JP2018518182A - ゲノム編集のためのcrispr/cas9複合体 - Google Patents
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Abstract
Description
CRISPR/Cas9増強遺伝子置換によるSCIDの矯正
ヤヌスファミリーキナーゼJAK3遺伝子の突然変異は、重症複合免疫不全症(SCID)を引き起こす。ヒトにおけるJAK3欠損は、循環T細胞及びナチュラルキラー(NK)細胞の欠如と、正常な数の機能が乏しいB細胞(T−B+NK−)を特徴とする。本明細書に示すように、SCID患者特異的誘導多能性幹細胞(iPSC)及びT細胞in vitro分化システムを使用して、JAK3欠損細胞の初期T細胞発達における完全な阻止を実証した。新規JAK3突然変異のCRISPR/Cas9増強遺伝子置換による矯正は、正常なT細胞発達を回復させ、これには、広範なT細胞受容体(TCR)レパートリーを有する成熟T細胞集団の産生を含む。矯正された細胞の全ゲノムシーケンシングは、CRISPR/Cas9オフターゲット改変がないことを実証した。ゆえに、免疫不全症を有するヒトにおけるヒトリンパ球新生の試験に関する新規のアプローチ及び遺伝子置換療法のための方法を本明細書に提供する。
男性患者を、ヘルシンキ宣言に従って治験審査委員会が承認した試験に登録した。家族歴は、免疫不全に関して陰性であった。生まれてから8カ月間、患者は、体重増加不良、下痢、及び再発性細気管支炎を有し、頻繁な入院を必要とした。患者は、重度の呼吸窮迫及び鵞口瘡により生後8カ月で入院した。気管支肺胞洗浄を伴う気管支鏡検査では、細菌(pseudomonas、H flu、S.pneumonia)及びウイルス性生物(呼吸器合抱体ウイルス)が示された。免疫学的評価により、重度の低ガンマグロブリン血症が示され、IgE<3、IgA<4、IgG=29、IgM=26であった。末梢血の免疫表現型は、B細胞は存在した(絶対B細胞数=875)ものの、CD3+T細胞及びNK細胞の完全な欠如を示した。マイトジェン試験により、コンカナバリンA、ポークウィードマイトジェン及びフィトヘマグルチニンAに対する反応の完全な欠如が示された。SCIDの診断は、遺伝子検査により確認され、JAK3遺伝子のエクソン14におけるホモ接合性C>Tヌクレオチド置換を伴い、これは、アルギニンコドン(CGA)の停止コドン(TGA)での置換をアミノ酸位置613にてもたらす。これは、このJAK3変異体(rs149316157)をSCIDの臨床例に結び付けた最初の報告である。患者は、強度減弱移植前処置に適合する非血縁骨髄移植を受け、治療から2年経って経過良好であり、免疫は完全に再構成されている。
iPSC誘導のために、5×104個の初代ケラチノサイトを、6ウェルプレートの1つのウェルに播種した。翌日に、ケラチノサイトに、1mLのウイルス上清及び4μg/mLの最終濃度でポリブレンを含有する1mLのヒトケラチノサイト培地を用いて形質導入した。ケラチノサイトを、800xgで45分間スピンフェクトした(1日目)。形質導入手順を、翌日再度繰り返した。3日目に、細胞を、新しいヒトケラチノサイト培地に交換し、さらに2日間培養した。5日目に、ケラチノサイトをトリプシン処理し、マイトマイシンC処理マウス胚性線維芽細胞(MEF)を予め播種した10cm皿に移し、ヒトケラチノサイト培地中で培養した。7日目に、細胞を、ヒトES培地に交換し、同じ皿にて3〜4週間継続して培養した。ES培地は、毎日交換した。潜在的なiPSCコロニーは、2〜3週間後に見ることができた。これらのコロニーを、個別に採取し、分析のためにMEF上で増殖させた。組み込まれたレンチウイルス及びポリシストロニックな配列を除去するために、iPSCを、Cre発現アデノウイルス(rAd−Cre−IE)に感染させた。個別のコロニーを採取し、loxPが導入された(floxed)配列のCre媒介性除去を、PCRによりプライマーgctaattcactcccaaagaagacaag(配列番号5)及びcttcagcaagccgagtcctg(配列番号6)を使用して確認した。
この手順は、前述している(Chang et al.,Broad T−cell receptor repertoire in T−lymphocytes derived from human induced pluripotent stem cells,”PloS one 9,e97335(2014))。この方法は、以下の改変を伴って使用した。6ウェルプレートの1つのウェルにおけるhiPSCの培養物を、Ohnuki et al(Ohnuki M,“Generation and characterization of human induced pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol Chapter 4:Unit 4A 2(2009))により記載されるように、CTK溶液を用いて処理して、小細胞集塊を作成した。細胞集塊を、次いで、10%FBS、1×ペニシリン/ストレプトマイシン及び100μMモノ−チオグリセロールを含有するα−MEM系培地中の2日齢のOP9細胞を予め播種しておいた10cmプレートへと移した。培地を1日おきに交換し、細胞は、継代することなく18日間培養した。18日間の共培養の後、細胞を、解離溶液(α−MEM培地中0.15%コラゲナーゼIV及び0.015%ヒアルロニダーゼ)で約30分間、その後0.25%トリプシンでさらに30分間処理することにより回収した。CD34+細胞を、次いで、抗CD34+磁性ビーズ(マイクロビーズキット;Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)上で精製した。T細胞分化のために、これらのCD34+細胞を、OP9−DL4細胞上にプレーティングし、20%FBS、5ng/mL hFlt3−L、5ng/mL hIL−7、及び10ng/mL hSCFを含有するα−MEM培地で培養した。培地を1日おきに交換し、細胞は、4日ごとに、新しいOP9−DL4プレートに移した。
hiPSCからのin vitro由来T細胞を、CD3/28ビーズ(Invitrogen,Carlsbad,CA)と製造業者のプロトコルに従って3日間インキュベートすることにより刺激してから、前述のように(Chang et al.,2014)フローサイトメトリーにより分析した。
細胞を回収し、洗浄してからLSRFortessaセルアナライザー(BD Bioscience,San Jose,CA)で分析した。細胞表面染色については、ヨウ化プロピジウム(PI,Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)を使用して、死亡細胞を除外した。アポトーシスアッセイについては、回収した細胞を、まず細胞表面抗体で30分間染色した。1×PBSで一回洗浄した後、細胞を、アネキシンV−647(Invitrogen,Carlsbad,CA)及びPIを含有する100μLのアネキシン結合バッファー(Invitrogen,Carlsbad,CA)に再懸濁し、15分間インキュベートしてから、PIを有する400μLのアネキシン結合バッファーを加えた。抗体は、別段の指定がない限り、BD Biosciencesから得た:CD3(Percp−Cy5−5、クローンUCHT1)、CD4(PE−Cy7、クローンSK3)、CD7(APC、BV510、クローンM−T701)、CD8(APC−Cy7、クローンSK1)、CD16(PE、クローンB73.1)、CD25(FITC、クローン2A3)、CD34(PE−Cy7、クローンWM59)、CD43(PE、クローン1G10)、CD56−PE(クローンMY31)、CD69(FITC、クローンL78)、NKG2D−PE(クローン1D11)、TCR−αβ(FITC、PE、クローンT10B9.1A−31)、TCR−Vδ1−FITC(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA、クローンTS8.2)、TCR−Vδ2−PE(クローンB6)、TCRVγ9−FITC(クローンB3)、TNF−α−PE−Cy7(クローンMAB11)、Beta Mark TCRレパトワキット(Beckman Coulter,Atlanta,GA)。
ポリシストロニックなOSKMベクターは、前述した(Chang et al.,”Polycistronic lentiviral vector for“hit and run”reprogramming of adult skin fibroblasts to induced pluripotent stem cells,”Stem cells 27:1042−1049(2009))。レンチ−hDL4−mCherryプラスミドは、PCR増幅ヒトDL4 cDNA(Open Biosystems,LaFayette,CO)、IRES断片(Open Biosystems)及びmCherry cDNAを、EF1αプロモーターを含有するレンチウイルスベクター(pDL171)へとクローニングすることにより構築した。PCR反応は、PrimeStarポリメラーゼ(Takara,Mountain View)を使用して行った。
IPSCを、1×非必須アミノ酸、1×ペニシリン−ストレプトマイシン、1×L−グルタミン(すべてMediatech社製、Corning,NY)を補充されたDMEM F−12、20%KnockOut Serum Replacement(Invitrogen)、2−βME(Sigma)及び5〜10ng/mL bFGF(Invitrogen)からなるES細胞培地中、E14.5 CF−1胚に由来するマイトマイシンC処理MEF上で培養した。ヒト初代ケラチノサイトは、DermaLife K Medium Complete Kit(LifeLine Cell Technology,Frederick,MD)中で培養した。OP9細胞は、ATCCから購入し、20%FBS及びペニシリン−ストレプトマイシンを有するα−MEM培地中で増殖させた。OP9−DL4細胞は、OP9細胞をhDL4及びmCherryを含有するレンチウイルスで形質導入することによって確立した。
レンチウイルスの調製のために、10μgのレンチウイルスベクター、2.5μgのエンベローププラスミド(pMDG)、及び7.5μgのパッケージングプラスミド(pCMBVdR8.9.1)を、5×106 293T細胞へとFugene 6(Roche,Nutley,NJまたはPromega,Madison,WI)によりコトランスフェクトした。ウイルス含有上清を、トランスフェクションの2日後に回収し、0.45μmフィルターに通した。
IPSCを、0.25%トリプシンを用いて5分間処理して、単一細胞懸濁液を生成した。1×PBSで2回洗浄した後、1〜2百万個の細胞を、5μgのJAK3修復プラスミド及び5μgのpX330−JAK3またはpX335−JAK3プラスミドとヌクレオフェクション(ヒト幹細胞用Nucleofectorキット,プログラムA−023,Lonza,Alpharetta,GA)のために混合して、MEF上にプレーティングした。2〜4日後、30μg/mLのG418を含有するhES培地を、プレートに加えて、薬物耐性コロニーを選択した。これらのコロニーを、3〜4週間後に採取し、ゲノムDNA抽出のために増殖させた。PCRジェノタイピングのために、5’プライマーセット(tgctaaagcgcatgctccagact(配列番号24)及びgtcttcatctcagggtcggct(配列番号25)ならびに3’プライマーセット(cctctctgtgcattatggcag(配列番号26)及びgccttctatcgccttcttg(配列番号27))を使用した。Neo選択マーカーを除去するために、hiPSCを、Cre発現アデノウィルス(rAd−Cre−IE)に感染させた。
トータルRNAを、in−vitro由来細胞からTrizol試薬(Invitrogen,Carlsbad,CA)を用いて単離した。cDNAを、0.5〜2μgのトータルRNAでSuperscriptファーストストランド合成システム(Invitrogen)を製造業者の使用説明に従って使用して合成した。SYBR Green PCRマスターミックス(Life Technologies,Carlsbad,CA)を、qPCRのために製造業者の使用説明に従って使用した。qPCRのために使用したプライマーセットは、GAPDH(F:actcctccacctttgacgct(配列番号28)、R:tcccctcttcaagggtctacatg(配列番号29));PU.1(F:gtgcaaaatggaagggtttc(配列番号30)、R:ggagctccgtgaagttgttc(配列番号31));GATA3(F:tgtttcctttcactggccaca(配列番号32)、R:aacggcaactggtgaacggta(配列番号33));BCL11B(F:ggcgatgccagaatagatgccg(配列番号34)、R:ccaggccacttggctcctctatctccaga(配列番号35));RAG1(F:ccttactgttgagactgcaatatcc(配列番号36)、R:ctgaagtcccagtatatacttcacac(配列番号37));RAG2(F:cccagaagcagtaataatcatcgag(配列番号38)、R:atgtgggatgtagtagatcttgc(配列番号39));pTa(F:gggtcttacctcagcagttac(配列番号40)、R:cctcacacagtgtgacgcag(配列番号41));BCL2(F:gactgagtacctgaaccggc(配列番号42)、R:gggccaaactgagcagagtc(配列番号43));BAX(F:aagaccagggtggttgggac(配列番号44)、R:gtaagaaaaatgcccacgtc(配列番号45));及びJAK3(F:agtcagacgtctggagcttc(配列番号46)、R:gtgagcagtgaaggcatgagtc(配列番号47))であった。すべての値は、GAPDH発現に対して正規化した。
iPSCからのDNAを、Covaris S2 Focused−ultrasonicatorを使用して剪断した:マイクロチューブ内の130μLの試料を、2回の40秒サイクルの10%のデューティサイクル、4のインテンシティー、及び200のサイクル/バーストに、周波数掃引モードにて供した。DNAチップ(DNA 1000キット;Agilent Technologies,Santa Clara,CA)分析には、Agilent 2100バイオアナライザーを使用し、これは、400bpの平均断片サイズを示した。ライブラリー調製は、NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina(NEB番号E7370)を使用して行い、最終ライブラリー濃度は、KAPA Illuminaライブラリー定量キット(KK4835;KAPA Biosystems,Wilmington,MA)及びApplied Biosystems ViiA 7リアルタイムPCRシステム(Life Technologies)を使用してqPCRにより決定した。シーケンシングクラスターは、フローセル上でIllumina TruSeq PE Cluster Kit v3−cBot−HS(PE−401−3001)及びIllumina cBotを使用して行われた。WGSを、Illumina TruSeq SBS Kit v3−HS−200サイクル(FC−401−3001)及びIllumina HiSeq 2500アップグレードを使用して行って、2×100シングルインデックスペアエンドリードをバイオインフォマティック分析のために生成した。ほぼ確実なオフターゲット部位を、CRISPR/Cas9ガイド配列をhg19基準ゲノムに対してEMBOSS fuzznucソフトウェア(v6.6.0.0)(Rice et al.,“EMBOSS:the European Molecular Biology Open Software Suite,”Trends in Genetics:TIG 16:276−277(2000))を使用して整列し、最大で3つのミスマッチを許容することで同定した;1193部位が第一のガイド配列(GTGAGATACAGATACAGACA)(配列番号48)について、257部位が第二のガイド配列(AATGATTTGCCTGGAATGCC)(配列番号49)について予測された。各試料についてのWGSからのリードのすべてを、hg19基準ゲノムに対してBWA(v0.7.5a)memアルゴリズム(Li and Durbin,“Fast and accurate long−read alignment with Burrows−Wheeler transform,”Bioinformatics 26:589−595(2010))を使用してマッピングし、重複リードを、Picard−tools(v1.100)(http://picard.sourceforge.net)を使用して除去した。局所的再アライメント(Local Realignment)及び塩基の品質の再測定をGATK(v2.7−2)(McKenna et al.,“The Genome Analysis Toolkit:a MapReduce framework for analyzing next−generation DNA sequencing data,”Genome research 20:1297−1303(2010))を使用して行った。SNV及び挿入欠失の両方を、GATK HaplotypeCallerを使用してコールした。加えて、SNV及び挿入欠失を、GATK Best Practicesに記載のように別々に再測定して、品質フィルターを適用した。4つのiPSC試料のすべてに共通する基準ゲノムからの変異体を、CRISPR/Cas9オフターゲット分析から除外した。除外されなかった変異体を、Bedtools(v2.17.0)(Quinlan and Hall,“BEDTools:a flexible suite of utilities for comparing genomic features,”Bioinformatics 26:841−842(2010))を使用してスクリーニングして、これらがほぼ確実なオフターゲット部位に当てはまるかどうかを決定した。分析により、これらの変異体はいずれもオフターゲット部位に属さないことが示され、これらの突然変異が無作為に蓄積されたことが示される。低対立遺伝子頻度(<1%、dbSNP 138)を有する機能的変異体(除外されたもの及び除外されなかったもの)をすべて、次いで、ANNOVARソフトウェアパッケージを使用して注釈をつけ、HGMD及びClinVar(v20140902)において疾患との公知の関わりについてスクリーニングした;加えて、高CADDスコア(CADD≧20)を有するヒットもすべて、GWAS Catalog及びCOSMIC(v70)を使用して複合体疾患との関わりについてスクリーニングした。確認された疾患関連変異体は、照会されたデータベースでは同定されなかった。特に興味深いことに、SNP(rs149316157)は、3.85のGERPスコア、38のCADDスコア(CADD phred−likeスコア)で、有意に有害(deleterius)であると予測されたが、JAK3 C1837T(p.R613X)突然変異も疾患と関連すると確認されなかった。それゆえ、JAK3 C1837T変異体は、SCIDの臨床例と初めて関連した。
WGSデータを、アクセッション番号SRP056149でNCBI SRAデータベースにてアクセスすることができる。
IPSCを、JAK3遺伝子のエクソン14におけるC>Tヌクレオチド置換に関してホモ接合性であるSCID患者の皮膚ケラチノサイト(Chang et al.,2009)から生成した。この突然変異は、CGAコドン(613でのアルギニン)をTGA停止コドン(p.R613X)と置き換える。上述のように、月齢4カ月の患者は、T−B+NK−臨床表現型を提示した。このSCID表現型がin vitroで再現され得るかどうかを決定するために、2段階OP9及びOP9−DL4システム(Chang et al.,2014)を使用する患者特異的iPSCのTリンパ球への分化を試みた。JAK3欠損iPSCは、健常ドナー由来の対照iPSCに匹敵する速度で増殖し、これらのiPSCは、CD34+造血祖先体(HP)へとOP9間質細胞単層上で効率的に分化した。しかしながら、JAK3欠損、iPSC由来CD34+HPを、OP9−DL4間質単層上にプレーティングしたとき、T細胞分化は、対照と比較して欠如していた(図1)。CD3+T細胞またはCD3−CD16+CD56+NK細胞は観察されず(図1A)、CD4+CD8+ダブルポジティブ(DP)、CD4+シングルポジティブ(SP)、またはCD8+シングルポジティブ(SP)T細胞は検出されなかった(図1B)。Jak3ノックアウト(KO)マウスは、生産的TCR再編成の前にCD4−CD8−ダブルネガティブ(DN)段階での胸腺分化における遮断のために小さい胸腺を有する。ヒトにおけるJAK3突然変異から生じる発達異常をさらに理解するために、T分化系列決定及びJAK3欠損細胞の成熟を、正常JAK3 WT対照と比較してアッセイした。IPSC由来CD34+細胞を、OP9−DL4単層上にプレーティングし、細胞を回収し、リンパ球マーカーについてT細胞誘導日(TD)14、21、28及び35で分析した(図4A)。正常対照では、1.2×107 CD7+細胞(リンパ球ゲート内で計数した細胞の84%)を、TD14で1〜2×106 CD34+細胞から生成した。T細胞マーカーCD4、CD8、CD3及びTCR αβを、T細胞成熟に際して順次検出した。TD35で、集団の50%超がCD8 SP細胞であった。JAK3欠損細胞では、4.5×104 CD7+細胞(リンパ球ゲート内で計数した細胞の38.9%)を、TD14で1〜2×106個のCD34+細胞から生成した。CD7+細胞の数は、長期培養中に低減し、T細胞マーカーCD3、CD4、CD8及びTCR αβは、有意に発現されなかった。初期T細胞祖先体(ETP)を通る移行期に、CD4−CD8−(DN)からCD4+CD8+(DP)への段階は、特定の転写因子の正確な活性化及び抑制によりもたらされる。対照細胞では、PU.1のサイレンシング及びGATA3及びBCL11Bの誘導(図1C)は、これらの細胞が、T分化系列決定の開始(DN2からDN3)、その後、TCR再編成へと進むことを示す。対照的に、JAK3欠損細胞では、PU.1は蓄積し、GATA3及びBCL11Bレベルは低下する(図1C)。これらのデータは、ヒトJAK3欠損細胞がDN2段階でまたはその前に停止することを示し、これは、Jak3 KOマウスにおいてT細胞が死亡する段階と類似する。興味深いことに、ヒトJAK3欠損細胞は、TCR再編成を行うために十分なRAG1、RAG2及びPTCRAを発現し得る(図1C)が、細胞は、この重要な発達段階に進むほど長く生存しない。JAK3欠損細胞のリンパ球発達におけるこれらの深刻な障害は、リンパ球祖先体の生存及び分化において重要な役割を果たすIL−7シグナル伝達の欠損により説明することができる。IL−7/JAK3シグナル伝達は、胸腺細胞恒常性を、アポトーシス調節因子のBCL2ファミリーを調節することによって維持する。Jak3 KOマウスからの胸腺細胞及び末梢T細胞は、一部にはアポトーシス促進因子であるBAXを選択的に上昇させることを通して、及び抗アポトーシス性因子であるBCL2の発現を低下させることにより、高いアポトーシス指数を有する。同様に、これらの試験では、in vitro由来ヒトJAK3欠損細胞のアポトーシスは、対照と比較して、TD10(9%対2.2%)及びTD17(7%対1.9%)と増加した(図2A)。この表現型と一致して、対照と比較してJAK3欠損細胞において、BAXレベルは増加し、BCL2レベルは低下した(図2B)。Bcl2の強制発現は、γc欠損マウスにおいてT細胞発達を救助するが、B細胞発達またはNK細胞発達は救助しない(Kondo et al.,Immunity 7:155−162(1997))。Bcl2発現Jak3 KO骨髄細胞を用いるJak3 KOマウスの移植も、末梢T細胞数を改善する(Wen et al.,Molecular and cellular biology 21:678−689(2001))。BCL2の過剰発現が、ヒトJAK3欠損細胞のT細胞発達異常を救助し得るかどうかを決定するために、in vitro由来の、JAK3欠損CD34+細胞を、EF1aプロモーターによって駆動されるBCL2−2A−GFPポリシストロンを含有するレンチウイルスで形質導入した。形質導入後、CD34+細胞を、OP9−DL4単層上にプレーティングし、NK及びT細胞マーカーについてTD28でアッセイした。CD3−CD16+CD56+NK細胞は、GFP−(JAK3−;BCL2低)またはGFP+細胞(JAK3−;BCL2+)において見いだされなかった(図2C)。これらの知見は、BCL2が、JAK3欠損細胞におけるDN段階で妨害物を放出したことを示す。興味深いことに、第二の発達停止がDP段階で明らかであった;CD8+CD4+DP陽性細胞のさらなる分化はGFP+細胞において観察されなかった(図2C)。まとめると、上記の試験は、ヒトSCID表現型を、患者由来iPSCでin vitroにて再現することができることを実証する。JAK3欠損は、DN胸腺細胞における増殖傷害をもたらす。BCL2の強制発現は、DN細胞の生存を向上し、これは、DP胸腺細胞にさらに分化する。それにもかかわらず、DP胸腺細胞は、SP T細胞へと成熟することができず、この欠損は、IL7/JAK3シグナル伝達の欠如から生じる可能性がある。
正常T細胞発達が、JAK3欠損SCID患者細胞において回復され得るかどうかを決定するために、JAK3突然変異を、iPSCにおいてCRISPR/Cas9増強遺伝子置換により矯正した。エクソン14のイントロン上流及び下流内にある6つのガイドRNAを、C1837T突然変異付近のwtCas9またはnCas9を標的とするように設計し、矯正鋳型を、遺伝子置換のために使用した(図3A)。IPSCを、D10A Cas9ニッカーゼ及び対を成すガイドRNAを発現する2つのプラスミドまたは野生型Cas9及び単一のガイドRNAを発現する単一のプラスミドでヌクレオフェクトした。細胞は、ヌクレオフェクションの後2週間、G418を含有する培地中で増殖させた。個別のコロニーを採取し、増殖させ、PCRにより遺伝子型を同定した(図3B上)。CRISPR/Cas9媒介性JAK3遺伝子矯正の効率を図3Cに示す。WT Cas9+gRNA#1からの3つのクローン、WT Cas9+gRNA#2からの3つのクローン及びCas9ニッカーゼ+対を成すgRNA#1及び#2からの6つのクローンを、サンガーシーケンシングによりさらに検証した。12の配列決定したクローンでは、2つのホモ接合性矯正クローン(Cas9ニッカーゼ+対を成すgRNA#1及び#2から1つのクローン、ならびにWT Cas9+gRNA#1から1つのクローン)及び10のヘテロ接合性矯正クローンを同定した(図3D)。JAK3遺伝子発現の回復は、RT−PCR(JAK3 mRNA)(図3B;左下パネル)及びウェスタンブロット法(JAK3タンパク質)(図3B;右下)により実証された。
オフターゲットの可能性について、CRISPR/Cas9配向性ゲノム改変は、ヒトにおける治療へのこのアプローチの使用に関していくらかの懸念を提起する。癌細胞株では、Cas9−gRNAによる比較的高いレベルのオフターゲット突然変異誘発が記載されている。ヒトSCID iPSCにおけるCRISPR/Cas9配向性JAK3矯正の特異性を決定するために、全ゲノムシーケンシングを、遺伝子置換の前後で行った。2つのヘテロ接合性及び1つのホモ接合性矯正クローンのゲノムを配列決定した。2つのヘテロ接合性クローンは、gRNA#2+野生型Cas9で矯正され、ホモ接合性クローンは、gRNA#1+gRNA#2+ニッカーゼCas9で矯正された(D10A)。20塩基CRISPRガイド配列を、可能性のあるオフターゲット部位を同定するために、ヒト基準ゲノムへとマッピングして最大3つのミスマッチを許容した。これらの部位を次いで、CRISPR/Cas9配向性遺伝子置換後のiPSC試料における変動について分析した。1つのホモ接合性及び2つのヘテロ接合性矯正iPSC株のWGS分析は、予期されたオフターゲット部位に導入された突然変異はない(SNVも挿入欠失もない)ことを実証し、これは、CRISPR/Cas9配向性遺伝子置換に関する強い特異性を示す。
T細胞発達が、JAK3遺伝子矯正後に回復したかどうかを決定するために、T細胞分化系列決定及び成熟をアッセイした。T細胞分化は、in vivoで観察される中間体:CD34+CD7+T/NK確定段階;CD7+CD4+CD8−未成熟、SP段階;CD4+CD8+DP段階;及び最後に、CD3+CD8+TCRαβ成熟段階を順次通過する。成熟T細胞は、ポリクローナルであり、増殖し、サイトカインをマイトジェンに反応して分泌する。それゆえ、JAK3矯正hiPSCは、OP9単層上で造血祖先体へと分化し、CD34+細胞は、抗CD34磁性ビーズ上で陽性選択された。これらの細胞を、OP9−DL4単層上にプレーティングし、非接着細胞を、リンパ球マーカーに関してTD14、21、28及び35で分析した(図4)。対照細胞と同様に、1〜2×106 CD34+JAK3矯正細胞は、4.7×106 CD7+細胞(リンパ球ゲート内で計数した細胞の91%)へとTD14で分化した。TD21、TD28及びTD35までさらに分化させた後、T細胞成熟マーカーCD3、CD4、CD8及びTCR αβは、豊富に観察された(図4A)。TCR再編成がJAK3矯正T細胞において再確立されたかどうかを決定するために、TCR Vβタイプ分けをフローサイトメトリーにより行い、図4Bにまとめた。JAK3矯正T細胞は、本発明者らが検査したすべてのVβセグメントを発現した(25のうち19);それゆえ、広範なTCRレパートリーが回復された。最後に、JAK3矯正T細胞における、T細胞機能の代用であるTCRシグナル伝達経路の統合性を、細胞表面活性化マーカーを抗CD3/CD28刺激の後に測定することにより検査した。刺激後3日目に、CD3+CD25+CD69+T細胞の割合(%)は、JAK3矯正T細胞において0.68%から59.7%まで増加し、対照細胞(0.01%から37.6%)においても同様に増加が観察された(図4C)。上記のこれらのデータ及び結果により、in vitro iPSCモデル系でのJAK3 C1837T(p.R613X)突然変異のCRISPR/Cas9増強遺伝子置換による矯正が、広範なTCRレパートリーを有する機能的、成熟T細胞集団を産生する能力を有する正常T細胞発達を回復させることが実証された。
CRISPR/Cas9増強遺伝子置換による鎌状赤血球貧血症に関連する突然変異の矯正
ベクター構築
両N末端及びC末端核局在化配列を有するヒトコドン最適化S.pyogenes Cas9(nls−Cas9−nls)を、px330ベクター(Addgene ID:42230)からHis6−SUMOタグをN末端で有する改変pET−28b(EMD Biosciences)ベクターへとPCRクローニングした。短いリンカーペプチド、続いて+36の正味電荷の超荷電GFP及び23アミノ酸インフルエンザウイルスヘマグルチニンHA−2変異体ペプチドINF7(GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYG)(配列番号50)を含有する遺伝子ブロックカセットを、E.coliにコドン最適化し、合成し(IDT DNA)、クローニングして、nls−Cas9−nlsのC末端に融合させた。HIV−TATペプチド(YGRKKRRQRRRPPQ))(配列番号51)コード配列も合成し(IDT DNA)、クローニングして、nls−Cas9−nlsのN末端に融合させた。
pET−SUMO−scCas9プラスミドを、LB培地中、E.coli菌株Rosetta(商標)2(DE3)細胞(EMD Millipore,Billerica,MA)へと形質転換させた。細胞を、37℃にて600nmで光学密度が0.6に達するまで増殖させた。タンパク質過剰発現の誘導は、0.5mMイソプロピル−1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(IPTG)を加え、振とう器中で18℃にて一晩培養することにより達成した。回収した細胞は、Ni結合バッファー(20mM Tris−HCl pH8.0、1.5M NaCl、25mMイミダゾール及び0.2mM TCEP)に再懸濁し、Emulsiflex C3高圧ホモジナイザー(Avestin)により溶解した。0.4%の最終濃度のポリエチレンイミン(PEI)を、清澄化ライセートへと加えて、核酸を沈殿させた。遠心分離後の上清中のタンパク質を、次いで、硫酸アンモニウムにより沈殿させて、PEIを除去し、Ni結合バッファーへと再溶解した。タンパク質は、まずHisTrapニッケルアフィニティーカラム(GE Healthcare)により精製し、その後、SUMOプロテアーゼUlp 1で4℃にて一晩消化させた。切断したHis−SUMOタグを、次いで、第二のHisTrapカラムを介して除去した。scCas9タンパク質を含有するフロースルー(flow though)を希釈して、0.5Mの最終NaCl濃度とし、HiTrapヘパリンカラム(GE Healthcare)上で、20mM Tris−HCl pH8.0、2.0M NaCl、及び0.2mM TCEPを含有するバッファーを用いたグラジエント溶出により精製した。溶出されたscCas9タンパク質を、ゲルろ過バッファー(20mM Tris−HCl pH8.0、0.5M NaCl、及び0.2mM TCEP)においてサイズ排除カラムSuperdex 200 16/600(GE Healthcare)によりさらに精製し、0.22μmフィルターを通すことにより滅菌し、Amicon Centrifugal Unit(EMD Millipore)によりカットオフを100kDaとして濃縮した。濃縮したタンパク質を、UV分光光度計により定量し、液体窒素で瞬間凍結した。
sgRNA転写のための鋳型DNAを、PCRにより、T7プロモーター及びポリA配列を加えたプライマーセットを用いて生成した。sgRNAは、T7 RNAポリメラーゼによりT7 Ribomax Express System(Promega,Madison,WI)を製造業者のマニュアルに従って使用して、in vitroで転写した。転写されたRNAは、フェノール:クロロホルム抽出、エタノール沈殿、その後MEGAclear(商標)転写クリーンアップキット(Ambion,Austin,TX)を用いたカラム精製により精製した。精製したgRNAは、UV分光光度計により定量し、−80℃の冷凍庫で保存した。
一本鎖DNA(ssODN)ドナーを、IDT DNAにより合成した。
ヒト鎌状赤血球患者iPSCは、皮膚繊維芽細胞に由来し、ペニシリン/ストレプトマイシンを含むmTeSR(商標)1培地(Stem Cell Technologies,Vancouver,CA)中、マトリゲル(BD)上で維持した。
1/10容量の10×PBSを、sgRNAへと加えて、1×最終濃度にした。sgRNAを、温度を95℃から4℃までゆっくりと低下させて、PCRサーモサイクラーでアニーリングした。アニーリング後、scCas9タンパク質を、sgRNAへと1:1.5タンパク質−対−RNAモル比で加え、すべての一過性沈殿がなくなるまで管を軽くたたいて迅速に混合した。混合物を室温で10分間、暗所でインキュベートした。次いで、1モル比の量のssODNを混合物に加え、暗所でさらに10分間インキュベートして、scCas9−sgRNA−ssODN複合体を形成した。
scCas9−sgRNA−ssODN複合体でヌクレオフェクトした細胞を、prepGEM組織DNA抽出試薬(ZyGEM,Hamilton,NZ)により製造業者のマニュアルに従って溶解し、水で1:3に希釈した。22μlのddPCR反応では、11μlの2×ddPCR混合物(Bio−rad)を、それぞれ1ulの5μM対立遺伝子特異的FAMまたは以下に記載するVIC Taqmanプローブ、それぞれ0.2μlの100μMフォワード及びリバースプライマー、ならびに8.6μlの希釈ゲノムDNAと混合した。ドロップレットを、QX200 Droplet Generator(Bio−rad,Hercules,CA)により製造業者のマニュアルに従って生成した。反応混合物を次いで、96ウェルPCRプレートへと移し、PCRを、標準的なサーマルサイクラー(Bio−rad)上で行った。PCRのためのプログラムは:工程1:95℃10分;工程2:95℃30秒;工程3:55℃1分;工程2〜3を39回反復;工程4:98℃10分;工程5:8℃保持とした。PCRを行った後、プレートを、次いで、QX200 Droplet Reader(Bio−rad)により分析した。
CRISPR/Cas9増強遺伝子置換による鎌状赤血球貧血症に関連する突然変異の矯正
iPSCは、すべての細胞型を生成する可能性を有し、それにはHSPC(ヒト幹細胞/祖先細胞)を含む;それゆえ、iPSCに基づく遺伝子療法は、鎌状赤血球症に対して根治療法を提供することができる。鎌状iPSCの矯正は、矯正されたHSPCを生成する制限されない数の細胞を提供することができ、これらの矯正されたHSPCは、自家移植のために使用することができる。重要なことに、矯正されたiPSC及びそれに由来するHSPCは、完全に特徴決定し、安全性について移植前に評価することができる。鎌状赤血球患者の繊維芽細胞に由来するiPSCのCRISPR/Cas9増強遺伝子矯正を以下に記載する。
ヒト鎌状iPSC
ヒト鎌状iPSCは、UAB Kirklin Clinicにて承諾を得た鎌状赤血球患者から得た皮膚生検の繊維芽細胞に由来した。細胞を、ペニシリン/ストレプトマイシンを有するmTeSR(商標)1培地(Stem cell Technologies)中マトリゲル(BD)上で維持した。ヒト鎌状iPSCは、コロニーをAccutase(Stem cell Technologies)とインキュベートすることにより、3〜4日ごとに継代し、単一の細胞を、10μM Rock阻害剤(Y−27632)(EMD Millipore)と共にマトリゲル被覆プレート上に播種した。1日後、培地を、Rock阻害剤を伴わずに交換した。
承諾を得た鎌状赤血球患者からの骨髄を、UABのadult sickle clinicにおいて吸引した。CD34+細胞を、抗Cd34+ビーズ上で精製し、一定分量に分け、液体窒素中に保管した。
Cas9WT
両N末端及びC末端に核局在化配列が融合しているS.pyogenes Cas9WTコード配列(nls−Cas9WT−nls)を、px330ベクター(Addgene ID:42230)からHis6−SUMOタグをN末端で有する改変されたpET−28b(EMD Biosciences)ベクターへとPCRクローニングし、pSUMO−Cas9WTプラスミドを得た。
短いリンカーペプチドを含有する合成した遺伝子ブロック(IDT DNA)及びEGFPのコード領域を、nls−Cas9WT−nlsのC末端にライゲートし、クローニングした。HIV−TATペプチドのコード配列(YGRKKRRQRRRPPQ)(配列番号51)も合成し、nls−Cas9WT−nlsのN末端にライゲートし、クローニングして、pSUMO−TAT−Cas9WT−EGFPプラスミドを得た。
+36の正味の正電荷を有する超荷電GFP(Lawrence et al.”Supercharging Proteins Can Impart Unusual Resilience,”J. Am. Chem. Soc. 129(33):10110(2007)))のE.coliコドン最適化コード配列及び短いリンカーペプチドを含有する合成された遺伝子ブロック(IDT DNA)を、nls−Cas9WT−nlsのC末端とライゲートし、クローニングし、pSUMO−Cas9WT−36GFPプラスミドを得た。
HIV−TATペプチドのコード配列(YGRKKRRQRRRPPQ)(配列番号51)を合成し、Cas9WT−36GFPのC末端とライゲートし、クローニングし、pSUMO−TAT−Cas9WT−36GFPベクターを得た。
短いリンカーペプチド、その後に+36の正味電荷を有する超荷電GFP(Lawrence,2007)及び23アミノ酸インフルエンザウイルスヘマグルチニンHA−2変異体ペプチドINF7(GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYG)(配列番号50)(Plank,1994)を含有する合成された遺伝子ブロック(IDT DNA)を、E.coliにコドン最適化し、nls−Cas9WT−nlsのC末端にライゲートし、クローニングした。HIV−TATペプチド(YGRKKRRQRRRPPQ)(配列番号51)コード配列も合成し、nls−Cas9−nlsのN末端にライゲートし、クローニングし、pSUMO−TAT−Cas9WT−36GFP−INF7プラスミドを得た。
短いリンカーで分けられたHIV−TATペプチドのためのコード領域の3縦列反復のコード配列(YGRKKRRQRRRPPQAGGGSGGSYGRKKRRQRRRPPQAGGGSGGSYGRKKRRQRRRPPQAG)(配列番号61)を、E.coliにコドン最適化し、合成し、nls−Cas9WT−nlsのC末端とライゲートし、クローニングし、pSUMO−Cas9WT−3xTATプラスミドを得た。
HIV−TATペプチドのコード配列(YGRKKRRQRRRPPQ)(配列番号51)を合成し、nls−Cas9WT−3xTATのN末端とライゲートし、クローニングし、pSUMO−TAT−Cas9WT−3xTATプラスミドを得た。
Cas9WTまたは操作した正荷電Cas9(EpcCas9)発現プラスミドを、LB培地中、E.coli菌株Rosetta(商標)2(DE3)細胞(EMD Millipore)へと形質転換した。細胞を、37℃にて600nmで光学密度が0.6に達するまで増殖させた。タンパク質過剰発現の誘導を、0.5mMイソプロピル−1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(IPTG)を加えること及び振とうインキュベータ内で18℃にて一晩培養することにより達成した。回収した細胞を、Ni結合バッファー(20mM Tris−HCl pH8.0、1.5M NaCl、25mMイミダゾール及び0.2mM TCEP)に再懸濁し、Emulsiflex C3高圧ホモジナイザー(Avestin)で溶解した。ポリエチレンイミン(PEI)を清澄化ライセート上清に加えて、0.4%の最終濃度として、核酸を沈殿させた。遠心分離後の上清を、次いで、硫酸アンモニウムにより沈殿させて、PEIを除去し、タンパク質ペレットをNi−結合バッファーに再溶解した。タンパク質溶液を、まずHisTrapニッケルアフィニティーカラム(GE Healthcare,Atlanta,GA)により精製し、その後SUMOプロテアーゼUlp1で4℃にて一晩消化した。切断したHis−SUMOタグを次いで、第二のHisTrapカラムを通過させることにより除去した。Cas9タンパク質を含有するフロースルーを、0.5Mの最終NaCl濃度に達するまで希釈し、HiTrapヘパリンカラム(GE Healthcare)上で、20mM Tris−HCl pH8.0、2.0M NaCl、及び0.2mM TCEPを含有するバッファーを用いたグラジエント溶出により精製した。溶出したCas9タンパク質を、ゲルろ過バッファー(20mM Tris−HCl pH8.0、0.5M NaCl、及び0.2mM TCEP)においてサイズ排除カラムSuperdex 200 16/600(GE Healthcare)によりさらに精製し、0.22μmフィルターを通過させることによって滅菌し、Amicon Centrifugal Unit(EMD Millipore)によりカットオフを100kDaとして濃縮した。濃縮したタンパク質を、UV分光光度計により定量し、液体窒素中で瞬間凍結し、−80℃で保管した。
sgRNA in vitro転写のためのDNA鋳型を、5’末端にT7プロモーター及び3’末端にポリA配列を加えたプライマーを用いてPCRにより生成した。sgRNAを、T7 RNAポリメラーゼによりT7 Ribomax Express Kit(Promega)を製造業者のマニュアルに従って使用して、in vitroで転写した。転写したRNAを、次いで、フェノール:クロロホルム抽出、エタノール沈殿及びMEGAclear(商標)転写クリーンアップキット(Ambion)を用いたカラム精製により単離した。sgRNAを、ヌクレアーゼ不含水に溶出し、濃度をUV分光光度計により測定した。ストックsgRNAを次いで、一定分量に分け、−80℃の冷凍庫で保管した。
Cas9タンパク質と複合体化する前に、10×PBSをストックsgRNA溶液に加えて、1×PBS最終塩濃度とした。sgRNAを、温度を95℃から4℃までゆっくりと低下させることにより、サーモサイクラーでアニーリングした。Cas9 RNPを形成するために、ストックCas9タンパク質を、アニーリングしたsgRNAに1:1.5タンパク質:RNAモル比で加え、すべての一過性沈殿がなくなるまで管を迅速に軽くたたいて完全に混合した。混合物を室温で10分間、暗所でインキュベートした。続いて、ヌクレオポレーションのためにssODNをCas9 RNPと1:1モル比で加えた。
ヌクレオポレーションの1日前に、ヒト鎌状iPSCを、accutase(Stem Cell Technologies)により剥がし、インキュベートして、10μM Rock阻害剤(Stem Cell Technologies)を補充されたmTesR1培地中の単一細胞懸濁物を得た。この単一細胞懸濁物を、6ウェルプレートへと5×105個の細胞/ウェルの密度で播種した。ヌクレオポレーションの当日、5×105個のヒト鎌状iPSC細胞を、上述のようにAccutaseで調製し、100μlのヒト幹細胞用Nucleofector溶液1(Lonza)に再懸濁し、7.5μMのCas9RNP/ssODNを、細胞懸濁物とヌクレオポレーションキュベット中で混合した。細胞を、プログラムA−023でNucleofector II(Lonza)を使用してヌクレオポレートし、予め温めておいた培地に即座に移した。細胞集団の矯正効率を、ヌクレオポレーションの2日後にアッセイした。
ヌクレオポレーションの2〜5日後、Cas9 RNP/ssODNヌクレオポレート細胞を、prepGEM組織DNA抽出試薬(ZyGEM)により製造業者のマニュアルに従って溶解し、細胞ライセートを、水で1:3に希釈した。22μlのddPCR反応では、11μlの2×ddPCR混合物(Bio−Rad)を、それぞれ1ulの5μM対立遺伝子特異的FAMまたはVIC Taqmanプローブ、それぞれ0.2μlの100μMフォワード及びリバースプライマー、ならびに8.6μlの希釈細胞ライセートと混合した。ドロップレットを、QX200 Droplet Generator(Bio−Rad)により製造業者の使用説明に従って生成した。反応混合物を次いで、96ウェルPCRプレートへと移し、PCRを、標準的なサーマルサイクラー(Bio−rad)上で行った。PCRのためのプログラムは:工程1:95℃10分;工程2:95℃30秒;工程3:55℃1分;工程2〜3を39回反復;工程4:98℃10分;工程5:8℃保持とした。PCRが完了した後、プレートを、QX200 Droplet Reader(Bio−rad)で分析した。
シングルiPSCクローンを生成するために、Cas9 RNP/ssODNヌクレオポレート鎌状iPSCを、20、10及び5細胞/ウェルの密度への連続希釈の後にBDマトリクスゲルで被覆した96ウェルプレートに播種した。10μM rock阻害剤を含む新しいmTesR1培地を、培養の最初の6日間、2日毎に交換した。rock阻害剤を含まないmTesR1培地を、6日目以降に毎日交換した。播種から10〜12日後、シングルiPSCコロニーを採取し、細胞ライセートをサンガーシーケンシングによりゲノム改変について分析した。
細胞周期を活性化させるために、凍結したヒト鎌状骨髄CD34+細胞を解凍し、CC110サイトカインカクテル(STEMCELL Technology)を補充した予め温めたStemspan培地へと再懸濁した。細胞を、37℃インキュベータにて5%CO2で培養し、新しい培地を2日間毎日部分的に交換してからヌクレオポレーションを行った。ヌクレオポレーション当日、5×105個の生存CD34+細胞を、1×PBSですすぎ、15分間の150gでの遠心分離により回収した。細胞ペレットを、100μlのP4初代細胞ヌクレオフェクション溶液(Lonza)へと再懸濁し、15μMのCas9 RNP/ssODN複合体を、細胞懸濁物とヌクレオポレーションキュベット中で混合した。細胞を、プログラムDN−100で4D−Nucleofector(Lonza)を使用してヌクレオポレートし、予め温めた培地へと即座に移した。遺伝子矯正の効率は、ヌクレオポレーションの6日後に分析した。
Cas9 RNP/ssODN複合体を用いたヌクレオポレーションの後、CD34+細胞を、Methocult培地(Stem Cell Technologies)へと35mm組織培養プレート中500〜1000細胞/mLの密度で播種した。細胞を、37℃インキュベータにて5%CO2で12〜15日間にわたって、コロニーが分析のための個別採取に十分大きくなるまで増殖させた。
CD34+細胞のCas9 RNP/ssODNを用いたヌクレオポレーションの1日後、培地を、赤血球系細胞増殖培地(1u/mLエリスロポエチン(EPO)、2nMデキサメタゾン(DEX)、1nM β−エストラジオール、20ng/mLヒトSCF、及び5ng/mLヒトIL−3を補充したStemspan SFEM(Stem Cell Technologies))へと交換した。培地を、2日毎に交換した。最初の7日間の増殖及び分化の後、培地に、より高濃度のEPO(2u/mL)を、15〜18日目に分化したRBCが回収されるまで補充した。
ヒト鎌状骨髄CD34+HSPCから分化したRBCの溶血液を、PAGEにより分離した。グロビンバンドを、ゲルから切り出し、トリプシン処理した。ペプチドを分離し、LC−MS/MSにより分析した。
鎌状HBB遺伝子を矯正するために、ヒト鎌状赤血球患者由来のiPSCをCas9WT/T2 RNP、Cas9WT−EGFP/T2、または8つの異なるEpcCas9/T2 RNP(操作された正荷電Cas9/T2 RNP)を91−nt ssODN矯正鋳型(配列番号51)と一緒に用いて、ヌクレオポレートした。Cas9/T2 RNPは、二本鎖切断を鎌状突然変異の近く(2bp下流)で誘導する。突然変異に対する切断部位の近接は、91−nt ssODN矯正鋳型を使用する鎌状突然変異のHDR(T→A)を向上させる。iPSCの集団に関するオンターゲットサンガーシーケンシングデータは、Cas9WT RNP/ssODNヌクレオポレート細胞における高い効率での鎌状突然変異の矯正を実証する(図11)。EGFP(高感度緑色蛍光タンパク質)ドメインのCas9WTのC末端での付加は、矯正のレベルに影響しなかった。
HDRに基づく遺伝子矯正及びNHEJに基づく挿入欠失の効率に与える正荷電改変の効果をさらに試験するために、ヒト鎌状iPSCを、Cas9 RNPプラスまたはマイナス91−nt ssODN矯正鋳型でヌクレオポレートした。オンターゲットサンガーシーケンシング分析により、両Cas9WT RNP及びTAT−Cas9WT−EGFPへのssODNの付加(+ssODN)が、鎌状突然変異を同様に高い効率で矯正することが実証された(図13)。しかしながら、ssODNの不在下では(−ssODN)、挿入欠失形成は、Cas9WTと比較してTAT−Cas9WT−EGFPで劇的に低かった。HDRがDSB(二本鎖切断)を必要とするため、Cas9の酵素活性は、1XTATの付加によってはあきらかに低下しない。それゆえ、挿入欠失形成における大きな矛盾は、TAT−Cas9WT−EGFPの低い形質導入効率または低い酵素活性に起因しない。
正荷電改変が細胞生存に影響するかどうかを決定するために、鎌状iPSCを、矯正ssODNを有する(+)または有さない(−)Cas9WT RNPまたは7つの異なるEpcCas9でヌクレオポレートした。ヌクレオポレーションの直後に、細胞を、培養皿にプレーティングし、増殖を48時間後に検査した。細胞生存はCas9WTで乏しく、より高い正荷電改変で劇的に増加した(図15)。優れた細胞生存が、両N末端及びC末端に正荷電改変を含有するCas9WT−36GFP及びEpcCas9で達成された(図15)。細胞生存及び矯正/挿入欠失効率を考慮すると、高い矯正、低い挿入欠失形成及び優れた細胞生存の最適なバランスは、ヒト鎌状iPSCでは、Cas9WT−36GFP及びTAT−Cas9−36GFP−INF7 RNPで達成されている。
ssODN矯正鋳型対Cas9 RNP(ssODN:Cas9 RNP)の比率は、HDR及び細胞生存にとって重要である。一本鎖ODNは、細胞に対して毒性である;それゆえ、高いssODN:Cas9 RNP比率は、ヌクレオポレーション後に細胞生存不良をもたらし得る。しかしながら、低いssODN:Cas9 RNP比率は、非効率的なHDRをもたらし得る。高い矯正効率と高い細胞生存を達成するために、ssODN:Cas9 RNP比率を最適化した。鎌状赤血球患者iPSCにおいて漸増用量のssODNを用いた鎌状突然変異矯正の効率を決定した。1:1.35のCas9WT−36GFP:T2 sgRNAモル比をこれらの実験に関して固定し、ssODN:Cas9WT−36GFP RNPのモル比を0から2.0に変動させた(r=0、0.2、0.5、1.0、1.15、1.35、1.5及び2.0)。例えば、図6のr=0.5値は、0.5のssODN:1.0のCas9WT−36GFP:1.35のT2 sgRNAである。ssODN:Cas9WT−36GFP RNPのヌクレオポレーションの48時間後に、鎌状矯正を、デジタルドロップレットPCR(ddPCR)(図16A)及びサンガーシーケンシング(図16B)により定量した。矯正率(%)(betaA/betaS対立遺伝子×100)を、r(ssODN:Cas9WT−36GFP RNP)に対してプロットした。矯正効率は、r=0.2からr=1.0で増加し、1.15で定常に達した(65.7%)。1.15を超えて増加したrは、矯正効率を有意に増加させず、細胞生存を劇的に阻害した。
理論的に、最適なCas9:sgRNAモル比は、1:1である。Cas9タンパク質のsgRNAでの飽和は、最大Cas9酵素活性を保証し、予期しないオフターゲットゲノム改変を産生し得る他の低分子RNAとの遊離Cas9相互作用の可能性を低下させる。低分子RNAは、ヌクレアーゼに対して感受性である;それゆえ、1:1を超えるCas9:sgRNAのモル比が、Ca9を飽和させるために必要であり得る。1:1.15、1:1.35及び1:1.5のCas9−36GFP:sgRNAモル比を、1.15または1.35のssODNモル比と検査して、患者iPSCにおける鎌状突然変異の最適な矯正効率を決定した。サンガーシーケンシング結果及び細胞生存分析は、最適な矯正効率及び細胞生存が、1:1:35:1.15のCas9−36GFP:sgRNA:ssODNモル比で達成されたことを実証した(図17)。
ヒト鎌状iPSCを、TAT−Cas9WT−36GFP−INF7:T2 sgRNA:ssODNを1.0:1.35:1.0のモル比で用いてヌクレオポレートし、細胞集団における矯正効率(図18)、その後、単一細胞レベルでの矯正効率を調査した(表3)。単一細胞分析については、ヌクレオポレートされたiPSCを、連続希釈の後に96ウェルプレートにプレーティングした。2週間後、シングルiPSCコロニーを採取し、ゲノムDNAを単離し、サンガーシーケンシングを行った。43個のシングルiPSCコロニーをオンターゲット改変について分析した。表3は、これらのiPSCクローンのサンガーシーケンシング結果をまとめる。43のうち28のコロニーが、少なくとも1つの矯正された対立遺伝子(A/A、A/SまたはA/挿入欠失)を含有した;それゆえ、クローンの65.1%が、少なくとも1つの矯正された対立遺伝子を含有した。少なくとも1つの矯正された対立遺伝子を含有するiPSCは、鎌状でない赤血球細胞を産生するだろう。
矯正されたDNAの再標的化は、HDRに基づく遺伝子矯正におけるCRISPR/Casシステムにとって潜在的な落とし穴である。プラスミドまたはウイルス送達と比較して、Cas9 RNPにとって再標的化のリスクは、RNPの短い半減期のために低い;しかしながら、再標的化は完全に回避することが困難である。本実施例では、鎌状突然変異は、T2 sgRNA標的化配列内に位置し、PAMからわずか2塩基対である。ssODNを用いた矯正の後、矯正されたDNAは、sgRNA標的配列と1塩基のミスマッチを含有する。この差異は、再標的化を低下させるが排除することはない。再標的化を防ぐための1つの戦略としては、ゆらぎ塩基変化を矯正鋳型に導入することである。これらの塩基変化は、翻訳されたタンパク質配列を変えないが、PAM配列のまたはその付近のDNA配列を変え、それにより矯正されたDNAはもはやCas9 RNPの標的とならないだろう。この戦略に基づき、鎌状iPSCを、TAT−Cas9WT−36GFP−INF7/T1sgRNA/T1wb−ssODN及びTAT−Cas9WT−36GFP−INF7/T2sgRNA/T2wb−ssODNでヌクレオポレートして、EpcCas9 RNPが鎌状突然変異を、ゆらぎssODNを用いて高い効率で矯正することができるかどうかを決定した。
ヒト鎌状赤血球患者iPSCのEpcCas9 RNP配向性矯正の特異性を決定するために、全ゲノムシーケンシング(WGS)を、未矯正鎌状iPSCに行い、4つのホモ接合性矯正クローンを、TAT−Cas9WT−36GFP−INF7 RNPを用いて産生した。4つの矯正されたiPSCクローンの中で、2つ(T2−cl1及びT2−cl2)は、T2 sgRNA及びゆらぎ塩基を伴わない91−nt ssODNで矯正され;1つのクローン(T1w)はT2 sgRNA及び95−nt T2wb ssODNで矯正され、1つのクローン(T1w)は、T1 sgRNA及び90−nt T1wb ssODNで矯正された(表4)。これらのWGSデータにより、4つのホモ接合性矯正iPSCクローンにおける鎌状突然変異のホモ接合性矯正及びオンターゲット挿入欠失の欠如が確認された(図20A)。T1 sgRNAに対する相同性を有する4720の潜在的なオフターゲット部位及びT2 sgRNAに対する相同性を有する1476の潜在的なオフターゲット部位(1〜5個のミスマッチ)の分析により、オフターゲット改変がないことが実証された(図20B)。さらには、Chang et al.(Cell Reports 12(10):1668−77(2015)に記載の全ゲノム配列データの分析により、sgRNAに対する相同性を有するまたは有さない配列において疾患誘発変異体はないことが実証された。4つのホモ接合性矯正クローンをTAT−Cas9WT−36GFP−INF7 RNPを用いて産生した。
鎌状赤血球患者からの初代CD34+HSPCの矯正とその後の自家移植は、SCD遺伝子療法のための強力かつ簡潔なアプローチである。EpcCas9 RNPが骨髄祖先体における鎌状突然変異も矯正できるかどうかを決定するために、獲得したCD34+HSPCを、承諾を得た鎌状赤血球患者の骨髄から得た。鎌状CD34+細胞を、抗CD34ビーズ上で精製し、細胞周期を、特定のサイトカイン(SCF、TPO及びFLT−3)を有する培地中で2日間培養することより活性化した。続いて、細胞を、Cas9WT、Cas9−36GFPまたはTAT−Cas9−3xTATプラスT2 sgRNA及びssODNでヌクレオポレートした。鎌状矯正の効率を、ヌクレオポレーションの6日後にサンガーシーケンシングにより決定した(図21A)。最も高い矯正効率は、Cas9WTで得られた;しかしながら、挿入欠失頻度は高かった。2つのEpcCas9 RNPでの矯正効率はCas9WTよりも低かったが、挿入欠失の頻度は、劇的に低かった。
患者骨髄CD34+細胞の集団において鎌状突然変異の矯正を検査することに加えて、本発明者らは、単一CD34+祖先体に由来するコロニーを分析した。TAT−Cas9WT−36GFP−INF7を用いたヌクレオポレーションの後、CD34+細胞を、半固形MethoCult培地と混合し、皿にプレーティングした。プレーティングの2週間後、単一細胞に由来するコロニーを単離し、DNAを抽出し、サンガーシークエンスを行った。本発明者らが検査したコロニーは、BFU−E(赤血球系バースト形成単位)、CFU−E(赤血球系コロニー形成単位)及びCFU−GEMM(顆粒球、赤血球、単球、巨核球コロニー形成単位)であった。図11は、典型的なBFU−E及びCFU−GEMMコロニー(A)及び得られた6つの遺伝子型の代表的なサンガーシーケンシング結果(B)を示す。表5は、それぞれ、Cas9WT、Cas9WT−36GFP、ならびにTAT−Cas9WT−3xTAT RNP及びssODNのヌクレオポレーションの後に得られた95、96、及び96コロニー(BFU−E、CFU−E及びCFU−GEMM)からのサンガーシーケンシング結果をまとめる。最も高い矯正効率は、Cas9WTで得られた(51.6%);しかしながら、Cas9WTで処理された挿入欠失/挿入欠失頻度も非常に高かった(40.0%)。このレベルの挿入欠失/挿入欠失は、ベータ−サラセミアをもたらし得る。なぜなら、これらのHSCが、限られた数の骨髄ニッチに効果的に競合し得、これらのHSCに由来する赤血球細胞がHbAを合成できないためである。Cas9WT−36GFP RNPで得られた矯正効率は低かった(28.1%)が、このレベルの矯正は、上記のような疾患を治癒するのに十分であり、挿入欠失の頻度(8.3%)は遥かに安全である。TAT−Cas9WT−3xTAT RNPについては、矯正効率(32.3%)及び挿入欠失頻度(14.6%)は中間値であった。Cas9WT、Cas9WT−36GFP、及びTAT−Cas9WT−3xTAT RNPプラスssODNのヌクレオポレーション後の矯正/挿入欠失比率は、それぞれ、1.29(51.6/40.0)、3.39(28.1/8.3)及び2.21(32.3/14.6)であった。それゆえ、3.39の矯正/挿入欠失比率を有するCas9WT−36GFPが、本発明者らの好ましいEpcCas9である。
図22Cにおけるデータは、EpcCas9 RNPが、鎌状赤血球患者骨髄CD34+HSPCにおけるヌクレオポレーションの後の細胞生存を向上させることを実証する。鎌状赤血球患者骨髄CD34+HSPCのヌクレオポレーションの後に得た赤血球系細胞コロニー(BFU−E及びCFU−E)の数を、Cas9WT、Cas9WT−36GFP、及びTAT−Cas9WT−3xTAT RNPプラスssODNと比較した。Cas9WT RPN/ssODNで得られたコロニーの数を1に正規化した。Cas9WT−36GFP RNP/ssODNで得られたコロニーの数は、Cas9WT対照と比較して2.5倍高く、TAT−Cas9WT−3xTAT RNP/ssODNは、1.6倍高かった。Epc(操作された正電荷)が、ヒト骨髄祖先体/幹細胞を一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(ssODN)の毒性作用から保護すると結論付けられた。
ヌクレオポレートされたCD34+細胞におけるEpcCas9 RNPによるゲノム編集の特異性を評価するために、ディープシーケンシング分析を5つの潜在的なオフターゲットゲノム遺伝子座にて実行した。5つの潜在的なオフターゲット部位は、Zhang MIT server(http://crispr.mit.edu)によりsgRNAに対する配列相同性に基づいて予測された上位5つの部位とした。Cas9 RNP/ssODNヌクレオポレート鎌状赤血球患者CD34+細胞では、ディープシーケンシングは、おおよそ0.1%オフターゲット挿入欠失をOT5部位にて測定した(表6)。対照的に、Cas9WT−36GFPまたはTAT−Cas9WT−3xTAT RNP/ssODNヌクレオポレート細胞では、オフターゲット改変は観察されなかった(図23)。
マウスにおける鎌状赤血球突然変異の矯正
図25は、鎌状赤血球突然変異を矯正するためにCas9 RNP/ssODNでヌクレオポレートした鎌状赤血球マウス胎児肝c−Kit+細胞の最初の移植から6週間後の血液の等電点電気泳動(IEF)ゲル分析を示す。マウス胎児肝c−kit+細胞は、ヒト臍帯血Cd34+細胞に相当する。図26は、放射線照射C57Bl6マウスへの移植後12週間でのFACS精製骨髄細胞のddPCR分析を示す。ヌクレオポレーション及び移植の12週間後、おおよそ50%の赤血球系細胞(Ter119+)及び骨髄系細胞(CD11b+及びCD11b+/GR1+)が矯正される。赤血球系細胞及び骨髄系細胞は、比較的短命である;それゆえ、これらの細胞は、移植されたHSCに由来する。B及びT細胞における矯正レベルは、12週間で二次移植後におおよそ50%まで上昇するはずである(合計で24週間)。24週間後、造血細胞のすべてではないにしても、ほとんどが長期HSC由来であるだろう。図27は、鎌状赤血球突然変異を矯正するためにCas9 RNP/ssODNでヌクレオポレートした細胞の初回移植の12週間後及び二回目移植の6週間後のマウスの血液のIEFゲル分析を示す。ヒトHbAは、鎌状赤血球突然変異を矯正するためにCas9 RNP/ssODNでヌクレオポレートしたHSCの移植後のマウスにおいて産生される。マウスヘモグロビンバンドは、さらに6週間後に消失するだろう。
Claims (76)
- 細胞のゲノム内の突然変異を矯正するための複合体であって、
a.突然変異を含む細胞の前記ゲノム内のターゲットDNAにハイブリッド形成する第一のヌクレオチド配列、及び部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第二のヌクレオチド配列を含むガイドRNA(gRNA);
b.前記ガイドRNAの前記第二のヌクレオチド配列と相互作用するRNA結合部分を含み、前記ターゲットDNAと特異的に結合してこれを切断し、二本鎖切断を作成する、超荷電(supercharged)タンパク質に作動可能に連結した組換え部位特異的ヌクレアーゼ;及び
c.前記ターゲットDNA内の前記二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリッド形成し、前記ターゲットDNA内に組み込んで、前記ターゲットDNA内の突然変異を矯正する、一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド(ssODN)を含む、前記複合体。 - 前記超荷電タンパク質が、前記ヌクレアーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に作動可能に連結している、請求項1に記載の複合体。
- 前記複合体が、前記部位特異的ヌクレアーゼのアミノ末端に作動可能に連結しているトランス活性化転写活性化因子(TAT)ペプチドをさらに含む、請求項1または2のいずれかに記載の複合体。
- 前記複合体が、前記部位特異的ヌクレアーゼのカルボキシ末端に作動可能に連結しているトランス活性化転写活性化因子(TAT)ペプチドをさらに含む、請求項1〜3のいずれかに記載の複合体。
- 前記複合体が、前記部位特異的ヌクレアーゼのカルボキシ末端に作動可能に連結している約10〜約25アミノ酸長の負荷電ペプチドをさらに含む、請求項1〜4のいずれかに記載の複合体。
- 前記負荷電ペプチドが、配列番号50を含むINF7ペプチドである、請求項5に記載の複合体。
- 前記超荷電タンパク質が、その対応する未改変タンパク質より大きな全体的な正電荷を有する、請求項1〜6のいずれかに記載の複合体。
- 前記全体的な正電荷が、約+5〜約+40である、請求項7に記載の複合体。
- 前記超荷電タンパク質が、超正荷電緑色蛍光タンパク質(GFP)である、請求項8に記載の複合体。
- 前記超荷電タンパク質が、超正荷電+36GFPである、請求項9に記載の複合体。
- 前記ターゲットDNA内の前記二本鎖切断に隣接する前記ゲノム配列にハイブリッド形成する前記ssODNが、前記ターゲットDNA内の突然変異の相同配向性修復のための鋳型である、請求項1〜10のいずれかに記載の複合体。
- 前記ssODNが、ヘモグロビンをコードする前記ゲノム配列にハイブリッド形成する、請求項11に記載の複合体。
- 前記ヌクレアーゼが、Cas9である、請求項1〜12のいずれかに記載の複合体。
- gRNA対超荷電タンパク質に作動可能に連結した部位特異的ヌクレアーゼ対ssODNのモル比が、約1:1:0.2〜約1.5:1:2.0である、請求項1〜13のいずれかに記載の複合体。
- gRNA対超荷電タンパク質に作動可能に連結した部位特異的ヌクレアーゼ対ssODNのモル比が、約1:1:1〜約1.5:1:1:15である、請求項1〜14のいずれかに記載の複合体。
- 請求項1〜15のいずれかに記載の複合体を含む細胞。
- 前記細胞が、真核細胞である、請求項16に記載の細胞。
- 前記真核細胞が、ヒト細胞である、請求項17に記載の細胞。
- 前記細胞が、生殖系列細胞、幹細胞、または前駆細胞である、請求項16〜18のいずれかに記載の細胞。
- 前記幹細胞が、誘導多能性幹細胞である、請求項19に記載の細胞。
- 前記前駆細胞が、造血幹細胞である、請求項19に記載の細胞。
- 前記細胞が、in vitro、ex vivoまたはin vivoにある、請求項16〜21のいずれかに記載の細胞。
- 細胞の集団におけるターゲットDNAの部位特異的改変の方法であって、請求項1〜15のいずれかに記載の複合体を前記細胞に導入することを含み、前記複合体が、前記細胞へと、相同配向性修復(HDR)及び前記ssODNの前記ターゲットDNAへの組込みを可能にする条件下で導入される、前記方法。
- 前記複合体が、前記細胞へとヌクレオポレーション(nucleoporation)により導入される、請求項23に記載の方法。
- 前記ターゲットDNAへと組み込まれた前記ssODNが、前記ターゲットDNA内の突然変異を矯正する、請求項23または24に記載の方法。
- 細胞の前記集団における相同配向性修復対非相同性末端結合(NHEJ)の比率が、約10〜約0.5である、請求項23〜25のいずれかに記載の方法。
- 前記突然変異が、前記細胞の少なくとも5%において矯正される、請求項23〜26のいずれかに記載の方法。
- 矯正された細胞に関する細胞生存率が、少なくとも約50%である、請求項27に記載の方法。
- gRNA対超荷電タンパク質に作動可能に連結した部位特異的ヌクレアーゼ対ssODNのモル比が、約1:1:0.2〜約1.5:1:2.0である、請求項23〜28のいずれかに記載の方法。
- 前記ターゲットDNAが、ヘモグロビンをコードする、請求項23〜29のいずれかに記載の方法。
- 前記部位特異的改変が、鎌状赤血球貧血症に関連するヘモグロビン突然変異を矯正する、請求項30に記載の方法。
- 前記部位特異的改変が、β−サラセミアに関連する突然変異を矯正する、請求項30に記載の方法。
- 対象のヘモグロビンをコードするゲノム配列内の突然変異に伴う疾患を処置する方法であって、
a.前記対象から得られた細胞の集団へと、請求項11に記載の複合体を、相同配向性修復(HDR)を可能にする条件下で導入して、ヘモグロビンをコードする前記ゲノム配列における前記突然変異を矯正すること、及び
b.ステップ(a)の前記細胞を前記対象へと移植することを含む、前記方法。 - ヘモグロビンをコードする前記ゲノム配列内の突然変異に伴う前記疾患が、鎌状赤血球症またはβ−サラセミアである、請求項33に記載の方法。
- 前記細胞が、造血幹細胞または誘導多能性幹細胞である、請求項33または34に記載の方法。
- 前記移植された細胞の少なくとも5%が、矯正された突然変異を含む、請求項33〜35のいずれかに記載の方法。
- 細胞の前記集団における相同配向性修復対非相同性末端結合の比率が、少なくとも約0.5である、請求項33〜36のいずれかに記載の方法。
- 前記複合体が、前記細胞へとヌクレオポレーションにより導入される、請求項33〜36のいずれかに記載の方法。
- T細胞障害に関連する突然変異を矯正する方法であって、前記T細胞障害を有する対象から得た細胞の集団へと:
a.前記T細胞障害に関連する突然変異を含む細胞のゲノム内のターゲットDNAにハイブリッド形成する第一のヌクレオチド配列、及び部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第二のヌクレオチド配列を含むガイドRNA(gRNA);
b.gRNAの前記第二のヌクレオチド配列と相互作用するRNA結合部分を含み、前記T細胞障害に関連する前記突然変異を含む前記ターゲットDNAと特異的に結合してこれを切断し、前記ターゲットDNA内に二本鎖切断を作成する、超荷電タンパク質に作動可能に連結した組換え部位特異的ヌクレアーゼ;及び
c.前記ターゲットDNA内の前記二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリッド形成し、前記ターゲットDNA内に組み込んで、前記T細胞障害に関連する前記突然変異を矯正する第三のヌクレオチド配列を含む一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド(ssODN)を含む複合体を導入することを含み、前記複合体が、前記細胞へと、相同配向性修復(HDR)を可能にする条件下で導入されて、前記T細胞障害に関連する前記突然変異を矯正する、前記方法。 - 前記ターゲットDNAが、Tリンパ球発達に関連するタンパク質をコードする、請求項39に記載の方法。
- 前記細胞が、造血幹細胞または多能性幹細胞からなる群より選択される、請求項39または40に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞が、誘導多能性幹細胞である、請求項41に記載の方法。
- 前記超荷電タンパク質が、前記ヌクレアーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に作動可能に連結している、請求項39〜42のいずれかに記載の方法。
- 超荷電タンパク質に作動可能に連結した前記組換え部位特異的ヌクレアーゼが、前記部位特異的ヌクレアーゼのアミノ末端に作動可能に連結したトランス活性化転写活性化因子(TAT)ペプチドをさらに含む、請求項39〜43のいずれかに記載の方法。
- 前記複合体が、前記部位特異的ヌクレアーゼのカルボキシ末端に作動可能に連結しているトランス活性化転写活性化因子(TAT)ペプチドをさらに含む、請求項39〜44のいずれかに記載の方法。
- 前記複合体が、前記部位特異的ヌクレアーゼのカルボキシ末端に作動可能に連結している約10〜約25アミノ酸長の負荷電ペプチドをさらに含む、請求項39〜45のいずれかに記載の方法。
- 前記負荷電ペプチドが、配列番号50を含むINF7ペプチドである、請求項46に記載の方法。
- 前記超荷電タンパク質が、その対応する未改変タンパク質より大きな全体的な正電荷を有する、請求項39〜47のいずれかに記載の方法。
- 前記全体的な正電荷が、約+5〜約約+40である、請求項48に記載の方法。
- 前記超荷電タンパク質が、超正荷電緑色蛍光タンパク質(GFP)である、請求項39〜49のいずれかに記載の方法。
- 前記超荷電タンパク質が、超正荷電+36GFPである、請求項50に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが、Cas9である、請求項39〜51のいずれかに記載の方法。
- gRNA対超荷電タンパク質に作動可能に連結した部位特異的ヌクレアーゼ対ssODNのモル比が、約1:1:0.2〜約1.5:1:2.0である、請求項39〜52のいずれかに記載の方法。
- 前記T細胞障害を有する対象から得た細胞の前記集団における相同配向性修復対非相同性末端結合の比率が、少なくとも約0.5である、請求項39〜53のいずれかに記載の方法。
- 前記複合体が、前記細胞へとヌクレオポレーションにより導入される、請求項39〜54のいずれかに記載の方法。
- 前記T細胞障害を有する対象から得た細胞の前記集団の少なくとも5%が、HDRを受けて、前記T細胞障害に関連する前記突然変異が矯正される、請求項39〜55のいずれかに記載の方法。
- HDRで矯正された前記細胞を単離することをさらに含む、請求項39〜56のいずれかに記載の方法。
- HDRで矯正された前記細胞を培養することをさらに含む、請求項57に記載の方法。
- 前記細胞が、増殖のための条件下で培養される、請求項58に記載の方法。
- 前記細胞が、前記細胞のT細胞への分化を促進する条件下で培養される、請求項58または59に記載の方法。
- 対象において遺伝的突然変異に伴うT細胞障害を処置する方法であって、前記対象に、請求項39〜60のいずれか一項に記載の方法により得られた細胞を移植することを含む、前記方法。
- 前記移植が、自家性である、請求項61に記載の方法。
- 前記T細胞障害が、重症複合免疫不全症である、請求項39〜62のいずれかに記載の方法。
- 細胞のゲノムにおけるT細胞障害に関連する突然変異を矯正するための複合体であって、
a.前記T細胞障害に関連する突然変異を含む細胞の前記ゲノム内のターゲットDNAにハイブリッド形成する第一のヌクレオチド配列、及び部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第二のヌクレオチド配列を含むガイドRNA(gRNA);
b.前記gRNAの前記第二のヌクレオチド配列と相互作用するRNA結合部分を含み、前記T細胞障害に関連する前記突然変異を含む前記ターゲットDNAと特異的に結合してこれを切断し、前記ターゲットDNA内に二本鎖切断を作成する、超荷電タンパク質に作動可能に連結した組換え部位特異的ヌクレアーゼ;及び
c.前記ターゲットDNA内の前記二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリッド形成し、前記ターゲットDNAに組み込んで、前記T細胞障害に関連する前記突然変異を矯正する第三のヌクレオチド配列を含む一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド(ssODN)を含む、前記複合体。 - 前記超荷電タンパク質が、前記ヌクレアーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に作動可能に連結している、請求項64に記載の複合体。
- 超荷電タンパク質に作動可能に連結した前記組換え部位特異的ヌクレアーゼが、前記部位特異的ヌクレアーゼのアミノ末端に作動可能に連結したトランス活性化転写活性化因子(TAT)ペプチドをさらに含む、請求項64または65に記載の複合体。
- 前記超荷電タンパク質が、その対応する未改変タンパク質より大きな全体的な正電荷を有する、請求項64〜66のいずれかに記載の複合体。
- 前記全体的な正電荷が、約+5〜約+40である、請求項67に記載の複合体。
- 前記超荷電タンパク質が、超正荷電緑色蛍光タンパク質(GFP)である、請求項64〜68のいずれかに記載の複合体。
- 前記超荷電タンパク質が、超正荷電+36GFPである、請求項69に記載の複合体。
- 前記ヌクレアーゼが、Cas9である、請求項64〜70のいずれかに記載の複合体。
- gRNA対超荷電タンパク質に作動可能に連結した部位特異的ヌクレアーゼ対ssODNのモル比が、約1:1:0.2〜約1.5:1:2.0である、請求項64〜71のいずれかに記載の複合体。
- 超荷電タンパク質に作動可能に連結した前記組換え部位特異的ヌクレアーゼが、超正荷電+36GFPに作動可能に連結した組換えCas9である、請求項1〜15のいずれかに記載の複合体。
- 超荷電タンパク質に作動可能に連結した前記組換え部位特異的ヌクレアーゼが、超正荷電+36GFPに作動可能に連結した組換えCas9である、請求項1〜15のいずれかに記載の複合体
- 超正荷電+36GFPが、Cas9のカルボキシ末端に作動可能に連結している、請求項74に記載の複合体。
- 前記ssODNが、ヘモグロビンをコードする前記ゲノム配列にハイブリッド形成し、配列番号52を含む、請求項74または75に記載の複合体。
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