CN112442516A - 一种高效修复环状铁粒幼细胞性贫血基因突变的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用基因编辑技术高效修复导致环状铁粒幼红细胞性贫血的ALAS‑2基因突变的方法，其包含利用基因编辑技术，高效安全地基因修饰患者造血干细胞的ALAS‑2基因特异点突变，恢复ALAS‑2基因表达，使亚铁血红素合成以及红细胞成熟恢复至正常水平，实现治疗疾病的目的。
Description
技术领域
本发明涉及基因编辑治疗领域，具体地，本发明涉及利用基因编辑技术高效修复导致环状铁粒幼红细胞性贫血的基因突变的方法，其包含利用基因编辑技术，高效安全地基因修饰人的造血干细胞的ALAS-2基因特异的点突变，恢复ALAS-2基因表达，实现治疗疾病的目的。
背景技术
遗传性铁粒幼红细胞贫血(Congenital sideroblastic anemia,CSA)是一组铁利用障碍性遗传性疾病。特征为骨髓中出现大量环状铁粒幼红细胞，红细胞无效生成，组织铁储量过多和外周血呈小细胞低色素性贫血。目前分子水平检测已经发现了7种疾病突变型，主要导致铁合成、铁硫复合物、线粒体蛋白合成障碍等病症。其中，X链锁铁粒幼红细胞性贫血是最普遍的疾病类型(Kaneko K,et al.Haematologica.2014)。
X链锁铁粒幼红细胞贫血(X-linked sideroblastic anemia,XLSA)是一种罕见血液系统遗传病，属于CSA的一种，发病率不足
十万分之一。发病人群主要是男性发病者，女性携带者由于正常的等位基因抑制了病态基因的表达，红细胞的异常较少，因而这种患病家族中女性携带者一般无贫血，但红细胞通常呈现明显的双向性。除少数典型病例于出生后或者婴儿时期出现贫血外，大多数与10-20岁左右出现贫血，偶有至50-60岁并发。XLSA患者除了贫血的症状和体征外，铁过载是常见的并发症，尤其在疾病晚期，可导致患者死亡。患者通常由于不规则的输血和排铁导致铁过载，使得肝脏和脾脏轻度甚至重度肿大，肝功能正常或轻度异常。铁过载最危险的临床表现是心率失常，常出现在疾病晚期。贫血严重的幼儿及少年常出现生长发育迟缓(Wakabayashi,et al.Proc Natl Acad Sci USA.2016)。研究发现，XLSA的发病机理主要是由于编码5-氨基乙酰丙酸合酶2(5-aminolevulinic acid synthase 2，ALAS-2)的基因发生突变所致。ALAS-2是调控红细胞中催化亚铁血红素合成的关键调控因子。迄今为止，在100多个家族的患者中，发现了至少61种ALAS-2外显子5-11中的突变类型，除此以外，在非编码区尤其是内含子-1区域的点突变，即Int-1-GATA(GATA-1和ALAS-2结合的关键区域)，也被报道是主要的突变类型之一(Zhang,et al.Nucliec Acids Res.2017；Campagna,etal.Am J hematol.2014)。
目前，虽然存在一些针对XLSA的治疗法，例如注射大剂量的维生素B6、长期输血和排铁治疗、异基因造血干细胞移植等方法。然而，长期的高剂量输血伴随去铁剂排铁治疗导致铁过载，患者的脾脏、肝脏、心脏和肾脏等重要脏器铁大量沉积而引起的器官损伤是XLSA患儿死亡的主要原因之一。异基因造血干细胞移植技术虽然能够根治XLSA，但是由于HLA全相合配型比例低和移植术后的GVHD(Graft-Versus-Host-Disease,移植物抗宿主反应)、免疫排斥导致的死亡，因此目前该治疗技术难以满足患者巨大的被治疗的需求。为了解决异源造血干细胞治疗技术的问题，基于基因修饰自体造血干细胞的转基因疗法和基因编辑疗法应运而生。其中，基因编辑疗法的治疗方案是利用基因编辑工具，如CRISPR/Cas9、锌指核酸酶(Zinc Finer Nulease，ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(transcriptionactivator-like effector nucleases，TALEN)等，编辑患者的自体的造血干细胞，修复ALAS-2基因突变从而恢复ALAS-2基因的表达，再将经过基因修饰的自体的造血干细胞回输给患者，使患者的亚铁血红素合成及红细胞状态恢复至正常水平，达到治疗疾病的目的。
基因编辑技术是人为的利用编码的核酸酶在DNA序列上特定位点进行插入、敲除以及突变使得基因序列发生改变的基因重组技术。基因编辑工具首先会识别基因组中特定的序列，通过核酸酶产生DNA双链断裂缺口，依赖内源的修复机制非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)和同源重组(Homology-directed repair，HDR)两种修复机制修复。前者通过细胞复制和修复会在基因组中引入片段插入和缺失(Insertion anddeletions,INDELs),产生突变；后者由于添加了外源的供体核酸作为模板精确修复基因组序列(Dever,et al.Nature.2016)。CRISPR/Cas9作为最新的基因编辑系统，具有操作简单、成本低、可开发空间大等优点，极大地提高了基因编辑可操作性和工作效率(Cong,etal.Science.2013；Jinek,et al.Science.2012)。
然而，虽然针对XLSA的疾病遗传学和发病机理等研究相对成熟，但是迄今为止，国内外并未报道针对该疾病有效的治疗方案，而利用基因编辑技术开发全新的针对该疾病的细胞治疗技术则为XLSA的疾病治疗带来新的希望。
发明概述
本发明首次利用基因编辑技术，例如CRISPR/Cas9基因编辑技术，开发出了新一代的造血干细胞，成功高效修复了XLSA病人骨髓来源的造血干细胞中ALAS-2基因的点突变，基因修复效率高达约30％-40％，经过基因修复的细胞的ALAS-2基因表达达到健康供者ALAS-2表达的50％左右，从而促进了造血干细胞向成熟红细胞的分化。同时，通过实验证明经过基因修复的造血干细胞能够快速、高效地植入小鼠模型的造血系统，而且植入后的细胞体内分化功能正常，能够实现造血系统的重建。
因此，本申请在一方面，提供了一种通过基因编辑来校正干细胞染色体中5-氨基乙酰丙酸合酶2(ALAS-2)基因突变的方法，其中所述基因编辑包括：
(a)将包含对应于所述突变序列的单链校正序列的供体DNA导入所述造血干细胞中；
(b)将剪切ALAS-2基因的序列特异性核酸酶导入所述造血干细胞中，其中所述供体DNA上的校正序列替代所述造血干细胞的染色体上的突变序列，由此校正所述突变。
一方面，本申请提供了一种通过基因编辑来校正ALAS-2基因突变，从而增加功能性ALAS-2表达的方法，其中所述基因编辑包括：
(a)将包含对应于所述突变序列的单链校正序列的供体DNA导入所述造血干细胞中；
(b)将剪切ALAS-2基因的序列特异性核酸酶导入所述造血干细胞中，其中所述供体DNA上的校正序列替代所述造血干细胞的染色体上的突变序列，由此校正所述突变。
一方面，本申请提供了一种通过基因编辑来校正干细胞染色体中的ALAS-2基因突变，增加功能性ALAS-2表达，从而增加源自所述造血干细胞的细胞中血红素产生的方法，其中所述基因编辑包括：
(a)将包含对应于所述突变序列的单链校正序列的供体DNA导入所述造血干细胞中；
(b)将剪切ALAS-2基因的序列特异性核酸酶导入所述造血干细胞中，其中所述供体DNA上的校正序列替代所述造血干细胞的染色体上的突变序列，由此校正所述突变。
一方面，本申请提供了一种通过基因编辑来校正干细胞染色体中的ALAS-2基因突变，增加功能性ALAS-2表达，从而增加源自所述造血干细胞的细胞中血红素产生，由此促进所述造血干细胞成熟的方法，其中所述基因编辑包括：
(a)将包含对应于所述突变序列的单链校正序列的供体DNA导入所述造血干细胞中；
(b)将剪切ALAS-2基因的序列特异性核酸酶导入所述造血干细胞中，其中所述供体DNA上的校正序列替代所述造血干细胞的染色体上的突变序列，由此校正所述突变。
一方面，本申请提供了一种通过基因编辑来校正干细胞染色体中的ALAS-2基因突变，增加功能性ALAS-2表达，从而增加源自所述造血干细胞的细胞中血红素产生，促进所述造血干细胞成熟，由此来治疗个体的贫血(例如XLSA)的方法，其中所述基因编辑包括：
(a)将包含对应于所述突变序列的单链校正序列的供体DNA导入所述造血干细胞中；
(b)将剪切ALAS-2基因的序列特异性核酸酶导入所述造血干细胞中，其中所述供体DNA上的校正序列替代所述造血干细胞的染色体上的突变序列，由此校正所述突变。
一方面，本申请提供了一种通过基因编辑来校正干细胞染色体中的ALAS-2基因突变，增加功能性ALAS-2表达的方法，其中所述基因编辑不在所述造血干细胞基因组造成脱靶或脱靶率低于1％，例如低于0.5％或低于0.1％，其中所述基因编辑包括：
(a)将包含对应于所述突变序列的单链校正序列的供体DNA导入所述造血干细胞中；
(b)将剪切ALAS-2基因的序列特异性核酸酶导入所述造血干细胞中，其中所述供体DNA上的校正序列替代所述造血干细胞的染色体上的突变序列，由此校正所述突变。
在上述方法的一些实施方案中，所述造血干细胞是CD34+造血干细胞和祖细胞(“HSPC”)，或人诱导多能干细胞(hiPSC)。
在上述方法的一些实施方案中，所述造血干细胞从贫血患者，例如铁粒幼红细胞贫血患者，具体地，遗传性铁粒幼红细胞贫血患者，更具体地，XLSA患者得到。
在上述方法的一些实施方案中，所述突变位于ALAS-2基因的外显子5-11或内含子-1中。
在上述方法的一些实施方案中，所述突变位于ALAS-2基因的内含子-1中。
在上述方法的一些实施方案中，所述突变是Int-1-GATA。
在上述方法的一些实施方案中，所述序列特异性核酸酶选自下组：RNA引导核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。
在上述方法的一些实施方案中，所述序列特异性核酸酶是RNA引导核酸酶。
在上述方法的一些实施方案中，所述RNA引导核酸酶是Cas。
在上述方法的一些实施方案中，所述RNA引导核酸酶是Cas9。
在上述方法的一些实施方案中，进一步包括将识别ALAS-2基因的引导RNA(sgRNA)引入到所述CD34+HSPC中。
在上述方法的一些实施方案中，核酸酶剪切位点距离所述突变位点不超过约20个核苷酸的位点，例如，约15个，13个，12个，11个，约10个，约9个，约8个，约7个，约6个，约5个，约4个，约3个，约2个，约1个核苷酸，或核酸酶剪切位点与所述突变位点重合。
在上述方法的一些实施方案中，所述sgRNA与所述染色体上的突变位点染色体序列互补或与所述染色体上的突变位点邻近的染色体序列互补。
在上述方法的一些实施方案中，所述sgRNA中的指导序列为约10个至约25个，约12个至约24个，约14个至约23个，约16个至约22个，约17个至约21个核苷酸长。在上述方法的一些具体实施方案中，所述sgRNA中的指导序列为20个核苷酸长。
在上述方法的一些实施方案中，所述sgRNA是经化学修饰的。在一些实施方案中所述sgRNA是经过核苷酸核糖2’-O-甲基化修饰和/或核苷酸间3’硫代磷酸酯化修饰(也可简称为硫代磷酸化修饰)的。在一些实施方案中所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个核苷酸核糖碱基的2’-O-甲基化修饰。在一些实施方案中，所述sgRNA包含5’端的前3个核苷酸和3’端后3个核苷酸核糖的2’-O-甲基化修饰和/或核苷酸间的3’硫代磷酸酯化修饰。在一些实施方案中，所述sgRNA在5’端前3个和3’端后3个核苷酸中包含核苷酸核糖的2′-O-甲基化修饰且在5’端的前3个和3’端后3个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化修饰。在一些实施方案中，所述sgRNA在5’端的前5个核苷酸及3’端的后5个核苷酸的核糖中包含2’-O-甲基化修饰，并且在5’端的前5个及3’端的后5个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化修饰。
在上述方法的一些实施方案中，所述sgRNA包含与ALAS-2基因的内含子-1中的序列互补的核酸序列。
在上述方法的一些实施方案中，所述sgRNA中包含的与ALAS-2基因的内含子-1中的序列互补的核酸序列选自下组：SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3。
在上述方法的一些实施方案中，通过电穿孔和转导将所述sgRNA引入到所述造血干细胞中。
在上述方法的一些实施方案中，所述供体DNA是环状的。
在上述方法的一些实施方案中，所述供体DNA是线性的。
在上述方法的一些实施方案中，所述供体DNA是ssODN。
在上述方法的一些实施方案中，所述供体DNA包含5’端磷酸化修饰，并且其5’端的前三个核苷酸和3’端的最后3个核苷酸间包含硫代磷酸酯修饰。在上述方法的一些实施方案中，所述供体DNA包含5’端磷酸化修饰，其5’端的前三个核苷酸和3’端的最后3个核苷酸间包含硫代磷酸酯修饰，并且5’端的前三个核苷酸和3’端的最后3个核苷酸还包含核糖的2’-O-甲基化修饰。
在上述方法的一些实施方案中，所述校正序列具有与所述突变序列相同的长度。在上述方法的一些实施方案中，所述供体DNA与所述校正序列长度相等。在上述方法的一些实施方案中，所述供体DNA长于所述校正序列。
在上述方法的一些实施方案中，所述校正序列为约50个至约300个，约60个至约250个，约60个至约240个，约60个至约230个，约60个至约220个，约60个至约210个，约60个至约200个核苷酸长。
在上述方法的一些实施方案中，所述校正序列包含与位于所述突变位点的3'端的靶区域基本上互补的5'臂，和与位于所述突变位点的5'端的靶区域基本上互补的3'臂。在一些具体实施方案中，所述校正序列的5'臂或3'臂分别与所述突变位点的3'端的靶区域或5'端的靶区域具有至少约85％的同源性，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％的同源性。在上述一些具体实施方案中，所述校正序列的5'臂或3'臂分别与所述突变位点的3'端的靶区域或5'端的靶区域具有100％的同源性。
在上述方法的一些实施方案中，所述校正序列的5'臂为约30个至约100个核苷酸长，例如，约35个至约80个，约40个至约70个，约40个至约60个核苷酸长。
在上述方法的一些实施方案中，所述校正序列的3'臂为约20个至约100个核苷酸长，例如，约20个至约80个，约20个至约70个，约20个至约60个，约20个至约50个核苷酸长。
在上述方法的一些实施方案中，所述校正序列的5'臂比所述校正序列的3'臂长。
在上述方法的一些实施方案中，所述校正序列的3'臂比所述校正序列的5'臂长。
在上述方法的一些实施方案中，所述校正序列的5'臂和所述校正序列的3'臂具有相同的长度。
在上述方法的一些实施方案中，所述校正序列与除突变位点外的ChrX:55028172-55028268处的靶序列互补。
在上述方法的一些实施方案中，所述校正序列当包含编码序列时，编码除突变位点以外的与所述突变序列编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
在上述方法的一些实施方案中，所述对应于所述突变的校正序列为SEQ ID NO:4。
在上述方法的一些实施方案中，通过电穿孔将所述供体DNA引入到所述造血干细胞中。
在上述方法的一些实施方案中，引入所述序列特异性核酸酶包括将编码所述序列特异性核酸酶的mRNA引入到干细胞中。
在上述方法的一些实施方案中，通过电穿孔将编码所述序列特异性核酸酶的mRNA引入到所述造血干细胞中。
在上述方法的一些实施方案中，将编码所述序列特异性核酸酶的mRNA和所述供体DNA同时引入到干细胞中。
在上述方法的一些实施方案中，将sgRNA引入到干细胞中，并且其中将编码所述序列特异性核酸酶的mRNA和所述sgRNA同时引入到干细胞中。
在上述方法的一些实施方案中，将所述sgRNA和所述供体DNA同时引入到干细胞中。
在上述方法的一些实施方案中，将所述sgRNA、编码所述序列特异性核酸酶的mRNA、所述供体DNA分别或同时通过电穿孔或转导的方式引入到干细胞中。
在上述方法的一些实施方案中，所述sgRNA与所述供体DNA的重量比为约1:12至约12:1，例如，约1:11至约11:1，约1:10至约10:1，约1:9至约9:1，约1:8至约8:1，约1:7至约7:1，约1:6至约6:1。
在上述方法的一些实施方案中，编码所述序列特异性核酸酶的mRNA与所述单链DNA的重量比为约1:12至约12:1，例如，约1:11至约11:1，约1:10至约10:1，约1:9至约9:1，约1:8至约8:1，约1:7至约7:1，约1:6至约6:1。
在上述方法的一些实施方案中，所述造血干细胞从雄性个体得到。
在上述方法的一些实施方案中，所述CD34+HSPC从雄性个体得到。
在上述方法的一些实施方案中，所述人诱导多能干细胞(hiPSC)从雄性个体得到。
在上述方法的一些实施方案中，所述造血干细胞从雌性个体得到。
在上述方法的一些实施方案中，所述CD34+HSPC从雌性个体得到。
在上述方法的一些实施方案中，所述人诱导多能干细胞(hiPSC)从雌性个体得到。本申请还涉及通过上述方法获得的经过基因编辑的CD34+HSPC或人诱导多能干细胞(hiPSC)，其中所述CD34+HSPC或人诱导多能干细胞(hiPSC)来源于贫血患者且经过基因编辑，所述ALAS-2基因的突变得到修正。在一些实施方案中，所述贫血为铁粒幼红细胞贫血，例如遗传性铁粒幼红细胞贫血，具体地，为XLSA。在一些实施方案中，所述ALAS-2基因突变位于ALAS-2基因的外显子5-11或内含子-1中。在一些实施方案中，所述突变是Int-1-GATA。
本申请涉及以下实施方案：
1.一种通过CRISPS/Cas9基因编辑校正造血干细胞的5-氨基乙酰丙酸合酶2(ALAS-2)基因突变的方法，包括：将包含对应于ALAS-2突变序列的单链校正序列的供体DNA、识别ALAS-2突变序列的sgRNA和编码Cas9蛋白的核酸序列导入所述造血干细胞，由此所述供体DNA中的校正序列替代所述造血干细胞中的ALAS-2突变序列。
2.技术方案1的方法，其中所述造血干细胞是CD34+HSPC。
3.技术方案1或2的方法，其中所述ALAS-2突变序列是ALAS-2基因外显子5-11中的突变序列和/或ALAS-2基因内含子-1中的突变序列。
4.技术方案1-3任一项的方法，其中所述ALAS-2突变序列位于ALAS-2基因内含子-1中。
5.技术方案4的方法，其中所述突变为ALAS2内含子-1中的点突变：X:55054635[Chr X(GRCh37/hg19):g.55054635A>G,NM 000032.4:c.-15–2187T>C。
6.技术方案4或5的方法，其中Cas9剪切位点距离ALAS-2突变位点不超过约11个核苷酸的位点。
7.技术方案1-6中任一项的方法，其中所述sgRNA为约17个至约20个核苷酸长。
8.技术方案7的方法，其中所述sgRNA是经化学修饰的。
9.技术方案8的方法，其中所述sgRNA的修饰包括核苷酸核糖上的2’-O-甲基化修饰或核苷酸间的3’硫代磷酸化修饰或二者。
10.技术方案9的方法，其中所述修饰为5’端的前三个核苷酸核糖上的2’-O-甲基化修饰、3’端的最后三个核苷酸核糖上的2’-O-甲基化修饰、5’端的前三个核苷酸的核苷酸间3’硫代磷酸化修饰和3’端的最后三个核苷酸的核苷酸间3’硫代磷酸化修饰。
11.技术方案1-10任一项的方法，其中所述sgRNA的序列选自下组：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。
12.技术方案1-11中任一项的方法，其中所述校正序列为约60个至约200个核苷酸长。
13.技术方案12的方法，其中所述校正序列包含与位于所述突变位点的3'的靶区域互补的5'臂，和与位于所述突变位点的5'的靶区域互补的3'臂，其中所述校正序列的5'臂为约40个至约60个核苷酸长，校正序列的3'臂为约20个至约50个核苷酸长。
14.技术方案13的方法，其中所述供体DNA是经过化学修饰的。
15.技术方案14的方法，其中所述化学修饰包括核苷酸核糖上的2’-O-甲基化修饰或核苷酸间的3’硫代磷酸化修饰或二者。
16.技术方案15的方法，其中所述修饰为5’端的前三个核苷酸的核苷酸间3’硫代磷酸化修饰和3’端的最后三个核苷酸的核苷酸间3’硫代磷酸化修饰。
17.技术方案15或16的方法，其中所述修饰还包括5’端磷酸化修饰。
18.技术方案17的方法，其中校正序列与除所述突变位点外的ChrX:55028172-55028268处的靶序列互补。
19.技术方案1-18任一项的方法，其中所述供体DNA序列如SEQ ID NO:4所示。
20.技术方案1-19中任一项的方法，其中通过电穿孔或转导方式将所述sgRNA、供体DNA和编码Cas9蛋白的核酸序列导入到所述造血干细胞中。
21.技术方案1-20中任一项的方法，其中所述sgRNA与所述供体DNA的重量比为约4:12。
22.技术方案1-21中任一项的方法，其中编码所述Cas9的mRNA与所述供体DNA的重量比为约4:12。
23.技术方案1-22中任一项的方法，其中向约1.0*10^6个造血干细胞中导入Cas9mRNA、sgRNA、供体DNA的重量选自如下任一组：
1)6μg、4μg、6μg；
2)6μg、4μg、8μg；
3)6μg、4μg、10μg；
4)6μg、4μg、12μg。
24.技术方案1-22中任一项的方法，其中Cas9 mRNA：sgRNA：供体DNA的重量比为1：1：1。
25.技术方案20-24中任一项所述的方法，其中所述Cas9 mRNA、sgRNA、供体DNA通过电穿孔导入造血干细胞中，所述电穿孔条件为300V，1ms。
附图说明
图1针对人X染色体上ALAS-2基因内含子-1的点突变(X:55054635[Chr X(GRCh37/hg19):g.55054635A>G,NM 000032.4:c.-15–2187T>C)附近位置设计的多条sgRNA和供体模板单链DNA的示意图。
图2针对人X染色体上ALAS-2基因内含子-1的点突变(X:55054635[Chr X(GRCh37/hg19):g.55054635A>G,NM 000032.4:c.-15–2187T>C)附近位置设计的多条sgRNA和供体模板单链DNA的序列信息。
图3电转Cas9 mRNA和针对ALAS-2内含子-1的点突变附近的3个sgRNA,分别是sgRNA-1，sgRNA-2和sgRNA-3进入XLSA病人来源的诱导性多潜能干细胞(human inducedpluripotent stem cells,hiPSCs)，4天后，扩增目的片段和一代测序，插入缺失频率(Indels frequency)通过“Synthego ICE Analysis”在线软件分析产生插入缺失频率的统计分析,n＝3个实验重复。
图4电转Cas9 mRNA和针对ALAS-2内含子-1的点突变附近的sgRNA-1,按照不同Cas9和sgRNA的添加量进入XLSA病人来源的hiPSCs，4天后，扩增目的片段和一代测序，插入缺失频率通过“Synthego ICE Analysis”在线软件分析产生,n＝3个实验重复。
图5电转Cas9 mRNA和针对ALAS-2内含子-1的点突变附近的sgRNA-1以及供体模板ssODN,按照不同Cas9、sgRNA和ssODN的添加量进入XLSA病人来源的hiPSCs，4天后，扩增目的片段和NGS，通过生物信息学方法分析NHEJ和HDR的比例。其中，NHEJ:非同源末端连接(non-homologous end joining),代表插入缺失比例，HDR:同源介导修复(Homology-directed repair),代表基因修复的比例，n＝3个实验重复。
图6电转Cas9 mRNA和针对ALAS-2内含子-1的点突变附近的sgRNA-1以及供体模板ssODN,按照不同Cas9、sgRNA和ssODN的添加量进入XLSA病人骨髓来源的CD34+HSPC，4天后，扩增目的片段和NGS，通过生物信息学方法分析NHEJ和HDR的比例。其中，NHEJ:代表插入缺失比例，HDR:代表基因修复的比例，n＝3个实验重复。
图7电转Cas9 mRNA和针对ALAS-2内含子-1的点突变附近的sgRNA-1以及供体模板ssODN进入XLSA病人骨髓来源的CD34+HSPC，4天后，扩增目的片段和NGS，通过生物信息学方法分析NHEJ和HDR的比例。其中，NHEJ代表Indels比例，HDR:代表基因修复的比例，n＝3个实验重复。
图8电转Cas9 mRNA和针对ALAS-2内含子-1的点突变附近的sgRNA-1以及供体模板ssODN进入XLSA病人骨髓来源的CD34+HSPC2天后进行体外克隆形成实验(CFU检测)，14天后统计不同血液系统的克隆数目，BFU-E、CFU-GM、CFU-E、CFU-GEMM代表红系、髓系、淋巴系等血液系统不同谱系的克隆形成。其中，健康供者:代表未经过基因编辑的健康供者，空白对照:代表未经过基因编辑的细胞，基因修复:代表经过基因修复的细胞，n＝3个实验重复。
图9电转Cas9 mRNA和针对ALAS-2内含子-1的点突变附近的sgRNA-1以及供体模板ssODN进入XLSA病人骨髓来源的CD34+HSPC，进行红细胞分化，分别检测分化后第7天、第13天和第18天人CD71和人CD235a两个膜蛋白表达比例，代表红系分化效率。其中，健康供者:代表未经过基因编辑的健康供者，空白对照:代表未经过基因编辑的细胞，基因修复:代表经过基因修复的细胞。
图10电转Cas9 mRNA和针对ALAS-2内含子-1的点突变附近的sgRNA-1以及供体模板ssODN进入XLSA病人骨髓来源的CD34+HSPC，进行红细胞分化，18天后，图A是分化后后细胞的拍照图。图B是Benzidine染色明场示意图。图C是Wright-Giemsa染色明场示意图。标尺:20um。其中，健康供者:代表未经过基因编辑的健康供者，空白对照:代表未经过基因编辑的细胞，基因修复:代表经过基因修复的细胞。
图11电转Cas9 mRNA和针对ALAS-2内含子-1的点突变附近的sgRNA-1以及供体模板ssODN进入XLSA病人骨髓来源的CD34+HSPC，进行红细胞分化，18天后，进行Benzidine染色，统计分析Benzidine阳性的比例。其中，健康供者:代表未经过基因编辑的健康供者，空白对照:代表未经过基因编辑的细胞，基因修复:代表经过基因修复的细胞，n＝3个实验重复。
图12电转Cas9 mRNA和针对ALAS-2内含子-1的点突变附近的的sgRNA-1以及供体模板ssODN进入XLSA病人骨髓来源的CD34+HSPC，进行红细胞分化，18天后检测，通过荧光定量PCR检测ALAS-2、GATA-1和GAPDH基因mRNA表达。其中，健康供者:代表未经过基因编辑的健康供者，空白对照:代表未经过基因编辑的细胞，基因修复:代表经过基因修复的细胞，n＝3个实验重复。ALAS-2基因和GATA-1与GAPDH和健康供者进行归一化处理。
图13电转Cas9 mRNA和针对ALAS-2内含子-1的点突变附近的sgRNA-1以及供体模板ssODN进入XLSA病人骨髓来源的CD34+HSPC，进行红细胞分化，18天后检测，通过WesternBlot实验检测ALAS-2、GATA-1和GAPDH基因蛋白水平表达。其中，健康供者:代表未经过基因编辑的健康供者，空白对照:代表未经过基因编辑的细胞，基因修复:代表经过基因修复的细胞。
图14电转Cas9 mRNA和针对ALAS-2内含子-1的点突变附近的sgRNA-1以及供体模板ssODN进入XLSA病人骨髓来源的CD34+HSPC，电转2天后移植经过基因修复和未经过基因编辑的细胞进入经过辐照仪照射的6周龄的NPG免疫缺陷小鼠模型，10周、12周、16周后，在小鼠外周血检测人CD45阳性细胞的比例，同时移植16周后在小鼠骨髓和脾脏中检测人CD45阳性细胞的比例，其中CD45阳性细胞的比例的计算方式为人CD45阳性细胞％/(人CD45阳性细胞％+小鼠CD45阳性细胞％)，人CD45阳性细胞％和小鼠CD45阳性细胞％分别是通过流式分析实验测得的结果。空白对照:代表未经过基因编辑的细胞，基因修复:代表经过基因修复的细胞。n＝6只小鼠。
图15电转Cas9 mRNA和针对ALAS-2内含子-1的点突变附近的sgRNA-1以及供体模板ssODN进入XLSA病人骨髓来源的CD34+的HSPC，电转2天后移植经过基因修复和未经过基因编辑的细胞进入经过辐照仪照射的6周龄的NPG免疫缺陷小鼠模型，16周后分别在小鼠骨髓和脾脏中检测CD3、CD33、CD56、CD19等人细胞膜蛋白占人CD45蛋白的比例。空白对照:代表未经过基因编辑的细胞，基因修复:代表经过基因修复的细胞。n＝6只小鼠。
图16电转Cas9 mRNA和针对ALAS-2内含子-1的点突变附近的sgRNA-1以及供体模板ssODN进入XLSA病人骨髓来源的CD34+的HSPC，电转2天后移植经过基因修复和未经过基因编辑的细胞进入经过辐照仪照射的6周龄的NPG免疫缺陷小鼠模型，16周后，流式分析空白对照组和基因修复组中各1只小鼠的骨髓、脾脏和外周血中人CD45阳性细胞的比例。
图17电转Cas9 mRNA和针对ALAS-2内含子-1的点突变附近的sgRNA-1以及供体模板ssODN进入XLSA病人骨髓来源的CD34+的HSPC，电转2天后移植经过基因修复和未经过基因编辑的细胞进入经过辐照仪照射的6周龄的NPG免疫缺陷小鼠模型，16周后，流式分析空白对照组和基因修复组中各1只小鼠的骨髓和脾脏中CD3、CD33、CD56、CD19等人细胞膜蛋白占人CD45蛋白的比例。其中，空白对照:代表未经过基因编辑的细胞，基因修复:代表经过基因修复的细胞。
图18电转Cas9 mRNA和针对ALAS-2内含子-1的点突变附近的sgRNA-1以及供体模板ssODN进入XLSA病人骨髓来源的CD34+的HSPC，电转2天后移植经过基因修复和未经过基因编辑的细胞进入经过辐照仪照射的6周龄的NPG免疫缺陷小鼠模型，提取移植前细胞和移植后16周骨髓的基因组，扩增目的片段和NGS，通过生物信息学方法分析NHEJ和HDR的比例。其中，NHEJ:non-homologous end joining,代表Indels比例，HDR:Homology-directedrepair,代表基因修复的比例。n＝6只小鼠。
图19分离经1次移植16周后NPG免疫缺陷小鼠的骨髓，再移植进入新的经过辐照的NPG免疫缺陷小鼠进行2次移植试验。移植后12周分离骨髓细胞，检测人CD45阳性细胞的比例，其中CD45阳性细胞的比例的计算方式为人CD45阳性细胞％/(人CD45阳性细胞％+小鼠CD45阳性细胞％)，人CD45阳性细胞％和小鼠CD45阳性细胞％，分别是通过流式分析实验测得的结果。空白对照:代表移植的是未经过基因编辑的细胞，基因修复:代表移植的是经过基因修复的细胞。
图20分离经1次移植NPG免疫缺陷小鼠16周后的骨髓，再移植进入新的经过辐照的NPG免疫缺陷小鼠进行2次移植试验。提取移植后12周分离骨髓细胞检测基因修复效率，分析NHEJ和HDR的比例。其中，NHEJ:为非同源末端连接,代表Indels比例，HDR:为同源重组修复,代表基因修复的比例。
图21电转Cas9 mRNA和针对ALAS-2内含子-1的点突变附近的sgRNA-1进入XLSA病人来源的hiPSCs，电转2天后提取基因组，扩增通过序列相似性预测分析以及无偏全基因组分析方法Digenome-Seq方法预测出的32个潜在脱靶位点的目的片段并进行NGS测序分析，通过生物信息学方法分析每个脱靶位点的突变频率。其中空白对照:代表未经过基因编辑的细胞，基因修复:代表经过基因编辑的细胞,POT:潜在脱靶位点(potential off-target),On-target(靶标位点)表示基因编辑效率。
发明详述
本申请提供了一种通过基因编辑校正5-氨基乙酰丙酸合酶2(ALAS-2)基因突变的方法，该方法能够高效修复XLSA患者来源的hiPSC和CD34+HSPC中的ALAS-2基因突变，显著提高ALAS-2基因和蛋白表达，从而显著提高分化的红细胞中亚铁血红素的合成，促进红细胞成熟和携带氧的能力，改善贫血患者的症状，从而克服传统治疗方法的缺陷，满足临床治疗的要求。
I.定义
本申请所述的“基因编辑”指对基因组进行定点修饰以实现在基因水平上定点删除、插入和/或替换具体核苷酸和核苷酸片段的技术。目前人们熟知的基因编辑技术包括人工核酸酶介导的锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)技术和RNA引导的CRISPR/Cas核酸酶(CRISPR/Cas RGNs)技术。它们都能特异性地识别靶位点,对其单链或双链进行精准切割后,由细胞内源性的修复机制来完成对靶标基因的敲除和替换。其中，CRISPR/Cas技术是一项新兴的基因编辑技术,它利用与目标序列互补的sg RNA引导Cas酶定点切割DNA。
“突变序列”为与正常的天然序列相比，核苷酸序列发生改变的基因序列。替换突变序列，从而实现对突变序列的校正的核苷酸序列称为“校正序列”。“供体DNA”是包含“校正序列”的DNA。包含校正序列的供体DNA分子通过电穿孔或转导等方式被导入细胞后，与突变序列可发生同源重组，从而校正序列可以替换突变序列，实现基因编辑。
“干细胞”是指具有旺盛的增殖潜力、多向分化的能力和自我更新能力的细胞群体。“造血干细胞”是指具有旺盛的增殖潜力、向血细胞多向分化的能力和自我更新能力的细胞群体。造血干细胞不仅能分化、补充各种血细胞，还能通过自我更新保持干细胞的特性和数量。造血干细胞的分化程度和增殖能力不一，有异质性。多能造血干细胞最原始，先分化为定向多能造血干细胞，例如能生成粒系、红系、单核系和巨核-血小板系的髓系造血干细胞及能发生B淋巴细胞和T淋巴细胞的淋巴干细胞。这两类干细胞既保持着造血干细胞基本特点，又略有分化，分别负责“骨髓成分”和淋巴细胞的发生，故称定向多能造血干细胞。它们进一步分化成为造血祖细胞，此细胞虽然也是原始的血细胞，但是它已丧失造血干细胞的许多基本特点，如已失去多向性分化能力，只能朝向一系或密切相关的二系细胞分化；失去了反复自我更新能力，而要依靠造血干细胞的增殖分化来补充数量；增殖潜力有限，只能分裂数次。根据造血祖细胞所能分化生成的血细胞系多少，又分为单能造血祖细胞(只分化为一个血细胞系)和寡能造血祖细胞(可分化为2～3个血细胞系)。本申请所述“造血干细胞”指可通过分化或通过定向诱导分化形成粒系、红系、单核系、巨核-血小板系和/或淋巴系细胞的细胞群体，是多能造血干细胞、定向多能造血干细胞、造血祖细胞的总称。造血干细胞可来源于骨髓(骨髓造血干细胞)、外周血(外周造血干细胞)、脐带血(脐带血造血干细胞)，也可来源于胎盘干细胞或hiPSC等。本申请所述的“CD34阳性造血干细胞/祖细胞”，简写CD34阳性HSPC(hematopoietic stem/progenitor cell，HSPC)或CD34+HSPC，指表面表达CD34标志物的、有造血功能的造血干细胞和祖细胞的细胞群体。可以使用例如流式细胞术和荧光标记的抗CD34抗体来检测和计数CD34阳性造血干细胞/祖细胞(HSPC)。
如本申请使用的，“CRISPR/Cas”是一种基因编辑技术，包括但不限于各种自然存在或人工设计的CRISPR/Cas系统,如CRISPR/Cas9系统。自然存在的CRISPR/Cas系统(Naturally occurring CRISPR/Cas system)是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。例如简单的CRISPR/Cas9系统包含Cas9酶、crRNA(CRISPR-derived RNA)和tracrRNA(trans-activating crRNA)三个组分。其中crRNA(CRISPR-derived RNA)包含指导序列以及与tracrRNA部分互补的序列。tracrRNA即反式作用crRNA(trans-activating RNA)，包含较长的恒定碱基序列，提供由CRISPR核酸酶(例如Cas9酶)结合的“茎环”结构。crRNA通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，通过此复合物中crRNA与目的序列形成互补，并通过tracrRNA中的“茎环”结构，可将Cas9核酸酶引导至目的序列的靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计，可将tracrRNA和crRNA结合，改造形成具有引导作用的sgRNA(single guideRNA)，使所述sgRNA足以引导Cas9对DNA的定点切割。作为一种RNA引导的dsDNA结合蛋白，Cas9核酸酶能够共定位RNA、DNA和蛋白，拥有巨大的改造潜力。CRISPR/Cas系统可使用一类，二类或三类Cas蛋白。本发明的一些实施方式中，所述方法使用Cas9。其他适用的CRISPR/Cas系统包括但不限于WO2013176772，WO2014065596，WO2014018423，US8,697,359、PCT/CN2018/112068、PCT/CN2018/112027中所描述的系统和方法。
细胞“分化”是指同一来源的细胞逐渐产生形态结构、功能特征各不相同的细胞类群的过程。
从造血干细胞到红细胞的“分化”包括造血干细胞阶段、红系祖细胞阶段、红系前体细胞(原红细胞至晚红细胞)的增殖与分化阶段、网织红细胞的增殖及成熟过程，以及网织红细胞向外周血释放成熟为红细胞的阶段。造血干细胞阶段：目前已知，造血干细胞主要存在于骨髓、脾、肝等造血组织内。也有少量循环于外周血中。红系祖细胞阶段：在红系祖细胞(progenitor cell)阶段，细胞是处于造血干细胞与红系前体细胞之间的细胞群。造血干细胞在骨髓造血微环境的影响下分化为红系祖细胞。造血微环境包括微血管系统、神经系统和造血间质等部分。通过体液因子、细胞因子对造血干细胞的分化起特殊的作用和影响。红系前体细胞阶段：包括原始红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞及网织红细胞阶段而达到成熟红细胞。
“非同源性末端接合”也简称为NHEJ(Non-homologous end joining)，是真核生物细胞在不依赖DNA同源性的情况下，而为了避免DNA或染色体断裂的滞留和因此造成的DNA降解的影响，强行将两个DNA断端彼此连接在一起的一种DNA双链断裂修复机制，在基因编辑过程中，NHEJ可能产生插入和缺失(Indels，Insertions and deletions),导致基因突变。
“同源修复”也简称为HDR(Homology-directed repair),也可称为同源介导的双链DNA修复。是细胞内一种修复DNA双链损伤的机制。只有当细胞核内存在与损伤DNA同源的DNA片段时，HDR才能发生。
“贫血”是指人体外周血红细胞容量减少，低于正常范围下限的一种临床症状。“铁粒幼细胞性贫血”是铁利用障碍性疾病，特征为骨髓中出现大量环状铁粒幼红细胞，红细胞无效生成，组织铁储量过多和外周血呈小细胞低色素性贫血。铁粒幼细胞性贫血主要分为获得性和遗传性铁粒幼细胞性贫血，其中遗传性铁粒幼细胞性贫血多为青少年、男性及有家族史。铁利用不良，血红素合成障碍和红细胞无效生成是本病发病的主要环节。铁利用不良和血红素合成障碍的结果是形成低色素性贫血，铁在红细胞及各组织内大量堆积，使红细胞形态及功能受损，致红细胞过早破坏。铁大量沉积于各组织内，形成血色病，影响各组织器官功能。
II.基因编辑校正ALAS-2基因突变
本申请涉及通过基因修复ALAS-2基因中特定突变，例如位于ALAS-2基因的外显子5-11或内含子-1中的突变，例如Int-1-GATA点突变，提高来源于铁粒幼红细胞贫血患者，例如遗传性铁粒幼红细胞贫血患者，具体地，XLSA患者的CD34+HSPC或人诱导多能干细胞(hiPSC)中ALAS-2基因和蛋白表达，从而治疗包括遗传性铁粒幼红细胞贫血，例如XLSA的铁粒幼红细胞贫血。
在一些实施方案中，本发明涉及一种通过基因编辑来校正造血干细胞染色体中5-氨基乙酰丙酸合酶2(ALAS-2)基因突变的方法，其中所述基因编辑包括：(a)将包含对应于所述突变序列的单链校正序列的供体DNA导入所述造血干细胞中；(b)将剪切ALAS-2基因的序列特异性核酸酶导入所述造血干细胞中，其中所述供体DNA上的校正序列替代所述造血干细胞的染色体上的突变序列，由此校正所述突变。本发明还涉及一种通过基因编辑来校正ALAS-2基因突变，从而增加功能性ALAS-2表达的方法。本发明还涉及一种通过基因编辑来校正ALAS-2基因突变，增加功能性ALAS-2表达，从而增加源自所述造血干细胞的细胞中血红素产生的方法。本发明还涉及一种通过基因编辑来校正ALAS-2基因突变，增加功能性ALAS-2表达，从而增加源自所述造血干细胞的细胞中血红素产生，由此促进所述造血干细胞成熟的方法。本发明还涉及一种通过基因编辑来校正ALAS-2基因突变，增加功能性ALAS-2表达，从而增加源自所述造血干细胞的细胞中血红素产生，促进所述造血干细胞成熟，由此来治疗个体的包括遗传性铁粒幼红细胞贫血，例如XLSA的铁粒幼红细胞贫血的方法。
在上述方法的一些具体实施方案中，所述造血干细胞是从铁粒幼红细胞贫血，包括遗传性铁粒幼红细胞贫血，例如XLSA的患者获得的。在一些实施方案中，所述患者为雄性个体或雌性个体，所获得的的干细胞为CD34+造血干细胞和祖细胞(“HSPC”)，或人诱导多能干细胞(hiPSC)。
在上述方法的一些具体实施方案中，CD34阳性造血干细胞/祖细胞从包含造血来源细胞的生物体(个体)分离获得。“分离”是指从其原始环境取出。例如，如果细胞与在其天然状态通常伴随它的一些或所有组分分开时，则它是分离的。造血干细胞/祖细胞可以从成人的未分级分离或分级分离的骨髓获得或分离，包括股骨，髋骨，肋骨，胸骨和其它骨骼。
造血干细胞和祖细胞可以利用针和注射器从髋骨取出直接获得或分离，或者从血液中获得，通常是在造血干细胞动员剂诸如G-CSF(粒细胞集落刺激因子)预处理后从血液中获得。造血干细胞和祖细胞的其他来源包括脐带血、胎盘血和经过动员的个体的外周血。
从个体(例如骨髓或外周血)分离获得细胞群体后可对其进行进一步纯化获得CD34阳性造血干细胞/祖细胞。例如可以通过免疫去除分离的细胞群体中的成熟谱系定向细胞，例如通过用结合一组“谱系”抗原(例如CD2，CD3，CD11b，CD14，CD15，CD16，CD19，CD56，CD123和CD235a)的抗体标记固体基质，之后用结合CD34阳性抗原的抗体分离原始造血干细胞和祖细胞。用于从多种细胞来源纯化造血干细胞和祖细胞的试剂盒是商业可获得的，并且在具体实施方案中，这些试剂盒可以与本发明的方法一起使用。
“CD34阳性造血干细胞/祖细胞”可代表富含CD34阳性细胞的细胞群中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的CD34阳性造血干细胞/祖细胞(HSPC)。
在上述方法的一些实施方案中，所述基因编辑包括将包含对应于所述突变序列的单链校正序列的供体DNA导入所述造血干细胞中。在一些实施方案中，所述的单链校正序列替换ALAS-2基因中的突变序列。
在一些实施方案中，所述的供体DNA与所述的单链校正序列核苷酸组成和长度相同。在一些实施方案中，所述供体DNA较所述单链校正序列长，例如所述的单链校正序列的一端或二端添加有一个或多个核苷酸。在一些实施方案中，所述添加的核苷酸组成的序列是核酸酶特异性识别位点。在一些实施方案中，所述供体DNA中校正序列的两端还可以进一步包含针对所述核酸酶特异性识别位点的保护碱基。在一些实施方案中所述供体DNA还进一步包含一个或多个LNA核苷。在一些实施方案中，所述供体DNA是单链的。在一些实施方案中，所述供体DNA是环状的。在一些实施方案中，所述的供体DNA以质粒或病毒载体的形式提供。在一些实施方案中，所述供体DNA是ssODN(单链供体寡核苷酸，single-stranded donoroligonucleotides)。在一些实施方案中，所述供体DNA为SEQ ID NO:4所示。
在一些实施方案中，所述供体DNA是经化学修饰的，例如核苷酸核糖上的2’-O-甲基化修饰、核苷酸间的3’硫代磷酸酯化修饰以及5’端磷酸化修饰。在一些具体实施方案中，所述化学修饰为所述供体DNA5’端前3个核苷酸和3’端后3个核苷酸核糖的2’-O-甲基化修饰和/或核苷酸间的3’硫代磷酸酯化修饰。在一些具体实施方案中，所述化学修饰为所述供体DNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个核苷酸核糖的2’-O-甲基化修饰。在一些实施方案中，所述供体DNA在5’端前3个和3’端后3个核苷酸中包含核苷酸核糖的2′-O-甲基化修饰且在5’端的前3个和3’端后3个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化修饰。在一些实施方案中，所述供体DNA在5’端的前5个核苷酸及3’端的后5个核苷酸的核糖中包含2’-O-甲基化修饰，并且在5’端的前5个及3’端的后5个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化修饰。在一些特定的实施方案中，所述供体DNA包含5’端磷酸化修饰，并且其5’端的前三个核苷酸和3’端的最后3个核苷酸间包含硫代磷酸酯修饰。在一些特定的实施方案中，所述供体DNA包含5’端磷酸化修饰，其5’端的前三个核苷酸和3’端的最后3个核苷酸间包含硫代磷酸酯修饰，并且5’端的前三个核苷酸和3’端的最后3个核苷酸还包含核糖的2’-O-甲基化修饰。
在本申请所述的一些方法中，基因编辑包括将剪切ALAS-2基因的序列特异性核酸酶导入所述造血干细胞中。在一些实施方案中，序列特异性核酸酶包括RNA引导核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。所述序列特异性核酸酶可以是例如RNA引导核酸酶，即Cas核酸酶，具体地可以是Cas9。在上述方法的一个具体实施方案中，所述核酸酶剪切位点距离所述突变位点不超过约11个核苷酸的位点。在一些实施方案中，将编码Cas9的mRNA，例如含有ARCA帽的mRNA导入(例如通过电穿孔或其他基因转导的方式)干细胞。在一些实施方案中，编码所述Cas核酸酶(例如Cas9)的核苷酸通过病毒载体(例如慢病毒载体)导入所述造血干细胞。在一些实施方案中，所述sgRNA与Cas9编码核酸存在于同一载体中。在一些实施方案中，所述sgRNA与Cas9编码核酸存在于不同载体中。
在本申请方法的一些实施方案中，进一步包括将识别ALAS-2基因的sgRNA引入到所述造血干细胞，例如CD34+HSPC中。
一般而言，sgRNA中的“指导序列”是与靶多核苷酸序列具有足够的互补性以与靶序列杂交并指导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用适当的比对算法最佳比对时，指导序列及其相应靶序列间的互补程度为约或大于约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。最佳比对可使用用于比对序列的任何适当的算法确定，其非限制性实例包括Smith-Waterman算法、Needleman-Wimsch算法、基于Burrows-Wheeler Transform的算法(例如Burrows Wheeler Aligner)、ClustalW、Clustai X、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies,ELAND((Illumina,SanDiego,CA)、SOAP(可在soap.genomics.org.cn获得)和Maq(可在maq.sourceforge.net获得)。在一些实施方案中，指导序列长度可以为约或大于约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或更多个核苷酸。在一些实施方案中，指导序列长度少于约75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、12或更少的核苷酸。指导序列指导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的能力可通过任何适当的测定方法评估。例如，可向具有相应靶序列的宿主细胞提供足以形成CRISPR复合物的CRISPR系统的组件(包括待测试的指导序列)，如可通过使用编码CRISPR序列组件的载体转染，随后评估靶序列内的优先切割(如通过如本文所述的Surveyor测定)来进行。同样地，靶多核苷酸序列的切割可在测试管中通过提供靶序列、CRISPR复合物(包含待测试的指导序列和不同于指导序列的对照指导序列)的组件，并比较测试和对照指导序列在靶序列的结合或切割率，以此进行评估。也可以使用本领域技术人员知道的其它测定方法进行上述测定和评估。
在上述方法的一些实施方案中，所述sgRNA可以是经修饰的，例如，可以是经过化学修饰的，具体地，所述sgRNA是经过核苷酸核糖2’-O-甲基化修饰和/或核苷酸间3’硫代磷酸酯修饰的。“化学修饰的sgRNA”指针对sgRNA进行特殊的化学修饰，例如对其5’和3’末端3个核苷酸的核糖的2’-O-甲基化修饰和/或核苷酸间的3’硫代磷酸酯修饰。例如，所述化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个核苷酸核糖的2’-O-甲基化修饰。在一些实施方案中，所述sgRNA包含5’端的前3个核苷酸和3’端后3个核苷酸核糖的2’-O-甲基修饰和/或核苷酸间的3’硫代磷酸酯化修饰。在一些实施方案中，所述sgRNA在5’端前3个和3’端后3个核苷酸中包含核苷酸核糖的2′-O-甲基化修饰且在5’端的前3个和3’端后3个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化修饰。在一些实施方案中，所述sgRNA在5’端的前5个核苷酸及3’端的后5个核苷酸的核糖中包含2’-O-甲基化修饰，并且在5’端的前5个及3’端的后5个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化修饰。
经过化学修饰的sgRNA至少具有以下两个优点。第一、由于sgRNA是单链形式的RNA，其半衰期非常短，进入到细胞后，会迅速降解(最长不超过12小时)，而Cas9蛋白结合sgRNA发挥基因编辑作用则至少需要48小时。因此，采用经过化学修饰的sgRNA，进入细胞后，稳定表达，与Cas9蛋白结合后，能高效基因编辑基因组，产生Indels。第二、未经修饰的sgRNA穿透细胞膜能力差，无法有效进入细胞或组织发挥相应功能。而经过了化学修饰的sgRNA穿透细胞膜的能力通常是增强的。在本发明中可以采用本领域中常用的化学修饰方法，只要能够提高sgRNA稳定性(延长半衰期)和提升进入细胞膜能力，均可以使用。除了实施例中使用的具体的化学修饰之外，还包括采用其它的修饰方法，例如，Deleavey GF1,Damha MJ.Designing chemically modified oligonucleotides for targeted genesilencing.Chem Biol.2012Aug24；19(8):937-54，以及Hendel et al.Chemicallymodified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primarycells.Nat Biotechnol.2015Sep；33(9):985-989文献中报道的化学修饰方法。
在上述方法的一个具体实施方案中，所述sgRNA可与所述染色体上的突变位点染色体序列互补或与所述染色体上的突变位点邻近的染色体序列互补。具体地，所述sgRNA可包含与ALAS-2基因的内含子-1中的序列互补的核酸序列。在上述方法的一些实施方案中，所述sgRNA包含的与ALAS-2基因的内含子-1中的序列互补的核酸序列可为约17个至约20个核苷酸长。具体地，所述sgRNA选自下组：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3。
III.ALAS-2基因修复效率的提高及脱靶率的降低
本申请利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，开发出了高效修复ALAS-2基因突变的方法，基因修复效率高达约30％-40％，经过基因修复的细胞的ALAS-2基因表达达到健康供者ALAS-2表达的50％左右，从而可以显著缓解铁幼粒红细胞贫血(例如XLSA)患者的临床表现。此外，如实施例5所示，使用所述方法可在靶标位点(On-target)产生极高的突变频率，远超出空白对照组的突变频率，且接近100％，而在潜在脱靶位点则无法测得基因编辑组与空白对照组的显著差异。因此，根据现有检测技术的检测结果，所述方法不会在所述造血干细胞基因组造成脱靶。但考虑到检测技术检测能力的限制及背景信号的影响，因此所述脱靶率低于1％，例如低于0.5％或低于0.1％。这种极低的脱靶率，可以提升所述方法用于造血干细胞基因修复的安全性。
在一些实施方案中，本申请提供了一种通过基因编辑来校正ALAS-2基因突变，从而增加功能性ALAS-2表达的方法，其中所述基因编辑包括：(a)将包含对应于所述突变序列的单链校正序列的供体DNA导入所述造血干细胞中；(b)将剪切ALAS-2基因的序列特异性核酸酶导入所述造血干细胞中，其中所述供体DNA上的校正序列替代所述造血干细胞的染色体上的突变序列，由此校正所述突变。在一些实施方案中，所述造血干细胞是CD34+造血干细胞和祖细胞(“HSPC”)，或人诱导多能干细胞(hiPSC)。
在本申请方法的一些实施方案中，所述序列特异性核酸酶为RNA引导核酸酶，具体地为Cas9。本发明人发现，核酸酶剪切位点距离所述突变位点越近越有助于提高修复效率。在一些实施方案中，核酸酶剪切位点距离所述突变位点不超过约11个核苷酸，例如，约10个，约9个，约8个，约7个，约6个，约5个，约4个，约3个，约2个，约1个核苷酸，或核酸酶剪切位点与所述突变位点重合。在本申请方法的一些实施方案中，所述sgRNA与所述染色体上的突变位点染色体序列互补或与所述染色体上的突变位点邻近的染色体序列互补。在一些实施方案中，所述sgRNA包含与ALAS-2基因的内含子-1中的序列互补的核酸序列。在本申请方法的一些实施方案中，所述sgRNA包含的与ALAS-2基因的内含子-1中的序列互补的核酸序列为17-20个核苷酸长。在一些实施方案中，所述sgRNA选自下组：SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3，优选的为SEQ ID NO:1。
在本申请方法的一些实施方案中，所述sgRNA是经化学修饰的。具体地，所述sgRNA是经过核苷酸核糖的2’-O-甲基化修饰和/或核苷酸间3’硫代磷酸酯化修饰的，例如，所述化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个核苷酸核糖碱基的2’-O-甲基化修饰。在一些实施方案中，所述sgRNA包含5’端的前3个核苷酸和3’端后3个核苷酸核糖的2’-O-甲基化修饰和/或核苷酸间的3’硫代磷酸酯化修饰。在一些实施方案中，所述sgRNA在5’端前3个和3’端后3个核苷酸中包含核苷酸核糖的2′-O-甲基化修饰且在5’端的前3个和3’端后3个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化修饰。在一些实施方案中，所述sgRNA在5’端的前5个核苷酸及3’端的后5个核苷酸的核糖中包含2’-O-甲基化修饰，并且在5’端的前5个及3’端的后5个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化修饰。
在本申请方法的一些实施方案中，所述供体序列长于校正序列。在一些实施方案中，所述供体序列与校正序列长度相等，为约60个至约200个核苷酸长，例如60个至约180个，60个至约160个，60个至约140个，60个至约120个，60个至约100个，60个至约80个核苷酸长。在一些实施方案中，所述校正序列包含与位于所述突变位点的3'端的靶区域基本上互补的5'臂，和与位于所述突变位点的5'端的靶区域基本上互补的3'臂。所述基本上互补指所述校正序列的5'臂或3'臂分别与所述突变位点的3'端的靶区域或5'端的靶区域具有较高的同源性，例如至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％的同源性。最优选所述校正序列的5'臂或3'臂分别与所述突变位点的3'端的靶区域或5'端的靶区域具有100％的同源性。所述校正序列的5'臂比所述校正序列的3'臂长，所述校正序列的3'臂比所述校正序列的5'臂长，或者所述校正序列的5'臂和所述校正序列的3'臂具有相同的长度。在一些实施方案中，所述供体DNA的序列为SEQ ID NO:4所示。
在一些实施方案中，所述供体DNA是经化学修饰的，例如核苷酸核糖上的2’-O-甲基化修饰、核苷酸间的3’硫代磷酸酯化修饰以及5’端磷酸化修饰。在一些具体实施方案中，所述化学修饰为所述供体DNA5’端前3个核苷酸和3’端后3个核苷酸核糖的2’-O-甲基化修饰和/或核苷酸间的3’硫代磷酸酯化修饰。在一些具体实施方案中，所述化学修饰为所述供体DNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个核苷酸核糖的2’-O-甲基化修饰。在一些实施方案中，所述供体DNA在5’端前3个和3’端后3个核苷酸中包含核苷酸核糖的2′-O-甲基化修饰且在5’端的前3个和3’端后3个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化修饰。在一些实施方案中，所述供体DNA在5’端的前5个核苷酸及3’端的后5个核苷酸的核糖中包含2’-O-甲基化修饰，并且在5’端的前5个及3’端的后5个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化修饰。在一些特定的实施方案中，所述供体DNA包含5’端磷酸化修饰，并且其5’端的前三个核苷酸和3’端的最后3个核苷酸间包含硫代磷酸酯修饰。在一些特定的实施方案中，所述供体DNA包含5’端磷酸化修饰，其5’端的前三个核苷酸和3’端的最后3个核苷酸间包含硫代磷酸酯修饰，并且5’端的前三个核苷酸和3’端的最后3个核苷酸还包含核糖的2’-O-甲基化修饰。
在本申请方法的一些实施方案中，通过电穿孔(或称电转导)将所述供体DNA，sgRNA和/或编码Cas9的mRNA顺序引入或同时引入到所述造血干细胞中。
在本申请方法的一些实施方案中，所述sgRNA与所述供体DNA，例如ssODN的重量比为约1:12至约12:1，例如，约1:11至约11:1，约1:10至约10:1，约1:9至约9:1，约1:8至约8:1，约1:7至约7:1，约1:6至约6:1。在本申请方法的一些实施方案中，编码所述序列特异性核酸酶的mRNA与所述单链DNA的重量比为约1:12至约12:1，例如，约1:11至约11:1，约1:10至约10:1，约1:9至约9:1，约1:8至约8:1，约1:7至约7:1，约1:6至约6:1。在一些具体实施方案中，所述Cas9 mRNA:sgRNA-1:ssODN是6μg:4μg:6μg、6μg:4μg:8μg、6μg:4μg:10μg、6μg:4μg:12μg。
在本申请方法的一个具体实施方案中，通过电穿孔(或称电转导)将所述供体DNA，sgRNA和/或编码Cas9的mRNA顺序引入或同时引入到所述造血干细胞中。所述电转导条件例如250-360V，0.5-1ms；250-300V，0.5-1ms；250V，1ms；250V，2ms；300V，0.5ms；300V，1ms；360V，0.5ms；或360V，1ms。
IV.基因修复的造血干细胞的植入和分化
通过本申请上述方法基因修复的造血干细胞，即ALAS-2基因突变(例如该基因的外显子5-11或内含子-1中基因突变，具体例如Int-1-GATA突变)得到修正或修复的造血干细胞，可以回输给铁粒幼红细胞贫血(例如遗传性铁粒幼红细胞贫血，具体例如XLSA)的患者。并且，将通过本申请上述方法基因修复的造血干细胞回输给患者后，所述造血干细胞可在所述患者骨髓中长期定植，并成功重建所述患者造血系统。此外，通过本申请上述方法基因修复的造血干细胞与未经基因修复的造血干细胞在非编辑位点的突变频率无显著差异，因此因脱靶而对患者造成的安全隐患较低。在一些实施方案中，ALAS-2基因突变修复的CD34+HSPC来源于待治疗个体的外周血(经过或不经过骨髓造血干细胞动员)或从其骨髓中获得。在一些实施方案中，在将ALAS-2基因突变得到修复的所述CD34+HSPC回输给所述个体之前，使用造血干细胞红系扩增和分化培养基对所述CD34+HSPC群体进行红系扩增和分化，其中，所述造血干细胞红系扩增和分化培养基包括基础培养基，以及生长因子的组合物，其中所述生长因子的组合物包括干细胞生长因子(SCF)；白介素3(IL-3)和促红细胞生成素(EPO)。在一些实施方案中，还包括使用红系分化脱核培养基进行造血干细胞红系分化脱核，所述红系分化脱核培养基包含基础培养基、生长因子、以及孕酮受体和糖皮质激素受体的拮抗剂和/或抑制剂。在一些实施方案中，所述红系分化脱核培养基中的生长因子包括促红细胞生成素(EPO)，所述孕酮受体和糖皮质激素受体的拮抗剂和/或抑制剂为选自下述化合物(I)～(IV)中的任一种或两种及以上：
在一些实施方案中，所述造血干细胞红系扩增和分化培养基包含基础培养基和生长因子添加剂，其中所述基础培养基可选自任何无血清基础培养基，例如STEMSPANTM SFEMII(STEM CELLS TECHNOLOGY Inc.),IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)，可选择地补充有ITS(Thermofisher)、L-gulutamin(Thermofisher)、维生素C和/或牛血清白蛋白；其中生长因子添加剂选自IL-3、SCF和EPO中的一个或多个的组合。
在上述造血干细胞红系扩增和分化培养基中可以使用任何常用的基础培养基，例如STEMSPANTM SFEM II(购自STEM CELL TECHONOLOGIES)；例如购自Thermo Fisher的IMDM、DF12、Knockout DMEM、RPMI 1640、Alpha MEM、DMEM等。此外，可以根据需要向这些基础培养基中进一步添加其他成分，例如可以添加ITS(即主要包括胰岛素、人转铁蛋白以及硒元素)、L-谷氨酰胺、维生素C以及牛血清白蛋白。例如可以在IMDM培养基中外加ITS、外加2mML-谷氨酰胺、外加10-50μg/ml维生素C以及0.5-5质量％的BSA(牛血清白蛋白)。此外，上述DF12可以外加同样浓度的ITS，L-谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白。Knockout DMEM可以外加同样浓度的ITS，L-谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白，RPMI 1640可以外加同样浓度的ITS，L-谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白，Alpha MEM可以外加同样浓度的ITS，L-谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白，DMEM也可以外加同样浓度的ITS，L-谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白。在此，各种基础培养基中外加的ITS的浓度可以是：胰岛素浓度是0.1mg/ml、人转铁蛋白是0.0055mg/ml、硒元素6.7×10-6mg/ml。此外，外加的ITS各成分的浓度也可以根据实际需要来调整。ITS可以从Thermofisher购买，并根据需要调节成合适的最终使用浓度。
可以将上述通过基因编辑修复的造血干细胞直接或培养一天或多天后回输给所述铁粒幼红细胞贫血(例如XLSA)患者进行治疗。在一些实施方案中，所述造血干细胞在施用于个体之前培养一天或多天(例如2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天)。在一些实施方案中，在将所述造血干细胞回输给患者个体之前，将所述细胞在冷冻条件下储存至少24小时。在一些实施方案中，在冷冻条件下进行储存之前，将所述细胞培养一天或多天(例如2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天)。
在一些实施方案中，所述治疗包括向所述个体施用(比如静脉注射,包括单次静脉注射)≥2x106、≥5x106、≥1x107、≥2x107个细胞/kg体重上述ALAS-2基因突变修复的造血干细胞。
随着造血干细胞的增殖和分化，可以检测到亚铁血红素的产生。可以用Benzidine染色：即联苯胺染色，在过氧化氢存在条件下，使联苯胺能够与血红蛋白中的亚铁血红素结合并反应，产生棕色或蓝色沉淀，检测亚铁血红素的合成，以评估基因治疗效果。也可以通过本领域常规方法检测ALAS-2基因和/或蛋白的表达来评估基因治疗的效果。
为了进一步评估ALAS-2基因突变修复后的造血干细胞的表型，也可以将分化后的细胞，进行例如Benzidine染色和Wright-Giemsa染色进行评估。健康供者来源的造血干细胞以及经过基因修复的造血干细胞分化后的红细胞主要是成熟红细胞和网织红细胞，而未经过基因修复的造血干细胞分化出的红细胞以早幼红细胞为主，表明分化停滞在早期阶段，无法分化出成熟的红细胞。通过本领域已知的检测方法，例如Benzidine染色和Wright-Giemsa染色方法可以判断造血干细胞分化情况，从而得以判断造血干细胞ALAS-2基因突变是否得到修正。
实施例
实施例1：高效基因修复XLSA病人来源的hiPSC中ALAS-2内含子-1点突变
本实施例涉及利用CRISPR/Cas9系统基因编辑XLSA病人来源的人诱导性多潜能干细胞(Human induced pluripotent stem cells,hiPSC),高效修复ALAS-2内含子-1点突变,位置在(X:55054635[Chr X(GRCh37/hg19):g.55054635A>G,NM 000032.4:c.-15–2187T>C)，由于该位点是GATA-1与ALAS-2基因的结合处，因此将该点突变命名为Int-1-GATA。
为了修复疾病突变，首先利用“CRISPR RGEN TOOLS”软件设计针对Int-1-GATA突变位点附近基因组的sgRNA并合成经过化学修饰的3个sgRNA，其中所述sgRNA中包含的与目的序列互补的序列编码信息分别如下：sgRNA-1:aactctggcaactttacctg(SEQ ID NO：1),sgRNA-2:caactttacctgtggtctgc(SEQ ID NO：2),sgRNA-3:gggctgagcctgcagaccac(SEQ IDNO：3)，同时设计用于该突变的供体DNA，该供体DNA序列信息如下:tcccacgccctggtctcagcttggggagtggtcagaccccaatggcgataaactctggcaactttacctgtggtctgcaggctcagccccaagtgct(SEQ ID NO：4),全长97nt，如图1和2所示。Cas9 mRNA编码信息如下:gacaagaagtacagcatcggcctggacatcggcaccaactctgtgggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgcccagcaagaaattcaaggtgctgggcaacaccgaccggcacagcatcaagaagaacctgatcggagccctgctgttcgacagcggcgaaacagccgaggccacccggctgaagagaaccgccagaagaagatacaccagacggaagaaccggatctgctatctgcaagagatcttcagcaacgagatggccaaggtggacgacagcttcttccacagactggaagagtccttcctggtggaagaggataagaagcacgagcggcaccccatcttcggcaacatcgtggacgaggtggcctaccacgagaagtaccccaccatctaccacctgagaaagaaactggtggacagcaccgacaaggccgacctgcggctgatctatctggccctggcccacatgatcaagttccggggccacttcctgatcgagggcgacctgaaccccgacaacagcgacgtggacaagctgttcatccagctggtgcagacctacaaccagctgttcgaggaaaaccccatcaacgccagcggcgtggacgccaaggccatcctgtctgccagactgagcaagagcagacggctggaaaatctgatcgcccagctgcccggcgagaagaagaatggcctgttcggcaacctgattgccctgagcctgggcctgacccccaacttcaagagcaacttcgacctggccgaggatgccaaactgcagctgagcaaggacacctacgacgacgacctggacaacctgctggcccagatcggcgaccagtacgccgacctgtttctggccgccaagaacctgtccgacgccatcctgctgagcgacatcctgagagtgaacaccgagatcaccaaggcccccctgagcgcctctatgatcaagagatacgacgagcaccaccaggacctgaccctgctgaaagctctcgtgcggcagcagctgcctgagaagtacaaagagattttcttcgaccagagcaagaacggctacgccggctacattgacggcggagccagccaggaagagttctacaagttcatcaagcccatcctggaaaagatggacggcaccgaggaactgctcgtgaagctgaacagagaggacctgctgcggaagcagcggaccttcgacaacggcagcatcccccaccagatccacctgggagagctgcacgccattctgcggcggcaggaagatttttacccattcctgaaggacaaccgggaaaagatcgagaagatcctgaccttccgcatcccctactacgtgggccctctggccaggggaaacagcagattcgcctggatgaccagaaagagcgaggaaaccatcaccccctggaacttcgaggaagtggtggacaagggcgcttccgcccagagcttcatcgagcggatgaccaacttcgataagaacctgcccaacgagaaggtgctgcccaagcacagcctgctgtacgagtacttcaccgtgtataacgagctgaccaaagtgaaatacgtgaccgagggaatgagaaagcccgccttcctgagcggcgagcagaaaaaggccatcgtggacctgctgttcaagaccaaccggaaagtgaccgtgaagcagctgaaagaggactacttcaagaaaatcgagtgcttcgactccgtggaaatctccggcgtggaagatcggttcaacgcctccctgggcacataccacgatctgctgaaaattatcaaggacaaggacttcctggacaatgaggaaaacgaggacattctggaagatatcgtgctgaccctgacactgtttgaggacagagagatgatcgaggaacggctgaaaacctatgcccacctgttcgacgacaaagtgatgaagcagctgaagcggcggagatacaccggctggggcaggctgagccggaagctgatcaacggcatccgggacaagcagtccggcaagacaatcctggatttcctgaagtccgacggcttcgccaacagaaacttcatgcagctgatccacgacgacagcctgacctttaaagaggacatccagaaagcccaggtgtccggccagggcgatagcctgcacgagcacattgccaatctggccggcagccccgccattaagaagggcatcctgcagacagtgaaggtggtggacgagctcgtgaaagtgatgggccggcacaagcccgagaacatcgtgatcgaaatggccagagagaaccagaccacccagaagggacagaagaacagccgcgagagaatgaagcggatcgaagagggcatcaaagagctgggcagccagatcctgaaagaacaccccgtggaaaacacccagctgcagaacgagaagctgtacctgtactacctgcagaatgggcgggatatgtacgtggaccaggaactggacatcaaccggctgtccgactacgatgtggaccatatcgtgcctcagagctttctgaaggacgactccatcgacaacaaggtgctgaccagaagcgacaagaaccggggcaagagcgacaacgtgccctccgaagaggtcgtgaagaagatgaagaactactggcggcagctgctgaacgccaagctgattacccagagaaagttcgacaatctgaccaaggccgagagaggcggcctgagcgaactggataaggccggcttcatcaagagacagctggtggaaacccggcagatcacaaagcacgtggcacagatcctggactcccggatgaacactaagtacgacgagaatgacaagctgatccgggaagtgaaagtgatcaccctgaagtccaagctggtgtccgatttccggaaggatttccagttttacaaagtgcgcgagatcaacaactaccaccacgcccacgacgcctacctgaacgccgtcgtgggaaccgccctgatcaaaaagtaccctaagctggaaagcgagttcgtgtacggcgactacaaggtgtacgacgtgcggaagatgatcgccaagagcgagcaggaaatcggcaaggctaccgccaagtacttcttctacagcaacatcatgaactttttcaagaccgagattaccctggccaacggcgagatccggaagcggcctctgatcgagacaaacggcgaaaccggggagatcgtgtgggataagggccgggattttgccaccgtgcggaaagtgctgagcatgccccaagtgaatatcgtgaaaaagaccgaggtgcagacaggcggcttcagcaaagagtctatcctgcccaagaggaacagcgataagctgatcgccagaaagaaggactgggaccctaagaagtacggcggcttcgacagccccaccgtggcctattctgtgctggtggtggccaaagtggaaaagggcaagtccaagaaactgaagagtgtgaaagagctgctggggatcaccatcatggaaagaagcagcttcgagaagaatcccatcgactttctggaagccaagggctacaaagaagtgaaaaaggacctgatcatcaagctgcctaagtactccctgttcgagctggaaaacggccggaagagaatgctggcctctgccggcgaactgcagaagggaaacgaactggccctgccctccaaatatgtgaacttcctgtacctggccagccactatgagaagctgaagggctcccccgaggataatgagcagaaacagctgtttgtggaacagcacaagcactacctggacgagatcatcgagcagatcagcgagttctccaagagagtgatcctggccgacgctaatctggacaaagtgctgtccgcctacaacaagcaccgggataagcccatcagagagcaggccgagaatatcatccacctgtttaccctgaccaatctgggagcccctgccgccttcaagtactttgacaccaccatcgaccggaagaggtacaccagcaccaaagaggtgctggacgccaccctgatccaccagagcatcaccggcctgtacgagacacggatcgacctgtctcagctgggaggcgac。(SEQ ID NO:5)
sgRNA的化学合成是指对于sgRNA的5’端的前三个核苷酸以及3’端的最后三个核苷酸的核糖进行了2’-O-甲基化物修饰和核苷酸间的3’硫代磷酸酯化修饰。如下述化学式所示，左侧是化学修饰后的sgRNA,右侧是未经过修饰的sgRNA。所述供体DNA包含5’端磷酸化修饰，并且其5’端的前三个核苷酸和3’端的最后3个核苷酸间包含硫代磷酸酯修饰。Cas9mRNA和sgRNA均购自美国Trilink Biotechnologies公司。
为了精确基因修复XLSA病人来源的hiPSC中Int-1-GATA突变，我们首先进行sgRNA切割效率的评估，即的比例。
我们扩增培养了XLSA病人来源的hiPSC(中国医学科学院天津血液病研究所提供)。在BTX ECM830电转仪选取了“300V 1ms”的电转条件，将经过合成的Cas9 mRNA和经过化学修饰合成的sgRNA-1、sgRNA-2和sgRNA-3分别电转进入XLSA病人来源的hiPSC中，电转4天后，提取该hiPSC的基因组，选取sgRNA切割位点左右各约450bp，总长度为905bp的片段进行扩增，进行Sanger测序。
正向引物:ctgagcatatcatggccaaa(SEQ ID NO：6)
反向引物：catatggcaacctccttcatc(SEQ ID NO：7)
针对测序结果利用“Synthego ICE Analysis”在线软件分析产生Indels效率的统计分析。其中，“Synthego ICE Analysis”在线软件是在线分析Indels效率的软件，以一代测序结果为基础，分析Indels引起的双峰突变的效率，可以参考如下网址：
https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis.
结果表明，本实施例中合成的3条sgRNA中，sgRNA-1、sgRNA-2和sgRNA-3的Indels效率分别约为35％、10％和40％，如图3所示。研究表明：第一、高效的Indels效率是基因修复的前提，因此我们选择sgRNA-1和sgRNA-3作为优选的sgRNA；第二、sgRNA的切割位点距离基因修复的位点越近，基因修复的效率越高(Xiquan Liang,et al.Journal ofBiotechnology.2016；Mark A.et al.Science Translational Medicine.2017)。评估切割位点和基因修复位点之间的距离。如图1所示，箭头指针位置即为切割位点，sgRNA-1的切割位点距离基因修复位点为5nt。因此，我们最终确定sgRNA-1为最合适的sgRNA进行后续评估。
针对sgRNA-1，我们对电转相同量的hiPSC(1.0*10^6细胞)进行了Cas9和sgRNA的添加量优化，即分别以以下比例电转Cas9mRNA:sgRNA，1μg:1μg,2μg:2μg,3μg:3μg,4μg:4μg,6μg:6μg进入到hiPSC中，电转4天后，提取该hiPSC的基因组，选取sgRNA切割位点左右各约450bp，总长度为905bp的片段进行扩增，进行Sanger测序。通过“Synthego ICEAnalysis”在线软件分析Indels效率。结果表明，随着Cas9 mRNA和sgRNA添加量增加，Indels效率提升，4ug:4ug的效率最高，达到约50％的基因编辑效率，如图4所示。
为了精确修复hiPSC中Int-1-GATA的点突变，我们按照不同的Cas9:sgRNA:ssODN的添加量，同时将Cas9 mRNA,sgRNA和ssODN电转进入1.0*10^6hiPSC中，4天后，提取该hiPSC的基因组，通过二代测序生物信息学方法分析基因修复效率(HDR)以及Indels效率(NHEJ)，如图5所示。Cas9mRNA:sgRNA:ssODN的测试量分别是1μg:1μg:1μg,2μg:2μg:2μg,3μg:3μg:3μg,4μg:4μg:4μg,6μg:6μg:6μg,结果表明，随着添加量增加，基因修复效率HDR提高，其中基因修复效率HDR最高的是6μg:6μg:6μg，约为25％，由此证明我们成功高效修复了XLSA病人来源的hiPSC中的点突变，在Int-1-GATA位点成功实现了从C到T的修复。Cas9mRNA:sgRNA:ssODN是6μg:6μg:6μg诱导了较高的Indels效率(％NHEJ，如图5所示)。
实施例2高效基因修复XLSA病人骨髓来源的CD34+HSPC中ALAS-2内含子-1点突变
在实施例1中，我们实现了高效修复XLSA来源的hiPSC的Int-1-GATA点突变，参考实施例1中添加的Cas9 mRNA、sgRNA-1和ssODN的量，在本实验中我们尝试基因修复XLSA病人骨髓来源的CD34+HSPC。
选取300v 1ms的电转条件，分别电转不同Cas9 mRNA，sgRNA-1和ssODN的量进入XLSA病人骨髓来源的CD34+HSPC，其中每1.0*10^6细胞中添加的Cas9 mRNA:sgRNA-1:ssODN是6μg:4μg:6μg和6μg:4μg:10μg,4天后，提取该HSPC的基因组，通过二代测序生物信息学方法分析基因修复效率(HDR)以及Indels效率(NHEJ)，如图6所示。结果表明，在不同Cas9mRNA、sgRNA-1和ssODN的添加量条件下，我们成功基因修复了XLSA的In-1-GATA突变。此外，在相同Cas9 mRNA和sgRNA-1的添加量条件下，随着供体模板ssODN的量增加，基因修复效率提高，6μg:4μg:10μg条件下基因修复效率达到约30％，提示我们供体模板的添加量会影响基因修复的效率。
为了验证该结论，我们选取300v 1ms的电转条件，分别电转不同Cas9mRNA，sgRNA-1和ssODN的量进入XLSA病人骨髓来源的CD34+HSPC，其中Cas9 mRNA:sgRNA-1:ssODN是6μg:4μg:12μg，4天后，提取该HSPC的基因组，通过二代测序生物信息学方法分析基因修复效率(HDR)以及Indels效率(NHEJ)，如图7所示，基因修复的效率达到约40％，由此表明在XLSA病人来源的CD34+HSPC上，我们成功高效基因修复了疾病突变，达到了现有技术中报道的最高基因修复效率(Mark,et al.Science Translational Medicine.2017；Park,etal.Nucleic Acids Research.2019)。
实施例3红系分化基因修复后的XLSA病人骨髓来源的CD34+HSPC以评估细胞表型
改变
3.1红细胞分化
参考实施例2中发现的Cas9 mRNA、sgRNA-1和ssODN的添加量(6μg:4μg:12μg)，选取300v 1ms的电转条件，分别电转Cas9 mRNA，sgRNA-1和ssODN进入XLSA病人骨髓来源的HSPC，利用下述“两步法”分化方案进行红细胞分化实验。此外，我们红系分化了健康供者动员外周血来源的CD34+HSPC作为阳性对照。
其中两步法分化为利用HSPC红系扩增和分化培养基进行分化，然后利用HSPC红系分化脱核培养基进行分化。
造血干细胞红系扩增和分化培养基为基础培养基为StemSpanTM SFEM II,生长因子为50-200ng/ml SCF,10-100ng/ml IL-3,1-10U EPO/ml，培养条件：利用造血干细胞红系扩增和分化培养基培养造血干细胞1.0×10^5细胞/ml，扩增7天。
造血干细胞红系分化脱核培养基为基础培养基为STEMSPANTM SFEM II,生长因子为1-10U EPO,100-1000μg/ml人转铁蛋白，化学小分子为0.5-10μm mifepristone，将利用上一步骤培养的1.0×10^6细胞/ml细胞在造血干细胞红系分化脱核培养基分化11天。
我们检测了红系分化后第7天、13天和18天，CD71和CD235a表达比例，如图8所示。结果显示：分化第7天，经过基因修复的细胞CD71和CD235a表达比例最高，达到31.71％；分化第13天，经过基因修复的细胞和健康供者的细胞均高表达CD71和CD235a,比例分别是68.90％和67.55％，显著高于未经过基因修复的细胞，比例是30.96％；分化第18天，经过基因修复的细胞CD71和CD235a的比例未54.48％，显著高于经过基因修复的细胞，比例为25.64％，但是低于健康供者来源的细胞，比例为90.13％。以上结果得出如下结论：1)经过基因修复的细胞在分化第二阶段的分化效率显著高于未经过修复的细胞，表明前者分化的细胞更加成熟，这是因为ALAS-2基因参与了亚铁血红素合成以及红细胞成熟(Zhang,etal.Nucleic Acids Research.2017；Liu,et al.Nature Communications.2018)，因此当ALAS-2基因突变被修复后，红细胞分化程度提高。2)经过基因修复的细胞在分化第二阶段的分化效率低于健康供者来源的细胞，这是由于ALAS-2Int-1-GATA突变被部分基因修复，效率约为40％。
3.2红细胞分化后，Benzidine染色和Wright-Giemsa染色
为了进一步评估红系分化基因修复后的造血干细胞的表型，我们将实施例2.1中的分化后的细胞，进行了Benzidine染色和Wright-Giemsa染色，如图9和10所示。实验结果如下：
1)明场拍照结果表明：健康供者来源的造血干细胞以及经过基因修复的造血干细胞分化后的红细胞呈现明显的红色，表明亚铁血红素合成显著增加，而未经过基因修复的造血干细胞分化出的红细胞呈白色，表明亚铁血红素合成显著缺乏。
2)Benzidine染色：健康供者来源的造血干细胞以及经过基因修复的造血干细胞分化后的红细胞，Benzidine染色后，阳性细胞比例(红色箭头所示)显著高于未经过基因修复的造血干细胞分化出的红细胞。统计分析结果进一步显示，健康供者来源的造血干细胞以及经过基因修复的造血干细胞分化后的红细胞，Benzidine阳性细胞比例约为60％，而未经过基因修复的造血干细胞分化出的红细胞仅为20％。
3)Wright-Giemsa染色:健康供者来源的造血干细胞以及经过基因修复的造血干细胞分化后的红细胞主要是成熟红细胞和网织红细胞，而未经过基因修复的造血干细胞分化出的红细胞以早幼红细胞为主，表明分化停滞在早期阶段，无法分化出成熟的红细胞。
3.3检测CD34+HSPC分化来的红细胞中ALAS-2、GATA-1和GAPDH
mRNA和蛋白表达
1)将实施例2.2中从CD34+HSPC分化来的红细胞提取细胞的mRNA,反转录成cDNA，通过荧光定量PCR检测ALAS-2、GATA-1、GAPDH基因的mRNA表达，与GAPDH和健康供者的结果进行归一化处理。如图11所示。
实验结果表明：经过基因修复的CD34+HSPC分化后的红细胞中ALAS-2基因表达显著高于未经过基因修饰的细胞，而且经过基因修复的细胞的ALAS-2基因表达达到健康供者ALAS-2表达的50％，这与基因修复的效率接近。此外，虽然我们基因修复了ALAS-2中GATA-1的结合位点的基因突变，但是GATA-1基因在三种细胞中表达无显著差异，这与之前的报道一致(Zhang,et al.Nucleic Acids Research.2017)。
2)将实施例2.2中从CD34+HSPC分化来的红细胞提取细胞的蛋白，进行WesternBlot实验，检测ALAS-2、GATA-1、GAPDH基因的蛋白表达，如图12所示。
实验结果表明：经过基因修复的CD34+HSPC分化后的红细胞中ALAS-2基因表达显著高于未经过基因修饰的细胞。此外，虽然我们基因修复了ALAS-2中GATA-1的结合位点的基因突变，但是GATA-1蛋白在三种细胞中表达无显著差异，这与之前的报道一致(Zhang,etal.Nucleic Acids Research.2017)。
实施例3：基因修复XLSA病人骨髓来源的CD34+HSPC的体外克隆形成
本实验涉及基因编辑XLSA病人骨髓来源的CD34+HSPC的克隆形成单位(CFU,colony-formation units)检测。
选取300V 1ms的电转条件，参考实施例2中发现的Cas9 mRNA、sgRNA-1和ssODN的添加量，分别电转Cas9 mRNA，sgRNA-1和ssODN进入XLSA病人骨髓来源的CD34+HSPC,将500个细胞重悬入1ml H4434(购自加拿大STEM CELLS TECHNOLOGIES)和IMDM(购自ThermoFisher)以及FBS(购自Thermo Fisher)的混合液中，14天后显微镜下观察CFU-M、BFU-E、CFU-E、CFU-G、CFU-GM、GEMM等不同形态的克隆形成数目，结果如图13所示。其中，BFU-E、CFU-GM、CFU-E、CFU-MM代表红系、髓系、淋巴系等血液系统不同谱系的克隆形成。其中，健康供者代表健康供者动员外周血来源的CD34+HSPC，空白对照:代表未经过基因修复的细胞，基因修复代表经过基因修复的细胞。
实验结果表明：与未经过基因修复的细胞相比，经过基因修复的细胞CFU-GM、BFU-E、CFU-E显著增高，BFU-E和CFU-E分别代表红系的前克隆和终末分化的红系克隆，由此进一步证明基因修复ALAS-2Int-1-GATA的突变位点恢复了CD34+HSPC红系成为成熟红细胞的能力。此外，由于基因修复效率约为40％，因此经过基因修复的细胞的形成的克隆总数以及不同的亚克隆数目低于健康供者来源的细胞形成的克隆数，符合实验预期。
实施例4基因修复XLSA病人骨髓来源的CD34+HSPC重建小鼠模型的造血系统
本实施选取300V 1ms的电转条件，参考实施例2中发现的Cas9 mRNA、sgRNA-1和ssODN的添加量，电转Cas9 mRNA，sgRNA-1和ssODN进入XLSA病人骨髓来源的CD34+HSPC，移植进入经过辐照仪照射的NPG免疫缺陷小鼠模型(购自北京维通达生物技术有限公司(Beijing Vitalstar Biotechnology,Inc.)。在移植10周、12周、16周后的外周血中检测人CD45和小鼠CD45的表达情况，同时检测移植16周后骨髓、脾脏的人CD45和小鼠CD45的表达情况，其结果如图14所示。其中移植到小鼠中的方法为：在细胞移植24小时前，进行1.0Gy射线照射，清除小鼠模型的骨髓。随后将用20μL 0.9％的生理盐水重悬的1.0×10^6的细胞注射到小鼠的尾静脉中，随后放入洁净级别的动物房中饲养。其中，空白对照:代表未经过基因修复的细胞，基因修复代表经过基因修复的细胞。
图14和图15的结果表明经过基因修复的CD34+HSPC，移植进入小鼠模型后，与未经过基因修复的CD34+HSPC相比，经过基因修饰的细胞移植的动物的外周血、骨髓和脾脏中人源的hCD45表达比例提高,表明经过基因修复的CD34+HSPC能够快速、高效地植入小鼠模型的造血系统，细胞体内分化功能正常，而未经过基因修复的CD34+HSPC在植入小鼠模型造血系统方面出现功能异常，植入效率低。
同时，在移植基因修复的细胞的小鼠中，16周后检测了骨髓和脾脏中人源的CD3、CD33、CD19、CD56等细胞膜蛋白的表达如图16和17所示。结果表明，与未经过基因修复的细胞相比，经过基因修复的细胞能正常表达相同比例的CD3、CD56和CD33蛋白，表明两种细胞均可以分化为T细胞、NK细胞和髓系细胞等血液系统的细胞，然而，经过基因修复的细胞高表达CD19蛋白，达到约90％比例，而未经基因修复的细胞CD19蛋白表达显著降低，表达比例低于5％，由此表明经过基因修复的细胞能正常表达CD19蛋白，正常分化为B细胞，而未经过基因修复的细胞B细胞分化显著异常。以上结果进一步证明，经过基因修复的细胞能高效重建小鼠模型的造血系统。
此外，虽然基因编辑的细胞能够快速、高效重建小鼠模型的造血系统。针对重建小鼠模型的细胞是否发生了基因编辑的判断结果如图18所示，提取移植前细胞、移植16周后骨髓的基因组，扩增目的片段，通过二代测序生物信息学方法分析基因修复效率(HDR)以及Indels效率(NHEJ)。结果表明移植16周后骨髓中的人源细胞均发生了高效的基因编辑，基因修复效率与移植前细胞相似，在30～40％之间。
为了进一步评估基因修复ALAS-2的疾病点突变对于CD34+HSPC干性的影响，进行了二次移植试验。上述实验进行到16周时，采集小鼠骨髓细胞，每只小鼠的骨髓移植到2只新的经过辐照后的NPG小鼠体内，称为2次移植。2次移植12周采集小鼠的骨髓进行流式分析人CD45和小鼠CD45的表达情况，其中，空白对照代表未经过基因修复的细胞，基因修复代表经过基因修复的细胞。图19结果表明，与未经过编辑的细胞相比，经过基因修复小鼠的人源重建水平显著提高，进一步证明基因修复ALAS-2后的CD34+HSPC具有长期的干性和分化能力。
此外提取二次移植小鼠12周后骨髓的基因组，扩增目的片段，通过二代测序生物信息学方法分析基因修复效率(HDR)以及Indels效率(NHEJ)。结果表明移植12周后骨髓中的人源细胞均具有高效的基因编辑，基因修复效率与移植前细胞相似，在40％左右，如图20所示。
实施例5潜在脱靶效应分析
为了评估基因修复ALAS-2后的潜在脱靶效应，通过同时采用序列相似性预测分析以及无偏全基因组分析方法Digenome-Seq方法(Daesik Kim,et al.NatureMethods.2014)，寻找sgRNA最可能引起脱靶的潜在脱靶位点(potential off-target)共32个,POT代表潜在脱靶位点。由于病人来源的CD34+HSPC数量限制，因此选用基因编辑的人潜能干细胞(hiPSCs)为目的细胞进行验证，对潜在脱靶位点的情况进行定点检测。如图21所示,其中，空白对照代表未经过基因编辑的细胞，基因修复代表经过基因编辑的细胞。结果表明，与空白对照组的细胞相比，经过基因编辑的细胞在32个潜在脱靶位点的突变频率无显著差异，进一步表明无潜在脱靶现象发生。
工业实用性
根据本发明，本发明的方法有以下几个优点，第一、本方法能够基因编辑并高效修复XLSA病人来源的hiPSC以及骨髓来源的CD34+HSPC，满足了临床治疗X-链锁环状铁粒幼红细胞贫血的治疗要求；第二、基因修复效率高，显著提高ALAS-2基因和蛋白表达，显著提高分化的红细胞中亚铁血红素的合成；第三、基因修复的造血干细胞能够高效重建模型小鼠的造血系统；第四、基因编辑后的细胞无潜在的脱靶现象发生。基于此，本发明开发的方法将有可能代替传统的造血干细胞移植治疗技术来治愈X-链锁环状铁粒幼红细胞贫血的患者。
序列表
<110> 广州辑因医疗科技有限公司
中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）
<120> 一种高效修复环状铁粒幼细胞性贫血基因突变的方法
<130> PD01156-FD00264PCT
<150> PCT/CN2019/103235
<151> 2019-08-29
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sgRNA的DNA编码序列
<400> 1
aactctggca actttacctg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sgRNA的DNA编码序列
<400> 2
caactttacc tgtggtctgc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sgRNA的DNA编码序列
<400> 3
gggctgagcc tgcagaccac 20
<210> 4
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 供体DNA序列
<400> 4
tcccacgccc tggtctcagc ttggggagtg gtcagacccc aatggcgata aactctggca 60
actttacctg tggtctgcag gctcagcccc aagtgct 97
<210> 5
<211> 4101
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cas9的mRNA的DNA编码序列
<400> 5
gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc 60
accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 120
agcatcaaga agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc 180
acccggctga agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat 240
ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg 300
gaagagtcct tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 360
atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa 420
ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg 480
atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 540
gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc 600
aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg 660
ctggaaaatc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggcaacctg 720
attgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat 780
gccaaactgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 840
atcggcgacc agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 900
ctgagcgaca tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg 960
atcaagagat acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag 1020
cagctgcctg agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1080
tacattgacg gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa 1140
aagatggacg gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag 1200
cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc 1260
attctgcggc ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag 1320
aagatcctga ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga 1380
ttcgcctgga tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg 1440
gtggacaagg gcgcttccgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac 1500
ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat 1560
aacgagctga ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc 1620
ggcgagcaga aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg 1680
aagcagctga aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc 1740
ggcgtggaag atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc 1800
aaggacaagg acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg 1860
accctgacac tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac 1920
ctgttcgacg acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg 1980
ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat 2040
ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2100
ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac 2160
gagcacattg ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg 2220
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gaaatggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg 2340
aagcggatcg aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg 2400
gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat 2460
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gtgcctcaga gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac 2580
aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac 2640
tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc 2700
aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg 2760
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ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac 3600
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aagggaaacg aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3720
tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 3780
cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc 3840
ctggccgacg ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc 3900
atcagagagc aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct 3960
gccgccttca agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag 4020
gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac 4080
ctgtctcagc tgggaggcga c 4101
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 测序引物
<400> 6
ctgagcatat catggccaaa 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 测序引物
<400> 7
catatggcaa cctccttcat c 21
Claims (10)
1.一种通过CRISPS/Cas9基因编辑校正造血干细胞的5-氨基乙酰丙酸合酶2(ALAS-2)基因突变的方法，包括：将包含对应于ALAS-2突变序列的单链校正序列的供体DNA、识别ALAS-2突变序列的sgRNA和编码Cas9蛋白的核酸序列导入所述造血干细胞，由此所述供体DNA中的校正序列替代所述造血干细胞中的ALAS-2突变序列。
2.权利要求1的方法，其中所述造血干细胞是CD34+HSPC。
3.权利要求1或2的方法，其中所述ALAS-2突变序列是ALAS-2基因外显子5-11中的突变序列和/或ALAS-2基因内含子-1中的突变序列。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述ALAS-2突变序列位于ALAS-2基因内含子-1中。
5.权利要求4的方法，其中所述突变为ALAS2内含子-1中的点突变：X:55054635[Chr X(GRCh37/hg19):g.55054635A>G,NM 000032.4:c.-15–2187T>C。
6.权利要求4或5的方法，其中Cas9剪切位点距离ALAS-2突变位点不超过约11个核苷酸的位点。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述sgRNA为约17个至约20个核苷酸长。
8.权利要求7的方法，其中所述sgRNA是经化学修饰的。
9.权利要求8的方法，其中所述sgRNA的修饰包括核苷酸核糖上的2’-O-甲基化修饰或核苷酸间的3’硫代磷酸化修饰或二者。
10.权利要求9的方法，其中所述修饰为5’端的前三个核苷酸核糖上的2’-O-甲基化修饰、3’端的最后三个核苷酸核糖上的2’-O-甲基化修饰、5’端的前三个核苷酸的核苷酸间3’硫代磷酸化修饰和3’端的最后三个核苷酸的核苷酸间3’硫代磷酸化修饰。
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