CN111378740A - circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法 - Google Patents
circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111378740A CN111378740A CN201911112185.4A CN201911112185A CN111378740A CN 111378740 A CN111378740 A CN 111378740A CN 201911112185 A CN201911112185 A CN 201911112185A CN 111378740 A CN111378740 A CN 111378740A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- circrna
- systemic lupus
- lupus erythematosus
- sle
- detecting
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 title claims abstract description 104
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 230000003902 lesion Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 44
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims abstract description 43
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 28
- 238000011160 research Methods 0.000 claims abstract description 24
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims abstract description 15
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 26
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims description 22
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 21
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 17
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 17
- 108091050874 miR-19a stem-loop Proteins 0.000 claims description 15
- 108091090860 miR-150 stem-loop Proteins 0.000 claims description 13
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims description 12
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims description 12
- 101150084233 ago2 gene Proteins 0.000 claims description 12
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 11
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 10
- 230000009390 immune abnormality Effects 0.000 claims description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 9
- 108091046841 MiR-150 Proteins 0.000 claims description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 8
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 claims description 7
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 claims description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 6
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 6
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 6
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 6
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 claims description 6
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 5
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 claims description 5
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 claims description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims description 5
- 230000009125 negative feedback regulation Effects 0.000 claims description 5
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 claims description 5
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 4
- 108700011325 Modifier Genes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 4
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 claims description 3
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 claims description 3
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Natural products C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims description 3
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 claims description 3
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 3
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 claims description 3
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 claims description 3
- -1 methyl guanosine Chemical compound 0.000 claims description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 3
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 claims description 3
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 claims description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 claims description 2
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 claims 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 abstract description 2
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 20
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- 230000009266 disease activity Effects 0.000 description 9
- 108091028075 Circular RNA Proteins 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 108090000638 Ribonuclease R Proteins 0.000 description 6
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 6
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 4
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000006607 hypermethylation Effects 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 101710159080 Aconitate hydratase A Proteins 0.000 description 2
- 101710159078 Aconitate hydratase B Proteins 0.000 description 2
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101710105008 RNA-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 206010062237 Renal impairment Diseases 0.000 description 2
- 102000007150 Tumor Necrosis Factor alpha-Induced Protein 3 Human genes 0.000 description 2
- 108010047933 Tumor Necrosis Factor alpha-Induced Protein 3 Proteins 0.000 description 2
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 2
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 208000018631 connective tissue disease Diseases 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000005977 kidney dysfunction Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 2
- 230000005976 liver dysfunction Effects 0.000 description 2
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000008816 organ damage Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 206010000117 Abnormal behaviour Diseases 0.000 description 1
- 102000008682 Argonaute Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010088141 Argonaute Proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 208000028523 Hereditary Complement Deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009194 climbing Effects 0.000 description 1
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 201000002388 complement deficiency Diseases 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 230000002074 deregulated effect Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 208000029824 high grade glioma Diseases 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000003468 luciferase reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 201000011614 malignant glioma Diseases 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Evolutionary Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于免疫和分子生物检测技术领域，公开了一种circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法，收集外周血单个核细胞PBMCs标本，通过RNA‑seq测序技术，对基因表达进行检测分析；挑选出20个存在显著性差异的基因；基于circRNA参与转录后调控，对候选基因进行匹配分析，筛选出存在靶向结合的miRNA；通过对靶向结合的miRNA归纳总结，筛选出SLE当中具有代表性研究价值的miRNA。在细胞和分子水平进一步深入探讨淋巴细胞免疫平衡异常调控SLE发病中的作用方式和分子机制；解析circRNA调控表达的方式和作用靶点，明确其介导的信号通路并确认circRNA发挥功能效应的分子途径。
Description
技术领域
本发明属于免疫和分子生物检测技术领域，尤其涉及一种circRNA在系统 性红斑狼疮病变免疫异常检测方法。
背景技术
目前，最接近的现有技术：长期以来，抗dsDNA抗体、补体活性和免疫复 合物等免疫学检测一直是SLE疾病活动性的经典技术标志。但是主要障碍是1. 相关的基因及表达产物同时与其他自身免疫病相关，特异性不高；2.SLE发病早 期机体变化微小，病变产生的相关蛋白量很少，甚至无法出现；3个体之间存在 较大差异。本技术从病因遗传因素出发结合RNA-seq高通量检测手段寻找发病 特异性基因变量，并且探索了基因级联或相互作用启动疾病发生的方式。
系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus，SLE)是一种临床表现多样、病情变化快的典型的自身免疫性疾病，以自身抗体产生、免疫复合物沉积、多器 官功能损害为主要特征。SLE缺乏有效治疗手段，常可导致患者死亡。因为目 前缺乏有效的诊断标志物和治疗标志物。所以研究SLE生物标志物，无论对于 早期诊断、病情活动监测、器官损害的可能性和损害程度的评估以及发现新的 治疗靶点均至关重要。
近年来，随着免疫学和分子生物学技术的不断发展，与SLE相关的新的发 病机制和抗体相继被发现。系统性红斑狼疮的管理对于临床医师来说仍是挑战， 关于该病的发病机制：系统性红斑狼疮(SLE)是一种典型的自身免疫性疾病， 其发病原因不清，发病机制也尚未明确。一般认为是多因素的：受遗传因素和 环境的影响，补体缺陷、B细胞和T细胞行为异常、细胞因子作用异常、细胞 凋亡异常等。诊断标志物和治疗标志物等仍有待澄清。进一步导致的技术问题: 很难从根本上找到调控疾病发生的靶点且操作难，可控性差等。
circularRNA(circRNA)叫做环形RNA，是一种新的内源性非编码RNA，作 为RNA家族的新成员成为研究热点。不具有5’帽子结构和3’尾巴结构，circRNA 是闭合的环状结构，没有5’-3’极性和聚核苷酸的尾巴结构。在包括肿瘤在内的 多种疾病的研究中，发现其与疾病的潜在关联，并在其中发挥重要的调控作用， 有巨大的潜力成为新型的临床诊疗靶标。随着RNA测序技术和生物信息学的发 展，显示在哺乳动物细胞中存在大量circRNA，其表达丰富、成内源性、结构保 守且稳定。circRNA最主要的功能研究是参与转录后调控，类似于一个内源性 RNA或miRNA的海绵，可以竞争性的抑制RNA/miRNA的转录调控。此外，circRNA还可以通过抑制转录起始位点调节可变剪切或转录。而且，circRNA还 可以调节其亲本基因的表达。circRNA是RNA家族中有一个值得关注的热点， 尽管目前人们对其了解还很浅，距离阐明其机制还相当遥远，但是其通过参与 转录调控，丰富了人们的认知。其时空特异性和稳定性使其能够成为良好的生 物标志物；而其与疾病的关联，可望成为潜在的临床诊疗标志物，具有巨大的 应用前景。
综上所述，现有技术存在的问题是：现有的系统性红斑狼疮的发病机制、 诊断标志物和治疗标志物等不清楚。
解决上述技术问题的难度：很难从根本上找到调控疾病发生的靶点且操作 难，变量可控性差等。
解决上述技术问题的意义：可以从基因水平，细胞水平等角度研究探索疾 病诱因，进而找到可以特异、稳定、便捷、直观的检测标志物。降低不可控变 量带来的影响，为探索复杂疾病诱发提供方向。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种circRNA在系统性红斑狼疮 病变免疫异常检测方法。
本发明是这样实现的，一种circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测 方法，所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法包括以下步骤：
第一步，收集外周血单个核细胞PBMCs标本，将样本通过RNA-seq测序 技术，从全基因表达谱的角度对基因表达情况进行了全方位的检测分析。
第二步，挑选出20个存在显著性差异的基因，上调10个，下调10个。
第三步，基于circRNA参与转录后调控，使用circmiR1.0软件对候选基因 进行匹配分析，将所有存在靶向结合的miRNA挑选出来。
第四步，通过对靶向结合的miRNA归纳总结，结合文献报道筛选出SLE 当中具有代表的miRNA。
第五步，验证circRNA吸附miRNA调控下游靶基因和信号通路的表型影响。
第六步，分别从circRNA吸附miRNA结合的蛋白复合物互作及调控的转录 因子角度对上述靶基因和信号通路进行机制研究。
进一步，所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法收集外周 血PBMCs提取RNA，使用RNaseR处理排除线性RNA干扰，逆转录cDNA,qPCR 检测circRNAs表达，并对产物进行sanger sequencing验证。
进一步，所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法收集外周 血PBMCs，进行培养，细胞爬片，然后利用设计好的探针进行FISH验证确定 其亚细胞定位；
进一步，所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法FISH及荧 光素酶活性分析circLOC101928570可作为miRNAs的海绵通过对靶向结合的 miRNA进行归纳总结，并筛选出SLE当中具有代表的miRNA；然后通过FISH 及荧光报告实验进行后续互作；通过软件比对分析显示circGARS与mir-19a-5p 可能存在结合，进行FISH验证；
circGARS与mir-19a-5p两者共定位于细胞质，结合前期生信分析SLE发病 相关信号通路，初步得出circGARS潜在信号轴即为：circGARS通过吸附 miR-19a-5p调节泛素-编辑酶A20负反馈调节激活NFKB通路介导SLE免疫炎 症反应；
circGARS与Ago2存在潜在结合：通过RIP-qPCR实验验证circGARS与 Ago2存在结合。
进一步，所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法利用3D计 算机circGARS与Ago2的帽子结构m7GPPPN存在结合，帽子结构是指在真核 生物中转录后修饰形成的成熟mRNA在5'端的一个特殊结构，即m7GPPPN结 构，又称为甲基鸟苷帽子；mRNA5’-端帽子结构是mRNA翻译起始的必要结构， 对核糖体对mRNA的识别提供了信号，协助核糖体与mRNA结合，使翻译从 AUG开始。
进一步，所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法circGARS 通过吸附miR-19a-5p调节泛素-编辑酶A20负反馈调节激活NFKB通路介导SLE 免疫炎症反应。
进一步，所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法基于3D计 算机模拟模型，利用生物素标记体外合成修饰基因circGARS表达结合RNA pulldown研究结合蛋白Ago2组成的三元复合物对靶基因A20转录表达； circLOC101928570靶向miR-150的两个成熟体miR-150-3p/5p，而前期查阅文献 文献miR-150在SLE患者T淋巴细胞中是高表达的；
通过转录因子预测软件对转录因子MYB靶基因预测发现在CD4+T细胞亚 群Th1和Th2中IL2受体基因具有较高的靶向结合性找出IL2启动子和转录因 子MYB结合区域，及circLOC101928570转录核心区域存在的CPG岛。
本发明的另一目的在于提供一种所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫 异常检测方法在临床诊疗标志物中的应用：环状RNA在肿瘤等领域的研究非常 热门，已有研究表明circRNA与白血病恶性胶质瘤胃癌肝癌等疾病的发生发展 密切关联，由于环状RNA对核酸酶不敏感，所以比线性RNA更为稳定，这使 得环状RNA在作为新型临床诊断标记物的开发应用上具有明显优势。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：SLE生物标志物对于早期诊断、 病情活动监测、器官损害的可能性和损害程度的评估以及发现新的治疗靶点均 至关重要。环状RNA具有时空特异性和稳定性使其能够成为良好的生物标志物。 为搜寻SLE相关分子靶标并评估其作为预测SLE发生发展的潜在分子标志物的 可能性，通过RNA-seq从全基因表达谱的角度对可能构成SLE发生发展因素的 差异表达环状RNA分子进行筛选验证且结果一致。本发明进一步研究circRNA 参与SLE发病机制的临床相关性和诊疗价值。同时，在细胞和分子水平进一步 深入探讨其在淋巴细胞免疫平衡异常调控SLE发病中的作用方式和分子机制；解析circRNA调控表达的方式和作用靶点，明确其介导的信号通路并确认 circRNA发挥功能效应的分子途径。
本发明为搜寻SLE相关circRNA分子靶标并评估其作为预测SLE发生发展 的潜在分子标志物的可能性，在临床上收集了4例典型患者和3例健康人外周 血单个核细胞PBMCs标本，将样本通过RNA-seq测序技术，从全基因表达谱 的角度对这两者基因表达情况进行了全方位的检测分析。挑选出20个存在显著 性差异的基因(上调10个，下调10个，这些分子可能构成了SLE发生发展的 分子因素)。基于circRNA参与转录后调控，其类似于一个内源性RNA或miRNA 的海绵，可以竞争性的抑制RNA/miRNA的转录调控这样一种模式，首先使用circmiR1.0软件(该软件整合了常用软件TargetScan，Miranda等的功能)对候 选基因进行匹配分析，将所有存在靶向结合的miRNA挑选出来，通过前期对靶 向结合的miRNA进行归纳总结，并通过搜素查阅文献的方式筛选出SLE当中 具有典型研究代表的miRNA，然后借助公司平台结合其下游靶基因的关联性挑 选具有潜在研究价值的三个分子进一步确认测序的结果，在20例SLE患者和3 例健康人PBMCs样本中提取RNA，通过使用RNaseR处理用qPCR检测的方法 进行了验证，确认所选分子与测序结果一致，这是一种特异性的表达改变。
附图说明
图1是本发明实施例提供的circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测 方法流程图。
图2是本发明实施例提供的circGARS示意图。
图3是本发明实施例提供的circLOC101928570示意图。
图4是本发明实施例提供的定量和半定量两种方法初证：circGARS在20 例SLE相较3例健康人PBMC中表达上调示意图。
图5是本发明实施例提供的定量和半定量两种方法初证：circLOC101928570 在20例SLE相较3例健康人PBMCs中表达下调示意图。
图6是本发明实施例提供的定量和半定量两种方法初证：circADCY9在20 例SLE相较3例健康人PBMCs中表达上调示意图。
图7是本发明实施例提供的6例SLE VS3例HC circGARS表达上调且总体 趋势一致在加酶前后略有影响示意图。
图8是本发明实施例提供的6例SLE VS3例HC circLOC101928570表达下 调且总体趋势一致在加酶前后略有影响示意图。
图9是本发明实施例提供的：6例SLE VS3例HC circADCY9表达下调且 总体趋势一致在加酶前后略有影响示意图。
图10是本发明实施例提供的三个基因mRNA在SLE与HC之间表达几乎 没有差异示意图。
图11是本发明实施例提供的Circ-RNA在加酶前后略有影响，消化时间较 酶量增加耐受程度下降。而内参基因影响显著示意图。
图12是本发明实施例提供的RT-PCR产物sanger测序序列结果一致示意图。
图13是本发明实施例提供的RT-PCR产物sanger测序序列结果一致示意图。
图14是本发明实施例提供的FISH验证确定circLOC101928570亚细胞定位 示意图。
图15是本发明实施例提供的FISH验证确定circGARS亚细胞定位示意图。
图16是本发明实施例提供的circRNA-miRNA共定位示意图。
图17是本发明实施例提供的对circGARS存在RBP预测分析显示示意图。
图18是本发明实施例提供的通过RIP-qPCR实验验证circGARS与Ago2存 在结合示意图。
图19是本发明实施例提供的circGARS-RIP-qPCR验证示意图。
图20是本发明实施例提供的利用3D计算机模拟预测circGARS与Ago2可 能存在结合区域示意图。
图21是本发明实施例提供的根据生信分析结果circGARS与miR-19a-5p互 作结合潜在调控靶基因为TNFAIP3示意图。
图22是本发明实施例提供的下游功能基因研究验证示意图。
图23是本发明实施例提供的通过RNApulldown研究利用生物素标记体外 合成修饰基因circGARS结合蛋白示意图。
图24是本发明实施例提供的circRNA-mirRNA共定位(FISH1)示意图。
图25是本发明实施例提供的荧光素酶报告基因分析示意图。
图26是本发明实施例提供的转录因子预测软件对转录因子MYB靶基因预 测发现在CD4+T细胞亚群Th1和Th2中IL2受体基因具有较高的靶向结合性。
图27是本发明实施例提供的IL2启动子和转录因子MYB结合区域示意图。
图28是本发明实施例提供的circLOC101928570转录核心区域存在的CPG 岛示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例， 对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种circRNA在系统性红斑狼疮 病变免疫异常检测方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异 常检测方法包括以下步骤：
S101：收集外周血单个核细胞PBMCs标本，将样本通过RNA-seq测序技 术，从全基因表达谱的角度对基因表达情况进行了全方位的检测分析。
S102：挑选出20个存在显著性差异的基因(上调10个，下调10个)。
S103：基于circRNA参与转录后调控，使用circmiR1.0软件对候选基因进 行匹配分析，将所有存在靶向结合的miRNA挑选出来。
S104：通过对靶向结合的miRNA归纳总结，并通过搜素查阅文献的方式筛 选出SLE当中具有典型研究代表的miRNA。
S105：验证circRNA吸附miRNA调控下游靶基因和信号通路的表型影响。
S106：分别从circRNA吸附miRNA结合的蛋白复合物互作及调控的转录因 子角度对所述靶基因和信号通路进行机制研究。
下面结合实验对本发明的技术方案作进一步的描述。
1、方法
1.1方法描述：SLE患者与健康人PBMCs进行RNA-seq测序
(1)临床研究严格遵守伦理学要求，实施前完善研究项目知情同意，除外感 染、肿瘤及其他结缔组织病后纳入SLE患者，根据 SLEDAI(SystemicLupusErythematosusDiseaseActivityIndex,SLE疾病活动指数)收 集不同疾病活动度SLE患者，其中SLEDAI<10，10≤SLEDAI≤14，SLEDAI>15 各1例，正常对照3例来自我院体检中心，纳入前排除血常规、尿常规、肝肾 功能异常、自身抗体阳性的病例，收集外周血PBMCs移交公司完成测序。
1.2生物信息学分析
使用circmiR1.0软件(该软件整合了常用软件TargetScan,Miranda等的功能) 对候选基因进行匹配分析，将所有存在靶向结合有研究价值的miRNA挑选出来， 通过前期对靶向结合的miRNA进行归纳总结。结果如图2和图3所示。
1.3 qRT-PCR with RNaseRtreatment、sanger sequencing验证circRNAs临床研究严格遵守伦理学要求，实施前完善研究项目知情同意，按照美国风湿病学会 1997推荐的SLE分类标准，除外感染、肿瘤及其他结缔组织病后纳入SLE患者， 根据SLEDAI(SystemicLupusErythematosusDiseaseActivityIndex,SLE疾病活动指 数)收集不同疾病活动度SLE患者20例，正常对照若干例来自我院体检中心， 纳入前排除血常规、尿常规、肝肾功能异常、自身抗体阳性的病例，收集外周 血PBMCs提取RNA，使用RNaseR处理排除线性RNA干扰，逆转录cDNA,qPCR 检测circRNAs表达。并对产物进行sanger sequencing验证。
一、(1)qPCR验证circGARS表达情况
如图4所示，定量和半定量两种方法初证：circGARS在20例SLE相较3 例健康人PBMCs中表达上调。
(2)qPCR验证circLOC101928570表达情况
如图5所示，定量和半定量两种方法初证：circLOC101928570在20例SLE 相较3例健康人PBMC中表达下调。
(3)qPCR验证circADCY9表达情况
如图6所示，定量和半定量两种方法初证：circADCY9在20例SLE相较3 例健康人PBMCs中表达上调。
二、(1)使用去线性RNA酶Rnase R前后qPCR验证circGARS表达情况
如图7所示，结果显示：6例SLEVS3例HC circGARS表达上调且总体趋 势一致在加酶前后略有影响。
(2)使用去线性RNA酶Rnase R前后qPCR验证circLOC101928570表达 情况。
如图8所示，结果显示：6例SLEVS3例HC circLOC101928570表达下调 且总体趋势一致在加酶前后略有影响。
(3)使用去线性RNA酶Rnase R前后qPCR验证circADCY9表达情况
如图9所示，结果显示：6例SLEVS3例HC circADCY9表达下调且总体趋 势一致在加酶前后略有影响。
(4)三个基因mRNA表达情况
如图10所示，结果显示：三个基因mRNA在SLE与HC之间表达几乎没 有差异。
三、不同时间不同Rnase R加量验证内参耐受程度比较
如图11所示，结果显示：circRNA在加酶前后略有影响，消化时间较酶量 增加耐受程度下降。而内参基因影响显著。
四、使用Rnase R前后circRNA及对应mRNA跑胶及sanger sequencing验 证；
(1)使用Rnase R前后circLOC101928570及对应mRNA跑胶验证，如图 12所示，RT-PCR产物sanger测序序列结果一致。
(2)使用Rnase R前后circGARS及对应mRNA跑胶验证，如图13所示， RT-PCR产物sanger测序序列结果一致。
1.4 circRNAs特性分析，并发现circLOC101928570显著富集(FISH验证) 收集SLE患者外周血PBMCs，进行培养，细胞爬片，然后利用设计好的探针进 行FISH验证确定其亚细胞定位。
(1)FISH验证确定circLOC101928570亚细胞定位，如图14所示，结果 显示：circLOC101928570主要定位于细胞质。
(2)FISH验证确定circGARS亚细胞定位，如图15所示，结果显示： circGARS主要定位于细胞质。
通过搜索circbase，circbank，RegRNA2.0等常用circRNA数据库本发明发 现circRNA并未被数据库收录，验证结果表明circLOC101928570在SLE患者中 作为新的低表达差异分子具有一定的潜在研究价值。结合前期使用软件分析 circLOC101928570靶向的miRNA，在结果中发现circLOC101928570靶向 miR-150的两个成熟体miR-150-3p/5p，而前期查阅文献文献miR-150在SLE患 者T淋巴细胞中是高表达的，所以本发明猜想这样一种潜在竞争性结合或许参 与影响SLE发病机制。
1.5 FISH及荧光素酶活性分析circLOC101928570可作为miRNAs的“海绵” 通过前期软件对靶向结合的miRNA进行归纳总结，并通过搜素查阅文献的方式 筛选出SLE当中具有典型研究代表的miRNA。然后通过FISH及荧光报告实验 进行后续互作研究。通过软件比对分析显示circGARS与mir-19a-5p可能存在结 合，进行FISH验证。
(1)circRNA-miRNA共定位(FISH1)，如图16所示，结果显示：circGARS 与miR-19a-5p两者共定位于细胞质，结合前期生信分析SLE发病相关信号通路， 初步查阅文献得出circGARS潜在信号轴即为：circGARS通过吸附miR-19a-5p 调节泛素-编辑酶A20负反馈调节激活NFKB通路介导SLE免疫炎症反应。
如图17所示，通过对circGARS存在RBP预测分析显示：circGARS与Ago2 存在潜在结合：通过RIP-qPCR实验验证circGARS与Ago2存在结合,原理： miRNA形成RISC复合体结合的时候，是被AGO蛋白包裹的，主要是Ago2。 也就是说，拉下Ago2蛋白，就能拉下结合在上面的miRNA。这样RISC结合的 circRNA以及mRNA也会被拉下来，这就是Ago2-RIP，也就是通过拉miRNA， 来分析miRNA结合的circRNA以及mRNA的量。
如图18所示，RIP-WB结果显示：circGARS与Ago2存在结合
(2)进一步进行circGARS-RIP-qPCR验证：
如图19所示，结果显示：Ago2组circGARS相对于对照组表达高。
(3)进一步利用3D计算机模拟预测circGARS与Ago2可能存在结合区域： 如图20所示，结果显示：circGARS与Ago2的帽子结构m7GPPPN存在结合， 帽子结构是指在真核生物中转录后修饰形成的成熟mRNA在5'端的一个特殊结 构，即m7GPPPN结构，又称为甲基鸟苷帽子。mRNA5’-端帽子结构是mRNA 翻译起始的必要结构，对核糖体对mRNA的识别提供了信号，协助核糖体与 mRNA结合，使翻译从AUG开始。帽子结构可增加mRNA的稳定性，保护mRNA 免遭5’→3‘核酸外切酶的攻击。
如图21所示，根据生信分析结果circGARS与miR-19a-5p互作结合潜在调 控靶基因为TNFAIP3,也为SLE发病的研究较为活跃的关键基因之一。进一步收 集标本，通过下游功能基因研究验证，如图22所示，结果显示:circGARS通过 吸附miR-19a-5p调节泛素-编辑酶A20负反馈调节激活NFKB通路介导SLE免 疫炎症反应。
(4)基于3D计算机模拟模型，利用生物素标记体外合成修饰基因circGARS 表达结合RNApulldown研究结合蛋白Ago2组成的三元复合物对靶基因A20转 录表达影响研究。如图23所示，RNApulldown结果显示：生物素标记体外合成 修饰基因circGARS存在RNA结合蛋白且进一步影响靶基因A20表达。
通过搜索circbase，circbank，RegRNA2.0等常用circRNA数据库本发明发 现circRNA并未被数据库收录，验证结果表明circLOC101928570在SLE患者中 作为新的低表达差异分子具有一定的潜在研究价值。结合前期使用软件分析 circLOC101928570靶向的miRNA，在结果中发现circLOC101928570靶向 miR-150的两个成熟体miR-150-3p/5p，而前期查阅文献文献miR-150在SLE患 者T淋巴细胞中是高表达的，所以本发明猜想这样一种潜在竞争性结合或许参 与影响SLE发病机制。
(5)circRNA-miRNA共定位(FISH)
如图24所示，结果显示：circLOC101928570与miR-150-3p两者共定位于 细胞质。
(6)本发明将成功构建的基因circLOC101928570的荧光素酶报告基因质 粒与miRNAs的类似物与抑制剂共同转染HEK-293T细胞，并同时转入pRL-TK 载体作为内对照。48小时后进行荧光素酶报告基因分析，如图25所示,初步结 果显示：相较空载、对照质粒组和质粒+mimcNC，质粒+inhibitorNC组，质粒 +mir-150-3p/5p mimc组荧光值下降，质粒+mir-150-3p/5p inhibitor组荧光值上升， 显示两者有结合。
(7)将构建突变荧光素酶报告系统，与野生型对照做互作研究。本发明通过转 录因子预测软件对转录因子MYB靶基因预测发现在CD4+T细胞亚群Th1和 Th2中IL2受体基因具有较高的靶向结合性找出IL2启动子和转录因子MYB结 合区域，及circLOC101928570转录核心区域存在的CPG岛。如图26所示，软 件结果显示：转录因子MYB在CD4+T细胞亚群Th1和Th2中IL2受体具有较高 的靶向结合性。
(8)确定基因IL2RA启动子转录核心区域
Homosapienschromosome10,GRCh38.p13PrimaryAssembly
NCBIReferenceSequence:NC_000010.11
GenBankGraphics
>NC_000010.11:c6010689-6008689Homosapienschromosome10,GRCh38.p13PrimaryAssembly
AGTCTTGGTTTTTATTATAAATATGATAAATATTGCTAGCTATAATCTACA TAACCAAAAACCTTTATAGTTTTTTGGTGCTTTTTTTTTGTTTTTTTGTTTTT TTTTTTTTTGAGATGGAGTGTTGCTCCGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGC ACAATCTCGGCTCACTGCAGCTTCTGCCTGCTGGGTTCAAGTGATTCTCTT GCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGACTACAGGCACCCACCACCAAGTCCA GCTAATTTTTGTATTTTTAGCAGAGACGGGGTTTCACCATGTTGGCCAGGCT GGTCTCGAACTCCTCACCTCAAGTGATCCACCCAACTCAGCCTCCCAAAG TGGTGGGATTACAGGCGTGAGCCACGGCACCCAGCCTGGTATCCTCTATAG TTTTTAATAGTTTTAAATAACATGCAAAGATCCTGTGAAATGGCCAACAAG CACATCAACATCACTGGTCATTTCAGAAATGCGAATCAAAACCACAATGAG ATACTACTTCATACCCATTAAGATGACTTTAAGAAAAAGAATAGGAATGCTC ACAGATGGCTGGTAGGAATGTCAAAATGTGCAGCCACTGTGCAAAACAGA GTCTGTTTTGGCAGTTCCTCAAAAAGCTAAACATAAATTTGTCCTATAACCCAGCAATTGTATTCCTAGGTACACACCCAAGAAAGACAAAAACGTGTCTAA ATACAAACTTGTACACGACTCTTTATAACAGCATTATTCATACTCACCAAGA GGTAGAAACACCCAAATACCCAACAACAAAGGGATGGATAAAGGCCGGGCATGGTGGCTCATGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGATGCCAAGGTGGGCA GATCATTTGAGGCCAGGAGTTGGAGACCAGCCTGGCCAACATGGTGAAAC CTCATCTCCACTGTCTCTACTAAAAATACAAAAAATTAGCTGGTCATAGTGG CGCGCATCTATAATCCCAGCTGCGTGGGAGGCTGAGGCACGAGAATCCCTT GAACCTGGGAGGCAGAGGTTGCAGTGAGCCAAGATGGTGCCACTGCACT CCAGCCTGGGCGACAGAGGGACTCTTCTCTCCAAAAAAAAAAAAAAAAA AGAATTGATAAGCAAATCATGGCATATCCCTGCCAGTGGAGTATTAGCCAC AGGAAGGGATGAAGTATTGATCCATGCTGCCATTTAGATGAACCTCAAAAA CATTATGCTGAGTGAAGGAAGCCAGACACAAAAGATCACTACTGTATGACT CATTTAACATGAAATATCTAGAATAGGCAATTCCATGGAGACAGAAAGCAG ATAAGTGTTTGCCAGGGGATTTTTCTGGGGTGGTAAAAAAGTTTTGAAACT AGAGGGAGGAGGTAGTTGCACAACATGTTGAATACACGAACAGCCACTGG ATTGTATACTTTATCATGGTTAATTGTGTGTTATGTGAATTTCGCCTCAACTT TTTAAAAAGGAGATCCTGAGGCCAAAATATTTAAATATTGCTTATCTTATTCT TGATGCTCAAAGAAGGGTCATCAGCCCAGAAGGATCCTCCTGAAGTCTTTA TGGTGACTTTAGTATTCTACTAAGTGAGTTATCAGGGGACCCTGAATTTTTG TTTTCAAAAACCAAAATTAGCATATTACTAAAGTTTATGGAAGACTCCACTT TGGTATTCTATCGAGAACGTAAAATTTGCATAGCTCCCAGGAAGGCTGCTG TTCCTGATGCATCACCAGAACTATCGTGAGTTGGTTTCAGTTTTTACTCGCTGGTATTCCTTCAGCTAAATGATGAATTCCTGCCAGTGATTTTCATGGAGGGG TTGTGTTGGCTGGCTCCCAACGTGCATAATCAATTAATTTGCTGTGGGTTGA AAATCTGAACAAACTGAAAGTCAATAACTCTTCTTAGGTCTGTAGAAGTAA GTAAGATTACAGGGTAGCTCACTGTCCCCAATATTGGAGAGGCAGACAGG CTGATACAG。
(9)找出IL2启动子和转录因子MYB结合区域
如图27所示，IL2RA启动子与MYB结合序列为：213-222和583-592区 域。
在人类基因组内，GC的含量大约为40％；这些GC并不是平均分布在基因 组内，在某些DNA片段上其含量可高达60％以上，而在另一些区域则只有33％ 左右。这种GC含量的差别，在基因表达的调控和基因突变上都可能扮演着重要 的角色。例如，在基因的末端和启动子区域通常存在一些富含双核苷酸“CG”的 区域，称为“CpG岛”(CpGisland)，这些CpG岛不仅是基因的一种标志，而且 还参与基因表达的调控和影响染色质的结构通常这些位点很容易发生甲基化。 正常细胞的CpG岛由于被保护而处于非甲基化状态.全基因组低甲基化，维持甲 基化模式酶的调节失控和正常非甲基化CpG岛的高甲基化是人类肿瘤中普遍存 在的现象。以往的研究证明启动子区的高甲基化导致抑癌基因失活是人类肿瘤 所具有的共同特征之一，而且这种高甲基化是导致抑癌基因失活的又一个机制。
如图28所示，circLOC101928570转录核心区域存在的CPG岛。
CPGPLOTislandsofunusualCGcomposition
chr6_77273307_77271340_-1967-LOC101928570from1to435ObservedExpectedratio0.60
PercentC+PercentG50.00
Length200
梯度分类转染PBMCs，T,B细胞，CD4+CD8+细胞，分别对照健康人和病 人分型检测T4和T8,Th1和Th2,Tc1和Tc2中细胞比例及IL2受体表达，如若可 行，一并检测Treg和Tfh细胞比例及IL2受体表达。难点是原代淋巴细胞转染 效率较低操作较难，目前想到方式是转染率低可用基因荧光标记筛选相当于只 分析转染成功的检测指标，转染方法采用脂质体转染和电转联合使用方法。查 找文献找出较优化的流式实验步骤，选购试剂。
视实验进展后续开展RNA结合蛋白与基因启动子区域染色质互作研究。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。
序列表
<110> 陆军军医大学第一附属医院
<120> circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2001
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtcttggtt tttattataa atatgataaa tattgctagc tataatctac ataaccaaaa 60
acctttatag ttttttggtg cttttttttt gtttttttgt tttttttttt tttgagatgg 120
agtgttgctc cgttgcccag gctggagtgc agtgcacaat ctcggctcac tgcagcttct 180
gcctgctggg ttcaagtgat tctcttgcct cagcctccca agtagctggg actacaggca 240
cccaccacca agtccagcta atttttgtat ttttagcaga gacggggttt caccatgttg 300
gccaggctgg tctcgaactc ctcacctcaa gtgatccacc caactcagcc tcccaaagtg 360
gtgggattac aggcgtgagc cacggcaccc agcctggtat cctctatagt ttttaatagt 420
tttaaataac atgcaaagat cctgtgaaat ggccaacaag cacatcaaca tcactggtca 480
tttcagaaat gcgaatcaaa accacaatga gatactactt catacccatt aagatgactt 540
taagaaaaag aataggaatg ctcacagatg gctggtagga atgtcaaaat gtgcagccac 600
tgtgcaaaac agagtctgtt ttggcagttc ctcaaaaagc taaacataaa tttgtcctat 660
aacccagcaa ttgtattcct aggtacacac ccaagaaaga caaaaacgtg tctaaataca 720
aacttgtaca cgactcttta taacagcatt attcatactc accaagaggt agaaacaccc 780
aaatacccaa caacaaaggg atggataaag gccgggcatg gtggctcatg cctgtaatcc 840
cagcactttg ggatgccaag gtgggcagat catttgaggc caggagttgg agaccagcct 900
ggccaacatg gtgaaacctc atctccactg tctctactaa aaatacaaaa aattagctgg 960
tcatagtggc gcgcatctat aatcccagct gcgtgggagg ctgaggcacg agaatccctt 1020
gaacctggga ggcagaggtt gcagtgagcc aagatggtgc cactgcactc cagcctgggc 1080
gacagaggga ctcttctctc caaaaaaaaa aaaaaaaaag aattgataag caaatcatgg 1140
catatccctg ccagtggagt attagccaca ggaagggatg aagtattgat ccatgctgcc 1200
atttagatga acctcaaaaa cattatgctg agtgaaggaa gccagacaca aaagatcact 1260
actgtatgac tcatttaaca tgaaatatct agaataggca attccatgga gacagaaagc 1320
agataagtgt ttgccagggg atttttctgg ggtggtaaaa aagttttgaa actagaggga 1380
ggaggtagtt gcacaacatg ttgaatacac gaacagccac tggattgtat actttatcat 1440
ggttaattgt gtgttatgtg aatttcgcct caacttttta aaaaggagat cctgaggcca 1500
aaatatttaa atattgctta tcttattctt gatgctcaaa gaagggtcat cagcccagaa 1560
ggatcctcct gaagtcttta tggtgacttt agtattctac taagtgagtt atcaggggac 1620
cctgaatttt tgttttcaaa aaccaaaatt agcatattac taaagtttat ggaagactcc 1680
actttggtat tctatcgaga acgtaaaatt tgcatagctc ccaggaaggc tgctgttcct 1740
gatgcatcac cagaactatc gtgagttggt ttcagttttt actcgctggt attccttcag 1800
ctaaatgatg aattcctgcc agtgattttc atggaggggt tgtgttggct ggctcccaac 1860
gtgcataatc aattaatttg ctgtgggttg aaaatctgaa caaactgaaa gtcaataact 1920
cttcttaggt ctgtagaagt aagtaagatt acagggtagc tcactgtccc caatattgga 1980
gaggcagaca ggctgataca g 2001
Claims (8)
1.一种circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法，其特征在于，所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法包括以下步骤：
第一步，收集外周血单个核细胞PBMCs标本，将样本通过RNA-seq测序技术，从全基因表达谱的角度对基因表达情况进行了全方位的检测分析；
第二步，挑选出20个存在显著性差异的基因，上调10个，下调10个；
第三步，基circRNA参与转录后调控，使用circmiR1.0软件对候选基因进行匹配分析，将所有存在靶向结合的miRNA挑选出来；
第四步，通过对靶向结合的miRNA归纳总结，结合典型文献报道筛选出SLE当中具有代表的miRNA；
第五步，验证circRNA吸附miRNA调控下游靶基因和信号通路的表型影响；
第六步，分别从circRNA吸附miRNA结合的蛋白复合物互作及调控的转录因子角度对所述靶基因和信号通路进行机制研究。
2.如权利要求1所述的circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法，其特征在于，所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法收集外周血PBMCs提取RNA，使用RNaseR处理排除线性RNA干扰，逆转录cDNA,qPCR检测circRNAs表达，并对产物进行sangersequencing验证。
3.如权利要求1所述的circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法，其特征在于，所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法收集外周血PBMCs，进行培养，细胞爬片，然后利用设计好的探针进行FISH验证确定其亚细胞定位。
4.如权利要求1所述的circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法，其特征在于，所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法FISH及荧光素酶活性分析circLOC101928570可作为miRNAs的海绵通过对靶向结合的miRNA进行归纳总结，并筛选出SLE当中具有代表的miRNA；然后通过FISH及荧光报告实验进行后续互作；通过软件比对分析显示circGARS与miR-19a-5p可能存在结合，进行FISH验证；
circGARS与miR-19a-5p两者共定位于细胞质，结合前期生信分析SLE发病相关信号通路，初步得出circGARS潜在信号轴即为：circGARS通过吸附miR-19a-5p调节泛素-编辑酶A20负反馈调节激活NFKB通路介导SLE免疫炎症反应；
circGARS与Ago2存在潜在结合：通过RIP-qPCR实验验证circGARS与Ago2存在结合。
5.如权利要求1所述的circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法，其特征在于，所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法利用3D计算机circ-GARS与Ago2的帽子结构m7GPPPN存在结合，帽子结构是指在真核生物中转录后修饰形成的成熟mRNA在5'端的一个特殊结构，即m7GPPPN结构，又称为甲基鸟苷帽子；mRNA5’-端帽子结构是mRNA翻译起始的必要结构，对核糖体对mRNA的识别提供了信号，协助核糖体与mRNA结合，使翻译从AUG开始。
6.如权利要求1所述的circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法，其特征在于，所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法circGARS通过吸附miR-19a-5p调节泛素-编辑酶A20负反馈调节激活NFKB通路介导SLE免疫炎症反应。
7.如权利要求1所述的circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法，其特征在于，所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法基于3D计算机模拟模型，利用生物素标记体外合成修饰基因circGARS表达结合RNA pulldown研究结合蛋白Ago2组成的三元复合物对靶基因A20转录表达；circLOC101928570靶向miR-150的两个成熟体miR-150-3p/5p，而前期查阅文献文献miR-150在SLE患者T淋巴细胞中是高表达的；
通过转录因子预测软件对转录因子MYB靶基因预测发现在CD4+T细胞亚群Th1和Th2中IL2受体基因具有较高的靶向结合性找出IL2启动子和转录因子MYB结合区域，及circLOC101928570转录核心区域存在的CPG岛。
8.一种如权利要求1～7任意一项所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法在临床诊疗标志物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911112185.4A CN111378740A (zh) | 2019-11-14 | 2019-11-14 | circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911112185.4A CN111378740A (zh) | 2019-11-14 | 2019-11-14 | circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111378740A true CN111378740A (zh) | 2020-07-07 |
Family
ID=71216916
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911112185.4A Pending CN111378740A (zh) | 2019-11-14 | 2019-11-14 | circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111378740A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112210600A (zh) * | 2020-11-15 | 2021-01-12 | 安徽中医药大学第一附属医院(安徽省中医院) | circRNA0003307基因的应用及其检测方法 |
| CN114990118A (zh) * | 2022-06-20 | 2022-09-02 | 广东医科大学附属医院 | 一种调控sle患者b淋巴细胞的分子标记、其载体及其应用 |
| CN115547417A (zh) * | 2022-10-18 | 2022-12-30 | 南方医科大学南方医院 | 一种疾病lncRNA-转录因子-靶基因层级调控网络的构建方法和应用 |
| CN116913370A (zh) * | 2023-09-06 | 2023-10-20 | 佛山市妇幼保健院 | 人脐带间充质干细胞治疗宫腔粘连的circRNA靶点筛选方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014082083A1 (en) * | 2012-11-26 | 2014-05-30 | Caris Science, Inc. | Biomarker compositions and methods |
| CN108441555A (zh) * | 2018-05-31 | 2018-08-24 | 南昌大学第附属医院 | 三条环状rna在系统性红斑狼疮生物标志物中的应用 |
-
2019
- 2019-11-14 CN CN201911112185.4A patent/CN111378740A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014082083A1 (en) * | 2012-11-26 | 2014-05-30 | Caris Science, Inc. | Biomarker compositions and methods |
| CN108441555A (zh) * | 2018-05-31 | 2018-08-24 | 南昌大学第附属医院 | 三条环状rna在系统性红斑狼疮生物标志物中的应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 叶霜,沈南,顾越英,陈顺乐,韩光明,冯修高,冯学兵,陈兴国,华晶,黄文群,王元,鲍春德: "系统性红斑狼疮的基因表达谱及其免疫调控通路的研究" * |
| 范薇;沈南;唐元家;: "MicroRNA参与系统性红斑狼疮发病机制的研究进展" * |
| 郭俊恺等: "3种环状RNA在系统性红斑狼疮中的表达及临床意义" * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112210600A (zh) * | 2020-11-15 | 2021-01-12 | 安徽中医药大学第一附属医院(安徽省中医院) | circRNA0003307基因的应用及其检测方法 |
| CN114990118A (zh) * | 2022-06-20 | 2022-09-02 | 广东医科大学附属医院 | 一种调控sle患者b淋巴细胞的分子标记、其载体及其应用 |
| CN114990118B (zh) * | 2022-06-20 | 2023-03-24 | 广东医科大学附属医院 | 一种调控sle患者b淋巴细胞的分子标记、其载体及其应用 |
| CN115547417A (zh) * | 2022-10-18 | 2022-12-30 | 南方医科大学南方医院 | 一种疾病lncRNA-转录因子-靶基因层级调控网络的构建方法和应用 |
| CN116913370A (zh) * | 2023-09-06 | 2023-10-20 | 佛山市妇幼保健院 | 人脐带间充质干细胞治疗宫腔粘连的circRNA靶点筛选方法 |
| CN116913370B (zh) * | 2023-09-06 | 2024-01-09 | 佛山市妇幼保健院 | 人脐带间充质干细胞治疗宫腔粘连的circRNA靶点筛选方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| He et al. | Single-cell transcriptome analysis of human skin identifies novel fibroblast subpopulation and enrichment of immune subsets in atopic dermatitis | |
| Mijnheer et al. | Conserved human effector Treg cell transcriptomic and epigenetic signature in arthritic joint inflammation | |
| Gur et al. | LGR5 expressing skin fibroblasts define a major cellular hub perturbed in scleroderma | |
| CN111378740A (zh) | circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法 | |
| Venner et al. | The molecular landscape of antibody-mediated kidney transplant rejection: evidence for NK involvement through CD16a Fc receptors | |
| Xue et al. | Identification of LncRNA Linc00513 containing lupus-associated genetic variants as a novel regulator of interferon signaling pathway | |
| Elo et al. | Genome-wide profiling of interleukin-4 and STAT6 transcription factor regulation of human Th2 cell programming | |
| Rebane et al. | Mechanisms of IFN-γ–induced apoptosis of human skin keratinocytes in patients with atopic dermatitis | |
| Dumanski et al. | Immune cells lacking Y chromosome show dysregulation of autosomal gene expression | |
| Calcagno et al. | The myeloid type I interferon response to myocardial infarction begins in bone marrow and is regulated by Nrf2-activated macrophages | |
| Zhu et al. | Analysis of lncRNA expression in patients with eosinophilic and neutrophilic asthma focusing on LNC_000127 | |
| EP3314015A1 (en) | Detection of chromosome interactions | |
| AU2010328019A2 (en) | Biomarker assay for diagnosis and classification of cardiovascular disease | |
| Gao et al. | Combined transcriptomic analysis revealed AKR1B10 played an important role in psoriasis through the dysregulated lipid pathway and overproliferation of keratinocyte | |
| Sun et al. | Analysis of lncRNA expression profiles by sequencing reveals that lnc-AL928768. 3 and lnc-AC091493. 1 are novel biomarkers for disease risk and activity of rheumatoid arthritis | |
| Zeng et al. | Research progress of single-cell transcriptome sequencing in autoimmune diseases and autoinflammatory disease: A review | |
| Xie et al. | Bioinformatics-based study to investigate potential differentially expressed genes and miRNAs in pediatric sepsis | |
| Wang et al. | Single-cell transcriptomic characterization reveals the landscape of airway remodeling and inflammation in a cynomolgus monkey model of asthma | |
| Jiang et al. | DNA methylation change of HIPK3 in Chinese rheumatoid arthritis and its effect on inflammation | |
| Qian et al. | Identification and validation of potential biomarkers and pathways for idiopathic pulmonary fibrosis by comprehensive bioinformatics analysis | |
| Khan et al. | Long intergenic noncoding RNA MIAT as a regulator of human Th17 cell differentiation | |
| Wei et al. | DDX39B predicts poor survival and associated with clinical benefit of anti-PD-L1 therapy in ccRCC | |
| Vecellio et al. | DNA methylation signature in monozygotic twins discordant for psoriatic disease | |
| Ferreirós-Vidal et al. | Feedforward regulation of Myc coordinates lineage-specific with housekeeping gene expression during B cell progenitor cell differentiation | |
| Zhang et al. | Identification of cuproptosis and immune-related gene prognostic signature in lung adenocarcinoma |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200707 |