KR20220053671A - 오프 타겟 평가 기반의 유전자 편집 치료의 평가 방법 - Google Patents

오프 타겟 평가 기반의 유전자 편집 치료의 평가 방법 Download PDF

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Abstract

개체에 대한 세포 요법의 적합성을 결정하는 방법. 생물정보학 방법과 편향 없는 잠재적 오프 타겟 부위 실험 분석 방법을 이용하여, 개체에 세포 요법을 사용하기 전에, 개체로부터 유래된 유전자 변형 세포의 잠재적 오프 타겟 부위를 예측하고, 개체로부터 유래된 유전자 변형 세포를 개체에게 투여한 후 잠재적 오프 타겟 부위를 모니터링함으로써, 상기 잠재적 오프 타겟 부위에 유전자 편집이 발생하였는지 여부를 결정하며, 유전자 편집 이벤트의 발생에 기반하여 상기 치료의 적합성을 평가한다.

Description

오프 타겟 평가 기반의 유전자 편집 치료의 평가 방법
본 발명은 유전자 치료 분야에 속하며, 구체적으로 본 발명은 개체에 대한 세포 요법의 적합성을 결정하는 방법에 관한 것이다.
지중해빈혈은 유전성 용혈성 빈혈의 일종으로, α형, β형, δβ형 및 δ형 등 네 가지로 나뉘며, 여기서 α 및 β 지중해빈혈이 더 흔하다.
인간 β-글로빈 유전자 클러스터는 11번 염색체에 위치하며, 여기서 기능적 유전자는 각각 ε, Gγ, Aγ, δ 및 β-글로빈 유전자이다. 발육 과정에서 유전자는 순차적으로 발현되는데, 태아기에는 γ-글로빈 유전자의 발현이 주로 되고, 이때 헤모글로빈은 주로 태아 헤모글로빈(HbF)이며, 그 후 γ-글로빈 유전자의 발현은 점차 닫히고, β-글로빈 유전자의 발현이 시작되며, 헤모글로빈은 주로 성인 헤모글로빈(HbA)으로 전환된다. β 지중해빈혈은 β-글로빈 유전자의 돌연변이를 포함한다. β 지중해빈혈에서, 돌연변이는 적혈구가 산소를 운반하는 헤모글로빈(성인 헤모글로빈)을 충분히 생성하는 것을 차단하여 빈혈을 유발한다.
BCL11A 유전자는 태아 헤모글로빈(HbF)의 발현과 관련된 유전자로 알려져 있으며, 이의 단백질 생성물은 γ-글로빈 유전자의 전사를 억제하는 트랜스 작용 인자이다. BCL11A 유전자 발현의 감소는 태아 헤모글로빈(HbF)의 지속적인 발현과 관련이 있다.
연구에 따르면, BCL11A 유전자를 비활성화하면 적혈구가 출생 후에도 태아 형태의 헤모글로빈을 계속 생성하도록 할 수 있고, 이는 결함있는 성인 헤모글로빈(HbA)을 대체할 수 있다. BCL11A의 유전적 인핸서는 적혈구에서만 활성이 있다. 따라서, 거의 모든 조혈 줄기 세포에서 BCL11A 인핸서를 편집할 수 있고, BCL11A 유전자(태아 헤모글로빈 생성 억제)를 전단하여 BCL11A의 발현을 감소시킴으로써, 태아 헤모글로빈 HBG 유전자의 발현에 대한 억제 작용을 해소하고, 지중해빈혈 환자의 혈액 내 헤모글로빈의 총량을 증가하며, 질환의 치료 목적을 구현한다.
현재, 자연의학 연구에서는 CRISPR-Cas9 유전자 편집 기술을 기반으로 BCL11A 유전자를 편집하고, 세포 요법을 사용하여 지중해빈혈 환자를 치료하며, 환자 체내에서 조혈 줄기 세포를 취하여 편집하고, 편집된 세포는 적혈구로 분화된 후 기능성 헤모글로빈을 생성할 수 있으며, 편집된 세포를 사용하여 환자의 원래 조혈 줄기 세포를 대체한다.
예를 들어, CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술을 기반으로 하는 CRISPR/Cas9 유전자 편집 BCL11A 인핸서의 자가 CD34+세포 주사액을 사용하여, 환자의 자체적인 CD34+조혈 줄기 세포 중 BCL11A 유전자의 적혈구 인핸서의 특정 타겟을 편집하여 BCL11A의 발현을 감소시킴으로써, 태아 헤모글로빈 HBG 유전자의 발현에 대한 억제 작용을 해소하고, 지중해빈혈 환자의 혈액 내 헤모글로빈의 총량을 증가하며, 질환의 치료 목적을 구현한다.
그러나, CRISPR/Cas9 유전자 편집 과정에 존재하는 문제 중 하나는 오프 타겟 효과이다. sgRNA는 게놈 DNA 서열에 결합될 때 일정 확률의 염기쌍오류가 존재할 수 있어, 비타겟 부위에서 오프 타겟 돌연변이가 발생할 수 있다.
따라서, 개체에 세포 요법을 사용한 후 잠재적 오프 타겟 부위를 모니터링하여 상기 잠재적 오프 타겟 부위에 유전자 편집이 발생하였는지 여부를 결정하고 유전자 편집 이벤트의 발생에 기반하여 개체에 대한 상기 치료의 적합성을 평가할 수 있는 방법이 필요하다.
본 발명은 생물정보학 예측 분석 방법과 편향 없는(unbiased) 잠재적 오프 타겟 부위 실험 분석 방법을 이용하여, 개체에 세포 요법을 사용하기 전에, 개체로부터 유래된 유전자 변형 세포의 잠재적 오프 타겟 부위를 검출한다. 본 발명의 방법을 통해 검출된 잠재적 오프 타겟 부위는 오프 타겟 마커 부위 패턴을 구축하고, 개체에 세포 요법을 사용한 후 잠재적 오프 타겟 부위를 추적 및 모니터링하여, 환자에서 오프 타겟 효과의 발생을 적시적으로 요해하며, 개체에 대한 상기 치료의 적합성, 상기 유전자 편집 세포 요법의 효과 및 상기 세포 요법에 개입이 필요한지 여부를 평가하여, 질환의 효과적인 치료를 부분적으로 구현하는 동시에 세포 요법의 위험을 감소한다.
본 발명의 일 양태는 개체에 대한 세포 요법의 적합성을 결정하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 개체에 대한 세포 요법의 적합성을 결정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 개체에게 상기 개체로부터 유래된 유전자 변형 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되고, 상기 방법은,
a) 상기 유전자 변형 세포 또는 이의 자손에서 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 각 부위의 유전자 편집의 발생을 결정하는 단계, 및
b) 상기 유전자 편집의 발생에 기반하여 상기 치료의 적합성을 평가하는 단계를 포함하며,
여기서 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 어느 하나도 유전자 편집이 발생하지 않았다는 것은 상기 세포 요법이 상기 개체에게 적합하다는 것을 나타낸다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 개체에 대한 세포 요법의 불적합성을 결정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 개체에게 상기 개체로부터 유래된 유전자 변형 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되고, 상기 방법은,
a) 상기 유전자 변형 세포 또는 이의 자손에서 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 각 부위의 유전자 편집의 발생을 결정하는 단계, 및
b) 상기 유전자 편집의 발생에 기반하여 상기 치료의 적합성을 평가하는 단계를 포함하며,
여기서 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 어느 하나가 유전자 편집이 발생하였다는 것은 상기 세포 요법이 상기 개체에게 불적합하다는 것을 나타낸다.
본 발명의 일 양태는 개체의 치료 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 세포 요법을 제공하고, 상기 방법은 1) 개체에 대한 세포 요법의 적합성을 결정하는 단계, 및 2) 세포 요법에 적합한 개체에게 상기 개체로부터 유래된 유전자 변형 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되고, 상기 개체에 대한 세포 요법의 적합성을 결정하는 단계는,
a) 상기 유전자 변형 세포 또는 이의 자손에서 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 각 부위의 유전자 편집의 발생을 결정하는 단계, 및
b) 상기 유전자 편집의 발생에 기반하여 상기 치료의 적합성을 평가하는 단계를 포함하며,
여기서 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 어느 하나도 유전자 편집이 발생하지 않았다는 것은 상기 세포 요법이 상기 개체에게 적합하다는 것을 나타낸다.
본 발명의 일 양태는 개체 유전자 편집 세포 요법을 수반하여 오프 타겟 여부를 진단하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 a) 상기 개체에게 상기 개체로부터 유래된 유전자 변형 세포 집단을 투여하되, 상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되는 단계, 및
b) 상기 유전자 변형 세포 또는 이의 자손에서 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 각 부위의 유전자 편집의 발생을 결정하는 단계를 포함하며,
여기서 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 어느 하나도 유전자 편집이 발생하지 않았다는 것은 상기 세포 요법에 오프 타겟이 나타나지 않았다는 것을 나타낸다.
본 발명의 일 양태는 유전자 편집 세포 요법의 효과를 모니터링하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 a) 상기 개체에게 상기 개체로부터 유래된 유전자 변형 세포 집단을 투여하되, 상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되는 단계, 및
b) 상기 유전자 변형 세포 또는 이의 자손에서 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 각 부위의 유전자 편집의 발생을 결정하는 단계를 포함하며,
여기서 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 어느 하나도 유전자 편집이 발생하지 않았다는 것은 상기 개체에 대한 상기 세포 요법의 치료 효과가 좋다는 것을 나타낸다.
본 발명의 일 양태는 어느 개체로부터 유래된 유전자 변형 세포 제품의 품질 관리 방법을 제공하고, 상기 방법은 a) 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 각 부위에서 상기 유전자 변형 세포의 유전자 편집의 발생을 결정하는 단계를 포함하며,
여기서 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 어느 하나도 유전자 편집이 발생하지 않았다는 것은 상기 세포 제품이 상기 개체의 세포 치료에 사용하기 적합하다는 것을 나타낸다.
본 발명의 일 양태는 유전자 편집 세포 요법을 받는 개체에게 개입 요법이 필요한지 여부를 결정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 a) 상기 개체에게 상기 개체로부터 유래된 유전자 변형 세포 집단을 투여하되, 상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되는 단계, 및
b) 상기 유전자 변형 세포 또는 이의 자손에서 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 각 부위의 유전자 편집의 발생을 결정하는 단계를 포함하며,
여기서 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 어느 하나가 유전자 편집이 발생하였다는 것은 유전자 편집 세포 요법을 받는 개체에게 개입 요법이 필요하다는 것을 나타낸다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 개체에게 상기 유전자 변형 세포를 투여하기 전에 상기 유전자 변형 세포에 대해 상기 결정 단계를 수행하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 개체에게 상기 유전자 변형 세포를 투여하는 단계를 더 포함한다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 유전자 변형 세포를 투여한 후 상기 유전자 변형 세포의 자손에 대해 상기 결정 단계를 수행하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 결정 단계는 상기 유전자 변형 세포를 투여한 후 적어도 약 1개월, 예를 들어 적어도 30일, 40일, 50일, 60일 후에 수행된다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 결정 및 평가 단계를 1회 이상, 예를 들어 2회, 3회, 4회, 5회 또는 그 이상, 예를 들어, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월에 한 번 반복하는 단계를 더 포함한다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 결정 및 평가 단계는 약 월 1회 내지 약 연 1회의 빈도로 반복한다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 평가 단계 후 개입 요법으로 상기 개체를 치료하는 단계를 더 포함한다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 개입 요법은 화학 요법이다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 개입 요법은 투여된 유전자 변형 세포 집단을 제거하는 것이다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 개입 요법은 상기 개체로부터 유래된 제2 유전자 변형 세포 집단을 투여하는 것이다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위는 적어도 약 10개(예를 들어 10 ~ 50개, 10 ~ 45개, 10 ~ 40개, 10 ~ 35개, 10 ~ 30개, 10 ~ 25개, 10 ~ 20개, 10 ~ 15개)의 오프 타겟 마커 부위를 포함한다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 오프 타겟 마커 부위에 0.1%보다 작은 유전자 편집 효율이 있거나 또는 유전자 편집에 의해 변형되지 않은 대조군 세포에 비해 오프 타겟 마커 부위에서 상기 유전자 변형 세포의 유전자 편집 효율이 오프 타겟 마커 부위에서 대조군의 유전자 편집 효율의 2배보다 작다는 것은, 상기 오프 타겟 마커 부위에 유전자 편집이 발생하지 않았다는 것을 나타낸다.
본 발명의 일 양태는 유전자 변형 세포 집단 또는 이의 자손에서 오프 타겟 유전자 편집을 평가하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되고, 상기 방법은 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 각 부위의 유전자 편집의 발생을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 1) 상기 타겟 부위와의 서열 유사성에 기반하여 제1 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 방식; 및/또는 2) 시험관 내 실험 방법을 사용하여 제2 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 방식을 통해 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위를 획득한다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 결정 단계는 DNA 시퀀싱을 통해 수행된다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 결정 단계는 1) 다수의 프라이머 세트를 사용하여 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위를 포함하는 핵산을 증폭하는 단계; 및 2) 증폭된 핵산에 대해 시퀀싱 분석을 수행하는 단계를 포함한다.
본 발명은 유전자 변형 세포 집단에서 다수의 오프 타겟 마커 부위를 획득하는 방법에 관한 것이며, 상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되고, 상기 방법은 1) 상기 타겟 부위와의 서열 유사성에 기반하여 제1 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 단계; 및 2) 시험관 내 실험 방법을 사용하여 제2 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 단계를 포함한다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 시험관 내 실험 방법은 게놈 전체의 편향 없는 오프 타겟 분석 방법(genome-wide unbiased off-target analysis)을 포함한다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 BLESS, GUIDE-seq, HIGTS, Circle-seq, SITE-seq 및 Digenome-seq 중 하나 이상을 포함한다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 시험관 내 실험 방법은 Digenome-seq를 포함한다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 시험관 내 실험 방법은 포화 조건 하에 수행된다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 시험관 내 실험 방법은 세포 집단의 게놈을 추출하고 포화 조건 하에 유전자 편집을 수행한다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 포화 조건은 상기 세포 집단의 게놈 중의 상기 타겟 부위에서 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 의 효과적인 절단을 허용한다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 유전자 변형 세포는 CRISPR/Cas 시스템을 통해 변형된다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 타겟 부위는 BCL11A 유전자좌에 위치한다.
본 발명은 유전자 변형 세포 집단 또는 이의 자손의 오프 타겟 편집을 평가하기 위한 키트에 관한 것이며, 상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에 대한 유전자 편집에 의해 변형되고, 상기 키트는 1) 상기 유전자 변형 세포를 생성하기 위한 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 구성요소; 및 2) 다수의 오프 타겟 마커 부위를 포함하는 핵산을 증폭하기 위한 다수의 프라이머 세트를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위는 1) 상기 타겟 부위와의 서열 유사성에 기반하여 제1 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 방식; 및/또는 2) 시험관 내 실험 방법을 사용하여 제2 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 방식을 통해 획득된다. 일부 실시형태에서, 상기 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas9 시스템이다. 일부 실시형태에서, 상기 유전자 변형 세포 집단 또는 이의 자손의 오프 타겟 편집을 평가하기 위한 키트는 상기 타겟 부위를 포함하는 핵산을 증폭하기 위한 하나 이상의 프라이머 세트를 더 포함한다
상기 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, 유전자 편집의 방법 또는 시스템은 ZFN, TALEN, CRISPR 또는 다른 유전자 편집 방법 또는 시스템으로부터 선택된다. 상기 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, 상기 유전자 편집 방법 또는 시스템은 CRISPR 유전자 편집 방법 또는 시스템이다. 상기 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, 상기 타겟 부위는 CD34 양성 조혈 줄기 세포/전구 세포 중의 BCL11A 유전자 부위이다. 상기 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, 상기 타겟 부위는 BCL11A 인핸서 유전자의 엑손 2와 엑손 3 사이의 뉴클레오티드 서열에 위치하고, 예를 들어 hg38에 기록된 바와 같이 위치 +55:Chr2:60497676-60498941; +58:Chr2:60494251-60495546; +62:Chr2:60490409-60491734에 위치하거나 대응되는 부위이다. 상기 키트의 일부 실시형태에서, 키트는 상기 타겟 부위를 표적화하는 sgRNA 또는 상기 sgRNA를 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 상기 sgRNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 키트의 일부 실시형태에서, 상기 키트는 서열번호 3 ~ 25로부터 선택되는 하나 이상의 sgRNA를 포함한다. 상기 키트의 일부 실시형태에서, 상기 키트는 Cas9 단백질 또는 상기 Cas9 단백질을 코딩하는 발현 벡터 또는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 키트의 일부 실시형태에서, 상기 하나 이상의 프라이머 세트는 서열번호 26 ~ 117 중 하나 이상의 서열을 포함한다.
도 1은 BCL11A 적혈구 인핸서에 대한 sgRNA 잠재적 오프 타겟 부위의 분석을 나타낸다. 횡축은 각 부위이고, 종축은 유전자 편집 효율(indel)이다. 모든 결과는 하기와 같은 3개의 군으로 나뉠 수 있다. 1) 타겟 부위군, 즉 횡좌표가 On-target인 군; 2) 유전자 편집 효율이 0.1%를 초과하지만, 대조군(Mock)과 현저한 차이가 없는 편집군(Mock군의 2배를 초과하지 않음), 예를 들어 POT-1, POT-7, POT-9, POT-43; 3) 유전자 편집 효율이 0.1%보다 작은 편집군, 즉 군 1) 및 군 2)에 포함된 잠재적 오프 타겟 부위를 제외한 횡축 부위. indel: (insertion and deletion, 삽입 및 결실).
본 발명의 일 양태는 개체에 대한 세포 요법의 적합성을 결정하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 개체에 대한 세포 요법의 적합성을 결정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 개체에게 상기 개체로부터 유래된 유전자 변형 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형된 세포이고, 상기 방법은,
a) 상기 유전자 변형 세포 또는 이의 자손에서 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 각 부위의 유전자 편집의 발생을 결정하는 단계, 및
b) 상기 발생에 기반하여 상기 치료의 적합성을 평가하는 단계를 포함하며,
여기서 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 어느 하나도 유전자 편집이 발생하지 않았다는 것은 상기 세포 요법이 상기 개체에게 적합하다는 것을 나타낸다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 개체에 대한 세포 요법의 불적합성을 결정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 개체에게 상기 개체로부터 유래된 유전자 변형 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형된 세포이며, 상기 방법은,
a) 상기 유전자 변형 세포 또는 이의 자손에서 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 각 부위의 유전자 편집의 발생을 결정하는 단계, 및
b) 상기 발생에 기반하여 상기 치료의 적합성을 평가하는 단계를 포함하며,
여기서 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 어느 하나가 유전자 편집이 발생하였다는 것은 상기 세포 요법이 상기 개체에게 불적합하다는 것을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 상기 유전자 변형 세포는 CRISPR/Cas 시스템을 통해 변형된 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 유전자 변형 세포는 CD34 양성 조혈 줄기 세포/전구 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 타겟 부위는 BCL11A 유전자좌에 위치한다. 일부 실시형태에서, 상기 타겟 부위는 CD34 양성 조혈 줄기 세포/전구 세포의 BCL11A 유전자좌에 위치한다.
본 발명에 사용된 용어 “세포 요법”은 건강한 살아있는 세포, 변형된 살아있는 세포와 같은 살아있는 세포를 개체에 이식하여 병든 세포를 보충, 고갈, 대체 또는 복구함으로써 세포 및 조직의 구조와 기능을 개선하는 치료 방법을 의미한다.
유전자 “변형” 세포는 세포가 유전자 수준에서 변경된 것을 의미하며, 예를 들어 유전자 편집 방법을 통해 세포를 분자 수준에서 변형시켜 세포가 유전자 수준에서 변경되도록 할 수 있다. 유전자 변형된 세포는 또한 세포 수준에서 변경될 수 있으며, 예를 들어 단백질 발현이 증강되거나 억제되고, 세포 기능이 향상되거나 감소된다. 예를 들어, 유전자 편집 방법을 통해 BCL11A 적혈구 인핸서에 대해 유전자 편집을 수행하고, BCL11A 유전자 발현을 하향 조절함으로써, γ 글로빈 및 HbF의 발현에 대한 BCL11A 유전자의 억제를 해소하여, 적혈구 중 γ 글로빈 및 HbF의 발현을 향상시킬 수 있으며, β-지중해빈혈 및 겸상 적혈구 빈혈을 치료할 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 분리된 CD34 양성 조혈 줄기 세포/전구 세포(“CD34 양성 HSPC”)는 유전자 편집 방법, 예를 들어 ZFN, TALEN 또는 CRISPR로부터 선택되는 유전자 편집 기술을 통해 BCL11A 유전자가 파괴되어 BCL11A 기능이 감소된 유전자 변형 세포를 생성할 수 있다.
유전자 변형은 예를 들어 DNA 수준의 유전자 편집 또는 조절을 통해 구현될 수 있다. 예를 들어 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 및 규칙적인 간격으로 나타나는 짧은 회문 구조의 반복 서열(CRISPR) 기술 중 어느 하나의 방법 또는 이들의 조합을 통해 세포에 대해 유전자 변형을 수행할 수 있다.
본 발명에 사용된 “CRISPR” 또는 “CRISPR/Cas” 기술은 유전자 편집 기술로, CRISPR/Cas9 시스템과 같은 자연적으로 발생하거나 인위적으로 설계된 다양한 CRISPR/Cas 시스템을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 자연적으로 발생하는 CRISPR/Cas 시스템(Naturally occurring CRISPR/Cas system)은 장기간 진화 과정에서 박테리아와 고세균에 의해 형성된 적응 면역 방어로, 침입하는 바이러스 및 외인성 DNA를 대항하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, CRISPR/Cas9의 작동 원리는 crRNA(CRISPR-derived RNA)가 염기쌍을 통해 tracrRNA(trans-activating RNA)와 결합하여 tracrRNA/crRNA 복합체를 형성하는 것이며, 이 복합체는 뉴클레아제 Cas9 단백질이 crRNA와 쌍을 이루는 서열 타겟 부위에서 이중 가닥 DNA를 절단하도록 유도한다. tracrRNA 및 crRNA를 인위적으로 설계하여 가이드 작용을 갖는 sgRNA(single guide RNA, 단일 가이드 RNA 또는 가이드 RNA)로 변형시킬 수 있으며, 이는 Cas9에 의한 DNA 부위 특이적 절단을 가이드하기에 충분하다. RNA 유도 dsDNA 결합 단백질로서, Cas9 이펙터 뉴클레아제는 RNA, DNA 및 단백질을 공동 국소화할 수 있으므로, 큰 엔지니어링 잠재력을 갖는다. CRISPR/Cas 시스템은 클래스 I, 클래스 II 또는 클래스 III Cas 단백질을 사용할 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 Cas9를 사용한다. 다른 적합한 CRISPR/Cas 시스템은 WO2013176772, WO2014065596, WO2014018423, US8,697,359, PCT/CN2018/112068, PCT/CN2018/112027에 설명된 시스템 및 방법을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 세포에 대해 유전자 변형을 수행하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 유전자 변형은 “CRISPR” 또는 “CRISPR/Cas” 유전자 편집 기술을 포함한다.
본 발명에 따른 “개체”는 유전자 편집된 자가 세포로 치료를 계획 중이거나 치료를 받고 있거나 치료를 받은 적이 있는 환자 또는 피험자를 의미하며, 여기서 상기 환자 또는 피험자는 β 지중해빈혈 환자, 겸상 적혈구 빈혈 환자 등을 포함한다.
본 발명에서 “오프 타겟” 또는 “오프 타겟 효과”는 기설정된 타겟 부위를 벗어나 변형이 발생한 현상을 의미한다. CRISPR/Cas 유전자 편집 방법의 경우, CRISPR 시스템은 sgRNA와 염색체 사이의 상보적 염기쌍을 통해 인식하기 때문에, 비타겟 부위와 타겟 부위의 서열 유사도가 높을수록 오프 타겟이 발생할 가능성이 높다고 볼 수 있다. 암의 발생과 같은 유전자 요법/세포 요법의 가능한 부작용은 편집하여서는 안되는 유전자 부위를 편집하는 오프 타겟 효과와 관련이 있다고 널리 알려져 있다. 따라서, 유전자 편집 오프 타겟 부위를 예측하고 모니터링하는 것은 유전자 요법/세포 요법의 위험을 줄이는 데 있어서 매우 중요하다.
본 발명에서 “타겟 부위”는 유전자 편집 방법과 같은 유전자 변형 관련 방법을 사용하여 변형된 기설정된 서열 세그먼트를 의미한다. 예를 들어, CRISPR를 이용한 유전자 편집 방법에서 sgRNA는 상보적 염기쌍의 방식을 통해 상기 타겟 부위와 결합하고, Cas 단백질이 상기 타겟 부위에 대해 유전자 변형을 수행하도록 유도할 수 있다. 본 발명에서 “비타겟 부위”는 타겟 부위가 위치한 게놈 중 타겟 부위 이외의 다른 서열 세그먼트를 의미한다. 본 발명에서 “오프 타겟 부위”는 유전자 편집 방법의 사용으로 인해 유전자 변형이 발생한 비타겟 부위를 의미한다. 본 발명에서 “오프 타겟 마커 부위”는 게놈에서 오프 타겟 위험이 있는 비타겟 부위로, 오프 타겟 마커 부위와 타겟 부위는 서열 상에서 매우 유사하며, 이러한 유사성은 오프 타겟 마커 부위의 핵산 서열이 타겟 부위에 대한 유전자 변형 과정에서 쉽게 변경되도록 함으르써, 오프 타겟 마커 부위에서 오프 타겟 효과가 발생하여 오프 타겟 부위를 형성한다. 본 발명에서 “오프 타겟 마커 부위”는 제1 다수의 오프 타겟 마커 부위와 제2 다수의 오프 타겟 마커 부위를 포함한다. 특별한 설명이 없는 한, 본 발명에서 “오프 타겟 마커 부위”와 “잠재적 오프 타겟 부위”는 호환하여 사용될 수 있다.
여기서, “제1 다수의 오프 타겟 마커 부위”는 생물정보학 방법을 통해 타겟 부위와의 서열 유사성에 기반하여 동정된 오프 타겟 마커 부위 그룹을 의미한다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 서열 유사성을 통해 제1 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정할 수 있다. 예를 들어, CRISPR/Cas 유전자 편집 방법의 경우, CRISPR 시스템은 sgRNA와 염색체 사이의 상보적 염기쌍을 통해 인식하기 때문에, 서열 유사도가 높을수록 오프 타겟이 발생할 가능성이 높다고 볼 수 있다. CRISPR 시스템에서, 타겟 부위는 통상적으로 sgRNA에 결합된 영역(통상적으로 19-21 bp, 예를 들어 20 bp) 및 PAM 영역에 의해 공동으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 타겟 부위와 80% 이상(예를 들어 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%)의 서열 유사성(또는 서열 동일성)을 갖는 부위는 오프 타겟 마커 부위로 동정된다. “서열 유사성” 또는 서열 동일성은 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 유사 정도를 의미한다. 서열 유사성은 타겟 뉴클레오티드 서열과 참조 뉴클레오티드 서열 사이의 동일한 뉴클레오티드 잔기의 백분율로 정의될 수 있다. 본 기술분야에 공지된 다양한 방법을 사용하여 뉴클레오티드의 서열 유사성에 대한 측정을 구현할 수 있고, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 사용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용할 수 있다. 당업자는 비교된 서열 전체 길이에 대해 최대 정렬을 구현하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열의 정렬을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
본 발명에서 “제2 다수의 오프 타겟 마커 부위”는 시험관 내 실험 방법을 통해 실제 편집 후 발생하는 변형의 동정에 의해 결정된 오프 타겟 마커 부위 그룹을 의미한다. 일부 실시형태에서, 상기 시험관 내 실험 방법은 임의의 게놈 전체의 편향 없는 오프 타겟 분석 방법(genome-wide unbiased off-target analysis)을 포함한다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 BLESS, GUIDE-seq, HIGTS, Circle-seq, SITE-seq 및 Digenome-seq 중 하나 이상을 포함한다. 여기서, BLESS는 이중 가닥이 파손된 DNA 말단을 비오틴으로 연결한 다음 스트렙타아비딘(streptavidin)으로 농축하고 시퀀싱 및 분석하는 것을 의미하며[Yan WX, Mirzazadeh R, Garnerone S, Scott D, Schneider MW, et al.2017.BLISS is a versatile and quantitative method for genome-wide profiling of DNA double-strand breaks.Nat.Commun.8:150583]; GUIDE-seq는 DNA 이중 가닥 파손 영역에 dsODN(double-stranded oligodeoxynucleotide)을 삽입하여 DSB를 표지하고 시퀀싱 및 분석하는 것을 의미하며[Tsai SQ, Zheng Z, Nguyen NT, Liebers M, Topkar VV, et al.2015.GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.Nat.Biotechnol.33:187-97]; HTGTS는 2개의 이중 가닥 파손 영역을 연결하여 전좌(translocation)로 표지하고 시퀀싱 및 분석하는 것을 의미하며[Frock RL, Hu J, Meyers RM, Ho YJ, Kii E, Alt FW.2015.Genome-wide detection of DNA double stranded breaks induced by engineered nucleases.Nat.Biotechnol.33:179-86]; Circle-seq, SITE-seq 및 Digenome-seq는 시험관 내에서 절단 부위를 표지하고 시퀀싱 및 분석하는 것을 의미한다[6.Tsai SQ, Nguyen NT, Malagon-Lopez J, Topkar VV, Aryee MJ, Joung JK.2017.CIRCLE-seq:a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR-Cas9 nuclease off-targets.Nat.Methods 14:607-14; Cameron P, Fuller CK, Donohoue PD, Jones BN, Thompson MS, et al.2017.Mapping the genomic landscape of CRISPR-Cas9 cleavage.Nat.Methods 14:600-6; Kim D, Bae S, Park J, Kim E, Kim S, et al.2015.Digenome-seq:genome-wide profiling of CRISPRCas9 off-target effects in human cells.Nat.Methods 12:237-43]. 이러한 방법은 대용량 염기 서열 분석(High-throughput sequencing)을 직접 이용하여 Cas 단백질 절단에 의해 생성된 DNA 이중 가닥 파손을 검출하여 오프 타겟 부위를 발견함으로써, 저주파 오프 타겟 부위를 효과적으로 발견할 수 있다.
본 발명에서 “제1 다수의 오프 타겟 마커 부위”와 “제2 다수의 오프 타겟 마커 부위”는 교집합이 있거나 없을 수도 있다.
본 발명에서 “유전자 편집의 발생”은 유전자 편집 방법의 사용으로 인해 타겟 부위 또는 오프 타겟 마커 부위에서 특이적 또는 비특이적 유전자 변형이 발생하는 현상을 의미한다.
본 발명은 유전자 변형 세포 집단 또는 이의 자손에서 오프 타겟 유전자 효과를 평가하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되고, 상기 방법은 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 각 부위의 유전자 편집의 발생을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 1) 상기 타겟 부위와의 서열 유사성에 기반하여 제1 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 방식; 및/또는 2) 시험관 내 실험 방법을 사용하여 제2 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 방식을 통해 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위를 획득한다. 일부 실시형태에서, 상기 결정 단계는 DNA 시퀀싱을 통해 수행된다. 일부 실시형태에서, 상기 결정 단계는 1) 다수의 프라이머 세트를 사용하여 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위를 포함하는 핵산을 증폭하는 단계; 및 2) 증폭된 핵산에 대해 시퀀싱 분석을 수행하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 유전자 변형 세포 집단에서 다수의 오프 타겟 마커 부위를 획득하는 방법을 제공하며, 상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되고, 상기 방법은 1) 상기 타겟 부위와의 서열 유사성에 기반하여 제1 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 단계; 및/또는 2) 시험관 내 실험 방법을 사용하여 제2 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 시험관 내 실험 방법은 BLESS, GUIDE-seq, HIGTS, Circle-seq, SITE-seq 및 Digenome-seq 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 시험관 내 실험 방법은 포화 조건 하에 수행된다. 용어 “포화 조건”은 시험관 내 타겟 부위에서 90%를 초과하는 효과적인 절단을 허용하는 조건을 의미한다. 일부 실시형태에서, 상기 시험관 내 실험 방법은 세포 집단의 게놈을 추출하고 포화 조건 하에 유전자 편집을 수행한다. 일부 실시형태에서, 상기 포화 조건은 상기 세포 집단의 게놈의 타겟 부위에서 적어도 90% 또는 그 이상, 예를 들어 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 의 효과적인 절단을 허용한다.
시퀀싱 과정에서, 예를 들어 딥 시퀀싱 과정에서 일정한 비율의 오류(예를 들어, PCR 과정에서 생성된 것)가 생성되고, 이 오류는 부위와 관련된다(예를 들어, 일부 부위는 PCR에 도움되지 않고, PCR 과정에서 많은 오류가 생성됨). 통상적으로, 대부분의 부위의 경우, 딥 시퀀싱 검출 방법의 검출 한계는 약 0.1%(Nat Rev Genet.2018 May; 19(5):269-285, Next Gener Seq Appl.2014; 1:1000106)로, 즉 유전자 변형 세포 집단에서 약 0.1% 또는 약 0.1%보다 작은 세포만 특정 부위에서 유전자 편집을 거친 경우, 기존의 딥 시퀀싱 검출 방법은 상기 부위의 실제 유전자 변형 비율에 대해 정확한 측정을 수행할 수 없다. 즉, 기존의 딥 시퀀싱 과정의 자체의 오류로 인해 유전자 변형 세포가 전혀 없더라도 기존의 딥 시퀀싱 검출 방법으로 검출된 유전자 변형 세포의 비율은 여전히 0% 내지 0.1%의 값이다. 기존의 딥 시퀀싱 검출 방법은 유전자 변형이 없는 경우와 유전자 변형 비율이 약 0.1%와 같거나 작은 경우를 구별할 수 없다. 따라서, 유전자 편집 효율의 검출 값이 약 0.1%보다 작으면 통상적으로 검출 방법의 배경으로 간주된다. 일부 특수한 부위의 경우, 예를 들어 기본 돌연변이 값이 높은 부위에서 검출 배경 값이 높기 때문에, 통상적으로 현저한 차이가 있는지 여부로 오프 타겟 효과가 있는지 여부를 설명하며, 예를 들어 유전자 편집에 의해 변형되지 않은 대조군 세포에 비해 오프 타겟 마커 부위에 2배 미만의 서열 변화(검출에 따르면 유전자 변형 세포 집단 중의 세포가 상기 오프 타겟 마커 부위에서 유전자 서열 변화가 발생하는 비율 대 유전자 편집에 의해 변형되지 않은 대조군 세포가 상기 오프 타겟 마커 부위에서 유전자 서열 변화가 발생하는 비율의 비율은 2보다 작음)가 있다는 것은 상기 부위에 유전자 편집이 발생하지 않았다는 것으로 간주할 수 있고; 상응하게, 2배(2배 포함)보다 큰 서열 변화는 상기 부위에 유전자 편집이 발생하였다는 것으로 판단할 수 있으며, 이에 대해서는 Maeder, Morgan L., et al.“Development of a gene-editing approach to restore vision loss in Leber congenital amaurosis type 10.”Nature medicine 25.2(2019):229를 참조할 수 있다.
유전자 편집 분야에서 통상적으로 유전자 편집 효율을 모든 효소 작용 부위에서 indel(insertion/deletion)이 발생하는 비율로 정의한다. 예를 들어, 10,000개의 세포에 있는 20,000개의 염색체 세트 중의 특정 부위에 대해 딥 시퀀싱을 200,000회 수행하고, indel이 있는 회수가 100회라면 유전자 편집 효율은 100/20,000=0.05%이다.
본 발명에 따른 방법의 일부 실시형태에서, 상기 유전자 변형 세포는 CD34 양성 조혈 줄기 세포/전구 세포로, 상기 세포의 BCL11A 유전자는 CRISPR/Cas 시스템을 통한 유전자 편집에 의해 변형된다. 본 발명의 일부 실시형태에서, “CRISPR/Cas” 유전자 편집 방법을 통해 BCL11A 인핸서(예를 들어 BCL11A의 발현 또는 기능을 증강시키는 데 영향을 미치는 핵산 서열)를 파괴한다. 상기 BCL11A 인핸서는 예를 들어 Bauer 등, Science[과학], 제342권, 2013, 제253-257페이지에 기재된 내용을 참조할 수 있다. 상기 BCL11A 인핸서의 일 구현예는 BCL11A 유전자의 엑손 2와 엑손 3 사이의 핵산 서열(예를 들어, hg38에 기록된 바와 같이 위치 +55:Chr2:60497676-60498941; +58:Chr2:60494251-60495546; +62:Chr2:60490409-60491734에 위치하거나 대응되는 핵산)이다. 상기 BCL11A 인핸서의 일 구현예는 BCL11A 유전자의 엑손 2와 엑손 3 사이의 핵산 서열의 +62 영역이다. 상기 BCL11A 인핸서의 일 구현예는 BCL11A 유전자의 엑손 2와 엑손 3 사이의 핵산 서열의 +58 영역(BCL11A 유전자 58K부위 150 bp 서열: ctgccagtcctcttctaccccacccacgcccccaccctaatcagaggccaaacccttcctggagcctgtgataaaagcaactgttagcttgcactagactagcttcaaagttgtattgaccctggtgtgttatgtctaagagtagatgcc)(서열번호 2)이다. 일부 실시형태에서, BCL11A 인핸서는 BCL11A 유전자의 엑손 2와 엑손 3 사이의 핵산 서열의 +55 영역이다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 인간의 2번 염색체 제60495197부위내지 제60495346부위의 영역의 BCL11A 유전자를 변형시켜 BCL11A 기능을 감소시킨다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas 기술을 통해 CD34 양성 HSPC 세포를 변형시켜 BCL11A 기능을 감소시킨다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 유전자 편집 기술을 통해 상기 조혈 줄기 세포의 2번 염색체 제60495219부위 내지 제60495336부위의 BCL11A 게놈 영역을 파괴하여 BCL11A 기능을 감소시킨다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 BCL11A 게놈 타겟 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3 ~ 서열번호 25로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 상보적이다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 서열번호 3 ~ 서열번호 25로부터 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 sgRNA를 상기 CD34 양성 조혈 줄기 세포/전구 세포에 도입하여 BCL11A 유전자를 편집함으로써 BCL11A 기능을 감소시킨다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 sgRNA는 2'-O-메틸 유사체 및/또는 뉴클레오티드간 3'티오에 의해 변형된다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 화학적 변형은 상기 sgRNA의 5'말단의 첫 번째, 두 번째 및/또는 세 번째 염기 및/또는 3'말단의 마지막 염기의 2'-O-메틸 유사체 변형이다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 sgRNA와 Cas9 코딩 뉴클레오티드를 상기 CD34 양성 조혈 줄기 세포/전구 세포에 공동 도입한다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 전기천공법을 통해 sgRNA와 Cas9 코딩 뉴클레오티드를 조혈 줄기 세포에 공동 도입한다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 전기천공 조건은 200 ~ 600 V, 0.5 ms ~ 2 ms이다.
본문에 사용된 바와 같이, “BCL11A”는 전사 인자로, 마우스에서 처음 발견되고, 레트로바이러스의 결합 부위로서 Evi9로 명명되며, 나중에는 인간 게놈에서도 발견되고 2번 염색체 단완 2p13 부위에 위치한다.
변형에 의한 BCL11A 기능의 감소는 변형, 예를 들어 유전자 변형, 예를 들어 CRISPR/Cas 시스템 및 방법을 통해 유전자 편집을 수행하여 BCL11A 유전자가 파괴되도록 하는 것을 의미한다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 유전자 변형 타겟 부위는 BCL11A 유전자에서 서열번호 3 ~ 서열번호 25로부터 선택되는 어느 하나의 서열과 상보적인 부위이다.
표 1은 서열번호 3 ~ 서열번호 25로 표시되는 서열 중 어느 하나를 포함하는 sgRNA에 의해 표적화된 인간 염색체 2 상의 게놈 서열 위치 및 각 sgRNA에 의해 개시된 Cas9 절단 부위를 나열하였다.
명칭 인간 게놈 서열 상의 위치 절단 부위
BCL11A의 인핸서-7 chr2:60495203-60495222 chr2:60495219
BCL11A의 인핸서-8 chr2:60495208-60495227 chr2:60495224
BCL11A의 인핸서-9 chr2:60495217-60495236 chr2:60495233
BCL11A의 인핸서-10 chr2:60495218-60495237 chr2:60495234
BCL11A의 인핸서-11 chr2:60495219-60495238 chr2:60495235
BCL11A의 인핸서-14 chr2:60495221-60495240 chr2:60495223
BCL11A의 인핸서-12 chr2:60495222-60495241 chr2:60495238
BCL11A의 인핸서-13 chr2:60495223-60495242 chr2:60495239
BCL11A의 인핸서-15 chr2:60495228-60495247 chr2:60495244
BCL11A의 인핸서-16 chr2:60495229-60495248 chr2:60495245
BCL11A의 인핸서-17 chr2:60495230-60495249 chr2:60495246
BCL11A의 인핸서-18 chr2:60495231-60495250 chr2:60495247
BCL11A의 인핸서-19 chr2:60495234-60495253 chr2:60495250
BCL11A의 인핸서-20 chr2:60495235-60495254 chr2:60495251
BCL11A의 인핸서-2 chr2:60495236-60495255 chr2:60495238
BCL11A의 인핸서-1 chr2:60495247-60495266 chr2:60495263
BCL11A의 인핸서-6 chr2:60495252-60495271 chr2:60495268
BCL11A의 인핸서-5 chr2:60495253-60495272 chr2:60495269
BCL11A의 인핸서-4 chr2:60495257-60495276 chr2:60495273
BCL11A의 인핸서-3 chr2:60495264-60495283 chr2:60495280
BCL11A의 인핸서-22 chr2:60495299-60495318 chr2:60495301
BCL11A의 인핸서-23 chr2:60495319-60495338 chr2:60495335
BCL11A의 인핸서-21 chr2:60495320-60495339 chr2:60495336
서열번호 3: 명칭이 BCL11A의 인핸서-1인 sgRNA(때로는 enhancer-1로 약칭): cacaggctccaggaagggtt
서열번호 4: 명칭이 BCL11A의 인핸서-2인 sgRNA(때로는 enhancer-2로 약칭): atcagaggccaaacccttcc
서열번호 5: 명칭이 BCL11A의 인핸서-3인 sgRNA(때로는 enhancer-3으로 약칭): Ctaacagttgcttttatcac
서열번호 6: 명칭이 BCL11A의 인핸서-4인 sgRNA(때로는 enhancer-4로 약칭): ttgcttttatcacaggctcc
서열번호 7: 명칭이 BCL11A의 인핸서-5인 sgRNA(때로는 enhancer-5로 약칭): ttttatcacaggctccagga
서열번호 8: 명칭이 BCL11A의 인핸서-6인 sgRNA(때로는 enhancer-6으로 약칭): tttatcacaggctccaggaa
서열번호 9: 명칭이 BCL11A의 인핸서-7인 sgRNA(때로는 enhancer-7로 약칭): tgggtggggtagaagaggac
서열번호 10: 명칭이 BCL11A의 인핸서-8인 sgRNA(때로는 enhancer-8로 약칭): gggcgtgggtggggtagaag
서열번호 11: 명칭이 BCL11A의 인핸서-9인 sgRNA(때로는 enhancer-9로 약칭): ttagggtgggggcgtgggtg
서열번호 12: 명칭이 BCL11A의 인핸서-10인 sgRNA(때로는 enhancer-10으로 약칭): attagggtgggggcgtgggt
서열번호 13: 명칭이 BCL11A의 인핸서-11인 sgRNA(때로는 enhancer-11로 약칭): gattagggtgggggcgtggg
서열번호 14: 명칭이 BCL11A의 인핸서-12인 sgRNA(때로는 enhancer-12로 약칭): tctgattagggtgggggcgt
서열번호 15: 명칭이 BCL11A의 인핸서-13인 sgRNA(때로는 enhancer-13으로 약칭): ctctgattagggtgggggcg
서열번호 16: 명칭이 BCL11A의 인핸서-14인 sgRNA(때로는 enhancer-14로 약칭): cacgcccccaccctaatcag
서열번호 17: 명칭이 BCL11A의 인핸서-15인 sgRNA(때로는 enhancer-15로 약칭): ttggcctctgattagggtgg
서열번호 18: 명칭이 BCL11A의 인핸서-16인 sgRNA(때로는 enhancer-16으로 약칭): tttggcctctgattagggtg
서열번호 19: 명칭이 BCL11A의 인핸서-17인 sgRNA(때로는 enhancer-17로 약칭): gtttggcctctgattagggt
서열번호 20: 명칭이 BCL11A의 인핸서-18인 sgRNA(때로는 enhancer-18로 약칭): ggtttggcctctgattaggg
서열번호 21: 명칭이 BCL11A의 인핸서-19인 sgRNA(때로는 enhancer-19로 약칭): aagggtttggcctctgatta
서열번호 22: 명칭이 BCL11A의 인핸서-20인 sgRNA(때로는 enhancer-20으로 약칭): gaagggtttggcctctgatt
서열번호 23: 명칭이 BCL11A의 인핸서-21인 sgRNA(때로는 enhancer-21로 약칭): actcttagacataacacacc
서열번호 24: 명칭이 BCL11A의 인핸서-22인 sgRNA(때로는 enhancer-22로 약칭): cttcaaagttgtattgaccc
서열번호 25: 명칭이 BCL11A의 인핸서-23인 sgRNA(때로는 enhancer-23으로 약칭): ctcttagacataacacacca
상기 23개의 sgRNA의 절단 부위를 분석한 결과, 이러한 sgRNA에 의해 개시된 Cas9 절단 위치가 BCL11A 유전자 제60495219부위 내지 제60495336부위의 게놈 영역에 집중되어 있는 것을 발견하였다.
일반적으로, sgRNA 중의 가이드 서열은 타겟 폴리뉴클레오티드 서열과 충분한 상보성을 가져 타겟 서열과 혼성화하고 CRISPR 복합체가 타겟 서열의 서열에 특이적으로 결합되도록 가이드하는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 실시형태에서, 적절한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬되는 경우, 가이드 서열 및 이의 상응한 타겟 서열 간의 상보성 정도는 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 또는 그 이상이거나 이보다 크다. 최적의 정렬은 서열을 정렬하기 위한 임의의 적절한 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있으며, 이의 비제한적인 구현예는 Smith-Waterman 알고리즘, Needleman-Wimsch 알고리즘, Burrows-Wheeler Transform 기반의 알고리즘(예를 들어, Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustai X, BLAT, Novoalign(Novocraft Technologies), ELAND(Illumina, San Diego, CA), SOAP(soap.genomics.org.cn에서 획득할 수 있음) 및 Maq(maq.sourceforge.net에서 획득할 수 있음)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열의 길이는 약 19 ~ 21, 예를 들어 19 bp, 20 bp, 21 bp이다.
본 발명의 일 양태는 개체에 대한 세포 요법의 적합성을 결정하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 개체에 대한 세포 요법의 적합성을 결정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 개체에게 상기 개체로부터 유래된 유전자 변형 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되고, 상기 방법은,
a) 상기 유전자 변형 세포 또는 이의 자손에서 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 각 부위의 유전자 편집의 발생을 결정하는 단계, 및
b) 상기 발생에 기반하여 상기 치료의 적합성을 평가하는 단계를 포함하며,
여기서 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 어느 하나도 유전자 편집이 발생하지 않았다는 것은 상기 세포 요법이 상기 개체에게 적합하다는 것을 나타낸다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 개체에 대한 세포 요법의 불적합성을 결정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 개체에게 상기 개체로부터 유래된 유전자 변형 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되고, 상기 방법은,
a) 상기 유전자 변형 세포 또는 이의 자손에서 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 각 부위의 유전자 편집의 발생을 결정하는 단계, 및
b) 상기 발생에 기반하여 상기 치료의 적합성을 평가하는 단계를 포함하며,
여기서 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 어느 하나가 유전자 편집이 발생하였다는 것은 상기 세포 요법이 상기 개체에게 불적합하다는 것을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 상기 유전자 변형 세포의 자손은 세포 분열 후 상기 유전자 변형 세포의 딸세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 유전자 변형 세포의 자손은 유전자 변형 세포 분화 후의 딸세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 유전자 변형 세포는 유전자 변형된 조혈 줄기 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 유전자 변형 세포의 자손은 유전자 변형된 조혈 줄기 세포의 분화된 자손이다.
“조혈 줄기 세포”는 활발한 증식 잠재력, 다방향 분화 능력 및 자가 재생 능력을 갖는 세포 집단을 의미한다. 조혈 줄기 세포는 다양한 혈액 세포를 분화 및 보충할 수 있을 뿐만 아니라 자가 재생을 통해 줄기 세포의 특성 및 개수를 유지할 수 있다. 조혈 줄기 세포의 분화 정도 및 증식 능력은 다르고 이질적이다. 다능성 조혈 줄기 세포는 가장 원시적이며, 먼저 골수, 적혈구, 단핵구 및 거핵구-혈소판 계통을 생성할 수 있는 골수 조혈 줄기 세포 및 B 림프구와 T 림프구를 생성할 수 있는 림프 줄기 세포와 같은 위탁 다능성 조혈 줄기 세포로 분화된다. 이 두 가지 줄기 세포는 조혈 줄기 세포의 기본 특성을 유지할 뿐만 아니라 약간 분화되어 각각 “골수 성분”과 림프구의 생성을 담당하기 때문에, 위탁 다능성 조혈 줄기 세포라고 한다. 이들은 조혈 전구 세포로 더 분화되는데, 이 세포도 원시적인 혈액 세포이지만 다방향 분화 능력과 같은 조혈 줄기 세포의 많은 기본 특성을 상실하고, 1차 또는 밀접하게 관련된 2차 세포로만 분화될 수 있으며; 반복되는 자가 재생 능력을 상실하여, 조혈 줄기 세포의 증식 및 분화에 의존하여 개수를 보충해야 하고; 증식 잠재력이 제한되어 몇 번만 분열될 수 있다. 조혈 전구 세포는 분화 가능한 혈액 세포주의 개수에 따라 단능성 조혈 전구 세포(하나의 혈액 세포주로만 분화됨) 및 oligopotent 조혈 전구 세포(2 ~ 3개의 혈액 세포주로 분화될 수 있음)로 나뉠 수 있다. 본 발명에서 용어 “조혈 줄기 세포/전구 세포” 및 “조혈 줄기 세포”는 호환하여 사용될 수 있고, 다능성 조혈 줄기 세포, 위탁 다능성 조혈 줄기 세포 및 조혈 전구 세포를 포함하며, 이질성을 갖는 조혈 줄기 세포의 총칭이다.
일부 실시형태에서, 상기 방법에 따른 유전자 변형 세포는 유전자 변형된 CD34 양성 조혈 줄기 세포/전구 세포이다. 유세포 분석 및 형광 표지 항 CD34 항체를 사용하여 CD34 양성 조혈 줄기 세포/전구 세포를 검출 및 계수할 수 있다.
구체적인 실시형태에서, CD34 양성 조혈 줄기 세포/전구 세포는 조혈 유래 세포를 포함하는 유기체(개체)로부터 분리되거나 획득된다. “분리”는 원시적인 환경으로부터 추출해내는 것을 의미한다. 예를 들어, 세포가 자연 상태에서 통상적으로 수반되는 이의 일부 또는 모든 구성요소와 분리되는 경우 이는 분리된 것이다.
조혈 줄기 세포/전구 세포는 대퇴골, 관골, 늑골, 흉골 및 다른 골격을 포함하는 성인의 미분획 또는 분획된 골수에서 획득되거나 분리될 수 있다. 조혈 줄기 세포 및 전구 세포는 바늘과 주사기를 이용하여 관골에서 직접 획득 또는 분리하거나 또는 혈액에서 획득할 수 있으며, 통상적으로 G-CSF(과립구 집락 자극 인자)와 같은 조혈 줄기 세포 동원제의 전처리 후 혈액에서 획득할 수 있다. 조혈 줄기 세포 및 전구 세포의 다른 유래에는 제대혈, 태반혈 및 동원된 개체의 말초혈액이 포함된다.
개체(예를 들어, 골수 또는 말초혈액)에서 세포 집단을 분리하여 획득한 다음 추가로 정제하여 CD34 양성 조혈 줄기 세포/전구 세포를 획득할 수 있다. 예를 들어 면역화하여 분리된 세포 집단 중의 성숙한 계통의 위탁 세포를 제거할 수 있고, 예를 들어 “계통” 항원(예를 들어 CD2, CD3, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD56, CD123 및 CD235a) 그룹에 결합하는 항체를 사용하여 고체 매트릭스를 표지한 다음, CD34 양성 항원에 결합하는 항체를 사용하여 원시 조혈 줄기 세포 및 전구 세포를 분리한다. 다양한 세포 유래에서 조혈 줄기 세포 및 전구 세포를 정제하기 위한 키트는 상업적으로 획득할 수 있다.
본 발명의 일부 구체적인 실시형태에서, 상기 유전자 변형 세포는 분리된 CD34 양성 조혈 줄기 세포/전구 세포로, CRISPR 기술과 같은 유전자 편집 방법 통해 BCL11A 유전자의 세포를 파괴한다.
세포 “분화”는 동일한 유래의 세포가 형태학적 구조, 기능적 특성이 다른 세포 집단을 점진적으로 생성하는 과정을 의미한다.
조혈 줄기 세포로부터 적혈구의 “분화”는 조혈 줄기 세포 단계, 적혈구 전구 세포 단계, 적혈구 전구체 세포(초기 적혈구에서 후기 적혈구)의 증식 및 분화 단계, 망상적혈구의 증식 및 성숙 과정, 및 망상적혈구가 말초혈액으로 방출되어 적혈구로 성숙하는 단계를 포함한다. 조혈 줄기 세포 단계: 현재 조혈 줄기 세포는 주로 골수, 비장, 간 등의 조혈 조직 내에 존재하는 것으로 알려져있다. 소량은 말초혈액으로도 순환한다. 적혈구 전구 세포 단계: 적혈구 전구 세포(progenitor cell) 단계에서 세포는 조혈 줄기 세포와 적혈구 전구체 세포 사이에 위치하는 세포 집단이다. 조혈 줄기 세포는 골수 조혈 미세 환경의 영향 하에 적혈구 전구 세포로 분화된다. 조혈 미세 환경에는 미세 혈관 시스템, 신경계 및 조혈 기질 등 부분이 포함된다. 체액성 인자 및 사이토카인을 통해 조혈 줄기 세포의 분화에 특별한 작용과 영향을 미친다. 적혈구 전구체 세포 단계는 전적아구, 호염기성적아구, 다염성적아구, 정염성적아구 및 망상적혈구 단계를 포함하여 성숙적혈구에 도달한다.
세포 성숙 과정은 헤모글로빈의 증가 및 세포핵 활성의 감쇠 과정이다. 세포가 성숙됨에 따라 유핵 적혈구 중의 헤모글로빈의 함량은 부단히 증가하고 RNA의 함량은 부단히 감소한다. 적혈구 내 헤모글로빈의 증가는 세포핵의 활성을 잃게 하여 DNA 또는 RNA을 합성할 수 없도록 한다. 실험을 통해 이는 헤모글로빈이 핵막간극을 통해 핵으로 들어가 뉴클레오히스톤(nucleohistones)에 작용함으로써 염색체의 비활성화를 일으켜 핵응축을 촉진하기 때문임을 증명하였다. 정염성적아구는 계속 분열하는 능력을 상실하고, 그 후 세포핵이 농축되어 빠져나와 단핵 대식 세포에 의해 포식되거나 비장에서 분열 및 용해되어 핵 없는 망상적혈구로 된다. 성숙적혈구 단계에서는 헤모글로빈을 더 이상 합성하지 않는다. 세포 내 헤모글로빈 농도의 증가가 세포핵의 활성을 잃게 한다는 이론에 따르면, 적혈구 성숙 과정에서 분열 회수 및 세포의 최종 크기는 헤모글로빈의 합성 속도와 일정한 관련이 있다. 세포가 성숙됨에 따라 적혈구 세포의 직경은 점차 감소되고 세포의 부피도 점차 감소된다. 이는 헤모글로빈, 매트릭스 단백질 및 다양한 효소를 합성하는 세포 내 일부 세포소기관(예를 들어 미토콘드리아, 골지체, 폴리솜)이 점차 감소되고 세포소기관이 점차 퇴화되어 사라지기 때문이다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 유전자 변형 세포의 자손은 조혈 줄기 세포의 분화된 자손으로, 예를 들어 말초혈액에서 다양한 분화 단계에 있는 유핵 적혈구, 예를 들어 호염기성적아구, 다염성적아구, 정염성적아구이다.
본 발명의 일 양태는 개체의 치료 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 세포 요법을 제공하고, 상기 방법은 1) 개체에 대한 세포 요법의 적합성을 결정하는 단계, 및 2) 세포 요법에 적합한 개체에게 상기 개체로부터 유래된 유전자 변형 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되고, 상기 개체에 대한 세포 요법의 적합성을 결정하는 단계는,
a) 상기 유전자 변형 세포 또는 이의 자손에서 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 각 부위의 유전자 편집의 발생을 결정하는 단계, 및
b) 상기 발생에 기반하여 상기 치료의 적합성을 평가하는 단계를 포함하며,
여기서 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 어느 하나도 유전자 편집이 발생하지 않았다는 것은 상기 세포 요법이 상기 개체에게 적합하다는 것을 나타낸다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 유전자 편집으로 변형된 세포 집단은 개체에 투여하기 전에 생체 외 또는 시험관 내에서 증식되지 않는다. 구체적인 실시형태에서, 상기 유전자 편집으로 변형된 세포를 세척하여 처리 시약을 제거하고, 생체 외 증식없이 환자에게 투여할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자 편집으로 변형된 세포가 임의의 유의한 생체 외 세포 분열이 일어나기 전 또는 임의의 유의한 생체 외 세포 분열에 필요한 시간 이전에 환자에게 투여한다. 일부 실시형태에서, 유전자 편집으로 변형된 세포는 변형 후 1일 이상 배양 후 개인에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 변형된 세포는 변형 후 2, 4, 6, 12, 24, 48시간 이내에 환자에게 투여된다.
일부 실시형태에서, 변형된 세포를 개체에게 투여하기 전에, 변형된 세포를 동결 조건 하에 적어도 24시간 동안 저장한다. 일부 실시형태에서, 동결 조건 하에 저장하기 전에, 변형된 세포를 1일 이상 배양한다. 변형된 세포는 세포 생존력을 유지하는 사이토카인이 첨가된 무혈청 기본 배지에서 1일 이상(예를 들어, 1일 ~ 3일) 배양될 수 있다.
일부 실시형태에서, 정맥 주사를 통해 상기 변형된 세포를 투여하는데, 예를 들어 주 1회, 2주에 1회, 3주에 1회, 월 1회 또는 2개월에 1회씩 상기 변형된 세포를 투여한다. 투여된 세포 수는 예를 들어 체중 1 kg 당 약 2×105 ~ 2×107개의 세포이다.
본문에 사용된 바와 같이 용어 “치료”는 질환 증상의 개선 또는 제거를 구현하는 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 필요한 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 획득하는 것을 의미한다. 효과는 질환 또는 그 증상을 전체적으로 또는 부분적으로 예방하는 것으로 나타내는 예방적인 것일 수 있거나; 및/또는 효과는 증상의 개선 또는 제거를 구현하거나 질환 및/또는 질환에 기인하는 불리한 영향에 대해 부분적 또는 완전한 치유를 제공하는 것으로 나타내는 치료적인 것일 수 있다. 본문에 사용된 바와 같이 “치료”는 포유동물, 특히는 인간의 질환에 대한 임의의 치료를 포함하고, (a) 개체 발병의 차단; (b) 질환의 억제, 즉 질환의 진행의 차단; (c) 질환의 완화, 예를 들어 질환의 경감, 예를 들어 질환의 증상에 대한 전체적 또는 부분적인 제거; 및 (d) 개체에 대한 질환 전 상태의 회복, 예를 들어 조혈 시스템의 재건을 포함한다. 본 발명에서, “치료”는 질환 또는 질환 상태 또는 이와 관련된 증상의 완전한 근절 또는 치유를 반드시 의미하는 것이 아니며, 질환 또는 질환 상태의 하나 이상의 측정 가능한 표상의 임의의 최소 정도의 개선 또는 완화를 포함한다. 상기 구체적인 방법에서, 치료는 조혈 재건에 의한 개선 또는 개체의 생존을 포함한다.
본 발명의 일 양태는 개체 유전자 편집 세포 요법을 수반하여 오프 타겟 여부를 진단하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 a) 상기 개체에게 상기 개체로부터 유래된 유전자 변형 세포 집단을 투여하되, 상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되는 단계, 및
b) 상기 유전자 변형 세포 또는 이의 자손에서 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 각 부위의 유전자 편집의 발생을 결정하는 단계를 포함하며,
여기서 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 어느 하나도 유전자 편집이 발생하지 않았다는 것은 상기 세포 요법에 오프 타겟이 나타나지 않았다는 것을 나타낸다.
본 발명의 일 양태는 유전자 편집 세포 요법의 효과를 모니터링하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 a) 상기 개체에게 상기 개체로부터 유래된 유전자 변형 세포 집단을 투여하되, 상기 유전자 변형 세포是 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되는 단계, 및
b) 상기 유전자 변형 세포 또는 이의 자손에서 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 각 부위의 유전자 편집의 발생을 결정하는 단계를 포함하며,
여기서 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 어느 하나도 유전자 편집이 발생하지 않았다는 것은 상기 개체에 대한 상기 세포 요법의 치료 효과가 좋다는 것을 나타낸다.
본 발명의 일 양태는 어느 개체로부터 유래된 유전자 변형 세포 제품의 품질 관리 방법을 제공하고, 상기 방법은 a)다수의 오프 타겟 마커 부위 중 각 부위에서 상기 유전자 변형 세포의 유전자 편집의 발생을 결정하는 단계를 포함하며,
여기서 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 어느 하나도 유전자 편집이 발생하지 않았다는 것은 상기 세포 제품이 상기 개체의 세포 치료에 사용하기 적합하다는 것을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 개체에게 상기 유전자 변형 세포 제품을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 양태는 유전자 편집 세포 요법을 받는 개체에게 개입 요법이 필요한지 여부를 결정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 a) 상기 개체에게 상기 개체로부터 유래된 유전자 변형 세포 집단을 투여하되, 상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되는 단계, 및
b) 상기 유전자 변형 세포 또는 이의 자손에서 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 각 부위의 유전자 편집의 발생을 결정하는 단계를 포함하며,
여기서 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 어느 하나가 유전자 편집이 발생하였다는 것은 유전자 편집 세포 요법을 받는 개체에게 개입 요법이 필요하다는 것을 나타낸다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 유전자 변형 세포를 투여하기 전에 상기 유전자 변형 세포에 대해 상기 결정 단계를 수행하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 개체에게 상기 유전자 변형 세포를 투여하는 단계를 더 포함한다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 유전자 변형 세포를 투여한 후 상기 유전자 변형 세포의 자손에 대해 상기 결정 단계를 수행하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 결정 단계는 상기 유전자 변형 세포를 투여한 후 적어도 약 1개월, 예를 들어 적어도 30일, 40일, 50일, 60일 후에 수행된다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 결정 및 평가 단계를 1회 이상, 예를 들어 2회, 3회, 4회, 5회 또는 그 이상 반복하는 단계를 더 포함한다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 결정 및 평가 단계는 약 월 1회 내지 약 연 1회의 빈도, 예를 들어 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월, 약 12개월에 한 번의 빈도로 반복한다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 평가 단계 후 개입 요법으로 상기 개체를 치료하는 단계를 더 포함한다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 개입 요법은 투여된 유전자 변형 세포 집단을 제거하는 것이며, 골수 제거 및/또는 림프구 제거 치료를 포함한다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 개입 요법은 화학 요법, 단클론 항체 요법 또는 전신 방사선 조사를 포함한다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 화학 요법은 상기 개체에게 부설판, 시클로포스파미드 및 플루다라빈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화학 치료제를 투여하는 것을 포함한다. 상기 방법의 일부 실시형태에서, 상기 개입 요법은 상기 개체로부터 유래된 제2 유전자 변형 세포 집단을 투여하는 것이다.
본 발명의 방법을 통해 10 ~ 50개, 10 ~ 45개, 10 ~ 40개, 10 ~ 35개, 10 ~ 30개, 10 ~ 25개, 10 ~ 20개, 10 ~ 15개의 오프 타겟 마커 부위와 같이 오프 타겟이 발생할 가능성이 가장 높은 부위를 예측한 다음, 오프 타겟 반응의 발생을 모니터링한다. 오프 타겟 반응이 발생하면 상기 부위가 편집되는 비율이 변경되는지 여부를 결정한다. 특정 부위에 오프 타겟 현상이 있는 것이 분명하지만 상기 부위가 편집되는 비율이 변경되지 않거나 감소된 경우, 상기 부위에 오프 타겟 효과가 발생한 것이 분명하지만 세포 증식(암발생)을 유발하는 위험이 없음을 나타낸다. 상기 경우 개입 요법을 사용하지 않을 수 있다. 하나의 부위에 오프 타겟이 발생한 것이 분명하고, 시간이 지남(지속적인 검출)에 따라 상기 부위가 편집되는 비율이 상승하는 것을 발견하는 경우, 상기 오프 타겟에 세포 증식(암발생)을 유발하는 위험이 있음을 나타낸다. 이때 상기 암발생에 대한 개입 요법을 고려해야 한다. 예를 들어 암을 치료하는 화학요법제를 투여한다. 암 치료를 위한 다양한 화학요법제는 본 기술분야에 공지된 것이다.
본 발명은 또한 유전자 변형 세포 집단 또는 이의 자손의 오프 타겟 편집을 평가하기 위한 키트에 관한 것이며, 여기서 상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되고, 상기 키트는 1) 상기 유전자 변형 세포를 생성하기 위한 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 구성요소; 및 2) 다수의 오프 타겟 마커 부위를 포함하는 핵산을 증폭하기 위한 다수의 프라이머 세트를 포함한다.
상기 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, 유전자 편집의 방법 또는 시스템은 ZFN, TALEN, CRISPR 또는 다른 유전자 편집 방법 또는 시스템으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 유전자 편집 방법 또는 시스템은 CRISPR 유전자 편집 방법 또는 시스템이다. 일부 실시형태에서, 상기 타겟 부위는 CD34 양성 조혈 줄기 세포/전구 세포 중의 BCL11A 유전자 부위이다. 상기 방법 및 키트의 일부 실시형태에서, 상기 타겟 부위는 BCL11A 인핸서 유전자의 엑손 2와 엑손 3 사이의 뉴클레오티드 부위(예를 들어 hg38에 기록된 바와 같이 위치 +55:Chr2:60497676-60498941; +58:Chr2:60494251-60495546; +62:Chr2:60490409-60491734에 위치하거나 대응되는 부위)이다. 상기 타겟 부위는 예를 들어 BCL11A 유전자의 엑손 2와 엑손 3 사이의 핵산 서열의 +62 영역, BCL11A 유전자의 엑손 2와 엑손 3 사이의 핵산 서열의 +58 영역, 또는 BCL11A 유전자의 엑손 2와 엑손 3 사이의 핵산 서열의 +55 영역, 하기 뉴클레오티드 서열로 표시되는 뉴클레오티드 영역: ctgccagtcctcttctaccccacccacgcccccaccctaatcagaggccaaacccttcctggagcctgtgataaaagcaactgttagcttgcactagactagcttcaaagttgtattgaccctggtgtgttatgtctaagagtagatgcc(서열번호 2)이다. 상기 키트의 일부 실시형태에서, 키트는 상기 타겟 부위를 표적화하는 sgRNA, 또는 상기 sgRNA를 포함하는 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 sgRNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 키트는 서열번호 2로 표시되는 서열을 표적화하는 sgRNA, 또는 상기 sgRNA를 포함하는 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 sgRNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 키트는 인간 2번 염색체 제60495197부위 내지 제60495346부위 영역의 BCL11A 유전자를 표적화하는 sgRNA, 또는 상기 sgRNA를 포함하는 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 sgRNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 키트는 인간 조혈 줄시 세포 중 2번 염색체 제60495219부위 내지 제60495336부위의 BCL11A 게놈 영역을 표적화하는 sgRNA, 또는 상기 sgRNA를 포함하는 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 sgRNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 sgRNA의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3 ~ 서열번호 25로부터 선택되는 하나 이상의 서열이다. 일부 실시형태에서, 상기 키트는 또한 Cas 단백질(예를 들어, Cas9 단백질), 또는 상기 Cas 단백질(예를 들어, Cas9 단백질)을 코딩하는 발현 벡터, 또는 Cas 단백질(예를 들어, Cas9 단백질)을 코딩 또는 발현하는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, mRNA 서열)을 포함한다. 상기 키트의 일부 실시형태에서, 상기 키트는 하기와 같이 표시되는 Cas9 핵산 서열을 포함한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
상기 방법의 일부 실시형태에서, 서열번호 3 ~ 서열번호 25로부터 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 sgRNA를 상기 CD34 양성 조혈 줄기 세포/전구 세포에 도입하여 BCL11A 유전자를 편집함으로써 BCL11A 기능을 제거 또는 감소시킨다. 상기 키트의 일부 실시형태에서, 상기 sgRNA는 2'-O-메틸 유사체 및/또는 뉴클레오티드간 3'티오에 의해 변형된다. 상기 키트의 일부 실시형태에서, 상기 화학적 변형은 상기 sgRNA의 5'말단의 첫 번째, 두 번째 및/또는 세 번째 염기 및/또는 3'말단의 마지막 염기의 2'-O-메틸 유사체 변형이다. 상기 키트의 일부 실시형태에서, 상기 sgRNA와 Cas9 코딩 뉴클레오티드를 상기 CD34 양성 조혈 줄기 세포/전구 세포에 공동 도입한다.
상기 키트의 일부 실시형태에서, 상기 키트는 다수의 오프 타겟 마커 부위를 포함하는 핵산을 증폭하기 위한 다수의 프라이머 세트를 포함한다. 상기 키트의 일부 실시형태에서, 상기 프라이머 세트는 표 3으로부터 선택된다. 서열 순서 번호는 서열번호 26 ~ 117이다.
상기 방법 및 키트의 실시형태에서, 상기 오프 타겟 마커 부위는 표 2로부터 선택되는 하나 이상이다.
이하, 구체적인 실시예를 결부하여 본 발명을 더 설명한다. 이러한 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다. 하기 실시예에서 구체적인 조건을 제시하지 않은 실험 방법은 통상적으로 일반적인 조건에 따른 조건을 따르거나, 또는 제조업체에서 권장하는 조건을 따른다. 하기 실시예에 사용된 실험 재료 및 시약은 특별한 설명이 없는 한 상업적인 경로를 통해 획득될 수 있다.
본 발명은 하기 실시형태에 관한 것이다.
1. 개체에 대한 세포 요법의 적합성을 결정하는 방법으로서, 상기 개체에게 상기 개체로부터 유래된 유전자 변형 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되고,
상기 방법은,
a) 상기 유전자 변형 세포 또는 이의 자손에서 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 각 부위의 유전자 편집의 발생을 결정하는 단계, 및
b) 상기 유전자 편집의 발생에 기반하여 상기 치료의 적합성을 평가하는 단계를 포함하며,
여기서 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 어느 하나도 유전자 편집이 발생하지 않았다는 것은 상기 세포 요법이 상기 개체에게 적합하다는 것을 나타낸다.
2. 실시형태 1의 방법에서, 상기 유전자 변형 세포를 투여하기 전에 상기 유전자 변형 세포에 대해 상기 결정 단계를 수행한다.
3. 실시형태 2의 방법에서, 상기 방법은 상기 개체에게 상기 유전자 변형 세포를 투여하는 단계를 더 포함한다.
4. 실시형태 1의 방법에서, 상기 유전자 변형 세포를 투여한 후 상기 유전자 변형 세포의 자손에 대해 상기 결정 단계를 수행한다.
5. 실시형태 4의 방법에서, 상기 결정 단계는 상기 유전자 변형 세포를 투여한 후 적어도 약 한 달 후에 수행되며, 예를 들어 상기 유전자 변형 세포를 투여한 후 1개월, 1.5개월, 2개월, 2.5개월 후에 수행된다.
6. 실시형태 4 또는 5의 방법에서, 상기 결정 및 평가 단계를 1회 이상 반복하는 단계를 더 포함한다.
7. 실시형태 6의 방법에서, 상기 결정 및 평가 단계는 약 월 1회 내지 약 연 1회의 빈도, 예를 들어 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월, 약 12개월에 한 번의 빈도로 반복한다.
8. 실시형태 7의 방법에서, 오프 타겟 마커 부위의 서열 변화가 0.1%보다 작거나 또는 오프 타겟 마커 부위의 서열 변화가 유전자 편집에 의해 변형되지 않은 대조군 세포에 비해 2배 미만이면, 3 ~ 12개월마다 상기 결정 및 평가 단계를 반복하고(예를 들어, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월, 약 12개월에 한 번의 빈도로 반복); 오프 타겟 마커 부위의 서열 변화가 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%보다 크거나, 또는 오프 타겟 마커 부위의 서열 변화가 유전자 편집에 의해 변형되지 않은 대조군 세포에 비해 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 초과이면, 서열 변화 빈도가 증가함에 따라 상기 결정 및 평가 단계를 반복하는 빈도(예를 들어 세 달에 한 번에서 두 달에 한 번 또는 한 달에 한 번 또는 반달에 한 번으로 증가함)를 증가하여, 오프 타겟 마커 부위의 유전자 편집의 빈도 및 암발생의 위험을 면밀히 모니터링한다. 오프 타겟 마커 부위의 유전자 편집의 빈도가 클수록 암발생의 위험이 높다는 것을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 오프 타겟 마커 부위의 유전자 편집의 빈도를 모니터링하는 동시에 다른 임상 검사 수단을 결부하여 암발생을 모니터링하고 적시에 개입 치료를 수행한다.
9. 실시형태 5 ~ 8 중 어느 하나에 따른 방법에서, 상기 방법은 상기 평가 단계 후 개입 요법으로 상기 개체를 치료하는 단계를 더 포함하며, 예를 들어 골수 제거 및/또는 림프구 제거 치료, 화학 요법(예를 들어, 상기 개체에게 부설판, 시클로포스파미드 및 플루다라빈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화학 치료제를 투여하는 것), 단클론 항체 요법 또는 전신 방사선 조사이다.
10. 실시형태 9의 방법에서, 상기 개입 요법은 상기 개체에게 투여된 상기 개체로부터 유래된 유전자 변형 세포 집단을 제거하는 것이다.
11. 실시형태 9 또는 10의 방법에서, 상기 개입 요법은 상기 개체로부터 유래된 제2 유전자 변형 세포 집단(투여된 유전자 변형 세포 집단과 다른 유전자 변형 세포 집단)을 투여하는 것을 포함한다.
12. 실시형태 1 ~ 11 중 어느 하나에 따른 방법에서, 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위는 적어도 약 10개의 오프 타겟 마커 부위를 포함한다.
13. 실시형태 1 ~ 12 중 어느 하나에 따른 방법에서, 오프 타겟 마커 부위에 0.1%보다 작은 서열 변화가 있거나 또는 유전자 편집에 의해 변형되지 않은 대조군 세포에 비해 오프 타겟 마커 부위에 2배 미만의 서열 변화가 있다는 것은, 상기 오프 타겟 마커 부위에 유전자 편집이 발생하지 않았다는 것을 나타낸다.
14. 실시형태 1 ~ 13 중 어느 하나에 따른 방법에서, 상기 결정 단계는 DNA 시퀀싱을 통해 수행된다.
15. 실시형태 14에 따른 방법에서, 상기 결정 단계는 1) 다수의 프라이머 세트를 사용하여 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위를 포함하는 핵산을 증폭하는 단계; 및 2) 증폭된 핵산에 대해 시퀀싱 분석을 수행하는 단계를 포함한다.
16. 실시형태 1 ~ 15 중 어느 하나에 따른 방법에서, 상기 시험관 내 실험 방법은 BLESS, GUIDE-seq, HIGTS, Circle-seq, SITE-seq 및 Digenome-seq 중 하나 이상을 포함한다.
17. 실시형태 1 ~ 16 중 어느 하나에 따른 방법에서, 상기 시험관 내 실험 방법은 포화 조건 하에 수행된다.
18. 실시형태 1 ~ 17 중 어느 하나에 따른 방법에서, 상기 포화 조건은 상기 타겟 부위에서 90% 이상의 효과적인 절단을 허용한다.
19. 실시형태 18에 따른 방법에서, 상기 포화 조건은 상기 타겟 부위에서 100%의 효과적인 절단을 허용한다.
20. 실시형태 1 ~ 19 중 어느 하나에 따른 방법에서, 상기 유전자 변형 세포는 CRISPR/Cas 시스템을 통해 변형된다.
21. 실시형태 1 ~ 20 중 어느 하나에 따른 방법에서, 상기 타겟 부위는 BCL11A 유전자좌에 위치한다.
22. 실시형태 21의 방법에서, 상기 오프 타겟 마커 부위는 표 2에 나타낸 부위 중의 하나 이상이다.
23. 유전자 변형 세포 집단 또는 이의 자손에서 오프 타겟 유전자 편집을 평가하는 방법으로서, 상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되고, 상기 방법은 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 각 부위의 유전자 편집의 발생을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 1) 상기 타겟 부위와의 서열 유사성에 기반하여 제1 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 방식; 및/또는 2) 시험관 내 실험 방법을 사용하여 제2 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 방식을 통해 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위를 획득하고, 여기서 오프 타겟 마커 부위에 0.1%보다 큰 서열 변화가 있거나 또는 유전자 편집에 의해 변형되지 않은 대조군 세포에 비해 오프 타겟 마커 부위에 2배 초과의 서열 변화가 있다는 것은, 유전자 변형 세포 집단 또는 이의 자손에 오프 타겟 유전자 편집이 있다는 것을 나타낸다.
24. 실시형태 23의 방법에서, 상기 결정 단계는 DNA 시퀀싱을 통해 수행된다.
25. 실시형태 24에 따른 방법에서, 상기 결정 단계는 1) 다수의 프라이머 세트를 사용하여 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위를 포함하는 핵산을 증폭하는 단계; 및 2) 증폭된 핵산에 대해 시퀀싱 분석을 수행하는 단계를 포함한다.
26. 유전자 변형 세포 집단에서 다수의 오프 타겟 마커 부위를 획득하는 방법으로서, 상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되고, 오프 타겟 마커 부위를 획득하는 상기 방법은 1) 상기 타겟 부위와의 서열 유사성에 기반하여 제1 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 단계; 및 2) 시험관 내 실험 방법을 사용하여 제2 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 단계를 포함한다.
27. 실시형태 23 ~ 26 중 어느 하나에 따른 방법에서, 상기 시험관 내 실험 방법은 BLESS, GUIDE-seq, HIGTS, Circle-seq, SITE-seq 및 Digenome-seq 중 하나 이상을 포함한다.
28. 실시형태 23 ~ 27 중 어느 하나에 따른 방법에서, 상기 시험관 내 실험 방법은 포화 조건 하에 수행된다.
29. 실시형태 28에 따른 방법에서, 상기 포화 조건은 상기 타겟 부위에서 90% 이상, 예를 들어 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상, 또는 100%의 효과적인 절단을 허용한다.
30. 실시형태 23 ~ 29 중 어느 하나에 따른 방법에서, 상기 유전자 변형 세포는 CRISPR/Cas 시스템을 통해 변형된다.
31. 유전자 변형 세포 집단 또는 이의 자손의 오프 타겟 편집을 평가하기 위한 키트로서, 상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되고, 상기 키트는 1) 상기 유전자 변형 세포를 생성하기 위한 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 구성요소; 및 2) 다수의 오프 타겟 마커 부위를 포함하는 핵산을 증폭하기 위한 다수의 프라이머 세트를 포함한다.
32. 실시형태 31의 키트에서, 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위는 1) 상기 타겟 부위와의 서열 유사성에 기반하여 제1 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 방식; 및/또는 2) 시험관 내 실험 방법을 사용하여 제2 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 방식을 통해 획득된다.
33. 실시형태 31 ~ 32 중 어느 하나에 따른 키트에서, 상기 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas9 시스템이다.
34. 실시형태 31 ~ 33 중 어느 하나에 따른 키트에서, 상기 타겟 부위를 포함하는 핵산을 증폭하기 위한 하나 이상의 프라이머 세트를 더 포함한다.
35. 실시형태 34의 키트에서, 상기 하나 이상의 프라이머 세트는 서열번호 26 ~ 117 중 하나 이상을 포함한다.
한편, 본 발명은 하기 기술적 해결수단에 관한 것이다.
1. 유전자 변형 세포 집단 또는 이의 자손에서 오프 타겟 유전자 편집을 평가하는 방법으로서, 상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되고, 상기 방법은 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 각 부위의 유전자 편집의 발생을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 1) 상기 타겟 부위와의 서열 유사성에 기반하여 제1 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 방식; 및/또는 2) 시험관 내 실험 방법을 사용하여 제2 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 방식을 통해 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위를 획득하고, 여기서 오프 타겟 마커 부위에 0.1%보다 큰 서열 변화가 있거나 또는 유전자 편집에 의해 변형되지 않은 대조군 세포에 비해 오프 타겟 마커 부위에 2배 초과의 서열 변화가 있다는 것은, 유전자 변형 세포 집단 또는 이의 자손에 오프 타겟 유전자 편집이 있다는 것을 나타낸다.
2. 기술적 해결수단 1의 방법에서, 상기 결정 단계는 DNA 시퀀싱을 통해 수행된다.
3. 기술적 해결수단 2에 따른 방법에서, 상기 결정 단계는 1) 다수의 프라이머 세트를 사용하여 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위를 포함하는 핵산을 증폭하는 단계; 및 2) 증폭된 핵산에 대해 시퀀싱 분석을 수행하는 단계를 포함한다.
4. 기술적 해결수단 1 ~ 3 중 어느 하나에 따른 방법에서, 상기 시험관 내 실험 방법은 BLESS, GUIDE-seq, HIGTS, Circle-seq, SITE-seq 및 Digenome-seq 중 하나 이상을 포함한다.
5. 기술적 해결수단 1 ~ 4 중 어느 하나에 따른 방법에서, 상기 시험관 내 실험 방법은 포화 조건 하에 수행된다.
6. 기술적 해결수단 5에 따른 방법에서, 상기 포화 조건은 상기 타겟 부위에서 90% 이상의 효과적인 절단을 허용한다.
7. 기술적 해결수단 1 ~ 6 중 어느 하나에 따른 방법에서, 상기 유전자 변형 세포는 CRISPR/Cas 시스템을 통해 변형된다.
8. 기술적 해결수단 1 ~ 7 중 어느 하나에 따른 방법에서, 상기 타겟 부위는 BCL11A 유전자좌에 위치한다.
9. 기술적 해결수단 8의 방법에서, 상기 오프 타겟 마커 부위는 표 2에 나타낸 부위 중의 하나 이상이다.
10. 유전자 변형 세포 집단에서 다수의 오프 타겟 마커 부위를 획득하는 방법으로서, 상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되고, 오프 타겟 마커 부위를 획득하는 상기 방법은 1) 상기 타겟 부위와의 서열 유사성에 기반하여 제1 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 단계; 및 2) 시험관 내 실험 방법을 사용하여 제2 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 단계를 포함한다.
11. 기술적 해결수단 10의 방법에서, 상기 동정은 DNA 시퀀싱을 통해 수행된다.
12. 기술적 해결수단 11에 따른 방법에서, 상기 동정 단계는 1) 다수의 프라이머 세트를 사용하여 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위를 포함하는 핵산을 증폭하는 단계; 및 2) 증폭된 핵산에 대해 시퀀싱 분석을 수행하는 단계를 포함한다.
13. 기술적 해결수단 10 ~ 12 중 어느 하나에 따른 방법에서, 상기 시험관 내 실험 방법은 BLESS, GUIDE-seq, HIGTS, Circle-seq, SITE-seq 및 Digenome-seq 중 하나 이상을 포함한다.
14. 기술적 해결수단 10 ~ 13 중 어느 하나에 따른 방법에서, 상기 시험관 내 실험 방법은 포화 조건 하에 수행된다.
15. 기술적 해결수단 14에 따른 방법에서, 상기 포화 조건은 상기 타겟 부위에서 90% 이상의 효과적인 절단을 허용한다.
16. 기술적 해결수단 10 ~ 15 중 어느 하나에 따른 방법에서, 상기 유전자 변형 세포는 CRISPR/Cas 시스템을 통해 변형된다.
17. 유전자 변형 세포 집단 또는 이의 자손의 오프 타겟 편집을 평가하기 위한 키트로서, 상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되고, 상기 키트는 1) 상기 유전자 변형 세포를 생성하기 위한 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 구성요소; 및 b)다수의 오프 타겟 마커 부위를 포함하는 핵산을 증폭하기 위한 다수의 프라이머 세트를 포함한다.
18. 기술적 해결수단 17의 키트에서, 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위는 1) 상기 타겟 부위와의 서열 유사성에 기반하여 제1 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 방식; 및/또는 2) 시험관 내 실험 방법을 사용하여 제2 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 방식을 통해 획득된다.
19. 기술적 해결수단 17 ~ 18 중 어느 하나에 따른 키트에서, 상기 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas9 시스템이다.
20. 기술적 해결수단 17 ~ 19 중 어느 하나에 따른 키트에서, 상기 타겟 부위를 포함하는 핵산을 증폭하기 위한 하나 이상의 프라이머 세트를 더 포함한다.
21. 기술적 해결수단 20의 키트에서, 상기 하나 이상의 프라이머 세트는 서열번호 26 ~ 117 중 하나 이상을 포함한다.
실시예
실시예 1: 전체 인간 게놈에서 BCL11A 인핸서를 표적화하는 sgRNA과 완전히 일치하는 부위가 BCL11A 유전자의 적혈구 인핸서 타겟 부위만을 갖고 있임을 확인
CRISPR/Cas9 시스템은 sgRNA에 위치하는 20개의 염기의 결합 영역 서열을 이용하여 BCL11A 유전자의 적혈구 인핸서의 특정 타겟을 표적화하고, Cas9 단백질을 상기 타겟 위치로 정확하게 가이드하여 유전자 변형을 수행한다.
브라우저를 통해 UCSC genome browser(https://genome.ucsc.edu/)에 로그인한다. 페이지 오른쪽에 있는 Our tools에서 BLAT(rapidly align sequences to the genome)를 선택한다. BLAT 도구는 인간 게놈에서 조회 서열과 완전히 일치하는 모든 영역을 찾을 수 있다. 선택된 게놈을 인간 게놈(버전 GRCh38/hg38)으로 결정하고, 검색창에 상기 sgRNA 결합 영역 서열(CTAACAGTTGCTTTTATCAC, 서열번호 5), 20개의 염기를 입력한다. submit를 클릭한다.
UCSC에서 검색한 후 반환한다. 검색 결과는 2번 염색체에서 하나의 결과만 반환하였다. 즉, sgRNA는 인간 게놈에서 완전히 일치하는 부위가 하나밖에 없다. 상기 위치는 상기 sgRNA 타겟 부위이며, 즉 BCL11A 유전자의 적혈구 인핸서의 특정 타겟을 표적화한다. 상기 sgRNA는 전체 인간 게놈에서 완전히 일치하는 부위가 하나밖에 없으며, 즉 BCL11A 유전자의 적혈구 인핸서의 특정 타겟이다.
실시예 2: 생물정보학에 의한 유전자 편집의 잠재적 오프 타겟 부위의 예측 및 분석 방법
sgRNA는 게놈 DNA 서열에 결합될 때 일정 확률의 염기쌍오류가 존재할 수 있으므로, 비타겟 부위에서 오프 타겟의 돌연변이가 발생할 수 있다. 이러한 관점에서 오프 타겟 부위는 sgRNA 타겟 서열과 높은 유사성을 가져야 한다. 따라서, 본 연구에서는 먼저 Cas-OFFinder(http://www.rgenome.net/cas-offinder/) 소프트웨어를 사용하고, 전체 게놈을 통해 sgRNA 타겟 부위와 유사한 서열을 정렬하여 잠재적인 오프 타겟 부위를 찾았다.
브라우저를 통해 Cas-OFFinder(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)에 로그인한다. 페이지 왼쪽에 있는 PAM Type 옵션에서 SpCas9 from Streptococcus pyogenes(화농연쇄상구균 유래 SpCas9):5'-NGG-3'; Target Genome(타겟 게놈) 옵션에서 Homo sapiens(GRCh38/hg38)-Human(호모 사피엔스(GRCh38/hg38)-인간)을 선택하고; 페이지 오른쪽에 sgRNA 서열: CTAACAGTTGCTTTTATCAC를 입력하며, Mismatch Number(염기쌍오류 수)에 3을 입력하고, DNA/RNA Bulge Size(돌출 크기)에 1을 입력한다.
결과가 반환된 후, 먼저 3개의 Mismatch 및 bulge가 동시에 존재하는 서열을 제외하였다. 그 후 염색체 상의 부위의 위치 정보를 반환하여 동일한 부위의 중복항을 제거하고 최종적으로 인간 게놈에서 sgRNA의 잠재적 오프 타겟 부위를 획득하였다.
실시예 3: Digenome-seq 실험 방법에 의한 유전자 편집의 잠재적 오프 타겟 부위의 예측 및 분석
게놈 편집 과정에서 Cas 단백질은 게놈 DNA를 절단하여 이중 가닥 파손(double strand break, DSB)을 생성하는데, 게놈의 이중 가닥 파손 영역을 식별하여 Cas 단백질의 결합 위치를 동정함으로써, 오프 타겟 효과를 검출할 수 있다. 이 원리에 기반하여 유전자 편집의 전체 게놈 오프 타겟 효과를 검출하였다.
다양한 유전자 편집 오프 타겟 방법의 특성을 상세하게 요해한 후, 현재 진행되는 유전자 편집 요법의 해결수단을 비교하고, 본 실시예는 다른 독립적인 방법으로 가장 민감한 Digenome-seq를 선택하여 sgRNA의 잠재적인 오프 타겟 부위를 찾았다.
인간 게놈 DNA는 K562 세포에서 추출되고; BCL11A 부위에 대한 프라이머는 Ruibo Xingke Biotechnology Co., Ltd.에서 합성되며; sgRNA는 미국 Synthego사에서 유래되고; spCas9 단백질 및 버퍼는 NEB사(M0386)에서 유래된다.
10^6개의 K562 세포에서 게놈을 추출하고, 프라이머를 이용하여 먼저 상기 sgRNA 타겟 영역을 증폭하여 절단된 양성대조군으로 사용하였다. 실험에서 1 μl의 Cas9 단백질(NEB M0386), 3 μl의 Cas9 buffer, 1.5 μl의 sgRNA, 14.5 μl의 물을 사용하여 2개의 Cas9 절단 시스템을 구성하고, 25℃에서 10분 동안 인큐베이션하여 Cas9를 sgRNA에 결합하였다. K562 게놈을 첨가하고 37℃에서 8시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 시퀀싱 업체로 보냈다. 데이터 분석은 문헌에 의거하여 수행되었다(Kim D, Bae S, Park J, Kim E, Kim S, et al.2015.Digenome-seq:genome-wide profiling of CRISPRCas9 off-target effects in human cells.Nat.Methods 12:237-43). 요약하면, 시퀀싱 파일 fq.gz를 압축 해제하여 sam 파일을 획득하고; 각 sam에 대해 각각 염색체 chr1-XY에 따라 sam을 추출하여 chr.sort.bam을 획득하며; 각 염색체에 대응되는 chr.sort.sam에 대해 각각의 대응되는 chr.vcf.txt를 계산하고; 각 염색체의 vcf 파일에서 수직 절단 부위를 검색하며; 추출된 서열에 따라 sgRNAlib와 매칭시켜 절단을 일으키는 sgRNA를 찾고; 각 수직 절단 부위에 대해 sgRNA 매칭 후보는 고유하지 않을 수 있으며, PAM에 의거하여 일부 불가능한 sgRNA를 필터링하여 최종 결과를 나열하였다.
본 연구 과정에서는 오프 타겟 효과가 가장 나타나기 쉬운 실험 조건을 사용하며, 이는 실제로 상기 시스템을 적용하여 조혈 줄기 세포에 대해 유전자 편집을 수행하는 제조 조건과 상이하다. 상이한 조건 하에 잠재적 오프 타겟 부위는 반드시 오프 타겟이 나타나지 않을 수 있다. 이러한 극단적인 조건을 통해 상기 sgRNA가 오프 타겟 효과를 일으킬 가능성이 가장 높은 부위를 찾아낸다.
Digenome-seq 실험 분석에서 표 2에 나타낸 바와 같은 유전자 편집의 잠재적 오프 타겟 부위를 획득하였다. 실시예 2 중의 방법으로 예측된 부위와 중복된 부위가 3개 있다.
Figure pct00004
Figure pct00005
Bio-info는 생물정보학에 의해 예측하여 획득한 것을 나타낸다.
Digenome는 Digenome-seq 방법에 의해 획득한 것을 나타낸다.
Both는 두 가지 방법에 의해 동시에 획득한 것을 나타낸다.
sgRNA에 대한 잠재적 오프 타겟 부위를 예측하는 다른 5가지 예측 방법은 하기와 같다.
BLESS: 이중 가닥이 파손된 DNA 말단을 비오틴으로 연결한 다음 스트렙타아비딘(streptavidin)으로 농축하고 시퀀싱 및 분석한다.
GUIDE-seq: DNA 이중 가닥 파손 영역에 dsODN(double-stranded oligodeoxynucleotide, 이중 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드)을 삽입하여 DSB를 표지하고 시퀀싱 및 분석한다.
HTGTS: 2개의 이중 가닥 파손 영역을 연결하여 전좌(translocation)로 표지하고 시퀀싱 및 분석한다.
Circle-seq: 시험관 내에서 절단 부위를 표지하고 시퀀싱 및 분석한다.
SITE-seq: 시험관 내에서 절단 부위를 표지하고 시퀀싱 및 분석한다.
실시예 4: sgRNA 잠재적 오프 타겟에 대한 식별 표지의 구축
생물정보학 예측 방법과 DiGenome-seq 분석 방법으로 획득된 서열을 병합하고 중복을 제거하여, 상기 sgRNA 잠재적 오프 타겟의 식별 표지를 획득하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 두 가지 유전자 편집의 오프 타겟 부위 분석 방법을 통해 오프 타겟 현상이 나타날 가능성이 높은 잠재적 오프 타겟 부위를 총 45개 획득하고, 이는 하나의 특정된 잠재적 오프 타겟의 식별 표지를 구성할 수 있다.
상기 표 2는 BCL11A 인핸서를 표적화하는 어느 하나의 sgRNA잠재적 오프 타겟 부위를 나타낸다.
실시예 5: 잠재적 오프 타겟의 식별 표지에 대한 샘플의 오프 타겟 빈도의 검출
단편 PCR을 통해 실시예 4에서 구축된 잠재적 오프 타겟의 식별 표지(45개의 잠재적 오프 타겟 부위)를 특이적으로 증폭시킨 후, 딥 시퀀싱(NGS) 방식을 이용하여 편집군과 미처리 대조군(Mock) 사이의 타겟 부위(BCL11A 인핸서에 위치) 및 잠재적 오프 타겟 부위의 유전자 편집 효율의 정보를 비교함으로써, 상기 sgRNA 생산을 이용하여 지중해빈혈 질환을 치료하는 과정에서 이러한 잠재적 오프 타겟 부위가 오프 타겟 효과를 나타내는지 여부를 결정하였다. 제품에 대해 검증을 수행하였다.
먼저 46쌍의 PCR 프라이머(표 2에 나타낸 바와 같음)를 합성하여 타겟 부위와 45개의 잠재적 오프 타겟 부위를 특이적으로 표적화하였다. 프라이머는 Ruibo Xingke Biotechnology Co., Ltd.에서 합성되고; Taq-Hifi DNA 중합 효소는 Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.(AP131)에서 구입되며; NEBNext Ultra II 라이브러리 구축 키트는 NEB사(E7103)에서 구입되고; TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box는 Illumina사(FC-121-1003)에 구입된다. 실험에 사용된 조혈 줄기 세포는 건강한 기증자로부터 유래된다. 동일한 기증자에서 유래된 미처리 세포는 대조군으로 사용된다.
Figure pct00006
Figure pct00007
프라이머를 합성하여 증폭 단편 길이를 200 ~ 250 bp 사이로 제어하고, 잠재적 오프 타겟 영역은 중간 위치에 있다. 유전자 편집 전의 조혈 줄기 세포의 샘플을 대조군으로 사용하고, 생산 후의 샘플을 실험군으로 사용하여, 각각 게놈을 추출하여 증폭하였다. 각 증폭 반응에는 100 ng의 게놈 DNA(15000개의 세포)가 포함되어 있다. 획득된 증폭 생성물은 PCR이 없이 NEBNext Ultra II 키트로 앰플리콘 라이브러리를 구축하고, Illumina HiSeq X-ten 시퀀서로 PE150 방식에 따라 시퀀싱하며, 오프 머신 데이터는 Fastp로 저품질을 필터링하고 링커 데이터를 포함하며, 획득된 clean data는 Vsearch로 페어드 엔드 데이터 접합을 수행하고, 획득된 고품질 서열은 blastn 국소 정렬 방식으로 각각 원시 타겟 서열 및 sgRNA-PAM 서열과 정렬되며, 후속 분석은 타겟 서열과의 일치성이 40% 이상이고 임의의 indel 서열을 포함하지 않는 완전한 sgRNA-PAM을 비편집 서열로, 불완전한 sgRNA-PAM을 편집 서열로 하는 방식으로 편집 효율을 계산하였다. NGS 자체의 검출 정확도의 하한은 0.1%이다. 시퀀싱 오류가 존재하고 상이한 부위의 시퀀싱 오류 정도가 상이하기 때문에, 오프 타겟 부위를 편집군 부위의 편집 효율이 0.1%를 초과하고 대조군과 현저한 차이(유전자 편집 효율이 대조군의 2배를 초과함)가 없는 것으로 정의한다.
딥 시퀀싱 분석 후, 45개의 잠재적 오프 타겟 부위와 타겟 부위의 유전자 편집 효율은 도 1에 나타낸 바와 같다.
실시예 5에서, 편집군과 대조군에 딥 시퀀싱과 결합된 PCR 특이적 단편 증폭 방법을 사용하고, 상기 sgRNA 잠재적 오프 타겟에 대해 특별히 구축된 식별 표지를 사용하여, 제품의 잠재적 오프 타겟 효과를 검출하였다. 타겟 부위에서 편집군은 74.39%의 특정 유전자 편집 효율을 테스트해 내고, 이는 Mock군의 0.05%보다 훨씬 높다. 45개의 잠재적 오프 타겟 부위에서 편집군의 유전자 편집 효율은 Mock군과 현저한 차이가 없고, 대부분 효율은 NGS 자체의 검출 정확도의 하한(0.1%) 좌우 또는 그 이하이며, 이러한 데이터는 상기 sgRNA가 우수한 유전자 편집 특이성을 갖고, 오프 타겟 효과가 최소화되었으며 NGS 자체의 검출 정확도의 하한보다 낮음을 보여준다.
Sequence Listing <110> EDIGENE INC. <120> Method for evaluating gene editing therapy based on off-target assessment <130> FD00277US <150> PCT/CN2019/104303 <151> 2019-09-04 <160> 163 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4101 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Cas9 nucleotide sequence <400> 1 gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc 60 accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 120 agcatcaaga agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc 180 acccggctga agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat 240 ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg 300 gaagagtcct tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 360 atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa 420 ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg 480 atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 540 gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc 600 aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg 660 ctggaaaatc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggcaacctg 720 attgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat 780 gccaaactgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 840 atcggcgacc agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 900 ctgagcgaca tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg 960 atcaagagat acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag 1020 cagctgcctg agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1080 tacattgacg gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa 1140 aagatggacg gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag 1200 cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc 1260 attctgcggc ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag 1320 aagatcctga ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga 1380 ttcgcctgga tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg 1440 gtggacaagg gcgcttccgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac 1500 ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat 1560 aacgagctga ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc 1620 ggcgagcaga aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg 1680 aagcagctga aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc 1740 ggcgtggaag atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc 1800 aaggacaagg acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg 1860 accctgacac tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac 1920 ctgttcgacg acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg 1980 ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat 2040 ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2100 ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac 2160 gagcacattg ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg 2220 aaggtggtgg acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2280 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atcatgaact ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct 3180 ctgatcgaga caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc 3240 accgtgcgga aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag 3300 acaggcggct tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc 3360 agaaagaagg actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat 3420 tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa 3480 gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt 3540 ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac 3600 tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag 3660 aagggaaacg aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3720 tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 3780 cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc 3840 ctggccgacg ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc 3900 atcagagagc aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct 3960 gccgccttca agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag 4020 gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac 4080 ctgtctcagc tgggaggcga c 4101 <210> 2 <211> 150 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> 150bp sequence of site 58K of the BCL11A gene <400> 2 ctgccagtcc tcttctaccc cacccacgcc cccaccctaa tcagaggcca aacccttcct 60 ggagcctgtg ataaaagcaa ctgttagctt gcactagact agcttcaaag ttgtattgac 120 cctggtgtgt tatgtctaag agtagatgcc 150 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The sequence of the sgRNA of the BCL11A enhancer complementary to the target site <400> 3 cacaggctcc aggaagggtt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The sequence of the sgRNA of the BCL11A enhancer complementary to the target site <400> 4 atcagaggcc aaacccttcc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The sequence of the sgRNA of the BCL11A enhancer complementary to the target site <400> 5 ctaacagttg cttttatcac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The sequence of the sgRNA of the BCL11A enhancer complementary to the target site <400> 6 ttgcttttat cacaggctcc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The sequence of the sgRNA of the BCL11A enhancer complementary to the target site <400> 7 ttttatcaca ggctccagga 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The sequence of the sgRNA of the BCL11A enhancer complementary to the target site <400> 8 tttatcacag gctccaggaa 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The sequence of the sgRNA of the BCL11A enhancer complementary to the target site <400> 9 tgggtggggt agaagaggac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The sequence of the sgRNA of the BCL11A enhancer complementary to the target site <400> 10 gggcgtgggt ggggtagaag 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The sequence of the sgRNA of the BCL11A enhancer complementary to the target site <400> 11 ttagggtggg ggcgtgggtg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The sequence of the sgRNA of the BCL11A enhancer complementary to the target site <400> 12 attagggtgg gggcgtgggt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The sequence of the sgRNA of the BCL11A enhancer complementary to the target site <400> 13 gattagggtg ggggcgtggg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The sequence of the sgRNA of the BCL11A enhancer complementary to the target site <400> 14 tctgattagg gtgggggcgt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The sequence of the sgRNA of the BCL11A enhancer complementary to the target site <400> 15 ctctgattag ggtgggggcg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The sequence of the sgRNA of the BCL11A enhancer complementary to the target site <400> 16 cacgccccca ccctaatcag 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The sequence of the sgRNA of the BCL11A enhancer complementary to the target site <400> 17 ttggcctctg attagggtgg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The sequence of the sgRNA of the BCL11A enhancer complementary to the target site <400> 18 tttggcctct gattagggtg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The sequence of the sgRNA of the BCL11A enhancer complementary to the target site <400> 19 gtttggcctc tgattagggt 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The sequence of the sgRNA of the BCL11A enhancer complementary to the target site <400> 20 ggtttggcct ctgattaggg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The sequence of the sgRNA of the BCL11A enhancer complementary to the target site <400> 21 aagggtttgg cctctgatta 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The sequence of the sgRNA of the BCL11A enhancer complementary to the target site <400> 22 gaagggtttg gcctctgatt 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The sequence of the sgRNA of the BCL11A enhancer complementary to the target site <400> 23 actcttagac ataacacacc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The sequence of the sgRNA of the BCL11A enhancer complementary to the target site <400> 24 cttcaaagtt gtattgaccc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The sequence of the sgRNA of the BCL11A enhancer complementary to the target site <400> 25 ctcttagaca taacacacca 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 26 cacacggcat ggcatacaaa 20 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 27 tgaagctagt ctagtgcaag ct 22 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 28 acctgactga tggcctaacg 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 29 gccatcccca agctaggttt 20 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 30 tgtgattcct tccttccctt tt 22 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 31 acctaataca tttcttgtcc agtga 25 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 32 gctatcttgc gccaccatct 20 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 33 tgtactctgc tctccttcac atc 23 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 34 cattctccgg gagcaagcat 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 35 ggctggcctg aagtccattt 20 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 36 aaacactgta ggggtagaga agt 23 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 37 aaagccactg tgacaaatac gt 22 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 38 acacccaatc acggtcttgt 20 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 39 actcttaccc caaaccaatc tcta 24 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 40 cgatccagct ccaccactta 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 41 cctggtctct tggcgttgtt 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 42 tctggaaaca ccctgttgca 20 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 43 cgcattacac ccctttactg cta 23 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 44 ccagctcatg gttgcaactg 20 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 45 tgcacagtga aaaccgctca a 21 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 46 cttctacgct gcctcttgct 20 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 47 actaccgatg gcagctatag c 21 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 48 ccattcaggg gcaggttgat 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 49 cccacaaaac caacggaaca 20 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 50 agctgctttt acacaggtga agt 23 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 51 agtgtctgcc tcctattgct 20 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 52 cactggcctg gcaactttat g 21 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 53 ctactcgtca ctggctctga 20 <210> 54 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 54 agtcccctca ttctttcagt tttca 25 <210> 55 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 55 aactcaagga agagatcagt tgga 24 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 56 gcgcccggct caacatatta 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 57 ctccttcctc ctcgcagtgt 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 58 gcattccagc ctaggcaaca 20 <210> 59 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 59 ggaacggtca attctcaaaa gga 23 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 60 gcaatgagcc tcaccttcca 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 61 aaccgatcag ctgggtatgt 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 62 ggaacgctgc ctggagaaat 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 63 cccacagcac agcagaaatt 20 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 64 tcttctgctc catcccacct t 21 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 65 gcatgagctt tgccaccaaa 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 66 gcacaacgta gcgcaaatct 20 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 67 gggcctgttc ttcaagacca a 21 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 68 gcctgccctg catttttcaa 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 69 aaggggacaa gtgctatgca 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 70 gctgcaggca aatggagttg 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 71 catgggagga gccttagcaa 20 <210> 72 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 72 agggagtagc aagtctggtc tt 22 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 73 agtgattacc tgcccctcct a 21 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 74 caccacgcct ggctcattta 20 <210> 75 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 75 tttcctgtca aaaaccaact gttagg 26 <210> 76 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 76 agcatacagt aggaagtcca caa 23 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 77 gttggtccct gtgatgaaag c 21 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 78 gcatctccct ggtgacgaaa 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 79 ccagtggctg tgggattact 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 80 tctcctccga atggcctcat 20 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 81 tgatagaggc cacagctgaa g 21 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 82 ggacgatgcc tggagtctct 20 <210> 83 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 83 tgtctcaggg acttaccaac ttg 23 <210> 84 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 84 acacagtggc ttgttctcga t 21 <210> 85 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 85 tgctttctga ctccactttt gt 22 <210> 86 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 86 ggggtgggac gcattgttt 19 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 87 tcacccaggg tcacaggata 20 <210> 88 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 88 tccattgaca gacacttcag ttgt 24 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 89 tggtgcagcc tctgtgaaaa 20 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 90 agtgtcatgg ggcttttgtc t 21 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 91 acttccacgc tcctcctgat 20 <210> 92 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 92 tcctttgttt ctgtttgtgt gtgt 24 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 93 tgctggggga aaaacatcca 20 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 94 ctcaggctgc agcagaaatg 20 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 95 agggagctgt taggtgcttt 20 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 96 atggctgccg tttgctctat 20 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 97 tggtgaagcc cctatgacaa c 21 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 98 gcaccgtgca tcaaaattca 20 <210> 99 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 99 tggagacatt aatacctcac agtgt 25 <210> 100 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 100 cccaccgaaa caaacaatgt ca 22 <210> 101 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 101 ctgcttgttt tcttcccctt ca 22 <210> 102 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 102 ttgtgtccca gagctcactg t 21 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 103 aaaatgcctc gcacctggta 20 <210> 104 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 104 tgcttttatc ccaggcctcc ta 22 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 105 tgcactccat cctggtgaca 20 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 106 acaccatgcc acaccatgaa 20 <210> 107 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 107 tggtccccct ggaaatgga 19 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 108 gcaacagcta cggaggactt 20 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 109 aggcagccct tcatagagtt 20 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 110 gccagatgcc ctccaaagag 20 <210> 111 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 111 aggtcattta cagagcaggc aat 23 <210> 112 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 112 tggatttcta gtgagagctg ttga 24 <210> 113 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 113 cagttgtttt atcactggac aagaa 25 <210> 114 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 114 actcctccaa ccccatcatc t 21 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 115 tgggacatcg gaacagcttt 20 <210> 116 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 116 cacttagtga accgcaaaca ca 22 <210> 117 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> The primer for sequencing <400> 117 gcactgcaca cttttcagac a 21 <210> 118 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of target site <400> 118 ctaacagttg cttttatcac agg 23 <210> 119 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 119 ctaacagttg ctttagcact gg 22 <210> 120 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 120 ctaccagttg ttttatcact gg 22 <210> 121 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 121 ctaaagttgc ttttaacaca gg 22 <210> 122 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 122 ctaactattg cttttatcag cagg 24 <210> 123 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 123 gtaacagttg cttttgtcac cagg 24 <210> 124 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 124 ccaaagttgc ctttatcaca gg 22 <210> 125 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 125 ctaacagttt ctgtttcaca gg 22 <210> 126 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 126 ctagaagttg ctttttcaca gg 22 <210> 127 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 127 ctaatattgc ttttttcaca gg 22 <210> 128 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 128 caaacagttg ctctttcact gg 22 <210> 129 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 129 ctaacagttg ttttatgtct gg 22 <210> 130 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 130 gtaacagctg cttttacaca gg 22 <210> 131 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 131 caaacatcgc ttttatcacg gg 22 <210> 132 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 132 cttacagttt cttttataca gg 22 <210> 133 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 133 ctgacagttg ctgtatcact gg 22 <210> 134 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 134 ctaatagttc tttgatcact gg 22 <210> 135 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 135 ctgacagttg cttttactct gg 22 <210> 136 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 136 ctaacattgc ttatatctca gg 22 <210> 137 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 137 ctaacaatgc tttcatcacg gg 22 <210> 138 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 138 ctagctgttg cttttatact gg 22 <210> 139 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 139 ctaacagttc ctttatccct gg 22 <210> 140 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 140 ctagcagttg cttttccaca gg 22 <210> 141 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 141 ctacagttgc tattctcaca gg 22 <210> 142 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 142 ctaacagttg gtttttgaca gg 22 <210> 143 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 143 ctaacactgc tttcatcaca gg 22 <210> 144 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 144 ctaacagtgg ctttgacact gg 22 <210> 145 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 145 ctaacagttc ctgttatccc gg 22 <210> 146 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 146 ttaacagttg ttttatcaat gg 22 <210> 147 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 147 gtaacagttg cttgttcact gg 22 <210> 148 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 148 ctagaagttg cttttatcca gg 22 <210> 149 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 149 ctaacgttgc tatgatcact gg 22 <210> 150 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 150 ctgtcagttg ctttatcact gg 22 <210> 151 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 151 ttcacattgc ttttatcact gg 22 <210> 152 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 152 ccaacagttg cttttctctc tgg 23 <210> 153 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 153 ctaacagtta cttttattcc tgg 23 <210> 154 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 154 ctaacaattg gttttataac agg 23 <210> 155 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 155 ctaacatttg attttaacac tgg 23 <210> 156 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 156 ctaacagctg cttttatcct ggg 23 <210> 157 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 157 ctaacatctg cttttatccc agg 23 <210> 158 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 158 attacagctg catttatcac agg 23 <210> 159 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 159 gagacagtag cttttataac agg 23 <210> 160 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 160 caatcagctg ctcttataac tgg 23 <210> 161 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 161 tctaccagtt gttttatcac tgg 23 <210> 162 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 162 agcacagttg gtttttataa cag 23 <210> 163 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence of off-target tagged site <400> 163 agcatagttg ctttttatca cag 23

Claims (35)

  1. 개체에 대한 세포 요법의 적합성을 결정하는 방법으로서,
    상기 개체에게 상기 개체로부터 유래된 유전자 변형 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되고,
    상기 방법은,
    a) 상기 유전자 변형 세포 또는 이의 자손에서 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 각 부위의 유전자 편집의 발생을 결정하는 단계, 및
    b) 상기 유전자 편집의 발생에 기반하여 상기 치료의 적합성을 평가하는 단계를 포함하되,
    상기 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 어느 하나도 유전자 편집이 발생하지 않았다는 것은 상기 세포 요법이 상기 개체에게 적합하다는 것을 나타내는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유전자 변형 세포를 투여하기 전에 상기 유전자 변형 세포에 대해 상기 결정 단계를 수행하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 방법은 상기 개체에게 상기 유전자 변형 세포를 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 유전자 변형 세포를 투여한 후 상기 유전자 변형 세포의 자손에 대해 상기 결정 단계를 수행하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 결정 단계는 상기 유전자 변형 세포를 투여한 후 적어도 한 달 후에 수행되는 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    상기 결정 및 평가 단계를 1회 이상 반복하는 단계를 더 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 결정 및 평가 단계는 월 1회 내지 연 1회의 빈도로 반복되는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    오프 타겟 마커 부위의 서열 변화가 0.1%보다 작거나 또는 오프 타겟 마커 부위의 서열 변화가 유전자 편집에 의해 변형되지 않은 대조군 세포에 비해 2배 미만이면, 3 ~ 12개월마다 상기 결정 및 평가 단계를 반복하고; 오프 타겟 마커 부위의 서열 변화가 0.1%보다 크거나 또는 오프 타겟 마커 부위의 서열 변화가 유전자 편집에 의해 변형되지 않은 대조군 세포에 비해 2배 초과이면, 서열 변화 빈도가 증가함에 따라 상기 결정 및 평가 단계를 반복하는 빈도를 증가하는 방법.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 평가 단계 후 개입 요법으로 상기 개체를 치료하는 단계를 더 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 개입 요법은 상기 개체에게 투여된 상기 개체로부터 유래된 유전자 변형 세포 집단을 제거하는 것인 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 개입 요법은 상기 개체로부터 유래된 제2 유전자 변형 세포 집단을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 다수의 오프 타겟 마커 부위는 적어도 10개의 오프 타겟 마커 부위를 포함하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    오프 타겟 마커 부위에 0.1%보다 작은 서열 변화가 있거나 또는 유전자 편집에 의해 변형되지 않은 대조군 세포에 비해 오프 타겟 마커 부위에 2배 미만의 서열 변화가 있다는 것은, 상기 오프 타겟 마커 부위에 유전자 편집이 발생하지 않았다는 것을 나타내는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결정 단계는 DNA 시퀀싱을 통해 수행되는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 결정 단계는 1) 다수의 프라이머 세트를 사용하여 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위를 포함하는 핵산을 증폭하는 단계; 및 2) 증폭된 핵산에 대해 시퀀싱 분석을 수행하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시험관 내 실험 방법은 BLESS, GUIDE-seq, HIGTS, Circle-seq, SITE-seq 및 Digenome-seq 중 하나 이상을 포함하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시험관 내 실험 방법은 포화 조건 하에 수행되는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포화 조건은 상기 타겟 부위에서 90% 이상의 효과적인 절단을 허용하는 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 포화 조건은 상기 타겟 부위에서 100%의 효과적인 절단을 허용하는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유전자 변형 세포는 CRISPR/Cas 시스템을 통해 변형되는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 타겟 부위는 BCL11A 유전자좌에 위치하는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 오프 타겟 마커 부위는 표 2에 나타낸 부위 중의 하나 이상인 방법.
  23. 유전자 변형 세포 집단 또는 이의 자손에서 오프 타겟 유전자 편집을 평가하는 방법으로서,
    상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되고, 상기 방법은 다수의 오프 타겟 마커 부위 중 각 부위의 유전자 편집의 발생을 결정하는 단계를 포함하되, 1) 상기 타겟 부위와의 서열 유사성에 기반하여 제1 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 방식; 및/또는 2) 시험관 내 실험 방법을 사용하여 제2 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 방식을 통해 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위를 획득하되, 오프 타겟 마커 부위에 0.1%보다 큰 서열 변화가 있거나 또는 유전자 편집에 의해 변형되지 않은 대조군 세포에 비해 오프 타겟 마커 부위에 2배 초과의 서열 변화가 있다는 것은, 유전자 변형 세포 집단 또는 이의 자손에 오프 타겟 유전자 편집이 있다는 것을 나타내는 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 결정 단계는 DNA 시퀀싱을 통해 수행되는 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 결정 단계는 1) 다수의 프라이머 세트를 사용하여 상기 다수의 오프 타겟 마커 부위를 포함하는 핵산을 증폭하는 단계; 및 2) 증폭된 핵산에 대해 시퀀싱 분석을 수행하는 단계를 포함하는 방법.
  26. 유전자 변형 세포 집단에서 다수의 오프 타겟 마커 부위를 획득하는 방법으로서,
    상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되고, 오프 타겟 마커 부위를 획득하는 상기 방법은 1) 상기 타겟 부위와의 서열 유사성에 기반하여 제1 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 단계; 및 2) 시험관 내 실험 방법을 사용하여 제2 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 단계를 포함하는 방법.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시험관 내 실험 방법은 BLESS, GUIDE-seq, HIGTS, Circle-seq, SITE-seq 및 Digenome-seq 중 하나 이상을 포함하는 방법.
  28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시험관 내 실험 방법은 포화 조건 하에 수행되는 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 포화 조건은 상기 타겟 부위에서 90% 이상의 효과적인 절단을 허용하는 방법.
  30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유전자 변형 세포는 CRISPR/Cas 시스템을 통해 변형되는 방법.
  31. 유전자 변형 세포 집단 또는 이의 자손의 오프 타겟 편집을 평가하기 위한 키트로서,
    상기 유전자 변형 세포는 타겟 부위에서 유전자 편집에 의해 변형되고, 상기 키트는 1) 상기 유전자 변형 세포를 생성하기 위한 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 구성요소; 및 2) 다수의 오프 타겟 마커 부위를 포함하는 핵산을 증폭하기 위한 다수의 프라이머 세트를 포함하는 키트.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 다수의 오프 타겟 마커 부위는 1) 상기 타겟 부위와의 서열 유사성에 기반하여 제1 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 방식; 및/또는 2) 시험관 내 실험 방법을 사용하여 제2 다수의 오프 타겟 마커 부위를 동정하는 방식을 통해 획득되는 키트.
  33. 제31항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas9 시스템인 키트.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 타겟 부위를 포함하는 핵산을 증폭하기 위한 하나 이상의 프라이머 세트를 더 포함하는 키트.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 하나 이상의 프라이머 세트는 서열번호 26 ~ 117 중 하나 이상을 포함하는 키트.

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