WO2024138810A1 - 在哺乳动物心脏中特异性启动基因的启动子序列及其应用 - Google Patents

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WO2024138810A1
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enhancer
myocardial
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chimeric promoter
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卜晔
李华鹏
檀克勤
陈君霖
钟育健
潘越
陈欢
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广州派真生物技术有限公司
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/864—Parvoviral vectors, e.g. parvovirus, densovirus

Definitions

  • myocardial specific means that the chimeric promoter or other transcriptional regulatory element preferentially drives or enhances the expression of an operably linked target gene in the myocardium.
  • Myocardial specific does not exclude the possibility that the chimeric promoter or other transcriptional regulatory element drives or enhances the expression of an operably linked target gene to a certain extent in another tissue, but its expression is much lower than that in the myocardium.
  • Transcription factor recognition binding site refers to a nucleotide sequence on a DNA molecule that a transcription factor can recognize and bind to. After the transcription factor binds to it, it helps to form a transcription initiation complex with other proteins (such as RNA polymerase) to start the transcription process.
  • E-syn promoter herein refers to a promoter that is capable of driving the expression of a target gene in muscle tissue (such as myocardium).
  • the E-syn promoter itself is a chimeric promoter, and its sequence is shown in SEQ ID NO: 6.
  • vector refers to a nucleic acid molecule that can be engineered to contain a polynucleotide of interest (e.g., a coding sequence for a polypeptide of interest) or a nucleic acid molecule that can replicate in a host cell (e.g., a nucleic acid, a plasmid, or a virus, etc.).
  • a vector may include one or more of the following components: an origin of replication, one or more regulatory sequences (such as a promoter and/or enhancer) that regulate the expression of the polynucleotide of interest, and/or one or more selectable marker genes (such as antibiotic resistance genes and genes that can be used in colorimetric analysis, such as ⁇ -galactose).
  • expression vector refers to a vector used to express a gene of interest in a host cell.
  • the chimeric promoter includes, from 5' to 3' direction, the Trans trans-acting factor binding element, the MyoG transcription factor binding site, the 2RS5 enhancer, the E-syn promoter and the MEF1 enhancer.
  • the MEF1 enhancer, the E-syn promoter and the MEF1 enhancer are included in sequence.
  • the individual nucleotides e.g., no more than 50, 20, 10, 5, 4, 3, 2 or 1 nucleotides
  • the individual nucleotides are modified (added, replaced or deleted), and the ability to promote the expression of the target gene is detected in vitro or in vivo, thereby obtaining functional variants of the chimeric promoter provided herein with myocardial specificity, and these functional variants should also be included in the scope of the present invention.
  • the functional variant may include such a nucleotide sequence, which has at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or even higher sequence identity compared to any one of the above-mentioned transcriptional regulatory sequences.
  • the above-mentioned transcriptional regulatory elements can be directly connected or connected by a linker sequence.
  • the length of the linker sequence can be between 1 and 50 nucleotides, such as 1 to 40 nucleotides, such as 1 to 30 nucleotides, such as 1 to 20 nucleotides, such as 1 to 10 nucleotides.
  • the design of the chimeric promoter can take into account the size restrictions of the carrier to be used, and therefore, such linker sequences, if present, are preferably short sequences.
  • Representative short linker sequences include nucleic acid sequences consisting of less than 15 nucleotides, particularly less than 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 or less than 2 nucleotides, such as 1 nucleotide linker sequence.
  • RNA sequences e.g., MCK enhancer or its functional variant
  • the target gene that can be introduced in the expression may include any gene of interest, especially therapeutic gene sequences associated with myocardial disorders.
  • Myocardial-related diseases may include primary and secondary myocardial disorders, such as dilated cardiomyopathy, hypertrophic cardiomyopathy, restrictive cardiomyopathy, arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy and undetermined cardiomyopathy, as well as viral cardiomyopathy, myocarditis, and the like.
  • the vector is a plasmid vector.
  • the vector is a non-viral vector, such as a nanoparticle, lipid nanoparticle (LNP), or liposome containing an expression cassette of the invention.
  • a non-viral vector such as a nanoparticle, lipid nanoparticle (LNP), or liposome containing an expression cassette of the invention.
  • the vector is a transposon-based system that allows integration of the expression cassette provided herein into the genome of the target cell.
  • the vector is a viral vector suitable for gene therapy.
  • the viral vector can be derived from an adenovirus, a retrovirus, or a lentivirus (e.g., an integration-defective lentivirus).
  • the other sequences can be retroviral or lentiviral LTR sequences on both sides of the expression cassette.
  • the viral vector is a parvoviral vector, such as an AAV vector, such as an AAV vector suitable for transducing the myocardium.
  • the other sequences are AAV ITR sequences on both sides of the expression cassette.
  • the vector is an AAV vector.
  • Human adeno-associated virus (AAV) is a naturally replication-deficient dependent virus that can integrate into the genome of infected cells to establish latent infection.
  • AAV vectors have been used in many applications as vectors for human gene therapy. The advantageous properties of this viral vector include its non-association with any human disease, its ability to infect both dividing and non-dividing cells, and can infect a wide range of cell lines derived from different tissues.
  • human serotype 2 is the first AAV developed as a gene transfer vector.
  • Other currently used AAV serotypes also include AAV-1, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, etc.
  • other non-natural engineered variants and chimeric AAVs may also be useful.
  • AAV viruses can be engineered using conventional molecular biology techniques, so that these particles can be optimized for cell-specific delivery of nucleic acid sequences, for minimizing immunogenicity, for regulating stability and particle lifespan, for efficient degradation, and for precise delivery to the cell nucleus.
  • the required AAV segments for assembly into vectors include capsid proteins, including vp1, vp2, vp3 and hypervariable regions, rep proteins, including rep 78, rep 68, rep 52 and rep 40, and sequences encoding these proteins. These segments can be readily utilized in a variety of different vector systems and host cells.
  • compositions comprising the above expression cassette, vector or host cell.
  • a composition comprises a therapeutically effective amount of the above expression cassette, vector or cell, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition is formulated according to conventional procedures to be suitable for intravenous or intramuscular administration.
  • the pharmaceutical composition for intravenous or intramuscular administration is a solution in a sterile isotonic aqueous buffer.
  • the pharmaceutical composition may also include a solubilizing agent and a local anesthetic such as lidocaine to relieve pain at the injection site of the subject.
  • Subject refers to an animal, such as a mammal, including but not limited to humans, rodents, monkeys, felines, canines, equines, bovines, swine, sheep, goats, mammalian experimental animals, mammalian farm animals, mammalian sports animals, and mammalian pets.
  • the subject may be male or female and may be any age-appropriate subject, including infants, young children, young people, adults, and elderly subjects.
  • a subject refers to an individual who needs to treat a disease or condition.
  • the subject being treated may be a patient who suffers from a condition associated with the treatment, or who is at risk of developing the condition.
  • the subject is a human, such as a human patient.
  • the term is generally used interchangeably with "patient,”"testsubject,””treatmentsubject,” and the like.
  • the expression cassette or vector of the invention may be delivered in a vesicle, in particular a liposome.
  • the nucleic acid sequence, expression cassette or vector of the invention may be delivered in a controlled release system.
  • the present invention provides a method for expressing a target gene in a muscle cell, comprising introducing an expression cassette or vector provided herein into the muscle cell, and expressing the target gene.
  • the method can be an in vitro, ex vivo or in vivo method for expressing a target gene in a muscle cell.
  • the present invention provides a method for expressing a target gene in myocardium, comprising introducing an expression cassette or expression vector provided herein into the myocardium, and expressing the target gene.
  • an implant including porous, non-porous or gel-like materials.
  • RNA protection solution Six tissue sites, including liver (Liver), heart (Heart), forelimb muscle (Fleg), hindlimb muscle (Bleg), abdominal muscle (Abdo), lung (Lung) and brain (Brian), were infiltrated in RNA protection solution and stored in a -80°C refrigerator.
  • Centrifugation can be performed at room temperature afterwards. Add the obtained solution and precipitate to the centrifuge, centrifuge at 12000xg for 30s at room temperature, and discard the effluent (if the volume is larger than the capacity of the centrifuge column, it can be completed in several times). Add 500 ⁇ L CB9, centrifuge at 12000xg at room temperature for 30s, and discard the effluent. Repeat CB9 column once. Add 500 ⁇ L WB9 (please check whether anhydrous ethanol has been added before use), centrifuge at 12000xg at room temperature for 30s, and discard the effluent. Repeat WB9 column once. Centrifuge at 12000xg at room temperature for 2min to completely remove the residual ethanol.
  • the optimized E-syn promoter can not only specifically express the target gene in cardiac tissue, but also the specific expression level is increased by 2.59 times and 3.96 times, respectively.
  • the specific expression efficiency of the promoter MEF2C-E-syn-MEF2C is significantly higher (P ⁇ 0.05) than that of the E-syn promoter.

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Abstract

提供了一种能在哺乳动物心脏组织中特异性表达的嵌合启动子，其包括：心肌特异性启动子、反式作用因子结合元件、转录因子结合位点、肌肉特异性的转录增强子。还提供了包括该嵌合启动子的基因表达盒、表达载体、病毒颗粒，以及它们在制备治疗心肌相关病症的药物中的用途。

Description

在哺乳动物心脏中特异性启动基因的启动子序列及其应用
本申请要求于2022年12月30日提交至中国专利局、申请号为202211739921.0的中国专利申请的优先权，在此通过引用将其全文并入本文。
技术领域
本发明涉及启动子，尤其是能在哺乳动物心肌组织中特异性启动基因表达的嵌合启动子。本发明还涉及该嵌合启动子的医疗应用。
背景技术
心脏病是疾病领域的大病种，随着人口老龄化，其死亡率和住院率长期以来居高不下。目前临床上有很多种药物用于心脏病的防治，但是很多患者还是会发展成心力衰竭。据估计目前全球心力衰竭患者超过3000万，我国心力衰竭患者达到450万。随着疾病的进展,心力衰竭患者会进入疾病的终末期，研发新的心力衰竭治疗药物显得尤为重要。随着对心力衰竭相关信号通路的研究越来越深入，针对于心力衰竭治疗的新的分子靶点被发现。然而很多信号通路分子很难通过小分子药物进行调控，而通过基因治疗的手段，可以直接且特异地在分子和细胞水平上调控心力衰竭的病理过程。一些针对心力衰竭的基因治疗项目已经进入了临床试验阶段，并且取得了一定的治疗效果，展示出了革命性和突破性的治疗前景。具有非致病性和复制缺陷等特点的腺相关病毒(AAV)是目前最有前景的用于基因治疗的递送载体系统。心肌特异性启动子的使用有助于提高基因在心肌组织的特异性表达，同时极大降低基因在非心肌组织的表达，减少基因治疗的细胞毒性，提高对心力衰竭等疾病的治疗效率。
E-syn启动子驱动的AAV转导已被证明在心力衰竭和肌肉营养不良动物模型中有着良好的治疗效果，而不需要任何物理或药物干预，并且在心脏中特异性相对更高[1-2]，我们前期的验证中也证明了这一特性。但其心肌特异性表达水平仍有待提高。Michael A等发现该启动子中的转录增强元件2RS5数量的增加有助于其启动的基因表达水平的提升[2]。Trans反式作用因子结合元件已被证明与大鼠α-心脏MHC中的反式作用因子(s)结合，在小鼠位点中也存在，其靶向的反式作用因子蛋白与肌源性的转录因子MEF1、MEF2特异性结合[3]。MEF2则是由MEF2-C基因编码的mads-box转录增强因子家族成员，在包括心肌在内的肌肉组织发生中起作用。MEF2 polypeptide C具有反式激活和dna结合活性，这种蛋白质可能在维持肌肉细胞的分化状态中发挥作用[5-6]。MyoG具有增强由Myod启动的基因子集的表达，而Myod对于生肌进程的关键基因的表达是必须的，其广泛存在于 各类肌肉相关的启动子中[7-8]。目前,尚未有报道验证这些基因序列的组合能否获得心肌特异性表达水平更高的启动子。
发明内容
在一方面，本文提供了心肌特异性嵌合启动子，其包括：
1)心肌特异性启动子；以及
2)一个或更多个增强子；
其中所述增强子选自2RS5增强子、MEF1增强子和MEF2C增强子。
在一些实施方案中，所述心肌特异性启动子为E-syn启动子；优选地，所述E-syn启动子包括SEQ ID NO：6所示序列或与SEQ ID NO:6有至少90％序列一致性的功能性变体。
在一些实施方案中，所述心肌特异性嵌合启动子还包括Trans反式作用因子结合元件；优选地，所述Trans反式作用因子结合元件包括SEQ ID NO：1所示序列，或与SEQ ID NO:1有至少90％序列一致性的功能性变体。
在一些实施方案中，所述心肌特异性嵌合启动子还包括MyoG转录因子结合位点；优选地，所述MyoG转录因子结合位点包括SEQ ID NO：2所示序列，或与SEQ ID NO:2有至少90％序列一致性的功能性变体。
在一些实施方案中，所述2RS5增强子包括SEQ ID NO：3所示序列，或与SEQ ID NO:3有至少90％序列一致性的功能性变体。
在一些实施方案中，所述MEF1增强子包括SEQ ID NO：4所示序列，或与SEQ ID NO:4有至少90％序列一致性的功能性变体。
在一些实施方案中，所述MEF2C增强子包括SEQ ID NO：5所示序列，或与SEQ ID NO:5有至少90％序列一致性的功能性变体。
在一些实施方案中，所述心肌特异性嵌合启动子，从5’至3’方向，依次包括所述Trans反式作用因子结合元件、所述MyoG转录因子结合位点、所述2RS5增强子、所述E-syn启动子和所述MEF1增强子。
在一些实施方案中，所述心肌特异性嵌合启动子包括所述E-syn启动子和至少两个所述MEF1增强子。
在一些实施方案中，所述的心肌特异性嵌合启动子，从5’至3’方向，依次包括所述MEF1增强子、所述E-syn启动子和所述MEF1增强子。
另一方面，本文提供了基因表达盒，其包括上述心肌特异性嵌合启动子和与其可操作地连接的目的基因。
另一方面，本文提供了表达载体，其包括上述心肌特异性嵌合启动子或基因表达盒。
在一些实施方案中，所述表达载体为病毒表达载体。
在一些实施方案中，所述表达载体为腺相关病毒(AAV)表达载体。
另一方面，本文提供了宿主细胞，其包括上述心肌特异性嵌合启动子、基因表达盒或表达载体。
另一方面，本文提供了药物组合物，包括：1)上述基因表达盒、表达载体或宿主细胞；以及2)药学上可接受的载体。
另一方面，本文提供了上述基因表达盒、表达载体、宿主细胞或药物组合物在制备治疗心肌相关病症的药物中的用途。
另一方面，本文提供了治疗心肌相关病症的方法，包括以有效量的所述基因表达盒、表达载体、宿主细胞或药物组合物向有需要的受试者给药。
本文公开了两种人工优化的能在哺乳动物心肌(或心脏)中特异性启动基因转录的启动子序列及其应用。第一种启动子通过添加Trans反式作用因子结合元件、MyoG转录因子结合位点、转录增强元件2RS5和MEF1转录增强因子序列对E-syn基因启动子进行优化；第二种启动子通过添加2个MEF2转录增强因子序列对E-syn启动子进行优化。通过小鼠体内实验，经优化后的E-syn启动子其心脏组织特异性及表达水平得到了很大的提高，更具应用前景。
附图说明
图1显示了使用不同启动子时的小鼠活体成像荧光图。图1-1仰卧；图1-2左侧卧；图1-3右侧卧；图1-4俯卧。A组：E-syn-luciferase-p2A-maxGFP；B组：Trans-MyoG-2RS5-E-syn-MEF1-luciferase-p2A-maxGFP；C组：MEF2C-E-syn-MEF2C-luciferase-p2A-maxGFP。曝光时间200ms。
图2显示了转录水平上通过qPCR测定的使用不同启动子时不同组织luciferase基因相对表达量(组内以心肌作为参照)及不同启动子在各组内心脏组织中luciferase基因相对表达量的结果(以A组作为参照)。图2-1 A组qPCR测定的启动子启动的Luciferase在不同器官组织中的相对表达水平；图2-2 B组qPCR测定的启动子启动的Luciferase在不同器官组织中的相对表达水平；图2-3 C组qPCR测定的启动子启动的Luciferase在不同器官组织中的相对表达水平；图2-4 qPCR测定的不同启动子在各组内心脏组织中luciferase基因相对表达水平。
图3显示了翻译水平上通过Western Blot测定的使用不同启动子时，心脏和肝脏组织中luciferase基因表达量的结果。图3-1使用不同启动子时各组心脏和肝脏组织中luciferase的Western Blot结果；图3-2 Western Blot测定的使用不同启动子时各组心脏组织中luciferase基因表达水平；图3-3 Western Blot测定的使用不同启动子时各组肝脏组织中luciferase基因表达水平。
具体实施方式
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
术语“或”是指列举的可选择要素中的单个要素，除非上下文明确地另外指出。术语“和/或”是指所列举的可选择要素中的任意一个、任意两个、任意三个、任意更多个或其全部。
本文所用术语“包含”、“含有”、“具有”以及类似的表述表示不排除未列举的要素。这些术语也包括仅由所列举的要素组成的情形。
“启动子(promoter)”是RNA聚合酶识别、结合和启动转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游(5’方向)，启动子本身不被转录。启动子的实例包括但不限于CMV、EF1A、CAG、CBh、SFFV等启动子。
“嵌合启动子”，也可称为“组合启动子”或“复合启动子”，指其，除启动子序列外，还包括至少一个转录调控元件，并且该转录调控元件与该启动子并非天然存在于同一基因的转录调控序列中。例如，该启动子天然存在于第一基因的转录调控序列中，另一转录调控元件(如转录因子识别结合位点)天然存在于第二基因的转录调控序列中，当这两个转录调控元件因人工操作而处于同一DNA分子中并控制同一基因的转录时，可以认为它们构成了嵌合启动子。另外，还可以在嵌合启动子基础上继续增加转录调控元件，形成新嵌合启动子，这种情况下，也可以将作为基础的嵌合启动子直接称为启动子，以便与该新嵌合启动子进行区分。
提及嵌合启动子或其他转录调控元件时，“心肌特异性的”指该嵌合启动子或其他转录调控元件偏好性地在心肌中驱动或增强可操作地连接的目的基因的表达。“心肌特异性的”不排除该嵌合启动子或其他转录调控元件在一定程度上在另一种组织中驱动或增强可操作地连接的目的基因的表达的可能性，只是其表达相对于在心肌中表达低得多。例如，心肌特异性嵌合启动子可驱动目的基因在心肌和肝组织中表达，但是，目的基因在心肌中的表达水平为肝组织中表达水平的2倍以上，或者5倍以上，或者10倍以上，或更高。
“转录调控元件”指能够驱动(例如启动子)或增强(例如增强子)可操作地连接的目的基因在组织或细胞中的表达的核苷酸片段。“转录调控序列”指控制目的基因表达的转录调控元件的总和，它们可能连续的存在于同一DNA分子中，或者有间隔的存在于同一DNA分子中。
“可操作地连接”指调控序列与其调控对象的连接方式使得调控序列能够对其调控对象发挥作用。例如，启动子与目的基因“可操作地连接”指启动子可驱动目的基因从准确起始位点的开始转录。
“转录因子识别结合位点”指DNA分子上的一段核苷酸序列，转录因子可识别并与其结合。转录因子与其结合后，有助于与其他蛋白(如RNA聚合酶)一起形成转录起始复合物，启动转录过程。
“功能性变体”或“功能性片段”指在原始序列(例如天然序列)基础上包括了少许改动(例如氨基酸或核苷酸删除、添加或替换)后获得的蛋白或核酸变体，其仍然保留了原始序列的全部或至少部分功能。例如，功能性变体可保留原始序列某种活性的50％、60％、70％、80％、90％、100％或甚至具有高于原始序列的活性。
“E-syn启动子”在本文中指一种启动子，其能够在肌肉组织(如心肌)中驱动目的基因的表达。E-syn启动子本身为嵌合启动子，其序列如SEQ ID NO：6所示。
“增强子”或“转录增强因子”，在本文中可互换使用，指一种转录调控序列，可通过顺式或反式作用增强与其可操作地连接的启动子的活性。增强子可能位于所调控基因上游、下游或其内部，甚至不一定接近所要调控的基因，例如相距>10kb也可能发挥作用。本文中提到的增强子序列包括2RS5、MEF1和MEF2增强子，它们的序列分别如SEQ ID NO：3、4和5所示。
本文中，术语“核酸分子”、“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，指核苷酸聚合物。此类核苷酸聚合物可含有天然和/或非天然核苷酸且包括(但不限于)DNA、RNA和PNA。“核酸序列”指包含于核酸分子或多核苷酸中的核苷酸线性序列。对于DNA分子来说，由于双链互补，在本文提及其中一条链的序列时，本领域技术人员应意识到已同时提及其互补链或包括其互补链的双链DNA分子。
术语“载体”指可经工程改造以含有目的多核苷酸(例如目的多肽的编码序列)的核酸分子或可在宿主细胞中复制的核酸分子(例如，核酸、质粒、或病毒等)。载体可包括以下组件中的一个或更多个：复制起点、一或更多个调控目的多核苷酸的表达的调控序列(诸如启动子和/或增强子子)和/或一个或更多个可选择标记物基因(诸如抗生素抗性基因和可用于比色分析中的基因，例如β-半乳糖)。术语“表达载体”指用于在宿主细胞中表达目基因的载体。
“宿主细胞”指可为或已为载体或经分离多核苷酸的接受体的细胞。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。示例性真核细胞包括哺乳动物细胞，诸如灵长类动物或非灵长类动物细胞；真菌细胞，诸如酵母；植物细胞；以及昆虫细胞。非限制性示例性哺乳动物细胞包括(但不限于)NSO细胞、293以及CHO细胞，以及其衍生细胞，诸如293-6E、CHO-DG44、CHO-K1、CHO-S和CHO-DS细胞。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，且后代可能由于自然、偶然或故意突变而不一定与原始母细胞完全一致(在形态或基因组DNA互补方面)。宿主细胞也包括在活体内经本文提供的核酸分子或表达载体转染的细胞。
“目的基因”是指编码RNA或蛋白质产物的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列可以根据所需目的引入到细胞或个体中，并且能够在适合条件下表达。目的基因可以编码感兴趣的产物，例如感兴趣的治疗性或诊断性产物。可使用治疗性目的基因，在将其引入细 胞、组织或器官中并进行表达以产生所需的治疗结果。治疗可以通过多种方式实现，包括通过将蛋白质在不表达所述蛋白质的细胞中表达，通过将蛋白质在表达所述蛋白质的突变版本的细胞中表达，通过表达对表达它的靶细胞有毒的蛋白质(用于例如杀死不想要的细胞例如癌细胞的策略)，通过表达反义RNA以诱导基因阻遏或外显子跳跃，或通过表达目的是抑制蛋白质表达的沉默RNA，例如shRNA。目的基因也可以编码用于靶向基因组的核酸酶，例如CRISPR相关核酸内切酶或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。另外，目的基因也可以是与CRISPR/Cas9系统一起使用的向导RNA或一组向导RNA。
当提及核苷酸序列时，术语“序列一致性(sequence identity)”(也称为“序列同一性”)指两核苷酸序列(例如查询序列和参照序列)之间一致性程度的量，一般以百分比表示。通常，在计算两核苷酸序列之间的一致性百分比之前，先进行序列比对(alignment)并引入缺口(gap)(如果有的话)。如果在某个比对位置，两序列中碱基相同，则认为两序列在该位置一致或匹配；两序列中或碱基不同，则认为在该位置不一致或错配。在一些算法中，用匹配位置数除以比对窗口中的位置总数以获得序列一致性。在另一些算法中，还将缺口数量和/或缺口长度考虑在内。常用的序列对比算法或软件包括DANMAN、CLUSTALW、MAFFT、BLAST、MUSCLE等。出于本发明的目的，可以采用公开的比对软件BLAST(可从https://www.ncbi.nlm.nih.gov/获得)，通过使用缺省设置来获得最佳序列比对并计算出两核苷酸序列之间的序列一致性。
术语“治疗”包括治愈、缓解或预防效果。因此，治疗性和预防性治疗包括改善障碍的症状或阻止或以其他方式降低发生特定症状的风险。可以提供治疗以延迟、减缓或逆转疾病和/或其一种或多种症状的进展。术语“预防性”可以被认为是降低特定病症的严重性或发作。“预防性”还包括在以前被诊断出患有特定病症的患者中阻止所述病症的复发。“治疗性”还可以是指降低现有病症的严重性。术语“治疗”在本文中用于指称可以有益于动物、特别是哺乳动物、更特别是人类对象的任何方案。在特定实施方式中，所述哺乳动物可以心肌相关病症的个体，例如人患者。
嵌合启动子
本发明人设计了在本文中称为“嵌合启动子”的转录调控元件，用于驱动或增强目的基因在心肌(或心脏)中的表达。
该嵌合启动子包括：心肌特异性启动子；以及一个或更多个增强子；其中所述增强子选自2RS5增强子、MEF1增强子和MEF2C增强子。
在存在两个或两个以上增强子的情况下，这些增强子直接串联连接或通过接头序列隔开。直接串联连接意味着后一增强子的第一个核苷酸紧跟在上游增强子的最后一个核苷酸之后。在通过接头序列连接的情况下，在上游增强子的最后一个核苷酸与随后的下游增强子的第一个核苷酸之间存在其他核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述嵌合启动子还包括Trans反式作用因子结合元件。这里的反式作用因子指DNA结合蛋白，例如MEF1或MEF2。优选地，Trans反式作用因子结合元件位于该嵌合启动子的5’端。Trans反式作用因子可与该嵌合启动子中的其他转录调控序列直接或通过接头序列连接。
在一些实施方案中，所述嵌合启动子还包括转录因子结合位点。该转录因子结合位点可以为Myod蛋白家族成员的识别结合位点。Myod蛋白家族成员可例如包括Myod1、Myf5、MyoG和Myf6转录因子。优选地，该转录因子结合位点为转录因子MyoG的识别结合位点。更具体地，该MyoG结合位点包括SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
在一些优选的实施方案中，所述嵌合启动子，从5’至3’方向，依次包括所述Trans反式作用因子结合元件、所述MyoG转录因子结合位点、所述2RS5增强子、所述E-syn启动子和所述MEF1增强子
在一些优选的实施方案中，其中，从5’至3’方向，依次包括所述MEF1增强子、所述E-syn启动子和所述MEF1增强子。
另外，可预期，对上述转录调控序列的个别核苷酸进行改动(添加、替换或删除)，也有可能仍然具有心肌特异性表达目的基因的能力，这些改动后的功能性变体也应该包括在本发明的范围内。例如，对上述转录调控序列的个别核苷酸(例如不超过50个、20个、10个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸)进行改动(添加、替换或删除)，并在体外或体内检测其启动目的基因表达的能力，从而获得具有心肌特异性的本文提供的嵌合启动子的功能性变体，这些功能性变体也应该包括在本发明的范围内。例如，在一些实施方案中，功能性变体可以包括这样的核苷酸序列，其与上述转录调控序列的任一个相比，至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至更高的序列一致性。
上述各转录调控元件之间可直接连接或通过接头序列连接。例如，所述接头序列的长度可以在1至50个核苷酸之间，例如1至40个核苷酸，例如1至30个核苷酸，例如1至20个核苷酸，例如1至10个核苷酸。在一些实施方案中，嵌合启动子的设计可以考虑到所准备使用的载体的尺寸限制，因此，此类接头序列如果存在的话，优选短序列。代表性的短接头序列包括由少于15个核苷酸，特别是少于14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3个或少于2个核苷酸构成的核酸序列，例如1个核苷酸的接头序列。
表达盒
本文提供的嵌合启动子可以被引入到表达盒中，该表达盒被设计用于提供目的基因在感兴趣的组织(如心肌)中表达。
因此，本文提供的表达盒包括上述嵌合启动子和目的基因。
在特定得实施方案中，本文提供的表达盒从5'到3'依次包含：
-本文提供的嵌合启动子；
-目的基因；以及
-多腺苷酸化信号。
从本文中公开的教导和分子生物学和基因疗法领域中的普通知识，本领域技术人员还可以考虑将其他转录调控元件并入到本文公开的嵌合启动子中，例如引入其他增强子序列(例如MCK增强子或其功能性变体)和内含子序列。可以在表达中引入的目的基因可包括任何感兴趣的基因，尤其是与心肌病症相关的治疗性基因序列。心肌相关疾病可包括原发性和继发性心肌病症，例如扩张型心肌病、肥厚型心肌病、限制型心肌病、致心律失常性右室心肌病和未定型心肌病，以及病毒性心肌病、心肌炎等。
载体、细胞和药物组合物
本文提供的表达盒可以被引入到载体中。因此，本发明还涉及包含上述表达盒的载体。在本发明中使用的载体是适合于RNA/蛋白质表达，特别是适合于基因疗法的载体。
在一些实施方式中，所述载体是质粒载体。
在另一些实施方式中，所述载体是非病毒载体，例如含有本发明的表达盒的纳米粒子、脂质纳米粒子(LNP)或脂质体。
在另一些实施方式中，所述载体是基于转座子的系统，允许将本文提供的表达盒整合到靶细胞的基因组中。
在另一实施方式中，所述载体是适用于基因疗法的病毒载体。在这种情况下，正如本领域中公知的，可以向本文提供的表达盒添加适用于产生高效病毒载体的其他序列。在特定实施方式中，所述病毒载体可以源自于腺病毒、反转录病毒或慢病毒(例如整合缺陷型慢病毒)。在所述病毒载体源自于反转录病毒或慢病毒的情况下，所述其他序列可以是在所述表达盒两侧的反转录病毒或慢病毒LTR序列。在另一个特定实施方式中，所述病毒载体是细小病毒载体，例如AAV载体，例如适合于转导心肌的AAV载体。在这个实施方式中，所述其他序列是在所述表达盒两侧的AAV ITR序列。
在优选实施方式中，所述载体是AAV载体。人类腺相关病毒(AAV)是一种天然复制缺陷的依赖病毒，其能够整合到被感染细胞的基因组中以建立潜伏感染。AAV载体作为用于人类基因疗法的载体已有众多应用。该病毒载体的有利特性包括它与任何人类疾病不存在关联，它感染分裂和非分裂细胞两者的能力，并且可以感染源自于不同组织的广范围的细胞系。
在从人类或非人类灵长动物(NHP)分离并充分表征的AAV的血清型中，人类血清2型是被开发为基因转移载体的第一种AAV。其他目前使用的AAV血清型还包括AAV-1、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10等。此外，其他非天然的工程化变体和嵌合AAV也可能是有用的。
AAV病毒可以使用常规的分子生物学技术进行工程化改造，使得可以优化这些粒子以用于核酸序列的细胞特异性递送，用于最小化免疫原性，用于调节稳定性和粒子寿命，用于高效降解，用于向细胞核的精确递送。
用于组装成载体的所需AAV片段包括衣壳蛋白，包括vp1、vp2、vp3和高变区，rep蛋白，包括rep 78、rep 68、rep 52和rep 40，以及编码这些蛋白质的序列。这些片段可以在各种不同的载体系统和宿主细胞中容易地利用。
本发明还涉及一种分离的细胞，例如心肌细胞，所述细胞用本发明的核酸序列或本发明的表达盒转化。本发明的细胞可以通过注射到需要的对象的感兴趣的组织中或血流中，递送到所述对象。在特定实施方式中，本发明涉及将本发明的核酸分子或表达盒引入到待治疗对象的细胞中，并将所述已引入有核酸或表达盒的细胞给回到所述对象。
本文还提供了包含上述表达盒、载体或宿主细胞的药物组合物。此类组合物包含治疗有效量的上述表达盒、载体或细胞，以及药学上可接受的载体。
提及药物组合物，所使用的术语“药学上可接受的载体”指可以安全地进行施用的固体或液体稀释剂、填充剂、抗氧化剂、稳定剂等物质，这些物质适合于受试者给药而无过度的不良副反应，同时适合于维持位于其中的药物或活性剂的活力。依照给药途径，可以使用本领域众所周知的各种不同的载体，包括，但不限于糖类、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽糖、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、藻酸、磷酸缓冲液、乳化剂、等渗盐水、和/或无热原水等。
如果需要，药物组合物也可以含有少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些药物组合物可以采取溶液、悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、持续释放制剂等的形式。
本文所提供的药物组合物可以制成粉末、注射剂等临床可接受的剂型。可以使用任何适当的途径向受试者施用本发明的药物组合物，例如可通过口服、静脉内输注、肌肉内注射、皮下注射、腹膜下、直肠、舌下，或经吸入、透皮等途径给药。
在优选实施方式中，所述药物组合物按照常规程序配制成适合于静脉内或肌肉内给药。通常，用于静脉内或肌内给药的药物组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，所述药物组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂例如利多卡因，以缓解受试者注射部位处的疼痛。
本文所用的“受试者”指动物，例如哺乳动物，包括(但不限于)人类、啮齿动物、猿猴、猫科动物、犬科动物、马科动物、牛科动物、猪科动物、绵羊、山羊、哺乳类实验动物、哺乳类农畜、哺乳类运动动物和哺乳类宠物。受试者可为雄性或雌性且可为任何适龄受试者，包括婴儿、幼年、青年、成年和老年受试者。在一些实例中，受试者指需要治疗疾病或病症的个体。在一些实例中，接受治疗的受试者可为患者，其患有与该治疗有关联的病症，或有风险患上该病症。在特定实例中，受试者为人类，诸如人类患者。该术语通常可与“患者”、“检测对象”、“治疗对象”等互换使用。
在一个实施方式中，本发明的表达盒或载体可以在囊泡、特别是脂质体中递送。在又一个实施方式中，本发明的核酸序列、表达盒或载体可以在受控释放系统中递送。
治疗应用
本文提供的嵌合启动子、表达盒或载体可用于在心肌中表达目的基因。因此，在一些实施方案中，本发明涉及上述表达盒、载体、细胞或药物组合物在制备用于治疗心肌相关疾病的药物中的用途。
本文提供的表达盒和载体也可用于基因疗法。因此，在一些实施方案中，本发明涉及治疗心肌相关疾病的方法，包括以有效量的上述表达盒、载体、细胞或药物组合物向有需要的受试者给药。
在一些实施方案中，本文提供了一种在肌细胞中表达目的基因的方法，其包括将本文提供的表达盒或载体引入到所述肌细胞中，并表达所述目的基因。所述方法可以是用于在肌细胞中表达目的基因的体外、离体或体内方法。
在一些实施方案中，本本文提供了一种在心肌中表达目的基因的方法，其包括将本文提供的表达盒或表达载体引入到心肌中，并表达所述目的基因。
在特定实施方式中，可能希望将本发明的药物组合物等局部给药到需要治疗的区域，例如局部心肌组织。这可以例如利用植入物来实现，包括多孔、无孔或凝胶状材料。
向有需要的受试者给药的剂量随着几种因素而变，包括但不限于给药途径、治疗的具体疾病、对象的年龄或获得治疗效果必需的表达水平。本领域技术人员可以在本领域知识的基础上，根据这些因素和其他因素容易地确定需要的剂量。在以AAV载体给药的情况下，载体的典型剂量是至少每千克体重1×108份载体基因组(vg/kg)，例如至少1×109vg/kg、至少1×1010vg/kg、至少1×1011vg/kg、至少1×1012vg/kg、至少1×1013vg/kg、至少1×1014vg/kg或至少1×1015vg/kg。当然，医师也可根据受试者的个体情况选择超出该范围的其他剂量。
以下通过具体实施例来进一步说明本发明。
实施例1质粒载体的构建
两种人工优化的能在哺乳动物心肌特异性启动基因的启动子序列，为E-syn启动子基因经人工优化所得，具体序列和各转录调控元件序列如下。
载体构建过程如下：
(1)通过在线基因合成网站DNAWorks(v3.2.4)以及无缝克隆等分子工具构建目标质粒。引物由金唯智生物合成。合成以下质粒：
(2)pAAV-E-syn-luciferase-p2A-maxGFP质粒的构建。引物合成E-syn启动子，步骤如下：浓度10μM引物，体积0.5μL加入反应体系中，使用高保证DNA聚合酶PrimeSTARGXL进行第1轮扩增。反应体系如下：
PCR条件：
移液枪吸取5μL第1轮PCR反应产物，作为模板，取1μL的E-syn的5’和3’引物进行第2轮扩增。反应体系如下：
PCR条件：

胶回收第2轮PCR反应产物，回收产物命名为Fragment-1。使用核酸内切酶MluI和EcoRI酶切本公司质粒EA0211(EA0211包含两端的ITR序列，luciferase-p2A-maxGFP序列以及由CMV Enhancer、CB Promoter、SV40intron组成的CAG启动子)，并进行胶回收3337bp载体骨架，回收产物命名为Skeleton-1。以EA0211质粒为模板，设计引物PCR扩增并回收SV40intron+luciferase-p2A-maxGFP片段，回收产物命名为Fragment-2。反应体系如下：
PCR条件：
使用本公司自制的Gibson Assembly Mix连接酶预混液进行无缝克隆，反应体系如下：
反应条件：

取10μL无缝克隆产物转化E.coli DH5α，涂于氨苄抗性LB固体平板，32℃培养20h，接种于氨苄抗性LB液体培养基，32℃，250rpm，培养20h，取菌液做PCR鉴定并进行质粒的酶切鉴定以筛选阳性克隆。将正确克隆送至广州金唯智生物科技有限公司进行测序。
(3)pAAV-Trans-MyoG-2RS5-E-syn-MEF1-luciferase-p2A-maxGFP和pAAV-MEF2C-E-syn-MEF2C-luciferase-p2A-maxGFP质粒的构建。同理，设计引物，以pAAV-E-syn-luciferase-p2A-maxGFP质粒为PCR模板和质粒骨架来源，获得上述质粒。
实施例2重组腺相关病毒的制备
通过3质粒转染HEK-293T细胞，将构建的启动子质粒包装进血清型9的腺相关病毒，并通过尾静脉注射的方式感染C57小鼠测定luciferase蛋白转录、翻译水平的表达效率，以比较启动子效率。
重组腺相关病毒的包装。以5E+6cell/well细胞的密度接种HEK-293T细胞在15cm培养皿中，于37℃细胞培养箱中培养24～48h。检测细胞密度生长至60～80％后，每皿加入15μg pHelper、10μg pRep2Cap9、7μg pAAV-E-syn-luciferase-p2A-maxGFP质粒(pAAV-Trans-MyoG-2RS5-E-syn-MEF1-luciferase-p2A-maxGF或pAAV-MEF2C-E-syn-MEF2C-luciferase-p2A-maxGFP)。和10μg转染试剂聚乙烯亚胺(PEI-pro)孵育转染，转染72小时后。收集细胞以及上清液，纯化病毒，通过实时荧光定量PCR测定病毒滴度。
实施例3动物病毒注射、活体成像与组织取样
每组随机选取3只5～6周龄，体重接近的BALB/c小鼠，适应性饲养1周后进行上述质粒包装的腺相关病毒的尾静脉注射，滴度为2.5×1012GC/mL，注射体积200μL。于病毒注射后第21天(注射当天记为第1天)进行活体成像，结果如图1-1至图1-4所示。显然，两种优化后的E-syn启动子在小鼠心脏中表达Luciferase的水平有进一步的提升。于活体成像后第2天进行组织取样。分别取肝脏(Liver)、心脏(Heart)、前肢肌肉(Fleg)、后肢肌肉(Bleg)、腹部肌肉(Abdo)、肺(Lung)和大脑(Brian)共6个组织部位浸润于RNA保护液并保存于-80℃冰箱。
实施例4组织样品中目标基因转录水平的表达量测定
(1)参照北京全式金TransZol Up Plus RNA Kit说明进行小鼠各个组织的RNA提取。剪取50～100mg组织置于RNA free研磨管中，加入2颗3mm直径的氧化锆研磨珠和600μL TransZol Up及120μL RNA Extraction Agent。将研磨管置于提前预冷至-20℃的研磨仪中，研磨参数：70HZ，震荡50s，停止10s，重复3次。室温静置5min，12000xg， 4℃，离心15min。转移无色的水相于新的离心管中，加入等体积的无水乙醇(此时可能会出现沉淀)，轻轻颠倒混匀。此后离心均可在室温中进行。将得到的溶液和沉淀一起加入离心中，12000xg，室温离心30s，弃掉流出液(如果体积大于离心柱容量,可以分几次完成)。加500μL CB9，室温12000xg，离心30s，弃掉流出液。重复CB9过柱1次。加入500μL WB9(使用前请先检查是否加入无水乙醇),室温12000xg，离心30s，弃掉流出液。重复WB9过柱1次。室温12000xg，离心2min，彻底去除残留的乙醇。将离心柱放入RNase-free Tube中，加50-100μL RNase-free Water在离心柱的中央，室温静置1min。室温12000xg，离心1min，洗脱RNA。将RNA置于-80℃保存。
(2)RNA逆转录。参照南京诺唯赞HiScript III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)逆转录试剂盒进行cDNA的合成。基因组DNA去除，在RNase-free离心管中配制如下混合液：
用移液器轻轻吹打混匀。42℃，2min。逆转录反应体系如下：
用移液器轻轻吹打混匀。37℃，15min；85℃，5s。
(3)实时荧光定量PCR。参照美国Bimake公司2x SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒进行目标基因Luciferase的转录水平的定量。配置qPCR反应体系如下：
QPCR程序设置如下：
由图2-1至2-4可知，优化后的E-syn启动子与原启动子相比，在心脏组织内不仅均能够特异性表达目的基因，且特异性表达水平分别提升2.59倍和3.96倍，其中启动子MEF2C-E-syn-MEF2C特异性表达效率显著(P<0.05)高于E-syn启动子。
实施例5组织样品中目标基因翻译水平的表达量测定
(1)组织中蛋白的提取与的BCA法浓度测定。参照碧云天RIPA裂解液的使用方法，剪取20～50mg组织置于研磨管内，加入2颗3mm直径的氧化锆研磨珠和300μL RIPA裂解液(终浓度为1mM的PMSF)，设置冷冻研磨仪温度为-20℃，研磨参数：70HZ，震荡50s，停止10s，重复3次。4℃，12000xg，离心10min。转移上清至1.5mL离心管内，参照生工生物工程(上海)股份有限公司改良型BCA法蛋白质浓度测定试剂盒的方法测定蛋白浓度，并保存于-20℃冰箱。
(2)Western Bolt。根据测定的蛋白浓度，每组选取3只小鼠的心脏、肝脏组织，进行蛋白表达水平的比较。调整各样品浓度一致，上样量20μg，使用浓度为4～12％SDS-PAGE胶，电泳条件：100V，15min；125V，50min。转膜条件：300mA，恒流，60min。使用ImageJ软件进行灰度分析，比较目标基因蛋白的相对表达水平。由图3-1至3-3可知，优化后的E-syn启动子与原启动子相比，在心脏组中表达的Luciferase蛋白水平均显著提高(P1＝0.0382，P2＝0.0029)，分别约为原始启动子表达效率的1.93倍和2.65倍。同时，优化的启动子对肝脏中表达Luciferase蛋白并未产生显著影响。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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Claims (18)

  1. 心肌特异性嵌合启动子，包括：
    1)心肌特异性启动子；以及
    2)一个或更多个增强子；
    其中所述增强子选自2RS5增强子、MEF1增强子和MEF2C增强子。
  2. 如权利要求1所述的心肌特异性嵌合启动子，其中所述心肌特异性启动子为E-syn启动子；优选地，所述E-syn启动子包括SEQ ID NO：6所示序列或与SEQ ID NO:6有至少90％序列一致性的功能性变体。
  3. 如权利要求1所述的心肌特异性嵌合启动子，还包括Trans反式作用因子结合元件；优选地，所述Trans反式作用因子结合元件包括SEQ ID NO：1所示序列，或与SEQ ID NO:1有至少90％序列一致性的功能性变体。
  4. 如权利要求1所述的心肌特异性嵌合启动子，还包括MyoG转录因子结合位点；优选地，所述MyoG转录因子结合位点包括SEQ ID NO：2所示序列，或与SEQ ID NO:2有至少90％序列一致性的功能性变体。
  5. 如权利要求1所述的心肌特异性嵌合启动子，其中所述2RS5增强子包括SEQ ID NO：3所示序列，或与SEQ ID NO:3有至少90％序列一致性的功能性变体。
  6. 如权利要求1所述的心肌特异性嵌合启动子，其中所述MEF1增强子包括SEQ ID NO：4所示序列，或与SEQ ID NO:4有至少90％序列一致性的功能性变体。
  7. 如权利要求1所述的心肌特异性嵌合启动子，其中所述MEF2C增强子包括SEQ ID NO：5所示序列，或与SEQ ID NO:5有至少90％序列一致性的功能性变体。
  8. 如权利要求1所述的心肌特异性嵌合启动子，其中，从5’至3’方向，依次包括所述Trans反式作用因子结合元件、所述MyoG转录因子结合位点、所述2RS5增强子、所述E-syn启动子和所述MEF1增强子。
  9. 如权利要求1所述的心肌特异性嵌合启动子，包括所述E-syn启动子和至少两个所述MEF1增强子。
  10. 如权利要求1所述的心肌特异性嵌合启动子，其中，从5’至3’方向，依次包括所述MEF1增强子、所述E-syn启动子和所述MEF1增强子。
  11. 基因表达盒，其包括权利要求1-10任一项所述的心肌特异性嵌合启动子和与其可操作地连接的目的基因。
  12. 表达载体，其包括权利要求1-10任一项所述的心肌特异性嵌合启动子或权利要求11所述的基因表达盒。
  13. 如权利要求12所述的表达载体，其为病毒表达载体。
  14. 如权利要求12或13所述的表达载体，其为腺相关病毒(AAV)表达载体。
  15. 宿主细胞，包括权利要求1-10任一项所述的心肌特异性嵌合启动子、权利要求11所述的基因表达盒或权利要求12-14任一项所述的表达载体。
  16. 药物组合物，包括：
    1)权利要求11所述的基因表达盒；
    权利要求12-14任一项所述的表达载体；或
    权利要求15所述的宿主细胞；以及
    2)药学上可接受的载体。
  17. 权利要求11所述的基因表达盒、权利要求12-14任一项所述的表达载体、权利要求15所述的宿主细胞或权利要求16所述的药物组合物在制备治疗心肌相关病症的药物中的用途。
  18. 治疗心肌相关病症的方法，包括以有效量的权利要求11所述的基因表达盒、权利要求12-14任一项所述的表达载体、权利要求15所述的宿主细胞或权利要求16所述的药物组合物向有需要的受试者给药。
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