CN112447264A - 基于脱靶评估评价基因编辑治疗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种确定细胞疗法对个体的适合性的方法。本发明利用了生物信息学方法和无偏向的潜在脱靶位点实验分析方法，在向个体施用细胞疗法前对源自个体的基因修饰细胞的潜在脱靶位点进行预测，并在将源自个体的基因修饰细胞施用至个体后对潜在脱靶位点进行监测，确定所述潜在脱靶位点是否发生基因编辑，并基于基因编辑事件的发生评估所述治疗的适合性。

Description

基于脱靶评估评价基因编辑治疗的方法

本发明属于基因治疗领域，具体地说，本发明涉及一种确定细胞疗法对个体的适合性的方法。

背景技术

地中海贫血病是一组遗传性溶血性贫血疾病，分为α型、β型、δβ型和δ型4种，其中以α和β地中海贫血较为常见。

人类β珠蛋白基因簇位于第11号染色体，其中功能基因分别为ε、Gγ、Aγ、δ和β-珠蛋白基因。发育过程中基因依次表达，胎儿时期以γ-珠蛋白基因表达为主，此时血红蛋白以胎儿血红蛋白(HbF)为主，之后γ-珠蛋白基因表达逐渐关闭，β-珠蛋白基因表达启动，血红蛋白转为以成人期血红蛋白(HbA)为主。β地中海贫血症涉及β-珠蛋白基因的突变。在β地中海贫血中，突变阻止红细胞产生足够的携氧血红蛋白(成人期血红蛋白)，导致贫血。

已知BCL11A基因是一种与胎儿血红蛋白(HbF)表达有关的基因，其蛋白产物是抑制γ-珠蛋白基因转录的反式作用因子。BCL11A基因表达减少与胎儿血红蛋白(HbF)的持续表达有关。

研究表明，灭活BCL11A基因可以使红细胞在出生后继续产生胎儿形式的血红蛋白，其可以代替有缺陷的成人期血红蛋白(HbA)。BCL11A的遗传增强子，仅在红细胞中有活性。因此可以在几乎所有造血干细胞中编辑BCL11A增强子，通过剪切BCL11A基因(抑制胎儿血红蛋白的产生)，降低BCL11A的表达，从而解除对于胎儿血红蛋白HBG基因表达的抑制作用，提高地中海贫血病患者血液中血红蛋白总量，实现治疗疾病的目的。

目前，在自然医学研究中，基于CRISPR-Cas9基因编辑技术对BCL11A基因进行编辑，使用细胞疗法对地中海贫血症患者进行治疗，从患者体内取出造血干细胞并对其进行编辑，编辑的细胞分化成红细胞后可产生功能性血红蛋白，然后使用编辑的细胞替换患者原有造血干细胞。

例如，使用CRISPR/Cas9基因编辑了BCL11A增强子的自体CD34+细胞注射液，基于CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过编辑患者自身的CD34+造血干细胞中BCL11A基因的红系增强子的一个特定靶点，降低BCL11A的表达，从而解除对于胎儿血红蛋白HBG基因表达的抑制作用，提高地中海贫血病患者血液中血红蛋白总量，达到治疗疾病的目的。

但是，CRISPR/Cas9基因编辑过程中存在的问题之一是脱靶效应。sgRNA在与基因组DNA序列结合时有可能存在一定几率的错配，造成在非靶向位点的脱靶突变。

因此，需要一种方法，其在向个体施用细胞疗法后可对潜在脱靶位点进行监测，能够确定所述潜在脱靶位点是否发生基因编辑，并基于基因编辑事件的发生评估所述治疗对个体的适合性。

发明概述

本发明采用生物信息学预测分析方法和无偏向(unbiased)的潜在脱靶位点实验分析方法，在向个体施用细胞疗法之前，对源自个体的基因修饰细胞的潜在脱靶位点进行检测。通过本发明的方法检测出的潜在脱靶位点，构建脱靶标志位点模式，并在向个体施用细胞疗法后，对潜在脱靶位点跟踪监测，从而及时了解患者中脱靶效应的发生，评估所述治疗对个体的适合性、所述基因编辑细胞疗法的效果、所述细胞疗法是否需要干预，从而部分实现了有效治疗疾病的同时减少了细胞疗法的风险。

本发明一方面涉及一种确定细胞疗法对个体的适合性的方法。具体地，本发明提供了一种确定细胞疗法对个体的适合性的方法，其包括向所述个体施用源自所述个体的基因修饰细胞群，其中所述基因修饰细胞是在靶位点经过基因编辑修饰的，所述方法包括以下步骤：

a)确定所述基因修饰细胞或其后代中在多个脱靶标志位点中的每一个位点的基因编辑的发生，

b)基于所述基因编辑的发生评估所述治疗的适合性，

其中在所述多个脱靶标志位点中没有任何一个发生基因编辑表明所述细胞疗法对所述个体是适合的。

另一方面，本发明也提供了一种确定细胞疗法对个体不适合的方法，其包括向所述个体施用源自所述个体的基因修饰细胞群，其中所述基因修饰细胞是在靶位点经过基因编辑修饰的，所述方法包括以下步骤：

a)确定所述基因修饰细胞或其后代中在多个脱靶标志位点中的每一个位点的基因编辑的发生，

b)基于所述基因编辑的发生评估所述治疗的适合性，

其中在所述多个脱靶标志位点中的任何一个发生基因编辑表明所述细胞疗法对所述个体是不适合的。

本发明一方面涉及一种治疗个体的方法。具体地，本发明提供了一种细胞疗法，包括：1)确定细胞疗法对个体适合性的步骤，和2)对细胞疗法适合的个体施用源自所述个体的基因修饰细胞群的步骤，其中所述基因修饰细胞是在靶位点经过基因编辑修饰的，所述确定细胞疗法对个体适合性的步骤包括：

a)确定所述基因修饰细胞或其后代中在多个脱靶标志位点中的每一个位点的基因编辑的发生，

b)基于所述基因编辑的发生评估所述治疗的适合性，

其中在所述多个脱靶标志位点中没有任何一个发生基因编辑表明所述细胞疗法对所述个体是适合的。

本发明一方面提供了一种伴随个体基因编辑细胞疗法诊断是否出现脱靶的方法，包括：a)向所述个体施用源自所述个体的基因修饰细胞群，其中所述基因修饰细胞是在靶位点经过基因编辑修饰的，

b)确定所述基因修饰细胞或其后代中在多个脱靶标志位点中的每一个位点的基因编辑的发生，

其中在所述多个脱靶标志位点中没有任何一个发生基因编辑表明所述细胞疗法没有出现脱靶。

本发明一方面提供了一种监测基因编辑细胞疗法效果的方法，包括：a)向所述个体施用源自所述个体的基因修饰细胞群，其中所述基因修饰细胞是在靶位点经过基因编辑修饰的，

b)确定所述基因修饰细胞或其后代中在多个脱靶标志位点中的每一个位点的基因编辑的发生，

其中在所述多个脱靶标志位点中没有任何一个发生基因编辑提示所述细胞疗法对所述个体的治疗效果较好。

本发明一方面提供了一种对源自某个体的基因修饰细胞产品进行质量监控的方法，包括：a)确定所述基因修饰细胞在多个脱靶标志位点中的每一个位点的基因编辑的发生，

其中在所述多个脱靶标志位点中没有任何一个发生基因编辑表明所述细胞产品适用于对该个体进行细胞治疗。本发明一方面提供了一种判断是否需要向基因编辑细胞疗法个体施用干预疗法的方法，包括：a)向所述个体施用源自所述个体的基因修饰细胞群，其中所述基因修饰细胞是在靶位点经过基因编辑修饰的，

b)确定所述基因修饰细胞或其后代中在多个脱靶标志位点中的每一个位点的基因编辑的发生，

其中在所述多个脱靶标志位点中的任何一个发生基因编辑表明需要向基因编辑细胞疗法的所述个体施用干预疗法。

在上述方法的一些实施方案中，所述方法包括在向所述个体施用所述基因修饰细胞前对所述基因修饰细胞进行所述确定步骤。在上述方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述个体施用所述基因修饰细胞。在上述方法的一些实施方案中，所述方法包括在施用所述基因修饰细胞后对所述基因修饰细胞的后代进行所述确定步骤。在上述方法的一些实施方案中，所述确定步骤在施用所述基因修饰细胞后至少约一个月，例如至少30天、40天、50天、60天进行。在上述方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述确定和评估步骤重复一次或多次，例如二次、三次、四次、五次或更多次，例如，约每月、约每二个月、约每三个月、约每四个月、约每五个月、约每六个月进行一次。在上述方法的一些实施方案中，所述确定和评估步骤以约每月一次至约每年一次的频率重复。

在上述方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括在所述评估步骤后用干预疗法治疗所述个体。在上述方法的一些实施方案中，所述干预疗法是化学疗法。在上述方法的一些实施方案中，所述干预疗法是清除已施用的基因修饰细胞群。在上述方法的一些实施方案中，所述干预疗法是施用源自所述个体的第二基因修饰细胞群。

在上述方法的一些实施方案中，所述多个脱靶标志位点包含至少约10个(例如10-50个、10-45个、10-40个、10-35个、10-30个、10-25个、10-20个、10-15个)脱靶标志位点。

在上述方法的一些实施方案中，在脱靶标志位点有小于0.1％的基因编辑效率，或与未通过基因编辑修饰的对照细胞相比，所述基因修饰细胞在脱靶标志位点的基因编辑效率小于对照组在脱靶标志位点基因编辑效率的2倍，表明在所述脱靶标志位点没有发生基因编辑。

本发明一方面涉及一种评估基因修饰细胞群或其后代中脱靶基因编辑的方法，其中所述基因修饰细胞是在靶位点经过基因编辑修饰的，所述方法包括确定在多个脱靶标志位点中的每一个位点的基因编辑的发生，其中通过以下方式获得所述多个脱靶标志位点：1)基于与所述靶位点的序列相似性鉴定第一多个脱靶标志位点；和/或2)使用体外试验方法鉴定第二多个脱靶标志位点。

在上述方法的一些实施方案中，其中所述确定步骤通过DNA测序进行。在上述方法的一些实施方案中，其中所述确定步骤包括：1)通过使用多个引物组扩增包含所述多个脱靶标志位点的核酸；2)对扩增的核酸进行测序分析。

本发明涉及一种在基因修饰细胞群中获得多个脱靶标志位点的方法，所述基因修饰细胞是在靶位点经过基因编辑修饰的，该方法包括：1)基于与所述靶位点的序列相似性鉴定第一多个脱靶标志位点；和2)使用体外试验方法鉴定第二多个脱靶标志位点。

在上述方法的一些实施方案中，其中所述体外试验方法包括任何全基因组无倾向脱靶分析方法(genome-wide unbiased off-target analysis)。在上述方法的一些实施方案中，所述方法包括以下任何一个或多个：BLESS，GUIDE-seq，HIGTS，Circle-seq，SITE-seq和Digenome-seq。在上述方法的一些实施方案中，所述体外试验方法包括Digenome-seq。在上述方法的一些实施方案中，所述体外试验方法在饱和条件下进行。在上述方法的一些实施方案中，所述体外试验方法提取了一群细胞的基因组，并在饱和条件下进行基因编辑。在上述方法的一些实施方案中，所述饱和条件允许所述一群细胞的基因组中的所述靶位点中至少有90％以上发生了有效切割，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％发生了有效切割。

在上述方法的一些实施方案中，其中所述基因修饰细胞通过CRISPR/Cas系统修饰。在上述方法的一些实施方案中，其中所述靶位点位于BCL11A基因座位。

本发明涉及一种用于评估基因修饰细胞群或其后代的脱靶编辑的试剂盒，其中所述基因修饰细胞是经过对靶位点的基因编辑修饰的，该试剂盒包括：1)基因编辑系统的一个或多个组分，其用于产生所述基因修饰细胞；和2)多个用于扩增包含多个脱靶标志位点的核酸的引物组。

在一些实施方案中，所述多个脱靶标志位点通过以下方式获得：1)基于与所述靶位点的序列相似性鉴定第一多个脱靶标志位点；和/或2)使用体外试验方法鉴定第二多个脱靶标志位点。在一些实施方案中，所述基因编辑系统是CRISPR/Cas9系统。在一些实施方案中，所述用于评估基因修饰细胞群或其后代的脱靶编辑的试剂盒进一步包含一个或多个引物组，所述引物组用于扩增包含所述靶位点的核酸。

在上述方法和试剂盒的一些实施方案中，基因编辑的方法或系统选自ZFN，TALEN、CRISPR，或其它基因编辑方法或系统。在上述方法和试剂盒的一些实施方案中，所述基因编辑方法或系统为CRISPR基因编辑方法或系统。在上述方法和试剂盒的一些实施方案中，所述靶位点为CD34阳性造血干细胞/祖细胞中的BCL11A基因位点。在上述方法和试剂盒的一些实施方案中，所述靶位点位于BCL11A增强子基因的外显子2和外显子3之间的核苷酸序列，例如，位于或对应于如hg38中所记录的位置+55:Chr2:60497676-60498941；+58:Chr2:60494251-60495546；+62:Chr2:60490409-60491734处的位点。在上述试剂盒的一些实施方案中，试剂盒包含靶向上述靶位点的sgRNA、或包含该sgRNA的核苷酸序列、或编码该sgRNA的核苷酸序列。在上述试剂盒的一些实施方案中，所述试剂盒包含选自SEQ ID NOs：3-25中任何一个或多个sgRNA。在上述试剂盒的一些实施方案中，所述试剂盒包含Cas9蛋白或编码或该Cas9蛋白的表达载体或核苷酸序列。在上述试剂盒的一些实施方案中，所述一个或多个引物组包含以下一个或多个序列：SEQ ID NOs：26-117。

附图说明

图1显示了针对BCL11A红系增强子的sgRNA潜在脱靶位点分析。横轴为各个位点，纵轴为基因编辑效率(indel)。所有结果可以分为三组：1)靶位点组，即横坐标为On-target的组；2)编辑组基因编辑效率超过0.1％，但与对照组(Mock)无显著差别组(不超过Mock组的二倍)，例如POT-1、POT-7、POT-9、POT-43；以及3)编辑组基因编辑效率小于0.1％的组，即除1)组及2)组所含潜在脱靶位点以外的横轴位点。indel：(insertion and deletion，插入和缺失)。

发明详述

本发明一方面涉及一种确定细胞疗法对个体的适合性的方法。具体地，本发明提供了一种确定细胞疗法对个体的适合性的方法，其包括向所述个体施用源自所述个体的基因修饰细胞群，其中所述基因修饰细胞是在靶位点经过基因编辑修饰的细胞，所述方法包括以下步骤：

a)确定所述基因修饰细胞或其后代在多个脱靶标志位点中的每一个位点的基因编辑的发生，

b)基于所述发生评估所述治疗的适合性，

其中在所述多个脱靶标志位点中没有任何一个发生基因编辑则表明所述细胞疗法对所述个体是适合的。

另一方面，本发明也提供了一种确定细胞疗法对个体不适合的方法，其包括向所述个体施用源自所述个体的基因修饰细胞群，其中所述基因修饰细胞是在靶位点经过基因编辑修饰的细胞，所述方法包括以下步骤：

a)确定所述基因修饰细胞或其后代中在多个脱靶标志位点中的每一个位点的基因编辑的发生，

b)基于所述发生评估所述治疗的适合性，

其中在所述多个脱靶标志位点中的任何一个发生基因编辑表明所述细胞疗法对所述个体是不适合的。

在一些实施方案中，所述基因修饰细胞为通过CRISPR/Cas系统修饰的细胞。在一些实施方案中，所述基因修饰细胞为CD34阳性造血干细胞/祖细胞。在一些实施方案中，所述靶位点位于BCL11A基因座位。在一些实施方案中，所述靶位点位于CD34阳性造血干细胞/祖细胞的BCL11A基因座位。

本发明所使用的术语“细胞疗法”指将活细胞，例如健康的活细胞、经过改造的活细胞移植到个体内以补充、冲减、替代或修复病变细胞，从而改善细胞和组织的结构和功能的治疗方法。

基因“修饰”细胞是指细胞在基因水平上发生了改变，例如可以通过基因编辑方法对细胞在分子水平上进行修饰，使细胞在基因水平上发生改变。经过基因修饰的细胞在细胞水平上也可以发生改变，例如蛋白表达被增强或抑制，细胞功能提高或降低。例如，通过基因编辑方法对BCL11A红系增强子进行基因编辑，下调BCL11A基因表达，从而解除BCL11A基因对于γ珠蛋白和HbF的表达抑制，可以提高红细胞中γ珠蛋白和HbF表达，治疗β-地中海贫血和镰刀形红细胞贫血。在具体实施方案中，可以将经分离的CD34阳性造血干细胞/祖细胞(“CD34阳性HSPC”)通过基因编辑方法，例如通过选自ZFN，TALEN或CRISPR的基因编辑技术破坏了BCL11A基因产生BCL11A功能降低的基因修饰细胞。

基因修饰可通过例如DNA水平的基因编辑或调控实现。例如可以通过锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)以及规律性间隔的短回文序列重复(CRISPR)技术中的任一方法或他们的组合对细胞进行基因修饰。

如本申请使用的“CRISPR”或“CRISPR/Cas”技术是一种基因编辑技术，包括但不限于各种自然存在或人工设计的CRISPR/Cas系统，如CRISPR/Cas9系统。自然存在的CRISPR/Cas系统(Naturally occurring CRISPR/Cas system)是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。例如，CRISPR/Cas9的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计tracrRNA和crRNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(single guide RNA，单向导RNA，或称向导RNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割。作为一种RNA引导的dsDNA结合蛋白，Cas9效应物核酸酶能够共定位RNA、DNA和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。CRISPR/Cas系统可使用一类，二类或三类Cas蛋白。本发明的一些实施方式中，所述方法使用Cas9。其他适用的CRISPR/Cas系统包括但不限于WO2013176772，WO2014065596，WO2014018423，US8,697,359、PCT/CN2018/112068、PCT/CN2018/112027中所描述的系统和方法。

在上述方法的一些实施方案中，所述方法包括对细胞进行基因修饰。在上述方法的一些实施方案中，所述基因修饰包括“CRISPR”或“CRISPR/Cas”基因编辑技术。

本申请中所述“个体”指计划、正在或已经使用基因编辑自体细胞进行治疗的患者或受试者，其中所述患者或受试者包含β地中海贫血患者、镰刀型贫血患者等。

本申请中“脱靶”或“脱靶效应”是指偏离预先设定的靶位点发生修饰的现象。对于CRISPR/Cas基因编辑方法而言，因为CRISPR系统通过sgRNA与染色体的碱基互补配对进行识别，因此可以认为非靶位点与靶位点序列相似性度越高，越有可能发生脱靶。普遍认为，基因疗法/细胞疗法可能的副作用，例如癌症的发生，很大程度上与脱靶效应有关，编辑了不该编辑的基因位点。因此，预测基因编辑脱靶位点并对其进行监控对降低基因疗法/细胞疗法的风险是至关重要的。

本申请中的“靶位点”是指预先设定的，使用基因修饰相关方法，例如基因编辑方法进行修饰的一段序列。例如在使用CRISPR的基因编辑方法中，sgRNA可通过碱基互补配对的方式与所述靶位点结合，并引导Cas蛋白对所述靶位点进行基因修饰。本申请中的“非靶位点”是指靶位点所在基因组中除靶位点以外的其他序列段。本申请中的“脱靶位点”则是指由于使用了基因编辑方法，而发生了基因修饰的非靶位点。本申请中的“脱靶标志位点”是基因组中存在脱靶风险的非靶位点，脱靶标志位点与靶位点在序列上高度相似，并且这种相似使得脱靶标志位点的核酸序列易于在针对靶位点的基因修饰过程中被改变，从而在脱靶标志位点出现脱靶效应，形成脱靶位点。本申请所述“脱靶标志位点”包含第一多个脱靶标志位点与第二多个脱靶标志位点。如无特别说明，在本申请中，“脱靶标志位点”与“潜在脱靶位点”可以互换使用。

其中，“第一多个脱靶标志位点”是指通过生物信息学方法，基于与靶位点序列的相似性鉴定的一组脱靶标志位点。在本申请的一些实施方案中，可通过序列相似性鉴定第一多个脱靶标志位点。例如，对于CRISPR/Cas基因编辑方法而言，因为CRISPR系统通过sgRNA与染色体碱基互补配对进行识别，因此可以认为序列相似性度越高，越有可能发生脱靶。在CRISPR系统中，靶位点通常由与sgRNA结合的区域(通常19-21bp，例如20bp)和PAM区域共同组成。在一些实施方案中，与靶位点有80％以上(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)序列相似性(或称序列同一性)的位点被鉴定为脱靶标志位点。“序列相似性”或称序列同一性意指二个核苷酸序列之间的相似程度。序列相似性可以定义为靶核苷酸序列和参照核苷酸序列之间相同核苷酸残基的百分率。可以采用本领域已知的多种方法实现对核苷酸序列相似性的测定，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能确定用于比对序列的适宜参数，包括对所比较序列全长实现最大对比需要的任何算法。

本申请中“第二多个脱靶标志位点”是指通过体外试验方法，通过对实际编辑后发生的修饰进行鉴别而确定的一组脱靶标志位点。在一些实施方案中，所述体外试验方法包括任何全基因组无倾向脱靶分析方法(genome-wide unbiased off-target analysis)。在上述方法的一些实施方案中，所述方法包括以下任何一个或多个：BLESS，GUIDE-seq，HIGTS，Circle-seq，SITE-seq和Digenome-seq。其中，BLESS是指将双链断裂的DNA末端用生物素连接，再用链酶亲和素(streptavidin)将其富集并测序和进行分析[Yan WX，Mirzazadeh R，Garnerone S，Scott D，Schneider MW，et al.2017.BLISS is a versatileand quantitative method for genome-wide profiling of DNA double-strandbreaks.Nat.Commun.8:150583]；GUIDE-seq是指在DNA双链断裂区域插入dsODN(double-stranded oligodeoxynucleotide)来标记DSB并测序和进行分析[Tsai SQ，Zheng Z，Nguyen NT，Liebers M，Topkar VV，et al.2015.GUIDE-seq enables genome-wideprofiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.Nat.Biotechnol.33:187–97]；HTGTS通过将两个双链断裂区域进行连接，以易位(translocation)来标记并测序和进行分析[Frock RL，Hu J，Meyers RM，Ho YJ，Kii E，Alt FW.2015.Genome-widedetection of DNA double stranded breaks induced by engineerednucleases.Nat.Biotechnol.33:179–86]；Circle-seq、SITE-seq和Digenome-seq则在体外将切割位点进行标记并测序和进行分析[6.Tsai SQ，Nguyen NT，Malagon-Lopez J，TopkarVV，Aryee MJ，Joung JK.2017.CIRCLE-seq:a highly sensitive in vitro screen forgenome-wide CRISPR-Cas9 nuclease off-targets.Nat.Methods 14:607–14；Cameron P，Fuller CK，Donohoue PD，Jones BN，Thompson MS，et al.2017.Mapping the genomiclandscape of CRISPR-Cas9 cleavage.Nat.Methods 14:600–6；Kim D，Bae S，Park J，KimE，Kim S，et al.2015.Digenome-seq:genome-wide profiling of CRISPRCas9 off-target effects in human cells.Nat.Methods 12:237–43]。这几种方法直接利用高通量测序来检测Cas蛋白切割产生的DNA双链断裂来发现脱靶位点，能够有效地发现低频的脱靶位点。

在本申请中，“第一多个脱靶标志位点”与“第二多个脱靶标志位点”可以有交集也可以没有交集。

本申请所述“基因编辑的发生”是指因使用基因编辑方法，而在靶位点或脱靶标志位点出现特异性或非特异性基因修饰的现象。

本申请提供一种评估基因修饰细胞群或其后代中脱靶效应的方法，其中所述基因修饰细胞是在靶位点经过基因编辑修饰的，所述方法包括确定在多个脱靶标志位点中的每一个位点的基因编辑的发生，其中通过以下方式获得所述多个脱靶标志位点：1)基于与所述靶位点的序列相似性鉴定第一多个脱靶标志位点；和/或2)使用体外试验方法鉴定第二多个脱靶标志位点。在一些实施方案中，所述确定步骤通过DNA测序进行。在一些实施方案中，所述确定步骤包括：1)通过使用多个引物组扩增包含所述多个脱靶标志位点的核酸；2)对扩增的核酸进行测序分析。本申请还提供一种在基因修饰细胞群中获得多个脱靶标志位点的方法，所述基因修饰细胞是在靶位点经过基因编辑修饰的，该方法包括：1)基于与所述靶位点的序列相似性鉴定第一多个脱靶标志位点；和/或2)使用体外试验方法鉴定第二多个脱靶标志位点。在一些实施方案中，所述体外试验方法包括以下任何一个或多个：BLESS，GUIDE-seq，HIGTS，Circle-seq，SITE-seq和Digenome-seq。

在一些实施方案中，上述体外试验方法在饱和条件下进行。术语“饱和条件”指允许在体外在靶位点处有超过90％的有效切割的条件。在一些实施方案中，所述体外试验方法提取了一群细胞的基因组，并在饱和条件下进行基因编辑。在一些实施方案中，所述饱和条件允许所述一群细胞的基因组的靶位点中发生了至少90％或以上的有效切割，例如发生了至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或100％的有效切割。

测序过程中，例如深度测序过程中会产生一定比例的错误(如PCR过程中产生的)，且这个错误与位点相关(如有些位点不利于PCR，PCR过程中会有较多的错误发生)。通常来说，对于大部分位点，深度测序检测方法的检测极限为约0.1％(Nat Rev Genet.2018 May；19(5):269–285，Next Gener Seq Appl.2014；1:1000106)，也就是说如果基因修饰细胞群中只有约0.1％或小于约0.1％的细胞在某一位点经过了基因编辑，则现有深度测序检测方法无法对该位点的实际基因修饰比例进行准确的测量。换句话讲，由于现有深度测序过程中本身存在的误差，即使完全没有发生基因修饰的细胞，用现有深度测序检测方法检测得到的基因修饰细胞的比例同样为0至0.1％的数值。现有深度测序检测方法无法区分无基因修饰以及基因修饰比例等于或低于约0.1％的情况。因此如果基因编辑效率的检测值低于约0.1％则通常认定为是检测方法的背景。对于一些特殊的位点，例如在基础突变值较高的位点，检测背景值较高，因此通常以是否存在显著差别来说明是否有脱靶效应，例如与未通过基因编辑修饰的对照细胞相比在脱靶标志位点有小于2倍的序列变化(经检测基因修饰细胞群中的细胞在所述脱靶标志位点发生基因序列变化的比例与未通过基因编辑修饰的对照细胞在所述脱靶标志位点发生基因序列变化的比例的比值小于2)可以认定为在该位点没有发生基因编辑；相应地，大于2倍(包含2倍)的序列变化可以判定为在该位点发生了基因编辑，对此可参见Maeder，Morgan L.，et al."Development of a gene-editingapproach to restore vision loss in Leber congenital amaurosis type 10."Naturemedicine 25.2(2019):229。

基因编辑领域内，通常把基因编辑效率定义为所有酶作用位点中发生indel(insertion/deletion)的比例。例如，针对一万个细胞的两万套染色体中的某一特定位点，深度测序20万次，发现有indel的次数是100次，则基因编辑效率为：100/20万＝0.05％。

在本申请上述方法的一些实施方案中，所述基因修饰细胞为CD34阳性造血干细胞/祖细胞，所述细胞的BCL11A基因通过CRISPR/Cas系统进行了基因编辑修饰。在本发明的一些实施方案中，通过CRISPR/Cas”基因编辑方法破坏BCL11A增强子(影响例如增强BCL11A的表达或功能的核酸序列)。所述BCL11A增强子参见例如，Bauer等人,Science[科学],第342卷,2013,第253-257页所述。所述BCL11A增强子的一个实例是BCL11A基因的外显子2和外显子3之间的核酸序列(例如，位于或对应于如hg38中所记录的位置+55:Chr2:60497676-60498941；+58:Chr2:60494251-60495546；+62:Chr2:60490409-60491734处的核酸)。所述BCL11A增强子的一个实例是BCL11A基因的外显子2和外显子3之间的核酸序列的+62区域。所述BCL11A增强子的一个实例是BCL11A基因的外显子2和外显子3之间的核酸序列的+58区域(BCL11A基因58K位点150bp序列：ctgccagtcctcttctaccccacccacgcccccaccctaatcagaggccaaacccttcctggagcctgtgataaaagcaactgttagcttgcactagactagcttcaaagttgtattgaccctggtgtgttatgtctaagagtagatgcc)(SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，BCL11A增强子是BCL11A基因的外显子2和外显子3之间的核酸序列的+55区域。

在上述方法的一些实施方案中，通过对人类第2号染色体第60495197位至第60495346位区域的BCL11A基因进行修饰，降低BCL11A功能。在上述方法的一些实施方案中，通过CRISPR/Cas技术对CD34阳性HSPC细胞进行修饰，降低BCL11A功能。在上述方法的一些实施方案中，通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495219位至第60495336位的BCL11A基因组区域减低BCL11A功能。在上述方法的一些实施方案中，所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与选自SEQ ID No.3～SEQ ID No.25任一的序列互补。

在上述方法的一些实施方案中，将包含选自SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:25任一序列的sgRNA导入所述CD34阳性造血干细胞/祖细胞对BCL11A基因进行编辑，减低BCL11A功能。在上述方法的一些实施方案中，所述sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的。在上述方法的一些实施方案中，所述化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。在上述方法的一些实施方案中，将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述CD34阳性造血干细胞/祖细胞。在上述方法的一些实施方案中，通过电转方法将sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入造血干细胞。在上述方法的一些实施方案中，所述电转条件为200-600V，0.5ms-2ms。

如本文使用，“BCL11A”是一种转录因子，首先在小鼠中发现，作为逆转录病毒的结合位点，被命名为Evi9，后来在人类基因组中也发现这一基因，定位于2号染色体短臂2p13位点。

经过修饰BCL11A功能降低是指通过修饰，例如经过基因修饰，例如通过CRISPR/Cas系统和方法进行基因编辑，使BCL11A基因被破坏。

在上述方法的一些实施方案中，基因修饰靶位点为BCL11A基因中与选自SEQ IDNo.3～SEQ ID No.25任一的序列互补的位点。

表1列出了包含SEQ ID No.3～SEQ ID No.25所示任一序列的sgRNA所靶向的人染色体2上的基因组序列位置，以及每条sgRNA引发的Cas9切割位点。

表1：

SEQ ID NO:3：名称为BCL11A的增强子-1的sgRNA(有时也简称为enhancer-1)：cacaggctccaggaagggtt

SEQ ID NO:4：名称为BCL11A的增强子-2的sgRNA(有时也简称为enhancer-2)：atcagaggccaaacccttcc

SEQ ID NO:5：名称为BCL11A的增强子-3的sgRNA(有时也简称为enhancer-3)：Ctaacagttgcttttatcac

SEQ ID NO:6：名称为BCL11A的增强子-4的sgRNA(有时也简称为enhancer-4)：ttgcttttatcacaggctcc

SEQ ID NO:7：名称为BCL11A的增强子-5的sgRNA(有时也简称为enhancer-5)：ttttatcacaggctccagga

SEQ ID NO:8：名称为BCL11A的增强子-6的sgRNA(有时也简称为enhancer-6)：tttatcacaggctccaggaa

SEQ ID NO:9：名称为BCL11A的增强子-7的sgRNA(有时也简称为enhancer-7)：tgggtggggtagaagaggac

SEQ ID NO:10：名称为BCL11A的增强子-8的sgRNA(有时也简称为enhancer-8)：gggcgtgggtggggtagaag

SEQ ID NO:11：名称为BCL11A的增强子-9的sgRNA(有时也简称为enhancer-9)：ttagggtgggggcgtgggtg

SEQ ID NO:12：名称为BCL11A的增强子-10的sgRNA(有时也简称为enhancer-10)：attagggtgggggcgtgggt

SEQ ID NO:13：名称为BCL11A的增强子-11的sgRNA(有时也简称为enhancer-11)：gattagggtgggggcgtggg

SEQ ID NO:14：名称为BCL11A的增强子-12的sgRNA(有时也简称为enhancer-12)：tctgattagggtgggggcgt

SEQ ID NO:15：名称为BCL11A的增强子-13的sgRNA(有时也简称为enhancer-13)：ctctgattagggtgggggcg

SEQ ID NO:16：名称为BCL11A的增强子-14的sgRNA(有时也简称为enhancer-14)：cacgcccccaccctaatcag

SEQ ID NO:17：名称为BCL11A的增强子-15的sgRNA(有时也简称为enhancer-15)：ttggcctctgattagggtgg

SEQ ID NO:18：名称为BCL11A的增强子-16的sgRNA(有时也简称为enhancer-16)：tttggcctctgattagggtg

SEQ ID NO:19：名称为BCL11A的增强子-17的sgRNA(有时也简称为enhancer-17)：gtttggcctctgattagggt

SEQ ID NO:20：名称为BCL11A的增强子-18的sgRNA(有时也简称为enhancer-18)：ggtttggcctctgattaggg

SEQ ID NO:21：名称为BCL11A的增强子-19的sgRNA(有时也简称为enhancer-19)：aagggtttggcctctgatta

SEQ ID NO:22：名称为BCL11A的增强子-20的sgRNA(有时也简称为enhancer-20)：gaagggtttggcctctgatt

SEQ ID NO:23：名称为BCL11A的增强子-21的sgRNA(有时也简称为enhancer-21)：actcttagacataacacacc

SEQ ID NO:24：名称为BCL11A的增强子-22的sgRNA(有时也简称为enhancer-22)：cttcaaagttgtattgaccc

SEQ ID NO:25：名称为BCL11A的增强子-23的sgRNA(有时也简称为enhancer-23)：ctcttagacataacacacca

分析上述23条sgRNA的切割位点发现，这些sgRNA所引发的Cas9切割位置集中在BCL11A基因第60495219位至第60495336位基因组区域。

一般而言，sgRNA中的指导序列是与靶多核苷酸序列具有足够的互补性以与靶序列杂交并指导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用适当的比对算法最佳比对时，指导序列及其相应靶序列间的互补程度为约或大于约80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更多。最佳比对可使用用于比对序列的任何适当的算法确定，其非限制性实例包括Smith-Waterman算法、Needleman-Wimsch算法、基于Burrows-Wheeler Transform的算法(例如Burrows Wheeler Aligner)、ClustalW、Clustai X、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies，ELAND((Illumina，San Diego，CA)、SOAP(可在soap.genomics.org.cn获得)和Maq(可在maq.sourceforge.net获得)。在一些实施方案中，指导序列长度约19-21，例如19bp、20bp、21bp。

本申请一方面涉及一种确定细胞疗法对个体的适合性的方法。具体地，本发明提供了一种确定细胞疗法对个体的适合性的方法，其包括向所述个体施用源自所述个体的基因修饰细胞群，其中所述基因修饰细胞是在靶位点经过基因编辑修饰的，所述方法包括以下步骤：

a)确定所述基因修饰细胞或其后代中在多个脱靶标志位点中的每一个位点的基因编辑的发生，

b)基于所述发生评估所述治疗的适合性，

其中在所述多个脱靶标志位点中没有任何一个发生基因编辑表明所述细胞疗法对所述个体是适合的。

另一方面，本发明也提供了一种确定细胞疗法对个体不适合的方法，其包括向所述个体施用源自所述个体的基因修饰细胞群，其中所述基因修饰细胞是在靶位点经过基因编辑修饰的，所述方法包括以下步骤：

a)确定所述基因修饰细胞或其后代中在多个脱靶标志位点中的每一个位点的基因编辑的发生，

b)基于所述发生评估所述治疗的适合性，

其中在所述多个脱靶标志位点中的任何一个发生基因编辑表明所述细胞疗法对所述个体是不适合的。

在一些实施方案中，所述基因修饰细胞的后代是所述基因修饰细胞通过细胞分裂后的子细胞。在一些实施方案中，所述基因修饰细胞的后代是基因修饰细胞分化后的子细胞。在一些实施方案中，所述基因修饰细胞为基因修饰的造血干细胞。在一些实施方案中，所述基因修饰细胞的后代为基因修饰的造血干细胞的分化后代。

“造血干细胞”是指具有旺盛的增殖潜力、多向分化的能力和自我更新能力的细胞群体。造血干细胞不仅能分化、补充各种血细胞，还能通过自我更新保持干细胞的特性和数量。造血干细胞的分化程度和增殖能力不一，有异质性。多能造血干细胞最原始，先分化为定向多能造血干细胞，例如能生成粒系、红系、单核系和巨核-血小板系的髓系造血干细胞及能发生B淋巴细胞和T淋巴细胞的淋巴干细胞。这两类干细胞既保持着造血干细胞基本特点，又略有分化，分别负责“骨髓成分”和淋巴细胞的发生，故称定向多能造血干细胞。它们进一步分化成为造血祖细胞，此细胞虽然也是原始的血细胞，但是它已丧失造血干细胞的许多基本特点，如已失去多向性分化能力，只能朝向一系或密切相关的二系细胞分化；失去了反复自我更新能力，而要依靠造血干细胞的增殖分化来补充数量；增殖潜力有限，只能分裂数次。根据造血祖细胞所能分化生成的血细胞系多少，又分为单能造血祖细胞(只分化为一个血细胞系)和寡能造血祖细胞(可分化为2～3个血细胞系)。本申请中“造血干细胞/祖细胞”和“造血干细胞”术语可以互换使用，涵盖多能造血干细胞、定向多能造血干细胞和造血祖细胞，是具有不同异质性的造血干细胞的总称。

在一些实施方案中，上述方法中所述的基因修饰细胞为基因修饰的CD34阳性造血干细胞/祖细胞。可以使用例如流式细胞术和荧光标记的抗CD34抗体来检测和计数CD34阳性造血干细胞/祖细胞。

在具体实施方案中，CD34阳性造血干细胞/祖细胞从包含造血来源细胞的生物体(个体)分离或获得。“分离”是指从其原始环境取出。例如，如果细胞与在其天然状态通常伴随它的一些或所有组分分开时，则它是分离的。

造血干细胞/祖细胞可以从成人的未分级分离或分级分离的骨髓获得或分离，包括股骨，髋骨，肋骨，胸骨和其它骨骼。造血干细胞和祖细胞可以利用针和注射器从髋骨取出直接获得或分离，或者从血液中获得，通常是在造血干细胞动员剂诸如G-CSF(粒细胞集落刺激因子)预处理后从血液中获得。造血干细胞和祖细胞的其他来源包括脐带血、胎盘血和经过动员的个体的外周血。

从个体(例如骨髓或外周血)分离获得细胞群体后可对其进行进一步纯化获得CD34阳性造血干细胞/祖细胞。例如可以通过免疫去除分离的细胞群体中的成熟谱系定向细胞，例如通过用结合一组“谱系”抗原(例如CD2，CD3，CD11b，CD14，CD15，CD16，CD19，CD56，CD123和CD235a)的抗体标记固体基质，之后用结合CD34阳性抗原的抗体分离原始造血干细胞和祖细胞。用于从多种细胞来源纯化造血干细胞和祖细胞的试剂盒是商业可获得的。

在本申请的一些具体实施方案中，所述基因修饰细胞为经分离的CD34阳性造血干细胞/祖细胞，通过基因编辑方法，例如通过CRISPR技术破坏了BCL11A基因的细胞。

细胞“分化”是指同一来源的细胞逐渐产生形态结构、功能特征各不相同的细胞类群的过程。

从造血干细胞到红细胞的“分化”包括造血干细胞阶段、红系祖细胞阶段、红系前体细胞(原红细胞至晚红细胞)的增殖与分化阶段、网织红细胞的增殖及成熟过程，以及网织红细胞向外周血释放成熟为红细胞的阶段。造血干细胞阶段：目前已知，造血干细胞主要存在于骨髓、脾、肝等造血组织内。也有少量循环于外周血中。红系祖细胞阶段：在红系祖细胞(progenitor cell)阶段，细胞是处于造血干细胞与红系前体细胞之间的细胞群。造血干细胞在骨髓造血微环境的影响下分化为红系祖细胞。造血微环境包括微血管系统、神经系统和造血间质等部分。通过体液因子、细胞因子对造血干细胞的分化起特殊的作用和影响。红系前体细胞阶段：包括原始红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞及网织红细胞阶段而达到成熟红细胞。

细胞成熟的过程是血红蛋白增加和细胞核活性衰减的过程。随着细胞的成熟，有核红细胞中的血红蛋白含量不断增加，RNA的含量不断减少。红细胞内血红蛋白的增高促使核失去活性，不再合成DNA或RNA。实验证实这是由于血红蛋白通过核膜间孔进入核内，作用于核组蛋白(nucleohistones)，导致染色体失活而促进核凝缩。晚幼红细胞已失去继续分裂的能力，以后细胞核浓缩并逸出，被单核巨噬细胞吞噬，或在脾脏内碎裂、溶解，成为无细胞核的网织红细胞。在成熟红细胞阶段不再合成血红蛋白。根据细胞内血红蛋白浓度的增高会促使细胞核失去活性的理论，红细胞成熟过程分裂的次数、细胞最终的大小与血红蛋白合成的快慢有一定的关系。随着细胞的成熟，红系细胞的直径逐渐缩短，细胞体积也逐渐缩小。这是因为细胞内一些用以合成血红蛋白、基质蛋白及各种酶的细胞器(如线粒体、高尔基器、聚核糖体)逐渐减少，细胞器也逐渐退化消失。

在本发明的一些实施方案中，基因修饰细胞的后代为造血干细胞分化的后代，例如外周血中的处在各种分化阶段的有核红细胞，例如早幼红细胞、中幼红细胞或晚幼红细胞。

本发明一方面涉及一种治疗个体的方法。具体地，本发明提供了一种细胞疗法，包括1)确定细胞疗法对个体适合性的步骤，和2)对细胞疗法适合的个体向所述个体施用源自所述个体的基因修饰细胞群的步骤，其中所述基因修饰细胞是在靶位点经过基因编辑修饰的，所述确定细胞疗法对个体适合性的步骤包括：

a)确定所述基因修饰细胞或其后代中在多个脱靶标志位点中的每一个位点的基因编辑的发生，

b)基于所述发生评估所述治疗的适合性，

其中在所述多个脱靶标志位点中没有任何一个发生基因编辑表明所述细胞疗法对所述个体是适合的。

在上述方法的一些实施方案中，经基因编辑修饰的细胞群体在施用于个体之前不被离体或体外增殖。在具体实施方案中，可以洗涤所述经基因编辑修饰的细胞以除去处理试剂，并且将其给予患者而不对其进行离体增殖。在一些实施方案中，在经基因编辑修饰的细胞发生任何明显的离体细胞分裂之前，或在任何明显的离体细胞分裂所需时间之前施用于患者。在一些实施方案中，经基因编辑修饰的细胞在被修饰后施用于个体之前培养一天或多天。在一些实施方案中，经修饰的细胞在被修饰后2、4、6、12、24、48小时之内给予患者。

在一些实施方案中，在将经修饰的细胞施用于个体之前，将经修饰的细胞在冷冻条件下储存至少24小时。在一些实施方案中，在冷冻条件下进行储存之前，将经修饰的细胞培养一天或多天。经修饰的细胞可以在无血清基础培养基基础上添加有维持细胞活力的细胞因子的培养基中培养一天或多天(例如1天-3天)。

在一些实施方案中，通过静脉注射施用所述修饰的细胞，例如一周一次，二周一次，三周一次，一月或二月一次施用所述经修饰的细胞。所施用的细胞数例如约2x10⁵-2x10⁷个细胞每千克体重。

如本文所用的术语“治疗”是指获得所需的药理学和/或生理效果，包括但不限于，实现疾病症状的改善或消除。效果可以是预防性的，表现为完全地或部分地预防疾病或其症状；和/或效果可以是治疗性的，表现为实现症状的改善或消除，或提供对疾病和/或归因于疾病的不利影响的部分或完全治愈。如本文所用，“治疗”包括对哺乳动物特别是人的疾病的任何治疗，包括：(a)阻止个体发病；(b)抑制疾病，即阻止其发展；(c)缓解疾病，例如，使疾病消退，例如，完全或部分消除疾病症状；及(d)使个体恢复至疾病前状态，例如，重建造血系统。在本申请中，“治疗”并不必然表示疾病或疾病状态或其相关症状的彻底根除或治愈，其涵盖疾病或疾病状况的任何一个或多个可测量表象的任何最小程度的改善或缓解。在上述具体方法中，治疗包括造血重建得到改善或个体得以存活。

本发明一方面提供了一种伴随个体基因编辑细胞疗法诊断是否出现脱靶的方法，包括：a)向所述个体施用源自所述个体的基因修饰细胞群，其中所述基因修饰细胞是在靶位点经过基因编辑修饰的，

b)确定所述基因修饰细胞或其后代中在多个脱靶标志位点中的每一个位点的基因编辑的发生，

其中在所述多个脱靶标志位点中没有任何一个发生基因编辑表明所述细胞疗法没有出现脱靶。

本发明一方面提供了一种监测基因编辑细胞疗法效果的方法，包括：a)向所述个体施用源自所述个体的基因修饰细胞群，其中所述基因修饰细胞是在靶位点经过基因编辑修饰的，

b)确定所述基因修饰细胞或其后代中在多个脱靶标志位点中的每一个位点的基因编辑的发生，

其中在所述多个脱靶标志位点中没有任何一个发生基因编辑提示所述细胞疗法对所述个体的治疗效果。

本发明一方面提供了一种对源自某个体的基因修饰细胞产品进行质量监控的方法，包括：a)确定所述基因修饰细胞在多个脱靶标志位点中的每一个位点的基因编辑的发生，

其中在所述多个脱靶标志位点中没有任何一个发生基因编辑表明所述细胞产品适用于对该个体进行细胞治疗。

在一些实施方案中，所述方法包括向所述个体施用所述基因修饰细胞产品。

本发明一方面提供了一种判断是否需要向基因编辑细胞疗法个体施用干预疗法的方法，包括：a)向所述个体施用源自所述个体的基因修饰细胞群，其中所述基因修饰细胞是在靶位点经过基因编辑修饰的，

b)确定所述基因修饰细胞或其后代中在多个脱靶标志位点中的每一个位点的基因编辑的发生，

其中在所述多个脱靶标志位点中的任何一个发生基因编辑表明需要向基因编辑细胞疗法的所述个体施用干预疗法。

在上述方法的一些实施方案中，所述方法包括在施用所述基因修饰细胞前对所述基因修饰细胞进行所述确定步骤。在上述方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述个体施用所述基因修饰细胞。在上述方法的一些实施方案中，所述方法包括在施用所述基因修饰细胞后对所述基因修饰细胞的后代进行所述确定步骤。在上述方法的一些实施方案中，所述确定步骤在施用所述基因修饰细胞后至少约一个月，例如至少30天、40天、50天、60天进行。在上述方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述确定和评估步骤重复一次或多次，例如二次、三次、四次、五次或更多次。在上述方法的一些实施方案中，所述确定和评估步骤以约每月一次至约每年一次的频率重复，例如，以约每月、约每二个月、约每三个月、约每四个月、约每五个月、约每六个月、约每七个月、约每八个月、约每九个月、约每十个月、约每十一个月、约每十二个月的频率重复。

在上述方法的一些实施方案中，所述方法干预进一步包括在所述评估步骤后用干预疗法治疗所述个体。在上述方法的一些实施方案中，所述干预疗法是清除已施用的基因修饰细胞群，包括清髓和/或清淋巴治疗。在上述方法的一些实施方案中，所述干预疗法包括化疗、单克隆抗体疗法或全身放射。在上述方法的一些实施方案中，所述化疗包括向所述个体施用一种或多种选自下组的化学治疗剂：白消安，环磷酰胺和氟达拉滨。在上述方法的一些实施方案中，所述干预疗法是施用源自所述个体的第二基因修饰细胞群。

通过本申请的方法预测最有可能发生脱靶的位点，例如10-50个、10-45个、10-40个、10-35个、10-30个、10-25个、10-20个、10-15个脱靶标志位点，之后监测其脱靶反应的发生。若发生脱靶反应，确定该位点被编辑的比例是否在变化。如果明确某个位点有脱靶现象，但该位点被编辑的比例不变或下降，说明该位点确实有脱靶效应发生，但尚无导致细胞扩增(癌变)的风险。该情况可以不采取干预疗法。如果明确一个位点发生脱靶，且随着时间的推移(不断地检测)，发现该位点被编辑的比例在上升，那么提示该脱靶有导致细胞扩增(癌变)的风险。此时应考虑进行针对该癌变的干预疗法。例如施用治疗癌症的化疗剂。癌症治疗的各种化疗剂在本领域是已知的。

本申请还涉及一种用于评估基因修饰细胞群或其后代的脱靶编辑的试剂盒，其中所述基因修饰细胞是经过在靶位点基因编辑修饰的，该试剂盒包括：1)基因编辑系统的一个或多个组分，其用于产生所述基因修饰细胞；和b)多个用于扩增包含多个脱靶标志位点的核酸的引物组。

在上述方法和试剂盒的一些实施方案中，基因编辑的方法或系统选自ZFN，TALEN、CRISPR或其它基因编辑方法或系统。在一些实施方案中，基因编辑方法或系统为CRISPR基因编辑方法或系统。在一些实施方案中，所述靶位点为CD34阳性造血干细胞/祖细胞中的BCL11A基因位点。在上述方法和试剂盒的一些实施方案中，所述靶位点为BCL11A增强子基因的外显子2和外显子3之间的核苷酸位点(例如，位于或对应于如hg38中所记录的位置+55:Chr2:60497676-60498941；+58:Chr2:60494251-60495546；+62:Chr2:60490409-60491734处的位点)。所述靶位点例如BCL11A基因的外显子2和外显子3之间的核酸序列的+62区域、BCL11A基因的外显子2和外显子3之间的核酸序列的+58区域、或BCL11A基因的外显子2和外显子3之间的核酸序列的+55区域、如下核苷酸序列所示的核苷酸区域：ctgccagtcctcttctaccccacccacgcccccaccctaatcagaggccaaacccttcctggagcctgtgataaaagcaactgttagcttgcactagactagcttcaaagttgtattgaccctggtgtgttatgtctaagagtagatgcc)(SEQ ID NO:2)。在上述试剂盒的一些实施方案中，试剂盒包含靶向上述靶位点的sgRNA、或包含该sgRNA的核苷酸序列、或编码该sgRNA的核苷酸序列。

在一些实施方案中，上述试剂盒包含靶向SEQ ID NO:2所示序列的sgRNA、或包含该sgRNA的核苷酸序列、或编码该sgRNA的核苷酸序列。在一些实施方案中，上述试剂盒包含靶向人类第2号染色体第60495197位至第60495346位区域BCL11A基因的sgRNA、或包含该sgRNA的核苷酸序列、或编码该sgRNA的核苷酸序列。在一些实施方案中，上述试剂盒包含针对人造血干细胞中2号染色体第60495219位至第60495336位的BCL11A基因组区域的sgRNA、或包含该sgRNA的核苷酸序列、或编码该sgRNA的核苷酸序列，所述sgRNA的核苷酸序列选自SEQ ID No.3～SEQ ID No.25中的任一或多个序列。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含Cas蛋白(例如Cas9蛋白)、或编码该Cas蛋白(例如Cas9蛋白)的表达载体、或编码或表达Cas蛋白(例如Cas9蛋白)的核苷酸序列(例如mRNA序列)。在上述试剂盒的一些实施方案中，所述试剂盒包含如下所示的Cas9核酸序列：gacaagaagtacagcatcggcctggacatcggcaccaactctgtgggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgcccagcaagaaattcaaggtgctgggcaacaccgaccggcacagcatcaagaagaacctgatcggagccctgctgttcgacagcggcgaaacagccgaggccacccggctgaagagaaccgccagaagaagatacaccagacggaagaaccggatctgctatctgcaagagatcttcagcaacgagatggccaaggtggacgacagcttcttccacagactggaagagtccttcctggtggaagaggataagaagcacgagcggcaccccatcttcggcaacatcgtggacgaggtggcctaccacgagaagtaccccaccatctaccacctgagaaagaaactggtggacagcaccgacaaggccgacctgcggctgatctatctggccctggcccacatgatcaagttccggggccacttcctgatcgagggcgacctgaaccccgacaacagcgacgtggacaagctgttcatccagctggtgcagacctacaaccagctgttcgaggaaaaccccatcaacgccagcggcgtggacgccaaggccatcctgtctgccagactgagcaagagcagacggctggaaaatctgatcgcccagctgcccggcgagaagaagaatggcctgttcggcaacctgattgccctgagcctgggcctgacccccaacttcaagagcaacttcgacctggccgaggatgccaaactgcagctgagcaaggacacctacgacgacgacctggacaacctgctggcccagatcggcgaccagtacgccgacctgtttctggccgccaagaacctgtccgacgccatcctgctgagcgacatcctgagagtgaacaccgagatcaccaaggcccccctgagcgcctctatgatcaagagatacgacgagcaccaccaggacctgaccctgctgaaagctctcgtgcggcagcagctgcctgagaagtacaaagagattttcttcgaccagagcaagaacggctacgccggctacattgacggcggagccagccaggaagagttctacaagttcatcaagcccatcctggaaaagatggacggcaccgaggaactgctcgtgaagctgaacagagaggacctgctgcggaagcagcggaccttcgacaacggcagcatcccccaccagatccacctgggagagctgcacgccattctgcggcggcaggaagatttttacccattcctgaaggacaaccgggaaaagatcgagaagatcctgaccttccgcatcccctactacgtgggccctctggccaggggaaacagcagattcgcctggatgaccagaaagagcgaggaaaccatcaccccctggaacttcgaggaagtggtggacaagggcgcttccgcccagagcttcatcgagcggatgaccaacttcgataagaacctgcccaacgagaaggtgctgcccaagcacagcctgctgtacgagtacttcaccgtgtataacgagctgaccaaagtgaaatacgtgaccgagggaatgagaaagcccgccttcctgagcggcgagcagaaaaaggccatcgtggacctgctgttcaagaccaaccggaaagtgaccgtgaagcagctgaaagaggactacttcaagaaaatcgagtgcttcgactccgtggaaatctccggcgtggaagatcggttcaacgcctccctgggcacataccacgatctgctgaaaattatcaaggacaaggacttcctggacaatgaggaaaacgaggacattctggaagatatcgtgctgaccctgacactgtttgaggacagagagatgatcgaggaacggctgaaaacctatgcccacctgttcgacgacaaagtgatgaagcagctgaagcggcggagatacaccggctggggcaggctgagccggaagctgatcaacggcatccgggacaagcagtccggcaagacaatcctggatttcctgaagtccgacggcttcgccaacagaaacttcatgcagctgatccacgacgacagcctgacctttaaagaggacatccagaaagcccaggtgtccggccagggcgatagcctgcacgagcacattgccaatctggccggcagccccgccattaagaagggcatcctgcagacagtgaaggtggtggacgagctcgtgaaagtgatgggccggcacaagcccgagaacatcgtgatcgaaatggccagagagaaccagaccacccagaagggacagaagaacagccgcgagagaatgaagcggatcgaagagggcatcaaagagctgggcagccagatcctgaaagaacaccccgtggaaaacacccagctgcagaacgagaagctgtacctgtactacctgcagaatgggcgggatatgtacgtggaccaggaactggacatcaaccggctgtccgactacgatgtggaccatatcgtgcctcagagctttctgaaggacgactccatcgacaacaaggtgctgaccagaagcgacaagaaccggggcaagagcgacaacgtgccctccgaagaggtcgtgaagaagatgaagaactactggcggcagctgctgaacgccaagctgattacccagagaaagttcgacaatctgaccaaggccgagagaggcggcctgagcgaactggataaggccggcttcatcaagagacagctggtggaaacccggcagatcacaaagcacgtggcacagatcctggactcccggatgaacactaagtacgacgagaatgacaagctgatccgggaagtgaaagtgatcaccctgaagtccaagctggtgtccgatttccggaaggatttccagttttacaaagtgcgcgagatcaacaactaccaccacgcccacgacgcctacctgaacgccgtcgtgggaaccgccctgatcaaaaagtaccctaagctggaaagcgagttcgtgtacggcgactacaaggtgtacgacgtgcggaagatgatcgccaagagcgagcaggaaatcggcaaggctaccgccaagtacttcttctacagcaacatcatgaactttttcaagaccgagattaccctggccaacggcgagatccggaagcggcctctgatcgagacaaacggcgaaaccggggagatcgtgtgggataagggccgggattttgccaccgtgcggaaagtgctgagcatgccccaagtgaatatcgtgaaaaagaccgaggtgcagacaggcggcttcagcaaagagtctatcctgcccaagaggaacagcgataagctgatcgccagaaagaaggactgggaccctaagaagtacggcggcttcgacagccccaccgtggcctattctgtgctggtggtggccaaagtggaaaagggcaagtccaagaaactgaagagtgtgaaagagctgctggggatcaccatcatggaaagaagcagcttcgagaagaatcccatcgactttctggaagccaagggctacaaagaagtgaaaaaggacctgatcatcaagctgcctaagtactccctgttcgagctggaaaacggccggaagagaatgctggcctctgccggcgaactgcagaagggaaacgaactggccctgccctccaaatatgtgaacttcctgtacctggccagccactatgagaagctgaagggctcccccgaggataatgagcagaaacagctgtttgtggaacagcacaagcactacctggacgagatcatcgagcagatcagcgagttctccaagagagtgatcctggccgacgctaatctggacaaagtgctgtccgcctacaacaagcaccgggataagcccatcagagagcaggccgagaatatcatccacctgtttaccctgaccaatctgggagcccctgccgccttcaagtactttgacaccaccatcgaccggaagaggtacaccagcaccaaagaggtgctggacgccaccctgatccaccagagcatcaccggcctgtacgagacacggatcgacctgtctcagctgggaggcgac。(SEQ ID NO:1)。

在上述方法的一些实施方案中，将包含选自SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:25任一序列的sgRNA导入所述CD34阳性造血干细胞/祖细胞对BCL11A基因进行编辑，消除或减低BCL11A功能。在上述试剂盒的一些实施方案中，所述sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的。在上述试剂盒的一些实施方案中，所述化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。在上述试剂盒的一些实施方案中，将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述CD34阳性造血干细胞/祖细胞。

在上述试剂盒的一些实施方案中，所述试剂盒包含多个用于扩增包含多个脱靶标志位点的核酸的引物组。在上述试剂盒的一些实施方案中，所述引物组选自表3。序列顺序编号为SEQ ID NOs：26-117。

在上述方法和试剂盒的实施方案中，所述脱靶标志位点选自表2中的一个或多个。

以下结合具体实施例，进一步描述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

本申请涉及以下实施方案：

1.一种确定细胞疗法对个体的适合性的方法，其包括向所述个体施用源自所述个体的基因修饰细胞群，其中所述基因修饰细胞是在靶位点经过基因编辑修饰的，

所述方法包括以下步骤：

a)确定所述基因修饰细胞或其后代中在多个脱靶标志位点中的每一个位点的基因编辑的发生，

b)基于所述基因编辑的发生评估所述治疗的适合性，

其中在所述多个脱靶标志位点中没有任何一个发生基因编辑表明所述细胞疗法对所述个体是适合的。

2.实施方案1的方法，其中在施用所述基因修饰细胞前对所述基因修饰细胞进行所述确定步骤。

3.实施方案2的方法，其中所述方法进一步包括向所述个体施用所述基因修饰细胞。

4.实施方案1的方法，其中在施用所述基因修饰细胞后对所述基因修饰细胞的后代进行所述确定步骤。

5.实施方案4的方法，其中所述确定步骤在施用所述基因修饰细胞后至少约一个月进行，例如在施用所述基因修饰细胞后1个月、1.5个月、2个月、2.5个月进行。

6.实施方案4或5的方法，其进一步包括将所述确定和评估步骤重复一次或多次。

7.实施方案6的方法，其中所述确定和评估步骤以约每月一次至约每年一次的频率重复，例如，以约每月、约每二个月、约每三个月、约每四个月、约每五个月、约每六个月、约每七个月、约每八重复一次、约每九个月、约每十个月、约每十一个月、约每十二个月的频率重复。

8.实施方案7的方法，其中如果脱靶标志位点的序列变化小于0.1％，或脱靶标志位点的序列变化与未通过基因编辑修饰的对照细胞相比小于2倍，则以每3-12个月的频率重复所述确定和评估步骤(例如以约每三个月、约每四个月、约每五个月、约每六个月、约每七个月、约每八个月、约每九个月、约每十个月、约每十一个月、约每十二个月的频率重复)；如果脱靶标志位点的序列变化大于0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％，或脱靶标志位点的序列变化与未通过基因编辑修饰的对照细胞相比大于2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍，则随着序列变化频率的增加而增加所述确定和评估步骤重复的频率(例如从每三个月一次增加为每二个月一次或每月一次，或每半月一次)，以密切监控脱靶标志位点基因编辑的频率和癌变的风险。脱靶标志位点基因编辑的频率越大说明癌变的风险越大。在一些实施方案中，在监控脱靶标志位点基因编辑频率的同时，结合其他临床检查手段，监控癌变的发生，及时进行干预治疗。

9.实施方案5-8中任一项的方法，其中所述方法进一步包括在所述评估步骤后用干预疗法治疗所述个体，例如清髓和/或清淋巴治疗、化疗(例如向所述个体施用一种或多种选自下组的化学治疗剂：白消安，环磷酰胺和氟达拉滨)、单克隆抗体疗法或全身放射。

10.实施方案9的方法，其中所述干预疗法是清除向所述个体施用的源自所述个体的基因修饰细胞群。

11.实施方案9或10的方法，其中所述干预疗法包括施用源自所述个体的第二基因修饰细胞群(不同于已施用的基因修饰细胞群的基因修饰细胞群)。

12.实施方案1-11中任一项的方法，其中所述多个脱靶标志位点包含至少约10个脱靶标志位点。

13.实施方案1-12中任一项的方法，其中在脱靶标志位点有小于0.1％的序列变化，或与未通过基因编辑修饰的对照细胞相比在脱靶标志位点有小于2倍的序列变化，表明在所述脱靶标志位点没有发生基因编辑。

14.实施方案1-13中任一项的方法，其中所述确定步骤通过DNA测序进行。

15.实施方案14所述的方法，其中所述确定步骤包括：1)通过使用多个引物组扩增包含所述多个脱靶标志位点的核酸；和2)对扩增的核酸进行测序分析。

16.实施方案1-15中任一项的方法，其中所述体外试验方法包括以下任何一种或多种：BLESS，GUIDE-seq，HIGTS，Circle-seq，SITE-seq和Digenome-seq。

17.实施方案1-16中任一项的方法，其中所述体外试验方法在饱和条件下进行。

18.实施方案1-17中任一项的方法，其中所述饱和条件允许在所述靶位点90％以上的有效切割。

19.实施方案18所述的方法，其中所述饱和条件允许在所述靶位点100％的有效切割。

20.实施方案1-19中任一项的方法，其中所述基因修饰细胞通过CRISPR/Cas系统修饰。

21.实施方案1-20中任一项的方法，其中所述靶位点位于BCL11A基因座位。

22.实施方案21的方法，其中所述脱靶标志位点为表2所示位点中的一个或多个。

23.一种评估基因修饰细胞群或其后代中脱靶基因编辑的方法，其中所述基因修饰细胞是在靶位点经过基因编辑修饰的，所述方法包括确定在多个脱靶标志位点中的每一个位点的基因编辑的发生，其中通过以下方式获得所述多个脱靶标志位点：1)基于与所述靶位点的序列相似性鉴定第一多个脱靶标志位点；和/或2)使用体外试验方法鉴定第二多个脱靶标志位点，其中在脱靶标志位点有大于0.1％的序列变化，或与未通过基因编辑修饰的对照细胞相比在脱靶标志位点有大于2倍的序列变化，指示基因修饰细胞群或其后代中有脱靶基因编辑。

24.实施方案23的方法，其中所述确定步骤通过DNA测序进行。

25.实施方案24所述的方法，其中所述确定步骤包括：1)通过使用多个引物组扩增包含所述多个脱靶标志位点的核酸；和2)对扩增的核酸进行测序分析。26.一种在基因修饰细胞群中获得多个脱靶标志位点的方法，所述基因修饰细胞是在靶位点经过基因编辑修饰的，脱靶标志位点该方法包括：1)基于与所述靶位点的序列相似性鉴定第一多个脱靶标志位点；和2)使用体外试验方法鉴定第二多个脱靶标志位点。

27.实施方案23-26中任一项的方法，其中所述体外试验方法包括以下任何一种或多种：BLESS，GUIDE-seq，HIGTS，Circle-seq，SITE-seq和Digenome-seq。

28.实施方案23-27中任一项的方法，其中所述体外试验方法在饱和条件下进行。

29.实施方案28所述的方法，其中所述饱和条件允许在所述靶位点90％以上、例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上，或100％的有效切割。

30.实施方案23-29中任一项的方法，其中所述基因修饰细胞通过CRISPR/Cas系统修饰。

31.一种用于评估基因修饰细胞群或其后代的脱靶编辑的试剂盒，其中所述基因修饰细胞是经过在靶位点基因编辑修饰的，该试剂盒包括：1)基因编辑系统的一个或多个组分，其用于产生所述基因修饰细胞；和b)多个用于扩增包含多个脱靶标志位点的核酸的引物组。

32.实施方案31的试剂盒，其中所述多个脱靶标志位点通过以下方式获得：1)基于与所述靶位点的序列相似性鉴定第一多个脱靶标志位点；和/或2)使用体外试验方法鉴定第二多个脱靶标志位点。

33.实施方案31-32中任一项的试剂盒，其中所述基因编辑系统是CRISPR/Cas9系统。

34.实施方案31-33中任一项的试剂盒，其进一步包含一个或多个引物组，所述引物组用于扩增包含所述靶位点的核酸。

35.实施方案34的试剂盒，其中所述一个或多个引物组包含以下一个或多个：SEQID NOs：26-117。

另一方面，本申请涉及以下技术方案：

1.一种评估技术方案基因修饰细胞群或其后代中脱靶基因编辑的方法，其中所述基因修饰细胞是在靶位点经过基因编辑修饰的，所述方法包括确定在多个脱靶标志位点中的每一个位点的基因编辑的发生，其中通过以下方式获得所述多个脱靶标志位点：1)基于与所述靶位点的序列相似性鉴定第一多个脱靶标志位点；和/或2)使用体外试验方法鉴定第二多个脱靶标志位点，其中，在脱靶标志位点有大于0.1％的序列变化，或与未通过基因编辑修饰的对照细胞相比在脱靶标志位点有大于2倍的序列变化，指示基因修饰细胞群或其后代中有脱靶基因编辑。

2.技术方案1的方法，其中所述确定步骤通过DNA测序进行。

3.技术方案2所述的方法，其中所述确定步骤包括：1)通过使用多个引物组扩增包含所述多个脱靶标志位点的核酸；和2)对扩增的核酸进行测序分析。

4.技术方案1-3中任一项的方法，其中所述体外试验方法包括以下任何一种或多种：BLESS，GUIDE-seq，HIGTS，Circle-seq，SITE-seq和Digenome-seq。

5.技术方案1-4中任一项的方法，其中所述体外试验方法在饱和条件下进行。

6.技术方案5所述的方法，其中所述饱和条件允许在所述靶位点90％以上的有效切割。

7.技术方案1-6中任一项的方法，其中所述基因修饰细胞通过CRISPR/Cas系统修饰。

8.技术方案1-7中任一项的方法，其中所述靶位点位于BCL11A基因座位。

9.技术方案8的方法，其中所述脱靶标志位点为表2所示位点中的一个或多个。

10.一种在基因修饰细胞群中获得多个脱靶标志位点的方法，所述基因修饰细胞是在靶位点经过基因编辑修饰的，脱靶标志位点该方法包括：1)基于与所述靶位点的序列相似性鉴定第一多个脱靶标志位点；和2)使用体外试验方法鉴定第二多个脱靶标志位点。

11.技术方案10的方法，其中所述鉴定通过DNA测序进行。

12.技术方案11所述的方法，其中所述鉴定包括：1)通过使用多个引物组扩增包含所述多个脱靶标志位点的核酸；和2)对扩增的核酸进行测序分析。

13.技术方案10-12任一项的方法，其中所述体外试验方法包括以下任何一种或多种：BLESS，GUIDE-seq，HIGTS，Circle-seq，SITE-seq和Digenome-seq。

14.技术方案10-13中任一项的方法，其中所述体外试验方法在饱和条件下进行。

15.技术方案14所述的方法，其中所述饱和条件允许在所述靶位点90％以上的有效切割。

16.技术方案10-15中任一项的方法，其中所述基因修饰细胞通过CRISPR/Cas系统修饰。

17.一种用于评估基因修饰细胞群或其后代的脱靶编辑的试剂盒，其中所述基因修饰细胞是经过在靶位点基因编辑修饰的，该试剂盒包括：1)基因编辑系统的一个或多个组分，其用于产生所述基因修饰细胞；和b)多个用于扩增包含多个脱靶标志位点的核酸的引物组。

18.技术方案17的试剂盒，其中所述多个脱靶标志位点通过以下方式获得：1)基于与所述靶位点的序列相似性鉴定第一多个脱靶标志位点；和/或2)使用体外试验方法鉴定第二多个脱靶标志位点。

19.技术方案17-18中任一项的试剂盒，其中所述基因编辑系统是CRISPR/Cas9系统。

20.技术方案17-19中任一项的试剂盒，其进一步包含一个或多个引物组，所述引物组用于扩增包含所述靶位点的核酸。

21.技术方案20的试剂盒，其中所述一个或多个引物组包含以下一个或多个：SEQID NOs：26-117。

实施例

实施例1：确认靶向BCL11A增强子的sgRNA在整个人类基因组上完全匹配的位点仅有BCL11A基因的红系增强子靶位点

CRISPR/Cas9系统利用位于sgRNA上的20个碱基的结合区域序列针对BCL11A基因的红系增强子的特定靶点，将Cas9蛋白精准的向导该靶点位置进行基因修饰。

通过浏览器登录UCSC genome browser(https://genome.ucsc.edu/)。在网页右侧Our tools中，选择BLAT(rapidly align sequences to the genome)。BLAT工具能够在人类基因组中，找到所有与查询序列完全匹配的区域。确定所选基因组为人类基因组(版本GRCh38/hg38)，在检索框内，填入该sgRNA结合区域序列(CTAACAGTTGCTTTTATCAC,SEQ IDNO:5)，20个碱基。点击submit即可。

在UCSC进行检索后，返回。检索结果仅返回了第二染色体上唯一一个结果。即sgRNA在人类基因组上仅有一个完全匹配位点。该位置为该sgRNA靶位点，即针对BCL11A基因的红系增强子的特定靶点。确认该sgRNA在整个人类基因组上只有一个完全匹配的靶位点，即BCL11A基因的红系增强子的这个特定靶点。

实施例2：生物信息学预测分析基因编辑潜在脱靶位点的方法

sgRNA在与基因组DNA序列结合时有可能存在一定几率的错配，造成在非靶向位点的脱靶突变。从这个角度看，脱靶位点一定与sgRNA靶向序列有很高的相似性。因此在本研究中，我们首先选用了Cas-OFFinder(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)软件，通过全基因组比对与sgRNA靶位点相似的序列，寻找潜在的脱靶位点。

通过浏览器登录Cas-OFFinder(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)。在网页左侧PAM Type选项中，选择SpCas9 from Streptococcus pyogenes(酿脓链球菌来源SpCas9):5'-NGG-3'；Target Genome(靶标基因组)选项中选择Homo sapiens(GRCh38/hg38)–Human(智人(GRCh38/hg38)-人类)；在网页右侧填入sgRNA序列：CTAACAGTTGCTTTTATCAC，Mismatch Number(错配数)填入3，DNA/RNA Bulge Size(凸起大小)填入1。

结果返回后，首先排除掉同时存在3个Mismatch和bulge的序列。然后通过返回位点在染色体上的位置信息，去除掉同一个位点的重复项，最终得到该sgRNA在人类基因组上的潜在脱靶位点。

实施例3：Digenome-seq实验方法预测分析基因编辑潜在脱靶位点

基因组编辑过程中，Cas蛋白切割基因组DNA产生双链断裂(double strandbreak，DSB)，通过识别基因组双链断裂区域可鉴定Cas蛋白结合位置，进而可检测脱靶效应。基于此原理检测基因编辑的全基因组脱靶效应。

在详细了解多种基因编辑脱靶方法的特征后，对比了目前已经开展的基因编辑疗法的方案，本实施例选取了敏感度最高的Digenome-seq作为另一种独立方法，用来寻找sgRNA潜在的脱靶位点。

人类基因组DNA提取自K562细胞；针对BCL11A位点的引物合成自睿博兴科生物科技有限公司；sgRNA来自于美国Synthego公司；spCas9蛋白与缓冲液来自于NEB公司(M0386)。

从10^6个K562细胞中提取基因组，并利用引物首先扩增出该sgRNA靶向区域，作为切割的阳性对照。实验时，使用Cas9蛋白(NEB M0386)1ul，Cas9 buffer 3ul，sgRNA 1.5ul，水14.5ul配置Cas9切割体系2份，25摄氏度温浴10min使得Cas9与sgRNA结合。加入K562基因组，37摄氏度反应8小时。反应结束后，送至测序公司。数据分析依据文献进行(Kim D,BaeS,Park J,Kim E,Kim S,et al.2015.Digenome-seq:genome-wide profiling ofCRISPRCas9 off-target effects in human cells.Nat.Methods 12:237–43)。简单来说，解压测序文件fq.gz，得到sam文件；每个sam，分别按照染色体chr1-XY抽取sam，得出chr.sort.bam；对每个染色体对应的chr.sort.sam，计算每个对应的chr.vcf.txt；对每个染色体的vcf文件寻找垂直切割位点；根据提取到的序列，与sgRNAlib进行匹配，寻找造成切割的sgRNA；对每个垂直切割位点，候选的匹配sgRNA可能不唯一，依据PAM过滤掉一些不可能的sgRNA，列出最终的结果。

在本研究过程中，采用了最容易出现脱靶效应的实验条件，这与实际应用该系统，对造血干细胞进行基因编辑制备条件不同。在不同的条件下潜在脱靶位点并不一定会出现脱靶。通过此类极端条件探索得出所述sgRNA最有可能造成脱靶效应的位点。

Digenome-seq实验分析得到基因编辑潜在脱靶位点如表2所示。与实施例2中的方法预测的位点有重复位点3个。

表2：靶位点及脱靶标志位点信息

Bio-info表示经由生物信息学预测得到；

Digenome表示由Digenome-seq方法得到；Both表示两种方法同时得到。

其它五种预测方法，针对sgRNA预测其潜在的脱靶位点，这五种方法分别是：

BLESS：是将双链断裂的DNA末端用生物素连接，再用链酶亲和素(streptavidin)将其富集并测序和进行分析；

GUIDE-seq：是在DNA双链断裂区域插入dsODN(double-strandedoligodeoxynucleotide，单链寡脱氧核苷酸)来标记DSB并测序和进行分析；

HTGTS:通过将两个双链断裂区域进行连接，以易位(translocation)来标记并测序和进行分析；

Circle-seq:在体外将切割位点进行标记并测序和进行分析；和

SITE-seq:在体外将切割位点进行标记并测序和进行分析。

实施例4：构建针对sgRNA潜在脱靶的识别标志

将生物信息学预测方法与DiGenome-seq分析方法所得的序列合并，去除重复，得到该sgRNA潜在脱靶的识别标志。两种基因编辑潜在脱靶位点分析方法得到最有可能出现脱靶现象的潜在脱靶位点共计45个，如表2所示，可以组成一个特定的潜在脱靶的识别标志。

上述表2为靶向BCL11A增强子的某一个sgRNA潜在脱靶位点。

实施例5：针对潜在脱靶的识别标志，检测样品的脱靶频率

通过片段PCR，特定性的扩增出实施例4中建立的潜在脱靶的识别标志(45个潜在脱靶位点)，然后使用深度测序(NGS)的方式比较编辑组与对照未处理组(Mock)之间的靶位点(位于BCL11A增强子)以及潜在脱靶位点的基因编辑效率的信息，来确定这些潜在脱靶位点在利用该sgRNA生产治疗地中海贫血疾病工艺下是否发生了脱靶效应。对产品进行了验证。

首先合成了46对PCR引物(表2所示)，特异性地针对靶位点和45个潜在脱靶位点。引物合成自睿博兴科生物科技有限公司；Taq-Hifi DNA聚合酶购自于全是金生物科技有限公司(AP131)；NEBNext Ultra II建库试剂盒购自于NEB公司(E7103)；TruSeq Dual IndexSequencing Primer Box购自于Illumina公司(FC-121-1003)。实验使用的造血干细胞来自于健康供者。同一供者来源未经处理的细胞为对照组。

表3：

合成引物，控制扩增片段长度在200-250bp之间，且潜在脱靶区域在中间位置。使用基因编辑前的造血干细胞的样品作为对照，生产完成后的样品作为实验组，分别提取基因组进行扩增。每个扩增反应中，含100ng基因组DNA(15000个细胞)。得到的扩增产物以NEBNext Ultra II试剂盒进行PCR-free方式构建扩增子文库，以Illumina HiSeq X-ten测序仪按照PE150方式进行测序，下机数据以Fastp过滤低质量和包含接头数据，所得到的clean data以Vsearch进行双端数据拼接，所得高质量序列以blastn局部比对方式分别与原始目的序列和sgRNA-PAM序列进行比对，后续分析以与目标序列一致性在40％以上，且完整sgRNA-PAM区域不包含任何indel序列作为非编辑序列、sgRNA-PAM不完整为编辑序列的方式计算编辑效率。NGS本身的检测精度下限为0.1％。由于测序错误的存在，且不同位点测序错误程度不同，脱靶位点定义为：编辑组位点编辑效率超过0.1％，且与对照组有显著差别(基因编辑效率超过对照组的2倍)。

经深度测序分析后，45个潜在脱靶位点与靶位点基因编辑效率如图1所示。

在实施例5中，我们使用了PCR特异性片段扩增结合深度测序的方法在编辑组和对照组上，使用特别建立的针对该sgRNA潜在脱靶的识别标志，对产品里的潜在脱靶效应进行了检测。在靶位点上，编辑组测试出了74.39％的特定基因编辑效率，远高于Mock组的0.05％。在45个潜在脱靶位点上，编辑组基因编辑效率和Mock组无显著差异，而且绝大部分效率均在NGS本身的检测精度下限(0.1％)左右或以下，这些数据说明该sgRNA有很好的基因编辑特异性，脱靶效应已降至最低，低于NGS本身的检测精度下限。

序列表

<110> 博雅辑因（北京）生物科技有限公司

<120> 基于脱靶评估评价基因编辑治疗的方法

<130> PD01185-FD00277PCT

<150> 2019108307557

<151> 2019-09-04

<160> 163

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4101

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cas9核酸序列

<400> 1

gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc 60

accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 120

agcatcaaga agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc 180

acccggctga agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat 240

ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg 300

gaagagtcct tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 360

atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa 420

ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg 480

atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 540

gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc 600

aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg 660

ctggaaaatc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggcaacctg 720

attgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat 780

gccaaactgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 840

atcggcgacc agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 900

ctgagcgaca tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg 960

atcaagagat acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag 1020

cagctgcctg agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1080

tacattgacg gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa 1140

aagatggacg gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag 1200

cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc 1260

attctgcggc ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag 1320

aagatcctga ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga 1380

ttcgcctgga tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg 1440

gtggacaagg gcgcttccgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac 1500

ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat 1560

aacgagctga ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc 1620

ggcgagcaga aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg 1680

aagcagctga aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc 1740

ggcgtggaag atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc 1800

aaggacaagg acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg 1860

accctgacac tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac 1920

ctgttcgacg acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg 1980

ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat 2040

ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2100

ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac 2160

gagcacattg ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg 2220

aaggtggtgg acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2280

gaaatggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg 2340

aagcggatcg aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg 2400

gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat 2460

atgtacgtgg accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc 2520

gtgcctcaga gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac 2580

aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac 2640

tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc 2700

aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg 2760

gtggaaaccc ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact 2820

aagtacgacg agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag 2880

ctggtgtccg atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac 2940

caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac 3000

cctaagctgg aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3060

atcgccaaga gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac 3120

atcatgaact ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct 3180

ctgatcgaga caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc 3240

accgtgcgga aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag 3300

acaggcggct tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc 3360

agaaagaagg actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat 3420

tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa 3480

gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt 3540

ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac 3600

tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag 3660

aagggaaacg aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3720

tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 3780

cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc 3840

ctggccgacg ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc 3900

atcagagagc aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct 3960

gccgccttca agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag 4020

gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac 4080

ctgtctcagc tgggaggcga c 4101

<210> 2

<211> 150

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL11A基因58K位点150bp序列

<400> 2

ctgccagtcc tcttctaccc cacccacgcc cccaccctaa tcagaggcca aacccttcct 60

ggagcctgtg ataaaagcaa ctgttagctt gcactagact agcttcaaag ttgtattgac 120

cctggtgtgt tatgtctaag agtagatgcc 150

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL11A增强子sgRNA与靶位点互补的序列

<400> 3

cacaggctcc aggaagggtt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL11A增强子sgRNA与靶位点互补的序列

<400> 4

atcagaggcc aaacccttcc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL11A增强子sgRNA与靶位点互补的序列

<400> 5

ctaacagttg cttttatcac 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL11A增强子sgRNA与靶位点互补的序列

<400> 6

ttgcttttat cacaggctcc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL11A增强子sgRNA与靶位点互补的序列

<400> 7

ttttatcaca ggctccagga 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL11A增强子sgRNA与靶位点互补的序列

<400> 8

tttatcacag gctccaggaa 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL11A增强子sgRNA与靶位点互补的序列

<400> 9

tgggtggggt agaagaggac 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL11A增强子sgRNA与靶位点互补的序列

<400> 10

gggcgtgggt ggggtagaag 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL11A增强子sgRNA与靶位点互补的序列

<400> 11

ttagggtggg ggcgtgggtg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL11A增强子sgRNA与靶位点互补的序列

<400> 12

attagggtgg gggcgtgggt 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL11A增强子sgRNA与靶位点互补的序列

<400> 13

gattagggtg ggggcgtggg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL11A增强子sgRNA与靶位点互补的序列

<400> 14

tctgattagg gtgggggcgt 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL11A增强子sgRNA与靶位点互补的序列

<400> 15

ctctgattag ggtgggggcg 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL11A增强子sgRNA与靶位点互补的序列

<400> 16

cacgccccca ccctaatcag 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL11A增强子sgRNA与靶位点互补的序列

<400> 17

ttggcctctg attagggtgg 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL11A增强子sgRNA与靶位点互补的序列

<400> 18

tttggcctct gattagggtg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL11A增强子sgRNA与靶位点互补的序列

<400> 19

gtttggcctc tgattagggt 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL11A增强子sgRNA与靶位点互补的序列

<400> 20

ggtttggcct ctgattaggg 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL11A增强子sgRNA与靶位点互补的序列

<400> 21

aagggtttgg cctctgatta 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL11A增强子sgRNA与靶位点互补的序列

<400> 22

gaagggtttg gcctctgatt 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL11A增强子sgRNA与靶位点互补的序列

<400> 23

actcttagac ataacacacc 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL11A增强子sgRNA与靶位点互补的序列

<400> 24

cttcaaagtt gtattgaccc 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BCL11A增强子sgRNA与靶位点互补的序列

<400> 25

ctcttagaca taacacacca 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 26

cacacggcat ggcatacaaa 20

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 27

tgaagctagt ctagtgcaag ct 22

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 28

acctgactga tggcctaacg 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 29

gccatcccca agctaggttt 20

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 30

tgtgattcct tccttccctt tt 22

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 31

acctaataca tttcttgtcc agtga 25

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 32

gctatcttgc gccaccatct 20

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 33

tgtactctgc tctccttcac atc 23

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 34

cattctccgg gagcaagcat 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 35

ggctggcctg aagtccattt 20

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 36

aaacactgta ggggtagaga agt 23

<210> 37

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 37

aaagccactg tgacaaatac gt 22

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 38

acacccaatc acggtcttgt 20

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 39

actcttaccc caaaccaatc tcta 24

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 40

cgatccagct ccaccactta 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 41

cctggtctct tggcgttgtt 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 42

tctggaaaca ccctgttgca 20

<210> 43

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 43

cgcattacac ccctttactg cta 23

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 44

ccagctcatg gttgcaactg 20

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 45

tgcacagtga aaaccgctca a 21

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 46

cttctacgct gcctcttgct 20

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 47

actaccgatg gcagctatag c 21

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 48

ccattcaggg gcaggttgat 20

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 49

cccacaaaac caacggaaca 20

<210> 50

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 50

agctgctttt acacaggtga agt 23

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 51

agtgtctgcc tcctattgct 20

<210> 52

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 52

cactggcctg gcaactttat g 21

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 53

ctactcgtca ctggctctga 20

<210> 54

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 54

agtcccctca ttctttcagt tttca 25

<210> 55

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 55

aactcaagga agagatcagt tgga 24

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 56

gcgcccggct caacatatta 20

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 57

ctccttcctc ctcgcagtgt 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 58

gcattccagc ctaggcaaca 20

<210> 59

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 59

ggaacggtca attctcaaaa gga 23

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 60

gcaatgagcc tcaccttcca 20

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 61

aaccgatcag ctgggtatgt 20

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 62

ggaacgctgc ctggagaaat 20

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 63

cccacagcac agcagaaatt 20

<210> 64

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 64

tcttctgctc catcccacct t 21

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 65

gcatgagctt tgccaccaaa 20

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 66

gcacaacgta gcgcaaatct 20

<210> 67

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 67

gggcctgttc ttcaagacca a 21

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 68

gcctgccctg catttttcaa 20

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 69

aaggggacaa gtgctatgca 20

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 70

gctgcaggca aatggagttg 20

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 71

catgggagga gccttagcaa 20

<210> 72

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 72

agggagtagc aagtctggtc tt 22

<210> 73

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 73

agtgattacc tgcccctcct a 21

<210> 74

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 74

caccacgcct ggctcattta 20

<210> 75

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 75

tttcctgtca aaaaccaact gttagg 26

<210> 76

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 76

agcatacagt aggaagtcca caa 23

<210> 77

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 77

gttggtccct gtgatgaaag c 21

<210> 78

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 78

gcatctccct ggtgacgaaa 20

<210> 79

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 79

ccagtggctg tgggattact 20

<210> 80

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 80

tctcctccga atggcctcat 20

<210> 81

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 81

tgatagaggc cacagctgaa g 21

<210> 82

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 82

ggacgatgcc tggagtctct 20

<210> 83

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 83

tgtctcaggg acttaccaac ttg 23

<210> 84

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 84

acacagtggc ttgttctcga t 21

<210> 85

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 85

tgctttctga ctccactttt gt 22

<210> 86

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 86

ggggtgggac gcattgttt 19

<210> 87

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 87

tcacccaggg tcacaggata 20

<210> 88

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 88

tccattgaca gacacttcag ttgt 24

<210> 89

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 89

tggtgcagcc tctgtgaaaa 20

<210> 90

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 90

agtgtcatgg ggcttttgtc t 21

<210> 91

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 91

acttccacgc tcctcctgat 20

<210> 92

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 92

tcctttgttt ctgtttgtgt gtgt 24

<210> 93

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 93

tgctggggga aaaacatcca 20

<210> 94

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 94

ctcaggctgc agcagaaatg 20

<210> 95

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 95

agggagctgt taggtgcttt 20

<210> 96

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 96

atggctgccg tttgctctat 20

<210> 97

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 97

tggtgaagcc cctatgacaa c 21

<210> 98

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 98

gcaccgtgca tcaaaattca 20

<210> 99

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 99

tggagacatt aatacctcac agtgt 25

<210> 100

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 100

cccaccgaaa caaacaatgt ca 22

<210> 101

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 101

ctgcttgttt tcttcccctt ca 22

<210> 102

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 102

ttgtgtccca gagctcactg t 21

<210> 103

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 103

aaaatgcctc gcacctggta 20

<210> 104

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 104

tgcttttatc ccaggcctcc ta 22

<210> 105

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 105

tgcactccat cctggtgaca 20

<210> 106

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 106

acaccatgcc acaccatgaa 20

<210> 107

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 107

tggtccccct ggaaatgga 19

<210> 108

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 108

gcaacagcta cggaggactt 20

<210> 109

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 109

aggcagccct tcatagagtt 20

<210> 110

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 110

gccagatgcc ctccaaagag 20

<210> 111

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 111

aggtcattta cagagcaggc aat 23

<210> 112

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 112

tggatttcta gtgagagctg ttga 24

<210> 113

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 113

cagttgtttt atcactggac aagaa 25

<210> 114

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 114

actcctccaa ccccatcatc t 21

<210> 115

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 115

tgggacatcg gaacagcttt 20

<210> 116

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 116

cacttagtga accgcaaaca ca 22

<210> 117

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 测序引物

<400> 117

gcactgcaca cttttcagac a 21

<210> 118

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶位点序列

<400> 118

ctaacagttg cttttatcac agg 23

<210> 119

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 119

ctaacagttg ctttagcact gg 22

<210> 120

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 120

ctaccagttg ttttatcact gg 22

<210> 121

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 121

ctaaagttgc ttttaacaca gg 22

<210> 122

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 122

ctaactattg cttttatcag cagg 24

<210> 123

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 123

gtaacagttg cttttgtcac cagg 24

<210> 124

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 124

ccaaagttgc ctttatcaca gg 22

<210> 125

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 125

ctaacagttt ctgtttcaca gg 22

<210> 126

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 126

ctagaagttg ctttttcaca gg 22

<210> 127

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 127

ctaatattgc ttttttcaca gg 22

<210> 128

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 128

caaacagttg ctctttcact gg 22

<210> 129

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 129

ctaacagttg ttttatgtct gg 22

<210> 130

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 130

gtaacagctg cttttacaca gg 22

<210> 131

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 131

caaacatcgc ttttatcacg gg 22

<210> 132

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 132

cttacagttt cttttataca gg 22

<210> 133

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 133

ctgacagttg ctgtatcact gg 22

<210> 134

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 134

ctaatagttc tttgatcact gg 22

<210> 135

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 135

ctgacagttg cttttactct gg 22

<210> 136

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 136

ctaacattgc ttatatctca gg 22

<210> 137

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 137

ctaacaatgc tttcatcacg gg 22

<210> 138

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 138

ctagctgttg cttttatact gg 22

<210> 139

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 139

ctaacagttc ctttatccct gg 22

<210> 140

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 140

ctagcagttg cttttccaca gg 22

<210> 141

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 141

ctacagttgc tattctcaca gg 22

<210> 142

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 142

ctaacagttg gtttttgaca gg 22

<210> 143

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 143

ctaacactgc tttcatcaca gg 22

<210> 144

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 144

ctaacagtgg ctttgacact gg 22

<210> 145

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 145

ctaacagttc ctgttatccc gg 22

<210> 146

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 146

ttaacagttg ttttatcaat gg 22

<210> 147

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 147

gtaacagttg cttgttcact gg 22

<210> 148

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 148

ctagaagttg cttttatcca gg 22

<210> 149

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 149

ctaacgttgc tatgatcact gg 22

<210> 150

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 150

ctgtcagttg ctttatcact gg 22

<210> 151

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 151

ttcacattgc ttttatcact gg 22

<210> 152

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 152

ccaacagttg cttttctctc tgg 23

<210> 153

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 153

ctaacagtta cttttattcc tgg 23

<210> 154

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 154

ctaacaattg gttttataac agg 23

<210> 155

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 155

ctaacatttg attttaacac tgg 23

<210> 156

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 156

ctaacagctg cttttatcct ggg 23

<210> 157

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 157

ctaacatctg cttttatccc agg 23

<210> 158

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 158

attacagctg catttatcac agg 23

<210> 159

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 159

gagacagtag cttttataac agg 23

<210> 160

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 160

caatcagctg ctcttataac tgg 23

<210> 161

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 161

tctaccagtt gttttatcac tgg 23

<210> 162

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 162

agcacagttg gtttttataa cag 23

<210> 163

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脱靶标志位点序列

<400> 163

agcatagttg ctttttatca cag 23

Claims (10)

1.一种确定细胞疗法对个体的适合性的方法，其包括向所述个体施用源自所述个体的基因修饰细胞群，其中所述基因修饰细胞是在靶位点经过基因编辑修饰的，

所述方法包括以下步骤：

a)确定所述基因修饰细胞或其后代中在多个脱靶标志位点中的每一个位点的基因编辑的发生，

b)基于所述基因编辑的发生评估所述治疗的适合性，

其中在所述多个脱靶标志位点中没有任何一个发生基因编辑表明所述细胞疗法对所述个体是适合的。

2.权利要求1的方法，其中在施用所述基因修饰细胞前对所述基因修饰细胞进行所述确定步骤。

3.权利要求2的方法，其中所述方法进一步包括向所述个体施用所述基因修饰细胞。

4.权利要求1的方法，其中在施用所述基因修饰细胞后对所述基因修饰细胞的后代进行所述确定步骤。

5.权利要求4的方法，其中所述确定步骤在施用所述基因修饰细胞后至少约一个月进行。

6.权利要求4或5的方法，其进一步包括将所述确定和评估步骤重复一次或多次。

7.权利要求6的方法，其中所述确定和评估步骤以约每月一次至约每年一次的频率重复。

8.一种评估基因修饰细胞群或其后代中脱靶基因编辑的方法，其中所述基因修饰细胞是在靶位点经过基因编辑修饰的，所述方法包括确定在多个脱靶标志位点中的每一个位点的基因编辑的发生，其中通过以下方式获得所述多个脱靶标志位点：1)基于与所述靶位点的序列相似性鉴定第一多个脱靶标志位点；和/或2)使用体外试验方法鉴定第二多个脱靶标志位点，其中在脱靶标志位点有大于0.1％的序列变化，或与未通过基因编辑修饰的对照细胞相比在脱靶标志位点有大于2倍的序列变化，指示基因修饰细胞群或其后代中有脱靶基因编辑。

9.一种在基因修饰细胞群中获得多个脱靶标志位点的方法，所述基因修饰细胞是在靶位点经过基因编辑修饰的，脱靶标志位点该方法包括：1)基于与所述靶位点的序列相似性鉴定第一多个脱靶标志位点；和2)使用体外试验方法鉴定第二多个脱靶标志位点。

10.一种用于评估基因修饰细胞群或其后代的脱靶编辑的试剂盒，其中所述基因修饰细胞是经过在靶位点基因编辑修饰的，该试剂盒包括：1)基因编辑系统的一个或多个组分，其用于产生所述基因修饰细胞；和b)多个用于扩增包含多个脱靶标志位点的核酸的引物组。

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