CN115820642A - 一种用于治疗杜氏肌营养不良症的CRISPR-Cas9系统 - Google Patents
一种用于治疗杜氏肌营养不良症的CRISPR-Cas9系统 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115820642A CN115820642A CN202211410690.9A CN202211410690A CN115820642A CN 115820642 A CN115820642 A CN 115820642A CN 202211410690 A CN202211410690 A CN 202211410690A CN 115820642 A CN115820642 A CN 115820642A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- crispr
- grna
- dmd
- muscular dystrophy
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 206010013801 Duchenne Muscular Dystrophy Diseases 0.000 title claims abstract description 45
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims abstract description 82
- 101150015424 dmd gene Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 13
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims abstract description 11
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 15
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 15
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 8
- 101000910035 Streptococcus pyogenes serotype M1 CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1 Proteins 0.000 claims description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 3
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 22
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 abstract description 16
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 8
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 16
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 13
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 9
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 8
- 101710172824 CRISPR-associated endonuclease Cas9 Proteins 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 6
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 6
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 102100035102 E3 ubiquitin-protein ligase MYCBP2 Human genes 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 5
- 101150061112 Dys gene Proteins 0.000 description 4
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 4
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 4
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 3
- 229950005470 eteplirsen Drugs 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 2
- 241001635911 Sarepta Species 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 101150038500 cas9 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 208000010428 Muscle Weakness Diseases 0.000 description 1
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000021642 Muscular disease Diseases 0.000 description 1
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 description 1
- 201000009623 Myopathy Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000035977 Rare disease Diseases 0.000 description 1
- 208000004756 Respiratory Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000011559 double-strand break repair via nonhomologous end joining Effects 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000011013 endotoxin removal Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000004220 muscle function Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000003234 polygenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于治疗杜氏肌营养不良症的CRISPR‑Cas9系统,包含:将发生在杜氏肌营养不良症(DMD)基因27号外显子的点突变或无义突变通过碱基的删除或添加将(3N‑1)的错误读码框纠正为(3N)恢复通读gRNA;敲除DMD基因27号外显子的gRNA;以及跳跃DMD基因27号外显子,使外显子26和28连在一起恢复通读的gRNA。本发明能较全面地对DMD基因27号外显子进行基因编辑,利用特定的CRISPR‑SaCas9、CRISPR‑SauriCas9小体积系统,有利于实现单载体递送,将来更易应用到临床;而且能为DMD非热点突变的患者制备个性化基因编辑药物。
Description
技术领域
本发明涉及基因编辑领域,尤其涉及一种用于治疗杜氏肌营养不良症的CRISPR-Cas9系统。
背景技术
遗传性疾病的治疗一直是一个亟待解决的难题,随着生命科学的不断发展,基因治疗被受到广泛的关注,尤其是CRISPR-Cas9的发现。由于CRISPR-Cas9技术其对基因组编辑方面的简洁和高效的优点,为很多遗传疾病的治疗带来了希望,该技术的应用得到了突飞猛进的发展,随着越来越多基因治疗药物的上市,为无数患者家庭带来希望,对人权的尊重、维护社会稳定,个性化治疗也成了必然趋势。但是目前多数上市的基因治疗药物多为国外开发,让技术不成为卡脖子的事情,保护我国病人享受治疗的权力,需加快对罕见病的治疗。
杜氏肌营养不良(DMD)是最常见的遗传性儿童肌病,在新生男孩中大约有1/3500患病,患者逐渐表现出进行性肌肉退化和虚弱,并因呼吸和心脏衰竭而过早死亡。绝大多数患者是因为编码肌营养不良蛋白的DMD基因发生突变,DMD基因位于X染色体上。DMD基因的突变主要包括大片段缺失,重复突变,点突变等,不同的突变类型表型也不相同。临床报告一部分患者基因突变集中在“热点突变区域”,也有很多患者突变在非热点区域。长久以来,国内外均无针对DMD的有效临床干预措施或药物。
研究者正在开发能够有效治疗DMD的药物,主要包括通过基因递送、外显子跳跃、终止密码子通读和基因组编辑疗法来恢复部分功能性肌萎缩蛋白的表达,以及通过靶向DMD发病机制中涉及的途径来改善肌肉功能和质量。2016年9月,美国FDA通过加快审批方式(仅进行了12例临床试验)批准了Sarepta Therapeutics公司的新药Exondys 51(Eteplirsen)注射液,该药是世界上第一款被批准用于治疗DMD的药物而Eteplirsen注射液只能针对Dys基因第51号外显子缺失的患者(约占DMD患者的13%),且目前尚无足够的证据证明eteplirsen对DMD的治疗效果,并且Dys基因的突变多集中在2-20号外显子区和45-53号外显子区。因此Sarepta Therapeutics公司还在开发另外7种外显子跳跃产品,它们通过跳过53、45、50、44、52、55和8号外显子治疗其他基因突变型的DMD患者,在外显子跳跃疗法、终止密码子的修复方式,已有药物上市,但仅适用一部分患者,价格昂贵,并且需要反复给药。
基因编辑技术CRISPR-Cas9的出现可以实现精确的基因编辑,提高基因的修复效率,为很多遗传疾病带来希望,但利用CRISPR-Cas9技术也会有很多无法避免的问题,递送方式是主要考虑问题之一,由于CRISPR-Cas9系统比较大,因此大部分只能采用AAV递送,而AAV的成本高并且体内存在很多预存抗体,无法进行第二次注射;另外Cas9会引起体内的免疫反应,极大的影响了治疗效果。因此还需要不断的优化系统以及递送方式,所以现在有很多小的基因编辑系统被开发,例如CRISPR-SaCas9、CRISPR-SauriCas9,实现单载体递送,增加临床安全性。
目前对DMD疾病治疗主要集中在对热点突变病人的研究,而非热点突变的病人也很多,并且随着科学技术的进步,将来实现基因个性化治疗成为趋势,因此针对非热点突变的DMD病人,制备CRISPR-Cas9基因药物很有必要。
发明内容
本发明提供了一种可以有效治疗杜氏肌营养不良症(DMD)的CRISPR-Cas9系统,选用多种修复方式达到多种修复效果,对DMD基因27号外显子进行了较全面的基因编辑研究。可以应用于多种Exon27号突变,其中有的gRNA还可以实现一体化包装,能够更好的应用于临床基因药物。
本发明利用CRISPR-Cas9系统应用临床时,需要把Cas9和gRNA导入到体内而目前做基因治疗最有效的递送载体是AAV病毒。但是AAV病毒包装的DNA一般不超过4.5kb,本发明采用的SpCas9 PAM序列简单(识别NGG)且活性高而得到广泛应用,SpCas9的DNA长度为4.1kb,加上gRNA和启动子,需要包装在两个病毒内使用;本发明还采用SaCas9、SauriCas9相对于SpCas9,SaCas9较复杂的PAM序列(NNGRRT)和SauriCas9的PAM序列(NNGG),但SaCas9蛋白的DNA长度为3.3kb、SauriCas9蛋白的DNA长度为3.1kb,加上gRNA和启动子可进行单个AAV(腺相关病毒)的有效包装,对治疗过程中采用肌肉局部注射更有优势,为将来应用于临床提供更大的可能性。此外DMD基因Exon27的突变虽不是DMD患者的热点突变区域,但在DMD患者中也占很大的比例,由于遗传疾病带来家庭创伤及社会不稳定,实现个性化治疗,挽救家庭,维护社会稳定也很重要,此发明包含所有在DMD患者Exon27的突变,涉及范围广。
为解决上述问题,本发明的技术方案如下:一种用于治疗杜氏肌营养不良症的CRISPR-Cas9系统,所述CRISPR-Cas9系统包含:将发生在DMD基因27号外显子的点突变或无义突变通过碱基的删除或添加将(3N-1)的错误读码框纠正为(3N)恢复通读gRNA、敲除DMD基因27号外显子的gRNA、以及将DMD基因27号外显子跳过使外显子26和28连在一起恢复通读的gRNA中的一种或多种。
作为优选,将发生在DMD基因27号外显子的点突变或无义突变通过碱基的删除或添加将(3N-1)的错误读码框纠正为(3N)恢复通读gRNA靶序列选自SEQ ID NO:1-SEQ IDNO:12中的至少一种。
作为进一步优选,所述通过碱基的删除或增加将3N-1的错误读码框纠正为3N恢复通读的gRNA靶序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:12中的至少一种。SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3采用的是CRISPR-SauriCas9编辑系统;SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8采用的是CRISPR-SpCas9编辑系统;SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:12采用的是CRISPR-SaCas9编辑系统。
更进一步优选,所述gRNA由靶序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中的一种和靶序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10中的一种进行组合,通过碱基的删除或增加将3N-1的错误读码框纠正为3N恢复通读。
作为优选,所述用于敲除DMD基因27号外显子的gRNA靶序列选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:17中的至少一种。
作为优选,所述用于敲除DMD基因27号外显子的gRNA由靶序列如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15中的一种,和靶序列如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16中的一种进行组合。
作为优选,通过对DMD基因27号外显子的跳跃,跳跃位点位于5A位点。
作为优选,通过对DMD基因27号外显子跳跃的gRNA靶序列选自SEQ ID NO:18和SEQID NO:19中的至少一种。
作为优选,所述CRISPR-Cas9还包括表达载体和Cas9蛋白,所述表达载体为AAV载体;所述Cas9蛋白为SpCas9、SaCas9、SauriCas9或nCas9蛋白。
本发明还提供CRISPR-Cas9系统在制备用于预防或治疗杜氏肌营养不良症的药物中的用途。
本发明采用CRISPR-SpCas9;CRISPR-SauriCas9;CRISPR-SaCas9以及单碱基编辑系统ABE基因编辑技术针对DMD基因外显子27号分别设计gRNA,将发生在DMD基因27号外显子的点突变或无义突变通过碱基的删除或添加将(3N-1)的错误读码框纠正为(3N),使其表达具有一定功能的抗肌萎缩蛋白;通过诱导DNA双链切割并通过NHEJ连接,切除27号外显子纠正Dys基因的读码框,使其表达出有一定功能的抗肌萎缩蛋白、以及通过ABE系统、nCas9系统实现对DMD基因27号外显子跳跃,这样对于27号外显子任何突变都可以进行修复。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:本发明针对DMD患者的非热点突变位点进行基因编辑,为这些患者带来希望,实现个性化治疗也必是将来的趋势;几乎包含当前所有的基因编辑方式较全面的对DMD基因27号外显子进行基因修复,利用CRISPR-SauriCas9系统,有利于实现单载体递送,将来更易应用到临床;利用CRISPR-SpCas9系统,编辑效率高;利用CRISPR-SaCas9、CRISPR-SauriCas9系统本发明筛选出的gRNA可以实现单载体递送。
附图说明
图1是CRISPR-Cas9介导的gRNA修复DMD基因27号外显子的策略;
图2是确定SaCas9、SauriCas9、SpCas9及gRNA载体构建是否成功;
图3是本发明实例1中SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:12 gRNA转染图;
图4是本发明实例1中SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:12 gRNA转染293T后进行PCR的检测结果;
图5是本发明实例1中SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:12 Sanger测序检测结果;
图6是本发明实例1中SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:12 T7酶切结果;
图7是本发明实例2中Group No:1-Group No:4 PCR结果;
图8是本发明实例3中SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:18载体构建结果;
图9是本发明实例3中SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:18 gRNA转染293T后进行PCR的检测结果;
图10是本发明实例3中SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:18Sanger测序部分结果;
图11是本发明实例3中Group NO:5-Group NO:8 PCR扩增结果;
图12是本发明实例3中Group NO:5-Group NO:8 PCR产物Sanger测序扩增结果;
图13是本发明实例4中DMD基因Exon26、Exon27、Exon28基因的扩增结果;
图14是本发明实例4中DMD基因Exon26、Exon27、Exon28基因的连接;
图15是本发明实例4中DMD基因Exon26、Exon27、Exon28基因的连接载体Sanger测序;
图16是本发明实例4中DMD基因Exon26-Exon27-Exon28基因定点突变Sanger检测;
图17是定点突变检测的PCR胶图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明,但本发明并不局限于以下技术方案。本发明针对27号外显子突变的DMD患者的多种修复方式,包括gRNA、表达载体、CRISPR-Cas9系统,包括发生在27号外显子的点突变或无义突变通过碱基的删除或添加通过诱导碱基的删除或添加将(3N-1)的错误读码框纠正为(3N)恢复通读的gRNA靶序列,使其表达具有一定功能的抗肌萎缩蛋白;用于敲除DMD基因27号外显子的gRNA;以及通过ABE系统、nCas9系统实现对DMD基因Exon27号外显子跳跃,使得DMD基因Exon26和Exon28连接在一起,恢复通读;以下实施例的修复策略如图1所示。
实施例1所述用于发生在27号外显子的点突变或无义突变通过碱基的删除或添加将(3N-1)的错误读码框纠正为(3N)恢复通读。
1.1载体的制备
用于治疗DMD的常规CRISPR-Cas9系统通常包括表达Cas9的载体和表达gRNA的载体,本实施例使用pAAV-CMV-SauriCas9(#135964)、pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)(#48138)、PX601-GFP(#84040)。其中pAAV-CMV-SauriCas9(#135964)使用Eco31I进行酶切,px458-GFP-SpCas9使用BpiI进行酶切,PX601-GFP(#84040)使用Eco31I进行酶切,在37℃水浴锅中进行酶切,使用胶回收试剂盒(Quick Gel Extraction Kit)进行线性化质粒的纯化。
1.2 gRNA退火形成双链
根据不同的Cas9系统的PAM识别位点,分别设计gRNA,并由第三方公司合成gRNA对应的寡核苷酸单链DNA,即Oligo-F和Oligo-R序列,退火后形成双链gRNA。
表1用于发生在27号外显子的点突变或无义突变通过碱基的删除或添加将(3N-1)的错误读码框纠正为(3N)恢复通读的gRNA靶序列及CRISPR-Cas9系统
1.3连接转化
随后进行DH5ɑ(TSINGKE TSC-C015αChemically Competent Cell)转化,将生长的细菌克隆并进行Sanger测序验证。确认正确的gRNA连接到相应的载体上。测序引物选用通用RenyuanU6启动子进行测序。将构建正确的质粒进行去内毒素提质粒,进行细胞转染,筛选出有效的gRNA。图2展示了部分连接成功的测序结果。
1.4细胞转染
使用常见工具细胞HEK293T细胞铺6孔板,待细胞密度到50%-60%,利用Lipofectamine 2000试剂盒(InvitrogenTM 11668019)将1.3中提取的质粒转染到转染HEK293T细胞,转染72h后,提基因组。连接的载体中,SaCas9、SpCas9带有GFP荧光、SauriCas9没有荧光,通过荧光确定转染效率。图3展示部分gRNA的转染293T的荧光图。
1.5 PCR验证在293T中gRNA的有效性
使用1.4中得到的基因组,在gRNA结合位点的上下游设计PCR引物,如表2所示,进行靶位点的PCR(Takara9158A)扩增,扩增后跑胶,如图4,通过胶图判定无外条件影响,使用DL2000(TaKaRa)指示扩增条带是否正确,确认无误后使用试剂盒纯化回收PCR产物,并测定产物浓度,PCR反应体系及PCR运行程序如下:
表2 PCR反应体系
PCR运行程序
1.6通过对PCR产物进行Sanger测序及T7酶切验证编辑有效性
由于PCR产物胶图无法清楚反映gRNA的编辑效率,分别通过Sanger测序以及T7酶切验证gRNA的编辑效率。其中Sanger测序为PCR回收产物使用PCR引物送到第三方公司进行测序,若gRNA有效率,则会在gRNA的靶位点附近有编辑,就会产生双峰,图5中已用方框标出起双峰的位置。T7酶切后跑胶,用“+”、“-”表示是否加入T7酶,结果如图6所示,若发生了编辑将会产生多种条带。通过T7酶切及Sanger测序确认使用SauriCas9编辑系统中SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6有效;SpCas9中SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:10均有效;SaCas9系统中SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12有效。
1.7应用临床DMD患者在第3682位缺失1bpG碱基造成dystrophin蛋白无法翻译的实例,通过TOPO克隆,找出是否能产生有效编辑。
根据中国DMD病人突变情况,找到一位DMD病人在DMD基因第3682位缺失1bpG碱基,本发明以该病人的序列为例子,验证本发明gRNA的有效性。该病人的序列如SEQ ID NO:20。
通过T7酶切以及Sanger测序本发明确定了有效的gRNA,使用TOPO克隆试剂盒(VAZYMEC601-01)将有效的gRNA转染细胞基因获得的PCR产物与pCE2 TA/Blunt-Zero连接,并进行转化,挑单克隆,每个gRNA挑30个克隆,分析具体突变方式。发现SaCas9引起的有效基因编辑效率较SauriCas9、SpCas9高,如表3所示,即SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12较SEQID NO:2-SEQ ID NO:10高。
表3 gRNA引起的有效突变效率
实施例2:所述用于发生在27号外显子的点突变或无义突变通过碱基的删除或添加将(3N-1)的错误读码框纠正为(3N)恢复通读gRNA的组合筛选
2.1 gRNA组合
将实施例1某些gRNA进行组合,27号外显子左端选用SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中的一种;27号外显子右端选用SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10中的一种。图表4所示:
表4通过碱基的删除或添加将(3N-1)的错误读码框纠正为(3N)恢复通读gRNA的组合
2.2细胞转染
使用常见工具细胞HEK293T细胞铺6孔板,待细胞密度到50%-60%,利用Lipofectamine2000试剂盒将1.3中提取的质粒转染到转染HEK293T细胞,转染72h后,提基因组。
2.3 PCR检测突变效果及测序分析
使用2.2中得到的基因组,在DMD基因27号外显子上下游设计PCR引物,如表5所示,进行靶位点的PCR扩增,扩增后跑胶,结果如图7,若发生切割,将会有小的条带出现,DMD基因Exon27的长度是183bp,根据TaKaRaDL2000(TaKaRa)指示红色箭头所指的条带也许是Exon27的敲除,确认无误后使用试剂盒纯化回收PCR产物,并测定产物浓度,并通过Sanger确定有效的切割组合。
使用TOPO克隆试剂盒将有效的gRNA转染细胞基因获得的PCR产物与pCE2 TA/Blunt-Zero连接,并进行转化,挑单克隆,每个gRNA挑30个克隆,分析具体突变方式,找到有效突变率。
表5 gRNA引起的有效突变效率
由表5可看出,SpCas9引导的组合1和组合2基因编辑效率增高,而SauriCas9引起的组合3和组合4基因编辑组合会使效率变低,我们猜测可能发生了同位竞争。
实施例3敲除DMD基因27号外显子的gRNA
3.1载体的制备
用于治疗DMD的常规CRISPR-Cas9系统通常包括表达Cas9的载体和表达gRNA的载体,本实施例使用px458-GFP-SpCas9质粒,使用BpiI进行酶切。在37℃水浴锅中进行酶切并使用胶回收试剂盒进行线性化质粒的纯化。
3.2 gRNA退火形成双链
根据不同的SpCas9系统的PAM识别位点,设计gRNA,并由第三方公司合成gRNA对应的寡核苷酸单链DNA,即Oligo-F和Oligo-R序列,退火后形成双链gRNA。
表6.敲除DMD基因27号外显子的gRNA靶序列
3.3连接转化
随后进行DH5ɑ转化,将生长的细菌克隆并进行Sanger测序验证。确认正确的gRNA连接到相应的载体上。测序引物选用通用RenyuanU6启动子进行测序。将构建正确的质粒进行去内毒素提质粒,进行细胞转染,筛选出有效的gRNA。图8展示了部分连接成功的测序结果。
3.4细胞转染
使用常见工具细胞HEK293T细胞铺6孔板,待细胞密度到50%-60%,利用Lipofectamine2000试剂盒将3.3中提取的质粒,按照表7的组合转染到转染HEK293T细胞,转染72h后,提基因组。
3.5 PCR验证在293T中gRNA的有效性
使用3.4中得到的基因组,在gRNA结合位点的上下游设计PCR引物,如表7所示,进行靶位点的PCR扩增,扩增后跑胶图9,通过胶图判定无外条件影响,使用TaKaRaDL2000指示扩增条带是否正确,确认无误后使用试剂盒纯化回收PCR产物,并测定产物浓度,PCR反应体系及PCR运行程序如下:
表7 PCR反应体系
PCR运行程序
3.6通过对PCR产物进行Sanger测序验证编辑有效性
由于PCR产物胶图无法清楚反映gRNA的编辑效率,分别通过Sanger测序验证gRNA的编辑效率。其中Sanger测序为PCR回收产物使用PCR引物送到第三方公司进行测序,若gRNA有效率,则会在gRNA的靶位点附近有编辑,就会产生双峰,图10中已用红色框标出起双峰的位置。由图中可知SEQ ID NO:10、以及SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:17的结果相差不大,都可以达到有效的编辑。
3.7将3.6有效的gRNA进行组合,查看是否可以有效的切除DMD基因Exon27,如表8所示。
表8将有效的gRNA进行组合,查看是否可以有效的切除DMD基因Exon27
Exon27左端 | Exon27右端 | |
Group NO:5 | SEQ ID NO:15 | SEQ ID NO:16 |
Group NO:6 | SEQ ID NO:14 | SEQ ID NO:16 |
Group NO:7 | SEQ ID NO:15 | SEQ ID NO:10 |
Group NO:8 | SEQ ID NO:14 | SEQ ID NO:10 |
3.8细胞转染
使用常见工具细胞HEK293T细胞铺6孔板,待细胞密度到50%-60%,利用Lipofectamine 2000试剂盒将3.3中提取的质粒,按照表7的组合转染到转染HEK293T细胞,转染72h后,提基因组。
3.9通过对PCR产物进行Sanger测序验证编辑有效性
同样进行PCR,PCR结果如图11所示,可以明显的看到切割,已用红色箭头表示。随后进行PCR产物回收后送Sanger测序,分析突变效率。图12部分展示测序结果,使用商用软件SnapGene主要从起双峰的位置进行截图,可以明显看出双峰,可以进行Exon27的删除;Group NO:5-Group NO:8的切割效果接近,Group NO:8的切割有效性略胜一筹。
实施例4 DMD基因27号外显子的跳跃
4.1合成DMD基因Exon26,Exon27、Exon28片段
从NCBI下载DMD基因序列,分别针对Exon26,Exon27、Exon28每个外显子设计引物,引物见表9。随后分别用设计好的引物,按照以下反应体系扩增293T的基因组,扩增后进行跑核酸胶鉴定,如图12,确认无误后进行PCR产物回收。
表9合成Exon26,Exon27、Exon28的引物
表10 PCR反应体系
PCR运行程序
4.2连接DMD基因Exon26,Exon27、Exon28片段
使用ClonExpress II One Step Cloning Kit(vazymeC112-01)试剂盒,将4.1的PCR产物及载体,载体结构如图14,按照比例进行连接,并DH5ɑ转化,第二天进行挑单克隆并进行Sanger测序,确认是否连接成功,图15展示载体与测序结果比对,证明是否连接成功。
4.3定点突变DMD基因Exon27的剪接受体、剪接供体确定引起跳跃的位点
分别针对Exon27的剪接受体、剪接供体突变设计引物,引物如表11所示,并将引物连接到载体后,进行DH5ɑ转化并进行挑单克隆送Sanger测序,测序结果如图16展示。将有效的菌株去内毒素提质粒进行转染并且提RNA,反转cDNA进行PCR检测,扩增PCR图17,5A位点引起的跳跃最高,故可确认5A位点是跳跃位点。
表11定点突变引物设计
4.4针对5A设计可以跳跃的gRNA
使用BE4Max系统(Matsoukas IG.Commentary:Programmable base editing ofA·T to G·C in genomic DNA without DNA cleavage.Front Genet.2018 Feb7;9:21.doi:10.3389/fgene.2018.00021.PMID:29469899;PMCID:PMC5808320.)以及CRISPR-NCas系统(Miller SM,Wang T,Randolph PB,Arbab M,Shen MW,Huang TP,Matuszek Z,NewbyGA,Rees HA,Liu DR.Continuous evolution of SpCas9 variants compatiblewith non-G PAMs.Nat Biotechnol.2020 Apr;38(4):471-481.doi:10.1038/s41587-020-0412-8.Epub 2020 Feb 10.PMID:32042170;PMCID:PMC7145744.)寻找发生有效跳跃的gRNA,根据不同系统的PAM识别位点,设计gRNA,并由第三方公司合成gRNA对应的寡核苷酸单链DNA,即Oligo-F和Oligo-R序列,退火后形成双链gRNA,表12跳跃DMD基因27号外显子的gRNA靶序列。随后进行DH5ɑ转化,将生长的细菌克隆并进行Sanger测序验证。确认正确的gRNA连接到相应的载体上。测序引物选用通用RenyuanU6启动子进行测序。将构建正确的质粒进行去内毒素提质粒,进行细胞转染,提基因组并通过PCR及Sanger筛选出有效的gRNA。
表12跳跃DMD基因27号外显子的gRNA靶序列
上述实施例仅是对本发明的详细阐述,但本发明并不局限于上述实施方式,在本发明的精神和权利要求保护范围之内,对本发明做出的任何修改、替换和改变等,均在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于治疗杜氏肌营养不良症(DMD)的CRISPR-Cas9系统,其特征在于,所述CRISPR-Cas9系统包含:将发生在DMD基因27号外显子的点突变或无义突变通过碱基的删除或添加将(3N-1)的错误读码框纠正为(3N)恢复通读gRNA、敲除DMD基因27号外显子的gRNA、以及跳跃DMD基因27号外显子使外显子26和28连在一起恢复通读的gRNA中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的用于治疗杜氏肌营养不良症的CRISPR-Cas9系统,其特征在于,将发生在DMD基因27号外显子的点突变或无义突变通过碱基的删除或添加将(3N-1)的错误读码框纠正为(3N)恢复通读gRNA靶序列选自SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:12中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的用于治疗杜氏肌营养不良症的CRISPR-Cas9系统,其特征在于,将发生在DMD基因27号外显子的点突变或无义突变通过碱基的删除或添加将(3N-1)的错误读码框纠正为(3N)恢复通读gRNA靶序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的用于治疗杜氏肌营养不良症的CRISPR-Cas9系统,其特征在于,所述gRNA由靶序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中的一种和靶序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10中的一种进行组合,将发生在DMD基因27号外显子的点突变或无义突变通过碱基的删除或添加将(3N-1)的错误读码框纠正为(3N)恢复通读gRNA。
5.根据权利要求1所述的用于治疗杜氏肌营养不良症的CRISPR-Cas9系统,其特征在于,所述用于敲除DMD基因27号外显子的gRNA靶序列选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13-SEQID NO:17中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的用于治疗杜氏肌营养不良症的CRISPR-Cas9系统,其特征在于,所述用于敲除DMD基因27号外显子的gRNA是靶序列如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15中的一种;和靶序列如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16中的一种进行组合。
7.根据权利要求1所述的用于治疗杜氏肌营养不良症的CRISPR-Cas9系统,其特征在于,所述跳跃DMD基因27号外显子的跳跃位点位于剪接受体5A处。
8.根据权利要求1所述的用于治疗杜氏肌营养不良症的CRISPR-Cas9系统,其特征在于,所述通过跳跃DMD基因27号外显子gRNA靶序列选自SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19中的至少一种。
9.根据权利要求1所述的用于治疗杜氏肌营养不良症的CRISPR-Cas9系统,其特征在于,所述CRISPR-Cas9还包括表达载体和Cas9蛋白,所述表达载体为AAV载体;所述Cas9蛋白为SpCas9、SaCas9、SauriCas9或nCas9蛋白。
10.如权利要求1-9任一所述的CRISPR-Cas9系统在制备用于预防或治疗杜氏肌营养不良症的药物中的用途。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211410690.9A CN115820642B (zh) | 2022-11-11 | 2022-11-11 | 一种用于治疗杜氏肌营养不良症的CRISPR-Cas9系统 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211410690.9A CN115820642B (zh) | 2022-11-11 | 2022-11-11 | 一种用于治疗杜氏肌营养不良症的CRISPR-Cas9系统 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115820642A true CN115820642A (zh) | 2023-03-21 |
CN115820642B CN115820642B (zh) | 2023-10-10 |
Family
ID=85527702
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211410690.9A Active CN115820642B (zh) | 2022-11-11 | 2022-11-11 | 一种用于治疗杜氏肌营养不良症的CRISPR-Cas9系统 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115820642B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115806989A (zh) * | 2022-11-25 | 2023-03-17 | 昆明理工大学 | 针对DMD基因5号外显子突变的sgRNA及载体和应用 |
Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080200409A1 (en) * | 2004-06-28 | 2008-08-21 | Stephen Donald Wilson | Antisense Oligonucleotides For Inducing Exon Skipping and Methods of Use Thereof |
CN102459597A (zh) * | 2009-05-08 | 2012-05-16 | 欧科库尔纳有限责任公司 | 通过针对dmd家族的天然反义转录物的抑制治疗肌营养蛋白家族相关疾病 |
US20140315862A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-10-23 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Compositions for treating muscular dystrophy |
CN106714845A (zh) * | 2014-08-11 | 2017-05-24 | 得克萨斯州大学系统董事会 | 通过crispr/cas9介导的基因编辑预防肌营养不良 |
CN108513546A (zh) * | 2015-10-28 | 2018-09-07 | 克里斯珀医疗股份公司 | 用于治疗杜氏肌营养不良症的材料和方法 |
US20180369400A1 (en) * | 2017-01-06 | 2018-12-27 | Avidity Biosciences Llc | Nucleic acid-polypeptide compositions and methods of inducing exon skipping |
US20190338311A1 (en) * | 2017-01-05 | 2019-11-07 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Optimized strategy for exon skipping modifications using crispr/cas9 with triple guide sequences |
CN110760511A (zh) * | 2018-07-27 | 2020-02-07 | 广东赤萌医疗科技有限公司 | 一种用于治疗杜氏肌营养不良症的gRNA、表达载体、CRISPR-Cas9系统 |
US20200354419A1 (en) * | 2017-11-03 | 2020-11-12 | Hunterian Medicine Llc | Compositions and methods of use thereof for the treatment of duchenne muscular dystrophy |
TW202100748A (zh) * | 2019-04-14 | 2021-01-01 | 美國公爵大學 | 恢復肌縮蛋白功能之基於crispr/cas之基因組編輯組合物 |
WO2022187571A1 (en) * | 2021-03-04 | 2022-09-09 | Research Institute At Nationwide Children's Hospital | Products and methods for treatment of dystrophin-based myopathies using crispr-cas9 to correct dmd exon duplications |
-
2022
- 2022-11-11 CN CN202211410690.9A patent/CN115820642B/zh active Active
Patent Citations (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080200409A1 (en) * | 2004-06-28 | 2008-08-21 | Stephen Donald Wilson | Antisense Oligonucleotides For Inducing Exon Skipping and Methods of Use Thereof |
CN102459597A (zh) * | 2009-05-08 | 2012-05-16 | 欧科库尔纳有限责任公司 | 通过针对dmd家族的天然反义转录物的抑制治疗肌营养蛋白家族相关疾病 |
US20140315862A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-10-23 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Compositions for treating muscular dystrophy |
CN106714845A (zh) * | 2014-08-11 | 2017-05-24 | 得克萨斯州大学系统董事会 | 通过crispr/cas9介导的基因编辑预防肌营养不良 |
CN108513546A (zh) * | 2015-10-28 | 2018-09-07 | 克里斯珀医疗股份公司 | 用于治疗杜氏肌营养不良症的材料和方法 |
US20190374655A1 (en) * | 2015-10-28 | 2019-12-12 | Crispr Therapeutics Ag | Materials and methods for treatment of duchenne muscular dystrophy |
US20190338311A1 (en) * | 2017-01-05 | 2019-11-07 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Optimized strategy for exon skipping modifications using crispr/cas9 with triple guide sequences |
CN110381980A (zh) * | 2017-01-06 | 2019-10-25 | 艾维迪提生物科学有限责任公司 | 核酸-多肽组合物以及诱导外显子跳读的方法 |
US20180369400A1 (en) * | 2017-01-06 | 2018-12-27 | Avidity Biosciences Llc | Nucleic acid-polypeptide compositions and methods of inducing exon skipping |
US20200354419A1 (en) * | 2017-11-03 | 2020-11-12 | Hunterian Medicine Llc | Compositions and methods of use thereof for the treatment of duchenne muscular dystrophy |
CN110760511A (zh) * | 2018-07-27 | 2020-02-07 | 广东赤萌医疗科技有限公司 | 一种用于治疗杜氏肌营养不良症的gRNA、表达载体、CRISPR-Cas9系统 |
TW202100748A (zh) * | 2019-04-14 | 2021-01-01 | 美國公爵大學 | 恢復肌縮蛋白功能之基於crispr/cas之基因組編輯組合物 |
WO2022187571A1 (en) * | 2021-03-04 | 2022-09-09 | Research Institute At Nationwide Children's Hospital | Products and methods for treatment of dystrophin-based myopathies using crispr-cas9 to correct dmd exon duplications |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
CEDRIC HAPPI MBAKAM等: "Therapeutic Strategies for Dystrophin Replacement in Duchenne Muscular Dystrophy", FRONTIERS IN MEDICINE, vol. 9, pages 1 - 19 * |
HONG-HAO YU等: "Porcine Zygote Injection with Cas9/sgRNA Results in DMD-Modified Pig with Muscle Dystrophy", INTERNATIONAL JOURNAL O F MOLECULAR SCIENCES, vol. 17, pages 1 - 12 * |
KENJI ROWEL Q. LIM等: "Applications of CRISPR/Cas9 for the Treatment of Duchenne Muscular Dystrophy", J. PERS. MED., vol. 8, no. 38, pages 1 - 20 * |
KENJI ROWEL Q. LIM等: "CRISPR-Generated Animal Models of Duchenne Muscular Dystrophy", GENES, vol. 11, no. 342, pages 1 - 14 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115806989A (zh) * | 2022-11-25 | 2023-03-17 | 昆明理工大学 | 针对DMD基因5号外显子突变的sgRNA及载体和应用 |
CN115806989B (zh) * | 2022-11-25 | 2023-08-08 | 昆明理工大学 | 针对DMD基因5号外显子突变的sgRNA及载体和应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN115820642B (zh) | 2023-10-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20230108687A1 (en) | Gene editing methods for treating spinal muscular atrophy | |
US11661596B2 (en) | Targeted RNA editing by leveraging endogenous ADAR using engineered RNAs | |
US11752202B2 (en) | Compositions and methods for treating hemoglobinopathies | |
AU2023263518A1 (en) | Compositions and methods for treating CEP290 associated disease | |
EP1160318B1 (en) | Splicing enhancer sequences in Dystrophin gene | |
US20240018551A1 (en) | Methods and compositions for modulating a genome | |
EP3510151A1 (en) | High-throughput precision genome editing | |
JP2022526455A (ja) | Rnaを編集する方法および組成物 | |
WO2017040709A1 (en) | Directed nucleic acid repair | |
KR20160089530A (ko) | Hbv 및 바이러스 질병 및 질환을 위한 crisprcas 시스템 및 조성물의 전달,용도 및 치료적 적용 | |
WO2018106693A1 (en) | SYSTEMS AND METHODS FOR ONE-SHOT GUIDE RNA (ogRNA) TARGETING OF ENDOGENOUS AND SOURCE DNA | |
US20220195406A1 (en) | Crispr/cas-based genome editing composition for restoring dystrophin function | |
US9074207B2 (en) | Modified human U1snRNA molecule, a gene encoding for the modified human U1snRNA molecule, an expression vector including the gene, and the use thereof in gene therapy | |
US20220387622A1 (en) | Methods of editing a single nucleotide polymorphism using programmable base editor systems | |
CA3116739A1 (en) | Compositions and methods for treating alpha-1 antitrypsin deficiencey | |
WO2014009567A1 (en) | Compositions and methods for duchenne muscular dystrophy gene therapy | |
US20210309986A1 (en) | Methods for exon skipping and gene knockout using base editors | |
US20230201375A1 (en) | Targeted genomic integration to restore neurofibromin coding sequence in neurofibromatosis type 1 (nf1) | |
CN115820642A (zh) | 一种用于治疗杜氏肌营养不良症的CRISPR-Cas9系统 | |
WO2022150974A1 (en) | Targeted rna editing by leveraging endogenous adar using engineered rnas | |
CN111718964A (zh) | 用于修复dmd基因突变的核酸序列及系统 | |
EP4289954A1 (en) | Sgrna targeting aqp1 mrna, and vector and use thereof | |
CN115806984A (zh) | 环状rna及载体和载体的应用 | |
CN109486813B (zh) | 一种用于修复TPP1基因Pre-mRNA异常剪接的U1-snRNA及其应用 | |
EP3690046A2 (en) | Composition for treatment of hemophilia, comprising crispr/cas system having coagulation factor viii gene inversion correction potential |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |