AAV 핵산 및 아미노산 서열의 교시를 위해 상기의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 또한, 예를 들어, 문헌 [Bantel-Schaal et al., (1999) J. Virol. 73: 939; Chiorini et al., (1997) J. Virol. 71:6823; Chiorini et al., (1999) J. Virol. 73:1309; Gao et al., (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854; Moris et al., (2004) Virol. 33-:375-383; Mori et al., (2004) Virol. 330:375; Muramatsu et al., (1996) Virol. 221:208; Ruffing et al., (1994) J. Gen. Virol. 75:3385; Rutledge et al., (1998) J. Virol. 72:309; Schmidt et al., (2008) J. Virol. 82:8911; Shade et al., (1986) J. Virol. 58:921; Srivastava et al., (1983) J. Virol. 45:555; Xiao et al., (1999) J. Virol. 73:3994]; 국제 특허 공개 WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; 및 미국 특허 번호 6,156,303을 참조하고; 파르보바이러스 및 AAV 핵산 및 아미노산 서열의 교시를 위해 상기의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 또한 표 1을 참조한다. AAV1, AAV2 및 AAV3 ITR 서열의 초기 기재는 문헌 [Xiao, X., (1996), "Characterization of Adeno-associated virus (AAV) DNA replication and integration," Ph.D. Dissertation, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA] (그 전문이 본원에 포함됨)에 제공된다.
"키메라" AAV 핵산 캡시드 코딩 서열 또는 AAV 캡시드 단백질은 2개 이상의 캡시드 서열의 부분을 합한 것이다. "키메라" AAV 비리온 또는 입자는 키메라 AAV 캡시드 단백질을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "향성"은 바이러스의 특정 세포 또는 조직 유형(들)으로의 선호되는 진입 및/또는 특정 세포 또는 조직 유형으로의 진입을 용이하게 하는 세포 표면과의 선호되는 상호작용, 임의로 및 바람직하게는 이어지는 바이러스 게놈에 의해 세포에 전달되는 서열의 발현 (예를 들어, 전사 및, 임의로 번역), 예를 들어 재조합 바이러스의 경우, 이종 뉴클레오티드 서열(들)의 발현을 지칭한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 바이러스 게놈으로부터의 이종 핵산 서열의 전사가 트랜스-작용 인자, 예를 들어 유도성 프로모터 또는 달리 조절되는 핵산 서열의 부재 하에 개시될 수 없다는 것을 인지할 것이다. rAAV 게놈의 경우, 바이러스 게놈으로부터의 유전자 발현은 안정하게 통합된 프로바이러스 및/또는 비-통합된 에피솜으로부터 뿐만 아니라 바이러스 핵산이 세포 내에 흡수될 수 있는 임의의 다른 형태로부터의 것일 수 있다.
표 1
Figure 112018124023342-pct00001
용어 "향성 프로파일"은 하나 이상의 표적 세포, 조직 및/또는 기관의 형질도입의 패턴을 지칭한다. 키메라 AAV 캡시드의 대표적인 예는 CNS의 세포의 효율적인 형질도입과 단지 말초 기관의 낮은 형질도입을 특징으로 하는 향성 프로파일을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "CLN1 유전자의 이상 발현과 연관된 장애"는 정상 대상체 또는 집단에서의 발현 수준 또는 활성에 비해 대상체에서 CLN1 유전자의 감소되거나 변경된 발현에 의해 유발된 질환, 장애, 증후군 또는 상태 또는 그의 증상을 지칭한다.
본원에 사용된 바이러스 벡터 (예를 들어, AAV 벡터)에 의한 세포의 "형질도입"은 벡터의 세포로의 진입, 및 핵산의 바이러스 벡터로의 혼입 및 바이러스 벡터를 통한 세포로의 후속 수송에 의한 유전 물질의 세포로의 수송을 의미한다.
달리 나타내지 않는 한, "효율적인 형질도입" 또는 "효율적인 향성" 또는 유사한 용어는 적합한 양성 또는 음성 대조군을 참조하여 결정될 수 있다 (예를 들어, 양성 대조군의 각각 형질도입 또는 향성의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 초과 또는 음성 대조군의 각각 형질도입 또는 향성의 적어도 약 110%, 120%, 150%, 200%, 300%, 500%, 1000% 또는 그 초과).
유사하게, 적합한 대조군을 참조하여 바이러스가 표적 조직 또는 유사한 용어에 대해 "효율적으로 형질도입시키지 않는지" 또는 "효율적인 향성을 갖지 않는지" 결정할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 CNS 외부의 조직, 예를 들어 간, 신장, 생식선 및/또는 배세포를 효율적으로 형질도입시키지 않는다 (즉, 효율적인 향성을 갖지 않는다). 특정한 실시양태에서, 조직(들) (예를 들어, 간)의 바람직하지 않은 형질도입은 목적 표적 조직(들) (예를 들어, CNS 세포)의 형질도입 수준의 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하, 0.1% 이하이다.
용어 "5' 부분" 및 "3' 부분"은 2개 이상의 요소 사이의 공간적 관계를 정의하기 위한 상대적 용어이다. 따라서, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 "3' 부분"은 또 다른 절편의 하류인 폴리뉴클레오티드의 절편을 나타낸다. 용어 "3' 부분"은, 그러할 수는 있지만, 절편이 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 반드시 존재한다거나, 심지어 그것이 폴리뉴클레오티드의 3' 절반에 반드시 존재한다는 것을 나타내는 것으로 의도되지 않는다. 마찬가지로, 폴리뉴클레오티드의 "5' 부분"은 또 다른 절편의 상류인 폴리뉴클레오티드의 절편을 나타낸다. 용어 "5' 부분"은, 그러할 수는 있지만, 절편이 폴리뉴클레오티드의 5' 단부에 반드시 존재한다거나, 심지어 그것이 폴리뉴클레오티드의 5' 절반에 반드시 존재한다는 것을 나타내는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는, 달리 나타내지 않는 한, 펩티드 및 단백질 둘 다를 포괄한다. 본원에 사용된 용어 주어진 펩티드의 "단편"은 펩티드의 임의의 펩티드 하위세트를 지칭하는 것으로 의도된다. 한 실시양태에서, 단편은 펩티드의 서열의 적어도 2개의 인접 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 단편은 펩티드의 적어도 4 적어도 5, 적어도 6, 적어도 8, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 또는 적어도 100개의 인접 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단편은 주어진 펩티드의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열을 갖는다.
"폴리뉴클레오티드", "핵산" 또는 "뉴클레오티드 서열"은 뉴클레오티드 염기의 서열이고, RNA, DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드 서열 (자연 발생 및 비-자연 발생 뉴클레오티드 둘 다를 포함)일 수 있지만, 바람직하게는 단일 또는 이중 가닥 DNA 서열이다.
본원에 사용된 용어 "오픈 리딩 프레임 (ORF)"은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부분, 예를 들어, 유전자를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "코돈-최적화"는 코딩 서열에 정상적으로 존재하는 1개 이상의 코돈을 동일한 (동의) 아미노산에 대한 코돈으로 치환함으로써 코딩 서열의 발현을 증가시키도록, 야생형 코딩 서열 (예를 들어, PPT1에 대한 코딩 서열)에 비해 최적화된 코딩 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 치환은 드문 코돈 (예를 들어, 인간 코돈)을 최소화하고/거나, 총 GC 함량을 증가시키고/거나, CpG 함량을 감소시키고/거나, 잠재 스플라이스 공여자 또는 수용자 부위를 제거하고/거나, 리보솜 진입 부위, 예컨대 코작 서열을 부가하거나 제거한다.
본원에 사용된 용어 "서열 동일성"은 관련 기술분야에서의 표준 의미를 갖는다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 다수의 상이한 프로그램을 사용하여 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 공지된 서열과 서열 동일성 또는 유사성을 갖는지 여부를 확인할 수 있다. 서열 동일성 또는 유사성은 문헌 [Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국부 서열 동일성 알고리즘, 문헌 [Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 서열 동일성 정렬 알고리즘, 문헌 [Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 검색 방법, 이들 알고리즘의 컴퓨터 구현 (위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package)의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 문헌 [Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12:387 (1984)]에 기재된 베스트 피트(Best Fit) 서열 프로그램을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야에 공지된 표준 기술을 사용하여, 바람직하게는 디폴드 설정을 사용하여, 또는 검사에 의해 결정될 수 있다.
유용한 알고리즘의 예는 파일업(PILEUP)이다. 파일업은 진행되는 쌍별 정렬을 사용하여 관련 서열들의 군으로부터의 다중 서열 정렬을 생성한다. 또한, 정렬을 생성하는데 사용된 클러스터링 관계를 나타내는 트리를 플롯팅할 수 있다. 파일업은 문헌 [Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351 (1987)]의 진행되는 정렬 방법의 단순화를 사용하고; 방법은 문헌 [Higgins & Sharp, CABIOS 5:151 (1989)]에 기재된 것과 유사하다.
유용한 알고리즘의 또 다른 예는 문헌 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990) 및 Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 (1993)]에 기재된 BLAST 알고리즘이다. 특히 유용한 BLAST 프로그램은 문헌 [Altschul et al., Meth. Enzymol., 266:460 (1996)]; blast.wustl/edu/blast/README.html에서 입수되는 WU-BLAST-2 프로그램이다. WU-BLAST-2는, 바람직하게는 디폴드 값으로 설정된, 여러 검색 파라미터를 사용한다. 파라미터는 동적 값이고, 특정한 서열의 조성 및 관심 서열이 검색되는 특정한 데이터베이스의 조성에 의존하여 프로그램 그 자체에 의해 확립되지만; 그러한 값은 감수성을 증가시키기 위해 조정될 수 있다.
추가의 유용한 알고리즘은 문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389 (1997)]에 보고된 바와 같은 갭이 있는 BLAST이다.
백분율 아미노산 서열 동일성 값은 동일한 잔기에 매칭하는 개수를 정렬된 영역에서의 "더 긴" 서열의 잔기의 총수로 나눈 것에 의해 결정된다. "더 긴" 서열은 정렬된 영역에서 최대 실제 잔기를 갖는 것이다 (정렬 스코어를 최대화하기 위해 WU-Blast-2에 의해 도입된 갭은 무시함).
유사한 방식으로, 퍼센트 핵산 서열 동일성은 본원에 구체적으로 개시된 폴리뉴클레오티드에서 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열에서의 뉴클레오티드 잔기의 백분율로 정의된다.
정렬은 정렬하고자 하는 서열에서의 갭의 도입을 포함할 수 있다. 또한, 본원에 구체적으로 개시된 폴리뉴클레오티드보다 더 많거나 또는 더 적은 뉴클레오티드를 함유하는 서열의 경우, 한 실시양태에서, 서열 동일성의 백분율은 뉴클레오티드의 총수와 관련하여 동일한 뉴클레오티드의 개수에 기초하여 결정될 것으로 이해된다. 따라서, 예를 들어, 본원에 구체적으로 개시된 서열보다 더 짧은 서열의 서열 동일성은 한 실시양태에서 더 짧은 서열에서의 뉴클레오티드의 개수를 사용하여 결정될 것이다. 퍼센트 동일성 계산에서, 서열 변이, 예컨대 삽입, 결실, 치환 등의 다양한 표시에 대해 상대 가중치를 할당하지 않는다.
한 실시양태에서, 동일성만을 양의 값 (+1)으로 스코어링하고, 갭을 포함한 모든 형태의 서열 변이에 "0"의 값을 할당하며, 이는 서열 유사성 계산에 대하여 하기 기재된 바와 같은 가중 스케일 또는 파라미터에 대한 필요를 제거한다. 퍼센트 서열 동일성은 예를 들어 동일한 잔기에 매칭하는 개수를 정렬된 영역에서의 "더 짧은" 서열의 잔기의 총수로 나누고, 100을 곱하여 계산할 수 있다. "더 긴" 서열은 정렬된 영역에서 가장 실제 잔기를 갖는 것이다.
본원에 사용된 "단리된" 핵산 또는 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, "단리된 DNA" 또는 "단리된 RNA")은 자연 발생 유기체 또는 바이러스의 다른 성분, 예를 들어 세포 또는 바이러스 구조적 성분 또는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열과 회합되어 통상적으로 발견되는 다른 폴리펩티드 또는 핵산의 적어도 일부로부터 분리되거나 또는 실질적으로 유리된 핵산 또는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
마찬가지로, "단리된" 폴리펩티드는 자연 발생 유기체 또는 바이러스의 다른 성분, 예를 들어 세포 또는 바이러스 구조적 성분 또는 폴리펩티드와 회합되어 통상적으로 발견되는 다른 폴리펩티드 또는 핵산의 적어도 일부로부터 분리되거나 또는 실질적으로 유리된 폴리펩티드를 의미한다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 적용되는 바와 같은 본원에 사용된 용어 "변형된"은 1개 이상의 결실, 부가, 치환, 또는 그의 임의의 조합으로 인해 야생형 서열과 상이한 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 바이러스 벡터를 "단리하다" 또는 "정제하다" (또는 문법적 등가물)는 바이러스 벡터가 출발 물질 중의 다른 성분 중 적어도 일부로부터 적어도 부분적으로 분리되는 것을 의미한다.
용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "의 치료" (또는 그의 문법적으로 동등한 용어)는 대상체의 상태의 중증도가 감소되거나, 적어도 부분적으로 개선 또는 호전되고/거나, 적어도 하나의 임상 증상의 일부 완화, 경감 또는 감소가 달성되고/거나, 상태의 진행이 지연됨을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "예방하다", "예방한다" 또는 "예방" (및 그의 문법적 등가물)은 질환 또는 장애의 발병의 지연 또는 질환 또는 장애의 발병 시 증상의 경감을 지칭한다. 용어는 질환의 완전한 제거를 의미하는 것으로 의도되지 않고, 상태의 발생률을 감소시키거나 상태의 발병 및/또는 진행을 지연시키는 임의의 유형의 예방적 치료를 포괄한다.
본원에 사용된 "치료 유효"량은 대상체에게 일부 개선 또는 이익을 제공하기에 충분한 양이다. 대안적으로 말하면, "치료 유효"량은 대상체에서 적어도 하나의 임상 증상의 일부 경감, 완화, 감소, 또는 안정화를 제공할 양이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 대상체에게 일부 이익이 제공되는 한 치료 효과가 완전하거나 치유적일 필요는 없다는 것을 인지할 것이다.
본원에 사용된 "예방 유효"량은, 대상체에서의 질환, 장애 및/또는 임상 증상의 발병을 예방하고/거나 지연시키기에 및/또는 본 발명의 방법의 부재 하에 일어날 것에 비해 대상체에서의 질환, 장애 및/또는 임상 증상의 발병의 중증도를 감소 및/또는 지연시키기에 충분한 양이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 대상체에게 일부 이익이 제공되는 한 예방 수준이 완전할 필요는 없다는 것을 인지할 것이다.
"이종 뉴클레오티드 서열" 또는 "이종 핵산"은 바이러스에서 자연적으로 발생하지 않는 서열이다. 일반적으로, 이종 핵산 또는 뉴클레오티드 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 및/또는 비번역 RNA를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "벡터" 또는 "전달 벡터" (및 유사한 용어)는 세포 또는 대상체에 전달될 수 있는 DNA 단편, 뉴클레오티드 분자 또는 입자를 지칭한다. 벡터는 바이러스 또는 비-바이러스 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터는 박테리아 플라스미드, 파지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스 벡터, 또는 다른 벡터를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 벡터는 나노입자를 포함한다. 용어 "바이러스 벡터" 또는 "바이러스성 벡터"는 일반적으로 핵산 전달 비히클로서 기능하고 비리온 내에 패키징된 바이러스 핵산 (즉, 벡터 게놈)을 포함하는 바이러스 입자를 지칭한다. 본 발명에 따른 바이러스 벡터는 본 발명에 따른 키메라 AAV 캡시드를 포함하나 이에 제한되지는 않고, AAV 또는 rAAV 게놈, 또는 바이러스 핵산을 포함한 임의의 다른 핵산을 패키징할 수 있다. 대안적으로, 일부 문맥에서, 용어 "벡터", "바이러스 벡터", "전달 벡터" (및 유사한 용어)는 비리온의 부재 하의 벡터 게놈 (예를 들어, vDNA) 및/또는 캡시드에 테더링되거나 캡시드 내에 패키징된 분자를 전달하기 위한 수송체로서 작용하는 바이러스 캡시드를 지칭하는데 사용될 수 있다. 용어 "비-바이러스 벡터"는 바이러스 요소를 포함하지 않는 벡터, 플라스미드, 구축물, 분자 또는 입자를 지칭한다. 비-바이러스 입자는, 일부 실시양태에서, 박테리아 플라스미드, 효모 플라스미드, 재조합 벡터, 나노입자 또는 다른 벡터를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 한 실시양태에서, 비-바이러스 입자는 나노입자를 포함한다. 비-바이러스 벡터는 주사, 전기천공, 유전자 총, 초음파천공, 마그네토펙션, 유체역학적 전달, 또는 다른 물리적이거나 화학적 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 방법에 의해 세포 또는 대상체에게 전달될 수 있다.
본 발명의 바이러스 벡터는 추가로 국제 특허 공개 WO 01/92551 (그의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 듀플렉스화된 파르보바이러스 입자일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 이중 가닥 (듀플렉스) 게놈이 패키징될 수 있다.
"재조합 AAV 벡터 게놈" 또는 "rAAV 게놈"은 적어도 1개의 역전된 말단 반복부 (예를 들어, 1, 2 또는 3개의 역전된 말단 반복부) 및 1개 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV 게놈 (즉, vDNA)이다. rAAV 벡터는 일반적으로 145개의 염기 말단 반복부(들) (TR(들))를 시스로 보유하여 바이러스를 생성하지만; 부분 또는 완전 합성 서열을 포함한 변형된 AAV TR 및 비-AAV TR이 또한 이 목적을 위해 사용될 수 있다. 모든 다른 바이러스 서열은 불필요하고, 트랜스로 공급될 수 있다 (Muzyczka, (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97). rAAV 벡터는 임의로 2개의 TR (예를 들어, AAV TR)을 포함하며, 이는 일반적으로 이종 뉴클레오티드 서열(들)의 5' 및 3' 단부에 있을 것이나, 그에 인접할 필요는 없다. TR은 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 벡터 게놈은 또한 그의 3' 또는 5' 단부에 단일 ITR을 함유할 수 있다.
용어 "말단 반복부" 또는 "TR"은 헤어핀 구조를 형성하며 역전된 말단 반복부로서 기능하는 (즉, 목적하는 기능, 예컨대 복제, 바이러스 패키징, 통합 및/또는 프로바이러스 구제 등을 매개하는) 임의의 바이러스 말단 반복부 또는 합성 서열을 포함한다. TR은 AAV TR 또는 비-AAV TR일 수 있다. 예를 들어, 비-AAV TR 서열, 예컨대 다른 파르보바이러스 (예를 들어, 개 파르보바이러스 (CPV), 마우스 파르보바이러스 (MVM), 인간 파르보바이러스 B-19)의 것 또는 SV40 복제의 기점으로서의 역할을 하는 SV40 헤어핀이 TR로서 사용될 수 있으며, 이는 말단절단, 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가에 의해 추가로 변형될 수 있다. 추가로, TR은 미국 특허 번호 5,478,745 (Samulski et al.)에 기재된 바와 같은 부분 또는 완전 합성, 예컨대 "이중-D 서열"일 수 있다.
파르보바이러스 게놈은 그의 5' 및 3' 단부 둘 다에 회문식 서열을 갖는다. 서열의 회문식 속성은 헤어핀 구조의 형성으로 이어지고 이는 상보적 염기 쌍 사이의 수소 결합의 형성에 의해 안정화된다. 이러한 헤어핀 구조는 "Y" 또는 "T" 형상을 채택하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 문헌 [FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapters 69 & 70 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)]을 참조한다.
"AAV 말단 반복부" 또는 "AAV TR"은 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11 또는 현재 공지되어 있거나 나중에 발견된 임의의 다른 AAV를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 AAV로부터의 것일 수 있다 (예를 들어, 표 1 참조). 일부 실시양태에서, AAV 말단 반복부는, 말단 반복부가 목적하는 기능, 예를 들어 복제, 바이러스 패키징, 통합 및/또는 프로바이러스 구제 등을 매개할 경우, 천연 말단 반복 서열을 갖지 않는다 (예를 들어, 천연 AAV TR 서열은 삽입, 결실, 말단절단 및/또는 미스센스 돌연변이에 의해 변경될 수 있음). 또 다른 실시양태에서, AAV 말단 반복부는 천연 말단 반복 서열을 갖는다.
용어 "rAAV 입자" 및 "rAAV 비리온"은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. "rAAV 입자" 또는 "rAAV 비리온"은 AAV 캡시드 내에 패키징된 rAAV 벡터 게놈을 포함한다.
본 발명의 바이러스 벡터는 추가로 국제 특허 공개 WO 00/28004 및 문헌 [Chao et al., (2000) Mol. Therapy 2:619]에 기재된 바와 같은 "표적화된" 바이러스 벡터 (예를 들어, 지시된 향성을 가짐) 및/또는 "하이브리드" 파르보바이러스 (즉, 바이러스 ITR 및 바이러스 캡시드가 상이한 파르보바이러스로부터의 것임)일 수 있다.
추가로, 바이러스 캡시드 또는 게놈 요소는 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함한 다른 변형을 함유할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "아미노산"은 임의의 자연 발생 아미노산, 그의 변형된 형태, 및 합성 아미노산을 포괄한다.
자연 발생, 좌선성 (L-) 아미노산이 표 2에 제시된다.
표 2
Figure 112018124023342-pct00002
대안적으로, 아미노산은 변형된 아미노산 잔기일 수 있거나 (비제한적 예가 표 3에 제시됨) 또는 번역 후 변형 (예를 들어, 아세틸화, 아미드화, 포르밀화, 히드록실화, 메틸화, 인산화 또는 황산화)에 의해 변형된 아미노산일 수 있다.
표 3: 아미노산 잔기 유도체
Figure 112018124023342-pct00003
Figure 112018124023342-pct00004
추가로, 비-자연 발생 아미노산은 문헌 [Wang et al., (2006) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35:225-49]에 기재된 바와 같은 "비천연" 아미노산일 수 있다. 이들 비천연 아미노산은 유리하게는 AAV 캡시드 단백질에 관심 분자를 화학적으로 연결시키는데 사용될 수 있다.
용어 "주형" 또는 "기질"은 본원에서, 복제되어 파르보바이러스 바이러스 DNA를 생산할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭하는데 사용된다. 벡터 생산을 위해, 주형은 전형적으로 플라스미드, 네이키드 DNA 벡터, 박테리아 인공 염색체 (BAC), 효모 인공 염색체 (YAC) 또는 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, AAV, 바큘로바이러스, 레트로바이러스 벡터 등)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 보다 큰 뉴클레오티드 서열 또는 구축물 내에 삽입될 것이다. 대안적으로, 주형은 패키징 세포의 염색체 내로 안정하게 혼입될 수 있다.
본원에 사용된 파르보바이러스 또는 AAV "Rep 코딩 서열"은 바이러스 복제 및 새로운 바이러스 입자의 생산을 매개하는 파르보바이러스 또는 AAV 비-구조 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다. 파르보바이러스 및 AAV 복제 유전자 및 단백질은, 예를 들어, 문헌 [Fields et al., Virology, volume 2, chapters 69 & 70 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)]에 기재되어 있다.
"Rep 코딩 서열"은 모든 파르보바이러스 또는 AAV Rep 단백질을 코딩할 필요는 없다. 예를 들어, AAV와 관련하여, Rep 코딩 서열은 모든 4종의 AAV Rep 단백질 (Rep78, Rep 68, Rep52 및 Rep40)을 코딩할 필요는 없고, 실제로, AAV5는 단지 스플라이싱된 Rep68 및 Rep40 단백질만을 발현하는 것으로 여겨진다. 대표적 실시양태에서, Rep 코딩 서열은 바이러스 게놈 복제 및 새로운 비리온 내로의 패키징에 필요한 적어도 그러한 복제 단백질을 코딩한다. Rep 코딩 서열은 일반적으로 적어도 1종의 대형 Rep 단백질 (즉, Rep78/68) 및 1종의 소형 Rep 단백질 (즉, Rep52/40)을 코딩할 것이다. 특정한 실시양태에서, Rep 코딩 서열은 AAV Rep78 단백질 및 AAV Rep52 및/또는 Rep40 단백질을 코딩한다. 다른 실시양태에서, Rep 코딩 서열은 Rep68 및 Rep52 및/또는 Rep40 단백질을 코딩한다. 추가 실시양태에서, Rep 코딩 서열은 Rep68 및 Rep52 단백질, Rep68 및 Rep40 단백질, Rep78 및 Rep52 단백질, 또는 Rep78및 Rep40 단백질을 코딩한다.
본원에 사용된 용어 "대형 Rep 단백질"은 Rep68 및/또는 Rep78을 지칭한다. 본 발명의 대형 Rep 단백질은 야생형 또는 합성일 수 있다. 야생형 대형 Rep 단백질은 혈청형 1, 2, 3a, 3b, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 13을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 임의의 파르보바이러스 또는 AAV로부터의 것, 또는 현재 공지되어 있거나 이후에 발견될 임의의 다른 AAV로부터의 것일 수 있다 (예를 들어, 표 1 참조). 합성 대형 Rep 단백질은 삽입, 결실, 말단절단 및/또는 미스센스 돌연변이에 의해 변경될 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 복제 단백질이 동일한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 필요는 없다는 것을 추가로 인지할 것이다. 예를 들어, MVM의 경우, NS-1 및 NS-2 단백질 (이는 스플라이스 변이체임)은 서로 독립적으로 발현될 수 있다. 마찬가지로, AAV의 경우, p19 프로모터는 불활성화될 수 있고, 대형 Rep 단백질(들)은 하나의 폴리뉴클레오티드로부터 발현되고, 소형 Rep 단백질(들)은 상이한 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있다. 그러나, 전형적으로 단일 구축물에서 복제 단백질을 발현시키는 것이 보다 편리할 것이다. 일부 시스템에서, 바이러스 프로모터 (예를 들어, AAV p19 프로모터)는 세포에 의해 인식되지 않을 수 있고, 따라서 대형 및 소형 Rep 단백질을 개별 발현 카세트로부터 발현시키는 것이 필요하다. 다른 경우에, 대형 Rep 및 소형 Rep 단백질을 개별적으로, 즉, 개별 전사 및/또는 번역 제어 요소의 제어 하에 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 대형 Rep 단백질의 발현을 제어하여, 대형 대 소형 Rep 단백질의 비를 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 곤충 세포의 경우에, 세포의 독성을 피하기 위해 대형 Rep 단백질 (예를 들어, Rep78/68)의 발현을 하향-조절하는 것이 유익할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Urabe et al., (2002) Human Gene Therapy 13:1935] 참조).
본원에 사용된 파르보바이러스 또는 AAV "cap 코딩 서열"은 기능적 파르보바이러스 또는 AAV 캡시드를 형성하는 구조 단백질을 코딩한다 (즉 DNA를 패키징하고 표적 세포를 감염시킬 수 있음). 전형적으로, cap 코딩 서열은 모든 파르보바이러스 또는 AAV 캡시드 서브유닛을 코딩할 것이지만, 기능적 캡시드가 생산되는 한 모든 것보다 작은 캡시드 서브유닛이 코딩될 수 있다. 전형적으로, 반드시 그러하지는 않지만, cap 코딩 서열은 단일 핵산 분자 상에 존재할 것이다.
자율 파르보바이러스 및 AAV의 캡시드 구조는 문헌 [BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapters 69 & 70 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.
특성을 "실질적으로 보유하다"는 특성 (예를 들어, 활성 또는 다른 측정가능한 특징)의 적어도 약 75%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 보유되는 것을 의미한다.
CLN1 발현 카세트 및 벡터
본 발명은 CLN1 유전자에 의해 코딩되는 효소인 팔미토일 단백질 티오에스테라제 1 (PPT1)의 최대 발현을 제공하기 위한 CLN1 발현 카세트의 설계, 및 대상체에서 PPT1의 치료 수준을 달성하기 위한 발현 카세트의 사용에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 팔미토일 단백질 티오에스테라제 1 (PPT1) 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 1의 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 (또는 그의 상보체) 또는 그와 적어도 약 90% 동일한 서열 또는 그의 상보체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 PPT1 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩한다. PPT1 폴리펩티드 서열은 진뱅크(GenBank)에서 발견할 수 있고, 수탁 번호 NP_071947.1, NP_776579.1, NP_032943.2, AAM49613.1, 및 AAH08426.1을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또 다른 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 세포는 인간 세포, 래트 세포, 마우스 세포, 개 세포 또는 임의의 포유동물 또는 식물 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 인간, 래트, 마우스, 소 또는 임의의 다른 종의 CLN1 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 인간 CLN1 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 오픈 리딩 프레임은 PPT1을 코딩하는 CLN1 유전자의 부분이다.
일부 실시양태에서, 코돈-최적화된 CLN1 오픈 리딩 프레임은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 서열 또는 그와 적어도 약 70% 동일한, 예를 들어, 그와 적어도 약 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다.
서열식별번호: 1: 인간 코돈-최적화된 CLN1 오픈 리딩 프레임 (부가된 정지 코돈은 밑줄표시됨)
Figure 112018124023342-pct00005
본 발명의 또 다른 측면은 PPT1 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 임의의 종의 CLN1 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 인간 CLN1 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 인간 코돈-최적화된 서열, 예를 들어, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그와 적어도 약 70% 동일한, 예를 들어, 그와 적어도 약 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일한 서열이다.
발현 카세트 내의 폴리뉴클레오티드는 코딩된 폴리펩티드의 발현을 증진시킬 수 있는 1종 이상의 발현 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다. 한 실시양태에서, 발현 카세트 내의 CLN1 폴리뉴클레오티드는 CLN1의 발현을 증진시킬 수 있는 1종 이상의 발현 요소에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 프로모터, 예를 들어 닭 베타-액틴 프로모터, 예를 들어, 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 이로 본질적으로 이루어진, 또는 이로 이루어진 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 추가로, 예를 들어 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 이로 본질적으로 이루어진, 또는 이로 이루어진 닭 베타-액틴 엑손 1 및 인트론 1을 포함한다.
서열식별번호: 2: 닭 베타-액틴 프로모터
Figure 112018124023342-pct00006
서열식별번호: 3: 닭 베타-액틴 엑손 1 및 인트론 1
Figure 112018124023342-pct00007
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 인핸서, 예를 들어 시토메갈로바이러스 인핸서, 예를 들어 서열식별번호: 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 이로 본질적으로 이루어진, 또는 이로 이루어진 인핸서에 작동가능하게 연결된다.
서열식별번호: 4: 시토메갈로바이러스 인핸서
Figure 112018124023342-pct00008
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 인트론, 예를 들어 하이브리드/변형된 MVM 인트론, 예를 들어 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 이로 본질적으로 이루어진, 또는 이로 이루어진 인트론에 작동가능하게 연결된다. 인트론은, 발현을 증진시키는데 효과적인 발현 카세트의 임의의 부분에, 예를 들어 ORF에 선행하여, ORF 내에, 또는 ORF와 폴리아데닐화 부위 사이에 위치할 수 있다.
서열식별번호: 5: 하이브리드/변형된 MVM 인트론
Figure 112018124023342-pct00009
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리아데닐화 신호, 예를 들어 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호, 예를 들어 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 이로 본질적으로 이루어진, 또는 이로 이루어진 폴리아데닐화 신호에 작동가능하게 연결된다.
서열식별번호: 6: 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호
Figure 112018124023342-pct00010
관련 기술분야의 통상의 기술자는 추가로 다양한 프로모터/인핸서 요소가 목적하는 수준 및 조직-특이적 발현에 따라 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 본원에 사용된 용어 "프로모터"는 RNA 폴리머라제가 결합하여 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열 (예를 들어, 유전자)의 전사를 개시하는 DNA 영역을 나타낸다. 프로모터는 바이러스 또는 비-바이러스 프로모터일 수 있다. 바이러스 프로모터는 pCMV, SV40, MMTV 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 비-바이러스 프로모터는 UbC, EF 또는 PGK 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 용어 "인핸서"는 시스-작용성 전사 조절 요소를 지칭한다. 한 실시양태에서, 인핸서는 유전자 발현의 전체적 조정의 측면을 부여한다. 또 다른 실시양태에서, 인핸서 요소는 DNA-결합 단백질에 결합하고/거나 DNA 위상에 영향을 미쳐, RNA 폴리머라제의 DNA 주형에 대한 접근을 선택적으로 허용 또는 제한하거나 또는 전사 개시 부위에서 이중 나선의 선택적 개방을 용이하게 하는 국부 입체형태를 발생시킨다. 인핸서의 비제한적 목록은 VISTA 인핸서 브라우저에서 찾아볼 수 있고, enhancer.lbl.gov/?에서 이용가능하다. 용어 "인트론"은 유전자좌와 회합된 5' 및 3' 비번역 영역과 함께, 엑손 사이의 비번역 DNA 서열을 지칭한다. 프로모터/인핸서는 목적하는 발현의 패턴에 따라 구성적 또는 유도성일 수 있다. 프로모터/인핸서는 천연 또는 외래의 것일 수 있고, 천연 또는 합성 서열일 수 있다. 외래의 것인 경우, 전사 개시 영역은 야생형 숙주에서는 발견되지 않으며, 그 내로 전사 개시 영역이 도입되는 것으로 의도된다.
프로모터/인핸서 요소는 표적 세포 또는 치료될 대상체에 대해 고유한 것이고/거나 이종 핵산 서열에 대해 고유한 것일 수 있다. 프로모터/인핸서 요소는 일반적으로 관심 표적 세포(들)에서 기능하게 되도록 선택된다. 대표적 실시양태에서, 프로모터/인핸서 요소는 포유동물 프로모터/인핸서 요소이다. 프로모터/인핸서 요소는 구성적 또는 유도성일 수 있다.
유도성 발현 제어 요소는 일반적으로 이종 핵산 서열(들)의 발현에 대한 조절을 제공하는 것이 바람직한 적용에 사용된다. 유전자 전달을 위한 유도성 프로모터/인핸서 요소는 조직-특이적 또는 조직-선호 프로모터/인핸서 요소일 수 있고, 근육 특이적 또는 선호 (심장, 골격 및/또는 평활 근육 포함), 신경 조직 특이적 또는 선호 (뇌-특이적 포함), 눈 (망막-특이적 및 각막-특이적 포함), 간 특이적 또는 선호, 골수 특이적 또는 선호, 췌장 특이적 또는 선호, 비장 특이적 또는 선호, 및 폐 특이적 또는 선호 프로모터/인핸서 요소를 포함한다. 다른 유도성 프로모터/인핸서 요소는 호르몬-유도성 및 금속-유도성 요소를 포함한다. 예시적인 유도성 프로모터/인핸서 요소는 Tet 온/오프 요소, RU486-유도성 프로모터, 엑디손-유도성 프로모터, 라파마이신-유도성 프로모터, 및 메탈로티오네인 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
CLN1 ORF가 표적 세포에서 전사된 후에 번역되는 실시양태에서, 특정 개시 신호는 일반적으로 삽입된 단백질 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 사용된다. ATG 개시 코돈 및 인접한 서열을 포함할 수 있는 이들 외인성 번역 제어 서열은 다양한 기원의 것이고, 천연 및 합성 둘 다일 수 있다.
특정 실시양태에서, 발현 카세트는 적어도 1개의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전된 말단 반복부 (ITR), 예를 들어 2개의 AAV ITR을 추가로 포함한다. 2개의 ITR은 동일한 뉴클레오티드 서열 또는 상이한 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. AAV ITR은 임의의 AAV 혈청형, 예를 들어 AAV2로부터의 것일 수 있다. 각각의 ITR은 독립적으로 야생형 서열 또는 변형된 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 AAV 게놈, 예를 들어, 자기-상보적 AAV 게놈이다.
특정 실시양태에서, 발현 카세트는 PPT1 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 발현 카세트는 인간 CLN1 오픈 리딩 프레임, 및 프로모터, 엑손, 인트론, 인핸서 및 폴리아데닐화 신호 중 1종 이상의 임의의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 인간 CLN1 오픈 리딩 프레임, 및 프로모터, 엑손, 인트론, 인핸서 및 폴리아데닐화 신호 중 1종 이상의 임의의 조합을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 인핸서, 프로모터, 인트론, 인간 CLN1 오픈 리딩 프레임 및 폴리아데닐화 부위를, 임의로 언급된 순서로 포함한다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 AAV ITR, 인핸서, 프로모터, 인트론, 인간 CLN1 오픈 리딩 프레임, 폴리아데닐화 부위, 및 AAV ITR을, 임의로 언급된 순서로 포함한다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 CMV 인핸서, 닭 베타 액틴 프로모터, 하이브리드/변형된 MVM 인트론, 인간 CLN1 오픈 리딩 프레임, 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 부위를, 임의로 언급된 순서로 포함한다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 돌연변이체 AAV ITR, CMV 인핸서, 닭 베타 액틴 프로모터, 하이브리드/변형된 MVM 인트론, 인간 CLN1 오픈 리딩 프레임, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 부위, 및 야생형 AAV ITR을, 임의로 언급된 순서로 포함한다.
일부 실시양태에서, 발현 카세트는 서열식별번호: 7의 뉴클레오티드 서열 또는 그와 적어도 약 70% 동일한, 예를 들어, 그와 적어도 약 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일한 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다.
서열식별번호: 7: CLN1 발현 카세트
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본 발명의 추가 측면은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 발현 카세트를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 적합한 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스 벡터 (예를 들어, AAV 벡터, 아데노바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 알파바이러스, 또는 바큘로바이러스 벡터), 박테리아 인공 염색체 (BAC) 또는 효모 인공 염색체 (YAC)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 핵산은 5' 및/또는 3' 말단 반복부 (예를 들어, 5' 및/또는 3' AAV 말단 반복부)를 포함하는 AAV 벡터를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어 AAV 벡터이다. AAV 벡터는 임의의 AAV 혈청형, 예를 들어 AAV9일 수 있다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터는 야생형 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, AAV 벡터는 야생형 캡시드 단백질과 비교하여 변경된 향성을 갖는 변형된 캡시드 단백질, 예를 들어 간-탈표적화되고 신경계 세포에 대해 증진된 향성을 갖는 변형된 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 신경계 세포 향성을 갖는 변형된 캡시드 단백질의 예는, 비제한적으로, 미국 특허 번호 9,636,370 (예를 들어, col. 48, 54-65줄; 표 2) 및 국제 공개 번호 WO 2016/081811 (예를 들어, 단락 [0144] 및 [0287])을 포함하고, 이들 둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 벡터는 자기-상보적 또는 듀플렉스화된 AAV (scAAV) 벡터이다. scAAV 벡터는 국제 특허 공개 WO 01/92551 (그의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. CLN1 ORF를 발현시키기 위해 scAAV를 사용하는 것은 형질도입된 세포의 수, 형질도입된 세포당 카피수, 또는 둘 다의 증가를 제공할 수 있다.
본 발명의 추가의 측면은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트 및/또는 벡터를 포함하는 형질전환된 세포에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 및/또는 벡터는 세포 게놈 내로 안정하게 혼입된다. 형질전환된 세포는 시험관내, 생체외 또는 생체내 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 형질전환된 세포는 하기 기재된 바와 같은 AAV 벡터의 생산에 적합한 세포이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 벡터, 폴리펩티드 및/또는 형질전환된 세포를 포함하는 트랜스제닉 동물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 트랜스제닉 동물은 실험 동물, 예를 들어, 마우스 래트, 개 또는 원숭이이다. 일부 실시양태에서, 동물은 질환의 모델이다.
본 발명의 추가 측면은 하기 기재된 바와 같은 제약상 허용되는 담체 중 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 벡터 및/또는 형질전환된 세포를 포함하는 제약 제제에 관한 것이다.
바이러스 벡터를 생산하는 방법
본 발명은 추가로, 바이러스 벡터를 생산하는 방법을 제공한다. 하나의 특정한 실시양태에서, 본 발명은 AAV 복제 허용 세포에게 (a) (i) 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 발현 카세트, 및 (ii) ITR을 포함하는 재조합 AAV 주형; (b) Rep 코딩 서열 및 Cap 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를; 재조합 AAV 주형의 복제 및 패키징에 충분한 조건 하에 제공하여; 재조합 AAV 입자가 세포에서 생산되게 하는 것을 포함하는, 재조합 AAV 입자를 생산하는 방법을 제공한다. 재조합 AAV 주형의 복제 및 패키징에 충분한 조건은, 예를 들어, AAV 주형의 복제 및 AAV 캡시드 내로의 캡슐화에 충분한 AAV 서열 (예를 들어, AAV rep 서열 및 AAV cap 서열) 및 아데노바이러스 및/또는 헤르페스바이러스로부터의 헬퍼 서열의 존재일 수 있다. 특정한 실시양태에서, AAV 주형은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 5' 및 3'에 위치한 2개의 AAV ITR 서열을 포함하며, 이들은 직접 인접할 필요는 없다.
일부 실시양태에서, 재조합 AAV 주형은 국제 특허 공개 WO 01/92551에 기재된 바와 같이 듀플렉스화된 AAV 벡터를 제조하기 위해 Rep에 의해 분해되지 않는 ITR을 포함한다.
AAV 주형 및 AAV rep 및 cap 서열은 AAV 캡시드 내에 패키징된 AAV 주형을 포함하는 바이러스 벡터가 세포에서 생산되도록 하는 조건 하에 제공된다. 방법은 세포에서 바이러스 벡터를 수집하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 배지로부터 및/또는 세포를 용해시킴으로써 수집될 수 있다.
세포는 AAV 바이러스 복제를 허용하는 세포일 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 세포가 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포 (예를 들어, 영장류 또는 인간 세포)이다. 또 다른 옵션으로서, 세포는 복제-결함 헬퍼 바이러스로부터 결실된 기능을 제공하는 트랜스-상보성 패키징 세포주, 예를 들어 293 세포 또는 다른 E1a 트랜스-상보성 세포일 수 있다.
AAV 복제 및 캡시드 서열은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제공될 수 있다. 현행 프로토콜은 전형적으로 단일 플라스미드 상의 AAV rep/cap 유전자를 발현한다. AAV 복제 및 패키징 서열은 함께 제공되는 것이 편리할 수는 있지만 그래야 할 필요는 없다. AAV rep 및/또는 cap 서열은 임의의 바이러스 또는 비-바이러스 벡터에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, rep/cap 서열은 하이브리드 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 벡터에 의해 제공될 수 있다 (예를 들어, 결실된 아데노바이러스 벡터의 E1a 또는 E3 영역 내로 삽입됨). EBV 벡터는 또한 AAV cap 및 rep 유전자를 발현하는데 사용될 수 있다. 이 방법의 하나의 이점은, EBV 벡터가 에피솜이지만 연속 세포 분열 전반에 걸쳐 높은 카피수를 유지할 것이라는 점이다 (즉, "EBV 기반 핵 에피솜"으로 지정되는 염색체외 요소로서 세포 내로 안정하게 통합됨, 문헌 [Margolski, (1992) Curr. Top. Microbiol. Immun. 158:67] 참조).
추가의 대안으로서, rep/cap 서열은 세포 내로 안정하게 혼입될 수 있다.
전형적으로 AAV rep/cap 서열은 이들 서열의 구제 및/또는 패키징을 방지하기 위해 TR에 플랭킹되지 않을 것이다.
AAV 주형은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 세포에 제공될 수 있다. 예를 들어, 주형은 비-바이러스 (예를 들어, 플라스미드) 또는 바이러스 벡터에 의해 공급될 수 있다. 특정한 실시양태에서, AAV 주형은 헤르페스바이러스 또는 아데노바이러스 벡터에 의해 공급된다 (예를 들어, 결실된 아데노바이러스의 E1a 또는 E3 영역 내로 삽입됨). 또 다른 예시로서, 문헌 [Palombo et al., (1998) J. Virology 72:5025]은 AAV TR에 플랭킹된 리포터 유전자를 운반하는 바큘로바이러스 벡터를 기재한다. EBV 벡터는 또한 rep/cap 유전자와 관련하여 상기 기재된 바와 같이 주형을 전달하는데 사용될 수 있다.
또 다른 대표적 실시양태에서, AAV 주형은 복제 rAAV 바이러스에 의해 제공된다. 또 다른 실시양태에서, AAV 주형을 포함하는 AAV 프로바이러스는 세포의 염색체 내로 안정하게 통합된다.
바이러스 역가를 증진시키기 위해, 생산성 AAV 감염을 촉진하는 헬퍼 바이러스 기능 (예를 들어, 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스)이 세포에게 제공될 수 있다. AAV 복제를 위해 필요한 헬퍼 바이러스 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 이들 서열은 헬퍼 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 벡터에 의해 제공될 것이다. 대안적으로, 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 서열은 또 다른 비-바이러스 또는 바이러스 벡터에 의해, 예를 들어 문헌 [Ferrari et al., (1997) Nature Med. 3:1295], 및 미국 특허 번호 6,040,183 및 6,093,570에 기재된 바와 같이 효율적인 AAV 생산을 촉진하는 모든 헬퍼 유전자를 운반하는 비-감염성 아데노바이러스 미니플라스미드로서 제공될 수 있다.
추가로, 헬퍼 바이러스 기능은 염색체에 삽입되어 있거나 또는 안정한 염색체외 요소로서 유지되는 헬퍼 서열을 갖는 패키징 세포에 의해 제공될 수 있다. 일반적으로, 헬퍼 바이러스 서열은 AAV 비리온 내로 패키징될 수 없고, 예를 들어 ITR에 플랭킹되지 않는다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 단일 헬퍼 구축물 상에 AAV 복제 및 캡시드 서열 및 헬퍼 바이러스 서열 (예를 들어, 아데노바이러스 서열)을 제공하는 것이 유리할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이 헬퍼 구축물은 비-바이러스 또는 바이러스 구축물일 수 있다. 하나의 비제한적 예시로서, 헬퍼 구축물은 AAV rep/cap 유전자를 포함하는 하이브리드 아데노바이러스 또는 하이브리드 헤르페스바이러스일 수 있다.
하나의 특정한 실시양태에서, AAV rep/cap 서열 및 아데노바이러스 헬퍼 서열은 단일 아데노바이러스 헬퍼 벡터에 의해 공급된다. 이 벡터는 추가로 AAV 주형을 포함할 수 있다. AAV rep/cap 서열 및/또는 AAV 주형은 아데노바이러스의 결실된 영역 (예를 들어, E1a 또는 E3 영역) 내로 삽입될 수 있다.
추가 실시양태에서, AAV rep/cap 서열 및 아데노바이러스 헬퍼 서열은 단일 아데노바이러스 헬퍼 벡터에 의해 공급된다. 이러한 실시양태에 따르면, AAV 주형은 플라스미드 주형으로서 제공될 수 있다.
또 다른 예시적인 실시양태에서, AAV rep/cap 서열 및 아데노바이러스 헬퍼 서열은 단일 아데노바이러스 헬퍼 벡터에 의해 제공되고, AAV 주형은 프로바이러스로서 세포 내로 통합된다. 대안적으로, AAV 주형은 염색체외 요소로서 세포 내에서 유지되는 EBV 벡터에 의해 제공된다 (예를 들어, EBV 기반 핵 에피솜으로서).
추가의 예시적인 실시양태에서, AAV rep/cap 서열 및 아데노바이러스 헬퍼 서열은 단일 아데노바이러스 헬퍼에 의해 제공된다. AAV 주형은 개별 복제 바이러스 벡터로서 제공될 수 있다. 예를 들어, AAV 주형은 AAV 입자 또는 제2 재조합 아데노바이러스 입자에 의해 제공될 수 있다.
상기 방법에 따르면, 하이브리드 아데노바이러스 벡터는 전형적으로 아데노바이러스 복제 및 패키징에 충분한 아데노바이러스 5' 및 3' 시스 서열 (즉, 아데노바이러스 말단 반복부 및 PAC 서열)을 포함한다. AAV rep/cap 서열 및 존재하는 경우에 AAV 주형은 이들 서열이 아데노바이러스 캡시드 내로 패키징될 수 있도록 아데노바이러스 백본에 삽입되고 5' 및 3' 시스 서열에 플랭킹된다. 상기 기재된 바와 같이, 아데노바이러스 헬퍼 서열 및 AAV rep/cap 서열은 일반적으로, 이들 서열이 AAV 비리온 내로 패키징되지 않도록 ITR에 플랭킹되지 않는다.
문헌 [Zhang et al., ((2001) Gene Ther. 18:704-12)]은 아데노바이러스 및 AAV rep 및 cap 유전자 둘 다를 포함하는 키메라 헬퍼를 기재한다.
헤르페스바이러스는 또한 AAV 패키징 방법에서 헬퍼 바이러스로서 사용될 수 있다. AAV Rep 단백질(들)을 코딩하는 하이브리드 헤르페스바이러스는 유리하게는 규모조정가능한 AAV 벡터 생산 방식을 용이하게 할 수 있다. AAV-2 rep 및 cap 유전자를 발현하는 하이브리드 단순 포진 바이러스 유형 I (HSV-1) 벡터가 기재되었다 (Conway et al., (1999) Gene Ther. 6:986 및 WO 00/17377).
추가의 대안으로서, 본 발명의 바이러스 벡터는 예를 들어 문헌 [Urabe et al., (2002) Human Gene Ther. 13:1935-43]에 기재된 바와 같이 rep/cap 유전자 및 AAV 주형을 전달하기 위해 바큘로바이러스 벡터를 사용하여 곤충 세포에서 생산될 수 있다.
오염 헬퍼 바이러스가 없는 AAV 벡터 스톡은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, AAV 및 헬퍼 바이러스는 크기에 기초하여 용이하게 구별될 수 있다. AAV는 또한 헤파린 기질에 대한 친화도에 기초하여 헬퍼 바이러스로부터 분리될 수 있다 (Zolotukhin et al. (1999) Gene Therapy 6:973). 결실된 복제-결함 헬퍼 바이러스는 임의의 오염 헬퍼 바이러스가 복제 적격이 아니도록 사용될 수 있다. 추가의 대안으로서, 단지 아데노바이러스 초기 유전자 발현만이 AAV의 패키징을 매개하는데 요구되기 때문에, 후기 유전자 발현이 결여된 아데노바이러스 헬퍼가 사용될 수 있다. 후기 유전자 발현에 결함이 있는 아데노바이러스 돌연변이체는 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, ts100K 및 ts149 아데노바이러스 돌연변이체).
CLN1 벡터를 사용하는 방법
본 발명은 또한, 예를 들어 시험관내, 생체외 또는 생체내 치료 또는 연구 목적으로, PPT1의 생산을 증가시키기 위해 CLN1 ORF를 세포 또는 대상체에게 전달하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 세포를 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트 및/또는 벡터와 접촉시켜, 세포에서 PPT1 폴리펩티드 또는 CLN1 오픈 리딩 프레임을 발현시키는 것을 포함하는, 세포에서 PPT1 폴리펩티드 또는 CLN1 오픈 리딩 프레임을 발현시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 세포는 시험관내 세포, 생체외 세포 또는 생체내 세포이다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상체에게 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 벡터, 및/또는 형질전환된 세포를 전달하여, 대상체에서 PPT1 폴리펩티드 또는 CLN1 오픈 리딩 프레임을 발현시키는 것을 포함하는, 대상체에서 PPT1 폴리펩티드 또는 CLN1 오픈 리딩 프레임을 발현시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 신경 세로이드 리포푸신증 또는 이상 CLN1 유전자 발현과 연관된 다른 장애의 동물 모델이다.
본 발명의 추가 측면은 CLN1 유전자의 이상 발현 또는 CLN1 유전자 생성물의 이상 활성과 연관된 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 벡터, 및/또는 형질전환된 세포를 전달하여, 대상체에서 CLN1 유전자의 이상 발현과 연관된 장애를 치료하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 CLN1 유전자의 이상 발현 또는 CLN1 유전자 생성물의 이상 활성과 연관된 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, CLN1 유전자의 발현과 연관된 장애는 후기-영아, 소아, 또는 성인-발병 신경 세로이드 리포푸신증을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 영아 신경 세로이드 리포푸신증 또는 신경 세로이드 리포푸신증의 후기 발병 형태이다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 벡터, 및/또는 형질전환된 세포는 대상체의 신경계에, 예를 들어 대상체의 신경계에 직접 전달된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 벡터, 및/또는 형질전환된 세포는 척수강내, 뇌내, 뇌실내, 비강내, 이내, 안내 또는 안구주위 전달, 또는 그의 임의의 조합에 의해 전달된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트, 벡터, 및/또는 형질전환된 세포는 정맥내로 전달된다. 또 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트 및/또는 벡터는 주사, 전기천공, 유전자 총, 초음파천공, 마그네토펙션, 유체역학 전달 또는 다른 물리적 또는 화학적 방법에 의해 전달된다.
본 발명에 따른 재조합 바이러스 벡터는 수의학적 및 의학적 적용 둘 다에서의 용도가 발견되었다. 적합한 대상체는 조류 및 포유동물 둘 다를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "조류"는 닭, 오리, 거위, 메추라기, 칠면조, 꿩, 앵무새, 사랑앵무새를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 용어 "포유동물"은 인간, 영장류 비-인간 영장류 (예를 들어, 원숭이 및 개코원숭이), 소, 양, 염소, 돼지, 말, 고양이, 개, 토끼, 설치류 (예를 들어, 래트, 마우스, 햄스터, 등) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 인간 대상체는 신생아, 유아, 소아 및 성인을 포함한다. 임의로, 대상체는, 예를 들어 대상체가 본원에 기재된 것을 포함한 장애 또는 본원에 기재된 것을 포함한 폴리뉴클레오티드의 전달로부터 이익을 얻을 장애를 갖거나 이에 대한 위험이 있는 것으로 여겨지기 때문에 본 발명의 방법"을 필요로 한다". 추가의 옵션으로서, 대상체는 실험 동물 및/또는 질환의 동물 모델일 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이를 필요로 하는 대상체의 삶에서 가능한 한 조기에, 예를 들어 대상체가 이상 CLN1 발현 및/또는 이상 PPT1 활성을 갖는 것으로 진단되자마자 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 신생아 스크리닝으로 이상 CLN1 발현 및/또는 이상 PPT1 활성이 확인된 후, 폴리뉴클레오티드는 신생아 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 출생전 스크리닝으로 이상 CLN1 발현 및/또는 이상 PPT1 활성이 확인된 후, 폴리뉴클레오티드는 자궁내 태아에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 대상체에서 이상 CLN1 발현 및/또는 이상 PPT1 활성과 연관된 증상이 발생하자마자 또는 이상 CLN1 발현 및/또는 이상 PPT1 활성을 갖는 것으로서 의심되거나 진단되자마자 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 대상체에서 이상 CLN1 발현 및/또는 이상 PPT1 활성과 연관된 증상이 발생하기 전에 대상체에게, 예를 들어 이상 CLN1 발현 및/또는 이상 PPT1 활성을 갖는 것으로서 의심되거나 진단되지만, 증상 출현이 시작되지 않은 대상체에게 투여된다.
특정한 실시양태에서, 본 발명은 제약상 허용되는 담체 중의 본 발명의 바이러스 벡터, 및 임의로 다른 의약 작용제, 제약 작용제, 안정화제, 완충제, 담체, 아주반트, 희석제 등을 포함하는 제약 조성물 또는 제약 제제를 제공한다. 주사의 경우, 담체는 전형적으로 액체일 것이다. 다른 투여 방법의 경우, 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 흡입 투여의 경우, 담체는 호흡가능할 것이며, 바람직하게는 고체 또는 액체 미립자 형태일 것이다.
"제약상 허용되는"은 독성이거나 또는 달리 바람직하지 않은 것이 아닌 물질을 의미하며, 즉 물질은 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하지 않으면서 대상체에게 투여될 수 있다.
본 발명의 한 측면은 시험관내에서 세포에 PPT1 폴리펩티드 또는 CLN1 ORF를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 전달하는 방법이다. 바이러스 벡터는 특정한 표적 세포에 적절한 표준 형질도입 방법에 따라 적절한 감염 다중도로 세포에 도입될 수 있다. 투여하기 위한 바이러스 벡터 또는 캡시드의 역가는 표적 세포 유형 및 수, 및 특정한 바이러스 벡터 또는 캡시드에 따라 달라질 수 있고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 과도한 실험 없이 결정될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 적어도 약 103 감염 단위, 보다 바람직하게는 적어도 약 105 감염 단위가 세포에 도입된다.
벡터 (예를 들어, 바이러스 또는 비-바이러스 벡터)가 도입될 수 있는 세포(들)는 신경 세포 (말초 및 중추 신경계의 세포, 특히 뇌 세포, 예컨대 뉴런, 핍지교세포, 신경교 세포, 성상세포 포함), 폐 세포, 눈의 세포 (망막 세포, 망막 색소 상피 및 각막 세포 포함), 상피 세포 (예를 들어, 장 및 호흡기 상피 세포), 골격근 세포 (근모세포, 근관 및 근섬유 포함), 횡경막 근육 세포, 수지상 세포, 췌장 세포 (도세포 포함), 간 세포, 위장관의 세포 (평활근 세포, 상피 세포 포함), 심장 세포 (심근세포 포함), 골 세포 (예를 들어, 골수 줄기 세포), 조혈 줄기 세포, 비장 세포, 각질세포, 섬유모세포, 내피 세포, 전립선 세포, 관절 세포 (예를 들어 연골, 메니스커스, 활막 및 골수 포함), 배세포 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 유형의 것일 수 있다. 대안적으로, 세포는 임의의 전구 세포일 수 있다. 추가의 대안으로서, 세포는 줄기 세포 (예를 들어, 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포)일 수 있다. 다른 추가의 대안으로서, 세포는 암 또는 종양 세포일 수 있다 (암 및 종양은 상기 기재됨). 더욱이, 세포는 상기 나타낸 바와 같이 임의의 기원 종으로부터의 것일 수 있다.
바이러스 또는 비-바이러스 벡터는 대상체에게 변형된 세포를 투여하려는 목적을 위해 시험관내에서 세포에 도입될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 세포가 대상체로부터 제거되고, 벡터가 그에 도입되고, 이어서 세포가 대상체 내로 다시 대체된다. 생체외에서 치료를 위해 대상체로부터 세포를 제거한 후에, 대상체 내로 다시 도입하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,399,346 참조). 대안적으로, 재조합 바이러스 벡터가 또 다른 대상체로부터의 세포 내로, 배양된 세포 내로, 또는 임의의 다른 적합한 공급원으로부터의 세포 내로 도입되고, 세포는 그를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
생체외 유전자 요법에 적합한 세포는 상기 기재된 바와 같다. 대상체에게 투여하기 위한 세포의 투여량은 대상체의 연령, 상태 및 종, 세포의 유형, 세포에 의해 발현될 핵산, 투여 방식 등에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 제약상 허용되는 담체 중 용량당 적어도 약 102 내지 약 108 또는 약 103 내지 약 106개의 세포가 투여될 것이다. 특정한 실시양태에서, 바이러스 벡터로 형질도입된 세포가 유효량으로 제약 담체와 조합되어 대상체에게 투여된다.
본 발명의 추가 측면은 대상체에게 본 발명의 바이러스 벡터를 투여하는 방법이다. 특정한 실시양태에서, 방법은 동물 대상체에게 유효량의 본 발명에 따른 바이러스 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 동물 대상체에게 PPT1 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 CLN1 ORF를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 전달하는 방법을 포함한다. 본 발명의 바이러스 벡터를 그를 필요로 하는 인간 대상체 또는 동물에게 투여하는 것은 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의할 수 있다. 임의로, 바이러스 벡터는 제약상 허용되는 담체 중에서 유효 용량으로 전달된다.
대상체에게 투여될 바이러스 벡터의 투여량은 투여 방식, 치료될 질환 또는 상태, 개별 대상체의 상태, 특정한 바이러스 벡터, 및 전달될 핵산에 좌우될 것이고, 상용 방식으로 결정될 수 있다. 치료 효과를 달성하기 위한 예시적인 용량은 적어도 약 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 103, 1014, 1015, 1016, 1017, 또는 1018개 형질도입 단위 또는 그 초과, 예를 들어, 약 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 또는 1016개 형질도입 단위, 예를 들어, 약 1012 내지 약 1014개 형질도입 단위의 바이러스 역가이다.
특정한 실시양태에서, 1회 초과의 투여 (예를 들어, 2, 3, 4회 또는 그 초과의 투여)가 다양한 간격의 기간, 예를 들어 매시간, 매일, 매주, 매월, 매년 등에 걸쳐 목적하는 수준의 유전자 발현을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 각각의 투여는 동일하거나 상이한 경로에 의할 수 있고, 예를 들어, 상이한 경로에 의한 1시간 이격된 2회의 투여일 수 있다.
예시적인 투여 방식은 경구, 직장, 경점막, 국소, 비강내, 흡입 (예를 들어, 에어로졸을 통함), 협측 (예를 들어, 설하), 질, 척수강내, 안내, 경피, 자궁내 (또는 난자내), 비경구 (예를 들어, 정맥내, 피하, 피내, 근육내 [골격, 횡경막 및/또는 심장 근육에의 투여 포함], 피내, 흉막내, 뇌내, 및 관절내), 국소 (예를 들어, 기도 표면을 포함한 피부 및 점막 표면 둘 다에, 및 경피 투여), 림프내 등, 뿐만 아니라 직접적 조직 또는 기관 주사 (예를 들어, 간, 골격근, 심근, 횡경막근 또는 뇌에)를 포함한다. 또한 종양 (예를 들어, 종양 또는 림프절 내 또는 근처)에 투여될 수 있다. 임의의 주어진 경우에서 가장 적합한 경로는 치료될 상태의 성질 및 중증도 및 사용될 특정한 벡터의 성질에 좌우될 것이다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 CNS, 말초 신경계 또는 둘 다에 투여된다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 CNS, 예를 들어 뇌 또는 척수에 직접 투여된다. 직접 투여는 CNS 세포의 형질도입의 높은 특이성을 발생시킬 수 있으며, 예를 들어 여기서 형집도입된 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 초과가 CNS 세포이다. 벡터를 CNS에 직접 투여하기 위한 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 벡터는 척수, 뇌간 (연수, 교뇌), 중뇌 (시상하부, 시상, 시상상부, 뇌하수체, 흑색질, 송과선), 소뇌, 종뇌 (선조체, 후두엽, 측두엽, 두정엽 및 전두엽을 포함한 대뇌, 피질, 기저 신경절, 해마 및 편도체), 변연계, 신피질, 선조체, 대뇌 및 하구 내로 도입될 수 있다. 벡터는 또한 눈의 상이한 영역, 예컨대 망막, 각막 또는 시신경에 투여될 수 있다. 벡터는 벡터의 보다 더 분산되는 투여를 위해 뇌척수액 내로 (예를 들어, 요추 천자에 의해) 전달될 수 있다.
전달 벡터는 척수강내, 뇌내, 뇌실내, 비강내, 이내, 안내 (예를 들어, 유리체내, 망막하, 전방) 및 안구주위 (예를 들어, 테논낭하 영역) 전달, 또는 그의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 임의의 경로에 의해 CNS의 목적 영역(들)에 투여될 수 있다.
전달 벡터는 CNS, 말초 신경계 및/또는 다른 조직을 포함한 조직의 보다 광범위한, 미만성 형질도입을 발생시키는 방식으로 투여될 수 있다.
전형적으로, 바이러스 벡터는 액체 제제로 직접 주사 (예를 들어, 정위 주사)에 의해 CNS 및/또는 다른 조직 내의 목적 영역 또는 구획에 투여될 것이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 저장소 및/또는 펌프를 통해 전달될 수 있다. 다른 실시양태에서, 벡터는 목적 영역에의 국소 적용에 의해 또는 에어로졸 제제의 비강내 투여에 의해 제공될 수 있다. 눈 또는 귀로의 투여는 액체 액적의 국소 적용에 의한 것일 수 있다. 추가의 대안으로서, 벡터는 고체, 느린-방출 제제로서 투여될 수 있다. 파르보바이러스 및 AAV 벡터의 제어 방출은 국제 특허 공개 WO 01/91803에 기재되어 있다.
주사제는 액체 용액 또는 현탁액, 주사 전 액체 중의 용해 또는 현탁에 적합한 고체 형태, 또는 에멀젼으로서 통상적인 형태로 제조될 수 있다. 대안적으로, 바이러스 벡터를 전신 방식보다는 국부로, 예를 들어 데포 또는 지속-방출 제제로 투여할 수 있다. 추가로, 바이러스 벡터는 외과적으로 이식가능한 매트릭스, 예컨대 골 이식 대체물, 봉합사, 스텐트 등 (예를 들어, 미국 특허 7,201,898에 기재된 바와 같음)에 건조되어 전달될 수 있다.
용어 "제약 조성물"은 정제, 코팅된 정제, 분말, 재구성을 위한 분말, 펠릿, 비드, 미니-정제, 다층 정제, 이중층 정제, 정제-내-정제, 환제, 마이크로-펠릿, 소형 정제 유닛, MUPS (다중 유닛 펠릿 시스템), 붕해 정제, 분산성 정제, 과립, 마이크로구체, 다중미립자, 캡슐 (분말, 재구성을 위한 분말, 펠릿, 비드, 미니-정제, 환제, 마이크로-펠릿, 소형 정제 유닛, MUPS, 경구 붕해 MUPS, 붕해 정제, 분산성 정제, 과립, 스프링클, 마이크로구체 및 다중미립자로 채워짐), 사쉐 (분말, 재구성을 위한 분말, 펠릿, 비드, 미니-정제, 환제, 마이크로-펠릿, 소형 정제 유닛, MUPS, 붕해 정제, 분산성 정제, 변형 방출 정제 또는 캡슐, 발포성 과립, 과립, 스프링클, 마이크로구체 및 다중미립자로 채워짐) 또는 스프링클을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 투여 형태를 지칭한다. 경구 투여에 적합한 제약 조성물은 각각 미리 결정된 양의 본 발명의 조성물을 함유하는 이산 단위, 예컨대 캡슐, 카쉐, 로젠지 또는 정제; 분말 또는 과립으로서; 수성 또는 비-수성 액체 중의 용액 또는 현탁액으로서; 또는 수중유 또는 유중수 에멀젼으로서 제공될 수 있다. 경구 전달은 동물의 장에서 소화 효소에 의한 분해를 견딜 수 있는 담체에 본 발명의 바이러스 벡터를 복합체화함으로써 수행될 수 있다. 이러한 담체의 예는 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 플라스틱 캡슐 또는 정제를 포함한다. 이러한 제제는 조성물 및 적합한 담체 (이는 상기 기재된 바와 같은 1종 이상의 보조 성분을 함유할 수 있음)를 회합시키는 단계를 포함하는, 임의의 적합한 제약 방법에 의해 제조된다. 일반적으로, 본 발명의 실시양태에 따른 제약 조성물은 조성물을 액체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 다와 균일하게 및 친밀하게 혼합하고, 이어서 필요하다면 생성된 혼합물을 성형하여 제조된다. 예를 들어, 정제는 조성물을 임의로 1종 이상의 보조 성분과 함께 함유하는 분말 또는 과립을 압축 또는 성형하여 제조될 수 있다. 압축 정제는 적합한 기계에서, 임의로 결합제, 윤활제, 불활성 희석제 및/또는 표면활성제/분산제(들)와 혼합된 자유-유동 형태, 예컨대 분말 또는 과립의 조성물을 압축하여 제조된다. 성형된 정제는 적합한 기계에서 불활성 액체 결합제로 습윤화된 분말화 화합물을 성형하여 제조된다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 치료 유효량의 활성 제약 성분을 함유하는 혼합물 또는 용액을 지칭하는 제약 제제를 포함한다. 활성 제약 성분은 화학 물질, 폴리펩티드, 뉴클레오티드, 항체 또는 지질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
협측 (설하) 투여에 적합한 제약 조성물은 향미 기재, 통상적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트에 본 발명의 조성물을 포함하는 로젠지; 및 불활성 기재, 예컨대 젤라틴 및 글리세린 또는 수크로스 및 아카시아에 조성물을 포함하는 파스틸을 포함한다.
비경구 투여에 적합한 제약 조성물은 본 발명의 조성물의 멸균 수성 및 비-수성 주사 용액을 포함할 수 있으며, 이 제제는 임의로 의도되는 수용자의 혈액과 등장성이다. 이들 제제는 조성물이 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되게 하는 항산화제, 완충제, 정박테리아제 및 용질을 함유할 수 있다. 수성 및 비-수성 멸균 현탁액, 용액 및 에멀젼은 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트이다. 수성 담체는 염수 및 완충 매질을 포함한, 물, 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화 링거, 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제 (예컨대 링거 덱스트로스를 기재로 하는 것) 등을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제, 예컨대, 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제 및 불활성 기체 등이 또한 제공될 수 있다.
조성물은 단위/용량 또는 다중-용량 용기에, 예를 들어 밀봉된 앰플 및 바이알에 제공될 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어 염수 또는 주사용수의 첨가만이 요구되는 동결-건조 (동결건조) 상태로 저장될 수 있다.
즉석 주사 용액 및 현탁액은 이전에 기재된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 밀봉된 용기에 단위 투여 형태의 본 발명의 주사가능한 안정한 멸균 조성물이 제공될 수 있다. 조성물은 대상체 내로의 주사에 적합한 액체 조성물을 형성하기 위해 적합한 제약상 허용되는 담체로 재구성될 수 있는 동결건조물 형태로 제공될 수 있다. 단위 투여 형태는 약 1 μg 내지 약 10 그램의 본 발명의 조성물일 수 있다. 조성물이 실질적으로 수불용성인 경우에, 생리학상 허용되는 충분한 양의 유화제가 수성 담체 중에서 조성물을 유화시키기에 충분한 양으로 포함될 수 있다. 하나의 이러한 유용한 유화제는 포스파티딜 콜린이다.
직장 투여에 적합한 제약 조성물은 단위 투여 좌제로서 제공될 수 있다. 이들은 조성물을 1종 이상의 통상적인 고체 담체, 예컨대 예를 들어 코코아 버터와 혼합한 다음에 생성된 혼합물을 성형하여 제조될 수 있다.
피부에의 국소 적용에 적합한 본 발명의 제약 조성물은 연고, 크림, 로션, 페이스트, 겔, 스프레이, 에어로졸 또는 오일 형태를 취할 수 있다. 사용될 수 있는 담체는 석유 젤리, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 알콜, 경피 증진제 및 그의 2종 이상의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 국소 전달은 본 발명의 제약 조성물을 피부 통과가 가능한 친지성 시약 (예를 들어, DMSO)과 혼합하여 수행될 수 있다.
경피 투여에 적합한 제약 조성물은 장기간 동안 대상체의 표피와 친밀한 접촉을 유지하는데 적합화된 별개의 패치 형태일 수 있다. 경피 투여에 적합한 조성물은 또한 이온영동에 의해 전달될 수 있고 (예를 들어, 문헌 [Pharm. Res. 3:318 (1986)] 참조), 전형적으로 본 발명의 조성물의 임의로 완충된 수용액 형태를 취한다. 적합한 제제는 시트레이트 또는 비스/트리스 완충제 (pH 6) 또는 에탄올/물을 포함할 수 있고, 0.1 내지 0.2M 활성 성분을 함유할 수 있다.
본원에 개시된 바이러스 벡터는 임의의 적합한 수단에 의해, 예를 들어 대상체가 흡입하는 바이러스 벡터로 구성된 호흡가능한 입자의 에어로졸 현탁액을 투여함으로써 대상체의 폐에 투여될 수 있다. 호흡가능한 입자는 액체 또는 고체일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 바이러스 벡터를 포함하는 액체 입자의 에어로졸은 임의의 적합한 수단에 의해, 예컨대 압력-구동 에어로졸 네뷸라이저 또는 초음파 네뷸라이저에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,501,729를 참조한다. 바이러스 벡터를 포함하는 고체 입자의 에어로졸은 마찬가지로 제약 기술분야에 공지된 기술에 의해 임의의 고체 미립자 의약 에어로졸 발생기를 사용하여 생산될 수 있다.
기재된 본 발명을 고려하여, 이들은 하기 실시예에서 보다 상세하게 설명될 것이나, 이는 단지 예시 목적을 위해 본원에 포함되는 것이며, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1
최적화된 CLN1을 포함하는 AAV 벡터
CLN1 ORF를 발현시키기 위해 AAV 벡터 게놈 카세트를 개발하였다. 이러한 카세트는 다중 AAV 캡시드 내에 패키징될 자기-상보적 AAV 게놈으로부터 최대 발현을 제공하기 위해 설계되었다. 카세트는 하기 순서: 돌연변이체 AAV2 ITR, CMV 인핸서, 닭 베타 액틴 프로모터, 하이브리드/변형된 MVM 인트론, 코돈 최적화된 인간 CLN1 ORF, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 부위, 및 야생형 (WT) AAV2 ITR (도 1)로 이루어졌다. 발현 카세트로 HEK293 세포를 형질감염시켜 CLN1의 발현을 확인하고, 발현된 단백질을 웨스턴 블롯에 의해 세포 및 배지에서 검출하였다.
CLN1 발현 카세트를 AAV9 캡시드 내에 패키징하고, 생성된 벡터를 사용하여 CLN1 녹아웃 마우스에 척수강내로, 정맥내로, 또는 대수조 주사에 의해 투여하였다. 척수강내 주사를 위해 야생형 AAV9 캡시드를 사용하였고, 정맥내 주사를 위해 간-탈표적화된 AAV9 캡시드 (AAV9.47)를 사용하였다. AAV9 벡터를 7x1010, 2.2x1011, 또는 7x1011개 벡터 게놈의 용량으로 척수강내로 투여하거나, 또는 출생 시 2.8x1011개 벡터 게놈의 용량으로 정맥내로 투여하였다. AAV9.47 벡터는 1x1012개 벡터 게놈의 용량으로 투여하였다. 벡터는 출생 시, 7-10일, 4주, 20주, 또는 26주에 투여하였다. 결과를 모든 코호트에 대해 도 2에 제시하고, 상이한 코호트에 대해 도 3-6에 제시한다.
이들 연구는 7 x 1010개 vg의 scAAV9/CLN1을 척수강내로 투여한 경우에, 마우스의 수명이 8개월에서 16개월로 배가되었음을 보여주었다. 또한 벡터는 정맥내로 투여한 경우에 치료적인 것으로 확인되었다.
도 7a는 scAAV9/CLN1 요법이 투여된 마우스에서의 혈청 PPT1 수준의 증가를 보여준다. 벡터를 야생형, 이종 및 CLN1 녹아웃 마우스에 7 x 1010 및 7 x 1011개 vg의 용량으로 4, 20, 및 26주령에 척수강내로 주사하였다. 투여 3개월 후 또는 인도적 종점에서 혈청 PPT1 수준을 측정하였다. 모든 시점 및 투여량에서 초생리학적 PPT1 수준이 관찰되었다. 도 7b는 7 x 1010 및 7 x 1011개 vg의 용량으로 상이한 연령에 scAAV9/CLN1이 투여된 마우스 군에 대한 생존 곡선을 보여준다. 생존율은 둘 다의 용량에서 보다 조기의 투여에 의해 증가되었다.
벡터 투여 후 행동의 개선을 검출하기 위해 처리된 마우스에 대해 행동 검정을 수행하였다.
운동 협응에 대한 시험에서, 마우스 (비처리된 이종, 비처리된 녹아웃, 상이한 연령에 저용량 (7 x 1010개 vg), 중간 용량 (2.2 x 1011개 vg), 또는 고용량 (7 x 1011개 vg)으로 처리된 녹아웃)를 초기 속도 3 rpm의 로타로드 상단에 두었다. 300초 시험 과정에 걸쳐 속도를 점진적으로 30 rpm까지 증가시켰다. 로드의 상단으로부터 떨어질 때까지의 지연시간을 측정하였다. 시험을 상이한 연령에 수행하였다. 결과를 도 8a (행동 시험이 <1년령에 시작됨) 및 도 8b (행동 시험이 >1년령에 시작됨)에 제시한다. AAV 벡터를 통한 CLN1 발현 카세트의 유전자 전달은 녹아웃 마우스에게 제시된 모든 용량 및 처리 연령에서 운동 기능의 일부 이익을 제공하였고, 보다 높은 용량으로의 보다 조기 개입이 최대의 이익을 제공하였다.
수영 능력 및 시각 기능 시험에서, 마우스 (비처리된 이종, 비처리된 녹아웃, 상이한 연령에 저용량 (7 x 1010개 vg), 중간 용량 (2.2 x 1011개 vg), 또는 고용량 (7 x 1011개 vg)으로 처리된 녹아웃)를 수많은 시각적 단서가 존재하는 방 안에 위치한 45 cm 깊이의 물이 채워진 122 cm 직경 풀로 이루어진 모리스 수중 미로 내에 두었다. 각각의 마우스가 2-3일에 걸쳐 1일 4회, 물의 표면 위로 연장된 패턴화된 실린더에 의해 단서표시된 탈출 플랫폼까지 수영하게 하였다. 각각의 시험의 경우에, 마우스를 풀 내의 4개의 가능한 위치 중 1개에 두고 (무작위 순서), 이어서 보이는 플랫폼을 발견하는데 60초를 제공하였다. 마우스가 플랫폼을 발견하면, 시험은 종료되고, 다음 시험을 시작하기 전에 동물이 플랫폼에서 10초 동안 머무르게 하였다. 플랫폼을 발견하지 못하면, 마우스를 플랫폼에 10초 동안 둔 다음, 다음 시험을 제공하였다. 시험은 상이한 연령에 수행하였다. 수영 속도 (도 9a-9b), 플랫폼까지의 시간 (도 10a-10b), 및 수영한 거리 (도 11a-11b)를 측정하였다. 처리된 녹아웃 마우스는 비처리된 대조군 녹아웃 마우스보다 이들 과제를 더 잘 수행하였고, 보다 높은 용량으로의 보다 조기 개입이 최대의 이익을 제공하였다.
그립 강도에 대한 시험에서, 마우스 (비처리된 이종, 비처리된 녹아웃, 상이한 연령에 저용량 (7 x 1010개 vg), 중간 용량 (2.2 x 1011개 vg), 또는 고용량 (7 x 1011개 vg)으로 처리된 녹아웃)를 대형 금속 케이지 덮개 위에 두었다. 덮개를 서서히 흔들어 마우스가 금속 그리드를 그립하도록 유도하였다. 이어서 케이지 상단을 뒤집고, 마우스에 대해 덮개로부터 떨어질 때까지의 지연시간을 기록하였다. 최대 시험 길이는 60초였다. 또한 그립 스코어를 측정하였고, 여기서 -6 = 마우스가 즉시 또는 15초 내에 떨어짐 (마우스가 덮개 위에 초기에 불안정하게 놓임으로 인해 떨어진 경우에는 제2 시험을 제공함); -4 = 마우스가 앞발 또는 뒷발에 의한 서투른 그립 능력을 나타내거나, 발로 와이어를 놓치거나, 와이어 상에서 매우 불안정함 (통상적으로 30초 내에 떨어짐); -2 = 마우스가 발이 아닌 주로 다리로 와이어를 그립함, 불량한 회전 능력, 와이어 상에서 매우 동요함; 및 0 = 마우스가 앞다리 및 뒷다리 둘 다에 의한 정상의, 잘-협응된 그립을 나타냄, 양호한 회전 능력. 시험을 상이한 연령에 수행하였다. 떨어질 때까지의 시간 (도 12a-12b), 및 협응 스코어 (도 13a-13b)를 측정하였다. 처리된 녹아웃 마우스는 비처리된 대조군 녹아웃 마우스보다 이들 과제를 더 잘 수행하였고, 보다 높은 용량으로의 보다 조기 개입이 최대의 이익을 제공하였다.
신생아에서 scAAV9/CLN1 요법의 효과를 시험하였다. 신생아 시에 이종 및 CLN1 녹아웃 마우스에게 벡터 (2.8 x 1011개 vg)를 정맥내로 투여하였다. 생존 (도 14a), 혈청 PPT1 수준 (도 14b), 가속화된 로타로드 수행 (도 14c), 떨어질 때까지의 시간 (도 14d), 협응 스코어 (도 14e), 수영 속도 (도 14f), 플랫폼까지의 시간 (도 14g), 및 수영한 거리 (도 14h)를 상이한 연령에 측정하였다. 이들 시험의 결과는 연장된 생존을 포함한 평가된 모든 분야에서 비처리된 대조군 녹아웃 마우스와 비교하여 처리된 녹아웃 마우스의 유의하게 더 우수한 기능을 보여준다. 결과는 혈청 PPT1 효소 활성의 초생리학적 수준의 장기간 발현에도 불구하고, 평가된 임의의 척도에 의하면 처리된 이형접합 마우스에 대해 어떠한 유해한 효과도 나타내지 않는다.
상기는 본 발명의 예시이며, 그를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
청구범위에서 용어 "또는"의 사용은 단지 대안만을 지칭하는 것으로 명백하게 표시되거나 또는 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용되지만, 본 개시내용은 단지 대안만을 지칭하는 정의 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 지지한다.
본 발명은 하기 청구범위에 의해 정의되며, 청구범위의 등가물은 그에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> The University of North Carolina at Chapel Hill Gray, Steven <120> OPTIMIZED CLN1 GENES AND EXPRESSION CASSETTES AND THEIR USE <130> 5470-788WO <150> US 62/349,411 <151> 2016-06-13 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 924 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Human codon-optimized CLN1 open reading frame <400> 1 atggcttctc cggggtgtct gtggctgctg gcagtggcac tccttccctg gacttgcgcc 60 agccgggctc tgcagcacct cgaccctcca gcccctcttc cactggtgat ttggcacgga 120 atgggtgatt cctgctgtaa tcccctgtca atgggagcca tcaagaagat ggtggagaag 180 aagatccctg gaatctacgt gctgtcactg gagattggaa agaccctgat ggaggacgtc 240 gagaactcct tcttcctcaa tgtcaactct caagtgacca ccgtctgcca ggccctggcc 300 aaggacccga agctgcagca ggggtataat gctatggggt tcagccaggg aggacagttc 360 cttcgggctg tggcccaacg ctgccctagc ccacccatga tcaacctgat ctcagtgggt 420 ggccagcatc agggcgtgtt cggacttccc cggtgtcccg gggaatcctc tcatatctgc 480 gacttcatcc gcaaaactct caatgcaggc gcttattcaa aggtcgtcca agagaggctg 540 gtgcaagccg agtactggca cgatcccatt aaggaggacg tgtacagaaa tcactcaatc 600 tttctggccg acattaacca ggagagggga attaacgaat catataagaa gaatctcatg 660 gccctcaaaa agttcgtcat ggtgaagttc cttaacgata gcattgtgga cccagtggac 720 agcgaatggt tcggatttta ccgctcaggc caggcaaaag aaaccatccc tctccaagag 780 acttctcttt acacccaaga cagacttggg cttaaggaaa tggataacgc tggtcagctg 840 gtgttcctcg ccaccgaagg tgaccatctg cagctcagcg aagagtggtt ctacgctcat 900 atcatcccgt ttcttggttg ataa 924 <210> 2 <211> 306 <212> DNA <213> Chicken beta-actin promoter <400> 2 tacgtattag tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc 60 cccatctccc ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt 120 gcagcgatgg gggcgggggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag 180 gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga 240 aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg 300 cgggcg 306 <210> 3 <211> 137 <212> DNA <213> Chicken beta-actin exon 1 and intron 1 <400> 3 ggagtcgctg cgacgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct cgcgccgccc 60 gccccggctc tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc 120 tccgggctgt aattagc 137 <210> 4 <211> 256 <212> DNA <213> Cytomegalovirus enhancer <400> 4 tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac 60 gtcaatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 120 aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 180 caatgacggt aaatggcccg cctggcattg tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 240 tacttggcag tacatc 256 <210> 5 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Hybrid/modified MVM intron <400> 5 aagaggtaag ggtttaaggg atggttggtt ggtggggtat taatgtttaa ttacctggag 60 cacctgcctg aaatcacttt ttttcaggtt gg 92 <210> 6 <211> 254 <212> DNA <213> Bovine growth hormone polyadenylation signal <400> 6 ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt 60 gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 120 ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga 180 ggattgggaa gacaacagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg cttctgaggc 240 ggaaagaacc agct 254 <210> 7 <211> 2302 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CLN1 expression cassette <400> 7 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggggtt cggtacccgt 120 tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac 180 gtcaatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 240 aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 300 caatgacggt aaatggcccg cctggcattg tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 360 tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac 420 gttctgcttc actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat 480 tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg 540 ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca 600 gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa 660 aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgacgctg ccttcgcccc gtgccccgct 720 ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga 780 gcgggcggga cggcccttct cctccgggct gtaattagct gagcaagagg taagggttta 840 agggatggtt ggttggtggg gtattaatgt ttaattacct ggagcacctg cctgaaatca 900 ctttttttca ggttggaccg gtcgccacca tggcttctcc ggggtgtctg tggctgctgg 960 cagtggcact ccttccctgg acttgcgcca gccgggctct gcagcacctc gaccctccag 1020 cccctcttcc actggtgatt tggcacggaa tgggtgattc ctgctgtaat cccctgtcaa 1080 tgggagccat caagaagatg gtggagaaga agatccctgg aatctacgtg ctgtcactgg 1140 agattggaaa gaccctgatg gaggacgtcg agaactcctt cttcctcaat gtcaactctc 1200 aagtgaccac cgtctgccag gccctggcca aggacccgaa gctgcagcag gggtataatg 1260 ctatggggtt cagccaggga ggacagttcc ttcgggctgt ggcccaacgc tgccctagcc 1320 cacccatgat caacctgatc tcagtgggtg gccagcatca gggcgtgttc ggacttcccc 1380 ggtgtcccgg ggaatcctct catatctgcg acttcatccg caaaactctc aatgcaggcg 1440 cttattcaaa ggtcgtccaa gagaggctgg tgcaagccga gtactggcac gatcccatta 1500 aggaggacgt gtacagaaat cactcaatct ttctggccga cattaaccag gagaggggaa 1560 ttaacgaatc atataagaag aatctcatgg ccctcaaaaa gttcgtcatg gtgaagttcc 1620 ttaacgatag cattgtggac ccagtggaca gcgaatggtt cggattttac cgctcaggcc 1680 aggcaaaaga aaccatccct ctccaagaga cttctcttta cacccaagac agacttgggc 1740 ttaaggaaat ggataacgct ggtcagctgg tgttcctcgc caccgaaggt gaccatctgc 1800 agctcagcga agagtggttc tacgctcata tcatcccgtt tcttggttga taagcggccg 1860 cggggatccc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt 1920 gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat 1980 tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag 2040 caagggggag gattgggaag acaacagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc 2100 ttctgaggcg gaaagaacca gctttggacg cgtaggaacc cctagtgatg gagttggcca 2160 ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc 2220 cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagctggcgt aatagcgaag 2280 aggcccgcac cgatcgccct tc 2302

Claims (44)

  1. 인간 CLN1 오픈 리딩 프레임을 포함하는 폴리뉴클레오티드이며, 상기 인간 CLN1 오픈 리딩 프레임은 서열식별번호: 1의 서열 또는 그의 상보체를 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트.
  3. 제2항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된 것인 발현 카세트.
  4. 제2항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 발현 카세트.
  5. 제4항에 있어서, 프로모터가 닭 베타 액틴 프로모터인 발현 카세트.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 인핸서에 작동가능하게 연결된 것인 발현 카세트.
  7. 제6항에 있어서, 인핸서가 시토메갈로바이러스 인핸서인 발현 카세트.
  8. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 인트론에 작동가능하게 연결된 것인 발현 카세트.
  9. 제8항에 있어서, 인트론이 하이브리드/변형된 MVM 인트론인 발현 카세트.
  10. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 폴리아데닐화 신호에 작동가능하게 연결된 것인 발현 카세트.
  11. 제10항에 있어서, 폴리아데닐화 신호가 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호인 발현 카세트.
  12. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1개의 아데노-연관 바이러스(AAV) 역전된 말단 반복부(ITR)를 추가로 포함하는 발현 카세트.
  13. 제12항에 있어서, 2개의 AAV ITR을 포함하는 발현 카세트.
  14. 제13항에 있어서, 2개의 AAV ITR이 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 발현 카세트.
  15. 제13항에 있어서, 2개의 AAV ITR이 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 발현 카세트.
  16. 제12항에 있어서, AAV ITR이 AAV2 ITR인 발현 카세트.
  17. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 자기-상보적 AAV 게놈인 발현 카세트.
  18. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 인핸서, 프로모터, 인트론, 인간 CLN1 오픈 리딩 프레임, 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 발현 카세트.
  19. 제18항에 있어서, AAV ITR, 인핸서, 프로모터, 인트론, 인간 CLN1 오픈 리딩 프레임, 폴리아데닐화 부위, 및 AAV ITR을 포함하는 발현 카세트.
  20. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, CMV 인핸서, 닭 베타 액틴 프로모터, 하이브리드/변형된 MVM 인트론, 인간 CLN1 오픈 리딩 프레임, 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 부위를 포함하는 발현 카세트.
  21. 제20항에 있어서, 돌연변이체 AAV ITR, CMV 인핸서, 닭 베타 액틴 프로모터, 하이브리드/변형된 MVM 인트론, 인간 CLN1 오픈 리딩 프레임, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 부위, 및 야생형 AAV ITR을 포함하는 발현 카세트.
  22. 제21항에 있어서, 서열식별번호: 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트.
  23. 제1항의 폴리뉴클레오티드 또는 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는 벡터.
  24. 제23항에 있어서, 바이러스 벡터인 벡터.
  25. 제24항에 있어서, AAV 벡터인 벡터.
  26. 제25항에 있어서, AAV 벡터가 AAV9 벡터인 벡터.
  27. 제26항에 있어서, AAV 벡터가 야생형 캡시드 단백질을 포함하는 것인 벡터.
  28. 제26항에 있어서, AAV 벡터가 야생형 캡시드 단백질과 비교하여 변경된 향성을 갖는 변형된 캡시드 단백질을 포함하는 것인 벡터.
  29. 제28항에 있어서, 변형된 캡시드 단백질이 간-탈표적화된 것인 벡터.
  30. 제1항의 폴리뉴클레오티드;
    제2항 내지 제5항 중 어느 한 항의 발현 카세트; 및/또는
    제1항의 폴리뉴클레오티드 또는 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는 벡터
    를 포함하는 생체외 형질전환된 세포.
  31. 제30항에 있어서, 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트 및/또는 벡터가 세포 게놈 내로 안정하게 혼입된 것인 생체외 형질전환된 세포.
  32. 생체외 세포를
    제1항의 폴리뉴클레오티드;
    제2항 내지 제5항 중 어느 한 항의 발현 카세트; 및/또는
    제1항의 폴리뉴클레오티드 또는 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는 벡터
    와 접촉시켜, 상기 세포에서 CLN1 오픈 리딩 프레임을 발현시키는 것을 포함하는, 생체외 세포에서 CLN1 오픈 리딩 프레임을 발현시키는 방법.
  33. 제1항의 폴리뉴클레오티드;
    제2항 내지 제5항 중 어느 한 항의 발현 카세트;
    제1항의 폴리뉴클레오티드 또는 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는 벡터; 및/또는
    제1항의 폴리뉴클레오티드, 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항의 발현 카세트, 및/또는 제1항의 폴리뉴클레오티드 또는 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는 벡터를 포함하는 생체외 형질전환된 세포
    를 포함하는, CLN1 유전자의 이상 발현 또는 CLN1 유전자 생성물의 이상 활성과 연관된 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 CLN1 유전자의 이상 발현 또는 CLN1 유전자 생성물의 이상 활성과 연관된 장애를 치료하기 위한 것이며,
    상기 CLN1 유전자의 발현과 연관된 장애는 영아, 후기-영아, 소아, 또는 성인-발병 신경 세로이드 리포푸신증인 제약 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 대상체의 신경계에 전달되는 제약 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 척수강내, 뇌내, 뇌실내, 비강내, 이내, 안내, 또는 안구주위 전달, 또는 그의 임의의 조합에 의해 전달되는 제약 조성물.
  36. 제33항에 있어서, 정맥내로 전달되는 제약 조성물.
  37. 3'에서 5' 순서로, 제1 AAV2 역전된 말단 반복부(ITR), 시토메갈로바이러스 인핸서, 닭 베타 액틴 프로모터, 하이브리드/변형된 MVM 인트론, 서열식별번호: 1의 서열을 포함하는 인간 CLN1 오픈 리딩 프레임, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 부위, 및 제2 AAV2 ITR을 포함하는 AAV9 벡터.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7287611B2 (ja) 2018-02-07 2023-06-06 学校法人日本医科大学 改良型アデノ随伴ウイルスベクター
US20210269829A1 (en) * 2018-06-28 2021-09-02 The University Of North Carolina At Chapel Hill Optimized cln5 genes and expression cassettes and their use
AU2020245415A1 (en) * 2019-03-22 2021-09-16 Rush University Medical Center Combination of nasal gene delivery and oral cinnamic acid, oleamide or gemfibrozil for lysosomal stoarge disorders
BR112021021632A8 (pt) * 2019-04-29 2022-06-28 Univ North Carolina Chapel Hill Terapia de gene de combinação intratecal e intravenosa para o tratamento da doença de batten infantil
US20210139933A1 (en) * 2019-11-08 2021-05-13 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Recombinant adeno-associated viral vector for gene delivery
IL293141A (en) * 2019-11-21 2022-07-01 Remedium Bio Inc growth factor recovery
WO2021133871A2 (en) * 2019-12-24 2021-07-01 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Method for identifying regulatory elements
US20230285595A1 (en) * 2020-07-23 2023-09-14 The University Of North Carolina At Chapel Hill Optimized slc13a5 genes and expression cassettes and their use

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014166836A1 (en) 2013-04-05 2014-10-16 Novo Nordisk A/S Growth hormone compound formulation

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4501729A (en) 1982-12-13 1985-02-26 Research Corporation Aerosolized amiloride treatment of retained pulmonary secretions
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US6093570A (en) 1995-06-07 2000-07-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Helper virus-free AAV production
US6040183A (en) 1995-06-07 2000-03-21 University Of North Carloina At Chapel Hill Helper virus-free AAV production
AU4645697A (en) 1996-09-11 1998-04-02 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Aav4 vector and uses thereof
US6156303A (en) 1997-06-11 2000-12-05 University Of Washington Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom
JP4060531B2 (ja) 1998-05-28 2008-03-12 アメリカ合衆国 Ａａｖ５ベクターおよびその使用
EP1115880A2 (en) 1998-09-22 2001-07-18 University of Florida Methods for large-scale production of recombinant aav vectors
JP4573437B2 (ja) 1998-11-05 2010-11-04 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア アデノ随伴ウイルス血清型１核酸配列、ベクターおよび同一物を含有する宿主細胞
CA2348382C (en) 1998-11-10 2013-09-17 The University Of North Carolina At Chapel Hill Chimeric parvovirus vectors and methods of making and administering the same
WO2001036603A2 (en) 1999-11-17 2001-05-25 Avigen, Inc. Recombinant adeno-associated virus virions for the treatment of lysosomal disorders
DE60139471D1 (de) 2000-06-01 2009-09-17 Univ North Carolina Verfahren und zusammensetzungen zur kontrollierter abgabe von rekombinant parvovirus vektoren
ES2256265T3 (es) * 2000-06-01 2006-07-16 University Of North Carolina At Chapel Hill Vectores de parvovirus duplicados.
US20030083299A1 (en) 2000-11-04 2003-05-01 Ferguson Ian A. Non-invasive delivery of polypeptides through the blood-brain barrier
GB0302330D0 (en) * 2003-02-01 2003-03-05 Ml Lab Plc Improved expression elements
ES2562490T3 (es) 2003-05-01 2016-03-04 Genzyme Corporation Terapia génica para trastornos neurometabólicos
US7405274B2 (en) * 2003-06-04 2008-07-29 Fibrogen, Inc. Connective tissue growth factor antibodies
US7442372B2 (en) 2003-08-29 2008-10-28 Biomarin Pharmaceutical Inc. Delivery of therapeutic compounds to the brain and other tissues
ES2648241T3 (es) 2003-09-30 2017-12-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Clados de virus adenoasociados (AAV), secuencias, vectores que contienen el mismo, y usos de los mismos
SI1678194T1 (sl) * 2003-10-10 2014-02-28 Alchemia Oncology Pty Limited Modulacija sinteze hialuronana in degradacija pri zdravljenju bolezni
ES2525067T3 (es) 2005-04-07 2014-12-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Método de incremento de la función de un vector de AAV
EP2019143A1 (en) 2007-07-23 2009-01-28 Genethon CNS gene delivery using peripheral administration of AAV vectors
EP2058401A1 (en) 2007-10-05 2009-05-13 Genethon Widespread gene delivery to motor neurons using peripheral injection of AAV vectors
US8242086B2 (en) 2008-11-12 2012-08-14 Duke University Methods and compositions for treating disorders caused by a deficiency in a gene product of a CLN gene
WO2011159157A1 (en) * 2010-06-15 2011-12-22 Cellagenics B.V. Novel intergenic elements for enhancing gene expression
CN104797593B (zh) 2012-09-28 2020-05-08 北卡罗来纳-查佩尔山大学 靶向少突胶质细胞的aav载体
WO2014089449A1 (en) 2012-12-07 2014-06-12 Rush University Nedical Center Composition and method for treating neuronal ceroid lipofuscinosis
WO2015060722A1 (en) * 2013-10-24 2015-04-30 Uniqure Ip B.V. Aav-5 pseudotyped vector for gene therapy for neurological diseases
RU2727015C2 (ru) 2014-11-21 2020-07-17 Дзе Юниверсити Оф Норт Каролина Эт Чепел Хилл Векторы aav, нацеленные на центральную нервную систему

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014166836A1 (en) 2013-04-05 2014-10-16 Novo Nordisk A/S Growth hormone compound formulation

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Neurobiology of Disease (2004) Vol.6, pp360 - 369. 1부.*

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