CN117999102A - 腺相关病毒颗粒和其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了包括AAV颗粒的鞘内组合物和其用于治疗单基因肌肉病症，如抗肌萎缩蛋白病，包含杜兴氏肌肉萎缩症(Duchenne muscular dystrophy)的用途。
Description
相关申请交叉引用
本申请要求于2021年8月5日提交的美国临时申请序列第63/229,936号以及于2021年9月1日提交的美国临时申请第63/239,881号的优先权，所述美国临时申请中的每一个的内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及用于递送微抗肌萎缩蛋白转基因的腺相关病毒(AAV)颗粒、产生AAV颗粒的方法、产生AAV颗粒的细胞，以及使用AAV颗粒将微抗肌萎缩蛋白转基因递送到骨骼肌和/或心肌以治疗抗肌萎缩蛋白病(例如杜兴氏肌肉萎缩症(Duchenne musculardystrophy))的方法。
序列表的并入
与本申请相关的序列表以XML格式代替纸质副本提供并特此通过引用并入本说明书中。含有序列表的XML文件的名称是INMD_166_02WO_SeqList_ST26.xml。所述XML文件为大约40,532字节，于2022年8月3日创建，并且正通过USPTO专利中心以电子方式提交。
背景技术
杜兴氏肌肉萎缩症(DMD)以X连锁隐性模式遗传，并且由阻止身体产生抗肌萎缩蛋白(肌肉正常工作所需的蛋白质)的遗传突变引起。DMD的部分特征在于进行性肌肉退化。随着疾病进展，DMD最初影响大腿、骨盆和手臂中的肌肉，最终影响所有随意肌，并在后期阶段涉及心脏和呼吸肌。在欧洲和北美，DMD的流行率为大约3,600个男性婴儿中的1个。DMD是最常见的儿童期肌肉萎缩症发作形式，并且几乎仅影响男性。没有已知的针对DMD的治疗方法，并且目前的治疗标准主要针对症状的管理，包含：类固醇、免疫抑制剂、抗惊厥剂、支架、矫正外科手术和辅助通气。与DMD相关的扩张型心肌病的积极管理包含在严重情况下的抗充血药物和心脏移植。
基因疗法是迅速加快的治疗方法，其中核酸被递送到携带突变或非功能性基因的细胞以校正突变细胞中的缺陷。在某些基因疗法中，核酸被包装在将核酸递送到细胞的腺相关病毒(AAV)内。一旦在细胞核内，核酸然后就指导适当的蛋白质产生，并且病毒被安全地降解。已经提出了用于治疗DMD的基因疗法，但需要递送高全身病毒滴度，从而导致患者毒性，并且由于每个患者需要大量病毒，因此制造成本高。
在动物模型和人中的微抗肌萎缩蛋白(μDys，经修饰但功能性缩短的抗肌萎缩蛋白核酸序列)的递送已被报道促进肌肉功能。μDys转基因被设计以编码427kDa抗肌萎缩蛋白的独特功能性结构域的各种组合。长度通常小于5千碱基的μDys序列先前已使用AAV进行测试以使用mdx小鼠(最广泛用于DMD研究的动物模型)在DMD的鼠模型中递送μDys转基因。mdx小鼠中的突变是外显子23中的中止全长抗肌萎缩蛋白表达的无义点突变(C至T转变)(Sicinski等人(1989)《科学(Science)》244,第1578-1580页，通过引用以其整体并入本文)。尽管已示出递送μDys的前途，但需要新型疗法来治疗DMD。本发明满足了这一需求和其它需求。
发明内容
本发明部分地涉及包括包装(即，衣壳化)微抗肌萎缩蛋白(μDys)转基因的衣壳的腺相关病毒(AAV)颗粒以及用于例如通过鞘内施用用其治疗各种抗肌萎缩蛋白病的方法。在一个实施例中，所述μDys转基因编码μDys多肽，所述μDys多肽包括：(i)包括肌动蛋白结合位点的N末端区(NTD)；(ii)包括三个铰链区和四个血影蛋白重复序列的结构域；以及(iii)富含半胱氨酸的结构域。在一个实施例中，所述μDys转基因包括SEQ ID NO:5中所示的核酸序列。
一方面，提供了一种AAV颗粒，其包括使载体基因组衣壳化的衣壳。在一个实施例中，所述载体基因组从5'至3'包括：5'反向末端重复序列(ITR)；启动子；μDys转基因；SV40poly(A)尾；以及3'ITR。在一个实施例中，所述μDys转基因编码多肽，所述多肽包括：(i)包括肌动蛋白结合位点的N末端区(NTD)；(ii)包括二至四个铰链区和四至六个血影蛋白重复序列的中心杆结构域；以及(iii)富含半胱氨酸的结构域。在另外的实施例中，所述μDys转基因编码μDys多肽，所述μDys多肽包括NTD、铰链区1、2和4以及血影蛋白重复序列1、2、3和24以及富含半胱氨酸的结构域。在甚至另外的实施例中，所述μDys转基因包括SEQ IDNO:5中所示的核酸序列。在一个实施例中，所述AAV颗粒是AAV9颗粒，并且以有效量存在于鞘内组合物中。在一个实施例中，与有效载体基因组量的静脉内(IV)组合物相比，所述有效量的所述AAV颗粒包括约90％或更少的载体基因组，所述IV组合物包括使μDys转基因，例如与所述鞘内组合物中存在的μDys转基因相同的转基因衣壳化的AAV颗粒。
在一个实施例中，所述载体基因组进一步包括位于所述μDys转基因的5'(上游)和位于所述启动子的3'(下游)的SV40内含子。在另一个实施例中，所述载体基因组进一步包括位于所述5'ITR的3'(下游)和位于所述启动子的5'(上游)的增强子。
在一个实施例中，所述启动子是MHCK7或鸡β-肌动蛋白杂合启动子。
在优选的实施例中，所述AAV颗粒是AAV9颗粒，即，所述AAV颗粒包括一种或多种AAV9衣壳蛋白。在一个实施例中，所述AAV9颗粒的衣壳由AAV9衣壳蛋白组成。在又一个实施例中，所述AAV颗粒是AAVrh74颗粒。
在一些实施例中，本发明的重组AAV载体基因组从5'至3'包括：5'ITR；SK-CRM4增强子；启动子；μDys转基因；SV40poly(A)尾；以及3'ITR。在一些实施例中，所述SK-CRM4增强子具有包括SEQ ID NO:8或由其组成的序列。在一些实施例中，所述μDys编码序列编码μDys蛋白，所述μDys蛋白包括肌动蛋白结合结构域和至少四个血影蛋白重复序列，例如四至六个血影蛋白重复序列。在一些实施例中，所述μDys转基因包括SEQ ID NO:5的核酸序列或由其组成。
在一些实施例中，本发明的经衣壳化的载体基因组包括5'AAV2ITR和3'AAV2ITR。在一些实施例中，所述5'AAV2ITR具有包括SEQ ID NO:1或由其组成的序列。在一些实施例中，所述3'AAV2ITR具有包括SEQ ID NO:7或由其组成的序列。
在一些实施例中，经衣壳化的载体基因组包括MHCK7启动子。在一些实施例中，所述MHCK7启动子具有包括SEQ ID NO:2或由其组成的序列。在另一个实施例中，所述启动子是鸡β-肌动蛋白杂合启动子。在另外的实施例中，所述鸡β-肌动蛋白杂合启动子具有SEQID NO:3中所示的核酸序列。
在一些实施例中，本发明的经衣壳化的载体基因组包括SV40内含子，所述SV40内含子具有包括SEQ ID NO:4或由其组成的序列。
在一些实施例中，所述经衣壳化的载体基因组包括SV40poly(A)尾，所述SV40poly(A)尾具有包括SEQ ID NO:6或由其组成的序列。
在一些实施例中，所述AAV颗粒的所述衣壳包括一种或多种AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAVrh.74、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或AAV13衣壳蛋白。在优选的实施例中，所述衣壳是AAV9衣壳，并且所述AAV9衣壳由AAV9衣壳蛋白组成。
另一方面，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的抗肌萎缩蛋白病的方法，所述方法包括以单剂量向所述受试者鞘内施用组合物，所述组合物包括有效量的AAV颗粒中的一种，所述AAV颗粒使包括μDys转基因的载体基因组衣壳化，如本文进一步所述。在一个实施例中，所述抗肌萎缩蛋白病是杜兴氏肌肉萎缩症(DMD)、贝克型肌肉萎缩症(Beckermuscular dystrophy)或DMD相关扩张型心肌病(DCM)。在甚至另外的实施例中，所述抗肌萎缩蛋白病是DMD。在另外的实施例中，与有效量的对应IV组合物(例如，静脉内施用的组合物)相比，所述有效量的所述AAV颗粒包括约90％或更少的载体基因组，所述对应IV组合物包括使包括μDys转基因，例如与鞘内施用的组合物中存在的μDys转基因相同的转基因的载体基因组衣壳化的AAV颗粒。
在一个实施例中，在所述受试者处于特伦德伦伯卧位(Trendelenburg position)时向其施用所述组合物。在另外的实施例中，在不存在非离子、低渗透压造影剂的情况下进行施用。
在治疗本文所述的抗肌萎缩蛋白病的所述方法的一个实施例中，有效剂量的鞘内施用的AAV颗粒提供比相同剂量的静脉内施用的AAV颗粒更大的治疗应答，所述静脉内施用的AAV颗粒使包括μDys转基因，例如与鞘内施用的AAV颗粒中存在的μDys转基因相同的转基因的载体基因组衣壳化。在一个实施例中，所述治疗应答是相对于北极星移动评价量表(NSAA)的基线的增加。
在治疗本文所述的抗肌萎缩蛋白病的所述方法的另一个实施例中，与在第二受试者静脉内施用使包括μDys转基因的载体基因组衣壳化的有效量的对应AAV颗粒时所述第二受试者所经历的副作用的数量或副作用的严重程度相比，鞘内施用使包括μDys转基因的载体基因组衣壳化的有效量的所述AAV颗粒使所述受试者的副作用的数量减少或一种或多种副作用的严重程度降低。在另外的实施例中，所述抗肌萎缩蛋白病是DMD。在甚至另外的实施例中，所述AAV颗粒是AAV9颗粒。
在治疗抗肌萎缩蛋白病的所述方法的甚至另一个实施例中，与肝组织中的μDys转基因表达的量相比，所述有效量的经鞘内施用的AAV颗粒在骨骼肌和/或心肌中提供更大的μDys转基因表达。在另外的实施例中，所述抗肌萎缩蛋白病是DMD。在甚至另外的实施例中，所述AAV颗粒是AAV9颗粒。在甚至又另外的实施例中，所述AAV颗粒使μDys转基因衣壳化，所述μDys转基因具有SEQ ID NO:5中所示的核酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种将μDys转基因优先递送到受试者的骨骼肌和/或心肌的方法。所述方法需要以单剂量向受试者鞘内施用组合物，所述组合物包括有效量的AAV9颗粒，所述AAV9颗粒包括AAV9衣壳和由所述AAV9衣壳衣壳化的包括μDys转基因的载体基因组。所述经衣壳化的基因组从5'至3'包括：5'ITR；启动子；μDys转基因；SV40poly(A)尾；以及3'ITR。在施用后，与所述受试者的肝组织中的所述转基因表达相比，所述μDys转基因在所述受试者的骨骼肌和/或心肌中以更高水平表达。
在本文所述的方法的一些实施例中，与所述受试者的所述骨骼肌和/或所述心肌相比，由所述受试者中的本文所述的AAV颗粒递送的μDys转基因在所述受试者的肝组织中的表达显著更少。在另外的实施例中，在所述受试者的所述骨骼肌和/或所述心肌中的μDys转基因表达比所述肝组织中的μDys转基因表达的所述量大至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％。在另一个实施例中，所述受试者的肝中的μDys转基因表达比所述骨骼肌和/或心肌中的μDys转基因表达的量少至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％。
附图说明
图1A示出了示例性μDys编码基因构建体(INS1201)的示意图。
图1B示出了替代性μDys编码基因构建体(INS1212)的示意图。
图1C示出了克隆到用HindIII/BsaI和SmaI(分别为泳道1和2)限制消化的psZ01载体主链(pSZ01-INS1201)中的INS1201基因构建体，以及克隆到用HindIII/BsaI和SmaI(分别为第3和4泳道)限制消化的psZ01载体主链(pSZ01-INS1212)中的INS1212基因构建体的琼脂糖凝胶电泳。
图2示出了1μl的INS1201-AAV9制剂(泳道1)、1μl的INS1212-AAV9制剂(泳道2)和0.5μl、1μl、2μl和4μl的1×1013个vg/ml AAV2标准品(分别为泳道3、4、5和6)的银染色SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
图3A示出了在肌内注射2.7×1011个vg的INS1201-AAV9(iii)或INS1212-AAV9(iv)后21天从mdx小鼠获得的并且针对抗肌萎缩蛋白进行免疫荧光染色的腓肠肌切片。示出了从未经注射的mdx小鼠(i)和野生型C57/Bl小鼠(ii)获得的并且针对抗肌萎缩蛋白进行免疫荧光染色的腓肠肌切片以进行比较。
图3B示出了在肌内注射2.7×1011载体基因组(vg)的INS1212-AAV9后21天从mdx小鼠获得的并且用DAPI(i)并且针对抗肌萎缩蛋白(ii)进行染色的腓肠肌切片。(iii)中示出了合并图像。
图4A示出了在脑室内(ICV)注射2.7×1011个vg的INS1201-AAV9后21天从mdx小鼠获得的并且针对抗肌萎缩蛋白进行免疫荧光染色的腓肠肌(i)、胫骨前肌(ii)、四头肌(iii)、臀大肌(iv)、三头肌(v)、膈膜(vi)、心脏(vii)和肝(viii)切片。
图4B示出了在脑室内(ICV)注射9×1010个vg的INS1201-AAV9后21天从mdx小鼠获得的并且针对抗肌萎缩蛋白进行免疫荧光染色的腓肠肌(i)、胫骨前肌(ii)、四头肌(iii)、臀大肌(iv)、三头肌(v)、膈膜(vi)、心脏(vii)和肝(viii)切片。
图5示出了在脑室内(ICV)注射9×1010个vg的INS1212-AAV9后21天从mdx小鼠获得的并且针对抗肌萎缩蛋白进行免疫荧光染色的腓肠肌(i)、胫骨前肌(ii)、四头肌(iii)、臀大肌(iv)、三头肌(v)、膈膜(vi)、心脏(vii)和肝(viii)切片。
图6A示出了在脑室内(ICV)注射9×1010个vg(ii)或2.7×1011个vg(iii)的INS1201-AAV9后80天从mdx小鼠获得的并且用苏木精和伊红(H&E)染色的腓肠肌切片。示出了从野生型C57/Bl小鼠(i)和未经注射的mdx小鼠(iv)获得的并且进行H&E染色腓肠肌切片以进行比较。
图6B示出了在脑室内(ICV)注射9×1010个vg(ii)或2.7×1011个vg(iii)的INS1201-AAV9后80天从mdx小鼠获得的并且针对抗肌萎缩蛋白进行染色的腓肠肌切片。示出了从野生型C57/Bl小鼠(i)和未经注射的mdx小鼠(iv)获得的并且针对抗肌萎缩蛋白进行染色的腓肠肌切片以进行比较。
图7A示出了在脑室内(ICV)注射9×1010个vg(ii)的INS1212-AAV9后80天从mdx小鼠获得的并且用苏木精和伊红(H&E)染色的腓肠肌切片。示出了从野生型C57/Bl小鼠(i)和未经注射的mdx小鼠(iii)获得的并且进行H&E染色腓肠肌切片以进行比较。
图7B示出了在脑室内(ICV)注射9×1010个vg(ii)的INS1212-AAV9后80天从mdx小鼠获得的并且针对抗肌萎缩蛋白进行染色的腓肠肌切片。示出了从野生型C57/Bl小鼠(i)和未经注射的mdx小鼠(iii)获得的并且针对抗肌萎缩蛋白进行染色的腓肠肌切片以进行比较。
图8A示出了脑室内(ICV)注射9×1010个vg或2.7×1011个vg的INS1201-AAV9后80天的mdx小鼠的腓肠肌细胞中的平均纤维直径(μm)的条形图。示出了野生型C57/Bl和未经注射的mdx小鼠的腓肠肌细胞中的平均纤维直径(μm)以进行比较。
图8B示出了脑室内(ICV)注射9×1010个vg或2.7×1011个vg的INS1201-AAV9后80天的mdx小鼠的腓肠肌细胞中的细胞直径(μm)的相对频率(％)的线图。示出了野生型C57/Bl和未经注射的mdx小鼠的腓肠肌细胞中的细胞直径的相对频率以进行比较。
图8C示出了脑室内(ICV)注射9×1010个vg或2.7×1011个vg的INS1201-AAV9后80天的mdx小鼠的三头肌细胞中的平均纤维直径(μm)的条形图。示出了野生型C57/Bl和未经注射的mdx小鼠的三头肌细胞中的平均纤维直径(μm)以进行比较。
图8D示出了脑室内(ICV)注射9×1010个vg或2.7×1011个vg的INS1201-AAV9后80天的mdx小鼠的三头肌细胞中的细胞直径(μm)的相对频率(％)的线图。示出了野生型C57/Bl和未经注射的mdx小鼠的三头肌细胞中的细胞直径的相对频率以进行比较。
图8E示出了脑室内(ICV)注射9×1010个vg或2.7×1011个vg的INS1201-AAV9后80天的mdx小鼠的胫骨前肌细胞中的平均纤维直径(μm)的条形图。示出了野生型C57/Bl和未经注射的mdx小鼠的胫骨前肌细胞中的平均纤维直径(μm)以进行比较。
图8F示出了脑室内(ICV)注射9×1010个vg或2.7×1011个vg的INS1201-AAV9后80天的mdx小鼠的胫骨前肌细胞中的细胞直径(μm)的相对频率(％)的线图。示出了野生型C57/Bl和未经注射的mdx小鼠的胫骨前肌细胞中的细胞直径的相对频率以进行比较。
图8G示出了脑室内(ICV)注射9×1010个vg或2.7×1011个vg的INS1201-AAV9后80天的mdx小鼠的膈膜肌细胞中的平均纤维直径(μm)的条形图。示出了野生型C57/Bl和未经注射的mdx小鼠的膈膜肌细胞中的平均纤维直径(μm)以进行比较。
图8H示出了脑室内(ICV)注射9×1010个vg或2.7×1011个vg的INS1201-AAV9后80天的mdx小鼠的膈膜肌细胞中的细胞直径(以μm为单位)的相对频率(％)的线图。示出了野生型C57/Bl和未经注射的mdx小鼠的膈膜肌细胞中的细胞直径的相对频率以进行比较。
图9A示出了脑室内(ICV)注射9×1010个vg的INS1212-AAV9后80天的mdx小鼠的腓肠肌细胞中的平均纤维直径(μm)的条形图。示出了野生型C57/Bl和未经注射的mdx小鼠的膈膜肌细胞中的平均纤维直径(μm)以进行比较。
图9B示出了脑室内(ICV)注射9×1010个vg的INS1212-AAV9后80天的mdx小鼠的腓肠肌细胞中的细胞直径(μm)的相对频率(％)的线图。示出了野生型C57/Bl和未经注射的mdx小鼠的膈膜肌细胞中的细胞直径的相对频率以进行比较。
图10A是野生型C57/Bl小鼠、在出生后第1天(p1)接受媒剂脑室内注射(ICV)的mdx小鼠、在出生后第1天p1接受ICV注射2.7×1011个vg的INS1201-AAV9的mdx小鼠以及在p1接受ICV注射9×1010个vg的INS1201-AAV9的mdx小鼠中由离心收缩(EC)引起的EDL肌肉中的收缩力百分比的线图。
图10B是(i)野生型C57/Bl小鼠以及在出生后第1天(p1)接受脑室内(ICV)注射(ii)9×109个vg的INS1201-AAV9、(iii)9×1010个vg的INS1201-AAV9、(iv)2.7×1011个vg的INS1201-AAV9或(v)媒剂控制的mdx小鼠中EDL肌肉中后离心收缩(EC)应力相对于前EC应力的百分比的条形图。
图10C是示出(i)野生型C57/Bl小鼠以及在出生后第28天(p28)接受脑室内(ICV)注射(ii)9×1010个vg的INS1201-AAV9、(iii)2.7×1011个vg的INS1201-AAV9、(iv)5.4×1011个vg的INS1201-AAV9、(v)1.2×1012个vg的INS1201-AAV9或(vi)媒剂对照的mdx小鼠中EDL肌肉中的收缩力百分比(离心收缩1(EC1)％)随离心收缩(EC)数量变化的图。
图10D是示出(i)野生型C57/Bl小鼠以及在出生后第28天(p28)接受脑室内(ICV)注射(ii)9×1010个vg的INS1201-AAV9、(iii)2.7×1011个vg的INS1201-AAV9、(iv)5.4×1011个vg的INS1201-AAV9、(v)1.2×1012个vg的INS1201-AAV9或(vi)媒剂对照的mdx小鼠的EDL肌肉中的力百分比(后EC5/后EC1)的条形图。
图10E是示出(i)野生型C57/Bl小鼠以及在出生后第28天(p28)接受脑室内(ICV)注射(ii)9×109个vg的INS1201-AAV9、(iii)9×1010个vg的INS1201-AAV9、(iv)2.7×1011个vg的INS1201-AAV9、(v)5.4×1011个vg的INS1201-AAV9、(vi)1.2×1012个vg的INS1201-AAV9或(vii)媒剂对照的mdx小鼠中由离心收缩(EC)引起的EDL肌肉中的最大张力(kPa)的图。
图10F是示出(i)野生型C57/Bl小鼠以及在出生后第28天(p28)接受脑室内(ICV)注射(ii)9×109个vg的INS1201-AAV9、(iii)9×1010个vg的INS1201-AAV9、(iv)2.7×1011个vg的INS1201-AAV9、(v)5.4×1011个vg的INS1201-AAV9、(vi)1.2×1012个vg的INS1201-AAV9或(vii)媒剂对照的mdx小鼠中由不同频率(Hz)下的离心收缩(EC)引起的峰值应力(kPa)的图。
图11A示出了从未经注射的食蟹猴(i)、静脉内(IV)注射5×1013个vg(ii)或1×1014个vg(iii)的AAV9CBA-GFP后21天的食蟹猴、或鞘内(IT)注射2.5×1013个vg(iv)、5×1013个vg(v)或1×1014个vg(vi)的AAV9CBA-GFP后21天的食蟹猴获得的并且用NovaRedTM进行免疫染色以用于检测GFP表达的腓肠肌切片。
图11B示出了从未经注射的食蟹猴(i)、静脉内(IV)注射5×1013个vg(ii)或1×1014个vg(iii)的AAV9CBA-GFP后21天的食蟹猴、或鞘内(IT)注射2.5×1013个vg(iv)、5×1013个vg(v)或1×1014个vg(vi)的AAV9CBA-GFP后21天的食蟹猴获得的并且用NovaRedTM进行免疫染色以用于检测GFP表达的四头肌切片。
图11C示出了从未经注射的食蟹猴(i)、静脉内(IV)注射5×1013个vg(ii)或1×1014个vg(iii)的AAV9CBA-GFP后21天的食蟹猴、或鞘内(IT)注射2.5×1013个vg(iv)、5×1013个vg(v)或1×1014个vg(vi)的AAV9CBA-GFP后21天的食蟹猴获得的并且用NovaRedTM进行免疫染色以用于检测GFP表达的三角肌切片。
图11D示出了从未经注射的食蟹猴(i)、静脉内(IV)注射5×1013个vg(ii)或1×1014个vg(iii)的AAV9CBA-GFP后21天的食蟹猴、或鞘内(IT)注射2.5×1013个vg(iv)、5×1013个vg(v)或1×1014个vg(vi)的AAV9CBA-GFP后21天的食蟹猴获得的并且用NovaRedTM进行免疫染色以用于检测GFP表达的三头肌切片。
图11E示出了从未经注射的食蟹猴(i)、静脉内(IV)注射5×1013个vg(ii)或1×1014个vg(iii)的AAV9CBA-GFP后21天的食蟹猴、或鞘内(IT)注射2.5×1013个vg(iv)、5×1013个vg(v)或1×1014个vg(vi)的AAV9CBA-GFP后21天的食蟹猴获得的并且用NovaRedTM进行免疫染色以用于检测GFP表达的二头肌切片。
图11F示出了从静脉内(IV)注射5×1013个vg(i)或1×1014个vg(ii)的AAV9CBA-GFP后21天的食蟹猴、或鞘内(IT)注射2.5×1013个vg(iii)、5×1013个vg(iv)或1×1014个vg(v)的AAV9CBA-GFP后21天的食蟹猴获得的并且用NovaRedTM进行免疫染色以用于检测GFP表达的胫骨前肌切片。
图11G示出了从静脉内(IV)注射5×1013个vg(i)或1×1014个vg(ii)的AAV9CBA-GFP后21天的食蟹猴、或鞘内(IT)注射2.5×1013个vg(iii)、5×1013个vg(iv)或1×1014个vg(v)的AAV9CBA-GFP后21天的食蟹猴获得的并且用NovaRedTM进行免疫染色以用于检测GFP表达的膈膜肌切片。
图11H示出了从静脉内(IV)注射5×1013个vg(i)或1×1014个vg(ii)的AAV9CBA-GFP后21天的食蟹猴、或鞘内(IT)注射2.5×1013个vg(iii)、5×1013个vg(iv)或1×1014个vg(v)的AAV9CBA-GFP后21天的食蟹猴获得的并且用NovaRedTM进行免疫染色以用于检测GFP表达的心肌切片。
图11I示出了从静脉内(IV)注射5×1013个vg(i)或1×1014个vg(ii)的AAV9CBA-GFP后21天的食蟹猴、或鞘内(IT)注射2.5×1013个vg(iii)、5×1013个vg(iv)或1×1014个vg(v)的AAV9CBA-GFP后21天的食蟹猴获得的并且用NovaRedTM进行免疫染色以用于检测GFP表达的肝切片。
图12A示出了鞘内(IT)注射2.5×1013个vg的AAV9CBA-GFP后21天从食蟹猴获得的并且用抗GFP抗体探测的二头肌(1)、三头肌(2)、三角肌(3)、四头肌(4)、腓肠肌(5)、胫骨前肌(6)、膈膜(7)和心脏(8)肌肉蛋白样品的丽春红染色(Ponceau stain)(上图)或蛋白质印迹(Western Blot)(下图)。
图12B示出了鞘内(IT)注射5×1013个vg的AAV9CBA-GFP后21天从食蟹猴获得的并且用抗GFP抗体探测的二头肌(1)、三头肌(2)、三角肌(3)、四头肌(4)、腓肠肌(5)、胫骨前肌(6)、膈膜(7)和心脏(8)肌肉蛋白样品的丽春红染色(上图)或蛋白质印迹(下图)。
图12C示出了鞘内(IT)注射1×1014个vg的AAV9CBA-GFP后21天从食蟹猴获得的并且用抗GFP抗体探测的二头肌(1)、三头肌(2)、三角肌(3)、四头肌(4)、腓肠肌(5)、胫骨前肌(6)、膈膜(7)和心脏(8)肌肉蛋白样品的丽春红染色(上图)或蛋白质印迹(下图)。
图12D示出了从未经注射的食蟹猴获得的并且用抗GFP抗体探测的二头肌(1)和三头肌(2)肌肉蛋白样品的丽春红染色(上图)或蛋白质印迹。
图13示出了在鞘内(IT)注射2.5×1013个vg的AAV9CBA-GFP后21天从食蟹猴获得的并且在存在(+)或不存在(-)逆转录酶的情况下经受RT-PCR的二头肌(1)、三头肌(2)、三角肌(3)、胫骨前肌(4)、腓肠肌(5)、四头肌股外侧肌(6)、膈膜(7)和心脏(8)肌肉和肝(9)组织样品的琼脂糖凝胶电泳。示出了从未经注射的食蟹猴获得的并且在存在(+)或不存在(-)逆转录酶的情况下经受RT-PCR的二头肌(10)、三头肌(11)、三角肌(12)和四头肌(13)肌肉组织样品以用于比较。
图14示出了由本文所提供的μDys转基因编码的各种μDys蛋白结构域。
图15是示出在出生后第28天(p28)接受脑室内(ICV)注射(ii)9×109个vg的INS1201-AAV9、(iii)9×1010个vg的INS1201-AAV9、(iv)2.7×1011个vg的INS1201-AAV9、(v)5.4×1011个vg的INS1201-AAV9、(vi)1.2×1012个vg的INS1201-AAV9或(vii)媒剂对照的mdx小鼠中的每二倍体基因组的INS1201DNA拷贝数量的图。
图16是示出在出生后第28天(p28)接受脑室内(ICV)注射(ii)9×109个vg的INS1201-AAV9、(iii)9×1010个vg的INS1201-AAV9、(iv)2.7×1011个vg的INS1201-AAV9、(v)5.4×1011个vg的INS1201-AAV9、(vi)1.2×1012个vg的INS1201-AAV9或(vii)媒剂对照的mdx小鼠中的相对于RPP30的拷贝数归一化的INS1201RNA转录物拷贝数量的图。
图17是示出(i)野生型C57/Bl小鼠以及在出生后第28天(p28)接受脑室内(ICV)注射(ii)9×109个vg的INS1201-AAV9、(iii)9×1010个vg的INS1201-AAV9、(iv)2.7×1011个vg的INS1201-AAV9、(v)5.4×1011个vg的INS1201-AAV9、(vi)1.2×1012个vg的INS1201-AAV9或(vii)媒剂对照的mdx小鼠中的在出生后第120天(p120)的EDL肌细胞中的平均纤维直径(μm)的图。
图18是示出(i)野生型C57/Bl小鼠以及在出生后第28天(p28)接受脑室内(ICV)注射(ii)9×109个vg的INS1201-AAV9、(iii)9×1010个vg的INS1201-AAV9、(iv)2.7×1011个vg的INS1201-AAV9、(v)5.4×1011个vg的INS1201-AAV9、(vi)1.2×1012个vg的INS1201-AAV9或(vii)媒剂对照的mdx小鼠中的在出生后第120天(p120)的胫骨前肌细胞中的平均纤维直径(μm)的图。
图19示出了脑室内(ICV)注射各种剂量的INS1201-AAV9后用天狼猩红(picrosirius red)染色的膈膜肌切片。在顶部示出了从野生型C57/Bl小鼠和被施用媒剂的mdx小鼠获得的膈膜切片以进行比较。
图20是示出(i)野生型C57/Bl小鼠以及在出生后第28天(p28)接受脑室内(ICV)注射(ii)媒剂对照、(iii)9×109个vg的INS1201-AAV9、(iv)9×1010个vg的INS1201-AAV9、(v)2.7×1011个vg的INS1201-AAV9、(v)5.4×1011个vg的INS1201-AAV9或(vi)1.2×1012个vg的INS1201-AAV9的mdx小鼠中的在出生后第120天(p120)的膈膜肌中的胶原蛋白百分比的图。
图21的顶部示出了在于p28时脑室内(ICV)注射5.4×1011个vg的INS1201-AAV9之后在出生后第120天(p120)从mdx小鼠获得的并且用苏木精和伊红(H&E)染色的(最左)、层粘连蛋白/dapi染色的(左起第二)、抗肌萎缩蛋白(右起第二)以及合并图像(最右)的趾长伸肌(EDL)切片。图21的底部示出了在于p28时脑室内(ICV)注射5个媒剂对照之后在出生后第120天(p120)从mdx小鼠获得的并且用苏木精和伊红(H&E)染色的(最左)、层粘连蛋白/dapi染色的(左起第二)、抗肌萎缩蛋白(右起第二)以及合并图像(最右)的EDL肌切片。
具体实施方式
本发明部分地涉及腺相关病毒(AAV)颗粒以及用于将其优先递送到需要治疗单基因肌肉病症(例如，抗肌萎缩蛋白病，如杜兴氏肌肉萎缩症(DMD)、贝克型肌肉萎缩症或DMD相关扩张型心肌病(DCM))的受试者的心肌和/或骨骼肌的方法。不希望受理论约束，所述颗粒和用于将其递送到有需要的受试者中，例如以治疗单基因肌肉病症(如抗肌萎缩蛋白病)的方法提供了至少由于本发明比已知的AAV颗粒和治疗方法更优的益处：(i)使得具有比IV递送显著更低的剂量以实现基本上相同或更好的治疗益处，从而减少病毒载量和毒性以及其它副作用；和/或(ii)使得具有与肝组织相比在心肌和/或骨骼肌组织中的优先转基因靶向和表达，由此将所述转基因靶向到所关注的细胞，以提供与静脉内递送的AAV载体相比更大的治疗益处；(iii)与IV调配物相比由于所需的剂量较低，对应的制备负担降低，可以有益于更多患者群体。
本发明的各方面涉及AAV颗粒、用于产生其的方法和用于将AAV颗粒递送到需要治疗的受试者的方法。AAV颗粒(例如，AAV9颗粒)包括包括一种或多种AAV9衣壳蛋白的衣壳和由AAV9衣壳衣壳化的载体基因组。载体基因组包括转基因和调控元件，所述调控元件当递送到肌细胞(例如骨骼肌和/或心肌细胞)时促进转基因的基因表达。在一个实施例中，所述转基因是微抗肌萎缩蛋白(μDys)转基因。
本文所述的方法包括以单剂量向需要治疗抗肌萎缩蛋白病的受试者鞘内施用包括有效量的如本文所述的AAV颗粒的组合物。在一个实施例中，所述抗肌萎缩蛋白病是DMD、贝克型肌肉萎缩症或DCM。在优选的实施例中，所述抗肌萎缩蛋白病是DMD。在本文所述的实施例中，将本发明的AAV颗粒鞘内递送到肌细胞可以使μDys稳健表达，并且可以显著改善肌肉健康和功能。本发明还提供了用于产生本文所述的AAV颗粒的方法和细胞。在本文所述的方法的一个实施例中，在AAV颗粒的鞘内施用之后，与受试者的肝组织中的转基因表达相比，所述转基因在所述受试者的所述骨骼肌和/或所述心肌中以更高水平表达。
为了便于理解本发明，下文对多个术语和短语进行了定义。
如本文所使用的，术语“一个(a)”和“一种(an)”意指“一个或多个”，并且包含复数，除非上下文不合适。
术语“核酸”、“核苷酸”或“寡核苷酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非具体限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述已知类似物具有与参考核酸类似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸类似的方式代谢。除非另外指出，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其经保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可以通过生成序列来实现，其中一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人,《核酸研究(Nucleic AcidRes.)》19:5081(1991)；Ohtsuka等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》260:2605-2608(1985)；以及Rossolini等人,《分子与细胞探测(Mol.Cell.Probes)》8:91-98(1994))。
术语“基因”可以指参与产生或编码多肽链的DNA的区段。其可以包含编码区之前和之后的区(前导区和尾区)以及单个编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。可替代地，术语“基因”可以指涉及产生或编码非翻译RNA，如rRNA、tRNA、向导RNA(gRNA)、短干扰RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)的DNA的区段。
如本文所使用的，术语“转基因”是指人工引入到细胞的基因组中的载体基因组中存在的外源基因，或人工引入到细胞的基因组中的非天然基因座中的内源基因。转基因可以指参与产生或编码多肽链的DNA的区段。转基因可以包含编码区之前和之后的区(前导区和尾区)以及单个编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。根据本文所述的实施例的转基因是μDys。在一个实施例中，所述μDys转基因编码μDys多肽，所述μDys多肽包括N末端区、约二至三个铰链区、约四至六个血影蛋白重复序列和富含半胱氨酸的结构域。
如本文所使用的，“载体基因组”是包括一个或多个异源核酸序列的核酸基因组。所述一个或多个异源核酸序列包括转基因。在本发明的一些实施例中，所述载体基因组包括至少一个ITR序列(例如，AAV ITR序列)，任选地两个ITR(例如，两个AAV ITR)，其通常将位于载体基因组的5'和3'端处并且侧接一个或多个异源核酸。ITR可以彼此相同或不同。
如本文所使用的，关于核酸，例如基因或细胞中的蛋白质的术语“内源”是如其在自然界，例如在其天然基因组位置或基因座处中发现的那样，所述特定细胞中存在的核酸或蛋白质。此外，“内源性表达”核酸或蛋白质的细胞表达如其在自然界中发现的核酸或蛋白质。
“启动子”被定义为一个或多个核酸调控序列，其指导核酸(例如转基因)的转录，并且可以存在于载体基因组内。如本文所使用的，启动子包含位于转录起始位点附近的核酸序列。启动子还任选地包含远侧增强子或阻遏元件，其可以位于距转录起始位点多达数千个碱基对处。
如本文所使用的，“调控元件”是指能够调节基因(例如转基因)的转录和/或调节经转录的mRNA产物的稳定性或翻译并且可以存在于载体基因组内的核酸序列。在一些实施例中，调控元件可以调节基因的组织特异性转录。调控元件可以包括至少一个转录因子结合位点，例如肌肉特异性转录因子的转录因子结合位点。当与在不存在调控元件的情况下仅由启动子转录基因相比时，如本文所使用的调控元件增加或增强经启动子驱动的基因表达。如本文所使用的调控元件可以在距其调节的转基因的任何距离(即，近侧或远侧)处发生。如本文所使用的调控元件可以包括参与转录调控的较大序列的一部分，例如，启动子序列的一部分。然而，仅调控元件通常不足以单独启动转录，并且需要启动子的存在。
当核酸被放置成与另一核酸序列处于功能关系中时，所述核酸是“可操作地连接的”。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位成便于翻译，则其与编码序列可操作地连接。
“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指氨基酸残基的聚合物。如本文所使用的，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，包含全长蛋白质和其功能性片段，其中所述氨基酸残基通过共价肽键连接。
如本文所使用的，术语“互补”或“互补性”是指核苷酸或核酸之间的特异性碱基配对。互补核苷酸通常是A和T(或A和U)以及G和C。本文所述的向导RNA(gRNA)可以包括序列，例如与基因组序列完全互补或基本上互补(例如，具有小部分错配碱基)的DNA靶向序列。
如本文所使用的，在核酸(例如，AAV载体)的上下文中的术语“引入”或“递送”是指将核酸从细胞(例如，肌细胞)外部易位到细胞内部。在一些情况下，引入是指将核酸从细胞外部易位到细胞的核内部。设想了此类易位的各种方法，包含但不限于电穿孔、与纳米线或纳米管接触、受体介导的内化、经由细胞穿透肽的易位、脂质体介导的易位等。
如本文所使用的，术语“经包装”或“经衣壳化”是指在包括病毒衣壳蛋白的衣壳中包含载体基因组以形成AAV颗粒。
如在多核苷酸或多肽序列的上下文中所使用的，术语“基本上同一性”或“基本上相同”是指与参考序列具有至少60％序列同一性的序列。可替代地，同一性百分比可以是60％至100％的任何整数。示例性实施例包含与使用本文所述的程序的参考序列相比，至少：60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；优选地使用标准参数的BLAST，如下所述。本领域技术人员将认识到可以通过考虑密码子简并性、氨基酸类似性、阅读框定位等来适当地调整这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的对应同一性。
为了进行序列比较，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，指定子序列坐标(如有必要)，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代性参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
适用于确定序列同一性和序列类似性百分比的算法是BLAST和BLAST 2.0算法，所述算法分别描述于：Altschul等人(1990)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》215:403-410和Altschul等人(1977)《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》25:3389-3402。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(NCBI)网站公开获得。此算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字进行对齐时，所述序列对匹配或满足某一正值阈值评分T。T被称作邻域字评分阈值(Altschul等人,同上)。这些初始邻域字命中充当用于启动搜索的种子以找到含有所述初始邻域字命中的较长HSP。然后字命中沿每个序列在两个方向上扩展，直到累积比对评分可以增加为止。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励评分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)来计算累积评分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积评分。当出现以下情况时，在每个方向上的字命中扩展将停止：累积比对评分从其最大实现值下降了数量X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积评分变为零或更低；或者到达任一序列的端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字大小(W)为28、期望值(E)为10、M＝1、N＝-2以及对两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字大小(W)为3、期望值(E)为10和BLOSUM62评分矩阵作为默认值(参见Henikoff和Henikoff,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》89:10915(1989))。
BLAST算法还对两个序列之间的类似性进行统计分析(参见例如，Karlin和Altschul,《美国国家科学院院刊》90:5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的一种类似性量度是最小总和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率小于约0.01，更优选地小于约10-5，并且最优选地小于约10-20，则核酸被认为与参考序列类似。
如本文所使用的，术语“受试者”和“患者”是指通过本文所述的方法和组合物治疗的生物体。此类生物体包含但不限于哺乳动物，如人、猿、鼠、马、牛、猪、犬、猫等。在一些实施例中，所述受试者或患者是人。在一个实施例中，本文所提供的治疗方法中的受试者是男性受试者。
在其中受试者是男性人类的实施例中，所述男性人类受试者为约4岁至约7岁、新生儿、约1岁至约7岁、约2岁至约7岁、约2岁至约6岁、约2岁至约5岁、约2岁至约4岁、约3岁至约7岁、约3岁至约6岁、约1月龄至约6岁、约1月龄至约5岁、约1月龄至约4岁、约1月龄至约3岁、约1月龄至约2岁或约1月龄至约12月龄。
在一个实施例中，所述受试者是约4岁至约7岁的男性人类患者。在一个实施例中，所述受试者是约3岁至约7岁的男性人类患者。在一个实施例中，所述受试者是约2岁至约7岁的男性人类患者。
如本文所使用的，术语“有效递送”或“有效地递送”是指AAV颗粒的施用，所述AAV颗粒包括使载体基因组衣壳化的AAV衣壳，所述载体基因组编码转基因，使得所述转基因在所需细胞或组织中表达。
如本文所使用的，术语“有效量”或“有效剂量”是指足以实现有益或期望的结果(例如，蛋白质的表达或期望的预防或治疗效果)的物质(例如，本发明的AAV颗粒)的量。有效量可以一种或多种施用方案、应用或剂量施用，并且不限于特定的调配物或施用途径。在剂量以“载体基因组”提供的情况下，“有效剂量”在本文中可以被称为“有效载体基因组剂量”。
如本文所使用的，术语“治疗”包含使病状、疾病、病症等改善或减轻其症状的任何效果，例如，缓解、减少、调节、减轻或消除。
贯穿本说明书，在组合物被描述为具有、包含或包括具体组分的情况下或在过程和方法被描述为具有、包含或包括具体步骤的情况下，另外设想的是，存在基本上由所述组分组成或由所述组分组成的本发明的组合物，并且存在基本上由所述处理步骤组成或由所述处理步骤组成的根据本发明的过程和方法。
腺相关病毒(AAV)颗粒
如本文所述，本发明的一方面涉及一种AAV颗粒，其包括一种或多种AAV衣壳蛋白和由所述一种或多种衣壳蛋白衣壳化的载体基因组；以及包括其的鞘内组合物。所述基因组从5'至3'包括：5'反向末端重复序列(ITR)、启动子、转基因、SV40poly(A)尾以及3'ITR。在一个实施例中，在鞘内施用于需要治疗的受试者时，与所述受试者的肝组织中的转基因表达相比，所述转基因在所述受试者的骨骼肌和/或心肌中以更高水平表达。在另一个实施例中，由本文所述的AAV颗粒提供的[(骨骼肌和/或心肌转基因表达)]/(肝转基因表达)]的比率比在静脉内施用所述相同剂量的所述相同AAV颗粒时的同一比率更大。在一个优选的实施例中，所述AAV颗粒是包括一种或多种AAV9衣壳蛋白的AAV9颗粒。
如本文所使用的，“腺相关病毒(AAV)颗粒”是指包括AAV衣壳和由AAV衣壳衣壳化的载体基因组的AAV病毒粒子。载体基因组通常包括侧接有AAV ITR序列的启动子和一个或多个转基因。AAV衣壳包括一种或多种AAV衣壳蛋白。AAV衣壳蛋白可以来自相同或不同的AAV血清型，并且可以是野生型或经工程化的。本文所述的载体基因组可以被复制，并当被引入到宿主细胞时包装到病毒载体(颗粒)，所述宿主细胞还包括一个或多个编码rep和cap基因产物的质粒。在一个实施例中，辅助质粒也被转染到宿主细胞中以帮助由宿主细胞产生载体。在一个实施例中，本文所用的AAV载体是AAV9载体，例如，如美国专利第7,906,111号中所述，所述美国专利的公开内容出于所有目的通过引用以其整体并入本文。在一个实施例中，所述AAV衣壳是AAV9衣壳。
术语“空衣壳”、“空小瓶颗粒”和“空AAV”是指缺乏包装在其内的载体基因组的AAV衣壳外壳。
本文所述的经衣壳化的载体基因组可以包含一个或多个调控元件，例如转基因上游的一个或多个调控元件。在一个实施例中，所述经衣壳化的基因组从5'至3'包括：5'ITR、启动子、转基因、SV40poly(A)尾；以及3'ITR。在另一个实施例中，所述经衣壳化的基因组从5'至3'包括：5'ITR、增强子、启动子、转基因、SV40poly(A)尾；以及3'ITR。在甚至另一个实施例中，所述经衣壳化的基因组从5'至3'包括：5'ITR、启动子、SV40内含子、转基因、SV40poly(A)尾；以及3'ITR。在甚至又一个实施例中，所述经衣壳化的基因组从5'至3'包括：5'ITR、增强子、启动子、SV40内含子、转基因、SV40poly(A)尾；以及3'ITR。
反向末端重复序列
反向末端重复序列(ITR)是侧接转基因的回文145个核苷酸序列。AAV载体基因组的5'和3'ITR对于将转基因整合到宿主细胞基因组(例如，人体中的19号染色体)和将转基因衣壳化到AAV颗粒中都是必需的。
在一些实施例中，本发明的AAV载体基因组包括来自任一种AAV血清型，例如AAVrh.74、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或AAV13的ITR序列。在一些实施例中，本文公开的AAV载体基因组包括5'AAV2ITR和3'AAV2ITR序列。
在一些实施例中，本文所述的AAV载体基因组包括与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的5'AAV2ITR(参见表1)。在一些实施例中，所述5'AAV2ITR包括SEQ ID NO:1。在一些实施例中，所述5'AAV2ITR由SEQ ID NO:1组成。
在一些实施例中，本文所述的AAV载体基因组包括与SEQ ID NO:7具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的3'AAV2ITR(参见表1)。在一些实施例中，所述3'AAV2ITR包括SEQ ID NO:7。在一些实施例中，所述3'AAV2ITR由SEQ ID NO:7组成。
启动子
启动子驱动转基因的表达，并且通常位于其调节转基因的表达的所述转基因的上游(或5')。
在一些实施例中，本发明的AAV载体基因组包括哺乳动物启动子，例如，人、非人灵长类动物(例如，食蟹猴)、小鼠、马、牛、猪、猫和狗启动子。在一些实施例中，本文公开的重组AAV载体基因组包括强的组成型活性启动子以驱动转基因的高水平表达。例如，在一些实施例中，所述启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子/增强子、延伸因子1α(EF1α)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、鸡β-肌动蛋白杂合启动子或CAG启动子。
在一个实施例中，所述启动子是MHCK7或鸡β-肌动蛋白杂合启动子。
在某些实施例中，本发明的AAV载体基因组包括肌肉特异性启动子，所述肌肉特异性启动子与转基因可操作地连接以驱动肌细胞中高水平和组织特异性表达。例如，本发明的肌肉特异性启动子包含但不限于选自以下的启动子：结蛋白(DES，也被称为CSM1或CSM2)启动子；α2辅肌动蛋白(ACTN2，也被称为CMD1AA)启动子；细丝蛋白-C(FLNC，也被称为肌动蛋白结合样蛋白(ABLP)、细丝蛋白-2(FLN2)、ABP-280、ABP280A、ABPA、ABPL、MFM5或MPD4)启动子；肌质/内质网钙ATP酶1(ATP2A1，也被称为ATP2A或SERCA1)启动子；1型肌钙蛋白I(TNNI1，也被称为SSTNI或25TTNI)启动子；肌球蛋白-1(MYH1)启动子，即可磷酸化的快速骨骼肌肌球蛋白轻链(MYLPF)启动子；肌球蛋白1(MYH1，也被称为MYHSA1、MYHa、MyC-2X/D或MyHC-2x)启动子；α-3链原肌球蛋白(TPM3，也被称为CFTD、NEM1、OK/Scl.5、TM-5、TM3、TM30、TM30nm、TM5、TPMsk3、TRK、h TM5或hscp30)启动子；含锚蛋白重复序列结构域的蛋白质2(ANKRD2，也被称为ARPP)启动子；肌球蛋白重链(MHC)启动子；肌球蛋白轻链(MLC)启动子；肌肉肌酸激酶(MCK)启动子，即合成肌肉启动子，如Li等人(1999.《自然生物技术(NatBiotechnol.)》17:241-245)中所述，如SPc5-12启动子、肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、dMCK启动子、tMCK启动子，其分别由MCK增强子与MCK基础启动子的双链或三链串联组成，如Wang等人(2008.《基因疗法(Gene Ther.)》15:1489-1499)中所述；以及杂合启动子，如杂合α-肌球蛋白重链增强子/MCK增强子(MHCK7；770bp)；MCK-C5-12启动子，如Wang等人(2008.《基因疗法》15:1489-1499)中所述；以及心肌和骨骼肌特异性肌球蛋白伴侣蛋白Unc45b(195bp)启动子，如Rudeck S等人(2016,《创世纪(Genesis.)》54(8):431-8)中所述。心脏特异性启动子的非限制性实例包含：肌钙集蛋白2(也被称为PDIB2、FLJ26321、FLJ93514或CASQ2(引用人基因的GeneID 845))启动子；锚蛋白重复序列结构域1(也被称为心脏锚蛋白重复序列蛋白)启动子；细胞因子诱导型核蛋白启动子；肝锚蛋白重复序列结构域1(ANKRD1；用于人基因的GeneID 27063)启动子；肌球蛋白，轻链2、调控心脏缓慢(MYL2；用于人基因的GeneID4633)启动子；肌球蛋白，轻链3，碱；心室、骨骼10缓慢(MYL3；用于人基因的GeneID 4634)启动子；含有7的溴结构域(也被称为BP75、CELTIX1、NAG4(BRD7；用于人基因的GeneID29117))启动子；α肌球蛋白重链(αMHC)启动子；心脏肌钙蛋白C启动子；以及所述心脏钠-钙交换剂(NCX1)的启动子，这赋予了心脏特异性。
在一些实施例中，本文所述的AAV载体基因组包括MHCK7启动子。例如，在一些实施例中，所述MHCK7启动子与SEQ ID NO:2具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性(参见表1)。在一些实施例中，所述MHCK7启动子包括SEQ IDNO:2。在一些实施例中，所述MHCK7启动子由SEQ ID NO:2组成。
SV40内含子
在一些实施例中，本发明的AAV载体基因组包括SV40内含子。SV40内含子是基因疗法载体中常用的调控元件，并且增强所表达的RNA转录物的翻译和稳定性。
在某些实施例中，所述SV40内含子位于启动子的下游(即，3')并且位于转基因的上游(即，5')。在其它实施例中，所述SV40内含子可以位于转基因的下游(即，3')。
在一些实施例中，所述SV40内含子与SEQ ID NO:4具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性(参见表1)。在一些实施例中，所述SV40内含子包括SEQ ID NO:4。在一些实施例中，所述SV40内含子由SEQ IDNO:4组成。
SV40-poly(A)尾
在一些实施例中，本发明的AAV载体基因组包括编码SV40poly(A)尾的核酸序列。SV40-poly(A)尾序列是基因疗法载体中常用的核酸元件，其有助于RNA从核输出、RNA的翻译和RNA稳定性。
在一些实施例中，本发明的AAV载体基因组包括编码SV40poly(A)尾的序列，所述序列与SEQ ID NO:6具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性(参见表1)。在一些实施例中，编码SV40poly(A)尾的序列包括SEQ ID NO:6。在一些实施例中，编码SV40poly(A)尾的序列由SEQ ID NO:6组成。
增强子
在一些实施例中，本发明的AAV载体基因组包括一个或多个增强子序列。在一个实施例中，增强子序列可以例如通过充当转录因子和共调节剂的结合位点来增加转基因的转录水平，这有助于DNA环化并将转录机制募集到启动子。
在一些实施例中，所述增强子位于5'ITR的下游(即，3')并且位于启动子的上游(即，5')。在一些实施例中，所述增强子位于启动子的下游(即，3')并且位于转基因的上游(即，5')。在一些实施例中，所述增强子位于转基因的下游(即，3')并且位于3'UTR的上游(即，5')。
在一些实施例中，本发明的重组AAV载体基因组包括增强子，所述增强子显著促进转基因在肌细胞，例如骨骼肌和/或心肌细胞中的转录。
在一些实施例中，本文所述的重组AAV载体包括骨骼顺式调控模块4(SK-CRM4)增强子。例如，在一些实施例中，所述SK-CRM4增强子与SEQ ID NO:8具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性(参见表1)。在一些实施例中，所述SK-CRM4增强子包括SEQ ID NO:8。在一些实施例中，所述SK-CRM4增强子由SEQ ID NO:8组成。
在又一个实施例中，本发明的AAV载体基因组包括巨细胞病毒(CMV)增强子核酸序列。在另外的实施例中，所述CMV增强子在启动子序列的上游。例如，在一个实施例中，所述CMV增强子具有SEQ ID NO:9的核酸序列。在一些实施例中，所述CMV增强子与SEQ ID NO:9具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性(参见表1)。在一些实施例中，所述CMV增强子包括SEQ ID NO:9。在一些实施例中，所述CMV增强子由SEQ ID NO:9组成。
转基因
用于与本发明一起使用的转基因是编码将在所述转基因所递送到其中的细胞(例如，肌细胞)中表达的多肽或其功能性片段的核酸序列。
在一些实施例中，所述转基因可以掺入到递送所述转基因的宿主细胞的基因组中，或者可以游离型表达。
在一些实施例中，所述转基因可以编码不由递送所述转基因的细胞内源性表达的多肽或其功能性片段。在一些实施例中，所述转基因编码由递送所述转基因的细胞内源性表达的多肽或其功能性片段的突变形式。在一些实施例中，所述转基因编码由递送所述转基因的细胞内源性表达但以低水平表达的蛋白质或其功能性片段，并且其中转基因的表达使蛋白质或其功能性片段具有较高表达水平。在一些实施例中，递送所述转基因的细胞携带一个或多个突变，所述一个或多个突变导致内源蛋白的表达水平较低和/或功能性缺陷蛋白，并且其中转基因的表达使内源蛋白表达恢复和/或缺陷蛋白功能性补充。在一些实施例中，所述转基因在引入到递送所述转基因并且可以诱导表达的细胞中时是沉默的。
在一些实施例中，所述转基因可以是异源的(即，来自不同物种)或与本文所述的重组AAV载体中存在的启动子和/或其它调控元件同源的(即，来自相同物种)。在一些实施例中，所述转基因可以与将转基因递送到其中的细胞异源或同源。
在一些实施例中，所述转基因可以是全长cDNA或基因组DNA序列，或其具有功能性活性的片段或突变体。在一些实施例中，所述转基因可以是微基因，即，缺乏其内含子序列的一部分、大部分或全部或可以含有其所有内含子序列的基因序列。在一些实施例中，所述转基因可以是包括同源和/或异源cDNA和/或基因组DNA片段的杂合核酸序列。在一些实施例中，与野生型序列相比，所述转基因可以包括一个或多个核苷酸取代、缺失和/或插入。
在一些实施例中，本发明的转基因编码治疗蛋白。在某些实施例中，所述转基因可以编码结构蛋白。
在一些实施例中，所述转基因是编码μDys多肽的微抗肌萎缩蛋白(μDys)转基因。在另外的实施例中，由所述转基因编码的μDys多肽包括：(i)包括肌动蛋白结合位点的N末端区(NTD)；(ii)包括二至四个铰链区和四至六个血影蛋白重复序列的中心杆结构域。在另外的实施例中，所述μDys转基因包括SEQ ID NO:5中所示的核酸序列。在甚至另外的实施例中，所述μDys转基因由SEQ ID NO:5中所示的核酸序列组成。在另一个实施例中，编码μDys蛋白的序列与SEQ ID NO:5具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
在一个实施例中，所述μDys转基因包括美国专利第10,351,611号的SEQ ID NO:4所示的核酸序列，所述美国专利出于所有目的通过引用以其整体并入本文。在另一个实施例中，编码μDys蛋白的序列与美国专利第10,351,611号的SEQ ID NO:4具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
在一个实施例中，所述μDys转基因编码μDys多肽，所述μDys多肽包括：(i)包括肌动蛋白结合位点的N末端区(NTD)；(ii)包括三个铰链区和四个血影蛋白重复序列的结构域；以及(iii)富含半胱氨酸的结构域。在另外的实施例中，所述μDys转基因编码μDys多肽，所述μDys多肽包括：包括肌动蛋白结合位点的N末端区(NTD)；(ii)包括铰链区1、2和4以及血影蛋白重复序列1、2、3和24的中心杆结构域；以及(iii)富含半胱氨酸的结构域。
在一个实施例中，所述μDys转基因编码已报道作为用于肌层神经元一氧化氮合酶(nNOS)靶向的支架的抗肌萎缩蛋白血影蛋白重复序列16和17。在另外的实施例中，所述μDys转基因编码抗肌萎缩蛋白血影蛋白重复序列1和24。在另一个实施例中，所述μDys转基因编码抗肌萎缩蛋白血影蛋白重复序列1、16和17、23和24。在又一个实施例中，所述μDys转基因编码抗肌萎缩蛋白血影蛋白重复序列1、2、3和24。在甚至又一个实施例中，所述μDys转基因编码抗肌萎缩蛋白血影蛋白重复序列1、2、22、23和24。
在一个实施例中，所述μDys转基因编码抗肌萎缩蛋白铰链区1和4。在另一个实施例中，所述μDys转基因编码抗肌萎缩蛋白铰链区1、3和4。
在一个实施例中，所述μDys转基因编码μDys蛋白，所述μDys蛋白包括图14中所示的μDys结构域的组合中的一种。
本文所述的AAV载体基因组包括编码μDys蛋白的μDys转基因，所述μDys蛋白包括：(i)包括肌动蛋白结合位点的NTD；(ii)包括二至四个铰链区和四至六个血影蛋白重复序列的中心杆结构域；以及(iii)富含半胱氨酸的结构域。例如，在一个实施例中，所述μDys转基因编码抗肌萎缩蛋白血影蛋白重复序列16和17。在另外的实施例中，所述μDys转基因编码抗肌萎缩蛋白血影蛋白重复序列1和24。在另一个实施例中，所述μDys转基因编码抗肌萎缩蛋白血影蛋白重复序列1、16和17、23和24。在又一个实施例中，所述μDys转基因编码抗肌萎缩蛋白血影蛋白重复序列1、2、3和24。在甚至又一个实施例中，所述μDys转基因编码抗肌萎缩蛋白血影蛋白重复序列1、2、22、23和24。
在一个实施例中，所述μDys转基因编码抗肌萎缩蛋白铰链区1和4。在另一个实施例中，所述μDys转基因编码抗肌萎缩蛋白铰链区1、3和4。
在一个实施例中，本文所述的AAV颗粒包括编码μDys蛋白的经衣壳化的转基因。例如，在一些实施例中，编码μDys蛋白的序列与SEQ ID NO:5具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性(参见表1)。在一些实施例中，编码μDys蛋白的序列包括SEQ ID NO:5。在一些实施例中，编码μDys蛋白的序列由SEQID NO:5组成。
可以使用标准分子生物学技术将本文公开的核酸元件连接在一起以形成基因构建体(参见例如，“《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》,第2版”(Sambrook等人,1989)；“《当代分子生物学实验指南(Current Protocols inMolecular Biology)”(Ausubel等人,1987))。
本文所述的基因构建体(从5'至3')最低限度地包括：(i)启动子；以及(ii)转基因。例如，在一些实施例中，所述启动子是MHCK7启动子。在某些实施例中，所述转基因包括编码μDys的核酸。在另外的实施例中，所述基因构建体可以包括一个或多个另外的调控元件。在一个实施例中，基因构建体从5'至3'包括：启动子、转基因和SV40poly(A)尾。在另一个实施例中，基因构建体从5'至3'包括：增强子、启动子、转基因、SV40内含子和SV40poly(A)尾。
在一些实施例中，基因构建体(从5'至3')包括：(i)启动子；(ii)以及SV40内含子；以及(iii)转基因。在某些实施例中，所述启动子是MHCK7启动子。在某些实施例中，所述转基因是编码μDys的核酸。在另外的实施例中，所述基因构建体可以包括一个或多个另外的调控元件。在一些实施例中，本文所述的基因构建体包括与SEQ ID NO:10具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的连续核酸序列。在一些实施例中，所述基因构建体包括SEQ ID NO:10。
在一些实施例中，所述基因构建体由SEQ ID NO:10组成。
在一些实施例中，基因构建体(从5'至3')包括：(i)增强子；(ii)启动子；(iii)转基因；以及(iv)编码SV40poly(A)尾的序列。在某些实施例中，所述增强子是SK-CRM4增强子。在某些实施例中，所述启动子是MHCK7启动子。在某些实施例中，所述转基因是编码μDys的核酸。在另外的实施例中，所述基因构建体可以包括一个或多个另外的调控元件。在一些实施例中，本文所述的基因构建体包括与SEQ ID NO:11具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的连续核酸序列。在一些实施例中，所述基因构建体包括SEQ ID NO:11的核酸序列。在一些实施例中，所述基因构建体由SEQ ID NO:11的核酸序列组成。
在一些实施例中，本文所述的载体基因组包括与SEQ ID NO:12具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在一些实施例中，所述基因构建体由SEQ ID NO:12组成。在一些实施例中，所述载体基因组包括SEQ ID NO:12的核酸序列。在一些实施例中，所述载体基因组由SEQ ID NO:12的核酸序列组成。
AAV载体主链
在一些实施例中，本发明的AAV载体基因组可以通过使用标准分子生物学技术将如本文所述的基因构建体插入适当的腺病毒质粒主链中来组装(参见例如，Sambrook等人(1989).“《分子克隆：实验室手册》,第2版”；Ausubel等人(1987).“《当代分子生物学实验指南》”)。在一个实施例中，所述腺病毒质粒主链包括本文所述的5'ITR和3'ITR序列。将基因构建体插入位于5'ITR序列的下游和位于3'ITR序列的上游的ITR序列之间的腺病毒质粒主链中。
例如，在一个实施例中，本发明的AAV载体基因组可以通过将包括SEQ ID NO:10的序列的基因构建体插入到包括SEQ ID NO:13的序列的腺病毒质粒主链中来组装。
在另一个实施例中，本发明的AAV载体基因组可以通过将包括SEQ ID NO:11的序列的基因构建体插入到包括SEQ ID NO:13的序列的腺病毒质粒主链中来组装。
在一些实施例中，本发明的腺病毒质粒主链包括与SEQ ID NO:13具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在一些实施例中，所述腺病毒质粒主链包括SEQ ID NO:13的核酸序列。在一些实施例中，所述腺病毒质粒主链由以下提供的SEQ ID NO:13的核酸序列组成。
腺相关病毒(AAV)颗粒产生
AAV颗粒可以通过任何标准方法产生(参见例如WO 2001/083692；Masic等人2014.《分子疗法(Molecular Therapy)》,22(11):1900-1909；Carter,1992,《当代生物技术观点(Current Opinions in Biotechnology)》,1533-539；Muzyczka,1992,《微生物学和免疫学的当前主题(Curr.Topics in Microbial,and Immunol.)》,158:97-129；Ratschin等人,《细胞分子生物学(Mol.Cell.Biol.)》4:2072(1984)；Hermonat等人,《美国国家科学院院刊》,81:6466(1984)；Tratschin等人,《细胞分子生物学》5:3251(1985)；McLaughlin等人,《病毒学杂志(J.Virol)》,62:1963(1988)；以及Lebkowski等人,《细胞分子生物学》,7:349(1988).Samulski等人,《病毒学杂志》,63:3822-3828(1989)；美国专利第5,173,414号；WO95/13365；美国专利第5,658.776号；WO95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441(PCT/US 96/14423)；WO 97/08298(PCT/US96/13872)；WO 97/21825(PCT/US96/20777)；WO 97/06243(PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin等人《疫苗(Vaccine)》13:1244-1250(1995)；Paul等人《人类基因疗法(Human Gene Therapy)》4:609-615(1993)；Clark等人《基因疗法(Gene Therapy)》3:1124-1132(1996)；美国专利第5,786,211号；美国专利第5,871,982号；和美国专利第6,258,595号，所述文献通过引用以其整体并入本文)。例如，在一些实施例中，本文所述的AAV载体基因组可以转化成大肠杆菌(Escherichiacoli)以扩大DNA产生，使用任何标准方法(例如，赛默飞世尔公司(Thermo Scientific)的Maxi-Prep K)纯化，并通过限制消化或测序进行验证。然后可以使用标准方法(例如，磷酸钙转染、聚乙烯亚胺、电穿孔等)将经纯化的AAV载体基因组与包括AAV rep和AAV cap基因的质粒和AAV辅助质粒组合转染到适当的包装细胞系(例如，HEK293、HeLa或PerC.6、MRC-5、WI-38、Vera和FRhL-2细胞)中。AAV rep和cap基因可以来自任何AAV血清型，并且可以与重组AAV载体ITR的血清型相同或不同，包含但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAVrh.74、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12和AAV13。在某些实施例中，本文所述的AAV颗粒包括分别源自AAV2和AAV9的AAV rep和cap基因。
在一些实施例中，本文所述的AAV颗粒可以从包装细胞收获，并通过本领域标准的方法纯化(例如，Clark等人,《人类基因疗法(Hum.Gene Ther.)》,10(6):1031-1039(1999)；Schenpp和Clark,《分子介导方法(Methods Mol.Med.)》,69 427-443(2002)；美国专利第6,566,118号和WO 98/09657，所述文献通过引用以其整体并入本文)，如通过氯化铯超离心梯度或柱色谱法。
药物组合物
本文提供的药物组合物是鞘内药物组合物，即，旨在经由鞘内途径递送。如本文所述，鞘内组合物包括有效量的使μDys转基因衣壳化的AAV颗粒。在一些实施例中，本文公开的药物组合物包括本发明的AAV颗粒和药学上可接受的载体以及任选地其它药物剂、药剂、稳定剂、缓冲液、载剂、佐剂、稀释剂等。“药学上可接受的”意指没有毒或以其它方式不期望的材料，即，所述材料可以施用于受试者而不引起任何不期望的生物学效应。所述药物组合物是鞘内药物组合物。与包括相同载体基因组组分或相同转基因的IV AAV药物组合物相比，有效量的AAV颗粒包括较低剂量的载体基因组。例如，在一个实施例中，与包括相同AAV颗粒或相同微抗肌萎缩蛋白转基因的有效量的IV组合物相比，本文所述的有效量的AAV颗粒具有约90％或更少的载体基因组。
在一些实施例中，本文提供的药物组合物包括无菌水性和非水性注射溶液，所述注射溶液任选地与药物组合物将递送至的受试者的血液等渗。药物组合物可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和溶质，这使得组合物与要施用的预期受试者的血液等渗。水性和非水性无菌悬浮液、溶液和乳液可以包含悬浮剂和增稠剂。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、如橄榄油等植物油以及如油酸乙酯等可注射有机酯。水性载剂包含水、醇性/水性溶液、乳液或悬浮液，包含盐水和缓冲介质。在一些实施例中，药物组合物包括药学上可接受的媒剂，并且可以包含氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。还可以存在防腐剂和其它添加剂，如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂以及惰性气体等。
在一些实施例中，药物组合物可以单位/剂量或多剂量容器，例如密封安瓿和小瓶中呈现，并且可以在仅需要添加无菌液体载剂的冷冻干燥(冻干)条件下储存，例如，在使用之前立即注射盐水或水。
在一些实施例中，本文公开的药物组合物可以被可替代地调配用于IV、肌内或脑室内(ICV)施用。
治疗方法
本发明的一方面涉及一种治疗有需要的受试者的抗肌萎缩蛋白病的方法，所述方法包括以单剂量鞘内施用鞘内组合物，所述鞘内组合物包括有效量的本文所述的AAV颗粒。所述方法可用于将AAV颗粒优先递送到受试者的心脏和/或骨骼，例如用于治疗抗肌萎缩蛋白病，如杜兴氏肌肉萎缩症(DMD)、贝克型肌肉萎缩症或DMD相关扩张型心肌病(DCM)。不希望受理论约束，AAV颗粒和用于将其递送到有需要的受试者以治疗抗肌萎缩蛋白病的方法提供了至少由于本发明比已知的AAV颗粒和治疗方法更优的益处：(i)使得具有比IV递送显著更低的剂量以实现基本上相同或更好的治疗益处，从而减少病毒载量和毒性以及其它副作用；和/或(ii)使得具有与肝组织相比在心肌和/或骨骼肌组织中的优先转基因靶向和表达，由此将所述转基因靶向到所关注的细胞，以提供与静脉内递送的AAV载体相比更大的治疗益处；(iii)与IV调配物相比由于所需的剂量较低，对应的制备负担降低，可以有益于更多患者群体。
在一个实施例中，提供了一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括以单剂量向所述受试者鞘内施用组合物，所述组合物包括有效量的AAV颗粒，所述AAV颗粒包括使包括μDys转基因的载体基因组衣壳化的AAV衣壳。在另外的实施例中，在所述鞘内施用之前使所述受试者置于特伦德伦伯卧位。在一个实施例中，在不存在非离子、低渗透压造影剂的情况下鞘内施用所述组合物。在另一个实施例中，在存在非离子、低渗透压造影剂的情况下进行鞘内施用。
本发明部分地基于以下发现：与受试者的肝组织中的转基因表达相比，鞘内施用有效量的本文所述的AAV颗粒使得在受试者的骨骼肌和/或心肌中的μDys转基因表达水平更高。例如，在一个实施例中，在施用有效量的AAV颗粒，例如AAV9颗粒后，与肝组织中的所述μDys转基因表达的水平相比，所述μDys转基因在所述受试者的所述骨骼肌中以更高水平表达。在另一个实施例中，在施用有效量的AAV颗粒，例如重组AAV9颗粒后，与肝组织中的所述μDys转基因表达的水平相比，所述μDys转基因在所述受试者的所述心肌中以更高水平表达。在又一个实施例中，在施用有效量的AAV颗粒，例如AAV9颗粒后，与肝组织中的所述μDys转基因表达的水平相比，所述μDys转基因在所述受试者的骨骼肌和心肌中以更高水平表达。
根据本文所述的实施例，转基因表达可以指基因表达(即，通过测量mRNA水平)或对应蛋白质的表达。本领域普通技术人员将理解，为了确定不同组织类型、基本上相同量的组织或基本上相同数量的细胞中的转基因表达水平，应比较基因表达水平。在一个实施例中，在骨骼肌和/或心肌中的所述更高水平的μDys转基因表达比肝组织中的μDys转基因表达的量高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％。在另外的实施例中，所述μDys转基因包括SEQ ID NO:5中所示的核酸序列。
在本文所述的方法的一个实施例中，与静脉内施用的基本上相同剂量的使μDys转基因衣壳化的AAV颗粒相比，递送有效剂量的使μDys转基因衣壳化的AAV颗粒的方法在骨骼肌和/或心肌中提供更大的μDys转基因表达。在另一个实施例中，与在静脉内施用有效量的使μDys转基因衣壳化的AAV颗粒相比，递送有效剂量的AAV颗粒的方法在骨骼肌和/或心肌中提供更大的μDys转基因表达。在一个实施例中，在施用包括有效量的AAV颗粒的组合物之后约1周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月、约18个月或约24个月测量转基因表达。在一个实施例中，所述转基因包括SEQ ID NO:5中所示的核酸序列。
在另一个实施例中，本发明的使μDys转基因衣壳化的AAV颗粒在鞘内施用时提供与在静脉内施用相同载体基因组剂量时相同组织类型中的转基因表达相比在骨骼肌和/或心肌中大至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％的转基因表达。相同的载体基因组不需要含有相同的调控元件和/或相同的转基因序列或相同的AAV衣壳。然而，鞘内和静脉内施用的转基因编码μDys多肽。
在又一个实施例中，在鞘内施用的AAV颗粒施用之后测量的[(骨骼肌和/或心肌μDys转基因表达)]/(肝μDys转基因表达)]的比率比在静脉内施用所述相同剂量的使μDys转基因衣壳化的AAV颗粒时的同一比率更大。在一个实施例中，在施用包括有效量的AAV颗粒的组合物之后约1周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月、约18个月、约24个月、约36个月、约48个月或约60个月测量转基因表达。
在一个实施例中，有效量的使μ转基因衣壳化的AAV颗粒在鞘内施用时提供与以相同剂量静脉内施用使μDys转基因衣壳化的AAV颗粒相比更大的功效或更大的治疗益处。
在一些实施例中，足以提供用于本文所述的治疗方法中的一种的治疗应答的鞘内(IT)载体基因组(vg)剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的静脉内(IV)vg剂量的编码μDys转基因的载体基因组的约90％、约90％或更少、约85％、约85％或更少、约80％、约80％或更少、约75％、约75％或更少、约70％、约70％或更少、约60％、约60％或更少、约50％、约50％或更少、约40％、约40％或更少、约30％、约30％或更少、约25％、约25％或更少、约10％或约10％或更少。IT载体基因组包括μDys转基因。IT和IVμDys转基因不需要包含相同的核酸序列。在一些实施例中，足以提供用于本文所述的治疗方法中的一种的治疗应答的所述IT vg剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述IV vg剂量的约90％或更小。在一些实施例中，足以提供用于本文所述的治疗方法中的一种的治疗应答的所述IT vg剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述IV vg剂量的约75％或更小。在一些实施例中，足以提供用于本文所述的治疗方法中的一种的治疗应答的所述IT vg剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述IV vg剂量的约50％或更小。在一些实施例中，足以提供用于本文所述的治疗方法中的一种的治疗应答的所述IT vg剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述IV vg剂量的约25％或更小。在一些实施例中，足以提供用于本文所述的治疗方法中的一种的治疗应答的所述IT vg剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述IV vg剂量的约10％或更小。在一些实施例中，足以提供用于本文所述的治疗方法中的一种的治疗应答的所述IT vg剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述IV vg剂量的约1/40至1/10。在一个实施例中，治疗应答是肌肉组织，例如心肌和/或骨骼肌组织中的μDys转基因表达。在另一个实施例中，治疗应答是北极星移动评价量表(NorthStar Ambulatory Assessment，NSAA)中所述受试者的评分相对于基线(即，治疗前)的增加。在另外的实施例中，所述转基因编码μDys多肽。
在一些实施例中，足以提供用于本文所述的治疗方法中的一种的治疗应答的所述鞘内(IT)载体基因组(vg)剂量低于足以提供相同或基本上相同的治疗应答的静脉内(IV)vg剂量，其中所述IT和IV载体基因组各自包含编码μDys多肽的转基因。然而，相应的转基因不需要包含相同的核酸序列。在一些实施例中，足以提供用于本文所述的治疗方法中的一种的治疗应答的所述IT vg剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述IV vg剂量的约1/2、约1/5、约1/10、约1/15、约1/20、约1/25、约1/30、约1/35、约1/40、约1/45、约1/50、约1/55、约1/60、约1/65、约1/70、约1/75、约1/80、约1/85、约1/90、约1/95、约1/100、约1/150、约1/200、约1/250、约1/500或约1/1000。在一些实施例中，足以提供用于本文所述的治疗方法中的一种的治疗应答的所述IT vg剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述IV vg剂量的约1/20至约1/10、约1/30至约1/10、约1/40至约1/10、约1/50至约1/10、约1/75至约1/10、约1/100至约1/10或约1/1000至约1/10。在一些实施例中，足以提供用于本文所述的治疗方法中的一种的治疗应答的所述IT vg剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述IV vg剂量的约1/30至约1/25、约1/40至约1/25、约1/50至约1/25、约1/75至约1/25、约1/100至约1/25、约1/500至约1/25或约1/1000至约1/25。在一些实施例中，足以提供用于本文所述的治疗方法中的一种的治疗应答的所述IT vg剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述IV vg剂量的约1/75至约1/50、约1/100至约1/50、约1/250至约1/50、约1/500至约1/50或约1/1000至约1/50。在一些实施例中，足以提供用于本文所述的治疗方法中的一种的治疗应答的所述IT vg剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述IV vg剂量的约1/200至约1/100、约1/250至约1/100、约1/500至约1/100或约1/1000至约1/100。在一些实施例中，足以提供用于本文所述的治疗方法中的一种的治疗应答的所述IT vg剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述IV vg剂量的约1/40至约1/10。在一些实施例中，足以提供用于本文所述的治疗方法中的一种的治疗应答的所述IT vg剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述IV vg剂量的约1/40至约1/25。在一些实施例中，足以提供用于本文所述的治疗方法中的一种的治疗应答的所述IT vg剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述IV vg剂量的约1/10。在一些实施例中，足以提供用于本文所述的治疗方法中的一种的治疗应答的所述IT vg剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述IV vg剂量的约1/25。在一些实施例中，足以提供用于本文所述的治疗方法中的一种的治疗应答的所述IT vg剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述IV vg剂量的约1/40。在一些实施例中，足以提供用于本文所述的治疗方法中的一种的治疗应答的所述IT vg剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述IVvg剂量的约1/50。在一些实施例中，足以提供用于本文所述的治疗方法中的一种的治疗应答的所述IT vg剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述IV vg剂量的约1/100。在一个实施例中，治疗应答是肌肉组织，例如心肌和/或骨骼肌组织中的转基因表达。
在一些实施例中，有效剂量的包括使本文所述的μDys转基因衣壳化的AAV颗粒的鞘内(IT)组合物低于有效剂量的包括使μDys转基因衣壳化的AAV颗粒的静脉内(IV)组合物。在一些实施例中，与有效量的所述IV组合物相比，所述有效剂量的包括所述AAV颗粒的所述IT组合物具有约90％、约90％或更少、约85％、约85％或更少、约80％、约80％或更少、约75％、约75％或更少、约70％、约70％或更少、约60％、约60％或更少、约50％、约50％或更少、约40％、约40％或更少、约30％、约30％或更少、约25％、约25％或更少、约10％或约10％或更少的载体基因组。在一些实施例中，与所述有效量的所述IV组合物相比，有效量的包括所述AAV颗粒的所述IT组合物具有约90％或更少的载体基因组。在一些实施例中，与所述有效量的所述IV组合物相比，所述有效量的包括所述AAV颗粒的所述IT组合物具有约75％或更少的载体基因组。在一些实施例中，与所述有效量的所述IV组合物相比，所述有效量的包括AAV颗粒的所述IT组合物具有约50％或更少的载体基因组。在一些实施例中，与所述有效量的所述IV组合物相比，所述有效量的包括所述AAV颗粒的所述IT组合物具有约25％或更少的载体基因组。在一些实施例中，与所述有效量的所述IV组合物相比，所述有效量的包括所述AAV颗粒的所述IT组合物具有约10％或更少的载体基因组。
在一些实施例中，IT组合物中的有效剂量的AAV颗粒的剂量低于IV组合物中的有效剂量的AAV颗粒，其中每个AAV颗粒使μys转基因衣壳化。在一些实施例中，IT组合物中的有效剂量的AAV颗粒的剂量是所述IV组合物中的有效剂量的所述AAV颗粒的约1/2、约1/5、约1/10、约1/15、约1/20、约1/25、约1/30、约1/35、约1/40、约1/45、约1/50、约1/55、约1/60、约1/65、约1/70、约1/75、约1/80、约1/85、约1/90、约1/95、约1/100、约1/150、约1/200、约1/250、约1/500或约1/1000。在一些实施例中，有效量(有效剂量)的包括所述AAV颗粒的所述IT组合物的剂量是有效量(有效剂量)的包括相同AAV颗粒或使编码与由所述IT组合物中的所述AAV颗粒衣壳化的转基因相同的多肽的转基因衣壳化的AAV颗粒的所述IV组合物的约1/20至约1/10、约1/30至约1/10、约1/40至约1/10、约1/50至约1/10、约1/75至约1/10、约1/100至约1/10或约1/1000至约1/10。在一些实施例中，所述有效量的包括所述AAV颗粒的所述鞘内组合物的剂量是所述有效量的包括相同AAV颗粒或使编码与由所述IT组合物中的所述AAV颗粒衣壳化的转基因相同的多肽的转基因衣壳化的AAV颗粒的所述IV组合物的约1/30至约1/25、约1/40至约1/25、约1/50至约1/25、约1/75至约1/25、约1/100至约1/25、约1/500至约1/25或约1/1000至约1/25。在一些实施例中，所述有效量的包括所述AAV颗粒的所述鞘内组合物的剂量是所述有效量的包括相同AAV颗粒或使编码与由所述IT组合物中的所述AAV颗粒衣壳化的转基因相同的多肽的转基因衣壳化的AAV颗粒的所述IV组合物的约1/75至约1/50、约1/100至约1/50、约1/250至约1/50、约1/500至约1/50或约1/1000至约1/50。在一些实施例中，所述有效量的包括所述AAV颗粒的所述IT组合物的剂量是所述有效量的包括相同AAV颗粒的所述IV组合物的约1/200至约1/100、约1/250至约1/100、约1/500至约1/100或约1/1000至约1/100。在一些实施例中，所述有效量的包括所述AAV颗粒的所述IT组合物是所述有效量的包括相同AAV颗粒或使编码与由所述IT组合物中的所述AAV颗粒衣壳化的转基因相同的多肽的转基因衣壳化的AAV颗粒的所述IV组合物的约1/40至约1/25。在一些实施例中，所述有效量的包括所述AAV颗粒的所述IT组合物的剂量是所述有效量的包括相同AAV颗粒或使编码与由所述IT组合物中的所述AAV颗粒衣壳化的转基因相同的多肽的转基因衣壳化的AAV颗粒的所述IV组合物的约1/10。在一些实施例中，所述有效量的包括所述AAV颗粒的所述IT组合物的剂量是所述有效量的包括相同AAV颗粒或使编码与由所述IT组合物中的所述AAV颗粒衣壳化的转基因相同的多肽的转基因衣壳化的AAV颗粒的所述IV组合物的约1/25。在一些实施例中，所述有效量的包括所述AAV颗粒的所述IT组合物的剂量是所述有效量的包括相同AAV颗粒或使编码与由所述IT组合物中的所述AAV颗粒衣壳化的转基因相同的多肽的转基因衣壳化的AAV颗粒的所述IV组合物的约1/40。在一些实施例中，所述有效量的包括所述AAV颗粒的所述IT组合物的剂量是所述有效量的包括相同AAV颗粒或使编码与由所述IT组合物中的所述AAV颗粒衣壳化的转基因相同的多肽的转基因衣壳化的AAV颗粒的所述IV组合物的约1/50。在一些实施例中，所述有效量的包括所述AAV颗粒的所述IT组合物的剂量是所述有效量的包括相同AAV颗粒或使编码与由所述IT组合物中的所述AAV颗粒衣壳化的转基因相同的多肽的转基因衣壳化的AAV颗粒的所述IV组合物的约1/100。在一些实施例中，所述转基因是μDys转基因。
在本文提供的治疗方法的一个实施例中，治疗包括与治疗前的血清CK水平相比，使受试者的血清肌酸激酶(CK)水平降低。在一些实施例中，与治疗前的血清CK水平相比，所述血清CK水平降低了约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多。在另外的实施例中，在用AAV颗粒治疗前以及在施用AAV颗粒后约12个月、约18个月、约24个月或约30个月评估血清CK水平。在另外的实施例中，所述AAV颗粒包括使μDys转基因衣壳化的AAV9衣壳。
在本文提供的鞘内治疗方法的另一个实施例中，治疗包括与经由IV施用有效量的相同AAV颗粒或使μDys转基因衣壳化的不同AAV颗粒进行治疗的受试者相比，减少所治疗的受试者中的副作用的数量或降低一种或多种副作用的严重程度。在一个实施例中，鞘内施用的AAV颗粒是AAV9颗粒。
在一些实施例中，本发明的AAV颗粒或包括其的药物组合物可用于治疗抗肌萎缩蛋白病，包含但不限于DMD、贝克型肌肉萎缩症和DCM。
在一些实施例中，将本发明的AAV颗粒施用于需要治疗的受试者，例如患有DMD的受试者一次或多次。在一些实施例中，将AAV颗粒施用于需要治疗的受试者一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。在优选的实施例中，将本文提供的包括AAV颗粒的鞘内组合物施用于需要治疗的受试者一次。在另外的实施例中，所述AAV颗粒是AAV9颗粒。
在一个实施例中，在用于治疗需要治疗的受试者的DMD的方法中使用有效量的包括使如本文所述的μDys转基因衣壳化的AAV衣壳的AAV颗粒。在另外的实施例中，以单剂量向受试者鞘内施用包括AAV颗粒的组合物。在另外的实施例中，所述AAV颗粒是AAV9颗粒。在甚至另外的实施例中，在所述施用之前使所述受试者置于特伦德伦伯卧位。
在用于治疗DMD的方法的一个实施例中，向需要治疗的受试者以单剂量鞘内施用组合物，所述组合物包括有效量的包括使μDys转基因衣壳化的AAV衣壳的AAV颗粒。在一个实施例中，所述μDys转基因包含图14中所示的抗肌萎缩蛋白元件的组合。在一个实施例中，所述载体基因组包括SEQ ID NO:5、10、11或12中所示的核酸序列。
在用于治疗DMD的方法的一个实施例中，治疗包括使北极星移动评价量表(NSAA)中所述受试者的评分相对于基线(即，治疗前)有所增加。NSAA是17项评级量表，用于测量有行走能力的DMD受试者的功能运动能力。标度是序数，其中34是指示完全独立函数的最大评分。每个活动被分级为0(无法独立实现)、1(经修改的方法，但独立于彼此的身体辅助而实现目标)或2(正常-活动没有明显修改)。参见例如，Mazonne等人(2009).《神经肌肉疾病(Neuromuscular Disorders)》19,第458-461页和researchrom.com/masterlist/view/18#form2，其中的每一个的公开内容出于所有目的通过引用以其整体并入本文。在一个实施例中，在施用鞘内组合物后12个月测量相对于基线的变化。在另一个实施例中，在施用鞘内组合物后18个月测量相对于基线的变化。在另一个实施例中，在施用鞘内组合物后24个月测量相对于基线的变化。在甚至另一个实施例中，在施用后12个月测量的受试者的NSAA相对于基线的评分增加在施用后18个月时基本上不变或增加。在甚至又一个实施例中，在施用后12个月测量的受试者的NSAA相对于基线的评分增加在施用后24个月时基本上不变或增加。在甚至又一个实施例中，在施用后12个月测量的受试者的NSAA相对于基线的评分增加在施用后60个月时基本上不变或增加。
在一个实施例中，使NSAA评分增加包括使NSAA评分增加了约5至约25、约5至约20、约5至约15或约5至约10。在另一个实施例中，使NSAA评分增加包括使NSAA评分增加了约2至约12分。在另一个实施例中，使NSAA评分增加包括使NSAA评分增加了约2至约10分。在又一个实施例中，使NSAA评分增加包括使NSAA评分增加了约3至约10分。在甚至另一个实施例中，使NSAA评分增加包括使NSAA评分增加了约4至约10分。在甚至又一个实施例中，使NSAA评分增加包括使评分增加了约2至约8分。在另一个实施例中，使NSAA评分增加包括使NSAA评分增加了约2至约6分。
在用于治疗DMD的方法的一个实施例中，以单剂量向需要治疗的受试者鞘内施用有效量的使μDys转基因衣壳化的AAV载体。在一个实施例中，所述μDys转基因包含图14中所示的抗肌萎缩蛋白元件的所述组合。在一个实施例中，所述载体基因组包括SEQ ID NO:5、10、11或12中所示的所述核酸序列。在一个实施例中，有效量的使μDys转基因衣壳化的AAV载体是与治疗前步行的米数相比足以增加在6分钟步行测试(6MWT)中步行的米数的量。
本发明的AAV颗粒或包括其的药物组合物以单剂量或分剂量施用。在一些实施例中，所述剂量是作为单剂量或作为分剂量递送的1×109至1×1016个载体基因组(vg)、2.5×1013至1×1015个vg、5×1013至1×1015个vg、7.5×1013至1×1015个vg、1×1014至1×1015个vg、2.5×1014至1×1015个vg、5×1014至1×1015个vg、7.5×1014至1×1015个vg、1×1013至7.5×1014个vg、2.5×1013至7.5×1014个vg、5×1013至7.5×1014个vg、7.5×1013至7.5×1014个vg、1×1013至5.0×1014个vg、2.5×1013至5.0×1014个vg、5×1013至5.0×1014个vg、7.5×1013至5.0×1014个vg、1×1013至2.5×1014个vg、2.5×1013至2.5×1014个vg、5×1013至2.5×1014个vg、7.5×1013至2.5×1014个vg、1×1013至1×1014个vg、2.5×1013至1×1014个vg、5×1013至1×1014个vg、7.5×1013至1×1014个vg。例如，在一些实施例中，本发明的AAV颗粒或包括其的药物组合物以2.5×1013个vg的单剂量施用。在另一个实施例中，本发明的AAV颗粒或包括其的药物组合物以5×1013个vg的单剂量施用。在又一个实施例中，本发明的AAV颗粒或包括其的药物组合物以1×1014个vg的单剂量施用。
本发明的AAV颗粒或包括其的药物组合物以单鞘内剂量施用。在一些实施例中，用于鞘内递送的剂量可以是作为单剂量或作为分剂量递送的1×109至1×1016个载体基因组(vg)、1×1010至1×1016个vg、1×1011至1×1016个vg、1×1012至1×1016个vg、1×1013至1×1016个vg、1×1014至1×1016个vg、1×1015至1×1016个vg、1×109至1×1015个vg、1×109至1×1014个vg、1×109至1X 1013个vg、1×109至1×1012个vg、1×109至1×1011个vg、1×109至1×1010个vg、1×1013至1×1015个载体vg、2.5×1013至1×1015个vg、5×1013至1×1015个vg、7.5×1013至1×1015个vg、1×1014至1×1015个vg、2.5×1014至1×1015个vg、5×1014至1×1015个vg、7.5×1014至1×1015个vg、1×1013至7.5×1014个vg、2.5×1013至7.5×1014个vg、5×1013至7.5×1014个vg、7.5×1013至7.5×1014个vg、1×1013至5.0×1014vg、2.5×1013至5.0×1014个vg、5×1013至5.0×1014个vg、7.5×1013至5.0×1014个vg、1×1013至2.5×1014个vg、2.5×1013至2.5×1014个vg、5×1013至2.5×1014个vg、7.5×1013至2.5×1014个vg、1×1013至1×1014个vg、2.5×1013至1×1014个vg、5×1013至1×1014个vg、7.5×1013至1×1014个vg。例如，在一些实施例中，本发明的AAV颗粒或包括其的药物组合物可以2.5×1013个vg的单鞘内剂量施用。在另一个实施例中，本发明的AAV颗粒或包括其的药物组合物可以5×1013个vg的单鞘内剂量施用。在又一个实施例中，本发明的AAV颗粒或包括其的药物组合物可以1×1014个vg的单鞘内剂量施用。
在其它实施例中，本发明的AAV颗粒或包括其的药物组合物可以作为单或分脑室内剂量施用。在一些实施例中，用于脑室内递送的剂量可以是1×1013至1×1015个vg、2.5×1013至1×1015个vg、5×1013至1×1015个vg、7.5×1013至1×1015个vg、1×1014至1×1015个vg、2.5×1014至1×1015个vg、5×1014至1×1015个vg、7.5×1014至1×1015个vg、1×1013至7.5×1014个vg、2.5×1013至7.5×1014个vg、5×1013至7.5×1014个vg、7.5×1013至7.5×1014个vg、1×1013至5.0×1014个vg、2.5×1013至5.0×1014个vg、5×1013至5.0×1014个vg、7.5×1013至5.0×1014个vg、1×1013至2.5×1014个vg、2.5×1013至2.5×1014个vg、5×1013至2.5×1014个vg、7.5×1013至2.5×1014个vg、1×1013至1×1014个vg、2.5×1013至1×1014个vg、5×1013至1×1014个vg、7.5×1013至1×1014个vg。例如，在一些实施例中，本发明的AAV颗粒或包括其的药物组合物可以2.5×1013个vg的单脑室内剂量施用。在另一个实施例中，本发明的AAV颗粒或包括其的药物组合物可以5×1013个vg的单脑室内剂量施用。在又一个实施例中，本发明的AAV颗粒或包括其的药物组合物可以1×1014个vg的单脑室内剂量施用。
实例
通过参考以下实例，将更容易理解现在总体上描述的本发明，这些实例仅出于说明本发明的某些方面和实施例的目的而被包含在内，并且不旨在限制本发明。
选择方法
在出生后第1天(p1)进行脑室内(ICV)注射
通过脑半球对新生幼崽(p1)进行脑室内注射(ICV)。在新生幼崽完全清醒的情况下注射。确保针的注射深度标记为2mm。注射部位是介于耳朵与眼睛之间的中点(位置在矢状缝外侧大约0.7-1.0mm，并且距新生幼崽前囟尾部约0.7-1.0mm)。P0被指定为小鼠出生日期(DoB)。可以在发现同时出生的一窝幼崽的36小时内对动物进行注射。
如果确定过量的给药溶液从注射部位泄漏，或者完全错过了注射部位，则将动物排除在研究之外。
在出生后第28天(p28)进行脑室内(ICV)注射
将汉密尔顿注射器(Hamilton syringe)重新装载期望体积的给药溶液。标准体积为每注射部位8μl。将动物单独地从笼中取出并放置在麻醉室中。一旦进入室中，动物就会被麻醉。管从麻醉机连接到立体定位装置，以允许在注射期间继续麻醉。在移除并放置在立体装置上之前，将相应的动物保留在室中持续约两分钟。一旦动物位于立体定位装置上，则将用于注射的坐标设置在内侧/外侧(M/L)：+/-1.00mm，前部/后部(A/P)：-0.5--0.8mm，背侧/腹侧(D/F)：-2.5mm。
出于无菌目的，在动物头皮的切口处使用碘拭子进行消毒。使用手术刀在动物的头皮上制作小切口，并且轻轻地向后剥头皮以露出颅骨区。一旦针处于期望的位置，则将注射器柱塞缓慢向下推动以将给药溶液注射到颅骨空间中。注射期间和注射后立即监测注射部位，以确认注射质量。
肌肉准备
当动物达到适当年龄时，将其称重并通过腹膜内(i.p.)注射进行麻醉(氯胺酮[80mg/kg]、乙酰丙嗪[0.5mg/kg]和甲苯噻嗪[16mg/kg])。然后进行组织解剖。使用剪刀切开脚踝处的皮肤，并且然后将两条小腿上的皮肤向后拉以露出小腿和大腿的肌肉。将一侧的胫骨前肌在靠近其插入点处解剖，并且称重至最接近0.1mg，并且然后丢弃。然后，将4.0缝线系在趾长伸肌(EDL)近端和远端的肌腱连接处，并且然后解剖并放入在室温下保存的林格氏溶液(Ringer's solution)(137mm NaCl，5mm KCl，2mm CaCl2，1mm MgSO4，1mmNaH2PO4，24mm NaHCO3，11mm葡萄糖，含10mg/升箭毒(curare))中。
在解剖EDL之后，打开腹部，并且使用1cc注射器从下腔静脉抽取血液(约300-500μL)。将血液在室温下静置25-35分钟，并且然后在4℃下以3,500×g离心10分钟。在将上清液旋转之后，将血清分离并放置到微量离心管中并在-80℃下冷冻。
然后切开跟腱并将其拉回以暴露比目鱼肌(soleus)、跖肌和腓肠肌。将比目鱼肌解剖并放置在管中，并在液氮冷却的异戊烷中冷冻。将跖肌钝性解剖，去掉腓肠肌，并且然后尽可能向近侧切开，并且放置在管中并且在液氮冷却的异戊烷中冷冻，并在-80℃下储存。
尽可能向近侧切割腓肠肌，称重至最接近0.1mg，并放置在管中并冷冻。将来自对侧的胫骨前肌自由解剖，称重至最接近0.1mg，并且以静止长度钉在软木上。将来自同一侧的EDL自由解剖，并且以静止长度钉在同一软木上。然后，将软木浸入液氮冷却的异戊烷中。在约30至约45秒之后，将软木放置在干冰上，并且包裹在箔中并在-80℃下储存。将四头肌解剖并放置在管中，并在液氮冷却的异戊烷中冷冻并在-80℃下储存。将一小块肝解剖并放置在管中，并在液氮冷却的异戊烷中冷冻并在-80℃下储存。将膈膜解剖，对半折叠，并且然后再次折叠，并且然后放置在软木上并钉住。然后，将软木浸入液氮冷却的异戊烷中。在30-45秒之后，将软木放置在干冰上，包裹在箔中并在-80℃下储存。
将整个心脏揭破，称重至最接近0.1mg，并且放置在管中，并在液氮冷却的异戊烷中冷冻。将管加盖并放置在液氮中，直到在-80℃下储存。
实例1：重组腺相关病毒颗粒的产生
微抗肌萎缩蛋白基因构建体的分子克隆
通过将MHCK7启动子和SV40内含子与编码μDys和SV40poly(A)信号的多核苷酸可操作地连接来合成微抗肌萎缩蛋白(μDys)编码基因构建体，其在本文中被称为INS1201并且先前被称为MTS-001(图1A)。通过将SK-CRM4增强子与MHCK7启动子可操作地连接到编码的多核苷酸和SV40poly(A)信号的多核苷酸来合成替代性的μDys编码基因构建体(在本文中被称为INS1212并且先前被称为MTS-003)(图1B)。INS1201和INS1212基因构建体在Puc57载体主链中产生。INS1201和INS1212构建体通过DNA测序得到证实，并且4542bp和4714构建体分别通过NruI限制消化分离并进行凝胶纯化，用于随后克隆到合适的AAV主链中。
经分离的INS1201和INS1212基因构建体各自独立地钝性克隆到含有ITR位点和通过NruI限制消化线性化/分离的卡那霉素抗性基因的凝胶纯化的pSZ01载体主链中。在INS1212构建体与pSZ01载体主链以及INS1212构建体与pSZ01载体主链T4连接后，将DNA转化到大肠杆菌(E.coli)中，生长并且使用NEB质粒最大制备试剂盒纯化。通过HindIII/BsaI限制消化鉴定已经成功连接以产生完整的pSZ01-INS1201或psZ01-INS1212质粒克隆的基因构建体。
通过使用Maxi-Prep试剂盒(GeneJET不含核酸内切酶的质粒最大制备试剂盒，赛默科技公司(ThermoScientific))在大肠杆菌中进行细菌转化而将pSZ01-INS1201和psZ01-INS1212克隆放大。通过BsaI/HindIII消化重新确认正确的质粒序列(图1C，泳道1和3)。另外地，使用SmaI进行限制消化(图1C，泳道2和4)以进一步确认含有INS1201和INS1212的ITR位点在pSZ01载体主链内的正确合并。
瞬时转染和病毒包装
使用标准磷酸钙转染方法，将经确认的pSZ01-INS1201和psZ01-INS1212AAV载体与腺病毒辅助质粒和递送AAV2rep基因和AAV9cap基因的嵌合包装构建体组合瞬时转染到HEK293细胞中(例如，如Vandendriessche等人(2007.《血栓与止血杂志(J ThrombHaemost)》5:16-24)所描述，所述文献通过引用以其整体并入本文)。转染后两天，采集AAV颗粒，并使用连续两轮氯化铯密度梯度超速离心进行纯化。对1μl的纯化的INS1201-AAV9(图2，泳道1)和INS1212-AAV9(图2，泳道2)中的每一者进行滴定，方法是与通过SDS-PAGE解析的1×1013个vg AAV2标准品(图2，泳道3(0.5μl)，泳道4(1μl)，泳道5(2μl)和泳道6(4μl))进行比较，并且银染色。
实例2：肌内递送AAV9μDys(INS1201-AAV9和INS1212-AAV9)引起MTX小鼠中的μDys 表达增加。
将INS1201-AAV9和INS1212-AAV9肌内注射到mdx小鼠(杜兴氏肌肉萎缩症的常见鼠类模型)的腓肠肌中(参见例如Rodino-Klapac等人(2013)《人类分子遗传学(Hum MolGenet.)》22(24):4929-37，所述文献通过引用并入本文)。如图3A所示，肌内注射后21天，注射2.7×1011个vg的INS1201-AAV9(iii)或INS1212-AAV9(iv)的腓肠肌表现出μDys的广泛表达，其水平显著高于未经注射的mdx小鼠(i)并且与野生型C57/Bl小鼠(ii)的水平相当。图3B类似地样显示，肌内注射2.7×1011个vg的INS1212-AAV9后21天，μDys在mdx小鼠中高水平表达。
实例3：脑室内递送AAV9μDys(INS1201-AAV9和INS1212-AAV9)引起MDX小鼠中的μ
Dys表达增加。
在出生后第1天(p1)将INS1201-AAV9脑室内注射到mdx小鼠中，并收集组织样品并针对抗肌萎缩蛋白进行分析。如图4A所示，脑室内(ICV)注射1.8×1011个vg的AAV后21天，INS1201-AAV9有效靶向并引起μDys在腓肠肌(i)、胫骨前肌(ii)、四头肌(iii)、臀大肌(iv)、三头肌(v)、膈膜(vi)和心脏(vii)肌细胞中的表达，其中在mdx动物的肝(viii)中几乎没有表达。类似地，如图4B所示，ICV注射9×1010个vg的AAV后21天，INS1201-AAV9有效靶向并引起μDys在腓肠肌(i)、胫骨前肌(ii)、四头肌(iii)、臀大肌(iv)、三头肌(v)、膈膜(vi)和心脏(vii)肌细胞中的表达，其中在肝(viii)中几乎没有表达。
同样在p1时将INS1212-AAV9脑室内注射到mdx小鼠中，并收集组织样品并针对抗肌萎缩蛋白进行免疫荧光染色。如图5所示，ICV注射9×1010个vg的AAV后21天，INS1212-AAV9有效靶向并引起μDys在腓肠肌(i)、胫骨前肌(ii)、四头肌(iii)、臀大肌(iv)、三头肌(v)、膈膜(vi)和心脏(vii)肌细胞中的表达，其中在肝(viii)中几乎没有表达。
如图6A的苏木精和伊红染色的样品所示，与野生型C57/Bl(i)和未经注射的mdx小鼠对照(iv)相比，ICV注射9×1010个vg(ii)和2.7×1011个vg(iii)的INS1201-AAV9后80天，腓肠肌组织表现出正常组织结构的恢复和杜兴氏肌肉萎缩症的组织病理学特征的校正。如图6B所示，在ICV注射9×1010个vg(ii)和2.7×1011个vg(iii)的INS1201-AAV9后80天，腓肠肌组织表现出μDys水平，与野生型C57/Bl小鼠(i)的抗肌萎缩蛋白水平相当，并且显著高于未经注射的mdx小鼠(iv)的抗肌萎缩蛋白水平。
类似地，如图7A(ii)的苏木精和伊红染色的样品所示，ICV注射9×1010个vg的INS1212-AAV9后80天，腓肠肌组织表现出正常组织结构的恢复和杜兴氏肌肉萎缩症的组织病理学特征的校正，如与野生型C57/Bl(图7A(i))和未经注射的mdx小鼠对照(图7A(iii))相比。如图7B(ii)，在ICV注射9×1010个vg的INS1212-AAV9后80天，腓肠肌组织表现出μDys水平，与野生型C57/Bl小鼠(图7B(i))中的抗肌萎缩蛋白水平相当，并且显著高于未经注射的mdx小鼠(图7A(iii))中的抗肌萎缩蛋白水平。
如图8所示，mdx小鼠中的腓肠肌(图8A)、三头肌(图8C)、胫骨前肌(图8E)和膈膜(图8F)肌肉组织在ICV注射9×1010个vg或2.7×1011个vg的INS1201-AAV9后80天表现出与未经注射的mdx的小鼠相比平均纤维直径的增加。与未经注射的小鼠相比，脑室内注射9×1010个vg或2.7×1011个vg的INS1201-AAV9的mdx小鼠在注射后80天，在腓肠肌(图8B)、三头肌(图8D)、胫骨前肌(图8F)和膈膜(图8H)中也表现出细胞具有更大直径(例如，25μm至60μm)的频率增加。
类似地，如图9A所示，与未经注射的mdx小鼠相比，在ICV注射9×1010个vg的INS1212-AAV9后80天，mdx小鼠的腓肠肌组织表现出平均纤维直径增加，同时表现出细胞具有较大直径(例如，25μm至60μm)的频率增加(图9B)。
实例4：INS1201-AAV9的脑室内递送引起mdx小鼠中μDys表达增加、肌肉组织学改
善和纤维化减少。
对出生后第28天(p28)的mdx小鼠(具有-1和+7天的窗口期，使得在注射时没有动物小于P27，也没有动物大于P35)通过脑室内(ICV)注射施用以下治疗中的一种：(i)9×109个vg的INS1201-AAV9(n＝6)；(ii)9×1010个vg的INS1201-AAV9(n＝7)；(iii)2.7×1011个vg的INS1201-AAV9(n＝10)；(iv)5.4×1011个vg的INS1201-AAV9(n＝7)；(v)1.2×1012个vg的INS1201-AAV9(n＝8)或(vi)媒剂对照(TFF调配物缓冲液，n＝11)。C57/BL1年龄匹配小鼠用作野生型(WT)比较物(n＝10)。
如上所述，在大约出生后第120天解剖组织。
使用INS1201转基因特异性引物，通过液滴数字聚合酶链反应(ddPCR)测量每二倍体基因组的INS1201拷贝。INS1201的DNA拷贝在图15中提供。RNA转录物拷贝在图16中提供。TA：胫骨前肌；EDL：趾长伸肌；GAS：腓肠肌；DIA：隔膜。RPP30：核糖核酸酶P/MRP P30亚基。
如图17所示，与未经注射的mdx小鼠相比，以所有测试剂量施用INS1201-AAV9的mdx小鼠表现出平均EDL纤维直径增加。与这些发现一致，与未经注射的小鼠相比，以所有剂量脑室内注射的INS1201-AAV9的mdx小鼠也表现出EDL肌中细胞具有更大直径(例如，25μm至60μm)的频率增加。
如图18所示，与未经注射的mdx小鼠相比，以四个最高测试剂量施用INS1201-AAV9的mdx小鼠表现出平均TA纤维直径增加。与这些发现一致，与未经注射的小鼠相比，以四个最高测试剂量(9×1010个vg；2.7×1011个vg；5.4×1011个vg；1.2×1012个vg)脑室内注射INS1201-AAV9的mdx小鼠表现出TA肌中细胞具有较大直径的频率增加。
图19示出了脑室内(ICV)注射各种剂量的INS1201-AAV9后用天狼猩红染色的膈膜肌切片。天狼猩红用于使胶原蛋白含量可视化。示出了从野生型C57/Bl小鼠和被施用媒剂的mdx小鼠获得的膈膜切片以进行比较(顶图)。如图19的下图所示，与施用媒剂的mdx小鼠相比，以五个测试剂量(9×109个vg；9×1010个vg；2.7×1011个vg；5.4×1011个vg；1.2×1012个vg)施用INS1201-AAV9的mdx小鼠表现出纤维化减少，如通过胶原蛋白含量测量的。膈膜肌中的胶原蛋白百分比也在图20中提供。
图21的顶部是在于p28时脑室内(ICV)注射5.4×1011个vg的INS1201-AAV9之后在出生后第120天(p120)从mdx小鼠获得的并且用苏木精和伊红(H&E)染色的(最左)、层粘连蛋白/dapi染色的(左起第二)、抗肌萎缩蛋白(右起第二)的EDL切片以及合并图像(最右)的显微图。图21的底部示出了在于p28时脑室内(ICV)注射媒剂对照之后在出生后第120天(p120)从mdx小鼠获得的并且用苏木精和伊红(H&E)染色的(最左)、层粘连蛋白/dapi染色的(左起第二)、抗肌萎缩蛋白(右起第二)以及合并图像(最右)的EDL肌切片。与从对照小鼠获得的样品相比，染色显示从用INS1201-AAV9处理的小鼠获得的样品中的抗肌萎缩蛋白表达更多。如从H&E和层粘连蛋白/dapi染色中显而易见的，来自经INS1201-AAV9处理的小鼠的肌肉也看起来更健康。
实例5：INS-1201AAV9的ICV递送引起mdx小鼠的肌肉生理学改善。
对出生后第1天(p1)的mdx小鼠通过脑室内(ICV)注射施用以下治疗中的一种：(i)9×109个vg的INS1201-AAV9；(ii)9×1010个vg的INS-1201-AAV9；(iii)2.7×1011个vg的INS1201-AAV9；(iv)媒剂对照(TFF调配物缓冲液)。C57/BL10年龄匹配小鼠(WT)用作比较物。
对出生后第28天(p28)的mdx小鼠(具有-1和+7天的窗口期，使得在注射时没有动物小于P27，也没有动物大于P35)通过脑室内(ICV)注射施用以下治疗中的一种：(i)9×109个vg的INS1201-AAV9；(ii)9×1010个vg的INS1201-AAV9；(iii)2.7×1011个vg的INS1201-AAV9；(iv)5.4×1011个vg的INS1201-AAV9；(v)1.2×1012个vg的INS1201-AAV9或(vi)媒剂对照(TFF调配物缓冲液)。C57/BL1年龄匹配小鼠用作野生型(WT)比较物。
当动物为120日龄至135日龄时，如上所述进行肌肉解剖和准备。
肌肉生理学实验设计
EDL中的肌肉力学
在室温下将EDL安置在含有林格氏溶液(137mM NaCl，5mM KCl，2mM CaCl2，1mMMgSO4，1mM NaH2PO4，24mM NaHCO3，11mM葡萄糖，含有10mg/升箭毒)的专门的室中。将肌肉起点系在刚性杆上，并且将插入物固定在双模测力计(300B型；加拿大安大略省的AuroraScientific公司(Aurora Scientific,ON,Canada))的臂上，其允许精确控制肌肉长度。
使用延伸肌肉长度的平行铂板电极经由电刺激器提供肌肉激活。通过增加电压的单个0.3毫秒抽动脉冲为每个实验建立超最大刺激条件，使用比实验测试中力稳定的值多+50％的值。使用一系列抽动来确定用于评估力特性的最佳肌肉长度，同时逐渐增加肌肉长度(从松弛长度增加10％)，并且被定义为超最大刺激产生最大抽动力的长度。在确定最佳长度后，测量肌肉纤维长度(Lf)，并使肌肉休息2分钟。
然后，用间隔60秒(0.3毫秒脉冲持续时间)的两次抽动刺激肌肉以评估抽动特性(抽动张力、半松弛时间和达峰时间张力)。
以增加的频率刺激肌肉(400毫秒训练持续时间和0.3毫秒脉冲持续时间；(i)EDL：1Hz、10Hz、30Hz、50Hz、70Hz、120Hz；(ii)比目鱼肌：1Hz、5Hz、10Hz、20Hz、40Hz、60Hz、80Hz和100Hz)，其中收缩之间的间隔为120秒，以确定力-频率(F-F)关系。
在F-F测试之后，通过在测试结束时经验地测试至多长度的±20％的最大抽动力来重新验证最佳长度。
离心收缩
在完成F-F曲线之后，以两分钟的间隔进行所有拉伸或收缩，并且对于等距和离心收缩，在100Hz下以400毫秒训练持续时间和0.3毫秒脉冲持续时间进行刺激。具体地，在F-F评估结束后的两分钟休息期后，通过在恢复到起始肌肉长度之前以0.7Lf/秒的速度施加两次10％Lf拉伸并保持500毫秒来测量肌肉的被动力学性质。然后，获得两个等距收缩作为前离心收缩(EC)最大等距力的测量结果。
然后，每个肌肉经历十次收缩的EC发作，在此期间，在前200毫秒内等距刺激肌肉，之后以2Lf/秒的速率施加15％Lf长度变化。然后，将肌肉保持在此长度持续500毫秒，然后返回到起始肌肉长度。在10EC收缩之后，获得两次等距收缩以确定后EC最大等距力。在完成最终等距测量时，获得两个另外的被动拉伸以确定后EC被动机械测量结果。
在收缩测试后，将肌肉修剪成外部肌腱，吸干并称重至最接近0.01mg。随纤维长度和肌肉质量的变化计算肌肉的生理横截面积。对于所有分析，相对于肌肉生理横截面积将力归一化并报告为应激。
与用媒剂处理的Mdx小鼠相比，在出生后第1天(p1)以所有测试剂量(9x 109个vg；9x 1010个vg；2.7x 1011个vg)接受INS1201-AAV9的ICV注射的mdx小鼠表现出由EC引起的收缩力百分比的减弱降低(图10A)。图10B类似地显示，与经媒剂处理的小鼠相比，在p1时以三个测试剂量(9x 109个vg；9x 1010个vg；2.7x 1011个vg)接受INS1201-AAV9的ICV注射的小鼠表现出改善的肌肉生理学，如后离心收缩应力相对于前离心收缩应力的增加的百分比所指示。
与用媒剂处理的mdx小鼠相比，在出生后第28天(p28)以三个最高测试剂量(2.7x1011个vg；5.4x 1011个vg；1.2x 1012个vg)接受INS1201-AAV9的ICV注射的Mdx小鼠表现出由EC引起的收缩力百分比的减弱降低(图10C、10D)。
与用媒剂处理的mdx小鼠相比，在出生后第28天(p28)以三个最高测试剂量(2.7x1011个vg；5.4x 1011个vg；1.2x 1012个vg)接受INS1201-AAV9的ICV注射的Mdx小鼠表现出改善和稳定的肌肉功能，如在不同频率刺激后峰值肌肉力量的增加所示(图10E、图10F)。
实例6：一个剂量的AAV9鞘内施用靶向到骨骼肌和心肌组织的转基因递送
向食蟹猴鞘内施用AAV9-CBA-GFP，使用高度特异性抗AAV9ELISA对所述食蟹猴进行针对抗AAV9抗体的筛选。经由单次鞘内剂量用2.5×1013个vg、5×1013个vg或1×1014个vg的AAV9-CBA-GFP对猕猴受试者进行处理，并且通过用NovaRed GFP免疫染色和HRP底物的免疫组织化学分析、RT-PCR和蛋白质印迹分析确定GFP的表达。
如图11所示，与接受静脉内施用的5×1013个vg(ii)或1×1014个vg(iii)AAV9-CBA-GFP的猕猴受试者相比，接受以2.5×1013个vg(iv)、5×1013个vg(v)或1×1014个vg(vi)的单鞘内剂量的AAV9-CBA-GFP的食蟹猴表现出腓肠肌(图11A)、四头肌(图11B)、三角肌(图11C)、三头肌(图11D)和二头肌(图11E)肌肉组织中GFP染色增加。类似地，以2.5×1013个vg(iii)、5×1013个vg(iv)或1×1014个vg(v)接受单次鞘内剂量的AAV9-CBA-GFP的食蟹猴表现出膈膜(图11F)、胫骨前肌(图11G)和心脏(图11H)肌肉组织中的GFP染色增加，如与接受静脉内施用5×1013个vg(i)或1×1014个vg(ii)AAV9-CBA-GFP的猕猴受试者相比。如图11A-E(i)所示，未经注射的猕猴受试者表现出很少GFP染色或没有GFP染色。
如图11I所示，以5×1013个vg(i)或1×1014个vg(ii)接受单次静脉内剂量的AAV9-CBA-GFP的食蟹猴表现出肝组织中的高水平GFP染色，而以2.5×1013个vg(iii)、5×1013个vg(iv)或1×1014个vg(v)接受单次鞘内剂量的AAV9-CBA-GFP的受试者表现出显著更低的GFP染色。
如图12所示，图11中示出的GFP的免疫组织化学染色与通过抗GFP蛋白质印迹检测到的蛋白质水平相对应。以2.5×1013个vg(图12A)、5×1013个vg(图12B)或1×1014个vg(图12C)接受单次鞘内剂量的AAV9-CBA-GFP的食蟹猴表现出二头肌(1)、三头肌(2)、三角肌(3)、四头肌(4)、腓肠肌(5)、胫骨前肌(6)、膈膜(7)和心脏(8)肌肉组织中的GFP水平增加，而在未经注射的受试者的二头肌(图12D，1)或三头肌(图12D，2)中，通过蛋白质印迹未检测到GFP蛋白。
如图13所示，图11和12中示出的GFP蛋白水平与GFP mRNA水平相对应，其中接受单次鞘内剂量的AAV9-CBA-GFP的食蟹猴表现出在二头肌(1)、三头肌(2)、三角肌(3)、胫骨前肌(4)、腓肠肌(5)、四头肌(6)、膈膜(7)和心脏(8)肌肉组织中的可检测的GFP mRNA表达，如通过RT-PCR分析的。在肝组织(9)中检测到最小GFP mRNA，并且在从未经注射的受试者中收集的二头肌(10)、三头肌(11)、三角肌(12)和四头肌(13)肌肉组织中未检测到GFP mRNA。
实例7：单剂量施用脑室内注射INS1201-AAV9后的C57BL/6J小鼠的毒性和生物分
布研究
测试系统
●物种：小家鼠(Mus musculus)
●品种：C57BL/6J
●性别：雄性
●年龄：在第1天时为大约4周龄
●体重：与年龄相称
●数量：192只(+额外60只)
●笼养：根据ASC SOP
●最小适应：5天
物种/品种、数量和性别。本研究获得了在研究开始时为大约4周龄的至多252只雄性C57BL/6J(品种编号000664)小鼠。研究中仅使用雄性小鼠，因为预期患者群体仅为男性。
起始年龄和体重范围。选择用于本研究的动物在研究开始时的年龄和体重应尽可能一致。动物在递送时将为大约3周龄，并且在研究的第1天时将为大约4周龄。
动物将被喂食特定物种的饮食，随意喂食。已知饮食中不存在会干扰本研究的结果的水平的污染物。将向每只动物随意提供辐照水。
本研究中使用的测试制品和对照制品分别在表2和表3中提供。
实验设计
研究设计
本研究由三个群组组成：分配到群组1的动物将在注射程序后第85±10天终止，分配到群组2的动物将在注射程序后第43±7天终止，并且群组3将在注射程序后第22±3天终止。总体研究设计呈现于表4中。可以对额外动物给药并且用于替换由于程序活动(即，注射、约束和在注射和/或血液采集期间的操作)直接引起的研究组动物的任何计划外死亡。可以替换在第4天(注射后3天)之前无法在测试制品施用程序中存活、死亡或需要提前终止的动物。这些动物将不会经受肉眼尸检(gross necropsy)。如有必要，可以替换不符合年龄纳入标准的动物。将报告所有动物死亡，无论注射后死亡的时间如何。对于组1-4，在每个给定的时间点，将使用5只动物进行血液学、血液ddPCR和组织ddPCR；5只动物将用于临床化学和组织病理学；并且5只动物进行凝血测试和组织病理学检查(n＝15/组/时间点)。所有组5只动物将在第12周安乐死以用于血液学、临床化学和凝血(对于每个测试，n＝4)。来自组5的五(5)只动物将用于组织病理学，而来自其余动物的组织将被收集和保存。
群组1-第85±10天终止。对于本研究的群组1，基于动物的组分配(表1)，60只分配到组1-4的动物将在第1天接受脑室内(ICV)注射。群组1中的另外12只动物是组5动物(“原初/未经处理”，表1)的一部分，其将不被注射。在研究第85±10天，将终止所有组1-5中的动物，并且将如表5所述收集血液和组织样品。
群组2-第43±7天终止。对于群组2，基于动物的组分配(表1)，60只动物将在第1天接受ICV注射。在研究第43±7天，将终止所有动物，并且将如表6所述收集血液和组织样品。
群组3-第22±3天终止。对于群组3，基于动物的组分配(表1)，60只动物将在第1天接受ICV注射。在研究第22±3天，将终止所有动物，并且将如表7所述收集血液和组织样品。
组分配。根据表5、6和7，将动物按三个单独的群组排序并分配到研究组。将对每个动物群组，包含额外动物，每组至多12只动物进行称重，并根据体重以递减顺序分配1至X的数字等级(最重动物将被分配等级＝1)。然后，根据研究设计，基于终止群组，将动物依序分配到每个研究组(参见表5、6、7)。
偏差控制。将尽一切努力最小化潜在研究偏差，包含：(a)纳入适当的对照组；(b)将动物随机分配到研究组；以及(c)跨组对动物进行适当交错给药。
测试制品施用进而研究程序
麻醉和外科手术准备。使用吸入麻醉剂(1％-5％异氟烷，以及100％氧气用于诱导；1％-3％用于外科手术期间的维持)麻醉动物。可替代地，用腹膜内施用的氯胺酮(至多80mg/kg)和甲苯噻嗪(至多12mg/kg)混合物麻醉动物。
测试制品制备和递送。所有测试制品制备和施用将由赞助者指定的人员进行。在第1天，对于每个群组(表5-7)，基于动物的组分配，通过立体定位注射到心室中向所有动物施用媒剂和测试制品。测试和对照制品将保存在冰上或2-8℃之间，直到准备好使用为止。
群组注射策略。每个终止日群组的注射将在3-4天内进行。在每个单独的注射日，将对大约15-30只小鼠进行注射。考虑到测试制品剂量调配物，在每个群组的第一天，将完成所有小鼠的剂量1的注射，随后在时间允许的情况下对组1中的动物子组进行媒剂注射。在每个群组的第二天，将完成所有剂量2小鼠的注射，随后在注射团队的时间允许的情况下，对第二动物子组进行媒剂注射。在每个群组的第三天，将完成所有剂量3小鼠的注射，随后在注射团队的时间允许的情况下，对第三动物子组进行媒剂注射。如果并非所有经媒剂注射的小鼠都已在前3天内注射，则剩余媒剂注射将在第四天进行。
处理。将根据表5、6和7，通过将处理直接注射到侧脑室中来向动物施用处理。根据给药组，每只动物将在单次外科手术程序中接受1次单侧注射或2次注射(双侧/每侧一次注射)。外科手术程序将使用立体定位器械进行。注射装置、手术器械、盖布和工作服在适当的情况下将是无菌的。对如下所述的程序的修改可以根据外科医生的决定执行。将施用单剂量的美洛昔康(meloxicam)(1mg/kg，SC/IM)和/或丁丙诺啡(buprenorphine)(0.01-0.05mg/kg SC)，以帮助缓解在颅骨切口之前诱导麻醉后的外科手术疼痛。在动物麻醉的情况下，将剃除颅骨之上的皮肤(根据需要)，并且将动物安置在立体定位框架中，将动物保持在鼻锥上以用于麻醉，其中头部视情况通过使用耳杆和切牙杆定位。无菌技术将用于所有外科手术程序。将皮肤用必妥碘(betadine)溶液、随后用70％酒精擦拭物或等效物消毒。
将在颅骨之上的中线处制作大约2cm的切口。电灼术可以用于实现切口部位的任何小出血的止血。将具有汉密尔顿2英寸、26规格(或更小)、12度斜角不锈钢针的汉密尔顿注射器连接到立体定位装置的Z轴。基于前囟，以下近似立体定位坐标将用于单侧或双侧靶向侧脑室：
●注射坐标：
○前部-后部(AP)：-0.5至-0.8mm
○中部-外侧(ML)：+/-1.0mm*
○当施用单侧注射时，注射在脑的右侧。当施用双侧注射时，第一次注射在右侧，第二次注射在左侧。
○背侧-腹侧(DV)：-2.5mm
注射的实际位置可以由外科医生根据需要调整。如果坐标与上述坐标不同，则将其记录在手术记录的原始数据中。
一旦针处于期望的位置，则将注射器柱塞缓慢向下推动以将给药溶液注射到颅骨空间中。注射期间和注射后立即监测注射部位，以确认注射质量。
期望的注射体积为每注射部位8μL。注射将靶向侧脑室并且将包含总共1次或2次注射。在递送处理之后，将针头留在适当位置处持续大约1分钟以防止回流。将在注射动物的注射表上记录任何注射异常(渗漏、回流等)。在完成注射并移除针头之后，使用VetBondTM外科胶水将切口闭合，并且可以用缝合线加固。可以基于动物的实时状态对外科手术程序进行轻微改变，并且将不会被视为偏离研究方案。
术后护理。外科手术程序后，将动物在恢复期间保持在热支撑上，并且将放置成侧向斜卧状态，根据需要交替换边。向小鼠皮下施用无菌盐水(大约0.5至1mL)。还可以在笼底板上向动物提供其饲料和饮食凝胶作为其外科手术恢复期间的补充饲料。
存活期观察和测量
常规一般健康观察。饲养人员将观察动物在适应期期间的总体外观、行为和疾病迹象的变化，并将记录作为设施记录的一部分存档。从第1天开始，在整个研究过程中记录每日观察结果，直到指定的终止日为止。将从研究中排除在第1天之前表现出非正常临床体征的任何动物。
研究前临床观察。在第1天之前，所有动物都将接受详细的临床体征检查。将注意到指示健康状况不佳、应激或其它异常的临床体征，并且研究负责人/主治兽医和赞助者代表可以决定将动物从研究中排除。
临床观察。所有研究动物将在术后6-10天接受详细的临床观察，然后每周一次，结合体重，直到计划的终止为止。在计划观察之外记录的观察结果将作为计划外观察输入。评估将包含但不限于：对运动活动、神经观察、姿势、呼吸、水合状态、外科手术部位、刻板行为、膀胱和肠道(粪便)观察以及总体身体状况的评估。
将记录计划临床观察期间是否存在发现。将记录指示健康状况不佳、应激和疼痛的临床体征，并将报告给主治兽医。主治兽医将对在濒死状态下实施安乐死的任何动物进行最终详细检查。
体重。在动物到达后不久，将记录个体的体重以进行初始组分配。将在给药前不超过4天获取基线体重。将每周进行一次体重测量(与临床观察一致)，直到计划的终止，并且将在计划的终止之前测量最终体重。根据研究负责人的判断，如果观察到不良健康或体重减轻的迹象(即，大于或等于前一周体重的10％)，则可以更频繁地测量体重。
计划的处死。将如下所述对存活至其计划的终止日期、研究第22±3天、第43±7天、第85±10天的动物进行人道安乐死、尸检以及血液和组织样品收集。将根据《AVMA动物安乐死指南(AVMA Guidelines for Euthanasia of Animals)》:2020版对动物实施安乐死。
样品/样本收集
血液收集。在尸检之前，可以将动物转移到麻醉箱中，并使用异氟烷(1％-2％)麻醉以进行血液收集，以用于血液学和液滴数字聚合酶链反应(ddPCR)、血清化学和凝血。将使用25g针和1cc注射器或类似注射器通过心脏穿刺或其它适当的血管从每只动物收集适当体积的全血。将在所有研究动物的计划的终止日收集血液样品。将根据ASC SOP对血液进行处理，并发送至QVL进行分析。
用于血液学和ddPCR的样品
对于血液学，将大约250-500μL的全血放置到含有K2EDTA作为抗凝血剂的小瓶中，轻轻倒置数次以混合，并且放在湿冰上，直到储存在设定为保持2℃至8℃的冰箱中为止。
血液学
收集体积：大约250-500μL
抗凝血剂：K2EDTA
要分析的血液学参数在表8中提供。
通过数字液滴聚合酶链式反应(ddPCR)进行的生物分布。此外，将收集大约250-500μL全血，以用于通过ddPCR分析进行生物分布。将全血放置到作为抗凝血剂的K2EDTA中，轻轻倒置数次以混合，并且放置在干冰上，直到在-80℃±10℃下储存为止。
用于临床化学的样品。对于临床化学，将大约500-1000μL的全血收集到不含抗凝血剂的管中，并允许在离心前在室温下凝结至少30分钟。将凝结的全血在4℃的温度下以大约3000×g离心5分钟以产生血清。将在离心后将血清样品分离，在收集之后立即在干冰上冷冻，并且在-80℃±10℃下冷冻保存。
要分析的血清化学参数在表9中提供。
用于凝血的样品。离心后将血浆样品分离，并储存在设定为维持-10℃至-30℃的冷冻箱中。
凝血。收集体积：大约300-800μL；抗凝血剂：3.2％柠檬酸钠；处理：至血浆。分析的参数：凝血酶原时间(PT)；激活部分凝血活酶时间(APTT)；纤维蛋白原。
肉眼尸检。尸检将由对动物的一般身体状况和组织(呼吸、心血管、消化和泌尿生殖系统)进行系统性、宏观的外部和内部检查组成。将对所有计划的和计划外的处死执行此尸检。将记录并保存任何肉眼病变。下文详细描述了关于组织收集的细节。经过培训并且合格的研究人员将进行肉眼尸检和组织收集。
组织收集。要在终止时收集并通过组织病理学或ddPCR进行分析的组织呈现于表10中。
组织收集：组织病理学。根据表2、3和4，将在动物的指定终止日从动物收集用于组织病理学的组织。将收集表6中标记的用于组织病理学的所有组织(眼睛除外)，包含肉眼病变/异常组织，并将其固定在10％中性缓冲福尔马林(neutral buffered formalin，NBF)中。将眼睛在戴维森溶液(Davidson Solution)中固定24至48小时，然后转移到70％乙醇中。
将组织修剪、处理、包埋在石蜡中、切片、用H&E染色并盖上盖子。如果可能的话，将横向地和纵向地对肌肉进行切片。对所得载玻片进行显微镜质量检查。所有制备的载玻片将由ACVP兽医病理学家评估。将发布病理学报告草稿，其由表格式显微镜数据和值得注意的变化的讨论组成。将拍摄显微照片并注释。
ddPCR分析。将收集并保留表10中列出的组织的代表性样品用于ddPCR分析。将作为一大部分收集的样本放入管中，在液氮中快速冷冻，放置在含有干冰的冷却器中，直到放置在设定为保持-60℃至-80℃的冰箱中为止。
实例8：在非人灵长类动物(NHP)中鞘内递送后INS1201-AAV9的生物分布
测试系统
●属：猕猴属(Macaca)
●物种：食蟹猴
●性别：雄性
●体重：约2-5kg
响应于鞘内施用，测量INS1201-AAV9在外周和骨骼肌中的生物分布。
所有注射均在脊髓的腰椎间隙鞘内进行。使用总共十二(12)只动物，如表11所提供的：
选择用于研究的动物将是介于2月龄与5岁之间的幼猴或成年猴，体重为大约3kg。对动物进行预筛选并且对AAV9抗体呈阴性。预筛选血液收集将在注射程序前2个月内进行。使用于筛选的动物镇静并收集血液样品。
在输注前几周将所选动物带到医院区域。在输注当天(d0)，使受试者镇静并收集血液样品用于化学分析和细胞计数(CBC)。然后根据上述给药表向受试者注射单剂量的INS1201--AAV9。将所有小于9月龄的动物与其母兽一起饲养。将大于9月龄的动物分小组饲养。
注射通过腰椎穿刺到腰椎囊膜的蛛网膜下腔中进行。对于鞘内(IT)注射，将受试者置于侧卧位，并且鉴定后部中线注射部位为约L4/5水平(在脊髓的圆锥下方)。在无菌条件下，插入带管心针的脊椎针，通过针中流出的透明CSF以及注射小体积的碘海醇，随后进行术中骨髓造影来确认蛛网膜下腔插管。抽取大约1ml CSF，收集并冷冻作为基线样品。这是为了减轻由后续注射测试制品产生的压力增加。为了改善测试制品的吻侧流动分布，然后受试者将以特伦德伦伯卧位(头部略微向下位置)倾斜。这是在人类受试者中执行CT骨髓造影时的常规程序。对于CSF抽液/IT输注，皮下注射针(22G3/4或11/2”)也可以用于此目的。
生命期观察：将经处理的NHP保持隔离，以减少暴露于混杂的毒性源。由兽医人员观察受试者的活动、相对皮肤颜色和总体健康状况，每天两次。注射后，将动物保留大约21天。对在安乐死时收集的样品进行生物分布和临床化学测试。
从脊髓收集以下区段用于生物分布研究：颈椎脊髓、胸椎脊髓、腰椎脊髓、骶骨脊髓、背根神经节(DRG)根颈椎水平、DRG根胸椎水平、DRG根腰椎水平。对于每个脊髓区段，总共收集两件。将一件储存在4％多聚甲醛(PFA)中，并且将一件快速冷冻。
对于肌肉和器官，各收集四个样品。将两个放置在4％ PFA中，并且将两个快速冷冻。收集以下肌肉的样品：膈膜、带肋间肌和神经的#6/#7肋、腰大肌、三角肌、胸大肌、肱二头肌、肱三头肌、股直肌、股内侧肌、股外侧肌、腓肠肌、胫骨前肌、比目鱼肌、舌头、咬肌、趾长伸肌、腹直肌。收集以下器官的样品：心脏、肝、肺、肾脏、脾脏。
临床化学测试如下：AST、ALT、GGT、碱性磷酸酶、钾、钠、氯化物、肌酸酐、血尿素氮、CBC。
脑样品收集如下。将小脑与脑的其余部分分离。将小脑切成四个象限，其中将右侧两个象限储存在4％ PFA中，并且将左侧两个象限快速冷冻。将脑分为右半球和左半球。然后，将脑切成四个象限(冠状切割)，其中将右侧两个象限储存在4％ PFA中，并且将左侧两个象限快速冷冻。
从四头肌采集六份样品用于后续肌肉活检。将三个储存在4％ PFA中，并且将三个快速冷冻。
还收集脑脊液(CSF)和血清用于生物分布研究。
通过液滴数字聚合酶链反应(ddPCR)对上述样品进行生物分布研究。
通过引用并入
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等效形式
在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下，本公开可以其它特定形式来体现。因此前述实施例在所有方面都应被认为是说明性的，而不是限制本文所述的发明。因此，本发明的范围由所附权利要求而不是前述描述来指示，并且在权利要求的含义和等效范围内的所有变化都旨在包含在其中。
Claims (169)
1.一种鞘内组合物，其包括有效量的腺相关病毒(AAV)颗粒和药学上可接受的载剂，其中所述AAV颗粒包括使载体基因组衣壳化的衣壳，其中所述载体基因组从5'至3'包括：
5'反向末端重复序列(ITR)；
启动子；
SV40内含子；
微抗肌萎缩蛋白(μDys)转基因；
SV40 poly(A)尾；以及
3'ITR，
其中与静脉内组合物中的使μDys转基因衣壳化的有效量的AAV颗粒相比，所述有效量的所述AAV颗粒包括约90％或更少的载体基因组。
2.一种鞘内组合物，其包括有效量的腺相关病毒(AAV)颗粒和药学上可接受的载剂，其中所述AAV颗粒包括使载体基因组衣壳化的衣壳，其中所述载体基因组从5'至3'包括：
5'ITR；
增强子；
启动子；
微抗肌萎缩蛋白(μDys)转基因；
SV40 poly(A)尾；以及
3'ITR，
其中与静脉内组合物中的使μDys转基因衣壳化的有效量的AAV颗粒相比，所述有效量的所述AAV颗粒包括约90％或更少的载体基因组。
3.根据权利要求2所述的鞘内组合物，其中所述增强子是SK-CRM4增强子。
4.根据权利要求3所述的鞘内组合物，其中所述SK-CRM4增强子具有包括SEQ ID NO:8的序列。
5.根据权利要求2所述的鞘内组合物，其中所述增强子是巨细胞病毒(CMV)增强子。
6.根据权利要求5所述的鞘内组合物，其中所述巨细胞病毒(CMV)增强子具有包括SEQID NO:9的序列。
7.根据权利要求2所述的鞘内组合物，其中所述载体基因组进一步包括位于所述微抗肌萎缩蛋白转基因的5'(上游)和位于所述启动子的3'(下游)的SV40内含子。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的鞘内组合物，其中所述载体基因组包括微抗肌萎缩蛋白(μDys)转基因，所述μDys转基因编码μDys蛋白，所述μDys蛋白包括：(i)包括肌动蛋白结合位点的N末端区(NTD)；(ii)包括二至四个铰链区和四至六个血影蛋白重复序列的中心杆结构域；以及(iii)富含半胱氨酸的结构域。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的鞘内组合物，其中所述载体基因组静脉内组合物包括AAV颗粒，所述AAV颗粒使微抗肌萎缩蛋白(μDys)转基因衣壳化，所述μDys转基因编码μDys蛋白，所述μDys蛋白包括：(i)包括肌动蛋白结合位点的N末端区(NTD)；(ii)包括三个铰链区和四个血影蛋白重复序列的中心杆结构域；以及(iii)富含半胱氨酸的结构域。
10.根据权利要求8或9所述的鞘内组合物，其中所述血影蛋白重复序列包括血影蛋白重复序列16和17。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的鞘内组合物，其中所述血影蛋白重复序列包括血影蛋白重复序列1和24。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的鞘内组合物，其中所述血影蛋白重复序列包括血影蛋白重复序列2。
13.根据权利要求8至11中任一项所述的鞘内组合物，其中所述血影蛋白重复序列包括血影蛋白重复序列22。
14.根据权利要求8至13中任一项所述的鞘内组合物，其中所述血影蛋白重复序列包括血影蛋白重复序列23。
15.根据权利要求8所述的鞘内组合物，其中所述血影蛋白重复序列包括血影蛋白重复序列1、16、17、23和24。
16.根据权利要求8所述的鞘内组合物，其中所述血影蛋白重复序列包括血影蛋白重复序列1、2、3和24。
17.根据权利要求8所述的鞘内组合物，其中所述血影蛋白重复序列包括血影蛋白重复序列1、2、22、23和24。
18.根据权利要求8至17中任一项所述的鞘内组合物，其中所述铰链区包括抗肌萎缩蛋白铰链区1和4。
19.根据权利要求8至17中任一项所述的鞘内组合物，其中所述铰链区包括铰链区1、3和4。
20.根据权利要求1至9中任一项所述的鞘内组合物，其中所述微抗肌萎缩蛋白转基因包括SEQ ID NO:5。
21.根据权利要求1至9中任一项所述的鞘内组合物，其中所述微抗肌萎缩蛋白转基因由SEQ ID NO:5组成。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的鞘内组合物，其中所述5'ITR是AAV2 ITR。
23.根据权利要求22所述的鞘内组合物，其中所述5'AAV2 ITR具有包括SEQ ID NO:1的序列。
24.根据权利要求22或23所述的鞘内组合物，其中所述5'AAV2 ITR具有由SEQ ID NO:1组成的序列。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的鞘内组合物，其中所述3'ITR是AAV2 ITR。
26.根据权利要求25所述的鞘内组合物，其中所述3'AAV2 ITR具有包括SEQ ID NO:7的序列。
27.根据权利要求25或26所述的鞘内组合物，其中所述3'AAV2 ITR具有由SEQ ID NO:7组成的序列。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的鞘内组合物，其中所述启动子是MHCK7启动子。
29.根据权利要求1至27中任一项所述的鞘内组合物，其中所述启动子是鸡β-肌动蛋白杂合启动子。
30.根据权利要求29所述的鞘内组合物，其中所述鸡β-肌动蛋白杂合启动子包括SEQID NO:3中所示的序列。
31.根据权利要求28所述的鞘内组合物，其中所述MHCK7启动子包括SEQ ID NO:2中所示的序列。
32.根据权利要求28所述的鞘内组合物，其中所述MHCK7启动子由SEQ ID NO:2中所示的序列组成。
33.根据权利要求1和3至32中任一项所述的鞘内组合物，其中所述SV40内含子包括SEQID NO:4中所示的核酸序列。
34.根据权利要求1和3至32中任一项所述的鞘内组合物，其中所述SV40内含子由SEQID NO:4中所示的核酸序列组成。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的鞘内组合物，其中所述SV40poly(A)尾包括SEQID NO:6中所示的核酸序列。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的鞘内组合物，其中所述SV40poly(A)尾由SEQID NO:6中所示的核酸序列组成。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的鞘内组合物，其中所述衣壳包括一种或多种AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAVrh.74、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或AAV13衣壳蛋白。
38.根据权利要求1至36中任一项所述的鞘内组合物，其中所述AAV颗粒是AAV9颗粒，并且所述衣壳由AAV9衣壳蛋白组成。
39.根据权利要求1至36中任一项所述的鞘内组合物，其中所述AAV颗粒是AAV9颗粒，并且所述衣壳由AAV9衣壳蛋白组成。
40.根据权利要求1至36中任一项所述的鞘内组合物，其中所述衣壳包括一种或多种AAV9衣壳蛋白。
41.根据权利要求40所述的鞘内组合物，其中所述一种或多种AAV9衣壳蛋白包括AAV9衣壳蛋白VP1。
42.根据权利要求40或41所述的鞘内组合物，其中所述一种或多种AAV9衣壳蛋白包括AAV9衣壳蛋白VP2。
43.根据权利要求40至42中任一项所述的鞘内组合物，其中所述一种或多种AAV9衣壳蛋白包括AAV9衣壳蛋白VP3。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的鞘内组合物，其中所述AAV颗粒是AAV9颗粒。
45.根据权利要求1至44中任一项所述的鞘内组合物，其中与所述静脉内组合物中的所述有效量的所述AAV颗粒相比，所述鞘内组合物中的所述有效量的所述AAV颗粒包括约80％或更少的载体基因组。
46.根据权利要求1至42中任一项所述的鞘内组合物，其中与所述静脉内组合物中的所述有效量的所述AAV颗粒相比，所述有效量的所述AAV颗粒包括约70％或更少的载体基因组。
47.根据权利要求1至42中任一项所述的鞘内组合物，其中所述有效量的所述AAV颗粒包括的载体基因组是所述有效量的所述静脉内组合物中的载体基因组的约1/40至1/10。
48.一种治疗有需要的受试者的抗肌萎缩蛋白病的方法，所述方法包括以单剂量向所述受试者鞘内施用根据权利要求1至47中任一项所述的鞘内组合物。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述受试者是约6月龄至约7岁的雄性受试者。
50.根据权利要求48所述的方法，其中所述受试者是约1岁至约7岁的雄性受试者。
51.根据权利要求48所述的方法，其中所述受试者是约2岁至约7岁的雄性受试者。
52.根据权利要求48所述的方法，其中所述受试者是约3岁至约7岁的雄性受试者。
53.根据权利要求48所述的方法，其中所述受试者是约4岁至约7岁的雄性受试者。
54.根据权利要求48所述的方法，其中所述受试者是约5岁至约7岁的雄性受试者。
55.根据权利要求48所述的方法，其中所述受试者是约2岁至约6岁的雄性受试者。
56.根据权利要求48所述的方法，其中所述受试者是约2岁至约5岁的雄性受试者。
57.根据权利要求48至56中任一项所述的方法，其中所述抗肌萎缩蛋白病是杜兴氏肌肉萎缩症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)。
58.根据权利要求48至56中任一项所述的方法，其中所述抗肌萎缩蛋白病是贝克型肌肉萎缩症(Becker muscular dystrophy)。
59.根据权利要求48至56中任一项所述的方法，其中所述抗肌萎缩蛋白病是DMD相关扩张型心肌病(DCM)。
60.根据权利要求48至59中任一项所述的方法，其中在所述治疗期间使所述受试者置于特伦德伦伯卧位(Trendelenburg position)。
61.根据权利要求48至60中任一项所述的方法，其中在不存在非离子、低渗透压造影剂的情况下施用所述鞘内组合物。
62.根据权利要求45至61中任一项所述的方法，其中所述鞘内组合物中的所述有效量的所述AAV颗粒提供比静脉内施用的相同载体基因组剂量的相同AAV颗粒更大的治疗应答。
63.根据权利要求48至62中任一项所述的方法，其中所述鞘内组合物中的所述有效量的所述AAV颗粒提供比在静脉内施用时所述静脉内组合物中的相同载体基因组剂量的所述AAV颗粒更大的治疗应答。
64.根据权利要求48至63中任一项所述的方法，其中与所述静脉内组合物中的所述AAV颗粒的有效载体基因组剂量相比，所述鞘内组合物包括约90％、约90％或更少、约75％、约75％或更少、约50％、约50％或更少、约25％或约25％或更少的所述有效载体基因组剂量。
65.根据权利要求48至63中任一项所述的方法，其中与所述静脉内组合物中的所述AAV颗粒的所述有效载体基因组剂量相比，鞘内组合物包括约90％或更少载体基因组的所述有效载体基因组剂量。
66.根据权利要求48至63中任一项所述的方法，其中与所述静脉内组合物中的所述AAV颗粒的所述有效载体基因组剂量相比，鞘内组合物包括约80％或更少载体基因组的所述有效载体基因组剂量。
67.根据权利要求48至63中任一项所述的方法，其中与所述静脉内组合物中的所述AAV颗粒的所述有效载体基因组剂量相比，所述鞘内组合物包括约75％或更少载体基因组的所述有效载体基因组剂量。
68.根据权利要求48至63中任一项所述的方法，其中与所述静脉内组合物中的所述AAV颗粒的所述有效载体基因组剂量相比，所述鞘内组合物包括约50％或更少载体基因组的所述有效载体基因组剂量。
69.根据权利要求48至63中任一项所述的方法，其中与所述静脉内组合物中的所述AAV颗粒的所述有效载体基因组剂量相比，所述鞘内组合物包括约25％或更少载体基因组的所述有效载体基因组剂量。
70.根据权利要求48至69中任一项所述的方法，其中治疗包括使所述受试者的治疗后的北极星移动评价量表(NorthStar Ambulatory Assessment，NSAA)评分与所述受试者的基线NSAA评分相比有所增加。
71.根据权利要求70所述的方法，其中使所述评分增加包括使所述评分增加了约5至约25、约5至约20、约5至约15或约5至约10。
72.根据权利要求70所述的方法，其中使所述评分增加包括使所述评分增加了约2至约12分。
73.根据权利要求70所述的方法，其中使所述评分增加包括使所述评分增加了约2至约10分。
74.根据权利要求70所述的方法，其中使所述评分增加包括使所述评分增加了约3至约10分。
75.根据权利要求70所述的方法，其中使所述评分增加包括使所述评分增加了约4至约10分。
76.根据权利要求0所述的方法，其中使所述评分增加包括使所述评分增加了约2至约8分。
77.根据权利要求70所述的方法，其中使所述评分增加包括使所述评分增加了约2至约6分。
78.根据权利要求70至77中任一项所述的方法，其中在所述受试者经历所述治疗方法之前，测量所述受试者的所述基线NSAA评分。
79.根据权利要求70至78中任一项所述的方法，其中在鞘内施用所述组合物后六(6)个月测量治疗后的所述NSAA评分。
80.根据权利要求70至78中任一项所述的方法，其中在鞘内施用所述组合物后十二(12)个月测量治疗后的所述NSAA评分。
81.根据权利要求70至78中任一项所述的方法，其中在鞘内施用所述组合物后十八(18)个月测量治疗后的所述NSAA评分。
82.根据权利要求70至78中任一项所述的方法，其中在鞘内施用所述组合物后二十四(24)个月测量治疗后的所述NSAA评分。
83.根据权利要求48至82中的一项所述的方法，其中治疗包括使在治疗后由所述受试者在六分钟步行测试(6MWT)中步行的米数与由所述受试者在所述6MWT中步行的基线米数相比有所增加。
84.根据权利要求83所述的方法，其中在所述受试者经历所述治疗方法之前，测量由所述受试者在所述6MWT中步行的所述基线米数。
85.根据权利要求83或84所述的方法，其中在鞘内施用所述组合物后六(6)个月评估治疗后的所述六分钟步行测试(6MWT)。
86.根据权利要求83或84所述的方法，其中在鞘内施用所述组合物后十二(12)个月评估治疗后的所述六分钟步行测试(6MWT)。
87.根据权利要求83或84所述的方法，其中在鞘内施用所述组合物后十八(18)个月评估治疗后的所述六分钟步行测试(6MWT)。
88.根据权利要求83或84所述的方法，其中在鞘内施用所述组合物后二十四(24)个月测量治疗后的所述六分钟步行测试(6MWT)。
89.根据权利要求83或84所述的方法，其中在鞘内施用所述组合物后三十六(36)个月测量治疗后的所述六分钟步行测试(6MWT)。
90.根据权利要求83或84所述的方法，其中在鞘内施用所述组合物后四十八(48)个月测量治疗后的所述六分钟步行测试(6MWT)。
91.根据权利要求83或84所述的方法，其中在鞘内施用所述组合物后六十(60)个月测量治疗后的所述六分钟步行测试(6MWT)。
92.根据权利要求83至91中任一项所述的方法，其中使由所述受试者在所述6MWT中步行的米数增加包括增加了约5米至约50米、约5米至约45米、约5米至约40米、约5米至约35米、约5米至约30米、约5米至约25米、约5米至约20米、约5米至约15米或约5米至约10米。
93.根据权利要求48至92中任一项所述的方法，其中与以有效剂量静脉内施用的使μDys转基因衣壳化的AAV颗粒相比，有效量的鞘内施用的AAV颗粒使副作用的数量减少或一种或多种副作用的严重程度降低。
94.根据权利要求48至93中任一项所述的方法，其中与肝组织中的μDys转基因表达的量相比，所述鞘内组合物在骨骼肌和心肌中提供更大的μDys转基因表达。
95.根据权利要求48至93中任一项所述的方法，其中与肝组织中的μDys转基因表达的量相比，所述有效量的所述鞘内组合物在骨骼肌或心肌中提供更大的μDys转基因表达。
96.根据权利要求48至93中任一项所述的方法，其中与肝组织中的μDys转基因表达的量相比，所述有效量的所述鞘内组合物在骨骼肌中提供更大的μDys转基因表达。
97.根据权利要求48至93中任一项所述的方法，其中与肝组织中的μDys转基因表达的量相比，所述有效量的所述鞘内组合物在心肌中提供更大的μDys转基因表达。
98.根据权利要求94至97中任一项所述的方法，其中所述更大的μDys转基因表达是比所述肝组织中的μDys转基因表达的所述量大至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％的表达。
99.根据权利要求48至98中任一项所述的方法，其中在施用所述鞘内组合物后十八(18)个月测量的所述治疗应答与在施用所述鞘内组合物后十二(12)个月测量的所述治疗应答基本上相同或更好。
100.根据权利要求48至98中任一项所述的方法，其中在施用所述鞘内组合物后二十四(24)个月测量的所述治疗应答与在施用所述鞘内组合物后十二(12)个月测量的所述治疗应答基本上相同或更好。
101.一种用于将微抗肌萎缩蛋白(μDys)转基因优先递送到受试者的骨骼肌和/或心肌的方法，所述方法包括：
以单剂量向受试者鞘内施用鞘内组合物，所述鞘内组合物包括有效量的腺相关病毒血清型9(AAV9)颗粒和药学上可接受的载剂，其中所述AAV9颗粒包括使载体基因组衣壳化的AAV9衣壳，其中所述载体基因组从5'至3'包括：
5'ITR；
启动子；
μDys转基因；
SV40 poly(A)尾；以及
3'ITR，
其中在施用后，与所述受试者的肝组织中的转基因表达相比，所述μDys转基因在所述受试者的骨骼肌或心肌中以更高水平表达。
102.根据权利要求101所述的方法，其中在施用后，与所述受试者的肝组织中的所述μDys转基因表达相比，所述μDys转基因在所述受试者的所述骨骼肌中以更高水平表达。
103.根据权利要求101或102所述的方法，其中在施用后，与所述受试者的肝组织中的所述μDys转基因表达相比，所述μDys转基因在所述受试者的所述心肌中以更高水平表达。
104.根据权利要求101所述的方法，其中在施用后，与所述受试者的肝组织中的所述μDys转基因表达相比，所述μDys转基因在所述受试者的所述骨骼肌和所述心肌中以更高水平表达。
105.根据权利要求101至104中任一项所述的方法，其中所述更高水平比所述肝组织中的转基因表达的量高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％。
106.根据权利要求101至105中任一项所述的方法，其中所述5'ITR是AAV2 ITR。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述5'AAV2 ITR包括SEQ ID NO:1的序列。
108.根据权利要求106或107所述的方法，其中所述5'AAV2 ITR具有由SEQ ID NO:1组成的序列。
109.根据权利要求101至108中任一项所述的方法，其中所述3'ITR是AAV2 ITR。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述3'AAV2 ITR具有包括SEQ ID NO:7的序列。
111.根据权利要求101至110中任一项所述的方法，其中所述启动子是MHCK7启动子。
112.根据权利要求111所述的方法，其中所述MHCK7启动子具有包括SEQ ID NO:2的序列。
113.根据权利要求101至110中任一项所述的方法，其中所述启动子是鸡β-肌动蛋白杂合启动子。
114.根据权利要求113所述的方法，其中所述鸡β-肌动蛋白杂合启动子具有包括SEQID NO:3的序列。
115.根据权利要求101至114中任一项所述的方法，其中所述载体基因组进一步包括位于所述转基因的5'(上游)和位于所述启动子的3'(下游)的SV40内含子。
116.根据权利要求115所述的方法，其中所述SV40内含子具有包括SEQ ID NO:4的序列。
117.根据权利要求115或116所述的方法，其中所述SV40内含子具有由SEQ ID NO:4组成的序列。
118.根据权利要求101至117中任一项所述的方法，其中所述SV40 poly(A)尾具有包括SEQ ID NO:6的序列。
119.根据权利要求101至118中任一项所述的方法，其中所述载体基因组进一步包括位于所述5'ITR的3'(下游)和位于所述启动子的5'(上游)的增强子。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述增强子是SK-CRM4增强子。
121.根据权利要求120所述的方法，其中所述SK-CRM4增强子具有包括SEQ ID NO:8的序列。
122.根据权利要求119所述的方法，其中所述增强子是巨细胞病毒(CMV)增强子。
123.根据权利要求122所述的方法，其中所述巨细胞病毒(CMV)增强子具有包括SEQ IDNO:9的序列。
124.根据权利要求101至123中任一项所述的方法，其中在所述施用期间使所述受试者置于特伦德伦伯卧位。
125.根据权利要求101至124中任一项所述的方法，其中在不存在非离子、低渗透压造影剂的情况下施用所述组合物。
126.根据权利要求101至125中任一项所述的方法，其中与静脉内施用的相同AAV9颗粒的相同剂量相比，鞘内施用的AAV9颗粒的剂量在所述骨骼肌和/或所述心肌中提供更大的转基因表达。
127.根据权利要求101至126中任一项所述的方法，其中由所述鞘内施用的AAV9颗粒提供的[(骨骼肌和/或心肌转基因表达)]/(肝转基因表达)]的比率比在静脉内施用所述相同剂量的所述相同AAV9颗粒时的同一比率更大。
128.根据权利要求101至127中任一项所述的方法，其中所述转基因是编码微抗肌萎缩蛋白的微抗肌萎缩蛋白转基因，所述微抗肌萎缩蛋白包括：(i)包括肌动蛋白结合位点的NTD；(ii)包括二至四个铰链区和四至六个血影蛋白重复序列的中心杆结构域；以及(iii)富含半胱氨酸的结构域。
129.根据权利要求128所述的方法，其中所述血影蛋白重复序列包括血影蛋白重复序列16和17。
130.根据权利要求128或129所述的方法，其中所述血影蛋白重复序列包括血影蛋白重复序列1和24。
131.根据权利要求128至130中任一项所述的方法，其中所述血影蛋白重复序列包括血影蛋白重复序列2。
132.根据权利要求128至130中任一项所述的方法，其中所述血影蛋白重复序列包括血影蛋白重复序列22。
133.根据权利要求128至130中任一项所述的方法，其中所述血影蛋白重复序列包括血影蛋白重复序列23。
134.根据权利要求128所述的方法，其中所述血影蛋白重复序列包括血影蛋白重复序列16和17。
135.根据权利要求128所述的方法，其中所述血影蛋白重复序列包括血影蛋白重复序列1、16、17、23和24。
136.根据权利要求128所述的方法，其中所述血影蛋白重复序列包括血影蛋白重复序列1、2、3和24。
137.根据权利要求128所述的方法，其中所述血影蛋白重复序列包括血影蛋白重复序列1、2、22、23和24。
138.根据权利要求128至137中任一项所述的方法，其中所述铰链区包括抗肌萎缩蛋白铰链区1和4。
139.根据权利要求128至137中任一项所述的方法，其中所述铰链区包括铰链区1、3和4。
140.根据权利要求128所述的方法，其中所述微抗肌萎缩蛋白转基因包括SEQ ID NO:5。
141.根据权利要求48至140中任一项所述的方法，其中所述鞘内组合物中的所述AAV颗粒的所述有效量为约1.0×109至约1×1016个载体基因组。
142.根据权利要求48至140中任一项所述的方法，其中所述鞘内组合物中的所述AAV颗粒的所述有效量为约1.0×109至约1×1015个载体基因组。
143.根据权利要求48至140中任一项所述的方法，其中所述鞘内组合物中的所述AAV颗粒的所述有效量为约1.0×109至约1×1014个载体基因组。
144.根据权利要求48至140中任一项所述的方法，其中所述鞘内组合物中的所述AAV颗粒的所述有效量为约1.0×109至约1×1013个载体基因组。
145.根据权利要求48至140中任一项所述的方法，其中所述鞘内组合物中的所述AAV颗粒的所述有效量为约1.0×109至约1×1012个载体基因组。
146.根据权利要求48至140中任一项所述的方法，其中所述鞘内组合物中的所述AAV颗粒的所述有效量为约1.0×109至约1×1011个载体基因组。
147.根据权利要求48至140中任一项所述的方法，其中所述鞘内组合物中的所述AAV颗粒的所述有效量为约1.0×109至约1×1010个载体基因组。
148.根据权利要求141所述的方法，其中所述鞘内组合物中的所述AAV颗粒的所述有效量为约1×1010至1×1016个载体基因组。
149.根据权利要求141所述的方法，其中所述鞘内组合物中的所述AAV颗粒的所述有效量为约1×1010至1×1015个载体基因组。
150.根据权利要求141所述的方法，其中所述鞘内组合物中的所述AAV颗粒的所述有效量为约1×1010至1×1014个载体基因组。
151.根据权利要求141所述的方法，其中所述鞘内组合物中的所述AAV颗粒的所述有效量为约1×1010至1×1013个载体基因组。
152.根据权利要求141所述的方法，其中所述鞘内组合物中的所述AAV颗粒的所述有效量为约1×1010至1×1012个载体基因组。
153.根据权利要求141所述的方法，其中所述鞘内组合物中的所述AAV颗粒的所述有效量为约1×1010至1×1011个载体基因组。
154.根据权利要求141所述的方法，其中所述鞘内组合物中的所述AAV颗粒的所述有效量为约1×1011至1×1016个载体基因组。
155.根据权利要求141所述的方法，其中所述鞘内组合物中的所述AAV颗粒的所述有效量为约1×1012至1×1016个载体基因组。
156.根据权利要求141所述的方法，其中所述鞘内组合物中的所述AAV颗粒的所述有效量为约1×1013至1×1016个载体基因组。
157.根据权利要求141所述的方法，其中所述鞘内组合物中的所述AAV颗粒的所述有效量为约1×1014至1×1016个载体基因组。
158.根据权利要求141所述的方法，其中所述鞘内组合物中的所述AAV颗粒的所述有效量为约1×1015至1×1016个载体基因组。
159.根据权利要求141所述的方法，其中所述鞘内组合物中的所述AAV颗粒的所述有效量为约2.5×1013至1×1014个载体基因组。
160.根据权利要求48至159中任一项所述的方法，其中足以提供治疗应答的所述鞘内载体基因组剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述静脉内组合物的所述载体基因组剂量的约1/2、约1/5、约1/10、约1/15、约1/20、约1/25、约1/30、约1/35、约1/40、约1/45、约1/50、约1/55、约1/60、约1/65、约1/70、约1/75、约1/80、约1/85、约1/90、约1/95、约1/100、约1/150、约1/200、约1/250。
161.根据权利要求160所述的方法，其中足以提供治疗应答的所述鞘内载体基因组剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述静脉内组合物的所述载体基因组剂量的约1/40至1/10。
162.根据权利要求160所述的方法，其中足以提供治疗应答的所述鞘内载体基因组剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述静脉内组合物的所述载体基因组剂量的约1/20。
163.根据权利要求160所述的方法，其中足以提供治疗应答的所述鞘内载体基因组剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述静脉内组合物的所述载体基因组剂量的约1/40。
164.根据权利要求160所述的方法，其中足以提供治疗应答的所述鞘内载体基因组剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述静脉内组合物的所述载体基因组剂量的约1/100。
165.根据权利要求48至159中任一项所述的方法，其中足以提供治疗应答的所述鞘内载体基因组剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述静脉内组合物的所述载体基因组剂量的至多约1/2、至多约1/5、至多约1/10、至多约1/15、至多约1/20、至多约1/25、至多约1/30、至多约1/35、至多约1/40、至多约1/45、至多约1/50、至多约1/55、至多约1/60、至多约1/65、至多约1/70、至多约1/75、至多约1/80、至多约1/85、至多约1/90、至多约1/95、至多约1/100、至多约1/150、至多约1/200、至多约1/250。
166.根据权利要求165所述的方法，其中足以提供治疗应答的所述鞘内载体基因组剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述静脉内组合物的所述载体基因组剂量的约1/10。
167.根据权利要求165所述的方法，其中足以提供治疗应答的所述鞘内载体基因组剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述静脉内组合物的所述载体基因组剂量的约1/20。
168.根据权利要求165所述的方法，其中足以提供治疗应答的所述鞘内载体基因组剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述静脉内组合物的所述载体基因组剂量的约1/40。
169.根据权利要求165所述的方法，其中足以提供治疗应答的所述鞘内载体基因组剂量是足以提供相同或基本上相同的治疗应答的所述静脉内组合物的所述载体基因组剂量的约1/100。
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