JP2021505587A - Crispr−cas9改変cd34+ヒト造血幹・前駆細胞及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2017年12月5日に出願された米国仮出願第62/594,689号、2018年4月27日に出願された米国仮出願第62/664,023号、2018年5月15日に出願された米国仮出願第62/671,770号、2018年9月21日に出願された米国仮出願第62/734,431号、及び2018年9月21日に出願された米国仮出願第62/734,543号における米国特許法第119条(e)下の恩典を主張するものであり、これらの各内容は、その全体において参照により本明細書に援用される。
βサラセミア
本開示の態様は、ベータサラセミア(βサラセミア)を処置する(例えば、症状及び/または臨床的徴候を緩和する)ための方法を提供する。ベータサラセミアは、ヘモグロビンの生成を低減する血液障害である。ヘモグロビンは、全身の細胞に酸素を運ぶ、赤血球中の鉄含有タンパク質である。ベータ−グロビンの欠如は、機能的ヘモグロビン量の低減につながる。
1)溶血によって、全身に酸素を有効に運搬するのに十分な赤血球及びHbが不足する;
2)細胞膜の酸化的損傷により赤血球前駆体のアポトーシスがもたらされ、そのため無効造血がもたらされる;ならびに
3)無効造血により、脾腫、骨髄増殖、付随する骨変形、及び鉄過剰などの病的状態に至る。
本開示の態様は、鎌状赤血球症(SCD)を治療する(例えば、症状及び/または臨床的徴候を緩和する)ための方法を提供する。鎌状赤血球症は、体内の細胞に酸素を供給する赤血球中の分子、ヘモグロビンに影響を及ぼす障害の一群である。この障害を有する対象は、ヘモグロビンSと呼ばれる非定型のヘモグロビン分子を有し、このヘモグロビンSによって赤血球は鎌状または三日月の形状に変形し得る。
本開示の一部の態様は、対象、例えば、β−サラセミア、鎌状赤血球症、または他のヘモグロビン異常症を有する対象における胎児ヘモグロビンレベルを上昇させる方法を提供する。赤血球は、主に、細胞の内外にガスを運搬する機能を果たしている。これは、ガスと結合する能力を有するヘモグロビンの構造構成要素によって促進される。発達の段階に応じて、ヒト体内で3つのタイプのヘモグロビンが合成される。胚ヘモグロビンは出生前に生成され、胎児ヘモグロビン(HbF)は胎児期に生成され、成人ヘモグロビンは出生後に生成される。胎児ヘモグロビン(HbF、α2γ2)は、ヒト胎児における主な酸素運搬タンパク質であり、アルファ(α)サブユニット及びガンマ(γ)サブユニットを含む。HbFは、生後約6ヵ月で発現しなくなる。成人ヘモグロビン(HbA、α2β2)は、生後約34週のヒトにおける主な酸素運搬タンパク質であり、アルファ(α)サブユニット及びベータ(β)サブユニットを含む。34週後、発生スイッチによってγ−グロブリン遺伝子の転写が減少しβ−グロブリン遺伝子の転写が増加する。ベータ鎖のグルタミン酸が6位においてバリンに置換されることにより、鎌状赤血球障害が生じる。ヘモグロビンS(HbS)と呼ばれるこの変化は、異常ヘモグロビンである。HbSは低酸素濃度に曝露されると、沈殿して、両凹の円盤ではなく鎌状に見える細長い結晶となる。鎌状赤血球症は血管における閉塞事象を特徴とし、この閉塞事象によって疼痛、臓器不全、そして場合によって死がもたらされる。ヘモグロビン異常症の多くの形態が、十分な量の正常なβ−グロビンを生成できない、または正常なβ−グロビンを完全に生成できないことによる結果であるため、γ−グロビン(HbF)の発現を増加させることによってβ−グロビン疾患の重症度が緩和されることになる。
一部の実施形態において、本開示の細胞(例えば、CD34+ hHSPC)は、ヒトB細胞リンパ腫11A(BCL11A)遺伝子の赤血球系統特異的エンハンサー内の+58 DNアーゼI高感受性部位(DHS)内に遺伝子改変を含む。BCL11Aはγグロビン遺伝子発現の転写サイレンサーであり、したがってHbFの負の修飾物質である(Menzel S et al.Nature Genetics.2007;39(10):1197−9;Lettre G et al.PNAS.2008;105(33):11869−74;及びUda M et al.PNAS.2008;105(5):1620−5を参照。これらのそれぞれは、全体が本明細書に援用される)。BCL11Aは2番染色体上にあり、60,451,167〜60,553,567塩基対(bp)(GRCh38)を範囲とする。この遺伝子はジンクフィンガー転写因子をコードする。ジンクフィンガー転写因子は、胎児ヘモグロビン(HbF)を抑制し生後約6週に始まるHbF発現を下方調節する。BCL11A遺伝子は、102.4kbのゲノムDNAに及ぶ4つのエキソンを含み、転写因子GATA−1に対するイントロン2内の結合ドメインを含む。GATA−1結合はBCL11A発現を向上させ、ひいてはHbF発現を抑制する。イントロン2は複数のDNアーゼI高感受性部位(DHS)を含有し、これには転写開始点からのキロベースの距離に基づき+55、+58、及び+62と呼ばれる部位が含まれる。この領域内の天然SNPが、BCL11A発現の減少や胎児Hbレベルの増加と関連付けられている。これらSNPは、3つのDNA高感受性部位、+55 DHS、+58 DHS、及び+62 DHSの周囲に編成されている。3つの領域のうち、+58 DHS領域は、胎児Hbレベルの増加に関連した主要な領域であるように思われ、またGATA1転写制御領域も有する。
一般にゲノム編集とは、ゲノムのヌクレオチド配列を改変するプロセスを指し、正確な方法または所定の方法で行われることが好ましい。本明細書に記載のゲノム編集方法の例としては、部位特異的ヌクレアーゼを使用してゲノム内の正確な標的位置でデオキシリボ核酸(DNA)を切断することにより、ゲノム中の特定の位置で1本鎖または2本鎖のDNA切断を創出する方法が挙げられる。このような切断は、近年Cox et al.,Nature Medicine 21(2),121−31(2015)で概説されているように、相同組換え修復(HDR)及びNHEJなどの天然の内因性細胞プロセスによって修復され得るものであり、また通常はそのように修復される。これら2つの主なDNA修復プロセスは、代替経路のファミリーからなる。NHEJは2本鎖切断から生じたDNA末端を直接連結するが、時としてヌクレオチド配列の損失または付加を伴い、遺伝子発現を分断するまたは向上させる可能性がある。HDRは、定義されたDNA配列を切断ポイントで挿入するためのテンプレートとして、相同配列、すなわちドナー配列を利用する。相同配列は、姉妹染色分体などの内因性ゲノム内に存在してもよい。代替的に、ドナーは外因性核酸であってもよく、例えば、ヌクレアーゼ切断される座位と相同性が高い領域を有し、ただし切断される標的座位に組み込むことができる追加の配列または配列変化(欠失を含む)も含有し得るプラスミド、1本鎖オリゴヌクレオチド、2本鎖オリゴヌクレオチド、デュプレックスオリゴヌクレオチド、またはウイルスであってもよい。第3の修復機構としては、少数の欠失及び挿入が切断部位で起こり得る点において遺伝子的結果がNHEJと同様のマイクロホモロジー媒介末端結合(MMEJ)(「代替的NHEJ」とも呼ばれる)が考えられる。MMEJは、DNA切断部位に隣接する少数の塩基対の相同配列を利用してさらに好ましいDNA末端修復結果を推進することができ、最近の研究ではこのプロセスにおける分子機構がさらに明らかになっている(例えば、Cho and Greenberg,Nature 518,174−76(2015);Kent et al.,Nature Structural and Molecular Biology,Adv.Online doi:10.1038/nsmb.2961(2015);Mateos−Gomez et al.,Nature 518,254−57(2015);Ceccaldi et al.,Nature 528,258−62(2015)を参照)。場合によっては、DNA切断部位における潜在的マイクロホモロジーの解析に基づいて、あり得る修復結果を予測することが可能であると考えられる。
CRISPR(クラスター化された規則的間隔の短回文のリピート(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats))ゲノム座位は、多くの原核生物(例えば、細菌及び古細菌)のゲノム内で見いだすことができる。原核生物において、CRISPR座位は免疫システムの1タイプとして機能する産物をコードして、原核生物をウイルス及びファージなどの外部侵入者から防御する一助となる。CRISPR座位機能には3つの段階が存在する:CRISPR座位への新規配列の統合、CRISPR RNA(crRNA)の発現、及び外部侵入者核酸のサイレンシング。5つのタイプのCRISPRシステム(例えば、I型、II型、III型、U型、及びV型)が特定されている。
II型CRISPRシステムにおけるcrRNAバイオジェネシスは、本質的にトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)を必要とする。tracrRNAは、内因性のRNアーゼIIIによって改変し、次にpre−crRNAアレイにおけるcrRNAリピートとハイブリダイズさせることができる。内因性のRNアーゼIIIは、pre−crRNAの切断に動員することができる。切断されたcrRNAは、エキソリボヌクレアーゼのトリミングに供して成熟crRNA形態を生成することができる(例えば、5’トリミング)。tracrRNAはcrRNAとハイブリダイズしたままでいることができ、tracrRNA及びcrRNAは部位特異的ポリペプチド(例えば、Cas9)と会合する。crRNA−tracrRNA−Cas9複合体のcrRNAは、crRNAとハイブリダイズし得る標的核酸まで複合体を誘導することができる。crRNAと標的核酸とのハイブリダイズは、標的核酸の切断のためにCas9を活性化させ得る。II型CRISPRシステムにおける標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)と呼ばれる。本質的に、PAMは部位特異的ポリペプチド(例えば、Cas9)と標的核酸との結合を容易にするために不可欠である。II型システム(NmeniまたはCASS4とも呼ばれる)は、さらにII型A(CASS4)及びII型B(CASS4a)に細分される。Jinek et al.,Science,337(6096):816−821(2012)では、CRISPR/Cas9システムがRNAプログラム可能なゲノム編集に有用であることが示され、国際特許出願公開第WO2013/176772号では、部位特異的遺伝子編集のためのCRISPR/Casエンドヌクレアーゼシステムにおける多数の例及び応用が提供されている。
例示的なCRISPR/Casポリペプチドとしては、Fonfara et al.,Nucleic Acids Research,42:2577−2590(2014)の図1にあるCas9ポリペプチドが挙げられる。CRISPR/Cas遺伝子命名システムは、Cas遺伝子が発見されて以来、多くの書き換えを経てきた。Fonfara(上記)の図5に、様々な種からのCas9ポリペプチドのPAM配列が示されている。
部位特異的ポリペプチドとは、DNA切断のためにゲノム編集で使用されるヌクレアーゼのことである。部位特異的ヌクレアーゼまたはポリペプチドは、1つ以上のポリペプチドとして、またはポリペプチドをコードする1つ以上のmRNAとして、細胞または患者に投与することができる。
本開示は、関連ポリペプチド(例えば、部位特異的ポリペプチド)の活性を標的核酸中の特定の標的配列に向けることができるゲノム標的化核酸を提供する。ゲノム標的化核酸は、RNAであり得る。ゲノム標的化RNAは、本明細書では「ガイドRNA」または「gRNA」と呼ばれる。ガイドRNAは、目的の標的核酸配列とハイブリダイズする少なくとも1つのスペーサー配列及びCRISPRリピート配列を含むことができる。II型システムにおいては、gRNAはtracrRNA配列と呼ばれる第2のRNAも含む。II型ガイドRNA(gRNA)においては、CRISPRリピート配列及びtracrRNA配列は、互いにハイブリダイズしてデュプレックスを形成する。V型ガイドRNA(gRNA)においては、crRNAがデュプレックスを形成する。両方のシステムにおいて、このデュプレックスは部位特異的ポリペプチドに結合し、それによってガイドRNA及び部位特異的ポリペプチドは複合体を形成することができる。ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドとの会合によって、複合体に標的特異性を提供することができる。したがって、ゲノム標的化核酸は部位特異的ポリペプチドの活性を向けることができる。
ゲノム標的化核酸の一部の例において、スペーサー延長配列は、活性を改変し、安定性を提供し、及び/またはゲノム標的化核酸が改変を行う位置を提供することができる。スペーサー延長配列は、オンもしくはオフターゲット活性または特異性を改変することができる。一部の例において、スペーサー延長配列が提供され得る。スペーサー延長配列は、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、1000、2000、3000、4000、5000、6000、または7000、またはそれ以上のヌクレオチドを超える長さを有することができる。スペーサー延長配列は、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000またはそれ以上のヌクレオチド未満の長さを有することができる。スペーサー延長配列は、10ヌクレオチド長未満であってもよい。スペーサー延長配列は、10〜30ヌクレオチド長であってもよい。スペーサー延長配列は、30〜70ヌクレオチド長であってもよい。
スペーサー配列は、目的の標的核酸の配列とハイブリダイズする。ゲノム標的化核酸のスペーサーは、ハイブリダイズによる配列特異的な方法(すなわち、塩基対合)で、標的核酸と相互作用することができる。スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の配列に応じて変動し得る。
最小CRISPRリピート配列は、参照CRISPRリピート配列(例えば、S.pyogenesからのcrRNA)に対し、少なくとも約30%、約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、または100%の配列同一性を有する配列であり得る。
最小tracrRNA配列は、参照tracrRNA配列(例えば、S.pyogenesからの野生型tracrRNA)に対し、少なくとも約30%、約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、または100%の配列同一性を有する配列であり得る。
一部の場合において、最小CRISPR RNAと最小tracrRNAとの間のデュプレックスに「バルジ」が存在することがある。バルジとは、デュプレックス中のヌクレオチドにおける対合していない領域のことである。バルジは、デュプレックスが部位特異的ポリペプチドと結合する一助となり得る。バルジは、デュプレックスの一方の側に対合していない5’−XXXY−3’(式中、Xは任意のプリンであり、Yは対向鎖上のヌクレオチドとゆらぎ対合を形成することができるヌクレオチドを含む)と、二重鎖の他方の側に対合していないヌクレオチド領域とを含むことができる。デュプレックスの2つの側における対合していないヌクレオチドの数は異なり得る。
様々な例において、1つ以上のヘアピンは、3’tracrRNA配列内で最小tracrRNAに対し3’側に位置することができる。
3’tracrRNA配列は、参照tracrRNA配列(例えば、S.pyogenesからのtracrRNA)に対し、少なくとも約30%、約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、または100%の配列同一性を有する配列を含むことができる。
tracrRNA延長配列は、tracrRNAが単一分子ガイドの文脈にあるか二重分子ガイドの文脈にあるかにかかわらず提供することができる。tracrRNA延長配列は、約1ヌクレオチド〜約400ヌクレオチドの長さを有することができる。tracrRNA延長配列は、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、または400ヌクレオチドを超える長さを有することができる。tracrRNA延長配列は、約20〜約5000またはそれ以上のヌクレオチドの長さを有することができる。tracrRNA延長配列は、1000ヌクレオチドを超える長さを有することができる。tracrRNA延長配列は、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、またはそれ以上のヌクレオチド未満の長さを有することができる。tracrRNA延長配列は、1000ヌクレオチド未満の長さを有することができる。tracrRNA延長配列は、10ヌクレオチド長未満を含むことができる。tracrRNA延長配列は、10〜30ヌクレオチド長であってもよい。tracrRNA延長配列は、30〜70ヌクレオチド長であってもよい。
単一分子ガイド核酸のリンカー配列は、約3ヌクレオチド〜約100ヌクレオチドの長さを有することができる。例えば、Jinek et al.(上記)では、シンプルな4ヌクレオチドの「テトラループ」(−GAAA−)が使用された(Science,337(6096):816−821(2012))。例示的なリンカーは、約3ヌクレオチド(nt)〜約90nt、約3nt〜約80nt、約3nt〜約70nt、約3nt〜約60nt、約3nt〜約50nt、約3nt〜約40nt、約3nt〜約30nt、約3nt〜約20nt、約3nt〜約10ntの長さを有する。例えば、リンカーは、約3nt〜約5nt、約5nt〜約10nt、約10nt〜約15nt、約15nt〜約20nt、約20nt〜約25nt、約25nt〜約30nt、約30nt〜約35nt、約35nt〜約40nt、約40nt〜約50nt、約50nt〜約60nt、約60nt〜約70nt、約70nt〜約80nt、約80nt〜約90nt、または約90nt〜約100ntの長さを有することができる。単一分子ガイド核酸のリンカーは、4〜40ヌクレオチドであってもよい。リンカーは、少なくとも約100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、または7000、またはそれ以上のヌクレオチドであってもよい。リンカーは、最大で約100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、または7000、またはそれ以上のヌクレオチドであってもよい。
特定の参照座位に対する5’境界及び/または3’境界の位置のシフトを使用して、特定のゲノム編集応用を容易にするまたは向上させることができ、このシフトは部分的には当該編集向けに選択されるエンドヌクレアーゼシステムに依存し、これについて本明細書でさらに説明し例示する。
一部の場合において、細胞に導入するポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞における活性、安定性、もしくは特異性を向上させ、送達を変更し、自然免疫応答を低減するために、または本明細書でさらに説明する当技術分野で公知の他の向上のために、個々にまたは組み合わせて使用され得る1つ以上の改変を含むことができる。
部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、目的の標的DNAを含有する細胞内での発現のために、当技術分野で標準の方法に従ってコドン最適化することができる。例えば、意図された標的核酸がヒト細胞内にある場合、Cas9ポリペプチド生成用にCas9をコードするヒトのコドン最適化ポリヌクレオチドを使用することが企図される。
ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチド(例えば、Cas9などの核酸誘導ヌクレアーゼ)と相互作用して、複合体を形成する。ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドを標的核酸に誘導する。
部位特異的ポリペプチド及びゲノム標的化核酸は、細胞または患者にそれぞれ別々に投与することができる。その一方で、部位特異的ポリペプチドは、1つ以上のゲノム標的化核酸(ガイドRNA、sgRNA、またはtracrRNAと一緒にしたcrRNA)と予め複合体化されてもよい。次に予め複合体化された材料を細胞または患者に投与することができる。このような予め複合体化された材料は、リボ核タンパク質粒子(RNP)として知られている。RNP内の部位特異的ポリペプチドは、例えば、Cas9エンドヌクレアーゼとすることができる。部位特異的ポリペプチドは、N末端、C末端、またはN末端及びC末端の両方で1つ以上の核局在化シグナル(NLS)に隣接していてもよい。例えば、Cas9エンドヌクレアーゼは、2つのNLS(一方のNLSはN末端に位置し、第2のNLSはC末端に位置する)に隣接していてもよい。NLSは、当技術分野で知られている任意のNLS(例えば、SV40 NLS)とすることができる。RNP内のゲノム標的化核酸:部位特異的ポリペプチドの重量比は1:1とすることができる。例えば、RNP内のsgRNA:Cas9エンドヌクレアーゼの重量比は1:1とすることができる。例えば、sgRNAは、配列番号1または2の核酸配列を含むことができ、Cas9エンドヌクレアーゼがN末端SV40 NLS及びC末端SV40 NLSを含むS.pyogenes Cas9であってもよく、sgRNA:Cas9エンドヌクレアーゼの重量比は1:1とすることができる。
本開示は、本開示のゲノム標的化核酸をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、及び/または本開示の方法の態様を実施するために必要な任意の核酸またはタンパク質性分子を提供する。
ガイドRNAポリヌクレオチド(RNAもしくはDNA)及び/またはエンドヌクレアーゼポリヌクレオチド(複数可)(RNAもしくはDNA)は、当技術分野で公知のウイルスまたは非ウイルス送達ビヒクル、例えばエレクトロポレーション、機械力、細胞変形(SQZ Biotech)、及び細胞膜透過性ペプチドによって送達することができる。代替的に、エンドヌクレアーゼポリペプチド(複数可)は、当技術分野で公知のウイルスまたは非ウイルス送達ビヒクル、例えばエレクトロポレーションまたは脂質ナノ粒子によって送達することができる。さらに代替的な態様において、DNAエンドヌクレアーゼは、単体で、または1つ以上のガイドRNAと共に、もしくはtracrRNAと一緒の1つ以上のcrRNAと共に予め複合体化させて、1つ以上のポリペプチドとして送達することができる。
一部の実施形態において、CRISPR−Cas9を用いた遺伝子編集を使用して、CD34+ヒト造血幹・前駆細胞(hHSPC)及び誘導多能性幹細胞(iPSC)内の2番染色体上の非コードBCL11A赤血球系統特異的エンハンサー内に、高い特異性及び頻度で改変を創出することができ、これにより、天然に存在する遺伝性胎児ヘモグロビン遺残症(HPFH)関連バリアントと同様の表現型がもたらされる。このような遺伝子改変はHbFの生成を増加させ、ひいてはβ−グロビン疾患の重症度を緩和する。
本開示のガイドRNAは、医薬的に許容される賦形剤(例えば、担体、溶媒、安定化剤、アジュバント、希釈剤など)を用いて、特定の投与様式及び剤形に応じて製剤化することができる。ガイドRNA組成物は、生理的適合性のpHを達成するように製剤化することができ、製剤及び投与経路に応じて、約3のpH〜約11のpH、約pH3〜約pH7を範囲とすることができる。一部の場合において、pHは約pH5.0〜約pH8の範囲に調整することができる。一部の場合において、当該組成物は、治療有効量の本明細書に記載の少なくとも1つの化合物を、1つ以上の医薬的に許容される賦形剤と共に含むことができる。任意選択で、当該組成物は、本明細書に記載の化合物の組合せを含むことができ、または細菌成長の処置または予防に有用な第2の活性成分(例えば、以下に限定されないが、抗菌剤または抗微生物剤)を含むことができ、または本開示の試薬の組合せを含むことができる。
オンターゲット部位及び推定上のオフターゲット部位をシークエンシングするために、適切な増幅プライマーを特定することができ、このようなプライマーとの反応は、トランスフェクションから3日後の処理された細胞からQuickExtract DNA抽出溶液(Epicentre)を用いて回収したゲノムDNAを用いてセットアップすることができる。増幅プライマーは、アダプターが隣接する遺伝子特異的部分を含有する。フォワードプライマーの5’末端は、改変フォワード(リード1)プライマー結合部位を含む。リバースプライマーの5’末端は、組み合わせられた改変リバース(リード2)及びバーコードプライマー結合部位を逆向きで含有する。個々のPCR反応は、アガロースゲル上で分離することによって検証し、次に精製し再増幅することができる。第2ラウンドのフォワードプライマーは、Illumina P5配列の次に改変フォワード(リード1)プライマー結合部位の一部を含有する。第2ラウンドのリバースプライマーは、Illumina P7配列(5’末端)の次に6塩基バーコードならびに組み合わされた改変リバース(リード2)及びバーコードプライマー結合部位を含有する。第2ラウンドの増幅も、アガロースゲル上でチェックし、次に精製し、NanoDrop分光光度計を用いて定量化することができる。増幅産物は、プールして濃度をマッチさせ、次にライブラリー調製及びIllumina Miseq機器によるシークエンシングのためにEmory Integrated Genomic coreに提出することができる。
Cas9及びガイドRNAの組合せにおけるオンターゲット及びオフターゲット切断活性は、NHEJによる2本鎖切断の不完全修復から得られる変異率を用いて測定することができる。
本明細書で説明し例示するように、ヘモグロビン異常症の緩和に関して、ゲノム編集の主な標的はヒト細胞である。例えば、ex vivoの方法では、ヒト細胞は体細胞であってもよく、体細胞は説明の方法を用いて改変した後に前駆細胞(例えば、CD34+ hHSPC)を生じ得る。例えば、in vivoの方法では、ヒト細胞は骨髄細胞、造血前駆細胞、またはCD34+細胞であってもよい。
本明細書に記載の遺伝子操作されたヒト細胞は、人工多能性幹細胞(iPSC)であり得る。iPSCを使用する利点は、当該細胞が、前駆細胞を投与する同じ対象に由来し得ることである。すなわち体細胞は、対象から取得し、人工多能性幹細胞に初期化し、次に対象に投与する前駆細胞(例えば、自家細胞)に再分化させることができる。前駆体は本質的に自家供給源に由来するため、別の対象または別の対象群からの細胞を使用することに比べると、移植拒絶反応またはアレルギー応答のリスクが低減され得る。加えて、iPSCを使用することで胚供給源から細胞を得る必要性がなくなる。そのため一態様では、本開示の方法で使用される幹細胞は胚幹細胞ではない。
一部の実施形態において、本開示のex vivoの方法における1つのステップは、患者特異的iPS細胞、患者特異的iPS細胞、または患者特異的iPS細胞株の創出を伴い得る。患者特異的iPS細胞の創出については、Takahashi and Yamanaka 2006;Takahashi,Tanabe et al.2007に記載のように、当技術分野において多くの確立した方法が存在する。例えば、創出するステップは、a)患者から体細胞(例えば、皮膚細胞または線維芽細胞)を単離することと、b)多能性細胞になるよう誘導するために、体細胞に多能性関連遺伝子のセットを導入することとを含み得る。多能性関連細胞のセットは、OCT4、SOX2、KLF4、Lin28、NANOG、及びcMYCからなる群から選択される1つ以上の遺伝子であってもよい。
一部の実施形態において、生検または吸引液とは、身体から採取された組織または体液の試料のことである。生検または吸引液には多くの様々な種類が存在する。そのほぼ全てが、鋭利な道具を使用して少量の組織を取り出すことを伴う。生検が皮膚または他の敏感な部位である場合、最初に痺れ薬を適用することができる。生検または吸引液は、当技術分野で公知の方法のいずれかに従って実施することができる。例えば、骨髄穿刺液の場合、大型の針を使用して骨盤に侵入させ、骨髄を採取する。
間葉系幹細胞は、例えば患者の骨髄または末梢血から、当技術分野で公知の任意の方法に従い単離することができる。例えば、骨髄穿刺液をヘパリンと共にシリンジに収集することができる。細胞は洗浄し、Percoll(商標)で密度勾配遠心分離することができる。血球、肝細胞、間質細胞、マクロファージ、肥満細胞、及び胸腺細胞などの細胞は、Percoll(商標)を用いて分離することができる。当該細胞は、10%のウシ胎児血清(FBS)を含有するダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(低グルコース)内で培養することができる(Pittinger MF,Mackay AM,Beck SC et al.,Science 1999;284:143−147)。
造血前駆細胞は、当技術分野で公知の任意の方法によって、患者から単離することができる。CD34+細胞は、例えば、CliniMACS(登録商標)Cell Selection System(Miltenyi Biotec)を用いて、豊富化することができる。CD34+細胞は、ゲノム編集前に、例えば、血清フリー培地(例えば、CellGrow SCGM培地、CellGenix)内でサイトカイン(例えば、SCF、rhTPO、rhFLT3)を用いて、弱く刺激することができる。
一部の実施形態において、本開示の遺伝子改変細胞はヒト造血幹・前駆細胞(hHSPC)である。この幹細胞系統は、赤血球系(赤血球(erythrocyte)または赤血球(red blood cell)(RBC))、骨髄系(単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、巨核球/血小板、ならびに樹状細胞)、及びリンパ系(T細胞、B細胞、NK細胞)を含めた全ての血球タイプをもたらす。血球は、ごく小規模な多能性造血幹細胞(HSC)集団の増殖及び分化によって生成され、この集団は自己再生によって自己を補充する能力も有する。分化中、HSCの後代は様々な中間的成熟段階を通じて進行し、多分化能かつ系統決定された前駆細胞を産生してから成熟に到達する。骨髄(BM)は、ヒトにおける主要な造血部位であり、正常条件下において、末梢血(PB)中には少数の造血幹・前駆細胞(HSPC)が見いだされ得るに過ぎない。サイトカイン(詳細には顆粒球コロニー刺激因子;G−CSF)や、がんの処置で使用される一部の骨髄抑制薬物や、造血細胞とBM間質細胞との相互作用を分断する化合物を用いた処置により、多数の幹・前駆細胞を迅速に循環中に動員することができる。本開示の一部の実施形態において、幹細胞動員を改善するためにG−CSFが対象内で使用され、一方他の実施形態においてはプレリキサホル(Mozobil(登録商標))が使用される。一部の実施形態において、プレリキサホルがG−CSFと組み合わせて使用される。プレリキサホルは、以下でより詳細に論じられる。
「遺伝子改変細胞」という用語は、(例えば、CRISPR/Cas9システムを用いて)ゲノム編集によって導入された少なくとも1つの遺伝子改変を含む細胞を指す。本明細書の一部のex vivoの例において、遺伝子改変細胞は遺伝子改変前駆細胞(例えば、CD34+ hHSPC)であり得る。本明細書の一部のin vivoの例において、遺伝子改変細胞は遺伝子改変造血前駆細胞(例えば、CD34+ hHSPC)であり得る。本明細書では、外因的ゲノム標的化核酸及び/またはゲノム標的化核酸をコードする外因的核酸を含む遺伝子改変細胞が企図されている。
一部の実施形態において、本開示におけるex vivoの方法の別のステップは、ゲノム編集されたiPSCを造血前駆細胞に分化させることを含むことができる。分化させるステップは、当技術分野において公知の任意の方法に従って実施することができる。
一部の実施形態において、本開示におけるex vivoの方法の別のステップは、ゲノム編集された間葉系幹細胞を造血前駆細胞に分化させることを含むことができる。分化させるステップは、当技術分野において公知の任意の方法に従って実施することができる。
本開示の薬物製品は、CRISPR−Cas9媒介遺伝子編集によって改変された自家CD34+ hHSPCを含む細胞製品である。CRISPR−Cas9遺伝子編集の標的は、BCL11A遺伝子の赤血球系統特異的エンハンサー領域であり、これは2番染色体上のエキソン2と3との間のイントロン2上にある。編集は、高度に特異的なガイドRNA(例えば、配列番号1または配列番号2を含むまたはそれからなるgRNA)を用いて創出され、ガイドRNAは、BCL11Aの赤血球系統特異的エンハンサー領域(DNアーゼI高感受性部位+58(DHS+58)として識別される)にある重要な転写因子結合部位(GATA1)を標的とする(例えば、WO2017/182881(この全体が参照により本明細書に援用される)を参照)。gRNA−エンドヌクレアーゼRNP(例えば、gRNA−Cas9 RNP)は、一部の実施形態において、本開示の細胞(例えば、CD34+ hHSPC)内に、当技術分野で公知のウイルスまたは非ウイルス送達機構(例えば、エレクトロポレーション)を用いて、送達または導入される。細胞内に送達した後、RNPは、配列依存的方式でDNAにDSBを導入する。NHEJによるDSBの修復により、GATA1結合を分断するように意図されたDNAインデルがもたらされ、それによってBCL11A転写が低下し、γ−グロビン及びHbFのレベルが同時に増加する。gRNA−Cas9 RNPが、BCL11Aの非コード赤血球系統特異的エンハンサー領域を正確に標的とし、BCL11Aコード配列自体は標的としないため、理論に束縛されるものではないが、赤血球系統のみの細胞内のBCL11A遺伝子及びタンパク質の発現レベルを修飾し、非赤血球造血系統には影響を及ぼさないことが予想される。
本明細書では、本開示の一部の態様において、ヘモグロビン異常症を有する患者を処置する方法が提供される。このような方法の一態様は、iPSCを用いたex vivoの細胞ベース療法である。例えば、患者特異的人工多能性幹細胞(iPSC)が創出され得る。次に、本明細書に記載の材料及び方法を用いてこのiPS細胞の染色体DNAを編集することができる。次に、ゲノム編集されたiPSCを造血前駆細胞に分化させることができる。最後に、この造血前駆細胞を患者に植え込むことができる。
一部の実施形態において、本開示におけるex vivoの方法の別のステップは、細胞を患者に植え込むことを含むことができる。この植え込みステップは、当技術分野で公知の任意の植え込み方法を用いて達成することができる。例えば、遺伝子改変細胞は、患者の血液に直接注射するか、または別の方法で患者に投与することができる。遺伝子改変細胞は、選択マーカーを用いてex vivoで精製することができる。
一部の実施形態において、本開示の処置方法は、自家幹細胞移植手順を含む。「自己由来」という用語は、手順に使用されるドナー細胞が対象(患者)からのものであることを意味する。本明細書では、CD34+ hHSPCを対象から取得し、CRISPR−Cas9遺伝子編集を用いて改変し、同じ対象に投与する。概して、本明細書で提供される自家幹細胞移植手順は、幹細胞の動員をもたらす(幹細胞を刺激して骨髄腔から血流に移動させる)(少なくとも1つの)動員剤(例えば、プレリキサホル及び/またはG−CSF)の投与(例えば、注射)と、アフェレーシスを用いた血液からの動員幹細胞の収集と、CRISPR−Cas9遺伝子編集を用いた幹細胞の改変(例えば、BCL11A遺伝子のイントロン2内の改変)と、対象への改変幹細胞の送達とを含む。
プレ動員期間と呼ばれる期間中、対象(例えば、SCDを有する対象)は、一部の実施形態において、赤血球(RBC)輸血を受けることができる。例えば、RBC輸血は、動員の開始予定時の8(±2)週間前に開始することができ、対象がブスルファン前処置を開始するまで継続することができる。このようなRBC輸血の目標は、一部の実施形態において、総Hb濃度≦11g/dLを保ちながらヘモグロビンS(HbS)レベル<総Hbの30%を標的とすることである。したがって、一部の実施形態において、本開示の方法は、必要に応じて、幹細胞動員の前に、または処置中の任意の他の時点で、対象に赤血球を投与することを含む。
末梢血中には少数のHSPCが見られるに過ぎないため、造血細胞と骨髄間質細胞との相互作用を分断する様々な異なる薬剤を使用して、多数の幹・前駆細胞を迅速に循環中に動員することができる。このような薬剤の非限定的な例としては、サイトカイン(例えば、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF))、がんの処置で使用されるいくつかの骨髄抑制薬物、及び造血細胞と骨髄間質細胞との相互作用を分断する他の化合物が挙げられる。一部の実施形態において、薬剤はプレリキサホル(MOZOBIL(登録商標))である。
動員が最適レベルに到達すると、幹細胞が、主にアフェレーシスによって収集される。アフェレーシス開始のための確立された閾値は様々であり得るが、典型的には5〜20(例えば、5、10、15、または20)CD34+細胞/ミリリットルとすることができる。末梢血CD34+数は、動員の有効性を推定するのに有用であるが、可変であり得る。一部の実施形態において、少なくとも15×106 CD34+ hHSPC/kgが、例えばアフェレーシスによって収集される。一部の実施形態において、1×106〜1×108 CD34+ hHSPC/kgが収集される。
骨髄破壊的化学療法は、骨髄を再建するために、通常、骨髄または幹細胞の移植の前に行われる。
本明細書で企図されている、前駆細胞(例えば、CD34+ hHSPC)を対象に投与するex vivoの方法は、前駆細胞(例えば、CD34+ hHSPC)を含む治療組成物の使用を伴い得る。
「投与する」「導入する」及び「移植する」という用語は、細胞(例えば、CD34+ hHSPCなどの前駆細胞)を対象に配置する文脈で互換的に使用され、所望の効果(複数可)を生じさせるために、所望部位(例えば、損傷または修復の部位)で導入細胞の少なくとも部分的な局在化がもたらされるような方法または経路が用いられる。細胞(例えば、CD34+ hHSPCなどの前駆細胞またはその分化した後代)は、植え込まれる細胞または細胞の構成要素の少なくとも一部が生存できる対象内の所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与することができる。対象への投与後における細胞の生存期間は、数時間という短期間であることもあれば、例えば、24時間から数日、さらに数年という長期間であることもあれば、さらに患者の生涯にわたる、すなわち長期移植であることもある。例えば、本明細書に記載の一部の態様において、有効量の筋原性前駆細胞は、全身の投与経路、例えば腹腔内または静脈内経路を介して投与される。
様々な適応症に対する自家移植は、典型的には、生着をサポートするために少なくとも2〜2.5×106 CD34+細胞/kgを使用する。SCD試験における全ての対象の生着を確実に行うため、自家移植向けの典型的な最少用量よりも20%〜50%高い保存的最少用量3×106改変CD34+ hHSPC/kgが使用され得る。理論に束縛されるものではないが、骨髄破壊後のより多数のCD34+幹細胞の注入は、より迅速な生着、耐久性、及び処置の効果に結び付く。一部の実施形態において、より低い用量もより高い用量も使用され得る。例えば、対象に、2×106、2.5×106、3×106、3.5×106、4×106、4.5×106、5×106、5.5×106、6×106、6.5×106、7×106、7.5×106、8×106、8.5×106、9×106、9.5×106、1×107、1.5×107、2×107改変CD34+hHSPC/kgが投与され得る。一部の実施形態において、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、または1×108改変CD34+ hHSPC/kgが投与され得る。
本開示は、本明細書に記載の方法を実施するためのキットを提供する。キットは、ゲノム標的化核酸、ゲノム標的化核酸をコードするポリヌクレオチド、部位特異的ポリペプチド、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び/または本明細書に記載の方法の諸態様を実施するために必要な任意の核酸もしくはタンパク質性分子、またはこれらの任意の組合せのうちの1つ以上を含むことができる。
以下の有効性及び毒性の非臨床試験を行った。
β−サラセミア患者(β+/β+ 2例、β0/β0 1例)の試料中で高頻度のアレル編集を再現し、gRNA−RNP編集後にβ+/β+では0.42及び0.58、ならびにβ0/β0では0.41のガンマ/α−グロビンmRNA比が得られた。また、gRNA−RNP処置群においては、β+/β+では73%及び79%、ならびにβ0/β0では92%のHbF(HbF+HbA)タンパク質レベルの上昇が得られ、これに対し非処置対照群において、β+/β+では24及び50%、ならびにβ0/β0では68%の上昇であった。さらなるβ−サラセミア患者(β+/β0)の試料中のレベルも測定した。gRNA−RNP編集後のγ/α−グロビンmRNA比は0.42であり、gRNA−RNP編集後のHbF/(HbF+HbA)タンパク質レベルは81%であった。これに対し、未処置対照群におけるγ/α−グロビンmRNA比は0.18、未処置対照群におけるHbF/(HbF+HbA)タンパク質レベルは61%であった。gRNA−RNP編集による結果的なγ−グロビンmRNA及びHbFレベルの増加は、HPFHを有する患者の過去の事例に見られるレベルと比較した場合、臨床的に意味のあるものである。
鎌状赤血球症患者試料中で高頻度のアレル編集を再現し、0.53のγ/(γ+β)−グロビンmRNA比(SD±0.085、n=9)及び40%のHbF(HbF/(HbF+HbA))タンパク質レベルの平均パーセンテージ(SD±9.2%、n=3)が得られた(図4)。
第1/2相安全性及び効果試験を行って、輸血依存性β−サラセミアを有する対象における自家CRISPR−Cas9改変CD34+ヒト造血幹・前駆細胞(hHSPC)(薬物製品)の単回用量の安全性及び有効性を評価する(主要目的)。薬物製品の注入の疾患特異的事象及び臨床的状態に及ぼす効果を評価し、遺伝子編集効率を定量化する(副次的目的)。さらに、バイオマーカーにおける、薬物製品の効果を特徴付け、処置アウトカムを予測する能力も評価する(探索的目的)。この試験は、最初は最大12例の対象を含め、試験に組み入れる対象を30例以上に拡大することが可能である。本試験に組み入れる対象は、書類で立証された非β0/β0輸血依存性β−サラセミアを有する18〜35歳(インフォームドコンセント時の年齢)とする。本試験は、小児集団(例えば、18歳未満)にまで拡大することができる。
・書類で立証されたホモ接合性β−サラセミア(β0/β0遺伝型を除く)、または複合ヘテロ接合性β−サラセミア(β−サラセミア/ヘモグロビンE(HbE)を含む)。
・少なくとも100mL/kg/年または10単位/年の濃縮赤血球輸血を2年の期間にわたり受けていること。
対象は、試験の組入れに適格であるためには、以下の基準の全てを満たさなくてはならない。
1.対象は、インフォームドコンセント用紙(ICF)に署名し日付を記入する。
2.インフォームドコンセントの日付時点で18〜35歳の対象。
3.以下によって定義される輸血依存性β−サラセミアの診断:
a.書類で立証されたホモ接合性β−サラセミア(β0/β0遺伝型を除く)、または複合ヘテロ接合性β−サラセミア(β−サラセミア/ヘモグロビンE(HbE)を含む)。対象は、過去のデータに基づいて組み入れることができるが、ブスルファン前処置の前に試験中央検査室を用いての遺伝型の確認が必要となる。HbVarデータベースを用いてβ0/β0遺伝型が定義されている。
b.本試験の同意を示す前の2年の期間にわたり、少なくとも100mL/kg/年または10単位/年の濃縮赤血球輸血を受けている。
4.カルノフスキー・パフォーマンス・ステータス≧80%。
5.治験責任医師の判断により自家幹細胞移植に適格である。
6.同意以前の少なくとも2年間の濃縮RBC輸血に関する詳細な診療記録(濃縮RBCの体積または単位、関連する輸血前Hb値、及び入院を含む)にアクセスできる。
7.妊娠可能な(初潮後であり、無処置の子宮及び少なくとも1つの卵巣を有し、閉経から1年未満である)女性対象は、同意時より薬物製品注入から6ヵ月以後まで、許容できる避妊方法(複数可)の使用に同意しなければならない。
8.男性対象は、動員開始より薬物製品注入から6ヵ月以後まで有効な避妊法を使用することに同意しなければならない。
9.予定された来院、処置計画、検査室検査、避妊ガイドライン、及び他の試験手順を遵守する意思及び能力がある。
10.本試験の完了後、追加の長期追跡調査研究に参加する意思がある。
以下の基準のいずれかを満たす対象は、組入れに不適格である。
1.10/10ヒト白血球抗原(HLA)適合の血縁ドナーが利用可能。
2.以前にHSCTを受けている。
3.関連するα−サラセミア及び>1アルファ鎖欠失を有する対象。
4.β0/β0サラセミア遺伝型または鎌状赤血球サラセミアバリアントを有する対象。
5.治験責任医師により、臨床的に重大かつ活動性のウイルス、真菌、または寄生虫の感染症と判定されている。
6.白血球(WBC)数<3×109/Lまたは血小板数<50×109であり、治験責任医師により、脾機能亢進とは無関係であると判断されている。
7.重大な出血系障害の病歴。
8.試験の結果と交絡するか、または対象に追加的リスクをもたらす恐れがあると治験責任医師が考える、任意の疾患または任意の臨床的状態の病歴。これには、限定されるものではないが、関連薬物のアレルギー、心血管もしくは中枢神経系の疾患の病歴、臨床的に重大な病態の病歴もしくは存在、精神疾患の病歴、または家族性がん症候群の病歴が含まれ得る。
9.任意の悪性腫瘍もしくは骨髄増殖性障害を以前有したか現在有する、または重大な免疫不全障害を有する。
10.以下のように定義される進行性肝疾患:
a.アスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)、アラニントランスアミナーゼ(ALT)>3×正常値上限(ULN)、もしくは直接ビリルビン値>2×ULN、または
b.ベースラインプロトロンビン時間(PT)(国際標準比[INR])>1.5×ULN、または
c.肝硬変の病歴もしくは線維性架橋形成の任意のエビデンス、もしくは肝生検における活動性肝炎
11.MRIによる心臓T2*<10ms、または心エコー図による左室駆出分画(LVEF)<45%。
12.ベースライン推算糸球体濾過量<60mL/分/1.73m2。
13.肺における一酸化炭素の拡散能(DLco)<予測値の50%(ヘモグロビン及び/または肺胞体積に対し補正)。
14.遺伝子療法/編集製品を用いた処置を以前受けている。
15.プレリキサホルまたはブスルファンに対する不耐性、禁忌、または既知の感受性。以前、薬物製品の賦形剤(ジメチルスルホキシド[DMSO]、デキストラン)に対するアナフィラキシー反応が生じている。
16.ヒト免疫不全ウイルス−1(HIV−1)またはヒト免疫不全ウイルス−2(HIV−2)、B型肝炎ウイルス(HBV)(B型肝炎コア抗体[HBcAb]もしくは核酸検査[NAT])、またはC型肝炎ウイルス(HCV)(NAT)について血清学的検査陽性である。細胞プロセッシングのための局所検査により求められる梅毒または他の任意の感染性疾患マーカーについて血清学的検査陽性である。
17.治験薬物/製品を用いた別の臨床試験に参加しており、スクリーニングから30日以内または治験薬剤の半減期の5倍未満(スクリーンからより長期間経っている方)である。
18.治験責任医師により、プロトコルに概説された試験手順を遵守する能力がないと判断された対象。
19.妊娠中または授乳中の女性。
この期間中、選択基準を満たす対象は、卵母細胞または精子の凍結保存による妊孕性温存を受ける選択肢を有する。
各対象に、G−CSF製品(例えば、フィルグラスチム)及びプレリキサホルを組み合わせて幹細胞動員を行う。末梢血単核球(PBMC)をアフェレーシスによって収集する。対象に連続2日間または3日間のアフェレーシスを行って、CD34+ hHSPCを収集する。標的とするCD34+細胞収集は、薬物製品を製造するための最少標的用量3×106 CD34+細胞/kgを達成するために、少なくとも15×106 CD34+細胞/kgである。薬物製品で生着しない場合のレスキュー療法のためのバックアップとして、追加の2×106 CD34+細胞/kgを収集する。1回目の動員及びアフェレーシスサイクルで、最少の薬物製品及び安全策バックアップの両方のための十分な細胞が得られない場合、または対象がアフェレーシスを完了することができない場合は、追加の細胞を収集するために最大2回の追加の動員及びアフェレーシスサイクルが許容される。追加の動員サイクルは、先の動員サイクルの初日から14日以後であって先のサイクルの終了から60日後までに開始する。
第3A段階 − 骨髄破壊的前処置:
施設で薬物製品を受け取り、バックアップ細胞が保管されていて利用可能であることを確認した後に、対象を入院させ、ブスルファンを用いた骨髄破壊的前処置を行う。ブスルファンは、1日1回、開始用量3.2mg/kg/日(ブスルファン開始の3〜7日前に収集した体重に基づく)で連続4日間静脈内に(IV)投与する。1日1回の投与が好ましいスケジュールであるが、施設の標準的なやり方に従い、6時間ごとに(Q6H)投与するようにブスルファン投与レジメンを調整してもよい。ブスルファンの用量は、ブスルファン初回用量の薬物動態(PK)に基づき、骨髄破壊の適切なレベルを維持するように調整する。開始用量3.2mg/kg/日を4日間投与する対象における平均標的曲線下面積(AUC)は、5000μM*/分(範囲:4500〜5500μM*分)であり、標的累積ブスルファン曝露90mg×時間/L(範囲80〜100mg×時間/L)に相当する。ブスルファンをQ6Hで4日間投与する対象における平均標的AUCは1125μM*分(範囲:900〜1350μM*分)である。
第4A段階 − 注入後の入院中追跡調査:移植部門内で毎日対象を経過観察し、造血幹細胞移植(HSCT)を受ける対象のための標準的なやり方に従って支持ケアを行う。対象のAE及び生着をモニターする。HSCTを受ける患者に対する標準的なやり方/治験責任医師の判断に従って、対象に濃縮RBC及び血小板輸血を投与する。対象は、好中球が生着し(連続3日間のANC≧500/μLとして定義される)、現地の病院のガイドライン及び/または治験責任医師の判断に従って主な医学的問題が安定化したら、移植部門から退院する。
様々な適応症に対する自家移植は、典型的には、生着をサポートするために少なくとも2〜2.5×106 CD34+細胞/kgを使用する。SCD試験における全ての対象の生着を確実に行うため、自家移植向けの典型的な最少用量よりも20%〜50%高い保存的最少用量3×106CD34+細胞/kgを選択した。原理上、骨髄破壊後のより多数のCD34+幹細胞の注入は、より迅速な生着、耐久性、及び処置の効果に結び付く。
第1段階の期間はおよそ1〜3ヵ月、第2段階はおよそ2〜3ヵ月、第3段階はおよそ1ヵ月、第4段階はおよそ2年となる。同意書に署名してから合計でおよそ2.5年間、薬物製品注入後およそ2年間、対象に試験の追跡調査を行う。加えて、薬物製品を注入した全ての対象に、本試験の完了後または本試験からの離脱/中止後、長期追跡調査研究または登録への組入れを依頼する。
スクリーニングから30日以内に服用した全ての投薬を記録する。試験スクリーニング同意日の24ヵ月前からのRBC輸血に関するレトロスペクティブ情報を記録する。
前処置レジメンの投与及び薬物製品の注入のために中心静脈カテーテルを使用する。中心静脈カテーテルは、治験責任医師の判断に従って、アフェレーシス、交換輸血、及び薬物製品注入後の対象への臨床ケアにも使用することができる。
アフェレーシス手順の開始前、及びブスルファン前処置の開始予定時の少なくとも1ヵ月前に、Hb≧11g/dLの目標を達成するように対象に輸血を行うこととする。これは、無効造血を抑制し、より好結果の生着を可能にするために行う。ブスルファン前処置及び薬物製品注入のために入院する間、HSCTを受ける患者に対する標準的なやり方に従って、対象を濃縮RBC及び血小板の輸血で支持することとする。
全ての血液製剤は、病院ガイドラインに従って濾過及び照射を行う。
キレートは、ブスルファンを用いた骨髄破壊的前処置を開始する7日以上前に中止しなければならない。デフェラシロクスは例外であり、(薬物間相互作用の潜在可能性により)前処置の30日以上前に中止することとする。デフェラシロクスを中止する場合、異なるキレート薬をブスルファン前処置の7日前まで使用することができる。
鉄キレートを中止する潜在的理由は以下の通りである。
・血清フェリチン<1000μg/L
・LIC<7mg/g
・輸血非依存であれば、鉄キレートの代替として瀉血を受けられる
G−CSFは、メディカルモニターとの協議及び同意がない限り、CTX001注入後に投与しないこととする。これは、早期G−CSFの投与によって、編集再注入CD34+細胞の、赤血球系統への分化ではなく骨髄系統への分化が優先的に推進されるという仮説的懸念によるものである。CTX001注入後にG−CSF投与を避けることで、全ての系統でのCD34+細胞の完全な成熟が可能になり得る。対象を綿密にモニターすることとし、好中球の生着がCTX001注入後21日までに発生しない場合は、治験責任医師はメディカルモニターに連絡を取ってG−CSFの開始の可能性について協議することができる。
動員を開始する前に、アフェレーシスに熟練した医師が各対象を診察し適切とみなした上で、表1及び施設の標準的手順に従って動員及びアフェレーシスを行う。不適格の例としては、血行力学的不安定、血清学的検査感染陽性、または活動性感染が挙げられる。
PBMCを、臨床施設のSOPに従って最大3日間収集する。アフェレーシスの1日目及び2日目にわたる製品製造のためのCD34+細胞収集の最低目標は、15×106 CD34+細胞/kgとする。アフェレーシスの3日目には、製造のための細胞を収集しない。これらの細胞を、薬物製品の製造用に中央製造施設に輸送する。
ブスルファン前処置は、施設で薬物製品を受け取り、サラセミア(アルファ及びHBB座位)の遺伝型判定を確認したら開始することとする。ブスルファンは、1日1回連続4日間、開始用量3.2mg/kg/日(ブスルファン投与初日以前の3〜7日以内に収集した体重に基づく)でIV投与する。1日1回の投与が好ましいスケジュールであるが、施設の標準的なやり方に従い、Q6Hで投与するようにブスルファン用量レジメンを調整してもよい。
薬物製品の単回用量は、ブスルファンの最終用量から48時間以後であって7日以内に投与する。薬剤製品バイアル(複数可)は、現地施設のSOPを利用して、注入予定時の直前に解凍し、解凍から20分以内に注入することとする。
薬物製品は、特に赤血球中のHbFの生成を増加させるために開発された細胞製品である。末梢血中のHbFレベルを測定することにより、薬物製品の投与による意図された結果を直接評価する。
・薬物製品注入の3ヵ月後を起点に少なくとも6ヵ月間の輸血非依存(TI6)を達成する対象の割合。
・薬物製品注入の3ヵ月後を起点に少なくとも12ヵ月間の輸血非依存(TR12)を達成する対象の割合。
・薬物製品注入の3ヵ月後を起点に少なくとも12ヵ月間の輸血低減(TI12)を達成する対象の割合。
・末梢血白血球中に存在する意図された遺伝子改変によるアレルの経時的な割合。意図された遺伝子改変とは、BCL11Aのイントロン2内の赤血球特異的エンハンサーの配列を改変するインデルである。
・骨髄細胞中に存在する意図された遺伝子改変によるアレルの経時的な割合
・(輸血前の)胎児ヘモグロビン濃度の経時的な変化
・EuroQol質問紙(5次元−5レベルの重症度)(EQ−5D−5L)を用いての、健康関連クオリティーオブライフ(HRQoL)のベースラインからの経時的な変化
・がん療法(骨髄移植)の機能的評価(FACT−BMT)質問紙を用いての、HRQoLのベースラインからの経時的な変化
・以下を含む鉄過剰のパラメーターの変化
○T2*磁気共鳴画像法(MRI)による評価におけるベースラインからの肝臓鉄濃度(LIC)及び心臓鉄量(CIC)
○血清フェリチンレベルのベースラインからの経時的な変化
・鉄キレート療法を受けている対象の経時的な割合
・胎児ヘモグロビンを発現する循環赤血球(F細胞)の割合におけるベースライン(輸血前)からの経時的な変化
・循環網状赤血球におけるα−グロビン及び非α−グロビンmRNAの経時的な発現
・エリスロポエチン(EPO)濃度の経時的な変化
・ヘプシジン濃度の経時的な変化
・骨髄解析における、ベースラインと経時的に比較した赤血球新生の評価
生着した対象の割合。生着は、連続3日間の好中球絶対数(ANC)≧500/μLとして定義される。生着不良は、薬物製品注入後、またはバックアップ非改変CD34+細胞が利用された場合の42日目までに、好中球の生着を達成しない任意の対象として定義される。これとは別に、血小板生着も解析する。
・生着時間
・米国国立がん研究所(NCI)有害事象共通用語規準(CTCAE)v4.03による評価における、インフォームドコンセント署名から24ヵ月目の来院までに収集したAEの頻度及び重症度。
・薬物製品注入後100日時及び1年時における移植関連死(TRM)の発生率。TRMは、移植手順に関連する可能性がある死亡として定義される。
・総死亡率
薬物製品注入後、対象は、HSCTについての現地のガイドライン及び治験責任医師の判断に従って、感染症の監視及び予防法(細菌性、ウイルス性、真菌性)を受けることができる。
PRO評価は、インフォームドコンセントを得た後の最初の評価として実施することとし、さらに試験来院の冒頭で、いかなる評価にも先行して対象が完了させることとする。
第1/2相安全性及び効果試験を行って、重症鎌状血球症(SCD)を有する対象における自家CRISPR−Cas9改変CD34+ヒト造血幹・前駆細胞(hHSPC)(薬物製品)の単回用量の安全性及び有効性を評価する(主要目的)。薬物製品の注入の疾患特異的事象及び臨床的状態に及ぼす効果を評価し、遺伝子編集効率を定量化する(副次的目的)。さらに、バイオマーカーにおける、薬物製品の効果を特徴付け、処置アウトカムを予測する能力も評価する(探索的目的)。この試験は、最初は最大12例の対象を含め、試験に組み入れる対象を45例以上に拡大することが可能である。本試験に組み入れる対象は、書類で立証されたβS/βS遺伝型を有する重症SCDの18〜35歳(インフォームドコンセント時の年齢)とする。本試験は、小児集団(例えば、18歳未満)にまで拡大することができる。
・医療施設への来院及び疼痛薬剤(オピオイドまたは静脈内(IV)非ステロイド性抗炎症薬物[NSAID])またはRBC輸血の投与を必要とする急性疼痛事象
・新規の肺浸潤物の存在によって示され、肺炎様の症状、疼痛、または発熱を伴う急性胸部症候群
・2時間を超えて持続する持続性勃起
・脾臓赤血球捕捉
対象は、試験の組入れに適格であるためには、以下の基準の全てを満たさなくてはならない。
11.対象は、インフォームドコンセント用紙(ICF)に署名し日付を記入する。
12.インフォームドコンセントの日付時点で18〜35歳の対象。
13.書類で立証されたβS/βS遺伝型。対象は、過去のβS/βS遺伝型結果に基づいて組み入れることができるが、ブスルファン前処置の前には遺伝型確認が必要である。
14.重症SCDを有する対象。
15.カルノフスキー・パフォーマンス・ステータス≧80%。
16.治験責任医師の判断により自家幹細胞移植に適格である。
17.妊娠可能な(初潮後であり、無処置の子宮及び少なくとも1つの卵巣を有し、閉経から1年未満である)女性対象は、同意時より薬物製品注入から6ヵ月以後まで、許容できる避妊方法(複数可)の使用に同意しなければならない。
18.男性対象は、動員開始より薬物製品注入から6ヵ月以後まで有効な避妊法を使用することに同意しなければならない。
19.予定された来院、処置計画、検査室検査、避妊ガイドライン、及び他の試験手順を遵守する意思及び能力がある。
20.本試験の完了後、追加の長期追跡調査研究に参加する意思がある。
以下の基準のいずれかを満たす対象は、組入れに不適格である。
20.10/10ヒト白血球抗原(HLA)適合の血縁ドナーが利用可能。
21.以前にHSCTを受けている。
22.治験責任医師により、臨床的に重大かつ活動性のウイルス、真菌、または寄生虫の感染症と判定されている。
23.白血球(WBC)数<3×109/Lまたは血小板数<50×109であり、治験責任医師により、脾機能亢進とは無関係であると判断されている。
24.生着後、定期的なRBC輸血を用いた処置を中断できないと治験責任医師が考える場合。
25.RBC抗原に対する同種免疫の病歴を有し、治験責任医師により、本試験の期間中に利用可能なRBC単位が不十分であると予測される対象。
26.スクリーニング前の1年間で10回を超える予定外の入院または救急部門の受診がある。
27.HUなどのHbF誘導処置を用いた併用処置に関係なく、HbFレベル>15.0%。
28.対象を出血のリスクにさらすと治験責任医師が考える、未処置のもやもや病の病歴またはスクリーニング時におけるもやもや病の存在。
29.重大な出血系障害の病歴。
30.試験の結果と交絡するか、または対象に追加的リスクをもたらす恐れがあると治験責任医師が考える、任意の疾患または任意の臨床的状態の病歴。これには、限定されるものではないが、関連薬物のアレルギー、心血管もしくは中枢神経系の疾患の病歴、臨床的に重大な病態の病歴もしくは存在、精神疾患の病歴、または家族性がん症候群の病歴が含まれ得る。
31.任意の悪性腫瘍もしくは骨髄増殖性障害を以前有したか現在有する、または重大な免疫不全障害を有する。
32.以下のように定義される進行性肝疾患:
a.アラニントランスアミナーゼ(ALT)>3×正常値上限(ULN)、もしくは直接ビリルビン値>2×ULN、または
b.ベースラインプロトロンビン時間(PT)(国際標準比[INR])>1.5×ULN、または
c.肝硬変の病歴もしくは線維性架橋形成の任意のエビデンス、もしくは肝生検における活動性肝炎
33.ベースライン推算糸球体濾過量<60mL/分/1.73m2。
34.肺における一酸化炭素の拡散能(DLco)<予測値の50%(ヘモグロビン及び/または肺胞体積に対し補正)。
35.心エコー図による左室駆出分画(LVEF)<45%。
36.遺伝子療法/編集製品を用いた処置を以前受けている。
37.プレリキサホルまたはブスルファンに対する不耐性、禁忌、または既知の感受性。以前、薬物製品の賦形剤(ジメチルスルホキシド[DMSO]、デキストラン)に対するアナフィラキシー反応が生じている。
38.ヒト免疫不全ウイルス−1(HIV−1)またはヒト免疫不全ウイルス−2(HIV−2)、B型肝炎ウイルス(HBV)(B型肝炎コア抗体[HBcAb]もしくは核酸検査[NAT])、またはC型肝炎ウイルス(HCV)(NAT)について血清学的検査陽性である。細胞プロセッシングのための局所検査により求められる梅毒または他の任意の感染性疾患マーカーについて血清学的検査陽性である。
39.治験薬物/製品を用いた別の臨床試験に参加しており、スクリーニングから30日以内または治験薬剤の半減期の5倍未満(スクリーンからより長期間経っている方)である。
40.治験責任医師により、プロトコルに概説された試験手順を遵守する能力がないと判断された対象。
41.妊娠中または授乳中の女性。
この期間中、選択基準を満たす対象は、卵母細胞または精子の凍結保存による妊孕性温存を受ける選択肢を有する。適格性を確認した後、動員開始予定時の8(±2)週間前に、対象にRBC輸血(単純または交換)を開始し、ブスルファン前処置を開始するまでこの輸血投与を継続する。このようなRBC輸血の目標は、総Hb濃度≦11g/dLを保ちながらヘモグロビンS(HbS)レベル<総Hbの30%を標的とすることである。HUを用いた処置は、動員予定時の少なくとも6週間前に中止することとする。
各対象に、プレリキサホル単体を用いた幹細胞動員を行う。末梢血単核球(PBMC)をアフェレーシスによって収集する。1日目は、アフェレーシス予定時の7(±2)時間前に対象にプレリキサホルを投与する。対象に連続2日間または3日間のアフェレーシスを行って、CD34+ hHSPCを収集する。標的とするCD34+細胞収集は、薬物製品を製造するための最少標的用量3×106 CD34+細胞/kgを達成するために、少なくとも15×106 CD34+細胞/kgである。薬物製品で生着しない場合のレスキュー療法のためのバックアップとして、追加の2×106 CD34+細胞/kgを収集する。1回目の動員及びアフェレーシスサイクルで、最少の薬物製品及び安全策バックアップの両方のための十分な細胞が得られない場合、または対象がアフェレーシスを完了することができない場合は、追加の細胞を収集するために最大2回の追加の動員及びアフェレーシスサイクルが許容される。追加の動員サイクルは、先の動員サイクルの初日から14日以後であって先のサイクルの終了から60日後までに開始する。
第3A段階 − 骨髄破壊的前処置:薬物製品製造中及びブスルファン前処置の開始予定時前に、総Hb濃度≦11g/dLを保ちながらHbSレベル<総Hbの30%を維持することを目標に、対象にRBCの単純または交換輸血の投与を継続する。
第4A段階 − 注入後の入院中追跡調査:移植部門内で毎日対象をモニターし、造血幹細胞移植(HSCT)を受ける対象のための標準的なやり方に従って支持ケアを行う。
様々な適応症に対する自家移植は、典型的には、生着をサポートするために少なくとも2〜2.5×106 CD34+細胞/kgを使用する。SCD試験における全ての対象の生着を確実に行うため、自家移植向けの典型的な最少用量よりも20%〜50%高い保存的最少用量3×106CD34+細胞/kgを選択した。原理上、骨髄破壊後のより多数のCD34+幹細胞の注入は、より迅速な生着、耐久性、及び処置の効果に結び付く。
薬物製品注入後2年間、対象に試験の追跡調査を行う。2年という追跡調査期間は、臨床的アウトカムの特徴付けに妥当とみなされた。本試験は、スクリーニング前の2年間において1年当たり少なくとも2回のVOC事象を伴う対象を組み入れるため、2年の追跡調査は、VOCの年率換算発生率の減少に対する意味のある評価を可能にする。
スクリーニングから30日以内に服用した全ての投薬を記録する。
前処置レジメンの投与及び薬物製品の注入のために中心静脈カテーテルを使用する。中心静脈カテーテルは、治験責任医師の判断に従って、アフェレーシス、交換輸血、及び薬物製品注入後の対象への臨床ケアにも使用することができる。
HU:ヒドロキシ尿素(HU)を用いた処置は、動員開始予定時の少なくとも6週間前に中止することとする。治験責任医師が必要とみなし、動員の完了からブスルファン前処置までの間で>4ヵ月が予定されている場合、対象は、動員及びアフェレーシスの後にHUを再開することができる。HUを再開する場合、ブスルファン前処置の前にRBC輸血を再開したときは、HUを中止することとする。
中心静脈ラインが動員に必要かどうかの決定は、アフェレーシスに熟練した看護師または医師が行う。動員にはプレリキサホルのみを用いる。G−CSFは投与しないこととする。
ブスルファンは、1日1回連続4日間、開始用量3.2mg/kg/日(ブスルファン投与初日以前の3〜7日以内に収集した体重に基づく)でIV投与する。1日1回の投与が好ましいスケジュールであるが、施設の標準的なやり方に従い、q6hで投与するようにブスルファン用量レジメンを調整してもよい。ブスルファン用量を予め決定するために、骨髄破壊を開始する30(±)2日前にブスルファンの試験用量を実施してもよい。
薬物製品は、注入バイアル(複数可)で供給する。薬物製品を含有する全てのバイアル(複数可)を注入することとする。さらなる詳細は、レファレンスマニュアルで提供される。
薬物製品は、特に赤血球中のHbFの生成を増加させるために開発された細胞製品である。末梢血中のHbFレベルを測定することにより、薬物製品の投与による意図された結果を直接評価する。
重症VOCの年率におけるベースラインからの相対的変化を各対象について計算し、要約する。
・薬物製品注入後に重症VOCの年率がベースラインから少なくとも50%低減した対象の割合を、対応する正確な95% CIで示す。
・薬物製品注入後に重症VOCの年率がベースラインから少なくとも65%低減した対象の割合を、対応する95% CIで示す。
・VOC事象なしを達成する対象の割合を、対応する正確な95% CIで示す。
・重症VOCによる入院の年率換算期間におけるベースラインからの変化を要約する。
・解析時に、薬物製品注入の3ヵ月後を起点に少なくとも3ヵ月間のHbF≧20%を達成する対象の割合を、正確な95% CIで示す。
・解析時に、薬物製品注入時を起点に少なくとも3ヵ月間のHbF≧20%を達成する対象の割合を、正確な95% CIで示す。
・HbF及びHb濃度を、経時的な連続変数として要約する。
・SCD関連徴候のために輸血するRBC単位数の相対的変化を要約する。
・PROの変化を、経時的な連続変数として要約する。
・末梢血白血球中に存在する意図された遺伝子改変によるアレルの割合を、経時的な連続変数として要約する。
・骨髄細胞中に存在する意図された遺伝子改変によるアレルの割合を、経時的な連続変数として要約する。
・4つの溶血マーカー(網状赤血球数、ASTの血清中濃度、LDH、及び総ビリルビン)の主成分分析による測定における溶血指数の変化を、経時的な連続変数として要約する。
・TRVの変化を、経時的な連続変数として要約する。
・F細胞を発現する循環赤血球の割合の変化を、経時的な連続変数として要約する。
・炎症マーカーの変化を、経時的な連続変数として要約する。
・内皮活性化マーカーの変化を、経時的な連続変数として要約する。
AEを、MedDRAに従ってコード化する。
・薬物製品注入後42日以内に好中球が生着した対象の割合
・好中球生着時間
・血小板生着時間
・インフォームドコンセント署名から24ヵ月目来院までのAE、臨床検査値、及びバイタルサイン。
・薬物製品注入後100日以内及び1年以内のTRM発生率。TRMは、治験責任医師により、移植手順に関連する可能性があると評価された死亡として定義される。
・総死亡率
本試験は、当初は最大12例の対象を組み入れて、薬物製品の安全性及び有効性の予備的評価を提供する。本試験は、合計最大45例の対象を含めるように拡大することができる。このサンプルサイズの拡大によって少なくとも90%の検出力がもたらされ、解析時、薬物製品注入後少なくとも3ヵ月間のHbF≧20%に対する真の応答率が75%であるときに、応答率50%が除外される。
薬物製品注入後、対象は、HSCTについての現地のガイドライン及び治験責任医師の判断に従って、感染症の監視及び予防法(細菌性、ウイルス性、真菌性)を受けることができる。
PRO評価は、インフォームドコンセントを得た後の最初の評価として実施することとし、さらに試験来院の冒頭で、いかなる評価にも先行して対象が完了させることとする。
本開示は、本発明の様々な態様及び/または潜在的用途を例示する目的で、様々な特定の態様における説明を提供しているが、バリエーション及び改変が生じ得ることが当業者には理解される。したがって、本明細書に記載の発明(単数または複数)は、少なくとも特許請求される内容と同じ範囲で理解されるべきであり、本明細書で提供される特定の例示的態様によって定義されるより狭い範囲で理解されるべきではない。
Claims (85)
- ヒトB細胞リンパ腫11A(BCL11A)遺伝子の赤血球系統特異的エンハンサー内の+58 DNアーゼI高感受性部位(DHS)内に遺伝子改変を含むCD34+ヒト造血幹・前駆細胞(hHSPC)を含む、組成物。
- 血清を実質的に含まない凍結保存培地、5%ジメチルスルホキシド(DMSO)、及び/またはデキストラン−40をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記遺伝子改変がインデルを含む、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記遺伝子改変が、CD34+ hHSPCに、Cas9エンドヌクレアーゼと、ヒトBCL11A遺伝子の前記+58 DHSを標的とするガイドRNA(gRNA)とを送達することによって生成される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記gRNAが、配列番号1または配列番号2のヌクレオチド配列を含む、請求項4に記載の組成物。
- 前記gRNAが、3つの2’−O−メチル−ホスホロチオアート残基を、それぞれの5’及び3’末端に、またはその付近に含む、請求項5に記載の組成物。
- 前記Cas9エンドヌクレアーゼが、S.pyogenes Cas9エンドヌクレアーゼまたはそのバリアントである、請求項4〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記改変CD34+ hHSPCが、0.1〜0.5のγ/(γ+α)−グロビンmRNA比の増加を示す、及び/または前記改変CD34+ hHSPCが、0.2〜0.6のγ/(γ+β)−グロビンmRNA比の増加を示す、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記改変CD34+ hHSPCが、15%〜50%のHbF/(HbF+HbA)タンパク質レベルのHbF平均パーセンテージを示す、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記改変CD34+ hHSPCが、70%〜90%の平均アレル編集頻度を示す、請求項1〜9のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記改変CD34+ hHSPCの少なくとも75%が、対象への前記改変CD34+ hHSPCの投与後少なくとも16週間、多系統分化能を維持する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記改変CD34+ hHSPCが、少なくとも40%のオンターゲットインデル率を示す、請求項1〜11のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記改変CD34+ hHSPCが、少なくとも80%のオンターゲットインデル率を示す、請求項12に記載の組成物。
- 前記改変CD34+ hHSPCが、5%未満のオフターゲットインデル率を示す、請求項1〜13のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記改変CD34+ hHSPCが、1%未満のオフターゲットインデル率を示す、請求項1〜14のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記改変CD34+ hHSPCの単回用量を含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記単回用量が、少なくとも2×106改変CD34+ hHSPC/kgを含む、請求項16に記載の組成物。
- 前記遺伝子改変が、前記CD34+ hHSPCに、N末端SV40核局在化シグナル(NLS)を含むS.pyogenes Cas9エンドヌクレアーゼまたはそのバリアントを送達することによって生成される、請求項1〜17のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記S.pyogenes Cas9エンドヌクレアーゼまたはそのバリアントが、C末端NLS、任意選択でC末端SV40 NLSをさらに含む、請求項18に記載の組成物。
- 配列番号1または配列番号2のヌクレオチド配列を含むgRNA(gRNA)をさらに含む、請求項18または19に記載の組成物。
- 前記gRNA:前記エンドヌクレアーゼの重量比が1:1である、請求項20に記載の組成物。
- ヘモグロビン異常症を有する対象に、ヒトB細胞リンパ腫11A(BCL11A)遺伝子の赤血球系統特異的エンハンサー内の+58 DNアーゼI高感受性部位(DHS)内に遺伝子改変を含むCD34+ヒト造血幹・前駆細胞(hHSPC)の用量を投与することを含む方法であって、前記hHSPCが、ベースラインとの対比で、前記対象に投与される輸血回数を低減するのに、及び/または前記対象における胎児ヘモグロビン(HbF)レベルを少なくとも20%まで増加させるのに有効な量で投与される、前記方法。
- (a)ヘモグロビン異常症を有する対象における幹細胞を動員することと、
(b)ステップ(a)の後に、前記対象からCD34+ hHSPCを収集することと、
(c)ヒトBCL11A遺伝子の赤血球系統特異的エンハンサー内の+58 DNアーゼI高感受性部位(DHS)内に遺伝子改変を含む改変CD34+ hHSPCを生成することと、
(d)前記対象に、ステップ(c)の前記改変CD34+ hHSPCの用量を、ベースラインとの対比で、前記対象に投与される輸血回数を低減するのに、及び/または前記対象における胎児ヘモグロビン(HbF)レベルを少なくとも20%まで増加させるのに有効な量で投与することとを含む、方法。 - ステップ(a)が、前記対象に、CXCR4ケモカイン受容体の阻害剤を投与することを含み、任意選択で、前記CXCR4ケモカイン受容体の阻害剤がプレリキサホルである、請求項23に記載の方法。
- ステップ(a)が、前記対象に、顆粒球コロニー刺激因子を投与することをさらに含む、請求項23または24に記載の方法。
- 前記対象に、赤血球を投与することをさらに含む、請求項22〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記赤血球が、ステップ(a)の前及び/またはステップ(b)の後に投与される、請求項26に記載の方法。
- 少なくとも15×106 CD34+ hHSPC/kgがステップ(b)で収集される、請求項23〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象に、ブスルファンを投与することをさらに含む、請求項22〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ブスルファンが、ステップ(c)の後であってステップ(d)の前に投与される、請求項29に記載の方法。
- ブスルファンの静脈内用量4mg/kg〜5mg/kgが1日1回4日間投与される、または静脈内用量0.5mg/kg〜1mg/kgが6時間ごとに4日間投与される、請求項30に記載の方法。
- 前記用量が、薬物動態レベルに基づき、曲線下面積(AUC)4500〜5500μM/分、好ましくは5000μM/分を達成するように調整される、請求項30に記載の方法。
- 前記遺伝子改変がインデルである、請求項22〜32のいずれか1項に記載の方法。
- 前記遺伝子改変が、前記CD34+ hHSPCに、Cas9エンドヌクレアーゼと、ヒトBCL11A遺伝子の前記+58 DHSを標的とするガイドRNA(gRNA)とを送達することによって生成される、請求項22〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 前記gRNAが、配列番号1または配列番号2のヌクレオチド配列を含む、請求項34に記載の方法。
- 前記gRNAが、3つの2’−O−メチル−ホスホロチオアート残基を、それぞれの5’及び3’末端に、またはその付近に含む、請求項35に記載の方法。
- 前記Cas9エンドヌクレアーゼが、S.pyogenes Cas9エンドヌクレアーゼである、請求項34〜36のいずれか1項に記載の方法。
- 好中球の生着が、前記改変CD34+ hHSPCの投与後35〜45日以内に前記対象内で発生する、請求項22〜37のいずれか1項に記載の方法。
- 好中球の生着が、前記改変CD34+ hHSPCの投与後42日以内に前記対象内で発生する、請求項38に記載の方法。
- 前記ヘモグロビン異常症がβ−サラセミアである、請求項22〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象が、前記改変CD34+ hHSPCの投与時期の2年の期間内、または前記改変CD34+ hHSPCの投与時期の後の2年の期間内に、前記改変CD34+ hHSPCの投与時期の前の2年の期間との対比で、より少ない輸血回数を必要とする、請求項22〜40のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象が、前記改変CD34+ hHSPCの投与の3ヵ月後を起点に、前記改変CD34+ hHSPCの投与から少なくとも3ヵ月間の輸血低減または輸血非依存を達成する、請求項22〜41のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象が、前記改変CD34+ hHSPCの投与の3ヵ月後を起点に、前記改変CD34+ hHSPCの投与から少なくとも6ヵ月間の輸血低減または輸血非依存を達成する、請求項22〜42のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象が、前記改変CD34+ hHSPCの投与の3ヵ月後を起点に、前記改変CD34+ hHSPCの投与から少なくとも12ヵ月間の輸血低減または輸血非依存を達成する、請求項22〜43のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象において、以下から選択されるアッセイ:疼痛スケール(11点の数値評価スケール[NRS])、EuroQolクオリティーオブライフスケール(EQ 5D 5L)、がん治療−骨髄移植の機能評価(FACT−BMT)、患者報告アウトカム測定情報システム(PROMIS)−疲労、PROMIS−認知機能、及び成人鎌状赤血球クオリティーオブライフ測定システム(ASCQ−Me)のうちの少なくとも1つを用いて、患者報告アウトカム(PRO)の経時的な変化が認められる、請求項22〜44のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象において、磁気共鳴画像法(MRI)による評価において、ベースラインとの対比で鉄過剰のパラメーターの減少が認められる、請求項22〜45のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象において、血清フェリチンレベルの変化による評価において、ベースラインとの対比で鉄過剰のパラメーターの経時的な減少が認められる、請求項22〜46のいずれか1項に記載の方法。
- 前記鉄過剰のパラメーターの減少が、肝臓鉄濃度(LIC)及び/または心臓鉄量(CIC)の減少を含む、請求項46または47に記載の方法。
- 前記対象が、前記改変CD34+ hHSPCの投与時期の2〜5年の期間内、または前記改変CD34+ hHSPCの投与時期の後の2〜5年の期間内に、前記改変CD34+ hHSPCの投与時期の前の2〜5年の期間との対比で鉄キレート療法を必要としない、請求項22〜48のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヘモグロビン異常症が鎌状赤血球症である、請求項22〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象の前記HbFレベルが、前記改変CD34+ hHSPCの投与時期の任意の時点または投与時期の後を起点に少なくとも3ヵ月間、少なくとも20%である、請求項22〜39または50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象の前記HbFレベルが、前記改変CD34+ hHSPCの投与時期の任意の時点を起点に少なくとも6ヵ月間、少なくとも20%である、請求項22〜39または50〜51のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象の前記HbFレベルが、前記改変CD34+ hHSPCの投与の3ヵ月後を起点に少なくとも3ヵ月間、少なくとも20%である、請求項22〜39または50〜52のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象の前記HbFレベルが、前記改変CD34+ hHSPCの投与の6ヵ月後を起点に少なくとも3ヵ月間、少なくとも20%である、請求項22〜39または50〜53のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象の前記HbFレベルが、二次薬物を用いた処置の不在下で少なくとも20%である、請求項22〜39または50〜54のいずれか1項に記載の方法。
- 前記二次薬物がヒドロキシウレア(HU)である、請求項55に記載の方法。
- 前記改変CD34+ hHSPCの投与の6ヵ月後を起点に、重症血管閉塞発作(VOC)の年率におけるベースラインからの相対的変化が認められる、請求項22〜39または50〜56のいずれか1項に記載の方法。
- 前記改変CD34+ hHSPCの投与の6ヵ月後を起点に、VOCの年率におけるベースラインからの少なくとも50%の低減が認められる、請求項57に記載の方法。
- 前記改変CD34+ hHSPCの投与の6ヵ月後を起点に少なくとも12ヵ月間のVOCの不在が認められる、請求項57または58に記載の方法。
- 前記改変CD34+ hHSPCの投与の6ヵ月後を起点に少なくとも24ヵ月間のVOCの不在が認められる、請求項59に記載の方法。
- 前記対象において、以下から選択されるアッセイ:疼痛スケール(11点の数値評価スケール[NRS])、EuroQolクオリティーオブライフスケール(EQ 5D 5L)、がん治療−骨髄移植の機能評価(FACT−BMT)、患者報告アウトカム測定情報システム(PROMIS)−疲労、PROMIS−認知機能、及び成人鎌状赤血球クオリティーオブライフ測定システム(ASCQ−Me)のうちの少なくとも1つを用いて、患者報告アウトカム(PRO)の経時的な変化が認められる、請求項22〜39または50〜60のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象において、以下の4つの溶血マーカー:網状赤血球数、アスパラギン酸トランスアミナーゼの血清中濃度、乳酸デヒドロゲナーゼ[LDH]、及び総ビリルビンの主成分分析による測定において、溶血指数の経時的な変化が認められる、請求項22〜39または50〜61のいずれか1項に記載の方法。。
- 前記対象において、三尖弁逆流ジェット速度(TRV)の経時的な変化が認められる、請求項22〜39または50〜62のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象に赤血球を投与することをさらに含み、前記赤血球が、前記改変CD34+ hHSPCを投与する前記ステップの前に投与される、請求項22〜39または50〜63のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象が、前記改変CD34+ hHSPCを投与する前記ステップの前に赤血球(RBC)輸血を受けている、請求項22〜39または50〜64のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象が、総Hbの30%未満のヘモグロビンS(HbS)レベルを有する、請求項22〜39または50〜65のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象が、11g/dL以下の総Hb濃度を有する、請求項22〜39または50〜66のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象において、ある期間にわたり、胎児ヘモグロビンを発現する循環赤血球(F細胞)の割合の増加が認められ、任意選択で少なくとも10%の増加が認められる、請求項22〜67のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象において、ある期間にわたり、炎症及び内皮活性化マーカーの変化が認められる、請求項22〜68のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象において、ある期間にわたり、末梢血白血球中に存在する前記遺伝子改変を伴うアレルの割合の変化が認められる、請求項69に記載の方法。
- 前記対象において、ある期間にわたり、骨髄細胞中に存在する前記遺伝子改変を伴うアレルの割合の変化が認められる、請求項22〜70のいずれか1項に記載の方法。
- 前記期間が、前記改変CD34+ hHSPCの投与から少なくとも3ヵ月である、請求項68〜71のいずれか1項に記載の方法。
- 前記期間が、前記改変CD34+ hHSPCの投与から少なくとも6ヵ月である、請求項72に記載の方法。
- 前記改変CD34+ hHSPCが、0.1〜0.5のγ/(γ+α)−グロビンmRNA比の増加を示す、及び/または前記改変CD34+ hHSPCが、0.2〜0.6のγ/(γ+β)−グロビンmRNA比の増加を示す、請求項22〜73のいずれか1項に記載の方法。
- 前記改変CD34+ hHSPCが、15%〜50%のHbF/(HbF+HbA)タンパク質レベルのHbF平均パーセンテージを示す、請求項22〜74のいずれか1項に記載の方法。
- 前記改変CD34+ hHSPCが、0.4以上の(γ+β)/α−グロビンmRNA比を示す、請求項22〜75のいずれか1項に記載の方法。
- 前記改変CD34+ hHSPCが、70%〜90%の平均アレル編集頻度を示す、請求項22〜76のいずれか1項に記載の方法。
- 前記改変CD34+ hHSPCの少なくとも50%が、前記改変CD34+ hHSPCの投与後少なくとも16週間、多系統分化能を維持する、請求項22〜77のいずれか1項に記載の方法。
- 前記改変CD34+ hHSPCが、少なくとも40%のオンターゲットインデル率を示す、請求項22〜78のいずれか1項に記載の方法。
- 前記改変CD34+ hHSPCが、少なくとも80%のオンターゲットインデル率を示す、請求項79に記載の方法。
- 前記対象が、前記改変CD34+ hHSPCの投与から生じる新生物性及び/または骨髄増殖性病変を示さない、請求項22〜80のいずれか1項に記載の方法。
- 前記用量が、少なくとも2×106改変CD34+ hHSPC/kgである、請求項22〜81のいずれか1項に記載の方法。
- 前記用量が、少なくとも3×106改変CD34+ hHSPC/kgである、請求項82に記載の方法。
- 前記対象にプレリキサホルを投与することをさらに含み、赤血球が、前記改変CD34+ hHSPCを投与する前記ステップの前に投与される、請求項22〜83のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象に、顆粒球コロニー刺激因子を投与することをさらに含む、請求項22〜84のいずれか1項に記載の方法。
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