JP2022506066A - 最適化されたｆｉｇ４遺伝子および発現カセットならびにそれらの使用 - Google Patents

最適化されたｆｉｇ４遺伝子および発現カセットならびにそれらの使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、最適化されたＦＩＧ４オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列を含んでいるポリヌクレオチド、それを含むベクター、ならびに、細胞または対象へのＯＲＦの送達のため、および、対象におけるＦＩＧ４遺伝子の異常な発現またはＦＩＧ４遺伝子産物の異常な活性と関連する障害、例えばＣＭＴ４Ｊを治療するための、その使用方法に関する。【選択図】 図１

Description

［優先権の陳述］
本出願は、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）の下で、２０１８年１１月５日に出願された米国仮出願番号６２／７５５，８７１の利益を主張し、その内容全体は参照により本明細書中に援用される。
［配列リストの電子出願に関する陳述］
連邦規則法典第３７巻１．８２１条の下で提出されたＡＳＣＩＩテキスト形式の配列リストであって、２０１９年１１月５日に作成されてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された、４４，３０５バイトのサイズの５４７０－８５４ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと題されたものは、紙のコピーの代わりに提供される。この配列リストは、その開示に関して参照により本明細書中に援用される。
［本発明の分野］
本発明は、最適化されたＦＩＧ４オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列を含んでいるポリヌクレオチド、それを含むベクター、ならびに、細胞または対象へのＯＲＦの送達のため、および、対象におけるＦＩＧ４遺伝子の異常な発現またはＦＩＧ４遺伝子産物の異常な活性と関連する障害、例えばＣＭＴ４Ｊを治療するための、その使用方法に関する。
Ｆａｃｔｏｒ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｇｅｎｅ ４（ＦＩＧ４）は、ホスファチジルイノシトール３，５－ビスホスフェート５－ホスファターゼ、ＳＡＣドメイン含有タンパク質３（Ｓａｃ３）、またはＦＩＧ４としても知られる、ポリホスホイノシチドホスファターゼをコードしている。ＦＩＧ４の突然変異は、稀な常染色体劣性疾患シャルコー・マリー・トゥース病ニューロパチー・タイプ４Ｊ（ＣＭＴ４Ｊ）（不器用な歩きぶり、肢の弱さ、および筋萎縮の幼時発症によって特徴付けられる末梢神経障害の１つのタイプ）を引き起こす［Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．２００７ Ｎａｔｕｒｅ ４４８：６８－７２］。ＣＭＴ４Ｊの存在および重症度は変化し得て、患者は通常、ＦＩＧ４において二対立遺伝子の複合ヘテロ接合突然変異を示し、ここで一方の対立遺伝子はヌル突然変異体であり、他方の対立遺伝子は部分的機能ミスセンス突然変異である。Ｙｕｎｉｓ－Ｖａｒｏｎ症候群は、ＣＭＴ４Ｊの特に病原性の変異であり、通常、ニ対立遺伝子の病原性の突然変異に起因し、ＦＩＧ４機能の完全な欠失をもたらす。
ＦＩＧ４は、ミエリン形成細胞、特にシュワン細胞、および後根神経節感覚ニューロンにおいて高く発現される［Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．２０１２ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．７１（１）：２８－２９］。シュワン細胞は、末梢神経のミエリン形成を維持する。ＦＩＧ４が枯渇したＣＭＴ４Ｊ患者において観察される、感覚および運動の末梢神経軸索の一貫した脱髄が存在する。［Ｈｕ ｅｔ ａｌ．２０１８ Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．８３：７５６－７７０］。脱髄は不均一であり、患者の神経伝導試験における、遅い伝導速度、時間的分散、運動神経応答の同期不全の兆候、伝導遮断、および、脊髄根におけるマクロファージ浸潤としばしば関連する。その発見は、脱髄性多発性神経障害の進行を示唆する。マウスおよびＣＭＴ４Ｊ患者における運動および感覚ニューロンの両方とも、異なる程度に影響を受ける。ＣＭＴ４Ｊを有するヒトは、主に虚弱および筋萎縮を経験するが、感覚の症候は経験しないか最小限である［Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．２０１２；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００８ Ｂｒａｉｎ １３１（８）：１９９０－２００１］。
ＣＭＴ障害では、ホスホイノシチドのシグナリングおよび小胞輸送が、主要な役割を果たすことが報告されている［Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ ２００７；Ｖａｃｃａｒｉ ｅｔ ａｌ．２０１１ ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．７：ｅ１００２３１９；ＭｃＣａｒｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．２０１４ ＢｉｏＥｓｓａｙｓ ３６：５２－６４］。重要なことに、ＦＩＧ４は、２つの他のタンパク質パートナーＶａｃ１４およびＦＡＢ１との複合体においてのみ機能性であり、この複合体は、ホスファチジルイノシトール３，５－ビスホスフェート（ＰＩ（３，５）Ｐ２）の生合成を調節する［Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．２００８ ＥＭＢＯ Ｊ．２７：３２２１－３２３４；Ｉｋｏｎｏｍｏｖ ｅｔ ａｌ．２００９ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４（３６）：２３９６１－２３９７１］。一般に見られるＣＭＴ４ＪにおけるＩ４１Ｔミスセンス突然変異は、Ｖａｃ１４とのタンパク質界面に位置し、その不安定化およびプロテアソームが介在する分解へと導く［Ｌｅｎｋ ｅｔ ａｌ．２０１１ ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．７：３１００２１０４］（図１）。ＦＩＧ４の欠失は、ＰＩ（３，５）Ｐ２レベルの低下をもたらす［Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ ２００７；Ｋａｔｏｎａ ｅｔ ａｌ．２０１１ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３３（８）：１４０１－１４１０］。ＰＩ３，５Ｐ２レベルは小胞輸送に重要であり、Ｆｉｇ４－／－マウスはレベルが低減し［１１］、過剰なリソソーム貯蔵として現れる［Ｋａｔｏｎａ ｅｔ ａｌ．２０１１］。ＰＩ（３，５）Ｐ２は、リソソーム膜においてＣａ＋＋チャネルに関するゲート・キーパーとして働く［Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１０ Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１：３８］。Ｆｉｇ４－／－細胞では、Ｃａ＋＋チャネルの脱活性化は、リソソーム分裂を損ない、軸索のミエリン形成を行なうシュワン細胞を含む［Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．２０１５ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３５：６８０１－６８１２］。
欧州の患者における最近の研究は、ヒトと、酵母、回虫（線虫）、ショウジョウバエ、ニワトリ、マウス、ラット、イヌ、マカク、オラウータンおよびチンパンジーのような多様な種との間で、高度に、または非常に高度に保存されているＦＩＧ４内の５アミノ酸残基が存在したことを示している。［ＭｃＣａｒｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．２０１４ ＢｉｏＥｓｓａｙｓ ３６：５２－６４］。これらのアミノ酸残基においてＦＩＧ４突然変異を有する患者は、主に上位運動ニューロンが不足しており、場合によっては、迅速な進行および下位運動ニューロンの影響があった。
ＣＭＴ４Ｊのための現行の治療は徴候的な緩和ケアに制限されており、疾患の原因を標的化する効果的な治療に関する必要が当該分野に残っている。本発明は、ＦＩＧ４発現と関連する障害、例えばＣＭＴ４Ｊを治療するために治療的レベルのＦＩＧ４発現を提供することが可能なコドン最適化ＦＩＧ４遺伝子、発現カセット、およびベクターを提供することにより、当該分野における欠点を克服する。
本発明は、ＦＩＧ４発現と関連する障害、例えばＣＭＴ４Ｊを治療するために治療的レベルのＦＩＧ４発現を提供することが可能な、最適化されたＦＩＧ４遺伝子、発現カセット、およびベクターの開発に部分的に基づく。
したがって、本発明の一態様は、ヒトＦＩＧ４オープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドに関し、ここでヒトＦＩＧ４オープンリーディングフレームは、ヒト細胞における発現に関してコドン最適化されている。
本発明のさらなる態様は、ヒトＦＩＧ４オープンリーディングフレームを含んでいるポリヌクレオチドを含む発現カセット、ならびに、本発明のポリヌクレオチドを含んでいるベクター、形質転換された細胞、およびトランスジェニック動物に関する。
本発明の別態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を、薬学的に許容できる担体内に含む、医薬製剤に関する。
本発明のさらなる一態様は、細胞においてＦＩＧ４オープンリーディングフレームを発現させる方法に関し、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクターと細胞を接触させるステップを含み、それにより、細胞においてＦＩＧ４オープンリーディングフレームを発現させる。
本発明のさらなる一態様は、細胞においてＦＩＧ４オープンリーディングフレームを発現させる方法に関し、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を対象に送達するステップを含み、それにより、細胞においてＦＩＧ４オープンリーディングフレームを発現させる。
本発明のさらなる一態様は、治療を必要とする対象における、ＦＩＧ４遺伝子の異常な発現またはＦＩＧ４遺伝子産物の異常な活性と関連する障害を治療する方法に関し、治療的に有効量の本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を、ＦＩＧ４オープンリーディングフレームが対象において発現されるように対象に投与するステップを含む。
本発明のさらなる一態様は、治療を必要とする対象における、シャルコー・マリー・トゥース病ニューロパチー・タイプ４Ｊを治療する方法に関し、治療的に有効量の本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を、ＦＩＧ４オープンリーディングフレームが対象において発現されるように対象に投与するステップを含む。
本発明の別態様は、治療を必要とする対象における、Ｙｕｎｉｓ－Ｖａｒｏｎ症候群を治療する方法に関し、治療的に有効量の本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を、ＦＩＧ４オープンリーディングフレームが対象において発現されるように対象に投与するステップを含む。
本発明のさらなる一態様は、治療を必要とする対象における、筋萎縮性側索硬化症を治療する方法に関し、治療的に有効量の本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を、ＦＩＧ４オープンリーディングフレームが対象において発現されるように対象に投与するステップを含む。
発明のさらなる一態様は、治療を必要とする対象における、小児発症の多発性硬化症を治療する方法に関し、治療的に有効量の本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を、ＦＩＧ４オープンリーディングフレームが対象において発現されるように対象に投与するステップを含む。
本発明の別態様は、治療を必要とする対象における、ＦＩＧ４遺伝子の異常な発現またはＦＩＧ４遺伝子産物の異常な活性と関連する障害を治療する方法での使用のための、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞に関する。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の本発明の説明においてより詳細に示される。
タンパク質パートナーＦＡＢ１およびＶＡＣ１４との相互作用におけるＦＩＧ４のＰＩ（３，５）Ｐ２生合成活性の説明を示し、一般に見られるＦＩＧ４ミスセンス突然変異Ｉ４１Ｔの位置を指す。 種間のＦＩＧ４タンパク質配列における類似性を示す。ヒト（ｈｏｍｏ）ＦＩＧ４タンパク質（配列番号７）と比較して、マウス（ｍｕｓ；９５．１５％；配列番号９）、ラット（ｒａｔｔｕｓ；９３．９４％；配列番号１０）およびサル（Ｍａｃａｃａ；９９．５６％；配列番号８）のホモロジーは、高レベルのアミノ酸同一性を維持している。アスタリスク（＊）は、完全に保存されたアミノ酸残基の注釈であり、コロン（：）は、類似性が強い残基の注釈であり、ピリオド（．）は、類似性の弱い残基の注釈である。保存されていないアミノ酸には注釈を付けない。 ＡＡＶ９／ＦＩＧ４療法後の、カプラン・マイヤー生存分析を示す。出生後１日目（ＰＮＤ１）または４日目（ＰＮＤ４）のマウスに、脳室内（ＩＣＶ）投与した（コホートあたりｎ＝１１）。出生後７日目（ＰＮＤ７）または１１日目（ＰＮＤ１１）のマウスに、髄腔内（ＩＴ）投与した（コホートあたりｎ≧５）。マウスを、罹患率または死亡率について毎日モニターした。データは生存（％）として提供される。 体重変化を示す。ＰＮＤ１または４のマウスにＩＣＶ投与し（コホートあたりｎ≧１１）、ＰＮＤ７または１１にＩＴ投与した（コホートあたりｎ＝９）。各コホートの平均体重（ＢＷ）を示す。 前腕および全ての肢の握力分析を示す。ＡＡＶ９／ＦＩＧ４療法は、Ｆｉｇ４－／－マウスにおいて筋力を改善させる。出生後１日目（ＰＮＤ１）または４日目（ＰＮＤ４）のマウスに、ＡＡＶ９－ＦＩＧ４をＩＣＶ投与した（コホートあたりｎ≧９）。上パネルは、２月齢のＰＮＤ１マウスにおいて評価された握力を示す。下パネルは、６月齢のＰＮＤ４注入マウスにおいて評価された握力を示す。体重に対して正規化された平均握力を示す。データは、平均±ＳＤとして提供される。マン・ホイットニーのｔ検定、ｎｓ ｐ＞０．０５、＊ｐ＜０．０５。 運動協調性分析を示す。運動協調性を、２月齢のＰＮＤ１注入マウス（上パネル）および６月齢のＰＮＤ４注入マウス（下パネル）において、ロータロッド試験により評価した（ｎ≧９あたりコホート）。グラフは、３つの試験にわたる、落ちるまでの平均潜時を示す。データは、平均±ＳＤとして提供される。マン・ホイットニーのｔ検定、ｎｓ ｐ＞０．０５。 全体的な活動分析を示す。全体的な活動を、３晩の自発かご走行によって試験した。２月齢のＰＮＤ１注入マウス（第１および第３のパネル）および６月齢のＰＮＤ４注入マウス（第２および第４のパネル）を記録した（コホートあたりｎ≧９）。移動した合計距離は、平均±ＳＤとして提供される。 神経伝導分析を示す。神経伝導速度を、６月齢のＰＮＤ１またはＰＮＤ４ ＩＣＶ注入マウスにおいて評価した（コホートあたりｎ≧８）。データは、平均±ｓｅｍとして提供される。マン・ホイットニーのｔ検定、ｎｓ ｐ＞０．０５、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 ＦＩＧ４タンパク質分析を示す。ＦＩＧ４（左パネル）、ＧＦＡＰ（中央パネル）およびｐ６２（右パネル）のタンパク質レベルを、ＰＮＤ１ ＩＣＶ注入マウスの全脳および脊髄に対するウエスタンブロットによって分析した（コホートあたりｎ≧３）。データは、未処置のＦｉｇ４＋／＋マウスと比較した、それぞれの群における相対的倍率変化（ＲＦＣ）の平均±ｓｅｍとして提供される。マン・ホイットニーのｔ検定、ｎｓ ｐ＞０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 ＡＡＶ９－ＦＩＧ４で処置されたＦｉｇ４－／－マウスにおける神経病理を示す。ＰＮＤ１ ＩＣＶ注入マウス由来の後根神経節（ＤＲＧ）、胸部脊髄および脳の切片をＨ／Ｅによって染色した。矢印は、細胞質内空胞の存在を示す。 ＦＩＧ４の神経組織学分析を示す。ＰＮＤ１ ＩＣＶ注入マウス由来の坐骨神経の半薄切片は、未処置に対してＦｉｇ４－／－処置のマウスにおいて、大きなサイズの軸索の頻度の有意な増大を示した。グラフは、それらの領域に対する軸索の平均頻度を提供する。写真は、分析した坐骨神経の代表的な半薄切片である。 ＡＡＶ９－ＦＩＧ４用量応答分析を示す。ＡＡＶ９－ＦＩＧ４は、Ｆｉｇ４－／－マウスを用量依存的な様式で救うことができる。ＰＮＤ７マウスに、無希釈のＡＡＶ９－ＦＩＧ４（１３０．５×１０１０ｖｇ）または１：５、１：１０および１：１００希釈をＩＴ（髄腔内）注入した。ＰＮＤ１に、ＡＡＶ９－ＦＩＧ４を１：１０希釈（５．４×１０１０ｖｇ）でＩＣＶ注入した。マウスを、罹患率または死亡率に関して毎日モニターした。上パネルのデータは、生存分析を提供する（コホートあたりｎ＞５）。下パネルにおいて、各コホートの平均体重が提供される。
本発明は、以下により詳細に説明される。この説明は、本発明が実施され得る全ての異なる方法または本発明に加えられ得る全ての特徴の詳細なカタログであることを意図しない。例えば、一実施態様に関して説明される特徴は、他の実施態様に組み込まれてよく、特定の実施態様に関して説明される特徴は、その実施態様から削除されてよい。さらに、本明細書において示唆される様々な実施態様に対する非常に多くのバリエーションおよび付加は、本開示に照らして当業者に明らかであり、本発明から逸脱しない。それ故に、以下の明細書は、本発明の一部の特定の実施態様を説明することを意図し、それらの全ての並べ替え、組み合わせ、およびバリエーションを網羅的に特定することを意図しない。
文脈が別段の指示をしない限り、本明細書に記載される本発明の様々な特徴は、任意の組み合わせで用いられ得ることが明確に意図される。さらに、本発明はまた、本発明の一部の実施態様では、本明細書中に示される任意の特徴または特徴の組み合わせが除外または省略され得ることも考えられる。例示すると、複合体は構成要素Ａ、ＢおよびＣを含むと明細書が記述している場合、Ａ、ＢまたはＣのいずれか、またはそれらの組み合わせが、単独または任意の組み合わせで省略および否定され得ることが明確に意図される。
別段の定義がされない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者の一人によって一般に理解されるのと同一の意味を持つ。本明細書において本発明の説明において用いられる専門用語は、特定の実施態様を説明する目的のためのみであり、本発明の制限を意図しない。
ヌクレオチド配列は、別段の明確な指示がない限り、本明細書において、一本鎖のみによって、５’から３’の方向で、左から右に示される。ヌクレオチドおよびアミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される様式で、または、（アミノ酸については）一文字コードまたは三文字コードのいずれかによって、どちらも３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２および確立された使用に従って表される。
別段の指示がある場合を除き、当業者に公知の標準的な方法が、組換えおよび合成ポリペプチド、抗体またはその抗原結合フラグメントの生産、核酸配列の操作、形質転換された細胞の生産、ｒＡＡＶ構築物、改変キャプシドタンパク質、ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列を発現するパッケージングベクター、および、一時的および安定的にトランスフェクトされたパッケージング細胞の構築のために用いられ得る。かかる技術は当業者に公知である。例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ２ｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）；Ｆ．Ｍ．ＡＵＳＵＢＥＬ ｅｔ ａｌ．ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照。
本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、ヌクレオチド配列、アミノ酸配列および他の参考文献は、参照によってそれらの全体で援用される。
定義
本発明の説明および添付の特許請求の範囲において用いられるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数形も含むことが意図される。
本明細書において用いられる「および／または」は、関係がある挙げられたアイテムの１つまたは複数の任意および全てのあり得る組み合わせ、ならびに、選択的に解釈される場合（「または」）は、組み合わせの欠失を指し、および包含する。
さらに、本発明は、本発明の一部の実施態様では、本明細書において示される任意の特徴または特徴の組み合わせが除外または省略され得ることも検討する。
さらに、本明細書において用いられる用語「約」は、本発明の化合物または薬剤の量、用量、時間、温度などの測定可能な値を指す場合、規定の量の±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または実に±０．１％の変動を包含することを意味する。
本明細書において用いられる移行句「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、列挙された材料またはステップ、および、特許請求の範囲に記載された発明の基礎的および新規の特徴（単数または複数）に実質的に影響を及ぼさないものを包含すると解釈されるべきである。したがって、本明細書において用いられる用語「から本質的になる」は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同等であると解釈されるべきでない。
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に加えられる用語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」（および文法上の変形）は、列挙された配列（例えば、配列番号）、および、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能が実質的に変更されないような、列挙された配列の５’および／または３’またはＮ末端および／またはＣ末端上または２つの末端の間（例えばドメイン間）の、合計で１０個以下（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のさらなるヌクレオチドまたはアミノ酸の、両方からなるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。合計で１０個以下のさらなるヌクレオチドまたはアミノ酸は、さらなるヌクレオチドまたはアミノ酸の合計数を合わせて含む。本発明のポリヌクレオチドに加えられる用語「実質的に変更される」は、列挙された配列からなるポリヌクレオチドの発現レベルと比較して少なくとも約５０％以上の、コードされるポリペプチドを発現する能力の増大または低減を指す。本発明のポリペプチドに加えられる用語「実質的に変更される」は、列挙された配列からなるポリペプチドの活性と比較して少なくとも約５０％以上の、生物学的活性の増大または低減を指す。
本明細書において用いられる用語「パルボウイルス」は、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅファミリーを包含し、自律複製するパルボウイルスおよびディペンドウイルスを含む。自律的パルボウイルスは、パルボウイルス、エリスロウイルス、デンソウイルス、イテラウイルス、および、コントラウイルス（Ｃｏｎｔｒａｖｉｒｕｓ）属のメンバーを含む。例示的な自律的パルボウイルスは、限定されないが、マウスの微小ウイルス、ウシのパルボウイルス、イヌのパルボウイルス、ニワトリのパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコのパルボウイルス、ガチョウのパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、バリケンのパルボウイルス、ヘビのパルボウイルス、およびＢ１９ウイルスを含む。他の自律的パルボウイルスは、当業者に公知である。例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。
ディペンドウイルス属は、制限されないが、ＡＡＶタイプ１、ＡＡＶタイプ２、ＡＡＶタイプ３（タイプ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶタイプ４、ＡＡＶタイプ５、ＡＡＶタイプ６、ＡＡＶタイプ７、ＡＡＶタイプ８、ＡＡＶタイプ９、ＡＡＶタイプ１０、ＡＡＶタイプ１１、ＡＡＶタイプ１２、ＡＡＶタイプ１３、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、ウマＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶを含む、アデノ付随ウイルス（ＡＡＶ）を含む。例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）；および表１を参照。
本発明の文脈における用語「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）は、制限されずに、ＡＡＶタイプ１、ＡＡＶタイプ２、ＡＡＶタイプ３（タイプ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶタイプ４、ＡＡＶタイプ５、ＡＡＶタイプ６、ＡＡＶタイプ７、ＡＡＶタイプ８、ＡＡＶタイプ９、ＡＡＶタイプ１０、ＡＡＶタイプ１１、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶ、ならびに、現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶを含む。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。複数のさらなるＡＡＶ血清型およびクレードが同定されており（例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１－６３８８および表１を参照）、それらも用語「ＡＡＶ」によって包含される。
本発明のパルボウイルス粒子およびゲノムは、限定されないが、ＡＡＶ由来であってよい。様々な血清型のＡＡＶおよび自律的パルボウイルスのゲノム配列、ならびに、ネイティブＩＴＲ、Ｒｅｐタンパク質、およびキャプシドサブユニットの配列は、当技術分野で知られている。かかる配列は、文献またはＧｅｎＢａｎｋのような公共データベースに見られ得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＮＣ＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１８６２、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＡＹ６３１９６６、ＡＸ７５３２５０、ＥＵ２８５５６２、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ＿００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２およびＡＹ５３０５７９を参照し；その開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶ核酸およびアミノ酸配列の教示のために本明細書中に参照により援用される。また、例えば、Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９３９；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１３０９；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４；Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌ．３３－：３７５－３８３；Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌ．３３０：３７５；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｖｉｒｏｌ．２２１：２０８；Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：３３８５；Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：３０９；Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：８９１１；Ｓｈａｄｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：５５５；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３９９４；国際特許公報ＷＯ００／２８０６１、ＷＯ９９／６１６０１、ＷＯ９８／１１２４４；および、米国特許第６，１５６，３０３号も参照し；その開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶ核酸およびアミノ酸配列の教示のために本明細書中に参照により援用される。表１も参照。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ３ ＩＴＲ配列の初期の説明は、Ｘｉａｏ，Ｘ．，（１９９６），「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ」Ｐｈ．Ｄ．学位論文、ピッツバーグ大学、ピッツバーグ、ペンシルバニア州によって提供される（その全体で本明細書中に援用される）。
「キメラ」ＡＡＶ核酸キャプシドコード配列またはＡＡＶキャプシドタンパク質は、２以上のキャプシド配列の部分を組み合わせたものである。「キメラ」ＡＡＶビリオンまたは粒子は、キメラＡＡＶキャプシドタンパク質を含む。
本明細書において用いられる用語「向性」は、特定の細胞または組織タイプ（単数または複数）へのウイルスの優先的侵入および／または特定の細胞または組織タイプへの侵入を促進する細胞表面との優先的相互作用を指し、任意選択で、および好ましくは、細胞においてウイルスゲノムによって保有される配列の発現（例えば、転写、および任意選択で、翻訳）、例えば、組み換えウイルスについては、異種ヌクレオチド配列（単数または複数）の発現が続く。当業者は、ウイルスゲノム由来の異種核酸配列の転写は、例えば、誘導性プロモーターまたは他の方法で調節される核酸配列に関するトランス作用因子が不存在では開始され得ないことを理解している。ｒＡＡＶゲノムの場合は、ウイルスゲノムからの遺伝子発現は、安定的に組み込まれたプロウイルス由来であってよく、および／または、組み込まれていないエピソーム、ならびに、ウイルス核酸が細胞内でとり得る任意の他の形態由来であってよい。
用語「向性プロファイル」は、１つまたは複数の標的細胞、組織および／または臓器の形質導入パターンを指す。キメラＡＡＶキャプシドの代表的な例は、末梢臓器の形質導入がほんの少しである中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞の効率的な形質導入によって特徴付けられる向性プロファイルを有する（例えば米国特許番号９，６３６，３７０（ＭｃＣｏｗｎら）、および米国特許公報２０１７／０３６０９６０（Ｇｒａｙら）を参照）。
本明細書において用いられる用語「ＦＩＧ４遺伝子の異常な発現と関連する障害」は、正常の対象または集団における発現レベルと比較した、対象におけるＦＩＧ４遺伝子の低減または変更された発現によって生じる疾患、障害、症候群、もしくは症状、またはその症候を指す。
本明細書において用いられる用語「ＦＩＧ４遺伝子産物の異常な活性と関連する障害」は、正常の対象または手段における活性と比較した、対象におけるＦＩＧ４遺伝子産物の低減または変更された活性によって生じる疾患、障害、症候群、もしくは症状、またはその症候を指す。
本明細書において用いられる、ウイルスベクター（例えばＡＡＶベクター）による細胞の「形質導入」は、細胞内へのベクターの侵入およびウイルスベクター内への核酸の取り込みによる細胞内への遺伝物質の移行およびウイルスベクターを介した細胞内へのその後の移行を意味する。
別段の指示がない限り、「効率的な形質導入」または「効率的な向性」または同様の用語は、適切なポジティブまたはネガティブコントロールに対する参照によって判定され得る（例えば、ポジティブコントロールの、それぞれ少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも多くの形質導入または向性、または、ネガティブコントロールの、それぞれ少なくとも約１１０％、１２０％、１５０％、２００％、３００％、５００％、１０００％またはそれよりも多くの形質導入または向性）。

Figure 2022506066000002
Figure 2022506066000003
同様に、適切なコントロールに対する参照によって、ウイルスが、標的組織に関して「効率的に形質導入しない」または「効率的な向性を有さない」（または同様の用語）か、判定することができる。特定の実施態様では、ウイルスベクターは、ＣＮＳ以外の組織、例えば、肝臓、腎臓、生殖腺および／または生殖細胞を効率的に形質導入しない（すなわち、効率的な向性を有さない）。特定の実施態様では、組織（単数または複数）の望ましくない形質導入（例えば、肝臓）は、望ましい標的組織（単数または複数）の形質導入（例えば、ＣＮＳ細胞）のレベルの、２０％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、０．１％以下である。
用語「５’部分」および「３’部分」は、２以上のエレメント間の空間的関係を定義するための相対的用語である。したがって、例えば、ポリヌクレオチドの「３’部分」は、別のセグメントの下流であるポリヌクレオチドのセグメントを示す。用語「３’部分」は、セグメントが必ずしもポリヌクレオチドの３’末端にあることを示すことを意図せず、または、必ずしもポリヌクレオチドの３’の半分にあることさえ意図しないが、そうであってよい。同様に、ポリヌクレオチドの「５’部分」は、別のセグメントの上流であるポリヌクレオチドのセグメントを示す。用語「５’部分」は、セグメントが必ずしもポリヌクレオチドの５’末端にあることを示すことを意図せず、または、必ずしもポリヌクレオチドの５’の半分にあることさえ意図しないが、そうであってよい。
本明細書において用いられる用語「ポリペプチド」は、別段の指示がない限り、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。
「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「ヌクレオチド配列」は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド配列（天然起源および非天然起源ヌクレオチドの両方を含む）であってよいが、好ましくは一本鎖または二本鎖ＤＮＡ配列のいずれかである。
本明細書において用いられる用語「オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）」は、ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、例えば遺伝子の部分を指す。
本明細書において用いられる用語「コドン最適化」は、コード配列（例えば、野生型配列、例えばＦＩＧ４に関するコード配列を含む）内に通常存在する１つまたは複数のコドンを、同一（同義）アミノ酸に関するコドンで置換することによって、発現を増大させるように最適化されている遺伝子コード配列を指す。この様式において、遺伝子によってコードされるタンパク質は同一であるが、根底となる遺伝子の核酸塩基配列または対応するｍＲＮＡは異なる。一部の実施態様では、最適化は、１つまたは複数のレアコドン（すなわち、特定の種由来の細胞において相対的に稀に生じるｔＲＮＡに関するコドン）を、翻訳の効率を改善するために、より頻繁に生じる同義コドンによって置換する。例えば、ヒトコドン最適化では、コード配列内の１つまたは複数のコドンは、同一アミノ酸に関してヒト細胞においてより頻繁に生じるコドンによって置換される。コドン最適化は、転写および／または翻訳の効率を改善し得る他のメカニズムを通して遺伝子発現を増大することもできる。ストラテジーは、制限されずに、合計ＧＣ含有量（すなわち、コード配列全体におけるグアニンおよびシトシンのパーセント）の増大、ＣｐＧ含有量（すなわち、コード配列におけるＣＧまたはＧＣジヌクレオチドの数）の低減、潜在的スプライスのドナーまたはアクセプター部位の除去、および／または、コザック配列のようなリボソームエントリー部位の付加または除去を含む。望ましくは、コドン最適化遺伝子は、改善されたタンパク質発現を示し、例えば、それによってコードされるタンパク質は、他の点で同様の細胞において野生型遺伝子によって提供されるタンパク質の発現レベルと比較して、細胞において、検出可能により大きなレベルで発現される。
本明細書において用いられる用語「配列同一性」は、当技術分野における標準的な意味を有する。当技術分野で知られているように、多くの異なるプログラムを用いて、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが公知配列と配列同一性または類似性を有するかどうか同定することができる。配列同一性または類似性は、制限されないが、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所配列同一性アルゴリズムを含む当技術分野で知られている標準的な技術を用いて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の配列同一性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピューター化された実行によって、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７（１９８４）により記載されるＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラム、好ましくはデフォルト設定を用いて、または調査によって、判定され得る。
有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブ・ペアワイズアライメントを用いて、関連のある配列のグループから多数の配列アライメントを作る。また、アライメントを作るために用いられるクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１（１９８７）のプログレッシブ・アライメント法の簡易化を用いて；その方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ５：１５１（１９８９）により記載される方法に似ている。
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）およびＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３（１９９３）に記載の、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２プログラムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：４６０（１９９６）；ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから取得されたものである。ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２は、いくつかの検索パラメーターを用いて、それらは好ましくは、デフォルト値に設定されている。パラメーターは、動的な値であり、特定の配列の構成、および、目的の配列が検索されている特定のデータベースの構成に応じて、プログラム自体によって確立されるが；感度を増大させるために値を調節してよい。
さらなる有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９（１９９７）により報告されるｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴである。
アミノ酸配列同一性の値のパーセンテージは、一致する同一残基の数を、並べられた領域内の「より長い」配列の残基の合計数で割って決定される。「より長い」配列は、並べられた領域内に最も現実の（ｍｏｓｔ ａｃｔｕａｌ）残基を有するものである（アライメントスコアを最大化するためにＷＵ－Ｂｌａｓｔ－２により導入されるギャップは無視する）。
同様の様式で、核酸配列同一性パーセントは、本明細書において具体的に開示されるポリヌクレオチド内のヌクレオチドと同一である候補配列内のヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。
アライメントは、並べられる配列内のギャップの導入を含んでよい。加えて、本明細書において具体的に開示されるポリヌクレオチドよりも多いまたは少ないヌクレオチドを含む配列に関して、一実施態様では、配列同一性のパーセンテージは、ヌクレオチドの合計数に対する、同一のヌクレオチドの数に基づいて決定されることが理解される。したがって、例えば、本明細書に具体的に開示される配列よりも短い配列の配列同一性は、一実施態様では、より短い配列におけるヌクレオチドの数を用いて決定される。同一性のパーセンテージの計算においては、相対的重みづけは、配列変動、例えば挿入、欠失、置換などの様々な出現に割り当てられない。
一実施態様では、同一性のみが正にスコアされて（＋１）、ギャップを含む全ての形態の配列変動は「０」の値に割り当てられて、配列類似性計算に関して以下に記載される重みづけスケールまたはパラメーターの必要性を取り除く。配列同一性パーセントは、例えば、一致する同一残基の数を、並べられた領域内の「より短い」配列の残基の合計数で割って、１００を掛けることにより、計算され得る。「より長い」配列は、並べられた領域内に最も現実の残基を有するものである。
本明細書において用いられる「単離された」核酸またはヌクレオチド配列（例えば、「単離されたＤＮＡ」または「単離されたＲＮＡ」）は、天然起源の生物またはウイルスの他の構成要素の少なくとも一部、例えば、細胞またはウイルスの構造的構成要素または核酸またはヌクレオチド配列と関連して一般に見られる他のポリペプチドまたは核酸から、分離されたまたは実質的にフリーの、核酸またはヌクレオチド配列を意味する。
同様に、「単離された」ポリペプチドは、天然起源の生物またはウイルスの他の構成要素の少なくとも一部、例えば、細胞またはウイルスの構造的構成要素またはポリペプチドと関連して一般に見られる他のポリペプチドまたは核酸から、分離されたまたは実質的にフリーの、ポリペプチドを意味する。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に加えられる、本明細書において用いられる用語「改変」は、１つまたは複数の欠失、付加、置換、またはそれらの任意の組み合わせに起因して、野生型配列とは異なる配列を指す。
本明細書において用いられる、ウイルスベクターを「単離する」（または文法上の同等物）によって、ウイルスベクターが、出発原料中の他の構成要素の少なくとも一部から少なくとも部分的に分離されることを意味する。
用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「の治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ）」（または文法上の同等の用語）によって、対象の状態の重症度を減少させる、または、少なくとも部分的に改善または改良すること、および／または、少なくとも１つの臨床症候の緩和、軽減または低減、および／または、症状の進行の遅延を意味する。
本明細書において用いられる用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｓ）」、または「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」（およびその文法上の同等物）は、疾患の発症を遅延または阻害することを意味する。その用語は、疾患の完全な消滅を必要とすることを意味せず、症状の発生率を減少させるため、または症状の発症を遅らせるための、任意のタイプの予防的治療を包含する。
本明細書において用いられる「治療効果的な」量は、対象に対して何らかの改善または利益を与えるのに十分な量である。別の言い方をすると、「治療効果的な」量は、対象における少なくとも１つの臨床症候の何らかの緩和、軽減、低減または安定化を提供する量である。当業者は、何らかの利益が対象に提供される限り治療的効果は完全または治癒的である必要はないことを理解している。
本明細書において用いられる「予防効果的な」量は、対象における疾患、障害および／または臨床症候の発症を予防および／または遅延させるのに十分な量、および／または、対象における疾患、障害および／または臨床症候の発症の重症度を、本発明の方法が存在しない場合に生じるであろうものと比較して減少および／または遅延させる量である。当業者は、何らかの利益が対象に提供される限り予防のレベルは完全である必要はないことを理解している。
ウイルスに関する、「異種ヌクレオチド配列」または「異種核酸」は、それぞれ、ウイルスにおいて天然起源でない配列または核酸である。一般に、異種核酸またはヌクレオチド配列は、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームおよび／または非翻訳ＲＮＡを含む。
本明細書において用いられる用語「ベクター」、「ウイルスベクター」、「送達ベクター」（および同様の用語）は、特定の実施態様では、一般に、核酸送達ビヒクルとして機能するウイルス粒子を指し、ビリオン内にパッケージされたウイルス核酸（すなわち、ベクターゲノム）を含む。本発明に係るウイルスベクターは、本発明に係るキメラＡＡＶキャプシドを含み、ＡＡＶまたはｒＡＡＶゲノムまたは任意の他の核酸（ウイルス核酸を含む）をパッケージすることができる。あるいは、一部のコンテキストにおいては、用語「ベクター」、「ウイルスベクター」、「送達ベクター」（および同様の用語）は、ビリオンが不存在のベクターゲノム（例えば、ｖＤＮＡ）、および／または、キャプシドにつながれた、またはキャプシド内にパッケージされた分子を送達するための輸送体として作用するウイルスキャプシドを指すために用いられ得る。
本発明のウイルスベクターはさらに、国際特許公報ＷＯ０１／９２５５１に記載される二重パルボウイルス粒子であってよい（その開示は参照によりその全体で本明細書中に援用される）。したがって、一部の実施態様では、二本鎖（二重）ゲノムがパッケージされ得る。
「組み換えＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」は、少なくとも１つの逆位末端配列（例えば、１つ、２つ、または３つの逆位末端配列）および１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含む、ＡＡＶゲノム（すなわち、ｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターは一般に、ウイルスを産生するためにシスで１４５塩基の末端反復（単数または複数）（ＴＲ（ｓ））を保持しているが、部分的または完全に合成の配列を含む改変ＡＡＶ ＴＲｓおよび非ＡＡＶ ＴＲｓも、この目的を果たし得る。全ての他のウイルス配列は必ずしも必要でなく、トランスで供給されてよい（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７）。ｒＡＡＶベクターは、２つのＴＲ（例えば、ＡＡＶ ＴＲｓ）を含んでもよく、それらは一般に、異種ヌクレオチド配列（単数または複数）の５’および３’末端にあるが、それに連続している必要はない。ＴＲｓは、互いに同一または異なってよい。ベクターゲノムは、単一のＩＴＲをその３’または５’末端に含んでもよい。
用語「末端反復」または「ＴＲ」は、ヘアピン構造を形成して逆位末端配列として機能する（すなわち、複製、ウイルスパッケージング、インテグレーションおよび／またはプロウイルス・レスキューなどの所望の機能を仲介する）、任意のウイルス末端反復または合成配列を含む。ＴＲは、ＡＡＶ ＴＲまたは非ＡＡＶ ＴＲ、例えば、他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＶＭ）、ヒトパルボウイルスＢ－１９）のもののような非ＡＡＶ ＴＲ配列、または、ＳＶ４０複製起源として作用するＳＶ４０ヘアピンを、ＴＲとして用いることができ、それは、トランケーション、置換、欠失、挿入および／または付加によってさらに改変されてよい。さらに、ＴＲは、部分的または完全に合成の、例えば、米国特許番号５，４７８，７４５（Ｓａｍｕｌｓｋｉら）に記載の「ダブル－Ｄ配列」であってよい。
パルボウイルスゲノムは、回文構造の配列をその５’および３’両末端に有する。配列の回文構造の性質は、相補塩基対の間の水素結合の形成によって安定化されるヘアピン構造の形成を生じさせる。このヘアピン構造は、「Ｙ」または「Ｔ」形状をとると考えられている。例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９＆７０章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。
「ＡＡＶ末端反復」または「ＡＡＶ ＴＲ」は、制限されないが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１、または、現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶを含む任意のＡＡＶ由来であってよい（例えば、表１を参照）。末端反復が、例えば、複製、ウイルスパッケージング、インテグレーション、および／またはプロウイルス・レスキューなどの所望の機能を仲介する限り、ＡＡＶ末端反復は、ネイティブの末端反復配列を有する必要はない（例えば、ネイティブのＡＡＶ ＴＲ配列は、挿入、欠失、トランケーションおよび／またはミスセンス突然変異によって変更されてよい）。
用語「ｒＡＡＶ粒子」および「ｒＡＡＶビリオン」は、本明細書において相互交換可能に用いられる。「ｒＡＡＶ粒子」または「ｒＡＡＶビリオン」は、ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたｒＡＡＶベクターゲノムを含む。
本発明のウイルスベクターはさらに、国際特許公報ＷＯ００／２８００４およびＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ２：６１９に記載される「標的化」ウイルスベクター（例えば、方向付けられた向性を有する）および／または「ハイブリッド」パルボウイルス（すなわち、ウイルスのＩＴＲｓおよびウイルスのキャプシドが異なるパルボウイルス由来である）であってよい。
さらに、ウイルスキャプシドまたはゲノムエレメントは、挿入、欠失および／または置換を含む他の改変を含んでよい。
本明細書において用いられる用語「アミノ酸」は、任意の天然起源アミノ酸、それらの改変された形態、および合成アミノ酸を包含し、非天然起源アミノ酸を含む。
天然起源、左旋性（Ｌ－）アミノ酸を表２に示す。
あるいは、アミノ酸は、改変されたアミノ酸残基（非限定的な例を表３に示す）であってよく、または、翻訳後修飾（例えば、アセチル化、アミド化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化または硫酸化）によって改変されたアミノ酸であってよい。
Figure 2022506066000004
Figure 2022506066000005
Figure 2022506066000006
さらに、非天然起源アミノ酸は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．３５：２２５－４９によって記載される「非天然」アミノ酸であってよい。これらの非天然アミノ酸は、目的分子をＡＡＶキャプシドタンパク質に化学的に連結させるために有利に用いることができる。
用語「テンプレート」または「基質」は、本明細書において、パルボウイルスのウイルスＤＮＡを生産するために複製され得るポリヌクレオチド配列を指すために用いられる。ベクター生産の目的のために、テンプレートは、典型的に、制限されないが、プラスミド、ネイキッドＤＮＡベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）またはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ＡＡＶ、バキュロウイルス、レトロウイルスベクターなど）を含む、より大きなヌクレオチド配列または構築物内に埋め込まれる。あるいは、テンプレートは、パッケージング細胞の染色体内に安定的に組み込まれ得る。
本明細書において用いられる、パルボウイルスまたはＡＡＶ「Ｒｅｐコード配列」は、ウイルス複製および新たなウイルス粒子の生産を仲介するパルボウイルスまたはＡＡＶの非構造的タンパク質をコードする核酸配列を示す。パルボウイルスおよびＡＡＶ複製遺伝子およびタンパク質は、例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９＆７０章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載されている。
「Ｒｅｐコード配列」は、パルボウイルスまたはＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の全てをコードする必要はない。例えば、ＡＡＶに関しては、Ｒｅｐコード配列は、４つのＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０）の全てをコードする必要はなく、実際に、ＡＡＶ５は、スプライスされたＲｅｐ６８およびＲｅｐ４０タンパク質のみを発現すると考えられている。代表的な実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、少なくとも、ウイルスゲノム複製および新たなビリオン中へのパッケージングに必要な、複製タンパク質をコードする。Ｒｅｐコード配列は、一般に、少なくとも１つの大きなＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８／６８）および１つの小さなＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ５２／４０）をコードする。特定の実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、ＡＡＶ Ｒｅｐ７８タンパク質およびＡＡＶ Ｒｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０タンパク質をコードする。他の実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０タンパク質をコードする。さらに、さらなる実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ５２タンパク質、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０タンパク質、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質、または、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ４０タンパク質をコードする。
本明細書において用いられる用語「大きなＲｅｐタンパク質」は、Ｒｅｐ６８および／またはＲｅｐ７８を指す。特許請求の範囲に記載される発明の大きなＲｅｐタンパク質は、野生型または合成のいずれかであってよい。野生型の大きなＲｅｐタンパク質は、制限されないが、血清型１、２、３ａ、３ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１３を含む任意のパルボウイルスまたはＡＡＶ、または、現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶ由来であってよい（例えば、表１を参照）。合成の大きなＲｅｐタンパク質は、挿入、欠失、トランケーションおよび／またはミスセンス突然変異によって変更され得る。
当業者は、複製タンパク質は同一のポリヌクレオチドによってコードされる必要はないことをさらに理解する。例えば、ＭＶＭに関しては、ＮＳ－１およびＮＳ－２タンパク質（スプライス変異体）は、互いに独立に発現され得る。同様に、ＡＡＶに関しては、ｐ１９プロモーターは不活化され得て、大きなＲｅｐタンパク質（単数または複数）は１つのポリヌクレオチドから発現され得て、小さなＲｅｐタンパク質（単数または複数）は異なるポリヌクレオチドから発現され得る。しかしながら典型的に、単一の構築物から複製タンパク質を発現することがより便利である。一部のシステムでは、ウイルスプロモーター（例えば、ＡＡＶ ｐ１９プロモーター）は、細胞によって認識されなくてよく、したがって、別個の発現カセットから大きなおよび小さなＲｅｐタンパク質を発現する必要がある。他の例では、大きなＲｅｐおよび小さなＲｅｐタンパク質を、別個に、すなわち、別個の転写および／または翻訳制御エレメントの制御下で発現することが望ましくあり得る。例えば、小さなＲｅｐタンパク質に対する大きな方の比を低減させるように、大きなＲｅｐタンパク質の発現を制御することが望ましくあり得る。昆虫細胞の場合は、細胞に対する毒性を避けるために、大きなＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８／６８）の発現を下方調節することが有利であり得る（例えば、Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ１３：１９３５を参照）。
本明細書において用いられる、パルボウイルスまたはＡＡＶ「ｃａｐコード配列」は、機能性パルボウイルスまたはＡＡＶキャプシドを形成する構造タンパク質をコードする（すなわち、ＤＮＡをパッケージおよび標的細胞を感染することができる）。典型的に、ｃａｐコード配列は、パルボウイルスまたはＡＡＶキャプシドサブユニットの全てをコードするが、機能性キャプシドが生産される限り、全てよりも少ないキャプシドサブユニットがコードされてよい。典型的に、必ずしもではないが、ｃａｐコード配列は、単一の核酸分子上に存在する。
自律的パルボウイルスおよびＡＡＶのキャプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９＆７０章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）により詳細に記載される。
特性を「実質的に維持する」によって、特性（例えば、活性または他の測定可能な特徴）の少なくとも約７５％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％が維持されることを意味する。
ＦＩＧ４発現カセットおよびベクター
本発明は、ポリホスホイノシチドホスファターゼ（ホスファチジルイノシトール３，５－ビスホスフェート５－ホスファターゼ、Ｓａｃ３、またはＦＩＧ４としても知られる）の治療的レベルの発現を提供するためのＦＩＧ４発現カセットの設計、ＦＩＧ４遺伝子によってコードされる酵素、および、対象における治療的レベルのＦＩＧ４を達成するための発現カセットの使用に関する。
したがって、本発明の一態様は、ヒトＦＩＧ４オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドに関し、ここでＦＩＧ４オープンリーディングフレームは、ヒト細胞における発現に関してコドン最適化されている。オープンリーディングフレームは、ＦＩＧ４をコードするＦＩＧ４遺伝子の部分である。本明細書において用いられるヒトＦＩＧ４ ＯＲＦは、ヒトＦＩＧ４をコードするヌクレオチド配列を指す。コドン最適化は、当技術分野でよく知られている技術であり、ヒトにおける発現に関する最適コドンは公知である。コドン最適化ＦＩＧ４配列の使用は、対象における内因性ＦＩＧ４配列の発現から、形質導入配列の発現を区別するのを可能にする。
一部の実施態様では、コドン最適化ＦＩＧ４オープンリーディングフレームは、野生型配列から改変されたＦＩＧ４酵素をコードし、例えば、野生型アミノ酸配列と比べて１、２、３、４、または５残基が置換、付加、および／または欠失されているアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。
一部の実施態様では、コドン最適化ＦＩＧ４オープンリーディングフレームは、配列番号１のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも約７０％同一の配列、例えばそれと少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一の配列を、含む、から本質的になる、またはからなる。
配列番号１：ヒトコドン最適化ＦＩＧ４オープンリーディングフレーム
ＡＴＧＣＣＡＡＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＡＡＴＣＡＴＴＴＣＡＴＣＡＧＴＧＣＡＡＡＡＧＣＴＴＧＴＧＣＴＣＴＡＣＧＡＧＡＣＡＡＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＴＴＴＣＣＴＧＧＴＣＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＡＧＴＡＣＡＧＡＧＴＧＣＴＴＡＡＧＡＴＴＧＡＣＣＧＣＡＣＣＧＡＡＣＣＧＡＡＧＧＡＣＣＴＣＧＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＧＡＴＣＧＣＣＡＣＧＴＧＴＡＣＡＣＴＣＡＧＣＡＡＧＡＡＧＴＧＣＧＣＧＡＡＣＴＣＴＴＧＧＧＡＣＧＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＣＧＡＡＣＣＡＡＡＡＴＧＧＧＣＣＡＧＡＡＧＧＧＣＴＣＣＴＣＣＧＧＴＣＴＧＴＴＴＣＧＧＧＣＡＧＴＧＴＣＧＧＣＴＴＴＣＧＧＣＧＴＣＧＴＧＧＧＡＴＴＣＧＴＧＣＧＡＴＴＣＣＴＴＧＡＧＧＧＧＴＡＣＴＡＴＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＴＣＡＣＧＡＡＧＣＧＧＣＧＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＴＣＧＧＡＧＧＡＣＡＣＧＣＴＡＴＡＴＡＣＡＡＧＧＴＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＡＡＣＡＴＧＡＴＣＴＡＣＡＴＴＣＣＧＡＡＣＧＡＴＴＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＣＣＧＡＴＧＡＡＧＣＣＣＧＣＴＡＣＣＴＴＡＧＡＡＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＧＴＧＧＡＴＣＴＣＴＣＣＴＣＧＡＡＣＴＴＴＴＡＣＴＴＣＴＣＡＴＡＣＴＣＧＴＡＣＧＡＣＣＴＧＴＣＣＣＡＣＴＣＧＣＴＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＧＧＡＴＧＣＣＴＣＴＧＧＡＧＡＴＧＣＴＣＡＡＧＴＣＣＧＡＧＡＴＧＡＣＴＣＡＡＡＡＴＣＧＧＣＡＧＧＡＡＴＣＣＴＴＣＧＡＣＡＴＣＴＴＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＧＧＴＣＴＧＡＴＣＡＣＴＣＡＡＧＧＡＧＧＧＴＣＧＧＧＡＧＴＧＴＴＣＧＧＣＡＴＴＴＧＣＡＧＣＧＡＡＣＣＣＴＡＣＡＴＧＡＡＡＴＡＣＧＴＧＴＧＧＡＡＣＧＧＡＧＡＧＣＴＣＣＴＧＧＡＣＡＴＴＡＴＣＡＡＧＡＧＣＡＣＴＧＴＧＣＡＣＣＧＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧＴＡＣＡＴＣＡＴＣＣＡＴＧＧＡＴＴＣＴＧＴＧＧＡＣＡＧＴＣＡＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＴＧＴＡＣＧＴＧＡＣＴＣＴＧＡＴＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＴＣＣＴＣＧＡＡＧＴＴＣＧＣＧＧＧＴＡＣＣＣＧＧＴＴＴＣＴＣＡＡＧＣＧＣＧＧＴＧＣＴＡＡＣＴＧＣＧＡＧＧＧＧＧＡＴＧＴＧＧＣＣＡＡＣＧＡＡＧＴＧＧＡＡＡＣＣＧＡＧＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＧＴＧＡＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＡＧＣＴＴＴＡＣＣＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＡＣＴＣＴＴＣＧＴＡＴＧＴＧＣＡＡＧＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＣＣＣＣＴＧＴＡＣＴＧＧＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＴＣＣＡＣＴＡＴＧＡＴＧＣＣＣＡＡＧＣＣＣＣＣＴＡＴＣＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＡＧＧＣＣＧＡＴＣＣＴＴＴＣＧＣＡＣＡＣＧＴＧＧＣＴＧＣＣＣＴＧＣＡＣＴＴＣＧＡＣＣＡＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＣＧＧＴＴＣＧＧＣＴＣＣＣＣＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＡＡＣＴＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＧＧＧＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＣＡＴＧＡＧＡＧＧＡＴＴＣＴＧＴＣＣＧＡＧＧＡＧＣＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＧＴＧＡＣＣＴＡＣＣＴＧＡＡＴＣＡＧＴＴＣＣＴＣＣＣＧＣＣＣＧＡＡＣＡＴＡＣＣＡＴＣＧＴＧＴＡＴＡＴＣＣＣＣＴＧＧＧＡＴＡＴＧＧＣＣＡＡＧＴＡＣＡＣＴＡＡＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＴＧＣＡＡＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＣＧＣＣＴＴＡＡＣＧＴＣＡＴＣＧＣＧＧＡＡＴＣＣＧＴＧＧＴＣＡＡＧＡＡＡＡＣＣＧＧＡＴＴＣＴＴＣＧＴＧＡＡＴＡＧＡＣＣＧＧＡＴＴＣＡＴＡＣＴＧＣＴＣＣＡＴＴＣＴＣＣＧＧＣＣＣＧＡＴＧＡＡＡＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＣＴＧＧＧＣＧＧＴＴＧＣＧＴＣＡＴＣＣＣＧＡＣＴＧＧＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＡＣＣＧＧＣＡＴＣＣＴＴＡＧＧＡＣＣＡＡＣＴＧＣＧＴＧＧＡＣＴＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＡＣＧＧＣＣＣＡＡＴＴＣＡＴＧＧＴＣＧＧＧＡＡＡＴＧＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＴＡＣＣＡＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＣＴＧＧＧＡＣＴＧＡＴＣＧＡＣＡＡＧＣＣＧＡＡＣＴＴＧＣＡＡＴＴＣＧＡＴＡＣＴＧＡＣＧＣＣＧＴＧＣＧＧＣＴＧＴＴＣＧＡＡＧＡＡＣＴＧＴＡＣＧＡＧＧＡＴＣＡＣＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＴＡＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＡＧＣＴＣＧＴＧＣＡＴＡＧＡＧＴＧＡＡＡＡＣＣＴＡＣＡＧＧＡＡＧＡＴＴＧＣＴＣＣＧＴＧＧＡＣＴＣＡＧＣＡＣＴＣＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＴＧＣＡＧＡＣＣＣＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＴＡＣＴＣＣＡＡＴＧＣＣＴＴＣＴＣＣＧＡＣＧＣＣＧＡＣＣＧＣＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡＴＴＡＡＣＣＴＣＴＴＣＣＴＧＧＧＡＧＴＧＴＴＣＣＡＣＣＣＡＡＣＣＧＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＡＣＣＴＧＴＧＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＡＣＴＧＡＴＴＴＣＴＡＣＴＴＧＣＡＴＣＡＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＡＴＧＡＧＡＣＴＣＣＴＧＣＣＣＡＣＣＣＧＧＣＧＣＴＣＣＴＡＣＡＣＴＴＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＡＧＴＧＡＴＣＡＡＧＣＡＣＣＴＣＣＣＧＣＴＧＣＣＧＴＡＣＧＡＣＧＡＧＧＴＣＡＴＣＴＧＣＧＣＣＧＴＧＡＡＣＣＴＧＡＡＡＡＡＧＣＴＧＡＴＣＧＴＣＡＡＡＡＡＧＴＴＣＣＡＴＡＡＡＴＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＣＧＡＣＡＴＴＣＡＣＡＡＣＧＡＡＴＴＣＴＴＣＣＧＧＣＣＡＴＡＣＧＡＧＣＴＧＴＣＣＴＣＧＴＴＣＧＡＣＧＡＣＡＣＣＴＴＴＴＧＴＣＴＧＧＣＧＡＴＧＡＣＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣＣＧＣＧＡＴＴＴＣＡＴＧＣＣＴＡＡＧＡＣＴＧＴＧＧＧＧＡＴＣＧＡＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＴＣＡＣＣＧＴＣＣＧＣＡＡＧＣＣＴＧＡＣＧＡＧＡＣＴＧＧＡＡＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＣＧＧＣＡＡＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＴＧＣＴＴＣＡＧＡＧＡＡＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＧＧＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＴＴＣＣＧＡＡＧＡＡＧＣＣＧＴＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＣＧＧＡＡＧＡＴＧＡＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣＣＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＴＣＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＣＧＧＴＣＣＡＣＣＣＣＧＧＴＣＡＡＧＡＴＧＡＣＴＧＡＣＧＣＣＧＧＧＧＡＣＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＴＣＡＣＣＧＡＡＡＡＣＧＴＧＧＴＧＣＡＡＣＣＣＡＴＧＡＡＧＧＡＡＣＴＧＴＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＣＣＴＴＡＧＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＴＣＴＧＡＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＴＣＴＡＣＴＣＴＣＧＧＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＧＡＧＣＣＡＧＣＡＣＡＡＧＣＡＧＧＡＣＡＡＧＡＡＴＴＣＣＣＡＡＣＡＧＣＣＧＴＧＣＡＧＣＡＧＡＴＧＣＴＣＣＧＡＣＧＧＡＧＴＧＡＴＴＡＡＧＣＴＧＡＣＴＣＣＧＡＴＴＡＧＣＧＣＧＴＴＣＴＣＧＣＡＡＧＡＴＡＡＣＡＴＣＴＡＣＧＡＡＧＴＧＣＡＡＣＣＣＣＣＴＣＧＣＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡＡＧＴＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＴＴＴＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＣＡＴＣＣＣＡＧＧＧＡＡＴＣＡＴＧＣＡＧＣＣＣＣＴＣＧＧＧＡＡＡＧＡＧＧＡＣＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴＡＣＣＧＧＧＡＧＴＡＣＡＴＣＡＧＡＡＡＣＣＧＣＴＡＣＣＴＧ
本発明の別態様は、ヒトＦＩＧ４オープンリーディングフレームを含んでいるポリヌクレオチドを含む発現カセットに関する。特定の実施態様では、ポリヌクレオチドは、ヒトコドン最適化配列、例えば、配列番号１のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも約７０％同一の配列、例えばそれと少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一の配列を含む、ポリヌクレオチドである。
発現カセット内のＦＩＧ４オープンリーディングフレームは、ＦＩＧ４の発現を増大させ得る１つまたは複数の発現エレメントに動作可能に連結され得る。一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、プロモーター、例えばニワトリβ－アクチンプロモーター、例えば、配列番号２のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも約７０％同一の配列、例えばそれと少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一の配列を含む、から本質的になる、またはからなるプロモーターに動作可能に連結される。一部の実施態様では、プロモーターは、例えば配列番号３のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも約７０％同一の配列、例えばそれと少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一の配列を含む、から本質的になる、またはからなる、ニワトリβ－アクチンエクソン１およびイントロンをさらに含む。
配列番号２：ニワトリβ－アクチンプロモーター
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配列番号３：ニワトリβ－アクチンエクソン１およびイントロン
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一部の実施態様では、ＦＩＧ４オープンリーディングフレームは、エンハンサー、例えばサイトメガロウイルスエンハンサー、例えば、配列番号４のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも約７０％同一の配列、例えばそれと少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一の配列を含む、から本質的になる、またはからなるエンハンサーに、動作可能に連結される。
配列番号４：サイトメガロウイルスエンハンサー
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一部の実施態様では、ＦＩＧ４オープンリーディングフレームは、ポリアデニル化シグナル、例えば合成のポリアデニル化シグナル、例えば、配列番号５のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも約７０％同一の配列、例えばそれと少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一の配列を含む、から本質的になる、またはからなる、ポリアデニル化シグナルに、動作可能に連結される。
配列番号５：合成のポリアデニル化シグナル（ＳｐＡ）
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当業者は、様々なプロモーター／エンハンサーエレメントが、所望のレベルおよび組織特異的発現に応じて用いられ得ることをさらに理解している。プロモーター／エンハンサーは、所望の発現パターンに応じて、構成的または誘導性であってよい。プロモーター／エンハンサーは、ネイティブまたは外来であってよく、天然または合成の配列であってよい。外来とは、転写開始領域が導入される野生型宿主において、その転写開始領域が見られないことを意図する。
プロモーター／エンハンサーエレメントは、処置される標的細胞または対象にとってネイティブであってよく、および／または、異種核酸配列にとってネイティブであってよい。プロモーター／エンハンサーエレメントは一般に、目的の標的細胞（単数または複数）内で機能するように選択される。代表的な実施態様では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、哺乳類のプロモーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンス・エレメントは、構成的または誘導性であってよい。
誘導性の発現制御エレメントは、異種核酸配列（単数または複数）の発現に対して調節を提供することが望ましい適用において一般に用いられる。遺伝子送達のための誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織特異的または組織好適プロモーター／エンハンサーエレメントであってよく、筋肉特異的または好適（心筋、骨格筋および／または平滑筋を含む）、神経組織特異的または好適（脳特異的を含む）、眼（網膜特異的および角膜特異的を含む）、肝臓特異的または好適、骨髄特異的または好適、膵臓特異的または好適、脾臓特異的または好適、および肺特異的または好適プロモーター／エンハンサーエレメントを含む。他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、ホルモン誘導性および金属誘導性エレメントを含む。例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、限定されないが、Ｔｅｔ ｏｎ／ｏｆｆエレメント、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、およびメタロチオネインプロモーターを含む。
ＦＩＧ４オープンリーディングフレームが、転写されて、それから標的細胞において翻訳される実施態様では、特異的な開始シグナルが一般に、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために用いられる。これらの外因的な転写制御配列は、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含んでよく、天然および合成の両方の様々な起源であってよい。
特定の実施態様では、発現カセットはさらに、少なくとも１つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端配列（ＩＴＲ）、例えば２つのＡＡＶ ＩＴＲｓを含む。２つのＩＴＲｓは、同一のヌクレオチド配列または異なるヌクレオチド配列を有してよい。ＡＡＶ ＩＴＲｓは、任意のＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ２由来であってよい。それぞれのＩＴＲは独立に、野生型配列または改変配列であってよい。一部の実施態様では、改変ＩＴＲは、Ｄ－エレメント欠失（ＷＯ０１／９２５５１）を有してよい。Ｄ－エレメント欠失は、Ｄ－エレメントとして知られるＩＴＲの部分の除去として定義される。Ｄ－エレメントは、あるいは、Ｄ領域またはＤ配列と呼ばれてよく、またはそのように知られており、および／または、回文構造のヘアピン構造を形成しないＩＴＲのヌクレオチドであってよい。一部の実施態様では、発現カセットは、ＡＡＶゲノム、例えば、自己相補ＡＡＶゲノムである。
特定の実施態様では、発現カセットは、エンハンサー、プロモーター、ヒトＦＩＧ４オープンリーディングフレーム、およびポリアデニル化部位を含む（挙げられた順番であってもよい）。特定の実施態様では、発現カセットは、ＡＡＶ ＩＴＲ、エンハンサー、プロモーター、ヒトＦＩＧ４オープンリーディングフレーム、ポリアデニル化部位、およびＡＡＶ ＩＴＲを含む（挙げられた順番であってもよい）。特定の実施態様では、発現カセットは、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター、ヒトＦＩＧ４オープンリーディングフレーム、および合成のポリアデニル化部位を含む（挙げられた順番であってもよい）。特定の実施態様では、発現カセットは、改変ＡＡＶ ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター、ヒトＦＩＧ４オープンリーディングフレーム、合成のポリアデニル化部位、および野生型ＡＡＶ ＩＴＲを含む（挙げられた順番であってもよい）。前述の構成要素は、動作可能に連結される。
一部の実施態様では、発現カセットは、配列番号６のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも約７０％同一の配列、例えばそれと少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一の配列を、含む、から本質的になる、またはからなる。
配列番号６：ＦＩＧ４発現カセット
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本発明のさらなる一態様は、本発明のポリヌクレオチドまたは発現カセットを含むベクターに関する。適切なベクターは、限定されないが、プラスミド、ファージ、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、またはバキュロウイルスベクター）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含む。例えば、核酸は、５’および／または３’末端反復（例えば、５’および／または３’ＡＡＶ末端反復）を含むＡＡＶベクターを、含んでよく、からなってよく、または、から本質的になってよい。一部の実施態様では、ベクターは、送達ビヒクル、例えば、粒子（例えば、微粒子またはナノ粒子）またはリポソームであり、それに対して発現カセットが付着され、またはその中に発現カセットが埋め込まれる。ベクターは、細胞内へ発現カセットを運ぶのに適切な任意の送達ビヒクルであってよい。
一部の実施態様では、ベクターは、ウイルスベクター、例えばＡＡＶベクターである。ＡＡＶベクターは、任意のＡＡＶ血清型、例えばＡＡＶ９であってよい。一部の実施態様では、ＡＡＶベクターは、野生型キャプシドタンパク質を含んでよい。他の実施態様では、ＡＡＶベクターは、野生型キャプシドタンパク質と比べて向性が変更された改変キャプシドタンパク質を含んでよく、例えば、改変キャプシドタンパク質は、肝臓－脱標的化（ｄｅｔａｒｇｅｔｅｄ）され、または、特定の細胞に関する高い向性を有する。
一部の実施態様では、ベクターは、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターである。一部の実施態様では、ベクターは、自己相補または二重ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである。ｓｃＡＡＶベクターは、国際特許公報ＷＯ０１／９２５５１に記載される（その開示はその全体で参照により本明細書中に援用される）。ＦＩＧ４ ＯＲＦを発現するためにｓｃＡＡＶを使用することは、形質導入される細胞の数、形質導入細胞あたりのコピー数、またはその両方を増大させ得る。
本発明のさらなる一態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクターを含む、形質転換された細胞に関する。一部の実施態様では、ポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクターは、細胞ゲノム内に安定的に組み込まれる。細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ細胞であってよい。
本発明の別態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を含む、トランスジェニック動物に関する。一部の実施態様では、動物は、実験動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル、または非ヒト霊長類である。
本発明のさらなる一態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を、薬学的に許容できる担体内に含む、医薬製剤に関する。
特定の実施態様では、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞は、単離される。
別の特定の実施態様では、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞は、精製される。
ウイルスベクターを生産する方法
本発明は、ウイルスベクターを生産する方法をさらに提供する。特定の一実施態様では、本発明は、組み換えＡＡＶ粒子を生産する方法を提供し、ＡＡＶ複製を許容する細胞へ：（ａ）（ｉ）本発明のポリヌクレオチドまたは発現カセット、および（ｉｉ）ＩＴＲを含む、組み換えＡＡＶテンプレート；（ｂ）Ｒｅｐコード配列およびＣａｐコード配列を含む、ポリヌクレオチド；を、組み換えＡＡＶテンプレートの複製およびパッケージングに十分な条件下で提供するステップを含み；それにより、組み換えＡＡＶ粒子が細胞において生産される。組み換えＡＡＶテンプレートの複製およびパッケージングに十分な条件は、例えば、ＡＡＶテンプレートの複製およびＡＡＶキャプシドへのキャプシド形成に十分なＡＡＶ配列の存在（例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ配列およびＡＡＶ ｃａｐ配列）、および、アデノウイルスおよび／またはヘルペスウイルス由来のヘルパー配列であってよい。特定の実施態様では、ＡＡＶテンプレートは、２つのＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み、それらは、本発明のポリヌクレオチドに対して５’および３’に位置するが、それに直接的に連続している必要はない。
一部の実施態様では、組み換えＡＡＶテンプレートは、Ｒｅｐによって分解されないＩＴＲを含み、国際特許公報ＷＯ０１／９２５５１に記載される二重ＡＡＶベクターを作製する。
ＡＡＶテンプレートならびにＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ配列は、ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたＡＡＶテンプレートを含むウイルスベクターが細胞内で生産される条件下で提供される。当該方法は、細胞からウイルスベクターを回収するステップをさらに含んでよい。ウイルスベクターは、培地から、および／または、細胞を溶解させることによって、回収することができる。
細胞は、ＡＡＶウイルス複製を許容する細胞であってよい。当技術分野で知られている任意の適切な細胞を用いてよい。特定の実施態様では、細胞は、哺乳類細胞（例えば、霊長類またはヒト細胞）である。別の選択肢としては、細胞は、複製欠損ヘルパーウイルスから欠失された機能を提供するトランス補完パッケージング細胞株、例えば、２９３細胞または他のＥ１ａトランス補完細胞であってよい。
ＡＡＶ複製およびキャプシド配列は、当技術分野で知られている任意の方法によって提供されてよい。現行のプロトコルは、典型的に、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を単一プラスミド上に発現する。ＡＡＶ複製およびパッケージング配列は、一緒に与えられる必要はないが、そうすることが便利であり得る。ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列は、任意のウイルスまたは非ウイルスベクターによって提供されてよい。例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、ハイブリッドアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供されてよい（例えば、欠失されたアデノウイルスベクターのＥ１ａまたはＥ３領域内に挿入される）。ＥＢＶベクターを用いてＡＡＶ ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子を発現してもよい。この方法の１つの利点は、ＥＢＶベクターがエピソームであり、さらに、継続的な細胞分裂にわたって高いコピー数を維持することである（すなわち、「ＥＢＶに基づく核エピソーム」と指定される染色体外エレメントとして細胞内に安定して組み込まれる。Ｍａｒｇｏｌｓｋｉ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．１５８：６７を参照）。
さらなる代替として、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、細胞内に安定的に組み込まれ得る。
典型的に、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、これらの配列のレスキューおよび／またはパッケージングを防ぐために、ＴＲｓがフランキングしていない。
ＡＡＶテンプレートは、当技術分野で知られている任意の方法を用いて細胞に提供され得る。例えば、テンプレートは、非ウイルス（例えば、プラスミド）またはウイルスベクターによって供給され得る。特定の実施態様では、ＡＡＶテンプレートは、ヘルペスウイルスまたはアデノウイルスベクターによって供給される（例えば、欠失されたアデノウイルスのＥ１ａまたはＥ３領域内に挿入される）。別の例示として、Ｐａｌｏｍｂｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：５０２５には、ＡＡＶ ＴＲｓによってフランキングされたレポーター遺伝子を保有するバキュロウイルスベクターが記載されている。ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子に関して上述したように、テンプレートを送達するためにＥＢＶベクターを用いてもよい。
別の代表的な実施態様では、ＡＡＶテンプレートは、複製ｒＡＡＶウイルスによって提供される。さらに他の実施態様では、ＡＡＶテンプレートを含むＡＡＶプロウイルスは、細胞の染色体内に安定的に組み込まれる。
ウイルス力価を高めるために、生産的なＡＡＶ感染を促進するヘルパーウイルス機能（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）が細胞に提供され得る。ＡＡＶ複製に必要なヘルパーウイルス配列は当技術分野で知られている。典型的に、これらの配列は、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供される。あるいは、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス配列は、別の非ウイルスまたはウイルスベクターによって、例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：１２９５、および米国特許番号６，０４０，１８３および６，０９３，５７０によって記載されるように、効率的なＡＡＶ生産を促進するヘルパー遺伝子の全てを保有する非感染性アデノウイルスミニプラスミドとして、提供され得る。
さらに、ヘルパーウイルス機能は、染色体内に埋め込まれた、または安定した染色体外エレメントとして維持された、ヘルパー配列を有するパッケージング細胞によって提供され得る。一般に、ヘルパーウイルス配列は、ＡＡＶビリオン内にパッケージされ得ず、例えばＩＴＲｓによってフランキングされない。
当業者は、ＡＡＶ複製およびキャプシド配列ならびにヘルパーウイルス配列（例えば、アデノウイルス配列）を、単一のヘルパー構築物上に提供することが有利であり得ると理解している。このヘルパー構築物は、非ウイルスまたはウイルス構築物であってよい。１つの非限定的な例示として、ヘルパー構築物は、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含む、ハイブリッドアデノウイルスまたはハイブリッドヘルペスウイルスであってよい。
１つの特定の実施態様では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。このベクターは、ＡＡＶテンプレートをさらに含んでよい。ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列および／またはＡＡＶテンプレートは、アデノウイルスの欠失された領域（例えば、Ｅ１ａまたはＥ３領域）内に挿入され得る。
さらなる一実施態様では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。この実施態様によれば、ＡＡＶテンプレートは、プラスミドテンプレートとして提供され得る。
別の例示的な実施態様では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって提供され、ＡＡＶテンプレートは、プロウイルスとして細胞内に組み込まれる。あるいは、ＡＡＶテンプレートは、染色体外エレメントとして（例えば、ＥＢＶに基づく核エピソームとして）細胞内に維持されるＥＢＶベクターによって提供される。
さらなる例示的な実施態様では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーによって提供される。ＡＡＶテンプレートは、別個の複製ウイルスベクターとして提供され得る。例えば、ＡＡＶテンプレートは、ＡＡＶ粒子または第２の組み換えアデノウイルス粒子によって提供され得る。
前述の方法によれば、ハイブリッドアデノウイルスベクターは典型的に、アデノウイルス複製およびパッケージングに十分な、アデノウイルス５’および３’シス配列（すなわち、アデノウイルス末端反復およびＰＡＣ配列）を含む。ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列、および、存在する場合は、ＡＡＶテンプレートは、アデノウイルス主鎖内に埋め込まれ、５’および３’シス配列によってフランキングされ、したがって、これらの配列は、アデノウイルスキャプシド内にパッケージングされ得る。上述のように、アデノウイルスヘルパー配列およびＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列は一般に、ＩＴＲｓによってフランキングされず、したがって、これらの配列はＡＡＶビリオン内にパッケージされない。
Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１８：７０４－１２）は、アデノウイルスならびにＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の両方を含む、キメラヘルパーを記載している。
ヘルペスウイルスも、ＡＡＶパッケージング方法におけるヘルパーウイルスとして用いられ得る。ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（単数または複数）をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは、スケーラブルなＡＡＶベクター生産スキームを有利に促進し得る。ＡＡＶ－２ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するハイブリッド単純ヘルペスウイルスタイプＩ（ＨＳＶ－１）ベクターが記載されている（Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：９８６およびＷＯ００／１７３７７）。
さらなる代替として、本発明のウイルスベクターは、例えば、Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：１９３５－４３によって記載されるように、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子およびＡＡＶテンプレートを送達するためにバキュロウイルスベクターを用いて、昆虫細胞において生産され得る。
ヘルパーウイルスの汚染がないＡＡＶベクターストックは、当技術分野で知られている任意の方法によって取得され得る。例えば、ＡＡＶおよびヘルパーウイルスは、サイズに基づいて容易に区別され得る。また、ＡＡＶは、ヘパリン基質に関する親和性に基づいてヘルパーウイルスから区別され得る（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：９７３）。いかなる汚染ヘルパーウイルスも複製能力がないように、欠失された複製欠損ヘルパーウイルスが用いられ得る。さらなる代替として、ＡＡＶのパッケージングを仲介するのに必要とされるのはアデノウイルス初期遺伝子発現のみなので、後期遺伝子発現が欠損しているアデノウイルスヘルパーが用いられ得る。後期遺伝子発現が欠損したアデノウイルス突然変異体は、当技術分野で知られている（例えば、ｔｓ１００Ｋおよびｔｓ１４９アデノウイルス突然変異体）。
ＦＩＧ４ベクターを使用する方法
本発明は、ＦＩＧ４の産生を増大させるため、例えば、インビトロ、エクスビボでまたはインビボでの治療的または研究目的のために、細胞または対象にＦＩＧ４ ＯＲＦを送達する方法にも関する。したがって、本発明の一態様は、細胞を、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクターと接触させるステップを含む、細胞においてＦＩＧ４オープンリーディングフレームを発現させる方法に関し、それにより、細胞においてＦＩＧ４オープンリーディングフレームを発現させる。一部の実施態様では、細胞は、インビトロ細胞、エクスビボ細胞、またはインビボ細胞である。
本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を対象に送達するステップを含む、対象においてＦＩＧ４オープンリーディングフレームを発現させる方法に関し、それにより、対象においてＦＩＧ４オープンリーディングフレームを発現させる。一部の実施態様では、対象は、異常なＦＩＧ４遺伝子発現と関連する障害の動物モデルである。
本発明のさらなる一態様は、治療的に有効量の本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を対象に送達するステップを含む、治療を必要とする対象における、ＦＩＧ４遺伝子の異常な発現またはＦＩＧ４遺伝子産物の異常な活性と関連する障害を治療する方法に関し、それにより、対象におけるＦＩＧ４遺伝子の異常な発現またはＦＩＧ４遺伝子産物の異常な活性と関連する障害を治療する。本発明は、治療を必要とする対象における、ＦＩＧ４遺伝子の異常な発現またはＦＩＧ４遺伝子産物の異常な活性と関連する障害を治療する方法を提供し、治療的に有効量の本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を、ＦＩＧ４オープンリーディングフレームが対象において発現されるように対象に投与するステップを含む。一部の実施態様では、ＦＩＧ４遺伝子の発現または遺伝子産物と関連する障害は、ＣＭＴ４Ｊである。一部の実施態様では、ＦＩＧ４遺伝子の発現または遺伝子産物と関連する障害は、Ｙｕｎｉｓ－Ｖａｒｏｎ症候群である。一部の実施態様では、ＦＩＧ４遺伝子の発現または遺伝子産物と関連する障害は、筋萎縮性側索硬化症である。一部の実施態様では、ＦＩＧ４遺伝子の発現または遺伝子産物と関連する障害は、小児発症の多発性硬化症である。
本発明は、治療を必要とする対象における、シャルコー・マリー・トゥース病ニューロパチー・タイプ４Ｊを治療する方法をさらに提供し、治療的に有効量の本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を、ＦＩＧ４オープンリーディングフレームが対象において発現されるように対象に投与するステップを含む。
本発明は、治療を必要とする対象における、Ｙｕｎｉｓ－Ｖａｒｏｎ症候群を治療する方法をさらに提供し、治療的に有効量の本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を、ＦＩＧ４オープンリーディングフレームが対象において発現されるように対象に投与するステップを含む。
本発明は、治療を必要とする対象における、筋萎縮性側索硬化症を治療する方法をさらに提供し、治療的に有効量の本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を、ＦＩＧ４オープンリーディングフレームが対象において発現されるように対象に投与するステップを含む。
本発明は、治療を必要とする対象における、小児発症の多発性硬化症を治療する方法をさらに提供し、治療的に有効量の本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を、ＦＩＧ４オープンリーディングフレームが対象において発現されるように対象に投与するステップを含む。
特定の実施態様では、ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞は、対象に、例えば、全身性（例えば、静脈内）に、または対象の中枢神経系へ直接（例えば、髄腔内または心室内注入によって脳脊髄液に）、送達される。一部の実施態様では、ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞は、静脈内に送達される。一部の実施態様では、ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞は、脳室内に送達される。
本発明に係る組み換えウイルスベクターは、獣医および医療用途の両方において使用を見いだす。適切な対象は、鳥類および哺乳類の両方を含む。本明細書において用いられる用語「鳥類」は、制限されないが、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、ターキー、キジ、オウム、インコを含む。本明細書において用いられる用語「哺乳類」は、制限されないが、ヒト、霊長類、非ヒト霊長類（例えば、サルおよびヒヒ）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、齧歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター等）などを含む。ヒト対象は、新生児、幼児、青少年、および成人を含む。任意選択で、対象は、例えば、本明細書中に記載のものを含む障害を対象が有するまたはそのリスクがあると考えられ、または、本明細書中に記載のものを含むポリヌクレオチドの送達によって恩恵を受けるので、本発明の方法「を必要とする」。さらなる選択肢として、対象は、実験動物および／または疾患の動物モデルであってよい。好ましくは、対象はヒトである。
特定の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、対象の人生においてできる限り早く、例えば、対象が、異常なＦＩＧ４発現または活性または任意の上述の疾患または障害が診断されたらすぐに、必要とする対象に投与される。一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、例えば、新生児の診断によって、異常なＦＩＧ４発現または活性が同定された後に、新生児対象に投与される。一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、例えば、出生前診断によって、異常なＦＩＧ４発現または活性または上述の疾患または障害のうちの１つの存在が同定された後に、胎児に子宮内へ投与される。一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、対象が、異常なＦＩＧ４発現または活性と関連する症候を発症したらすぐに、または、異常なＦＩＧ４発現または活性または上述の疾患または障害のうちの１つを有する疑いがあるか、または有すると診断されたらすぐに、対象に投与される。一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、対象が、異常なＦＩＧ４発現または活性と関連する症候、または疾患／障害を発症する前に、例えば、異常なＦＩＧ４発現または活性または上述の疾患または障害のうちの１つを有する疑いがあるか、または有すると診断されるが、症候を示し始めていない対象に、投与される。
特定の実施態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を、薬学的に許容できる担体内に含む医薬組成物を提供し、他の医学的薬剤、医薬品、安定化剤、バッファー、担体、アジュバント、希釈剤などを含んでいてもよい。注入のために、担体は典型的に液体である。他の投与方法については、担体は、固体または液体のいずれかであってよい。吸入投与については、担体は呼吸用であり、好ましくは固体または液体微粒子の形態である。
「薬学的に許容できる」によって、毒性または他の方法で望ましくないようなものでない材料を意味し、すなわち、材料は、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こさずに対象に投与され得る。
本発明の一態様は、ＦＩＧ４ ＯＲＦを細胞にインビトロで移行させる方法である。本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクターは、適切な量で細胞に導入され得る。ウイルスベクターは、特定の標的細胞に適切な標準的な形質導入方法に従って、適切な感染多重度で細胞に導入され得る。投与するウイルスベクターまたはキャプシドの力価は、標的細胞のタイプおよび数、ならびに、特定のウイルスベクターまたはキャプシドによって変化し得て、過度の実験をせずに当業者によって決定され得る。特定の実施態様では、少なくとも約１０３感染単位、より好ましくは少なくとも約１０５感染単位が、細胞に導入される。
本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクター、例えば、ウイルスベクターが導入され得る細胞（単数または複数）は、制限されないが、神経系細胞（末梢および中枢神経系の細胞、特に、脳細胞、例えば、ニューロン、オリゴデンドロサイト、グリア細胞、星状細胞を含む）、肺細胞、眼の細胞（網膜細胞、網膜色素上皮、および角膜細胞を含む）、上皮細胞（例えば、消化管および呼吸器上皮細胞）、骨格筋細胞（筋芽細胞、筋管および筋線維を含む）、横隔膜筋細胞、樹状細胞、膵臓細胞（膵島細胞を含む）、肝細胞、消化管の細胞（平滑筋細胞、上皮細胞を含む）、心臓細胞（心筋細胞を含む）、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチン生成細胞、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、関節細胞（例えば、軟骨、半月板、滑膜および骨髄を含む）、生殖細胞などを含む、任意のタイプであってよい。あるいは、細胞は、任意の前駆細胞であってよい。さらなる代替として、細胞は、幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝臓幹細胞）であってよい。さらなる代替として、細胞は、がんまたは腫瘍細胞であってよい。さらに、細胞は、上述の起源の任意の種由来であってよい。
本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクター、例えば、ウイルスベクターは、改変細胞を対象に投与する目的のために、インビトロで細胞に導入され得る。特定の実施態様では、細胞が対象から取り出されて、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクター、例えば、ウイルスベクターがその中に導入されて、それから、細胞が対象内に戻される。エクスビボでの処置のために対象から細胞を取り出して、その後に対象内に導入する方法は、当技術分野で知られている（例えば、米国特許番号５，３９９，３４６を参照）。あるいは、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクター、例えば、ウイルスベクターが、別の対象由来の細胞内に、培養細胞内に、または任意の他の適切な由来の細胞内に導入されて、そして、細胞が、必要とする対象に投与される。
エクスビボの遺伝子療法のための適切な細胞は上述のとおりである。対象に投与する細胞の用量は、対象の年齢、状態および種、細胞のタイプ、細胞によって発現される核酸、投与モードなどによって異なる。典型的に、少なくとも約１０２～約１０８または約１０３～約１０６細胞が、薬学的に許容できる担体において、用量あたり投与される。特定の実施態様では、エクスビボでのウイルスベクターによる細胞形質導入は、調剤担体と組み合わせて有効量で対象に投与される。
本発明のさらなる一態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクター、例えば、ウイルスベクターを、対象に投与する方法である。特定の実施態様では、当該方法は、ＦＩＧ４ ＯＲＦを動物対象に送達する方法を含み、その方法は、有効量の本発明に係るウイルスベクターを動物対象に投与するステップを含む。必要とするヒト対象または動物への本発明のウイルスベクターの投与は、当技術分野で知られている任意の手段によってよい。ウイルスベクターは、効果的な用量で薬学的に許容できる担体において送達されてもよい。
対象に投与されるウイルスベクターの用量は、投与モード、治療される疾患または状態、個々の対象の状態、特定のウイルスベクター、および、送達される核酸に依存し、日常的な様式で決定することができる。治療的効果を達成するために例示的な用量は、少なくとも約１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６形質導入単位またはそれよりも多く、例えば、約１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、または１０１５形質導入単位、さらにより好ましくは約１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、または１０１５形質導入単位のウイルス力価である。用量およびウイルス力価形質導入単位は、ベクターまたはウイルスゲノム（ｖｇ）として計算され得る。
特定の実施態様では、様々な間隔、例えば、毎日、毎週、毎月、毎年などの期間にわたって、１回を超える投与（例えば、２回、３回、４回、またはそれよりも多くの投与）を用いて、所望のレベルの遺伝子発現が達成され得る。
例示的な投与モードは、経口、直腸、経粘膜、局所、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介する）、口腔（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼球内、経皮、子宮内（または胚内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内［骨格筋、横隔膜および／または心筋への投与を含む］、皮内、胸膜内、脳内、および関節内）、局所（例えば、皮膚および粘膜表面の両方、気道表面を含む、および経皮投与）、リンパ内など、ならびに、直接的な組織または臓器注入（例えば、肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋または脳）を含む。投与は、腫瘍（例えば、腫瘍またはリンパ節内、またはその付近）に対するものであってもよい。任意の所定の場合における最も適切な経路は、治療される症状の性質および重症度、ならびに、用いられる特定のベクターの性質に依存する。
一部の実施態様では、ウイルスベクターは、ＣＮＳ、末梢神経系、またはその両方に投与される。
一部の実施態様では、ウイルスベクターは、ＣＮＳ、例えば、脳または脊髄に直接投与される。直接投与は、ＣＮＳ細胞の形質導入の高い特異性をもたらし得て、例えば、形質導入細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも多くがＣＮＳ細胞である。ＣＮＳにベクターを直接投与するための当技術分野で知られている任意の方法を用いることができる。ベクターは、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、脳下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、大脳（後頭、側頭、頭頂および前頭葉を含む）、皮質、基底核、海馬および扁桃体）、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、および下丘内に導入され得る。ベクターは、眼の異なる領域、例えば、網膜、角膜または視神経へ投与されてもよい。ベクターは、ベクターのより分散した投与のために、脳脊髄液内に（例えば腰椎穿刺によって）送達されてよい。
送達ベクターは、ＣＮＳの所望の領域（単数または複数）に、制限されないが、髄腔内、脳内、心室内、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前房）および眼周囲（例えば、テノン下（ｓｕｂ－Ｔｅｎｏｎ’ｓ）領域）送達または任意のそれらの組み合わせを含む、当技術分野で知られている任意の経路によって投与され得る。
送達ベクターは、ＣＮＳ、末梢神経系、および／または他の組織を含む組織の、より広範な、拡散する形質導入を生じさせる様式で投与され得る。
典型的に、ウイルスベクターは、ＣＮＳおよび／または他の組織内の所望の領域または区画への直接注入（例えば、定位的な注入）によって、液体製剤において投与される。一部の実施態様では、ベクターは、リザーバーおよび／またはポンプを介して送達され得る。他の実施態様では、ベクターは、所望の領域への局所適用によって、またはエアロゾル製剤の経鼻内投与によって提供され得る。眼または耳への投与は、液滴の局所適用によるものであってよい。さらなる代替として、ベクターは、固体、徐放製剤として投与され得る。パルボウイルスおよびＡＡＶベクターの制御放出は、国際特許公報ＷＯ０１／９１８０３によって記載される。
注入剤は、従来の形態で、液体の溶液または懸濁液、注入前の液体中の溶液または懸濁液に適切な固体形態として、またはエマルションとして、調製され得る。あるいは、ウイルスベクターは、全身性ではなく局所的な様式で、例えば、デポーまたは徐放性製剤において投与され得る。さらに、ウイルスベクターは、外科的に埋め込み可能なマトリックス、例えば、骨補填材、縫合、ステントなど（例えば米国特許７，２０１，８９８に記載される）に乾燥送達する（ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｄｒｉｅｄ）ことができる。
経口投与に適切な医薬組成物は、個別単位、例えば、カプセル、カシェ剤、トローチ、または錠剤において（それぞれ、所定量の本発明の組成物を含んでいる）；粉末または顆粒として；水性または非水性の液体中の溶液または懸濁液として；または、水中油もしくは油中水エマルションとして、提供され得る。経口送達は、本発明のウイルスベクターを、動物の消化管内の消化酵素による分解に耐えることのできる担体と複合化させることによって行われ得る。かかる担体の例は、当技術分野で知られているプラスチックカプセルまたは錠剤を含む。かかる製剤は、薬学の任意の適切な方法によって調製され、組成物および適切な担体を関連させるステップを含む（上記のとおり、１つまたは複数の副成分を含んでよい）。一般に、本発明の実施態様に係る医薬組成物は、組成物を、液体または微細に分割された固体担体、または両方と均一かつ密接に混合して、それから、もし必要ならば、生じた混合物を成形することによって調製される。例えば、錠剤は、組成物を含んでいる粉末または顆粒（１つまたは複数の副成分を含んでよい）を圧縮または成形することによって調製され得る。圧縮錠剤は、適切な機械において、粉末または顆粒のような自由流動形態の組成物を圧縮することによって調製される（結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、および／または表面活性／分散剤（単数または複数）とともに混合されていてもよい）。成形錠剤は、適切な機械において、不活性液体結合剤によって湿らせた粉末化化合物を成形することによって作製される。
口腔（舌下）投与に適切な医薬組成物は、本発明の組成物を、香り付けられたベース、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント内に含んでいるロゼンジ（ｌｏｚｅｎｇｅ）；および、不活性ベース、例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシア内に組成物を含んでいるトローチ（ｐａｓｔｉｌｌｅ）を含む。
非経口投与に適切な医薬組成物は、本発明の組成物の滅菌水性および非水性注入溶液を含んでよく、その製剤は、意図されるレシピエントの血液と等張であってもよい。これらの製剤は、抗酸化剤、バッファー、静菌薬および溶質であって、組成物を意図されるレシピエントの血液と等張にするものを含んでよい。水性および非水性滅菌懸濁液、溶液およびエマルションは、懸濁剤および増粘剤を含んでよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、および、オレイン酸エチルのような注入可能な有機エステルである。水性担体は、水、アルコール性／水性の溶液、エマルションまたは懸濁液を含み、生理食塩水および緩衝化培地を含む。非経口ビヒクルは、食塩水、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または固定油を含む。静脈内ビヒクルは、流体および栄養補充液（ｆｌｕｉｄ ａｎｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、電解質補充液（例えば、リンゲルブドウ糖に基づくもの）などを含む。防腐剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどが存在してもよい。
組成物は、単位用量または複数回用量のコンテナーにおいて、例えば、密封されたアンプルおよびバイアルにおいて提供され得て、使用の直前に滅菌液体担体、例えば、生理食塩水または注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管され得る。
即座の注入溶液および懸濁液は、前述した種類の滅菌された粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。例えば、注入可能な安定した本発明の滅菌組成物が、密封されたコンテナーにおける単位投与形態で提供され得る。組成物は、適切な薬学的に許容できる担体を用いて再構成して対象への注入に適切な液体組成物を形成することのできる凍結乾燥物の形態で提供され得る。単位投与形態は、約１μｇ～約１０ｇの本発明の組成物であってよい。組成物が実質的に水不溶性である場合は、生理的に許容できる十分な量の乳化剤が、水性担体中に組成物を乳化させるのに十分な量で含まれてよい。そのような有用な乳化剤の１つはホスファチジルコリンである。
直腸投与に適切な医薬組成物は、単位用量の坐薬として提供され得る。これらは、組成物を１つまたは複数の従来の固形担体（例えば、カカオ脂）と混合して、それから、生じた混合物を成形することによって調製され得る。
皮膚への局所適用に適切な本発明の医薬組成物は、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ジェル、スプレー、エアロゾル、またはオイルの形態をとり得る。用いることのできる担体は、限定されないが、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール類、アルコール類、経皮エンハンサー、および、それらの２以上の組み合わせを含む。一部の実施態様では、例えば、局所送達は、本発明の医薬組成物を、皮膚内へ通過することが可能な脂溶性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と混合することによって行われ得る。
経皮投与に適切な医薬組成物は、長期間、対象の上皮と密接に接触した状態を保つために適用される個別パッチの形態であってよい。経皮投与に適切な組成物は、イオン導入によって送達することもでき（例えば、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．３：３１８（１９８６）を参照）、典型的に、本発明の組成物の緩衝化されていてもよい水溶液の形態をとる。適切な製剤は、クエン酸またはｂｉｓ／ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ６）またはエタノール／水を含んでよく、０．１～０．２Ｍの活性成分を含んでよい。
本明細書中に開示されるウイルスベクターは、任意の適切な手段によって、例えば、対象が吸入する、ウイルスベクターを含む呼吸用粒子のエアロゾル懸濁液の投与によって、対象の肺に投与され得る。呼吸用粒子は、液体または固体であってよい。ウイルスベクターを含む液体粒子のエアロゾルは、当業者に公知のように、任意の適切な手段、例えば、圧力駆動のエアロゾル噴霧器または超音波噴霧器を用いて生産され得る。例えば、米国特許番号４，５０１，７２９を参照。ウイルスベクターを含む固体粒子のエアロゾルは、調剤分野において公知の技術によって、任意の固体微粒子の薬品エアロゾル発生器を用いて同様に生産され得る。
本発明を記載したが、同じことが、以下の実施例においてより詳細に説明され、それは例示目的のみのために本明細書中に含まれ、本発明の限定を意図しない。
［実施例１：ＦＩＧ４欠乏のインビボ処置におけるｈＦＩＧ４ｏｐｔの効能の同定］
マウス、ラットおよびサルＦＩＧ４のアミノ酸配列を、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａプログラムを用いて最適化ヒト配列と比較した。結果は、ＦＩＧ４タンパク質配列が、高レベルのアミノ酸同一性で、種間で保存されていることを示す（図２）。
２７２１ｂｐのｈＦｉｇ４ ＤＮＡコード配列を、ＣＭＶエンハンサーを有する１６１２ｂｐのニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターと４８ｂｐの合成のポリアデニル化（ＳｐＡ）シグナルの間に置いた。ＣＢＡプロモーターおよびＳｐＡは、サイズが小さいこと、および、強い発現を生じさせるという両方の理由から使用され、ＡＡＶベクター内へのパッケージングを可能にする［Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．２０１１ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２：１１４３－１１５３］。上流逆位末端配列（ＩＴＲ；プロモーターに近位）はＡＡＶ２由来であり、一本鎖（ｓｓ）ゲノムのパッケージングを促進するためにＤエレメントが欠失されている。下流ＩＴＲ（ポリＡに近位）は、無傷のＷＴ ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
前臨床試験を、ＦＩＧ４発現が欠失しているマウスモデル（劣性のヒト状態を再現する）において行なった。これらのマウスは、運動神経障害およびヒト疾患の他の態様を発症し、実際に、マウス突然変異の同定は、ＣＭＴ４Ｊに関する原因遺伝子としてＦＩＧ４の同定を導いた。ヒトおよびマウスのＦＩＧ４タンパク質および活性は高度に保存されており、マウスにおいて行われた前臨床試験は、ＡＡＶ９によって送達されたコドン最適化ヒトＦＩＧ４遺伝子を用いた。
ＣＳＦ内の投与を、１／２ｃｃインスリンシリンジを用いて脳室内に（ＩＣＶ）、またはＨａｍｉｌｔｏｎ（登録商標）シリンジを用いて髄腔内に（ＩＴ）、動物へ投与した。処置開始時のマウスの齢、用量レベル、および投与経路を表４に示す。
それぞれの齢における処置は、５コホートを含んだ：１）未処置Ｆｉｇ＋／＋マウスは、健康なコホートを表わし、２）ＡＡＶ９／ＦＩＧ４を注入したＦｉｇ＋／＋マウスは、遺伝子療法の安全性をモニターするための非疾患表現型を表わし、３）ＡＡＶ９／ＦＩＧ４を注入したＦＩＧ４－／－マウスは、遺伝子療法の効能および安全性を調べるためであり、４）ビヒクルを投与したＦｉｇ４－／－マウスは、疾患の自然な経過を表わし、５）未処置Ｆｉｇ４－／－コントロールマウスは、注入技術による任意の効果をモニターするためのものである。


Figure 2022506066000007
このベクターを、ＩＣＶ（Ｐ１およびＰ４）またはＩＴ（Ｐ７およびＰ１１）注入のいずれかによって神経系に直接投与することは、生存の改善（図３）、握力（図５）を含む全体の運動機能の改善（図６および７）、末梢運動神経伝導の改善（図８）、ならびに、脊髄および後根神経節、および中枢神経系の他の部分における病理組織学的成果の改善（図９、１０、および１１）によって示されるように利益を生じさせた。これらの成果は、遺伝子置換が、ＦＩＧ４機能欠失突然変異を補うのに効果的であることを示す。重要なことに、我々の結果は、ＦＩＧ４－ＡＡＶ９の送達が早いほど、利益が最大であることを示す。我々の結果は、Ｐ７マウスにおいて、最大限に実行可能な用量までの処置の明確な用量応答も示し、最大限の実行可能な用量が最も効果的な処置を提供することの正当性を示す（図１２）。さらに、ベクターを用いて処置した場合に、Ｆｉｇ４突然変異体または同腹子コントロールマウスにおいて、明白に、または病理組織学的試験によって、いかなる副作用も観察されなかった（図３および４）。
本明細書中に挙げられる全ての参考文献は、それぞれの個々の文献または特許または特許出願が、具体的および個々に、参照によりその全体で全ての目的に関して援用されると示されるのと同程度まで、それらの全体で全ての目的に関して参照により本明細書中に援用される。
前述の実施例は本発明の例示であり、それらの限定と解釈されるべきでない。本発明は、好ましい実施態様に関して詳細に記載されているが、バリエーションおよび改変が、以下の特許請求の範囲において記載および定義される本発明の範囲および主旨の中に存在する。

Claims (48)

  1. ヒトＦＩＧ４オープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドであって、
    前記ヒトＦＩＧ４オープンリーディングフレームは、ヒト細胞における発現に関してコドン最適化される、
    ポリヌクレオチド。
  2. 請求項１のポリヌクレオチドであって、
    前記ヒトＦＩＧ４オープンリーディングフレームは、配列番号１のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
    ポリヌクレオチド。
  3. ヒトＦＩＧ４オープンリーディングフレームを含んでいるポリヌクレオチドを含む、
    発現カセット。
  4. 請求項３の発現カセットであって、
    前記ポリヌクレオチドは、請求項１または２のポリヌクレオチドである、
    発現カセット。
  5. 請求項３または４の発現カセットであって、
    前記ヒトＦＩＧ４オープンリーディングフレームは、プロモーターに動作可能に連結される、
    発現カセット。
  6. 請求項５の発現カセットであって、
    前記プロモーターは、ニワトリβアクチンプロモーターである、
    発現カセット。
  7. 請求項３から６のいずれか一項の発現カセットであって、
    前記ヒトＦＩＧ４オープンリーディングフレームは、エンハンサーに動作可能に連結される、
    発現カセット。
  8. 請求項７の発現カセットであって、
    前記エンハンサーは、サイトメガロウイルスのエンハンサーである、
    発現カセット。
  9. 請求項３から８のいずれか一項の発現カセットであって、
    前記ヒトＦＩＧ４オープンリーディングフレームは、ポリアデニル化シグナルに動作可能に連結される、
    発現カセット。
  10. 請求項９の発現カセットであって、
    前記ポリアデニル化シグナルは、合成のポリアデニル化シグナルである、
    発現カセット。
  11. 請求項３から１０のいずれか一項の発現カセットであって、
    少なくとも１つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端配列（ＩＴＲ）をさらに含む、
    発現カセット。
  12. 請求項１１の発現カセットであって、
    前記発現カセットは、２つのＡＡＶ ＩＴＲｓを含む、
    発現カセット。
  13. 請求項１２の発現カセットであって、
    前記２つのＡＡＶ ＩＴＲｓは、同一のヌクレオチド配列を有する、
    発現カセット。
  14. 請求項１２の発現カセットであって、
    前記２つのＡＡＶ ＩＴＲｓは、異なるヌクレオチド配列を有する、
    発現カセット。
  15. 請求項１２から１４のいずれか一項の発現カセットであって、
    前記２つのＡＡＶ ＩＴＲｓのうちの１つは、改変ＩＴＲである、
    発現カセット。
  16. 請求項１２から１４のいずれか一項の発現カセットであって、
    前記２つのＡＡＶ ＩＴＲｓのうちの１つは、Ｄ－エレメント欠失改変ＩＴＲである、
    発現カセット。
  17. 請求項１１から１６のいずれか一項の発現カセットであって、
    前記のＡＡＶ ＩＴＲｓは、ＡＡＶ２ ＩＴＲｓである、
    発現カセット。
  18. 請求項３から１７のいずれか一項の発現カセットであって、
    前記発現カセットは、自己相補ＡＡＶゲノムである、
    発現カセット。
  19. 請求項３から１８のいずれか一項の発現カセットであって、
    前記発現カセットは、プロモーター、前記ヒトＦＩＧ４オープンリーディングフレーム、およびポリアデニル化部位を含む、
    発現カセット。
  20. 請求項１９の発現カセットであって、
    前記発現カセットは、ＡＡＶ ＩＴＲ、エンハンサー、プロモーター、前記ヒトＦＩＧ４オープンリーディングフレーム、ポリアデニル化部位、およびＡＡＶ ＩＴＲを含む、
    発現カセット。
  21. 請求項３から１８のいずれか一項の発現カセットであって、
    前記発現カセットは、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター、前記ヒトＦＩＧ４オープンリーディングフレーム、および合成のポリアデニル化部位を含む、
    発現カセット。
  22. 請求項２１の発現カセットであって、
    前記発現カセットは、改変ＡＡＶ ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター、前記ヒトＦＩＧ４オープンリーディングフレーム、合成のポリアデニル化部位、およびＷＴ ＡＡＶ ＩＴＲを含む、
    発現カセット。
  23. 請求項２２の発現カセットであって、
    配列番号６のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも約９０％同一の配列を含む、
    発現カセット。
  24. 請求項１または２のポリヌクレオチドまたは請求項３から２３のいずれか一項の発現カセットを含む、
    ベクター。
  25. 請求項２４のベクターであって、
    前記ベクターは、ウイルスベクターである、
    ベクター。
  26. 請求項２４のベクターであって、
    前記ベクターは、ＡＡＶベクターである、
    ベクター。
  27. 請求項２６のベクターであって、
    前記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９ベクターである、
    ベクター。
  28. 請求項１または２のポリヌクレオチド、請求項３から２３のいずれか一項の発現カセット、および／または、請求項２４から２７のいずれか一項のベクターを含む、
    形質転換された細胞。
  29. 請求項２７の形質転換された細胞であって、
    前記ポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクターは、細胞ゲノム内に安定して取り込まれる、
    形質転換された細胞。
  30. 請求項１または２のポリヌクレオチド、請求項３から２３のいずれか一項の発現カセット、請求項２４から２７のいずれか一項のベクター、および／または、請求項２８または２９の形質転換された細胞を含む、
    トランスジェニック動物。
  31. 請求項１または２のポリヌクレオチド、請求項３から２３のいずれか一項の発現カセット、請求項２４から２７のいずれか一項のベクター、および／または、請求項２８または２９の形質転換された細胞を、薬学的に許容できる担体内に含む、
    医薬組成物。
  32. 細胞においてＦＩＧ４オープンリーディングフレームを発現させる方法であって、
    請求項１または２のポリヌクレオチド、請求項３から２３のいずれか一項の発現カセット、および／または、請求項２４から２７のいずれか一項のベクターと、細胞を接触させるステップを含み、それにより、細胞においてＦＩＧ４オープンリーディングフレームを発現させる、
    方法。
  33. 対象においてＦＩＧ４オープンリーディングフレームを発現させる方法であって、
    請求項１または２のポリヌクレオチド、請求項３から２３のいずれか一項の発現カセット、請求項２４から２７のいずれか一項のベクター、および／または、請求項２８または２９の形質転換された細胞を、対象に送達するステップを含み、それにより、対象においてＦＩＧ４オープンリーディングフレームを発現させる、
    方法。
  34. 治療を必要とする対象における、ＦＩＧ４遺伝子の異常な発現またはＦＩＧ４遺伝子産物の異常な活性と関連する障害を治療する方法であって、
    治療的に有効量の請求項１または２のポリヌクレオチド、請求項３から２３のいずれか一項の発現カセット、請求項２４から２７のいずれか一項のベクター、および／または、請求項２８または２９の形質転換された細胞を、ＦＩＧ４オープンリーディングフレームが対象において発現されるように対象に投与するステップを含む、
    方法。
  35. 請求項３４の方法であって、
    ＦＩＧ４遺伝子の発現と関連する障害は、シャルコー・マリー・トゥース病ニューロパチー・タイプ４Ｊである、
    方法。
  36. 請求項３５の方法であって、
    ＦＩＧ４遺伝子の発現と関連する障害は、Ｙｕｎｉｓ－Ｖａｒｏｎ症候群である、
    方法。
  37. 請求項３４の方法であって、
    ＦＩＧ４遺伝子の異常な発現と関連する障害は、筋萎縮性側索硬化症である、
    方法。
  38. 請求項３４の方法であって、
    ＦＩＧ４遺伝子の異常な発現と関連する障害は、小児発症の多発性硬化症である、
    方法。
  39. 治療を必要とする対象における、シャルコー・マリー・トゥース病ニューロパチー・タイプ４Ｊを治療する方法であって、
    治療的に有効量の請求項１または２のポリヌクレオチド、請求項３から２３のいずれか一項の発現カセット、請求項２４から２７のいずれか一項のベクター、および／または、請求項２８または２９の形質転換された細胞を、ＦＩＧ４オープンリーディングフレームが対象において発現されるように対象に投与するステップを含む、
    方法。
  40. 治療を必要とする対象における、Ｙｕｎｉｓ－Ｖａｒｏｎ症候群を治療する方法であって、
    治療的に有効量の請求項１または２のポリヌクレオチド、請求項３から２３のいずれか一項の発現カセット、請求項２４から２７のいずれか一項のベクター、および／または、請求項２８または２９の形質転換された細胞を、ＦＩＧ４オープンリーディングフレームが対象において発現されるように対象に投与するステップを含む、
    方法。
  41. 治療を必要とする対象における、筋萎縮性側索硬化症を治療する方法であって、
    治療的に有効量の請求項１または２のポリヌクレオチド、請求項３から２３のいずれか一項の発現カセット、請求項２４から２７のいずれか一項のベクター、および／または、請求項２８または２９の形質転換された細胞を、ＦＩＧ４オープンリーディングフレームが対象において発現されるように対象に投与するステップを含む、
    方法。
  42. 治療を必要とする対象における、小児発症の多発性硬化症を治療する方法であって、
    治療的に有効量の請求項１または２のポリヌクレオチド、請求項３から２３のいずれか一項の発現カセット、請求項２４から２７のいずれか一項のベクター、および／または、請求項２８または２９の形質転換された細胞を、ＦＩＧ４オープンリーディングフレームが対象において発現されるように対象に投与するステップを含む、
    方法。
  43. 請求項３４から４２の方法であって、
    前記対象はヒトである、
    方法。
  44. 請求項３４から４３のいずれか一項の方法であって、
    前記ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞は、前記対象の神経系へ送達される、
    方法。
  45. 請求項４４の方法であって、
    前記ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞は、髄腔内、脳内、脳室内、鼻腔内、耳内、眼内、または眼周囲の送達、またはそれらの任意の組み合わせによって送達される、
    方法。
  46. 請求項４４の方法であって、
    前記ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞は、静脈内に送達される、
    方法。
  47. 請求項４５の方法であって、
    前記ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞は、髄腔内に送達される、
    方法。
  48. 請求項４５の方法であって、
    前記ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞は、脳室内に送達される、
    方法。
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