CN112708668B - Hsp70作为检测地中海贫血的分子标记物及其在制备诊断试剂盒中的应用 - Google Patents

Hsp70作为检测地中海贫血的分子标记物及其在制备诊断试剂盒中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112708668B
CN112708668B CN202110068477.3A CN202110068477A CN112708668B CN 112708668 B CN112708668 B CN 112708668B CN 202110068477 A CN202110068477 A CN 202110068477A CN 112708668 B CN112708668 B CN 112708668B
Authority
CN
China
Prior art keywords
thalassemia
hsp70
molecular marker
peripheral blood
diagnostic kit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110068477.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112708668A (zh
Inventor
刘静
陈慧勇
彭元亮
张海航
梁龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Central South University
Original Assignee
Central South University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Central South University filed Critical Central South University
Priority to CN202110068477.3A priority Critical patent/CN112708668B/zh
Publication of CN112708668A publication Critical patent/CN112708668A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112708668B publication Critical patent/CN112708668B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/22—Haematology

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了HSP70作为检测地中海贫血的分子标记物及其在制备诊断试剂盒中的应用，外周血HSP70的mRNA和蛋白质水平可以作为地中海贫血诊疗的一种特异性标记，HSP70在地贫中表达水平很高，可以精准鉴定是否为地贫，并随着治疗地贫症状的缓解，HSP70表达下降；所以HSP70不仅可以作为地贫诊断的分子标记，同时也可以作为地贫治疗效果评定的一个依据。

Description

HSP70作为检测地中海贫血的分子标记物及其在制备诊断试 剂盒中的应用
技术领域
本发明涉及HSP70作为检测地中海贫血的分子标记物及其在制备诊断试剂盒中的应用。属于地中海贫血分子标记物技术领域。
背景技术
地中海贫血(简称“地贫”)是一种严重威胁人类健康的致死、致残的遗传溶血性贫血，根据基因缺陷，可以将其分为α链珠蛋白地中海贫血(简称α地贫)和β链珠蛋白地中海贫血(简称β地贫)。地贫主要由红细胞内珠蛋白链不平衡导致，根据α/β链数量不平衡程度可以将地贫分为轻型、中间型和重型地贫。现有地贫诊断技术主要有血常规诊断、珠蛋白基因诊断、和血红蛋白分析等。其中血常规诊断无法确定判断是否为地中海贫血，一般需做基因分析才可以检查出来；珠蛋白基因诊断对实验室、设备、技术人员要求较高，收费相对较高；产前诊断费用较贵，且诊断时间较长；血红蛋白分析较为常见，可明确诊断中间型和重型地贫患者，但无法诊断轻型α地贫。
热休克蛋白70(HSP70)是热休克蛋白家族的重要一员，在正常细胞中表达水平较低，而应激状态下可显著升高。HSP70是目前热休克家族研究的热点之一，涉及多个领域，如肿瘤、神经退行性疾病等，但与地贫相关的报道较少。已有研究指出HSP70在有核红细胞中发挥重要作用，其在地贫患者有核红细胞中的核质分布异常可能与无效红细胞生成有关。具体HSP70表达变化能否作为地贫诊断和预后检测指标，尚未有报道。
现有检测是否为地中海贫血的手段主要包括血常规诊断、基因诊断、产前诊断、血红蛋白分析等。血常规诊断无法精准判断是否地贫，需联合基因诊断进一步判断；基于珠蛋白基因DNA序列的诊断对实验室设备和技术人员要求较高，如DNA芯片和高通量DNA 测序，操作步骤较为繁琐，诊断时间较长，费用较高。基于高效液相色谱的血红蛋白分析对于一些症状较轻的又容易出现假阴性结果。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供HSP70作为检测地中海贫血的分子标记物及其在制备诊断试剂盒中的应用。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
1、HSP70作为检测地中海贫血的分子标记物的应用。
2、外周血HSP70表达水平检测在制备地中海贫血诊断试剂盒中的应用。
优选的，HSP70表达水平检测的具体方法选自mRNA qRT-PCR检测、蛋白质免疫荧光检测或蛋白质流式细胞术检测中的任一种。
本发明的有益效果：
1、外周血HSP70的mRNA和蛋白质水平可以作为地中海贫血诊疗的一种特异性标记， HSP70在地贫中表达水平很高，可以精准鉴定是否为地贫，并随着治疗地贫症状的缓解， HSP70表达下降；所以HSP70不仅可以作为地贫诊断的分子标记，同时也可以作为地贫治疗效果评定的一个依据。
2、针对HSP70适用于地贫诊疗检测的应用，既可以进行mRNA水平的检测，也可以进行蛋白质水平的检测，检测技术多样化，可根据不同实验室条件选择合适检测技术。
3、外周血样本易取易得，检测方便，可用于大范围人群鉴定。
4、本发明既可以进行核酸水平qRT-PCR检测，也可以直接适用于外周血细胞免疫荧光和流式细胞术检测，特异性好，适用范围广。
附图说明
图1为本发明采用qRT-PCR技术检测小鼠外周血HSP70的mRNA水平表达情况， ****p＜0.0001。
图2为本发明采用免疫荧光检测小鼠外周血细胞中HSP70蛋白质的表达水平，****p ＜0.0001。
图3为本发明采用流式细胞术检测小鼠外周血HSP70蛋白质的表达水平，其中，A为野生型小鼠，B为地贫小鼠。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
本发明涉及的β-地中海贫血小鼠购自美国杰克逊实验室，地贫小鼠模型构建见参考文献；相同遗传背景的野生型小鼠购自湖南斯莱克景达公司。
实施例1：本实施例采用qRT-PCR技术检测小鼠外周血HSP70的mRNA水平。
实验步骤：
1)用抗凝EP管收集小鼠外周血；
2)加入1ml RNA抽提试剂(Trizol)溶液裂解红细胞，提取总RNA；μ
3)检测总RNA浓度，逆转录成cDNA；
4)配置qPCR反应体系10μL，具体如下：
cDNA(30ng,2μL)；SYBR Green荧光染料(5μL)；双蒸水(1μL)；HSP70或内参基因GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)引物(10mM，2μL)。其中HSP70正向引物序列为5'-CCATCGAGGAGGTGGATTAGA-3'，如SEQ ID NO.1所示；HSP70反向引物序列为5'-AGTGCTGCTCCCAACATTAC-3'，如SEQ ID NO.2所示；GAPDH正向引物序列为 5'-ATCATCCCTGCATCCACT-3'，如SEQ ID NO.3所示；GAPDH反向引物序列为 5'-ATCCACGACGGACACATT-3'，如SEQ ID NO.4所示。
5)用qRT-PCR测得相应数据，进行统计学分析。
实验结果如图1所示。结果表明，地贫小鼠外周血细胞中HSP70的mRNA水平约为野生型小鼠的150倍，这说明使用qRT-PCR检测外周血HSP70的mRNA水平可以区分具有相同遗传背景地中海贫血和野生型小鼠。
实施例2：本实施例采用免疫荧光检测小鼠外周血HSP70的表达水平。
实验步骤：
1)用抗凝EP管收集小鼠外周血；
2)抽取10μl抗凝血缓缓加入1ml冰甲醇内固定20分钟；
3)固定结束后将血细胞均匀涂抹在载玻片上；
4)用体积百分比0.1％Triton X-100透膜10分钟，用pH7.2-7.4磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次；
5)用质量浓度1％的牛血清白蛋白封闭30分钟；
6)HSP70一抗(美国Abcam公司)4℃孵育过夜；
7)回收抗体，PBS洗3次，加入红系细胞表面标志糖蛋白Ter119的抗体(美国Biolegend公司)、异硫氰酸荧光素标记(FITC)的山羊抗兔二抗(美国杰森实验室)孵育1小时， PBS洗3次；
8)用4',6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)孵育5分钟，PBS洗3-5次；
9)质量浓度50％甘油水溶液封片，显微镜观察。
实验结果如图2所示：左图为HSP70蛋白在外周血细胞中的免疫荧光检测结果，右图 为外周血中HSP70蛋白表达呈阳性的细胞比例。结果表明，地贫小鼠外周血中无核红细胞 (Ter119阳性且DAPI阴性)中的HSP70蛋白质表达水平远高于野生型小鼠，这说明外周血细胞HSP70蛋白质的免疫荧光分析可以用于检测地贫。
实施例3：本实施例采用流式细胞术检测小鼠外周血HSP70的表达水平。
实验步骤：
1)用抗凝EP管收集小鼠外周血；
2)抽取10μl抗凝血缓缓加入1ml冰甲醇内固定20分钟；
3)清洗细胞1遍，用质量浓度0.1％Triton X-100透膜10分钟；
4)等待自然沉降后弃上清，随后加入HSP70、Ter119、Hoechst 33342流式抗体避光孵育20分钟；
5)孵育结束后，清洗细胞后上流式仪检测。
实验结果如图3所示：利用流式细胞术检测野生型小鼠外周血细胞中无核细胞(Ter119 阳性且Hoechst3342阴性)的HSP70阳性细胞比例为0.42±0.09％(图3中A)，而地贫小鼠的为7.23±1.06％(图3中B)。结果表明外周血细胞HSP70蛋白质的流式细胞术可以用于检测地贫。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
序列表
<110> 中南大学
<120> HSP70作为检测地中海贫血的分子标记物及其在制备诊断试剂盒中的应用
<130> 2021
<141> 2021-01-17
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ccatcgagga ggtggattag a 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
agtgctgctc ccaacattac 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atcatccctg catccact 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
atccacgacg gacacatt 18

Claims (1)

1.外周血HSP70作为诊断标记物在制备β-地中海贫血诊断试剂盒中的应用；外周血HSP70表达水平检测的具体方法为mRNA qRT-PCR检测、蛋白质免疫荧光检测或蛋白质流式细胞术检测中的任一种；所述β-地中海贫血包括轻型、中间型和重型。
CN202110068477.3A 2021-01-19 2021-01-19 Hsp70作为检测地中海贫血的分子标记物及其在制备诊断试剂盒中的应用 Active CN112708668B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110068477.3A CN112708668B (zh) 2021-01-19 2021-01-19 Hsp70作为检测地中海贫血的分子标记物及其在制备诊断试剂盒中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110068477.3A CN112708668B (zh) 2021-01-19 2021-01-19 Hsp70作为检测地中海贫血的分子标记物及其在制备诊断试剂盒中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112708668A CN112708668A (zh) 2021-04-27
CN112708668B true CN112708668B (zh) 2022-10-18

Family

ID=75549350

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110068477.3A Active CN112708668B (zh) 2021-01-19 2021-01-19 Hsp70作为检测地中海贫血的分子标记物及其在制备诊断试剂盒中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112708668B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113774126B (zh) * 2021-09-03 2022-11-22 南方科技大学 一种β-地中海贫血诊断标志物及其应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2013149142A (ru) * 2011-04-06 2015-05-20 Конинклейке Филипс Н.В. Маркеры, ассоциированные с признаком бета-талассемии
CN102344925B (zh) * 2011-10-20 2014-04-30 昆明金域医学检验所有限公司 一种缺失型α地中海贫血-2基因及其检测试剂盒和PCR测序方法
CN104370852B (zh) * 2014-11-26 2016-04-20 山东大学 一种噻唑烷酮类化合物及其在制备治疗铁紊乱相关疾病药物中的应用
WO2017079591A2 (en) * 2015-11-04 2017-05-11 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating ineffective erythropoiesis
CN111939271A (zh) * 2019-04-30 2020-11-17 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 一种血红蛋白病治疗有效性预测方法
CN110592208B (zh) * 2019-10-08 2022-05-03 北京诺禾致源科技股份有限公司 地中海贫血症三类亚型的捕获探针组合物及其应用方法和应用装置
CN111560429B (zh) * 2020-05-27 2023-02-03 广州市番禺区中心医院 一种用于地中海贫血诊断的circRNA标志物的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112708668A (zh) 2021-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101222437B1 (ko) 바이오마커
CN110484613B (zh) 一种强直性脊柱炎早期诊断标志物
CN112708668B (zh) Hsp70作为检测地中海贫血的分子标记物及其在制备诊断试剂盒中的应用
KR20110014983A (ko) 심장 동종이식 만성 거부반응 진단방법
US20120115146A1 (en) Method of analyzing genetically abnormal cells
KR101343916B1 (ko) 폐암의 림프절 미세전이 진단용 마커, 상기 마커에 대한프라이머를 포함하는 키트, 상기 마커 또는 상기 마커에대한 항체를 포함하는 마이크로어레이, 및 폐암의 림프절미세전이 여부를 진단하는 방법
CN107190071B (zh) 一种用于检测RhD变异表型的SNP标记
CN110656169B (zh) 心房颤动的诊断标志物
CN108034707B (zh) Spag7基因在制备老年痴呆诊断制剂中的应用
CN108588218B (zh) 一种血清miRNA组合的微创检测试剂盒
CN107937515B (zh) 一种阿尔茨海默的诊疗基因靶点及其应用
KR102039815B1 (ko) 신장이식 후 이식 장기의 염증 진단 또는 예측용 바이오마커
WO2013054984A1 (en) Composition for diagnosis of lung cancer and diagnosis kit of lung cancer
KR100873629B1 (ko) 신규한 폐암 진단용 마커
CN114959003A (zh) 急性心肌梗死标志物及其应用
CN114959005A (zh) 基于分子标志物的肥厚型心肌病诊断产品及其应用
CN112126623A (zh) 一种Miltenberger血型系列表型红细胞的制备方法
CN105821152A (zh) 冠心病生物标志物
CN106048005B (zh) 一种诊断冠心病的分子标志物
KR102455051B1 (ko) 혈청내 Daxx 단백질의 측정을 통한 만성 간질환의 진단
KR100947596B1 (ko) 신규한 폐암 진단용 마커
Rezaei et al. Dogs may carry Leishmania tropica and Leishmania major in their blood circulation: a molecular and hematological study
CN106048006B (zh) Smchd1在制备诊断冠心病产品中的应用
CN105648093B (zh) Maff在诊断和区分冠心病和冠心病合并糖尿病中的应用
JP2022147356A (ja) 黄色人種由来メラノーマ細胞の検出方法及び回収方法、並びに、それらの方法に用いる試薬及び担体固定化分子

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant