JP2022526455A - Rnaを編集する方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2019年4月15日に提出された国際出願番号PCT/CN2019/082713である国際出願、及び2019年12月30日に提出された国際出願番号CN2019/129952である国際出願の優先権を享有することを主張する。それらの内容は、その全体が参照により本出願に取り込まれる。
ASCIIテキストファイルで提出された内容は、その全体が参照により本出願に取り込まれる:配列表のコンピュータ可読形態(CRF)(ファイル名:FD0020PCT-sequence listing.TXT、記録日付:2020年4月13日、サイズ:133KB)。
本発明を、特定の実施形態を用いて特定の図面を参照して説明するが、本発明は、それに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。請求項内の参照記号は、範囲を制限するものと解釈されるべきではない。「含む」という用語が本明細書および請求の範囲で使用される場合、それは他の要素またはステップを除外しない。単数名詞に言及する時に、例えば、「一つ」または「一種」、「当該」など、不定冠詞または定冠詞が使用される場合、特に明記されていない限り、その名詞の複数形も含まれる。本明細書におけるヌクレオチドの数値範囲に対する説明については、その間に介在する各数値が明確に考慮されている。例えば、40~260ヌクレオチドの範囲については、40ヌクレオチドおよび260ヌクレオチドの数の他に、40~260ヌクレオチドの間の任意の整数のヌクレオチドも考慮される。
本発明において、本明細書で使用されるdRNAは、標的RNAに結合する時に標的RNAで編集される標的アデノシンの真向かいのシチジン(C)、アデノシン(A)、またはウリジン(U)を含むRNA配列を含む。標的アデノシンの真向かいのシチジン(C)、アデノシン(A)、及びウリジン(U)はまとめて「標的ヌクレオチド」と呼ばれ、またはそれぞれ「標的C」、「標的A」、及び「標的U」と呼ばれる。標的ヌクレオチドおよび標的ヌクレオチドに直接隣接する2つのヌクレオチドは、本明細書では「標的トリプレット」と呼ばれるトリプレットを形成する。
一態様では、本出願は、本明細書に記載の方法のいずれか1つに使用できるデアミナーゼ動員RNAを提供する。このセクションで説明されているdRNAのいずれか1つを、ここで説明されているRNA編集および治療法で使用することができる。dRNAについて本明細書に記載されている特徴およびパラメータのいずれかを、あたかもすべての組み合わせが個別に記載されているかのように、互いに組み合わせることができることが意図されている。本明細書に記載のdRNAは、CRISPR/Casシステムで使用されるtracrRNA、crRNA、またはgRNAを含まない。
本明細書に記載のRNA編集方法および組成物は、遺伝性遺伝子疾患および薬剤耐性を含むがこれらに限定されない、個体の疾患または病症を治療または予防するために使用することができる。
本明細書はさらに、dRNA、構築体、ライブラリー、または本明細書に記載のように編集されたRNAを有するまたは宿主細胞のいずれか1つを含む組成物(医薬組成物など)を提供する。
本明細書に提供された実施形態は下記通りである。
1.デアミナーゼ動員RNA(dRNA)またはdRNAをコードする構築体を宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞において標的RNAを編集するための方法であって、前記dRNAは、前記標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、前記デアミナーゼ動員RNAは、前記標的RNA中の標的アデノシンを脱アミノ化するようにRNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)を動員することができる、方法。
2.前記RNA配列が、前記標的RNA中の前記標的アデノシンの真向かいにあるシチジン、アデノシン、またはウリジンを含む、実施形態1に記載の方法。
3.前記RNA配列が、前記標的RNA中の前記標的アデノシンの真向かいにあるシチジンミスマッチを含む、実施形態2に記載の方法。
4.前記シチジンミスマッチが、前記dRNAにおいて前記相補配列の3’末端から少なくとも20ヌクレオチド離れ、かつ前記相補配列の5’端から少なくとも5ヌクレオチド離れて位置する、実施形態3に記載の方法。
5.前記シチジンミスマッチが、前記dRNAにおいて前記相補配列の中心(例えば、中心にある)から10ヌクレオチド以内に位置する、実施形態4に記載の方法。
6.前記RNA配列が、前記標的RNA中の非標的アデノシンのそれぞれに対向する1つ以上のグアノシンをさらに含む、実施形態1~5のいずれか一項に記載の方法。
7.前記相補配列が、前記標的RNA中の非標的アデノシンに対向する2つ以上の連続するミスマッチヌクレオチドを含む、実施形態1~6のいずれか一項に記載の方法。
8.前記標的RNA中の前記標的アデノシンの5’に最も近い隣接物が、U、C、A、及びGから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がU>C≒A>Gであり、前記標的RNAにおける前記標的アデノシンの3’に最も近い隣接物が、G、C、A、及びUから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がG>C>A≒Uである、実施形態1~7のいずれか一項に記載の方法。
9.前記標的RNAにおける前記標的アデノシンが、UAG、UAC、UAA、UAU、CAG、CAC、CAA、CAU、AAG、AAC、AAA、AAU、GAG、GAC、GAA、及びGAUからなる群より選ばれる3塩基モチーフに位置する、実施形態1~8のいずれか一項に記載の方法。
10.前記3塩基モチーフがUAGであり、前記デアミナーゼ動員RNAが、前記3塩基モチーフのウリジンの真向かいのA、前記標的アデノシンの真向かいのシチジン、及び前記3塩基モチーフのグアノシンの真向かいのシチジン、グアノシン、またはウリジンを含む、実施形態9に記載の方法。
12.前記デアミナーゼ動員RNAが約60~230ヌクレオチド長である、実施形態11に記載の方法。
13.前記dRNAが約60ヌクレオチドを超える長さを有する、実施形態11または12に記載の方法。
14.前記dRNAが約100から約150(例えば、約110~150)ヌクレオチド長である、実施形態11~13のいずれか一項に記載の方法。
15.前記標的RNAが、プレメッセンジャーRNA、メッセンジャーRNA、リボソームRNA、トランスファーRNA、長い非コードRNA、及び小さいRNAからなる群より選ばれるRNAである、実施形態1~14のいずれか一項に記載の方法。
16.前記標的RNAがプレメッセンジャーRNAである、実施形態15に記載の方法。
17.前記ADARが前記宿主細胞によって内因的に発現される、実施形態1~16のいずれか一項に記載の方法。
18.前記ADARが前記宿主細胞対して外因的である、実施形態1~16のいずれか一項に記載の方法。
19.前記ADARを前記宿主細胞に導入することをさらに含む、実施形態18に記載の方法。
20.前記ADARがE1008突然変異を含む、実施形態18または19に記載の方法。
22.前記相補的RNA配列が一本鎖であり、前記デアミナーゼ動員RNAが1つ以上の二本鎖領域をさらに含む、実施形態1~20のいずれか一項に記載の方法。
23.前記dRNAがADAR-動員ドメイン(例えば、DSB結合ドメイン、GluR2ドメインまたはMS2ドメイン)を含まない、実施形態1~22のいずれか一項に記載の方法。
24.dRNAが、化学的修飾のヌクレオチド(例えば、2’-O-メチル化またはホスホロチオ化)を含まない、実施形態1~23のいずれか一項に記載の方法。
25.前記標的RNA中の標的アデノシンの脱アミノ化作用が、前記標的RNAによってコードされるタンパク質の点突然変異、切断、伸長および/またはミスフォールディングを引き起こすか、または、前記標的RNA中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングまたは可変的スプライシングの回復によって、機能的で、完全長の、正しくフォールディングされた、及び/または野生型タンパク質を引き起こす、実施形態24に記載の方法。
26.前記宿主細胞が真核細胞である、実施形態1~25のいずれか一項に記載の方法。
27.前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、実施形態26に記載の方法。
28.前記宿主細胞がヒトまたはマウス細胞である、実施形態27に記載の方法。
29.前記ADARがADAR1および/またはADAR2である、実施形態27または28に記載の方法。
30.前記宿主細胞が初代細胞である、実施形態1~29のいずれか一項に記載の方法。
32.前記宿主細胞が有糸分裂後の細胞である、実施形態30に記載の方法。
33.ADAR3の阻害剤を前記宿主細胞に導入することをさらに含む、実施形態1~32のいずれか一項に記載の方法。
34.インターフェロンの刺激物を前記宿主細胞に導入することをさらに含む、実施形態1~33のいずれか一項に記載の方法。
35.それぞれ異なる標的RNAを標的とする複数のdRNAを導入することを含む、実施形態1~34のいずれか一項に記載の方法。
36.前記標的RNAを編集する効率が少なくとも約30%(例えば、少なくとも約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%またはそれ以上)である、実施形態1~35のいずれか一項に記載の方法。
37.前記dRNAが免疫応答を誘導しない、実施形態1~36のいずれか一項に記載の方法。
38.実施形態1~37のいずれか一項に記載の方法によって生成された編集されたRNAまたは編集されたRNAを有する宿主細胞。
39.実施形態1~37のいずれか一項に記載の方法に従って、個体の細胞内の疾患または病症に関連する標的RNAを編集することを含む、個体の疾患または病症を治療または予防するための方法。
40.前記疾患または病症が、遺伝性遺伝子疾患または1つ以上の後天性遺伝子突然変異に関連する疾患または病症である、実施形態39に記載の方法。
42.前記疾患または病症が単一遺伝子の疾患または病症である、実施形態39~41のいずれか一項に記載の方法。
43.前記疾患または病症が多遺伝子の疾患または病症である、実施形態39~42のいずれか一項に記載の方法。
44.(i)前記標的RNAがTP53であり、前記疾患または病症がガンである;
(ii)前記標的RNAがIDUAであり、前記疾患または病症がI型ムコ多糖症(MPS I)である;
(iii)前記標的RNAがCOL3A1であり、前記疾患または病症がエーラース・ダンロス症候群である;
(iv)前記標的RNAがBMPR2であり、前記疾患または病症がジュベール症候群である;
(v)前記標的RNAがFANCCであり、前記疾患または病症がファンコニ貧血である;
(vi)前記標的RNAがMYBPC3であり、前記疾患または病症が原発性家族性肥大型心筋症である;または
(vii)前記標的RNAがIL2RGであり、前記疾患または病症がX連鎖重症複合免疫不全である、
実施形態39~43のいずれか一項に記載の方法。
45.標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含む、RNAに作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)を動員することによって前記標的RNA中の標的アデノシンを脱アミノ化するためのデアミナーゼ動員RNA(dRNA)。
46.前記RNA配列が、前記標的RNA中の前記標的アデノシンの真向かいにあるシチジン、アデノシン、またはUを含む、実施形態47に記載のデアミナーゼ動員RNA。
47.前記RNA配列が、前記標的RNA中の前記標的アデノシンの真向かいにあるシチジンミスマッチを含む、実施形態48に記載のdRNA。
48.前記シチジンミスマッチが、前記dRNAにおいて前記相補配列の3’末端から少なくとも20ヌクレオチド離れ、かつ前記相補配列の5’端から少なくとも5ヌクレオチド離れて位置する、実施形態49に記載のdRNA。
49.前記シチジンミスマッチが、前記dRNAにおいて前記相補配列の中心(例えば、中心にある)から10ヌクレオチド以内に位置する、実施形態50に記載のdRNA。
50.前記RNA配列が、前記標的RNA中の非標的アデノシンのそれぞれに対向する1つ以上のグアノシンをさらに含む、実施形態47~51のいずれか一項に記載のデアミナーゼ動員RNA。
52.前記標的RNAにおける前記標的アデノシンが、UAG、UAC、UAA、UAU、CAG、CAC、CAA、CAU、AAG、AAC、AAA、AAU、GAG、GAC、GAA、及びGAUからなる群より選ばれる3塩基モチーフに位置する、実施形態47~53のいずれか一項に記載のデアミナーゼ動員RNA。
53.前記3塩基モチーフがUAGであり、前記dRNAが、前記3塩基モチーフのウリジンの真向かいのアデノシン、前記標的アデノシンの真向かいのシチジン、及び前記3塩基モチーフのグアノシンの真向かいのシチジン、グアノシン、またはウリジンを含む、実施形態54に記載のデアミナーゼ動員RNA。
54.前記3塩基モチーフが、前記標的RNA中のUAGであり、前記デアミナーゼ動員RNAが、前記標的RNAのUAGに対向するACC、ACG、またはACUを含む、実施形態55に記載のデアミナーゼ動員RNA。
55.前記デアミナーゼ動員RNAが約40~260ヌクレオチド長である、実施形態47~56のいずれか一項に記載のデアミナーゼ動員RNA。
56.前記dRNAが約70ヌクレオチドの長さを有する、実施形態57に記載のdRNA。
57.前記dRNAが約100から約150(例えば、約110~150)ヌクレオチド長である、実施形態57または58に記載のdRNA。
58.前記dRNAがADAR動員ドメイン(例えば、DSB結合ドメイン、GluR2ドメインまたはMS2ドメイン)を含まない、実施形態47~59のいずれか一項に記載のdRNA。
59.前記dRNAが、化学的修飾のヌクレオチド(例えば、2’-O-メチル化またはホスホロチオ化)を含まない、実施形態47~60のいずれか一項に記載のdRNA。
60.実施形態47~61のいずれか一項に記載のデアミナーゼ動員RNAをコードする構築体。
62.実施形態47~61のいずれか一項に記載の複数のデアミナーゼ動員RNAまたは実施形態62または63に記載の構築体を含むライブラリー。
63.実施形態47~61のいずれか一項に記載のデアミナーゼ動員RNA、実施形態62または63に記載の構築体、または実施形態64に記載のライブラリーを含む、組成物。
64.実施形態47~61のいずれか一項に記載のデアミナーゼ動員RNAまたは実施形態62または63に記載の構築体を含む、宿主細胞。
65.前記宿主細胞が真核細胞である、実施形態66に記載の宿主細胞。
66.前記宿主細胞が初代細胞である、実施形態66または67に記載の宿主細胞。
67.デアミナーゼ動員RNAを含む、宿主細胞における標的RNAを編集するためのキットであって、前記デアミナーゼ動員RNAは、前記標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、前記デアミナーゼ動員RNAは、前記標的RNA中の標的アデノシンを脱アミノ化するようにADARを動員することができる、キット。
68.60~200ヌクレオチドのデアミナーゼ動員RNA(dRNA)であって、
a)前記dRNAが、標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、
b)前記dRNAが、前記標的RNA中の標的アデノシンを脱アミノ化するようにデアミナーゼまたはデアミナーゼを含む構築体またはデアミナーゼの触媒ドメインを含む構築体を動員することができ、
c)前記dRNAが1つ以上の化学修飾を含む、
前記dRNA。
69.前記dRNAが、60nt、65nt、70nt、80nt、90nt、100nt、または110ntのいずれよりも長い、実施形態68に記載のdRNA。
70.相補的な標的RNA領域との1つ以上のミスマッチ、ウォブルおよび/またはバルジを含む、実施形態1または69に記載のdRNA。
72.前記標的アデノシンの真向かいにある前記シチジン、アデノシン、またはウリジンが、3’末端から少なくとも約7ヌクレオチド、例えば、3’末端から少なくとも約8、9、10もしくはそれ以上のヌクレオチド離れて位置する、または3’末端から約7~25nt離れて位置する、実施形態71に記載のdRNA。
73.前記標的アデノシンの真向かいにある前記シチジン、アデノシン、またはウリジンが、5’末端から少なくとも約25ヌクレオチド、例えば、5’末端から少なくとも約30、35、40、45、50もしくは55ヌクレオチド離れて位置する、または5’末端から約45~55nt離れて位置する、実施形態71または72に記載のdRNA。
74.前記標的アデノシンの真向かいにある前記シチジン、アデノシン、またはウリジンに隣接する5’および3’配列の長さが等しくない、実施形態71~73のいずれか一項に記載のdRNA。
75.前記標的アデノシンの真向かいにある前記シチジン、アデノシン、またはウリジンに隣接する5’配列の長さが3’配列の長さより長い、実施形態71~74のいずれか一項に記載のdRNA。
76.前記標的RNA中の前記標的アデノシンの真向かいにあるシチジンを含む、実施形態68~75のいずれか一項に記載のdRNA。
77.前記相補的なRNA配列が、前記標的RNA中の非標的アデノシンのそれぞれに対向する1つ以上のグアノシンをさらに含む、実施形態68~76のいずれか一項に記載のdRNA。
78.前記相補配列が、前記標的RNA中の非標的アデノシンに対向する2つ以上の連続するミスマッチヌクレオチドを含む、実施形態68~77のいずれか一項に記載のdRNA。
79.前記標的RNA中の前記標的アデノシンの5’に最も近い隣接物が、U、C、A、及びGから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がU>C≒A>Gであり、前記標的RNAにおける前記標的アデノシンの3’に最も近い隣接物が、G、C、A、及びUから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がG>C>A≒Uである、実施形態68~78のいずれか一項に記載のdRNA。
80.前記標的アデノシンが、UAG、UAC、UAA、UAU、CAG、CAC、CAA、CAU、AAG、AAC、AAA、AAU、GAG、GAC、GAA、及びGAUからなる群より選ばれる、前記標的RNAにおける3塩基モチーフに位置する、実施形態68~79のいずれか一項に記載のdRNA。
82.UAGの3塩基モチーフの真向かいにある5’-CCA-3’を含む、実施形態81に記載dRNA。
83.前記化学修飾が、メチル化および/またはホスホロチオ化、例えば、2’-O-メチル化および/またはヌクレオチド間ホスホロチオエート結合である、実施形態68~82のいずれか一項に記載のdRNA。
84.前記化学修飾が、最初と最後の各1~5、2~5、3~5、4~5ヌクレオチドの2’-O-メチル化および/または最初と最後の各1~5、2~5、3~5、4~5ヌクレオチド間結合のホスホロチオ化を含む、実施形態83に記載のdRNA。
85.前記化学修飾が、前記標的アデノシンに対向するヌクレオチドおよび/またはその5’及び/または3’に最も隣接するヌクレオチドにおける2’-O-メチル化および/または3’-ホスホロチオ化を含む、実施形態83または実施形態84に記載のdRNA。
86.前記化学修飾が、
1)最初と最後の各3ヌクレオチドの2’-O-メチル化および/または最初と最後の各3ヌクレオチド間結合のホスホロチオ化;
2)最初と最後の各3ヌクレオチドの2’-O-メチル化および/または最初と最後の各3ヌクレオチド間結合のホスホロチオ化、及び単一または複数のウリジン(例えば、すべてのウリジン)の2’-O-メチル化;
3)最初と最後の各3ヌクレオチドの2’-O-メチル化、最初と最後の各3ヌクレオチド間結合のホスホロチオ化、単一または複数またはすべてのウリジンの2’-O-メチル化、及び前記標的アデノシンに対向する前記ヌクレオチドおよび/またはその5’及び/または3’に最も隣接するヌクレオチドの修飾;
4)最初と最後の各3ヌクレオチドの2’-O-メチル化、最初と最後の各3ヌクレオチド間結合のホスホロチオ化、すべてのウリジンの2’-O-メチル化、及び前記標的アデノシンに対向する前記ヌクレオチドの3’及び/または5’に最も隣接するヌクレオチドの2’-O-メチル化;
5)最初と最後の各3ヌクレオチドの2’-O-メチル化、最初と最後の各3ヌクレオチド間結合のホスホロチオ化、すべてのウリジンの2’-O-メチル化、及び前記標的アデノシンに対向する前記ヌクレオチドおよび/またはその5’及び/または3’に最も隣接するヌクレオチドのホスホロチオ化;
6)最初と最後の各5ヌクレオチドの2’-O-メチル化および/または最初と最後の各5ヌクレオチド間結合のホスホロチオ化
から選択される、実施形態1~85のいずれか一項に記載のdRNA。
87.前記標的アデノシンに対向する前記ヌクレオチド及び/または前記標的アデノシンに対向するヌクレオチドに最も隣接する1つまたは2つのヌクレオチド修飾が2’-O-メチル化またはホスホロチオエート結合であり、例えば、3’-ホスホロチオエート結合である、実施形態86に記載のdRNA。
88.ADAR酵素に結合するための分子内ステムループ構造を形成することができるADAR動員ドメインを含まない、実施形態68~87のいずれか一項に記載のdRNA。
89.実施形態68~88のいずれか一項に記載のdRNAを含むまたはコードする構築体。
90.真核細胞、初代細胞、T細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、ネズミ細胞などを含むがこれらに限定されない宿主細胞に、実施形態68~89のいずれか一項に記載のdRNAを感染、エレクトロトランスフェクション、リポフェクション、エンドサイトーシス、リポソームまたは脂質ナノ粒子送達などによって導入することを含む、宿主細胞において標的RNAを編集する方法。
92.インターフェロンの刺激物を前記宿主細胞に導入することをさらに含む、実施形態90または91に記載の方法。
93.それぞれ異なる標的RNAを標的とする複数のdRNAを導入することを含む、実施形態90~92のいずれか一項に記載の方法。
94.前記dRNAが免疫応答を誘導しない、実施形態90~93のいずれか一項に記載の方法。
95.外因性ADARを前記宿主細胞に導入することをさらに含む、実施形態90~94のいずれか一項に記載の方法。
96.前記ADARが、E1008突然変異を含むADAR1である、実施形態95に記載の方法。
97.実施形態68~89のいずれか一項に記載のdRNAを含む組成物、細胞、ライブラリー、またはキット。
プラスミドの構築
二重蛍光レポーターは、mCherryおよびEGFP(EGFPの第1のコドンATGが削除された)をコードするDNAをPCR増幅することによってクローン化され、3×GSリンカーおよびターゲティングDNA配列がPCR中にプライマーを介して追加された。次に、PCR産物をタイプIIの制限酵素BsmB1(Thermo)とT4 DNAリガーゼ(NEB)で切断して連結し、pLentiバックボーン(pLenti-CMV-MCS-SV-Bsd、Stanley Cohen Lab, Stanford University)に挿入した。
哺乳類細胞株は、ダルベッコ改良イーグル培地(Dulbecco’s Modified Eagle Medium,10-013-CV,Corning,Tewksbury,MA,USA))で培養され、10%ウシ胎児血清(蘭州百霊生物技術有限公司、蘭州、中国)を添加し、37℃、5%CO2で1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した。Adar1-KO細胞株はEdiGene Chinaから購入し、ジェノタイピングの結果もEdiGene Chinaから提供された。
二重蛍光レポーター編集実験では、293T-WT細胞または293T-Adar1-KO細胞を6ウェルプレートに播種し(6×105細胞/ウェル)、24時間後、1.5μgのレポータープラスミドと1.5μgのdRNAプラスミドを播種した。X-tremeGENE HP DNAトランスフェクション試薬(06366546001;Roche、Mannheim、ドイツ)を、サプライヤーのプロトコルに従って使用して同時トランスフェクトした。48~72時間後、細胞を収集し、FACS解析を実行した。レポーターmRNA編集をさらに確認するために、FACS Ariaフローサイトメーター(BD Biosciences)を使用して、レポーターおよびdRNAプラスミドをトランスフェクトした293T-WT細胞からのEGFP陽性細胞を選別し、続いてトータルRNAを単離した(TIANGEN、DP430)。次に、RNAをRT-PCR(TIANGEN、KR103-04)を介してcDNAに逆転写し、標的遺伝子座を対応するプライマーペア(23PCRサイクル)でPCR増幅し、PCR産物をサンガーシーケンシング用に精製した。
初代ヒトT細胞は、健康なヒトドナーからの白血球アフェレーシス産物から単離された。簡単に説明すると、末梢血単核細胞(PBMC)をFicoll遠心分離(Dakewei、AS1114546)で分離し、EasySep人T細胞分離キット(STEMCELL、17951)を使用してT細胞をPBMCから磁気ネガティブセレクションで分離した。分離後、T細胞をX-vivo15培地、10%FBSおよびIL2(1000 U/ml)で培養し、CD3/CD28 DynaBeads(ThermoFisher、11131D)で2日間刺激した。健康なドナーからの白血球アフェレーシス製品は、AllCells LLC Chinaから購入した。すべての健康なドナーはインフォームドコンセントを提供した。
発現プラスミドは、X-tremeGENE HP DNAトランスフェクション試薬を介して、2つのウイルスパッケージングプラスミドpR8.74およびpVSVG(Addgene)とともにHEK293T-WT細胞に同時トランスフェクトされた。72時間後、上清ウイルスを回収し、-80℃で保存した。HEK293T-WT細胞をレンチウイルスに感染させ、72時間後、mCherry陽性細胞をFACSで選別して培養し、限界希釈法により、EGFPバックグラウンドが非常に低い二重蛍光レポーターシステムを安定して発現する単一クローン細胞株を選択した。
二重蛍光レポーターでのRNA編集を評価するために、HEK293T細胞またはHEK293T ADAR1-/-細胞を6ウェルプレート(6×105細胞/ウェル)に播種した。24時間後、細胞に1.5μgのレポータープラスミドと1.5μgのarRNAプラスミドを同時トランスフェクトした。ADAR1p110、ADAR1p150、またはADAR2タンパク質発現の影響を調べるために、編集効率をEGFP陽性率とディープシーケンシングによってアッセイした。
内因性mRNA編集実験では、293T-WT細胞を6ウェルプレートに播種した(6×105細胞/ウェル)。約70%コンフルエントになったら、X-tremeGENE HP DNAトランスフェクション試薬(Roche)を使用してHEK293細胞に3μgのdRNAをトランスフェクトした。72時間後、FACSを介してGFP陽性またはBFP陽性細胞を(対応する蛍光マーカーに従って)選別し、続いてRNAを単離した。次に、単離されたRNAをRT-PCRを介してcDNAに逆転写し、対応するプライマーペアで特異的標的遺伝子座を増幅し(23PCRサイクル)、Illumina NextSeqでシーケンシングした。
HEK293T(陽性対照)およびHEK293T ADAR1-/-(陰性対照)細胞に加えて、1つのマウス細胞株(NIH3T3)およびさまざまな組織や器官に由来する7つのヒト細胞株(RD、HeLa、SF268、A549、HepG2、HT-29、SW13)を選択して実験を行った。トランスフェクション効率の高い細胞株では、約8~9×104細胞(RD、HeLa、SF268)または1.5×105(HEK293T)を12ウェルプレートの各ウェルに播種し、トランスフェクションが困難なもの(A549、HepG2、HT-29、SW13、NIH3T3)について、2~2.5x105細胞を6ウェルプレートに播種した。そして、これらの細胞はすべて、37℃でダルベッコ改良イーグル培地(DMEM、Corning)で維持され、この培地には、10%ウシ胎児血清(FBS、CellMax)及び5%CO2が補充された。24時間後、CG2レポーターと71nt dRNA(35-C-35)プラスミドをX-tremeGENE HP DNAトランスフェクション試薬(Roche)で異なるタイプの細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、細胞をトリプシンで処理し、FACS(BD)で解析した。トランスフェクション効率の低い細胞ではmCherryおよびBFP陽性細胞が非常に少なかったため、6ウェルプレートに播種した細胞について、FACS解析ための総細胞数を1×105に増やした。
ディープシーケンシング解析では、arRNAカバー配列の標的部位配列(上流および下流20-nt)を使用してインデックスが生成された。リードは、BWAバージョン0.7.10-r789を使用してアライメントおよび定量化された。次に、BAMをSamtoolsアライメントで選別し、REDitools 1.0.4バージョンを使用してRNA編集部位を解析した。パラメータは、-U[AGまたはTC]-t8-n0.0-T6-6-e-d-uであった。フィッシャーの正確検定(Fisher’s exact test)(p値<0.05)によって計算されたarRNA標的領域内のすべての有意なA>G変換(p値<0.05)は、arRNAによる編集と見なされた。標的アデノシンを除く変換は、オフターゲット編集であった。対照群と実験群に同時に現れた突然変異はSNPと見なされた。
BFP発現カセットを有する対照RNA151またはarRNA151-PPIB発現プラスミドをHEK293T細胞にトランスフェクトした。BFP+細胞はトランスフェクションの48時間後にFACSによって濃縮され、RNAはRNAprep Pure Microキット(TIANGEN、DP420)で精製された。次に、NEBNext ポリ(A)mRNA磁性分離モジュール(New England Biolabs、E7490)を使用してmRNAを精製し、IlluminaのNEBNext Ultra II RNAライブラリープレプキット(New England Biolabs、E7770)で処理した後、Illumina HiSeq X Tenプラットフォーム(2×150-bpペアエンド;各サンプル30G)を使用してディープシーケンス解析を行った。トランスフェクションによる非特異的影響を排除するために、トランスフェクション試薬でのみ細胞を処理した模擬グループを含めた。各グループには4つの複製が含まれていた。
ADAR1(Santa Cruz、sc-271854)、ADAR2(Santa Cruz、sc-390995)、ADAR3(Santa Cruz、sc-73410)、P53(Santa Cruz、sc-99)、KRAS(Sigma、SAB1404011); GAPDH(Santa Cruz、sc-47724)およびβ-チューブリン(CWBiotech、CW0098)に対するマウスモノクローナル一次抗体をそれぞれ使用した。HRPがコンジュゲートされたヤギ抗マウスIgG(H+L、115-035-003)二次抗体は、Jackson ImmunoResearchから購入した。2×106個の細胞を選別して溶解し、等量の各溶解物をSDS-PAGE用にロードした。次に、サンプルタンパク質をPVDFメンブレン(Bio-Rad Laboratories)に転写し、ADAR酵素の1つに対する一次抗体(抗ADAR1、1:500、抗ADAR2、1:100、抗ADAR3、1:800)でイムノブロットした。続いて、二次抗体のインキュベーション(1:10,000)および曝露を行った。ADARタンパク質を剥離緩衝液(CWBiotech、CW0056)で剥離した後、β-チューブリンを同じPVDFメンブレンで再プローブした。実験は3回繰り返された。半定量解析は、Image Labソフトウェアを使用して行われた。
HEK293T細胞を12ウェルプレートに播種した(2×105細胞/ウェル)。約70%がコンフルエンシーになったら、細胞に1.5μgのarRNAをトランスフェクトした。陽性対照として、1μgのポリ(I:C)(Invitrogen、tlrl-picw)をトランスフェクトした。48時間後、細胞を回収し、RNA分離(TIANGEN、DP430)を行った。次に、RT-PCR(TIANGEN、KR103-04)を介して全RNAをcDNAに逆転写し、定量PCR(TAKARA、RR820A)によりIFN-βとIL-6の発現を測定した。プライマーの配列は上の表に記載されている。
TP53W53X cDNA発現プラスミドとarRNA発現プラスミドを、p53の転写調節活性を検出するために、p53-ホタルルシフェラーゼシス報告プラスミド(YRGene、VXS0446)およびレニラルシフェラーゼプラスミド(北京大学Z.Jiang研究室からの贈り物)とともにHEK293T TP53-/-細胞に同時トランスフェクトした。48時間後、細胞を回収し、製造元のプロトコルに従ってPromega Dual-Gloルシフェラーゼアッセイシステム(Promega、E4030)でアッセイした。簡単に説明すると、150μLのデュアルグロルシフェラーゼ試薬を採取した細胞ペレットに添加し、30分後、100μLのデュアルグロルシフェラーゼ試薬(細胞溶解)をInfinite M200リーダー(TECAN)で96ウェルホワイトプレートに添加してホタルの発光を測定した。30分後、100μLのデュアルグロストップとグロ試薬を各ウェルに順次添加して、レニラ発光を測定し、ホタル発光とレニラ発光の比率を計算した。
ヒト初代肺線維芽細胞またはヒト初代気管支上皮細胞におけるarRNA発現プラスミドのエレクトロポレーションでは、20μgのプラスミドをNucleofectorTM 2b装置(Lonza)およびBasic NucleofectorTMキット(Lonza、VPI-1002)でエレクトロポレーションし、エレクトロポレーションプログラムはU-023であった。ヒト初代T細胞におけるarRNA発現プラスミドのエレクトロポレーションでは、20μgのプラスミドをNucleofectorTM 2b Device(Lonza)およびHuman T細胞NucleofectorTM Kit(Lonza、VPA-1002)を使用してヒト初代Tにエレクトロポレーションし、エレクトロポレーションプログラムはT-024であった。エレクトロポレーションの48時間後、細胞をFACSアッセイで選別および収集し、標的RNA編集アッセイのために以下のディープシーケンシングを行った。エレクトロポレーション効率は、蛍光マーカーに従って正規化された。
採取した細胞ペレットを再懸濁し、氷上で1×PBS緩衝液中の28μLの0.5%Triton X-100で30分間溶解した。次に、25μLの細胞溶解液を25μLの190μM 4-メチルウンベリフェリル-α-L-イデュロニダーゼ基質(Cayman、2A-19543-500)に添加し、0.2%Triton X-100を含む0.4Mギ酸ナトリウム緩衝液に溶解し、pH 3.5、暗所で37℃で90分間インキュベートした。触媒反応は、200μLの0.5M NaOH/グリシン緩衝液、pH10.3を添加してクエンチし、4℃で2分間遠心分離した。上澄みを96ウェルプレートに移し、Infinite M200リーダー(TECAN)を使用して365nmの励起波長と450nmの発光波長で蛍光を測定した。
レポーターに基づいた本発明のRNA編集法の試験
Cas13ファミリータンパク質(C2c2)が哺乳類細胞のRNAを編集できることが報告されている。さらに、このシステムをさまざまな条件下でテストした。まず、mCherryとEGFP遺伝子の間に終止コドンを含む3×GSリンカーターゲティング配列を導入することにより、mCherryとEGFPの蛍光に基づく二重蛍光レポーターシステムを構築した。また、EGFP翻訳の漏れを減らすために、EGFPの開始コドンATGを削除した。
二重蛍光レポーター-1は、mCherryの配列(配列番号1)、3×GSリンカーおよび標的Aを含む配列(配列番号2)、およびeGFPの配列(配列番号3)を含む。
(eGFPの配列)(配列番号3)
dRNAを設計するための要因の最適化
次に、dRNAを最適化して、より高い編集効率を実現することに着手した。まず、標的アデニンの反対側のサイトのどの塩基が編集により有利であるかを決定することを目的とした。以前の研究では、標的アデノシンの反対側の塩基が編集に効率的に影響することが示されていた。したがって、標的Aの反対側の中央位置にミスマッチN(A、U、C、及びG)を持つ71nt dRNAを設計した。FACSの結果に基づいて、4つの異なるdRNAが次のように効率的に編集されることがわかった:C>A>U>G(図2A及び2B)。最近、標的UAGサイトの小さなバブルが編集効率に役立つ可能性があることが報告された。したがって、仮説をテストするために、標的UAG部位を持つ2つまたは3つのミスマッチ塩基を含むdRNAを設計した。ゴールデンゲート(Golden Gate)クローニング法を使用して、BFPマーカーを含むdRNAベクター上に16種類の異なる71 ntdRNAを設計および構築した。CCAおよびGCA配列を持つdRNAが最も効率が高いことがわかった。これは、少なくともUAG標的部位の場合、小さなバブルがA-I編集にほとんど寄与しないことを意味する。さらに、NCA配列の4つのdRNAはGFP陽性細胞の割合が高く、相補的なU-A塩基対がADAR編集に重要である可能性があるという結論に至る(図2Cおよび2D)。続いて、レポーターに基づいてさまざまな長さのdRNAの効率をテストした。dRNAは、31ntから221ntの範囲の異なる長さで、中央の位置にミスマッチCが設計された。dRNAが長いほど編集効率が上がることがわかった。レポーターシステムの編集のピークは171nt dRNAにある。51 nt dRNAは、レポーターシステムを良好な効率(18%)で活性化させることができる(図2E及び2F)。最後に、dRNAのミスマッチCの位置が編集効率に影響を与えるかどうかを調べた。dRNAは同じ71ntの長さに保たれ、転写開始とは異なる位置にミスマッチCが設計された。FACSの結果に基づいて、それに対向するミスマッチCの位置が編集効率に影響を与える可能性があり、dRNAの5’または3’にあるミスマッチCの効率が低いことがわかった(図2Gおよび2H)。
可能な3つの塩基モチーフすべてを含む標的配列を含む16の異なるレポーターが、ギブソン(Gibson)クローニングによって構築され、pLentiバックボーン(pLenti-CMV-MCS-SV-Bsd,Stanley Cohen Lab,Stanford University)にクローニングされた。前記標的配列を以下に示す。
TAT:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgctatagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc (配列番号9)
TAA:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgctaaagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc (配列番号10)
TAC:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgctacagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc (配列番号11)
TAG:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgctagagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc (配列番号12)
AAT:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgcaatagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc (配列番号13)
AAA:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgcaaaagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc (配列番号14)
AAC:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgcaacagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc (配列番号15)
AAG:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgcaagagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc (配列番号16)
CAT:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgccatagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc (配列番号17)
CAA:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgccaaagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc (配列番号18)
CAC:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgccacagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc (配列番号19)
CAG:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgccagagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc (配列番号20)
GAT:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgcgatagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc (配列番号21)
GAA:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgcgaaagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc (配列番号22)
GAC:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgcgacagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc (配列番号23)
GAG:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgcgagagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc (配列番号24)
12ウェル細胞培養クラスターでは、2×105細胞HEK293Tを各ウェルにプレーティングし、各実験を3回繰り返して実施した。24時間後、X-tremeGENE HP DNAトランスフェクション試薬(Roche)を使用して、0.5μgのdRNAプラスミドと0.5μgのレポーターターゲットプラスミドを細胞に同時トランスフェクトした。48時間後、細胞をトリプシン処理し、FACS(BD)を介してmCherry陽性細胞を選択した。合計4×105個の細胞を回収し、RNAprep pure Cell/Bacteria Kit(TIANGEN DP430)を使用してトータルRNAを抽出した。Quantscript RT Kit(TIANGEN KR103-04)を使用して、2μgのトータルRNAからcDNAを合成した。そして、111の標的領域がPCRによって増幅され、ディープシーケンシングを行った。
16の異なる3塩基モチーフすべてが、可変効率ではあるが、本出願の例示的なRNA編集方法によって編集できることを見出した。要約すると、結果は、編集されるAの5’最近傍が優先度U>C≒A>Gを持ち、編集されるAの3’最近傍が優先度G>C>A≒Uを持っていることを示している。データは図3Aに棒グラフ、図3Bにヒートマップとして示された。
内因性遺伝子から転写されたRNAの編集
次に、dRNAが内因性遺伝子から転写されたmRNAを媒介できるかどうかをテストした。KRAS、PPIB、β-アクチン、及びGAPDHの4つの遺伝子を標的としたdRNAを設計した。KRAS mRNAについては、以下に示す配列を有する、91、111、131、151、171、および191ヌクレオチド長のdRNA(図4A)を設計した。
uagcuguaucgucaaggcacucuugccuacgccaccagcuccaaccaccacaaguuuauauucagucauuuucagcaggccucucucccgc (配列番号25)
111-nt KRAS-dRNA
gauucugaauuagcuguaucgucaaggcacucuugccuacgccaccagcuccaacuaccacaaguuuauauucagucauuuucagcaggccucucucccgcaccugggagc (配列番号26)
131-nt KRAS-dRNA
uccacaaaaugauucugaauuagcuguaucgucaaggcacucuugccuacgccaccagcuccaacuaccacaaguuuauauucagucauuuucagcaggccucucucccgcaccugggagccgcugagccu (配列番号27)
151-nt KRAS-dRNA
aucauauucguccacaaaaugauucugaauuagcuguaucgucaaggcacucuugccuacgccaccagcuccaaccaccacaaguuuauauucagucauuuucagcaggccucucucccgcaccugggagccgcugagccucuggccccgc (配列番号28)
171-nt KRAS-dRNA
cuauuguuggaucauauucguccacaaaaugauucugaauuagcuguaucgucaaggcacucuugccuacgccaccagcuccaaccaccacaaguuuauauucagucauuuucagcaggccucucucccgcaccugggagccgcugagccucuggccccgccgccgccuuc (配列番号29)
191-nt KRAS-dRNA
uaggaauccucuauuguuggaucauauucguccacaaaaugauucugaauuagcuguaucgucaaggcacucuugccuacgccaccagcuccaaccaccacaaguuuauauucagucauuuucagcaggccucucucccgcaccugggagccgcugagccucuggccccgccgccgccuucagugccugcg (配列番号30)
gaggcgcagcauccacaggcggaggcgaaagcagcccggacagcugaggccggaagaggguggggccgcgguggccagggagccggcgccgccacgcgcgggugggggggacugggguugcucgcgggcuccgggcgggcggcgggcgccg (配列番号31)
151-nt PPIB-dRNA (部位2)
uccuguagcuaaggccacaaaauuauccacuguuuuuggaacagucuuuccgaagagaccaaagaucacccggcccacaucuucaucuccaauucguaggucaaaauacaccuugacggugacuuugggccccuucuucuucucaucggcc (配列番号32)
151-nt PPIB-dRNA (部位3)
gcccuggaucaugaaguccuugauuacacgauggaauuugcuguuuuuguagccaaauccuuucucuccuguagccaaggccacaaaauuauccacuguuuuuggaacagucuuuccgaagagaccaaagaucacccggccuacaucuuca (配列番号33)
gcgcaaguuagguuuugucaagaaaggguguaacgcaaccaagucauaguccgccuagaagcauuugcggug (配列番号34)
131-nt β-アクチン-dRNA (部位1)
gccaugccaaucucaucuuguuuucugcgcaaguuagguuuugucaagaaaggguguaacgcaaccaagucauaguccgccuagaagcauuugcgguggacgauggaggggccggacucgucauacuccug (配列番号35)
70-nt β-アクチン-dRNA (部位2)
ggacuuccuguaacaacgcaucucauauuuggaaugaccauuaaaaaaacaacaaugugcaaucaaaguc (配列番号36)
例示的なLEAPERメソッドのオフターゲット解析
治療用途では、編集の精度が極めて重要である。次に、本出願の例示的なRNA編集システムの特異性をキャラクタリゼーションすることを試みた。解析のために内因性PPIB部位1とKRAS部位を選択した。PPIB部位1の場合、dRNAでカバーされた領域の間に、A22、A30、A33、A34、A39、A49、A80、A91、A107、A140など、標的A76に隣接するいくつかのA塩基があることが見えた。隣接するA塩基がほとんど編集されていないが、標的のA76塩基(A-Cミスマッチ)が最大14%の編集効率を示したことが明らかになった(図5A及び5B)。
KRAS部位に関しては、dRNAでカバーされた領域で、標的A56塩基に隣接する多くのアデニンがあり、最大29の隣接するA塩基があることが見えた。KRAS mRNA編集の結果から、標的A56塩基(A-Cミスマッチ)が最大11.7%の編集効率を示したが、隣接するアデニンを編集できることがわかった(図5Cおよび5D)。複数のオフターゲットアデニンが編集されたが、A41、A43、A45、A46、A74、A79などのアデニンはより多くの編集を示した。編集されていないA塩基の5’最近傍はGまたはCであるのに対し、効率的に編集されたアデニンの5’最近傍はTまたはAであることがわかった。この観察に基づいて、編集されやすいそれらのアデニンのオフターゲット編集を最小限に抑えるようにdRNAの設計に着手した。私たちの研究では、ADARが、A-CとA-A、A-Uミスマッチが好ましく、A-Gミスマッチが最も好ましくないことが分かった。したがって、5’最近傍がUまたはAであるオフターゲットA塩基の場合、A-Gミスマッチがオフターゲット効果を低減または減少させる可能性があることを提案した。以前の研究では、A-GミスマッチがADARによる脱アミノ化の編集をブロックする可能性があることが報告されていた。
次に、図5Dの統計結果及び既存知識に基づいて、異なるA-Gミスマッチの組み合わせを含む3種類の91nt dRNA変異体および4種類の111nt dRNA変異体(以下に示す配列を有する)を設計した:dRNA-AG1(A41,A46,A74); dRNA-AG2(A41,A43,A45,A46,A74,A79); dRNA-AG3(A31,A32,A33,A41,A43,A45,A46,A47,A74,A79); dRNA-AG4(A7,A31,A32,A33,A40,A41,A43,A45,A46,A47,A74,A79,A95)(図4E)。
KRAS-dRNA-91-AG2
KRAS-dRNA-91-AG3
UAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCgACGCCACCAGCUCCAACcACCACAAGUgUAUAgUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGC (配列番号39)
KRAS-dRNA-91-AG4
UAGCUGGAUCGUCAAGGCACUCGUGCCGACGCCACCAGCUCCAACCACCACAAGGGGAGAGGCAGUCAGGGUCAGCAGGCCUCUCUCCCGC (配列番号40)
KRAS-dRNA-111-AG1
GAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCgACGCCACCAGCUCCAACcACCACAAGUgUAUAgUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGC (配列番号41)
KRAS-dRNA-111-AG2
GAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCgUGCCgACGCCACCAGCUCCAACcACCACAAGUggAgAgUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGC (配列番号42)
KRAS-dRNA-111-AG3
GAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCgUGCCgACGCCACCAGCUCCAACcACCACAAGgggAgAgUCAGUCAgggUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGC (配列番号43)
KRAS-dRNA-111-AG4
GCUCCCCGGUGCGGGAGAGAGGCCUGCUGACCCUGACUGCCUCUCCCCUUGUGGUGGUUGGAGCUGGUGGCGUCGGCACGAGUGCCUUGACGAUCCAGCUAAUUCAGAAUC (配列番号44)
複数の細胞株で例示的なLEAPERメソッドをテストすること
HEK293T細胞での結果から、線形dRNAとその標的RNAによって形成された二本鎖RNAは、A-I編集のために内因性ADARタンパク質を動員できると考えられた。この仮説を確認するために、RNA編集法をテストするためにさらに多くの細胞株を選択した。結果を図9に示す。複数の細胞株でのこれらの結果は、RNA編集法の普遍性を証明した。まず、複数の編集効率にもかかわらず、dRNAを使用して内因性ADARを動員することは、(7つの異なる組織および器官に由来する)複数のヒト細胞株に適した。さらに、この方法はヒト細胞だけでなくマウス細胞でも機能し、マウスで実験を行う可能性を提供する。
RNA編集のための内因性ADARの活用
効率的なRNA編集プラットフォームを探索するために、高活性E1008Q変異体ADAR1(ADAR1DD)40のデアミナーゼドメインを、RNA誘導RNAターゲティングCRISPRエフェクター41である触媒不活性LbuCas13(dCas13a)に融合した(図10A)。RNA編集効率を評価するために、3×GGGGSコード領域とインフレームUAG終止コドンを含む配列によってリンクされたmCherryおよびEGFP遺伝子を含む代理レポーター(surrogate reporter)を構築した(レポーター-1、図10B)。レポーターをトランスフェクトした細胞はmCherryタンパク質のみを発現したが、レポーター転写産物のUAGを標的として編集すると、終止コドンがUIGに変換され、その結果、下流のEGFP発現が可能になる。このようなレポーターを使用すると、EGFPレベルを監視することでAからIへの編集効率を測定できる。次に、ターゲティング用のCas13a認識の対象となる5’スキャフォールドと可変長のスペーサー配列(crRNACas13a、LbuCas13 crRNA配列に続く)を含むhU6プロモーター駆動型crRNA(CRISPR RNA)を設計した。
特定の長く操作されたcrRNACas13aがdCas13a-ADAR1DDとは独立してRNA編集を可能にするという驚くべき発見により、crRNAからCas13a動員スキャフォールド配列を削除することにした。crRNA70はEGFP発現をトリガーする最も高い活性を持っていたため(図10C、10D)、Cas13a動員スキャフォールのない、表3における同じ70-ntの長さのガイドRNAを選択して、さらなるテストを行った(図11Aおよび以下の実施例で使用されたarRNAと対照RNA配列)。
LEAPERは複数の細胞株でのRNA編集を可能にする
内因性ADARタンパク質の発現は、LEAPERを介したRNA編集の前提条件であるため、HT29、A549、HepG2、RD、SF268、SW13、HeLaなどの異なる組織に由来する細胞株におけるLEAPERのパフォーマンスをテストした。最初に、ウエスタンブロッティング解析を使用して、3種類すべてのADARタンパク質の内因性発現を調べた。ADAR1は、テストしたすべての細胞株で高度に発現し、ウエスタンブロットでの身分は陰性対照であるHEK293T ADAR1-/-株によって確認された(図14A、B)。ADAR3はHepG2およびHeLa細胞でのみ検出された(図14A、B)。ADAR2はどの細胞でも検出できなかった。これは、ADAR2を過剰発現するHEK293T細胞からADAR2タンパク質を検出できたため、ウエスタンブロッティングの失敗によるものではなかった(図14A、B)。これらの発見は、ADAR1が遍在的に発現している一方、ADAR2およびADAR3の発現が特定の組織に限定されているという以前の報告と一致している11。
LEAPERは、効率が異なるが、このarRNA71についてテストされたすべての細胞で機能した(図14C)。これらの結果は、HepG2およびHeLa細胞を除いて、ADAR1/2タンパク質レベルがRNA編集収量42と相関するという以前の報告と一致している。編集効率とADAR1レベルの次善の相関関係は、ADAR3がRNA編集において阻害的役割を果たすことが報告されているため、これら2つのラインに大量なADAR3発現があるからかもしれない(図14A、B)。重要なことに、LEAPERはマウス由来の3つの異なる細胞株(NIH3T3、マウス胚性線維芽細胞(MEF)およびB16)でも機能し(図14D)、動物および疾患モデルを通じてその治療の可能性をテストする道を開いた。まとめると、LEAPERは、幅広い種類の細胞やさまざまな生物に使用する多機能ツールであると結論付けた。
LEAPERの特性と最適化
LEAPERをよりよくキャラクタリゼーションして最適化するために、標的転写物のUAGトリプレット内のアデノシンと対向するヌクレオチドの選択を調査した。HEK293T細胞では、レポーター1を標的とするarRNA71は、可変的な編集効率を示し、標的となるUAGに対向する変化したトリプレット(5’-CNA、NはA/U/C/Gの一つを表す)を有する(上記列した、この研究で使用されたarRNA及び対照RNAの配列)。A-Cミスマッチは最高の編集効率をもたらし、A-Gミスマッチは最小であるが明白な編集をもたらした(図16A)。次に、arRNAのA-Cミスマッチに隣接するヌクレオチドの優先度を調査した。シチジン(5’-N1CN2)の周りの5’および3’隣接部位の16の組み合わせすべてをテストし(上記のこの研究で使用したarRNAおよび対照RNAの配列)、3’隣接アデノシンが効率的な編集に必要なものであり、アデノシンが5’部位で最も好ましくないヌクレオチドであることを発見した(図16B、C)。したがって、arRNAのCCAモチーフは、UAG部位を標的とした最高の編集効率をもたらすと結論付けた。arRNAの3’隣接グアノシン(5’-N1CG)が有意な阻害効果を示したことに注意すべきである(図16B、C)。
LEAPERを使用した内因性転写産物の編集
次に、LEAPERが内因性転写物の効果的な編集を可能にするかどうかを調べた。異なる長さのarRNAを使用して、PPIB、KRAS、SMAD4遺伝子の転写産物のUAGモチーフ、およびFANCC遺伝子転写産物のUACモチーフを標的にした(図17A、上記のこの研究で使用したarRNAと対照RNAの配列)。心強いことに、4つの転写物すべての標的アデノシン部位は、NGSの結果によると効率が異なるが、4つのサイズすべての対応するarRNAによって編集された(図17B)。以前の観察と一致して、arRNAが長いほど編集率が高くなる傾向があった。注目すべきことに、151ntのarRNAPPIBはPPIB遺伝子の全転写産物の約50%を編集した(図17B)。それらの標的転写物(図18A)または最終的なタンパク質レベル(例えば、KRAS、図18B)に対してRNAi効果を示すarRNAはなかった。さらに、LEAPERは非UAN部位で望ましい編集率を達成することができ(図17Cおよび上記のこの研究で使用されたarRNAと対照RNAの配列)、内因性転写物の編集におけるLEAPERの柔軟性を示している。LEAPERの機能をさらに探求するために、LEAPERが複数の部位を同時に標的とすることができるかどうかをテストした。2つのarRNA(上記のこの研究で使用したarRNAと対照RNAの配列)の共発現によるTARDBPとFANCCの両方の転写産物の多重編集を観察し、単一のarRNAよりも効率が高いことを示している(図17D)。これは、LEAPERが、複数の標的を並行して編集するのに適していることを示した。
LEAPERのRNA編集特異性
arRNAで覆われたdsRNA領域内で起こりうるオフターゲット効果に加えて、arRNAの部分的な塩基対形成による他の転写産物への潜在的なオフターゲット効果についても懸念していた。そして、トランスクリプトーム全体のRNAシーケンシング解析を実行して、LEAPERのグローバルなオフターゲット効果を評価した。RNAシーケンス解析を行う前に、細胞に対照RNA151またはPPIB特異的arRNA(arRNA151-PPIB)発現プラスミドをトランスフェクトした。対照RNA151グループ(図20A)で6つの潜在的なオフターゲットを特定し、arRNA151-PPIBグループ(図20B)で5つを特定し、NGS解析に基づくPPIBオンターゲット率は約37%であった(図20B)。さらなる解析により、EIF2AK2転写産物からの2つの部位を除くすべての部位がSINE(Alu)またはLINE領域のいずれかに位置し(図20A、B)、両方ともADARを介した編集の傾向があることが明らかになり45、これらのオフターゲットが標的転写産物とarRNAまたは対照RNAとのペアリングに由来しない場合があることは示された。注目すべきなことに、オフターゲティング転写物、WDR73とSMYD4が両方のグループに現れ、それらが配列依存性のRNA編集である可能性が低いことを示唆している。実際、最小自由エネルギー解析は、これらの可能なオフターゲット転写物すべてが、対照RNA151またはarRNA151-PPIBのいずれかと安定した二重鎖を形成できなかったことを示唆した(図20C)。arRNAが配列依存のオフターゲットを生成するかどうかをさらにテストするために、NCBI BLASTを使用してarRNA151-PPIBとarRNA111-FANCCの配列の類似性を比較することにより、潜在的なオフターゲットサイトを選択した。arRNA151-PPIBのTRAPPC12転写物およびarRNA111-FANCCのST3GAL1、OSTM1-AS1およびEHD2転写物の3つの部位が最もよい候補であった(図20Dおよび図21A)。NGS解析により、これらの予測されたオフターゲットサイトのいずれでも編集が検出されなかったことが明らかになった(図20Dおよび図21B)。これらの結果は、LEAPERが、トランスクリプトーム全体の特異性を維持しながら、標的部位での効率的な編集を許可し、配列依存のオフターゲット編集を検出しなかったことを示している。
哺乳類細胞におけるLEAPERの安全性評価
arRNAは標的転写産物の編集を内因性ADARタンパク質に依存しているため、外因性arRNAの添加は、ADAR1またはADAR2タンパク質を過剰に占有することにより、ネイティブRNA編集イベントに影響を与えるかどうかを知りたかった。そのため、トランスクリプトーム全体のRNAシーケンシング結果から、模擬グループとarRNA151-PPIBグループが共有するAからIへのRNA編集部位を解析し、模擬グループと対照RNA151グループの比較も解析した。対照RNA151グループもarRNA151-PPIBグループも模擬グループと比較して有意差を示さず(図22A、B)、LEAPERがネイティブAからIへの編集イベントを触媒する内因性ADAR1の正常な機能にほとんど影響を与えなかったことを示している。
arRNAが標的転写物とRNA二重鎖を形成し、RNA二重鎖が自然免疫応答を誘発する可能性があることを考慮して、arRNAの導入がそのような効果をもたらすかどうかを調査した。これをテストするために、効果が証明されている4つの遺伝子転写産物を標的とするarRNAを選択した。自然免疫活性化の2つの特徴であるインターフェロン-β(IFN-β)(図22E)またはインターロイキン-6(IL-6)(図22F)のmRNA誘導は観察されなかった。陽性対照として、二本鎖RNAの合成類似体ポリ(I:C)は強いIFN-βおよびIL-6発現を誘導した(図22E、F)。LEAPERは、安全な治療に重要な特徴である標的細胞に免疫原性を誘発しないようである。
LEAPERによるp53の転写調節活性の回復
外因的タンパク質を導入することなくRNA編集ができる新しい方法を確立したので、その治療的有用性を実証することを試みた。まず、細胞の恒常性の維持に重要な役割を果たすことが知られている腫瘍抑制遺伝子TP53を標的としたが、ヒトの癌の50%以上で頻繁に変異が起こる46。TP53中のc.158G>Aの変異は、臨床的に関連のあるナンセンス変異(Trp53Ter)であり、機能しないトランケートされたタンパク質をもたらす46。1つのarRNA111と2つの代替arRNA(arRNA111-AG1とarRNA111-AG4)(上記のこの研究で使用したarRNAと対照RNAの配列)を設計した。これらはいずれもTP53W53X転写産物を標的としており(図23A)、後者の2つは最小化した潜在的なオフターゲットに設計されている。ネイティブp53タンパク質の影響を排除するために、HEK293T TP53-/-細胞株を生成した。TP53W53Xを標的とするarRNAの3つの形態はすべて、変異したアデノシン部位でTP53W53X転写産物の約25~35%を変換し(図23B)、arRNA111-AG1およびarRNA111-AG4の不要な編集を可変的に削減した(図24)。ウエスタンブロットは、arRNA111、arRNA111-AG1、およびarRNA111-AG4がすべて、HEK293T TP53-/-細胞におけるTP53W53X転写産物に基づく完全長p53タンパク質の産生を救うことができるのに対し、対照RNA111が救うことができないことを示した(図23C)。
LEAPERによる病原性突然変異の補正
次に、LEAPERを使用してより病原性の高い変異を補正できるかどうかを調査した。エーラス・ダンロス症候群のCOL3A1、原発性肺高血圧症のBMPR2、ジュベール症候群のAHI1、ファンコニ貧血のFANCC、原発性家族性肥大性心筋症のMYBPC3、及びX連鎖重症複合免疫不全症のIL2RGの6つの病原性遺伝子からの臨床的に関連する変異を目指して、対応する病原性G>A変異を有するこれらの遺伝子のそれぞれに対して111-nt arRNAを設計した(図25および上記のこの研究で使用されたarRNAと対照RNAの配列、およびこの研究で使用された以下の疾患関連cDNA)。
LEAPERによる複数のヒト初代細胞でのRNA編集
LEAPERの臨床的有用性をさらに探求するために、複数のヒト初代細胞でこの方法をテストすることに着手した。まず、レポーター1を編集するために151 nt arRNA(上記のこの研究で使用したarRNAと対照RNAの配列)を使用して、ヒト初代肺線維芽細胞とヒト初代気管支上皮細胞でLEAPERをテストした(図15A)。EGFP陽性細胞の35~45%は、両方のヒト初代細胞でLEAPERによって取得できた(図27A)。次に、これら2つの初代細胞とヒト初代T細胞でのLEAPERによる内因性遺伝子PPIBの編集をテストし、arRNA151-PPIBがヒト初代肺線維芽細胞、初代気管支上皮細胞(図27B)および初代T細胞(図27C)での編集率がそれぞれ>40%、>80%、>30%を達成できることを発見した。ヒト初代細胞におけるLEAPERの高い編集効率は、治療におけるその潜在的な用途のため特に有望である。
レンチウイルスの発現とarRNAの化学合成による効率的な編集
次に、LEAPERをより臨床的に適切な方法で送達できるかどうかを調査した。まず、レンチウイルスベースの発現を介してarRNAの効果をテストした。レポーター-1を標的とするarRNA151は、感染2日後(dpi)にHEK293T細胞でレポーター-1を保有する全細胞の40%以上で強力なEGFP発現を誘導した。8dpiでは、EGFP比は約38%の同等レベルに維持され(図28Aおよび上記のこの研究で使用されたarRNAと対照RNAの配列)、LEAPERは、継続的な投与を必要とする治療法に適用できることを示唆している。ネイティブ遺伝子編集では、HEK293T細胞でレンチウイルス形質導入を介してPPIBターゲティングarRNA151を送達し、6dpiで6%を超える標的編集を観察した(図28B)。
LEAPERによるハーラー(Hurler)症候群患者由来の初代線維芽細胞におけるα-L-イデュロニダーゼ活性の回復
最後に、単一遺伝子疾患-ハーラー(Hurler)症候群の治療におけるLEAPERの可能性を検討した。この疾患は、ムコ多糖の分解に関与するリソソーム代謝酵素であるα-L-イズロニダーゼ(IDUA)の欠損によるムコ多糖症I型(MPS I)の最も重篤なサブタイプである(MPS I)50。もともとハーラー症候群患者から分離された初代線維芽細胞GM06214を選択した。GM06214細胞は、IDUA遺伝子のエクソン9にホモ接合のTGG>TAG変異を含み、タンパク質にTrp402Ter変異をもたらす。配列の最初と最後の3ヌクレオチドにおける2’-O-メチル化とヌクレオチド間ホスホロチオエート結合である化学修飾を加えた合成RNAオリゴヌクレオチドによって、IDUAの成熟mRNAとプレmRNAをそれぞれ標的とするarRNA111-IDUA-V1とarRNA111-IDUA-V2の2つのバージョンのarRNAを設計した(図29A及び上記のこの研究で使用されたarRNAと対照RNAの配列)。エレクトロポレーションによりGM06214細胞にarRNA111-IDUA-V1またはarRNA111-IDUA-V2を導入した後、NGS解析により標的RNA編集率を測定し、4-MU-α-L-イズロニダーゼの基質によるα-L-イズロニダーゼの触媒活性を異なる時点で測定しました。arRNA111-IDUA-V1とarRNA111-IDUA-V2はどちらも、エレクトロポレーション後の時間とともにIDUA欠損GM06214細胞のIDUA触媒活性を徐々に回復させ、arRNA111-IDUA-V2はarRNA111-IDUA-V1よりもはるかに優れた性能を示し、α-L-イズロニダーゼ活性は、3つの対照群で検出できなかった(図29B)。
GM06214変異遺伝子型の検出
GM06214細胞は、15%血清および1%線維芽細胞増殖添加剤(ScienCell、GFS、カタログ番号2301)を含む線維芽細胞培養培地(ScienCell、FM培地、カタログ番号2301)で、37℃および5%CO2のインキュベーター内で2~3日間培養された。細胞が90%コンフルエントになったら、0.25%トリプシンで消化し、15%血清を含む線維芽細胞培地で消化を終了した。DNA抽出は、TianGene(登録商標)(天根生化科技(北京)有限公司、TIANGEN Biotech(Beijing)Co.,Ltd.)細胞DNA抽出キット(カタログ番号DP304-03)の取扱説明書に従って行われた。
GM06214細胞トランスフェクション条件のテスト
GM06214細胞は、GM06214が90%のコンフルエンシーになったときに消化され、消化の終了後にカウントされた。エレクトロトランスフェクションでは、600万個の細胞を400μlの事前混合されたエレクトロトランスフェクション溶液(Lonza、カタログ番号V4XP-3024)で再懸濁し、20μgのGFPプラスミド(Lonza、カタログ番号V4XP-3024)を添加した。混合後、20μlの懸濁液を、Lonza NucleofectorTM機器を使用して、7つのテストエレクトロトランスフェクション条件(図35を参照)と1つの陰性対照を含む8つの条件のそれぞれのテスト用のエレクトロトランスフェクションシステムとして使用した。各条件のテストが一回複製された。エレクトロトランスフェクション後、細胞を15%血清を含む2mlの線維芽細胞培養培地(ScienCell、FM培地、カタログ番号2301)に迅速に移した。各条件の細胞を2ウェル(6ウェル培養プレート)に播種し、5%CO2、37℃のインキュベーターで培養した。エレクトロトランスフェクションの24時間後、各エレクトロトランスフェクション条件の2つのウェルの1つにある細胞を消化し、GFP陽性細胞の割合をフローサイトメトリーで測定した。エレクトロトランスフェクションの48時間後、各エレクトロトランスフェクション条件の2つのウェルのもう一方のウェルの細胞を消化し、GFP陽性細胞の割合をフローサイトメトリーで測定した。細胞に最適なエレクトロトランスフェクション条件は、図35に示すように、CA-137条件である。
IDUA酵素活性とAからGへの変異率の検出
オリゴdRNAは、IDUA遺伝子から転写されたプレmRNAおよび成熟RNAの変異部位を持つ配列を標的とするように設計および合成された。dRNAの配列を以下に示す。すべてのdRNA配列はCM0パターンで修飾された(2’-O-メチル化は配列の最初と最後の各3ヌクレオチドにあり、配列の最初と最後の各3ヌクレオチド間結合はホスホロチオ化されていた)。
gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucauccagcagcgccagcagcgcaccccuggggugagcaccggcuu(プレ-55nt-c-55nt);
配列番号205:
gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcggggcgggggggggccgucgccgcguggggucguug(m-55nt-c-55nt);
配列番号341:
uaccgcuacagccacgcugauuucagcuauaccugcccgguauaaagggacguucacaccggauguucuccgcggggauaucgcgauauucaggauuaaaagaagugc(ランダム-111nt)。
設計したdRNAをRNA酵素フリーの水(TransGene Biotech、カタログ番号:GI201-01)に必要な濃度まで溶解し、-80℃で保存した。GM06214細胞が約90%のコンフルエンスに成長したときに細胞を消化し、消化の終了後にカウントした。100万個の細胞と200pmolのdRNAを混合し、100μlに希釈した後、CA-137の条件下でエレクトロトランスフェクトした。エレクトロトランスフェクションの48時間後、細胞をカウントし、それらの生存率を測定した。細胞をRNaseフリーの遠心チューブに移し、遠心分離した。上澄みを廃棄した。QIAGEN RNA抽出キット(QIAGEN、カタログ番号74134)を使用してRNAを抽出した。説明書に従って、0.35mlのBuffer RLT Plusを5×105個の細胞と混合した(RNAを凍結細胞から直接抽出する場合は、細胞をPBSで1回洗浄することを勧める)。細胞溶解液をgDNA Eliminatorスピンカラムに移し、8000g以上で30秒間遠心分離した。カラムを廃棄し、液体を残した。液体と同じ体積の70%エタノールを加えた。混合後すぐに、混合物をRNeasyMinEluteスピンカラムに移し、8000g以上で15秒間遠心分離し、廃液を廃棄した。700μlのBuffer RW1をRNeasyMinEluteスピンカラムに加え、8000g以上で15秒間遠心分離した。廃液を捨て、500μlのBuffer RPEを加えた後、RNeasyMinEluteスピンカラムを8000g以上で15秒間遠心分離した。廃液を捨て、80%エタノール500μlを加えた後、RNeasyMinEluteスピンカラムを8000g以上で2分間遠心分離した。廃液を廃棄した。RNeasyMinEluteスピンカラムを新しい2mlのコレクションカラムに入れ、蓋を掛けて最大速度で5分間遠心分離し、カラムを乾燥させた。RNeasyMinEluteスピンカラムを新しい1.5mlのコレクションカラムに入れ、14μlのRNaseフリー水をカラムメンブレンの中央に滴下し、カラムを最大速度で1分間遠心分離してRNAを溶出した。
GM06214細胞を消化し、遠心分離し、0.1%TritonX-100を含む28ulの1×PBSに再懸濁し、氷上で30分間溶解した。次に、25μlの細胞溶解液を190μmの4-メチルウンベリフェリル-α-L-イズロニダーゼ(4-methylumbelliferyl-α-L-iduronidase、Cayman、2A-19543-500、0.2%Triton X-100を含むpH3.5の0.4Mギ酸ナトリウム緩衝液に溶解)を含む25μlの基質に添加し、暗所で37°Cで90分間インキュベートした。pH10.3の200μlの0.5M NaOH/グリシン溶液(北京化工、Beijing Chemical Works、NAOH、カタログ番号AR500G;Solarbio、グリシン、カタログ番号G8200)を添加して、触媒反応を不活性化した。4℃で2分間遠心分離した後、その上澄みを96ウェルプレートに移し、Infinite M200機器(TECAN)を使用して蛍光値を測定した。励起光の波長は365nmと450nmであった。蛍光は酵素活性を表しており、図ではGM01323の酵素活性の倍数として表されている。
化学修飾されたdRNAのエレクトロトランスフェクション後のIDUAレポーター細胞株における編集効率の検出
異なる長さの化学修飾されたdRNAでトランスフェクションした後の異なる時点でのGM06214細胞における細胞内IDUA酵素活性とRNA編集効率の測定
異なる長さのdRNAをGM06214細胞にエレクトロトランスフェクトするための実施例18の条件(表8を参照)、並びに酵素活性および編集効率を測定するための実施例19の方法を使用した。エレクトロトランスフェクション後2、4、6、8、10、12、14日目に、細胞内酵素活性をテストした。2日目と4日目に、細胞内でのRNA編集効率をテストした。図38Aに示すように、91nt:45-c-45は最高の酵素活性をもたらし、IDUA酵素活性はエレクトロトランスフェクション後6日目まで高レベルで維持されていた。図38Bでは、91ntのdRNAと111ntのdRNAはほぼ同じ編集効率を示した。この場合も、51ntのdRNAは低い編集効率を示した。
化学修飾されたdRNAの好ましい配列のスクリーニング
文献研究を通じて、エレクトロトランスフェクションは将来の疾患の治療には適さないと考えている。そのため、dRNAを細胞にトランスフェクトするために、エレクトロトランスフェクションをリポフェクタミン(Lipofectamine)RNAiMAX(Invitrgen、カタログ番号13778-150)に変更した。その結果、Lipofectamine RNAiMAXは、エレクトロトランスフェクションよりもトランスフェクション効率が高いことがわかった。まず配列は両方の末端で同時に切り捨てられ、次に該配列の一方の末端が固定され、もう一方の末端が切り捨てられた。このようにして、以下の表9に示すように、等長の14個のdRNAと4個のランダム配列が取得された。すべてのdRNA配列はCM0パターンで修飾された。図39に示すように、IDUA酵素活性(図39A、実施例19に記載の方法を使用)およびRNA編集効率(図39B、NGSを使用)は、トランスフェクションの48時間後に測定された。81nt:55-c-25(配列番号24)および71nt:55-c-15(配列番号25)によって引き起こされたIDUA酵素活性およびRNA編集効率は、他のdRNAによって引き起こされたIDUA酵素活性およびRNA編集効率よりも高いことが判明された。3’末端が短くて5’末端が長いdRNAは、常に効率が高くなった。また、dRNAの長さが61nt以下になると、3’または5’末端がどのように変化しても、dRNAの編集効率が劇的に低下したようである。
化学修飾されたdRNAの3’末端の任意の長さの決定
実施例22では、81nt:55-c-25および71nt:55-c-15配列を有するdRNAによって編集された細胞において、より高いIDUA酵素活性および編集効率が検出された。3’末端の最短かつ最適な長さを見つけるために、表10に示すように、3’末端の配列を25nt(81nt:55-c-25)から5nt(61nt:55-c-5)に切り詰めた。すべてのdRNA配列はCM0パターンで修飾された。81nt:55-c-25から66nt:55-c-10までのdRNAで別々にトランスフェクトされた細胞(図40A)および72nt:55-c-16から61nt:55-c-5までのdRNAで別々にトランスフェクトされた細胞(図40B)で2つのIDUA酵素活性アッセイを行った。3’末端の長さが25ntから9ntのdRNAは、GM06214細胞の酵素活性をGM0123細胞の20倍以上に容易に上昇させた。したがって、3’末端の最適な長さは25nt~7ntであった。さらに、3’と5’の末端が等しい長さの45nt-c-45ntと比較して、3’の末端が短いdRNAは常に編集効率が高かった。
3’末端の長さが固定されている場合の化学修飾されたdRNAの5’末端の最適な長さの決定
5’末端のトランケーションは、76nt:55-c-20と71nt:55-c-15の2つの異なる長さのdRNAで別々に行われた。表11に示すように、3’末端の長さが固定されているため、5’末端は徐々に切り詰められた。すべてのdRNA配列はCM0パターンで修飾された。IDUA酵素活性アッセイの結果によると、55ntと45ntの間の5’末端を有するdRNAでトランスフェクトされた細胞は、図41に示すように、より高いIDUA酵素活性を有していた。Lipofectamine RNAiMAXをトランスフェクションに使用した。図39によると、長さが61nt未満に減少すると、dRNAの編集効率は、3’と5’の末端の長さが等しくない場合でも劇的に低下した。
ターゲティングヌクレオチドの位置とIDUA変異部位への化学修飾dRNAの編集効率との関係の決定
上記のデータによると、dRNAの編集効率は、dRNA上のターゲティングヌクレオチドの長さと位置に関連している。通常、ターゲティングヌクレオチドが5’末端に近いほど、編集効率は低くなる。したがって、この実施例では、3つの固定長のdRNAの3つのグループが設計された。各グループのdRNAは、ターゲティングヌクレオチドを配列の中央から5’末端に向かって徐々に移動させることによって設計された。合成が容易でない構造は避けられた。配列を表12に示す。すべてのdRNA配列はCM0パターンで修飾された。Lipofectamine RNAiMAXを使用して、dRNAをGM06214細胞にトランスフェクトした。48時間後、細胞を収集し、実施例23に記載の方法に従って酵素活性をテストした。図42に示すデータによると、少なくともdRNAの全長が67nt、70nt、または72ntに固定されている場合、ターゲティングヌクレオチドの位置の変化は、編集効率を表す酵素活性に影響を与えなかったようである。
dRNAの編集効率に対する化学修飾の影響
合成されたRNAの化学修飾は、RNAの安定性を高め、オフターゲットの可能性を減らす。RNAの比較的一般的な化学修飾は、2’-O-メチル化(2’-O-Me)とホスホロチオエート結合である。長さの異なる:71ntまたは76nt及び化学的修飾の組み合わせを有するdRNAを表13に示した。GM06214細胞は、細胞内IDUAの編集のためにリポフェクタミンRNAiMAXを使用して異なるdRNAでトランスフェクトされた。トランスフェクションの48時間後に細胞を収集し、実施例23に示される方法を使用してIDUA酵素活性を測定した。図42Aに示す結果によって、CM5を除く(5番目の修飾:ターゲティングヌクレオチドとその両側の5ntを除くすべてのヌクレオチドが2’-O-Meによって修飾された)すべての修飾が良好な酵素活性をもたらした。ターゲティングヌクレオチドまたはそれに最も隣接する2つのヌクレオチドを修飾しても、編集効率は低下しなかった。
修飾パターンのさらなる検証
CM1の修飾パターンは別の配列でテストされた。従来技術における好ましい修飾パターンが対照として使用された。表14に示すように、55nt-c-15nt-CM1が測定配列であり、36nt-c-13nt-CM11が陽性対照であり、編集トリプレット「CCA」を除くすべてのヌクレオチドが2’-O-Meによって修飾され、しかも最初と最後の各4つのヌクレオチド間結合がチオ化ロチオエート化された。さらに、36nt-c-13nt-CM11はわずか51ntであり、これは本発明では好ましい長さではないが、従来技術では好ましい長さである。Lipofectamine RNAiMAXを使用してGM06214細胞にdRNAをトランスフェクトしてから48時間後、実施例23に示す方法を使用してIDUA酵素活性を検出した。図44に示すように、55nt-c-15nt-CM1は、36nt-c-13nt-CM11よりも大幅に高い編集効率を示した。
他の細胞におけるdRNAのさらなるテスト
この実施例では、LEAPERテクノロジーを使用したUSH2A c.11864 G>A(p.Trp3955*)変異の修復に焦点を当てた。この実施例で設計されたレポーターシステムを図45Aに示す。USH2A c.11864 G>A(p.Trp3955*)の場合、通常のTGG配列は終止コドンであるTAGに変異しているため、変異したmRNAの翻訳はこのTAGで早期に終了する。293T(293T細胞は、C.Zhangの研究室(北京大学)から入手)レポーターシステムはレンチウイルスベクターであり、図45Aに示すmRNAはCMVプロモーターによって駆動される。このシステムは、1)安定して発現できるmCherry赤色蛍光タンパク質、2)USH2A遺伝子の変異部位と両側の隣接する100塩基対、3)GFP緑色蛍光タンパク質を含む。変異部位が成功裏に編集されると、TAGコドンがTIGに変換され、翻訳を継続できるようになり、USH2A配列後のGFPが正常に翻訳される。したがって、GFPの発現は編集効率を表している。
5’-atggccgagatcaaggagaaaatctgcgactatctcttcaatgtgtctgactcctctgccctgaatttggctaaaaatattggccttaccaaggcccgagatataaatgctgtgctaattgacatggaaaggcagggggatgtctatagacaagggacaacccctcccatatggcatttgacagacaagaagcgagagaggatgcaaatcaagagaaatacgaacagtgttcctgaaaccgctccagctgcaatccctgagaccaaaagaaacgcagagttcctcacctgtaatatacccacatcaaatgcctcaaataacatggtaaccacagaaaaagtggagaatgggcaggaacctgtcataaagttagaaaacaggcaagaggccagaccagaaccagcaagactgaaaccacctgttcattacaatggcccctcaaaagcagggtatgttgactttgaaaatggccagtgggccacagatgacatcccagatgacttgaatagtatccgcgcagcaccaggtgagtttcgagccatcatggagatgccctccttctacagtcatggcttgccacggtgttcaccctacaagaaactgacagagtgccagctgaagaaccccatcagcgggctgttagaatatgcccagttcgctagtcaaacctgtgagttcaacatgatagagcagagtggaccaccccatgaacctcgatttaaattccaggttgtcatcaatggccgagagtttcccccagctgaagctggaagcaagaaagtggccaagcaggatgcagctatgaaagccatgacaattctgctagaggaagccaaagccaaggacagtggaaaatcagaagaatcatcccactattccacagagaaagaatcagagaagactgcagagtcccagacccccaccccttcagccacatccttcttttctgggaagagccccgtcaccacactgcttgagtgtatgcacaaattggggaactcctgcgaattccgtctcctgtccaaagaaggccctgcccatgaacccaagttccaatactgtgttgcagtgggagcccaaactttccccagtgtgagtgctcccagcaagaaagtggcaaagcagatggccgcagaggaagccatgaaggccctgcatggggaggcgaccaactccatggcttctgataaccagcctgaaggtatgatctcagagtcacttgataacttggaatccatgatgcccaacaaggtcaggaagattggcgagctcgtgagatacctgaacaccaaccctgtgggtggccttttggagtacgcccgctcccatggctttgctgctgaattcaagttggtcgaccagtccggacctcctcacgagcccaagttcgtttaccaagcaaaagttgggggtcgctggttcccagccgtctgcgcacacagcaagaagcaaggcaagcaggaagcagcagatgcggctctccgtgtcttgattggggagaacgagaaggcagaacgcatgggtttcacagaggtaaccccagtgacaggggccagtctcagaagaactatgctcctcctctcaaggtccccagaagcacagccaaagacactccctctcactggcagcaccttccatgaccagatagccatgctgagccaccggtgcttcaacactctgactaacagcttccagccctccttgctcggccgcaagattctggccgccatcattatgaaaaaagactctgaggacatgggtgtcgtcgtcagcttgggaacagggaatcgctgtgtaaaaggagattctctcagcctaaaaggagaaactgtcaatgactgccatgcagaaataatctcccggagaggcttcatcaggtttctctacagtgagttaatgaaatacaactcccagactgcgaaggatagtatatttgaacctgctaagggaggagaaaagctccaaataaaaaagactgtgtcattccatctgtatatcagcactgctccgtgtggagatggcgccctctttgacaagtcctgcagcgaccgtgctatggaaagcacagaatcccgccactaccctgtcttcgagaatcccaaacaaggaaagctccgcaccaaggtggagaacggagaaggcacaatccctgtggaatccagtgacattgtgcctacgtgggatggcattcggctcggggagagactccgtaccatgtcctgtagtgacaaaatcctacgctggaacgtgctgggcctgcaaggggcactgttgacccacttcctgcagcccatttatctcaaatctgtcacattgggttaccttttcagccaagggcatctgacccgtgctatttgctgtcgtgtgacaagagatgggagtgcatttgaggatggactacgacatccctttattgtcaaccaccccaaggttggcagagtcagcatatatgattccaaaaggcaatccgggaagactaaggagacaagcgtcaactggtgtctggctgatggctatgacctggagatcctggacggtaccagaggcactgtggatgggccacggaatgaattgtcccgggtctccaaaaagaacatttttcttctatttaagaagctctgctccttccgttaccgcagggatctactgagactctcctatggtgaggccaagaaagctgcccgtgactacgagacggccaagaactacttcaaaaaaggcctgaaggatatgggctatgggaactggattagcaaaccccaggaggaaaagaacttttatctctgcccagta gattacaaggatgacgacgataag(標記タグ) TAG-3’ (配列番号332)
5’atgaatccgcggcaggggtattccctcagcggatactacacccatccatttcaaggctatgagcacagacagctcagataccagcagcctgggccaggatcttcccccagtagtttcctgcttaagcaaatagaatttctcaaggggcagctcccagaagcaccggtgattggaaagcagacaccgtcactgccaccttccctcccaggactccggccaaggtttccagtactacttgcctccagtaccagaggcaggcaagtggacatcaggggtgtccccaggggcgtgcatctcggaagtcaggggctccagagagggttccagcatccttcaccacgtggcaggagtctgccacagagaggtgttgattgcctttcctcacatttccaggaactgagtatctaccaagatcaggaacaaaggatcttaaagttcctggaagagcttggggaagggaaggccaccacagcacatgatctgtctgggaaacttgggactccgaagaaagaaatcaatcgagttttatactccctggcaaagaagggcaagctacagaaagaggcaggaacaccccctttgtggaaaatcgcggtctccactcaggcttggaaccagcacagcggagtggtaagaccagacggtcatagccaaggagccccaaactcagacccgagtttggaaccggaagacagaaactccacatctgtctcagaagatcttcttgagccttttattgcagtctcagctcaggcttggaaccagcacagcggagtggtaagaccagacagtcatagccaaggatccccaaactcagacccaggtttggaacctgaagacagcaactccacatctgccttggaagatcctcttgagtttttagacatggccgagatcaaggagaaaatctgcgactatctcttcaatgtgtctgactcctctgccctgaatttggctaaaaatattggccttaccaaggcccgagatataaatgctgtgctaattgacatggaaaggcagggggatgtctatagacaagggacaacccctcccatatggcatttgacagacaagaagcgagagaggatgcaaatcaagagaaatacgaacagtgttcctgaaaccgctccagctgcaatccctgagaccaaaagaaacgcagagttcctcacctgtaatatacccacatcaaatgcctcaaataacatggtaaccacagaaaaagtggagaatgggcaggaacctgtcataaagttagaaaacaggcaagaggccagaccagaaccagcaagactgaaaccacctgttcattacaatggcccctcaaaagcagggtatgttgactttgaaaatggccagtgggccacagatgacatcccagatgacttgaatagtatccgcgcagcaccaggtgagtttcgagccatcatggagatgccctccttctacagtcatggcttgccacggtgttcaccctacaagaaactgacagagtgccagctgaagaaccccatcagcgggctgttagaatatgcccagttcgctagtcaaacctgtgagttcaacatgatagagcagagtggaccaccccatgaacctcgatttaaattccaggttgtcatcaatggccgagagtttcccccagctgaagctggaagcaagaaagtggccaagcaggatgcagctatgaaagccatgacaattctgctagaggaagccaaagccaaggacagtggaaaatcagaagaatcatcccactattccacagagaaagaatcagagaagactgcagagtcccagacccccaccccttcagccacatccttcttttctgggaagagccccgtcaccacactgcttgagtgtatgcacaaattggggaactcctgcgaattccgtctcctgtccaaagaaggccctgcccatgaacccaagttccaatactgtgttgcagtgggagcccaaactttccccagtgtgagtgctcccagcaagaaagtggcaaagcagatggccgcagaggaagccatgaaggccctgcatggggaggcgaccaactccatggcttctgataaccagcctgaaggtatgatctcagagtcacttgataacttggaatccatgatgcccaacaaggtcaggaagattggcgagctcgtgagatacctgaacaccaaccctgtgggtggccttttggagtacgcccgctcccatggctttgctgctgaattcaagttggtcgaccagtccggacctcctcacgagcccaagttcgtttaccaagcaaaagttgggggtcgctggttcccagccgtctgcgcacacagcaagaagcaaggcaagcaggaagcagcagatgcggctctccgtgtcttgattggggagaacgagaaggcagaacgcatgggtttcacagaggtaaccccagtgacaggggccagtctcagaagaactatgctcctcctctcaaggtccccagaagcacagccaaagacactccctctcactggcagcaccttccatgaccagatagccatgctgagccaccggtgcttcaacactctgactaacagcttccagccctccttgctcggccgcaagattctggccgccatcattatgaaaaaagactctgaggacatgggtgtcgtcgtcagcttgggaacagggaatcgctgtgtaaaaggagattctctcagcctaaaaggagaaactgtcaatgactgccatgcagaaataatctcccggagaggcttcatcaggtttctctacagtgagttaatgaaatacaactcccagactgcgaaggatagtatatttgaacctgctaagggaggagaaaagctccaaataaaaaagactgtgtcattccatctgtatatcagcactgctccgtgtggagatggcgccctctttgacaagtcctgcagcgaccgtgctatggaaagcacagaatcccgccactaccctgtcttcgagaatcccaaacaaggaaagctccgcaccaaggtggagaacggagaaggcacaatccctgtggaatccagtgacattgtgcctacgtgggatggcattcggctcggggagagactccgtaccatgtcctgtagtgacaaaatcctacgctggaacgtgctgggcctgcaaggggcactgttgacccacttcctgcagcccatttatctcaaatctgtcacattgggttaccttttcagccaagggcatctgacccgtgctatttgctgtcgtgtgacaagagatgggagtgcatttgaggatggactacgacatccctttattgtcaaccaccccaaggttggcagagtcagcatatatgattccaaaaggcaatccgggaagactaaggagacaagcgtcaactggtgtctggctgatggctatgacctggagatcctggacggtaccagaggcactgtggatgggccacggaatgaattgtcccgggtctccaaaaagaacatttttcttctatttaagaagctctgctccttccgttaccgcagggatctactgagactctcctatggtgaggccaagaaagctgcccgtgactacgagacggccaagaactacttcaaaaaaggcctgaaggatatgggctatgggaactggattagcaaaccccaggaggaaaagaacttttatctctgcccagta gattacaaggatgacgacgataag(標記タグ) TAG-3’ (配列番号333)
5’-atggatatagaagatgaagaaaacatgagttccagcagcactgatgtgaaggaaaaccgcaatctggacaacgtgtcccccaaggatggcagcacacctgggcctggcgagggctctcagctctccaatgggggtggtggtggccccggcagaaagcggcccctggaggagggcagcaatggccactccaagtaccgcctgaagaaaaggaggaaaacaccagggcccgtcctccccaagaacgccctgatgcagctgaatgagatcaagcctggtttgcagtacacactcctgtcccagactgggcccgtgcacgcgcctttgtttgtcatgtctgtggaggtgaatggccaggtttttgagggctctggtcccacaaagaaaaaggcaaaactccatgctgctgagaaggccttgaggtctttcgttcagtttcctaatgcctctgaggcccacctggccatggggaggaccctgtctgtcaacacggacttcacatctgaccaggccgacttccctgacacgctcttcaatggttttgaaactcctgacaaggcggagcctcccttttacgtgggctccaatggggatgactccttcagttccagcggggacctcagcttgtctgcttccccggtgcctgccagcctagcccagcctcctctccctgccttaccaccattcccacccccgagtgggaagaatcccgtgatgatcttgaacgaactgcgcccaggactcaagtatgacttcctctccgagagcggggagagccatgccaagagcttcgtcatgtctgtggtcgtggatggtcagttctttgaaggctcggggagaaacaagaagcttgccaaggcccgggctgcgcagtctgccctggccgccatttttaacttgcacttggatcagacgccatctcgccagcctattcccagtgagggtcttcagctgcatttaccgcaggttttagctgacgctgtctcacgcctggtcctgggtaagtttggtgacctgaccgacaacttctcctcccctcacgctcgcagaaaagtgctggctggagtcgtcatgacaacaggcacagatgttaaagatgccaaggtgataagtgtttctacaggaacaaaatgtattaatggtgaatacatgagtgatcgtggccttgcattaaatgactgccatgcagaaataatatctcggagatccttgctcagatttctttatacacaacttgagctttacttaaataacaaagatgatcaaaaaagatccatctttcagaaatcagagcgaggggggtttaggctgaaggagaatgtccagtttcatctgtacatcagcacctctccctgtggagatgccagaatcttctcaccacatgagccaatcctggaagaaccagcagatagacacccaaatcgtaaagcaagaggacagctacggaccaaaatagagtctggtgaggggacgattccagtgcgctccaatgcgagcatccaaacgtgggacggggtgctgcaaggggagcggctgctcaccatgtcctgcagtgacaagattgcacgctggaacgtggtgggcatccagggatccctgctcagcattttcgtggagcccatttacttctcgagcatcatcctgggcagcctttaccacggggaccacctttccagggccatgtaccagcggatctccaacatagaggacctgccacctctctacaccctcaacaagcctttgctcagtggcatcagcaatgcagaagcacggcagccagggaaggcccccaacttcagtgtcaactggacggtaggcgactccgctattgaggtcatcaacgccacgactgggaaggatgagctgggccgcgcgtcccgcctgtgtaagcacgcgttgtactgtcgctggatgcgtgtgcacggcaaggttccctcccacttactacgctccaagattaccaaacccaacgtgtaccatgagtccaagctggcggcaaaggagtaccaggccgccaaggcgcgtctgttcacagccttcatcaaggcggggctgggggcctgggtggagaagcccaccgagcaggaccagttctcactcacgccc gattacaaggatgacgacgataag(標記タグ) TAG-3’ (配列番号334)
COL3A1
5’-atgatgagctttgtgcaaaaggggagctggctacttctcgctctgcttcatcccactattattttggcacaacaggaagctgttgaaggaggatgttcccatcttggtcagtcctatgcggatagagatgtctggaagccagaaccatgccaaatatgtgtctgtgactcaggatccgttctctgcgatgacataatatgtgacgatcaagaattagactgccccaacccagaaattccatttggagaatgttgtgcagtttgcccacagcctccaactgctcctactcgccctcctaatggtcaaggacctcaaggccccaagggagatccaggccctcctggtattcctgggagaaatggtgaccctggtattccaggacaaccagggtcccctggttctcctggcccccctggaatctgtgaatcatgccctactggtcctcagaactattctccccagtatgattcatatgatgtcaagtctggagtagcagtaggaggactcgcaggctatcctggaccagctggccccccaggccctcccggtccccctggtacatctggtcatcctggttcccctggatctccaggataccaaggaccccctggtgaacctgggcaagctggtccttcaggccctccaggacctcctggtgctataggtccatctggtcctgctggaaaagatggagaatcaggtagacccggacgacctggagagcgaggattgcctggacctccaggtatcaaaggtccagctgggatacctggattccctggtatgaaaggacacagaggcttcgatggacgaaatggagaaaagggtgaaacaggtgctcctggattaaagggtgaaaatggtcttccaggcgaaaatggagctcctggacccatgggtccaagaggggctcctggtgagcgaggacggccaggacttcctggggctgcaggtgctcggggtaatgacggtgctcgaggcagtgatggtcaaccaggccctcctggtcctcctggaactgccggattccctggatcccctggtgctaagggtgaagttggacctgcagggtctcctggttcaaatggtgcccctggacaaagaggagaacctggacctcagggacacgctggtgctcaaggtcctcctggccctcctgggattaatggtagtcctggtggtaaaggcgaaatgggtcccgctggcattcctggagctcctggactgatgggagcccggggtcctccaggaccagccggtgctaatggtgctcctggactgcgaggtggtgcaggtgagcctggtaagaatggtgccaaaggagagcccggaccacgtggtgaacgcggtgaggctggtattccaggtgttccaggagctaaaggcgaagatggcaaggatggatcacctggagaacctggtgcaaatgggcttccaggagctgcaggagaaaggggtgcccctgggttccgaggacctgctggaccaaatggcatcccaggagaaaagggtcctgctggagagcgtggtgctccaggccctgcagggcccagaggagctgctggagaacctggcagagatggcgtccctggaggtccaggaatgaggggcatgcccggaagtccaggaggaccaggaagtgatgggaaaccagggcctcccggaagtcaaggagaaagtggtcgaccaggtcctcctgggccatctggtccccgaggtcagcctggtgtcatgggcttccccggtcctaaaggaaatgatggtgctcctggtaagaatggagaacgaggtggccctggaggacctggccctcagggtcctcctggaaagaatggtgaaactggacctcagggacccccagggcctactgggcctggtggtgacaaaggagacacaggaccccctggtccacaaggattacaaggcttgcctggtacaggtggtcctccaggagaaaatggaaaacctggggaaccaggtccaaagggtgatgccggtgcacctggagctccaggaggcaagggtgatgctggtgcccctggtgaacgtggacctcctggattggcaggggccccaggacttagaggtggagctggtccccctggtcccgaaggaggaaagggtgctgctggtcctcctgggccacctggtgctgctggtactcctggtctgcaaggaatgcctggagaaagaggaggtcttggaagtcctggtccaaagggtgacaagggtgaaccaggcggtccaggtgctgatggtgtcccagggaaagatggcccaaggggtcctactggtcctattggtcctcctggcccagctggccagcctggagataagggtgaaggtggtgcccccggacttccaggtatagctggacctcgtggtagccctggtgagagaggtgaaactggccctccaggacctgctggtttccctggtgctcctggacagaatggtgaacctggtggtaaaggagaaagaggggctccgggtgagaaaggtgaaggaggccctcctggagttgcaggaccccctggaggttctggacctgctggtcctcctggtccccaaggtgtcaaaggtgaacgtggcagtcctggtggacctggtgctgctggcttccctggtgctcgtggtcttcctggtcctcctggtagtaatggtaacccaggacccccaggtcccagcggttctccaggcaaggatgggcccccaggtcctgcgggtaacactggtgctcctggcagccctggagtgtctggaccaaaaggtgatgctggccaaccaggagagaagggatcgcctggtgcccagggcccaccaggagctccaggcccacttgggattgctgggatcactggagcacggggtcttgcaggaccaccaggcatgccaggtcctaggggaagccctggccctcagggtgtcaagggtgaaagtgggaaaccaggagctaacggtctcagtggagaacgtggtccccctggaccccagggtcttcctggtctggctggtacagctggtgaacctggaagagatggaaaccctggatcagatggtcttccaggccgagatggatctcctggtggcaagggtgatcgtggtgaaaatggctctcctggtgcccctggcgctcctggtcatccaggcccacctggtcctgtcggtccagctggaaagagtggtgacagaggagaaagtggccctgctggccctgctggtgctcccggtcctgctggttcccgaggtgctcctggtcctcaaggcccacgtggtgacaaaggtgaaacaggtgaacgtggagctgctggcatcaaaggacatcgaggattccctggtaatccaggtgccccaggttctccaggccctgctggtcagcagggtgcaatcggcagtccaggacctgcaggccccagaggacctgttggacccagtggacctcctggcaaagatggaaccagtggacatccaggtcccattggaccaccagggcctcgaggtaacagaggtgaaagaggatctgagggctccccaggccacccagggcaaccaggccctcctggacctcctggtgcccctggtccttgctgtggtggtgttggagccgctgccattgctgggattggaggtgaaaaagctggcggttttgccccgtattatggagatgaaccaatggatttcaaaatcaacaccgatgagattatgacttcactcaagtctgttaatggacaaatagaaagcctcattagtcctgatggttctcgtaaaaaccccgctagaaactgcagagacctgaaattctgccatcctgaactcaagagtggagaatactgggttgaccctaaccaaggatgcaaattggatgctatcaaggtattctgtaatatggaaactggggaaacatgcataagtgccaatcctttgaatgttccacggaaacactggtggacagattctagtgctgagaagaaacacgtttggtttggagagtccatggatggtggttttcagtttagctacggcaatcctgaacttcctgaagatgtccttgatgtgcagctggcattccttcgacttctctccagccgagcttcccagaacatcacatatcactgcaaaaatagcattgcatacatggatcaggccagtggaaatgtaaagaaggccctgaagctgatggggtcaaatgaaggtgaattcaaggctgaaggaaatagcaaattcacctacacagttctggaggatggttgcacgaaacacactggggaatggagcaaaacagtctttgaatatcgaacacgcaaggctgtgagactacctattgtagatattgcaccctatgacattggtggtcctgatcaagaatttggtgtggacgttggccctgtttgctttttataa-3’ (配列番号335)
5’-atgacttcctcgctgcagcggccctggcgggtgccctggctaccatggaccatcctgctggtcagcgctgcggctgcttcgcagaatcaagaacggctatgtgcgtttaaagatccgtatcagcaagaccttgggataggtgagagtagaatctctcatgaaaatgggacaatattatgctcgaaaggtagcacctgctatggcctttgggagaaatcaaaaggggacataaatcttgtaaaacaaggatgttggtctcacattggagatccccaagagtgtcactatgaagaatgtgtagtaactaccactcctccctcaattcagaatggaacataccgtttctgctgttgtagcacagatttatgtaatgtcaactttactgagaattttccacctcctgacacaacaccactcagtccacctcattcatttaaccgagatgagacaataatcattgctttggcatcagtctctgtattagctgttttgatagttgccttatgctttggatacagaatgttgacaggagaccgtaaacaaggtcttcacagtatgaacatgatggaggcagcagcatccgaaccctctcttgatctagataatctgaaactgttggagctgattggccgaggtcgatatggagcagtatataaaggctccttggatgagcgtccagttgctgtaaaagtgttttcctttgcaaaccgtcagaattttatcaacgaaaagaacatttacagagtgcctttgatggaacatgacaacattgcccgctttatagttggagatgagagagtcactgcagatggacgcatggaatatttgcttgtgatggagtactatcccaatggatctttatgcaagtatttaagtctccacacaagtgactgggtaagctcttgccgtcttgctcattctgttactagaggactggcttatcttcacacagaattaccacgaggagatcattataaacctgcaatttcccatcgagatttaaacagcagaaatgtcctagtgaaaaatgatggaacctgtgttattagtgactttggactgtccatgaggctgactggaaatagactggtgcgcccaggggaggaagataatgcagccataagcgaggttggcactatcagatatatggcaccagaagtgctagaaggagctgtgaacttgagggactgtgaatcagctttgaaacaagtagacatgtatgctcttggactaatctattgggagatatttatgagatgtacagacctcttcccaggggaatccgtaccagagtaccagatggcttttcagacagaggttggaaaccatcccacttttgaggatatgcaggttctcgtgtctagggaaaaacagagacccaagttcccagaagcctggaaagaaaatagcctggcagtgaggtcactcaaggagacaatcgaagactgttgggaccaggatgcagaggctcggcttactgcacagtgtgctgaggaaaggatggctgaacttatgatgatttgggaaagaaacaaatctgtgagcccaacagtcaatccaatgtctactgctatgcagaatgaacgcaacctgtcacataataggcgtgtgccaaaaattggtccttatccagattattcttcctcctcatacattgaagactctatccatcatactgacagcatcgtgaagaatatttcctctgagcattctatgtccagcacacctttgactataggggaaaaaaaccgaaattcaattaactatgaacgacagcaagcacaagctcgaatccccagccctgaaacaagtgtcaccagcctctccaccaacacaacaaccacaaacaccacaggactcacgccaagtactggcatgactactatatctgagatgccatacccagatgaaacaaatctgcataccacaaatgttgcacagtcaattgggccaacccctgtctgcttacagctgacagaagaagacttggaaaccaacaagctagacccaaaagaagttgataagaacctcaaggaaagctctgatgagaatctcatggagcactctcttaaacagttcagtggcccagacccactgagcagtactagttctagcttgctttacccactcataaaacttgcagtagaagcaactggacagcaggacttcacacagactgcaaatggccaagcatgtttgattcctgatgttctgcctactcagatctatcctctccccaagcagcagaaccttcccaagagacctactagtttgcctttgaacaccaaaaattcaacaaaagagccccggctaaaatttggcagcaagcacaaatcaaacttgaaacaagtcgaaactggagttgccaagatgaatacaatcaatgcagcagaacctcatgtggtgacagtcaccatgaatggtgtggcaggtagaaaccacagtgttaactcccatgctgccacaacccaatatgccaatgggacagtactatctggccaaacaaccaacatagtgacacatagggcccaagaaatgttgcagaatcagtttattggtgaggacacccggctgaatattaattccagtcctgatgagcatgagcctttactgagacgagagcaacaagctggccatgatgaaggtgttctggatcgtcttgtggacaggagggaacggccactagaaggtggccgaactaattccaataacaacaacagcaatccatgttcagaacaagatgttcttgcacagggtgttccaagcacagcagcagatcctgggccatcaaagcccagaagagcacagaggcctaattctctggatctttcagccacaaatgtcctggatggcagcagtatacagataggtgagtcaacacaagatggcaaatcaggatcaggtgaaaagatcaagaaacgtgtgaaaactccctattctcttaagcggtggcgcccctccacctgggtcatctccactgaatcgctggactgtgaagtcaacaataatggcagtaacagggcagttcattccaaatccagcactgctgtttaccttgcagaaggaggcactgctacaaccatggtgtctaaagatataggaatgaactgtctgtga-3’ (配列番号336)
5’-atgcctacagctgagagtgaagcaaaagtaaaaaccaaagttcgctttgaagaattgcttaagacccacagtgatctaatgcgtgaaaagaaaaaactgaagaaaaaacttgtcaggtctgaagaaaacatctcacctgacactattagaagcaatcttcactatatgaaagaaactacaagtgatgatcccgacactattagaagcaatcttccccatattaaagaaactacaagtgatgatgtaagtgctgctaacactaacaacctgaagaagagcacgagagtcactaaaaacaaattgaggaacacacagttagcaactgaaaatcctaatggtgatgctagtgtagaggaagacaaacaaggaaagccaaataaaaaggtgataaagacggtgccccagttgactacacaagacctgaaaccggaaactcctgagaataaggttgattctacacaccagaaaacacatacaaagccacagccaggcgttgatcatcagaaaagtgagaaggcaaatgagggaagagaagagactgatttagaagaggatgaagaattgatgcaagcatatcagtgccatgtaactgaagaaatggcaaaggagattaagaggaaaataagaaagaaactgaaagaacagttgacttactttccctcagatactttattccatgatgacaaactaagcagtgaaaaaaggaaaaagaaaaaggaagttccagtcttctctaaagctgaaacaagtacattgaccatctctggtgacacagttgaaggtgaacaaaagaaagaatcttcagttagatcagtttcttcagattctcatcaagatgatgaaataagctcaatggaacaaagcacagaagacagcatgcaagatgatacaaaacctaaaccaaaaaaaacaaaaaagaagactaaagcagttgcagataataatgaagatgttgatggtgatggtgttcatgaaataacaagccgagatagcccggtttatcccaaatgtttgcttgatgatgaccttgtcttgggagtttacattcaccgaactgatagacttaagtcagattttatgatttctcacccaatggtaaaaattcatgtggttgatgagcatactggtcaatatgtcaagaaagatgatagtggacggcctgtttcatcttactatgaaaaagagaatgtggattatattcttcctattatgacccagccatatgattttaaacagttaaaatcaagacttccagagtgggaagaacaaattgtatttaatgaaaattttccctatttgcttcgaggctctgatgagagtcctaaagtcatcctgttctttgagattcttgatttcttaagcgtggatgaaattaagaataattctgaggttcaaaaccaagaatgtggctttcggaaaattgcctgggcatttcttaagcttctgggagccaatggaaatgcaaacatcaactcaaaacttcgcttgcagctatattacccacctactaagcctcgatccccattaagtgttgttgaggcatttgaatggtggtcaaaatgtccaagaaatcattacccatcaacactgtacgtaactgtaagaggactgaaagttccagactgtataaagccatcttaccgctctatgatggctcttcaggaggaaaaaggtaaaccagtgcattgtgaacgtcaccatgagtcaagctcagtagacacagaacctggattagaagagtcaaaggaagtaataaagtggaaacgactccctgggcaggcttgccgtatcccaaacaaacacctcttctcactaaatgcaggagaacgaggatgtttttgtcttgatttctcccacaatggaagaatattagcagcagcttgtgccagccgggatggatatccaattattttatatgaaattccttctggacgtttcatgagagaattgtgtggccacctcaatatcatttatgatctttcctggtcaaaagatgatcactacatccttacttcatcatctgatggcactgccaggatatggaaaaatgaaataaacaatacaaatactttcagagttttacctcatccttcttttgtttacacggctaaattccatccagctgtaagagagctagtagttacaggatgctatgattccatgatacggatatggaaagttgagatgagagaagattctgccatattggtccgacagtttgacgttcacaaaagttttatcaactcactttgttttgatactgaaggtcatcatatgtattcaggagattgtacaggggtgattgttgtttggaatacctatgtcaagattaatgatttggaacattcagtgcaccactggactataaataaggaaattaaagaaactgagtttaagggaattccaataagttatttggagattcatcccaatggaaaacgtttgttaatccataccaaagacagtactttgagaattatggatctccggatattagtagcaaggaagtttgtaggagcagcaaattatcgggagaagattcatagtactttgactccatgtgggacttttctgtttgctggaagtgaggatggtatagtgtatgtttggaacccagaaacaggagaacaagtagccatgtattctgacttgccattcaagtcacccattcgagacatttcttatcatccatttgaaaatatggttgcattctgtgcatttgggcaaaatgagccaattcttctgtatatttacgatttccatgttgcccagcaggaggctgaaatgttcaaacgctacaatggaacatttccattacctggaatacaccaaagtcaagatgccctatgtacctgtccaaaactaccccatcaaggctcttttcagattgatgaatttgtccacactgaaagttcttcaacgaagatgcagctagtaaaacagaggcttgaaactgtcacagaggtgatacgttcctgtgctgcaaaagtcaacaaaaatctctcatttacttcaccaccagcagtttcctcacaacagtctaagttaaagcagtcaaacatgctgaccgctcaagagattctacatcagtttggtttcactcagaccgggattatcagcatagaaagaaagccttgtaaccatcaggtagatacagcaccaacggtagtggctctttatgactacacagcgaatcgatcagatgaactaaccatccatcgcggagacattatccgagtgtttttcaaagataatgaagactggtggtatggcagcataggaaagggacaggaaggttattttccagctaatcatgtggctagtgaaacactgtatcaagaactgcctcctgagataaaggagcgatcccctcctttaagccctgaggaaaaaactaaaatagaaaaatctccagctcctcaaaagcaatcaatcaataagaacaagtcccaggacttcagactaggctcagaatctatgacacattctgaaatgagaaaagaacagagccatgaggaccaaggacacataatggatacacggatgaggaagaacaagcaagcaggcagaaaagtcactctaatagagta-3’ (配列番号337)
5’-atggctcaagattcagtagatctttcttgtgattatcagttttggatgcagaagctttctgtatgggatcaggcttccactttggaaacccagcaagacacctgtcttcacgtggctcagttccaggagttcctaaggaagatgtatgaagccttgaaagagatggattctaatacagtcattgaaagattccccacaattggtcaactgttggcaaaagcttgttggaatccttttattttagcatatgatgaaagccaaaaaattctaatatggtgcttatgttgtctaattaacaaagaaccacagaattctggacaatcaaaacttaactcctggatacagggtgtattatctcatatactttcagcactcagatttgataaagaagttgctcttttcactcaaggtcttgggtatgcacctatagattactatcctggtttgcttaaaaatatggttttatcattagcgtctgaactcagagagaatcatcttaatggatttaacactcaaaggcgaatggctcccgagcgagtggcgtccctgtcacgagtttgtgtcccacttattaccctgacagatgttgaccccctggtggaggctctcctcatctgtcatggacgtgaacctcaggaaatcctccagccagagttctttgaggctgtaaacgaggccattttgctgaagaagatttctctccccatgtcagctgtagtctgcctctggcttcggcaccttcccagccttgaaaaagcaatgctgcatctttttgaaaagctaatctccagtgagagaaattgtctgagaaggatcgaatgctttataaaagattcatcgctgcctcaagcagcctgccaccctgccatattccgggttgttgatgagatgttcaggtgtgcactcctggaaaccgatggggccctggaaatcatagccactattcaggtgtttacgcagtgctttgtagaagctctggagaaagcaagcaagcagctgcggtttgcactcaagacctactttccttacacttctccatctcttgccatggtgctgctgcaagaccctcaagatatccctcggggacactggctccagacactgaagcatatttctgaactgctcagagaagcagttgaagaccagactcatgggtcctgcggaggtccctttgagagctggttcctgttcattcacttcggaggatgggctgagatggtggcagagcaattactgatgtcggcagccgaaccccccacggccctgctgtggctcttggccttctactacggcccccgtgatgggaggcagcagagagcacagactatggtccaggtgaaggccgtgctgggccacctcctggcaatgtccagaagcagcagcctctcagcccaggacctgcagacggtagcaggacagggcacagacacagacctcagagctcctgcacaacagctgatcaggcaccttctcctcaacttcctgctctgggctcctggaggccacacgatcgcctgggatgtcatcaccctgatggctcacactgctgagataactcacgagatcattggctttcttgaccagaccttgtacagatggaatcgtcttggcattgaaagccctagatcagaaaaactggcccgagagctccttaaagagctgcgaactcaagtctag-3’ (配列番号338)
5’-atgcctgagccggggaagaagccagtctcagcttttagcaagaagccacggtcagtggaagtggccgcaggcagccctgccgtgttcgaggccgagacagagcgggcaggagtgaaggtgcgctggcagcgcggaggcagtgacatcagcgccagcaacaagtacggcctggccacagagggcacacggcatacgctgacagtgcgggaagtgggccctgccgaccagggatcttacgcagtcattgctggctcctccaaggtcaagttcgacctcaaggtcatagaggcagagaaggcagagcccatgctggcccctgcccctgcccctgctgaggccactggagcccctggagaagccccggccccagccgctgagctgggagaaagtgccccaagtcccaaagggtcaagctcagcagctctcaatggtcctacccctggagcccccgatgaccccattggcctcttcgtgatgcggccacaggatggcgaggtgaccgtgggtggcagcatcaccttctcagcccgcgtggccggcgccagcctcctgaagccgcctgtggtcaagtggttcaagggcaaatgggtggacctgagcagcaaggtgggccagcacctgcagctgcacgacagctacgaccgcgccagcaaggtctatctgttcgagctgcacatcaccgatgcccagcctgccttcactggcagctaccgctgtgaggtgtccaccaaggacaaatttgactgctccaacttcaatctcactgtccacgaggccatgggcaccggagacctggacctcctatcagccttccgccgcacgagcctggctggaggtggtcggcggatcagtgatagccatgaggacactgggattctggacttcagctcactgctgaaaaagagagacagtttccggaccccgagggactcgaagctggaggcaccagcagaggaggacgtgtgggagatcctacggcaggcacccccatctgagtacgagcgcatcgccttccagtacggcgtcactgacctgcgcggcatgctaaagaggctcaagggcatgaggcgcgatgagaagaagagcacagcctttcagaagaagctggagccggcctaccaggtgagcaaaggccacaagatccggctgaccgtggaactggctgaccatgacgctgaggtcaaatggctcaagaatggccaggagatccagatgagcggcagcaagtacatctttgagtccatcggtgccaagcgtaccctgaccatcagccagtgctcattggcggacgacgcagcctaccagtgcgtggtgggtggcgagaagtgtagcacggagctctttgtgaaagagccccctgtgctcatcacgcgccccttggaggaccagctggtgatggtggggcagcgggtggagtttgagtgtgaagtatcggaggagggggcgcaagtcaaatggctgaaggacggggtggagctgacccgggaggagaccttcaaataccggttcaagaaggacgggcagagacaccacctgatcatcaacgaggccatgctggaggacgcggggcactatgcactgtgcactagcgggggccaggcgctggctgagctcattgtgcaggaaaagaagctggaggtgtaccagagcatcgcagacctgatggtgggcgcaaaggaccaggcggtgttcaaatgtgaggtctcagatgagaatgttcggggtgtgtggctgaagaatgggaaggagctggtgcccgacagccgcataaaggtgtcccacatcgggcgggtccacaaactgaccattgacgacgtcacacctgccgacgaggctgactacagctttgtgcccgagggcttcgcctgcaacctgtcagccaagctccacttcatggaggtcaagattgacttcgtacccaggcaggaacctcccaagatccacctggactgcccaggccgcataccagacaccattgtggttgtagctggaaataagctacgtctggacgtccctatctctggggaccctgctcccactgtgatctggcagaaggctatcacgcaggggaataaggccccagccaggccagccccagatgccccagaggacacaggtgacagcgatgagtgggtgtttgacaagaagctgctgtgtgagaccgagggccgggtccgcgtggagaccaccaaggaccgcagcatcttcacggtcgagggggcagagaaggaagatgagggcgtctacacggtcacagtgaagaaccctgtgggcgaggaccaggtcaacctcacagtcaaggtcatcgacgtgccagacgcacctgcggcccccaagatcagcaacgtgggagaggactcctgcacagtacagtgggagccgcctgcctacgatggcgggcagcccatcctgggctacatcctggagcgcaagaagaagaagagctaccggtggatgcggctgaacttcgacctgattcaggagctgagtcatgaagcgcggcgcatgatcgagggcgtggtgtacgagatgcgcgtctacgcggtcaacgccatcggcatgtccaggcccagccctgcctcccagcccttcatgcctatcggtccccccagcgaacccacccacctggcagtagaggacgtctctgacaccacggtctccctcaagtggcggcccccagagcgcgtgggagcaggaggcctggatggctacagcgtggagtactgcccagagggctgctcagagtgggtggctgccctgcaggggctgacagagcacacatcgatactggtgaaggacctgcccacgggggcccggctgcttttccgagtgcgggcacacaatatggcagggcctggagcccctgttaccaccacggagccggtgacagtgcaggagatcctgcaacggccacggcttcagctgcccaggcacctgcgccagaccattcagaagaaggtcggggagcctgtgaaccttctcatccctttccagggcaagccccggcctcaggtgacctggaccaaagaggggcagcccctggcaggcgaggaggtgagcatccgcaacagccccacagacaccatcctgttcatccgggccgctcgccgcgtgcattcaggcacttaccaggtgacggtgcgcattgagaacatggaggacaaggccacgctggtgctgcaggttgttgacaagccaagtcctccccaggatctccgggtgactgacgcctggggtcttaatgtggctctggagtggaagccaccccaggatgtcggcaacacggagctctgggggtacacagtgcagaaagccgacaagaagaccatggagtggttcaccgtcttggagcattaccgccgcacccactgcgtggtgccagagctcatcattggcaatggctactacttccgcgtcttcagccagaatatggttggctttagtgacagagcggccaccaccaaggagcccgtctttatccccagaccaggcatcacctatgagccacccaactataaggccctggacttctccgaggccccaagcttcacccagcccctggtgaaccgctcggtcatcgcgggctacactgctatgctctgctgtgctgtccggggtagccccaagcccaagatttcctggttcaagaatggcctggacctgggagaagacgcccgcttccgcatgttcagcaagcagggagtgttgactctggagattagaaagccctgcccctttgacgggggcatctatgtctgcagggccaccaacttacagggcgaggcacggtgtgagtgccgcctggaggtgcgagtgcctcagtga-3’ (配列番号339)
5’-atgttgaagccatcattaccattcacatccctcttattcctgcagctgcccctgctgggagtggggctgaacacgacaattctgacgcccaatgggaatgaagacaccacagctgatttcttcctgaccactatgcccactgactccctcagtgtttccactctgcccctcccagaggttcagtgttttgtgttcaatgtcgagtacatgaattgcacttggaacagcagctctgagccccagcctaccaacctcactctgcattattggtacaagaactcggataatgataaagtccagaagtgcagccactatctattctctgaagaaatcacttctggctgtcagttgcaaaaaaaggagatccacctctaccaaacatttgttgttcagctccaggacccacgggaacccaggagacaggccacacagatgctaaaactgcagaatctggtgatcccctgggctccagagaacctaacacttcacaaactgagtgaatcccagctagaactgaactggaacaacagattcttgaaccactgtttggagcacttggtgcagtaccggactgactgggaccacagctggactgaacaatcagtggattatagacataagttctccttgcctagtgtggatgggcagaaacgctacacgtttcgtgttcggagccgctttaacccactctgtggaagtgctcagcattggagtgaatggagccacccaatccactgggggagcaatacttcaaaagagaatcctttcctgtttgcattggaagccgtggttatctctgttggctccatgggattgattatcagccttctctgtgtgtatttctggctggaacggacgatgccccgaattcccaccctgaagaacctagaggatcttgttactgaataccacgggaacttttcggcctggagtggtgtgtctaagggactggctgagagtctgcagccagactacagtgaacgactctgcctcgtcagtgagattcccccaaaaggaggggcccttggggaggggcctggggcctccccatgcaaccagcatagcccctactgggcccccccatgttacaccctaaagcctgaaacctga-3’ (配列番号340)
ゲノム編集技術は生物医学研究を徹底的に変えている。ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)1、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)2-4、およびCRISPRのCasタンパク質(クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート)システム5-7などの高活性ヌクレアーゼは、無数の生物のゲノムを操縦するように成功裏に操作された。最近、デアミナーゼは、二本鎖DNAを破壊することなく遺伝暗号を正確に変更するために利用されている。シチジンまたはアデノシンデアミナーゼをCRISPR-Cas9システムと結合することにより、研究者は、ゲノムDNA中のC・GからT・AまたはA・TからG・Cへの変換8-10を可能にするプログラム可能な塩基編集器を作成し、致病変異の補正の新しい機会を提供する。
Claims (31)
- 60~200ヌクレオチドのデアミナーゼ動員RNA(dRNA)であって、
a)前記dRNAが、標的RNAにハイブリダイズする相補的RNA配列を含み、
b)前記dRNAが、前記標的RNA中の標的アデノシンを脱アミノ化するようにデアミナーゼまたはデアミナーゼを含む構築体またはデアミナーゼの触媒ドメインを含む構築体を動員することができ、
c)前記dRNAが1つ以上の化学修飾を含む、
前記dRNA。 - 前記dRNAが、約60nt、65nt、70nt、80nt、90nt、100nt、または110ntのいずれよりも長い、請求項1に記載のdRNA。
- 相補的な標的RNA領域との1つ以上のミスマッチ、ウォブルおよび/またはバルジを含む、請求項1または2に記載のdRNA。
- 前記相補的なRNA配列が、前記標的RNA中の標的アデノシンの真向かいにあるシチジン、アデノシン、またはウリジンを含む、請求項1~3のいずれか一項に記載のdRNA。
- 前記標的アデノシンの真向かいにある前記シチジン、アデノシン、またはウリジンが、3’末端から少なくとも約7ヌクレオチド、例えば、3’末端から少なくとも約8、9または10ヌクレオチド離れて位置する、請求項4に記載のdRNA。
- 前記標的アデノシンの真向かいにある前記シチジン、アデノシン、またはウリジンが、5’末端から少なくとも約25ヌクレオチド、例えば、5’末端から少なくとも約30、35、40、45、50または55ヌクレオチド離れて位置する、請求項4または5に記載のdRNA。
- 前記標的アデノシンの真向かいにある前記シチジン、アデノシン、またはウリジンに隣接する5’および3’配列の長さが等しくない、請求項4~6のいずれか一項に記載のdRNA。
- 前記標的アデノシンの真向かいにある前記シチジン、アデノシン、またはウリジンに隣接する5’配列の長さが前記3’配列の長さより長い、請求項4~7のいずれか一項に記載のdRNA。
- 前記標的RNA中の前記標的アデノシンの真向かいにあるシチジンを含む、請求項1~8のいずれか一項に記載のdRNA。
- 前記相補的なRNA配列が、前記標的RNA中の非標的アデノシンのそれぞれに対向する1つ以上のグアノシンをさらに含む、請求項1~9のいずれか一項に記載のdRNA。
- 前記相補配列が、前記標的RNA中の非標的アデノシンに対向する2つ以上の連続するミスマッチヌクレオチドを含む、請求項1~10のいずれか一項に記載のdRNA。
- 前記標的RNA中の前記標的アデノシンの5’に最も近い隣接物が、U、C、A、及びGから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がU>C≒A>Gであり、前記標的RNAにおける前記標的アデノシンの3’に最も近い隣接物が、G、C、A、及びUから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がG>C>A≒Uである、請求項1~11のいずれか一項に記載のdRNA。
- 前記標的アデノシンが、UAG、UAC、UAA、UAU、CAG、CAC、CAA、CAU、AAG、AAC、AAA、AAU、GAG、GAC、GAA、及びGAUからなる群より選ばれる、前記標的RNAにおける3塩基モチーフに位置する、請求項1~12のいずれか一項に記載のdRNA。
- 前記3塩基モチーフがUAGであり、前記dRNAが、前記3塩基モチーフのウリジンの真向かいのA、前記標的アデノシンの真向かいのシチジン、及び前記3塩基モチーフのグアノシンの真向かいのシチジン、グアノシン、またはウリジンを含む、請求項13に記載のdRNA。
- UAGの3塩基モチーフの真向かいにある5’-CCA-3’を含む、請求項14に記載dRNA。
- 前記化学修飾が、メチル化および/またはホスホロチオ化を含む、請求項1~15のいずれか一項に記載のdRNA。
- 前記化学修飾が、2’-O-メチル化および/またはヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を含む、請求項16に記載のdRNA。
- 前記化学修飾が、最初と最後の各1~5、2~5、3~5、4~5ヌクレオチドの2’-O-メチル化および/または最初と最後の各1~5、2~5、3~5、4~5ヌクレオチド間結合のホスホロチオ化を含む、請求項16に記載のdRNA。
- 前記化学修飾が、前記標的アデノシンに対向するヌクレオチドおよび/またはその5’及び/または3’に最も隣接するヌクレオチドにおける2’-O-メチル化および/または3’-ホスホロチオ化を含む、請求項16~18のいずれか一項に記載のdRNA。
- 前記化学修飾が、
1)最初と最後の各3ヌクレオチドの2’-O-メチル化および/または最初と最後の各3ヌクレオチド間結合のホスホロチオ化;
2)最初と最後の各3ヌクレオチドの2’-O-メチル化および/または最初と最後の各3ヌクレオチド間結合のホスホロチオ化、及び単一または複数またはすべてのウリジンの2’-O-メチル化;
3)最初と最後の各3ヌクレオチドの2’-O-メチル化、最初と最後の各3ヌクレオチド間結合のホスホロチオ化、単一または複数またはすべてのウリジンの2’-O-メチル化、及び前記標的アデノシンに対向するヌクレオチドおよび/またはその5’及び/または3’に最も隣接するヌクレオチドの修飾;
4)最初と最後の各3ヌクレオチドの2’-O-メチル化、最初と最後の各3ヌクレオチド間結合のホスホロチオ化、単一または複数またはすべてのウリジンの2’-O-メチル化、及び前記標的アデノシンに対向するヌクレオチドの3’及び/または5’に最も隣接するヌクレオチドの2’-O-メチル化;
5)最初と最後の各3ヌクレオチドの2’-O-メチル化、最初と最後の各3ヌクレオチド間結合のホスホロチオ化、単一または複数またはすべてのウリジンの2’-O-メチル化、及び前記標的アデノシンに対向するヌクレオチドおよび/またはその5’及び/または3’に最も隣接するヌクレオチドのホスホロチオ化結合;
6)最初と最後の各1~5ヌクレオチドの2’-O-メチル化および/または最初と最後の各1~5ヌクレオチド間結合のホスホロチオ化
から選択される、請求項1~19のいずれか一項に記載のdRNA。 - 前記標的アデノシンに対向するヌクレオチド及び/または前記標的アデノシンに対向するヌクレオチドに最も隣接する1つまたは2つのヌクレオチド修飾が2’-O-メチル化および/またはホスホロチオエート結合である、請求項20に記載のdRNA。
- ADAR酵素に結合するための分子内ステムループ構造を形成することができるADAR動員ドメインを含まない、請求項1~21のいずれか一項に記載のdRNA。
- 請求項1~22のいずれか一項に記載のdRNAを含むまたはコードする構築体。
- 請求項1~23のいずれか一項に記載のdRNAを宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞において標的RNAを編集する方法。
- ADAR3の阻害剤を前記宿主細胞に導入することをさらに含む、請求項24に記載の方法。
- インターフェロンの刺激物を前記宿主細胞に導入することをさらに含む、請求項24または25に記載の方法。
- それぞれ異なる標的RNAを標的とする複数のdRNAを導入することを含む、請求項24~26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記dRNAが免疫応答を誘導しない、請求項24~27のいずれか一項に記載の方法。
- 外因性ADARを前記宿主細胞に導入することをさらに含む、請求項24~28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ADARが、E1008突然変異を含むADAR1である、請求項29に記載の方法。
- 請求項1~23のいずれか一項に記載のdRNAを含む構築体、組成物、細胞、ライブラリー、またはキット。
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