TW202100752A

TW202100752A - 一種異常血紅素症治療有效性預測方法

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Publication number: TW202100752A
Application number: TW109114454A
Authority: TW
Inventors: 方日國; 于玲玲; 楊卉慧
Original assignee: 大陸商博雅輯因（北京）生物科技有限公司
Priority date: 2019-04-30
Filing date: 2020-04-30
Publication date: 2021-01-01
Also published as: CN111939271A

Abstract

本申請涉及一種治療個體中的異常血紅素症的方法，包括：a）評估步驟，該評估步驟包括評估經修飾的CD34陽性造血幹細胞/祖細胞的第一群體分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白的能力，其中第一群體的經修飾的CD34陽性HSPC來源於所述個體並經過修飾以降低BCL11A功能;並且b）治療步驟，該治療步驟包括向所述個體施用第二群體經修飾的CD34陽性HSPC，該經修飾的CD34陽性HSPC來源於所述個體並且經修飾降低了BCL11A功能。同時，本申請還涉及治療個體中的異常血紅素症的方法、選擇患有異常血紅素症的個體用於以第二群體的經修飾CD34陽性HSPC進行治療的方法和確定患有異常血紅素症的個體是否適合或不適合用來源於所述個體並經修飾降低了BCL11A功能的第二群體的經修飾CD34陽性HSPC進行治療的方法。

Description

一種異常血紅素症治療有效性預測方法

本申請涉及預測基因編輯技術治療異常血紅素症有效性的伴隨預測方法。該預測方法在治療疾病之前，預先分離患者CD34陽性造血幹細胞，利用基因編輯技術，破壞BCL11A紅系增強子位點，透過評估上調γ球蛋白和胎兒血紅蛋白表達的程度，提前預測基因編輯BCL11A紅系增強子治療異常血紅素症的有效性，輔助疾病治療。

異常血紅素症(hemoglobinopathy)是由於血紅蛋白分子結構異常或球蛋白肽鏈合成異常所引起的一組遺傳性血液病。異常血紅素症中的主要兩種疾病類型是β-地中海型貧血和鐮刀型貧血症。β-地中海型貧血，其致病機轉是因為β球蛋白肽鏈發生基因突變，多數病人是點突變，少數是大片段基因缺失。基因缺失和某些點突變可以導致一部分β球蛋白肽鏈的合成完全被抑制，這類稱為β⁰ 地中海型貧血；而少數的點突變使β鏈的合成部分受到抑制，仍保留一部分肽鏈合成，這類稱為β⁺ 地中海型貧血，不同的組合可能出現不同的臨床症狀。由於β球蛋白表達缺失或減少，導致血液內多餘的α鏈會沉積在紅血球內形成包涵體，附著在紅血球膜表面上，使紅血球膜特性發生改變，細胞變僵硬而導致變形能力下降，呈現慢性溶血性貧血表現，進一步導致骨髓構成改變。鐮刀型貧血症，與β-地中海型貧血類似，都屬於一種常染色體隱性遺傳病，不同的是該貧血症突變位點單一，由於β球蛋白的單一堿基突變，正常的β基因的第6位元密碼子由GAG(編碼穀胺酸)突變為GTG(纈氨酸)所致。在突變純合子狀態，正常的α球蛋白和異常的β球蛋白形成四聚體複合物，稱為HbS, 該四聚體攜帶氧氣的能力是正常血紅蛋白的一半，在去氧狀態下聚集成聚合體，因形成的聚合體排列方向與膜平行，緊密接觸細胞膜，當聚合體數量達到一定程度後，細胞膜由正常的凹形變成鐮刀形。鐮刀形紅血球，變形性差，容易破碎而發生溶血，造成血管堵塞，損傷，壞死等(D.Rund, et al.New England Journal of Medicine . 2005, 718-739)。

目前針對β-地中海型貧血和鐮刀型貧血症的標準治療方法包括長期高劑量輸血伴隨排鐵劑排鐵治療和異源造血幹細胞移植治療技術。然而，長期的高劑量輸血伴隨排鐵劑排鐵治療導致鐵質沉積，患者的脾臟、肝臟、心臟和腎臟等重要臟器鐵大量沉積而引起的器官損傷是地中海型貧血患兒死亡的主要原因之一。異源造血幹細胞移植雖然能夠根治β-地中海型貧血和鐮刀型貧血症，但是由於HLA全相合配型比例低和移植術後的GVHD(Graft-Versus-Host-Disease, 移植物抗宿主病)、免疫排斥導致的死亡，因此目前該治療技術難以滿足患者巨大的被治療的需求。為了解決異源造血幹細胞治療技術的問題，基於基因修飾自體造血幹細胞的轉基因療法和基因編輯療法應運而生。其中，基因編輯療法的治療方案是利用基因編輯工具，如CRISPR/Cas9、 Zinc Finer Nulease (ZFN)和TALEN等，編輯患者的自源的造血幹細胞，提升胎兒血紅蛋白(Fetal Hemoglobin, HbF)的表達，再將經過基因修飾的自源的造血幹細胞回輸給患者，使患者的血紅蛋白總量恢復至正常水準，達到治療疾病的目的。

基因編輯療法治療β-地中海型貧血和鐮刀型貧血症的主要機理是利用了人體內天然存在的生物學現象，即血紅蛋白切換(Globin Switch)。成年人的血紅蛋白Adult Hemoglobin (HbA)是由兩條α球蛋白和兩條β球蛋白組成的四聚體複合物，但是胎兒在母體內及出生後120天內，人體內的血紅蛋白則是HbF,由兩條α球蛋白和兩條γ球蛋白組成的四聚體複合物，其特點是攜帶氧氣能力強、釋放氧氣能力弱，利於胎兒從母體內獲取養分。但是在胎兒出生120後，人體內紅血球中發生HbF向HbA的切換，開始表達正常的血紅蛋白HbA(Marina et al,Molecular Therapy . 2017; Megan D, et al.Blood . 2015)。臨床上存在一類病人，雖然攜帶了β-地中海型貧血或鐮刀型貧血症的疾病突變，但是症狀輕微或無臨床症狀，這是由於抑制HbF表達的基因同時也攜帶了突變使得這些基因表達降低，最終導致患者產生遺傳性胎兒血紅蛋白持續增高(Hereditary persistence of fetal hemoglobin, HPFH), 從而彌補了由於β-球蛋白缺失或減少導致的紅血球內整體血紅蛋白水準下降，使整體血紅蛋白接近或恢復至正常水準(Vinjamur DS, et al.Br. J. Haematol . 2018)。因此，如何尋找到合適的基因靶點透過基因編輯方法提高紅血球內胎兒血紅蛋白表達成為了一種全新的治療策略。然而，在人體內HbF和HbA的表達處於動態平衡、此消彼長的相對穩態，其調節的機制非常複雜，研究表明在β-球蛋白上游40~60kb存在長度約為16 kb的LCR (Locus control region)，該區域內含有5個DNA酶高度敏感的位點，參與調節了HbF和HbA的表達。除此以外，一些參與造血系統發育和紅血球分化、成熟的關鍵轉錄因子緊密結合在該區域，包括GATA-1、BCL11A、FOG1、NuRD、LRF、MYB、KLF1、TAL1、E2A、LMO2和LDB1等，共同作用參與調節HbF和HbA的表達(G. Lettre, et al.PNAS . 2008, 11869-11874; Marina et al,Molecular Therapy . 2017; Megan D, et al.Blood . 2015)。目前，發現的合適的靶點是BCL11A紅系增強子(+58)位置，透過基因編輯的方法修飾該區域，下調BCL11A基因表達，從而解除BCL11A基因對於γ球蛋白和HbF的表達抑制，提高γ球蛋白和HbF表達，同時不影響其它譜系的分化和發育，而且臨床上一些無症狀的患者也正是攜帶了該位點的突變導致了HPFH(U. Manuela, et al.PNAS . 2008; P. Liu, et al.Nature Immunology . 2003; D.E. Bauer.Science . 2013; V.G. Sankaran, et al.Science . 2008; Matthew C, et al.Nature . 2015)。

雖然臨床上已經開展了針對BCL11A紅系增強子位點，即利用基因編輯技術開發的自體造血幹細胞移植治療β-地中海型貧血和鐮刀型貧血症的臨床Phase1/2試驗(Clinicaltrials.gov編碼是NCT03655678, NCT03745287, NCT03432364)，但是由於病人之間存在個體差異，BCL11A基因對於HbF的調節程度在不同的病人中效果不同，例如假設在某類病人中BCL11A基因已經處於非常低表達的狀態，表明已經解除了BCL11A基因對於HbF的表達抑制，那麼再編輯BCL11A紅系增強子擬提高HbF來治療病人可能會失效，而病人如果已經經過了化療清除骨髓和免疫系統，這將造成的難以預估的潛在危害。況且，調節γ球蛋白和HbF胎兒血紅蛋白表達的機制非常複雜，難以透過檢測某個基因或者某幾個基因的表達情況來提前預知治療方法的有效性。因此，如何能夠提前預測BCL11A基因對於γ球蛋白和HbF的表達上調的程度和潛能則是基因編輯自體造血幹細胞療法亟待解決的關鍵問題。

本申請利用預先評估BCL11A基因對於HbF調節程度的策略，開發出了預測基因編輯技術治療異常血紅素症有效性的伴隨診斷方法，提前預知基因編輯BCL11A紅系增強子位點對於提高γ球蛋白和HbF的表達程度，降低由於患者細胞中BCL11A低表達或者低功能帶來的該療法失效或有效性減弱的風險，利於臨床治療過程中患者分級診療，優先選擇BCL11A高表達和/或對γ球蛋白和HbF調節起到主要作用的患者進行治療，開發了伴隨診斷加基因編輯自體造血幹細胞的全新的治療方案，填補了現有技術的空白，助力基因編輯技術自體造血幹細胞治療異常血紅素症的全新治療策略的快速發展，滿足了臨床應用的需求。

本申請透過實驗首次證明，不同供體的動員週邊血液中來源的造血幹細胞，經過高效基因編輯BCL11A紅系增強子的相同位點，紅系分化後γ球蛋白mRNA水準和HbF蛋白水準的提高程度不同，表明個體差異影響了BCL11A對於γ球蛋白和HbF蛋白表達的抑制潛能和程度。此外，同一供體的動員週邊血液來源的造血幹細胞，在不同批次的實驗中經過高效基因編輯BCL11A紅系增強子的相同位點，紅系分化後γ球蛋白mRNA水準和HbF蛋白水準的具有穩定且相似的提高程度。進一步實驗結果表明，在同一批次中γ球蛋白和HbF蛋白表達更高的供體，在另一批次實驗中γ球蛋白和HbF蛋白表達也更高，反之亦然。最後，本申請首次提出了伴隨診斷+基因編輯自體造血幹細胞BCL11A紅系增強子位點治療異常血紅素症的全新治療方案和策略。

一方面，本申請提供一種治療個體中的異常血紅素症的方法，包括：

a)評估步驟，該評估步驟包括評估經修飾的CD34陽性的造血幹細胞/祖細胞(“CD34陽性HSPC”)的第一群體分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白(HbF)的能力，其中第一群體的經修飾的CD34陽性HSPC來源於所述個體並經過修飾以降低BCL11A功能(“經修飾的EV細胞”);並且

b)治療步驟，該治療步驟包括向所述個體施用第二群體經修飾的CD34陽性HSPC，該經修飾的CD34陽性HSPC來源於所述個體並且經修飾降低了BCL11A功能(“經修飾的TR細胞”)。

一方面，本申請提供一種增強胎兒血紅蛋白在個體內表達的方法，包括：

一方面，本申請提供一種血紅蛋白在個體內功能的方法，包括：

b)治療步驟，該治療步驟包括向所述個體施用第二群體經修飾的CD34陽性HSPC，該經修飾的CD34陽性HSPC來源於所述個體並且經修飾降低了BCL11A功能(“經修飾的TR細胞”)。一方面，本申請提供一種治療個體中的異常血紅素症的方法，包括治療步驟，所述治療步驟包括向所述個體施用來源於所述個體且經修飾降低了BCL11A功能的第二群體的經修飾CD34陽性HSPC(“經修飾的TR細胞”)，

其中基於經由評估步驟的功能評價選出所述個體用於治療，所述評估步驟包括：評估第一群體經修飾的CD34陽性HSPC分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白(HbF)的能力，其中第一群體的經修飾CD34陽性HSPC來源於個體並經修飾降低了BCL11A功能(“經修飾的EV細胞”)。

一方面，本申請提供一種選擇患有異常血紅素症的個體用於以第二群體的經修飾CD34陽性HSPC進行治療的方法，所述經修飾CD34陽性HSPC來源於所述個體並經修飾降低了BCL11A功能(“經修飾的TR細胞”)，其中所述方法包括評估步驟，所述評估步驟包括：評估第一群體的經修飾CD34陽性HSPC分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白(HbF)的能力，其中第一群體的經修飾CD34陽性HSPC來源於所述個體並經修飾降低了BCL11A功能(“經修飾的EV細胞”)，其中如果第一群體的經修飾CD34陽性HSPC產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白(HbF)，則選擇所述個體進行治療。

一方面，本申請提供一種確定患有異常血紅素症的個體是否適合於用來源於所述個體並經修飾降低了BCL11A功能的第二群體的經修飾CD34陽性HSPC(“經修飾的TR細胞”)進行治療的方法，其中所述方法包括評估步驟，其包括：評估第一群體的經修飾CD34陽性HSPC分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白(HbF)的能力，其中第一群體的經修飾的CD34陽性HSPC來源於所述個體並經修飾降低了BCL11A功能(“經修飾的” EV細胞)，其中如果第一群體的經修飾CD34陽性HSPC產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白(HbF)，則所述個體適於治療。

一方面，本申請提供一種確定患有異常血紅素症的個體不適合用來源於所述個體並經修飾降低了BCL11A功能的第二群體的經修飾CD34陽性HSPC(“經修飾的TR細胞”)進行治療的方法，其中所述方法包括評估步驟，其包括：評估第一群體的經修飾的CD34陽性HSPC分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白(HbF)的能力，其中第一群體的經修飾的CD34陽性HSPC來源於所述個體並經修飾降低了BCL11A功能(“經修飾的” EV細胞)，其中如果第一群體的經修飾的CD34陽性HSPC不產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白(HbF)則所述個體不適合用所述經修飾的TR細胞進行治療。

在上述實施方案中，評估第一群體經修飾的CD34陽性HSPC分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力是指評估經修飾降低了BCL11A功能的CD34陽性HSPC分化後產生γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的水準是否比未經此修飾的CD34陽性HSPC分化後產生的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）水準至少提高約12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、120%。

如果第一群體經修飾的CD34陽性HSPC分化後產生的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的水準比未經此修飾的CD34陽性HSPC分化後產生的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）水準提高至少約12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、120%，則所述個體適合用所述經修飾的TR細胞進行治療。

在上述方法的一些實施方案中，所述經修飾的CD34陽性HSPC分化後產生的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白的水準是未經修飾的CD34陽性HSPC分化後產生的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白的水準的150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%、600%，或更高。

在上述方法的一些實施方案中，所述經修飾的CD34陽性HSPC分化後產生的胎兒血紅蛋白超過6.5g/dL、7.0g/dL、7.5g/dL、8.0g/dL、8.5g/dL、9.0g/dL、9.5g/dL、10g/dL、10.5g/dL、11.0g/dL週邊血液，或更高水準。在一些實施方案中，所述經修飾的CD34陽性HSPC分化後產生的胎兒血紅蛋白大約為9.0-18g/dL,例如10-17g/dL, 11-15g/dL或12-16g/dL週邊血液。

在上述方法的一些實施方案中，所述所需水準的γ-球蛋白為相對於未經修飾的CD34陽性HSPC，經修飾的CD34陽性HSPC產生超過約50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%、600%，或更高水準的γ-球蛋白mRNA。

在上述方法的一些實施方案中，所述評估步驟包括：

a)從所述個體的骨髓或週邊血液樣品中分離出CD34陽性HSPC以獲得經分離的CD34陽性HSPC群體(“經分離的EV細胞”);

b)修飾經分離的EV細胞以獲得第一群體經修飾CD34陽性HSPC細胞，其具有降低了的BCL11A功能(“經修飾的EV細胞”);以及

c)評估經修飾的EV細胞分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白(HbF)的能力。

在上述方法的一些實施方案中，所述治療步驟包括：

a)動員所述個體骨髓中的CD34陽性HSPC進入週邊血液以增加週邊血液中的CD34陽性HSPC的量;

b)從所述個體的週邊血液中分離CD34陽性HSPC，以獲得經分離的CD34陽性HSPC群體(“經分離的TR細胞”)，

c)修飾經分離的TR細胞以獲得降低了BCL11A功能的、第二群體的經修飾CD34陽性HSPC(“經修飾的TR細胞”);以及

d)向所述個體施用有效量的經修飾的TR細胞。

一方面，本申請提供一種治療個體中異常血紅素症的方法，包括：

1)評估步驟，其中所述評估步驟包括：

a)從所述個體的骨髓或週邊血液樣品中分離CD34陽性HSPC以獲得經分離的CD34陽性HSPC群體(“經分離的EV細胞”);

b)修飾經分離的EV細胞以獲得降低了BCL11A功能的第一群體的經修飾CD34陽性HSPC細胞(“經修飾的EV細胞”);以及

c)評估經修飾的EV細胞分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白(HbF)的能力;以及

2)治療步驟，其中所述治療步驟包括：

a)將所述個體中的CD34陽性HSPC動員至週邊血液;

b)從所述個體的週邊血液中分離CD34陽性HSPC以獲得經分離的CD34陽性HSPC群體(“經分離的TR細胞”)，

d)向所述個體施用有效量的經修飾的TR細胞。

1)評估步驟，其中所述評估步驟包括：

b)基因修飾（比如透過CRISPR方法基因修飾）經分離的EV細胞以獲得降低了BCL11A功能的第一群體的經修飾CD34陽性HSPC細胞(“經修飾的EV細胞”);以及

2)治療步驟，其中所述治療步驟包括：

a)將所述個體中的CD34陽性HSPC動員至週邊血液;

c) 基因修飾（比如透過CRISPR方法基因修飾）經分離的TR細胞以獲得降低了BCL11A功能的、第二群體的經修飾CD34陽性HSPC(“經修飾的TR細胞”);以及

d)向所述個體施用（例如靜脈注射，包括單次靜脈注射）有效量的經修飾的TR細胞。

在上述方法的一些實施方案中，所述用於分離CD34陽性HSPC以產生經分離的EV細胞的骨髓或週邊血液樣品為少量，比如骨髓取樣量不多於20ml，例如5-20ml、5-10ml；週邊血液取樣量不多於30ml，例如10-30ml、15-20ml。

在上述方法的一些實施方案中，所述用於分離CD34陽性HSPC以產生經分離的TR細胞的骨髓或週邊血液樣品為多量，比如不少於50mL，例如50-300ml，100-200ml。

在上述方法的一些實施方案中，所述CD34陽性HSPC細胞可由個體骨髓或週邊血液分離獲得。在一些實施方案中，所述分離方法包括磁珠分離。在上述方法的一些實施方案中，所述方法包括對經分離的EV細胞進行基因修飾。在上述方法的一些實施方案中，所述基因修飾包括透過鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化因子樣效應因子核酸酶(TALEN)以及規律性間隔的短回文序列重複(CRISPR)、RNA編輯、RNA干擾（RNAi）技術中的任一方法或他們的組合對經分離的EV細胞進行基因修飾。在上述方法的一些實施方案中，透過對人類第2號染色體第60495197位元至第60495346位元區域的BCL11A基因進行修飾，降低BCL11A功能。在上述方法的一些實施方案中，透過CRISPR/Cas技術對CD34陽性HSPC細胞進行基因修飾，降低BCL11A功能。在上述方法的一些實施方案中，透過BCL11A功能抑制劑對CD34陽性HSPC細胞進行修飾，降低BCL11A功能。在一些實施方案中，所述BCL11A功能抑制劑為抑制BCL11A基因轉錄和/或表達的蛋白或核酸分子，例如核酸酶（例如ZFN和TALEN）、肽核酸、反義RNA、siRNA、miRNA和shRNA。在一些實施方案中，所述BCL11A功能抑制劑為抑制人類第2號染色體第60495197位元至第60495346位元區域基因轉錄和/或表達的蛋白或核酸分子，在一些實施方案中，所述BCL11A功能抑制劑為干擾、抑制或破壞人類第2號染色體第60495197位元至第60495346位元區域基因轉錄和/或表達的蛋白或核酸分子。在一些實施方案中，所述BCL11A功能抑制劑為干擾、抑制或破壞人類第2號染色體第60495197位元至第60495346位元區域的核酸酶（例如ZFN和TALEN）、肽核酸、反義RNA、siRNA、miRNA。

在上述方法的一些實施方案中，在評估步驟中評估經修飾的EV細胞分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白(HbF)的能力，所述步驟包括：1)在允許分化以獲得紅血球群體的條件下培養經修飾的EV細胞；以及 2)確定所述紅血球產生的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白(HbF)的水準。

在上述方法的一些實施方案中，在評估步驟中評估經修飾的EV細胞中分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白(HbF)的能力包括：確定γ-球蛋白的mRNA水準。在上述方法的一些實施方案中，在評估步驟中評估經修飾的EV細胞分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白(HbF)的能力包括：確定胎兒血紅蛋白(HbF)的蛋白質水準。在上述方法的一些實施方案中，其中所述個體在評估步驟之前未經歷過CD34陽性HSPC細胞動員或預處理。比如，個體在評估步驟之前未注射清骨髓和清淋巴的藥物，如白消安（Busulfan）和氟達拉濱（Fludarabine）等。在上述方法的一些實施方案中，所述評估步驟在所述治療步驟之前重複至少一次。

對經分離的TR細胞進行修飾的方法可以和對經分離的EV細胞進行修飾的方法相同或不同。在一些實施方案中，對經分離的TR細胞進行修飾的方法可以和對經分離的EV細胞進行修飾的方法相同。在上述方法的一些實施方案中，對經分離的TR細胞進行基因修飾。在上述方法的一些實施方案中，所述基因修飾包括透過鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化因子樣效應因子核酸酶(TALEN)以及規律性間隔的短回文序列重複(CRISPR)、RNA編輯、RNA干擾（RNAi）技術中的任一方法或他們的組合對經分離的TR細胞進行基因修飾。在上述方法的一些實施方案中，透過對人類第2號染色體第60495197位元至第60495346位元區域的BCL11A基因進行修飾，降低BCL11A功能。在上述方法的一些實施方案中，透過CRISPR/Cas技術對CD34陽性HSPC細胞進行基因修飾，降低BCL11A功能。在上述方法的一些實施方案中，透過BCL11A功能抑制劑對CD34陽性HSPC細胞進行修飾，降低BCL11A功能。在一些實施方案中，所述BCL11A功能抑制劑為抑制BCL11A基因轉錄和/或表達的蛋白或核酸分子，例如核酸酶（例如ZFN和TALEN）、肽核酸、反義RNA、siRNA、miRNA和shRNA。在一些實施方案中，所述BCL11A功能抑制劑為抑制人類第2號染色體第60495197位元至第60495346位元區域基因轉錄和/或表達的蛋白或核酸分子，在一些實施方案中，所述BCL11A功能抑制劑為干擾、抑制或破壞人類第2號染色體第60495197位元至第60495346位元區域基因轉錄和/或表達的蛋白或核酸分子。在一些實施方案中，所述BCL11A功能抑制劑為干擾、抑制或破壞人類第2號染色體第60495197位元至第60495346位元區域的核酸酶（例如ZFN和TALEN）、肽核酸、反義RNA、siRNA、miRNA。

在一些實施方案中，在治療步驟中包括對該個體進行骨髓動員使得骨髓產生大量的造血幹細胞釋放進入週邊血液循環系統。動員CD34陽性HSPC包括在採集CD34陽性HSPC細胞之前（例如4-10天、5-8天、6-7天）給予所述個體粒細胞集落刺激因子(GCSF)和/或普樂沙福(plerixafor)。

在上述方法的一些實施方案中，所述治療步驟還包括：在施用所述經修飾的TR細胞之前對所述個體進行預處理。預處理可包括清髓和/或清淋巴治療。在一些實施方案中，所述預處理包括化療、單克隆抗體療法或全身放射。在一些實施方案中，所述化療包括向所述個體施用一種或多種選自由下述組成的組的化學治療劑：白消安，環磷醯胺（Cyclophosphamide）和氟達拉濱。

在上述方法的一些實施方案中，所述治療步驟包括向所述個體施用（比如靜脈注射, 包括單次靜脈注射）≥2x10⁶ 、≥5x10⁶ 、≥1x10⁷ 、≥2x10⁷ 個細胞/kg體重經修飾的TR細胞。

在一些實施方案中，在進行修飾之前將分離的TR細胞培養一天或多天，之後對分離的TR細胞進行修飾。在一些實施方案中，所述經修飾的TR細胞在施用于個體之前培養一天或多天（例如2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天）。在一些實施方案中，在將經修飾的TR細胞施用於個體之前，將經修飾的TR細胞在冷凍條件下儲存至少24小時。在一些實施方案中，在冷凍條件下進行儲存之前，將經修飾的TR細胞培養一天或多天（例如2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天）。

在上述方法的一些實施方案中，所述異常血紅素症選自由下述組成的組：鐮狀細胞病、鐮狀細胞性狀、血紅蛋白C病、血紅蛋白C性狀、血紅蛋白S / C病、血紅蛋白D病、血紅蛋白 E病、地中海型貧血、帶有增加的氧親和力的與血紅蛋白相關的病症、帶有降低的氧親和力的與血紅蛋白相關的病症、不穩定的異常血紅素症和高鐵血紅蛋白血症。在一些實施方案中，所述異常血紅素症選自由β-地中海型貧血和鐮狀細胞性貧血組成的組。在一些實施方案中，所述異常血紅素症是β0或β+地中海型貧血。

在上述方法的一些實施方案中，其中所述個體是人。在一些實施方案中，所述個體為年齡35歲以下的人。在一些實施方案中，所述個體為男性。在一些實施方案中，所述個體為女性。在一些實施方案中，所述個體為無心臟、肝臟、肺或脾臟併發症的人。在一些實施方案中，所述個體在治療前的血紅蛋白水準不多於5.0g/dL、6.0g/dL、7.0g/dL、8.0g/dL、9.0g/dL週邊血液。在上述方法的一些實施方案中，其中緊隨所述評估步驟進行所述治療步驟。

本申請涉及透過降低BCL11A功能，例如透過基因組編輯技術破壞造血幹細胞中BCL11A紅系增強子位點，將經過基因編輯的造血幹細胞進行紅血球分化，透過評估上調γ球蛋白和胎兒血紅蛋白的表達的程度，來預測基因編輯技術治療異常血紅素症，例如β-地中海型貧血和鐮刀紅血球貧血是否有效或者有效性高低的方法。

具體地，本申請提供了一種治療個體中的異常血紅素症的方法，包括：

a）評估步驟，該評估步驟包括評估經修飾的CD34陽性造血幹細胞/祖細胞（“CD34陽性HSPC”）的第一群體分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力，其中第一群體的經修飾的CD34陽性HSPC來源於所述個體並經過修飾以降低BCL11A功能（“經修飾的EV細胞”）;並且

b）治療步驟，該治療步驟包括向所述個體施用第二群體經修飾的CD34陽性HSPC，該經修飾的CD34陽性HSPC來源於所述個體並且經修飾降低了BCL11A功能（“經修飾的TR細胞”）。在上述方法的實施方案中，該第一群體和/或第二群體是透過對人類第2號染色體第60495197位元至第60495346位元區域的BCL11A基因進行修飾(比如透過CRISPR/Cas技術進行基因修飾, 包括將包含選SEQ ID NO: 3~ SEQ ID NO: 25任一序列的sgRNA導入所述CD34陽性造血幹細胞/祖細胞對BCL11A基因進行編輯)來降低BCL11A功能。

一方面，本申請提供一種治療個體中的異常血紅素症的方法，包括治療步驟，所述治療步驟包括向所述個體施用來源於所述個體且經修飾降低了BCL11A功能的第二群體的經修飾CD34陽性HSPC（“經修飾的TR細胞”），

其中基於經由評估步驟的功能評價選出所述個體用於治療，所述評估步驟包括：評估第一群體經修飾的CD34陽性HSPC分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力，其中第一群體的經修飾CD34陽性HSPC來源於個體並經修飾降低了BCL11A功能（“經修飾的EV細胞”）。在上述方法的實施方案中，該第一群體和/或第二群體是透過對人類第2號染色體第60495197位元至第60495346位元區域的BCL11A基因進行修飾(比如透過CRISPR/Cas技術進行基因修飾, 包括將包含選SEQ ID NO: 3~ SEQ ID NO: 25任一序列的sgRNA導入所述CD34陽性造血幹細胞/祖細胞對BCL11A基因進行編輯)來降低BCL11A功能。

一方面，本申請提供一種選擇患有異常血紅素症的個體用於以第二群體的經修飾CD34陽性HSPC進行治療的方法，所述經修飾CD34陽性HSPC來源於所述個體並經修飾降低了BCL11A功能（“經修飾的TR細胞”），其中所述方法包括評估步驟，所述評估步驟包括：評估第一群體的經修飾CD34陽性HSPC分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力，其中第一群體的經修飾CD34陽性HSPC來源於所述個體並經修飾降低了BCL11A功能（“經修飾的EV細胞”），其中如果第一群體的經修飾CD34陽性HSPC產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF），則選擇所述個體進行治療。在上述方法的實施方案中，該第一群體和/或第二群體是透過對人類第2號染色體第60495197位元至第60495346位元區域的BCL11A基因進行修飾(比如透過CRISPR/Cas技術進行基因修飾, 包括將包含選SEQ ID NO: 3~ SEQ ID NO: 25任一序列的sgRNA導入所述CD34陽性造血幹細胞/祖細胞對BCL11A基因進行編輯)來降低BCL11A功能。

1)評估步驟，其中所述評估步驟包括：

2)治療步驟，其中所述治療步驟包括：

a)將所述個體中的CD34陽性HSPC動員至週邊血液;

d)向所述個體施用（例如靜脈注射，包括單次靜脈注射）有效量的經修飾的TR細胞。在上述方法的實施方案中，該第一群體和/或第二群體是透過對人類第2號染色體第60495197位元至第60495346位元區域的BCL11A基因進行修飾(比如透過CRISPR/Cas技術進行基因修飾, 包括將包含選SEQ ID NO: 3~ SEQ ID NO: 25任一序列的sgRNA導入所述CD34陽性造血幹細胞/祖細胞對BCL11A基因進行編輯)來降低BCL11A功能。

在上述方法的一些實施方案中，所述CD34陽性HSPC細胞可由個體骨髓或週邊血液分離獲得。在一些實施方案中，所述分離方法包括磁珠分離。例如將骨髓或週邊血液中的細胞用超級順磁性的 MACS MicroBeads （MACS微型磁珠）特異性地標記，磁性標記之後，使這些細胞透過一個放在強而穩定磁場中的分選柱（分選柱裡的基質造成一個高梯度磁場）。被磁性標記的細胞滯留在柱內而未被標記的細胞流出。當分選柱移出磁場後，滯留柱內的磁性標記細胞便可以被洗脫出來，如此便可以獲得標記和未標記的兩個細胞群體。在具體的實施方案中，可以使用Ficoll液密度梯度離心法，利用不同成分的比重差異，透過低速密度梯度離心，將血液中不同的細胞層分離開。紅血球和粒細胞密度大於分層液體，並且因紅血球遇到Ficoll液之後會迅速凝集成串錢狀而積于管底。唯有與分層液密度相當的單個核細胞富集在血漿層和分層液之間，即白膜層，造血幹細胞即存在於此層，透過後續磁珠分選即可獲得CD34陽性HSPC細胞。

一方面，本申請提供一種確定患有異常血紅素症的個體是否適合於用來源於所述個體並經修飾降低了BCL11A功能的第二群體的經修飾CD34陽性HSPC（“經修飾的TR細胞”）進行治療的方法，其中所述方法包括評估步驟，其包括：評估第一群體的經修飾CD34陽性HSPC分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力，其中第一群體的經修飾的CD34陽性HSPC來源於所述個體並經修飾降低了BCL11A功能（”經修飾的” EV細胞），其中如果第一群體的經修飾CD34陽性HSPC產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF），則所述個體適於治療。

一方面，本申請提供一種確定患有異常血紅素症的個體不適合用來源於所述個體並經修飾降低了BCL11A功能的第二群體的經修飾CD34陽性HSPC（“經修飾的TR細胞”）進行治療的方法，其中所述方法包括評估步驟，其包括：評估第一群體的經修飾的CD34陽性HSPC分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力，其中第一群體的經修飾的CD34陽性HSPC來源於所述個體並經修飾降低了BCL11A功能（“經修飾的” EV細胞），其中如果第一群體的經修飾的CD34陽性HSPC不產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF），則所述個體不適合用所述第二群體的經修飾CD34陽性HSPC（“經修飾的TR細胞”）進行治療。

“造血幹細胞”是指具有旺盛的增殖潛力、多向分化的能力和自我更新能力的細胞群體。造血幹細胞不僅能分化、補充各種血細胞，還能透過自我更新保持幹細胞的特性和數量。造血幹細胞的分化程度和增殖能力不一，有異質性。多能造血幹細胞最原始，先分化為定向多能造血幹細胞，例如能生成粒系、紅系、單核系和巨核-血小板系的髓系造血幹細胞及能發生B淋巴細胞和T淋巴細胞的淋巴幹細胞。這兩類幹細胞既保持著造血幹細胞基本特點，又略有分化，分別負責“骨髓成分”和淋巴細胞的發生，故稱定向多能造血幹細胞。它們進一步分化成為造血祖細胞，此細胞雖然也是原始的血細胞，但是它已喪失造血幹細胞的許多基本特點，如已失去多向性分化能力，只能朝向一系或密切相關的二系細胞分化；失去了反復自我更新能力，而要依靠造血幹細胞的增殖分化來補充數量；增殖潛力有限，只能分裂數次。根據造血祖細胞所能分化生成的血細胞系多少，又分為單能造血祖細胞(只分化為一個血細胞系)和寡能造血祖細胞(可分化為2～3個血細胞系)。本申請中“造血幹細胞/祖細胞”和“造血幹細胞”術語可以互換使用，涵蓋多能造血幹細胞、定向多能造血幹細胞和造血祖細胞，是具有不同異質性的造血幹細胞的總稱。

本申請所述的“CD34陽性造血幹細胞/祖細胞”，簡寫CD34陽性HSPC(hematopoietic stem/progenitor cell，HSPC)，指表面表達CD34標誌物的、有造血功能的幹細胞和祖細胞細胞群體。可以使用例如流式細胞術和螢光標記的抗CD34抗體來檢測和計數CD34陽性造血幹細胞/祖細胞。

在具體實施方案中，CD34陽性造血幹細胞/祖細胞從包含造血來源細胞的生物體（個體）分離或獲得。“分離”是指從其原始環境取出。例如，如果細胞與在其天然狀態通常伴隨它的一些或所有組分分開時，則它是分離的。

造血幹細胞/祖細胞可以從成人的未分級分離或分級分離的骨髓獲得或分離，包括股骨，髖骨，肋骨，胸骨和其它骨骼。造血幹細胞和祖細胞可以利用針和注射器從髖骨取出直接獲得或分離，或者從血液中獲得，通常是在造血幹細胞動員劑諸如G-CSF(粒細胞集落刺激因子)預處理後從血液中獲得。造血幹細胞和祖細胞的其他來源包括臍帶血、胎盤血和經過動員的個體的週邊血液。

從個體（例如骨髓或週邊血液）分離獲得細胞群體後可對其進行進一步純化獲得CD34陽性造血幹細胞/祖細胞。例如可以透過免疫去除分離的細胞群體中的成熟譜系定向細胞，例如透過用結合一組“譜系”抗原（例如CD2，CD3，CD11b，CD14，CD15，CD16，CD19，CD56，CD123和CD235a）的抗體標記固體基質，之後用結合CD34陽性抗原的抗體分離原始造血幹細胞和祖細胞。用於從多種細胞來源純化造血幹細胞和祖細胞的試劑盒是商業可獲得的，並且在具體實施方案中，這些試劑盒可以與本發明的方法一起使用。

“CD34陽性造血幹細胞/祖細胞”可代表富含CD34陽性細胞的細胞群中至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的CD34陽性造血幹細胞/祖細胞細胞群體。

經“修飾”的細胞是指細胞透過生物或化學方法在分子水準或細胞水準上發生了變化。例如經分離的CD34陽性造血幹細胞/祖細胞（“CD34陽性HSPC”）透過基因編輯方法，例如透過選自ZFN, TALEN、CHRISPR、RNA編輯或RNAi技術破壞了BCL11A基因或其編碼RNA產生BCL11A功能降低的經修飾的EV細胞或經修飾的TR細胞。也可透過例如核酸酶（例如ZFN和TALEN）、肽核酸、反義RNA、siRNA、miRNA、shRNA等BCL11A功能抑制劑抑制BCL11A基因的功能從而實現對經分離的CD34陽性造血幹細胞/祖細胞（“CD34陽性HSPC”）的修飾，產生經修飾的EV細胞或經修飾的TR細胞。CD34陽性

“EV細胞”在本文中代表用於進行評估（Evaluation，EV）的細胞；而“TR細胞”在本文中代表用於進行治療（Treatment，TR）的細胞。

造血幹細胞“動員(mobilization)”是指處於造血微環境中的造血幹細胞在受到動員劑的作用後從特定的骨髓微環境中運動遷移到外周迴圈的過程。

異常血紅素症(hemoglobinopathy)是由於血紅蛋白分子結構異常或球蛋白肽鏈合成異常所引起的一組遺傳性血液病。臨床可表現溶血性貧血、高鐵血紅蛋白血症或因血紅蛋白氧親和力增高或減低而引起組織缺氧或代償性紅血球增多所致紫紺等。

“血紅蛋白”是一種結合蛋白，由球蛋白和血紅素構成。球蛋白分子有二對肽鏈，一對是α鏈，另一對是非α鏈，有β、γ、δ、ξ(結構與α鏈相似)及ε5種。人類血紅蛋白是由二對(4條)血紅蛋白單體(每一條肽鏈和一個血紅素連接，構成一個血紅蛋白單體)按一定的空間關係結合成四聚體，如HbA(或HbA1，α2β2)、HbA2(α2δ2)及HbF(α2γ2)。其中，HbF(α2γ2)為胎兒血紅蛋白四聚體。

如本文使用，“BCL11A” 是一種轉錄因子，首先在小鼠中發現，作為逆轉錄病毒的結合位元點，被命名為Evi9, 後來在人類基因組中也發現這一基因，定位於2號染色體短臂2p13位點。

經過修飾BCL11A功能降低是指透過修飾，例如經過基因修飾(例如DNA水準和/或RNA水準的基因編輯)或透過加入BCL11A功能抑制劑(例如針對BCL11A基因的核酸酶（例如ZFN和TALEN）、肽核酸、反義RNA、siRNA、miRNA、shRNA)使BCL11A基因被破壞、表達和/或轉錄被抑制、減弱、受阻、干擾。

如本申請使用的，“CRISPR/Cas”是一種基因編輯技術，包括但不限於各種自然存在或人工設計的CRISPR/Cas系統, 如CRISPR/Cas9系統。自然存在的CRISPR/Cas系統(Naturally occurring CRISPR/Cas system)是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防禦，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。例如，CRISPR/Cas9的工作原理是 crRNA(CRISPR-derived RNA)透過堿基配對與 tracrRNA(trans-activating RNA)結合形成 tracrRNA/crRNA 複合物，此複合物引導核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對的序列靶位點剪切雙鏈 DNA。而透過人工設計tracrRNA和crRNA，可以改造形成具有引導作用的sgRNA (single guide RNA )，足以引導 Cas9 對 DNA 的定點切割。作為一種 RNA 導向的 dsDNA 結合蛋白，Cas9 效應物核酸酶能夠共定位 RNA、DNA 和蛋白，從而擁有巨大的改造潛力。CRISPR/Cas系統可使用一類，二類或三類Cas蛋白。本發明的一些實施方式中，所述方法使用Cas9。其他適用的CRISPR/Cas系統包括但不限於WO2013176772，WO2014065596，WO2014018423，US8,697,359、PCT/CN2018/112068、PCT/CN2018/112027中所描述的系統和方法。

在上述方法的一些實施方案中，所述方法包括對經分離的EV細胞進行基因修飾。在上述方法的一些實施方案中，所述基因修飾包括

透過鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化因子樣效應因子核酸酶(TALEN)以及規律性間隔的短回文序列重複(CRISPR)、RNA編輯、RNA干擾（RNAi）技術中的任一方法或他們的組合對經分離的EV細胞進行基因修飾。

在本發明的一些實施方案中，透過基因修飾（例如選自(ZFN、TALEN、CRISPR、RNA編輯或RNAi)方法破壞BCL11a增強子（影響例如增強BCL11a的表達或功能的核酸序列）。所述BCL11a增強子參見例如，Bauer等人,Science[科學],第342卷,2013,第253-257頁所述。所述BCL11a增強子的一個實例是BCL11a基因的外顯子2和外顯子3之間的核酸序列(例如，位於或對應於如hg38中所記錄的位置+55:Chr2:60497676-60498941；+58:Chr2:60494251-60495546；+62:Chr2:60490409-60491734處的核酸)。所述BCL11a增強子的一個實例是BCL11a基因的外顯子2和外顯子3之間的核酸序列的+62區域。所述BCL11a增強子的一個實例是BCL11a基因的外顯子2和外顯子3之間的核酸序列的+58區域（BCL11A基因58K位點150bp序列：ctgccagtcctcttctaccccacccacgcccccaccctaatcagaggccaaacccttcctggagcctgtgataaaagcaactgttagcttgcactagactagcttcaaagttgtattgaccctggtgtgttatgtctaagagtagatgcc）(SEQ ID NO: 2)。在一些實施方案中，BCL11a增強子是BCL11a基因的外顯子2和外顯子3之間的核酸序列的+55區域。

在上述方法的一些實施方案中，透過對人類第2號染色體第60495197位元至第60495346位元區域的BCL11A基因進行修飾，降低BCL11A功能。在上述方法的一些實施方案中，透過CRISPR/Cas技術對CD34陽性HSPC細胞進行修飾，降低BCL11A功能。在一些實施方案中，所述BCL11A功能抑制劑為抑制人類第2號染色體第60495197位元至第60495346位元區域基因轉錄和/或表達的蛋白或核酸分子，在一些實施方案中，所述BCL11A功能抑制劑為干擾、抑制或破壞人類第2號染色體第60495197位元至第60495346位元區域基因轉錄和/或表達的蛋白或核酸分子。在一些實施方案中，所述BCL11A功能抑制劑為干擾、抑制或破壞人類第2號染色體第60495197位元至第60495346位元區域的核酸酶（例如ZFN和TALEN）、肽核酸、反義RNA、siRNA、miRNA。在上述方法的一些實施方案中，透過基因編輯技術破壞所述造血幹細胞中2號染色體第60495219位至第60495336位的BCL11A基因組區域減低BCL11A功能。在上述方法的一些實施方案中，所述基因編輯技術為基於鋅指核酸酶的基因編輯技術、TALEN基因編輯技術或CRISPR/Cas基因編輯技術、RNA編輯技術、RNAi技術。在上述方法的一些實施方案中，所述基因編輯技術為CRISPR/Cas9基因編輯技術。在上述方法的一些實施方案中，所述BCL11A基因組靶核苷酸序列與選自SEQ ID No.3~ SEQ ID No.25任一的序列互補。

在上述方法的一些實施方案中，將包含選自SEQ ID NO: 3~ SEQ ID NO: 25任一序列的sgRNA導入所述CD34陽性造血幹細胞/祖細胞對BCL11A基因進行編輯，減低BCL11A功能。在上述方法的一些實施方案中，所述sgRNA是經過2’-O-甲基類似物和/或核苷酸間3’硫代修飾的。在上述方法的一些實施方案中，所述化學修飾為所述sgRNA的5’端前一個、二個和/或三個堿基和/或3’端的最後一個堿基的2’-O-甲基類似物修飾。在上述方法的一些實施方案中，將所述sgRNA與Cas9編碼核苷酸共同導入所述CD34陽性造血幹細胞/祖細胞。在上述方法的一些實施方案中，透過電轉方法將sgRNA與Cas9編碼核苷酸共同導入造血幹細胞。在上述方法的一些實施方案中，所述電轉條件為200-600V，0.5ms-2ms。

細胞“分化”是指同一來源的細胞逐漸產生形態結構、功能特徵各不相同的細胞類群的過程。

從造血幹細胞到紅血球的“分化”包括造血幹細胞階段、紅系祖細胞階段、紅系前體細胞（原紅血球至晚紅血球）的增殖與分化階段、網織紅血球的增殖及成熟過程，以及網織紅血球向週邊血液釋放成熟為紅血球的階段。造血幹細胞階段：目前已知，造血幹細胞主要存在於骨髓、脾、肝等造血組織內。也有少量迴圈于週邊血液中。紅系祖細胞階段：在紅系祖細胞（progenitor cell）階段，細胞是處於造血幹細胞與紅系前體細胞之間的細胞群。造血幹細胞在骨髓造血微環境的影響下分化為紅系祖細胞。造血微環境包括微血管系統、神經系統和造血間質等部分。透過體液因子、細胞因子對造血幹細胞的分化起特殊的作用和影響。紅系前體細胞階段：包括原始紅血球、早幼紅血球、中幼紅血球、晚幼紅血球及網織紅血球階段而達到成熟紅血球。

細胞成熟的過程是血紅蛋白增加和細胞核活性衰減的過程。隨著細胞的成熟，有核紅血球中的血紅蛋白含量不斷增加，RNA的含量不斷減少。紅血球內血紅蛋白的增高促使核失去活性，不再合成DNA或RNA。實驗證實這是由於血紅蛋白透過核膜間孔進入核內，作用於核組蛋白（nucleohistones），導致染色體失活而促進核凝縮。晚幼紅血球已失去繼續分裂的能力，以後細胞核濃縮並逸出，被單核巨噬細胞吞噬，或在脾臟內碎裂、溶解，成為無細胞核的網織紅血球。在成熟紅血球階段不再合成血紅蛋白。根據細胞內血紅蛋白濃度的增高會促使細胞核失去活性的理論，紅血球成熟過程分裂的次數、細胞最終的大小與血紅蛋白合成的快慢有一定的關係。隨著細胞的成熟，紅系細胞的直徑逐漸縮短，細胞體積也逐漸縮小。這是因為細胞內一些用以合成血紅蛋白、基質蛋白及各種酶的細胞器（如線粒體、高爾基器、聚核糖體）逐漸減少，細胞器也逐漸退化消失。基因活性在紅血球成熟過程中是由球蛋白的表達所支配。球蛋白在原始紅血球中僅占蛋白質的0.1%，到網織紅血球時達95%。已知成年人球蛋白的合成主要是HbA（α2β2），少量的HbA2 （α2δ2）及HbF（α2γ2）。應用方向性核素標記細胞增殖週期DNA合成能力作指標可以推算紅系細胞的增殖時間，原始紅血球的增殖時間約為20小時，早幼紅血球約為16小時，中幼紅血球為25～30小時，晚幼紅血球不具備合成DNA的能力，屬非增殖性細胞。故正常紅系前體細胞由骨髓生成，經過增殖、分化直到新生網織紅血球從骨髓中逸出約需3～5天。網織紅血球以後又在脾內停留1～2天，繼續成熟且改變膜脂質成分後再進入血循環。

“所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白(HbF)的能力”表示與不經過修飾的EV細胞分化後產生γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白的水準相比，EV細胞經修飾並分化後產生γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白的水準提高，例如提高至少0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、1.0倍、1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6.0倍或更多。例如，在本申請的一些實施方案中，所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白為相對於不經修飾的CD34陽性HSPC，經修飾的CD34陽性HSPC產生120%、130%、140%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%、600%，或更高水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白。

在上述方法的一些實施方案中，所述所需水準的胎兒血紅蛋白超過6.5g/dL、7.0g/dL、7.5g/dL、8.0g/dL、8.5g/dL、9.0g/dL、9.5g/dL、10g/dL、10.5g/dL、11.0g/dL週邊血液，或更高水準。

在上述方法的一些實施方案中，所述所需水準的γ-球蛋白為相對於不經修飾的CD34陽性HSPC，經修飾的CD34陽性HSPC產生超過50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%、600%，或更高水準的γ-球蛋白mRNA。

上述γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白(HbF)的水準可以在CD34陽性HSPC分化到無核紅血球占全部分化細胞群體總數的10%以上（例如15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%）後透過例如檢測γ-球蛋白mRNA或血紅蛋白(HbF)檢測，來比較經修飾降低了BCL11A功能的CD34陽性HSPC分化後產生γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的水準是否比未經此修飾的CD34陽性HSPC分化後產生的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）水準至少提高約12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、120%。

在一些實施方案中，所述經修飾降低了BCL11A功能的CD34陽性HSPC是透過對人類第2號染色體第60495197位元至第60495346位元區域的BCL11A基因進行修飾(比如透過CRISPR/Cas技術進行基因修飾, 包括將包含選SEQ ID NO: 3~ SEQ ID NO: 25任一序列的sgRNA導入所述CD34陽性造血幹細胞/祖細胞對BCL11A基因進行編輯)來降低BCL11A功能的。

在上述方法的一些實施方案中，在評估步驟中評估經修飾的EV細胞分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白(HbF)的能力，所述步驟包括：i)在允許分化以獲得紅血球群體的條件下培養經修飾的EV細胞；以及 2)確定所述紅血球產生的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白(HbF)的水準。

在上述方法的一些實施方案中，在評估步驟中評估經修飾的EV細胞中分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白(HbF)的能力包括：確定γ-球蛋白的mRNA水準。在上述方法的一些實施方案中，在評估步驟中評估經修飾的EV細胞分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白(HbF)的能力包括：確定胎兒血紅蛋白(HbF)的蛋白質水準。在上述方法的一些實施方案中，其中所述個體在評估步驟之前未經歷過CD34陽性HSPC細胞動員或預處理。

在一些實施方案中，所述CD34陽性HSPC細胞動員包括給予受試者個體G-CSF和/或MozobilTM(Genzyme公司)或其它造血幹細胞動員劑。

在上述方法的一些實施方案中，所述評估步驟在所述治療步驟之前重複至少一次，比如2、3、4、5次或更多次。

分離的TR細胞可以透過採用與修飾分離的EV細胞同樣的或不同的方法進行修飾。在上述方法的一些實施方案中，將經分離的TR細胞進行基因修飾。在上述方法的一些實施方案中，在上述方法的一些實施方案中，所述方法包括對經分離的TR細胞進行基因修飾。在上述方法的一些實施方案中，所述基因修飾包括透過鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化因子樣效應因子核酸酶(TALEN)以及規律性間隔的短回文序列重複(CRISPR)中的任一方法或他們的組合對經分離的TR細胞進行基因修飾。

在本發明的一些實施方案中，透過基因修飾（例如選自(ZFN、TALEN、CRISPR、RNA編輯、RNAi)方法破壞分離的EV細胞或TR細胞中的BCL11a增強子（影響例如增強BCL11a的表達或功能的核酸序列）。所述BCL11a增強子參見例如，Bauer等人,Science[科學],第342卷,2013,第253-257頁所述。所述BCL11a增強子的一個實例是BCL11a基因的外顯子2和外顯子3之間的核酸序列(例如，位於或對應於如hg38中所記錄的位置+55:Chr2:60497676-60498941；+58:Chr2:60494251-60495546；+62:Chr2:60490409-60491734處的核酸)。所述BCL11a增強子的一個實例是BCL11a基因的外顯子2和外顯子3之間的核酸序列的+62區域。所述BCL11a增強子的一個實例是BCL11a基因的外顯子2和外顯子3之間的核酸序列的+58區域。在一些實施方案中，BCL11a增強子是BCL11a基因的外顯子2和外顯子3之間的核酸序列的+55區域。

在上述方法的一些實施方案中，透過對人類第2號染色體第60495197位元至第60495346位元區域的BCL11A基因進行修飾，降低BCL11A功能。在上述方法的一些實施方案中，透過CRISPR/Cas技術對CD34陽性HSPC細胞進行修飾，降低BCL11A功能。在一些實施方案中，所述BCL11A功能抑制劑為抑制人類第2號染色體第60495197位元至第60495346位元區域基因轉錄和/或表達的蛋白或核酸分子，在一些實施方案中，所述BCL11A功能抑制劑為干擾、抑制或破壞人類第2號染色體第60495197位元至第60495346位元區域基因轉錄和/或表達的蛋白或核酸分子。在一些實施方案中，所述BCL11A功能抑制劑為干擾、抑制或破壞人類第2號染色體第60495197位元至第60495346位元區域的核酸酶（例如ZFN和TALEN）、肽核酸、反義RNA、siRNA、miRNA。

在上述方法的一些實施方案中，透過基因編輯技術破壞所述造血幹細胞中2號染色體第60495219位至第60495336位的BCL11A基因組區域減低BCL11A功能。在上述方法的一些實施方案中，所述基因編輯技術為基於鋅指核酸酶的基因編輯技術、TALEN基因編輯技術或CRISPR/Cas基因編輯技術、RNA編輯技術、RNAi技術。在上述方法的一些實施方案中，所述基因編輯技術為CRISPR/Cas9基因編輯技術。在上述方法的一些實施方案中，所述BCL11A基因組靶核苷酸序列與選自SEQ ID No.3~ SEQ ID No.25任一的序列互補。

下表列出了SEQ ID No.3~ SEQ ID No.25所示sg RNA所靶向的人染色體2上的基因組序列位置，以及每條sgRNA引起的Cas9切割的切割位點。

名稱	人類基因組序列上的位置	切割位點
BCL11A的增強子-7	chr2:60495203-60495222	chr2:60495219
BCL11A的增強子-8	chr2:60495208-60495227	chr2:60495224
BCL11A的增強子-9	chr2:60495217-60495236	chr2:60495233
BCL11A的增強子-10	chr2:60495218-60495237	chr2:60495234
BCL11A的增強子-11	chr2:60495219-60495238	chr2:60495235
BCL11A的增強子-14	chr2:60495221-60495240	chr2:60495223
BCL11A的增強子-12	chr2:60495222-60495241	chr2:60495238
BCL11A的增強子-13	chr2:60495223-60495242	chr2:60495239
BCL11A的增強子-15	chr2:60495228-60495247	chr2:60495244
BCL11A的增強子-16	chr2:60495229-60495248	chr2:60495245
BCL11A的增強子-17	chr2:60495230-60495249	chr2:60495246
BCL11A的增強子-18	chr2:60495231-60495250	chr2:60495247
BCL11A的增強子-19	chr2:60495234-60495253	chr2:60495250
BCL11A的增強子-20	chr2:60495235-60495254	chr2:60495251
BCL11A的增強子-2	chr2:60495236-60495255	chr2:60495238
BCL11A的增強子-1	chr2:60495247-60495266	chr2:60495263
BCL11A的增強子-6	chr2:60495252-60495271	chr2:60495268
BCL11A的增強子-5	chr2:60495253-60495272	chr2:60495269
BCL11A的增強子-4	chr2:60495257-60495276	chr2:60495273
BCL11A的增強子-3	chr2:60495264-60495283	chr2:60495280
BCL11A的增強子-22	chr2:60495299-60495318	chr2:60495301
BCL11A的增強子-23	chr2:60495319-60495338	chr2:60495335
BCL11A的增強子-21	chr2:60495320-60495339	chr2:60495336

SEQ ID NO: 3：名稱為BCL11A的增強子-1的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-1)sgRNA編碼序列： cacaggctccaggaagggtt

SEQ ID NO: 4：名稱為BCL11A的增強子-2的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-2)sgRNA編碼序列： atcagaggccaaacccttcc

SEQ ID NO: 5：名稱為BCL11A的增強子-3的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-3)sgRNA編碼序列： Ctaacagttgcttttatcac

SEQ ID NO: 6：名稱為BCL11A的增強子-4的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-4)sgRNA編碼序列： ttgcttttatcacaggctcc

SEQ ID NO: 7：名稱為BCL11A的增強子-5的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-5)sgRNA編碼序列： ttttatcacaggctccagga

SEQ ID NO: 8：名稱為BCL11A的增強子-6的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-6)sgRNA編碼序列： tttatcacaggctccaggaa

SEQ ID NO: 9：名稱為BCL11A的增強子-7的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-7)sgRNA編碼序列： tgggtggggtagaagaggac

SEQ ID NO: 10：名稱為BCL11A的增強子-8的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-8)sgRNA編碼序列： gggcgtgggtggggtagaag

SEQ ID NO: 11：名稱為BCL11A的增強子-9的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-9)sgRNA編碼序列： ttagggtgggggcgtgggtg

SEQ ID NO: 12：名稱為BCL11A的增強子-10的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-10)sgRNA編碼序列： attagggtgggggcgtgggt

SEQ ID NO: 13：名稱為BCL11A的增強子-11的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-11)sgRNA編碼序列： gattagggtgggggcgtggg

SEQ ID NO: 14：名稱為BCL11A的增強子-12的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-12)sgRNA編碼序列： tctgattagggtgggggcgt

SEQ ID NO: 15：名稱為BCL11A的增強子-13的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-13)sgRNA編碼序列： ctctgattagggtgggggcg

SEQ ID NO: 16：名稱為BCL11A的增強子-14的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-14)sgRNA編碼序列： cacgcccccaccctaatcag

SEQ ID NO: 17：名稱為BCL11A的增強子-15的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-15)sgRNA編碼序列： ttggcctctgattagggtgg

SEQ ID NO: 18：名稱為BCL11A的增強子-16的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-16)sgRNA編碼序列： tttggcctctgattagggtg

SEQ ID NO: 19：名稱為BCL11A的增強子-17的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-17)sgRNA編碼序列： gtttggcctctgattagggt

SEQ ID NO: 20：名稱為BCL11A的增強子-18的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-18)sgRNA編碼序列： ggtttggcctctgattaggg

SEQ ID NO: 21：名稱為BCL11A的增強子-19的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-19)sgRNA編碼序列： aagggtttggcctctgatta

SEQ ID NO: 22：名稱為BCL11A的增強子-20的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-20)sgRNA編碼序列： gaagggtttggcctctgatt

SEQ ID NO: 23：名稱為BCL11A的增強子-21的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-21)sgRNA編碼序列： actcttagacataacacacc

SEQ ID NO: 24：名稱為BCL11A的增強子-22的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-22)sgRNA編碼序列： cttcaaagttgtattgaccc

SEQ ID NO: 25：名稱為BCL11A的增強子-23的sgRNA(有時也簡稱為enhancer-23)sgRNA編碼序列： ctcttagacataacacacca

分析上述23條sg RNA的切割位點發現，這些sgRNA所引發的Cas9切割的切割位點集中在BCL11A基因第60495219位至第60495336位元基因組區域。

一般而言，sgRNA中的指導序列是與靶序列具有足夠的互補性以與靶序列雜交並指導CRISPR複合物與靶序列的序列特異性結合的任何多核苷酸序列。在一些實施方案中，當使用適當的比對演算法最佳比對時，指導序列及其相應靶序列間的互補程度為約或大於約80%、85%、90%、95%、97.5%、99%或更多。最佳比對可使用用於比對序列的任何適當的演算法確定，其非限制性實例包括Smith-Waterman演算法、Needleman-Wimsch演算法、基於Burrows-Wheeler Transform的演算法(例如Burrows Wheeler Aligner)、ClustalW、Clustai X、BLAT、Novoalign (Novocraft Technologies, ELAND ((Illumina, San Diego, CA)、SOAP (可在soap.genomics.org.cn獲得)和Maq (可在maq.sourceforge.net獲得)。在一些實施方案中，指導序列長度可以為約或大於約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或更多個核苷酸。在一些實施方案中，指導序列長度少於約75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、12或更少的核苷酸。指導序列指導CR1SPR複合物與靶序列的序列特異性結合的能力可透過任何適當的測定方法評估。例如，可向具有相應靶序列的宿主細胞提供足以形成CRISPR複合物的CRISPR系統的元件(包括待測試的指導序列)，如可透過使用編碼CRISPR序列元件的載體轉染，隨後評估靶序列內的優先切割(如透過如本文所述的Surveyor測定)來進行。同樣地，靶多核苷酸序列的切割可在測試管中透過提供靶序列、CRISPR複合物(包含待測試的指導序列和不同於指導序列的對照指導序列)的元件，並比較測試和對照指導序列在靶序列的結合或切割率，以此進行評估。也可以使用所屬技術領域中具有通常知識者知道的其它測定方法進行上述測定和評估。

在一些實施方案中，進行基因編輯過程中所使用的sgRNA是經過化學修飾的。“化學修飾的sgRNA”指標對sgRNA進行特殊的化學修飾，例如在其5’和3’末端3個堿基處的2’-O-甲基類似物修飾和/或核苷酸間的3’硫代修飾。

經過化學修飾的sgRNA至少具有以下兩個優點。第一、由於sgRNA是單鏈形式的RNA，其半衰期非常短，進入到細胞後，會迅速降解(最長不超過12小時)，而Cas9 蛋白結合sgRNA發揮基因編輯作用則至少需要48hrs。因此，採用經過化學修飾的sgRNA，進入細胞後，穩定表達，與Cas9蛋白結合後，能高效基因編輯基因組，產生Indels。第二、未經修飾的sgRNA穿透細胞膜能力差，無法有效進入細胞或組織發揮相應功能。而經過了化學修飾的sgRNA穿透細胞膜的能力通常是增強的。在本發明中可以採用本領域中常用的化學修飾方法，只要能夠提高sgRNA穩定性(延長半衰期)和提升進入細胞膜能力，均可以使用。除了實施例中使用的具體的化學修飾之外，還包括採用其它的修飾方法，例如，Deleavey GF1, Damha MJ. Designing chemically modified oligonucleotides for targeted gene silencing. Chem Biol. 2012 Aug 24;19(8):937-54，以及Hendel et al. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat Biotechnol. 2015 Sep;33(9):985-989文獻中報導的化學修飾方法。

在一些實施方案中，所述sgRNA和/或Cas9編碼核苷酸（如mRNA）透過電轉導入造血幹細胞，例如，透過250-360V，0.5-1ms；250-300V，0.5-1ms; 250V 1ms; 250V 2ms; 300V 0.5ms; 300V 1ms; 360V 0.5ms; 或360V1ms的電轉條件導入造血幹細胞。在一些實施方案中，所述sgRNA和Cas9編碼核苷酸透過電轉方式共同導入造血幹細胞。在一些實施方案中，所述sgRNA透過電轉方式導入表達Cas9的造血幹細胞。

在一些實施方案中，所述Cas9編碼核苷酸為mRNA，如含有ARCA帽的mRNA。在一些實施方案中，所述Cas9編碼核苷酸在病毒載體中，如慢病毒載體。在一些實施方案中，所述Cas9編碼核苷酸包含如SEQ ID NO：26所述的序列。在一些實施方案中，所述sgRNA與Cas9編碼核苷酸在同一載體中。

在上述方法的一些實施方案中，在治療步驟中動員CD34陽性HSPC包括：用粒細胞集落刺激因子(GCSF)和/或普樂沙福(plerixafor)治療所述個體。

在上述方法的一些實施方案中，所述治療步驟還包括：在施用所述經修飾的TR細胞之前對所述個體進行預處理。

在一些實施方案中，所述預處理包括化療、單克隆抗體療法或全身放射。在一些實施方案中，所述化療包括向所述個體施用一種或多種選自由下述組成的組的化學治療劑：白消安，環磷醯胺和氟達拉濱。

在上述方法的一些實施方案中，經修飾的EV細胞群體經過體外培養進一步分化為表達γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白的紅血球前體細胞或成熟紅血球。

在一些實施方案中，所述紅血球前體細胞為處於成熟紅血球之前的能夠表達γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白的前體細胞。

在上述方法的一些實施方案中，使用造血幹細胞紅系擴增和分化培養基對經修飾的EV細胞群體進行造血幹細胞紅系擴增和分化，其中，所述造血幹細胞紅系擴增和分化培養基包括基礎培養基，以及生長因子的組合物，其中所述生長因子的組合物包括幹細胞生長因子（SCF）；白介素3（IL-3）和促紅血球生成素（EPO）。在一些實施方案中，還包括使用紅系分化脫核培養基進行造血幹細胞紅系分化脫核，所述紅系分化脫核培養基包含基礎培養基、生長因子、以及孕酮受體和糖皮質激素受體的拮抗劑和/或抑制劑。在一些實施方案中，所述紅系分化脫核培養基中的生長因子包括促紅血球生成素（EPO），所述孕酮受體和糖皮質激素受體的拮抗劑和/或抑制劑為選自下述化合物(I)~(IV)中的任一種或兩種及以上：

(I)

(II)

(III)

(IV)。

在一些實施方案中，所述造血幹細胞紅系擴增和分化培養基包含基礎培養基和生長因子添加劑，其中所述基礎培養基可選自任何無血清基礎培養基，例如STEMSPAN™ SFEM II (STEM CELLS TECHNOLOGY Inc.), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium)，可選擇地補充有ITS (Thermofisher)、L-gulutamin(Thermofisher)、維生素C和/或牛血清白蛋白；其中生長因子添加劑選自IL-3、SCF和EPO中的一個或多個的組合。

在上述方法的一些實施方案中，將經修飾的EV細胞群體經過5-10天，例如6-10天、7-10天的擴增和分化後獲得紅血球前體細胞，例如成紅血球（erythroblast）、有核紅血球、幼紅血球和網織紅血球。將紅血球前體細胞再經過約4-14天，例如約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天的分化（或分化脫核）處理獲得成熟的紅血球。

在一些實施方案中，經修飾的EV細胞群體分化為產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的成熟紅血球的步驟可包括：

a)從人的週邊血液（經過或不經過骨髓造血幹細胞動員）或骨髓中獲得CD34陽性造血幹細胞/祖細胞（經分離的CD34陽性HSPC），

b)對上述CD34陽性HSPC進行基因修飾以降低BCL11A功能；

c)在無血清培養基（Serum-free medium (SFME)）中，添加額外的生長因子，經過5-10天，例如5天、6天、7天、8天、9天、10天擴增和分化，使HSPC分化成為紅血球前體細胞；

d) 在無血清培養基（Serum-free medium (SFME)）中，添加額外的生長因子，經過約4-14天，（例如約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天）分化後，獲得成熟的紅血球。在一些實施方案中，所述造血幹細胞紅系分化脫核培養基包含基礎培養基、生長因子及化學小分子添加劑，其中所述基礎培養基為無血清基礎培養基，例如可以為STEMSPAN™ SFEM II (STEM CELLS TECHNOLOGY Inc.)、IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium)，任選地添加有ITS (Thermofisher)、L-gulutamin(Thermofisher)、維生素C和/或牛血清白蛋白，生長因子及化學小分子添加劑包括EPO、人轉鐵蛋白和/或化學小分子mifepristone。

經修飾的CD34陽性HSPC（EV細胞群體）分化後產生γ-球蛋白mRNA或血紅蛋白(HbF)，產生的γ-球蛋白mRNA或血紅蛋白(HbF)可以透過本領域常規方法檢測。例如，當經修飾的CD34陽性HSPC（EV細胞群體）分化到無核紅血球占全部分化細胞群體總數的約10%以上（例如15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%）後，可以透過本領域常規方法檢測產生的γ-球蛋白mRNA或血紅蛋白(HbF)水準，比較經修飾降低了BCL11A功能的CD34陽性HSPC分化後產生的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）是否比未經此修飾的CD34陽性HSPC分化後產生的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）水準提高。如果提高了至少約12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、120%，表明可以用本發明的方法進行治療。在上述造血幹細胞紅系擴增和分化培養基和造血幹細胞紅系分化脫核培養基中可以使用任何常用的基礎培養基，例如STEMSPAN™ SFEM II (購自STEM CELL TECHONOLOGIES)；例如購自Thermo Fisher的IMDM、DF12、Knockout DMEM、RPMI 1640、Alpha MEM、DMEM等。此外，可以根據需要向這些基礎培養基中進一步添加其他成分，例如可以添加ITS(即主要包括胰島素、人轉鐵蛋白以及硒元素)、L-穀氨醯胺、維生素C以及牛血清白蛋白。例如可以在IMDM培養基中外加ITS、外加2mM L-穀氨醯胺、外加10-50 µg/ml 維生素C以及0.5-5品質%的BSA(牛血清白蛋白)。此外，上述DF12可以外加同樣濃度的ITS，L-穀氨醯胺，維生素C和牛血清白蛋白。Knockout DMEM可以外加同樣濃度的ITS，L-穀氨醯胺，維生素C和牛血清白蛋白，RPMI 1640可以外加同樣濃度的ITS，L-穀氨醯胺，維生素C和牛血清白蛋白，Alpha MEM可以外加同樣濃度的ITS，L-穀氨醯胺，維生素C和牛血清白蛋白，DMEM也可以外加同樣濃度的ITS，L-穀氨醯胺，維生素C和牛血清白蛋白。在此，各種基礎培養基中外加的ITS的濃度可以是：胰島素濃度是0.1 mg/ml、人轉鐵蛋白是0.0055mg/ml、硒元素6.7×10^-6 mg/ml。此外，外加的ITS各成分的濃度也可以根據實際需要來調整。ITS可以從Thermofisher購買，並根據需要調節成合適的最終使用濃度。

在上述方法的一些實施方案中，經修飾的TR細胞群體在被給予個體之前不被離體或體外增殖。在具體實施方案中，可以洗滌所述經修飾的TR細胞以除去處理試劑，並且將其給予患者而不對其進行離體增殖。在一些實施方案中，在經修飾的TR細胞發生任何明顯的離體細胞分裂之前，或在任何明顯的離體細胞分裂所需時間之前給予患者。在一些實施方案中，經修飾的TR細胞在被修飾後施用于個體之前培養一天或多天。在一些實施方案中，經修飾的TR細胞在被修飾後2、4、6、12、24、48小時之內給予患者。

在一些實施方案中，在將經修飾的TR細胞施用於個體之前，將經修飾的TR細胞在冷凍條件下儲存至少24小時。在一些實施方案中，在冷凍條件下進行儲存之前，將經修飾的TR細胞培養一天或多天。經修飾的TR細胞可以在無血清基礎培養基基礎上添加有維持細胞活力的細胞因子的培養基中培養一天或多天（例如1天-3天），所述細胞因子例如SCF(Stem Cell Factor), TPO(Thrombopoietin), FLT-3L(FMS-like Tyrosine Kinase 3 Ligand), IL-6(Interleukin-6)。例如可以在Stem Cell Growth Medium （CellGenix）中培養培養一天或多天（例如1天-3天）。

在一些實施方案中，在進行修飾之前將分離的TR細胞培養一天或多天，之後對分離的TR細胞進行修飾。

在上述方法的一些實施方案中，其中所述個體是人。在上述方法的一些實施方案中，其中緊隨所述評估步驟進行所述治療步驟。

如本文所用的，術語“治療”是指獲得所需的藥理學和/或生理效果，包括但不限於，實現疾病症狀的改善或消除。效果可以是預防性的，表現為完全地或部分地預防疾病或其症狀；和/或效果可以是治療性的，表現為實現症狀的改善或消除，或提供對疾病和/或歸因於疾病的不利影響的部分或完全治癒。如本文所用，“治療”包括對哺乳動物特別是人的疾病的任何治療，包括：(a)阻止個體發病；(b)抑制疾病，即阻止其發展；(c)緩解疾病，例如，使疾病消退，例如，完全或部分消除疾病症狀；及(d)使個體恢復至疾病前狀態，例如，重建造血系統。在本申請中，“治療”並不必然表示疾病或疾病狀態或其相關症狀的徹底根除或治癒，其涵蓋疾病或疾病狀況的任何一個或多個可測量表像的任何最小程度的改善或緩解。在上述具體方法中，治療包括造血重建得到改善或個體得以存活。

示例性實施方案：

1.一種治療個體中的異常血紅素症的方法，包括：

b）治療步驟，該治療步驟包括向所述個體施用第二群體經修飾的CD34陽性HSPC，該經修飾的CD34陽性HSPC來源於所述個體並且經修飾降低了BCL11A功能（“經修飾的TR細胞”）。

2.一種治療個體中的異常血紅素症的方法，包括治療步驟，所述治療步驟包括向所述個體施用來源於所述個體且經修飾降低了BCL11A功能的第二群體的經修飾CD34陽性HSPC（“經修飾的TR細胞”），

其中基於經由評估步驟的功能評價選出所述個體用於治療，所述評估步驟包括：評估第一群體經修飾的CD34陽性HSPC分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力，其中第一群體的經修飾CD34陽性HSPC來源於個體並經修飾降低了BCL11A功能（“經修飾的EV細胞”）。3.一種選擇患有異常血紅素症的個體用於以第二群體的經修飾CD34陽性HSPC進行治療的方法，所述經修飾CD34陽性HSPC來源於所述個體並經修飾降低了BCL11A功能（“經修飾的TR細胞”），其中所述方法包括評估步驟，所述評估步驟包括：評估第一群體的經修飾CD34陽性HSPC分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力，其中第一群體的經修飾CD34陽性HSPC來源於所述個體並經修飾降低了BCL11A功能（“經修飾的EV細胞”），其中如果第一群體的經修飾CD34陽性HSPC產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF），則選擇所述個體進行治療。

4.一種確定患有異常血紅素症的個體是否適合於用來源於所述個體並經修飾降低了BCL11A功能的第二群體的經修飾CD34陽性HSPC（“經修飾的TR細胞”）進行治療的方法，其中所述方法包括評估步驟，其包括：評估第一群體的經修飾CD34陽性HSPC分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力，其中第一群體的經修飾的CD34陽性HSPC來源於所述個體並經修飾降低了BCL11A功能（”經修飾的” EV細胞），其中如果第一群體的經修飾CD34陽性HSPC產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF），則所述個體適於治療。

5.一種確定患有異常血紅素症的個體不適合用來源於所述個體並經修飾降低了BCL11A功能的第二群體的經修飾CD34陽性HSPC（“經修飾的TR細胞”）進行治療的方法，其中所述方法包括評估步驟，其包括：評估第一群體的經修飾的CD34陽性HSPC分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力，其中第一群體的經修飾的CD34陽性HSPC來源於所述個體並經修飾降低了BCL11A功能（“經修飾的EV細胞”），其中如果第一群體的經修飾的CD34陽性HSPC不產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）則所述個體不適合所述經修飾的TR細胞進行治療。

6.如實施方案1-5中任一項所述的方法，其中所述評估步驟包括：

a）從所述個體的骨髓或週邊血液樣品中分離出CD34陽性HSPC以獲得經分離的CD34陽性HSPC群體（“經分離的EV細胞”）;

b）修飾經分離的EV細胞以獲得第一群體經修飾CD34陽性HSPC細胞，其具有降低了的BCL11A功能（“經修飾的EV細胞”）;以及

c）評估經修飾的EV細胞分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力。

7.如實施方案1-6中任一項所述的方法，其中所述治療步驟包括：

a）動員所述個體骨髓中的CD34陽性HSPC以增加.週邊血液中CD34陽性HSPC的量;

b）從所述個體的週邊血液中分離CD34陽性HSPC，以獲得經分離的CD34陽性HSPC群體（“經分離的TR細胞”），

c）修飾經分離的TR細胞以獲得降低了BCL11A功能的、第二群體的經修飾CD34陽性HSPC（“經修飾的TR細胞”）;以及

d）向所述個體施用有效量的經修飾的TR細胞。

8.一種治療個體中異常血紅素症的方法，包括：

1）評估步驟，其中所述評估步驟包括：

a）從所述個體的骨髓或週邊血液樣品中分離CD34陽性HSPC以獲得經分離的CD34陽性HSPC群體（“經分離的EV細胞”）;

b）修飾經分離的EV細胞以獲得降低了BCL11A功能的第一群體的經修飾CD34陽性HSPC細胞（“經修飾的EV細胞”）;以及

c）評估經修飾的EV細胞分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力;以及

2）治療步驟，其中所述治療步驟包括：

a）將所述個體中的CD34陽性HSPC動員至週邊血液;

b）從所述個體的週邊血液中分離CD34陽性HSPC以獲得經分離的CD34陽性HSPC群體（“經分離的TR細胞”），

d）向所述個體施用有效量的經修飾的TR細胞。

9.如實施方案1-8中任一項所述的方法，其中經修飾的EV細胞是透過基因修飾得到修飾的。

10.如實施方案6-8中任一項所述的方法，其中對經分離的EV細胞進行修飾包括對經分離的EV細胞進行基因修飾。

11.如實施方案9或10所述的方法，其中透過選自由鋅指核酸酶（ZFN）、轉錄活化因子樣效應因子核酸酶（TALEN）以及規律性間隔的短回文序列重複（CRISPR）、RNA編輯、RNA干擾的組的技術對經分離的EV細胞進行基因修飾。

12.如實施方案1-11中任一項所述的方法，其中在評估步驟中評估經修飾的EV細胞分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力，所述步驟包括：i）在允許分化以獲得紅血球群體的條件下培養經修飾的EV細胞；以及 2）確定所述紅血球產生的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的水準。

13.如實施方案1-12中任一項所述的方法，其中在評估步驟中評估經修飾的EV細胞中分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力包括：確定γ-球蛋白的mRNA水準。

14.如實施方案1-12中任一項所述的方法，其中在評估步驟中評估經修飾的EV細胞分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力包括：確定胎兒血紅蛋白（HbF）的蛋白質水準。

15. 如實施方案1-14中任一項所述的方法，其中所述個體在評估步驟之前未經歷過動員或預處理。

16.如實施方案1-15中任一項所述的方法，其中所述評估步驟在所述治療步驟之前重複至少一次。

17.如實施方案1-16中任一項所述的方法，其中

經修飾的TR細胞是透過基因修飾得到修飾的。

18.如實施方案7-16中任一項所述的方法，其中對經分離的TR細胞進行修飾包括對經分離的TR細胞進行基因修飾。

19.如實施方案17或18所述的方法，其中透過選自由鋅指核酸酶（ZFN）、轉錄活化因子樣效應因子核酸酶（TALEN）以及規律性間隔的短回文序列重複（CRISPR）、RNA編輯、RNA干擾的組的技術對經分離的TR細胞進行基因修飾。

20.如實施方案7-19中任一項所述的方法，其中在治療步驟中動員CD34陽性HSPC包括：用粒細胞集落刺激因子（GCSF）和/或普樂沙福（plerixafor）治療所述個體。

21.如實施方案1-20中任一項所述的方法，其中所述治療步驟還包括：在施用所述經修飾的TR細胞之前對所述個體進行預處理。

22.如實施方案21所述的方法，其中所述預處理包括化療、單克隆抗體療法或全身放射。

23.如實施方案22所述的方法，其中所述預處理包括化療。

24.如實施方案23所述的方法，其中所述化療包括向所述個體施用一種或多種選自由下述組成的組的化學治療劑：白消安，環磷醯胺和氟達拉濱。

25.如實施方案7-24中任一項所述的方法，其中在進行修飾之前將分離的TR細胞培養一天或多天。

26.如實施方案7-25中任一項所述的方法，其中所述經修飾的TR細胞在施用于個體之前培養一天或多天。

27.如實施方案1-26中任一項所述的方法，其中在將經修飾的TR細胞施用於個體之前，將經修飾的TR細胞在冷凍條件下儲存至少24小時。

28.如實施方案27所述的方法，其中在冷凍條件下進行儲存之前，將經修飾的TR細胞培養一天或多天。

29.如實施方案1-28中任一項所述的方法，其中所述異常血紅素症選自由下述組成的疾病：鐮狀細胞病、鐮狀細胞性狀、血紅蛋白C病、血紅蛋白C性狀、血紅蛋白S / C病、血紅蛋白D病、血紅蛋白 E病、地中海型貧血、帶有增加的氧親和力的與血紅蛋白相關的病症、帶有降低的氧親和力的與血紅蛋白相關的病症、不穩定的異常血紅素症和高鐵血紅蛋白血症。

30.如實施方案29所述的方法，其中所述異常血紅素症選自由β-地中海型貧血和鐮狀細胞性貧血組成的組。

31.如實施方案30所述的方法，其中所述異常血紅素症是β0或β+地中海型貧血。

32.如實施方案1-31中任一項所述的方法，其中所述個體是人。

33.如實施方案1-32中任一項所述的方法，其中緊隨所述評估步驟進行所述治療步驟。

在上述所有實施方案的一些具體實施方案中，評估第一群體經修飾的CD34陽性HSPC分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力是指評估經修飾降低了BCL11A功能的CD34陽性HSPC分化後產生γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的水準是否比未經此修飾的CD34陽性HSPC分化後產生的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）水準至少提高約12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、120%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%、600%。

本申請還涉及以下的實施方案

1. 經修飾的TR細胞在製備治療個體中的異常血紅素症的方法中應用的藥物中的用途，所述方法包括：

2. 經修飾的TR細胞在製備治療個體中的異常血紅素症的方法中應用的藥物中的用途，所述方法包括治療步驟，所述治療步驟包括向所述個體施用來源於所述個體且經修飾降低了BCL11A功能的第二群體的經修飾CD34陽性HSPC（“經修飾的TR細胞”），

其中基於經由評估步驟的功能評價選出所述個體用於治療，所述評估步驟包括：評估第一群體經修飾的CD34陽性HSPC分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力，其中第一群體的經修飾CD34陽性HSPC來源於個體並經修飾降低了BCL11A功能（“經修飾的EV細胞”）。3. 經修飾的EV細胞在製備確定患有異常血紅素症的個體是否適合或不適合於用來源於所述個體並經修飾降低了BCL11A功能的第二群體的經修飾CD34陽性HSPC（“經修飾的TR細胞”）進行治療的方法中應用的製品中的用途，其中所述方法包括評估步驟，其包括：評估第一群體的經修飾CD34陽性HSPC分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力，其中第一群體的經修飾的CD34陽性HSPC來源於所述個體並經修飾降低了BCL11A功能（經修飾的EV細胞），其中如果第一群體的經修飾CD34陽性HSPC產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF），則所述個體適於治療；其中如果第一群體的經修飾的CD34陽性HSPC不產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）則所述個體不適合所述經修飾的TR細胞進行治療。

4. 如實施方案1-3中任一項所述的用途，其中所述評估步驟包括：

5. 如實施方案1-4中任一項所述的用途，其中所述治療步驟包括：

d）向所述個體施用有效量的經修飾的TR細胞。

6. 如實施方案1-5中任一項所述的用途，

1）其中所述評估步驟包括：

2）其中所述治療步驟包括：

a）將所述個體中的CD34陽性HSPC動員至週邊血液;

d）向所述個體施用有效量的經修飾的TR細胞。

7. 如實施方案1-6中任一項所述的用途，其中經修飾的EV細胞是透過基因修飾得到修飾的。

8. 如實施方案4-6中任一項所述的用途，其中對經分離的EV細胞進行修飾包括對經分離的EV細胞進行基因修飾。

9. 如實施方案7或8所述的用途，其中透過選自由鋅指核酸酶（ZFN）、轉錄活化因子樣效應因子核酸酶（TALEN）以及規律性間隔的短回文序列重複（CRISPR）、RNA編輯、RNA干擾的組的技術對經分離的EV細胞進行基因修飾。

10. 如實施方案1-9中任一項所述的用途，其中在評估步驟中評估經修飾的EV細胞分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力，所述步驟包括：i）在允許分化以獲得紅血球群體的條件下培養經修飾的EV細胞；以及 2）確定所述紅血球產生的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的水準。

11. 如實施方案1-10中任一項所述的用途，其中在評估步驟中評估經修飾的EV細胞中分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力包括：確定γ-球蛋白的mRNA水準。

12. 如實施方案1-10中任一項所述的用途，其中在評估步驟中評估經修飾的EV細胞分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力包括：確定胎兒血紅蛋白（HbF）的蛋白質水準。

13. 如實施方案1-12中任一項所述的用途，其中所述個體在評估步驟之前未經歷過動員或預處理。

14. 如實施方案1-13中任一項所述的用途，其中所述評估步驟在所述治療步驟之前重複至少一次。

15. 如實施方案1-14中任一項所述的用途，其中

經修飾的TR細胞是透過基因修飾得到修飾的。

16. 如實施方案5-14中任一項所述的用途，其中對經分離的TR細胞進行修飾包括對經分離的TR細胞進行基因修飾。

17. 如實施方案15或16所述的用途，其中透過選自由鋅指核酸酶（ZFN）、轉錄活化因子樣效應因子核酸酶（TALEN）以及規律性間隔的短回文序列重複（CRISPR）、RNA編輯、RNA干擾的組的技術對經分離的TR細胞進行基因修飾。

18. 如實施方案5-17中任一項所述的用途，其中在治療步驟中動員CD34陽性HSPC包括：用粒細胞集落刺激因子（GCSF）和/或普樂沙福（plerixafor）治療所述個體。

19. 如實施方案1-18中任一項所述的用途，其中所述治療步驟還包括：在施用所述經修飾的TR細胞之前對所述個體進行預處理。

20. 如實施方案19所述的用途，其中所述預處理包括化療、單克隆抗體療法或全身放射。

21. 如實施方案20所述的用途，其中所述預處理包括化療。

22. 如實施方案21所述的用途，其中所述化療包括向所述個體施用一種或多種選自由下述組成的組的化學治療劑：白消安，環磷醯胺和氟達拉濱。

23. 如實施方案5-22中任一項所述的用途，其中在進行修飾之前將分離的TR細胞培養一天或多天。

24. 如實施方案5-23中任一項所述的用途，其中所述經修飾的TR細胞在施用于個體之前培養一天或多天。

25. 如實施方案1-24中任一項所述的用途，其中在將經修飾的TR細胞施用於個體之前，將經修飾的TR細胞在冷凍條件下儲存至少24小時。

26. 如實施方案25所述的用途，其中在冷凍條件下進行儲存之前，將經修飾的TR細胞培養一天或多天。

27. 如實施方案1-26中任一項所述的用途，其中所述異常血紅素症選自由下述組成的疾病：鐮狀細胞病、鐮狀細胞性狀、血紅蛋白C病、血紅蛋白C性狀、血紅蛋白S / C病、血紅蛋白D病、血紅蛋白 E病、地中海型貧血、帶有增加的氧親和力的與血紅蛋白相關的病症、帶有降低的氧親和力的與血紅蛋白相關的病症、不穩定的異常血紅素症和高鐵血紅蛋白血症。

28. 如實施方案27所述的用途，其中所述異常血紅素症選自由β-地中海型貧血和鐮狀細胞性貧血組成的組。

29. 如實施方案28所述的用途，其中所述異常血紅素症是β0或β+地中海型貧血。

30. 如實施方案1-29中任一項所述的用途，其中所述個體是人。

31. 如實施方案1-30中任一項所述的用途，其中緊隨所述評估步驟進行所述治療步驟。

實施例

實施例1：造血幹細胞BCL11A增強子的基因編輯

本實施例涉及利用CRISPR/Cas9系統基因編輯地中海型貧血(以下簡稱地中海型貧血)病人和健康供體動員週邊血液來源的CD34陽性造血幹細胞BCL11A紅系增強子位點。

利用“CRISPR RGEN TOOLS”軟體設計針對BCL11A(+58)位點的sgRNA並合成經過化學修飾的兩個sgRNA，序列資訊分別如下：sgRNA-1: ctaacagttgcttttatcac (SEQ ID NO: 5), sgRNA-2: atcagaggccaaacccttcc SEQ ID NO: 4。Cas9 mRNA編碼序列資訊如下: gacaagaagtacagcatcggcctggacatcggcaccaactctgtgggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgcccagcaagaaattcaaggtgctgggcaacaccgaccggcacagcatcaagaagaacctgatcggagccctgctgttcgacagcggcgaaacagccgaggccacccggctgaagagaaccgccagaagaagatacaccagacggaagaaccggatctgctatctgcaagagatcttcagcaacgagatggccaaggtggacgacagcttcttccacagactggaagagtccttcctggtggaagaggataagaagcacgagcggcaccccatcttcggcaacatcgtggacgaggtggcctaccacgagaagtaccccaccatctaccacctgagaaagaaactggtggacagcaccgacaaggccgacctgcggctgatctatctggccctggcccacatgatcaagttccggggccacttcctgatcgagggcgacctgaaccccgacaacagcgacgtggacaagctgttcatccagctggtgcagacctacaaccagctgttcgaggaaaaccccatcaacgccagcggcgtggacgccaaggccatcctgtctgccagactgagcaagagcagacggctggaaaatctgatcgcccagctgcccggcgagaagaagaatggcctgttcggcaacctgattgccctgagcctgggcctgacccccaacttcaagagcaacttcgacctggccgaggatgccaaactgcagctgagcaaggacacctacgacgacgacctggacaacctgctggcccagatcggcgaccagtacgccgacctgtttctggccgccaagaacctgtccgacgccatcctgctgagcgacatcctgagagtgaacaccgagatcaccaaggcccccctgagcgcctctatgatcaagagatacgacgagcaccaccaggacctgaccctgctgaaagctctcgtgcggcagcagctgcctgagaagtacaaagagattttcttcgaccagagcaagaacggctacgccggctacattgacggcggagccagccaggaagagttctacaagttcatcaagcccatcctggaaaagatggacggcaccgaggaactgctcgtgaagctgaacagagaggacctgctgcggaagcagcggaccttcgacaacggcagcatcccccaccagatccacctgggagagctgcacgccattctgcggcggcaggaagatttttacccattcctgaaggacaaccgggaaaagatcgagaagatcctgaccttccgcatcccctactacgtgggccctctggccaggggaaacagcagattcgcctggatgaccagaaagagcgaggaaaccatcaccccctggaacttcgaggaagtggtggacaagggcgcttccgcccagagcttcatcgagcggatgaccaacttcgataagaacctgcccaacgagaaggtgctgcccaagcacagcctgctgtacgagtacttcaccgtgtataacgagctgaccaaagtgaaatacgtgaccgagggaatgagaaagcccgccttcctgagcggcgagcagaaaaaggccatcgtggacctgctgttcaagaccaaccggaaagtgaccgtgaagcagctgaaagaggactacttcaagaaaatcgagtgcttcgactccgtggaaatctccggcgtggaagatcggttcaacgcctccctgggcacataccacgatctgctgaaaattatcaaggacaaggacttcctggacaatgaggaaaacgaggacattctggaagatatcgtgctgaccctgacactgtttgaggacagagagatgatcgaggaacggctgaaaacctatgcccacctgttcgacgacaaagtgatgaagcagctgaagcggcggagatacaccggctggggcaggctgagccggaagctgatcaacggcatccgggacaagcagtccggcaagacaatcctggatttcctgaagtccgacggcttcgccaacagaaacttcatgcagctgatccacgacgacagcctgacctttaaagaggacatccagaaagcccaggtgtccggccagggcgatagcctgcacgagcacattgccaatctggccggcagccccgccattaagaagggcatcctgcagacagtgaaggtggtggacgagctcgtgaaagtgatgggccggcacaagcccgagaacatcgtgatcgaaatggccagagagaaccagaccacccagaagggacagaagaacagccgcgagagaatgaagcggatcgaagagggcatcaaagagctgggcagccagatcctgaaagaacaccccgtggaaaacacccagctgcagaacgagaagctgtacctgtactacctgcagaatgggcgggatatgtacgtggaccaggaactggacatcaaccggctgtccgactacgatgtggaccatatcgtgcctcagagctttctgaaggacgactccatcgacaacaaggtgctgaccagaagcgacaagaaccggggcaagagcgacaacgtgccctccgaagaggtcgtgaagaagatgaagaactactggcggcagctgctgaacgccaagctgattacccagagaaagttcgacaatctgaccaaggccgagagaggcggcctgagcgaactggataaggccggcttcatcaagagacagctggtggaaacccggcagatcacaaagcacgtggcacagatcctggactcccggatgaacactaagtacgacgagaatgacaagctgatccgggaagtgaaagtgatcaccctgaagtccaagctggtgtccgatttccggaaggatttccagttttacaaagtgcgcgagatcaacaactaccaccacgcccacgacgcctacctgaacgccgtcgtgggaaccgccctgatcaaaaagtaccctaagctggaaagcgagttcgtgtacggcgactacaaggtgtacgacgtgcggaagatgatcgccaagagcgagcaggaaatcggcaaggctaccgccaagtacttcttctacagcaacatcatgaactttttcaagaccgagattaccctggccaacggcgagatccggaagcggcctctgatcgagacaaacggcgaaaccggggagatcgtgtgggataagggccgggattttgccaccgtgcggaaagtgctgagcatgccccaagtgaatatcgtgaaaaagaccgaggtgcagacaggcggcttcagcaaagagtctatcctgcccaagaggaacagcgataagctgatcgccagaaagaaggactgggaccctaagaagtacggcggcttcgacagccccaccgtggcctattctgtgctggtggtggccaaagtggaaaagggcaagtccaagaaactgaagagtgtgaaagagctgctggggatcaccatcatggaaagaagcagcttcgagaagaatcccatcgactttctggaagccaagggctacaaagaagtgaaaaaggacctgatcatcaagctgcctaagtactccctgttcgagctggaaaacggccggaagagaatgctggcctctgccggcgaactgcagaagggaaacgaactggccctgccctccaaatatgtgaacttcctgtacctggccagccactatgagaagctgaagggctcccccgaggataatgagcagaaacagctgtttgtggaacagcacaagcactacctggacgagatcatcgagcagatcagcgagttctccaagagagtgatcctggccgacgctaatctggacaaagtgctgtccgcctacaacaagcaccgggataagcccatcagagagcaggccgagaatatcatccacctgtttaccctgaccaatctgggagcccctgccgccttcaagtactttgacaccaccatcgaccggaagaggtacaccagcaccaaagaggtgctggacgccaccctgatccaccagagcatcaccggcctgtacgagacacggatcgacctgtctcagctgggaggcgac。（SEQ ID NO:1）

sgRNA的化學合成是指對於sgRNA的5’端的前三個堿基以及3’端的最後三個堿基進行了2’-O-甲基類似物修飾和核苷酸間的3’硫代修飾。如下述化學式所示，左側是化學修飾後的sgRNA, 右側是未經過修飾的sgRNA。Cas9 mRNA和sgRNA均購自美國Trilink Biotechnologies公司。

我們分別從5個地中貧血病人和2個健康供體的動員週邊血液中，分離了CD34陽性的造血幹細胞((動員週邊血液樣品均由南方春富(兒童)血液病研究院提供)。在BTX ECM830電轉儀選取了“300V 1ms”的電轉條件，將經過合成的Cas9 mRNA 和經過化學修飾合成的sgRNA-1和sgRNA-2分別電轉進入5個病人患者和2個健康的CD34陽性造血幹細胞，電轉4天后，提取該CD34陽性的造血幹細胞的基因組，選取sgRNA切割位點左側453bp，右側450bp，總長度為903bp的片段進行擴增，進行Sanger測序。

正向引物: cacctcagcagaaacaaagttatc (SEQ ID NO: 26)

反向引物：gggaagctccaaactctcaa (SEQ ID NO: 27)

針對測序結果利用“Synthego ICE Analysis”線上軟體分析產生Indels效率的統計分析。其中，“Synthego ICE Analysis”線上軟體是線上分析Indels效率的軟體，以一代測序結果為基礎，分析Indels引起的雙峰突變的效率，可以參考如下網址： https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis.

如圖1所示，結果表明，本實施例中合成的兩條sgRNA能夠成功基因編輯不同地中海型貧血病人和健康供體動員週邊血液來源的CD34陽性造血幹細胞。其中，sgRNA-1的基因編輯效率在30~70%之間，Indels效率在不同的供體之間有顯著差別。與此形成鮮明對比，sgRNA-2能更高效且穩定地編輯細胞產生Indels，破壞BCL11A紅系增強子，針對5個病人供體和2個健康供體，基因編輯效率達到60~80%。

實施例2：γ球蛋白mRNA及紅系分化相關蛋白的表達

本實驗驗證基因編輯的造血幹細胞分化後γ球蛋白 (HBG基因) mRNA的表達，所述造血幹細胞來源於地中海型貧血患者和健康供體動員後的週邊血液。

2.1 紅血球分化

選取300v 1ms的電轉條件，分別電轉Cas9 mRNA和sgRNA-1，Cas9 mRNA和sgRNA-2進入5個地中海型貧血患者和2個健康供體動員週邊血液來源的造血幹細胞。對照組細胞無電轉步驟。之後，利用下述“兩步法”分化方案進行紅血球分化實驗。

其中“兩步法”分化中的第一步是利用造血幹細胞紅系擴增和分化培養基將CD34+造血乾祖細胞誘導分化成為紅系祖細胞進行分化，然後利用造血幹細胞紅系分化脫核培養基將紅系祖細胞誘導分化成為成熟紅血球。

造血幹細胞紅系擴增和分化培養基中的基礎培養基為StemSpan™ SFEM II, 生長因子為50-200 ng/ml SCF, 10-100 ng/ml IL-3, 1-10U EPO/ml，培養條件：CD34+造血乾祖細胞，按照1.0×10^5 細胞/ml的細胞密度，使用造血幹細胞紅系擴增和分化培養基培養，分化7天之後，CD34+造血乾祖細胞分化成為紅系祖細胞。

造血幹細胞紅系分化脫核培養基中的基礎培養基為STEMSPAN™ SFEM II, 生長因子為1-10U EPO, 100-1000 μg/ml 人轉鐵蛋白，化學小分子為0.5-10 μm mifepristone，將利用上一步驟培養的紅系祖細胞按照1.0×10^6 細胞/ml 細胞密度在造血幹細胞紅系分化脫核培養基分化11天之後，紅系祖細胞分化成熟變為成熟紅血球。

我們檢測了紅血球表達的細胞表面膜蛋白CD71和CD235a的表達，透過CD71和CD235a雙陽性的比例來指標CD34+造血乾祖細胞向紅血球分化的效率，如圖2所示。實驗組包括：sgRNA-1和sgRNA-2和對照組均能高效分化成為紅血球，CD71和CD235a的表達比例均在約80%以上，分化效率高，表明sgRNA-1和sgRNA-2的編輯效果均較為良好。

2.2 檢測造血幹細胞分化來的紅血球中γ球蛋白(HBG)基因的mRNA表達

將實施例2.1中從造血幹細胞分化來的成熟紅血球提取細胞的mRNA, 反轉錄成cDNA，透過螢光定量PCR檢測HBG 基因的mRNA表達。如圖3所示。

實驗結果表明：

在地中海型貧血患者和健康供體動員樣本來源的CD34陽性造血幹細胞中，基因編輯BCL11A的紅系增強子位點，解除BCL11A對於γ球蛋白(HBG)和胎兒血紅蛋白HbF的抑制，sgRNA-1和sgRNA-2兩個實驗組的細胞中，γ球蛋白(HBG)的mRNA表達水平均有提高。

具體而言：

對於病人患者1，sgRNA-1提高約4.2倍，sgRNA-2提高約3.8倍左右。

對於病人患者2，sgRNA-1提高約1.8倍，sgRNA-2提高約2倍左右。

對於病人患者3，sgRNA-1提高約2.1倍，sgRNA-2提高約3.1倍左右。

對於病人患者4，sgRNA-1提高約4倍，sgRNA-2提高約5.8倍左右。

對於病人患者5，sgRNA-1提高約1.6倍，sgRNA-2提高約2.2倍左右。

對於健康供體1，sgRNA-1提高約3.0倍，sgRNA-2提高約6.1倍左右。

對於健康供體2，sgRNA-1提高約1.7倍，sgRNA-2提高約1.7倍左右。

結合以上資料可發現，無論是sgRNA-1還是sgRNA-2,在不同的供體(病人和健康人)中，雖然編輯了BCL11A紅系增強子，解除了BCL11A對於γ球蛋白(HBG)和胎兒血紅蛋白HbF的抑制,但是不同供體的γ球蛋白(HBG)提高程度不同。

此外，雖然sgRNA-1和sgRNA-2對於γ球蛋白(HBG)提高程度有差異，但是與γ球蛋白(HBG)提高程度低的供體相比，在γ球蛋白(HBG)提高程度更高的供體中，sgRNA-1和sgRNA-2趨勢相同，具有高度一致性和穩定性，例如：對於病人供體1, sgRNA-1和sgRNA-2均提高約4倍左右，但是在病人供體2，sgRNA-1和sgRNA-2均只提高約2倍左右；對於健康供體1，sgRNA-1和sgRNA-2均提高3.0~6.0倍，但是在健康供體2中，sgRNA-1和sgRNA-2均提高不到2倍。

實施例3：針對基因編輯效率檢測的多批次驗證試驗

3.1 健康供體動員週邊血液來源

本實驗涉及利用CRISPR/Cas9系統高效基因編輯2個健康供體動員週邊血液來源的CD34陽性造血幹細胞BCL11A紅系增強子位點的多批次驗證試驗。

從實施例1和實施例2的結果中可知，利用Cas9 mRNA和sgRNA-2不僅能夠高效穩定地基因編輯BCL11A紅系增強子位點，基因編輯效率為60~80%，比sgRNA-1效率高，而且，解除BCL11A對於γ球蛋白(HBG)和胎兒血紅蛋白HbF的抑制後，sgRNA-2比sgRNA-1對γ球蛋白(HBG)的mRNA水準的提升更高。因此，在本實施例中，選擇sgRNA-2作為優選的靶點開展後續實驗。

在BTX ECM830電轉儀選取了“300V 1ms”的電轉條件，將經過合成的Cas9 mRNA 和經過化學修飾合成的sgRNA-2電轉進入2個健康供體的CD34陽性的造血幹細胞中，轉4天后，提取該CD34陽性的造血幹細胞的基因組，選取sgRNA切割位點左右各約450bp，總長度為903bp的片段進行擴增，進行Sanger測序，測序引物和基因編輯效率分析方法見實施例1。實驗結果如圖4A所示

實驗結果表明，在該電轉條件下，本實施例中合成的sgRNA-2能夠成功高效基因編輯不同供體動員週邊血液來源的CD34陽性造血幹細胞，均能高效地產生Indels，針對2個健康供體的3批次實驗中，基因編輯效率達到70~80%。其中，“3批次實驗”是指，對於每個健康供體，我們分別獲得1個週邊血液動員的樣本，分離了CD34陽性的造血幹細胞，但是針對該細胞，進行了3次獨立的基因編輯實驗。

3.2地中海型貧血患者動員週邊血液來源

使用BTX ECM830電轉儀，選取“300V 1ms”的電轉條件，將Cas9 mRNA 和經過化學修飾合成的sgRNA-2電轉進入10個地中海型貧血患者動員週邊血液來源的CD34陽性的造血幹細胞中。對照組細胞無電轉步驟。2天后，，提取基因組，選取sgRNA切割位點左右各約450bp，總長度為903bp的片段進行PCR擴增。之後使用PCR產物進行Sanger測序，測序引物和基因編輯效率分析方法見實施例1。實驗結果如圖4B所示。

實驗結果表明，在該電轉條件下，本實施例中合成的sgRNA-2能夠成功高效基因編輯不同地中海型貧血患者動員週邊血液來源的CD34陽性造血幹細胞，均能高效地產生Indels，針對10個地中海型貧血患者的多批次實驗中，基因編輯效率達到約60~80%或以上。其中，我們從這10個地中海型貧血患者中分別獲得了各1個週邊血液動員的樣本，分離了CD34陽性的造血幹細胞進行基因編輯實驗，針對這些細胞，病人供體1進行了3次獨立的基因編輯實驗，病人供體6、9和10這三個供體進行了2次獨立的基因編輯實驗，而剩餘病人供體則開展了單次基因編輯實驗。

實施例4：造血幹細胞分化後γ球蛋白mRNA和胎兒血紅蛋白HbF的表達

本實施例涉及檢測基因編輯造血幹細胞紅系分化後BCL11A基因和γ球蛋白mRNA的表達，其中所述造血幹細胞來源於健康供體動員的週邊血液。

4.1 紅血球分化

4.1.1健康供體

選取300v 1ms的電轉條件，電轉Cas9 mRNA和sgRNA-2進入2個健康供體動員週邊血液來源的造血幹細胞。對照組細胞無電轉步驟。利用下述“兩步法”分化方案進行3批次的紅血球分化實驗。

其中兩步法分化為利用造血幹細胞紅系擴增和分化培養基進行分化，然後利用造血幹細胞紅系分化脫核培養基進行分化。

造血幹細胞紅系擴增和分化培養基為基礎培養基為StemSpan™ SFEM II, 生長因子為50-200 ng/ml SCF, 10-100 ng/ml IL-3, 1-10U EPO/ml，培養條件：利用造血幹細胞紅系擴增和分化培養基培養造血幹細胞1.0×10^5 cells/ml，擴增7天。

造血幹細胞紅系分化脫核培養基為基礎培養基為STEMSPAN™ SFEM II, 生長因子為1-10U EPO, 100-1000 μg/ml 人轉鐵蛋白，化學小分子為0.5-10 μm mifepristone，將利用上一步驟培養的1.0×10^6 cells/ml 細胞在造血幹細胞紅系分化脫核培養基分化11天。

我們用FACS方法檢測了CD71和CD235a的表達，如圖5所示。實驗組和對照組均能高效分化成為紅血球，CD71和CD235a的表達比例均在約85%以上，分化效率高，效果良好。其中“3批次的紅血球分化實驗”是指對於每個健康供體，我們分別獲得1個週邊血液動員的樣本，分離了CD34陽性的造血幹細胞，針對這些細胞，進行了3次獨立的基因編輯實驗，並分別進行了3次紅血球分化實驗。

4.1.2地中海型貧血患者

選取300v 1ms的電轉條件，電轉Cas9 mRNA和sgRNA-2進入10個地中海型貧血患者動員週邊血液來源的造血幹細胞。對照組細胞無電轉步驟。利用4.1.1中的“兩步法”分化方案進行了多批次的紅血球分化實驗。

分化18天后，我們檢測了CD71和CD235a表達，如圖6所示。實驗組和對照組均能高效分化成為紅血球，不同地中海型貧血患者紅系分化效率存在個體差異，CD71和CD235a的雙陽性表達比例在約60-95%。表明其分化效率高，效果良好。

其中，我們針對這10個地中海型貧血患者分別各獲得1個週邊血液動員的樣本，分離了CD34陽性的造血幹細胞。其中，使用病人供體1的CD34陽性的造血幹細胞進行了3次獨立的基因編輯實驗，以及3次獨立的紅血球分化實驗，病人供體6、9和10的CD34陽性的造血幹細胞分別進行了2次獨立的基因編輯實驗，2次紅血球分化實驗，剩餘6名病人供體則開展了單次的基因編輯實驗和單次紅血球分化實驗。

4.2 檢測健康供體來源的造血幹細胞分化來的紅血球中γ球蛋白和BCL11A基因的mRNA表達

將實施例4.1.1中從造血幹細胞分化來的成熟紅血球提取細胞的mRNA, 反轉錄成cDNA，透過螢光定量PCR檢測BCL11A 、 HBG 等基因的mRNA表達。如圖7和8所示。

實驗結果表明：

對於健康供體1，3個批次的結果顯示，造血幹細胞BCL11A紅系增強子經過編輯後，實驗組中BCL11A基因表達下調，約是對照組中表達量的約40~80%，而γ球蛋白(HBG基因)的基因表達則顯著提高，在3個批次中提高倍數是對照組的約6~10倍，結果具有高度的一致性和穩定性。

對於健康供體2，3個批次的結果顯示，造血幹細胞BCL11A紅系增強子經過編輯後，實驗組中BCL11A基因表達下調，約是對照組中表達量的約40~80%，而γ球蛋白(HBG基因)的基因表達則顯著提高，在3個批次重複性實驗中，相對於對照組提高倍數是1.5~3.5倍，結果具也有高度的一致性和穩定性。

本實驗結果進一步證明，對於不同的供體，電轉針對BCL11A紅系增強子的sgRNA和Cas9 mRNA後，BCL11A基因表達下調的比例均是20~60%。然而，對於γ球蛋白的表達提高卻有顯著差別。對於健康供體1，γ球蛋白的表達提高6~10倍，健康供體2 γ球蛋白的表達提高1.5~3.5倍。其中，“3批次的紅血球分化實驗”是指對於每個健康供體，我們分別獲得1個週邊血液動員的樣本，分離了CD34陽性的造血幹細胞，但是針對該細胞，進行了3次獨立的基因編輯實驗，並分別進行了3次紅血球分化，檢測BCL11A基因和γ球蛋白(HBG基因)的mRNA水準表達。

4.3檢測地中海型貧血患者來源的造血幹細胞分化來的紅血球中胎兒血紅蛋白HbF表達

將實施例4.1.2中從造血幹細胞分化來的成熟紅血球，用流式細胞術檢測細胞內胎兒血紅蛋白HbF的陽性表達比例。如圖9A、9B和10所示。

實驗結果表明：

與未編輯的對照組相比，經過編輯的CD34陽性造血幹細胞分化得到的紅血球中HbF表達提高。

不同地中海型貧血患者HbF表達提高的程度有顯著差異，其中病人供體1的三批次實驗和病人供體7的HbF表達是對照組的約1.3倍，而病人供體2的HbF表達是對照組的約2.3倍。而同一地中海型貧血患者的不同批次實驗顯示HbF表達程度非常近似，病人供體1的兩批次實驗顯示HbF表達是對照組的約1.3倍，病人供體9的HbF表達是對照組的約1.4倍，病人供體10的HbF表達是對照組的約1.5-1.6倍。

病人供體1中實驗組的HbF表達是對照組的1.29±0.12倍。由此我們認為如果基因編輯後HbF表達水準比對照組提高至少約12%，即一個標準差的值，那麼對於這個地中海型貧血患者是有效的。

實施例5 基因編輯BCL11A紅系增強子治療異常血紅素症

從實施例2.2、實施例4.2和實施例4.3的結果中不難發現，對於不同的供體，電轉針對BCL11A紅系增強子的Cas9 mRNA和相同的sgRNA後，對於γ球蛋白和胎兒血紅蛋白HbF的表達提高卻有顯著差別。其主要原因是，如本申請中先前技術描述，成熟紅血球內調節抑制γ球蛋白和胎兒血紅蛋白HbFb表達的機制複雜，不僅有遠端調節區域的LCR參與，而且有多個轉錄因子如BCL11A, MYB, KLF1等結合成一個複合物，作為調節γ球蛋白和胎兒血紅蛋白HbF的開關(G. Lettre, et al.PNAS . 2008, 11869-11874; Marina et al,Molecular Therapy . 2017; Megan D, et al.Blood . 2015)。這意味著，BCL11A對於γ球蛋白和胎兒血紅蛋白HbF的抑制作用存在顯著的個體差異。

此外，雖然對於γ球蛋白和胎兒血紅蛋白HbF的調節機制複雜，但是對於同一個體，從胎兒時期到出生成年後，其γ球蛋白和胎兒血紅蛋白HbF的調節機制是處於相對恒定狀態，這意味著BCL11A基因對於γ球蛋白和胎兒血紅蛋白HbF的抑制程度和作用是基本不變的(Paikari A, et al.Br J Haematol. 2018; Lettre G, et al.Lancet. 2016; G. Lettre, et al.PNAS . 2008, 11869-11874; Marina et al,Molecular Therapy . 2017; Megan D, et al.Blood . 2015)，這從實施例4.2和4.3中的結果中得到進一步證實，對於同一個供體，基因編輯BCL11A紅系增強子位點，紅血球分化，檢測分析γ球蛋白(HBG基因)的mRNA表達和胎兒血紅蛋白HbF的多批次實驗中，其提高程度是一致且穩定的。

因此，結合本申請的實驗結果和現象，目前基因編輯BCL11A紅系增強子治療異常血紅素症的治療策略則存在明顯的潛在缺陷，即現有技術並未提前預測BCL11A對於γ球蛋白和胎兒血紅蛋白HbF的調節程度和作用，患者經過大劑量的清除骨髓的藥物處理和自體造血幹細胞移植治療後，將極有可能治療方案無效或者效果不顯著，這將為患者帶來潛在的巨大危害。而本申請則提供了有效的預測方法，即不同個體中γ球蛋白和胎兒血紅蛋白HbF的提升程度和作用是不同，結果也是一致且穩定的；同一個體的造血幹細胞在不同批次實驗中，經過基因編輯下調BCL11A表達後，對於γ球蛋白和胎兒血紅蛋白HbF的提升程度和作用是一致且穩定的；基因編輯後胎兒血紅蛋白HbF如能至少提高約12%，則認為該治療方案對地中海型貧血患者有效。

基於該實驗結果，本申請提出了一種全新的利用基因編輯BCL11A紅系增強子治療異常血紅素症的治療方法，即伴隨診斷+基因編輯自體造血幹細胞治療。如圖11所示。

伴隨診斷：在利用基因編輯BCL11A紅系增強子治療異常血紅素症的患者之前，我們可以提前預測該治療方案的有效性，即提前從患者體內抽取少量骨髓或者週邊血液，分離其中的CD34陽性的造血幹細胞，經過基因編輯BCL11A紅系增強子位點，將編輯的細胞分化為成熟的紅血球，透過一系列的指標評估提升γ球蛋白(HBG基因)和胎兒血紅蛋白HbF的表達程度，選擇γ球蛋白和胎兒血紅蛋白HbF表達提高程度更高的患者作為優先治療的對象，則該治療方案的有效性的概率就更高。其中，如果與未編輯對照組相比，實驗組中胎兒血紅蛋白HbF的表達至少提高約12%，那麼接受治療的患者才有可能臨床受益。因為一方面，臨床上認為血紅蛋白量達到90g/L患者就能夠擺脫輸血依賴，如果選擇γ球蛋白和胎兒血紅蛋白HbF表達提高程度更高的患者接受治療，則擺脫輸血依賴的可能性更大。另一方面，雖然90g/L患者能夠擺脫輸血，但是仍會表現出輕度貧血(90-110g/L)，骨骼發育也有可能受到影響 (正常男性的血紅蛋白含量範圍是120-160g/L,女性則為110-150g/L), 選擇γ球蛋白和胎兒血紅蛋白HbF表達提高程度更高的患者接受治療，患者完全恢復健康的可能性就更大。因此，利用基因編輯BCL11A紅系增強子治療異常血紅素症的治療策略的目標是使得患者的總血紅蛋白量表達越高越好，達到正常人的標準，效果才更加顯著，患者受益更大。此外，本申請中開發的預測方法，只需抽取少量的骨髓或者週邊血液即可，流程簡單。患者無需經過流程複雜的打動員劑使得骨髓大量產生造血造血幹細胞，並且患者在篩選期，並未注射大劑量的清骨髓和清淋巴的藥物，如白消安和氟達拉濱等，患者的健康得到保障。

基因編輯自體造血幹細胞治療：透過本申請開發的伴隨診斷方法確定最終入組治療的異常血紅素症的受試者。隨後進入基因編輯自體造血幹細胞治療流程：1. 將給予受試者粒細胞集落刺激因子(G-CSF)或/和plerixafor (一種去趨化因子受體CXCR4的拮抗劑)進行骨髓動員，使得骨髓產生大量的造血幹細胞釋放進入週邊血液循環系統。2.動員完畢後，進入基因編輯細胞治療產品生產流程，首先透過CD34磁珠標記和分選獲得CD34陽性的造血幹細胞和培養。其次，電轉Cas9和sgRNA，編輯BCL11A紅系增強子位點。最後，細胞凍存，進入品質控制和安全性評價階段，達到放行標準之後即可準備開始回輸給患者。3.產品製備成功並放行透過後，臨床醫生將通知受試者住院，並接受預處理化療(清髓藥物白消安(Busulfan)或/和、清淋巴藥物環磷醯胺(cyclophosphamide)及氟達拉濱(fludarabine)，需要說明的是不同的臨床機構採取的預處理方案可能不同，有些臨床機構可能只會採用清髓藥物，如白消安，而有的臨床機構會採用清髓和清淋巴藥物，如環磷醯胺和氟達拉濱等。在完成預處理之後，將基因編輯的自體造血幹細胞透過單次靜脈注射給藥回輸，給藥劑量為≥2×10^6活性CD34陽性細胞/kg。4. 於給藥注射完成後，進行至少2兩年的受試者隨訪，評估安全性、耐受性和有效性指標等。

工業實用性

根據本申請，本申請的方法有以下優點：第一、本申請首次發現在不同個體中，經過基因編輯造血幹細胞下調BCL11A表達後，對於γ球蛋白和胎兒血紅蛋白HbF的提升程度和作用不同, 而在同一個體中，經過基因編輯造血幹細胞下調BCL11A表達後，對於γ球蛋白和胎兒血紅蛋白HbF的提升程度和作用是一致且穩定的的現象，填補了現有技術的空白。第二、本申請首次設定了基因編輯BCL11A紅系增強子後，胎兒血紅蛋白HbF提高程度的有效性閾值，即編輯後HbF提高至少約12%，那麼患者接受治療後，病症將有可能得到顯著改善，有可能減少輸血頻率或擺脫輸血。第三，本申請開發的伴隨診斷方法操作簡單，只需從處於篩選期(病人篩選期通常需持續2-3個月)的擬入組的患者中抽取少量骨髓或者週邊血液，分離CD34陽性的造血幹細胞，基因編輯BCL11A紅系增強子，紅血球分化，檢測γ球蛋白和胎兒血紅蛋白HbF的提高程度即可，整個評估流程僅需要3~4周時間即可完成，避免了患者由於BCL11A基因對於γ球蛋白和胎兒血紅蛋白HbF的調節作用的個體差異導致的治療方法失效或者效果不顯著的風險。第四、本申請開發的方法將有利於基因編輯技術治療異常血紅素症的治療方案中，患者進行分層和分級治療，即γ球蛋白和胎兒血紅蛋白HbF的提升程度更高的患者處於優先治療的級別等。第五、本申請提出了全新的治療方案，即將伴隨診斷和基因編輯自體造血幹細胞治療相結合，提升了基因編輯治療異常血紅素症的安全性和有效性。

無

圖1電轉Cas9 mRNA編碼基因(SEQ ID NO:1)和破壞BCL11A的紅系增強子的2個sgRNA,分別是sgRNA-1和sgRNA-2進入5個不同的地中海型貧血病人和2個健康供體動員週邊血液來源的造血幹細胞，4天后，“Synthego ICE Analysis”線上軟體分析產生Indels效率的統計分析。圖2電轉Cas9 mRNA和破壞BCL11A的紅系增強子的兩個sgRNA，分別是sgRNA-1和sgRNA-2進入5個不同的地中海型貧血病人和2個健康供體動員週邊血液來源的CD34陽性的造血幹細胞，進行紅血球分化，18天后檢測，檢測人CD71和人CD235a 兩個膜蛋白表達比例，代表紅系分化效率。對照組：代表未經過基因編輯的細胞，sgRNA-1和sgRNA-2：分別代表經過兩種sgRNA基因編輯的細胞。圖3電轉Cas9 mRNA和破壞BCL11A的紅系增強子的兩個sgRNA，分別是sgRNA-1和sgRNA-2進入5個不同的地中海型貧血病人和2個健康供體動員週邊血液來源的CD34陽性的造血幹細胞，進行紅血球分化，18天后檢測，透過螢光定量PCR檢測HBG(γ-globin)基因mRNA表達。對照組: 代表未經過基因編輯的細胞。實驗組：分別代表經過兩種sgRNA基因編輯的細胞。N=3個實驗重複。HBG基因與GAPDH基因進行歸一化處理。圖4A電轉Cas9 mRNA和破壞BCL11A的紅系增強子sgRNA-2進入2個不同健康供體動員週邊血液來源的CD34陽性造血幹細胞的3個批次的實驗，4天后，“Synthego ICE Analysis”線上軟體分析產生Indels效率的統計分析。圖4B電轉Cas9 mRNA和破壞BCL11A的紅系增強子sgRNA-2進入10個地中海型貧血患者動員週邊血液來源的CD34陽性造血幹細胞多批次實驗(病人供體1三個批次，病人供體6，病人供體9和病人供體10各兩個獨立批次)，2天后，“Synthego ICE Analysis”線上軟體分析產生Indels效率的統計分析。圖5電轉Cas9 mRNA和破壞BCL11A的紅系增強子sgRNA-2進入2個不同健康供體動員週邊血液來源的CD34陽性造血幹細胞的3個批次的實驗，進行紅血球分化，18天后檢測，檢測人CD71和人CD235a 兩個膜蛋白表達，表示紅系分化效率。對照組：代表未經過基因編輯的細胞，實驗組：代表經過sgRNA-2基因編輯的細胞。圖6電轉Cas9 mRNA和破壞BCL11A的紅系增強子sgRNA-2進入10個地中海型貧血患者動員週邊血液來源的CD34陽性造血幹細胞多批次實驗，進行紅血球分化，18天后檢測，檢測人CD71和人CD235a 兩個膜蛋白表達，表示紅系分化效率。對照組：代表未經過基因編輯的細胞，實驗組：代表經過sgRNA-2基因編輯的細胞。圖7電轉Cas9 mRNA和破壞BCL11A的紅系增強子sgRNA-2進入第1個健康供體動員週邊血液來源的CD34陽性造血幹細胞的3個批次的紅血球分化實驗，分化18天后，透過螢光定量PCR檢測BCL11A、HBG((γ-globin))等基因mRNA表達。對照組: 代表未經過基因編輯的細胞。實驗組：代表經過sgRNA-2基因編輯的細胞。N=3個實驗重複。HBG基因和BCL11A基因分別與GAPDH基因進行歸一化處理。圖8電轉Cas9 mRNA和破壞BCL11A的紅系增強子sgRNA-2進入第2個健康供體動員週邊血液來源的CD34陽性造血幹細胞的3個批次的紅血球分化實驗，分化18天后，透過螢光定量PCR檢測BCL11A、HBG((γ-globin))等基因mRNA表達。對照組: 代表未經過基因編輯的細胞。實驗組：代表經過sgRNA-2基因編輯的細胞。N=3個實驗重複。HBG基因和BCL11A基因分別與GAPDH基因進行歸一化處理。圖9A電轉Cas9 mRNA和破壞BCL11A的紅系增強子sgRNA-2進入10個地中海型貧血患者動員週邊血液來源的CD34陽性造血幹細胞多批次實驗，進行紅血球分化，18天后檢測，透過流式試驗檢測分化出的紅血球中HbF的表達比例。對照組：代表未經過基因編輯的細胞，實驗組：代表經過sgRNA-2基因編輯的細胞。圖9B不同地中海型貧血患者來源的實驗組HbF+%和對照組HbF+%的倍數統計分析。圖10 地中海型貧血患者1來源的實驗組HbF+%和對照組HbF+%的倍數的統計分析, n=3次實驗。圖11基因編輯BCL11A紅系增強子位點治療異常血紅素症的全新治療方案示意圖。

Claims

一種治療個體中的異常血紅素症的方法，包括：評估步驟，所述評估步驟包括評估經修飾的CD34陽性造血幹細胞/祖細胞（“CD34陽性HSPC”）的第一群體分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力，其中第一群體的經修飾的CD34陽性HSPC來源於所述個體並經過修飾以降低BCL11A功能（“經修飾的EV細胞”）；以及治療步驟，所述治療步驟包括向所述個體施用第二群體經修飾的CD34陽性HSPC，所述經修飾的CD34陽性HSPC來源於所述個體並且經修飾降低了BCL11A功能（“經修飾的TR細胞”）。
一種治療個體中的異常血紅素症的方法，包括治療步驟，所述治療步驟包括向所述個體施用來源於所述個體且經修飾降低了BCL11A功能的第二群體的經修飾CD34陽性HSPC（“經修飾的TR細胞”），其中基於經由評估步驟的功能評價選出所述個體用於治療，所述評估步驟包括：評估第一群體經修飾的CD34陽性HSPC分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力，其中第一群體的經修飾CD34陽性HSPC來源於個體並經修飾降低了BCL11A功能（“經修飾的EV細胞”）。
一種確定患有異常血紅素症的個體是否適合或不適合於用來源於所述個體並經修飾降低了BCL11A功能的第二群體的經修飾CD34陽性HSPC（“經修飾的TR細胞”）進行治療的方法，其中所述方法包括評估步驟，其包括：評估第一群體的經修飾CD34陽性HSPC分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力，其中第一群體的經修飾的CD34陽性HSPC來源於所述個體並經修飾降低了BCL11A功能（“經修飾的” EV細胞），其中如果第一群體的經修飾CD34陽性HSPC產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF），則所述個體適於治療；其中如果第一群體的經修飾的CD34陽性HSPC不產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）則所述個體不適合所述經修飾的TR細胞進行治療。
如請求項1 至請求項3中任一項所述的方法，其中所述評估步驟包括：從所述個體的骨髓或週邊血液樣品中分離出CD34陽性HSPC以獲得經分離的CD34陽性HSPC群體（“經分離的EV細胞”）；修飾經分離的EV細胞以獲得第一群體經修飾CD34陽性HSPC細胞，其具有降低了的BCL11A功能（“經修飾的EV細胞”）；以及評估經修飾的EV細胞分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力。
如請求項1至請求項4中任一項所述的方法，其中所述治療步驟包括：動員所述個體骨髓中的CD34陽性HSPC以增加週邊血液中CD34陽性HSPC的量；從所述個體的週邊血液中分離CD34陽性HSPC，以獲得經分離的CD34陽性HSPC群體（“經分離的TR細胞”）；修飾經分離的TR細胞以獲得降低了BCL11A功能的、第二群體的經修飾CD34陽性HSPC（“經修飾的TR細胞”）；以及向所述個體施用有效量的經修飾的TR細胞。
如請求項1至請求項5中任一項所述的方法：其中所述評估步驟包括：從所述個體的骨髓或週邊血液樣品中分離CD34陽性HSPC以獲得經分離的CD34陽性HSPC群體（“經分離的EV細胞”）；修飾經分離的EV細胞以獲得降低了BCL11A功能的第一群體的經修飾CD34陽性HSPC細胞（“經修飾的EV細胞”）；以及評估經修飾的EV細胞分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力；以及其中所述治療步驟包括：將所述個體中的CD34陽性HSPC動員至週邊血液；從所述個體的週邊血液中分離CD34陽性HSPC以獲得經分離的CD34陽性HSPC群體（“經分離的TR細胞”），修飾經分離的TR細胞以獲得降低了BCL11A功能的、第二群體的經修飾CD34陽性HSPC（“經修飾的TR細胞”）；以及向所述個體施用有效量的經修飾的TR細胞。
如請求項1至請求項6中任一項所述的方法，其中經修飾的EV細胞是透過基因修飾得到修飾的。
如請求項4至請求項6中任一項所述的方法，其中對經分離的EV細胞進行修飾包括對經分離的EV細胞進行基因修飾。
如請求項7或請求項8所述的方法，其中透過選自鋅指核酸酶（ZFN）、轉錄活化因子樣效應因子核酸酶（TALEN）以及規律性間隔的短回文序列重複（CRISPR）、RNA編輯、RNA干擾的技術對經分離的EV細胞進行基因修飾。
如請求項1至請求項9中任一項所述的方法，其中在評估步驟中評估經修飾的EV細胞分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力，所述步驟包括：i）在允許分化以獲得紅血球群體的條件下培養經修飾的EV細胞；以及 2）確定所述紅血球產生的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的水準。
如請求項1至請求項10中任一項所述的方法，其中在評估步驟中評估經修飾的EV細胞中分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力包括：確定γ-球蛋白的mRNA水準。
如請求項1至請求項10中任一項所述的方法，其中在評估步驟中評估經修飾的EV細胞分化後產生所需水準的γ-球蛋白或胎兒血紅蛋白（HbF）的能力包括：確定胎兒血紅蛋白（HbF）的蛋白質水準。
如請求項1至請求項12中任一項所述的方法，其中所述個體在評估步驟之前未經歷過動員或預處理。
如請求項1至請求項13中任一項所述的方法，其中所述評估步驟在所述治療步驟之前重複至少一次。
如請求項1至請求項14中任一項所述的方法，其中經修飾的TR細胞是透過基因修飾得到修飾的。
如請求項5至請求項14中任一項所述的方法，其中對經分離的TR細胞進行修飾包括對經分離的TR細胞進行基因修飾。
如請求項15或請求項16所述的方法，其中透過選自鋅指核酸酶（ZFN）、轉錄活化因子樣效應因子核酸酶（TALEN）以及規律性間隔的短回文序列重複（CRISPR）、RNA編輯、RNA干擾的技術對經分離的TR細胞進行基因修飾。
如請求項5至請求項17中任一項所述的方法，其中在治療步驟中動員CD34陽性HSPC包括：用粒細胞集落刺激因子（GCSF）和/或普樂沙福（plerixafor）治療所述個體。
如請求項1至請求項18中任一項所述的方法，其中所述治療步驟還包括：在施用所述經修飾的TR細胞之前對所述個體進行預處理。
如請求項19所述的方法，其中所述預處理包括化療、單克隆抗體療法或全身放射。
如請求項20所述的方法，其中所述預處理包括化療。
如請求項21所述的方法，其中所述化療包括向所述個體施用一種或多種選自由下述組成的組的化學治療劑：白消安（busulfan），環磷醯胺和氟達拉濱。
如請求項5至請求項22中任一項所述的方法，其中在進行修飾之前將分離的TR細胞培養一天或多天。
如請求項5至請求項23中任一項所述的方法，其中所述經修飾的TR細胞在施用于個體之前培養一天或多天。
如請求項1至請求項24中任一項所述的方法，其中在將經修飾的TR細胞施用於個體之前，將經修飾的TR細胞在冷凍條件下儲存至少24小時。
如請求項25所述的方法，其中在冷凍條件下進行儲存之前，將經修飾的TR細胞培養一天或多天。
如請求項1至請求項26中任一項所述的方法，其中所述異常血紅素症選自由下述組成的疾病：鐮狀細胞病、鐮狀細胞性狀、血紅蛋白C病、血紅蛋白C性狀、血紅蛋白S / C病、血紅蛋白D病、血紅蛋白 E病、地中海型貧血、帶有增加的氧親和力的與血紅蛋白相關的病症、帶有降低的氧親和力的與血紅蛋白相關的病症、不穩定的異常血紅素症和高鐵血紅蛋白血症。
如請求項27所述的方法，其中所述異常血紅素症選自由β-地中海型貧血和鐮狀細胞性貧血組成的組。
如請求項28所述的方法，其中所述異常血紅素症是β0或β+地中海型貧血。
如請求項1至請求項29中任一項所述的方法，其中所述個體是人。
如請求項1至請求項30中任一項所述的方法，其中緊隨所述評估步驟進行所述治療步驟。