CN112708668B - Hsp70作为检测地中海贫血的分子标记物及其在制备诊断试剂盒中的应用 - Google Patents

Hsp70作为检测地中海贫血的分子标记物及其在制备诊断试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了HSP70作为检测地中海贫血的分子标记物及其在制备诊断试剂盒中的应用，外周血HSP70的mRNA和蛋白质水平可以作为地中海贫血诊疗的一种特异性标记，HSP70在地贫中表达水平很高，可以精准鉴定是否为地贫，并随着治疗地贫症状的缓解，HSP70表达下降；所以HSP70不仅可以作为地贫诊断的分子标记，同时也可以作为地贫治疗效果评定的一个依据。

Description

HSP70作为检测地中海贫血的分子标记物及其在制备诊断试 剂盒中的应用
技术领域
本发明涉及HSP70作为检测地中海贫血的分子标记物及其在制备诊断试剂盒中的应用。属于地中海贫血分子标记物技术领域。
背景技术
地中海贫血(简称“地贫”)是一种严重威胁人类健康的致死、致残的遗传溶血性贫血，根据基因缺陷，可以将其分为α链珠蛋白地中海贫血(简称α地贫)和β链珠蛋白地中海贫血(简称β地贫)。地贫主要由红细胞内珠蛋白链不平衡导致，根据α/β链数量不平衡程度可以将地贫分为轻型、中间型和重型地贫。现有地贫诊断技术主要有血常规诊断、珠蛋白基因诊断、和血红蛋白分析等。其中血常规诊断无法确定判断是否为地中海贫血，一般需做基因分析才可以检查出来；珠蛋白基因诊断对实验室、设备、技术人员要求较高，收费相对较高；产前诊断费用较贵，且诊断时间较长；血红蛋白分析较为常见，可明确诊断中间型和重型地贫患者，但无法诊断轻型α地贫。
热休克蛋白70(HSP70)是热休克蛋白家族的重要一员，在正常细胞中表达水平较低，而应激状态下可显著升高。HSP70是目前热休克家族研究的热点之一，涉及多个领域，如肿瘤、神经退行性疾病等，但与地贫相关的报道较少。已有研究指出HSP70在有核红细胞中发挥重要作用，其在地贫患者有核红细胞中的核质分布异常可能与无效红细胞生成有关。具体HSP70表达变化能否作为地贫诊断和预后检测指标，尚未有报道。
现有检测是否为地中海贫血的手段主要包括血常规诊断、基因诊断、产前诊断、血红蛋白分析等。血常规诊断无法精准判断是否地贫，需联合基因诊断进一步判断；基于珠蛋白基因DNA序列的诊断对实验室设备和技术人员要求较高，如DNA芯片和高通量DNA 测序，操作步骤较为繁琐，诊断时间较长，费用较高。基于高效液相色谱的血红蛋白分析对于一些症状较轻的又容易出现假阴性结果。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供HSP70作为检测地中海贫血的分子标记物及其在制备诊断试剂盒中的应用。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
1、HSP70作为检测地中海贫血的分子标记物的应用。
2、外周血HSP70表达水平检测在制备地中海贫血诊断试剂盒中的应用。
优选的，HSP70表达水平检测的具体方法选自mRNA qRT-PCR检测、蛋白质免疫荧光检测或蛋白质流式细胞术检测中的任一种。
本发明的有益效果：
1、外周血HSP70的mRNA和蛋白质水平可以作为地中海贫血诊疗的一种特异性标记， HSP70在地贫中表达水平很高，可以精准鉴定是否为地贫，并随着治疗地贫症状的缓解， HSP70表达下降；所以HSP70不仅可以作为地贫诊断的分子标记，同时也可以作为地贫治疗效果评定的一个依据。
2、针对HSP70适用于地贫诊疗检测的应用，既可以进行mRNA水平的检测，也可以进行蛋白质水平的检测，检测技术多样化，可根据不同实验室条件选择合适检测技术。
3、外周血样本易取易得，检测方便，可用于大范围人群鉴定。
4、本发明既可以进行核酸水平qRT-PCR检测，也可以直接适用于外周血细胞免疫荧光和流式细胞术检测，特异性好，适用范围广。
附图说明
图1为本发明采用qRT-PCR技术检测小鼠外周血HSP70的mRNA水平表达情况， ****p＜0.0001。
图2为本发明采用免疫荧光检测小鼠外周血细胞中HSP70蛋白质的表达水平，****p ＜0.0001。
图3为本发明采用流式细胞术检测小鼠外周血HSP70蛋白质的表达水平，其中，A为野生型小鼠，B为地贫小鼠。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
本发明涉及的β-地中海贫血小鼠购自美国杰克逊实验室，地贫小鼠模型构建见参考文献；相同遗传背景的野生型小鼠购自湖南斯莱克景达公司。
实施例1：本实施例采用qRT-PCR技术检测小鼠外周血HSP70的mRNA水平。
实验步骤：
1)用抗凝EP管收集小鼠外周血；
2)加入1ml RNA抽提试剂(Trizol)溶液裂解红细胞，提取总RNA；μ
3)检测总RNA浓度，逆转录成cDNA；
4)配置qPCR反应体系10μL，具体如下：
cDNA(30ng,2μL)；SYBR Green荧光染料(5μL)；双蒸水(1μL)；HSP70或内参基因GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)引物(10mM，2μL)。其中HSP70正向引物序列为5'-CCATCGAGGAGGTGGATTAGA-3'，如SEQ ID NO.1所示；HSP70反向引物序列为5'-AGTGCTGCTCCCAACATTAC-3'，如SEQ ID NO.2所示；GAPDH正向引物序列为 5'-ATCATCCCTGCATCCACT-3'，如SEQ ID NO.3所示；GAPDH反向引物序列为 5'-ATCCACGACGGACACATT-3'，如SEQ ID NO.4所示。
5)用qRT-PCR测得相应数据，进行统计学分析。
实验结果如图1所示。结果表明，地贫小鼠外周血细胞中HSP70的mRNA水平约为野生型小鼠的150倍，这说明使用qRT-PCR检测外周血HSP70的mRNA水平可以区分具有相同遗传背景地中海贫血和野生型小鼠。
实施例2：本实施例采用免疫荧光检测小鼠外周血HSP70的表达水平。
实验步骤：
1)用抗凝EP管收集小鼠外周血；
2)抽取10μl抗凝血缓缓加入1ml冰甲醇内固定20分钟；
3)固定结束后将血细胞均匀涂抹在载玻片上；
4)用体积百分比0.1％Triton X-100透膜10分钟，用pH7.2-7.4磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次；
5)用质量浓度1％的牛血清白蛋白封闭30分钟；
6)HSP70一抗(美国Abcam公司)4℃孵育过夜；
7)回收抗体，PBS洗3次，加入红系细胞表面标志糖蛋白Ter119的抗体(美国Biolegend公司)、异硫氰酸荧光素标记(FITC)的山羊抗兔二抗(美国杰森实验室)孵育1小时， PBS洗3次；
8)用4',6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)孵育5分钟，PBS洗3-5次；
9)质量浓度50％甘油水溶液封片，显微镜观察。
实验结果如图2所示：左图为HSP70蛋白在外周血细胞中的免疫荧光检测结果，右图 为外周血中HSP70蛋白表达呈阳性的细胞比例。结果表明，地贫小鼠外周血中无核红细胞 (Ter119阳性且DAPI阴性)中的HSP70蛋白质表达水平远高于野生型小鼠，这说明外周血细胞HSP70蛋白质的免疫荧光分析可以用于检测地贫。
实施例3：本实施例采用流式细胞术检测小鼠外周血HSP70的表达水平。
实验步骤：
1)用抗凝EP管收集小鼠外周血；
2)抽取10μl抗凝血缓缓加入1ml冰甲醇内固定20分钟；
3)清洗细胞1遍，用质量浓度0.1％Triton X-100透膜10分钟；
4)等待自然沉降后弃上清，随后加入HSP70、Ter119、Hoechst 33342流式抗体避光孵育20分钟；
5)孵育结束后，清洗细胞后上流式仪检测。
实验结果如图3所示：利用流式细胞术检测野生型小鼠外周血细胞中无核细胞(Ter119 阳性且Hoechst3342阴性)的HSP70阳性细胞比例为0.42±0.09％(图3中A)，而地贫小鼠的为7.23±1.06％(图3中B)。结果表明外周血细胞HSP70蛋白质的流式细胞术可以用于检测地贫。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
序列表
<110> 中南大学
<120> HSP70作为检测地中海贫血的分子标记物及其在制备诊断试剂盒中的应用
<130> 2021
<141> 2021-01-17
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ccatcgagga ggtggattag a 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
agtgctgctc ccaacattac 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atcatccctg catccact 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
atccacgacg gacacatt 18

Claims (1)

1.外周血HSP70作为诊断标记物在制备β-地中海贫血诊断试剂盒中的应用；外周血HSP70表达水平检测的具体方法为mRNA qRT-PCR检测、蛋白质免疫荧光检测或蛋白质流式细胞术检测中的任一种；所述β-地中海贫血包括轻型、中间型和重型。
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