JP2021505587A - Ｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ９改変ｃｄ３４＋ヒト造血幹・前駆細胞及びその使用 - Google Patents

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Abstract

本明細書では、一部の実施形態において、自家ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９改変ＣＤ３４＋ヒト造血幹・前駆細胞を用いて、β−サラセミアを有する対象及び鎌状赤血球症を有する対象を処置するための方法及び組成物が提供される。【選択図】図２

Description

関連出願
本出願は、２０１７年１２月５日に出願された米国仮出願第６２／５９４，６８９号、２０１８年４月２７日に出願された米国仮出願第６２／６６４，０２３号、２０１８年５月１５日に出願された米国仮出願第６２／６７１，７７０号、２０１８年９月２１日に出願された米国仮出願第６２／７３４，４３１号、及び２０１８年９月２１日に出願された米国仮出願第６２／７３４，５４３号における米国特許法第１１９条（ｅ）下の恩典を主張するものであり、これらの各内容は、その全体において参照により本明細書に援用される。
ヘモグロビン（Ｈｂ）は４個のグロビンペプチドから形成された４量体であり、各ペプチドは、鉄原子を含有するヘム基と密接に結合している。妊娠中におけるヘモグロビンの優勢形態は、２つのα−グロビン鎖と２つのγ−グロビン鎖とから構成された胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）である。出生直前に、ＨｂＦから、２つのα−グロビンポリペプチド鎖と２つのβ−グロビンポリペプチド鎖とを含有する成人ヘモグロビンに切り替わる。ＨｂＦから成人ヘモグロビンへの切替えは、１１番染色体上にあるβ−グロビン遺伝子クラスター内のγ−グロビンからβ−グロビンへの転写スイッチによって媒介される。
ヘモグロビン異常症は、ヘモグロビン分子の生成または機能に影響を及ぼす遺伝子欠損によって引き起こされる障害である。最も一般的なヘモグロビン異常症のうちの２つがβ−サラセミア及び鎌状赤血球症（ＳＣＤ）である。
β−サラセミアは、全世界において最も一般的な常染色体劣性障害の１つであり、有病率が高いのは、地中海（５〜１５％）、中近東及び西アジア（２〜５％）、東南アジア（最大１０％）、ならびに南アジア（最大１８％）の人口である（Ｃｏｌａｈ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｈｅｍａｔｏｌ ３，１０３−１１７）。人口移動に起因して、β−サラセミアは北ヨーロッパ、北米及び南米、カリブ海、オーストラリアにも見られる。現在、登録され治療を受けているβ−サラセミアメジャー患者の全世界における生存人口は、２００，０００人と推定されている（Ｇａｌａｎｅｌｌｏ，Ｒ．，Ｏｒｉｇａ，Ｒ．，２０１０．Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ ５，１１．）。
β−サラセミアは、成人ヘモグロビン（ＨｂＡ）の生成の低減または不在をもたらす変異スペクトルによって引き起こされる。種々のＨｂ形態が、種々の発達段階でもたらされる。胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）は出生前の優勢なＨｂであり、新生児期まで存続する。ＨｂＦは、２つのγ−グロビン鎖と２つのα−グロビン鎖とを含有する４量体グロビンタンパク質（α２γ２）である。新生児期後、Ｈｂの主な形態は、２つのβ−グロビン鎖と２つのα−グロビン鎖とから構成された４量体（α２β２）のＨｂＡである。ＨｂＡは、通常、成人の血液中の総ヘモグロビンの９５％超を占める。
輸血依存性β−サラセミア（ＴＤＴ）の処置には、詳細には、３〜６週間ごとの生涯にわたる輸血が含まれる。輸血療法の目的は、重症貧血の症状及び生理的後遺症を緩和するため、かつ正常な成長及び発達を維持するために、Ｈｂレベル≧９ｇ／ｄＬを保つことである。長期輸血レジメンは、疾患の特質的症状及び身体的徴候の予防に有効であるものの、大きな鉄過剰を導入しており、この鉄過剰が鉄関連の心毒性及び肝毒性による死亡につながる恐れがある。これを予防するために、鉄過剰は鉄キレートレジメンを用いて管理されており、当該レジメンは通常は若年時に開始される。キレートレジメンとの適合不良が、依然として重要な課題となっている。現在の治療法による改善にもかかわらず、クオリティーオブライフは不十分であり、３０歳までの全体的生存率はわずか５５％である。
ＳＣＤは、数百万人もの人々に影響を及ぼす、最も一般的な単一遺伝子障害の１つである。米国では１００，０００人超、ヨーロッパでは約４２，０００人が罹患していると推定されている。鎌状赤血球貧血と呼ばれる、最も重症かつ有病率が高いＳＣＤ形態は、ホモ接合性変異による常染色体劣性疾患であり、β−グロビンタンパク質においてバリンが６位のグルタミン酸を置換し、それにより脱酸素化ヘモグロビンの重合及び赤血球（ＲＢＣ）の鎌状赤血球化をもたらす。
ＳＣＤは、急性疼痛、慢性溶血、貧血、進行性組織損傷、及び臓器機能不全をもたらす、再発性急性ＶＯＣを特徴とする慢性疾患である。当該疾患は、複数の臓器に影響を及ぼし、それにより、急性胸部症候群、卒中、持続勃起症、脾臓赤血球捕捉、骨壊死、腎不全、肺高血圧、肝疾患、骨損傷、限定的成長、感染症に対する感受性増加、疲労、及び進行性認知低下などの急性及び慢性合併症が引き起こされる。
米国またはＥＵでＳＣＤを伴って生まれた小児の約９０％は成人期まで生存するが、寿命は一般集団に比べて２０〜３０年短く、死亡時の年齢中央値はおよそ４０〜５０歳となっている。
本開示は、一部の実施形態において、β−サラセミアまたは鎌状赤血球症のようなヘモグロビン異常症を処置するための方法及び組成物を提供する。遺伝子編集技術を使用して、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の非コード赤血球系統特異的エンハンサーに、正確かつ効率的に遺伝子変化を導入し、他の造血系統に影響を及ぼすことなく、赤血球前駆細胞のＢＣＬ１１Ａを特異的に下方制御する。理論に束縛されるものではないが、この非コード変化は、γ−グロビン遺伝子転写を再活性化し、赤血球（ＲＢＣ）における胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）タンパク質を上昇させ、よって疾患の重症度を緩和するものと考えられている。
したがって、一部の態様において、本開示は、ヒトＢ細胞リンパ腫１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子の赤血球系統特異的エンハンサー内の＋５８ ＤＮアーゼＩ高感受性部位（ＤＨＳ）内に遺伝子改変を有するＣＤ３４＋ヒト造血幹・前駆細胞（ｈＨＳＰＣ）を含む、組成物を提供する。一部の実施形態において、組成物はさらに、無血清凍結保存培地、５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、デキストラン−４０、または前述の試薬のうちの２つ以上の任意の組合せを含む。
一部の実施形態において、遺伝子改変は、（少なくとも１つの）挿入、欠失、変異、もしくはこれらの組合せであるか、またはそれを含む。一部の実施形態において、遺伝子改変は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介改変から生じる挿入及び欠失（すなわち、インデル）を含む。
一部の実施形態において、遺伝子改変は、ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣに、（例えば、Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓの）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ（またはＣａｓ９ヌクレアーゼをコードする核酸）と、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球系統特異的エンハンサー内の＋５８ ＤＨＳを標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、例えば、ｓｇＲＮＡ）（またはｇＲＮＡをコードする核酸）とを送達することによって生成される。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号１または配列番号２（配列番号１の改変バージョン）を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、３つの２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオアート残基を、それぞれの５’及び３’末端に、またはその付近に含む。一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼは、Ｎ末端ＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）及び／またはＣ末端ＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。一部の実施形態において、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡはリボ核タンパク質複合体として送達され、任意選択で、ｇＲＮＡ：当該エンドヌクレアーゼの重量比は１：１である。
一部の実施形態において、遺伝子改変ｈＨＳＰＣまたはｈＨＳＰＣ集団は、非改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣとの対比で０．１〜０．５のγ／（γ＋α）−グロビンｍＲＮＡ比の増加を示し、及び／または当該改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣは、非改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣとの対比で０．２〜０．６のγ／（γ＋β）−グロビンｍＲＮＡ比の増加を示す。一部の実施形態において、遺伝子改変ｈＨＳＰＣまたはｈＨＳＰＣ集団は、１５％〜５０％のＨｂＦ／（ＨｂＦ＋ＨｂＡ）タンパク質レベルのＨｂＦ平均パーセンテージを示す。一部の実施形態において、遺伝子改変ｈＨＳＰＣまたはｈＨＳＰＣ集団は、７０％〜９０％の平均アレル編集頻度を示す。
一部の実施形態において、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ集団の少なくとも７５％が、対象への改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与後少なくとも１６週間、多系統分化能を維持する。一部の実施形態において、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ集団は、少なくとも４０％または少なくとも８０％のオンターゲットインデル率を示す。一部の実施形態において、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ集団は、５％未満または１％未満のオフターゲットインデル率を示す。
他の態様において、本開示は、ヘモグロビン異常症を有する対象（例えば、ヒト対象）に、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球系統特異的エンハンサー内の＋５８ ＤＨＳ内に遺伝子改変を含むＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの用量を（例えば、注射／静脈内輸血を介して）投与することを含む方法であって、ｈＨＳＰＣが、対象に投与される輸血の回数を、ベースラインとの対比で、（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び／または２倍、３倍、４倍、５倍、もしくはそれ以上）低減するのに、及び／または対象における胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）レベルを少なくとも２０％まで増加させるのに有効な量で投与される、方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、対象におけるヘモグロビン異常症、例えば、β−サラセミアまたは鎌状赤血球症を処置する方法である。一部の実施形態において、本方法は、対象におけるＨｂＦを増加させる方法である。
一部の実施形態において、対象は１８歳以上である。一部の実施形態において、対象は１８〜３５歳である。一部の実施形態において、対象は３５歳超である。一部の実施形態において、対象は１８歳未満である。一部の実施形態において、対象は１１歳以上である。一部の実施形態において、対象は１１〜３５歳である。一部の実施形態において、対象は２歳以上である。一部の実施形態において、対象は２〜３５歳である。
一部の実施形態において、本方法は、（ａ）ヘモグロビン異常症を有する対象における幹細胞を動員することと、（ｂ）対象からＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣを収集することと、（ｃ）ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球系統特異的エンハンサー内の＋５８ ＤＨＳ内に遺伝子改変を含む改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣを生成することと、（ｄ）対象に、ステップ（ｃ）の改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの用量を、ベースラインとの対比で、投与される輸血回数を（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び／または２倍、３倍、４倍、５倍、もしくはそれ以上）低減するのに、及び／または対象における胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）レベルを少なくとも２０％まで増加させるのに有効な量で投与することとを含む。一部の実施形態において、本方法は、ヘモグロビン異常症、例えば、β−サラセミアまたは鎌状赤血球症を処置する方法である。一部の実施形態において、本方法は、対象におけるＨｂＦを増加させる方法である。一部の実施形態において、ステップ（ａ）は、対象に、ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体の阻害剤を投与することを含み、任意選択で、ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体の阻害剤はプレリキサホルである。一部の実施形態において、ステップ（ａ）はさらに、対象に顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）を投与することを含む。
一部の実施形態において、諸方法は、任意選択で、対象における幹細胞を動員する（ステップ（ａ））前、及び／または対象からＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣを収集した（ステップ（ｂ））後に、対象に赤血球を投与することを含む。
一部の実施形態において、少なくとも１５×１０６ ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ／ｋｇが、例えば、ステップ（ｂ）で、対象から収集される。
一部の実施形態において、諸方法は、任意選択で、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣを生成した（ステップ（ｃ））後であって当該ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの用量を対象に投与する（ステップ（ｄ））前に、対象にブスルファンを投与することを含む。一部の実施形態において、ブスルファンは、４ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの用量で４日間静脈内に投与されるか、または０．５ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの用量で６時間ごとに４日間静脈内に投与される。一部の実施形態において、ブスルファンの用量は、薬物動態レベルに基づき、曲線下面積（ＡＵＣ）４５００〜５５００μＭ／分、好ましくは５０００μＭ／分を達成するように調整される。
一部の実施形態において、ステップ（ｃ）の改変はインデルであり、任意選択で、ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣに、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）と、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子の＋５８ ＤＨＳを標的とするガイドＲＮＡ（例えば、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡ）とを送達することによって生成される。
一部の実施形態において、好中球の生着は、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与（ステップ（ｄ））後３５〜４５日以内、例えば、４２日以内に対象内で発生する。
一部の実施形態において、ヘモグロビン異常症を有する対象は、β−サラセミアを有する対象である。他の実施形態において、ヘモグロビン異常症を有する対象は、鎌状赤血球症を有する対象である。
一部の実施形態において、対象は、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与時期の２年の期間内、または改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与時期の後の２年の期間内に、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与時期の前の２年の期間との対比で、より少ない（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％少ない）輸血回数を必要とする。
一部の実施形態において、対象は、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与の３ヵ月後を起点に、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与から少なくとも６ヵ月間、または少なくとも１２ヵ月間の輸血低減または輸血非依存を達成する。
一部の実施形態において、対象は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）または血清フェリチンレベルの変化による評価において、ベースラインとの対比で、鉄過剰パラメーターの経時的な減少（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％の減少）を示す。一部の実施形態において、鉄過剰のパラメーターの減少は、肝臓鉄濃度（ＬＩＣ）及び／または心臓鉄量（ＣＩＣ）の減少（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％の減少）を含む。
一部の実施形態において、対象は、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与時期の２〜５年の期間内（例えば、２、３、４、または５年以内）、または改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与時期の後の２〜５年の期間内に、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与時期の前の２〜５年の期間との対比で鉄キレート療法を必要としない。
一部の実施形態において、対象は、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与時期の任意の時点または投与時期の後を起点に少なくとも３ヵ月間、少なくとも６ヵ月間、少なくとも２０％のＨｂＦレベルを示す。一部の実施形態において、対象は、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与時期の３ヵ月後または６ヵ月後を起点に少なくとも３ヵ月間、少なくとも６ヵ月間、少なくとも２０％のＨｂＦレベルを示す。一部の実施形態において、対象は、二次薬物、例えば、ヒドロキシウレア（ＨＵ）を用いた処置の不在下で、少なくとも２０％のＨｂＦレベルを示す。
一部の実施形態において、対象は、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与の６ヵ月後を起点に、重症血管閉塞発作（ＶＯＣ）の年率におけるベースラインからの相対的変化、例えば低減を示す。一部の実施形態において、対象は、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与の６ヵ月後を起点に少なくとも１２ヵ月間または少なくとも２４ヵ月間、ＶＯＣの不在を示す。
一部の実施形態において、対象は、例えば、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与後に、以下から選択されるアッセイ：疼痛スケール（１１点の数値評価スケール［ＮＲＳ］）、ＥｕｒｏＱｏｌクオリティーオブライフスケール（ＥＱ ５Ｄ ５Ｌ）、がん治療−骨髄移植の機能評価（ＦＡＣＴ−ＢＭＴ）、患者報告アウトカム測定情報システム（ＰＲＯＭＩＳ）−疲労、ＰＲＯＭＩＳ−認知機能、及び成人鎌状赤血球クオリティーオブライフ測定システム（ＡＳＣＱ−Ｍｅ）のうちの少なくとも１つを用いて、患者報告アウトカム（ＰＲＯ）の経時的な変化を経験する。
一部の実施形態において、対象は、以下の４つの溶血マーカー：網状赤血球数、アスパラギン酸トランスアミナーゼの血清中濃度、乳酸デヒドロゲナーゼ［ＬＤＨ］、及び総ビリルビンの主成分分析による測定において、溶血指数の経時的な変化を示す。一部の実施形態において、対象は、三尖弁逆流ジェット速度（ＴＲＶ）の経時的な変化を示す。
一部の実施形態において、方法はさらに、対象に赤血球を投与することを含み、赤血球は、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣを投与するステップの前に投与される。一部の実施形態において、対象は、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣを投与するステップの前に赤血球（ＲＢＣ）輸血を受けており、対象は、総Ｈｂの３０％未満のヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）及び／または１１ｇ／ｄＬ以下の総Ｈｂ濃度を有する。
一部の実施形態において、対象は、ある期間にわたり、胎児ヘモグロビンを発現する循環赤血球（Ｆ細胞）の割合の増加を示し、任意選択で少なくとも１０％の増加を示す。一部の実施形態において、対象は、ある期間にわたり、炎症及び内皮活性化マーカーの変化、末梢血白血球中に存在する遺伝子改変を伴うアレルの割合の変化、及び／または骨髄細胞中に存在する遺伝子改変を伴うアレルの割合の変化を示し、任意選択でこの期間は、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与から少なくとも３ヵ月または少なくとも６ヵ月である。
一部の実施形態において、対象に投与される改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣは、非改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣとの対比で０．１〜０．５のγ／（γ＋α）−グロビンｍＲＮＡ比の増加を示す改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣであり、及び／または当該改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣは、非改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣとの対比で０．２〜０．６のγ／（γ＋β）−グロビンｍＲＮＡ比の増加を示す。。一部の実施形態において、対象に投与される改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣは、１５％〜５０％のＨｂＦ／（ＨｂＦ＋ＨｂＡ）タンパク質レベルのＨｂＦ平均パーセンテージを示す、０．４以上の（γ＋β）／α−グロビンｍＲＮＡ比を示す、及び／または７０％〜９０％の平均アレル編集頻度を示す、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣである。一部の実施形態において、対象に投与される改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの少なくとも５０％が、対象への投与後少なくとも１６週間、多系統分化能を維持する。一部の実施形態において、対象に投与される改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣは、少なくとも４０％または少なくとも８０％のオンターゲットインデル率を示す改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣである。
一部の実施形態において、対象は、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与から生じる新生物性及び／または骨髄増殖性病変を示さない。
一部の実施形態において、用量は、少なくとも２×１０６または少なくとも３×１０６改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ／ｋｇを含む。
一部の実施形態において、方法はさらに、対象にプレリキサホルを投与することを含み、赤血球は、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣを投与するステップの前に投与される。一部の実施形態において、方法はさらに、対象に顆粒球コロニー刺激因子を投与することを含む。
本発明の１つ以上の実施形態の詳細が、以下の記述で説明される。本発明の他の特徴または利点は、以下の図面及びいくつかの実施形態の詳細な説明から、ならびに付属する特許請求の範囲から明らかになるであろう。
編集細胞が生着及び分化する能力を維持することを示す一連のグラフである。 β−サラセミア患者試料の遺伝子編集後のグロビンｍＲＮＡ比を示すグラフである。 β−サラセミア患者試料の遺伝子編集後のグロビンｍＲＮＡ比を、遺伝型で分けたデータと共に示すグラフである。 ＳＣＤ患者試料の編集後にＨｂＦタンパク質が増加することを示す一連のグラフである。
現在、輸血依存性β−サラセミア（ＴＤＴ）に対する唯一の治療処置選択は、同種造血幹細胞移植（ａｌｌｏ−ＨＳＣＴ）である。ａｌｌｏ−ＨＳＣＴに関連する顕著なリスク、例えば、重篤な感染症、移植不全、及び移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）が存在し、これらの一部は致命的であり得る。そのため移植は、頻繁には実施されず、主に、利用可能なヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合同胞ドナーが存在し、若齢（１６歳未満）であり、かつ顕著な鉄過剰を有しない対象に提案される。ＨＬＡ適合同胞ドナーが必要であることにより、ａｌｌｏ−ＨＳＣＴは、適格な患者の２５％未満が利用可能であるに過ぎず、残りの患者は生涯にわたる輸血及びキレート化が必要となる。非血縁臍帯血及びハプロタイプ一致ドナーなどの代替的ドナー源を用いた移植は、生着不全及びＧｖＨＤのリスクが高いため、実験的なものにとどまる。適切なドナーの不在、移植関連の重大なリスク、そしてＧｖＨＤ予防のために移植後免疫抑制療法を要することにより、ＴＤＴを有する対象のための、革新的可能性を備えた新規療法に対するアンメットメディカルニーズが示される。
鎌状赤血球症（ＳＣＤ）の合併症予防のための承認された療法としては、米国及びＥＵにおけるヒドロキシウレア（ＨＵ）、ならびに米国におけるＬ−グルタミン経口用粉末が挙げられる。これらの療法はＳＣＤの合併症を低減するものの、患者は依然として破綻的な血管閉塞発作（ＶＯＣ）を有し得る。さらに、ＨＵは、全ての患者に有効であるわけではなく、忍容性が良好ではなく、発がん性及び催奇形のリスクもある。同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）がＳＣＤに対する唯一の既知の治療法であるが、ＨＳＣＴは、適合ドナーがいる約２０％の患者が利用可能であるに過ぎず、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）が既知のリスクである。そのため、ＳＣＤ及び他のヘモグロビン異常症の処置に対する重大なアンメットメディカルニーズも存在する。
本明細書で提供される方法及び組成物を用いた遺伝子編集は、自家ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣのＤＮＡ配列の変化を誘導して、患者における赤血球分化の際に、γ−グロビンの発現が増加し、それにより成人赤血球系細胞におけるＨｂＦ発現レベルが増加するようにする。ＨｂＦの増加は、β−サラセミア及びＳＣＤの臨床的徴候を緩和する。
本開示のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９編集治療アプローチは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子内の非コード領域の編集によってＨｂＦ生成を回復させることである。ＢＣＬ１１Ａは、γ−グロビン遺伝子発現の転写サイレンサーであり、よってＨｂＦの負の修飾物質である。
ヘモグロビン異常症
βサラセミア
本開示の態様は、ベータサラセミア（βサラセミア）を処置する（例えば、症状及び／または臨床的徴候を緩和する）ための方法を提供する。ベータサラセミアは、ヘモグロビンの生成を低減する血液障害である。ヘモグロビンは、全身の細胞に酸素を運ぶ、赤血球中の鉄含有タンパク質である。ベータ−グロビンの欠如は、機能的ヘモグロビン量の低減につながる。
ベータサラセミアを有する対象では、低レベルのヘモグロビンにより、身体の多くの部位で酸素不足となる。十分なヘモグロビンがなければ、赤血球は正常に発達しないため、成熟赤血球が不足する。成熟赤血球の数が少ないことで貧血につながり、貧血は皮膚蒼白、虚弱、疲労、及びより重篤な合併症の原因となり得る。ベータサラセミアを有する人々は、異常な血餅を発生するリスクが高い。
ベータサラセミアは、症状の重症度に応じて、サラセミアメジャー（別称クーリー貧血）及びサラセミア中間型の２つのタイプに分類される。２つのタイプのうち、サラセミアメジャーの方がより重症である。
サラセミアメジャーの徴候及び症状は生後２年以内に現れる。小児は、生命を脅かす貧血を発症する。体重増加や期待される速度の成長が見られず（発育不全）、皮膚及び白目の黄変（黄疸）を示すことがある。患者は、脾臓、肝臓、及び心臓が肥大し、骨が奇形化する可能性がある。サラセミアメジャーを有する青年の中には思春期の遅れを経験する者もいる。サラセミアメジャーを有する多くの人々が重度の症状を有するため、赤血球供給を補充するための頻繁な輸血を必要とする。時間と共に、慢性的な輸血による鉄含有ヘモグロビンの流入は体内の鉄の蓄積につながり、肝臓、心臓、及びホルモンの問題を引き起こす恐れがある。
サラセミア中間型は、サラセミアメジャーよりも軽度である。サラセミア中間型の徴候及び症状は、幼児期及びそれ以降の人生で現れる。患者は、軽度から中等度の貧血を有し、また成長遅延及び骨の異常も有することがある。
ヘモグロビン遺伝子の変異がベータサラセミアを引き起こす。ヘモグロビン遺伝子のいくつかの変異は、いかなるベータ−グロビンの生成も妨げる。ベータ−グロビンの不在は、ベータ−ゼロ（β０）サラセミアと呼ばれる。他のヘモグロビン遺伝子変異は、低減された量ではあるが、ある程度のベータ−グロビンの生成を可能にする。低減された量のベータ−グロビンは、ベータ−プラス（β＋）サラセミアと呼ばれる。β−グロビン発現の程度が不十分（β＋）または不在（β０）であることから生じるＨｂＡ生成の度合いが、β−サラセミアの重症度を決定する。β−グロビン生成が低減した結果、赤芽球中に非複合体化α−グロビンが過剰に蓄積する。このα−グロビン／β−グロビン不均衡の臨床的意義は、以下の通りである：
１）溶血によって、全身に酸素を有効に運搬するのに十分な赤血球及びＨｂが不足する；
２）細胞膜の酸化的損傷により赤血球前駆体のアポトーシスがもたらされ、そのため無効造血がもたらされる；ならびに
３）無効造血により、脾腫、骨髄増殖、付随する骨変形、及び鉄過剰などの病的状態に至る。
Ｂ０またはＢ＋サラセミアいずれかを有することで、必ずしも疾患の重症度が予測されるとは限らないが、両方のタイプを有する人々は、サラセミアメジャー及びサラセミア中間型と診断されている。
ＨＰＦＨ表現型を有する患者は、生涯にわたり総Ｈｂの１０％〜３０％のＨｂＦレベルを維持し、しばしばＨｂＦの汎細胞分布を伴う。ＨＰＦＨを有する多くの人々は、β−サラセミアまたは鎌状赤血球症の遺伝子欠陥も保有する。ＨＰＦＨ及びβグロビン変異両方を同時に遺伝的に受け継ぐ患者は、根底にあるβ−サラセミアまたは鎌状赤血球症の臨床的症状を有しないか、または軽度形態の疾患を患う。
ＨｂＦレベルの増加は、ＨｂＦレベルを測定することができる輸血非依存性サラセミア（ＮＴＤＴ）を有する患者のβサラセミアにおける緩和及び防御因子である（Ｍｕｓａｌｌａｍ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．２０１２．Ｂｌｏｏｄ １１９，３６４−３６７）。
γ−グロビン生成が増加すると、β−サラセミアの特質である過剰な不対α−グロビン及びα／βタンパク質不均衡から生じる病態が軽減される。その結果、疾患に見られる無効造血の改善、溶血の減少、及びより高いレベルのＨｂＦを含有する赤血球の生存率が改善することによる総ヘモグロビンレベルの増加が認められる。いかなる量のＨｂＦであっても、β−サラセミア中間型を有する輸血非依存性患者に有益であるように思われることから、βサラセミアを有する患者のより低い病的状態に結び付くＨｂＦの最小閾値は存在しないように思われる（Ｍｕｓａｌｌａｍ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｂｌｏｏｄ １２１，２１９９−２２１２）。ＨｂＦレベルの増加による無効造血の結果的減少は、鉄過剰及び終末器官損傷にも正の効果を有する可能性がある（Ｔａｎｎｏ，Ｔ．ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｌ．，２０１０．Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ ３５８２８３）。
輸血依存性β−サラセミア（ＴＤＴ）の処置には、詳細には、３〜６週間ごとの生涯にわたる輸血が含まれる。輸血療法の目的は、重症貧血の症状及び生理的後遺症を緩和するため、かつ正常な成長及び発達を維持するために、Ｈｂレベル≧９ｇ／ｄＬを保つことである。長期輸血レジメンは、疾患の特質的症状及び身体的徴候の予防に有効であるものの、大きな鉄過剰を導入しており、この鉄過剰が鉄関連の心毒性及び肝毒性による死亡につながる恐れがある。これを予防するために、鉄過剰は鉄キレートレジメンを用いて管理されており、当該レジメンは通常は若年時に開始される。キレートレジメンとの適合不良が、依然として重要な課題となっている。現在の治療法による改善にもかかわらず、クオリティーオブライフは不十分であり、３０歳までの全体的生存率はわずか５５％である。
鎌状赤血球症
本開示の態様は、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）を治療する（例えば、症状及び／または臨床的徴候を緩和する）ための方法を提供する。鎌状赤血球症は、体内の細胞に酸素を供給する赤血球中の分子、ヘモグロビンに影響を及ぼす障害の一群である。この障害を有する対象は、ヘモグロビンＳと呼ばれる非定型のヘモグロビン分子を有し、このヘモグロビンＳによって赤血球は鎌状または三日月の形状に変形し得る。
ＳＣＤの徴候及び症状は、通常は幼児期に開始する。この障害の特徴としては、少ない赤血球数（貧血）、感染症の反復、及び定期的な疼痛発作が挙げられる。症状の重症度は対象によって異なる。軽度の症状を有する対象も存在すれば、より重篤な合併症のために頻繁に入院する対象も存在する。
ＳＣＤは、急性疼痛、慢性溶血、貧血、進行性組織損傷、及び臓器機能不全をもたらす、再発性急性ＶＯＣを特徴とする慢性疾患である。当該疾患は、複数の臓器に影響を及ぼし、それにより、急性胸部症候群、卒中、持続勃起症、脾臓赤血球捕捉、骨壊死、腎不全、肺高血圧、肝疾患、骨損傷、限定的成長、感染症に対する感受性増加、疲労、及び進行性認知低下などの急性及び慢性合併症が引き起こされる。
米国またはＥＵでＳＣＤを伴って生まれた小児の約９０％は成人期まで生存するが、寿命は一般集団に比べて２０〜３０年短く、死亡時の年齢中央値はおよそ４０〜５０歳となっている。
ＳＣＤの徴候及び症状は、赤血球の鎌状化によって引き起こされる。赤血球が鎌状化すると、早期に破壊され、それが貧血につながり得る。貧血は、息切れ、疲労、ならびに小児の成長及び発達の遅延を引き起こし得る。赤血球の急速な破壊は、黄疸の徴候である目及び皮膚の黄変も引き起こす可能性がある。疼痛発作は、硬く柔軟性のない鎌状赤血球が小血管内で詰まったときに生じ得る。このような発作は、組織及び臓器から酸素豊富血液を欠乏させ、特に肺、脾臓、及び脳における臓器損傷をもたらす恐れがある。ＳＣＤの特に重篤な合併症は、肺に供給する血管の高血圧（肺高血圧症）である。肺高血圧症はＳＣＤを有する成人の約３分の１で発生し、心不全につながる恐れがある。
ヘモグロビン遺伝子の変異はＳＣＤを引き起こす。ヘモグロビンは、４つのタンパク質サブユニット、典型的には、アルファ−グロビンと呼ばれる２つのサブユニットと、ベータ−グロビンと呼ばれる２つのサブユニットとからなる。ヘモグロビン遺伝子は、ベータ−グロビンを作製するための指示をもたらす。ベータ−グロビンは、ヘモグロビンの構成要素（サブユニット）である。ヘモグロビンは、４つのタンパク質サブユニット、典型的には、ベータ−グロビンの２つのサブユニットと、アルファ−グロビンと呼ばれる別のタンパク質の２つのサブユニットとからなる。ベータ−グロビンの様々なバージョンが、ヘモグロビン遺伝子の種々の変異から生じる。１つの特定のヘモグロビン遺伝子変異は、ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）として知られるベータ−グロビンの異常バージョンをもたらす。ヘモグロビン遺伝子の他の変異は、ヘモグロビンＣ（ＨｂＣ）及びヘモグロビンＥ（ＨｂＥ）などのベータ−グロビンのさらなる異常バージョンをもたらす。
胎児ヘモグロビン
本開示の一部の態様は、対象、例えば、β−サラセミア、鎌状赤血球症、または他のヘモグロビン異常症を有する対象における胎児ヘモグロビンレベルを上昇させる方法を提供する。赤血球は、主に、細胞の内外にガスを運搬する機能を果たしている。これは、ガスと結合する能力を有するヘモグロビンの構造構成要素によって促進される。発達の段階に応じて、ヒト体内で３つのタイプのヘモグロビンが合成される。胚ヘモグロビンは出生前に生成され、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）は胎児期に生成され、成人ヘモグロビンは出生後に生成される。胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ、α２γ２）は、ヒト胎児における主な酸素運搬タンパク質であり、アルファ（α）サブユニット及びガンマ（γ）サブユニットを含む。ＨｂＦは、生後約６ヵ月で発現しなくなる。成人ヘモグロビン（ＨｂＡ、α２β２）は、生後約３４週のヒトにおける主な酸素運搬タンパク質であり、アルファ（α）サブユニット及びベータ（β）サブユニットを含む。３４週後、発生スイッチによってγ−グロブリン遺伝子の転写が減少しβ−グロブリン遺伝子の転写が増加する。ベータ鎖のグルタミン酸が６位においてバリンに置換されることにより、鎌状赤血球障害が生じる。ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）と呼ばれるこの変化は、異常ヘモグロビンである。ＨｂＳは低酸素濃度に曝露されると、沈殿して、両凹の円盤ではなく鎌状に見える細長い結晶となる。鎌状赤血球症は血管における閉塞事象を特徴とし、この閉塞事象によって疼痛、臓器不全、そして場合によって死がもたらされる。ヘモグロビン異常症の多くの形態が、十分な量の正常なβ−グロビンを生成できない、または正常なβ−グロビンを完全に生成できないことによる結果であるため、γ−グロビン（ＨｂＦ）の発現を増加させることによってβ−グロビン疾患の重症度が緩和されることになる。
ＢＣＬ１１Ａ赤血球系統特異的エンハンサー
一部の実施形態において、本開示の細胞（例えば、ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ）は、ヒトＢ細胞リンパ腫１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子の赤血球系統特異的エンハンサー内の＋５８ ＤＮアーゼＩ高感受性部位（ＤＨＳ）内に遺伝子改変を含む。ＢＣＬ１１Ａはγグロビン遺伝子発現の転写サイレンサーであり、したがってＨｂＦの負の修飾物質である（Ｍｅｎｚｅｌ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００７；３９（１０）：１１９７−９；Ｌｅｔｔｒｅ Ｇ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ．２００８；１０５（３３）：１１８６９−７４；及びＵｄａ Ｍ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ．２００８；１０５（５）：１６２０−５を参照。これらのそれぞれは、全体が本明細書に援用される）。ＢＣＬ１１Ａは２番染色体上にあり、６０，４５１，１６７〜６０，５５３，５６７塩基対（ｂｐ）（ＧＲＣｈ３８）を範囲とする。この遺伝子はジンクフィンガー転写因子をコードする。ジンクフィンガー転写因子は、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を抑制し生後約６週に始まるＨｂＦ発現を下方調節する。ＢＣＬ１１Ａ遺伝子は、１０２．４ｋｂのゲノムＤＮＡに及ぶ４つのエキソンを含み、転写因子ＧＡＴＡ−１に対するイントロン２内の結合ドメインを含む。ＧＡＴＡ−１結合はＢＣＬ１１Ａ発現を向上させ、ひいてはＨｂＦ発現を抑制する。イントロン２は複数のＤＮアーゼＩ高感受性部位（ＤＨＳ）を含有し、これには転写開始点からのキロベースの距離に基づき＋５５、＋５８、及び＋６２と呼ばれる部位が含まれる。この領域内の天然ＳＮＰが、ＢＣＬ１１Ａ発現の減少や胎児Ｈｂレベルの増加と関連付けられている。これらＳＮＰは、３つのＤＮＡ高感受性部位、＋５５ ＤＨＳ、＋５８ ＤＨＳ、及び＋６２ ＤＨＳの周囲に編成されている。３つの領域のうち、＋５８ ＤＨＳ領域は、胎児Ｈｂレベルの増加に関連した主要な領域であるように思われ、またＧＡＴＡ１転写制御領域も有する。
一部の実施形態において、（例えば、以下で論じるＮＨＥＪ修復プロセスを通じての）本開示の遺伝子編集戦略、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子編集戦略は、２番染色体上の非コードＢＣＬ１１Ａ赤血球系統特異的エンハンサー内にインデルを産生して、他の造血系統での影響が予想されることなく、赤血球前駆体におけるＢＣＬ１１Ａを下方調節する。したがって、一部の実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子の＋５８ ＤＨＳ内の遺伝子改変は、少なくとも１つ（１つ以上）のインデルを含む。理論に束縛されるものではないが、この非コード変化は、γ−グロビン遺伝子転写を再活性化し、ＲＢＣにおけるＨｂＦタンパク質を上昇させるものと考えられている。
また、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列は、改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｃＤＮＡを挿入することによって修飾または不活性化することもできる。例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）による修飾または不活性化に用いるドナーは、アニーリングを可能にするための小型または大型の相同アームが隣接するＢＣＬ１１Ａ遺伝子の改変転写制御配列を含有する。本質的にはＨＤＲは、ＤＳＢ修復の間、供給される相同のＤＮＡ配列をテンプレートとして使用するエラーフリー機構である。相同組換え修復（ＨＤＲ）の比率は、転写制御配列と切断部位との間の距離の関数であるため、重複する標的部位または近くにある標的部位を選ぶことが重要である。テンプレートは相同領域に隣接する余分な配列を含むことができ、またはゲノム配列とは異なる配列を含有してもよく、このようにして配列編集が可能になる。
ＮＨＥＪまたはＨＤＲにより、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列に欠失、修飾、または不活性化を行うことに加えて、他にも様々な選択肢が考えられる。小さなまたは大きな欠失が存在する場合、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の改変転写制御配列を含有するｃＤＮＡをノックインすることができる。全長ｃＤＮＡのノック先を、好適な調節配列を伴ってまたは伴わずに、任意の「セーフハーバー」に、すなわちＢＣＬ１１Ａ遺伝子そのものではない有害性のない挿入ポイントにすることができる。このコンストラクトをＢＣＬ１１Ａ調節エレメント付近にノックインする場合、当該コンストラクトは正常な遺伝子と同様の生理的制御を有するべきである。２つ以上（例えば、１対）のヌクレアーゼを使用して転写制御配列の欠失を行ってもよいが、機能の修飾または不活性化を行うには通常はドナーが提供されなければならない。この場合、２つのｇＲＮＡ及び１つのドナー配列が供給されることになる。
本明細書では、ゲノム操作ツールを使用して、１）ＮＨＥＪ経路によって生じる欠失により、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列に対する修飾または不活性化を行うこと、２）ＨＣＲにより、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列に対する修飾または不活性化を行うこと、３）転写制御配列の少なくとも一部の欠失、及び／または改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子もしくはｃＤＮＡを遺伝子座位もしくはセーフハーバーにノックインすることにより、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列に対する修飾または不活性化を行うこと、によってゲノムに永続的な変化を創出するための、細胞のｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの方法が提供される。このような方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）ヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼを使用して、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列のゲノム座位の中またはその付近で、転写制御配列に対する永続的な欠失、挿入、または編集を行う。このようにして、本開示で示す例は、（患者の一生にわたって有望な療法を送達するのではなく）単回処置または限られた回数の処置で、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列に対する欠失、修飾、または不活性化を行う一助になり得る。
ゲノム編集
一般にゲノム編集とは、ゲノムのヌクレオチド配列を改変するプロセスを指し、正確な方法または所定の方法で行われることが好ましい。本明細書に記載のゲノム編集方法の例としては、部位特異的ヌクレアーゼを使用してゲノム内の正確な標的位置でデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を切断することにより、ゲノム中の特定の位置で１本鎖または２本鎖のＤＮＡ切断を創出する方法が挙げられる。このような切断は、近年Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２１（２），１２１−３１（２０１５）で概説されているように、相同組換え修復（ＨＤＲ）及びＮＨＥＪなどの天然の内因性細胞プロセスによって修復され得るものであり、また通常はそのように修復される。これら２つの主なＤＮＡ修復プロセスは、代替経路のファミリーからなる。ＮＨＥＪは２本鎖切断から生じたＤＮＡ末端を直接連結するが、時としてヌクレオチド配列の損失または付加を伴い、遺伝子発現を分断するまたは向上させる可能性がある。ＨＤＲは、定義されたＤＮＡ配列を切断ポイントで挿入するためのテンプレートとして、相同配列、すなわちドナー配列を利用する。相同配列は、姉妹染色分体などの内因性ゲノム内に存在してもよい。代替的に、ドナーは外因性核酸であってもよく、例えば、ヌクレアーゼ切断される座位と相同性が高い領域を有し、ただし切断される標的座位に組み込むことができる追加の配列または配列変化（欠失を含む）も含有し得るプラスミド、１本鎖オリゴヌクレオチド、２本鎖オリゴヌクレオチド、デュプレックスオリゴヌクレオチド、またはウイルスであってもよい。第３の修復機構としては、少数の欠失及び挿入が切断部位で起こり得る点において遺伝子的結果がＮＨＥＪと同様のマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）（「代替的ＮＨＥＪ」とも呼ばれる）が考えられる。ＭＭＥＪは、ＤＮＡ切断部位に隣接する少数の塩基対の相同配列を利用してさらに好ましいＤＮＡ末端修復結果を推進することができ、最近の研究ではこのプロセスにおける分子機構がさらに明らかになっている（例えば、Ｃｈｏ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ ５１８，１７４−７６（２０１５）；Ｋｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｄｖ．Ｏｎｌｉｎｅ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｓｍｂ．２９６１（２０１５）；Ｍａｔｅｏｓ−Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５１８，２５４−５７（２０１５）；Ｃｅｃｃａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５２８，２５８−６２（２０１５）を参照）。場合によっては、ＤＮＡ切断部位における潜在的マイクロホモロジーの解析に基づいて、あり得る修復結果を予測することが可能であると考えられる。
このようなゲノム編集機構の各々は、所望のゲノム変更の創出に使用することができる。ゲノム編集プロセスにおける１つのステップは、変異が意図された部位付近としての標的座位で、１つまたは２つのＤＮＡ切断（後者は２本鎖切断または２つの１本鎖切断として）を創出することであってもよい。これは、本明細書で説明し例示する部位特異的ポリペプチドの使用によって達成することができる。
部位特異的ポリペプチド（例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ）は、核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）内に２本鎖切断または１本鎖切断を導入することができる。２本鎖切断は、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路（例えば、相同性依存修復、すなわち非相同末端結合、または代替的非相同末端結合（Ａ−ＮＨＥＪ）、すなわちマイクロホモロジー媒介末端結合）を刺激し得る。ＮＨＥＪは、相同テンプレートの必要なしに、切断された標的核酸を修復することができる。このことにより、時として切断部位における標的核酸内で少数の欠失または挿入（インデル）がもたらされ、遺伝子発現の分断または変更につながり得る。ＨＤＲは、相同修復テンプレート、すなわちドナーが利用可能であるときに生じ得る。相同ドナーテンプレートは、標的核酸切断部位に隣接する配列に相同であり得る配列を含むことができる。姉妹染色分体が修復テンプレートとして細胞に使用されてもよい。ただしゲノム編集の目的においては、修復テンプレートは、外因性核酸（例えば、プラスミド、デュプレックスオリゴヌクレオチド、１本鎖オリゴヌクレオチド、２本鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルス核酸）として供給され得る。外因性ドナーテンプレートを用いて、追加の核酸配列（例えば、導入遺伝子）または改変（例えば、単一または複数の塩基変化または欠失）を相同する隣接領域間に導入して、追加のまたは変更された核酸配列も標的座位に組み込まれるようにしてもよい。ＭＭＥＪは、少数の欠失及び挿入が切断部位で生じ得るという点において、ＮＨＥＪと同様の遺伝子的結果をもたらし得る。ＭＭＥＪは、切断部位に隣接する少数の塩基対の相同配列を利用して、好ましい末端結合ＤＮＡ修復結果を促進することができる。場合によっては、ヌクレアーゼ標的領域内の潜在的マイクロホモロジーの解析に基づいて、あり得る修復結果を予測することが可能であると考えられる。
したがって一部の場合において、相同組換えは、標的核酸切断部位に外因性ポリヌクレオチド配列を挿入するのに使用することができる。外因性ポリヌクレオチド配列は、本明細書ではドナーポリヌクレオチド（またはドナー、もしくはドナー配列、もしくはポリヌクレオチドドナーテンプレート）と称される。ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部は、標的核酸切断部位に挿入することができる。ドナーポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチド配列、すなわち、標的核酸切断部位に天然には存在しない配列であってもよい。
ＮＨＥＪ及び／またはＨＤＲによる標的ＤＮＡの改変は、例えば、変異、欠失、変更、統合、遺伝子修正、遺伝子置き換え、遺伝子タグ付け、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子分断、転座、及び／または遺伝子変異をもたらし得る。ゲノムＤＮＡを欠失させ、非ネイティブ核酸をゲノムＤＮＡに組み込むプロセスは、ゲノム編集の例である。
ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼシステム
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的間隔の短回文のリピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ））ゲノム座位は、多くの原核生物（例えば、細菌及び古細菌）のゲノム内で見いだすことができる。原核生物において、ＣＲＩＳＰＲ座位は免疫システムの１タイプとして機能する産物をコードして、原核生物をウイルス及びファージなどの外部侵入者から防御する一助となる。ＣＲＩＳＰＲ座位機能には３つの段階が存在する：ＣＲＩＳＰＲ座位への新規配列の統合、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の発現、及び外部侵入者核酸のサイレンシング。５つのタイプのＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｕ型、及びＶ型）が特定されている。
ＣＲＩＳＰＲ座位は、「リピート」と呼ばれる複数の短い反復配列を含む。リピートは発現すると２次構造（例えば、ヘアピン）を形成し、及び／または非構造的１本鎖配列を含み得る。通常、リピートはクラスター内に生じ、種間で異なることが多い。リピートは、「スペーサー」と呼ばれる一意の介在配列によって規則的に間隔が置かれており、その結果、リピート−スペーサー−リピートの座位アーキテクチャーがもたらされる。スペーサーは、既知の外部侵入者配列と同一であるか、高い相同性を有する。スペーサー−リピート単位はｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードし、このｃｒＲＮＡは処理されて成熟形態のスペーサー−リピート単位になる。ｃｒＲＮＡは、標的核酸の標的化に関与する「シード」またはスペーサー配列を含む（原核生物における天然の形態では、スペーサー配列は外部侵入者核酸を標的化する）。スペーサー配列は、ｃｒＲＮＡの５’または３’末端に位置する。
また、ＣＲＩＳＰＲ座位は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列も含む。Ｃａｓ遺伝子は、原核生物におけるバイオジェネシス及びｃｒＲＮＡ機能の干渉段階に関与するエンドヌクレアーゼをコードする。一部のＣａｓ遺伝子は、相同の２次及び／または３次構造を含む。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムにおけるｃｒＲＮＡバイオジェネシスは、本質的にトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要とする。ｔｒａｃｒＲＮＡは、内因性のＲＮアーゼＩＩＩによって改変し、次にｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイにおけるｃｒＲＮＡリピートとハイブリダイズさせることができる。内因性のＲＮアーゼＩＩＩは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの切断に動員することができる。切断されたｃｒＲＮＡは、エキソリボヌクレアーゼのトリミングに供して成熟ｃｒＲＮＡ形態を生成することができる（例えば、５’トリミング）。ｔｒａｃｒＲＮＡはｃｒＲＮＡとハイブリダイズしたままでいることができ、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡは部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）と会合する。ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−Ｃａｓ９複合体のｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとハイブリダイズし得る標的核酸まで複合体を誘導することができる。ｃｒＲＮＡと標的核酸とのハイブリダイズは、標的核酸の切断のためにＣａｓ９を活性化させ得る。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムにおける標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる。本質的に、ＰＡＭは部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）と標的核酸との結合を容易にするために不可欠である。ＩＩ型システム（ＮｍｅｎｉまたはＣＡＳＳ４とも呼ばれる）は、さらにＩＩ型Ａ（ＣＡＳＳ４）及びＩＩ型Ｂ（ＣＡＳＳ４ａ）に細分される。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２）では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムがＲＮＡプログラム可能なゲノム編集に有用であることが示され、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／１７６７７２号では、部位特異的遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムにおける多数の例及び応用が提供されている。
Ｃａｓ遺伝子／ポリペプチド及びプロトスペーサー隣接モチーフ
例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドとしては、Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４２：２５７７−２５９０（２０１４）の図１にあるＣａｓ９ポリペプチドが挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子命名システムは、Ｃａｓ遺伝子が発見されて以来、多くの書き換えを経てきた。Ｆｏｎｆａｒａ（上記）の図５に、様々な種からのＣａｓ９ポリペプチドのＰＡＭ配列が示されている。
部位特異的ポリペプチド
部位特異的ポリペプチドとは、ＤＮＡ切断のためにゲノム編集で使用されるヌクレアーゼのことである。部位特異的ヌクレアーゼまたはポリペプチドは、１つ以上のポリペプチドとして、またはポリペプチドをコードする１つ以上のｍＲＮＡとして、細胞または患者に投与することができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの文脈において、部位特異的ポリペプチドはガイドＲＮＡに結合することができ、次にガイドＲＮＡは当該ポリペプチドが導かれる標的ＤＮＡ内の部位を特定する。本明細書で開示するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、部位特異的ポリペプチドは、エンドヌクレアーゼ、例えばＤＮＡエンドヌクレアーゼであり得る。
部位特異的ポリペプチドは、複数の核酸切断（すなわち、ヌクレアーゼ）ドメインを含むことができる。２つ以上の核酸切断ドメインは、リンカーを介して一緒に結合することができる。例えば、リンカーは可動性リンカーを含むことができる。リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０またはそれ以上の長さのアミノ酸を含む。
天然に存在する野生型Ｃａｓ９酵素は、２つのヌクレアーゼドメイン、１つのＨＮＨヌクレアーゼドメイン、及び１つのＲｕｖＣドメインを含む。本明細書において「Ｃａｓ９」とは、天然に存在するＣａｓ９及び組換えＣａｓ９の両方を指す。本明細書で企図されているＣａｓ９酵素は、ＨＮＨもしくはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン、及び／またはＲｕｖＣもしくはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含むことができる。
ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、ＭｃｒＡ様の折りたたみを含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、２つの逆平行のβ鎖及び１つのαヘリックスを含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、金属結合部位（例えば、２価のカチオン結合部位）を含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、標的核酸の１つの鎖（例えば、ｃｒＲＮＡ標的鎖の相補鎖）を切断することができる。
ＲｕｖＣまたはＲｒｕＣ様ドメインは、ＲＮアーゼＨまたはＲｎアーゼＨ様折りたたみを含む。ＲｕｖＣ／ＲｎアーゼＨドメインは、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方への作用を含めた多様なセットの核酸ベースの機能に関与する。ＲｎアーゼＨドメインは、複数のαヘリックスに囲まれた５つのβ鎖を含む。ＲｕｖＣ／ＲｎアーゼＨまたはＲｕｖＣ／ＲｎアーゼＨ様ドメインは、金属結合部位（例えば、２価のカチオン結合部位）を含む。ＲｕｖＣ／ＲｎアーゼＨまたはＲｕｖＣ／ＲｎアーゼＨ様ドメインは、標的核酸の１つの鎖（例えば、２本鎖標的ＤＮＡの非相補鎖）を切断することができる。
部位特異的ポリペプチドは、核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）内に２本鎖切断または１本鎖切断を導入することができる。２本鎖切断は、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路（例えば、相同性依存修復（ＨＤＲ）、またはＮＨＥＪ、または代替的非相同末端結合（Ａ−ＮＨＥＪ）、すなわちマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ））を刺激し得る。ＮＨＥＪは、相同テンプレートの必要なしに、切断された標的核酸を修復することができる。このことにより、時として切断部位における標的核酸内で少数の欠失または挿入（インデル）がもたらされ、遺伝子発現の分断または変更につながり得る。ＨＤＲは、相同修復テンプレート、すなわちドナーが利用可能であるときに生じ得る。相同ドナーテンプレートは、標的核酸切断部位に隣接する配列に相同である配列を含むことができる。姉妹染色分体が修復テンプレートとして細胞に使用されてもよい。ただしゲノム編集の目的においては、修復テンプレートは、外因性核酸（例えば、プラスミド、デュプレックスオリゴヌクレオチド、１本鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルス核酸）として供給され得る。外因性ドナーテンプレートを用いて、追加の核酸配列（例えば、導入遺伝子）または改変（例えば、単一または複数の塩基変化または欠失）を相同する隣接領域間に導入して、追加のまたは変更された核酸配列も標的座位に組み込まれるようにしてもよい。ＭＭＥＪは、少数の欠失及び挿入が切断部位で生じ得るという点において、ＮＨＥＪと同様の遺伝子的結果をもたらし得る。ＭＭＥＪは、切断部位に隣接する少数の塩基対の相同配列を利用して、好ましい末端結合ＤＮＡ修復結果を促進することができる。場合によっては、ヌクレアーゼ標的領域内の潜在的マイクロホモロジーの解析に基づいて、あり得る修復結果を予測することが可能であると考えられる。
したがって一部の場合において、相同組換えは、標的核酸切断部位に外因性ポリヌクレオチド配列を挿入するのに使用することができる。外因性ポリヌクレオチド配列は、本明細書ではドナーポリヌクレオチド（またはドナーもしくはドナー配列）と称される。ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部は、標的核酸切断部位に挿入することができる。ドナーポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチド配列、すなわち、標的核酸切断部位に天然には存在しない配列であってもよい。
ＮＨＥＪ及び／またはＨＤＲによる標的ＤＮＡの改変は、例えば、変異、欠失、変更、統合、遺伝子修正、遺伝子置き換え、遺伝子タグ付け、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子分断、転座、及び／または遺伝子変異をもたらし得る。ゲノムＤＮＡを欠失させ、非ネイティブ核酸をゲノムＤＮＡに組み込むプロセスは、ゲノム編集の例である。
部位特異的ポリペプチドは、野生型の例示的な部位特異的ポリペプチド［例えば、ＵＳ２０１４／００６８７９７の配列番号８またはＳａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，３９（２１）：９２７５−９２８２（２０１１）のＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９］に対し、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、及び他の様々な部位特異的ポリペプチドを含むことができる。部位特異的ポリペプチドは、野生型の部位特異的ポリペプチド（上記にあるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９）に対し、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を１０個の連続したアミノ酸にわたって備えることができる。部位特異的ポリペプチドは、野生型の部位特異的ポリペプチド（上記にあるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９）に対し、最大で７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を１０個の連続したアミノ酸にわたって備えることができる。部位特異的ポリペプチドは、野生型の部位特異的ポリペプチド（上記にあるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９）に対し、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメイン内の１０個の連続したアミノ酸にわたって備えることができる。部位特異的ポリペプチドは、野生型の部位特異的ポリペプチド（上記にあるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９）に対し、最大で７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメイン内の１０個の連続したアミノ酸にわたって備えることができる。部位特異的ポリペプチドは、野生型の部位特異的ポリペプチド（上記にあるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９）に対し、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン内の１０個の連続したアミノ酸にわたって備えることができる。部位特異的ポリペプチドは、野生型の部位特異的ポリペプチド（上記にあるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９）に対し、最大で７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン内の１０個の連続したアミノ酸にわたって備えることができる。
部位特異的ポリペプチドは、改変形態の野生型の例示的な部位特異的ポリペプチドを含むことができる。改変形態の野生型の例示的な部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドの核酸切断活性を低減する変異を含むことができる。改変形態の野生型の例示的な部位特異的ポリペプチドは、野生型の例示的な部位特異的ポリペプチド（例えば、上記にあるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９）の核酸切断活性の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満の核酸切断活性を有することができる。改変形態の部位特異的ポリペプチドは、実質的に核酸切断活性を有しない可能性がある。部位特異的ポリペプチドが実質的に核酸切断活性を有しない改変形態であるとき、この部位特異的ポリペプチドは本明細書では「酵素的に不活性」と呼ばれる。
改変形態の部位特異的ポリペプチドは、（例えば、２本鎖標的核酸の糖−リン酸骨格のうちの１つのみを切断することによって）標的核酸上に１本鎖切断（ＳＳＢ）を誘導できるような変異を含むことができる。当該変異は、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、上記にあるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９）の複数の核酸切断ドメインのうちの１つ以上における核酸切断活性の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、５％未満、または１％未満の核酸切断活性をもたらし得る。当該変異は、標的核酸の相補鎖の切断能力を保持し、標的核酸の非相補鎖の切断能力を低減する複数の核酸切断ドメインのうちの１つ以上をもたらし得る。当該変異は、標的核酸の非相補鎖の切断能力を保持し、標的核酸の相補鎖の切断能力を低減する複数の核酸切断ドメインのうちの１つ以上をもたらし得る。例えば、野生型の例示的なＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ポリペプチドにおける残基（例えば、Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４、及びＡｓｎ８５６）は、複数の核酸切断ドメイン（例えば、ヌクレアーゼドメイン）のうちの１つ以上を不活性化するように変異させる。変異対象の残基は、野生型の例示的なＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ポリペプチドにおける残基Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４、及びＡｓｎ８５６に対応し得る（例えば、配列及び／または構造アラインメントによって決定される）。変異の非限定的な例としては、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａが挙げられる。当業者であれば、アラニン置換以外の変異が好適であり得ると認識することになる。
Ｄ１０Ａ変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１つ以上と合わせて、実質的にＤＮＡ切断活性が欠如した部位特異的ポリペプチドを生成することができる。Ｈ８４０Ａ変異を、Ｄ１０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１つ以上と合わせて、実質的にＤＮＡ切断活性が欠如した部位特異的ポリペプチドを生成することができる。Ｎ８５４Ａ変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１つ以上と合わせて、実質的にＤＮＡ切断活性が欠如した部位特異的ポリペプチドを生成することができる。Ｎ８５６Ａ変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＤ１０Ａ変異のうちの１つ以上と合わせて、実質的にＤＮＡ切断活性が欠如した部位特異的ポリペプチドを生成することができる。１つの実質的に不活性のヌクレアーゼドメインを含む部位特異的ポリペプチドは、「ニッカーゼ」と呼ばれる。
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）のニッカーゼバリアントは、ＣＲＩＳＰＲが媒介するゲノム編集の特異性を増加させるのに使用することができる。典型的には、野生型のＣａｓ９は、標的配列内の指定された約２０ヌクレオチドの配列（例えば、内在的ゲノム座位）とハイブリダイズするように設計された単一のガイドＲＮＡによって誘導される。しかし、ガイドＲＮＡと標的座位との間にいくつかのミスマッチが許容される可能性があり、標的部位内で必要な相同性の長さが、例えばわずか１３ｎｔの相同性に効果的に低減されることにより、結果的に、標的ゲノム内の別の場所でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体による結合及び２本鎖核酸切断（オフターゲット切断としても知られる）が生じる可能性が高まる。Ｃａｓ９のニッカーゼバリアントはそれぞれ１本の鎖しか切断しないため、２本鎖切断を創出するには、１対のニッカーゼが近接して標的核酸の対向鎖上で結合することにより、２本鎖切断の等価物である１対のニックを創出する必要がある。このために求められるのは、２つの別々のガイドＲＮＡ（各ニッカーゼに対し１つ）が、近接して標的核酸の対向鎖上で結合しなければならないということである。この要件は、本質的に、２本鎖切断が発生するのに必要な相同性の最短の長さを倍増するものであり、これによってゲノム内の別の場所で２本鎖切断の事象が発生する可能性は低減され、もし２つのガイドＲＮＡ部位が存在しても、これらが２本鎖切断形成を可能にするほど十分に近接して存在する可能性は低い。当技術分野で説明されているように、ニッカーゼは、ＮＨＥＪに対しＨＤＲを促進するために使用することもできる。ＨＤＲは、所望の変化を効果的に媒介する特定のドナー配列の使用を通じて、選択された変化をゲノム内の標的部位に導入するのに使用することができる。
企図されている変異としては、置換、付加、及び欠失、またはこれらの任意の組合せが挙げられ得る。当該変異は、変異対象のアミノ酸をアラニンに変換する。当該変異は、変異対象のアミノ酸を別のアミノ酸（例えば、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、またはアルギニン）に変換する。当該変異は、変異対象のアミノ酸を非天然のアミノ酸（例えば、セレノメチオニン）に変換する。当該変異は、変異対象のアミノ酸をアミノ酸ミミック（例えば、ホスホミミック）に変換する。当該変異は、保存的変異であってもよい。例えば、当該変異は、変異対象のアミノ酸を、変異対象のアミノ酸のサイズ、形状、電荷、極性、立体構造、及び／または回転異性体に類似するアミノ酸に変換する（例えば、システイン／セリン変異、リジン／アスパラギン変異、ヒスチジン／フェニルアラニン変異）。当該変異は、リーディングフレームのシフト、及び／または未成熟終止コドンの創出を引き起こし得る。変異は、遺伝子の調節領域または１つ以上の遺伝子の発現に作用する座位に対し、変化を引き起こし得る。
部位特異的ポリペプチド（例えば、バリアントの、変異した、酵素的に不活性の、及び／または条件的に酵素的に不活性の部位特異的ポリペプチド）は、核酸を標的化することができる。部位特異的ポリペプチド（例えば、バリアントの、変異した、酵素的に不活性の、及び／または条件的に酵素的に不活性のエンドリボヌクレアーゼ）は、ＤＮＡを標的化することができる。部位特異的ポリペプチド（例えば、バリアントの、変異した、酵素的に不活性の、及び／または条件的に酵素的に不活性のエンドリボヌクレアーゼ）は、ＲＮＡを標的化することができる。
部位特異的ポリペプチドは、１つ以上の非ネイティブ配列を含むことができる（例えば、部位特異的ポリペプチドは融合タンパク質である）。
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９に対し少なくとも１５％のアミノ酸同一性を備えるアミノ酸配列と、核酸結合ドメインと、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）とを含むことができる。
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９に対し少なくとも１５％のアミノ酸同一性を備えるアミノ酸配列と、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）とを含むことができる。
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９に対し少なくとも１５％のアミノ酸同一性を備えるアミノ酸配列と、２つの核酸切断ドメインとを含むことができ、核酸切断ドメインの一方または両方は、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９からのヌクレアーゼドメインに対し少なくとも５０％のアミノ酸同一性を備える。
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９に対し少なくとも１５％のアミノ酸同一性を備えるアミノ酸配列と、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）と、非ネイティブ配列（例えば、核局在化シグナル）または部位特異的ポリペプチドを非ネイティブ配列に結合させるリンカーとを含むことができる。
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９に対し少なくとも１５％のアミノ酸同一性を備えるアミノ酸配列と、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）とを含むことができ、部位特異的ポリペプチドは、核酸切断ドメインの一方または両方に、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％低減する変異を含む。
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９に対し少なくとも１５％のアミノ酸同一性を備えるアミノ酸配列と、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）とを含むことができ、ヌクレアーゼドメインの一方はアスパラギン酸１０の変異を含み、及び／またはヌクレアーゼドメインの一方はヒスチジン８４０の変異を含むことができ、当該変異はヌクレアーゼドメイン（複数可）の切断活性を少なくとも５０％低減する。
１つ以上の部位特異的ポリペプチド（例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ）は、ゲノム内の特定の座位に１つの２本鎖切断を共にもたらす２つのニッカーゼ、またはゲノム内の特定の座位に２つの２本鎖切断を共にもたらすまたは起こす４つのニッカーゼを含むことができる。代替的に、１つの部位特異的ポリペプチド（例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ）は、ゲノム内の特定の座位に１つの２本鎖切断をもたらすまたは起こすことができる。
部位特異的ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方で１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）に隣接していてもよい。例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、２つのＮＬＳ（一方のＮＬＳはＮ末端に位置し、第２のＮＬＳはＣ末端に位置する）に隣接していてもよい。ＮＬＳは、当技術分野で知られている任意のＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ）とすることができる。
ゲノム標的化核酸
本開示は、関連ポリペプチド（例えば、部位特異的ポリペプチド）の活性を標的核酸中の特定の標的配列に向けることができるゲノム標的化核酸を提供する。ゲノム標的化核酸は、ＲＮＡであり得る。ゲノム標的化ＲＮＡは、本明細書では「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」と呼ばれる。ガイドＲＮＡは、目的の標的核酸配列とハイブリダイズする少なくとも１つのスペーサー配列及びＣＲＩＳＰＲリピート配列を含むことができる。ＩＩ型システムにおいては、ｇＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡも含む。ＩＩ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）においては、ＣＲＩＳＰＲリピート配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、互いにハイブリダイズしてデュプレックスを形成する。Ｖ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）においては、ｃｒＲＮＡがデュプレックスを形成する。両方のシステムにおいて、このデュプレックスは部位特異的ポリペプチドに結合し、それによってガイドＲＮＡ及び部位特異的ポリペプチドは複合体を形成することができる。ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドとの会合によって、複合体に標的特異性を提供することができる。したがって、ゲノム標的化核酸は部位特異的ポリペプチドの活性を向けることができる。
例示的なガイドＲＮＡとしては、配列表における、配列番号１または２のスペーサー配列、ならびに配列番号１または配列番号２のｓｇＲＮＡ配列が挙げられる。当業者が理解するように、各ガイドＲＮＡは、自らのゲノム標的配列に対し相補的なスペーサー配列を含めるように設計することができる。例えば、配列表における配列番号１〜３の各スペーサー配列を、（対応するｔｒａｃｒＲＮＡと共に）単一のＲＮＡキメラまたはｃｒＲＮＡに入れてもよい。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，８１６−８２１（２０１２）及びＤｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７１，６０２−６０７（２０１１）を参照。
ゲノム標的化核酸は、二重分子ガイドＲＮＡであり得る。ゲノム標的化核酸は、単一分子ガイドＲＮＡであり得る。
二重分子ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの２本鎖を含むことができる。第１の鎖は、５’から３’の方向に、任意選択のスペーサー延長配列、スペーサー配列、及び最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列を含む。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列に対し相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含むことができる。
ＩＩ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’の方向に、任意選択のスペーサー延長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含むことができる。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長は、ガイドＲＮＡに追加の機能性（例えば、安定性）をもたらすエレメントを含むことができる。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を結合して、ヘアピン構造を形成することができる。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長は、１つ以上のヘアピンを含むことができる。
Ｖ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’の方向に、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列及びスペーサー配列を含むことができる。
ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０ヌクレオチドのスペーサー配列を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０ヌクレオチド未満のスペーサー配列を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０ヌクレオチドを超えるスペーサー配列を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に１７〜３０ヌクレオチドの可変長のスペーサー配列を含むことができる。
ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端にウラシルを含まない場合がある。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１つ以上のウラシルを含むことができる。例えば、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１つのウラシル（Ｕ）を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に２つのウラシル（ＵＵ）を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に３つのウラシル（ＵＵＵ）を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に４つのウラシル（ＵＵＵＵ）を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に５つのウラシル（ＵＵＵＵＵ）を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に６つのウラシル（ＵＵＵＵＵＵ）を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に７つのウラシル（ＵＵＵＵＵＵＵ）を含むことができる。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に８つのウラシル（ＵＵＵＵＵＵＵＵ）を含むことができる。
ｓｇＲＮＡは、非改変であっても改変されていてもよい。例えば、改変ｓｇＲＮＡは、１つ以上の２’−Ｏ−メチル ホスホロチオアートヌクレオチドを含むことができる。
例示として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムで使用するガイドＲＮＡ、または他のより低分子のＲＮＡは、以下に例示し当技術分野で説明されているように、化学的手段によって容易に合成することができる。化学合成手順が継続的に拡大している一方で、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、これはＰＡＧＥなどのゲルの使用を回避する）などの手順によるこのようなＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチド長が１００ヌクレオチド程度を顕著に上回って増加するにつれて、難易度が高くなる傾向がある。より長いＲＮＡを産生するために用いる１つのアプローチは、共にライゲーションした２つ以上の分子を生成することである。さらに長いＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡ）は、より容易に酵素的に産生される。様々なタイプのＲＮＡ改変、例えば、安定性の向上、自然免疫応答の可能性または程度の低減、及び／または当技術分野で説明されているような他の特質を向上させる改変を、ＲＮＡの化学合成及び／または酵素的産生の最中または後に導入することができる。
スペーサー延長配列
ゲノム標的化核酸の一部の例において、スペーサー延長配列は、活性を改変し、安定性を提供し、及び／またはゲノム標的化核酸が改変を行う位置を提供することができる。スペーサー延長配列は、オンもしくはオフターゲット活性または特異性を改変することができる。一部の例において、スペーサー延長配列が提供され得る。スペーサー延長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、または７０００、またはそれ以上のヌクレオチドを超える長さを有することができる。スペーサー延長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００またはそれ以上のヌクレオチド未満の長さを有することができる。スペーサー延長配列は、１０ヌクレオチド長未満であってもよい。スペーサー延長配列は、１０〜３０ヌクレオチド長であってもよい。スペーサー延長配列は、３０〜７０ヌクレオチド長であってもよい。
スペーサー延長配列は、別の部分（例えば、安定性制御配列、エンドリボヌクレアーゼ結合配列、リボザイム）を含むことができる。当該部分は、核酸標的核酸の安定性を減少または増加させることができる。当該部分は、転写終結セグメント（すなわち、転写終結配列）であり得る。当該部分は、真核生物内で機能することができる。当該部分は、原核生物内で機能することができる。当該部分は、真核生物内及び原核生物内の両方で機能することができる。好適な部分の非限定的な例としては、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７ Ｇ））、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及びタンパク質複合体による安定性調節及び／または接近可能性調節を可能にする）、ｄｓＲＮＡデュプレックス（例えば、ヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内の位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する配列、トラッキングをもたらす改変または配列（例えば、蛍光分子への直接結合、蛍光検出を容易にする部分への結合、蛍光検出を可能にする配列など）、及び／またはタンパク質に結合部位をもたらす改変または配列（例えば、転写活性化因子、転写制御、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含めた、ＤＮＡに対して作用するタンパク質）が挙げられる。
スペーサー配列
スペーサー配列は、目的の標的核酸の配列とハイブリダイズする。ゲノム標的化核酸のスペーサーは、ハイブリダイズによる配列特異的な方法（すなわち、塩基対合）で、標的核酸と相互作用することができる。スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の配列に応じて変動し得る。
本明細書におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、スペーサー配列は、当該システムで使用するＣａｓ９酵素のＰＡＭの５’に位置する標的核酸とハイブリダイズするように設計することができる。スペーサーは、標的配列に完全にマッチすることもあればミスマッチを有することもある。各Ｃａｓ９酵素は、標的ＤＮＡ内で認識する特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓは標的核酸内で配列５’−ＮＲＧ−３’（式中、ＲはＡまたはＧのいずれかを含み、Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｎはスペーサー配列に標的化された標的核酸配列の３’のすぐ近くにある）を含むＰＡＭを認識する。
標的核酸配列は、２０ヌクレオチドを含むことができる。標的核酸は、２０ヌクレオチド未満を含むことができる。標的核酸は、２０ヌクレオチド超を含むことができる。標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、またはそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。標的核酸は、最大で５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、またはそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。標的核酸配列は、ＰＡＭにおける第１のヌクレオチドの５’のすぐ近くに２０塩基を含むことができる。例えば、５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＲＧ−３’（配列番号３）を含む配列において、標的核酸は、Ｎに対応する配列を含むことができる（式中、Ｎは任意のヌクレオチドであり、下線付きのＮＲＧ配列は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＰＡＭである）。
標的核酸とハイブリダイズするスペーサー配列は、少なくとも約６ヌクレオチド（ｎｔ）の長さを有することができる。スペーサー配列は、少なくとも約６ｎｔ、少なくとも約１０ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔ、または少なくとも約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約８０ｎｔ、約６ｎｔ〜約５０ｎｔ、約６ｎｔ〜約４５ｎｔ、約６ｎｔ〜約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約３５ｎｔ、約６ｎｔ〜約３０ｎｔ、約６ｎｔ〜約２５ｎｔ、約６ｎｔ〜約２０ｎｔ、約６ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、または約２０ｎｔ〜約６０ｎｔとすることができる。一部の例において、スペーサー配列は２０ヌクレオチドを含むことができる。一部の例において、スペーサーは１９ヌクレオチドを含むことができる。
一部の例において、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％である。一部の例において、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、最大約３０％、最大約４０％、最大約５０％、最大約６０％、最大約６５％、最大約７０％、最大約７５％、最大約８０％、最大約８５％、最大約９０％、最大約９５％、最大約９７％、最大約９８％、最大約９９％、または１００％である。一部の例において、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、標的核酸の相補鎖の標的配列の最も５’側にある連続した６ヌクレオチドについて１００％である。スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、連続した約２０ヌクレオチドについて少なくとも６０％であり得る。スペーサー配列及び標的核酸の長さは、１〜６ヌクレオチドだけ相違することがあり、これはバルジ（単数または複数）として考えられ得る。
スペーサー配列は、コンピュータープログラムを用いて設計または選択することができる。コンピュータープログラムは、予測融解温度、２次構造形成、予測アニーリング温度、配列同一性、ゲノム文脈、クロマチン接近可能性、ＧＣ％、ゲノム出現頻度（例えば、同一の配列、または類似するがミスマッチ、挿入、もしくは欠失の結果１つ以上のスポットで異なる配列について）、メチル化状態、ＳＮＰの存在などの変数を使用することができる。
最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列
最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、参照ＣＲＩＳＰＲリピート配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのｃｒＲＮＡ）に対し、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を有する配列であり得る。
最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、細胞内で最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチドを含むことができる。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、デュプレックス、すなわち塩基が対合した二本鎖構造を形成することができる。共に、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、部位特異的ポリペプチドに結合することができる。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とハイブリダイズすることができる。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対し、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の相補性を備えることができる。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対し、最大で約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の相補性を備えることができる。
最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、約７ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有することができる。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の長さは、約７ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約７ｎｔ〜約４０ｎｔ、約７ｎｔ〜約３０ｎｔ、約７ｎｔ〜約２５ｎｔ、約７ｎｔ〜約２０ｎｔ、約７ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔである。一部の例において、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、およそ９ヌクレオチド長であってもよい。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、およそ１２ヌクレオチド長であってもよい。
最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、ひと続きの連続した少なくとも６、７、または８ヌクレオチドについて、参照の最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからの野生型ｃｒＲＮＡ）に対し、少なくとも約６０％同一であってもよい。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、ひと続きの連続した少なくとも６、７、または８ヌクレオチドについて、参照の最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列に対し、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一であってもよい。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからの野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）に対し、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を有する配列であり得る。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、細胞内で最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列とハイブリダイズするヌクレオチドを含むことができる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、デュプレックス、すなわち塩基が対合した二本鎖構造を形成することができる。共に、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び最小ＣＲＩＳＰＲリピートは、部位特異的ポリペプチドに結合することができる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも一部は、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列とハイブリダイズすることができる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列に対し、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％相補的であることができる。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有することができる。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約７ｎｔ〜約４０ｎｔ、約７ｎｔ〜約３０ｎｔ、約７ｎｔ〜約２５ｎｔ、約７ｎｔ〜約２０ｎｔ、約７ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さであってもよい。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ９ヌクレオチド長であってもよい。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ１２ヌクレオチドであってもよい。最小ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（上記）に記載のｔｒａｃｒＲＮＡ ｎｔ２３〜４８からなっていてもよい。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ひと続きの連続した少なくとも６、７、または８ヌクレオチドにわたって、参照の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからの野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列に対し、少なくとも約６０％同一であってもよい。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ひと続きの連続した少なくとも６、７、または８ヌクレオチドにわたって、参照の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対し、少なくとも約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一、または１００％同一であってもよい。
最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間のデュプレックスは、二重らせんを含むことができる。最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間のデュプレックスは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、またはそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間のデュプレックスは、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、またはそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。
デュプレックスは、ミスマッチを含み得る（すなわち、デュプレックスの２本鎖は１００％相補的ではない）。デュプレックスは、少なくとも約１、２、３、４、または５つのミスマッチを含み得る。デュプレックスは、最大で約１、２、３、４、または５つのミスマッチを含み得る。デュプレックスは、２つ以下のミスマッチを含み得る。
バルジ
一部の場合において、最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間のデュプレックスに「バルジ」が存在することがある。バルジとは、デュプレックス中のヌクレオチドにおける対合していない領域のことである。バルジは、デュプレックスが部位特異的ポリペプチドと結合する一助となり得る。バルジは、デュプレックスの一方の側に対合していない５’−ＸＸＸＹ−３’（式中、Ｘは任意のプリンであり、Ｙは対向鎖上のヌクレオチドとゆらぎ対合を形成することができるヌクレオチドを含む）と、二重鎖の他方の側に対合していないヌクレオチド領域とを含むことができる。デュプレックスの２つの側における対合していないヌクレオチドの数は異なり得る。
一例において、バルジは、対合していないプリン（例えば、アデニン）をバルジの最小ＣＲＩＳＰＲリピート鎖上に含むことができる。一部の例において、バルジは、バルジの最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖の対合していない５’−ＡＡＧＹ−３’を含むことができ、式中、Ｙは最小ＣＲＩＳＰＲリピート鎖のヌクレオチドとゆらぎ対合を形成することができるヌクレオチドを含む。
デュプレックスのうち、最小ＣＲＩＳＰＲリピート側のバルジは、少なくとも１、２、３、４、または５、またはそれ以上の対合していないヌクレオチドを含むことができる。デュプレックスのうち、最小ＣＲＩＳＰＲリピート側のバルジは、最大で１、２、３、４、または５、またはそれ以上の対合していないヌクレオチドを含むことができる。デュプレックスのうち、最小ＣＲＩＳＰＲリピート側のバルジは、１つの対合していないヌクレオチドを含むことができる。
デュプレックスのうち、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側のバルジは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、またはそれ以上の対合していないヌクレオチドを含むことができる。デュプレックスのうち、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側のバルジは、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、またはそれ以上の対合していないヌクレオチドを含むことができる。デュプレックスのうち、第２の側（例えば、デュプレックスのうち、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側）のバルジは、４つの対合していないヌクレオチドを含むことができる。
バルジは、少なくとも１つのゆらぎ対合を含むことができる。一部の例において、バルジは、最大で１つのゆらぎ対合を含むことができる。バルジは、少なくとも１つのプリンヌクレオチドを含むことができる。バルジは、少なくとも３つのプリンヌクレオチドを含むことができる。バルジ配列は、少なくとも５つのプリンヌクレオチドを含むことができる。バルジ配列は、少なくとも１つのグアニンヌクレオチドを含むことができる。一部の例において、バルジ配列は、少なくとも１つのアデニンヌクレオチドを含むことができる。
ヘアピン
様々な例において、１つ以上のヘアピンは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内で最小ｔｒａｃｒＲＮＡに対し３’側に位置することができる。
ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲリピート及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列のデュプレックスにおける最後の対合ヌクレオチドから３’側の少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０、またはそれ以上のヌクレオチドで開始することができる。ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲリピート及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列のデュプレックスにおける最後の対合ヌクレオチドの３’側の最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、またはそれ以上のヌクレオチドで開始することができる。
ヘアピンは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０、またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含むことができる。ヘアピンは、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含むことができる。
ヘアピンは、ＣＣジヌクレオチド（すなわち、２つの連続したシトシンヌクレオチド）を含むことができる。
ヘアピンは、デュプレックスヌクレオチド（すなわち、ヘアピン内の共にハイブリダイズしたヌクレオチド）を含むことができる。例えば、ヘアピンは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のヘアピンデュプレックス内に、ＧＧジヌクレオチドとハイブリダイズしたＣＣジヌクレオチドを含むことができる。
ヘアピンのうちの１つ以上は、部位特異的ポリペプチドのガイドＲＮＡ相互作用領域と相互作用することができる。
一部の例では２つ以上のヘアピンが存在し、他の例では３つ以上のヘアピンが存在する。
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのｔｒａｃｒＲＮＡ）に対し、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有することができる。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約６ｎｔ〜約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約３０ｎｔ、約６ｎｔ〜約２５ｎｔ、約６ｎｔ〜約２０ｎｔ、約６ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さを有することができる。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、およそ１４ヌクレオチドの長さを有することができる。
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ひと続きの連続した少なくとも６、７、または８ヌクレオチドにわたって、参照の３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからの野生型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）に対し、少なくとも約６０％同一であってもよい。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ひと続きの連続した少なくとも６、７、または８ヌクレオチドにわたって、参照の３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからの野生型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）に対し、少なくとも約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一、または１００％同一であってもよい。
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、２つ以上のデュプレックス領域（例えば、ヘアピン、ハイブリダイズ領域）を含むことができる。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、２つのデュプレックス領域を含むことができる。
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ステムループ構造を含むことができる。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ内のステムループ構造は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５または２０、またはそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ内のステムループ構造は、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０、またはそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。ステムループ構造は、機能的部分を含むことができる。例えば、ステムループ構造は、アプタマー、リボザイム、タンパク質相互作用ヘアピン、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、及びエキソンを含むことができる。ステムループ構造は、少なくとも約１、２、３、４、または５、またはそれ以上の機能的部分を含むことができる。ステムループ構造は、最大で約１、２、３、４、または５、またはそれ以上の機能的部分を含むことができる。
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内のヘアピンは、Ｐドメインを含むことができる。一部の例において、Ｐドメインはヘアピン内の２本鎖領域を含むことができる。
ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列
ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡが単一分子ガイドの文脈にあるか二重分子ガイドの文脈にあるかにかかわらず提供することができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、約１ヌクレオチド〜約４００ヌクレオチドの長さを有することができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、または４００ヌクレオチドを超える長さを有することができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、約２０〜約５０００またはそれ以上のヌクレオチドの長さを有することができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１０００ヌクレオチドを超える長さを有することができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、またはそれ以上のヌクレオチド未満の長さを有することができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１０００ヌクレオチド未満の長さを有することができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１０ヌクレオチド長未満を含むことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１０〜３０ヌクレオチド長であってもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、３０〜７０ヌクレオチド長であってもよい。
ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、機能的部分（例えば、安定性制御配列、リボザイム、エンドリボヌクレアーゼ結合配列）を含むことができる。この機能的部分は、転写終結セグメント（すなわち、転写終結配列）を含むことができる。機能的部分は、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）〜約１００ヌクレオチド、約１０ｎｔ〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、約９０ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの全長を有することができる。機能的部分は、真核細胞内で機能することができる。機能的部分は、原核細胞内で機能することができる。機能的部分は、真核細胞内及び原核細胞内の両方で機能することができる。
好適なｔｒａｃｒＲＮＡ延長機能的部分の非限定的な例としては、３’ポリアデニル化テール、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及びタンパク質複合体による安定性調節及び／または接近可能性調節を可能にする）、ｄｓＲＮＡデュプレックス（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内の位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する配列、トラッキングをもたらす改変または配列（例えば、蛍光分子への直接結合、蛍光検出を容易にする部分への結合、蛍光検出を可能にする配列など）、及び／またはタンパク質に結合部位をもたらす改変または配列（例えば、転写活性化因子、転写制御、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含めた、ＤＮＡに対して作用するタンパク質）が挙げられる。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、プライマー結合部位または分子指標（例えば、バーコード配列）を含むことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列は、１つ以上のアフィニティータグを含むことができる。
単一分子ガイドリンカー配列
単一分子ガイド核酸のリンカー配列は、約３ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有することができる。例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（上記）では、シンプルな４ヌクレオチドの「テトラループ」（−ＧＡＡＡ−）が使用された（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２））。例示的なリンカーは、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約９０ｎｔ、約３ｎｔ〜約８０ｎｔ、約３ｎｔ〜約７０ｎｔ、約３ｎｔ〜約６０ｎｔ、約３ｎｔ〜約５０ｎｔ、約３ｎｔ〜約４０ｎｔ、約３ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３ｎｔ〜約２０ｎｔ、約３ｎｔ〜約１０ｎｔの長さを有する。例えば、リンカーは、約３ｎｔ〜約５ｎｔ、約５ｎｔ〜約１０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２５ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約３５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有することができる。単一分子ガイド核酸のリンカーは、４〜４０ヌクレオチドであってもよい。リンカーは、少なくとも約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、または７０００、またはそれ以上のヌクレオチドであってもよい。リンカーは、最大で約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、または７０００、またはそれ以上のヌクレオチドであってもよい。
リンカーは様々な配列のいずれも含むことができるが、一部の例において、ガイドＲＮＡの他の部分と相同的な広範な領域を有する配列は、ガイドの他の機能的領域を妨害し得る分子内結合を引き起こす可能性があり、リンカーはこのような配列を含まないことになる。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（上記）では、シンプルな４ヌクレオチドの配列−ＧＡＡＡ−が使用された（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２））が、より長い配列を含めた他の多く配列も同様に使用することができる。
リンカー配列は、機能的部分を含むことができる。例えば、リンカー配列は、アプタマー、リボザイム、タンパク質相互作用ヘアピン、タンパク質結合部位、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、またはエキソンを含めた１つ以上の特徴を含むことができる。リンカー配列は、少なくとも約１、２、３、４、または５、またはそれ以上の機能的部分を含むことができる。一部の例において、リンカー配列は、最大で約１、２、３、４、または５、またはそれ以上の機能的部分を含むことができる。
本開示におけるｅｘ ｖｉｖｏの方法のステップは、ゲノム操作を用いて患者特異的ｉＰＳＣ細胞を編集することを含むことができる。代替的に、本開示におけるｅｘ ｖｉｖｏの方法のステップは、間葉系幹細胞または造血前駆細胞を編集することを含むことができる。同様に、本開示におけるｉｎ ｖｉｖｏの方法のステップは、ゲノム操作を用いて、ヘモグロビン異常症を有する患者における細胞を編集することを含むことができる。同様に、本開示の細胞の方法におけるステップは、ヒト細胞内のＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で、ゲノム操作によって編集することを含むことができる。
ヘモグロビン異常症を有する異なる患者には、概して、異なる欠失、修飾、または不活性化の戦略が必要となる。任意のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを本開示の方法で使用することができるが、それぞれのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは各自の関連ＰＡＭを有し、当該ＰＡＭは疾患特異的であることも疾患特異的でないこともある。
例えば、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列は、ＮＨＥＪ経路に起因して生じる欠失によって修飾または不活性化を行うことができる。ＮＨＥＪは遺伝子、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列のセグメントを欠失させるのに使用することができ、これは直接、または複数の位置をターゲットとする１つのｇＲＮＡもしくは複数のｇＲＮＡによる切断を通じて１つのｇＲＮＡスプライスドナー部位もしくはアクセプター部位を変化させることによって行う。
また、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列は、改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｃＤＮＡを挿入することによって修飾または不活性化することもできる。例えば、ＨＤＲによる修飾または活性化に用いるドナーは、アニーリングを可能にするための小型または大型の相同アームが隣接するＢＣＬ１１Ａ遺伝子の改変転写制御配列を含有する。本質的にはＨＤＲは、ＤＳＢ修復の間、供給される相同のＤＮＡ配列をテンプレートとして使用するエラーフリー機構である。相同組換え修復（ＨＤＲ）の比率は、転写制御配列と切断部位との間の距離の関数であるため、重複する標的部位または最も近くにある標的部位を選ぶことは重要である。テンプレートは相同領域に隣接する余分な配列を含むことができ、またはゲノム配列とは異なる配列を含有してもよく、このようにして配列編集が可能になる。
ＮＨＥＪまたはＨＤＲにより、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列に対する修飾、または不活性化を行うことに加えて、他にも様々な選択肢が考えられる。小さなまたは大きな欠失が存在する場合、改変転写制御配列を含有するｃＤＮＡをノックインすることができる。全長ｃＤＮＡを任意の「セーフハーバー」内にノックインすることもできるが、供給されたプロモーターまたは他のプロモーターを使用しなければならない。このコンストラクトを正しい位置内にノックインする場合、当該コンストラクトは正常な遺伝子と同様の生理的制御を有することになる。ヌクレアーゼの対を使用して遺伝子領域の欠失を行ってもよいが、機能の修飾または不活性化を行うには通常はドナーが提供されなければならない。この場合には、２つのｇＲＮＡ及び１つのドナー配列が供給されることになる。
一部のゲノム操作戦略は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列の少なくとも一部の欠失を行うことにより、及び／または改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｃＤＮＡを、相同組換え修復（ＨＤＲ）（相同組換え（ＨＲ）としても知られる）によって対応遺伝子の座位またはセーフハーバー座位にノックインすることにより、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列の修飾または不活性化を行うことを伴う。この戦略は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列に対する修飾または不活性化を行い、疾患状態を反転、処置、及び／または軽減することができる。転写制御配列に対する修飾／不活性化を行うためのドナーヌクレオチドは小さい（＜３００ｂｐ）ことが多い。ＨＤＲ効率はドナー分子のサイズと反比例し得るため、このことは有利である。また、ドナーテンプレートが、サイズ制約があるがドナーテンプレート送達に有効な手段であることが示されているアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）分子に適合し得ることも予想される。
相同組換え修復は、２本鎖切断（ＤＳＢ）を修復するための細胞機構である。最も一般的な形態は相同組換えである。ＨＤＲには、１本鎖アニーリング及び代替ＨＤＲを含めた追加の経路が存在する。ゲノム操作ツールによって、研究者が細胞の相同組換え経路を操作して、ゲノムに対し部位特異的改変を創出することが可能になる。細胞がトランスで提供される合成ドナー分子を用いて２本鎖切断を修復できることが分かっている。そのため、特定の変異付近で２本鎖切断を導入し、好適なドナーを提供することにより、ゲノム内で標的変化を施すことができる。特異的切断は、ＨＤＲの比率を、相同ドナーのみを受け取った場合の１０６細胞中１という比率よりも１，０００倍超増加させる。特定のヌクレオチドにおける相同組換え修復（ＨＤＲ）の比率は、切断部位への距離の関数であるため、重複する標的部位または最も近くにある標的部位を選ぶことが重要である。ｉｎ ｓｉｔｕでの修正は残りのゲノムを安定した状態にしておけるため、遺伝子編集は遺伝子付加に対する優位性をもたらす。
ＨＤＲによる編集向けに供給されるドナーは著しく多様であるが、ゲノムＤＮＡへのアニーリングを可能にするための小型または大型の隣接する相同アームを有する意図された配列を含有することができる。導入される遺伝子変化に隣接する相同領域は、３０ｂｐ以下であっても、プロモーター、ｃＤＮＡなどを含有することができる数キロベースという大きなカセットであってもよい。１本鎖及び２本鎖両方のオリゴヌクレオチドドナーが使用されている。これらのオリゴヌクレオチドのサイズは１００ｎｔ未満から何ｋｂ超にも及ぶが、それよりも長いｓｓＤＮＡも産生及び使用され得る。ＰＣＲアンプリコン、プラスミド、及びミニサークルを含めた２本鎖ドナーを使用することができる。概して、ＡＡＶベクターがドナーテンプレートの送達に非常に有効な手段であり得ることが分かっているが、個々のドナーに対するパッケージングの限界は＜５ｋｂとなっている。ドナーの活性転写はＨＤＲを３倍増加させたが、これはプロモーターを含めることで変換が増加し得ることを示している。逆に、ドナーのＣｐＧメチル化は遺伝子発現及びＨＤＲを減少させた。
Ｃａｓ９などの野生型エンドヌクレアーゼに加えて、いずれか一方のヌクレアーゼドメインが不活性化されていることにより１本のＤＮＡ鎖のみを切断するニッカーゼバリアントが存在する。ＨＤＲは、個々のＣａｓニッカーゼから向けられることもあれば、標的エリアに隣接するニッカーゼの対を用いて向けられることもある。ドナーは、１本鎖であっても、ニックであっても、ｄｓＤＮＡであってもよい。
ドナーＤＮＡは、ヌクレアーゼを用いて供給されることもあれば、独立して様々な異なる方法によって、例えばトランスフェクション、ナノ粒子、マイクロ注入、またはウイルス形質導入によって供給されることもある。ＨＤＲ向けドナーの可用性を向上させるために、様々な繋留の選択肢が提案されている。例としては、ドナーをヌクレアーゼに付着させること、付近に結合するＤＮＡ結合タンパク質に付着させること、またはＤＮＡ末端結合または修復に関与するタンパク質に付着させることが挙げられる。
修復経路の選択は、複数の培養条件（例えば、細胞周期に影響を及ぼす条件）によって、またはＤＮＡ修復及び関連タンパク質の標的化によって、誘導することができる。例えば、ＨＤＲを増加させるために、主要なＮＨＥＪ分子、例えばＫＵ７０、ＫＵ８０、またはＤＮＡリガーゼＩＶが抑制されてもよい。
ドナーが存在しない場合、１つのＤＮＡ切断における両端または異なる切断からの複数の端部は、いくつかの非相同の修復経路を用いて連結することができ、このときＤＮＡ末端は、接合部に少数の塩基対合を伴うか塩基対合なしで連結する。古典的ＮＨＥＪに加えて、同様の修復機構（例えば、代替的ＮＨＥＪ）が存在する。２つの切断が存在する場合、介在セグメントは欠失または逆転され得る。ＮＨＥＪ修復経路は、接合部に挿入、欠失、または変異をもたらすことができる。
ＮＨＥＪを使用して、１５ｋｂの誘導性遺伝子発現カセットをヌクレアーゼ切断後のヒト細胞株内の定義された部位に挿入した。Ｍａｒｅｓｃａ，Ｍ．，Ｌｉｎ，Ｖ．Ｇ．，Ｇｕｏ，Ｎ．＆ Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ２３，５３９−５４６（２０１３）。
ＮＨＥＪまたはＨＤＲによるゲノム編集に加えて、ＮＨＥＪ経路及びＨＲの両方を使用する部位特異的な遺伝子挿入が行われている。ある特定の状況（場合によってはイントロン／エキソン境界を含む）では、組合せアプローチが適用可能であり得る。イントロン内のライゲーションにはＮＨＥＪが有効であると判明する可能性がある一方、コード領域内ではエラーフリーＨＤＲの方がより適している可能性がある。
さらなる代替として、改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｃＤＮＡは、対応する遺伝子の座位にノックインするか、またはＡＡＶＳ１などのセーフハーバー部位にノックインすることができる。一部の例において、当該方法は、１つのｇＲＮＡまたは１対のｇＲＮＡであって、改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｃＤＮＡの一部または全体をノックインするためのポリヌクレオチドドナーテンプレートからの新規配列の組み込みを容易にするために使用することができる、１つのｇＲＮＡまたは１対のｇＲＮＡを提供することができる。
当該方法は、ｇＲＮＡの対であって、一方のｇＲＮＡが１つ以上の変異の５’末端で切断し、他方のｇＲＮＡが１つ以上の変異の３’末端で切断し、遺伝子を２回切断することによって欠失をもたらし、この欠失がＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列を置き換えるためのポリヌクレオチドドナーテンプレートからの新規配列の挿入を容易にする、ｇＲＮＡの対を提供することができる。切断は、各々がゲノム内でＤＳＢを行う１対のＤＮＡエンドヌクレアーゼによって、または共にゲノム内でＤＳＢを行う複数のニッカーゼによって、達成することができる。
代替的に、当該方法は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列の周囲で１つの２本鎖切断を行う１つのｇＲＮＡであって、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列を改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｃＤＮＡで置き換えるための、ポリヌクレオチドドナーテンプレートからの新規配列の挿入を容易にする、１つのｇＲＮＡを提供することができる。２本鎖切断は、単一のＤＮＡエンドヌクレアーゼによって、または共にゲノム内でＤＳＢを行う複数のニッカーゼによって行うことができる。
ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中または付近における例示的な改変としては、上記で言及したＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列の中または付近で（近接して）の置き換え、例えば、転写制御配列の３ｋｂ未満、２ｋｂ未満、１ｋｂ未満、０．５ｋｂ未満上流または下流の領域内での置き換えが挙げられる。
このようなバリアントとしては、問題となる特定の置き換えよりも５’及び／もしくは３’方向に大きな置き換え、またはいずれかの方向でも小さな置き換えが挙げられ得る。したがって、特定の置き換えに関する「付近」または「近接」とは、所望の置き換え境界（本明細書ではエンドポイントとも呼ばれる）に関連するＳＳＢまたはＤＳＢ座位が、記載の参照座位から約３ｋｂ未満の領域内であり得ることが意図されている。ＳＳＢまたはＤＳＢ座位はさらに近接して、２ｋｂ以内、１ｋｂ以内、０．５ｋｂ以内、または０．１ｋｂ以内であってもよい。小さな置き換えの場合、所望のエンドポイントは参照座位にあってもそれに「隣接」していてもよく、このことにより、エンドポイントが参照座位から１００ｂｐ以内、５０ｂｐ以内、２５ｂｐ以内、または約１０ｂｐ〜５ｂｐ未満であり得ることが意図される。
より大きなまたはより小さな置き換えを含む例は、転写制御活性が修飾または不活性化されている限り、同じ利点をもたらすことが予想され得る。したがって、本明細書で説明し例示する置き換えの多くのバリエーションは、ヘモグロビン異常症の緩和に有効であり得ることが予想される。
別のゲノム操作戦略は、エキソンまたはイントロンの欠失を伴う。特定のエキソンまたはイントロンの欠失標的化は、単一の治療カクテルを用いて大きなサブセットの患者を処置するための魅力的な戦略であり得る。欠失は、単一のエキソンまたはイントロンの欠失であることも、複数のエキソンまたはイントロンの欠失であることもある。複数のエキソン欠失は多数の患者に到達し得る一方で、欠失が多い場合については、欠失の効率はサイズ増加に伴って大きく減少する。そのため、欠失の範囲は、４０〜１０，０００塩基対（ｂｐ）のサイズとすることができる。例えば、欠失は、４０〜１００、１００〜３００、３００〜５００、５００〜１，０００、１，０００〜２，０００、２，０００〜３，０００、３，０００〜５，０００、または５，０００〜１０，０００塩基対のサイズを範囲とすることができる。イントロンが、転写制御エレメント（例えば、転写因子結合部位）などの調節エレメントを含有する場合、イントロンを欠失させることが望ましいことがある。
欠失後にｐｒｅ−ｍＲＮＡが適切に処理されることを保証するために、周囲のスプライシングシグナルを除去することができる。スプライシングドナー及びアクセプターは、概して、近隣イントロンの１００塩基対以内である。そのため、一部の例において、方法は、目的の各エキソン／イントロン接合部についておよそ＋／−１００〜３１００ｂｐを切断する全てのｇＲＮＡを提供することができる。
ゲノム編集戦略のいずれについても、ゲノム編集はシークエンシングまたはＰＣＲ解析によって確認することができる。
標的配列の選択
特定の参照座位に対する５’境界及び／または３’境界の位置のシフトを使用して、特定のゲノム編集応用を容易にするまたは向上させることができ、このシフトは部分的には当該編集向けに選択されるエンドヌクレアーゼシステムに依存し、これについて本明細書でさらに説明し例示する。
このような標的配列の選択における第１の非限定的な例において、多くのエンドヌクレアーゼシステムは、切断における潜在的標的部位の初期選択を誘導することができる規則または基準（例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＩＩ型またはＶ型のエンドヌクレアーゼの場合、ＤＮＡ切断部位に隣接する特定の位置におけるＰＡＭ配列モチーフの要件）を有する。
標的配列の選択または最適化についての別の非限定的な例において、標的配列と遺伝子編集エンドヌクレアーゼとの特定の組合せに関するオフターゲット活性の出現頻度（すなわち、選択された標的配列以外の部位に発生するＤＳＢの出現頻度）は、オンターゲット活性との比較で評価することができる。一部の場合において、所望の座位で正しく編集された細胞は、他の細胞に対し選択優位性を有することができる。選択優位性における例示的、ただし非限定的な例としては、複製率、持続率、ある特定の条件に対する抵抗率の向上、移植の成功率または患者への導入後のｉｎ ｖｉｖｏ持続率の向上などの特質の獲得、及びこのような細胞の数または生存率の維持または増加に関連する他の特質の獲得が挙げられる。他の場合において、所望の座位で正しく編集された細胞は、正しく編集された細胞を特定、ソート、または他の方法で選択するために使用される１つ以上のスクリーニング法によってポジティブに選択され得る。選択優位性及び定方向選択のいずれの方法も、修正に関連する表現型を活用することができる。一部の場合において、細胞は、意図された細胞集団を選択または精製するために使用される新規の表現型を創出する第２の改変を創出するために、２回以上編集することができる。このような第２の改変は、選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカーのための第２のｇＲＮＡを追加することによって創出することができると考えられる。一部の場合において、細胞は、ｃＤＮＡとさらに選択可能なマーカーとを含有するＤＮＡ断片を用いて、所望の座位で正しく編集することができる。
特定の場合においていずれの選択優位性が適用可能であるかいずれの定方向選択が適用されるべきかにかかわらず、標的配列の選択は、適用の有効性を向上させるために、及び／または所望の標的以外の部位における望ましくない変更の可能性を低減するために、オフターゲットの出現頻度の考慮によっても誘導され得る。本明細書及び当技術分野においてさらに説明及び例示するように、オフターゲット活性の発生は、標的部位と様々なオフターゲット部位との間の類似点及び相違点ならびに使用する特定のエンドヌクレアーゼを含めた複数の因子による影響を受ける可能性がある。オフターゲット活性の予測を支援するバイオインフォマティクスツールが利用可能であり、しばしばこのようなツールは、オフターゲット活性の可能性が最も高い部位の特定に使用することもでき、次にこれをオフターゲット対オンターゲット活性の相対的出現頻度を評価するための実験設定で評価することができ、それによって相対的オンターゲット活性がより高い配列を選択することが可能になる。このような技法の例示的な例が本明細書に示され、他の例は当技術分野において公知である。
標的配列の選択における別の態様は、相同的組換え事象に関する。相同的領域を共有する配列は、介在配列の欠失をもたらす相同的組換え事象の焦点として働き得る。このような組換え事象は、染色体及び他のＤＮＡ配列の正常な複製の途中で、また他の時、例えば２本鎖切断（ＤＳＢ）が修復される場合のようにＤＮＡ配列が合成されている際にも発生し、これは正常な細胞複製の周期中に定期的に発生するが、様々な事象（例えば、ＵＶ光及び他のＤＮＡ切断誘導物質）の発生またはある特定の薬剤（例えば、様々な化学的誘導物質）の存在によっても向上し得る。多くのこのような誘導物質がゲノム内でＤＳＢを無差別に引き起こし、ＤＳＢが正常な細胞内で規則的に誘導され修復され得る。修復の間に、元の配列が完全な忠実さで再構築されることもあるが、一部の場合には小さな挿入または欠失（「インデル」と呼ばれる）がＤＳＢ部位に導入される。
また、ＤＳＢは、本明細書で説明する、選択された染色体位置で定方向または優先的遺伝子改変事象を引き起こすために使用され得るエンドヌクレアーゼシステムの場合のように、特定の位置で特異的に誘導することもできる。相同配列がＤＮＡ修復（及び複製）の文脈で組換えに供される傾向は、複数の状況で活用することができ、この傾向は、遺伝子編集システムの１つの応用、例えばＣＲＩＳＰＲにとっての基礎となる（ＣＲＩＳＰＲでは、相同組換え修復を使用して、「ドナー」ポリヌクレオチドの使用を通じて提供される対象の配列を、所望の染色体位置に挿入する）。
特定の配列間の相同領域（わずか１０以下の塩基対を含み得る小さな「マイクロホモロジー」領域であり得る）を、所望の欠失をもたらすために使用することもできる。例えば、単一のＤＳＢを、付近の配列に対しマイクロホモロジーを呈する部位に導入することができる。このようなＤＳＢの正常な修復過程の間に高い出現頻度で発生する結果は、ＤＳＢが容易にする組換え及び同時発生的な細胞修復プロセスの結果としての、介在配列の欠失である。
しかし、一部の状況において、相同領域内での標的配列の選択は、遺伝子融合（欠失がコード領域内の場合）を含めたはるかに大きな欠失をもたらすことがあり、これは特定の状況を仮定すれば望ましいことも望ましくないこともある。
本明細書に示す例は、転写制御タンパク質活性の修飾または不活性化をもたらす置き換えを誘導するように設計されたＤＳＢの創出のための様々な標的領域の選択、そしてオンターゲット事象に対しオフターゲット事象を最小化するように設計されたこのような領域内での特定の標的配列の選択を、さらに例示する。
核酸の改変
一部の場合において、細胞に導入するポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞における活性、安定性、もしくは特異性を向上させ、送達を変更し、自然免疫応答を低減するために、または本明細書でさらに説明する当技術分野で公知の他の向上のために、個々にまたは組み合わせて使用され得る１つ以上の改変を含むことができる。
ある特定の例において、改変ポリヌクレオチドはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムで使用することができ、この場合、ガイドＲＮＡ（単一分子ガイドまたは二重分子ガイド）及び／または細胞に導入するＤＮＡまたはＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡは、以下で説明及び例示するように改変することができる。このような改変ポリヌクレオチドは、任意の１つ以上のゲノム座位を編集するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムで使用することができる。
このような用法の非限定的な例示の目的でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用すると、ガイドＲＮＡの改変は、ガイドＲＮＡ（単一分子ガイドであっても二重分子ガイドであってもよい）及びＣａｓエンドヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集複合体の形成または安定性を向上させるために使用することができる。ガイドＲＮＡの改変は、さらにまたは代替的に、ゲノム編集複合体とゲノム内の標的配列との相互作用の開始、安定性、または動態を向上させるために使用することができ、これは例えばオンターゲット活性を向上させるために使用することができる。ガイドＲＮＡの改変は、さらにまたは代替的に、特異性を向上させるために、例えばオンターゲット部位におけるゲノム編集の相対的比率を他の（オフターゲット）部位における影響と比較して向上させるために使用することができる。
改変は、さらにまたは代替的に、ガイドＲＮＡの安定性を増加させるために使用することができ、例えば、細胞内に存在するリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）による分解に対するガイドＲＮＡの耐性を増加させて細胞内の半減期を増加させることによって行われる。ガイドＲＮＡの半減期を向上させる改変は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが細胞に導入されてエンドヌクレアーゼの産生に翻訳が必要なＲＮＡによって編集される態様においては、ＲＮＡがエンドヌクレアーゼをコードするのと同時に導入ガイドＲＮＡの半減期を増加させることがガイドＲＮＡ及びコードされるＣａｓエンドヌクレアーゼの細胞内の共存時間を増加させるために使用され得るため、特に有用であり得る。
改変は、さらにまたは代替的に、細胞に導入されるＲＮＡによる自然免疫応答の誘発の可能性または程度を低下させるために使用することができる。このような応答は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）（以下で、そして当技術分野で説明されているように、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む）の文脈において十分に特性が明らかになっており、ＲＮＡの半減期低減に及び／またはサイトカインもしくは免疫応答に関連する他の因子の誘発に関連する傾向がある。
１つ以上のタイプの改変は、エンドヌクレアーゼをコードし細胞に導入されるＲＮＡに対しても行うことができ、この改変には、以下に限定されないが、ＲＮＡの安定性を向上させる改変（例えば、細胞内に存在するＲＮアーゼによるＲＮＡ分解を増加することにより行う）、得られた産物（すなわち、エンドヌクレアーゼ）の翻訳を向上させる改変、及び／または細胞に導入されるＲＮＡによる自然免疫応答の誘発の可能性もしくは程度を低下させる改変が含まれる。
改変（例えば上記及びその他）の組合せも同様に使用することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の場合、１つ以上のタイプの改変を（上記で例示したものを含めて）ガイドＲＮＡに対し行うことができ、及び／または１つ以上のタイプの改変を（上記で例示したものを含めて）ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡに対し行うことができる。
例示として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムで使用するガイドＲＮＡ、または他のより低分子のＲＮＡは、以下に例示し当技術分野で説明されているように、複数の改変を容易に組み込むことが可能な化学的手段によって容易に合成することができる。化学合成手順が継続的に拡大している一方で、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、これはＰＡＧＥなどのゲルの使用を回避する）などの手順によるこのようなＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチド長が１００ヌクレオチド程度を顕著に上回って増加するにつれて、難易度が高くなる傾向がある。より長い化学的改変ＲＮＡを産生するために用いられ得る１つのアプローチは、共にライゲーションした２つ以上の分子を生成することである。さらに長いＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡ）は、より容易に酵素的に産生される。酵素的に産生されたＲＮＡでの使用において利用可能な改変タイプはより少ない一方で、それでもなお、例えば、安定性の向上、自然免疫応答の可能性もしくは程度の低減、及び／または以下で、そして当技術分野でさらに説明される他の特質の向上に使用され得る改変が存在し、新たなタイプの改変が定常的に開発されている。
様々なタイプの改変、特により低分子の化学合成ＲＮＡと共にしばしば使用される改変の例示として、改変は、糖の２’位で改変された１つ以上のヌクレオチド、一部の態様では２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、または２’−フルオロ改変ヌクレオチドを含むことができる。一部の例において、ＲＮＡ改変は、ピリミジン、脱塩基残基、またはＲＮＡの３’末端にある逆位塩基のリボースに、２’−フルオロ、２’−アミノ、または２’Ｏ−メチル改変を含むことができる。このような改変は通例的にオリゴヌクレオチドに組み込むことができ、当該オリゴヌクレオチドは、所与の標的に対し２’−デオキシオリゴヌクレオチドよりも高いＴｍ（すなわち、高い標的結合親和性）を有することが示されている。
複数のヌクレオチド及びヌクレオシドの改変において、組み込んだオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ消化に対する耐性がネイティブなオリゴヌクレオチドよりも高まり、この改変オリゴが非改変オリゴヌクレオチドよりも長期間インタクトのまま残存することが示されている。改変オリゴヌクレオチドの具体的な例としては、改変骨格、例えば、ホスホロチオアート、ホスホトリエステル、メチルホスホナート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルの糖間結合、または短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環の糖間結合を含むものが挙げられる。一部のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアート骨格を有するオリゴヌクレオチド及びヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオチドであり、特に、ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ、〜Ｎ（ＣＨ３）〜Ｏ〜ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られている）、ＣＨ−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、及びＯ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２骨格（ネイティブなホスホジエステル骨格はＯ−Ｐ−−Ｏ−ＣＨとして表される）；アミド骨格［Ｄｅ Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２８：３６６−３７４（１９９５）を参照］；モルホリノ骨格構造（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ，米国特許第５，０３４，５０６号を参照）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格がポリアミド骨格で置き換えられ、ヌクレオチドはポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１，２５４，１４９７を参照）を有する。リン含有結合としては、以下に限定されないが、ホスホロチオアート、キラルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’アルキレンホスホナート及びキラルホスホナートを含むメチル及び他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、３’−アミノホスホロアミダート及びアミノアルキルホスホロアミダートを含むホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに通常の３’−５’結合を有するボラノホスファート、これらの２’−５’結合アナログ、ならびにヌクレオシド単位の隣接対が３’−５’から５’−３’、または２’−５’から５’−２’に結合している逆極性を有するものが挙げられる；米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；同第５，６２５，０５０号を参照。
モルホリノベースのオリゴマー化合物は、Ｂｒａａｓｃｈ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｃｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（１４）：４５０３−４５１０（２００２）；Ｇｅｎｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ３０，Ｉｓｓｕｅ ３，（２００１）；Ｈｅａｓｍａｎ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２４３：２０９−２１４（２００２）；Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２６：２１６−２２０（２０００）；Ｌａｃｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：９５９１−９５９６（２０００）；及び１９９１年７月２３日に発行された米国特許第５，０３４，５０６号で説明されている。
シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチドミメティックは、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：８５９５−８６０２（２０００）に記載されている。
リン原子を含まない改変ポリヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合（部分的にはヌクレオシドの糖部分から形成されている）を有する骨格；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホナート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびにＮ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ２が混合した構成要素部分を有する他の骨格を含む；米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；同第５，６７７，４３９号を参照。
１つ以上の置換された糖部分、例えば以下のうちの１つも２’位に含まれ得る：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ３Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、またはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３（式中、ｎは１〜約１０である）；Ｃ１〜Ｃ１０の低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換された低級アルキル、アルカリル、またはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換されたシリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基；またはオリゴヌクレオチド及び同様の特性を有する他の置換基の薬物動態特性を改善する基。一部の態様において、改変は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）としても知られている））（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＨｅＩｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６）を含む。他の改変は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−プロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。また、同様の改変をオリゴヌクレオチド上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位、及び５’末端ヌクレオチドの５’位で行うこともできる。また、オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどの糖ミメティックを有することもできる。
いくつかの例において、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合（すなわち、骨格）の両方が新規の基で置き換えることができる。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイズのために維持することができる。１つのこのようなオリゴマー化合物、優れたハイブリダイズ特性を有することが示されたオリゴヌクレオチドミメティックは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれている。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格（例えば、アミノエチルグリシン骨格）で置き換えることができる。核酸塩基は保持し、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合させることができる。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、以下に限定されないが、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；及び同第５，７１９，２６２号が挙げられる。ＰＮＡ化合物についてのさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７−１５００（１９９１）で見いだすことができる。
またガイドＲＮＡは、追加的または代替的に、核酸塩基（当技術分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い）の改変または置換も含む。本明細書において、「非改変」または「天然」の核酸塩基には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）が含まれる。改変核酸塩基には、天然の核酸では低頻度または過渡的にしか見いだされない核酸塩基が含まれ、例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン、特に５−メチルシトシン（５−メチル−２’デオキシシトシンとも呼ばれ、当技術分野ではしばしば５−Ｍｅ−Ｃと呼ばれる）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ及びゲントビオシルＨＭＣ、ならびに合成核酸塩基、例えば、２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ）アデニン、または他のヘテロ置換されたアルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン、及び２，６−ジアミノプリンが挙げられる。Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ７５−７７（１９８０）；Ｇｅｂｅｙｅｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：４５１３（１９９７）。当技術分野で知られている「普遍的な」塩基（例えば、イノシン）も含まれ得る。５−Ｍｅ−Ｃ置換は、核酸デュプレックスの安定性を０．６〜１．２℃だけ増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、塩基置換の諸態様である。
改変核酸塩基は、他の合成及び天然の核酸塩基、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、ならびに他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、ならびに他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンを含むことができる。
さらに、核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示される塩基、‘Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ’（８５８〜８５９頁），Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示される塩基、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｌｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０（６１３頁）によって開示される塩基、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（２８９〜３０２頁），Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅａ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３によって開示される塩基を含むことができる。これらの核酸塩基の一部は、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である。これには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、及び０−６置換プリンが含まれ、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、及び５−プロピニルシトシンを構成する。５−メチルシトシン置換は、核酸デュプレックス安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，‘Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、とりわけ２’−Ｏ−メトキシエチル糖改変と組み合わせた場合には塩基置換の態様となる。改変核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに同第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，６８１，９４１号；同第５，７５０，６９２号；同第５，７６３，５８８号；同第５，８３０，６５３号；同第６，００５，０９６号；及び米国特許出願公開第２００３／０１５８４０３号に記載されている。
したがって、「改変」という用語は、ガイドＲＮＡ、エンドヌクレアーゼ、もしくはＢＣＬ１１Ａの転写制御配列に、またはガイドＲＮＡ及びエンドヌクレアーゼの両方に組み込まれる非天然の糖、リン酸塩、または塩基を指す。所与のオリゴヌクレオチドにおける全ての位置が一様に改変される必要はなく、実際には前述の改変のうちの２つ以上を単一のオリゴヌクレオチド内に、またはオリゴヌクレオチド中の単一のヌクレオシド内であっても、組み込むことができる。
ガイドＲＮＡ及び／またはエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（もしくはＤＮＡ）は、活性、細胞分布、またはオリゴヌクレオチドの細胞取込みを向上させる１つ以上の部分または結合体に化学的に結合することができる。このような部分は、以下に限定されないが、コレステロール部分などの脂質部分［Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：６５５３−６５５６（１９８９）］；コール酸［Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，４：１０５３−１０６０（１９９４）］；チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール［Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０：３０６−３０９（１９９２）及びＭａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，３：２７６５−２７７０（１９９３）］；チオコレステロール［Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０：５３３−５３８（１９９２）］；脂肪族鎖、例えばドデカンジオールもしくはウンデシル残基［Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２５９：３２７−３３０（１９９０）及びＳｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７５：４９−５４（１９９３）］；リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホナート［Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１−３６５４（１９９５）及びＳｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：３７７７−３７８３（１９９０）］；ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖［Ｍａｎｃｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１４：９６９−９７３（１９９５）］；アダマンタン酢酸［Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１−３６５４（１９９５）］；パルミチル部分［（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２６４：２２９−２３７（１９９５）］；またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−ｔオキシコレステロール部分［Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７７：９２３−９３７（１９９６）］を含む。また、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号、及び同第５，６８８，９４１号も参照。
糖及び他の部分は、ヌクレオチド（例えば、カチオン性ポリソーム及びリポソーム）を含むタンパク質及び複合体を特定の部位に対し標的化するために使用することができる。例えば、肝細胞に向けた移行は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）によって媒介され得る。例えば、Ｈｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ．２１（１０）：１０２５−３０（２０１４）を参照。当技術分野において公知であり定常的に開発されている他のシステムを使用して、本発明において使用する生体分子及び／またはその複合体を特定の目的の標的細胞に対し標的化することができる。
このような標的化部分または結合体は、官能基（例えば、１級または２級ヒドロキシル基）と共有結合した結合体基を含むことができる。本発明の結合体基としては、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬物力学特性を向上させる基、及びオリゴマーの薬物動態特性を向上させる基が挙げられる。典型的な結合体基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び色素が挙げられる。本開示の文脈において薬物力学特性を向上させる基としては、取込みを改善する、分解に対する耐性を向上させる、及び／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイズを強化する基が挙げられる。本発明の文脈において薬物動態特性を向上させる基としては、本発明の化合物の取込み、分布、代謝、または排泄を改善する基が挙げられる。代表的な結合体基は、１９９２年１０月２３日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号、及び米国特許第６，２８７，８６０号に開示されている。結合体部分としては、以下に限定されないが、脂質部分、例えばコレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル−５−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールもしくはウンデシル残基、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホナート、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、もしくはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分が挙げられる。例えば、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号、及び同第５，６８８，９４１号を参照。
化学合成の適用が難しく典型的には酵素的合成によって生成されるより長いポリヌクレオチドも、様々な方法によって改変することができる。このような改変としては、例えば、ある特定のヌクレオチドアナログの導入、分子の５’または３’末端における特定の配列または他の部分の組み込み、及び他の改変が挙げられる。例示として、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡはおよそ４ｋｂの長さであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏの転写によって合成することができる。ｍＲＮＡに対する改変は、例えば、その翻訳または安定性を増加させるために（例えば、細胞による分解に対する耐性を増加させることによって）適用することもあれば、ＲＮＡが自然免疫応答（外因的ＲＮＡ、特にＣａｓ９をコードするＲＮＡのようなより長いＲＮＡの導入後に、細胞内でしばしば観察される）を誘発する傾向を低減するために適用することもある。
当技術分野では、このような改変が多数説明されており、例えば、ｐｏｌｙＡテール、５’キャップアナログ（例えば、アンチリバースキャップアナログ（Ａｎｔｉ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ）（ＡＲＣＡ）もしくはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ （ｍＣＡＰ））、改変５’もしくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、改変塩基の使用（例えば、シュード−ＵＴＰ、２−チオ−ＵＴＰ、５−メチルシチジン−５’−トリホスファート（５−メチル−ＣＴＰ）、もしくはＮ６−メチル−ＡＴＰ）、または５’末端ホスファートを除去するためのホスファターゼによる処理がある。これら及び他の改変は当技術分野において公知であり、新たなＲＮＡ改変が定常的に開発されている。
改変ＲＮＡの供給業者は多数存在し、これにはＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＡｘｏＬａｂｓ、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ．、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、その他多数が含まれる。例えば、ＴｒｉＬｉｎｋが説明しているように、５−メチル−ＣＴＰは、ヌクレアーゼの安定性の増加、翻訳の増加、または自然免疫受容体とｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡとの相互作用の低減などの、所望の特徴を付与するために使用することができる。５−メチルシチジン−５’−トリホスファート（５−メチル−ＣＴＰ）、Ｎ６−メチル−ＡＴＰ、ならびにシュード−ＵＴＰ及び２−チオ−ＵＴＰは、以下で参照されるＫｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．及びＷａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．による刊行物に例示されているように、培養液中及びｉｎ ｖｉｖｏで自然免疫応答を低減する一方で翻訳を向上させることが示されている。
ｉｎ ｖｉｖｏで送達される化学的改変ｍＲＮＡは、治療効果の改善を達成するために使用され得ることが示されている。例えば、Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９，１５４−１５７（２０１１）を参照。このような改変は、例えば、ＲＮＡ分子の安定性を増加させるために、及び／またはその免疫原性を低減するために使用することができる。シュード−Ｕ、Ｎ６−メチル−Ａ、２−チオ−Ｕ、及び５−メチル−Ｃなどの化学的改変を使用して、ウリジン及びシチジン残基のちょうど４分の１をそれぞれ２−チオ−Ｕ及び５−メチル−Ｃで置換すると、トール様受容体（ＴＬＲ）媒介のｍＲＮＡ認識が顕著に低下することがマウスで見いだされている。これらの改変は、自然免疫システムの活性化を低減することにより、ｉｎ ｖｉｖｏでのｍＲＮＡの安定性及び寿命を効果的に増加させるために使用することができる。例えば、Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（上記）を参照。
また、生得的な抗ウイルス応答を迂回するように設計された改変を組み込む合成メッセンジャーＲＮＡを繰り返し投与することで、分化したヒト細胞が多分化能に初期化されることも示されている。例えば、Ｗａｒｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，７（５）：６１８−３０（２０１０）を参照。このような一次的初期化タンパク質として作用する改変ｍＲＮＡは、複数のヒト細胞タイプを初期化する効率的な手段であり得る。このような細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と呼ばれ、５−メチル−ＣＴＰ、シュード−ＵＴＰ及びアンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）を組み込む酵素的合成ＲＮＡは、細胞の抗ウイルス応答を効果的に避けるために使用することができると思われることが明らかになった。例えば、Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（上記）を参照。
当技術分野で説明されている他のポリヌクレオチド改変としては、例えば、ｐｏｌｙＡテールの使用、５’キャップアナログ（例えば、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ））の付加、５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の改変、または５’末端ホスファートを除去するためのホスファターゼによる処理が挙げられ、新たなアプローチが定常的に開発されている。
本明細書で使用するための改変ＲＮＡの産生に適用可能な複数の組成物及び技法は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含めたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の改変との関連で開発されている。ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ干渉によって遺伝子サイレンシングに及ぼす影響が概して一過性であることから反復投与を必要とし得るため、ｉｎ ｖｉｖｏにおける特定の課題が提示される。加えて、ｓｉＲＮＡは２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であるが、哺乳類細胞の免疫反応は、ウイルス感染の副産物であることが多いｄｓＲＮＡを検出し無効化するように進化してきた。このように、ｄｓＲＮＡに対する細胞応答を媒介し得るＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ応答性キナーゼ）などの哺乳類酵素及び潜在的レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）、ならびにこのような分子に応答してサイトカインの誘導を作動させ得るトール様受容体（例えば、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ８）が存在する。例えば、Ａｎｇａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂａｓｅｌ）６（４）：４４０−４６８（２０１３）；Ｋａｎａｓｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０（３）：５１３−５２４（２０１２）；Ｂｕｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．６（９）：１１３０−４６（２０１１）；Ｊｕｄｇｅ ａｎｄ ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９（２）：１１１−２４（２００８）による概説、及びこれらにおける引用文献を参照。
本明細書に記載のように、ＲＮＡ安定性を向上させるため、自然免疫応答を低減するため、及び／またはヒト細胞へのポリヌクレオチド導入との関連で有用であり得る他の利益を達成するために、多種多様な改変が開発され適用されている。例えば、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ＫＡ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２：７７−９６（２０１１）；Ｇａｇｌｉｏｎｅ ａｎｄ Ｍｅｓｓｅｒｅ，Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，１０（７）：５７８−９５（２０１０）；Ｃｈｅｒｎｏｌｏｖｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，１２（２）：１５８−６７（２０１０）；Ｄｅｌｅａｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍ Ｃｈａｐｔｅｒ １６：Ｕｎｉｔ １６．３（２００９）；Ｂｅｈｌｋｅ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８（４）：３０５−１９（２００８）；Ｆｕｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ ２２（３）：２０５−２１０（２０１２）；Ｂｒｅｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｇｅｎｅｔ ３：１５４（２０１２）による概説を参照。
上述のように改変ＲＮＡの供給業者は複数存在し、その多くが、ｓｉＲＮＡの有効性を改善するように設計された改変に特化している。文献で報告された様々な知見に基づく様々なアプローチが提供されている。例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎは、Ｋｏｌｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １１：１２５−１４０（２０１２）による報告のように、ｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を改善するために、硫黄（ホスホロチオアート、ＰＳ）による非架橋酸素の置き換えを広範に使用したと言及している。リボースの２’位置の改変は、ヌクレオチド間リン酸結合のヌクレアーゼ耐性を改善する一方でデュプレックス安定性（Ｔｍ）を増加させることが報告されており、また免疫活性化からの保護をもたらすことも示されている。低分子で認容性の高い２’置換（２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−ヒドロ）を用いた適度なＰＳ骨格改変の組合せは、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３−１７８（２００４）による報告のように、ｉｎ ｖｉｖｏでの適用向けに安定性の高いｓｉＲＮＡと関連付けられており、また２’−Ｏ−メチル改変は、Ｖｏｌｋｏｖ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９：１９１−２０２（２００９）による報告のように、安定性の改善に有効であることが報告されている。自然免疫応答の誘導を低下させることに関しては、特定の配列を２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−ヒドロで改変すると、ＴＬＲ７／ＴＬＲ８の相互作用を低減する一方で、サイレンシング活性を概ね保つことが報告されている。例えば、Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３：４９４−５０５（２００６）及びＣｅｋａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６５：９０−１０８（２００７）を参照。追加的な改変、例えば、２−チオウラシル、シュードウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、及びＮ６−メチルアデノシンが、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ８によって媒介される免疫作用を最小化することも示されている。例えば、Ｋａｒｉｋｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３：１６５−１７５（２００５）を参照。
当技術分野でも公知であるように、また市販されているように、細胞による送達及び／または取込みを向上させることができる複数の結合体を、本明細書で使用するポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）に適用することができ、このような結合体としては、例えば、コレステロール、トコフェロール及び葉酸、脂質、ペプチド、ポリマー、リンカー、及びアプタマーが挙げられる。例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．４：７９１−８０９（２０１３）による概説、及びその引用文献を参照。
コドン最適化
部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、目的の標的ＤＮＡを含有する細胞内での発現のために、当技術分野で標準の方法に従ってコドン最適化することができる。例えば、意図された標的核酸がヒト細胞内にある場合、Ｃａｓ９ポリペプチド生成用にＣａｓ９をコードするヒトのコドン最適化ポリヌクレオチドを使用することが企図される。
ゲノム標的化核酸と部位特異的ポリペプチドとの複合体
ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９などの核酸誘導ヌクレアーゼ）と相互作用して、複合体を形成する。ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドを標的核酸に誘導する。
ＲＮＰ
部位特異的ポリペプチド及びゲノム標的化核酸は、細胞または患者にそれぞれ別々に投与することができる。その一方で、部位特異的ポリペプチドは、１つ以上のゲノム標的化核酸（ガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡと一緒にしたｃｒＲＮＡ）と予め複合体化されてもよい。次に予め複合体化された材料を細胞または患者に投与することができる。このような予め複合体化された材料は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として知られている。ＲＮＰ内の部位特異的ポリペプチドは、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼとすることができる。部位特異的ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方で１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）に隣接していてもよい。例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、２つのＮＬＳ（一方のＮＬＳはＮ末端に位置し、第２のＮＬＳはＣ末端に位置する）に隣接していてもよい。ＮＬＳは、当技術分野で知られている任意のＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ）とすることができる。ＲＮＰ内のゲノム標的化核酸：部位特異的ポリペプチドの重量比は１：１とすることができる。例えば、ＲＮＰ内のｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの重量比は１：１とすることができる。例えば、ｓｇＲＮＡは、配列番号１または２の核酸配列を含むことができ、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＮ末端ＳＶ４０ ＮＬＳ及びＣ末端ＳＶ４０ ＮＬＳを含むＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９であってもよく、ｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの重量比は１：１とすることができる。
核酸コードシステムの構成要素
本開示は、本開示のゲノム標的化核酸をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、及び／または本開示の方法の態様を実施するために必要な任意の核酸またはタンパク質性分子を提供する。
本開示のゲノム標的化核酸をコードする核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、及び／または本開示の方法の態様を実施するために必要な任意の核酸またはタンパク質性分子は、ベクター（例えば、組換え発現ベクター）を含むことができる。
「ベクター」という用語は、結合している別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。あるタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは、追加の核酸セグメントをライゲーションすることができる環状の２本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ウイルスベクターの場合、追加の核酸セグメントをウイルスゲノムにライゲーションすることができる。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞における自己複製が可能である（例えば、細菌起源の複製を有する細菌ベクター及びエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに統合されて、宿主ゲノムに連動して複製される。
一部の例において、ベクターは、自らが作用可能に結合した核酸の発現を指示することが可能であり得る。このようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」またはより簡略に「発現ベクター」と呼ばれ、同等の機能を果たす。
「作用可能に連結」という用語は、目的のヌクレオチド配列が、当該ヌクレオチド配列の発現を可能にするようにして調節配列（複数可）に結合していることを意味する。「調節配列」という用語は、例えば、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むように意図されている。このような調節配列は当技術分野において周知であり、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）で説明されている。調節配列としては、多くのタイプの宿主細胞内でヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、及びある特定の宿主細胞内でのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。当業者であれば、発現ベクターの設計が標的細胞の選択、所望の発現レベルなどの因子に依存し得ることを理解することになる。
企図される発現ベクターとしては、以下に限定されないが、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペス、ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳房腫瘍ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）に基づいたウイルスベクター、ならびに他の組換えベクターが挙げられる。真核生物の標的細胞向けに企図される他のベクターとしては、以下に限定されないが、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のベクターが挙げられる。真核生物の標的細胞向けに企図されるさらなるベクターとしては、以下に限定されないが、ｐＣＴｘ−１、ｐＣＴｘ−２、及びｐＣＴｘ−３のベクターが挙げられる。他のベクターも、宿主細胞に適合性である限り使用することができる。
一部の例において、ベクターは１つ以上の転写及び／または翻訳制御エレメントを含むことができる。利用する宿主／ベクターシステムに応じて、複数の好適な転写及び翻訳制御エレメントのいずれか（構成的及び誘導的プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含む）が発現ベクター内で使用され得る。ベクターは、ウイルス配列またはＣＲＩＳＰＲ機構もしくは他のエレメントの構成要素を不活性化する自己不活性化ベクターであり得る。
好適な真核生物プロモーター（すなわち、真核細胞内で機能するプロモーター）の非限定的な例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期からのもの、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期及び後期のＳＶ４０、レトロウイルスからの長末端反復配列（ＬＴＲ）、ヒト伸長因子１プロモーター（ＥＦ１）、トリβ−アクチンプロモーター（ＣＡＧ）に融合したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーを含むハイブリッドコンストラクト、マウス幹細胞ウイルスプロモーター（ＭＳＣＶ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１座位プロモーター（ＰＧＫ）、及びマウスメタロチオネイン−Ｉが挙げられる。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼとの関連で使用されるガイドＲＮＡを含めた低分子ＲＮＡの発現に関しては、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６及びＨ１を含む）のような様々なプロモーターが有利であり得る。このようなプロモーターについての説明及びその用法を向上するパラメーターは当技術分野において公知であり、追加の情報及びアプローチが定常的に記載されている。例えば、Ｍａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ − Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３，ｅ１６１（２０１４）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１４．１２を参照。
発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写ターミネーターも含有することができる。また発現ベクターは、発現を増幅するための適切な配列も含むことができる。また発現ベクターは、非ネイティブなタグ（例えば、ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ、緑色蛍光タンパク質など）をコードし、部位特異的ポリペプチドと融合することで融合タンパク質をもたらすヌクレオチド配列も含むことができる。
プロモーターは、誘導的プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲン受容体調節プロモーターなど）であってもよい。プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター）であってもよい。一部の場合において、プロモーターは、空間的制約のある、及び／または時間的制約のあるプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞タイプ特異的プロモーターなど）であってもよい。
本開示のゲノム標的化核酸をコードする核酸及び／または部位特異的ポリペプチドは、細胞への送達に用いる送達ビヒクル内に、またはその表面上にパッケージ化することができる。企図される送達ビヒクルとしては、以下に限定されないが、ナノ球体、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、ポリエチレングリコール粒子、ヒドロゲル、及びミセルが挙げられる。当技術分野で説明されているように、このようなビヒクルと所望の細胞タイプまたは位置との優先的相互作用を向上させるために、様々な標的化部分を使用することができる。
本開示の複合体、ポリペプチド、及び核酸の細胞への導入は、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、結合体化、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿法、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿法、直接的マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達などによって生じ得る。
ガイドＲＮＡ及び／またはエンドヌクレアーゼポリヌクレオチドの送達
ガイドＲＮＡポリヌクレオチド（ＲＮＡもしくはＤＮＡ）及び／またはエンドヌクレアーゼポリヌクレオチド（複数可）（ＲＮＡもしくはＤＮＡ）は、当技術分野で公知のウイルスまたは非ウイルス送達ビヒクル、例えばエレクトロポレーション、機械力、細胞変形（ＳＱＺ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、及び細胞膜透過性ペプチドによって送達することができる。代替的に、エンドヌクレアーゼポリペプチド（複数可）は、当技術分野で公知のウイルスまたは非ウイルス送達ビヒクル、例えばエレクトロポレーションまたは脂質ナノ粒子によって送達することができる。さらに代替的な態様において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、単体で、または１つ以上のガイドＲＮＡと共に、もしくはｔｒａｃｒＲＮＡと一緒の１つ以上のｃｒＲＮＡと共に予め複合体化させて、１つ以上のポリペプチドとして送達することができる。
エレクトロポレーションは、細胞膜の浸透性を増加させて、薬物、核酸（ゲノム標的化核酸）、タンパク質（部位特異的ポリペプチド）、またはＲＮＰなどの物質を細胞に導入できるようにするために、１つ以上の細胞に電場を適用する送達技法である。概して、エレクトロポレーションは、エレクトロポレーションキュベット内の懸濁細胞の１〜２ミリメートルの距離にわたり数千ボルトを通すことによって機能する（１．０〜１．５ｋＶ、２５０〜７５０Ｖ／ｃｍ）。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いた遺伝子編集
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いた遺伝子編集を使用して、ＣＤ３４＋ヒト造血幹・前駆細胞（ｈＨＳＰＣ）及び誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）内の２番染色体上の非コードＢＣＬ１１Ａ赤血球系統特異的エンハンサー内に、高い特異性及び頻度で改変を創出することができ、これにより、天然に存在する遺伝性胎児ヘモグロビン遺残症（ＨＰＦＨ）関連バリアントと同様の表現型がもたらされる。このような遺伝子改変はＨｂＦの生成を増加させ、ひいてはβ−グロビン疾患の重症度を緩和する。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムは、原核生物における天然の防御機構であり、遺伝子編集に使用するＲＮＡ誘導型ＤＮＡ標的化プラットフォームとして再利用されたものである。当該システムは、ＤＮＡ切断を標的化するために、ＤＮＡヌクレアーゼＣａｓ９、ならびに２つの非コードＲＮＡ、ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）に依存する。
ｃｒＲＮＡは、典型的には標的ＤＮＡ内の２０ヌクレオチド（ｎｔ）配列によるワトソン・クリック塩基対合を通じて、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の配列認識及び特異性を推進する。ｃｒＲＮＡ内の５’２０ｎｔの配列を変化させることで、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体の特定の座位に対する標的化が可能になる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体は、標的配列の後に、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる特定の短いＤＮＡモチーフ（配列ＮＧＧを伴う）がある場合、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の最初の２０ｎｔに対する配列適合を含むＤＮＡ配列のみに結合する。
ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの３’末端とハイブリダイズしてＲＮＡ−デュプレックス構造を形成し、当該構造がＣａｓ９エンドヌクレアーゼと結合して触媒活性のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体を形成し、そして当該複合体が標的ＤＮＡを切断することができる。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体が標的部位でＤＮＡに結合すると、Ｃａｓ９酵素内の２つの独立したヌクレアーゼドメインがそれぞれ、ＰＡＭ部位の３塩基上流のＤＮＡ鎖のうちの１つを切断し、ＤＮＡの両方の鎖が塩基対で終了する（平滑末端）２本鎖切断（ＤＳＢ）を残す。
薬物製品の生成で使用する分子試薬については、２つのＲＮＡ分子（ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）がリンカーループ（例えば、ＷＯ２０１７／１８２８８１またはＷＯ２０１７／１９１５０３に示される４ヌクレオチドリンカーループ（これらの各々は参照により全体が本明細書に援用される））によって連結して、キメラシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成する。ｓｇＲＮＡ（例えば、配列番号１または配列番号２を含むまたはそれからなるｓｇＲＮＡ）は、重要な赤血球系統特異的転写因子結合部位（ＧＡＴＡ１）を標的とする。転写因子結合部位は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の２番目のイントロン内の赤血球系統特異的エンハンサー内にある。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９）複合体は共に、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）をｉｎ ｓｉｔｕで形成する。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体が特定の標的部位でＤＮＡに結合し部位特異的ＤＳＢを形成した後、次のキーステップは、ＤＳＢの修復である。細胞は、２つの主なＤＮＡ修復経路：非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用してＤＳＢを修復する。
ＮＨＥＪは、非分裂細胞を含めた大部分の細胞タイプで活性が高いと思われる、ロバストな修復機構である。ＮＨＥＪはエラーを起こしやすく、その結果、ＤＳＢの部位でしばしば１から数百ヌクレオチドの間のヌクレオチドの除去または追加が生じ得る。ただし、このような改変は典型的には＜２０ｎｔである。得られた挿入及び欠失（インデル）は、遺伝子のコード領域または非コード領域を分断することができる。代替的に、ＨＤＲは、内因的または外因的に提供される長いひと続きの相同ドナーＤＮＡを使用して、高い忠実度でＤＳＢを修復する。ＨＤＲは、分裂細胞でのみ活性であり、ほとんどの細胞タイプで比較的低頻度に発生する。本開示の多くの実施形態において、ＮＨＥＪは修復オペラントとして利用される。
一部の実施形態において、薬物製品の細胞を生成するために使用されるｓｇＲＮＡは、以下の配列：ＣＵＡＡＣＡＧＵＵＧＣＵＵＵＵＡＵＣＡＣＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号１）を含むか、またはそれからなる。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡは改変されている。例えば、ｓｇＲＮＡは、２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオアート残基を５’末端または３’末端に含むことができる。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡは、以下のように、３つの２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオアート残基を５’末端に、２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオアート残基を３’末端に含む：ｃ＊ｕ＊ａ＊ＡＣＡＧＵＵＧＣＵＵＵＵＡＵＣＡＣＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣｕ＊ｕ＊ｕ＊Ｕ（配列番号２）（式中、「＊」は２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオアート残基を示す）。
一部の実施形態において、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）エンドヌクレアーゼはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓからのものである。ただし、他のＣａｓ９ホモログが使用されてもよい。野生型Ｃａｓ９が使用されてもよく、または、本明細書で提供されるようなＣａｓ９の改変バージョン（例えば、Ｃａｓ９の進化バージョン）が使用されてもよい（例えば、Ｃａｓ９のオルソログもしくはバリアント）ことを理解されたい。一部の実施形態において、Ｃａｓ９は、別のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、例えば、（クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの）Ｃｐｆ１または任意の既知の標的特異性エンドヌクレアーゼで置換されてもよい。
ガイドＲＮＡの製剤化
本開示のガイドＲＮＡは、医薬的に許容される賦形剤（例えば、担体、溶媒、安定化剤、アジュバント、希釈剤など）を用いて、特定の投与様式及び剤形に応じて製剤化することができる。ガイドＲＮＡ組成物は、生理的適合性のｐＨを達成するように製剤化することができ、製剤及び投与経路に応じて、約３のｐＨ〜約１１のｐＨ、約ｐＨ３〜約ｐＨ７を範囲とすることができる。一部の場合において、ｐＨは約ｐＨ５．０〜約ｐＨ８の範囲に調整することができる。一部の場合において、当該組成物は、治療有効量の本明細書に記載の少なくとも１つの化合物を、１つ以上の医薬的に許容される賦形剤と共に含むことができる。任意選択で、当該組成物は、本明細書に記載の化合物の組合せを含むことができ、または細菌成長の処置または予防に有用な第２の活性成分（例えば、以下に限定されないが、抗菌剤または抗微生物剤）を含むことができ、または本開示の試薬の組合せを含むことができる。
好適な賦形剤としては、例えば、大型でゆっくりと代謝される巨大分子、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び不活性ウイルス粒子を含む担体分子が挙げられる。他の例示的な賦形剤としては、抗酸化剤（例えば、以下に限定されないが、アスコルビン酸）、キレート剤（例えば、以下に限定されないが、ＥＤＴＡ）、炭水化物（例えば、以下に限定されないが、デキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、及びヒドロキシアルキルメチルセルロース）、ステアリン酸、液体（例えば、以下に限定されないが、油、水、食塩水、グリセロール及びエタノール）、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などが挙げられ得る。
シークエンシングによるオンターゲット及びオフターゲットの変異検出
オンターゲット部位及び推定上のオフターゲット部位をシークエンシングするために、適切な増幅プライマーを特定することができ、このようなプライマーとの反応は、トランスフェクションから３日後の処理された細胞からＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いて回収したゲノムＤＮＡを用いてセットアップすることができる。増幅プライマーは、アダプターが隣接する遺伝子特異的部分を含有する。フォワードプライマーの５’末端は、改変フォワード（リード１）プライマー結合部位を含む。リバースプライマーの５’末端は、組み合わせられた改変リバース（リード２）及びバーコードプライマー結合部位を逆向きで含有する。個々のＰＣＲ反応は、アガロースゲル上で分離することによって検証し、次に精製し再増幅することができる。第２ラウンドのフォワードプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ５配列の次に改変フォワード（リード１）プライマー結合部位の一部を含有する。第２ラウンドのリバースプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ７配列（５’末端）の次に６塩基バーコードならびに組み合わされた改変リバース（リード２）及びバーコードプライマー結合部位を含有する。第２ラウンドの増幅も、アガロースゲル上でチェックし、次に精製し、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を用いて定量化することができる。増幅産物は、プールして濃度をマッチさせ、次にライブラリー調製及びＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ機器によるシークエンシングのためにＥｍｏｒｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｏｒｅに提出することができる。
シークエンシングリードは、バーコードによって並び替え、次にバイオインフォマティクスにより各産物に与えられた参照配列に対し整列させることができる。整列させたシークエンシングリードにおける挿入及び欠失の比率は、先述のソフトウェアを用いて推定切断部位の領域内で検出することができる。例えば、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４２：７４７３−７４８５（２０１４）を参照。次に、このウィンドウ内で検出した挿入及び欠失のレベルを、模擬トランスフェクション細胞から単離したゲノムＤＮＡの同じ位置で見られたレベルと比較して、シークエンシングアーティファクトの影響を最小化することができる。
変異検出アッセイ
Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡの組合せにおけるオンターゲット及びオフターゲット切断活性は、ＮＨＥＪによる２本鎖切断の不完全修復から得られる変異率を用いて測定することができる。
オンターゲット座位は、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｔｙ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、製造業者の指示に従って４０サイクル（９４℃を３０秒；５２〜６０℃を３０秒；６８℃を６０秒）、１μｌの細胞可溶化物と１μｌのそれぞれ１０μＭの増幅プライマーとを含有する５０μｌ反応液中で増幅することができる。Ｔ７ＥＩ変異検出アッセイを、製造業者のプロトコル［Ｒｅｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３０：４６０−４６５（２０１２）］に従い、２％アガロースゲル上で消化物を分離し、ＩｍａｇｅＪを用いて定量化して［Ｇｕｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６４９：２４７−２５６（２０１０）］実施した。当該アッセイは、細胞のバルク集団における挿入／欠失（「インデル」）のパーセンテージを測定することができる。
ヒト細胞
本明細書で説明し例示するように、ヘモグロビン異常症の緩和に関して、ゲノム編集の主な標的はヒト細胞である。例えば、ｅｘ ｖｉｖｏの方法では、ヒト細胞は体細胞であってもよく、体細胞は説明の方法を用いて改変した後に前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ）を生じ得る。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏの方法では、ヒト細胞は骨髄細胞、造血前駆細胞、またはＣＤ３４＋細胞であってもよい。
患者由来の自家細胞内でゲノム編集を実施することにより、自家細胞は必要とする患者に既に完全に適合しているため、安全に患者に再導入することができる細胞を産生することや、患者の疾患に関連する１つ以上の臨床状態の緩和に有効であり得る細胞集団を効果的に生じさせることが可能である。
前駆細胞（本明細書では幹細胞とも呼ばれる）は、増殖させることもさらに前駆細胞を生じさせることも可能であり、次にこれらは多数の母細胞を産生することができ、次に母細胞は分化したまたは分化可能な娘細胞を生じることができる。娘細胞自体を、増殖し１つ以上の成熟細胞タイプに分化する後代を産生するように誘導させる一方で親の発生可能性を有する１つ以上の細胞も保持させることができる。そこで「幹細胞」という用語は、特定の状況下でさらに特化または分化した表現型に分化する能力または可能性を有し、ある特定の状況下で実質的な分化を伴うことなく増殖する能力を保持する細胞を指す。一態様において、前駆細胞または幹細胞という用語は、その子孫（後代）が、分化によって、例えば、胚細胞及び胚組織の進行的多様化で生じるように、完全に個別の特徴を獲得することによって、しばしば異なる方向に特化する全般的な母細胞を指す。細胞分化は、典型的には多くの細胞分割を通じて発生する複雑なプロセスである。分化細胞は、自らが多能性細胞由来である多能性細胞に由来してもよい。このような多能性細胞の各々は幹細胞とみなすことができるが、各々が生じ得る細胞タイプの範囲はかなり変動し得る。一部の分化細胞は、発生的可能性がさらに大きい細胞を生じる能力も有する。このような能力は、天然であることもあれば、様々な因子を用いた処置によって人工的に誘導されることもある。多くの生物学的事例において、幹細胞は、２つ以上の異なる細胞タイプの後代を生成することができることから「多能性」である可能性もあるが、このことは「幹細胞性」の要件ではない。
自己再生は、幹細胞におけるもう１つの重要な態様である。理論上、自己再生は２つの主要な機構のいずれかによって生じ得る。幹細胞は非対称的に分割して、一方の娘細胞が幹細胞状態を保持し、他方の娘細胞が何らかの異なる他の特定機能及び表現型を発現することがある。あるいは、集団内の幹細胞の一部が対称的に２つの幹細胞へと分割することがあり、このようにして全体としては集団内の一部の幹細胞が保持され、一方、集団内の他の細胞は分化した後代のみを生じる。概して、「前駆細胞」は、より原始的な（すなわち、発生経路または進行において完全に分化した細胞よりも早期のステップにある）細胞表現型を有する。しばしば、前駆細胞は顕著なまたは非常に高い増殖可能性も有する。前駆細胞は、発生経路に応じて、また細胞が発生し分化する環境に応じて、複数の異なる分化細胞タイプを生じることもあれば、単一の分化細胞タイプを生じることもある。
細胞個体発生の文脈において、「分化した」または「分化させる」という形容詞は相対的な用語である。「分化細胞」とは、比較対象の細胞よりもさらに発生経路に沿って進行した細胞のことである。したがって、幹細胞は、系統が限定された前駆体細胞（例えば、造血前駆細胞）に分化することができ、次にこの前駆体細胞はさらに経路に沿った他のタイプの前駆体細胞（例えば、造血前駆体）に分化し、次に最終段階の分化細胞（例えば、赤血球）に分化することができるが、この最終段階の分化細胞はある組織タイプで特徴的な役割を担い、さらに増殖する能力を保持することもあれば保持しないこともある。
「造血前駆細胞」という用語は、赤血球系（赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）または赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）（ＲＢＣ））、骨髄系（単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、巨核球／血小板、ならびに樹状細胞）、及びリンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含めた全ての血球タイプをもたらす幹細胞系統の細胞を指す。
「赤血球系統の細胞」とは、接触されている細胞が、赤血球新生を経て、最終分化の際に赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）または赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）を形成する細胞であることを指す。このような細胞は、骨髄の造血前駆細胞から生じる。造血前駆細胞は、造血微小環境における特定の成長因子及び他の構成要素の曝露を受けると、一連の中間分化細胞タイプ、赤血球系統の全ての中間体を介し、ＲＢＣに成熟することができる。したがって、「赤血球系統」の細胞は、造血前駆細胞、前赤芽球、前赤血球、赤芽球、後赤血球、網状赤血球、及び赤血球を含む。
造血前駆細胞は、下記の造血前駆細胞に特有の細胞表面マーカーのうちの少なくとも１つを発現することができる：ＣＤ３４＋、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙｌ／ＣＤ９０＋、ＣＤ３８１ｏ／−、及びＣ−ｋｉｔ／ＣＤｌ １７＋。本明細書で提供される一部の例において、造血前駆細胞はＣＤ３４＋であり得る。
造血前駆細胞は、患者を顆粒球コロニー刺激因子などの１つ以上の因子を用いて（任意選択でプレリキサホルと組み合わせて）処置した後に患者から得られる末梢血幹細胞であり得る。ＣＤ３４＋細胞は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて豊富化することができる。ＣＤ３４＋細胞は、ゲノム編集前に血清フリー培地（例えば、ＣｅｌｌＧｒｏｗ ＳＣＧＭ培地、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）内でサイトカイン（例えば、ＳＣＦ、ｒｈＴＰＯ、ｒｈＦＬＴ３）を用いて刺激することができる。長期移植を改善するために、ＳＲ１及びｄｍＰＧＥ２及び／または他の因子の付加が企図されている。
赤血球系統の造血前駆細胞は、ＣＤ７１及びＴｅｒｌ １９などの赤血球系統に特有の細胞表面マーカーを有し得る。
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、修正された細胞の持続的供給源をもたらすため、遺伝子療法の重要な標的であり得る。ＨＳＣは、骨髄系及びリンパ系両系統の血球を生じさせる。成熟血球は有限の寿命を有し、一生を通じて継続的に置き換えられなければならない。血球は多能性ＨＳＣ集団の増殖及び分化によって絶えず生成され、多能性ＨＳＣ集団は自己再生によって補充され得る。骨髄（ＢＭ）は、ヒトにおける主要な血球新生部位であり、造血幹細胞及び造血前駆細胞（ＨＳＰＣ）の良好な供給源である。ＨＳＰＣは、末梢血（ＰＢ）中にも少数が見いだされ得る。一部の徴候及び処置において、ＨＳＰＣの数は増加する。ＨＳＣの後代は段階を通じて成熟し、ＢＣＬ１１Ａを発現する細胞を生じさせるリンパ系前駆細胞を含めた、多分化能の系統決定された後代細胞を産生する。Ｂ細胞前駆体及びＴ細胞前駆体は、再配置の前の段階でこれらを編集され得るようにするためＢＣＬ１１Ａの活性を必要とする２つの細胞集団であるが、前駆体の修正は、修正された細胞の供給源であり続けるという利点を有する。処置された細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）は、患者に戻されることになる。移植のレベルは、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ３４＋注入後の遺伝子編集された細胞に対する細胞の多系統移植能力が重要であり得るのと同じように、重要であり得る。
人工多能性幹細胞
本明細書に記載の遺伝子操作されたヒト細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。ｉＰＳＣを使用する利点は、当該細胞が、前駆細胞を投与する同じ対象に由来し得ることである。すなわち体細胞は、対象から取得し、人工多能性幹細胞に初期化し、次に対象に投与する前駆細胞（例えば、自家細胞）に再分化させることができる。前駆体は本質的に自家供給源に由来するため、別の対象または別の対象群からの細胞を使用することに比べると、移植拒絶反応またはアレルギー応答のリスクが低減され得る。加えて、ｉＰＳＣを使用することで胚供給源から細胞を得る必要性がなくなる。そのため一態様では、本開示の方法で使用される幹細胞は胚幹細胞ではない。
分化は概して生理的文脈下では非可逆的であるが、近年、体細胞をｉＰＳＣに初期化するいくつかの方法が開発されている。例示的な方法は当業者にとって公知であり、本明細書では下記で簡単に説明する。
「初期化」という用語は、分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態を変更または反転するプロセスを指す。言い換えれば、初期化とは、細胞の分化を逆方向に促進し、より未分化のタイプまたはより原始的なタイプの細胞にするプロセスを指す。多くの初代細胞を培養液中に入れると、完全に分化した特性のいくらかの損失につながり得ることに留意されたい。したがって、分化細胞という用語に含まれるこのような細胞を単に培養することが当該細胞を非分化細胞（例えば、未分化細胞）または多能性細胞にすることにはならない。分化細胞が多能性に移行するには、培養液中での分化特性の部分的損失をもたらす刺激を超えた初期化刺激が必要である。また、初期化細胞は、培養液中では概して限られた回数の分割しかできない初代細胞の親との対比で、成長可能性を損失することなく継代を延長できるという特徴も有する。
初期化対象の細胞は、初期化する前に部分的に分化していても最終的に分化していてもよい。初期化は、分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態における多能性状態または多分化能状態への完全な復帰を含み得る。初期化は、分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態における未分化細胞（例えば、胚様細胞）への完全または部分的な復帰を含み得る。初期化は、細胞による特定の遺伝子の発現をもたらす可能性があり、この発現はさらに初期化に寄与する。本明細書に記載のある特定の例において、分化細胞（例えば、体細胞）の初期化により、分化細胞は未分化状態の（例えば、未分化細胞である）様相を呈することができる。得られた細胞は「初期化細胞」または「人工多能性幹細胞」（ｉＰＳＣまたはｉＰＳ細胞）と呼ばれる。
初期化は、細胞分化中に発生する遺伝的パターン、例えば、核酸改変（例えば、メチル化）、クロマチン凝縮、エピジェネティック変化、ゲノムインプリンティングなどにおける少なくとも一部の変更（例えば、逆転）を伴い得る。初期化は、単に、既に多能性を有する細胞における既存の未分化状態を維持することや、既に多分化能を有する細胞（例えば、造血幹細胞）における既存の完全分化未満の状態を維持することとは異なる。また、初期化は、既に多能性または多分化能を有する細胞の自己再生または増殖を促進することとも異なるが、本明細書に記載の組成物及び方法は、一部の例において、このような目的に使用することもできる。
体細胞からの多能性幹細胞の産生に使用され得る多くの方法が、当技術分野で知られている。体細胞を多能性表現型に初期化するこのような方法はいずれも、本明細書に記載の方法での使用に適切であると考えられる。
定義された転写因子の組合せを用いた多能性細胞生成のための初期化方法論を説明してきた。マウス体細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃの直接的な形質導入により、発生可能性が拡大したＥＳ細胞様細胞に変換することができる。例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ １２６（４）：６６３−７６（２００６）を参照。ｉＰＳＣは、多能性関連の転写回路やエピジェネティックなランドスケープの多くを復元することから、ＥＳ細胞に似ている。加えて、マウスｉＰＳＣは、全ての多能性に関する標準アッセイ、具体的には、３胚葉における細胞タイプへのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化、奇形腫形成、キメラへの寄与、生殖系列の伝達［例えば、Ｍａｈｅｒａｌｉ ａｎｄ Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．３（６）：５９５−６０５（２００８）を参照］、及び４倍体補完法を満たす。
ヒトｉＰＳＣは同様の形質導入方法を用いて得ることができ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧの３つの転写因子は多能性を司る転写因子のコアセットとして確立されている。例えば、Ｂｕｄｎｉａｔｚｋｙ ａｎｄ Ｇｅｐｓｔｅｉｎ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．３（４）：４４８−５７（２０１４）；Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ ３：１−６ ｓｃｔｍ．２０１４−０１２１（２０１４）；Ｆｏｃｏｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ４：ｅ２１１（２０１４）；及びこれらの文献内で引用されている文献を参照。ｉＰＳＣの生成は、幹細胞関連の遺伝子をコードする核酸配列を、歴史的にはウイルスベクターを用いて、成人の体細胞に導入することにより達成され得る。
ｉＰＳＣは、最終分化体細胞及び成人の幹細胞または体性幹細胞から産生する、または導き出すことができる。すなわち、非多能性前駆細胞は、初期化によって多能性または多分化能にすることができる。このような場合には、最終分化細胞の初期化に必要な初期化因子と同じ数の初期化因子を含める必要がない可能性がある。さらに、初期化の誘導は、初期化因子の非ウイルス導入により、例えばタンパク質そのものの導入により、または初期化因子をコードする核酸の導入により、または翻訳の際に初期化因子を生成するメッセンジャーＲＮＡの導入により行うことができる（例えば、Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，７（５）：６１８−３０（２０１０）を参照）。初期化は、例えば、Ｏｃｔ−４（Ｏｃｔ−３／４またはＰｏｕｆ５１としても知られる）、Ｓｏｘｌ、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１８、ＮＡＮＯＧ、Ｋｌｆｌ、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、ＮＲ５Ａ２、ｃ−Ｍｙｃ、１−Ｍｙｃ、ｎ−Ｍｙｃ、Ｒｅｍ２、Ｔｅｒｔ、及びＬＩＮ２８を含めた、幹細胞関連遺伝子をコードする核酸の組合せの導入によって達成することができる。本明細書に記載の方法及び組成物を用いた初期化はさらに、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘファミリーのメンバー、Ｋｌｆファミリーのメンバー、及びＭｙｃファミリーのメンバーのうちの１つ以上を体細胞に対し導入することを含み得る。本明細書に記載の方法及び組成物はさらに、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｃ−ＭＹＣ、及びＫｌｆ４の各々のうちの１つ以上を初期化向けに導入することを含み得る。上で注記したように、初期化に使用する厳密な方法は、本明細書に記載の方法及び組成物に必ずしも決定的なものではない。ただし、初期化細胞から分化した細胞を、例えばヒトの治療で使用する場合、一態様において当該初期化はゲノムを変更する方法によって行われない。したがってこのような例において、初期化は、例えばウイルスまたはプラスミドのベクターを使用することなく、達成することができる。
開始細胞集団から導き出す初期化の効率（すなわち、初期化細胞の数）は、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ−Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２：５２５−５２８（２００８）；Ｈｕａｎｇｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６（７）：７９５−７９７（２００８）、及びＭａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ−Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ３：１３２−１３５（２００８）により示されるように、様々な薬剤、例えば低分子の添加によって向上させることができる。したがって、人工多能性幹細胞生成の効率または速度を向上させる薬剤または薬剤の組合せは、患者特異的または疾患特異的ｉＰＳＣの生成で使用することができる。初期化効率を向上させる薬剤の一部の非限定的な例としては、可溶性Ｗｎｔ、Ｗｎｔ条件培地、ＢＩＸ−０１２９４（Ｇ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ）、ＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、バルプロ酸、５’−アザシチジン、デキサメタゾン、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、ビタミンＣ、及びトリコスタチン（ＴＳＡ）が特に挙げられる。
初期化を向上させる薬剤におけるその他の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ（例えば、ＭＫ０６８３、ボリノスタット）及び他のヒドロキサム酸）、ＢＭＬ−２１０、デプデシン（例えば、（−）−デプデシン）、ＨＣトキシン、ヌルスクリプト（４−（１，３−ジオキソ−１Ｈ，３Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−２−イル）−Ｎ−ヒドロキシブタンアミド）、フェニル酪酸塩（例えば、フェニル酪酸ナトリウム）及びバルプロ酸（（ＶＰ Ａ）及び他の短鎖脂肪酸）、スクリプタイド、スラミンナトリウム、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ＡＰＨＡ化合物８、アピシジン、酪酸ナトリウム、酪酸ピバロイルオキシメチル（Ｐｉｖａｎｅｘ、ＡＮ−９）、トラポキシンＢ、クラミドシン、デプシペプチド（ＦＲ９０１２２８またはＦＫ２２８としても知られる）、ベンズアミド（例えば、ＣＩ−９９４（例えば、Ｎ−アセチルジナリン）及びＭＳ−２７−２７５）、ＭＧＣＤ０１０３、ＮＶＰ−ＬＡＱ−８２４、ＣＢＨＡ（ｍ−カルボキシケイ皮酸ビスヒドロキサム酸）、ＪＮＪ１６２４１１９９、ツバシン、Ａ−１６１９０６、プロキサミド、オキサムフラチン、３−Ｃｌ−ＵＣＨＡ（例えば、６−（３−クロロフェニルウレイド）カプロンヒドロキサム酸）、ＡＯＥ（２−アミノ−８−オキソ−９，１０−エポキシデカン酸）、ＣＨＡＰ３１及びＣＨＡＰ５０。初期化を向上させる薬剤としては、例えば、ＨＤＡＣの優性阻害型（例えば、触媒不活性型）、ＨＤＡＣのｓｉＲＮＡ阻害剤、及びＨＤＡＣに特異的に結合する抗体が挙げられる。このような阻害剤は、例えば、ＢＩＯＭＯＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｆｕｋａｓａｗａ、Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｔｉｔａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＭｅｔｈｙｌＧｅｎｅ、及びＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能である。
本明細書に記載の方法と共に使用する多能性幹細胞の導入を確認するために、単離されたクローンに対し、幹細胞マーカーの発現を試験することができる。体細胞由来の細胞内でこのような発現があれば、当該細胞は多能性幹細胞として特定される。幹細胞マーカーは、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、Ｎａｎｏｇ、Ｆｂｘｌ５、Ｅｃａｔ１、Ｅｓｇ１、Ｅｒａｓ、Ｇｄｆ３、Ｆｇｆ４、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｄａｘ１、Ｚｐｆ２９６、Ｓｌｃ２ａ３、Ｒｅｘ１、Ｕｔｆ１、及びＮａｔ１を含む非限定的な群から選択され得る。例えば、ある場合において、Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇを発現する細胞は多能性であるものとして特定される。このようなマーカーの発現を検出する方法としては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ及びコードされたポリペプチドの存在を検出する免疫学的方法（例えば、ウェスタンブロットまたはフローサイトメトリー解析）が挙げられ得る。検出は、ＲＴ−ＰＣＲを伴うだけではなく、タンパク質マーカーの検出も含み得る。細胞内マーカーはＲＴ−ＰＣＲ、または免疫組織化学検査などのタンパク質検出法によって最もよく特定することができ、一方、細胞表面マーカーは、例えば免疫組織化学検査によって容易に特定される。
単離された細胞の多能性幹細胞特性は、３胚葉の各細胞に分化するｉＰＳＣの能力を評価する試験によって確認することができる。一例として、ヌードマウスにおける奇形腫形成は、単離されたクローンの多能特性を評価するのに使用することができる。細胞をヌードマウスに導入し、細胞から生じた腫瘍に組織診断及び／または免疫組織化学検査を実施することができる。例えば、３胚葉全てからの細胞を含む腫瘍の成長は、この細胞が多能性幹細胞であることをさらに示す。
患者特異的ｉＰＳＣの創出
一部の実施形態において、本開示のｅｘ ｖｉｖｏの方法における１つのステップは、患者特異的ｉＰＳ細胞、患者特異的ｉＰＳ細胞、または患者特異的ｉＰＳ細胞株の創出を伴い得る。患者特異的ｉＰＳ細胞の創出については、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ ２００６；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．２００７に記載のように、当技術分野において多くの確立した方法が存在する。例えば、創出するステップは、ａ）患者から体細胞（例えば、皮膚細胞または線維芽細胞）を単離することと、ｂ）多能性細胞になるよう誘導するために、体細胞に多能性関連遺伝子のセットを導入することとを含み得る。多能性関連細胞のセットは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌｉｎ２８、ＮＡＮＯＧ、及びｃＭＹＣからなる群から選択される１つ以上の遺伝子であってもよい。
患者骨髄の生検または吸引液の実施
一部の実施形態において、生検または吸引液とは、身体から採取された組織または体液の試料のことである。生検または吸引液には多くの様々な種類が存在する。そのほぼ全てが、鋭利な道具を使用して少量の組織を取り出すことを伴う。生検が皮膚または他の敏感な部位である場合、最初に痺れ薬を適用することができる。生検または吸引液は、当技術分野で公知の方法のいずれかに従って実施することができる。例えば、骨髄穿刺液の場合、大型の針を使用して骨盤に侵入させ、骨髄を採取する。
間葉系幹細胞の単離
間葉系幹細胞は、例えば患者の骨髄または末梢血から、当技術分野で公知の任意の方法に従い単離することができる。例えば、骨髄穿刺液をヘパリンと共にシリンジに収集することができる。細胞は洗浄し、Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）で密度勾配遠心分離することができる。血球、肝細胞、間質細胞、マクロファージ、肥満細胞、及び胸腺細胞などの細胞は、Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）を用いて分離することができる。当該細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（低グルコース）内で培養することができる（Ｐｉｔｔｉｎｇｅｒ ＭＦ，Ｍａｃｋａｙ ＡＭ，Ｂｅｃｋ ＳＣ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９；２８４：１４３−１４７）。
患者からの造血前駆細胞の単離
造血前駆細胞は、当技術分野で公知の任意の方法によって、患者から単離することができる。ＣＤ３４＋細胞は、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、豊富化することができる。ＣＤ３４＋細胞は、ゲノム編集前に、例えば、血清フリー培地（例えば、ＣｅｌｌＧｒｏｗ ＳＣＧＭ培地、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）内でサイトカイン（例えば、ＳＣＦ、ｒｈＴＰＯ、ｒｈＦＬＴ３）を用いて、弱く刺激することができる。
ヒト造血幹・前駆細胞
一部の実施形態において、本開示の遺伝子改変細胞はヒト造血幹・前駆細胞（ｈＨＳＰＣ）である。この幹細胞系統は、赤血球系（赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）または赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）（ＲＢＣ））、骨髄系（単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、巨核球／血小板、ならびに樹状細胞）、及びリンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含めた全ての血球タイプをもたらす。血球は、ごく小規模な多能性造血幹細胞（ＨＳＣ）集団の増殖及び分化によって生成され、この集団は自己再生によって自己を補充する能力も有する。分化中、ＨＳＣの後代は様々な中間的成熟段階を通じて進行し、多分化能かつ系統決定された前駆細胞を産生してから成熟に到達する。骨髄（ＢＭ）は、ヒトにおける主要な造血部位であり、正常条件下において、末梢血（ＰＢ）中には少数の造血幹・前駆細胞（ＨＳＰＣ）が見いだされ得るに過ぎない。サイトカイン（詳細には顆粒球コロニー刺激因子；Ｇ−ＣＳＦ）や、がんの処置で使用される一部の骨髄抑制薬物や、造血細胞とＢＭ間質細胞との相互作用を分断する化合物を用いた処置により、多数の幹・前駆細胞を迅速に循環中に動員することができる。本開示の一部の実施形態において、幹細胞動員を改善するためにＧ−ＣＳＦが対象内で使用され、一方他の実施形態においてはプレリキサホル（Ｍｏｚｏｂｉｌ（登録商標））が使用される。一部の実施形態において、プレリキサホルがＧ−ＣＳＦと組み合わせて使用される。プレリキサホルは、以下でより詳細に論じられる。
最もよく知られているヒトＨＳＰＣのマーカーは、細胞表面糖タンパク質のＣＤ３４である。ＣＤ３４は、骨髄移植で臨床的に使用するためのｈＨＳＰＣを同定し単離するために日常的に使用されている。したがって、本明細書において、薬物製品のｈＨＳＰＣは改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣと呼ばれる。
遺伝子改変細胞
「遺伝子改変細胞」という用語は、（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて）ゲノム編集によって導入された少なくとも１つの遺伝子改変を含む細胞を指す。本明細書の一部のｅｘ ｖｉｖｏの例において、遺伝子改変細胞は遺伝子改変前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ）であり得る。本明細書の一部のｉｎ ｖｉｖｏの例において、遺伝子改変細胞は遺伝子改変造血前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ）であり得る。本明細書では、外因的ゲノム標的化核酸及び／またはゲノム標的化核酸をコードする外因的核酸を含む遺伝子改変細胞が企図されている。
「対照処置集団」という用語は、ゲノム編集構成要素の追加以外では、同一の培地、ウイルス誘導、核酸配列、温度、培養密度、フラスコサイズ、ｐＨなどを用いて処置された細胞集団を説明する。当技術分野で公知の任意の方法を使用して、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列またはタンパク質発現または活性の修飾または不活性化を測定することができ、例えば、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子タンパク質の転写制御配列に対するウェスタンブロット解析、またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子ｍＲＮＡの転写制御配列の定量化がある。
「単離細胞」という用語は、その細胞が最初に発見された生物から取り出された細胞、またはこのような細胞の子孫を指す。任意選択で、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば定義された条件下でまたは他の細胞の存在下で培養することができる。任意選択で、細胞は、のちに第２の生物に導入するか、または単離元の生物（または由来細胞）に再導入することができる。
細胞における単離集団に関しての「単離集団」という用語は、混合または不均質の細胞集団から取り出し分離された細胞集団を指す。一部の場合において、単離集団は、当該細胞の単離または豊富化を行った不均質の集団と比較して、実質的に純粋な細胞集団であり得る。一部の場合において、単離集団は、ヒトの前駆細胞の単離集団、例えば、ヒト前駆細胞及びヒト前駆細胞が由来する細胞を含む不均質な細胞集団と比較して、ヒト前駆細胞の実質的に純粋な集団であり得る。
特定の細胞集団に対する「実質的に向上した」という用語は、特定のタイプの細胞の出現率が、例えば、ヘモグロビン異常症改善向けにこのような細胞に所望されるレベルに応じて、既存または基準レベルとの対比で少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも４００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも２００００倍、少なくとも１０００００倍、またはそれ以上の倍数だけ増加した細胞集団を指す。
特定の細胞集団に対する「実質的に豊富化された」という用語は、総細胞集団を構成する細胞に対し少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、またはそれ以上である細胞集団を指す。
特定の細胞集団に対する「実質的に純粋な」という用語は、総細胞集団を構成する細胞に対し少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％純粋である細胞集団を指す。すなわち、前駆細胞集団に対する「実質的に純粋な」または「本質的に精製された」という用語は、約２０％、約１５％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、または１％未満の、本明細書における用語によって定義される前駆細胞ではない細胞を含有する細胞集団を指す。
ゲノム編集されたｉＰＳＣの造血前駆細胞への分化
一部の実施形態において、本開示におけるｅｘ ｖｉｖｏの方法の別のステップは、ゲノム編集されたｉＰＳＣを造血前駆細胞に分化させることを含むことができる。分化させるステップは、当技術分野において公知の任意の方法に従って実施することができる。
ゲノム編集された間葉系幹細胞の造血前駆細胞への分化
一部の実施形態において、本開示におけるｅｘ ｖｉｖｏの方法の別のステップは、ゲノム編集された間葉系幹細胞を造血前駆細胞に分化させることを含むことができる。分化させるステップは、当技術分野において公知の任意の方法に従って実施することができる。
薬物製品
本開示の薬物製品は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介遺伝子編集によって改変された自家ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣを含む細胞製品である。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子編集の標的は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球系統特異的エンハンサー領域であり、これは２番染色体上のエキソン２と３との間のイントロン２上にある。編集は、高度に特異的なガイドＲＮＡ（例えば、配列番号１または配列番号２を含むまたはそれからなるｇＲＮＡ）を用いて創出され、ガイドＲＮＡは、ＢＣＬ１１Ａの赤血球系統特異的エンハンサー領域（ＤＮアーゼＩ高感受性部位＋５８（ＤＨＳ＋５８）として識別される）にある重要な転写因子結合部位（ＧＡＴＡ１）を標的とする（例えば、ＷＯ２０１７／１８２８８１（この全体が参照により本明細書に援用される）を参照）。ｇＲＮＡ−エンドヌクレアーゼＲＮＰ（例えば、ｇＲＮＡ−Ｃａｓ９ ＲＮＰ）は、一部の実施形態において、本開示の細胞（例えば、ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ）内に、当技術分野で公知のウイルスまたは非ウイルス送達機構（例えば、エレクトロポレーション）を用いて、送達または導入される。細胞内に送達した後、ＲＮＰは、配列依存的方式でＤＮＡにＤＳＢを導入する。ＮＨＥＪによるＤＳＢの修復により、ＧＡＴＡ１結合を分断するように意図されたＤＮＡインデルがもたらされ、それによってＢＣＬ１１Ａ転写が低下し、γ−グロビン及びＨｂＦのレベルが同時に増加する。ｇＲＮＡ−Ｃａｓ９ ＲＮＰが、ＢＣＬ１１Ａの非コード赤血球系統特異的エンハンサー領域を正確に標的とし、ＢＣＬ１１Ａコード配列自体は標的としないため、理論に束縛されるものではないが、赤血球系統のみの細胞内のＢＣＬ１１Ａ遺伝子及びタンパク質の発現レベルを修飾し、非赤血球造血系統には影響を及ぼさないことが予想される。
一部の実施形態において、薬物製品は、５％ ＤＭＳＯ及びデキストラン４０を含有するＣＲＹＯＳＴＯＲ（登録商標）ＣＳ５培地などの血清フリー（血清を含まない、または血清を実質的に含まない）凍結保存培地中で製剤化される。他の凍結保存培地及び／または賦形剤を使用してもよい。
一部の実施形態において、本開示の改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣは、非改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣとの対比で、０．３０±０．２０のγ／（γ＋α）−グロビンｍＲＮＡ比の増加を示す。一部の実施形態において、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣは、非改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣとの対比で、０．１〜０．６のγ／（γ＋α）−グロビンｍＲＮＡ比の増加を示し得る。一部の実施形態において、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣは、非改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣとの対比で、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、または０．６のγ／（γ＋α）−グロビンｍＲＮＡ比の増加を示し得る。
一部の実施形態において、本開示の改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣは、非改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣとの対比で、０．４１±０．１５のγ／（γ＋β）−グロビンｍＲＮＡ比の増加を示す。一部の実施形態において、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣは、非改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣとの対比で、０．２〜０．６のγ／（γ＋β）−グロビンｍＲＮＡ比の増加を示し得る。一部の実施形態において、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣは、非改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣとの対比で、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、または０．６のγ／（γ＋β）−グロビンｍＲＮＡ比の増加を示し得る。
一部の実施形態において、本開示の改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣは、０．４以上（例えば、０．４以上、０．４２以上、０．４４以上、０．４６以上、０．４８以上、０．５以上、例えば、０．４超、０．４２超、０．４４超、０．４６超、０．４８超、または０．５超）のγ／（γ＋β）α−グロビンｍＲＮＡ比を示す。
一部の実施形態において、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣは、３２％±９％のＨｂＦ／（ＨｂＦ＋ＨｂＡ）タンパク質レベルのＨｂＦ平均パーセンテージを示す。一部の実施形態において、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣは、２９％±１１％のＨｂＦ／（ＨｂＦ＋ＨｂＡ）タンパク質レベルのＨｂＦ平均パーセンテージを示す。一部の実施形態において、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣは、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％のＨｂＦ／（Ｈｂｆ＋ＨｂＡ）タンパク質レベルのＨｂＦ平均パーセンテージを示す。
一部の実施形態において、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣは、３０％〜９９％の平均アレル編集頻度を示す。一部の実施形態において、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣは、７０％〜９９％の平均アレル編集頻度を示す。一部の実施形態において、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣは、７０％〜９０％の平均アレル編集頻度を示す。一部の実施形態において、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣは、８０％±４％の平均アレル編集頻度を示す。一部の実施形態において、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣは、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の平均アレル編集頻度を示す。
一部の実施形態において、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの少なくとも５０％が、対象への改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与後少なくとも１６週間、多系統分化能を維持する。一部の実施形態において、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が、対象への改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与後少なくとも１６（例えば、１６、１７、１８、１９、２０）週間、多系統分化能を維持する。
一部の実施形態において、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣは、少なくとも８０％のオンターゲットインデル率を示す。一部の実施形態において、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣは、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のオンターゲットインデル率を示す。
一部の実施形態において、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣは、５％未満、または１％未満のオフターゲットインデル率を示す。一部の実施形態において、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣは、０．９％未満、０．８％未満、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、または０．１％のオフターゲットインデル率を示す。
治療アプローチ
本明細書では、本開示の一部の態様において、ヘモグロビン異常症を有する患者を処置する方法が提供される。このような方法の一態様は、ｉＰＳＣを用いたｅｘ ｖｉｖｏの細胞ベース療法である。例えば、患者特異的人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が創出され得る。次に、本明細書に記載の材料及び方法を用いてこのｉＰＳ細胞の染色体ＤＮＡを編集することができる。次に、ゲノム編集されたｉＰＳＣを造血前駆細胞に分化させることができる。最後に、この造血前駆細胞を患者に植え込むことができる。
このような方法のまた別の態様は、間葉系幹細胞を用いたｅｘ ｖｉｖｏの細胞ベース療法である。例えば、患者から間葉系幹細胞が単離され得るが、この間葉系幹細胞は患者の骨髄または末梢血から単離することができる。次に、本明細書に記載の材料及び方法を用いてこの間葉系幹細胞の染色体ＤＮＡを編集することができる。次に、ゲノム編集された間葉系幹細胞を造血前駆細胞に分化させることができる。最後に、この造血前駆細胞を患者に植え込むことができる。
このような方法のさらなる態様は、造血前駆細胞を用いたｅｘ ｖｉｖｏの細胞ベース療法である。例えば、造血前駆細胞が患者から単離され得る。次に、本明細書に記載の材料及び方法を用いてこの細胞の染色体ＤＮＡを編集することができる。最後に、ゲノム編集された造血前駆細胞を患者に植え込むことができる。
ｅｘ ｖｉｖｏの細胞療法アプローチにおける１つの利点は、治療薬の包括的な解析を行ってから投与することができる点である。ヌクレアーゼベースの治療薬は、一定レベルのオフターゲット作用を有し得る。ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子修正を実施することにより、修正された細胞集団の特性決定を実施してから植え込むことができる。本開示は、修正された細胞のゲノムの一部または全体をシークエンシングして、オフターゲット作用が存在する場合、それが患者に対する最小のリスクと関連するゲノム位置に存在できるように保証することを含む。さらに、クローン集団を含めた特定の細胞集団は、植え込みの前に単離され得る。
ｅｘ ｖｉｖｏの細胞療法における別の利点は、他の初代細胞源と比較してのｉＰＳＣの遺伝子修正に関する。ｉＰＳＣは増殖性が高いため、細胞ベース療法に必要となる多数の細胞を容易に得ることができる。さらに、ｉＰＳＣはクローン単離の実施に理想的な細胞タイプである。このため、生存率低下のリスクを伴うことなく正しいゲノム修正についてスクリーニングすることができる。これに対し、他の初代細胞の生存率はわずか数継代に過ぎず、クローン拡大が困難である。したがって、ヘモグロビン異常症の処置向けのｉＰＳＣ操作ははるかに容易であり、所望の遺伝子修正を行うために必要な時間を短縮することができる。
ｅｘ ｖｉｖｏの療法において、植え込みを行うには、移植する骨髄微小環境またはドナーＨＳＣのクリアランスが必要である。現状の方法は、放射線照射及び／または化学療法に依存している。これらによる制約のため、より安全な前処置レジメンがこれまでに開発され、現在も開発中であるが、例としては、造血細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ１１７、ｃ−ｋｉｔなど）に向けられた抗体または抗体毒素複合体による骨髄細胞の免疫枯渇がある。ＨＳＣ移植が成功するかは、骨髄への効率的なホーミング、次に行う移植、及び骨髄の再増殖によって決まる。ゲノム編集された細胞が移植されるレベルは、細胞の多系統移植能力が重要であるのと同じように重要である。
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、修正された細胞の供給源を持続させるため、ｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子療法において重要な標的である。処置されたＣＤ３４＋細胞は、患者に戻されることになる。
諸方法には、ｉｎ ｖｉｖｏベース療法も含まれ得る。患者内の細胞の染色体ＤＮＡは、本明細書に記載の材料及び方法を用いて編集される。当該細胞は、骨髄細胞、造血前駆細胞、またはＣＤ３４＋細胞とすることができる。
血球は、ｅｘ ｖｉｖｏの処置及び治療に対する魅力的な標的を提示するが、送達の有効性を増大させることで、造血幹細胞（ＨＳＣ）及び／または他のＢ及びＴ細胞前駆体（例えば、ＣＤ３４＋細胞）に対し直接ｉｎ ｖｉｖｏで送達できるようになり得る。理想的には、標的化及び編集は関連細胞に向けられる。他の細胞における切断は、ある特定の細胞または発生段階でのみ活性を有するプロモーターを使用することで防止することもできる。追加のプロモーターは誘導的であるため、ヌクレアーゼがプラスミドとして送達される場合は時間的に制御することができる。送達されたＲＮＡ及びタンパク質が細胞内にとどまる時間は、追加される処置またはドメインを用いて、半減期を変えるように調整することもできる。ｉｎ ｖｉｖｏの処置は処置ステップ回数を減らすことになるが、送達率が低いと編集率を高くする必要が生じ得る。ｉｎ ｖｉｖｏの処置は、ｅｘ ｖｉｖｏの処置及び移植からの問題や損失を減らし得る。
ｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子療法の利点は、治療薬の生成及び投与の容易さであり得る。同じ治療アプローチ及び療法が、２人以上の患者（例えば、同じまたは類似の遺伝型またはアレルを共有する複数の患者）の処置に使用される可能性を有することになる。これに対し、ｅｘ ｖｉｖｏの細胞療法は、典型的には患者自身の細胞を使用する必要があり、この細胞は単離され、操作され、同じ患者に戻される。
また本明細書では、ゲノム編集によって細胞内のＢＣＬ１１Ａ遺伝子を編集するための細胞の方法が提供される。例えば、細胞は患者または動物から単離することができる。次に、本明細書に記載の材料及び方法を用いてこの細胞の染色体ＤＮＡを編集することができる。
本明細書で提供される方法は、細胞、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｖｏのいずれの方法であるかにかかわらず、以下のうちの１つまたは組合せを伴い得る：１）ＮＨＥＪ経路によって生じる欠失により、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列に対する修飾または不活性化を行う、２）ＨＤＲにより、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列に対する修飾または不活性化を行う、３）転写制御配列の少なくとも一部の欠失、及び／または改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子もしくはｃＤＮＡを、遺伝子座位もしくはゲノム内の異種の位置（例えば、ＡＡＶＳ１などのセーフハーバー部位）にノックインすることにより、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列に対する修飾または不活性化を行う。ＨＤＲ及びノックインの戦略は共に、相同組換え修復（ＨＤＲ）におけるドナーＤＮＡテンプレートを利用することができる。いずれの戦略におけるＨＤＲも、１つ以上のエンドヌクレアーゼを使用することによりゲノム内の特定の部位で１つ以上の１本鎖切断（ＳＳＢ）または２本鎖切断（ＤＳＢ）を行うことによって達成することができる。
例えば、ＮＨＥＪ戦略は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列の少なくとも一部に対する欠失を伴う可能性があり、これは、１つ以上のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡ）を用いてＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で１つの１本鎖切断または２本鎖切断を誘導することにより、あるいは２つ以上のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ及び２つ以上のｓｇＲＮＡを用いてＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で２つ以上の１本鎖切断または２本鎖切断を誘導することにより行われる。このアプローチは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列向けのｓｇＲＮＡの開発及び最適化が必要となり得る。
例えば、ＨＤＲ戦略は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列に対する修飾または不活性化を伴う可能性があり、これは、細胞のＤＳＢ応答を相同組換え修復に向けるために外来的に導入されたドナーＤＮＡテンプレートの存在下で（ドナーＤＮＡテンプレートは、短い１本鎖オリゴヌクレオチド、短い２本鎖オリゴヌクレオチド、長い１本鎖または２本鎖のＤＮＡ分子であり得る）、１つ以上のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡ）を用いてＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で１つの１本鎖切断または２本鎖切断を誘導することにより、あるいは１つ以上のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ及び２つ以上のｇＲＮＡを用いてＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の中またはその付近で２つ以上の１本鎖切断または２本鎖切断を誘導することにより行われる。このアプローチは、ｇＲＮＡと、改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子を含むドナーＤＮＡ分子との開発及び最適化が必要となり得る。
例えば、ノックイン戦略は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写制御配列の上流もしくは当該配列内、またはセーフハーバー部位（例えばＡＡＶＳ１）内を標的とする１つのｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡ）または一対のｇＲＮＡを用いて、改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子またはｃＤＮＡをＢＣＬ１１Ａ遺伝子の座位にノックインすることを伴う。ドナーＤＮＡは１本鎖または２本鎖のＤＮＡであり、改変転写制御配列を含む野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子を含む。
上述の戦略（欠失／修飾／不活性化及びノックイン）の利点は、原則的な短期・長期両方における臨床及び実験室の有益作用を含めて類似している。
上に挙げた編集の選択肢に加えて、Ｃａｓ９または類似タンパク質は、エフェクタードメインを、編集用に特定することができる同じ標的部位に、またはエフェクタードメインの範囲内の追加の標的部位に標的化するのに使用することができる。一連のクロマチン改変酵素、メチラーゼまたはデメチラーゼは、標的遺伝子の発現の変更に使用することができる。このようなタイプのエピジェネティック調節は、とりわけ可能性のあるオフターゲット作用が限定されていることから、いくつかの利点を有する。
転写及び翻訳の調節は、細胞のタンパク質またはヌクレオチドと相互作用する複数の異なるクラスの部位を暗示する。しばしば、転写因子または他のタンパク質のＤＮＡ結合部位は、当該部位の役割を研究する目的での変異または欠失のために標的化され得るが、当該部位は遺伝子発現の変化のためにも標的化され得る。部位は、非相同末端結合ＮＨＥＪまたは相同組換え修復（ＨＤＲ）による直接的なゲノム編集を通じて付加することができる。ゲノムシークエンシング、ＲＮＡ発現、及び転写因子結合のゲノムワイド研究を多く用いることで、我々は、部位がどのように発生的または時間的な遺伝子調節をもたらすかをますます特定できるようになった。これらの制御システムは、直接的であることもあれば、複数のエンハンサーからの活性の統合が必要となり得る広範な調節を伴うこともある。典型的には、転写因子は長さ６〜１２ｂｐの縮重ＤＮＡ配列に結合する。個々の部位がもたらす低レベルの特異性は、複雑な相互作用及びルールが結合及び機能的結果に関与することを示唆する。縮重性の低い結合部位は、より簡略な調節手段を提供することができる。ゲノム内の類似配列が少なくオフターゲット切断の可能性が低い、より長い配列を特定するように人工転写因子を設計することができる。このようなタイプの結合部位はいずれも、遺伝子調節または発現の変化を可能にするように変異、欠失、または創出も行うことができる（Ｃａｎｖｅｒ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１５））。ＧＡＴＡ転写因子は、ＧＡＴＡ ＤＮＡ結合配列に結合する能力を特徴とする転写因子のファミリーである。ＧＡＴＡ結合配列は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の＋５８ ＤＮＡ高感受性部位（ＤＨＳ）内に位置する。このような特徴を有する別のクラスの遺伝子調節領域は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位である。ｍｉＲＮＡは非コードＲＮＡであり、転写後の遺伝子調節で主要な役割を担う。ｍｉＲＮＡは、全ての哺乳類のタンパク質コード遺伝子の３０％の発現を調節することができる。２本鎖ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）による特異的かつ強力な遺伝子サイレンシングが発見され、またさらなる低分子非コードＲＮＡも発見された（Ｃａｎｖｅｒ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１５））。遺伝子サイレンシングに重要な最も大きなクラスの非コードＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである。哺乳類において、ｍｉＲＮＡは最初に長いＲＮＡ転写物として転写されるが、これは別々の転写ユニット、タンパク質イントロンの一部、または他の転写物であり得る。この長い転写物は１次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）と呼ばれ、不完全な塩基対合のヘアピン構造を含む。このようなｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、ドローシャを伴う核内のタンパク質複合体であるマイクロプロセッサーによって１つ以上の短いｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）に切断され得る。
ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、２−ヌクレオチドの３’−オーバーハングを有する長さ約７０ヌクレオチドの短いステムループであり、成熟した１９〜２５ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊２本鎖に輸送される。塩基対合の安定性が低いｍｉＲＮＡ鎖（ガイド鎖）は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）にロードされる。パッセンジャーガイド鎖（＊で示す）は機能し得るが、通常は分解する。成熟ｍｉＲＮＡは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）中で主に見いだされる標的ｍＲＮＡ内の部分的に相補的な配列モチーフにＲＩＳＣを繋留し、転写後遺伝子サイレンシングを誘導する（Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．Ｃｅｌｌ １３６，２１５−２３３（２００９）；Ｓａｊ，Ａ．＆Ｌａｉ，Ｅ．Ｃ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ２１，５０４−５１０（２０１１））。ｍｉＲＮＡは、発生、分化、細胞周期、及び成長制御において、そして哺乳類及び他の多細胞生物における実質的に全ての生物学的経路において重要であり得る。また、ｍｉＲＮＡは、細胞周期制御、アポトーシス、及び幹細胞分化、造血、低酸素、筋肉発生、神経発生、インスリン分泌、コレステロール代謝、老化、ウイルス複製、及び免疫応答にも関与し得る。
１つのｍｉＲＮＡが何百もの異なるｍＲＮＡ転写物を標的とすることができる一方、個々の転写物は多数の異なるｍｉＲＮＡによって標的化され得る。最新のｍｉＲＢａｓｅ（ｖ．２１）では、２８６４５を超えるマイクロＲＮＡが注釈されている。一部のｍｉＲＮＡは複数の座位によってコードすることができ、そのうちの一部は直列的に共転写されたクラスターから発現され得る。当該機能は、複数の経路及びフィードバック制御を有する複雑な調節ネットワークを可能にする。ｍｉＲＮＡは、これらフィードバック及び調節の回路の一体部分と考えられ、またタンパク質生成を限度内に保つことにより遺伝子発現を調節する一助となり得る（Ｈｅｒｒａｎｚ，Ｈ．＆ Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｍ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２４，１３３９−１３４４（２０１０）；Ｐｏｓａｄａｓ，Ｄ．Ｍ． ＆ Ｃａｒｔｈｅｗ，Ｒ．Ｗ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ２７，１−６（２０１４））。
また、ｍｉＲＮＡは、異常なｍｉＲＮＡ発現に関連する多数のヒト疾患においても重要であり得る。この関連は、ｍｉＲＮＡ調節経路の重要性を強調するものである。最近のｍｉＲＮＡ欠失研究では、ｍｉＲＮＡが免疫応答の調節と結び付けられている（Ｓｔｅｒｎ−Ｇｉｎｏｓｓａｒ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１７，３７６−３８１（２００７））。また、ｍｉＲＮＡはがんとの強い結び付きがあり、異なるタイプのがんで役割を担っている可能性がある。ｍｉＲＮＡは、複数の腫瘍で下方調節されていることが見いだされている。ｍｉＲＮＡは、細胞周期制御及びＤＮＡ損傷応答などの主要ながん関連経路の調節において重要であり得るため、診断に使用することができ、臨床的に標的化することができる。マイクロＲＮＡは血管新生のバランスをきめ細やかに調節することができるため、全てのマイクロＲＮＡを枯渇させる実験は腫瘍の血管新生を抑制する（Ｃｈｅｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２８，１０５４−１０６７（２０１４））。
タンパク質コード遺伝子に関して示されたように、ｍｉＲＮＡ遺伝子は、がんと共に発生するエピジェネティックな変化に供することもできる。多くのｍｉＲＮＡ座位は、ＤＮＡメチル化によって調節の機会を増加させるＣｐＧアイランドと関連する可能性がある（Ｗｅｂｅｒ，Ｂ．，Ｓｔｒｅｓｅｍａｎｎ，Ｃ．，Ｂｒｕｅｃｋｎｅｒ，Ｂ．＆ Ｌｙｋｏ，Ｆ．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ６，１００１−１００５（２００７））。多くの研究で、エピジェネティック的にサイレンシングされたｍｉＲＮＡを明らかにするためにクロマチン再形成薬物を用いた処置が使用されてきた。
ＲＮＡサイレンシングにおける役割に加えて、ｍｉＲＮＡは翻訳を活性化することもできる（Ｐｏｓａｄａｓ，Ｄ．Ｍ．＆ Ｃａｒｔｈｅｗ，Ｒ．Ｗ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ２７，１−６（２０１４））。これらの部位のノックアウトが標的遺伝子の発現減少をもたらし得る一方で、これらの部位の導入は発現を増加させ得る。
個々のｍｉＲＮＡは、結合特異性にとって重要であり得るシード配列（マイクロＲＮＡの塩基２〜８）を変異させることにより、最も効果的にノックアウトすることができる。ＮＨＥＪによる誤修復の前に行われるこの領域内の切断は、標的部位への結合をブロックすることにより、効果的にｍｉＲＮＡ機能を消失させることができる。ｍｉＲＮＡは、パリンドローム配列に隣接する特別なループ領域の特異的標的化によっても阻害され得る。触媒不活性のＣａｓ９もｓｈＲＮＡ発現の阻害に使用することができる（Ｚｈａｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ４，３９４３（２０１４））。ｍｉＲＮＡの標的化に加えて、結合部位にも標的化及び変異を行ってｍｉＲＮＡによるサイレンシングを防止することもできる。
患者への細胞植え込み
一部の実施形態において、本開示におけるｅｘ ｖｉｖｏの方法の別のステップは、細胞を患者に植え込むことを含むことができる。この植え込みステップは、当技術分野で公知の任意の植え込み方法を用いて達成することができる。例えば、遺伝子改変細胞は、患者の血液に直接注射するか、または別の方法で患者に投与することができる。遺伝子改変細胞は、選択マーカーを用いてｅｘ ｖｉｖｏで精製することができる。
処置方法 − 自家幹細胞移植
一部の実施形態において、本開示の処置方法は、自家幹細胞移植手順を含む。「自己由来」という用語は、手順に使用されるドナー細胞が対象（患者）からのものであることを意味する。本明細書では、ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣを対象から取得し、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子編集を用いて改変し、同じ対象に投与する。概して、本明細書で提供される自家幹細胞移植手順は、幹細胞の動員をもたらす（幹細胞を刺激して骨髄腔から血流に移動させる）（少なくとも１つの）動員剤（例えば、プレリキサホル及び／またはＧ−ＣＳＦ）の投与（例えば、注射）と、アフェレーシスを用いた血液からの動員幹細胞の収集と、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子編集を用いた幹細胞の改変（例えば、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のイントロン２内の改変）と、対象への改変幹細胞の送達とを含む。
赤血球豊富化
プレ動員期間と呼ばれる期間中、対象（例えば、ＳＣＤを有する対象）は、一部の実施形態において、赤血球（ＲＢＣ）輸血を受けることができる。例えば、ＲＢＣ輸血は、動員の開始予定時の８（±２）週間前に開始することができ、対象がブスルファン前処置を開始するまで継続することができる。このようなＲＢＣ輸血の目標は、一部の実施形態において、総Ｈｂ濃度≦１１ｇ／ｄＬを保ちながらヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）レベル＜総Ｈｂの３０％を標的とすることである。したがって、一部の実施形態において、本開示の方法は、必要に応じて、幹細胞動員の前に、または処置中の任意の他の時点で、対象に赤血球を投与することを含む。
幹細胞動員
末梢血中には少数のＨＳＰＣが見られるに過ぎないため、造血細胞と骨髄間質細胞との相互作用を分断する様々な異なる薬剤を使用して、多数の幹・前駆細胞を迅速に循環中に動員することができる。このような薬剤の非限定的な例としては、サイトカイン（例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ））、がんの処置で使用されるいくつかの骨髄抑制薬物、及び造血細胞と骨髄間質細胞との相互作用を分断する他の化合物が挙げられる。一部の実施形態において、薬剤はプレリキサホル（ＭＯＺＯＢＩＬ（登録商標））である。
プレリキサホルは、ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体の阻害剤であり、その同族リガンドの間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１α）の結合をブロックする。ＳＤＦ−１α及びＣＸＣＲ４は、造血幹細胞（ＨＳＣ）の骨髄コンパートメントへの輸送及びホーミングを行う役割を果たすものと認識されている。プレリキサホル（注射用）（ＮＤＣ番号００２４−５８６２−０１）は、２０ｍｇ／ｍＬ溶液として使い捨てバイアルで提供される。各バイアルは、１．２ｍＬの体積を送達するように満たされ、必要に応じて塩酸及び水酸化ナトリウムでｐＨ６．０〜７．５に調整した注射用水に溶解した薬物２４ｍｇ及び塩化ナトリウム５．９ｍｇを含有する。プレリキサホルの推奨用量は０．２４ｍｇ／ｋｇ体重であり、皮下（ＳＣ）注射によって投与される。したがって、一部の実施形態において、プレリキサホルは、対象に０．２４ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与されるが、ただしそれより多くまたは少なく投与されてもよい。例えば、プレリキサホルは、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、または０．３５ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。一部の実施形態において、プレリキサホルは、０．２、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
一部の実施形態において、対象は、プレリキサホルのみを用いた幹細胞動員を受け、次いでアフェレーシスにより、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）が収集される。例えば、１日目に、対象は、アフェレーシス予定時の７（±２）時間前にプレリキサホルの投与を受ける。
一部の実施形態において、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（例えば、１０マイクログラム／ｋｇ）が、プレリキサホルの初回用量の前に投与される。例えば、Ｇ−ＣＳＦは、プレリキサホルの初回用量の前の４日間及びアフェレーシスの前の各日に１日１回投与することができる。Ｇ−ＣＳＦは、フィルグラスチム（ＺＡＲＸＩＯ（登録商標））またはレノグラスチム（ＧＲＡＮＯＣＹＴＥ（登録商標））と呼ばれることもある。対象は、ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣを収集するために、連続２日間または３日間のアフェレーシスを受ける場合がある。標的とするＣＤ３４＋細胞収集は、一部の実施形態において、薬物製品を製造するための最少標的用量３×１０６ ＣＤ３４＋細胞／ｋｇを達成するために、少なくとも１５×１０６ ＣＤ３４＋細胞／ｋｇである。一部の実施形態において、薬物製品で生着しない場合のレスキュー療法のためのバックアップとして、追加の細胞（例えば、追加の２×１０６ ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ）を収集してもよい。
１回目の動員及びアフェレーシスサイクルで、最少の薬物製品及び安全策バックアップの両方のための十分な細胞が得られない場合、または対象がアフェレーシスを完了することができない場合は、追加の細胞を収集するために追加の動員及びアフェレーシスサイクルを使用することができる。追加の動員サイクルは、例えば、先の動員サイクルの初日から１４日以後、一部の実施形態においては、先のサイクルの終了から６０日後までに開始することができる。
幹細胞の回収
動員が最適レベルに到達すると、幹細胞が、主にアフェレーシスによって収集される。アフェレーシス開始のための確立された閾値は様々であり得るが、典型的には５〜２０（例えば、５、１０、１５、または２０）ＣＤ３４＋細胞／ミリリットルとすることができる。末梢血ＣＤ３４＋数は、動員の有効性を推定するのに有用であるが、可変であり得る。一部の実施形態において、少なくとも１５×１０６ ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ／ｋｇが、例えばアフェレーシスによって収集される。一部の実施形態において、１×１０６〜１×１０８ ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ／ｋｇが収集される。
骨髄破壊的前処置
骨髄破壊的化学療法は、骨髄を再建するために、通常、骨髄または幹細胞の移植の前に行われる。
薬物製品の製造中及び骨髄破壊的（例えば、ブスルファン）前処置の開始予定時前に、一部の実施形態において、対象（例えば、ＳＣＤを有する対象）に対し、総Ｈｂ濃度≦１１ｇ／ｄＬを保ちながらＨｂＳレベル＜総Ｈｂの３０％を維持することを目標に、ＲＢＣ単純輸血またはＲＢＣ交換輸血の投与を継続する。骨髄破壊的前処置の開始予定時が動員の完了から４ヵ月後より先になる場合は、ＲＢＣ輸血レジメンを中止することができ、また以前ヒドロキシウレア（ＨＵ）を用いて処置していた対象のためにＨＵ処置を再開することができる。ＲＢＣ輸血レジメンを中断する場合、一部の実施形態において、対象は、骨髄破壊的前処置の開始予定時の８（±２）週間前に、例えば、総Ｈｂ濃度≦１１ｇ／ｄＬを保ちながらＨｂＳレベル＜総Ｈｂの３０％を維持することを目標に、ＲＢＣ輸血（単純または交換）を開始することができる。一部の実施形態において、骨髄破壊的前処置の開始予定時前の７（±３）日以内にＨｂＳレベル＞総Ｈｂの３０％である場合、骨髄破壊的前処置の開始前に、ＨｂＳレベル＜３０％を確実にすることを目標に、対象に１回の交換輸血を投与することができる。
一部の実施形態において、骨髄破壊的前処置は、ブスルファン（ＢＵＳＵＬＦＥＸ（登録商標）、ＭＹＬＥＲＡＮ（登録商標））の投与を含む。ブスルファンは、アルキル化剤として分類される抗がん（抗新生物性または細胞毒性）化学療法薬物であり、自家幹細胞移植の前に行う前処置レジメンでしばしば使用される。ブスルファンの開始用量は、一部の実施形態において、４５００〜５５００μＭ／分、例えば、４０００μＭ／分の曲線下面積（ＡＵＣ）を標的とする１日３．２ｍｇ／ｋｇである。他の用量を使用してもよい。例えば、ブスルファンの用量は、２、２．５、３、３．５、または４ｍｇ／ｋｇとすることができる。一部の実施形態において、ブスルファンの用量は、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、または３．５ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態において、ブスルファンは、例えば、１日１回連続４日間、静脈内（ＩＶ）に投与される。他の実施形態において、ブスルファンは、０．８ｍｇ／ｋｇとして６時間ごとに（ｑ６ｈ）連続４日間投与することができる。他の投与レジメンを使用してもよい。一部の実施形態において、用量は、薬物動態レベルに基づき、４５００〜５５００μＭ／分の曲線下面積（ＡＵＣ）を達成するように調整される。一部の実施形態において、用量は、薬物動態レベルに基づき、５０００μＭ／分のＡＵＣを達成するように調整される。
医薬的に許容される担体
本明細書で企図されている、前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ）を対象に投与するｅｘ ｖｉｖｏの方法は、前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ）を含む治療組成物の使用を伴い得る。
治療組成物は、細胞組成物と一緒に生理的に認容性の担体と、任意選択で、本明細書に記載の少なくとも１つの追加の生物活性剤とを、活性成分として組成物中に溶解または分散した状態で含有することができる。一部の場合において、治療組成物は、所望されていない限り、治療目的で哺乳類またはヒト患者に投与された際に実質的に免疫原性ではない。
概して、本明細書に記載の前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ）は、医薬的に許容される担体を有する懸濁液として投与することができる。当業者であれば、細胞組成物で使用される医薬的に許容される担体は、対象に送達される細胞の生存率に実質的に干渉する量の緩衝液、化合物、凍結保存剤、保存料、または他の薬剤を含まないことを認識することになる。細胞を含む製剤は、例えば、細胞膜の統合性を維持できるようにする浸透圧緩衝液と、任意選択で、細胞生存率を維持するまたは投与時に移植を向上させる栄養素とを含むことができる。このような製剤及び懸濁液は、当業者に公知であり、及び／または、本明細書に記載のように、通常の実験を用いて前駆細胞との使用に適応させることができる。
また、細胞組成物は、乳化手順が細胞生存率に悪影響を及ぼさないことを条件に、乳化させることもリポソーム組成物として提示することもできる。細胞及び他の任意の活性成分は、医薬的に許容され活性成分に適合性である賦形剤と、本明細書に記載の治療方法での使用に適した量で、混合することができる。
細胞組成物に含まれる追加の薬剤は、中の構成要素の医薬的に許容される塩を含むことができる。医薬的に許容される塩としては、例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で形成された（ポリペプチドの遊離アミノ基で形成された）酸付加塩が挙げられる。また、遊離カルボキシル基で形成された塩は、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄など）、及び有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど）に由来してもよい。
生理的に認容性の担体は当技術分野において周知である。例示的な液体担体は、活性成分及び水の他に材料を含有しない無菌水性溶液、または生理的ｐＨ値のリン酸ナトリウムなどの緩衝液、生理食塩水、またはその両方（例えば、リン酸緩衝食塩水）を含有する無菌水性溶液である。またさらに、水性担体は２つ以上の緩衝塩、さらに塩化ナトリウム及び塩化カリウムなどの塩、ブドウ糖、ポリエチレングリコール、ならびに他の溶質を含有することができる。また液体組成物は、水に加えて及び水以外に、液相も含有することができる。このような追加の液相の例示としては、グリセリン、綿実油などの植物油、及び水−油エマルジョンがある。特定の障害または状態の処置において有効な細胞組成物で使用する活性化合物の量は、その障害または状態の性質に依存する可能性があり、標準的な臨床技法によって決定され得る。
投与及び有効性
「投与する」「導入する」及び「移植する」という用語は、細胞（例えば、ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣなどの前駆細胞）を対象に配置する文脈で互換的に使用され、所望の効果（複数可）を生じさせるために、所望部位（例えば、損傷または修復の部位）で導入細胞の少なくとも部分的な局在化がもたらされるような方法または経路が用いられる。細胞（例えば、ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣなどの前駆細胞またはその分化した後代）は、植え込まれる細胞または細胞の構成要素の少なくとも一部が生存できる対象内の所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与することができる。対象への投与後における細胞の生存期間は、数時間という短期間であることもあれば、例えば、２４時間から数日、さらに数年という長期間であることもあれば、さらに患者の生涯にわたる、すなわち長期移植であることもある。例えば、本明細書に記載の一部の態様において、有効量の筋原性前駆細胞は、全身の投与経路、例えば腹腔内または静脈内経路を介して投与される。
「個体」「対象」「宿主」及び「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、診断、処置または治療が所望される任意の対象を指す。一部の態様において、対象は哺乳類である。一部の態様において、対象はヒトである。
予防的に提供される場合、本明細書に記載の前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ）は、ヘモグロビン異常症のいずれかの症状の前に、例えば、疲労、息切れ、黄疸、成長の遅れ、思春期の遅発、関節、骨、及び胸部の痛み、脾臓及び肝臓の肥大が発生する前に、対象に投与することができる。したがって、造血前駆細胞集団の予防的投与は、Ｂ−サラセミアまたは鎌状赤血球症などのヘモグロビン異常症の予防に役立つ。
治療的に提供される場合、造血前駆細胞は、ヘモグロビン異常症の症状または徴候の発生時（またはその後）に、例えば、疾患の発症後すぐに提供される。
本明細書に記載の方法に従って投与される造血前駆細胞集団は、１名以上のドナーから得られた同種の造血前駆細胞を含むことができる。「同種」とは、１体以上の同じ種のドナーから得られ、１つ以上の座位における遺伝子が同一ではない造血前駆細胞または造血前駆細胞を含む生物学的試料を指す。例えば、対象に投与される造血前駆細胞集団は、１名以上の非血縁のドナー対象、または１名以上の同一でない同胞に由来してもよい。一部の場合において、同系の造血前駆細胞集団、例えば遺伝子的に同一の動物または同一の双生子から得られた造血前駆細胞集団を使用することができる。造血前駆細胞は自家細胞とすることができる。すなわち、造血前駆細胞は、対象から得られまたは単離されて同じ対象に投与され、すなわち、ドナーとレシピエントが同じである。
「有効量」という用語は、ヘモグロビン異常症における少なくとも１つ以上の徴候または症状の予防または軽減に必要な前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ）またはその後代の集団の量を指し、例えばヘモグロビン異常症を有する対象を処置するために、所望の効果の提供に十分な量の組成物に関連する。そのため、「治療有効量」という用語は、典型的な対象、例えばヘモグロビン異常症を有するまたはその危険性がある対象に投与した際に特定の効果を促進するのに十分である、前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ）または前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ）を含む組成物の量を指す。また、有効量は、疾患の症状発生の予防または遅延、疾患の症状の経過の変更（例えば、以下に限定されないが、疾患の症状の進行を遅らせること）、または疾患の症状の反転に十分な量も含むと考えられる。任意の所与の場合について、適切な「有効量」は、当業者により、通常の実験を用いて決定され得ると理解されている。
本明細書に記載の様々な態様での使用において、有効量の前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ）は、少なくとも１０２個の前駆細胞、少なくとも５×１０２個の前駆細胞、少なくとも １０３個の前駆細胞、少なくとも５×１０３個の前駆細胞、少なくとも１０４個の前駆細胞、少なくとも５×１０４個の前駆細胞、少なくとも１０５個の前駆細胞、少なくとも２×１０５個の前駆細胞、少なくとも３×１０５個の前駆細胞、少なくとも４×１０５個の前駆細胞、少なくとも５×１０５個の前駆細胞、少なくとも６×１０５個の前駆細胞、少なくとも７×１０５個の前駆細胞、少なくとも８×１０５個の前駆細胞、少なくとも９×１０５個の前駆細胞、少なくとも１×１０６個の前駆細胞、少なくとも２×１０６個の前駆細胞、少なくとも３×１０６個の前駆細胞、少なくとも４×１０６個の前駆細胞、少なくとも５×１０６個の前駆細胞、少なくとも６×１０６個の前駆細胞、少なくとも７×１０６個の前駆細胞、少なくとも８×１０６個の前駆細胞、少なくとも９×１０６個の前駆細胞、またはその倍数を含む。前駆細胞は、１名以上のドナーに由来してもよく、自家供給源から得てもよい。本明細書に記載の一部の例において、前駆細胞は、培養液中で増やしてからそれを必要とする対象に投与することができる。
「投与される」とは、前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ）組成物が、所望の部位で少なくとも部分的な当該細胞組成物の局在化をもたらす方法または経路によって、対象に送達されることを指す。細胞組成物は、対象内で有効な処置をもたらす任意の経路によって投与することができる。すなわち、投与により、対象内の所望の位置への送達がもたらされ、送達される組成物の少なくとも一部、すなわち、少なくとも１×１０４細胞が、所望の部位にある期間の間送達される。投与様式には、注射、注入、点滴、または摂取が含まれる。「注射」には、以下に限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、心室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、及び胸骨内の注射及び注入が含まれる。一部の例において、経路は静脈内である。細胞の送達に関しては、注射または点滴による投与を行うことができる。
細胞は全身的に投与することができる。「全身投与」「全身的に投与される」「末梢投与」及び「末梢的に投与される」という表現は、標的部位、組織、臓器に直接ではない形で前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ）の集団を投与することを指し、当該投与の結果、前駆細胞集団は、対象の循環系に侵入することにより、代謝及び他の類似プロセスに供される。
ヘモグロビン異常症の処置用の組成物を含む処置の有効性は、熟練した臨床医によって決定され得る。ただし、一例として、機能的ＢＣＬ１１Ａ及び機能的ＨｂＦのレベルのいずれか１つまたは全ての徴候または症状が有益な方法で変更された場合（例えば、ＢＣＬ１１Ａが少なくとも１０％低下し、及び／またはＨｂＦが少なくとも１０％増加した場合）、または疾患における他の臨床的に容認された症状またはマーカーが改善または緩和した場合、処置は「有効な処置」とみなされる。また、有効性は、個体が入院施設で評価された通りに悪化しないことや医療介入を必要としない（例えば、疾患の進行が停止している、または少なくとも遅くなっている）ことによっても測定され得る。これらの指標の測定方法は当業者に公知であり、及び／または本明細書に記載されている。処置には、個体または動物（一部の非限定的な例としては、ヒトまたは哺乳類が挙げられる）における任意の疾患処置が含まれ、以下のものが挙げられる：（１）疾患の抑制、例えば、疾患の進行の抑止もしくは緩徐化、または（２）疾患の軽減、例えば、疾患の後退をもたらすこと、及び（３）症状が発生する可能性の予防または低減。
本開示による処置は、個体における機能的ＢＣＬ１１Ａの量を低下させ、及び／または機能的ＨｂＦの量を増加させることによって、ヘモグロビン異常症に関連する１つ以上の症状を緩和することができる。典型的にヘモグロビン異常症に関連する早期の徴候としては、例えば、疲労、息切れ、黄疸、成長の遅れ、思春期の遅発、関節、骨、及び胸部の痛み、脾臓及び肝臓の肥大が挙げられる。
本明細書において、疾患または障害に対する「処置する」、「処置すること」、または「処置」とは、以下のうちの１つ以上を遂行することを意味する：（ａ）処置対象となる障害の重症度及び／または持続期間を低減すること；（ｂ）処置対象となる障害（複数可）に特徴的な症状の発生を限定または予防すること；（ｃ）処置対象となる障害（複数可）に特徴的な症状の悪化を抑制すること；（ｄ）障害（複数可）を過去に有した患者における障害（複数可）の再発を限定または予防すること；ならびに（ｅ）過去に障害（複数可）の症状を示した患者における症状の再発を限定または予防すること。
本明細書において「単位剤形」とは、ヒト対象のための単位薬用量として好適な、物理的に別々の単位を指し、各単位は、必要とされる医薬的な希釈剤、担体、またはビヒクルと共に所望の治療効果をもたらすように算出された所定量の活性材料を含有する。本発明の新規の単位剤形の仕様は、（ａ）活性材料に特有の特徴及び達成されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）本明細書で開示されているような動物またはヒトにおける治療使用向けの活性材料を配合する技術分野に固有の限界によって規定され、またそれに直接依存するものであり、これらが本発明の特色である。本発明に従う好適な単位剤形の例としては、バイアル、錠剤、カプセル、トローチ、坐薬、粉末パケット、オブラート、カシェ剤、アンプル、前述のいずれかを複数に分離したもの、本明細書に記載のまたは当技術分野で広く知られている他の形態がある。遺伝子編集細胞の１つ以上のこのような単位剤形が本発明の製造品に含まれ得る。
薬物製品の薬用量及び投与経路
様々な適応症に対する自家移植は、典型的には、生着をサポートするために少なくとも２〜２．５×１０６ ＣＤ３４＋細胞／ｋｇを使用する。ＳＣＤ試験における全ての対象の生着を確実に行うため、自家移植向けの典型的な最少用量よりも２０％〜５０％高い保存的最少用量３×１０６改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ／ｋｇが使用され得る。理論に束縛されるものではないが、骨髄破壊後のより多数のＣＤ３４＋幹細胞の注入は、より迅速な生着、耐久性、及び処置の効果に結び付く。一部の実施形態において、より低い用量もより高い用量も使用され得る。例えば、対象に、２×１０６、２．５×１０６、３×１０６、３．５×１０６、４×１０６、４．５×１０６、５×１０６、５．５×１０６、６×１０６、６．５×１０６、７×１０６、７．５×１０６、８×１０６、８．５×１０６、９×１０６、９．５×１０６、１×１０７、１．５×１０７、２×１０７改変ＣＤ３４＋ｈＨＳＰＣ／ｋｇが投与され得る。一部の実施形態において、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、または１×１０８改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ／ｋｇが投与され得る。
一部の実施形態において、薬物製品の単回用量は、ブスルファンの最終用量から４８時間以上（例えば、４８、５４、６０、６６、または７２時間以上）後でかつ７日以内（例えば、１、２、３、４、５、６、または７日以内）に投与される。一部の実施形態において、薬物製品の全用量は、解凍からおよそ２０分以内に注入される。
一部の実施形態において、１日目に中心静脈カテーテルを介して対象に薬物製品を投与する。他の投与経路（例えば、静脈内経路）を使用してもよい。
一部の実施形態において、好中球（及び／または血小板）の生着は、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与後４２日以内に対象内で発生する。概して、生着とは、移植中に受け取った収集幹細胞が成長し新たな血球を作り始めるプロセスである。好中球の生着は、一部の実施形態において、好中球数（好中球の絶対数）が５００細胞／ｍｍ３（０．５×１０９／Ｌ）以上である連続した３日のうちの最初の日として定義される。血小板の生着は、一部の実施形態において、血小板輸血による支持なしの２０，０００／ｍｍ３（２０×１０９／Ｌ）として定義される。一部の実施形態において、好中球（及び／または血小板）の生着は、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与後２０、２５、３０、３５、または４０日以内に対象内で発生する。一部の実施形態において、好中球（及び／または血小板）の生着は、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与から４０日より後に対象内で発生する。
一部の実施形態において、β−サラセミアを有する対象について、薬物製品の注入後、輸血回数におけるベースラインからの低減が認められる。一部の実施形態において、ベースラインとの対比で、輸血回数の低減が認められる。例えば、一部の実施形態において、β−サラセミアを有する対象において、ベースラインとの対比で２倍の輸血回数の低減が認められる。一部の実施形態において、β−サラセミアを有する対象において、ベースラインとの対比で２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、または５倍の輸血回数の低減が認められる。一部の実施形態において、β−サラセミアを有する対象において、ベースラインとの対比で２倍〜５倍、３倍〜５倍、または４倍〜５倍の輸血回数の低減が認められる。一部の実施形態において、輸血回数の低減は、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与（処置）時、投与の３ヵ月以後、または投与の６ヵ月以後（または６ヵ月後）を起点に計算される。一部の実施形態において、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与時期、投与の３ヵ月後、または投与の６ヵ月後を起点に、少なくとも６ヵ月間（例えば、少なくとも６ヵ月間、少なくとも１２ヵ月間、少なくとも１８ヵ月間、または少なくとも２４ヵ月間）の輸血回数の低減が認められる。
一部の実施形態において、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与時期、投与から３ヵ月以後、投与から６ヵ月以後、または投与から９ヵ月以後を起点に、少なくとも６ヵ月間、少なくとも１２ヵ月間、少なくとも１８ヵ月間、または少なくとも２４ヵ月間の、輸血非依存を達成する（定期的な疾患関連の輸血を投与しない）β−サラセミアを有する対象の数におけるベースラインからの変化が認められる。β−サラセミアを有する対象は、１回以上の輸血（複数可）が、例えば、手術または出血過剰に関する輸血のように、ヘモグロビン異常症の処置と無関係のある特定の臨床設定で必要とされる場合であっても、輸血非依存を達成したものとみなされ得ることを理解されたい。
ベースライン値は、スクリーニング中及び動員を開始する前に収集された、（予定されたまたは予定外の）最も最近の欠測でない測定値である。
β−サラセミアを有する対象における輸血事象の回数について、処置前のベースラインは、組入れ前の２年間における輸血回数として定義される。ベースラインは、処置の前の２年間における全ての輸血事象の記録を用いて計算することができる。ベースラインからの変化（絶対的変化）は、ベースライン後の値−ベースライン値として計算することができる。ベースラインからの相対的変化は、１００％×（ベースライン後の値−ベースライン値）／ベースライン値として計算し、パーセンテージで表すことができる。
一部の実施形態において、ＳＣＤを有する対象のＨｂＦレベルは、ヒドロキシウレア（ＨＵ）を用いた処置の不在下で、少なくとも２０％である。一部の実施形態において、ＳＣＤを有する対象のＨｂＦレベルは、ＨＵを用いた処置の不在下で、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％である。一部の実施形態において、ＳＣＤを有する対象のＨｂＦレベルは、ヒドロキシウレア（ＨＵ）の不在下で、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与時期を起点に少なくとも３ヵ月間、少なくとも２０％である。一部の実施形態において、ＳＣＤを有する対象のＨｂＦレベルは、ＨＵの不在下で、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与時期を起点に少なくとも３ヵ月間、少なくとも４ヵ月間、少なくとも５ヵ月間、または少なくとも６ヵ月間、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％である。一部の実施形態において、ＳＣＤを有する対象のＨｂＦレベルは、ＨＵの不在下で、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与の３ヵ月後を起点に少なくとも３ヵ月間、少なくとも２０％である。一部の実施形態において、ＳＣＤを有する対象のＨｂＦレベルは、ＨＵの不在下で、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与の３ヵ月後を起点に少なくとも３ヵ月間、少なくとも４ヵ月間、少なくとも５ヵ月間、または少なくとも６ヵ月間、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％である。一部の実施形態において、ＳＣＤを有する対象のＨｂＦレベルは、ＨＵの不在下で、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与の６ヵ月後を起点に少なくとも３ヵ月間、少なくとも２０％である。一部の実施形態において、ＳＣＤを有する対象のＨｂＦレベルは、ＨＵの不在下で、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与の６ヵ月後を起点に少なくとも３ヵ月間、少なくとも４ヵ月間、少なくとも５ヵ月間、または少なくとも６ヵ月間、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％である。
一部の実施形態において、ＳＣＤを有する対象について、重症血管閉塞発作（ＶＯＣ）の年率におけるベースラインからの相対的変化が認められる。一部の実施形態において、ＳＣＤを有する対象について、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与の６ヵ月後を起点に少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％の、重症ＶＯＣの年率におけるベースラインからの低減が認められる。一部の実施形態において、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与の６ヵ月後を起点に少なくとも１２ヵ月間（例えば、少なくとも１８ヵ月間または少なくとも２４ヵ月間）のＶＯＣの不在が認められる。
一部の実施形態において、ＳＣＤを有する対象について、改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与の６ヵ月後を起点に、重症ＶＯＣの年率の入院期間におけるベースラインからの変化が認められる。
ベースライン値は、スクリーニング中及び動員を開始する前に収集された、（予定されたまたは予定外の）最も最近の欠測でない測定値である。重症ＶＯＣ事象の回数について、処置前のベースラインは、組入れ前の２年間における年当たりの平均重症ＶＯＣ事象回数として定義される。ベースラインは、処置の前の２年間における全ての重症ＶＯＣ事象の記録を用いて計算することができる。ベースラインからの変化（絶対的変化）は、ベースライン後の値−ベースライン値として計算することができる。ベースラインからの相対的変化は、１００％×（ベースライン後の値−ベースライン値）／ベースライン値として計算し、パーセンテージで表すことができる。
一部の実施形態において、対象において、以下から選択されるアッセイ：疼痛スケール（１１ポイントの数値評価スケール［ＮＲＳ］）、ＥｕｒｏＱｏｌクオリティーオブライフスケール（ＥＱ ５Ｄ ５Ｌ）、がん治療−骨髄移植の機能評価（ＦＡＣＴ−ＢＭＴ）、患者報告アウトカム測定情報システム（ＰＲＯＭＩＳ）−疲労、ＰＲＯＭＩＳ−認知機能、及び成人鎌状赤血球クオリティーオブライフ測定システム（ＡＳＣＱ−Ｍｅ）のうちの少なくとも１つを用いて、患者報告アウトカム（ＰＲＯ）の経時的な変化が認められる。疼痛スケール（１１点のＮＲＳ）：数値評価スケールは、成人における痛みの強さを報告する１次元尺度である。
１１点のＮＲＳは、０〜１０の数字を含む区切られた視覚アナログスケール（ＶＡＳ）であり、「０」は痛みなしに相当し、「１０」は考えられる中で最悪の痛みに相当する。各回答者は、自分の痛みの強さを反映するスケール上の整数を選択する。ＮＲＳのスコアは０〜１０点を範囲とし、高い値ほど高いレベルの痛みを示す。
ＥＱ−５Ｄ−５Ｌ：ＥＱ−５Ｄ−５Ｌ質問紙法は、標準化された方法で対象の健康状態を評価するものであり、ＥＱ−５Ｄ記述システム及びＥＱ ＶＡＳの２つの部分からなる。ＥＱ−５Ｄ−５Ｌ記述システムは、同じ５つの次元（移動、セルフケア、普段の活動、痛み／不快、及び不安／抑うつ）を含む。各次元は、５つのレベル（問題はない、少し問題がある、中程度の問題がある、かなり問題がある、非常に問題がある）を有する。回答者は、５次元の各々における最も適切な記述に対しボックスにチェック印を付ける（または×印を付ける）ことで自分の健康状態を示すように求められる。この決定により、その次元で選択したレベルを表す１桁の番号が得られる。５つの次元の桁を合わせて、対象の健康状態を説明する５桁の番号にすることができる。
ＥＱ ＶＡＳは、対象が自己評価する健康状態を、両端が「想像可能な最高の健康状態」及び「想像可能な最悪の健康状態」と示されている１００点のＶＡＳに記録する。この情報は、個別の回答者によって判断された健康の定量的尺度として使用することができる。
ＦＡＣＴ−ＢＭＴ：ＦＡＣＴ−ＢＭＴ質問紙法は、身体面、社会面、家族面、感情面、及び機能面の健康を含む、検証済みの自己報告質問紙法である。ＦＡＣＴ−ＢＭＴは、ＦＡＣＴ−一般（全てのサブスケールの中核を構成する）と、骨髄移植の処置特異的な関心事項とからなる。
ＦＡＣＴ−ＢＭＴの各記述は、０〜４を範囲とする５点のリッカートタイプ回答尺度（０＝「全く当てはまらない」；１＝「わずかに当てはまる」；２＝「多少当てはまる」；３＝「かなり当てはまる」；及び４＝「非常によく当てはまる」）を有する。対象は、記述に対し過去７日間に当てはまる自分の回答を示すために行ごとに１つの番号に丸または印を付けるように求められる。次いで質問紙はスコア化され、スコアが高いほどＱＯＬが良好となる。この情報を使用して、対象のニーズを特定する全人的アセスメントを提供することができる。これは、標準的な臨床コンサルテーションでは明らかにならない可能性のあるものである。
ＰＲＯＭＩＳ−疲労及びＰＲＯＭＩＳ−認知機能：ＰＲＯＭＩＳ項目バンクは、３００項目を超える疾患関連ＰＲＯを含む。ＰＲＯＭＩＳ−疲労７ａは、７項目を含み、自己報告による症状、例えば、疲労や極端な消耗の感覚、ならびにこれらの症状が日常活動及び正常な機能に及ぼす影響を評価する。ＰＲＯＭＩＳ−認知機能８ａは、思考、集中などの能力に関係する８項目を含む。いずれの尺度も、７日の想起期間（「過去７日間」）を有する。各質問は、５つのレベル（全くない、ほとんどない、時々ある、よくある、ほとんど常にある）を有する。ＰＲＯＭＩＳ尺度は、基準集団の平均を５０、ＳＤを１０とするＴスコアメトリックを用いてスコア化される。スコアは、スコア化の方向や、報告スコアと基準集団の平均５０（ＳＤ１０）との間の差を考慮することによって解釈することができる。
ＡＳＣＱ−Ｍｅ：ＡＳＣＱ−Ｍｅは、疾患の重症度に関する情報と共に、身体面、精神面、及び社会面の健康状態を評価する尺度から構成される。ＡＳＣＱ−Ｍｅは以下のドメインを含む：感情面の影響、疼痛の影響、疼痛のエピソード、睡眠の影響、社会的機能の影響、硬直の影響、及びＳＣＤ病歴チェックリスト。ほとんどの次元は５つのレベル（全くない、めったにない、時々ある、よくある、いつもある、または全く当てはまらない、わずかに当てはまる、多少当てはまる、かなり当てはまる、非常に当てはまる）を有する。ＳＣＤ病歴チェックリストに関する質問は、はい／いいえの選択肢によって示され、疼痛エピソードの頻度及び重症度は、事象の頻度によって示される。ＡＳＣＱ−Ｍｅドメインは、基準集団の平均を５０、ＳＤを１０とするＴスコアメトリックを用いてスコア化される。スコアは、スコア化の方向や、報告スコアと基準集団の平均５０（ＳＤ１０）との間の差を考慮することによって解釈することができる。
一部の実施形態において、対象において、以下の４つの溶血マーカー：網状赤血球数、アスパラギン酸トランスアミナーゼの血清中濃度、乳酸デヒドロゲナーゼ［ＬＤＨ］、及び総ビリルビンの主成分分析による測定において、溶血指数の経時的な変化が認められる。
肺高血圧（ＰＨＴＮ）は、潜在的に生命を脅かす合併症であり、三尖弁逆流速度（ＴＲＶ）上昇の心エコーエビデンスによって検出される。この状態は、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）及び他の溶血性障害を有する成人において説明されているが、小児患者ではこの状態の発生に関する情報がほとんど存在しない。一部の実施形態において、対象において、三尖弁逆流ジェット速度（ＴＲＶ）の経時的な変化（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、または少なくとも３０％の低減）が認められる。
一部の実施形態において、対象において、胎児ヘモグロビンを発現する循環赤血球（Ｆ細胞）の割合の経時的な増加が認められる。一部の実施形態において、対象において、胎児ヘモグロビンを発現する循環赤血球（Ｆ細胞）の割合の少なくとも１０％（例えば、少なくとも２０％または少なくとも３０％）の経時的な増加が認められる。
一部の実施形態において、対象において、炎症及び内皮活性化マーカーの経時的な変化（例えば、低減）が認められる。一部の実施形態において、対象において、炎症及び内皮活性化マーカーの少なくとも１０％、少なくとも２０％、または少なくとも３０％の経時的な低減が認められる。
一部の実施形態において、対象において、末梢血白血球中に存在する遺伝子改変を有するアレルの割合の経時的な変化（例えば、増加）が認められる。一部の実施形態において、対象において、末梢血白血球中に存在する遺伝子改変を有するアレルの割合の少なくとも１０％（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％）の経時的な増加が認められる。
一部の実施形態において、対象において、骨髄中に存在する遺伝子改変を有するアレルの割合の経時的な変化（例えば、増加）が認められる。一部の実施形態において、対象において、末梢血白血球中に存在する遺伝子改変を有するアレルの割合の少なくとも１０％（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％）の経時的な増加が認められる。
上記エンドポイントが測定される期間は、３ヵ月〜５年またはそれ以上を範囲とすることができる。例えば、「経時的」とは、３ヵ月、６ヵ月、９ヵ月、１２ヵ月、１８ヵ月、２４ヵ月、３０ヵ月、３６ヵ月、４２ヵ月、４８ヵ月、５４ヵ月、または６０ヵ月を含むことができる。
キット
本開示は、本明細書に記載の方法を実施するためのキットを提供する。キットは、ゲノム標的化核酸、ゲノム標的化核酸をコードするポリヌクレオチド、部位特異的ポリペプチド、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び／または本明細書に記載の方法の諸態様を実施するために必要な任意の核酸もしくはタンパク質性分子、またはこれらの任意の組合せのうちの１つ以上を含むことができる。
キットは、（１）ゲノム標的化核酸をコードするヌクレオチド配列を含むベクターと、（２）部位特異的ポリペプチドまたは部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターと、（３）ベクター（複数可）及びまたはポリペプチドを再構成及び／または希釈するための試薬と、を含むことができる。
キットは、（１）（ｉ）ゲノム標的化核酸をコードするヌクレオチド配列及び（ｉｉ）部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターと、（２）ベクターを再構成及び／または希釈するための試薬と、を含むことができる。
上記キットのいずれかにおいて、キットは単一分子ガイドゲノム標的化核酸（例えば、配列番号１または２）を含むことができる。上記キットのいずれかにおいて、キットは二重分子ゲノム標的化核酸を含むことができる。上記キットのいずれかにおいて、キットは２つ以上の二重分子ガイドまたは単一分子ガイドを含むことができる。キットは、核酸標的化核酸をコードするベクターを含むことができる。
上記キットのいずれかにおいて、キットはさらに、所望の遺伝子改変をもたらすために挿入されるポリヌクレオチドを含むことができる。
キットの構成要素は、別々の容器に入っていても単一の容器に一緒に入っていてもよい。
上述の任意のキットはさらに、１つ以上の追加の試薬を含むことができ、このような追加の試薬は、緩衝液、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを細胞に導入するための緩衝液、洗浄緩衝液、対照試薬、対照ベクター、対照ＲＮＡポリヌクレオチド、ＤＮＡからポリペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏ生成するための試薬、シークエンシング用のＤＮＡアダプターなどから選択される。緩衝液は、安定化緩衝液、再構成緩衝液、希釈緩衝液などであり得る。また、キットは、オンターゲット結合もしくはエンドヌクレアーゼによるＤＮＡの切断を容易にするもしくは向上させるために、または標的化の特異性を改善するために使用され得る、１つ以上の構成要素も含むことができる。
上述の構成要素に加えて、キットはさらに、当該方法の実施のためにキットの構成要素を使用するための説明書をさらに含むことができる。当該方法を実施する説明書は、好適な記録媒体に記録することができる。例えば、説明書は、紙またはプラスチックなどの基材に印刷することができる。説明書は、添付文書としてキット内、キットまたはその構成要素の容器のラベル内（すなわち、パッケージまたはサブパッケージに関連して）などに存在してもよい。説明書は、好適なコンピューター可読記憶媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブなど）上に存在する電子記憶データファイルとして存在してもよい。一部の場合において、実際の説明書はキット内に存在するのではなく、（例えば、インターネット経由で）リモートソースから説明書を得る手段が提供されてもよい。この場合の一例としては、説明書を見ることができる、及び／またはダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットがある。説明書と同様に、説明書を得るこの手段が好適な基材に記録されていてもよい。
実施例１．非臨床試験
以下の有効性及び毒性の非臨床試験を行った。
簡潔に述べると、薬物製品（ＣＴＸ００１）を調べる前臨床試験では、健康ドナーのＣＤ３４＋細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子赤血球エンハンサーにおけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子編集は、γ−グロビンｍＲＮＡ（０．３０の平均γ／α−グロビン比（標準偏差［ＳＤ］±０．２０）及び０．４１のγ／（γ＋β）−グロビン比（ＳＤ±０．１５））ならびにＨｂＦ（３２％のＨｂＦ／（ＨｂＦ＋ＨｂＡ）タンパク質レベルの平均パーセンテージ（ＳＤ±９％））の増加をもたらした。平均アレル編集頻度は８０％（ＳＤ±４％）であり、長期造血幹細胞（ＬＴ−ＨＳＣ）を含めたＣＤ３４＋細胞のサブ集団全体にわたって均一であった。編集の大部分は両アレルであった。
マウスの異種移植試験では、移植後１６週時に薬物製品または対照（ＥＧＦＰ）編集ＣＤ３４＋ｈＨＳＰＣを注入したＮＯＣ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウス間において、生着キメラ化の差は認められなかった（図１）。１６週時における骨髄試料中に存在する編集アレルの平均頻度は９１％（ＳＤ±１５％）であった。さらに、生着細胞は、その多系統分化能を維持することができた（図１）。
薬物製品に関連する最も適切な潜在的リスクにさらに対処するため、薬物製品の安全性を評価する前臨床試験も実施した。薬物製品の非臨床的な遺伝子毒性及び毒性学評価では、複数の十分に確立された方法を用いて、オンターゲット及び潜在的オフターゲット編集を広範囲かつ体系的に評価した。薬物製品は、未編集の健康ドナー細胞に比べて、高い比率のオンターゲット挿入及び欠失（およそ８８％）を示し、検出可能なレベルではオフターゲット編集を示さなかった。核型分析は、いかなる染色体転座も他の検出可能な異常も同定しなかった。さらに、腫瘍原性試験では、薬物製品を投与したマウスにおいて、いかなる新生物性病変も骨髄増殖性病変も明らかにならなかった。
β−サラセミア患者試料
β−サラセミア患者（β＋／β＋ ２例、β０／β０ １例）の試料中で高頻度のアレル編集を再現し、ｇＲＮＡ−ＲＮＰ編集後にβ＋／β＋では０．４２及び０．５８、ならびにβ０／β０では０．４１のガンマ／α−グロビンｍＲＮＡ比が得られた。また、ｇＲＮＡ−ＲＮＰ処置群においては、β＋／β＋では７３％及び７９％、ならびにβ０／β０では９２％のＨｂＦ（ＨｂＦ＋ＨｂＡ）タンパク質レベルの上昇が得られ、これに対し非処置対照群において、β＋／β＋では２４及び５０％、ならびにβ０／β０では６８％の上昇であった。さらなるβ−サラセミア患者（β＋／β０）の試料中のレベルも測定した。ｇＲＮＡ−ＲＮＰ編集後のγ／α−グロビンｍＲＮＡ比は０．４２であり、ｇＲＮＡ−ＲＮＰ編集後のＨｂＦ／（ＨｂＦ＋ＨｂＡ）タンパク質レベルは８１％であった。これに対し、未処置対照群におけるγ／α−グロビンｍＲＮＡ比は０．１８、未処置対照群におけるＨｂＦ／（ＨｂＦ＋ＨｂＡ）タンパク質レベルは６１％であった。ｇＲＮＡ−ＲＮＰ編集による結果的なγ−グロビンｍＲＮＡ及びＨｂＦレベルの増加は、ＨＰＦＨを有する患者の過去の事例に見られるレベルと比較した場合、臨床的に意味のあるものである。
（γ＋β）／α−グロビンｍＲＮＡ比についても、ｇＲＮＡ−ＲＮＰ編集したβ−サラセミア患者（β＋／β＋ ２例、β０／β０ １例、及びβ＋／β０ １例）の試料で評価し、未処置対照群と比較した（図２及び図３）。理論に束縛されることは望まないが、臨床的利益を得るために必要な（γ＋β）／α−グロビンｍＲＮＡ比の閾値は、およそ０．４である（例えば、Ｇｉａｍｐａｏｌｏ ｅｔ ａｌ．Ｈｅｔｅｒｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ｆｅｔａｌ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨＰＦＨ）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｂｎｏｒｍａｌ ｇａｍｍａ−ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂｅｔａ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ａｎｄ ｌｉｎｋａｇｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．１９８４；６６（２−３）：１５１−１５６及びＭａｒｉｎｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．ｂｅｔａ Ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ＨＢＦ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｈｅｔｅｒｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ｆｅｔａｌ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ （ＨＰＦＨ） ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｂｅｔａ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ｉｎ ａ ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｉｔａｌｉａｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ．１９８１；５（１）：１−を参照）。編集したβ−サラセミア患者試料は、０．４超の（γ＋β）／α−グロビンｍＲＮＡ比を有しており（図２及び図３）、これは、編集した患者試料におけるγ−グロビン及びβ−グロビンのｍＲＮＡレベルの合わせた増加が臨床的に意味があることを示すものである。
鎌状赤血球症患者試料
鎌状赤血球症患者試料中で高頻度のアレル編集を再現し、０．５３のγ／（γ＋β）−グロビンｍＲＮＡ比（ＳＤ±０．０８５、ｎ＝９）及び４０％のＨｂＦ（ＨｂＦ／（ＨｂＦ＋ＨｂＡ））タンパク質レベルの平均パーセンテージ（ＳＤ±９．２％、ｎ＝３）が得られた（図４）。
実施例２．輸血依存性β−サラセミアを有する対象における自家ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９改変ＣＤ３４＋ヒト造血幹・前駆細胞の単回用量の安全性及び有効性を評価する試験
第１／２相安全性及び効果試験を行って、輸血依存性β−サラセミアを有する対象における自家ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９改変ＣＤ３４＋ヒト造血幹・前駆細胞（ｈＨＳＰＣ）（薬物製品）の単回用量の安全性及び有効性を評価する（主要目的）。薬物製品の注入の疾患特異的事象及び臨床的状態に及ぼす効果を評価し、遺伝子編集効率を定量化する（副次的目的）。さらに、バイオマーカーにおける、薬物製品の効果を特徴付け、処置アウトカムを予測する能力も評価する（探索的目的）。この試験は、最初は最大１２例の対象を含め、試験に組み入れる対象を３０例以上に拡大することが可能である。本試験に組み入れる対象は、書類で立証された非β０／β０輸血依存性β−サラセミアを有する１８〜３５歳（インフォームドコンセント時の年齢）とする。本試験は、小児集団（例えば、１８歳未満）にまで拡大することができる。
本試験の目的において、輸血依存性β−サラセミアは、以下によって定義される。
・書類で立証されたホモ接合性β−サラセミア（β０／β０遺伝型を除く）、または複合ヘテロ接合性β−サラセミア（β−サラセミア／ヘモグロビンＥ（ＨｂＥ）を含む）。
・少なくとも１００ｍＬ／ｋｇ／年または１０単位／年の濃縮赤血球輸血を２年の期間にわたり受けていること。
試験の初期段階中の安全対策として、最初の対象２例は、時間をずらした方式で薬物製品を用いて処置して、第２の対象を処置する前に、第１の対象の生着成功が認められることを確実にする。第２の対象には、最初の対象が好中球の生着（連続３日間の好中球絶対数［ＡＮＣ］≧５００／μＬ）を達成し、データモニタリング委員会（ＤＭＣ）が利用可能な生着及び安全性のデータを検討し、薬物製品注入から３０日後以降になってから、骨髄破壊を行う。２番目の対象が好中球の生着を達成し、ブスルファン前処置または自家移植手順に典型的に関連するもの以外でグレード≧３ＡＥを有しなければ、残りの対象に前処置及び薬物製品注入を行うことができる。薬物製品を注入した２番目の対象が、ブスルファン前処置または自家移植手順に関連するもの以外でグレード≧３ＡＥを経験した場合は、残りの対象に前処置及び薬物製品注入を行い得る前に、ＤＭＣ会議を開催し、データを検討する。ブスルファン骨髄破壊に先行する全てのステップ、例えば、同意、スクリーニング、及び幹細胞収集は、対象への対応に時間をずらすことなく同時に進めることができる。
合計で最大３０例の対象を含めるように試験を拡大する決定は、少なくとも６例の対象に薬物製品注入を行った後に、ＤＭＣ及び運営委員会との協議の上、治験依頼者による利用可能な安全性及び有効性のデータの検討に基づく。
各対象について、本試験は、以下に記載する４つの段階で行う。薬物製品を注入した全ての対象に、追加の長期追跡調査研究への組入れを依頼する。
選択基準の例
対象は、試験の組入れに適格であるためには、以下の基準の全てを満たさなくてはならない。
１．対象は、インフォームドコンセント用紙（ＩＣＦ）に署名し日付を記入する。
２．インフォームドコンセントの日付時点で１８〜３５歳の対象。
３．以下によって定義される輸血依存性β−サラセミアの診断：
ａ．書類で立証されたホモ接合性β−サラセミア（β０／β０遺伝型を除く）、または複合ヘテロ接合性β−サラセミア（β−サラセミア／ヘモグロビンＥ（ＨｂＥ）を含む）。対象は、過去のデータに基づいて組み入れることができるが、ブスルファン前処置の前に試験中央検査室を用いての遺伝型の確認が必要となる。ＨｂＶａｒデータベースを用いてβ０／β０遺伝型が定義されている。
ｂ．本試験の同意を示す前の２年の期間にわたり、少なくとも１００ｍＬ／ｋｇ／年または１０単位／年の濃縮赤血球輸血を受けている。
４．カルノフスキー・パフォーマンス・ステータス≧８０％。
５．治験責任医師の判断により自家幹細胞移植に適格である。
６．同意以前の少なくとも２年間の濃縮ＲＢＣ輸血に関する詳細な診療記録（濃縮ＲＢＣの体積または単位、関連する輸血前Ｈｂ値、及び入院を含む）にアクセスできる。
７．妊娠可能な（初潮後であり、無処置の子宮及び少なくとも１つの卵巣を有し、閉経から１年未満である）女性対象は、同意時より薬物製品注入から６ヵ月以後まで、許容できる避妊方法（複数可）の使用に同意しなければならない。
８．男性対象は、動員開始より薬物製品注入から６ヵ月以後まで有効な避妊法を使用することに同意しなければならない。
９．予定された来院、処置計画、検査室検査、避妊ガイドライン、及び他の試験手順を遵守する意思及び能力がある。
１０．本試験の完了後、追加の長期追跡調査研究に参加する意思がある。
除外基準の例
以下の基準のいずれかを満たす対象は、組入れに不適格である。
１．１０／１０ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合の血縁ドナーが利用可能。
２．以前にＨＳＣＴを受けている。
３．関連するα−サラセミア及び＞１アルファ鎖欠失を有する対象。
４．β０／β０サラセミア遺伝型または鎌状赤血球サラセミアバリアントを有する対象。
５．治験責任医師により、臨床的に重大かつ活動性のウイルス、真菌、または寄生虫の感染症と判定されている。
６．白血球（ＷＢＣ）数＜３×１０９／Ｌまたは血小板数＜５０×１０９であり、治験責任医師により、脾機能亢進とは無関係であると判断されている。
７．重大な出血系障害の病歴。
８．試験の結果と交絡するか、または対象に追加的リスクをもたらす恐れがあると治験責任医師が考える、任意の疾患または任意の臨床的状態の病歴。これには、限定されるものではないが、関連薬物のアレルギー、心血管もしくは中枢神経系の疾患の病歴、臨床的に重大な病態の病歴もしくは存在、精神疾患の病歴、または家族性がん症候群の病歴が含まれ得る。
９．任意の悪性腫瘍もしくは骨髄増殖性障害を以前有したか現在有する、または重大な免疫不全障害を有する。
１０．以下のように定義される進行性肝疾患：
ａ．アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）＞３×正常値上限（ＵＬＮ）、もしくは直接ビリルビン値＞２×ＵＬＮ、または
ｂ．ベースラインプロトロンビン時間（ＰＴ）（国際標準比［ＩＮＲ］）＞１．５×ＵＬＮ、または
ｃ．肝硬変の病歴もしくは線維性架橋形成の任意のエビデンス、もしくは肝生検における活動性肝炎
１１．ＭＲＩによる心臓Ｔ２＊＜１０ｍｓ、または心エコー図による左室駆出分画（ＬＶＥＦ）＜４５％。
１２．ベースライン推算糸球体濾過量＜６０ｍＬ／分／１．７３ｍ２。
１３．肺における一酸化炭素の拡散能（ＤＬｃｏ）＜予測値の５０％（ヘモグロビン及び／または肺胞体積に対し補正）。
１４．遺伝子療法／編集製品を用いた処置を以前受けている。
１５．プレリキサホルまたはブスルファンに対する不耐性、禁忌、または既知の感受性。以前、薬物製品の賦形剤（ジメチルスルホキシド［ＤＭＳＯ］、デキストラン）に対するアナフィラキシー反応が生じている。
１６．ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）またはヒト免疫不全ウイルス−２（ＨＩＶ−２）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）（Ｂ型肝炎コア抗体［ＨＢｃＡｂ］もしくは核酸検査［ＮＡＴ］）、またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）（ＮＡＴ）について血清学的検査陽性である。細胞プロセッシングのための局所検査により求められる梅毒または他の任意の感染性疾患マーカーについて血清学的検査陽性である。
１７．治験薬物／製品を用いた別の臨床試験に参加しており、スクリーニングから３０日以内または治験薬剤の半減期の５倍未満（スクリーンからより長期間経っている方）である。
１８．治験責任医師により、プロトコルに概説された試験手順を遵守する能力がないと判断された対象。
１９．妊娠中または授乳中の女性。
薬物製品は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いてＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球系統特異的エンハンサーで改変した自家ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣを含み、静脈内（ＩＶ）注入によって投与される。
本試験は、輸血依存性β−サラセミアを有する対象における単一群非盲検多施設共同単回用量１／２相試験である。本試験は、自家ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９改変ｈＨＳＰＣ（薬物製品）の単回用量における安全性及び有効性を評価し、最大１２例の１８〜３５歳（両端値を含む）の対象を含める。本試験は、合計３０例以上の対象を含めるように拡大することができる。本試験は、小児集団も含めることができる。
全体的なプロセスは、以下に記載するいくつかの例外を除き、悪性疾患を有する患者における自家ＨＳＣＴに使用する手順と一致している。そのため、本試験の手順に関連するリスクは、このような手順の標準的なリスクと顕著に相違することはないと予想される。
動員の後、Ｇ−ＣＳＦ製品（例えば、フィルグラスチム）及びプレリキサホルを組み合わせて、アフェレーシスによりＣＤ３４＋幹細胞を収集する。骨髄採取ではなくアフェレーシスによって幹細胞を収集することで、そのプロセスが、患者に対しより低侵襲的であり全身麻酔を必要としないことから、より容易なＣＤ３４＋単離が可能になる。
ブスルファンは、単体で前処置に使用する。同種幹細胞移植においては、ブスルファンは、典型的にはシクロホスファミドまたはフルダラビンと組み合わせる。これは、この組合せにより、骨髄破壊及び免疫抑制の両方が得られるためである。自家移植においては、薬物製品を用いた臨床試験と同様に、ＧｖＨＤを予防するための免疫抑制は不要であり、単剤のブスルファンが支配的に骨髄破壊効果をもたらす。ブスルファン前処置を用いたレジメンはβ−サラセミアの同種移植で使用されており、生着の成功、処置関連合併症の減少、及び安定したドナーキメラ化が得られている。加えて、他の遺伝子療法試験も、ＳＣＤ、β−サラセミア、及びアデノシンデアミナーゼ欠損症による重症複合型免疫不全などの疾患領域において、ブスルファン単体での前処置を首尾よく使用している。
薬物製品の投与は自家手順であるため、ＧｖＨＤの予防的処置の必要性はない。
本試験は、４段階で行われる。
第１段階：スクリーニング及びプレ動員期間
この期間中、選択基準を満たす対象は、卵母細胞または精子の凍結保存による妊孕性温存を受ける選択肢を有する。
第２段階：動員、自家ＣＤ３４＋幹細胞収集、薬物製品製造、及び配置
各対象に、Ｇ−ＣＳＦ製品（例えば、フィルグラスチム）及びプレリキサホルを組み合わせて幹細胞動員を行う。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をアフェレーシスによって収集する。対象に連続２日間または３日間のアフェレーシスを行って、ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣを収集する。標的とするＣＤ３４＋細胞収集は、薬物製品を製造するための最少標的用量３×１０６ ＣＤ３４＋細胞／ｋｇを達成するために、少なくとも１５×１０６ ＣＤ３４＋細胞／ｋｇである。薬物製品で生着しない場合のレスキュー療法のためのバックアップとして、追加の２×１０６ ＣＤ３４＋細胞／ｋｇを収集する。１回目の動員及びアフェレーシスサイクルで、最少の薬物製品及び安全策バックアップの両方のための十分な細胞が得られない場合、または対象がアフェレーシスを完了することができない場合は、追加の細胞を収集するために最大２回の追加の動員及びアフェレーシスサイクルが許容される。追加の動員サイクルは、先の動員サイクルの初日から１４日以後であって先のサイクルの終了から６０日後までに開始する。
第３段階：骨髄破壊的前処置（第３Ａ段階）及び薬物製品注入（１日目、第３Ｂ段階）
第３Ａ段階 − 骨髄破壊的前処置：
施設で薬物製品を受け取り、バックアップ細胞が保管されていて利用可能であることを確認した後に、対象を入院させ、ブスルファンを用いた骨髄破壊的前処置を行う。ブスルファンは、１日１回、開始用量３．２ｍｇ／ｋｇ／日（ブスルファン開始の３〜７日前に収集した体重に基づく）で連続４日間静脈内に（ＩＶ）投与する。１日１回の投与が好ましいスケジュールであるが、施設の標準的なやり方に従い、６時間ごとに（Ｑ６Ｈ）投与するようにブスルファン投与レジメンを調整してもよい。ブスルファンの用量は、ブスルファン初回用量の薬物動態（ＰＫ）に基づき、骨髄破壊の適切なレベルを維持するように調整する。開始用量３．２ｍｇ／ｋｇ／日を４日間投与する対象における平均標的曲線下面積（ＡＵＣ）は、５０００μＭ＊／分（範囲：４５００〜５５００μＭ＊分）であり、標的累積ブスルファン曝露９０ｍｇ×時間／Ｌ（範囲８０〜１００ｍｇ×時間／Ｌ）に相当する。ブスルファンをＱ６Ｈで４日間投与する対象における平均標的ＡＵＣは１１２５μＭ＊分（範囲：９００〜１３５０μＭ＊分）である。
第３Ｂ段階 − 薬物製品注入：薬物製品の注入は、ブスルファン注入完了から４８時間以後及び最大でブスルファン注入完了から７日後までに行う。
１日目に薬物製品の全用量（全バイアル［複数可］）を解凍し、中心静脈カテーテルを介して投与する。
第４段階：生着後及び薬物製品注入後２年までの追跡調査
第４Ａ段階 − 注入後の入院中追跡調査：移植部門内で毎日対象を経過観察し、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受ける対象のための標準的なやり方に従って支持ケアを行う。対象のＡＥ及び生着をモニターする。ＨＳＣＴを受ける患者に対する標準的なやり方／治験責任医師の判断に従って、対象に濃縮ＲＢＣ及び血小板輸血を投与する。対象は、好中球が生着し（連続３日間のＡＮＣ≧５００／μＬとして定義される）、現地の病院のガイドライン及び／または治験責任医師の判断に従って主な医学的問題が安定化したら、移植部門から退院する。
万一、生着が薬物製品注入から４２日以内に達成されない場合は、対象にバックアップＣＤ３４＋幹細胞を投与する。
第４Ｂ段階 − 生着後追跡調査：対象に対し、薬物製品注入後の２４ヵ月間、身体検査、検査室及び画像評価、及びＡＥ評価によって追跡調査を行う。対象は、施設の管理ガイドライン及び／または治験責任医師の判断に従って、薬物製品注入のおよそ１ヵ月後、鉄キレートの再開が可能になる。
生着後、Ｈｂ≧９ｇ／ｄＬにおける濃縮ＲＢＣ輸血は、医学的に必要（例えば、症候性貧血または手術の要件として）でない限り避けることとする。対象は、Ｈｂ＜７．０ｇ／ｄＬの場合、濃縮ＲＢＣ輸血を行うことが推奨され、一方、Ｈｂレベル７〜９ｇ／ｄＬの場合は、医学的判断として、対象の臨床的必要性に基づいて輸血することが助言される。
注入手順、用量、及び投与
様々な適応症に対する自家移植は、典型的には、生着をサポートするために少なくとも２〜２．５×１０６ ＣＤ３４＋細胞／ｋｇを使用する。ＳＣＤ試験における全ての対象の生着を確実に行うため、自家移植向けの典型的な最少用量よりも２０％〜５０％高い保存的最少用量３×１０６ＣＤ３４＋細胞／ｋｇを選択した。原理上、骨髄破壊後のより多数のＣＤ３４＋幹細胞の注入は、より迅速な生着、耐久性、及び処置の効果に結び付く。
薬物製品は、５％ ＤＭＳＯ及びデキストラン４０を含有するＣＲＹＯＳＴＯＲ（登録商標）ＣＳ５培地中で製剤化する。ＤＭＳＯに関連するヒスタミン放出は、吐き気、嘔吐、下痢、紅潮、発熱、悪寒、頭痛、呼吸困難、発疹、気管支痙攣、アナフィラキシー、血管拡張及び低血圧、ならびに精神状態変化などの有害作用を含めた症状をもたらし得る。これらのＡＥのリスクを考慮して、対象に薬物製品を投与する前に、抗ヒスタミン薬（ジフェンヒドラミン塩酸塩）及び解熱剤（アセトアミノフェンまたはパラセタモール）を前投薬する。このような投薬は、施設内ガイドライン及び治験責任医師の判断に従い、必要に応じて３〜４時間ごとに繰り返してもよい。
薬物製品の単回用量は、ブスルファンの最終用量から４８時間以後であって７日以内に投与する。薬物製品バイアル（複数可）は、現地施設のＳＯＰに従い、注入予定時の直前に解凍することとする。解凍から２０分以内に薬物製品の全用量を注入することとする。細胞の解凍及び注入についての詳細な指示内容は、試験レファレンスマニュアルに記載されている。病院ガイドラインは、幹細胞試験所から対象までに至る薬物製品の保管管理を維持するために使用する。注入の前に、対象の同一性及び製品の詳細の確認に関しては現地の手順に従って、製品の適合性及び完全性を確実にすることとする。
１日目に中心静脈カテーテルを介して対象に薬物製品を投与する。薬物製品を含有する全てのバイアル（複数可）を注入することとする。
薬物製品を伴う全ての手順は、臨床施設のＳＯＰに従い、訓練を受けた職員が無菌技法を用いて実施することとする。
万一、ブスルファンの最終用量後７日以内に薬物製品注入を行わない場合は、バックアップＣＤ３４＋幹細胞を対象に投与することとする。
試験期間
第１段階の期間はおよそ１〜３ヵ月、第２段階はおよそ２〜３ヵ月、第３段階はおよそ１ヵ月、第４段階はおよそ２年となる。同意書に署名してから合計でおよそ２．５年間、薬物製品注入後およそ２年間、対象に試験の追跡調査を行う。加えて、薬物製品を注入した全ての対象に、本試験の完了後または本試験からの離脱／中止後、長期追跡調査研究または登録への組入れを依頼する。
前投薬
スクリーニングから３０日以内に服用した全ての投薬を記録する。試験スクリーニング同意日の２４ヵ月前からのＲＢＣ輸血に関するレトロスペクティブ情報を記録する。
静脈アクセス
前処置レジメンの投与及び薬物製品の注入のために中心静脈カテーテルを使用する。中心静脈カテーテルは、治験責任医師の判断に従って、アフェレーシス、交換輸血、及び薬物製品注入後の対象への臨床ケアにも使用することができる。
輸血
アフェレーシス手順の開始前、及びブスルファン前処置の開始予定時の少なくとも１ヵ月前に、Ｈｂ≧１１ｇ／ｄＬの目標を達成するように対象に輸血を行うこととする。これは、無効造血を抑制し、より好結果の生着を可能にするために行う。ブスルファン前処置及び薬物製品注入のために入院する間、ＨＳＣＴを受ける患者に対する標準的なやり方に従って、対象を濃縮ＲＢＣ及び血小板の輸血で支持することとする。
薬物製品注入後の２４ヵ月の追跡調査期間中、Ｈｂ≦７ｇ／ｄＬの場合及び輸血を必要とする臨床的症状の場合には、対象に濃縮ＲＢＣを投与することが推奨される。全ての輸血の理由は文書に記録することとする。Ｈｂ≧９ｇ／ｄＬの場合は、臨床的に重要（例えば、手術の場合）とみなされない限り、避けることとする。
全ての血液製剤は、病院ガイドラインに従って濾過及び照射を行う。
鉄キレート
キレートは、ブスルファンを用いた骨髄破壊的前処置を開始する７日以上前に中止しなければならない。デフェラシロクスは例外であり、（薬物間相互作用の潜在可能性により）前処置の３０日以上前に中止することとする。デフェラシロクスを中止する場合、異なるキレート薬をブスルファン前処置の７日前まで使用することができる。
安定した造血回復を可能にし、骨髄抑制効果の潜在可能性を避けるため、デフェラシロクス、デフェロキサミン、またはデフェリプロンを用いた鉄キレートは、ＣＴＸ００１注入から１ヵ月以後に開始することとする。対象を定期的に評価して、キレートが必要かどうかを判定することとする。キレート薬は、施設内ガイドラインに従って初回用量、漸増及び中断ルールを選択するときに、輸血要件及び鉄過剰レベルに応じて投与することとする。
鉄キレートを中止する潜在的理由は以下の通りである。
・血清フェリチン＜１０００μｇ／Ｌ
・ＬＩＣ＜７ｍｇ／ｇ
・輸血非依存であれば、鉄キレートの代替として瀉血を受けられる
持続的にＨｂ≧１１ｇ／ｄＬで輸血非依存の対象については、キレートの代わりに瀉血を使用することができる。
禁止薬
Ｇ−ＣＳＦは、メディカルモニターとの協議及び同意がない限り、ＣＴＸ００１注入後に投与しないこととする。これは、早期Ｇ−ＣＳＦの投与によって、編集再注入ＣＤ３４＋細胞の、赤血球系統への分化ではなく骨髄系統への分化が優先的に推進されるという仮説的懸念によるものである。ＣＴＸ００１注入後にＧ−ＣＳＦ投与を避けることで、全ての系統でのＣＤ３４＋細胞の完全な成熟が可能になり得る。対象を綿密にモニターすることとし、好中球の生着がＣＴＸ００１注入後２１日までに発生しない場合は、治験責任医師はメディカルモニターに連絡を取ってＧ−ＣＳＦの開始の可能性について協議することができる。
動員
動員を開始する前に、アフェレーシスに熟練した医師が各対象を診察し適切とみなした上で、表１及び施設の標準的手順に従って動員及びアフェレーシスを行う。不適格の例としては、血行力学的不安定、血清学的検査感染陽性、または活動性感染が挙げられる。
動員は、フィルグラスチム及びプレリキサホルの組合せを含む。フィルグラスチムは、５μｇ／ｋｇ／用量の用量で１２時間ごとに５〜６日間、皮下投与する。用量は、動員初日から５日以内に測定した体重に基づく。脾臓摘出術を受けた対象には、重大な白血球増加を予防するため、より低用量のＧ−ＣＳＦを５μｇ／ｋｇで２４時間ごとに５〜６日間投与することとする。
プレリキサホルは、対象にＧ−ＣＳＦを４日間投与した後に投与する。プレリキサホルは皮下注射によって投与することとし、推奨用量は０．２４ｍｇ／ｋｇとし、アフェレーシス予定時のおよそ５〜７時間前に投与する。また、用量は、動員初日以前の５日以内に測定した体重にも基づく。完全な投与スケジュールについては表１を参照。
全血球数（ＣＢＣ）は、白血球増加に対しフィルグラスチムの１、４、及び５日目に測定し、重大な白血球増加（例えば、＞７０×１０９／Ｌ）の存在下では現地のやり方に基づいて用量を調整する。末梢血中のＣＤ３４＋細胞数は、アフェレーシスの前の午前中（複数可）に実施する。追加のＣＤ３４＋細胞数及びＣＢＣは、施設の標準業務手順書（ＳＯＰ）に従って実施する。
アフェレーシス手順
ＰＢＭＣを、臨床施設のＳＯＰに従って最大３日間収集する。アフェレーシスの１日目及び２日目にわたる製品製造のためのＣＤ３４＋細胞収集の最低目標は、１５×１０６ ＣＤ３４＋細胞／ｋｇとする。アフェレーシスの３日目には、製造のための細胞を収集しない。これらの細胞を、薬物製品の製造用に中央製造施設に輸送する。
バックアップ細胞は、２×１０６ ＣＤ３４＋細胞／ｋｇを目標に、アフェレーシスの３日目に収集する。バックアップ細胞は、アフェレーシスの２日目に収集することもできるが、製造施設への輸送用に十分な細胞を確保した後に限る。バックアップ細胞は、生着しない場合の安全策手順として収集する。バックアップ細胞は、処置施設で凍結保存し保管する。これは、第３段階（ブスルファン前処置）に進む前に行う。
１回目の動員及びアフェレーシスサイクルで、薬物製品及び安全策バックアップ両方のための十分な細胞が得られない場合、２回目の動員サイクルは２〜６週間後に発生することとする。
前処置：ブスルファン投与
ブスルファン前処置は、施設で薬物製品を受け取り、サラセミア（アルファ及びＨＢＢ座位）の遺伝型判定を確認したら開始することとする。ブスルファンは、１日１回連続４日間、開始用量３．２ｍｇ／ｋｇ／日（ブスルファン投与初日以前の３〜７日以内に収集した体重に基づく）でＩＶ投与する。１日１回の投与が好ましいスケジュールであるが、施設の標準的なやり方に従い、Ｑ６Ｈで投与するようにブスルファン用量レジメンを調整してもよい。
ブスルファンの用量は、初回用量ブスルファンＰＫに基づき、骨髄破壊の適切なレベルを維持するように調整する。４日間の開始用量３．２ｍｇ／ｋｇ／日の対象における平均標的ＡＵＣは、５０００μＭ＊／分（範囲：４５００〜５５００）であり、標的累積ブスルファン曝露９０ｍｇ×時間／Ｌ［範囲８０１００ｍｇ×時間／Ｌ］に相当する。ブスルファンをＱ６Ｈで４日間投与する対象におけるＡＵＣは、１１２５μＭ＊分（範囲：９００〜１３５０）である。
ブスルファン用量を予め決定するために、骨髄破壊を開始する３〜７日前にブスルファンの試験用量を実施してもよい。治験責任医師の裁量に従ってデフィブロチド予防法が使用可能である。ブスルファン前処置中は、病院ガイドラインに従って発作予防法及び他の支持療法を開始することとする。
薬物製品注入
薬物製品の単回用量は、ブスルファンの最終用量から４８時間以後であって７日以内に投与する。薬剤製品バイアル（複数可）は、現地施設のＳＯＰを利用して、注入予定時の直前に解凍し、解凍から２０分以内に注入することとする。
１日目に中心静脈カテーテルを介して、対象に薬物製品を≧３．０×１０６ ＣＤ３４＋細胞／ｋｇの用量で投与する。薬物製品を含有する全てのバイアル（複数可）を注入することとする。
薬物製品を伴う全ての手順は、臨床施設のＳＯＰに従い、訓練を受けた職員が無菌技法を用いて実施することとする。
有効性の主要エンドポイントの解析
薬物製品は、特に赤血球中のＨｂＦの生成を増加させるために開発された細胞製品である。末梢血中のＨｂＦレベルを測定することにより、薬物製品の投与による意図された結果を直接評価する。
有効性の主要エンドポイントは、「薬物製品注入後９〜２４ヵ月の間に少なくとも６ヵ月間の輸血低減（ＴＲ６）を達成する対象の割合」である。
有効性の副次エンドポイントの解析
・薬物製品注入の３ヵ月後を起点に少なくとも６ヵ月間の輸血非依存（ＴＩ６）を達成する対象の割合。
・薬物製品注入の３ヵ月後を起点に少なくとも１２ヵ月間の輸血非依存（ＴＲ１２）を達成する対象の割合。
・薬物製品注入の３ヵ月後を起点に少なくとも１２ヵ月間の輸血低減（ＴＩ１２）を達成する対象の割合。
・末梢血白血球中に存在する意図された遺伝子改変によるアレルの経時的な割合。意図された遺伝子改変とは、ＢＣＬ１１Ａのイントロン２内の赤血球特異的エンハンサーの配列を改変するインデルである。
・骨髄細胞中に存在する意図された遺伝子改変によるアレルの経時的な割合
・（輸血前の）胎児ヘモグロビン濃度の経時的な変化
・ＥｕｒｏＱｏｌ質問紙（５次元−５レベルの重症度）（ＥＱ−５Ｄ−５Ｌ）を用いての、健康関連クオリティーオブライフ（ＨＲＱｏＬ）のベースラインからの経時的な変化
・がん療法（骨髄移植）の機能的評価（ＦＡＣＴ−ＢＭＴ）質問紙を用いての、ＨＲＱｏＬのベースラインからの経時的な変化
・以下を含む鉄過剰のパラメーターの変化
○Ｔ２＊磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）による評価におけるベースラインからの肝臓鉄濃度（ＬＩＣ）及び心臓鉄量（ＣＩＣ）
○血清フェリチンレベルのベースラインからの経時的な変化
・鉄キレート療法を受けている対象の経時的な割合
探索的エンドポイントの解析
・胎児ヘモグロビンを発現する循環赤血球（Ｆ細胞）の割合におけるベースライン（輸血前）からの経時的な変化
・循環網状赤血球におけるα−グロビン及び非α−グロビンｍＲＮＡの経時的な発現
・エリスロポエチン（ＥＰＯ）濃度の経時的な変化
・ヘプシジン濃度の経時的な変化
・骨髄解析における、ベースラインと経時的に比較した赤血球新生の評価
安全性解析
生着した対象の割合。生着は、連続３日間の好中球絶対数（ＡＮＣ）≧５００／μＬとして定義される。生着不良は、薬物製品注入後、またはバックアップ非改変ＣＤ３４＋細胞が利用された場合の４２日目までに、好中球の生着を達成しない任意の対象として定義される。これとは別に、血小板生着も解析する。
・生着時間
・米国国立がん研究所（ＮＣＩ）有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）ｖ４．０３による評価における、インフォームドコンセント署名から２４ヵ月目の来院までに収集したＡＥの頻度及び重症度。
・薬物製品注入後１００日時及び１年時における移植関連死（ＴＲＭ）の発生率。ＴＲＭは、移植手順に関連する可能性がある死亡として定義される。
・総死亡率
薬物製品注入後感染症の予防及び監視
薬物製品注入後、対象は、ＨＳＣＴについての現地のガイドライン及び治験責任医師の判断に従って、感染症の監視及び予防法（細菌性、ウイルス性、真菌性）を受けることができる。
対象が薬物製品注入後に敗血症または全身性菌血症を発症した場合、適切な培養及び医学的管理を開始する。
患者報告アウトカム
ＰＲＯ評価は、インフォームドコンセントを得た後の最初の評価として実施することとし、さらに試験来院の冒頭で、いかなる評価にも先行して対象が完了させることとする。
実施例３．重症鎌状赤血球症を有する対象における自家ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９改変ＣＤ３４＋ヒト造血幹・前駆細胞の単回用量の安全性及び有効性を評価する試験
第１／２相安全性及び効果試験を行って、重症鎌状血球症（ＳＣＤ）を有する対象における自家ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９改変ＣＤ３４＋ヒト造血幹・前駆細胞（ｈＨＳＰＣ）（薬物製品）の単回用量の安全性及び有効性を評価する（主要目的）。薬物製品の注入の疾患特異的事象及び臨床的状態に及ぼす効果を評価し、遺伝子編集効率を定量化する（副次的目的）。さらに、バイオマーカーにおける、薬物製品の効果を特徴付け、処置アウトカムを予測する能力も評価する（探索的目的）。この試験は、最初は最大１２例の対象を含め、試験に組み入れる対象を４５例以上に拡大することが可能である。本試験に組み入れる対象は、書類で立証されたβＳ／βＳ遺伝型を有する重症ＳＣＤの１８〜３５歳（インフォームドコンセント時の年齢）とする。本試験は、小児集団（例えば、１８歳未満）にまで拡大することができる。
重症ＳＣＤは、スクリーニング前の２年間における各年に、治験責任医師が判断した適切な支持ケア（例えば、疼痛管理計画、必要が示される場合はＨＵ）を受けながら、以下の事象のうちの少なくとも２つが発生することにより定義される。
・医療施設への来院及び疼痛薬剤（オピオイドまたは静脈内（ＩＶ）非ステロイド性抗炎症薬物［ＮＳＡＩＤ］）またはＲＢＣ輸血の投与を必要とする急性疼痛事象
・新規の肺浸潤物の存在によって示され、肺炎様の症状、疼痛、または発熱を伴う急性胸部症候群
・２時間を超えて持続する持続性勃起
・脾臓赤血球捕捉
試験の初期段階中の安全対策として、最初の対象２例は、時間をずらした方式で薬物製品を用いて処置して、第２の対象を処置する前に、第１の対象の生着成功が認められることを確実にする。第２の対象には、最初の対象が好中球の生着（連続３日間の好中球絶対数［ＡＮＣ］≧５００／μＬ）を達成し、データモニタリング委員会（ＤＭＣ）が利用可能な生着及び安全性のデータを検討し、薬物製品注入から３０日後以降になってから、骨髄破壊を行う。２番目の対象が好中球の生着を達成し、ブスルファン前処置または自家移植手順に典型的に関連するもの以外でグレード≧３ＡＥを有しなければ、残りの対象に前処置及び薬物製品注入を行うことができる。薬物製品を注入した２番目の対象が、ブスルファン前処置または自家移植手順に関連するもの以外でグレード≧３ＡＥを経験した場合は、残りの対象に前処置及び薬物製品注入を行い得る前に、ＤＭＣ会議を開催し、データを検討する。ブスルファン骨髄破壊に先行する全てのステップ、例えば、同意、スクリーニング、及び幹細胞収集は、対象への対応に時間をずらすことなく同時に進めることができる。
合計で最大４５例の対象を含めるように試験を拡大する決定は、少なくとも６例の対象に薬物製品注入を行った後に、ＤＭＣ及び運営委員会（ＳＣ）との協議の上、治験依頼者による利用可能な安全性及び有効性のデータの検討に基づく。
各対象について、本試験は、以下に記載する４つの段階で行う。薬物製品を注入した全ての対象に、追加の長期追跡調査研究への組入れを依頼する。
選択基準の例
対象は、試験の組入れに適格であるためには、以下の基準の全てを満たさなくてはならない。
１１．対象は、インフォームドコンセント用紙（ＩＣＦ）に署名し日付を記入する。
１２．インフォームドコンセントの日付時点で１８〜３５歳の対象。
１３．書類で立証されたβＳ／βＳ遺伝型。対象は、過去のβＳ／βＳ遺伝型結果に基づいて組み入れることができるが、ブスルファン前処置の前には遺伝型確認が必要である。
１４．重症ＳＣＤを有する対象。
１５．カルノフスキー・パフォーマンス・ステータス≧８０％。
１６．治験責任医師の判断により自家幹細胞移植に適格である。
１７．妊娠可能な（初潮後であり、無処置の子宮及び少なくとも１つの卵巣を有し、閉経から１年未満である）女性対象は、同意時より薬物製品注入から６ヵ月以後まで、許容できる避妊方法（複数可）の使用に同意しなければならない。
１８．男性対象は、動員開始より薬物製品注入から６ヵ月以後まで有効な避妊法を使用することに同意しなければならない。
１９．予定された来院、処置計画、検査室検査、避妊ガイドライン、及び他の試験手順を遵守する意思及び能力がある。
２０．本試験の完了後、追加の長期追跡調査研究に参加する意思がある。
除外基準の例
以下の基準のいずれかを満たす対象は、組入れに不適格である。
２０．１０／１０ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合の血縁ドナーが利用可能。
２１．以前にＨＳＣＴを受けている。
２２．治験責任医師により、臨床的に重大かつ活動性のウイルス、真菌、または寄生虫の感染症と判定されている。
２３．白血球（ＷＢＣ）数＜３×１０９／Ｌまたは血小板数＜５０×１０９であり、治験責任医師により、脾機能亢進とは無関係であると判断されている。
２４．生着後、定期的なＲＢＣ輸血を用いた処置を中断できないと治験責任医師が考える場合。
２５．ＲＢＣ抗原に対する同種免疫の病歴を有し、治験責任医師により、本試験の期間中に利用可能なＲＢＣ単位が不十分であると予測される対象。
２６．スクリーニング前の１年間で１０回を超える予定外の入院または救急部門の受診がある。
２７．ＨＵなどのＨｂＦ誘導処置を用いた併用処置に関係なく、ＨｂＦレベル＞１５．０％。
２８．対象を出血のリスクにさらすと治験責任医師が考える、未処置のもやもや病の病歴またはスクリーニング時におけるもやもや病の存在。
２９．重大な出血系障害の病歴。
３０．試験の結果と交絡するか、または対象に追加的リスクをもたらす恐れがあると治験責任医師が考える、任意の疾患または任意の臨床的状態の病歴。これには、限定されるものではないが、関連薬物のアレルギー、心血管もしくは中枢神経系の疾患の病歴、臨床的に重大な病態の病歴もしくは存在、精神疾患の病歴、または家族性がん症候群の病歴が含まれ得る。
３１．任意の悪性腫瘍もしくは骨髄増殖性障害を以前有したか現在有する、または重大な免疫不全障害を有する。
３２．以下のように定義される進行性肝疾患：
ａ．アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）＞３×正常値上限（ＵＬＮ）、もしくは直接ビリルビン値＞２×ＵＬＮ、または
ｂ．ベースラインプロトロンビン時間（ＰＴ）（国際標準比［ＩＮＲ］）＞１．５×ＵＬＮ、または
ｃ．肝硬変の病歴もしくは線維性架橋形成の任意のエビデンス、もしくは肝生検における活動性肝炎
３３．ベースライン推算糸球体濾過量＜６０ｍＬ／分／１．７３ｍ２。
３４．肺における一酸化炭素の拡散能（ＤＬｃｏ）＜予測値の５０％（ヘモグロビン及び／または肺胞体積に対し補正）。
３５．心エコー図による左室駆出分画（ＬＶＥＦ）＜４５％。
３６．遺伝子療法／編集製品を用いた処置を以前受けている。
３７．プレリキサホルまたはブスルファンに対する不耐性、禁忌、または既知の感受性。以前、薬物製品の賦形剤（ジメチルスルホキシド［ＤＭＳＯ］、デキストラン）に対するアナフィラキシー反応が生じている。
３８．ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）またはヒト免疫不全ウイルス−２（ＨＩＶ−２）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）（Ｂ型肝炎コア抗体［ＨＢｃＡｂ］もしくは核酸検査［ＮＡＴ］）、またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）（ＮＡＴ）について血清学的検査陽性である。細胞プロセッシングのための局所検査により求められる梅毒または他の任意の感染性疾患マーカーについて血清学的検査陽性である。
３９．治験薬物／製品を用いた別の臨床試験に参加しており、スクリーニングから３０日以内または治験薬剤の半減期の５倍未満（スクリーンからより長期間経っている方）である。
４０．治験責任医師により、プロトコルに概説された試験手順を遵守する能力がないと判断された対象。
４１．妊娠中または授乳中の女性。
薬物製品は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いてＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球系統特異的エンハンサーで改変した自家ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣを含み、静脈内（ＩＶ）注入によって投与される。
本試験は、重症ＳＣＤを有する対象における単一群非盲検多施設共同単回用量第１／２相試験である。本試験は、自家ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９改変ｈＨＳＰＣ（薬物製品）の単回用量における安全性及び有効性を評価し、最大１２例の１８〜３５歳（両端値を含む）の対象を含める。本試験は、合計４５例以上の対象を含めるように拡大することができる。本試験は、小児集団も含めることができる。
全体的なプロセスは、以下に記載するいくつかの例外を除き、悪性疾患を有する患者における自家ＨＳＣＴに使用する手順と一致している。そのため、本試験の手順に関連するリスクは、このような手順の標準的なリスクと顕著に相違することはないと予想される。
予防的ＲＢＣ輸血（単純または交換）は、動員の８（±２）週間前から薬物製品注入まで投与して、動員及びブスルファン前処置の間のＶＯＣのリスクを減少させる。この輸血ガイダンスの理由付けは、ＳＣＤを有する患者への単純または交換技法による非鎌状ＲＢＣの輸血が、生理的合併症、例えば、卒中３１、手術手順後の疾患関連合併症３２、ＡＣＳ３３、及びＶＯＣ３４を軽減し得るというエビデンスに由来する。ＳＣＤを有する患者に対する幹細胞移植プロトコルは、動員及び前処置の前にＨｂＳ＜３０％に減少させるための交換輸血を伴うことが多い。
動員後、ＣＤ３４＋幹細胞を、プレリキサホル単体を用いたアフェレーシスによって収集する。骨髄採取ではなくアフェレーシスによって幹細胞を収集することで、そのプロセスが、患者に対しより低侵襲的であり全身麻酔を必要としないことから、より容易なＣＤ３４＋単離が可能になる。収集に使用される標準的レジメンであるプレリキサホルと顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）との組合せではなく、プレリキサホル単体を使用するという決定は、Ｇ−ＣＳＦが、ＳＣＤを有する対象において、致命的になり得る重症ＶＯＣを誘導する恐れがあるという事実に由来する。健康な対象及びヘモグロビン異常症を有する対象における試験からのデータは、プレリキサホル単体がＣＤ３４＋細胞を有効に動員し得ることを示している。また、これらの試験は、健康な対象においてプレリキサホル単体を用いて収集したＣＤ３４＋細胞が、同種ＨＳＣＴの文脈で投与したときに首尾よく生着することも示している。加えて、重症ＳＣＤを有する対象におけるプレリキサホル単体を用いた幹細胞動員を説明する小規模試験では、単回のアフェレーシス後における中央値１０．４×１０６ ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ（５．１〜２０．０）の収集が報告されている。ただし、直前の２ヵ月間ＲＢＣ輸血を投与したにもかかわらず、非重症疼痛発作が７例中３例の対象に発生した。ＣＤ３４＋細胞の標的数を首尾よく収集できないことは、本試験の中止基準に含まれる。
ブスルファンは、単体で前処置に使用する。同種幹細胞移植においては、ブスルファンは、典型的にはシクロホスファミドまたはフルダラビンと組み合わせる。これは、この組合せにより、骨髄破壊及び免疫抑制の両方が得られるためである。自家移植においては、薬物製品を用いた臨床試験と同様に、ＧｖＨＤを予防するための免疫抑制は不要であり、単剤のブスルファンが支配的に骨髄破壊効果をもたらす。ブスルファン前処置を用いたレジメンはＳＣＤの同種移植で使用されており、生着の成功、処置関連合併症の減少、及び安定したドナーキメラ化が得られている。加えて、他の遺伝子療法試験も、β−サラセミア、ＳＣＤ、及びアデノシンデアミナーゼ欠損症による重症複合型免疫不全などの疾患領域において、ブスルファン単体での前処置を首尾よく使用している。
薬物製品の投与は自家手順であるため、ＧｖＨＤの予防的処置の必要性はない。
本試験は、４段階で行われる。
第１段階：スクリーニング及びプレ動員期間
この期間中、選択基準を満たす対象は、卵母細胞または精子の凍結保存による妊孕性温存を受ける選択肢を有する。適格性を確認した後、動員開始予定時の８（±２）週間前に、対象にＲＢＣ輸血（単純または交換）を開始し、ブスルファン前処置を開始するまでこの輸血投与を継続する。このようなＲＢＣ輸血の目標は、総Ｈｂ濃度≦１１ｇ／ｄＬを保ちながらヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）レベル＜総Ｈｂの３０％を標的とすることである。ＨＵを用いた処置は、動員予定時の少なくとも６週間前に中止することとする。
第２段階：動員、自家ＣＤ３４＋幹細胞収集、薬物製品製造、及び配置
各対象に、プレリキサホル単体を用いた幹細胞動員を行う。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をアフェレーシスによって収集する。１日目は、アフェレーシス予定時の７（±２）時間前に対象にプレリキサホルを投与する。対象に連続２日間または３日間のアフェレーシスを行って、ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣを収集する。標的とするＣＤ３４＋細胞収集は、薬物製品を製造するための最少標的用量３×１０６ ＣＤ３４＋細胞／ｋｇを達成するために、少なくとも１５×１０６ ＣＤ３４＋細胞／ｋｇである。薬物製品で生着しない場合のレスキュー療法のためのバックアップとして、追加の２×１０６ ＣＤ３４＋細胞／ｋｇを収集する。１回目の動員及びアフェレーシスサイクルで、最少の薬物製品及び安全策バックアップの両方のための十分な細胞が得られない場合、または対象がアフェレーシスを完了することができない場合は、追加の細胞を収集するために最大２回の追加の動員及びアフェレーシスサイクルが許容される。追加の動員サイクルは、先の動員サイクルの初日から１４日以後であって先のサイクルの終了から６０日後までに開始する。
第３段階：骨髄破壊的前処置（第３Ａ段階）及び薬物製品注入（１日目、第３Ｂ段階）
第３Ａ段階 − 骨髄破壊的前処置：薬物製品製造中及びブスルファン前処置の開始予定時前に、総Ｈｂ濃度≦１１ｇ／ｄＬを保ちながらＨｂＳレベル＜総Ｈｂの３０％を維持することを目標に、対象にＲＢＣの単純または交換輸血の投与を継続する。
ブスルファン前処置の開始予定時が動員の完了後４ヵ月を超える場合は、治験責任医師は、ＲＢＣ輸血レジメンを中止し、以前ＨＵで処置していた対象のためにＨＵを再開することができる。ＲＢＣ輸血レジメンを中断する場合、対象は、ブスルファン前処置の開始予定時の８（±２）週間前に、総Ｈｂ濃度≦１１ｇ／ｄＬを保ちながらＨｂＳレベル＜総Ｈｂの３０％を維持することを目標に、ＲＢＣ輸血（単純または交換）を開始することとする。ブスルファン前処置の開始予定時前の７（±３）日以内にＨｂＳレベル＞総Ｈｂの３０％である場合、ブスルファン前処置の開始前に、ＨｂＳレベル＜３０％を確実にすることを目標に、対象に１回の交換輸血を投与する。
施設で薬物製品を受け取り、バックアップ細胞が利用可能な状態に保たれ、必要な場合の投与に許容される条件下にあることを確認した後に、対象にブスルファンを投与する。ブスルファンの開始用量は３．２ｍｇ／ｋｇとし、１日１回連続４日間ＩＶ投与する。ただし、施設の標準的なやり方に従って、ブスルファンを０．８ｍｇ／ｋｇで６時間ごとに（ｑ６ｈ）連続４日間投与してもよい。
第３Ｂ段階 − 薬物製品注入：薬物製品の注入は、ブスルファン注入完了から４８時間以後及び最大でブスルファン注入完了から７日後までに行う。
１日目に薬物製品の全用量（全バイアル［複数可］）を解凍し、中心静脈カテーテルを介して投与する。
第４段階：生着後及び薬物製品注入後２年までの追跡調査
第４Ａ段階 − 注入後の入院中追跡調査：移植部門内で毎日対象をモニターし、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受ける対象のための標準的なやり方に従って支持ケアを行う。
第４Ｂ段階 − 生着後の追跡調査：移植部門を退院してから、薬物製品注入後およそ２年間、対象に追跡調査を行う。
第１段階の期間はおよそ２〜４ヵ月、第２段階はおよそ２〜４ヵ月、第３段階はおよそ１ヵ月、第４段階はおよそ２年となる。薬物製品注入後合計およそ２年間、対象に試験の追跡調査を行う。加えて、薬物製品を注入した全ての対象に、完了後または離脱／中止後、長期追跡調査研究への組入れを依頼する。
以下の評価が行われる：有効性評価のためのＨｂＦレベル、ＶＯＣ事象、ＲＢＣ輸血、意図された遺伝子改変によるアレル、及びＰＲＯ；安全性評価のための生着、ＴＲＭ、臨床検査室評価、バイタルサイン、身長、体重、ＥＣＧ、及び身体検査（ＰＥ）；ならびに探索的評価のための溶血検査室評価、ＴＲＶ、炎症及び内皮活性化マーカー、Ｆ細胞分布。
注入手順、用量、及び投与
様々な適応症に対する自家移植は、典型的には、生着をサポートするために少なくとも２〜２．５×１０６ ＣＤ３４＋細胞／ｋｇを使用する。ＳＣＤ試験における全ての対象の生着を確実に行うため、自家移植向けの典型的な最少用量よりも２０％〜５０％高い保存的最少用量３×１０６ＣＤ３４＋細胞／ｋｇを選択した。原理上、骨髄破壊後のより多数のＣＤ３４＋幹細胞の注入は、より迅速な生着、耐久性、及び処置の効果に結び付く。
薬物製品は、５％ ＤＭＳＯ及びデキストラン４０を含有するＣＲＹＯＳＴＯＲ（登録商標）ＣＳ５培地中で製剤化する。ＤＭＳＯに関連するヒスタミン放出は、吐き気、嘔吐、下痢、紅潮、発熱、悪寒、頭痛、呼吸困難、発疹、気管支痙攣、アナフィラキシー、血管拡張及び低血圧、ならびに精神状態変化などの有害作用を含めた症状をもたらし得る。これらのＡＥのリスクを考慮して、対象に薬物製品を投与する前に、抗ヒスタミン薬（ジフェンヒドラミン塩酸塩）及び解熱剤（アセトアミノフェンまたはパラセタモール）を前投薬する。このような投薬は、施設内ガイドライン及び治験責任医師の判断に従い、必要に応じて３〜４時間ごとに繰り返してもよい。
薬物製品の単回用量は、ブスルファンの最終用量から４８時間以後であって７日以内に投与する。薬物製品バイアル（複数可）は、現地施設のＳＯＰに従い、注入予定時の直前に解凍することとする。解凍から２０分以内に薬物製品の全用量を注入することとする。細胞の解凍及び注入についての詳細な指示内容は、試験レファレンスマニュアルに記載されている。病院ガイドラインは、幹細胞試験所から対象までに至る薬物製品の保管管理を維持するために使用する。注入の前に、対象の同一性及び製品の詳細の確認に関しては現地の手順に従って、製品の適合性及び完全性を確実にすることとする。
１日目に中心静脈カテーテルを介して対象に薬物製品を投与する。薬物製品を含有する全てのバイアル（複数可）を注入することとする。
薬物製品を伴う全ての手順は、臨床施設のＳＯＰに従い、訓練を受けた職員が無菌技法を用いて実施しなければならない。
万一、ブスルファンの最終用量後７日以内に薬物製品注入を行わない場合は、バックアップＣＤ３４＋幹細胞を対象に投与することとする。
試験期間
薬物製品注入後２年間、対象に試験の追跡調査を行う。２年という追跡調査期間は、臨床的アウトカムの特徴付けに妥当とみなされた。本試験は、スクリーニング前の２年間において１年当たり少なくとも２回のＶＯＣ事象を伴う対象を組み入れるため、２年の追跡調査は、ＶＯＣの年率換算発生率の減少に対する意味のある評価を可能にする。
加えて、薬物製品を注入した全ての対象に、完了後または離脱／中止後、最大１５年間の長期追跡調査研究への組入れを依頼する、これは、薬物製品に関する任意の潜在的長期ＡＥを確実に取り込むためであり、また、長期処置アウトカムを評価し、さらに有効性に対するより長期の追跡調査をもたらすためである。
前投薬
スクリーニングから３０日以内に服用した全ての投薬を記録する。
試験スクリーニング同意日の２４ヵ月前からのＲＢＣ輸血に関するレトロスペクティブ情報を記録する。
静脈アクセス
前処置レジメンの投与及び薬物製品の注入のために中心静脈カテーテルを使用する。中心静脈カテーテルは、治験責任医師の判断に従って、アフェレーシス、交換輸血、及び薬物製品注入後の対象への臨床ケアにも使用することができる。
禁止薬
ＨＵ：ヒドロキシ尿素（ＨＵ）を用いた処置は、動員開始予定時の少なくとも６週間前に中止することとする。治験責任医師が必要とみなし、動員の完了からブスルファン前処置までの間で＞４ヵ月が予定されている場合、対象は、動員及びアフェレーシスの後にＨＵを再開することができる。ＨＵを再開する場合、ブスルファン前処置の前にＲＢＣ輸血を再開したときは、ＨＵを中止することとする。
薬物製品注入後、生着が達成されたとき、対象がＶＯＣまたは他の合併症を経験し、治験責任医師がそのＶＯＣまたは他の合併症をＳＣＤに関するものと判断し、ＨＵの再開を保証した場合は、ＨＵを再開することができる。ＨＵを再開する場合、医学的に許容されるとみなされかつＨｂＦ≧２０％であれば、ＨＵを徐々に漸減することが推奨される。
Ｌ−グルタミン：Ｌ−グルタミンを用いた処置は、薬物製品注入後中止することとする。
ＨｂＦ誘導剤（ＨＵ以外）：任意のＨｂＦ誘導処置を用いた処置は、薬物製品注入後中止することとする。
動員
中心静脈ラインが動員に必要かどうかの決定は、アフェレーシスに熟練した看護師または医師が行う。動員にはプレリキサホルのみを用いる。Ｇ−ＣＳＦは投与しないこととする。
アフェレーシス予定時の７（±２）時間前に、対象に、皮下注射を介し０．２４ｍｇ／ｋｇの用量のプレリキサホルを投与する。動員初日以前の５日以内に測定した体重を推奨用量の計算に使用する。完全な投与スケジュールについては表２を参照。
アフェレーシス手順
臨床施設の標準業務手順書（ＳＯＰ）に従って、ＰＢＭＣを最大連続３日間収集する。標的とするＣＤ３４＋細胞は、薬物製品の製造用に少なくとも１５×１０６ＣＤ３４＋細胞とする。より低い収集標的は、可能な場合は後で調べることができる。薬物製品で生着しない場合のレスキュー療法のためのバックアップとして、追加の２×１０６ ＣＤ３４＋細胞／ｋｇを収集する。バックアップ細胞の収集は、第３段階（ブスルファン前処置）に進む前に行わなければならない。
１回目の動員及びアフェレーシスサイクルで、最少の薬物製品及び安全策バックアップの両方のための十分な細胞が得られない場合、または対象がＶＯＣ（複数可）によりアフェレーシスを完了することができない場合は、追加の細胞を収集するために２回の追加の動員及びアフェレーシスサイクルが許容される。
追加の動員サイクルは、先の動員サイクルの初日から１４日以後であって先のサイクルの終了から６０日後までに開始することとする。メディカルモニターは、製造施設で受け取ったＣＤ３４＋細胞の数及び製造された薬物製品用量に基づき、追加の動員サイクルが必要かを臨床施設に知らせる。治験責任医師は、製造またはバックアップ用の細胞の最少用量に到達していないか、または対象に追加の動員サイクルが必要かについて、メディカルモニターと連絡を取ることとする。
アフェレーシス手順に関連する任意のＡＥは、施設の標準的ガイドラインに従って管理することとする。
細胞は、最初及び２回目の収集日の終わりに輸送することとする。バックアップ用量用に収集した細胞は凍結保存し、試験施設で保管する。輸送及び受取りに関する追加の詳細及び指示内容は、試験レファレンスマニュアルに含まれている。
前処置：ブスルファン投与
ブスルファンは、１日１回連続４日間、開始用量３．２ｍｇ／ｋｇ／日（ブスルファン投与初日以前の３〜７日以内に収集した体重に基づく）でＩＶ投与する。１日１回の投与が好ましいスケジュールであるが、施設の標準的なやり方に従い、ｑ６ｈで投与するようにブスルファン用量レジメンを調整してもよい。ブスルファン用量を予め決定するために、骨髄破壊を開始する３０（±）２日前にブスルファンの試験用量を実施してもよい。
ブスルファンの用量は、ブスルファン初回用量のＰＫに基づき、骨髄破壊の適切なレベルを維持するように調整することができる。４日間の開始用量３．２ｍｇ／ｋｇ／日の対象における平均標的ＡＵＣは、５０００μＭ・／分（範囲：４５００〜５５００）であり、標的累積ブスルファン曝露９０ｍｇ・時間／Ｌ（範囲８０１００ｍｇ・時間／Ｌ）に相当する。ブスルファンをｑ６ｈで４日間投与する対象におけるＡＵＣは、１１２５μＭ・分（範囲：９００〜１３５０）である。
ブスルファン前処置中は、病院ガイドラインに従って抗発作予防法及び他の支持療法を開始することとする。
薬物製品注入
薬物製品は、注入バイアル（複数可）で供給する。薬物製品を含有する全てのバイアル（複数可）を注入することとする。さらなる詳細は、レファレンスマニュアルで提供される。
有効性の主要エンドポイントの解析
薬物製品は、特に赤血球中のＨｂＦの生成を増加させるために開発された細胞製品である。末梢血中のＨｂＦレベルを測定することにより、薬物製品の投与による意図された結果を直接評価する。
有効性の主要エンドポイントは、「ＨＵを用いた処置の不在下で、薬物製品注入の６ヵ月後を起点に、少なくとも３ヵ月間のＨｂＦ≧２０％」である。対象は、ＨＵを用いた処置の不在下で、解析時に、薬物製品注入の６ヵ月後を起点に少なくとも３ヵ月間ＨｂＦレベル≧２０％である場合、有効性の主要エンドポイントを満たしたとみなされる。
主にＣＳＳＣＤ及びＭＳＨデータの再解析に基づき、ＨｂＦ閾値２０％を主要エンドポイントとして選択した。これらの解析は、疼痛発作の相対的リスクとＨｂＦレベルとの間の反比例関係を示しており、ＨｂＦレベル≧２０％では疼痛発作のリスクが非常に低い。詳細には、回帰モデルは、ＨｂＦ濃度２０％における（ＨｂＦ濃度０％と比較しての）ＶＯＣリスク低減を予測しており、ＣＳＳＣＤデータに基づけば８７．３％（９５％ ＣＩ：８３．０％、９１．５％）、ＭＳＨデータに基づけば８１．５％（９５％ ＣＩ：７０．５％、９２．５％）の低減となっている。
また、閾値２０％は、ＨＵを用いた処置の指針となる閾値を見いだすためにＨｂＦレベルとＳＣＤ関連事象との関係を解析した２件の観察研究でも支持されている。ＨＵを投与していない成人２７２例において行われた過去の試験では、ＨｂＦレベルが高いほど合併症が少なく、著者らは、意味のある臨床的利益をもたらすにはＨｂＦレベル２０％の達成が必要であると結論付けた。ＳＣＤを有する小児２３０例において行われ、ＨＵを用いて処置したより最近のプロスペクティブ試験（ヒドロキシウレアの長期効果試験（ＨＵＳＴＬＥ））では、ＨｂＦ値＜２０％の場合、小児が血管閉塞及び急性胸部症候群を含めた何らかの理由で入院する可能性は２倍であり、発熱で入院する可能性は４倍を超えた。著者らは、このデータは、ＨｂＦ＞２０％を標的とするのが好ましい投与戦略であることを示唆していると結論付けた。
有効性の副次エンドポイントの解析
重症ＶＯＣの年率におけるベースラインからの相対的変化を各対象について計算し、要約する。
・薬物製品注入後に重症ＶＯＣの年率がベースラインから少なくとも５０％低減した対象の割合を、対応する正確な９５％ ＣＩで示す。
・薬物製品注入後に重症ＶＯＣの年率がベースラインから少なくとも６５％低減した対象の割合を、対応する９５％ ＣＩで示す。
・ＶＯＣ事象なしを達成する対象の割合を、対応する正確な９５％ ＣＩで示す。
・重症ＶＯＣによる入院の年率換算期間におけるベースラインからの変化を要約する。
・解析時に、薬物製品注入の３ヵ月後を起点に少なくとも３ヵ月間のＨｂＦ≧２０％を達成する対象の割合を、正確な９５％ ＣＩで示す。
・解析時に、薬物製品注入時を起点に少なくとも３ヵ月間のＨｂＦ≧２０％を達成する対象の割合を、正確な９５％ ＣＩで示す。
・ＨｂＦ及びＨｂ濃度を、経時的な連続変数として要約する。
・ＳＣＤ関連徴候のために輸血するＲＢＣ単位数の相対的変化を要約する。
・ＰＲＯの変化を、経時的な連続変数として要約する。
・末梢血白血球中に存在する意図された遺伝子改変によるアレルの割合を、経時的な連続変数として要約する。
・骨髄細胞中に存在する意図された遺伝子改変によるアレルの割合を、経時的な連続変数として要約する。
探索的エンドポイントの解析
・４つの溶血マーカー（網状赤血球数、ＡＳＴの血清中濃度、ＬＤＨ、及び総ビリルビン）の主成分分析による測定における溶血指数の変化を、経時的な連続変数として要約する。
・ＴＲＶの変化を、経時的な連続変数として要約する。
・Ｆ細胞を発現する循環赤血球の割合の変化を、経時的な連続変数として要約する。
・炎症マーカーの変化を、経時的な連続変数として要約する。
・内皮活性化マーカーの変化を、経時的な連続変数として要約する。
安全性解析
ＡＥを、ＭｅｄＤＲＡに従ってコード化する。
安全性解析対象集団に基づいた解析には、以下のものが含まれる。
・薬物製品注入後４２日以内に好中球が生着した対象の割合
・好中球生着時間
・血小板生着時間
・インフォームドコンセント署名から２４ヵ月目来院までのＡＥ、臨床検査値、及びバイタルサイン。
・薬物製品注入後１００日以内及び１年以内のＴＲＭ発生率。ＴＲＭは、治験責任医師により、移植手順に関連する可能性があると評価された死亡として定義される。
・総死亡率
ＡＥ及び処置下で発現したＡＥを有する対象の数及びパーセンテージを、以下の期間：ＩＣＦ署名から動員開始まで、動員からブスルファン前処置開始まで、ブスルファン前処置から薬物製品注入開始まで、及び薬物製品注入から注入後２４ヵ月までに従って、表形式で重症度及び重篤度別に要約する。
好中球生着時間（移植からＡＮＣ≧５００／μＬとなる連続した３日のうちの初日として定義される）をカプラン・マイヤー法によって解析する。生着不良は、薬物製品注入後、またはバックアップ幹細胞投与後４２日目までに好中球の生着を達成しないこととして定義される。生着不良の対象の数及びパーセンテージを要約する。
血小板生着時間（過去７日間で移植を伴わずに血小板≧２０，０００／μＬとなる連続した３日のうちの初日として定義される）をカプラン・マイヤー法によって評価する。
臨床検査値異常（正常範囲外の値、及び有害事象共通用語規準［ＣＴＣＡＥ］グレードによるもの）も表にする。
薬物製品注入後１００日及び１年以内におけるＴＲＭの対象の数及びパーセンテージを要約する（ＴＲＭは、治験責任医師により、少なくとも移植手順に関連する可能性があると評価された死亡として定義される）。治験責任医師により、死亡に至るＳＡＥと移植との間の関連性が評価される。ＳＡＥが少なくとも移植手順に関連する可能性があると評価された場合、その死亡例は移植関連として分類される。
統計解析
本試験は、当初は最大１２例の対象を組み入れて、薬物製品の安全性及び有効性の予備的評価を提供する。本試験は、合計最大４５例の対象を含めるように拡大することができる。このサンプルサイズの拡大によって少なくとも９０％の検出力がもたらされ、解析時、薬物製品注入後少なくとも３ヵ月間のＨｂＦ≧２０％に対する真の応答率が７５％であるときに、応答率５０％が除外される。
２つの中間解析（ＩＡ）を用いた群逐次試験手順を拡大試験で使用して、圧倒的有効性の早期評価を可能にする。
解析時に、薬物製品注入の６ヵ月後を起点に少なくとも３ヵ月間のＨｂＦ≧２０％を達成する対象の割合を、正確な９５％ ＣＩで示す。
キーとなる有効性の副次エンドポイントである、重症ＶＯＣの年率におけるベースラインからの相対的変化を要約する。
連続変数は、以下の記述的要約統計量：対象者数（ｎ）、平均、ＳＤ、中央値、最小値（ｍｉｎ）、及び最大値（ｍａｘ）を用いて要約する。
カテゴリー変数は、数及びパーセンテージを用いて要約する。パーセンテージは小数第１位まで提示する。
推定値の不確かさはＣＩによって評価する。全ての対象者データを対象データリストに提示する。リストは、対象が試験薬投与を受けたかどうかにかかわらず、組み入れた集団内の全ての対象を表示する。縦断的データは、データの性質に応じて、毎月または年４回などの適切な時間間隔によって提示する。
ベースライン値は、別段の指定がない限り、スクリーニング中及び動員を開始する前に収集された、（予定されたまたは予定外の）最も最近の欠測でない測定値として定義される。
重症ＶＯＣ事象の回数について、処置前のベースラインは、組入れ前の２年間における年当たりの平均重症ＶＯＣ事象回数として定義される。ベースラインは、ＩＣＦに署名する前の２年間における全ての重症ＶＯＣ事象の記録を用いて計算する。
薬物製品注入後から試験終了（２４ヵ月目）までに発生した全ての重症ＶＯＣ事象は、薬物製品後の重症ＶＯＣ事象として取り込む。全ての薬物製品注入前後の重症ＶＯＣ事象はＥＡＣによって判定され、基礎疾患のＳＣＤと関連し急性の併発事象（例えば、急性の出血または感染症）とは関連しない重症ＶＯＣ事象のみが、ＶＯＣの年率におけるベースラインからの変化を評価するために含められる。
ベースラインからの変化（絶対的変化）は、ベースライン後の値−ベースライン値として計算する。
ベースラインからの相対的変化は、１００％×（ベースライン後の値−ベースライン値）／ベースライン値として計算し、パーセンテージで表す。
処置下発現（ＴＥ）期間は、薬物製品注入から最終試験来院までの時間を含む。
薬物製品注入後感染症の予防及び監視
薬物製品注入後、対象は、ＨＳＣＴについての現地のガイドライン及び治験責任医師の判断に従って、感染症の監視及び予防法（細菌性、ウイルス性、真菌性）を受けることができる。
対象が薬物製品注入後に敗血症または全身性菌血症を発症した場合、適切な培養及び医学的管理を開始する。
患者報告アウトカム
ＰＲＯ評価は、インフォームドコンセントを得た後の最初の評価として実施することとし、さらに試験来院の冒頭で、いかなる評価にも先行して対象が完了させることとする。
例示的な実施例に関する注記
本開示は、本発明の様々な態様及び／または潜在的用途を例示する目的で、様々な特定の態様における説明を提供しているが、バリエーション及び改変が生じ得ることが当業者には理解される。したがって、本明細書に記載の発明（単数または複数）は、少なくとも特許請求される内容と同じ範囲で理解されるべきであり、本明細書で提供される特定の例示的態様によって定義されるより狭い範囲で理解されるべきではない。
本明細書で特定された任意の特許、刊行物、または開示資料は、別段の指示がない限り、ただし、援用される資料が、既存の説明、定義、記載、または本明細書で明示的に記された他の開示資料と矛盾しない程度において、その全体が参照により本明細書に援用される。そのため、また必要な程度において、本明細書に記載された明示的開示は、参照により援用されたいかなる矛盾する資料にも優先される。参照により本明細書に援用されると述べられ、ただし既存の定義、記載、または本明細書に記載された他の開示資料と矛盾する任意の資料またはその一部は、この援用された資料と既存の開示資料との間に矛盾が生じない範囲に限って援用される。出願人らは、本明細書を修正して、参照により本明細書に援用される任意の主題またはその一部を明示的に挙げる権利を留保する。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、本発明に対し必須である組成物、方法、及びこれらのそれぞれの構成要素（複数可）に関して使用され、ただし、必須であるかそうでないかにかかわらず、指定されていないエレメントを含むことに対する制限はない。
「〜から本質的になる」という用語は、所与の態様に必要とされるエレメントを指す。この用語は、本発明の態様の基本的かつ新規または機能的特徴（複数可）に実質的な影響を及ぼさない追加のエレメントの存在を許容する。
「〜からなる」という用語は、本明細書に記載の組成物、方法、及びこれらのそれぞれの構成要素を指し、態様の記載に挙げられていないエレメントはいずれも除外される。
文脈による明確な別段の定めがない限り、単数形「ａ」、「ａｎ、及び「ｔｈｅ」には複数の指示対象が含まれる。
本明細書で挙げられている任意の数値範囲は、挙げられた範囲内に含まれる同じ数値的精度（すなわち、指定の桁の同じ数字）の全てのサブ範囲を記述しているものとする。例えば、「１．０〜１０．０」と挙げられた範囲は、挙げられた最小値の１．０から挙げられた最大値の１０．０の間（両端の値を含む）の全てのサブ範囲を記述しているものとし、例えば、「２．４〜７．６」という範囲が明細書の本文に明示的に挙げられていない場合であっても「２．４〜７．６」を記述しているものとする。したがって、出願人は、本明細書内に明示的に挙げられた範囲内で含まれる同じ数値的精度の任意のサブ範囲を明示的に挙げる目的で、請求項を含めて本明細書を修正する権利を留保する。全てのこのような範囲は本来的に本明細書に記載されており、任意のこのようなサブ範囲を明示的に挙げるための修正は、米国特許法第１１２条（ａ）及び欧州特許条約第１２３（２）条の要件を含めて、書面の記載、記載の十分性、及び追加事項要件に従うことになる。また、明示的な記載がないまたは文脈により別段の要求がない限り、本明細書に記載の全ての数値パラメーター（例えば、値、範囲、量、パーセンテージなどを表現するもの）は、「約」という語が明示的に数字の前に出現しない場合であっても、「約」という語が手前に置かれているかのように読み取ってもよい。加えて、本明細書に記載の数値パラメーターは、報告された有効数字の数、数値精度に照らして、そして通常の丸め技法を適用することによって、解釈されるべきである。また、本明細書に記載の数値パラメーターは、パラメーターの数値の決定に使用された基礎的測定技法における固有の可変性の特徴を必然的に所持することも理解される。
また、明確に反対のことが示されない限り、本明細書で特許請求される２つ以上のステップまたは行為を含む任意の方法において、当該方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも当該方法のステップまたは行為が記載されている順序に限定されるとは限らない。
請求項及び上記明細書において、全ての移行句、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」「保有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」「有する（ｈａｖｉｎｇ）」「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」「〜から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）」などはオープンエンドであること、すなわち後に続くものを含むがそれに限定されないことを意味するものと理解されるべきである。「〜からなる」「〜から本質的になる」という移行句のみが、米国特許商標庁審査基準の２１１１．０３節に記載のように、それぞれクローズドまたはセミクローズドな移行句であるものとする。
数値の手前にある「約」及び「実質的に」という用語は、記載された数値の±１０％を意味する。
値の範囲が示される場合、範囲の上端と下端との間の各値は、本明細書において具体的に企図され記載されている。

Claims (85)

  1. ヒトＢ細胞リンパ腫１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子の赤血球系統特異的エンハンサー内の＋５８ ＤＮアーゼＩ高感受性部位（ＤＨＳ）内に遺伝子改変を含むＣＤ３４＋ヒト造血幹・前駆細胞（ｈＨＳＰＣ）を含む、組成物。
  2. 血清を実質的に含まない凍結保存培地、５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及び／またはデキストラン−４０をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記遺伝子改変がインデルを含む、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記遺伝子改変が、ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣに、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子の前記＋５８ ＤＨＳを標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを送達することによって生成される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
  5. 前記ｇＲＮＡが、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記ｇＲＮＡが、３つの２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオアート残基を、それぞれの５’及び３’末端に、またはその付近に含む、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはそのバリアントである、請求項４〜６のいずれか１項に記載の組成物。
  8. 前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣが、０．１〜０．５のγ／（γ＋α）−グロビンｍＲＮＡ比の増加を示す、及び／または前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣが、０．２〜０．６のγ／（γ＋β）−グロビンｍＲＮＡ比の増加を示す、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
  9. 前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣが、１５％〜５０％のＨｂＦ／（ＨｂＦ＋ＨｂＡ）タンパク質レベルのＨｂＦ平均パーセンテージを示す、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
  10. 前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣが、７０％〜９０％の平均アレル編集頻度を示す、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
  11. 前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの少なくとも７５％が、対象への前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与後少なくとも１６週間、多系統分化能を維持する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
  12. 前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣが、少なくとも４０％のオンターゲットインデル率を示す、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
  13. 前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣが、少なくとも８０％のオンターゲットインデル率を示す、請求項１２に記載の組成物。
  14. 前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣが、５％未満のオフターゲットインデル率を示す、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
  15. 前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣが、１％未満のオフターゲットインデル率を示す、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
  16. 前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの単回用量を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
  17. 前記単回用量が、少なくとも２×１０６改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ／ｋｇを含む、請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記遺伝子改変が、前記ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣに、Ｎ末端ＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含むＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはそのバリアントを送達することによって生成される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
  19. 前記Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはそのバリアントが、Ｃ末端ＮＬＳ、任意選択でＣ末端ＳＶ４０ ＮＬＳをさらに含む、請求項１８に記載の組成物。
  20. 配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに含む、請求項１８または１９に記載の組成物。
  21. 前記ｇＲＮＡ：前記エンドヌクレアーゼの重量比が１：１である、請求項２０に記載の組成物。
  22. ヘモグロビン異常症を有する対象に、ヒトＢ細胞リンパ腫１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子の赤血球系統特異的エンハンサー内の＋５８ ＤＮアーゼＩ高感受性部位（ＤＨＳ）内に遺伝子改変を含むＣＤ３４＋ヒト造血幹・前駆細胞（ｈＨＳＰＣ）の用量を投与することを含む方法であって、前記ｈＨＳＰＣが、ベースラインとの対比で、前記対象に投与される輸血回数を低減するのに、及び／または前記対象における胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）レベルを少なくとも２０％まで増加させるのに有効な量で投与される、前記方法。
  23. （ａ）ヘモグロビン異常症を有する対象における幹細胞を動員することと、
    （ｂ）ステップ（ａ）の後に、前記対象からＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣを収集することと、
    （ｃ）ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球系統特異的エンハンサー内の＋５８ ＤＮアーゼＩ高感受性部位（ＤＨＳ）内に遺伝子改変を含む改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣを生成することと、
    （ｄ）前記対象に、ステップ（ｃ）の前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの用量を、ベースラインとの対比で、前記対象に投与される輸血回数を低減するのに、及び／または前記対象における胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）レベルを少なくとも２０％まで増加させるのに有効な量で投与することとを含む、方法。
  24. ステップ（ａ）が、前記対象に、ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体の阻害剤を投与することを含み、任意選択で、前記ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体の阻害剤がプレリキサホルである、請求項２３に記載の方法。
  25. ステップ（ａ）が、前記対象に、顆粒球コロニー刺激因子を投与することをさらに含む、請求項２３または２４に記載の方法。
  26. 前記対象に、赤血球を投与することをさらに含む、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記赤血球が、ステップ（ａ）の前及び／またはステップ（ｂ）の後に投与される、請求項２６に記載の方法。
  28. 少なくとも１５×１０６ ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ／ｋｇがステップ（ｂ）で収集される、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記対象に、ブスルファンを投与することをさらに含む、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記ブスルファンが、ステップ（ｃ）の後であってステップ（ｄ）の前に投与される、請求項２９に記載の方法。
  31. ブスルファンの静脈内用量４ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇが１日１回４日間投与される、または静脈内用量０．５ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇが６時間ごとに４日間投与される、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記用量が、薬物動態レベルに基づき、曲線下面積（ＡＵＣ）４５００〜５５００μＭ／分、好ましくは５０００μＭ／分を達成するように調整される、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記遺伝子改変がインデルである、請求項２２〜３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記遺伝子改変が、前記ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣに、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子の前記＋５８ ＤＨＳを標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを送達することによって生成される、請求項２２〜３１のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記ｇＲＮＡが、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記ｇＲＮＡが、３つの２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオアート残基を、それぞれの５’及び３’末端に、またはその付近に含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 好中球の生着が、前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与後３５〜４５日以内に前記対象内で発生する、請求項２２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 好中球の生着が、前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与後４２日以内に前記対象内で発生する、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記ヘモグロビン異常症がβ−サラセミアである、請求項２２〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記対象が、前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与時期の２年の期間内、または前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与時期の後の２年の期間内に、前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与時期の前の２年の期間との対比で、より少ない輸血回数を必要とする、請求項２２〜４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記対象が、前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与の３ヵ月後を起点に、前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与から少なくとも３ヵ月間の輸血低減または輸血非依存を達成する、請求項２２〜４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記対象が、前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与の３ヵ月後を起点に、前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与から少なくとも６ヵ月間の輸血低減または輸血非依存を達成する、請求項２２〜４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記対象が、前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与の３ヵ月後を起点に、前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与から少なくとも１２ヵ月間の輸血低減または輸血非依存を達成する、請求項２２〜４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記対象において、以下から選択されるアッセイ：疼痛スケール（１１点の数値評価スケール［ＮＲＳ］）、ＥｕｒｏＱｏｌクオリティーオブライフスケール（ＥＱ ５Ｄ ５Ｌ）、がん治療−骨髄移植の機能評価（ＦＡＣＴ−ＢＭＴ）、患者報告アウトカム測定情報システム（ＰＲＯＭＩＳ）−疲労、ＰＲＯＭＩＳ−認知機能、及び成人鎌状赤血球クオリティーオブライフ測定システム（ＡＳＣＱ−Ｍｅ）のうちの少なくとも１つを用いて、患者報告アウトカム（ＰＲＯ）の経時的な変化が認められる、請求項２２〜４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記対象において、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）による評価において、ベースラインとの対比で鉄過剰のパラメーターの減少が認められる、請求項２２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記対象において、血清フェリチンレベルの変化による評価において、ベースラインとの対比で鉄過剰のパラメーターの経時的な減少が認められる、請求項２２〜４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記鉄過剰のパラメーターの減少が、肝臓鉄濃度（ＬＩＣ）及び／または心臓鉄量（ＣＩＣ）の減少を含む、請求項４６または４７に記載の方法。
  49. 前記対象が、前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与時期の２〜５年の期間内、または前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与時期の後の２〜５年の期間内に、前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与時期の前の２〜５年の期間との対比で鉄キレート療法を必要としない、請求項２２〜４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. 前記ヘモグロビン異常症が鎌状赤血球症である、請求項２２〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  51. 前記対象の前記ＨｂＦレベルが、前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与時期の任意の時点または投与時期の後を起点に少なくとも３ヵ月間、少なくとも２０％である、請求項２２〜３９または５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. 前記対象の前記ＨｂＦレベルが、前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与時期の任意の時点を起点に少なくとも６ヵ月間、少なくとも２０％である、請求項２２〜３９または５０〜５１のいずれか１項に記載の方法。
  53. 前記対象の前記ＨｂＦレベルが、前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与の３ヵ月後を起点に少なくとも３ヵ月間、少なくとも２０％である、請求項２２〜３９または５０〜５２のいずれか１項に記載の方法。
  54. 前記対象の前記ＨｂＦレベルが、前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与の６ヵ月後を起点に少なくとも３ヵ月間、少なくとも２０％である、請求項２２〜３９または５０〜５３のいずれか１項に記載の方法。
  55. 前記対象の前記ＨｂＦレベルが、二次薬物を用いた処置の不在下で少なくとも２０％である、請求項２２〜３９または５０〜５４のいずれか１項に記載の方法。
  56. 前記二次薬物がヒドロキシウレア（ＨＵ）である、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与の６ヵ月後を起点に、重症血管閉塞発作（ＶＯＣ）の年率におけるベースラインからの相対的変化が認められる、請求項２２〜３９または５０〜５６のいずれか１項に記載の方法。
  58. 前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与の６ヵ月後を起点に、ＶＯＣの年率におけるベースラインからの少なくとも５０％の低減が認められる、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与の６ヵ月後を起点に少なくとも１２ヵ月間のＶＯＣの不在が認められる、請求項５７または５８に記載の方法。
  60. 前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与の６ヵ月後を起点に少なくとも２４ヵ月間のＶＯＣの不在が認められる、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記対象において、以下から選択されるアッセイ：疼痛スケール（１１点の数値評価スケール［ＮＲＳ］）、ＥｕｒｏＱｏｌクオリティーオブライフスケール（ＥＱ ５Ｄ ５Ｌ）、がん治療−骨髄移植の機能評価（ＦＡＣＴ−ＢＭＴ）、患者報告アウトカム測定情報システム（ＰＲＯＭＩＳ）−疲労、ＰＲＯＭＩＳ−認知機能、及び成人鎌状赤血球クオリティーオブライフ測定システム（ＡＳＣＱ−Ｍｅ）のうちの少なくとも１つを用いて、患者報告アウトカム（ＰＲＯ）の経時的な変化が認められる、請求項２２〜３９または５０〜６０のいずれか１項に記載の方法。
  62. 前記対象において、以下の４つの溶血マーカー：網状赤血球数、アスパラギン酸トランスアミナーゼの血清中濃度、乳酸デヒドロゲナーゼ［ＬＤＨ］、及び総ビリルビンの主成分分析による測定において、溶血指数の経時的な変化が認められる、請求項２２〜３９または５０〜６１のいずれか１項に記載の方法。。
  63. 前記対象において、三尖弁逆流ジェット速度（ＴＲＶ）の経時的な変化が認められる、請求項２２〜３９または５０〜６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 前記対象に赤血球を投与することをさらに含み、前記赤血球が、前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣを投与する前記ステップの前に投与される、請求項２２〜３９または５０〜６３のいずれか１項に記載の方法。
  65. 前記対象が、前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣを投与する前記ステップの前に赤血球（ＲＢＣ）輸血を受けている、請求項２２〜３９または５０〜６４のいずれか１項に記載の方法。
  66. 前記対象が、総Ｈｂの３０％未満のヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）レベルを有する、請求項２２〜３９または５０〜６５のいずれか１項に記載の方法。
  67. 前記対象が、１１ｇ／ｄＬ以下の総Ｈｂ濃度を有する、請求項２２〜３９または５０〜６６のいずれか１項に記載の方法。
  68. 前記対象において、ある期間にわたり、胎児ヘモグロビンを発現する循環赤血球（Ｆ細胞）の割合の増加が認められ、任意選択で少なくとも１０％の増加が認められる、請求項２２〜６７のいずれか１項に記載の方法。
  69. 前記対象において、ある期間にわたり、炎症及び内皮活性化マーカーの変化が認められる、請求項２２〜６８のいずれか１項に記載の方法。
  70. 前記対象において、ある期間にわたり、末梢血白血球中に存在する前記遺伝子改変を伴うアレルの割合の変化が認められる、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記対象において、ある期間にわたり、骨髄細胞中に存在する前記遺伝子改変を伴うアレルの割合の変化が認められる、請求項２２〜７０のいずれか１項に記載の方法。
  72. 前記期間が、前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与から少なくとも３ヵ月である、請求項６８〜７１のいずれか１項に記載の方法。
  73. 前記期間が、前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与から少なくとも６ヵ月である、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣが、０．１〜０．５のγ／（γ＋α）−グロビンｍＲＮＡ比の増加を示す、及び／または前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣが、０．２〜０．６のγ／（γ＋β）−グロビンｍＲＮＡ比の増加を示す、請求項２２〜７３のいずれか１項に記載の方法。
  75. 前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣが、１５％〜５０％のＨｂＦ／（ＨｂＦ＋ＨｂＡ）タンパク質レベルのＨｂＦ平均パーセンテージを示す、請求項２２〜７４のいずれか１項に記載の方法。
  76. 前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣが、０．４以上の（γ＋β）／α−グロビンｍＲＮＡ比を示す、請求項２２〜７５のいずれか１項に記載の方法。
  77. 前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣが、７０％〜９０％の平均アレル編集頻度を示す、請求項２２〜７６のいずれか１項に記載の方法。
  78. 前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの少なくとも５０％が、前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与後少なくとも１６週間、多系統分化能を維持する、請求項２２〜７７のいずれか１項に記載の方法。
  79. 前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣが、少なくとも４０％のオンターゲットインデル率を示す、請求項２２〜７８のいずれか１項に記載の方法。
  80. 前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣが、少なくとも８０％のオンターゲットインデル率を示す、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記対象が、前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣの投与から生じる新生物性及び／または骨髄増殖性病変を示さない、請求項２２〜８０のいずれか１項に記載の方法。
  82. 前記用量が、少なくとも２×１０６改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ／ｋｇである、請求項２２〜８１のいずれか１項に記載の方法。
  83. 前記用量が、少なくとも３×１０６改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣ／ｋｇである、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記対象にプレリキサホルを投与することをさらに含み、赤血球が、前記改変ＣＤ３４＋ ｈＨＳＰＣを投与する前記ステップの前に投与される、請求項２２〜８３のいずれか１項に記載の方法。
  85. 前記対象に、顆粒球コロニー刺激因子を投与することをさらに含む、請求項２２〜８４のいずれか１項に記載の方法。
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