CN111939271A - 一种血红蛋白病治疗有效性预测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种治疗个体中的血红蛋白病的方法，包括：a)评估步骤，该评估步骤包括评估经修饰的CD34阳性造血干细胞/祖细胞的第一群体分化后产生所需水平的γ‑球蛋白或胎儿血红蛋白的能力，其中第一群体的经修饰的CD34阳性HSPC来源于所述个体并经过修饰以降低BCL11A功能；并且b)治疗步骤，该治疗步骤包括向所述个体施用第二群体经修饰的CD34阳性HSPC，该经修饰的CD34阳性HSPC来源于所述个体并且经修饰降低了BCL11A功能。同时，本申请还涉及治疗个体中的血红蛋白病的方法、选择患有血红蛋白病的个体用于以第二群体的经修饰CD34阳性HSPC进行治疗的方法和确定患有血红蛋白病的个体是否适合或不适合用来源于所述个体并经修饰降低了BCL11A功能的第二群体的经修饰CD34阳性HSPC进行治疗的方法。
Description
技术领域
本申请涉及预测基因编辑技术治疗血红蛋白病有效性的伴随预测方法。该预测方法在治疗疾病之前，预先分离患者CD34阳性造血干细胞，利用基因编辑技术，破坏BCL11A红系增强子位点，通过评估上调γ珠蛋白和胎儿血红蛋白表达的程度，提前预测基因编辑BCL11A红系增强子治疗血红蛋白病的有效性，辅助疾病治疗。
背景技术
血红蛋白病(hemoglobinopathy)是由于血红蛋白分子结构异常或珠蛋白肽链合成异常所引起的一组遗传性血液病。血红蛋白病中的主要两种疾病类型是β-地中海贫血和镰刀形红细胞贫血。β-地中海贫血，其发病机理是因为β珠蛋白肽链发生基因突变，多数病人是点突变，少数是大片段基因缺失。基因缺失和某些点突变可以导致一部分β珠蛋白肽链的合成完全被抑制，这类称为β0地贫；而少数的点突变使β链的合成部分受到抑制，仍保留一部分肽链合成，这类称为β+地贫，不同的组合可能出现不同的临床症状。由于β珠蛋白表达缺失或减少，导致血液内多余的α链会沉积在红细胞内形成包涵体，附着在红细胞膜表面上，使红细胞膜特性发生改变，细胞变僵硬而导致变形能力下降，呈现慢性溶血性贫血表现，进一步导致骨髓构成改变。镰刀形红细胞贫血，与β-地中海贫血类似，都属于一种常染色体隐性遗传病，不同的是该贫血症突变位点单一，由于β珠蛋白的单一碱基突变，正常的β基因的第6位密码子由GAG(编码谷氨酸)突变为GTG(缬氨酸)所致。在突变纯合子状态，正常的α珠蛋白和异常的β珠蛋白形成四聚体复合物，称为HbS,该四聚体携带氧气的能力是正常血红蛋白的一半，在脱氧状态下聚集成多聚体，因形成的多聚体排列方向与膜平行，紧密接触细胞膜，当多聚体数量达到一定程度后，细胞膜由正常的凹形变成镰刀形。镰刀形红细胞，变形性差，容易破碎而发生溶血，造成血管堵塞，损伤，坏死等(D.Rund,et al.NewEngland Journal of Medicine.2005,718-739)。
目前针对β-地中海贫血和镰刀形红细胞贫血的标准治疗方法包括长期高剂量输血伴随去铁剂排铁治疗和异源造血干细胞移植治疗技术。然而，长期的高剂量输血伴随去铁剂排铁治疗导致铁过载，患者的脾脏、肝脏、心脏和肾脏等重要脏器铁大量沉积而引起的器官损伤是地贫患儿死亡的主要原因之一。异源造血干细胞移植虽然能够根治β-地中海贫血和镰刀形红细胞贫血，但是由于HLA全相合配型比例低和移植术后的GVHD(Graft-Versus-Host-Disease,移植物抗宿主反应)、免疫排斥导致的死亡，因此目前该治疗技术难以满足患者巨大的被治疗的需求。为了解决异源造血干细胞治疗技术的问题，基于基因修饰自体造血干细胞的转基因疗法和基因编辑疗法应运而生。其中，基因编辑疗法的治疗方案是利用基因编辑工具，如CRISPR/Cas9、Zinc Finer Nulease(ZFN)和TALEN等，编辑患者的自源的造血干细胞，提升胎儿血红蛋白(Fetal Hemoglobin,HbF)的表达，再将经过基因修饰的自源的造血干细胞回输给患者，使患者的血红蛋白总量恢复至正常水平，达到治疗疾病的目的。
基因编辑疗法治疗β-地中海贫血和镰刀形红细胞贫血的主要机理是利用了人体内天然存在的生物学现象，即血红蛋白切换(Globin Switch)。成年人的血红蛋白AdultHemoglobin(HbA)是由两条α珠蛋白和两条β珠蛋白组成的四聚体复合物，但是胎儿在母体内及出生后120天内，人体内的血红蛋白则是HbF,由两条α珠蛋白和两条γ珠蛋白组成的四聚体复合物，其特点是携带氧气能力强、释放氧气能力弱，利于胎儿从母体内获取养分。但是在胎儿出生120后，人体内红细胞中发生HbF向HbA的切换，开始表达正常的血红蛋白HbA(Marina et al,Molecular Therapy.2017；Megan D,et al.Blood.2015)。临床上存在一类病人，虽然携带了β-地中海贫血或镰刀形红细胞贫血的疾病突变，但是症状轻微或无临床症状，这是由于抑制HbF表达的基因同时也携带了突变使得这些基因表达降低，最终导致患者产生遗传性胎儿血红蛋白持续增高(Hereditary persistence of fetal hemoglobin,HPFH),从而弥补了由于β-珠蛋白缺失或减少导致的红细胞内整体血红蛋白水平下降，使整体血红蛋白接近或恢复至正常水平(Vinjamur DS,et al.Br.J.Haematol.2018)。因此，如何寻找到合适的基因靶点通过基因编辑方法提高红细胞内胎儿血红蛋白表达成为了一种全新的治疗策略。然而，在人体内HbF和HbA的表达处于动态平衡、此消彼长的相对稳态，其调控的机制非常复杂，研究表明在β-珠蛋白上游40～60kb存在长度约为16kb的LCR(Locuscontrol region)，该区域内含有5个DNA酶高度敏感的位点，参与调控了HbF和HbA的表达。除此以外，一些参与造血系统发育和红细胞分化、成熟的关键转录因子紧密结合在该区域，包括GATA-1、BCL11A、FOG1、NuRD、LRF、MYB、KLF1、TAL1、E2A、LMO2和LDB1等，共同作用参与调控HbF和HbA的表达(G.Lettre,et al.PNAS.2008,11869-11874；Marina et al,MolecularTherapy.2017；Megan D,et al.Blood.2015)。目前，发现的合适的靶点是BCL11A红系增强子(+58)位置，通过基因编辑的方法修饰该区域，下调BCL11A基因表达，从而解除BCL11A基因对于γ珠蛋白和HbF的表达抑制，提高γ珠蛋白和HbF表达，同时不影响其它谱系的分化和发育，而且临床上一些无症状的患者也正是携带了该位点的突变导致了HPFH(U.Manuela,et al.PNAS.2008；P.Liu,et al.Nature Immunology.2003；D.E.Bauer.Science.2013；V.G.Sankaran,et al.Science.2008；Matthew C,etal.Nature.2015)。
虽然临床上已经开展了针对BCL11A红系增强子位点，即利用基因编辑技术开发的自体造血干细胞移植治疗β-地中海贫血和镰刀形红细胞贫血的临床Phase1/2试验(Clinicaltrials.gov编码是NCT03655678,NCT03745287,NCT03432364)，但是由于病人之间存在个体差异，BCL11A基因对于HbF的调控程度在不同的病人中效果不同，例如假设在某类病人中BCL11A基因已经处于非常低表达的状态，表明已经解除了BCL11A基因对于HbF的表达抑制，那么再编辑BCL11A红系增强子拟提高HbF来治疗病人可能会失效，而病人如果已经经过了化疗清除骨髓和免疫系统，这将造成的难以预估的潜在危害。况且，调控γ珠蛋白和HbF胎儿血红蛋白表达的机制非常复杂，难以通过检测某个基因或者某几个基因的表达情况来提前预知治疗方法的有效性。因此，如何能够提前预测BCL11A基因对于γ珠蛋白和HbF的表达上调的程度和潜能则是基因编辑自体造血干细胞疗法亟待解决的关键问题。
发明内容
本申请利用预先评估BCL11A基因对于HbF调控程度的策略，开发出了预测基因编辑技术治疗血红蛋白病有效性的伴随诊断方法，提前预知基因编辑BCL11A红系增强子位点对于提高γ珠蛋白和HbF的表达程度，降低由于患者细胞中BCL11A低表达或者低功能带来的该疗法失效或有效性减弱的风险，利于临床治疗过程中患者分级诊疗，优先选择BCL11A高表达和/或对γ珠蛋白和HbF调控起到主要作用的患者进行治疗，开发了伴随诊断加基因编辑自体造血干细胞的全新的治疗方案，填补了现有技术的空白，助力基因编辑技术自体造血干细胞治疗血红蛋白病的全新治疗策略的快速发展，满足了临床应用的需求。
本申请通过实验首次证明，不同供体的动员外周血中来源的造血干细胞，经过高效基因编辑BCL11A红系增强子的相同位点，红系分化后γ珠蛋白mRNA水平和HbF蛋白水平的提高程度不同，表明个体差异影响了BCL11A对于γ珠蛋白和HbF蛋白表达的抑制潜能和程度。此外，同一供体的动员外周血来源的造血干细胞，在不同批次的实验中经过高效基因编辑BCL11A红系增强子的相同位点，红系分化后γ珠蛋白mRNA水平和HbF蛋白水平的具有稳定且相似的提高程度。进一步实验结果表明，在同一批次中γ珠蛋白和HbF蛋白表达更高的供者，在另一批次实验中γ珠蛋白和HbF蛋白表达也更高，反之亦然。最后，本申请首次提出了伴随诊断+基因编辑自体造血干细胞BCL11A红系增强子位点治疗血红蛋白病的全新治疗方案和策略。
一方面，本申请提供一种治疗个体中的血红蛋白病的方法，包括：
a)评估步骤，该评估步骤包括评估经修饰的CD34阳性的造血干细胞/祖细胞(“CD34阳性HSPC”)的第一群体分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，其中第一群体的经修饰的CD34阳性HSPC来源于所述个体并经过修饰以降低BCL11A功能(“经修饰的EV细胞”)；并且
b)治疗步骤，该治疗步骤包括向所述个体施用第二群体经修饰的CD34阳性HSPC，该经修饰的CD34阳性HSPC来源于所述个体并且经修饰降低了BCL11A功能(“经修饰的TR细胞”)。
一方面，本申请提供一种增强胎儿血红蛋白在个体内表达的方法，包括：
a)评估步骤，该评估步骤包括评估经修饰的CD34阳性的造血干细胞/祖细胞(“CD34阳性HSPC”)的第一群体分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，其中第一群体的经修饰的CD34阳性HSPC来源于所述个体并经过修饰以降低BCL11A功能(“经修饰的EV细胞”)；并且
b)治疗步骤，该治疗步骤包括向所述个体施用第二群体经修饰的CD34阳性HSPC，该经修饰的CD34阳性HSPC来源于所述个体并且经修饰降低了BCL11A功能(“经修饰的TR细胞”)。
一方面，本申请提供一种血红蛋白在个体内功能的方法，包括：
a)评估步骤，该评估步骤包括评估经修饰的CD34阳性的造血干细胞/祖细胞(“CD34阳性HSPC”)的第一群体分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，其中第一群体的经修饰的CD34阳性HSPC来源于所述个体并经过修饰以降低BCL11A功能(“经修饰的EV细胞”)；并且
b)治疗步骤，该治疗步骤包括向所述个体施用第二群体经修饰的CD34阳性HSPC，该经修饰的CD34阳性HSPC来源于所述个体并且经修饰降低了BCL11A功能(“经修饰的TR细胞”)。一方面，本申请提供一种治疗个体中的血红蛋白病的方法，包括治疗步骤，所述治疗步骤包括向所述个体施用来源于所述个体且经修饰降低了BCL11A功能的第二群体的经修饰CD34阳性HSPC(“经修饰的TR细胞”)，
其中基于经由评估步骤的功能评价选出所述个体用于治疗，所述评估步骤包括：评估第一群体经修饰的CD34阳性HSPC分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，其中第一群体的经修饰CD34阳性HSPC来源于个体并经修饰降低了BCL11A功能(“经修饰的EV细胞”)。
一方面，本申请提供一种选择患有血红蛋白病的个体用于以第二群体的经修饰CD34阳性HSPC进行治疗的方法，所述经修饰CD34阳性HSPC来源于所述个体并经修饰降低了BCL11A功能(“经修饰的TR细胞”)，其中所述方法包括评估步骤，所述评估步骤包括：评估第一群体的经修饰CD34阳性HSPC分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，其中第一群体的经修饰CD34阳性HSPC来源于所述个体并经修饰降低了BCL11A功能(“经修饰的EV细胞”)，其中如果第一群体的经修饰CD34阳性HSPC产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)，则选择所述个体进行治疗。
一方面，本申请提供一种确定患有血红蛋白病的个体是否适合于用来源于所述个体并经修饰降低了BCL11A功能的第二群体的经修饰CD34阳性HSPC(“经修饰的TR细胞”)进行治疗的方法，其中所述方法包括评估步骤，其包括：评估第一群体的经修饰CD34阳性HSPC分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，其中第一群体的经修饰的CD34阳性HSPC来源于所述个体并经修饰降低了BCL11A功能(“经修饰的”EV细胞)，其中如果第一群体的经修饰CD34阳性HSPC产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)，则所述个体适于治疗。
一方面，本申请提供一种确定患有血红蛋白病的个体不适合用来源于所述个体并经修饰降低了BCL11A功能的第二群体的经修饰CD34阳性HSPC(“经修饰的TR细胞”)进行治疗的方法，其中所述方法包括评估步骤，其包括：评估第一群体的经修饰的CD34阳性HSPC分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，其中第一群体的经修饰的CD34阳性HSPC来源于所述个体并经修饰降低了BCL11A功能(“经修饰的”EV细胞)，其中如果第一群体的经修饰的CD34阳性HSPC不产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)则所述个体不适合用所述经修饰的TR细胞进行治疗。
在上述实施方案中，评估第一群体经修饰的CD34阳性HSPC分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力是指评估经修饰降低了BCL11A功能的CD34阳性HSPC分化后产生γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的水平是否比未经此修饰的CD34阳性HSPC分化后产生的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)水平至少提高约12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、120％。
如果第一群体经修饰的CD34阳性HSPC分化后产生的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的水平比未经此修饰的CD34阳性HSPC分化后产生的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)水平提高至少约12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、120％，则所述个体适合用所述经修饰的TR细胞进行治疗。
在上述方法的一些实施方案中，所述经修饰的CD34阳性HSPC分化后产生的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白的水平是未经修饰的CD34阳性HSPC分化后产生的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白的水平的150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％，或更高。
在上述方法的一些实施方案中，所述经修饰的CD34阳性HSPC分化后产生的胎儿血红蛋白超过6.5g/dL、7.0g/dL、7.5g/dL、8.0g/dL、8.5g/dL、9.0g/dL、9.5g/dL、10g/dL、10.5g/dL、11.0g/dL外周血，或更高水平。在一些实施方案中，所述所述经修饰的CD34阳性HSPC分化后产生的胎儿血红蛋白大约为9.0-18g/dL,例如10-17g/dL,11-15g/dL或12-16g/dL外周血。
在上述方法的一些实施方案中，所述所需水平的γ-球蛋白为相对于未经修饰的CD34阳性HSPC，经修饰的CD34阳性HSPC产生超过约50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％，或更高水平的γ-球蛋白mRNA。
在上述方法的一些实施方案中，所述评估步骤包括：
a)从所述个体的骨髓或外周血样品中分离出CD34阳性HSPC以获得经分离的CD34阳性HSPC群体(“经分离的EV细胞”)；
b)修饰经分离的EV细胞以获得第一群体经修饰CD34阳性HSPC细胞，其具有降低了的BCL11A功能(“经修饰的EV细胞”)；以及
c)评估经修饰的EV细胞分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力。在上述方法的一些实施方案中，所述治疗步骤包括：
a)动员所述个体骨髓中的CD34阳性HSPC进入外周血以增加外周血中的CD34阳性HSPC的量；
b)从所述个体的外周血中分离CD34阳性HSPC，以获得经分离的CD34阳性HSPC群体(“经分离的TR细胞”)，
c)修饰经分离的TR细胞以获得降低了BCL11A功能的、第二群体的经修饰CD34阳性HSPC(“经修饰的TR细胞”)；以及
d)向所述个体施用有效量的经修饰的TR细胞。
一方面，本申请提供一种治疗个体中血红蛋白病的方法，包括：
1)评估步骤，其中所述评估步骤包括：
a)从所述个体的骨髓或外周血样品中分离CD34阳性HSPC以获得经分离的CD34阳性HSPC群体(“经分离的EV细胞”)；
b)修饰经分离的EV细胞以获得降低了BCL11A功能的第一群体的经修饰CD34阳性HSPC细胞(“经修饰的EV细胞”)；以及
c)评估经修饰的EV细胞分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力；以及
2)治疗步骤，其中所述治疗步骤包括：
a)将所述个体中的CD34阳性HSPC动员至外周血；
b)从所述个体的外周血中分离CD34阳性HSPC以获得经分离的CD34阳性HSPC群体(“经分离的TR细胞”)，
c)修饰经分离的TR细胞以获得降低了BCL11A功能的、第二群体的经修饰CD34阳性HSPC(“经修饰的TR细胞”)；以及
d)向所述个体施用有效量的经修饰的TR细胞。
一方面，本申请提供一种治疗个体中血红蛋白病的方法，包括：
1)评估步骤，其中所述评估步骤包括：
a)从所述个体的骨髓或外周血样品中分离CD34阳性HSPC以获得经分离的CD34阳性HSPC群体(“经分离的EV细胞”)；
b)基因修饰(比如通过CRISPR方法基因修饰)经分离的EV细胞以获得降低了BCL11A功能的第一群体的经修饰CD34阳性HSPC细胞(“经修饰的EV细胞”)；以及
c)评估经修饰的EV细胞分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力；以及
2)治疗步骤，其中所述治疗步骤包括：
a)将所述个体中的CD34阳性HSPC动员至外周血；
b)从所述个体的外周血中分离CD34阳性HSPC以获得经分离的CD34阳性HSPC群体(“经分离的TR细胞”)，
c)基因修饰(比如通过CRISPR方法基因修饰)经分离的TR细胞以获得降低了BCL11A功能的、第二群体的经修饰CD34阳性HSPC(“经修饰的TR细胞”)；以及
d)向所述个体施用(例如静脉注射，包括单次静脉注射)有效量的经修饰的TR细胞。
在上述方法的一些实施方案中，所述用于分离CD34阳性HSPC以产生经分离的EV细胞的骨髓或外周血样品为少量，比如骨髓取样量不多于20ml，例如5-20ml、5-10ml；外周血取样量不多于30ml，例如10-30ml、15-20ml。
在上述方法的一些实施方案中，所述用于分离CD34阳性HSPC以产生经分离的TR细胞的骨髓或外周血样品为多量，比如不少于50mL，例如50-300ml，100-200ml。
在上述方法的一些实施方案中，所述CD34阳性HSPC细胞可由个体骨髓或外周血分离获得。在一些实施方案中，所述分离方法包括磁珠分离。在上述方法的一些实施方案中，所述方法包括对经分离的EV细胞进行基因修饰。在上述方法的一些实施方案中，所述基因修饰包括通过锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)以及规律性间隔的短回文序列重复(CRISPR)、RNA编辑、RNA干扰(RNAi)技术中的任一方法或他们的组合对经分离的EV细胞进行基因修饰。在上述方法的一些实施方案中，通过对人类第2号染色体第60495197位至第60495346位区域的BCL11A基因进行修饰，降低BCL11A功能。在上述方法的一些实施方案中，通过CRISPR/Cas技术对CD34阳性HSPC细胞进行基因修饰，降低BCL11A功能。在上述方法的一些实施方案中，通过BCL11A功能抑制剂对CD34阳性HSPC细胞进行修饰，降低BCL11A功能。在一些实施方案中，所述BCL11A功能抑制剂为抑制BCL11A基因转录和/或表达的蛋白或核酸分子，例如核酸酶(例如ZFN和TALEN)、肽核酸、反义RNA、siRNA、miRNA和shRNA。在一些实施方案中，所述BCL11A功能抑制剂为抑制人类第2号染色体第60495197位至第60495346位区域基因转录和/或表达的蛋白或核酸分子，在一些实施方案中，所述BCL11A功能抑制剂为干扰、抑制或破坏人类第2号染色体第60495197位至第60495346位区域基因转录和/或表达的蛋白或核酸分子。在一些实施方案中，所述BCL11A功能抑制剂为干扰、抑制或破坏人类第2号染色体第60495197位至第60495346位区域的核酸酶(例如ZFN和TALEN)、肽核酸、反义RNA、siRNA、miRNA。
在上述方法的一些实施方案中，在评估步骤中评估经修饰的EV细胞分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，所述步骤包括：1)在允许分化以获得红细胞群体的条件下培养经修饰的EV细胞；以及2)确定所述红细胞产生的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的水平。
在上述方法的一些实施方案中，在评估步骤中评估经修饰的EV细胞中分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力包括：确定γ-球蛋白的mRNA水平。在上述方法的一些实施方案中，在评估步骤中评估经修饰的EV细胞分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力包括：确定胎儿血红蛋白(HbF)的蛋白质水平。在上述方法的一些实施方案中，其中所述个体在评估步骤之前未经历过CD34阳性HSPC细胞动员或预治疗。比如，个体在评估步骤之前未注射清骨髓和清淋巴的药物，如白消安(Busulfan)和氟达拉滨(Fludarabine)等。在上述方法的一些实施方案中，所述评估步骤在所述治疗步骤之前重复至少一次。
对经分离的TR细胞进行修饰的方法可以和对经分离的EV细胞进行修饰的方法相同或不同。在一些实施方案中，对经分离的TR细胞进行修饰的方法可以和对经分离的EV细胞进行修饰的方法相同。在上述方法的一些实施方案中，对经分离的TR细胞进行基因修饰。在上述方法的一些实施方案中，所述基因修饰包括通过锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)以及规律性间隔的短回文序列重复(CRISPR)、RNA编辑、RNA干扰(RNAi)技术中的任一方法或他们的组合对经分离的TR细胞进行基因修饰。在上述方法的一些实施方案中，通过对人类第2号染色体第60495197位至第60495346位区域的BCL11A基因进行修饰，降低BCL11A功能。在上述方法的一些实施方案中，通过CRISPR/Cas技术对CD34阳性HSPC细胞进行基因修饰，降低BCL11A功能。在上述方法的一些实施方案中，通过BCL11A功能抑制剂对CD34阳性HSPC细胞进行修饰，降低BCL11A功能。在一些实施方案中，所述BCL11A功能抑制剂为抑制BCL11A基因转录和/或表达的蛋白或核酸分子，例如核酸酶(例如ZFN和TALEN)、肽核酸、反义RNA、siRNA、miRNA和shRNA。在一些实施方案中，所述BCL11A功能抑制剂为抑制人类第2号染色体第60495197位至第60495346位区域基因转录和/或表达的蛋白或核酸分子，在一些实施方案中，所述BCL11A功能抑制剂为干扰、抑制或破坏人类第2号染色体第60495197位至第60495346位区域基因转录和/或表达的蛋白或核酸分子。在一些实施方案中，所述BCL11A功能抑制剂为干扰、抑制或破坏人类第2号染色体第60495197位至第60495346位区域的核酸酶(例如ZFN和TALEN)、肽核酸、反义RNA、siRNA、miRNA。
在一些实施方案中，在治疗步骤中包括对该个体进行骨髓动员使得骨髓产生大量的造血干细胞释放进入外周血循环系统。动员CD34阳性HSPC包括在采集CD34阳性HSPC细胞之前(例如4-10天、5-8天、6-7天)给予所述个体粒细胞集落刺激因子(GCSF)和/或普乐沙福(plerixafor)。
在上述方法的一些实施方案中，所述治疗步骤还包括：在施用所述经修饰的TR细胞之前对所述个体进行预治疗。预治疗可包括清髓和/或清淋巴治疗。在一些实施方案中，所述预治疗包括化疗、单克隆抗体疗法或全身放射。在一些实施方案中，所述化疗包括向所述个体施用一种或多种选自由下述组成的组的化学治疗剂：白消安，环磷酰胺(Cyclophosphamide)和氟达拉滨。
在上述方法的一些实施方案中，所述治疗步骤包括向所述个体施用(比如静脉注射,包括单次静脉注射)≥2x106、≥5x106、≥1x107、≥2x107个细胞/kg体重经修饰的TR细胞。
在一些实施方案中，在进行修饰之前将分离的TR细胞培养一天或多天，之后对分离的TR细胞进行修饰。在一些实施方案中，所述经修饰的TR细胞在施用于个体之前培养一天或多天(例如2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天)。在一些实施方案中，在将经修饰的TR细胞施用于个体之前，将经修饰的TR细胞在冷冻条件下储存至少24小时。在一些实施方案中，在冷冻条件下进行储存之前，将经修饰的TR细胞培养一天或多天(例如2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天)。
在上述方法的一些实施方案中，所述血红蛋白病选自由下述组成的组：镰状细胞病、镰状细胞性状、血红蛋白C病、血红蛋白C性状、血红蛋白S/C病、血红蛋白D病、血红蛋白E病、地中海贫血、带有增加的氧亲和力的与血红蛋白相关的病症、带有降低的氧亲和力的与血红蛋白相关的病症、不稳定的血红蛋白病和高铁血红蛋白血症。在一些实施方案中，所述血红蛋白病选自由β-地中海贫血和镰状细胞性贫血组成的组。在一些实施方案中，所述血红蛋白病是β0或β+地中海贫血。
在上述方法的一些实施方案中，其中所述个体是人。在一些实施方案中，所述个体为年龄35岁以下的人。在一些实施方案中，所述个体为男性。在一些实施方案中，所述个体为女性。在一些实施方案中，所述个体为无心脏、肝脏、肺或脾脏并发症的人。在一些实施方案中，所述个体在治疗前的血红蛋白水平不多于5.0g/dL、6.0g/dL、7.0g/dL、8.0g/dL、9.0g/dL外周血。在上述方法的一些实施方案中，其中紧随所述评估步骤进行所述治疗步骤。
附图简述
图1电转Cas9 mRNA编码基因(SEQ ID NO:1)和破坏BCL11A的红系增强子的2个sgRNA,分别是sgRNA-1和sgRNA-2进入5个不同的地中海贫血病人和2个健康供者动员外周血来源的造血干细胞，4天后，“Synthego ICE Analysis”在线软件分析产生Indels效率的统计分析。
图2电转Cas9 mRNA和破坏BCL11A的红系增强子的两个sgRNA，分别是sgRNA-1和sgRNA-2进入5个不同的地中海贫血病人和2个健康供者动员外周血来源的CD34阳性的造血干细胞，进行红细胞分化，18天后检测，检测人CD71和人CD235a两个膜蛋白表达比例，代表红系分化效率。对照组：代表未经过基因编辑的细胞，sgRNA-1和sgRNA-2：分别代表经过两种sgRNA基因编辑的细胞。
图3电转Cas9 mRNA和破坏BCL11A的红系增强子的两个sgRNA，分别是sgRNA-1和sgRNA-2进入5个不同的地中海贫血病人和2个健康供者动员外周血来源的CD34阳性的造血干细胞，进行红细胞分化，18天后检测，通过荧光定量PCR检测HBG(γ-globin)基因mRNA表达。对照组:代表未经过基因编辑的细胞。实验组：分别代表经过两种sgRNA基因编辑的细胞。N＝3个实验重复。HBG基因与GAPDH基因进行归一化处理。
图4A电转Cas9 mRNA和破坏BCL11A的红系增强子sgRNA-2进入2个不同健康供者动员外周血来源的CD34阳性造血干细胞的3个批次的实验，4天后，“Synthego ICE Analysis”在线软件分析产生Indels效率的统计分析。图4B电转Cas9 mRNA和破坏BCL11A的红系增强子sgRNA-2进入10个地中海贫血患者动员外周血来源的CD34阳性造血干细胞多批次实验(病人供者1三个批次，病人供者6，病人供者9和病人供者10各两个独立批次)，2天后，“Synthego ICE Analysis”在线软件分析产生Indels效率的统计分析。
图5电转Cas9 mRNA和破坏BCL11A的红系增强子sgRNA-2进入2个不同健康供者动员外周血来源的CD34阳性造血干细胞的3个批次的实验，进行红细胞分化，18天后检测，检测人CD71和人CD235a两个膜蛋白表达，表示红系分化效率。对照组：代表未经过基因编辑的细胞，实验组：代表经过sgRNA-2基因编辑的细胞。
图6电转Cas9 mRNA和破坏BCL11A的红系增强子sgRNA-2进入10个地中海贫血患者动员外周血来源的CD34阳性造血干细胞多批次实验，进行红细胞分化，18天后检测，检测人CD71和人CD235a两个膜蛋白表达，表示红系分化效率。对照组：代表未经过基因编辑的细胞，实验组：代表经过sgRNA-2基因编辑的细胞。
图7电转Cas9 mRNA和破坏BCL11A的红系增强子sgRNA-2进入第1个健康供者动员外周血来源的CD34阳性造血干细胞的3个批次的红细胞分化实验，分化18天后，通过荧光定量PCR检测BCL11A、HBG((γ-globin))等基因mRNA表达。对照组:代表未经过基因编辑的细胞。实验组：代表经过sgRNA-2基因编辑的细胞。N＝3个实验重复。HBG基因和BCL11A基因分别与GAPDH基因进行归一化处理。
图8电转Cas9 mRNA和破坏BCL11A的红系增强子sgRNA-2进入第2个健康供者动员外周血来源的CD34阳性造血干细胞的3个批次的红细胞分化实验，分化18天后，通过荧光定量PCR检测BCL11A、HBG((γ-globin))等基因mRNA表达。对照组:代表未经过基因编辑的细胞。实验组：代表经过sgRNA-2基因编辑的细胞。N＝3个实验重复。HBG基因和BCL11A基因分别与GAPDH基因进行归一化处理。
图9A电转Cas9 mRNA和破坏BCL11A的红系增强子sgRNA-2进入10个地中海贫血患者动员外周血来源的CD34阳性造血干细胞多批次实验，进行红细胞分化，18天后检测，通过流式试验检测分化出的红细胞中HbF的表达比例。对照组：代表未经过基因编辑的细胞，实验组：代表经过sgRNA-2基因编辑的细胞。图9B不同地中海贫血患者来源的实验组HbF+％和对照组HbF+％的倍数统计分析。
图10地贫患者1来源的实验组HbF+％和对照组HbF+％的倍数的统计分析,n＝3次实验。
图11基因编辑BCL11A红系增强子位点治疗血红蛋白病的全新治疗方案示意图。
具体实施方式
本申请涉及通过降低BCL11A功能，例如通过基因组编辑技术破坏造血干细胞中BCL11A红系增强子位点，将经过基因编辑的造血干细胞进行红细胞分化，通过评估上调γ珠蛋白和胎儿血红蛋白的表达的程度，来预测基因编辑技术治疗血红蛋白病，例如β-地中海贫血和镰刀红细胞贫血是否有效或者有效性高低的方法。
具体地，本申请提供了一种治疗个体中的血红蛋白病的方法，包括：
a)评估步骤，该评估步骤包括评估经修饰的CD34阳性造血干细胞/祖细胞(“CD34阳性HSPC”)的第一群体分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，其中第一群体的经修饰的CD34阳性HSPC来源于所述个体并经过修饰以降低BCL11A功能(“经修饰的EV细胞”)；并且
b)治疗步骤，该治疗步骤包括向所述个体施用第二群体经修饰的CD34阳性HSPC，该经修饰的CD34阳性HSPC来源于所述个体并且经修饰降低了BCL11A功能(“经修饰的TR细胞”)。在上述方法的实施方案中，该第一群体和/或第二群体是通过对人类第2号染色体第60495197位至第60495346位区域的BCL11A基因进行修饰(比如通过CRISPR/Cas技术进行基因修饰,包括将包含选SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:25任一序列的sgRNA导入所述CD34阳性造血干细胞/祖细胞对BCL11A基因进行编辑)来降低BCL11A功能。
一方面，本申请提供一种治疗个体中的血红蛋白病的方法，包括治疗步骤，所述治疗步骤包括向所述个体施用来源于所述个体且经修饰降低了BCL11A功能的第二群体的经修饰CD34阳性HSPC(“经修饰的TR细胞”)，
其中基于经由评估步骤的功能评价选出所述个体用于治疗，所述评估步骤包括：评估第一群体经修饰的CD34阳性HSPC分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，其中第一群体的经修饰CD34阳性HSPC来源于个体并经修饰降低了BCL11A功能(“经修饰的EV细胞”)。在上述方法的实施方案中，该第一群体和/或第二群体是通过对人类第2号染色体第60495197位至第60495346位区域的BCL11A基因进行修饰(比如通过CRISPR/Cas技术进行基因修饰,包括将包含选SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:25任一序列的sgRNA导入所述CD34阳性造血干细胞/祖细胞对BCL11A基因进行编辑)来降低BCL11A功能。
一方面，本申请提供一种选择患有血红蛋白病的个体用于以第二群体的经修饰CD34阳性HSPC进行治疗的方法，所述经修饰CD34阳性HSPC来源于所述个体并经修饰降低了BCL11A功能(“经修饰的TR细胞”)，其中所述方法包括评估步骤，所述评估步骤包括：评估第一群体的经修饰CD34阳性HSPC分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，其中第一群体的经修饰CD34阳性HSPC来源于所述个体并经修饰降低了BCL11A功能(“经修饰的EV细胞”)，其中如果第一群体的经修饰CD34阳性HSPC产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)，则选择所述个体进行治疗。在上述方法的实施方案中，该第一群体和/或第二群体是通过对人类第2号染色体第60495197位至第60495346位区域的BCL11A基因进行修饰(比如通过CRISPR/Cas技术进行基因修饰,包括将包含选SEQ ID NO:3～SEQID NO:25任一序列的sgRNA导入所述CD34阳性造血干细胞/祖细胞对BCL11A基因进行编辑)来降低BCL11A功能。
一方面，本申请提供一种治疗个体中血红蛋白病的方法，包括：
1)评估步骤，其中所述评估步骤包括：
a)从所述个体的骨髓或外周血样品中分离CD34阳性HSPC以获得经分离的CD34阳性HSPC群体(“经分离的EV细胞”)；
b)基因修饰(比如通过CRISPR方法基因修饰)经分离的EV细胞以获得降低了BCL11A功能的第一群体的经修饰CD34阳性HSPC细胞(“经修饰的EV细胞”)；以及
c)评估经修饰的EV细胞分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力；以及
2)治疗步骤，其中所述治疗步骤包括：
a)将所述个体中的CD34阳性HSPC动员至外周血；
b)从所述个体的外周血中分离CD34阳性HSPC以获得经分离的CD34阳性HSPC群体(“经分离的TR细胞”)，
c)基因修饰(比如通过CRISPR方法基因修饰)经分离的TR细胞以获得降低了BCL11A功能的、第二群体的经修饰CD34阳性HSPC(“经修饰的TR细胞”)；以及
d)向所述个体施用(例如静脉注射，包括单次静脉注射)有效量的经修饰的TR细胞。在上述方法的实施方案中，该第一群体和/或第二群体是通过对人类第2号染色体第60495197位至第60495346位区域的BCL11A基因进行修饰(比如通过CRISPR/Cas技术进行基因修饰,包括将包含选SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:25任一序列的sgRNA导入所述CD34阳性造血干细胞/祖细胞对BCL11A基因进行编辑)来降低BCL11A功能。
在上述方法的一些实施方案中，所述用于分离CD34阳性HSPC以产生经分离的EV细胞的骨髓或外周血样品为少量，比如骨髓取样量不多于20ml，例如5-20ml、5-10ml；外周血取样量不多于30ml，例如10-30ml、15-20ml。
在上述方法的一些实施方案中，所述用于分离CD34阳性HSPC以产生经分离的TR细胞的骨髓或外周血样品为多量，比如不少于50mL，例如50-300ml，100-200ml。
在上述方法的一些实施方案中，所述CD34阳性HSPC细胞可由个体骨髓或外周血分离获得。在一些实施方案中，所述分离方法包括磁珠分离。例如将骨髓或外周血中的细胞用超级顺磁性的MACS MicroBeads(MACS微型磁珠)特异性地标记，磁性标记之后，使这些细胞通过一个放在强而稳定磁场中的分选柱(分选柱里的基质造成一个高梯度磁场)。被磁性标记的细胞滞留在柱内而未被标记的细胞流出。当分选柱移出磁场后，滞留柱内的磁性标记细胞便可以被洗脱出来，如此便可以获得标记和未标记的两个细胞群体。在具体的实施方案中，可以使用Ficoll液密度梯度离心法，利用不同成分的比重差异，通过低速密度梯度离心，将血液中不同的细胞层分离开。红细胞和粒细胞密度大于分层液体，并且因红细胞遇到Ficoll液之后会迅速凝集成串钱状而积于管底。唯有与分层液密度相当的单个核细胞富集在血浆层和分层液之间，即白膜层，造血干细胞即存在于此层，通过后续磁珠分选即可获得CD34阳性HSPC细胞。
一方面，本申请提供一种确定患有血红蛋白病的个体是否适合于用来源于所述个体并经修饰降低了BCL11A功能的第二群体的经修饰CD34阳性HSPC(“经修饰的TR细胞”)进行治疗的方法，其中所述方法包括评估步骤，其包括：评估第一群体的经修饰CD34阳性HSPC分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，其中第一群体的经修饰的CD34阳性HSPC来源于所述个体并经修饰降低了BCL11A功能(”经修饰的”EV细胞)，其中如果第一群体的经修饰CD34阳性HSPC产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)，则所述个体适于治疗。
一方面，本申请提供一种确定患有血红蛋白病的个体不适合用来源于所述个体并经修饰降低了BCL11A功能的第二群体的经修饰CD34阳性HSPC(“经修饰的TR细胞”)进行治疗的方法，其中所述方法包括评估步骤，其包括：评估第一群体的经修饰的CD34阳性HSPC分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，其中第一群体的经修饰的CD34阳性HSPC来源于所述个体并经修饰降低了BCL11A功能(“经修饰的”EV细胞)，其中如果第一群体的经修饰的CD34阳性HSPC不产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)，则所述个体不适合用所述第二群体的经修饰CD34阳性HSPC(“经修饰的TR细胞”)进行治疗。
“造血干细胞”是指具有旺盛的增殖潜力、多向分化的能力和自我更新能力的细胞群体。造血干细胞不仅能分化、补充各种血细胞，还能通过自我更新保持干细胞的特性和数量。造血干细胞的分化程度和增殖能力不一，有异质性。多能造血干细胞最原始，先分化为定向多能造血干细胞，例如能生成粒系、红系、单核系和巨核-血小板系的髓系造血干细胞及能发生B淋巴细胞和T淋巴细胞的淋巴干细胞。这两类干细胞既保持着造血干细胞基本特点，又略有分化，分别负责“骨髓成分”和淋巴细胞的发生，故称定向多能造血干细胞。它们进一步分化成为造血祖细胞，此细胞虽然也是原始的血细胞，但是它已丧失造血干细胞的许多基本特点，如已失去多向性分化能力，只能朝向一系或密切相关的二系细胞分化；失去了反复自我更新能力，而要依靠造血干细胞的增殖分化来补充数量；增殖潜力有限，只能分裂数次。根据造血祖细胞所能分化生成的血细胞系多少，又分为单能造血祖细胞(只分化为一个血细胞系)和寡能造血祖细胞(可分化为2～3个血细胞系)。本申请中“造血干细胞/祖细胞”和“造血干细胞”术语可以互换使用，涵盖多能造血干细胞、定向多能造血干细胞和造血祖细胞，是具有不同异质性的造血干细胞的总称。
本申请所述的“CD34阳性造血干细胞/祖细胞”，简写CD34阳性HSPC(hematopoietic stem/progenitor cell，HSPC)，指表面表达CD34标志物的、有造血功能的干细胞和祖细胞细胞群体。可以使用例如流式细胞术和荧光标记的抗CD34抗体来检测和计数CD34阳性造血干细胞/祖细胞。
在具体实施方案中，CD34阳性造血干细胞/祖细胞从包含造血来源细胞的生物体(个体)分离或获得。“分离”是指从其原始环境取出。例如，如果细胞与在其天然状态通常伴随它的一些或所有组分分开时，则它是分离的。
造血干细胞/祖细胞可以从成人的未分级分离或分级分离的骨髓获得或分离，包括股骨，髋骨，肋骨，胸骨和其它骨骼。造血干细胞和祖细胞可以利用针和注射器从髋骨取出直接获得或分离，或者从血液中获得，通常是在造血干细胞动员剂诸如G-CSF(粒细胞集落刺激因子)预处理后从血液中获得。造血干细胞和祖细胞的其他来源包括脐带血、胎盘血和经过动员的个体的外周血。
从个体(例如骨髓或外周血)分离获得细胞群体后可对其进行进一步纯化获得CD34阳性造血干细胞/祖细胞。例如可以通过免疫去除分离的细胞群体中的成熟谱系定向细胞，例如通过用结合一组“谱系”抗原(例如CD2，CD3，CD11b，CD14，CD15，CD16，CD19，CD56，CD123和CD235a)的抗体标记固体基质，之后用结合CD34阳性抗原的抗体分离原始造血干细胞和祖细胞。用于从多种细胞来源纯化造血干细胞和祖细胞的试剂盒是商业可获得的，并且在具体实施方案中，这些试剂盒可以与本发明的方法一起使用。
“CD34阳性造血干细胞/祖细胞”可代表富含CD34阳性细胞的细胞群中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的CD34阳性造血干细胞/祖细胞细胞群体。
经“修饰”的细胞是指细胞通过生物或化学方法在分子水平或细胞水平上发生了变化。例如经分离的CD34阳性造血干细胞/祖细胞(“CD34阳性HSPC”)通过基因编辑方法，例如通过选自ZFN,TALEN、CHRISPR、RNA编辑或RNAi技术破坏了BCL11A基因或其编码RNA产生BCL11A功能降低的经修饰的EV细胞或经修饰的TR细胞。也可通过例如核酸酶(例如ZFN和TALEN)、肽核酸、反义RNA、siRNA、miRNA、shRNA等BCL11A功能抑制剂抑制BCL11A基因的功能从而实现对经分离的CD34阳性造血干细胞/祖细胞(“CD34阳性HSPC”)的修饰，产生经修饰的EV细胞或经修饰的TR细胞。
CD34阳性
“EV细胞”在本文中代表用于进行评估(Evaluation，EV)的细胞；而“TR细胞”在本文中代表用于进行治疗(Treatment，TR)的细胞。
造血干细胞“动员(mobilization)”是指处于造血微环境中的造血干细胞在受到动员剂的作用后从特定的骨髓微环境中运动迁移到外周循环的过程。
血红蛋白病(hemoglobinopathy)是由于血红蛋白分子结构异常或珠蛋白肽链合成异常所引起的一组遗传性血液病。临床可表现溶血性贫血、高铁血红蛋白血症或因血红蛋白氧亲和力增高或减低而引起组织缺氧或代偿性红细胞增多所致紫绀等。
“血红蛋白”是一种结合蛋白，由珠蛋白和血红素构成。珠蛋白分子有二对肽链，一对是α链，另一对是非α链，有β、γ、δ、ξ(结构与α链相似)及ε5种。人类血红蛋白是由二对(4条)血红蛋白单体(每一条肽链和一个血红素连接，构成一个血红蛋白单体)按一定的空间关系结合成四聚体，如HbA(或HbA1，α2β2)、HbA2(α2δ2)及HbF(α2γ2)。其中，HbF(α2γ2)为胎儿血红蛋白四聚体。
如本文使用，“BCL11A”是一种转录因子，首先在小鼠中发现，作为逆转录病毒的结合位点，被命名为Evi9,后来在人类基因组中也发现这一基因，定位于2号染色体短臂2p13位点。
经过修饰BCL11A功能降低是指通过修饰，例如经过基因修饰(例如DNA水平和/或RNA水平的基因编辑)或通过加入BCL11A功能抑制剂(例如针对BCL11A基因的核酸酶(例如ZFN和TALEN)、肽核酸、反义RNA、siRNA、miRNA、shRNA)使BCL11A基因被破坏、表达和/或转录被抑制、减弱、受阻、干扰。
如本申请使用的，“CRISPR/Cas”是一种基因编辑技术，包括但不限于各种自然存在或人工设计的CRISPR/Cas系统,如CRISPR/Cas9系统。自然存在的CRISPR/Cas系统(Naturally occurring CRISPR/Cas system)是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。例如，CRISPR/Cas9的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计tracrRNA和crRNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(singleguide RNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割。作为一种RNA导向的dsDNA结合蛋白，Cas9效应物核酸酶能够共定位RNA、DNA和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。CRISPR/Cas系统可使用一类，二类或三类Cas蛋白。本发明的一些实施方式中，所述方法使用Cas9。其他适用的CRISPR/Cas系统包括但不限于WO2013176772，WO2014065596，WO2014018423，US8,697,359、PCT/CN2018/112068、PCT/CN2018/112027中所描述的系统和方法。
在上述方法的一些实施方案中，所述方法包括对经分离的EV细胞进行基因修饰。在上述方法的一些实施方案中，所述基因修饰包括
通过锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)以及规律性间隔的短回文序列重复(CRISPR)、RNA编辑、RNA干扰(RNAi)技术中的任一方法或他们的组合对经分离的EV细胞进行基因修饰。
在本发明的一些实施方案中，通过基因修饰(例如选自(ZFN、TALEN、CRISPR、RNA编辑或RNAi)方法破坏BCL11a增强子(影响例如增强BCL11a的表达或功能的核酸序列)。所述BCL11a增强子参见例如，Bauer等人,Science[科学],第342卷,2013,第253-257页所述。所述BCL11a增强子的一个实例是BCL11a基因的外显子2和外显子3之间的核酸序列(例如，位于或对应于如hg38中所记录的位置+55:Chr2:60497676-60498941；+58:Chr2:60494251-60495546；+62:Chr2:60490409-60491734处的核酸)。所述BCL11a增强子的一个实例是BCL11a基因的外显子2和外显子3之间的核酸序列的+62区域。所述BCL11a增强子的一个实例是BCL11a基因的外显子2和外显子3之间的核酸序列的+58区域(BCL11A基因58K位点150bp序列：ctgccagtcctcttctaccccacccacgcccccaccctaatcagaggccaaacccttcctggagcctgtgataaaagcaactgttagcttgcactagactagcttcaaagttgtattgaccctggtgtgttatgtctaagagtagatgcc)(SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，BCL11a增强子是BCL11a基因的外显子2和外显子3之间的核酸序列的+55区域。
在上述方法的一些实施方案中，通过对人类第2号染色体第60495197位至第60495346位区域的BCL11A基因进行修饰，降低BCL11A功能。在上述方法的一些实施方案中，通过CRISPR/Cas技术对CD34阳性HSPC细胞进行修饰，降低BCL11A功能。在一些实施方案中，所述BCL11A功能抑制剂为抑制人类第2号染色体第60495197位至第60495346位区域基因转录和/或表达的蛋白或核酸分子，在一些实施方案中，所述BCL11A功能抑制剂为干扰、抑制或破坏人类第2号染色体第60495197位至第60495346位区域基因转录和/或表达的蛋白或核酸分子。在一些实施方案中，所述BCL11A功能抑制剂为干扰、抑制或破坏人类第2号染色体第60495197位至第60495346位区域的核酸酶(例如ZFN和TALEN)、肽核酸、反义RNA、siRNA、miRNA。在上述方法的一些实施方案中，通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495219位至第60495336位的BCL11A基因组区域减低BCL11A功能。在上述方法的一些实施方案中，所述基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术、RNA编辑技术、RNAi技术。在上述方法的一些实施方案中，所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9基因编辑技术。在上述方法的一些实施方案中，所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与选自SEQ ID No.3～SEQ ID No.25任一的序列互补。
在上述方法的一些实施方案中，将包含选自SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:25任一序列的sgRNA导入所述CD34阳性造血干细胞/祖细胞对BCL11A基因进行编辑，减低BCL11A功能。在上述方法的一些实施方案中，所述sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的。在上述方法的一些实施方案中，所述化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。在上述方法的一些实施方案中，将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述CD34阳性造血干细胞/祖细胞。在上述方法的一些实施方案中，通过电转方法将sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入造血干细胞。在上述方法的一些实施方案中，所述电转条件为200-600V，0.5ms-2ms。
细胞“分化”是指同一来源的细胞逐渐产生形态结构、功能特征各不相同的细胞类群的过程。
从造血干细胞到红细胞的“分化”包括造血干细胞阶段、红系祖细胞阶段、红系前体细胞(原红细胞至晚红细胞)的增殖与分化阶段、网织红细胞的增殖及成熟过程，以及网织红细胞向外周血释放成熟为红细胞的阶段。造血干细胞阶段：目前已知，造血干细胞主要存在于骨髓、脾、肝等造血组织内。也有少量循环于外周血中。红系祖细胞阶段：在红系祖细胞(progenitor cell)阶段，细胞是处于造血干细胞与红系前体细胞之间的细胞群。造血干细胞在骨髓造血微环境的影响下分化为红系祖细胞。造血微环境包括微血管系统、神经系统和造血间质等部分。通过体液因子、细胞因子对造血干细胞的分化起特殊的作用和影响。红系前体细胞阶段：包括原始红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞及网织红细胞阶段而达到成熟红细胞。
细胞成熟的过程是血红蛋白增加和细胞核活性衰减的过程。随着细胞的成熟，有核红细胞中的血红蛋白含量不断增加，RNA的含量不断减少。红细胞内血红蛋白的增高促使核失去活性，不再合成DNA或RNA。实验证实这是由于血红蛋白通过核膜间孔进入核内，作用于核组蛋白(nucleohistones)，导致染色体失活而促进核凝缩。晚幼红细胞已失去继续分裂的能力，以后细胞核浓缩并逸出，被单核巨噬细胞吞噬，或在脾脏内碎裂、溶解，成为无细胞核的网织红细胞。在成熟红细胞阶段不再合成血红蛋白。根据细胞内血红蛋白浓度的增高会促使细胞核失去活性的理论，红细胞成熟过程分裂的次数、细胞最终的大小与血红蛋白合成的快慢有一定的关系。随着细胞的成熟，红系细胞的直径逐渐缩短，细胞体积也逐渐缩小。这是因为细胞内一些用以合成血红蛋白、基质蛋白及各种酶的细胞器(如线粒体、高尔基器、聚核糖体)逐渐减少，细胞器也逐渐退化消失。基因活性在红细胞成熟过程中是由珠蛋白的表达所支配。珠蛋白在原始红细胞中仅占蛋白质的0.1％，到网织红细胞时达95％。已知成年人珠蛋白的合成主要是HbA(α2β2)，少量的HbA2(α2δ2)及HbF(α2γ2)。应用方向性核素标记细胞增殖周期DNA合成能力作指标可以推算红系细胞的增殖时间，原始红细胞的增殖时间约为20小时，早幼红细胞约为16小时，中幼红细胞为25～30小时，晚幼红细胞不具备合成DNA的能力，属非增殖性细胞。故正常红系前体细胞由骨髓生成，经过增殖、分化直到新生网织红细胞从骨髓中逸出约需3～5天。网织红细胞以后又在脾内停留1～2天，继续成熟且改变膜脂质成分后再进入血循环。
“所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力”表示与不经过修饰的EV细胞分化后产生γ-球蛋白或胎儿血红蛋白的水平相比，EV细胞经修饰并分化后产生γ-球蛋白或胎儿血红蛋白的水平提高，例如提高至少0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、1.0倍、1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6.0倍或更多。例如，在本申请的一些实施方案中，所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白为相对于不经修饰的CD34阳性HSPC，经修饰的CD34阳性HSPC产生120％、130％、140％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％，或更高水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白。
在上述实施方案中，评估第一群体经修饰的CD34阳性HSPC分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力是指评估经修饰降低了BCL11A功能的CD34阳性HSPC分化后产生γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的水平是否比未经此修饰的CD34阳性HSPC分化后产生的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)水平至少提高约12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、120％。
在上述方法的一些实施方案中，所述所需水平的胎儿血红蛋白超过6.5g/dL、7.0g/dL、7.5g/dL、8.0g/dL、8.5g/dL、9.0g/dL、9.5g/dL、10g/dL、10.5g/dL、11.0g/dL外周血，或更高水平。
在上述方法的一些实施方案中，所述所需水平的γ-球蛋白为相对于不经修饰的CD34阳性HSPC，经修饰的CD34阳性HSPC产生超过50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％，或更高水平的γ-球蛋白mRNA。
上述γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的水平可以在CD34阳性HSPC分化到无核红细胞占全部分化细胞群体总数的10％以上(例如15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％)后通过例如检测γ-球蛋白mRNA或血红蛋白(HbF)检测，来比较经修饰降低了BCL11A功能的CD34阳性HSPC分化后产生γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的水平是否比未经此修饰的CD34阳性HSPC分化后产生的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)水平至少提高约12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、120％。
在一些实施方案中，所述经修饰降低了BCL11A功能的CD34阳性HSPC是通过对人类第2号染色体第60495197位至第60495346位区域的BCL11A基因进行修饰(比如通过CRISPR/Cas技术进行基因修饰,包括将包含选SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:25任一序列的sgRNA导入所述CD34阳性造血干细胞/祖细胞对BCL11A基因进行编辑)来降低BCL11A功能的。
在上述方法的一些实施方案中，在评估步骤中评估经修饰的EV细胞分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，所述步骤包括：i)在允许分化以获得红细胞群体的条件下培养经修饰的EV细胞；以及2)确定所述红细胞产生的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的水平。
在上述方法的一些实施方案中，在评估步骤中评估经修饰的EV细胞中分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力包括：确定γ-球蛋白的mRNA水平。在上述方法的一些实施方案中，在评估步骤中评估经修饰的EV细胞分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力包括：确定胎儿血红蛋白(HbF)的蛋白质水平。在上述方法的一些实施方案中，其中所述个体在评估步骤之前未经历过CD34阳性HSPC细胞动员或预治疗。
在一些实施方案中，所述CD34阳性HSPC细胞动员包括给予受试者个体G-CSF和/或MozobilTM(Genzyme公司)或其它造血干细胞动员剂。
在上述方法的一些实施方案中，所述评估步骤在所述治疗步骤之前重复至少一次，比如2、3、4、5次或更多次。
分离的TR细胞可以通过采用与修饰分离的EV细胞同样的或不同的方法进行修饰。在上述方法的一些实施方案中，将经分离的TR细胞进行基因修饰。在上述方法的一些实施方案中，在上述方法的一些实施方案中，所述方法包括对经分离的TR细胞进行基因修饰。在上述方法的一些实施方案中，所述基因修饰包括通过锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)以及规律性间隔的短回文序列重复(CRISPR)中的任一方法或他们的组合对经分离的TR细胞进行基因修饰。
在本发明的一些实施方案中，通过基因修饰(例如选自(ZFN、TALEN、CRISPR、RNA编辑、RNAi)方法破坏分离的EV细胞或TR细胞中的BCL11a增强子(影响例如增强BCL11a的表达或功能的核酸序列)。所述BCL11a增强子参见例如，Bauer等人,Science[科学],第342卷,2013,第253-257页所述。所述BCL11a增强子的一个实例是BCL11a基因的外显子2和外显子3之间的核酸序列(例如，位于或对应于如hg38中所记录的位置+55:Chr2:60497676-60498941；+58:Chr2:60494251-60495546；+62:Chr2:60490409-60491734处的核酸)。所述BCL11a增强子的一个实例是BCL11a基因的外显子2和外显子3之间的核酸序列的+62区域。所述BCL11a增强子的一个实例是BCL11a基因的外显子2和外显子3之间的核酸序列的+58区域。在一些实施方案中，BCL11a增强子是BCL11a基因的外显子2和外显子3之间的核酸序列的+55区域。
在上述方法的一些实施方案中，通过对人类第2号染色体第60495197位至第60495346位区域的BCL11A基因进行修饰，降低BCL11A功能。在上述方法的一些实施方案中，通过CRISPR/Cas技术对CD34阳性HSPC细胞进行修饰，降低BCL11A功能。在一些实施方案中，所述BCL11A功能抑制剂为抑制人类第2号染色体第60495197位至第60495346位区域基因转录和/或表达的蛋白或核酸分子，在一些实施方案中，所述BCL11A功能抑制剂为干扰、抑制或破坏人类第2号染色体第60495197位至第60495346位区域基因转录和/或表达的蛋白或核酸分子。在一些实施方案中，所述BCL11A功能抑制剂为干扰、抑制或破坏人类第2号染色体第60495197位至第60495346位区域的核酸酶(例如ZFN和TALEN)、肽核酸、反义RNA、siRNA、miRNA。
在上述方法的一些实施方案中，通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495219位至第60495336位的BCL11A基因组区域减低BCL11A功能。在上述方法的一些实施方案中，所述基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术、RNA编辑技术、RNAi技术。在上述方法的一些实施方案中，所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9基因编辑技术。在上述方法的一些实施方案中，所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与选自SEQ ID No.3～SEQ ID No.25任一的序列互补。
下表列出了SEQ ID No.3～SEQ ID No.25所示sg RNA所靶向的人染色体2上的基因组序列位置，以及每条sgRNA引起的Cas9切割的切割位点。
SEQ ID NO:3：名称为BCL11A的增强子-1的sgRNA(有时也简称为enhancer-1)sgRNA编码序列：
cacaggctccaggaagggtt
SEQ ID NO:4：名称为BCL11A的增强子-2的sgRNA(有时也简称为enhancer-2)sgRNA编码序列：
atcagaggccaaacccttcc
SEQ ID NO:5：名称为BCL11A的增强子-3的sgRNA(有时也简称为enhancer-3)sgRNA编码序列：
Ctaacagttgcttttatcac
SEQ ID NO:6：名称为BCL11A的增强子-4的sgRNA(有时也简称为enhancer-4)sgRNA编码序列：
ttgcttttatcacaggctcc
SEQ ID NO:7：名称为BCL11A的增强子-5的sgRNA(有时也简称为enhancer-5)sgRNA编码序列：
ttttatcacaggctccagga
SEQ ID NO:8：名称为BCL11A的增强子-6的sgRNA(有时也简称为enhancer-6)sgRNA编码序列：
tttatcacaggctccaggaa
SEQ ID NO:9：名称为BCL11A的增强子-7的sgRNA(有时也简称为enhancer-7)sgRNA编码序列：
tgggtggggtagaagaggac
SEQ ID NO:10：名称为BCL11A的增强子-8的sgRNA(有时也简称为enhancer-8)sgRNA编码序列：
gggcgtgggtggggtagaag
SEQ ID NO:11：名称为BCL11A的增强子-9的sgRNA(有时也简称为enhancer-9)sgRNA编码序列：
ttagggtgggggcgtgggtg
SEQ ID NO:12：名称为BCL11A的增强子-10的sgRNA(有时也简称为enhancer-10)sgRNA编码序列：
attagggtgggggcgtgggt
SEQ ID NO:13：名称为BCL11A的增强子-11的sgRNA(有时也简称为enhancer-11)sgRNA编码序列：
gattagggtgggggcgtggg
SEQ ID NO:14：名称为BCL11A的增强子-12的sgRNA(有时也简称为enhancer-12)sgRNA编码序列：
tctgattagggtgggggcgt
SEQ ID NO:15：名称为BCL11A的增强子-13的sgRNA(有时也简称为enhancer-13)sgRNA编码序列：
ctctgattagggtgggggcg
SEQ ID NO:16：名称为BCL11A的增强子-14的sgRNA(有时也简称为enhancer-14)sgRNA编码序列：
cacgcccccaccctaatcag
SEQ ID NO:17：名称为BCL11A的增强子-15的sgRNA(有时也简称为enhancer-15)sgRNA编码序列：
ttggcctctgattagggtgg
SEQ ID NO:18：名称为BCL11A的增强子-16的sgRNA(有时也简称为enhancer-16)sgRNA编码序列：
tttggcctctgattagggtg
SEQ ID NO:19：名称为BCL11A的增强子-17的sgRNA(有时也简称为enhancer-17)sgRNA编码序列：
gtttggcctctgattagggt
SEQ ID NO:20：名称为BCL11A的增强子-18的sgRNA(有时也简称为enhancer-18)sgRNA编码序列：
ggtttggcctctgattaggg
SEQ ID NO:21：名称为BCL11A的增强子-19的sgRNA(有时也简称为enhancer-19)sgRNA编码序列：
aagggtttggcctctgatta
SEQ ID NO:22：名称为BCL11A的增强子-20的sgRNA(有时也简称为enhancer-20)sgRNA编码序列：
gaagggtttggcctctgatt
SEQ ID NO:23：名称为BCL11A的增强子-21的sgRNA(有时也简称为enhancer-21)sgRNA编码序列：
actcttagacataacacacc
SEQ ID NO:24：名称为BCL11A的增强子-22的sgRNA(有时也简称为enhancer-22)sgRNA编码序列：
cttcaaagttgtattgaccc
SEQ ID NO:25：名称为BCL11A的增强子-23的sgRNA(有时也简称为enhancer-23)sgRNA编码序列：
ctcttagacataacacacca
分析上述23条sg RNA的切割位点发现，这些sgRNA所引发的Cas9切割的切割位点集中在BCL11A基因第60495219位至第60495336位基因组区域。
一般而言，sgRNA中的指导序列是与靶序列具有足够的互补性以与靶序列杂交并指导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用适当的比对算法最佳比对时，指导序列及其相应靶序列间的互补程度为约或大于约80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更多。最佳比对可使用用于比对序列的任何适当的算法确定，其非限制性实例包括Smith-Waterman算法、Needleman-Wimsch算法、基于Burrows-Wheeler Transform的算法(例如Burrows Wheeler Aligner)、ClustalW、ClustaiX、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies,ELAND((Illumina,San Diego,CA)、SOAP(可在soap.genomics.org.cn获得)和Maq(可在maq.sourceforge.net获得)。在一些实施方案中，指导序列长度可以为约或大于约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或更多个核苷酸。在一些实施方案中，指导序列长度少于约75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、12或更少的核苷酸。指导序列指导CR1SPR复合物与靶序列的序列特异性结合的能力可通过任何适当的测定方法评估。例如，可向具有相应靶序列的宿主细胞提供足以形成CRISPR复合物的CRISPR系统的组件(包括待测试的指导序列)，如可通过使用编码CRISPR序列组件的载体转染，随后评估靶序列内的优先切割(如通过如本文所述的Surveyor测定)来进行。同样地，靶多核苷酸序列的切割可在测试管中通过提供靶序列、CRISPR复合物(包含待测试的指导序列和不同于指导序列的对照指导序列)的组件，并比较测试和对照指导序列在靶序列的结合或切割率，以此进行评估。也可以使用本领域技术人员知道的其它测定方法进行上述测定和评估。
在一些实施方案中，进行基因编辑过程中所使用的sgRNA是经过化学修饰的。“化学修饰的sgRNA”指针对sgRNA进行特殊的化学修饰，例如在其5’和3’末端3个碱基处的2’-O-甲基类似物修饰和/或核苷酸间的3’硫代修饰。
经过化学修饰的sgRNA至少具有以下两个优点。第一、由于sgRNA是单链形式的RNA，其半衰期非常短，进入到细胞后，会迅速降解(最长不超过12小时)，而Cas9蛋白结合sgRNA发挥基因编辑作用则至少需要48hrs。因此，采用经过化学修饰的sgRNA，进入细胞后，稳定表达，与Cas9蛋白结合后，能高效基因编辑基因组，产生Indels。第二、未经修饰的sgRNA穿透细胞膜能力差，无法有效进入细胞或组织发挥相应功能。而经过了化学修饰的sgRNA穿透细胞膜的能力通常是增强的。在本发明中可以采用本领域中常用的化学修饰方法，只要能够提高sgRNA稳定性(延长半衰期)和提升进入细胞膜能力，均可以使用。除了实施例中使用的具体的化学修饰之外，还包括采用其它的修饰方法，例如，Deleavey GF1,Damha MJ.Designing chemically modified oligonucleotides for targeted genesilencing.Chem Biol.2012Aug 24；19(8):937-54，以及Hendel et al.Chemicallymodified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primarycells.Nat Biotechnol.2015Sep；33(9):985-989文献中报道的化学修饰方法。
在一些实施方案中，所述sgRNA和/或Cas9编码核苷酸(如mRNA)通过电转导入造血干细胞，例如，通过250-360V，0.5-1ms；250-300V，0.5-1ms；250V 1ms；250V 2ms；300V0.5ms；300V 1ms；360V 0.5ms；或360V1ms的电转条件导入造血干细胞。在一些实施方案中，所述sgRNA和Cas9编码核苷酸通过电转方式共同导入造血干细胞。在一些实施方案中，所述sgRNA通过电转方式导入表达Cas9的造血干细胞。
在一些实施方案中，所述Cas9编码核苷酸为mRNA，如含有ARCA帽的mRNA。在一些实施方案中，所述Cas9编码核苷酸在病毒载体中，如慢病毒载体。在一些实施方案中，所述Cas9编码核苷酸包含如SEQ ID NO：26所述的序列。在一些实施方案中，所述sgRNA与Cas9编码核苷酸在同一载体中。
在上述方法的一些实施方案中，将包含选自SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:25任一序列的sgRNA导入所述CD34阳性造血干细胞/祖细胞对BCL11A基因进行编辑，减低BCL11A功能。在上述方法的一些实施方案中，所述sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的。在上述方法的一些实施方案中，所述化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。在上述方法的一些实施方案中，将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述CD34阳性造血干细胞/祖细胞。在上述方法的一些实施方案中，通过电转方法将sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入造血干细胞。在上述方法的一些实施方案中，所述电转条件为200-600V，0.5ms-2ms。
在上述方法的一些实施方案中，在治疗步骤中动员CD34阳性HSPC包括：用粒细胞集落刺激因子(GCSF)和/或普乐沙福(plerixafor)治疗所述个体。
在上述方法的一些实施方案中，所述治疗步骤还包括：在施用所述经修饰的TR细胞之前对所述个体进行预治疗。
在一些实施方案中，所述预治疗包括化疗、单克隆抗体疗法或全身放射。在一些实施方案中，所述化疗包括向所述个体施用一种或多种选自由下述组成的组的化学治疗剂：白消安，环磷酰胺和氟达拉滨。
在上述方法的一些实施方案中，经修饰的EV细胞群体经过体外培养进一步分化为表达γ-球蛋白或胎儿血红蛋白的红细胞前体细胞或成熟红细胞。
在一些实施方案中，所述红细胞前体细胞为处于成熟红细胞之前的能够表达γ-球蛋白或胎儿血红蛋白的前体细胞。
在上述方法的一些实施方案中，使用造血干细胞红系扩增和分化培养基对经修饰的EV细胞群体进行造血干细胞红系扩增和分化，其中，所述造血干细胞红系扩增和分化培养基包括基础培养基，以及生长因子的组合物，其中所述生长因子的组合物包括干细胞生长因子(SCF)；白介素3(IL-3)和促红细胞生成素(EPO)。在一些实施方案中，还包括使用红系分化脱核培养基进行造血干细胞红系分化脱核，所述红系分化脱核培养基包含基础培养基、生长因子、以及孕酮受体和糖皮质激素受体的拮抗剂和/或抑制剂。在一些实施方案中，所述红系分化脱核培养基中的生长因子包括促红细胞生成素(EPO)，所述孕酮受体和糖皮质激素受体的拮抗剂和/或抑制剂为选自下述化合物(I)～(IV)中的任一种或两种及以上：
在一些实施方案中，所述造血干细胞红系扩增和分化培养基包含基础培养基和生长因子添加剂，其中所述基础培养基可选自任何无血清基础培养基，例如STEMSPANTMSFEMII(STEM CELLS TECHNOLOGY Inc.),IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)，可选择地补充有ITS(Thermofisher)、L-gulutamin(Thermofisher)、维生素C和/或牛血清白蛋白；其中生长因子添加剂选自IL-3、SCF和EPO中的一个或多个的组合。
在上述方法的一些实施方案中，将经修饰的EV细胞群体经过5-10天，例如6-10天、7-10天的扩增和分化后获得红细胞前体细胞，例如成红细胞(erythroblast)、有核红细胞、幼红细胞和网织红细胞。将红细胞前体细胞再经过约4-14天，例如约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天的分化(或分化脱核)处理获得成熟的红细胞。
在一些实施方案中，经修饰的EV细胞群体分化为产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的成熟红细胞的步骤可包括：
a)从人的外周血(经过或不经过骨髓造血干细胞动员)或骨髓中获得CD34阳性造血干细胞/祖细胞(经分离的CD34阳性HSPC)，
b)对上述CD34阳性HSPC进行基因修饰以降低BCL11A功能；
c)在无血清培养基(Serum-free medium(SFME))中，添加额外的生长因子，经过5-10天，例如5天、6天、7天、8天、9天、10天扩增和分化，使HSPC分化成为红细胞前体细胞；
d)在无血清培养基(Serum-free medium(SFME))中，添加额外的生长因子，经过约4-14天，(例如约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天)分化后，获得成熟的红细胞。在一些实施方案中，所述造血干细胞红系分化脱核培养基包含基础培养基、生长因子及化学小分子添加剂，其中所述基础培养基为无血清基础培养基，例如可以为STEMSPANTMSFEM II(STEM CELLS TECHNOLOGY Inc.)、IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)，任选地添加有ITS(Thermofisher)、L-gulutamin(Thermofisher)、维生素C和/或牛血清白蛋白，生长因子及化学小分子添加剂包括EPO、人转铁蛋白和/或化学小分子mifepristone。
经修饰的CD34阳性HSPC(EV细胞群体)分化后产生γ-球蛋白mRNA或血红蛋白(HbF)，产生的γ-球蛋白mRNA或血红蛋白(HbF)可以通过本领域常规方法检测。例如，当经修饰的CD34阳性HSPC(EV细胞群体)分化到无核红细胞占全部分化细胞群体总数的约10％以上(例如15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％)后，可以通过本领域常规方法检测产生的γ-球蛋白mRNA或血红蛋白(HbF)水平，比较经修饰降低了BCL11A功能的CD34阳性HSPC分化后产生的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)是否比未经此修饰的CD34阳性HSPC分化后产生的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)水平提高。如果提高了至少约12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、120％，表明可以用本发明的方法进行治疗。在上述造血干细胞红系扩增和分化培养基和造血干细胞红系分化脱核培养基中可以使用任何常用的基础培养基，例如STEMSPANTMSFEM II(购自STEM CELLTECHONOLOGIES)；例如购自Thermo Fisher的IMDM、DF12、Knockout DMEM、RPMI 1640、AlphaMEM、DMEM等。此外，可以根据需要向这些基础培养基中进一步添加其他成分，例如可以添加ITS(即主要包括胰岛素、人转铁蛋白以及硒元素)、L-谷氨酰胺、维生素C以及牛血清白蛋白。例如可以在IMDM培养基中外加ITS、外加2mM L-谷氨酰胺、外加10-50μg/ml维生素C以及0.5-5质量％的BSA(牛血清白蛋白)。此外，上述DF12可以外加同样浓度的ITS，L-谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白。Knockout DMEM可以外加同样浓度的ITS，L-谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白，RPMI 1640可以外加同样浓度的ITS，L-谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白，Alpha MEM可以外加同样浓度的ITS，L-谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白，DMEM也可以外加同样浓度的ITS，L-谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白。在此，各种基础培养基中外加的ITS的浓度可以是：胰岛素浓度是0.1mg/ml、人转铁蛋白是0.0055mg/ml、硒元素6.7×10- 6mg/ml。此外，外加的ITS各成分的浓度也可以根据实际需要来调整。ITS可以从Thermofisher购买，并根据需要调节成合适的最终使用浓度。
在上述方法的一些实施方案中，经修饰的TR细胞群体在被给予个体之前不被离体或体外增殖。在具体实施方案中，可以洗涤所述经修饰的TR细胞以除去处理试剂，并且将其给予患者而不对其进行离体增殖。在一些实施方案中，在经修饰的TR细胞发生任何明显的离体细胞分裂之前，或在任何明显的离体细胞分裂所需时间之前给予患者。在一些实施方案中，经修饰的TR细胞在被修饰后施用于个体之前培养一天或多天。在一些实施方案中，经修饰的TR细胞在被修饰后2、4、6、12、24、48小时之内给予患者。
在一些实施方案中，在将经修饰的TR细胞施用于个体之前，将经修饰的TR细胞在冷冻条件下储存至少24小时。在一些实施方案中，在冷冻条件下进行储存之前，将经修饰的TR细胞培养一天或多天。经修饰的TR细胞可以在无血清基础培养基基础上添加有维持细胞活力的细胞因子的培养基中培养一天或多天(例如1天-3天)，所述细胞因子例如SCF(StemCell Factor),TPO(Thrombopoietin),FLT-3L(FMS-like Tyrosine Kinase 3Ligand),IL-6(Interleukin-6)。例如可以在Stem Cell Growth Medium(CellGenix)中培养培养一天或多天(例如1天-3天)。
在一些实施方案中，在进行修饰之前将分离的TR细胞培养一天或多天，之后对分离的TR细胞进行修饰。
在上述方法的一些实施方案中，所述血红蛋白病选自由下述组成的组：镰状细胞病、镰状细胞性状、血红蛋白C病、血红蛋白C性状、血红蛋白S/C病、血红蛋白D病、血红蛋白E病、地中海贫血、带有增加的氧亲和力的与血红蛋白相关的病症、带有降低的氧亲和力的与血红蛋白相关的病症、不稳定的血红蛋白病和高铁血红蛋白血症。在一些实施方案中，所述血红蛋白病选自由β-地中海贫血和镰状细胞性贫血组成的组。在一些实施方案中，所述血红蛋白病是β0或β+地中海贫血。
在上述方法的一些实施方案中，其中所述个体是人。在上述方法的一些实施方案中，其中紧随所述评估步骤进行所述治疗步骤。
如本文所用的，术语“治疗”是指获得所需的药理学和/或生理效果，包括但不限于，实现疾病症状的改善或消除。效果可以是预防性的，表现为完全地或部分地预防疾病或其症状；和/或效果可以是治疗性的，表现为实现症状的改善或消除，或提供对疾病和/或归因于疾病的不利影响的部分或完全治愈。如本文所用，“治疗”包括对哺乳动物特别是人的疾病的任何治疗，包括：(a)阻止个体发病；(b)抑制疾病，即阻止其发展；(c)缓解疾病，例如，使疾病消退，例如，完全或部分消除疾病症状；及(d)使个体恢复至疾病前状态，例如，重建造血系统。在本申请中，“治疗”并不必然表示疾病或疾病状态或其相关症状的彻底根除或治愈，其涵盖疾病或疾病状况的任何一个或多个可测量表象的任何最小程度的改善或缓解。在上述具体方法中，治疗包括造血重建得到改善或个体得以存活。
示例性实施方案：
1.一种治疗个体中的血红蛋白病的方法，包括：
a)评估步骤，该评估步骤包括评估经修饰的CD34阳性造血干细胞/祖细胞(“CD34阳性HSPC”)的第一群体分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，其中第一群体的经修饰的CD34阳性HSPC来源于所述个体并经过修饰以降低BCL11A功能(“经修饰的EV细胞”)；并且
b)治疗步骤，该治疗步骤包括向所述个体施用第二群体经修饰的CD34阳性HSPC，该经修饰的CD34阳性HSPC来源于所述个体并且经修饰降低了BCL11A功能(“经修饰的TR细胞”)。
2.一种治疗个体中的血红蛋白病的方法，包括治疗步骤，所述治疗步骤包括向所述个体施用来源于所述个体且经修饰降低了BCL11A功能的第二群体的经修饰CD34阳性HSPC(“经修饰的TR细胞”)，
其中基于经由评估步骤的功能评价选出所述个体用于治疗，所述评估步骤包括：评估第一群体经修饰的CD34阳性HSPC分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，其中第一群体的经修饰CD34阳性HSPC来源于个体并经修饰降低了BCL11A功能(“经修饰的EV细胞”)。3.一种选择患有血红蛋白病的个体用于以第二群体的经修饰CD34阳性HSPC进行治疗的方法，所述经修饰CD34阳性HSPC来源于所述个体并经修饰降低了BCL11A功能(“经修饰的TR细胞”)，其中所述方法包括评估步骤，所述评估步骤包括：评估第一群体的经修饰CD34阳性HSPC分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，其中第一群体的经修饰CD34阳性HSPC来源于所述个体并经修饰降低了BCL11A功能(“经修饰的EV细胞”)，其中如果第一群体的经修饰CD34阳性HSPC产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)，则选择所述个体进行治疗。
4.一种确定患有血红蛋白病的个体是否适合于用来源于所述个体并经修饰降低了BCL11A功能的第二群体的经修饰CD34阳性HSPC(“经修饰的TR细胞”)进行治疗的方法，其中所述方法包括评估步骤，其包括：评估第一群体的经修饰CD34阳性HSPC分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，其中第一群体的经修饰的CD34阳性HSPC来源于所述个体并经修饰降低了BCL11A功能(”经修饰的”EV细胞)，其中如果第一群体的经修饰CD34阳性HSPC产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)，则所述个体适于治疗。
5.一种确定患有血红蛋白病的个体不适合用来源于所述个体并经修饰降低了BCL11A功能的第二群体的经修饰CD34阳性HSPC(“经修饰的TR细胞”)进行治疗的方法，其中所述方法包括评估步骤，其包括：评估第一群体的经修饰的CD34阳性HSPC分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，其中第一群体的经修饰的CD34阳性HSPC来源于所述个体并经修饰降低了BCL11A功能(“经修饰的EV细胞”)，其中如果第一群体的经修饰的CD34阳性HSPC不产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)则所述个体不适合所述经修饰的TR细胞进行治疗。
6.如实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述评估步骤包括：
a)从所述个体的骨髓或外周血样品中分离出CD34阳性HSPC以获得经分离的CD34阳性HSPC群体(“经分离的EV细胞”)；
b)修饰经分离的EV细胞以获得第一群体经修饰CD34阳性HSPC细胞，其具有降低了的BCL11A功能(“经修饰的EV细胞”)；以及
c)评估经修饰的EV细胞分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力。
7.如实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述治疗步骤包括：
a)动员所述个体骨髓中的CD34阳性HSPC以增加.外周血中CD34阳性HSPC的量；
b)从所述个体的外周血中分离CD34阳性HSPC，以获得经分离的CD34阳性HSPC群体(“经分离的TR细胞”)，
c)修饰经分离的TR细胞以获得降低了BCL11A功能的、第二群体的经修饰CD34阳性HSPC(“经修饰的TR细胞”)；以及
d)向所述个体施用有效量的经修饰的TR细胞。
8.一种治疗个体中血红蛋白病的方法，包括：
1)评估步骤，其中所述评估步骤包括：
a)从所述个体的骨髓或外周血样品中分离CD34阳性HSPC以获得经分离的CD34阳性HSPC群体(“经分离的EV细胞”)；
b)修饰经分离的EV细胞以获得降低了BCL11A功能的第一群体的经修饰CD34阳性HSPC细胞(“经修饰的EV细胞”)；以及
c)评估经修饰的EV细胞分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力；以及
2)治疗步骤，其中所述治疗步骤包括：
a)将所述个体中的CD34阳性HSPC动员至外周血；
b)从所述个体的外周血中分离CD34阳性HSPC以获得经分离的CD34阳性HSPC群体(“经分离的TR细胞”)，
c)修饰经分离的TR细胞以获得降低了BCL11A功能的、第二群体的经修饰CD34阳性HSPC(“经修饰的TR细胞”)；以及
d)向所述个体施用有效量的经修饰的TR细胞。
9.如实施方案1-8中任一项所述的方法，其中经修饰的EV细胞是通过基因修饰得到修饰的。
10.如实施方案6-8中任一项所述的方法，其中对经分离的EV细胞进行修饰包括对经分离的EV细胞进行基因修饰。
11.如实施方案9或10所述的方法，其中通过选自由锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)以及规律性间隔的短回文序列重复(CRISPR)、RNA编辑、RNA干扰的组的技术对经分离的EV细胞进行基因修饰。
12.如实施方案1-11中任一项所述的方法，其中在评估步骤中评估经修饰的EV细胞分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，所述步骤包括：i)在允许分化以获得红细胞群体的条件下培养经修饰的EV细胞；以及2)确定所述红细胞产生的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的水平。
13.如实施方案1-12中任一项所述的方法，其中在评估步骤中评估经修饰的EV细胞中分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力包括：确定γ-球蛋白的mRNA水平。
14.如实施方案1-12中任一项所述的方法，其中在评估步骤中评估经修饰的EV细胞分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力包括：确定胎儿血红蛋白(HbF)的蛋白质水平。
15.如实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述个体在评估步骤之前未经历过动员或预治疗。
16.如实施方案1-15中任一项所述的方法，其中所述评估步骤在所述治疗步骤之前重复至少一次。
17.如实施方案1-16中任一项所述的方法，其中
经修饰的TR细胞是通过基因修饰得到修饰的。
18.如实施方案7-16中任一项所述的方法，其中对经分离的TR细胞进行修饰包括对经分离的TR细胞进行基因修饰。
19.如实施方案17或18所述的方法，其中通过选自由锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)以及规律性间隔的短回文序列重复(CRISPR)、RNA编辑、RNA干扰的组的技术对经分离的TR细胞进行基因修饰。
20.如实施方案7-19中任一项所述的方法，其中在治疗步骤中动员CD34阳性HSPC包括：用粒细胞集落刺激因子(GCSF)和/或普乐沙福(plerixafor)治疗所述个体。
21.如实施方案1-20中任一项所述的方法，其中所述治疗步骤还包括：在施用所述经修饰的TR细胞之前对所述个体进行预治疗。
22.如实施方案21所述的方法，其中所述预治疗包括化疗、单克隆抗体疗法或全身放射。
23.如实施方案22所述的方法，其中所述预治疗包括化疗。
24.如实施方案23所述的方法，其中所述化疗包括向所述个体施用一种或多种选自由下述组成的组的化学治疗剂：白消安，环磷酰胺和氟达拉滨。
25.如实施方案7-24中任一项所述的方法，其中在进行修饰之前将分离的TR细胞培养一天或多天。
26.如实施方案7-25中任一项所述的方法，其中所述经修饰的TR细胞在施用于个体之前培养一天或多天。
27.如实施方案1-26中任一项所述的方法，其中在将经修饰的TR细胞施用于个体之前，将经修饰的TR细胞在冷冻条件下储存至少24小时。
28.如实施方案27所述的方法，其中在冷冻条件下进行储存之前，将经修饰的TR细胞培养一天或多天。
29.如实施方案1-28中任一项所述的方法，其中所述血红蛋白病选自由下述组成的疾病：镰状细胞病、镰状细胞性状、血红蛋白C病、血红蛋白C性状、血红蛋白S/C病、血红蛋白D病、血红蛋白E病、地中海贫血、带有增加的氧亲和力的与血红蛋白相关的病症、带有降低的氧亲和力的与血红蛋白相关的病症、不稳定的血红蛋白病和高铁血红蛋白血症。
30.如实施方案29所述的方法，其中所述血红蛋白病选自由β-地中海贫血和镰状细胞性贫血组成的组。
31.如实施方案30所述的方法，其中所述血红蛋白病是β0或β+地中海贫血。
32.如实施方案1-31中任一项所述的方法，其中所述个体是人。
33.如实施方案1-32中任一项所述的方法，其中紧随所述评估步骤进行所述治疗步骤。
在上述所有实施方案的一些具体实施方案中，评估第一群体经修饰的CD34阳性HSPC分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力是指评估经修饰降低了BCL11A功能的CD34阳性HSPC分化后产生γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的水平是否比未经此修饰的CD34阳性HSPC分化后产生的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)水平至少提高约12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、120％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％。
本申请还涉及以下的实施方案
1.经修饰的TR细胞在制备治疗个体中的血红蛋白病的方法中应用的药物中的用途，所述方法包括：
a)评估步骤，该评估步骤包括评估经修饰的CD34阳性造血干细胞/祖细胞(“CD34阳性HSPC”)的第一群体分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，其中第一群体的经修饰的CD34阳性HSPC来源于所述个体并经过修饰以降低BCL11A功能(“经修饰的EV细胞”)；并且
b)治疗步骤，该治疗步骤包括向所述个体施用第二群体经修饰的CD34阳性HSPC，该经修饰的CD34阳性HSPC来源于所述个体并且经修饰降低了BCL11A功能(“经修饰的TR细胞”)。
2.经修饰的TR细胞在制备治疗个体中的血红蛋白病的方法中应用的药物中的用途，所述方法包括治疗步骤，所述治疗步骤包括向所述个体施用来源于所述个体且经修饰降低了BCL11A功能的第二群体的经修饰CD34阳性HSPC(“经修饰的TR细胞”)，
其中基于经由评估步骤的功能评价选出所述个体用于治疗，所述评估步骤包括：评估第一群体经修饰的CD34阳性HSPC分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，其中第一群体的经修饰CD34阳性HSPC来源于个体并经修饰降低了BCL11A功能(“经修饰的EV细胞”)。3.经修饰的EV细胞在制备确定患有血红蛋白病的个体是否适合或不适合于用来源于所述个体并经修饰降低了BCL11A功能的第二群体的经修饰CD34阳性HSPC(“经修饰的TR细胞”)进行治疗的方法中应用的制品中的用途，其中所述方法包括评估步骤，其包括：评估第一群体的经修饰CD34阳性HSPC分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，其中第一群体的经修饰的CD34阳性HSPC来源于所述个体并经修饰降低了BCL11A功能(经修饰的EV细胞)，其中如果第一群体的经修饰CD34阳性HSPC产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)，则所述个体适于治疗；其中如果第一群体的经修饰的CD34阳性HSPC不产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)则所述个体不适合所述经修饰的TR细胞进行治疗。
4.如实施方案1-3中任一项所述的用途，其中所述评估步骤包括：
a)从所述个体的骨髓或外周血样品中分离出CD34阳性HSPC以获得经分离的CD34阳性HSPC群体(“经分离的EV细胞”)；
b)修饰经分离的EV细胞以获得第一群体经修饰CD34阳性HSPC细胞，其具有降低了的BCL11A功能(“经修饰的EV细胞”)；以及
c)评估经修饰的EV细胞分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力。
5.如实施方案1-4中任一项所述的用途，其中所述治疗步骤包括：
a)动员所述个体骨髓中的CD34阳性HSPC以增加.外周血中CD34阳性HSPC的量；
b)从所述个体的外周血中分离CD34阳性HSPC，以获得经分离的CD34阳性HSPC群体(“经分离的TR细胞”)，
c)修饰经分离的TR细胞以获得降低了BCL11A功能的、第二群体的经修饰CD34阳性HSPC(“经修饰的TR细胞”)；以及
d)向所述个体施用有效量的经修饰的TR细胞。
6.如实施方案1-5中任一项所述的用途，
1)其中所述评估步骤包括：
a)从所述个体的骨髓或外周血样品中分离CD34阳性HSPC以获得经分离的CD34阳性HSPC群体(“经分离的EV细胞”)；
b)修饰经分离的EV细胞以获得降低了BCL11A功能的第一群体的经修饰CD34阳性HSPC细胞(“经修饰的EV细胞”)；以及
c)评估经修饰的EV细胞分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力；以及
2)其中所述治疗步骤包括：
a)将所述个体中的CD34阳性HSPC动员至外周血；
b)从所述个体的外周血中分离CD34阳性HSPC以获得经分离的CD34阳性HSPC群体(“经分离的TR细胞”)，
c)修饰经分离的TR细胞以获得降低了BCL11A功能的、第二群体的经修饰CD34阳性HSPC(“经修饰的TR细胞”)；以及
d)向所述个体施用有效量的经修饰的TR细胞。
7.如实施方案1-6中任一项所述的用途，其中经修饰的EV细胞是通过基因修饰得到修饰的。
8.如实施方案4-6中任一项所述的用途，其中对经分离的EV细胞进行修饰包括对经分离的EV细胞进行基因修饰。
9.如实施方案7或8所述的用途，其中通过选自由锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)以及规律性间隔的短回文序列重复(CRISPR)、RNA编辑、RNA干扰的组的技术对经分离的EV细胞进行基因修饰。
10.如实施方案1-9中任一项所述的用途，其中在评估步骤中评估经修饰的EV细胞分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，所述步骤包括：i)在允许分化以获得红细胞群体的条件下培养经修饰的EV细胞；以及2)确定所述红细胞产生的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的水平。
11.如实施方案1-10中任一项所述的用途，其中在评估步骤中评估经修饰的EV细胞中分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力包括：确定γ-球蛋白的mRNA水平。
12.如实施方案1-10中任一项所述的用途，其中在评估步骤中评估经修饰的EV细胞分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力包括：确定胎儿血红蛋白(HbF)的蛋白质水平。
13.如实施方案1-12中任一项所述的用途，其中所述个体在评估步骤之前未经历过动员或预治疗。
14.如实施方案1-13中任一项所述的用途，其中所述评估步骤在所述治疗步骤之前重复至少一次。
15.如实施方案1-14中任一项所述的用途，其中
经修饰的TR细胞是通过基因修饰得到修饰的。
16.如实施方案5-14中任一项所述的用途，其中对经分离的TR细胞进行修饰包括对经分离的TR细胞进行基因修饰。
17.如实施方案15或16所述的用途，其中通过选自由锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)以及规律性间隔的短回文序列重复(CRISPR)、RNA编辑、RNA干扰的组的技术对经分离的TR细胞进行基因修饰。
18.如实施方案5-17中任一项所述的用途，其中在治疗步骤中动员CD34阳性HSPC包括：用粒细胞集落刺激因子(GCSF)和/或普乐沙福(plerixafor)治疗所述个体。
19.如实施方案1-18中任一项所述的用途，其中所述治疗步骤还包括：在施用所述经修饰的TR细胞之前对所述个体进行预治疗。
20.如实施方案19所述的用途，其中所述预治疗包括化疗、单克隆抗体疗法或全身放射。
21.如实施方案20所述的用途，其中所述预治疗包括化疗。
22.如实施方案21所述的用途，其中所述化疗包括向所述个体施用一种或多种选自由下述组成的组的化学治疗剂：白消安，环磷酰胺和氟达拉滨。
23.如实施方案5-22中任一项所述的用途，其中在进行修饰之前将分离的TR细胞培养一天或多天。
24.如实施方案5-23中任一项所述的用途，其中所述经修饰的TR细胞在施用于个体之前培养一天或多天。
25.如实施方案1-24中任一项所述的用途，其中在将经修饰的TR细胞施用于个体之前，将经修饰的TR细胞在冷冻条件下储存至少24小时。
26.如实施方案25所述的用途，其中在冷冻条件下进行储存之前，将经修饰的TR细胞培养一天或多天。
27.如实施方案1-26中任一项所述的用途，其中所述血红蛋白病选自由下述组成的疾病：镰状细胞病、镰状细胞性状、血红蛋白C病、血红蛋白C性状、血红蛋白S/C病、血红蛋白D病、血红蛋白E病、地中海贫血、带有增加的氧亲和力的与血红蛋白相关的病症、带有降低的氧亲和力的与血红蛋白相关的病症、不稳定的血红蛋白病和高铁血红蛋白血症。
28.如实施方案27所述的用途，其中所述血红蛋白病选自由β-地中海贫血和镰状细胞性贫血组成的组。
29.如实施方案28所述的用途，其中所述血红蛋白病是β0或β+地中海贫血。
30.如实施方案1-29中任一项所述的用途，其中所述个体是人。
31.如实施方案1-30中任一项所述的用途，其中紧随所述评估步骤进行所述治疗步骤。
在上述所有实施方案的一些具体实施方案中，评估第一群体经修饰的CD34阳性HSPC分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力是指评估经修饰降低了BCL11A功能的CD34阳性HSPC分化后产生γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的水平是否比未经此修饰的CD34阳性HSPC分化后产生的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)水平至少提高约12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、120％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％。
实施例
实施例1：造血干细胞BCL11A增强子的基因编辑
本实施例涉及利用CRISPR/Cas9系统基因编辑地中海贫血(以下简称地贫)病人和健康供者动员外周血来源的CD34阳性造血干细胞BCL11A红系增强子位点。
利用“CRISPR RGEN TOOLS”软件设计针对BCL11A(+58)位点的sgRNA并合成经过化学修饰的两个sgRNA，序列信息分别如下：sgRNA-1:ctaacagttgcttttatcac(SEQ ID NO:5),sgRNA-2:atcagaggccaaacccttcc SEQ ID NO:4。Cas9 mRNA编码序列信息如下:gacaagaagtacagcatcggcctggacatcggcaccaactctgtgggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgcccagcaagaaattcaaggtgctgggcaacaccgaccggcacagcatcaagaagaacctgatcggagccctgctgttcgacagcggcgaaacagccgaggccacccggctgaagagaaccgccagaagaagatacaccagacggaagaaccggatctgctatctgcaagagatcttcagcaacgagatggccaaggtggacgacagcttcttccacagactggaagagtccttcctggtggaagaggataagaagcacgagcggcaccccatcttcggcaacatcgtggacgaggtggcctaccacgagaagtaccccaccatctaccacctgagaaagaaactggtggacagcaccgacaaggccgacctgcggctgatctatctggccctggcccacatgatcaagttccggggccacttcctgatcgagggcgacctgaaccccgacaacagcgacgtggacaagctgttcatccagctggtgcagacctacaaccagctgttcgaggaaaaccccatcaacgccagcggcgtggacgccaaggccatcctgtctgccagactgagcaagagcagacggctggaaaatctgatcgcccagctgcccggcgagaagaagaatggcctgttcggcaacctgattgccctgagcctgggcctgacccccaacttcaagagcaacttcgacctggccgaggatgccaaactgcagctgagcaaggacacctacgacgacgacctggacaacctgctggcccagatcggcgaccagtacgccgacctgtttctggccgccaagaacctgtccgacgccatcctgctgagcgacatcctgagagtgaacaccgagatcaccaaggcccccctgagcgcctctatgatcaagagatacgacgagcaccaccaggacctgaccctgctgaaagctctcgtgcggcagcagctgcctgagaagtacaaagagattttcttcgaccagagcaagaacggctacgccggctacattgacggcggagccagccaggaagagttctacaagttcatcaagcccatcctggaaaagatggacggcaccgaggaactgctcgtgaagctgaacagagaggacctgctgcggaagcagcggaccttcgacaacggcagcatcccccaccagatccacctgggagagctgcacgccattctgcggcggcaggaagatttttacccattcctgaaggacaaccgggaaaagatcgagaagatcctgaccttccgcatcccctactacgtgggccctctggccaggggaaacagcagattcgcctggatgaccagaaagagcgaggaaaccatcaccccctggaacttcgaggaagtggtggacaagggcgcttccgcccagagcttcatcgagcggatgaccaacttcgataagaacctgcccaacgagaaggtgctgcccaagcacagcctgctgtacgagtacttcaccgtgtataacgagctgaccaaagtgaaatacgtgaccgagggaatgagaaagcccgccttcctgagcggcgagcagaaaaaggccatcgtggacctgctgttcaagaccaaccggaaagtgaccgtgaagcagctgaaagaggactacttcaagaaaatcgagtgcttcgactccgtggaaatctccggcgtggaagatcggttcaacgcctccctgggcacataccacgatctgctgaaaattatcaaggacaaggacttcctggacaatgaggaaaacgaggacattctggaagatatcgtgctgaccctgacactgtttgaggacagagagatgatcgaggaacggctgaaaacctatgcccacctgttcgacgacaaagtgatgaagcagctgaagcggcggagatacaccggctggggcaggctgagccggaagctgatcaacggcatccgggacaagcagtccggcaagacaatcctggatttcctgaagtccgacggcttcgccaacagaaacttcatgcagctgatccacgacgacagcctgacctttaaagaggacatccagaaagcccaggtgtccggccagggcgatagcctgcacgagcacattgccaatctggccggcagccccgccattaagaagggcatcctgcagacagtgaaggtggtggacgagctcgtgaaagtgatgggccggcacaagcccgagaacatcgtgatcgaaatggccagagagaaccagaccacccagaagggacagaagaacagccgcgagagaatgaagcggatcgaagagggcatcaaagagctgggcagccagatcctgaaagaacaccccgtggaaaacacccagctgcagaacgagaagctgtacctgtactacctgcagaatgggcgggatatgtacgtggaccaggaactggacatcaaccggctgtccgactacgatgtggaccatatcgtgcctcagagctttctgaaggacgactccatcgacaacaaggtgctgaccagaagcgacaagaaccggggcaagagcgacaacgtgccctccgaagaggtcgtgaagaagatgaagaactactggcggcagctgctgaacgccaagctgattacccagagaaagttcgacaatctgaccaaggccgagagaggcggcctgagcgaactggataaggccggcttcatcaagagacagctggtggaaacccggcagatcacaaagcacgtggcacagatcctggactcccggatgaacactaagtacgacgagaatgacaagctgatccgggaagtgaaagtgatcaccctgaagtccaagctggtgtccgatttccggaaggatttccagttttacaaagtgcgcgagatcaacaactaccaccacgcccacgacgcctacctgaacgccgtcgtgggaaccgccctgatcaaaaagtaccctaagctggaaagcgagttcgtgtacggcgactacaaggtgtacgacgtgcggaagatgatcgccaagagcgagcaggaaatcggcaaggctaccgccaagtacttcttctacagcaacatcatgaactttttcaagaccgagattaccctggccaacggcgagatccggaagcggcctctgatcgagacaaacggcgaaaccggggagatcgtgtgggataagggccgggattttgccaccgtgcggaaagtgctgagcatgccccaagtgaatatcgtgaaaaagaccgaggtgcagacaggcggcttcagcaaagagtctatcctgcccaagaggaacagcgataagctgatcgccagaaagaaggactgggaccctaagaagtacggcggcttcgacagccccaccgtggcctattctgtgctggtggtggccaaagtggaaaagggcaagtccaagaaactgaagagtgtgaaagagctgctggggatcaccatcatggaaagaagcagcttcgagaagaatcccatcgactttctggaagccaagggctacaaagaagtgaaaaaggacctgatcatcaagctgcctaagtactccctgttcgagctggaaaacggccggaagagaatgctggcctctgccggcgaactgcagaagggaaacgaactggccctgccctccaaatatgtgaacttcctgtacctggccagccactatgagaagctgaagggctcccccgaggataatgagcagaaacagctgtttgtggaacagcacaagcactacctggacgagatcatcgagcagatcagcgagttctccaagagagtgatcctggccgacgctaatctggacaaagtgctgtccgcctacaacaagcaccgggataagcccatcagagagcaggccgagaatatcatccacctgtttaccctgaccaatctgggagcccctgccgccttcaagtactttgacaccaccatcgaccggaagaggtacaccagcaccaaagaggtgctggacgccaccctgatccaccagagcatcaccggcctgtacgagacacggatcgacctgtctcagctgggaggcgac。(SEQ ID NO:1)
sgRNA的化学合成是指对于sgRNA的5’端的前三个碱基以及3’端的最后三个碱基进行了2’-O-甲基类似物修饰和核苷酸间的3’硫代修饰。如下述化学式所示，左侧是化学修饰后的sgRNA,右侧是未经过修饰的sgRNA。Cas9 mRNA和sgRNA均购自美国TrilinkBiotechnologies公司。
我们分别从5个地中贫血病人和2个健康供者的动员外周血中，分离了CD34阳性的造血干细胞((动员外周血样品均由南方春富(儿童)血液病研究院提供)。在BTX ECM830电转仪选取了“300V 1ms”的电转条件，将经过合成的Cas9 mRNA和经过化学修饰合成的sgRNA-1和sgRNA-2分别电转进入5个病人患者和2个健康的CD34阳性造血干细胞，电转4天后，提取该CD34阳性的造血干细胞的基因组，选取sgRNA切割位点左侧453bp，右侧450bp，总长度为903bp的片段进行扩增，进行Sanger测序。
正向引物:cacctcagcagaaacaaagttatc(SEQ ID NO:26)
反向引物：gggaagctccaaactctcaa(SEQ ID NO:27)
针对测序结果利用“Synthego ICE Analysis”在线软件分析产生Indels效率的统计分析。其中，“Synthego ICE Analysis”在线软件是在线分析Indels效率的软件，以一代测序结果为基础，分析Indels引起的双峰突变的效率，可以参考如下网址：
https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis.
如图1所示，结果表明，本实施例中合成的两条sgRNA能够成功基因编辑不同地贫病人和健康供者动员外周血来源的CD34阳性造血干细胞。其中，sgRNA-1的基因编辑效率在30～70％之间，Indels效率在不同的供者之间有显著差别。与此形成鲜明对比，sgRNA-2能更高效且稳定地编辑细胞产生Indels，破坏BCL11A红系增强子，针对5个病人供者和2个健康供者，基因编辑效率达到60～80％。
实施例2γ珠蛋白mRNA及红系分化相关蛋白的表达
本实验验证基因编辑的造血干细胞分化后γ珠蛋白(HBG基因)mRNA的表达，所述造血干细胞来源于地贫患者和健康供者动员后的外周血。
2.1红细胞分化
选取300v 1ms的电转条件，分别电转Cas9 mRNA和sgRNA-1，Cas9 mRNA和sgRNA-2进入5个地贫患者和2个健康供者动员外周血来源的造血干细胞。对照组细胞无电转步骤。之后，利用下述“两步法”分化方案进行红细胞分化实验。
其中“两步法”分化中的第一步是利用造血干细胞红系扩增和分化培养基将CD34+造血干祖细胞诱导分化成为红系祖细胞进行分化，然后利用造血干细胞红系分化脱核培养基将红系祖细胞诱导分化成为成熟红细胞。
造血干细胞红系扩增和分化培养基中的基础培养基为StemSpanTMSFEM II,生长因子为50-200ng/ml SCF,10-100ng/ml IL-3,1-10U EPO/ml，培养条件：CD34+造血干祖细胞，按照1.0×10^5细胞/ml的细胞密度，使用造血干细胞红系扩增和分化培养基培养，分化7天之后，CD34+造血干祖细胞分化成为红系祖细胞。
造血干细胞红系分化脱核培养基中的基础培养基为STEMSPANTMSFEM II,生长因子为1-10U EPO,100-1000μg/ml人转铁蛋白，化学小分子为0.5-10μm mifepristone，将利用上一步骤培养的红系祖细胞按照1.0×10^6细胞/ml细胞密度在造血干细胞红系分化脱核培养基分化11天之后，红系祖细胞分化成熟变为成熟红细胞。
我们检测了红细胞表达的细胞表面膜蛋白CD71和CD235a的表达，通过CD71和CD235a双阳性的比例来指针CD34+造血干祖细胞向红细胞分化的效率，如图2所示。实验组包括：sgRNA-1和sgRNA-2和对照组均能高效分化成为红细胞，CD71和CD235a的表达比例均在约80％以上，分化效率高，表明sgRNA-1和sgRNA-2的编辑效果均较为良好。
2.2检测造血干细胞分化来的红细胞中γ珠蛋白(HBG)基因的mRNA表达
将实施例2.1中从造血干细胞分化来的成熟红细胞提取细胞的mRNA,反转录成cDNA，通过荧光定量PCR检测HBG基因的mRNA表达。如图3所示。
实验结果表明：
在地中海贫血患者和健康供者动员样本来源的CD34阳性造血干细胞中，基因编辑BCL11A的红系增强子位点，解除BCL11A对于γ珠蛋白(HBG)和胎儿血红蛋白HbF的抑制，sgRNA-1和sgRNA-2两个实验组的细胞中，γ珠蛋白(HBG)的mRNA表达水平均有提高。
具体而言：
对于病人患者1，sgRNA-1提高约4.2倍，sgRNA-2提高约3.8倍左右。
对于病人患者2，sgRNA-1提高约1.8倍，sgRNA-2提高约2倍左右。
对于病人患者3，sgRNA-1提高约2.1倍，sgRNA-2提高约3.1倍左右。
对于病人患者4，sgRNA-1提高约4倍，sgRNA-2提高约5.8倍左右。
对于病人患者5，sgRNA-1提高约1.6倍，sgRNA-2提高约2.2倍左右。
对于健康供者1，sgRNA-1提高约3.0倍，sgRNA-2提高约6.1倍左右。
对于健康供者2，sgRNA-1提高约1.7倍，sgRNA-2提高约1.7倍左右。
结合以上数据可发现，无论是sgRNA-1还是sgRNA-2,在不同的供者(病人和健康人)中，虽然编辑了BCL11A红系增强子，解除了BCL11A对于γ珠蛋白(HBG)和胎儿血红蛋白HbF的抑制,但是不同供者的γ珠蛋白(HBG)提高程度不同。
此外，虽然sgRNA-1和sgRNA-2对于γ珠蛋白(HBG)提高程度有差异，但是与γ珠蛋白(HBG)提高程度低的供者相比，在γ珠蛋白(HBG)提高程度更高的供者中，sgRNA-1和sgRNA-2趋势相同，具有高度一致性和稳定性，例如：对于病人供者1,sgRNA-1和sgRNA-2均提高约4倍左右，但是在病人供者2，sgRNA-1和sgRNA-2均只提高约2倍左右；对于健康供者1，sgRNA-1和sgRNA-2均提高3.0～6.0倍，但是在健康供者2中，sgRNA-1和sgRNA-2均提高不到2倍。
实施例3：针对基因编辑效率检测的多批次验证试验
3.1健康供者动员外周血来源
本实验涉及利用CRISPR/Cas9系统高效基因编辑2个健康供者动员外周血来源的CD34阳性造血干细胞BCL11A红系增强子位点的多批次验证试验。
从实施例1和实施例2的结果中可知，利用Cas9 mRNA和sgRNA-2不仅能够高效稳定地基因编辑BCL11A红系增强子位点，基因编辑效率为60～80％，比sgRNA-1效率高，而且，解除BCL11A对于γ珠蛋白(HBG)和胎儿血红蛋白HbF的抑制后，sgRNA-2比sgRNA-1对γ珠蛋白(HBG)的mRNA水平的提升更高。因此，在本实施例中，选择sgRNA-2作为优选的靶点开展后续实验。
在BTX ECM830电转仪选取了“300V 1ms”的电转条件，将经过合成的Cas9 mRNA和经过化学修饰合成的sgRNA-2电转进入2个健康供者的CD34阳性的造血干细胞中，转4天后，提取该CD34阳性的造血干细胞的基因组，选取sgRNA切割位点左右各约450bp，总长度为903bp的片段进行扩增，进行Sanger测序，测序引物和基因编辑效率分析方法见实施例1。实验结果如图4A所示
实验结果表明，在该电转条件下，本实施例中合成的sgRNA-2能够成功高效基因编辑不同供者动员外周血来源的CD34阳性造血干细胞，均能高效地产生Indels，针对2个健康供者的3批次实验中，基因编辑效率达到70～80％。其中，“3批次实验”是指，对于每个健康供者，我们分别获得1个外周血动员的样本，分离了CD34阳性的造血干细胞，但是针对该细胞，进行了3次独立的基因编辑实验。
3.2地贫患者动员外周血来源
使用BTX ECM830电转仪，选取“300V 1ms”的电转条件，将Cas9 mRNA和经过化学修饰合成的sgRNA-2电转进入10个地贫患者动员外周血来源的CD34阳性的造血干细胞中。对照组细胞无电转步骤。2天后，，提取基因组，选取sgRNA切割位点左右各约450bp，总长度为903bp的片段进行PCR扩增。之后使用PCR产物进行Sanger测序，测序引物和基因编辑效率分析方法见实施例1。实验结果如图4B所示。
实验结果表明，在该电转条件下，本实施例中合成的sgRNA-2能够成功高效基因编辑不同地贫患者动员外周血来源的CD34阳性造血干细胞，均能高效地产生Indels，针对10个地贫患者的多批次实验中，基因编辑效率达到约60～80％或以上。其中，我们从这10个地贫患者中分别获得了各1个外周血动员的样本，分离了CD34阳性的造血干细胞进行基因编辑实验，针对这些细胞，病人供者1进行了3次独立的基因编辑实验，病人供者6、9和10这三个供者进行了2次独立的基因编辑实验，而剩余病人供者则开展了单次基因编辑实验。
实施例4造血干细胞分化后γ珠蛋白mRNA和胎儿血红蛋白HbF的表达
本实施例涉及检测基因编辑造血干细胞红系分化后BCL11A基因和γ珠蛋白mRNA的表达，其中所述造血干细胞来源于健康供者动员的外周血。
4.1红细胞分化
4.1.1健康供者
选取300v 1ms的电转条件，电转Cas9 mRNA和sgRNA-2进入2个健康供者动员外周血来源的造血干细胞。对照组细胞无电转步骤。利用下述“两步法”分化方案进行3批次的红细胞分化实验。
其中两步法分化为利用造血干细胞红系扩增和分化培养基进行分化，然后利用造血干细胞红系分化脱核培养基进行分化。
造血干细胞红系扩增和分化培养基为基础培养基为StemSpanTMSFEM II,生长因子为50-200ng/ml SCF,10-100ng/ml IL-3,1-10U EPO/ml，培养条件：利用造血干细胞红系扩增和分化培养基培养造血干细胞1.0×10^5cells/ml，扩增7天。
造血干细胞红系分化脱核培养基为基础培养基为STEMSPANTMSFEM II,生长因子为1-10U EPO,100-1000μg/ml人转铁蛋白，化学小分子为0.5-10μm mifepristone，将利用上一步骤培养的1.0×10^6cells/ml细胞在造血干细胞红系分化脱核培养基分化11天。
我们用FACS方法检测了CD71和CD235a的表达，如图5所示。实验组和对照组均能高效分化成为红细胞，CD71和CD235a的表达比例均在约85％以上，分化效率高，效果良好。其中“3批次的红细胞分化实验”是指对于每个健康供者，我们分别获得1个外周血动员的样本，分离了CD34阳性的造血干细胞，针对这些细胞，进行了3次独立的基因编辑实验，并分别进行了3次红细胞分化实验。
4.1.2地贫患者
选取300v 1ms的电转条件，电转Cas9 mRNA和sgRNA-2进入10个地贫患者动员外周血来源的造血干细胞。对照组细胞无电转步骤。利用4.1.1中的“两步法”分化方案进行了多批次的红细胞分化实验。
分化18天后，我们检测了CD71和CD235a表达，如图6所示。实验组和对照组均能高效分化成为红细胞，不同地贫患者红系分化效率存在个体差异，CD71和CD235a的双阳性表达比例在约60-95％。表明其分化效率高，效果良好。
其中，我们针对这10个地贫患者分别各获得1个外周血动员的样本，分离了CD34阳性的造血干细胞。其中，使用病人供者1的CD34阳性的造血干细胞进行了3次独立的基因编辑实验，以及3次独立的红细胞分化实验，病人供者6、9和10的CD34阳性的造血干细胞分别进行了2次独立的基因编辑实验，2次红细胞分化实验，剩余6名病人供者则开展了单次的基因编辑实验和单次红细胞分化实验。
4.2检测健康供者来源的造血干细胞分化来的红细胞中γ珠蛋白和BCL11A基因的mRNA表达
将实施例4.1.1中从造血干细胞分化来的成熟红细胞提取细胞的mRNA,反转录成cDNA，通过荧光定量PCR检测BCL11A、HBG等基因的mRNA表达。如图7和8所示。
实验结果表明：
对于健康供者1，3个批次的结果显示，造血干细胞BCL11A红系增强子经过编辑后，实验组中BCL11A基因表达下调，约是对照组中表达量的约40～80％，而γ珠蛋白(HBG基因)的基因表达则显著提高，在3个批次中提高倍数是对照组的约6～10倍，结果具有高度的一致性和稳定性。
对于健康供者2，3个批次的结果显示，造血干细胞BCL11A红系增强子经过编辑后，实验组中BCL11A基因表达下调，约是对照组中表达量的约40～80％，而γ珠蛋白(HBG基因)的基因表达则显著提高，在3个批次重复性实验中，相对于对照组提高倍数是1.5～3.5倍，结果具也有高度的一致性和稳定性。
本实验结果进一步证明，对于不同的供体，电转针对BCL11A红系增强子的sgRNA和Cas9 mRNA后，BCL11A基因表达下调的比例均是20～60％。然而，对于γ珠蛋白的表达提高却有显著差别。对于健康供者1，γ珠蛋白的表达提高6～10倍，健康供者2γ珠蛋白的表达提高1.5～3.5倍。其中，“3批次的红细胞分化实验”是指对于每个健康供者，我们分别获得1个外周血动员的样本，分离了CD34阳性的造血干细胞，但是针对该细胞，进行了3次独立的基因编辑实验，并分别进行了3次红细胞分化，检测BCL11A基因和γ珠蛋白(HBG基因)的mRNA水平表达。
4.3检测地贫患者来源的造血干细胞分化来的红细胞中胎儿血红蛋白HbF表达
将实施例4.1.2中从造血干细胞分化来的成熟红细胞，用流式细胞术检测细胞内胎儿血红蛋白HbF的阳性表达比例。如图9A、9B和10所示。
实验结果表明：
与未编辑的对照组相比，经过编辑的CD34阳性造血干细胞分化得到的红细胞中HbF表达提高。
不同地贫患者HbF表达提高的程度有显著差异，其中病人供者1的三批次实验和病人供者7的HbF表达是对照组的约1.3倍，而病人供者2的HbF表达是对照组的约2.3倍。而同一地贫患者的不同批次实验显示HbF表达程度非常近似，病人供者1的两批次实验显示HbF表达是对照组的约1.3倍，病人供者9的HbF表达是对照组的约1.4倍，病人供者10的HbF表达是对照组的约1.5-1.6倍。
病人供者1中实验组的HbF表达是对照组的1.29±0.12倍。由此我们认为如果基因编辑后HbF表达水平比对照组提高至少约12％，即一个标准差的值，那么对于这个地贫患者是有效的。
实施例5基因编辑BCL11A红系增强子治疗血红蛋白病
从实施例2.2、实施例4.2和实施例4.3的结果中不难发现，对于不同的供体，电转针对BCL11A红系增强子的Cas9 mRNA和相同的sgRNA后，对于γ珠蛋白和胎儿血红蛋白HbF的表达提高却有显著差别。其主要原因是，如本申请中背景技术描述，成熟红细胞内调控抑制γ珠蛋白和胎儿血红蛋白HbFb表达的机制复杂，不仅有远端调控区域的LCR参与，而且有多个转录因子如BCL11A,MYB,KLF1等结合成一个复合物，作为调控γ珠蛋白和胎儿血红蛋白HbF的开关(G.Lettre,et al.PNAS.2008,11869-11874；Marina et al,MolecularTherapy.2017；Megan D,et al.Blood.2015)。这意味着，BCL11A对于γ珠蛋白和胎儿血红蛋白HbF的抑制作用存在显著的个体差异。
此外，虽然对于γ珠蛋白和胎儿血红蛋白HbF的调控机制复杂，但是对于同一个体，从胎儿时期到出生成年后，其γ珠蛋白和胎儿血红蛋白HbF的调控机制是处于相对恒定状态，这意味着BCL11A基因对于γ珠蛋白和胎儿血红蛋白HbF的抑制程度和作用是基本不变的(Paikari A,et al.Br J Haematol.2018；Lettre G,et al.Lancet.2016；G.Lettre,et al.PNAS.2008,11869-11874；Marina et al,Molecular Therapy.2017；Megan D,etal.Blood.2015)，这从实施例4.2和4.3中的结果中得到进一步证实，对于同一个供者，基因编辑BCL11A红系增强子位点，红细胞分化，检测分析γ珠蛋白(HBG基因)的mRNA表达和胎儿血红蛋白HbF的多批次实验中，其提高程度是一致且稳定的。
因此，结合本申请的实验结果和现象，目前基因编辑BCL11A红系增强子治疗血红蛋白病的治疗策略则存在明显的潜在缺陷，即现有技术并未提前预测BCL11A对于γ珠蛋白和胎儿血红蛋白HbF的调控程度和作用，患者经过大剂量的清除骨髓的药物处理和自体造血干细胞移植治疗后，将极有可能治疗方案无效或者效果不显著，这将为患者带来潜在的巨大危害。而本申请则提供了有效的预测方法，即不同个体中γ珠蛋白和胎儿血红蛋白HbF的提升程度和作用是不同，结果也是一致且稳定的；同一个体的造血干细胞在不同批次实验中，经过基因编辑下调BCL11A表达后，对于γ珠蛋白和胎儿血红蛋白HbF的提升程度和作用是一致且稳定的；基因编辑后胎儿血红蛋白HbF如能至少提高约12％，则认为该治疗方案对地贫患者有效。
基于该实验结果，本申请提出了一种全新的利用基因编辑BCL11A红系增强子治疗血红蛋白病的治疗方法，即伴随诊断+基因编辑自体造血干细胞治疗。如图11所示。
伴随诊断：在利用基因编辑BCL11A红系增强子治疗血红蛋白病的患者之前，我们可以提前预测该治疗方案的有效性，即提前从患者体内抽取少量骨髓或者外周血，分离其中的CD34阳性的造血干细胞，经过基因编辑BCL11A红系增强子位点，将编辑的细胞分化为成熟的红细胞，通过一系列的指标评估提升γ珠蛋白(HBG基因)和胎儿血红蛋白HbF的表达程度，选择γ珠蛋白和胎儿血红蛋白HbF表达提高程度更高的患者作为优先治疗的对象，则该治疗方案的有效性的概率就更高。其中，如果与未编辑对照组相比，实验组中胎儿血红蛋白HbF的表达至少提高约12％，那么接受治疗的患者才有可能临床受益。因为一方面，临床上认为血红蛋白量达到90g/L患者就能够摆脱输血依赖，如果选择γ珠蛋白和胎儿血红蛋白HbF表达提高程度更高的患者接受治疗，则摆脱输血依赖的可能性更大。另一方面，虽然90g/L患者能够摆脱输血，但是仍会表现出轻度贫血(90-110g/L)，骨骼发育也有可能受到影响(正常男性的血红蛋白含量范围是120-160g/L,女性则为110-150g/L),选择γ珠蛋白和胎儿血红蛋白HbF表达提高程度更高的患者接受治疗，患者完全恢复健康的可能性就更大。因此，利用基因编辑BCL11A红系增强子治疗血红蛋白病的治疗策略的目标是使得患者的总血红蛋白量表达越高越好，达到正常人的标准，效果才更加显著，患者受益更大。此外，本申请中开发的预测方法，只需抽取少量的骨髓或者外周血即可，流程简单。患者无需经过流程复杂的打动员剂使得骨髓大量产生造血造血干细胞，并且患者在筛选期，并未注射大剂量的清骨髓和清淋巴的药物，如白消安和氟达拉滨等，患者的健康得到保障。
基因编辑自体造血干细胞治疗：通过本申请开发的伴随诊断方法确定最终入组治疗的血红蛋白病的受试者。随后进入基因编辑自体造血干细胞治疗流程：1.将给予受试者粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或/和plerixafor(一种去趋化因子受体CXCR4的拮抗剂)进行骨髓动员，使得骨髓产生大量的造血干细胞释放进入外周血循环系统。2.动员完毕后，进入基因编辑细胞治疗产品生产流程，首先通过CD34磁珠标记和分选获得CD34阳性的造血干细胞和培养。其次，电转Cas9和sgRNA，编辑BCL11A红系增强子位点。最后，细胞冻存，进入质量控制和安全性评价阶段，达到放行标准之后即可准备开始回输给患者。3.产品制备成功并放行通过后，临床医生将通知受试者住院，并接受预处理化疗(清髓药物白消安(Busulfan)或/和、清淋巴药物环磷酰胺(cyclophosphamide)及氟达拉滨(fludarabine))，需要说明的是不同的临床机构采取的预处理方案可能不同，有些临床机构可能只会采用清髓药物，如白消安，而有的临床机构会采用清髓和清淋巴药物，如环磷酰胺和氟达拉滨等。在完成预处理之后，将基因编辑的自体造血干细胞通过单次静脉注射给药回输，给药剂量为≥2×10^6活性CD34阳性细胞/kg。4.于给药注射完成后，进行至少2两年的受试者随访，评估安全性、耐受性和有效性指标等。
工业实用性
根据本申请，本申请的方法有以下优点：第一、本申请首次发现在不同个体中，经过基因编辑造血干细胞下调BCL11A表达后，对于γ珠蛋白和胎儿血红蛋白HbF的提升程度和作用不同,而在同一个体中，经过基因编辑造血干细胞下调BCL11A表达后，对于γ珠蛋白和胎儿血红蛋白HbF的提升程度和作用是一致且稳定的的现象，填补了现有技术的空白。第二、本申请首次设定了基因编辑BCL11A红系增强子后，胎儿血红蛋白HbF提高程度的有效性阈值，即编辑后HbF提高至少约12％，那么患者接受治疗后，病症将有可能得到显著改善，有可能减少输血频率或摆脱输血。第三，本申请开发的伴随诊断方法操作简单，只需从处于筛选期(病人筛选期通常需持续2-3个月)的拟入组的患者中抽取少量骨髓或者外周血，分离CD34阳性的造血干细胞，基因编辑BCL11A红系增强子，红细胞分化，检测γ珠蛋白和胎儿血红蛋白HbF的提高程度即可，整个评估流程仅需要3～4周时间即可完成，避免了患者由于BCL11A基因对于γ珠蛋白和胎儿血红蛋白HbF的调控作用的个体差异导致的治疗方法失效或者效果不显著的风险。第四、本申请开发的方法将有利于基因编辑技术治疗血红蛋白病的治疗方案中，患者进行分层和分级治疗，即γ珠蛋白和胎儿血红蛋白HbF的提升程度更高的患者处于优先治疗的级别等。第五、本申请提出了全新的治疗方案，即将伴随诊断和基因编辑自体造血干细胞治疗相结合，提升了基因编辑治疗血红蛋白病的安全性和有效性。
SEQUENCE LISTING
<110> 博雅辑因（北京）生物科技有限公司
<120> 一种血红蛋白病治疗有效性预测方法
<130> PD01017-FD00222PCT
<150> 2019103589612
<151> 2019-04-30
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cas9 mRNA coding gene
<400> 1
gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc 60
accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 120
agcatcaaga agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc 180
acccggctga agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat 240
ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg 300
gaagagtcct tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 360
atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa 420
ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg 480
atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 540
gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc 600
aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg 660
ctggaaaatc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggcaacctg 720
attgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat 780
gccaaactgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 840
atcggcgacc agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 900
ctgagcgaca tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg 960
atcaagagat acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag 1020
cagctgcctg agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1080
tacattgacg gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa 1140
aagatggacg gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag 1200
cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc 1260
attctgcggc ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag 1320
aagatcctga ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga 1380
ttcgcctgga tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg 1440
gtggacaagg gcgcttccgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac 1500
ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat 1560
aacgagctga ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc 1620
ggcgagcaga aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg 1680
aagcagctga aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc 1740
ggcgtggaag atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc 1800
aaggacaagg acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg 1860
accctgacac tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac 1920
ctgttcgacg acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg 1980
ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat 2040
ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2100
ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac 2160
gagcacattg ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg 2220
aaggtggtgg acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2280
gaaatggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg 2340
aagcggatcg aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg 2400
gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat 2460
atgtacgtgg accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc 2520
gtgcctcaga gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac 2580
aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac 2640
tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc 2700
aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg 2760
gtggaaaccc ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact 2820
aagtacgacg agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag 2880
ctggtgtccg atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac 2940
caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac 3000
cctaagctgg aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3060
atcgccaaga gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac 3120
atcatgaact ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct 3180
ctgatcgaga caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc 3240
accgtgcgga aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag 3300
acaggcggct tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc 3360
agaaagaagg actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat 3420
tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa 3480
gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt 3540
ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac 3600
tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag 3660
aagggaaacg aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3720
tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 3780
cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc 3840
ctggccgacg ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc 3900
atcagagagc aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct 3960
gccgccttca agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag 4020
gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac 4080
ctgtctcagc tgggaggcga c 4101
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<211> 150
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> BCL11A基因58K位点150bp序列
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<220>
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Claims (10)
1.一种治疗个体中的血红蛋白病的方法，包括：
a)评估步骤，该评估步骤包括评估经修饰的CD34阳性造血干细胞/祖细胞(“CD34阳性HSPC”)的第一群体分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，其中第一群体的经修饰的CD34阳性HSPC来源于所述个体并经过修饰以降低BCL11A功能(“经修饰的EV细胞”)；并且
b)治疗步骤，该治疗步骤包括向所述个体施用第二群体经修饰的CD34阳性HSPC，该经修饰的CD34阳性HSPC来源于所述个体并且经修饰降低了BCL11A功能(“经修饰的TR细胞”)。
2.一种治疗个体中的血红蛋白病的方法，包括治疗步骤，所述治疗步骤包括向所述个体施用来源于所述个体且经修饰降低了BCL11A功能的第二群体的经修饰CD34阳性HSPC(“经修饰的TR细胞”)，
其中基于经由评估步骤的功能评价选出所述个体用于治疗，所述评估步骤包括：评估第一群体经修饰的CD34阳性HSPC分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，其中第一群体的经修饰CD34阳性HSPC来源于个体并经修饰降低了BCL11A功能(“经修饰的EV细胞”)。
3.一种确定患有血红蛋白病的个体是否适合或不适合于用来源于所述个体并经修饰降低了BCL11A功能的第二群体的经修饰CD34阳性HSPC(“经修饰的TR细胞”)进行治疗的方法，其中所述方法包括评估步骤，其包括：评估第一群体的经修饰CD34阳性HSPC分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，其中第一群体的经修饰的CD34阳性HSPC来源于所述个体并经修饰降低了BCL11A功能(“经修饰的”EV细胞)，其中如果第一群体的经修饰CD34阳性HSPC产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)，则所述个体适于治疗；其中如果第一群体的经修饰的CD34阳性HSPC不产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)则所述个体不适合所述经修饰的TR细胞进行治疗。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述评估步骤包括：
a)从所述个体的骨髓或外周血样品中分离出CD34阳性HSPC以获得经分离的CD34阳性HSPC群体(“经分离的EV细胞”)；
b)修饰经分离的EV细胞以获得第一群体经修饰CD34阳性HSPC细胞，其具有降低了的BCL11A功能(“经修饰的EV细胞”)；以及
c)评估经修饰的EV细胞分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述治疗步骤包括：
a)动员所述个体骨髓中的CD34阳性HSPC以增加外周血中CD34阳性HSPC的量；
b)从所述个体的外周血中分离CD34阳性HSPC，以获得经分离的CD34阳性HSPC群体(“经分离的TR细胞”)，
c)修饰经分离的TR细胞以获得降低了BCL11A功能的、第二群体的经修饰CD34阳性HSPC(“经修饰的TR细胞”)；以及
d)向所述个体施用有效量的经修饰的TR细胞。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法：
1)其中所述评估步骤包括：
a)从所述个体的骨髓或外周血样品中分离CD34阳性HSPC以获得经分离的CD34阳性HSPC群体(“经分离的EV细胞”)；
b)修饰经分离的EV细胞以获得降低了BCL11A功能的第一群体的经修饰CD34阳性HSPC细胞(“经修饰的EV细胞”)；以及
c)评估经修饰的EV细胞分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力；以及
2)其中所述治疗步骤包括：
a)将所述个体中的CD34阳性HSPC动员至外周血；
b)从所述个体的外周血中分离CD34阳性HSPC以获得经分离的CD34阳性HSPC群体(“经分离的TR细胞”)，
c)修饰经分离的TR细胞以获得降低了BCL11A功能的、第二群体的经修饰CD34阳性HSPC(“经修饰的TR细胞”)；以及
d)向所述个体施用有效量的经修饰的TR细胞。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中经修饰的EV细胞是通过基因修饰得到修饰的。
8.如权利要求4-6中任一项所述的方法，其中对经分离的EV细胞进行修饰包括对经分离的EV细胞进行基因修饰。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中通过选自由锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)以及规律性间隔的短回文序列重复(CRISPR)、RNA编辑、RNA干扰的组的技术对经分离的EV细胞进行基因修饰。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中在评估步骤中评估经修饰的EV细胞分化后产生所需水平的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的能力，所述步骤包括：i)在允许分化以获得红细胞群体的条件下培养经修饰的EV细胞；以及2)确定所述红细胞产生的γ-球蛋白或胎儿血红蛋白(HbF)的水平。
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