CN117925612A

CN117925612A - 用于治疗杜氏肌营养不良症的靶向人DMD基因51号外显子的sgRNA及其载体和应用

Info

Publication number: CN117925612A
Application number: CN202311841417.6A
Authority: CN
Inventors: 陈永昌; 白绕仙; 任帅伟; 肖浦豪; 郭文婷; 张婷
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2023-12-28
Filing date: 2023-12-28
Publication date: 2024-04-26

Abstract

本发明提供了一种用于治疗杜氏肌营养不良症的靶向人DMD基因51号外显子的sgRNA及其载体和应用。涉及的sgRNA为靶向DMD基因51号外显子的Human‑sgRNA1^Ex51，Human‑sgRNA2^Ex51，Human‑sgRNA3^Ex51，Monkey‑sgRNA1^Ex51，Monkey‑sgRNA2^Ex51，Monkey‑sgRNA3^Ex51，Monkey‑sgRNA4^Ex51中的一种；载体由sgRNA克隆至质粒上并进行病毒包装获得。本发明筛选出来的sgRNA具有更高的打靶效率，可用于治疗DMD基因51号外显子上产生终止密码子的DMD患者。

Description

用于治疗杜氏肌营养不良症的靶向人DMD基因51号外显子的 sgRNA及其载体和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种用于治疗杜氏肌营养不良症的靶向人DMD基因51号外显子的sgRNA及其载体和应用。

背景技术

杜氏肌营养不良症(Duchenne Muscular Dystrophy，DMD)，也称假性肌肥大营养不良，是一种由DMD基因编码的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)突变所致的X染色体隐性遗传疾病。女孩为携带者，男孩发病，患病率约为1/3500。DMD基因是目前已知最大的人类基因之一，全长约2.4Mb，含有79个外显子和78个内含子，cDNA长14kb。DMD突变主要以大片段缺失和重复突变为主，其中外显子2-20和45-55为两个热点突变区域。DMD基因突变导致功能性dystrophin蛋白缺失，引起肌细胞膜脆性增加和肌细胞变性坏死，导致患者肌无力和丧失行走能力，最终因膈肌功能不全、心脏和呼吸衰竭而过早死亡。目前国内外针对DMD均无彻底有效的治疗方法，临床上的治疗方案大多只能缓解症状，无法阻止肌肉组织功能的持续丧失。在过去的许多年里，科学家们已经尝试了许多治疗方法，如用各种抗炎激素药物治疗，通过重组腺相关病毒(AAV)递送截短的mini-/micro-dystrophin蛋白，及用反义寡核苷酸和小分子药物实现外显子跳跃等。这些方法都存在一些不足，如长期服用激素类药物具有明显的副作用，且治标不治本；通过AAV递送的截短mini-/micro-dystrophin蛋白功能不全或不明确，且存在外源性免疫排斥反应的风险；用反义寡核苷酸和小分子药物实现的外显子跳跃治疗方法需要长期给药，且药价昂贵。因此，开发安全、有效、能永久性修复、且经济条件负担得起的恢复dystrophin蛋白的治疗方法至关重要。

CRISPR/Cas基因编辑技术能从DMD基因层面精准纠正突变，从而使肌细胞持久的产生dystrophin蛋白，因此具有治疗DMD的巨大潜力。应用AAV递送CRISPR/Cas组分，在各种DMD模型包括mdx小鼠、犬和猪模型，还有人心肌细胞中已经成功恢复了dystrophin蛋白的表达，为DMD的临床治疗带来了希望。在进行临床试验之前，动物模型对于评估治疗方法的安全性和有效性非常重要。与猪和狗相比，灵长类动物在遗传背景、生理和行为等方面与人类更为相似，是评估DMD治疗方法有效性和安全性的理想动物模型。

现有技术采用AAV递送CRISPR/spCas9基因编辑系统，针对DMD基因51号外显子设计单个或者双个sgRNAs，诱导DNA双链断裂并通过非同源末端连接(NHEJ)修复，纠正DMD基因的阅读框，使其表达有一定功能的dystrophin蛋白。然而，由于spCas9蛋白(1368个氨基酸)较大，加上sgRNA及其他功能原件将超出AAV载体的包载能力(＜4.7kb)，因此需要双载体进行递送，导致效率较低，而且需要的病毒量较大，这使得安全风险和治疗费用大大增加。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于治疗杜氏肌营养不良症的靶向人DMD基因51号外显子的sgRNA及其载体和应用。

为了实现上述目的，本发明提供了一种用于治疗杜氏肌营养不良症的靶向人DMD基因51号外显子的sgRNA，所述sgRNA为Human-sgRNA1^Ex51、Human-sgRNA2^Ex51、Human-sgRNA3^Ex51、Monkey-sgRNA1^Ex51，Monkey-sgRNA2^Ex51，Monkey-sgRNA3^Ex51，和Monkey-sgRNA4^Ex51，中的一种；

Human-sgRNA1^Ex51是针对人DMD基因51号外显子设计的sgRNA，核苷酸序列如SEQID NO.1所示，具体为：GTAACAGTCTGAGTAGGAGC。

Human-sgRNA2^Ex51是针对人DMD基因51号外显子设计的sgRNA，核苷酸序列如SEQID NO.2所示，具体为：GTGACACAACCTGTGGTTAC。

Human-sgRNA3^Ex51是针对人DMD基因51号外显子设计的sgRNA，核苷酸序列如SEQID NO.3所示，具体为：AGACTGTTACTCTGGTGACA。

Monkey-sgRNA1^Ex51是针对猕猴DMD基因51号外显子设计的sgRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：TAACAGTCTGACTAGGAGCT。

Monkey-sgRNA2^Ex51是针对猕猴DMD基因51号外显子设计的sgRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：GTAACAGTCTGACTAGGAGC。

Monkey-sgRNA3^Ex51是针对猕猴DMD基因51号外显子设计的sgRNA与SEQ ID NO.2相同，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：GTGACACAACCTGTGGTTAC。该序列与SEQ IDNO.2完全相同。

Monkey-sgRNA4^Ex51是针对猕猴DMD基因51号外显子设计的sgRNA与SEQ ID NO.3相同，核苷序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：AGACTGTTACTCTGGTGACA。该序列与SEQ ID NO.3完全相同。

基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种载体，所述载体为将所述的sgRNA克隆至质粒上，并进行病毒包装。

上述的载体，进一步的，所述质粒为pAAV-Cas12i^Max-U6-crRNA-sgRNA质粒。

上述的载体，进一步的，所述病毒为MyoAAV。

基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述的载体用于制备治疗DMD的药物。

上述的应用，进一步的，所述用于治疗DMD药物为用于治疗DMD基因50号外显子缺失引起的DMD的药物、用于治疗DMD基因49-50号外显子缺失引起的DMD的药物、用于治疗DMD基因48-50号外显子缺失引起的DMD的药物、用于治疗DMD基因47-50号外显子缺失引起的DMD的药物或用于治疗DMD基因45-50号外显子缺失引起的DMD的药物。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明提供了一种靶向DMD基因51号外显子用于治疗DMD的sgRNA。以DMD基因51号外显子为靶点可治疗大约13％的DMD患者。因此，我们设计了一种人猴共用的、肌肉特异性的单切(single-cut)治疗策略。该策略通过单个或两个sgRNAs靶向DMD基因51号外显子5'-AG-3'的剪接受体位点，能够实现跳跃或重构DMD基因51号外显子，恢复阅读框，从而恢复dystrophin蛋白的表达。该策略在DMD模型猴上取得成功后，可直接应用于患者。

(2)本发明提供了一种肌肉靶向性MyoAAV递送的Cas12i^Max-Human-sgRNA2^Ex51单载体。我们采用了最近开发的肌肉特异性AAV病毒血清型MyoAAV，该血清型对非人灵长类动物的肌肉靶向性高，且肝细胞感染效率低。此外，为了能够实现MyoAAV单载体递送，我们选择了最近发现的一种尺寸较小的CRISPR/Cas12系统Cas12i^Max，它具有很高的DNA编辑活性，且蛋白体积小(1056个氨基酸)，能够实现MyoAAV-Cas12i^Max-Human-sgRNA2^Ex51的单载体递送。这种利用肌肉靶向性的MyoAAV递送Cas12i^Max-Human-sgRNA2^Ex51的单载体治疗方法可显著减少用药剂量、降低成本、产生有效的编辑、避免高剂量AAV病毒潜在的免疫毒副作用，为治疗DMD带来了巨大希望。

附图说明

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

图1为基因编辑系统CRISPR/Cas12i^Max靶向DMD基因51号外显子的基因修复策略示意图。

图2为本发明实施例1中的靶向DMD基因51号外显子的人和猴sgRNA序列及位置示意图以及人和猴的部分DMD基因51号外显子序列示意图；图中的A为人DMD基因51号外显子序列；图中的B为猕猴DMD基因51号外显子序列。

图3为本发明实施例2中3个人源Human-sgRNA^Ex51质粒分别转染HEK293T细胞和Hela细胞之后的PCR图和T7E1酶切的DNA电泳胶图；图中的A为3个人源Human-sgRNA^Ex51质粒转染HEK293T细胞的PCR图和T7E1酶切的DNA电泳胶图；图中的B为3个人源Human-sgRNA^Ex51质粒转染Hela细胞之后的PCR图和T7E1酶切的DNA电泳胶图。

图4为本发明实施例2中3个人源Human-sgRNA^Ex51质粒分别转染HEK293T细胞和Hela细胞之后的TA克隆突变效率柱状图，以及Human-sgRNA1^Ex51和Human-sgRNA2^Ex51共同转染HEK293T细胞的TA克隆突变效率柱状图；图中的A为3个人源Human-sgRNAEx51质粒转染HEK293T细胞之后的TA克隆突变效率柱状图；图中的B为3个人源Human-sgRNAEx51质粒转染Hela细胞细胞之后的TA克隆突变效率柱状图；图中的C为Human-sgRNA1Ex51和Human-sgRNA2Ex51共同转染HEK293T细胞的TA克隆突变效率柱状图。

图5为本发明实施例3中4个猴Monkey-sgRNA^Ex51质粒转染COS7细胞之后的TA克隆突变效率柱状图。

图6为本发明实施例4中DMD^ΔEx50模型猴基因治疗后第8周、35周和1年不同肌肉的DNA和mRNA水平的编辑效率；图中的A为DNA水平的编辑效率；图中的B为mRNA水平的编辑效率。

图7为本发明实施例4中野生型(WT)、DMD^ΔEx50模型猴注射病毒前以及注射病毒后第8周、35周和1年不同肌肉中Dystrophin的蛋白表达水平。

图8为本发明实施例4中野生型(WT)、DMD^ΔEx50模型猴注射病毒前以及注射病毒后第8周、35周和1年不同肌肉中Dystrophin的免疫荧光染色。

具体实施方式

本发明提供了一种用于治疗DMD的靶向人DMD基因51号外显子的sgRNA及载体和应用，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售产品。

实施例1：靶向DMD基因51号外显子的sgRNA筛选。

设计sgRNA靶向DMD基因51号外显子，通过插入3n+1个核苷酸或删除3n-2个核苷酸实现51号外显子重构；或者当Indels发生范围足够大，以至破坏5'-AG-3'剪接受体，则发生51号外显子跳跃。

本实施例的sgRNA是Human-sgRNA1^Ex51、Human-sgRNA2^Ex51、Human-sgRNA3^Ex51、Monkey-sgRNA1^Ex51、Monkey-sgRNA2^Ex51、Monkey-sgRNA3^Ex51、Monkey-sgRNA4^Ex51的一种。

Human-sgRNA1^Ex51是针对人DMD基因51号外显子设计的sgRNA，核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

Human-sgRNA2^Ex51是针对人DMD基因51号外显子设计的sgRNA，核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

Human-sgRNA3^Ex51是针对人DMD基因51号外显子设计的sgRNA，核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

Monkey-sgRNA1^Ex51是针对猕猴DMD基因51号外显子设计的sgRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

Monkey-sgRNA2^Ex51是针对猕猴DMD基因51号外显子设计的sgRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

Monkey-sgRNA3^Ex51是针对猕猴DMD基因51号外显子设计的sgRNA与SEQ ID NO.2相同，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

Monkey-sgRNA4^Ex51是针对猕猴DMD基因51号外显子设计的sgRNA与SEQ ID NO.3相同，核苷序列如SEQ ID NO.7所示。

图2为本发明实施例1中的靶向DMD基因51号外显子的人和猴sgRNA序列及位置示意图。

实施例2：针对人DMD基因51号外显子的sgRNA编辑效率。

将实施例1中的sgRNA序列SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3分别或2个联合克隆至pAAV-Cas12i^Max-crRNA scaffold质粒上获得pAAV-Cas12i^Max-U6-crRNA-sgRNA载体。

本实施例获得的载体是：

pAAV-Cas12i^Max-U6-crRNA-Human-sgRNA1^Ex51,

pAAV-Cas12i^Max-U6-crRNA-Human-sgRNA2^Ex51,

pAAV-Cas12i^Max-U6-crRNA-Human-sgRNA3^Ex51,

pAAV-Cas12i^Max-U6-crRNA-Human-sgRNA1^Ex51-crRNA-Human-sgRNA2^Ex51。

将构建的质粒分别在HEK293T细胞或Hela细胞中转染，进行sgRNA效率的验证。

具体构建方法为：

(1)在擎科生物公司合成带有核定位信号的Cas12i^Max序列，然后用引物Cas12i^Max-F和Cas12i^Max-R，以上述合成的序列为模板进行PCR，进行PCR产物纯化回收。

Cas12i^Max-F：gctctctggctaactaccggtGCCACCATGGCACCTAAGAA(SEQ ID NO.8)。

Cas12i^Max-R：aacatcgtatgggtaggatccGACCTTCCGCTTTTTCTTAG(SEQ ID NO.9)。

(2)以质粒pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA；U6::BsaI-sgRNA质粒为骨架，使用AgeI和BamHI进行线性化，然后使用vazyme试剂盒IIOne StepCloning Kit将上述PCR片段Cas12i^Max连接到pX601的载体上，进行测序验证克隆正确。将该质粒命名为pX601-Cas12i^Max。

(3)crRNA的合成：使用引物crRNA-F和crRNA-R按照张峰实验室(Genomeengineering using the CRISPR-Cas9 system)已经发表的方法进行crRNA的合成。具体引物为SEQ ID NO.10-SEQ ID NO.11。然后将上述质粒pAAV-Cas12i^Max用BsaI和NotI酶进行酶切，然后将合成好的双链crRNA使用vazyme试剂盒IIOne Step Cloning Kit将上述crRNA片段连接到pX601-Cas12i^Max的载体上，进行测序验证克隆正确。将该质粒命名为pAAV-Cas12i^Max-U6-crRNA-sgRNA。

crRNA-F：accgagaaatccgtctttcattgacggggAGACCCGAGGGTCTctttttttctagac(SEQID NO.10)。

crRNA-R：ggccgtctagaaaaaaagAGACCCTCGGGTCTccccgtcaatgaaagacggatttct(SEQID NO.11)。

(4)转染细胞：在转化前一个小时，取出6孔细胞培养板中已培养约18h～24h，80％～90％丰度、分布均匀、生长状况好的COS7、HEK293T或者Hela细胞。吸弃原来的培养基，用无血清、无抗生素的DMEM洗两次后，再用Opti-MEM洗一次，最后加入750μl Opti-MEM覆盖于细胞上；提前半个小时，开始准备质粒和lip2000混合物；将10μl lip2000转染试剂按说明书稀释到115μl无血清培养基Opti-MEM中，涡旋震荡混匀，短暂离心，将管壁上的液体沉于管底；另将质粒分别用3μg～5μg稀释至125μl无血清培养基Opti-MEM中，涡旋震荡混匀，短暂离心，将管壁上的液体沉于管底。然后将上述稀释的lip2000至混合质粒中，轻轻吹吸10余次，充分混匀，室温结合20min，同时设置不加质粒的对照组。加入质粒与lipo2000的结合物(共250μl)，使其均匀覆盖于细胞上，在37℃，5％ CO₂培养箱中吸附6h，换入含10％血清的DMEM 2mL，72h后小心吹落细胞，与上清一起收集。

(5)提取细胞基因组：消化收集细胞，放于1.5ml EP管中，12000rpm室温离心10min，吸弃培养基，残余液体10-15μl，震荡重悬，加入200ul PBS，12000rpm室温离心10min；使用细胞基因组提取试剂盒Genomic DNA Purification Kit(货号A1120)提取细胞基因组，提取好的基因组放于-20℃保存。

(6)设计引物：从NCBI数据库中下载人源和猴源DMD基因组序列，并分别找到51号外显子序列，利用Primer 6软件进行引物的设计，引物具体为：

Mk-Ex51-F：ACTTGTCCAGGCACGAGAAT(SEQ ID NO.12)；

Mk-Ex51-R：GCTGAACAGTGAGAGTAATGTGT(SEQ ID NO.13)；

H-Ex51-F：CTTGTCCAGGCATGAGAATGAG(SEQ ID NO.14)；

H-Ex51-R：GGCTGAATAGTGAGAGTAATGTGTT(SEQ ID NO.15)。

其中，Mk-Ex51-F和Mk-Ex51-R是根据猕猴DMD基因组序列设计的；H-Ex51-F和H-Ex51-R是根据人DMD基因组序列设计的。

PCR反应体系：5×PrimeSTAR GXL Buffer:10μl；dNTP Mixture(2.5mM each):4μl；Mk-Ex51-F/H-Ex51-F；2μl；Mk-Ex51-R/H-Ex51-R:2μl；DNA基因组:1μl；PrimeSTAR GXLDNA Polymerase:1μl；H₂O:30μl。

PCR程序为：95℃预变性5min；40个循环；98℃变性10sec，60℃退火15sec(SEQ IDNO.12～SEQ ID NO.13)；60℃退火15sec(SEQ ID NO.14～SEQ ID NO.15)；72℃延伸30sec，72℃延伸10min。

PCR产物纯化回收之后，进行Sanger测序，挑取单克隆进行测序。

(7)T7E1酶切鉴定CRISPR/Cas12i^Max编辑效果:取上述PCR纯化回收产物200ng，加入2ul的NEB Buffer2，进行对扩增的DNA进行变性和退火复性。扩增的DNA发生双链重新匹配，当基因编辑发生时，将产生异质双链DNA。然后加入0.5μl T7E1酶处理退火后的DNA产物，37℃孵育15分钟，然后利用2％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。T7E1可以在双链DNA的错配位点处进行双链DNA切割。代表基因编辑成功的异质双链DNA将被切割，没有被编辑的不发生切割。T7E1酶切后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳。如果出现了切割下来的DNA条带，则说明在目标片段发生了基因编辑。

图3为本发明实施例2中3个人源Human-sgRNAEx51质粒分别转染HEK293T细胞(图中的A)和Hela细胞(图中的B)之后的PCR图和T7E1酶切的DNA电泳胶图。从图中可以看出：3个人sgRNA在51号外显子的位点可以进行切割，说明sgRNA具有切割能力。

图4为本发明实施例2中3个人源Human-sgRNAEx51质粒分别转染HEK293T细胞(图中的A)和Hela细胞(图中的B)之后的TA克隆突变效率柱状图，以及Human-sgRNA1Ex51和Human-sgRNA2Ex51共同转染HEK293T细胞(图中的C)的TA克隆突变效率柱状图。

从图中可以看出，3个人sgRNA(Human-sgRNA1^Ex51，Human-sgRNA2^Ex51，Human-sgRNA3^Ex51)在HEK293T细胞水平总的编辑效率依次分别是33.33％、58.53％和66.67％，有效的编辑效率依次分别是13.33％，14.63％，31.11％。3个人sgRNA在Hela细胞水平总的编辑效率依次分别是22.44％、30.94％和22.22％，有效的编辑效率依次分别是12.27％，9.52％，11.11％。Human-sgRNA1^Ex51-crRNA-Human-sgRNA2^Ex51在HEK293T细胞水平总的编辑效率是40.82％，有效的编辑效率是18.37％。

实施例3：针对猴DMD基因51号外显子的sgRNA编辑效率。

将实施例1中的sgRNA替换为SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ IDNO.7，采用实施例2相同的方法在COS7细胞中初步验证4个猴sgRNA的编辑效率。

图5为本发明实施例3中4个猴Monkey-sgRNAEx51质粒转染COS7细胞之后的TA克隆突变效率柱状图。从图中可以看出，在COS7细胞水平分别转染4个猴sgRNA质粒，之后进行TA克隆分析。4个猴sgRNA(Monkey-sgRNA1^Ex51，Monkey-sgRNA2^Ex51，Monkey-sgRNA3^Ex51，Monkey-sgRNA4^Ex51，)总的编辑效率依次分别是32.5％、32.5％、45％和47％，有效的编辑效率依次分别为12.5％，12.5％，20％，17.5％。

实施例4：利用携带基因编辑工具的MyoAAV对DMD^△Ex50模型猴进行体内治疗。

(1)选用人猴序列完全相同且效率较高的Human-sgRNA2^Ex51构建pAAV-Cas12i^Max-crRNA-human-sgRNA2^Ex51载体，并进行MyoAAV病毒的包装。

(2)选择一只17个月大的50号外显子缺失DMD模型猴(DMD^△Ex50)评估基因治疗的有效性。对DMD^△Ex50模型猴给予静脉注射MyoAAV-Cas12i^Max-Human-sgRNA2^Ex51，剂量为4E+13vg/kg。在注射MyoAAV前、以及注射后8周、35周和一年(1y)进行肌肉活检，检测治疗的有效性。

(3)设计引物：根据猴源DMD基因组和mRNA序列，设计高通量建库的引物，引物具体为：

DMD-Ex51-F:GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGCTCCTAGTCAGA CTGTTACTC(SEQ ID NO.16)；

DMD-Ex51-R:TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGAAGCCATTCGGTA AGTTCTGT(SEQ ID NO.17)；

RT-Ex51-F:GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCTCAGCCAGTGAAG CTCCTA(SEQID NO.18)；

RT-Ex51-R:TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCATTCGGTAAGTTCT GTCCAA(SEQ ID NO.19)。

图6为本发明实施例4中DMD^△Ex50模型猴基因治疗后第8周、35周和1年不同肌肉的DNA和mRNA水平的编辑效率；图中的A为DNA水平的编辑效率；图中的B为mRNA水平的编辑效率。其中QD表示股四头肌，DT表示三角肌，TB表示肱三头肌，BB表示肱二头肌，TA表示胫骨前肌。从图中可以看出：DMD^△Ex50模型猴在MyoAAV-Cas12i^Max-Human-sgRNA2^Ex51全身治疗后的第8周(8w)、35周(35w)和1年(1y)时不同肌肉组织中均表现出不同程度的编辑效率，且编辑效率可维持至少1年的时间。

图7为本发明实施例4中野生型(WT)、DMD^△Ex50模型猴注射病毒前以及注射病毒后第8周、35周和1年不同肌肉中Dystrophin的蛋白表达水平。从图中可以看出：Western Blot结果显示病毒注射后的第8周、35周和一年，QD、DT、TB、BB和TA肌肉中的肌营养不良蛋白(Dystrophin)成功恢复。

图8为本发明实施例4中野生型(WT)、DMD^△Ex50模型猴注射病毒前以及注射病毒后第8周、35周和1年不同肌肉中Dystrophin的免疫荧光染色。从图中可以看出，免疫染色结果显示病毒注射后的第8周、35周和一年，QD、DT、TB、BB和TA肌肉中的肌营养不良蛋白(Dystrophin)成功恢复。

Claims

1.一种用于治疗杜氏肌营养不良症的靶向人DMD基因51号外显子的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA为Human-sgRNA1^Ex51，Human-sgRNA2^Ex51，Human-sgRNA3^Ex51，Monkey-sgRNA1^Ex51，Monkey-sgRNA2^Ex51，Monkey-sgRNA3^Ex51，Monkey-sgRNA4^Ex51中的一种；

所述Human-sgRNA1^Ex51是针对人DMD基因51号外显子设计的sgRNA，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；

所述Human-sgRNA2^Ex51是针对人DMD基因51号外显子设计的sgRNA，核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；

所述Human-sgRNA3^Ex51是针对人DMD基因51号外显子设计的sgRNA，核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；

所述Monkey-sgRNA1^Ex51是针对猕猴DMD基因51号外显子设计的sgRNA，核苷酸序列如SEQID NO.4所示；

所述Monkey-sgRNA2^Ex51是针对猕猴DMD基因51号外显子设计的sgRNA，核苷酸序列如SEQID NO.5所示；

所述Monkey-sgRNA3^Ex51是针对猕猴DMD基因51号外显子设计的sgRNA，核苷酸序列如SEQID NO.6所示；

所述Monkey-sgRNA4^Ex51是针对猕猴DMD基因51号外显子设计的sgRNA，核苷酸序列如SEQID NO.7所示。

2.一种载体，其特征在于，所述载体为将权利要求1所述的sgRNA分别克隆至质粒上，并进行病毒包装。

3.一种载体，其特征在于，所述载体为将权利要求1所述的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的sgRNA共同构建到同一个质粒上，并进行病毒包装。

4.根据权利要求2或3所述的载体，其特征在于，所述质粒为pAAV-Cas12i^Max-U6-crRNA-sgRNA质粒。

5.根据权利要求2或3所述的载体，其特征在于，所述病毒为MyoAAV。

6.如权利要求1所述的sgRNA或者如权利要求2-3任一所述的表达载体在制备用于治疗DMD药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述用于治疗DMD药物为用于治疗DMD基因50号外显子缺失引起的DMD的药物、用于治疗DMD基因49-50号外显子缺失引起的DMD的药物、用于治疗DMD基因48-50号外显子缺失引起的DMD的药物、用于治疗DMD基因47-50号外显子缺失引起的DMD的药物或用于治疗DMD基因45-50号外显子缺失引起的DMD的药物。