CN109735497A - 一种提高胎儿血红蛋白表达水平的方法 - Google Patents

一种提高胎儿血红蛋白表达水平的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及高效安全基因编辑造血干细胞BCL11A的增强子位点的方法。在本发明中，已确认能够修饰完成后的造血干细胞具有正常细胞功能，且显著提高胎儿血红蛋白的表达,以抵消地中海贫血患者缺失的正常血红蛋白。因此，可将基因编辑后的造血干细胞用于β‑地中海贫血和镰刀红细胞贫血的临床治疗。

Description

一种提高胎儿血红蛋白表达水平的方法
交叉引用
本申请要求享有2017年10月27日提交的中国专利申请2017110277086 的优先权，该中国专利申请的公开内容以其整体通过引用并入本申请。
技术领域
本发明涉及用于治疗地中海贫血和镰刀形红细胞贫血等贫血疾病的细胞治疗方案，其包含利用基因编辑技术，高效安全地基因修饰人的造血干细胞的BCL11A的增强子位点，上调γ珠蛋白和胎儿血红蛋白的表达，实现治疗疾病的目的。
背景技术
地中海贫血又称为珠蛋白生成障碍贫血或者海洋性贫血，是一组由于基因缺陷等遗传因素导致的溶血性贫血类疾病。遗传性基因缺陷致使血红蛋白中一种或几种珠蛋白肽链合成缺失或者不足，从而导致贫血或者溶血的病理状态。合成血红蛋白的珠蛋白链减少或缺失会导致血红蛋白结构异常，这种含有异常血红蛋白的红细胞变形性降低，寿命减短，在骨髓中可能出现原位溶血，进入到外周血液循环后被脾脏等脏器提前破坏，致使贫血、体内铁沉积甚至发育异常。由于不同珠蛋白链基因突变的多样性和复杂性，使缺失的珠蛋白类型、数量及临床症状变异性非常大。
地中海贫血根据所缺失的珠蛋白链种类及缺乏程度予以命名和分类。按照不同类型珠蛋白肽链生成障碍可分为α型、β型、δ型、δβ型。目前地中海贫血是全球最普遍的基因缺陷遗传性疾病之一。据统计，4.83％的全球人口携带珠蛋白突变基因，其中包括1.67％的α、β地中海贫血杂合子，同时包含1.92％携带镰刀形细胞突变的血红蛋白，0.95％携带血红蛋白E，0.29％携带血红蛋白C等。由此产生的有疾病症状的血红蛋白异常的全球人口出生率不少于0.024％，是一种常见的基因缺陷型疾病。
β地中海贫血(以下简称β地贫)是地中海贫血的一种，其发病机理是因为β珠蛋白肽链发生基因突变，多数病人是点突变，少数是大片段基因缺失。基因缺失和某些点突变可以导致一部分β珠蛋白肽链的合成完全被抑制，这类称为β0地贫；而少数的点突变使β链的合成部分受到抑制，仍保留一部分肽链合成，这类称为β+地贫，不同的组合可能出现不同的临床症状。β地贫基因突变类型非常多，据统计全球约有300多种基因异常，已发现的突变点有100多种，目前国内临床报道的有28种。其中常见的突变有6种，β41-42(-TCTT缺失)，约占45％，IVS-II654(C到T点突变)，约占24％，β17(A 到T点突变)，约占14％，TATA盒子-28(A到T点突变)，约占9％。Β71-72(+A 插入突变)，约占2％，β26(G到A点突变)约占2％等。
重型β地贫的突变基因类型有两种，其一是β纯合子，契尔氏β0与β+地贫双重杂合子，因为β珠蛋白肽链生成近于完全受到抑制，体内无法产生β珠蛋白链，由α链和β链组成的正常的血红蛋白A合成减少或消失。虽然多余的α链蛋白能与红细胞内γ链结合形成血红蛋白F，但是由于出生后，γ合成逐渐受到抑制(又称为血红蛋白链合成切换)，因此，多余的α链会沉积在红细胞内形成包涵体，附着在红细胞膜表面上，使红细胞膜特性发生改变，细胞变僵硬而导致变形能力下降，在骨髓中发生被破坏导致“无效造血”。部分地中海贫血的红细胞虽然能够在骨髓中生长发育成熟，并最终被释放到外周血循环中，但当它们通过外周局部微循环(如脾脏等脏器)时，就会因为变形能力下降，容易发生机械破坏。由于上述原因，患儿在临床上出现出生时无症状，出生后由于HbF(胎儿血红蛋白)表达而且红细胞寿命长达120天，往往当6个月后由于γ链合成被生理性抑制，血红蛋白链合成切换为β链，同时由于基因缺陷无法合成β链，细胞发生病理改变引起破坏增加，呈现慢性溶血性贫血表现，进一步导致骨髓构成改变。治疗过程中需反复输血，导致含铁血黄素沉着症，影响重要脏器功能。
镰刀形红细胞贫血，与β-地中海贫血类似，都属于一种常染色体隐性遗传病，不同的是该贫血症突变位点单一，由于β珠蛋白的单一碱基突变，正常的β基因的第6位密码子由GAG(编码谷氨酸)突变为GTG(缬氨酸)所致。在突变纯合子状态，正常的α珠蛋白和异常的β珠蛋白形成四聚体复合物，称为HbS,该四聚体携带氧气的能力是正常血红蛋白的一半，在脱氧状态下聚集成多聚体，因形成的多聚体排列方向与膜平行，紧密接触细胞膜，当多聚体数量达到一定程度后，细胞膜由正常的凹形变成镰刀形。镰刀形红细胞，变形性差，容易破碎而发生溶血，造成血管堵塞，损伤，坏死等。
β-地中海贫血和镰刀形红细胞贫血的治疗方法包括：一般支持治疗、高剂量输血及规律去铁治疗、造血干细胞移植、诱导胎儿血红蛋白药物治疗和探索性的基因治疗。目前，所有治疗方案中唯一有治愈希望的方法是异基因造血干细胞移植，自1981年托马斯进行了首例地贫患者造血干细胞移植并取得成功后，造血干细胞移植技术在全球多个地贫研究中心开展并成功取代了经典的输血和去铁的治疗方案。然而，由于HLA全相合供者严重缺乏和移植后GVHD(graft-versus-host disease，移植物抗宿主反应)导致的死亡，依旧限制着造血干细胞移植治疗地中海贫血的广发应用。与此同时，一直以来研究者们在持续探索治疗地中海贫血的药物，目前FDA唯一批准用于临床治疗的口服药物是羟基脲，主要通过诱导胎儿血红蛋白表达缓解疾病临床症状，但由于该药物的临床疗效不一致且存在很大的副作用，以及剂量相关的骨髓抑制，亟待开发新的治疗方法治疗β-地中海贫血和镰刀形红细胞贫血等相关贫血疾病。
在本说明书的整篇文本中引用了数篇文件。此处的每篇文件(包括任何期刊文章或摘要、公开或未公开的专利申请、授权专利、制造商的说明书、使用说明等)通过提述并入本文。然而，并非认可此处引用的文件事实上是本发明的现有技术。
发明内容
本发明利用基因编辑技术，例如CRISPR/Cas9基因编辑技术，开发出了新一代的造血干细胞，该造血干细胞与现有技术的造血干细胞相比，对 BCL11A增强子基因敲除的效率大大增加，从而使分化成熟后的红细胞胎儿血红蛋白的表达大大提升，一定程度上解决了现有技术中BCL11A增强子编辑效率低，胎儿血红蛋白表达量不能满足临床应用的问题。另外，本发明也进一步改善了对基因编辑后的造血干细胞的培养和分化策略，不仅大大缩短了从造血干细胞到成熟红细胞的分化进程，同时也使收获的成熟红细胞的数量大大增加，从而部分满足了临床应用的要求。
具体地本发明涉及如下各项：
1.一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白(HbF)表达的方法，包括：
通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495219位至第60495336位的BCL11A基因组区域。
2.项1所述的方法，其中所述基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术。
3.项2所述的方法，其中所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9基因编辑技术。
4.项1-3中任一项所述的方法，其中所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与选自SEQID No.3～SEQ ID No.25任一的序列互补。
5.项3或4的方法，将包含选自SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:25任一序列的sgRNA导入所述造血干细胞以实现对所述BCL11A基因组的编辑。
6.项5的方法，其中所述sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的。
7.项6的方法，其中所述化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。
8.项3-7中任一项的方法，其中将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入造血干细胞。
9.项8的方法，其中通过电转方法将sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入造血干细胞。
10.项9的方法，其中所述电转条件为200-600V，0.5ms-2ms。
11.一种通过CRISPR/Cas9系统体外高效编辑造血干细胞的方法，包括将含有选自SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：25任一序列的sgRNA导入所述造血干细胞，其中该sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的。
12.项11的方法，其中将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入造血干细胞。
13.项12的方法，其中通过电转方法将sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入造血干细胞。
14.项13的方法，其中所述电转条件为200-600V，0.5ms-2ms。
15.通过项1～14中任一项所述的方法得到的造血干细胞。
16.一种通过基因改造使胎儿血红蛋白(HbF)表达升高的人造血干细胞，其中该造血干细胞中染色体2上第60495219位至第60495336位的BCL11A 基因组靶序列中的一个或多个位点通过基因编辑技术被破坏。
17.通过分化培养项15或16所述的造血干细胞获得的、处于成熟红细胞之前的不同分化阶段的前体细胞。
18.通过分化培养项15或16所述的造血干细胞获得的成熟红细胞。
19.一种制造通过基因改造使胎儿血红蛋白(HbF)表达升高的成熟红细胞或其前体细胞的方法，该方法包括：
(a)使用项1-14中任一项所述的方法得到基因改造的造血干细胞；和
(b)使用造血干细胞红系扩增和分化培养基对所述基因改造的造血干细胞进行造血干细胞红系扩增和分化，
其中，所述造血干细胞红系扩增和分化培养基包括基础培养基，以及生长因子的组合物，其中所述生长因子的组合物包括干细胞生长因子(SCF)；白介素3(IL-3)和促红细胞生成素(EPO)。
20.根据项19所述的方法，该方法还包括：
使用红系分化脱核培养基进行造血干细胞红系分化脱核，
所述红系分化脱核培养基包含基础培养基、生长因子、以及孕酮受体和糖皮质激素受体的拮抗剂和/或抑制剂。
21.根据项20所述的方法，其中所述红系分化脱核培养基中的生长因子包括促红细胞生成素(EPO)，所述孕酮受体和糖皮质激素受体的拮抗剂和/ 或抑制剂为选自下述化合物(I)～(IV)中的任一种或两种及以上：
22.通过项19-21任意一项获得的成熟红细胞或其前体细胞。
23.一种组合物，包含项15或16的造血干细胞，或项17或22的前体细胞，或项18或22的成熟红细胞。
24.包含项15或16的造血干细胞，或项17或22的前体细胞，或项18 或22的成熟红细胞的医用制品。
25.项15或16的造血干细胞，或项17或22的前体细胞，或项18或 22的成熟红细胞在预防或治疗有需要的受试者的疾病中的用途。
26.项25的用途，所述疾病为贫血性疾病、失血性疾病、肿瘤或其它需要大量输血进行预防或治疗的疾病。
27.根据项26的用途，其中所述疾病为β-地中海贫血或镰刀形红细胞贫血。
28.项25-27任一项的用途，其中所述受试者为人。
29.项15或16的造血干细胞，或项17或22的前体细胞，或项18或 22的成熟红细胞在制备预防或治疗受试者疾病中的药物或医用制品中的用途。
30.项29的用途，所述疾病为贫血性疾病、失血性疾病、肿瘤或其它需要大量输血进行预防或治疗的疾病。
31.根据项30的用途，其中所述疾病为β-地中海贫血或镰刀形红细胞贫血。
32.项29-31中任一项的用途，其中所述受试者为人。
33.一种sgRNA构建体，包含选自SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：25之一的核苷酸序列。
34.项33的构建体，其包含2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰。
35.项34的构建体，其中所述化学修饰为在选自SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：25之一的核苷酸序列的5’端的前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。
36.包含项33-35中任一项的构建体的载体、宿主细胞或制剂。
37.包含项33-35中任一项的构建体在基因编辑造血干细胞中的用途。
38.一种治疗或预防受试者贫血性疾病、失血性疾病、肿瘤或其它需要大量输血进行预防或治疗的疾病的方法，其包括给药受试者项15或16的造血干细胞，项17或22的前体细胞，或项18或22的成熟红细胞。
39.根据项38所述的方法，其中，所述疾病为β-地中海贫血或镰刀形红细胞贫血。
40.根据项39所述的方法，其中，所述受试者为人。
41.一种用于治疗或预防受试者贫血性疾病、失血性疾病、肿瘤或其它需要大量输血进行预防或治疗的疾病的试剂盒，包含项33-35中任一项的 sgRNA的构建体，或项36中的载体。
42.项41所述的试剂盒，还包含Cas9mRNA。
发明效果
本发明通过优化电转体系，基因编辑正常供体和贫血病人的造血干细胞的BCL11A的增强子位点，满足临床治疗的需求；且编辑的造血干细胞向红系分化能显著提升γ珠蛋白和胎儿血红蛋白(HbF)的表达，以及重建动物模型的造血系统；脱靶分析显示本方法安全性高，几乎检测不到基因编辑所引起的副作用。
附图简述
图1基因编辑自体造血干细胞治疗β-地中海贫血和镰刀红细胞贫血的治疗路线。从病人体内动员外周血，通过体外分离获得CD34阳性的造血干细胞，体外经过基因编辑，提高胎儿血红蛋白表达，将经过基因修饰的自体造血干细胞回输病人。
图2在癌症细胞系K562上多批次实验检测最佳电转条件，电转GFP 4 天后的荧光显微镜拍照图。“V”指脉冲电压，“ms”指脉冲时间。
图3在癌症细胞系K562上多批次实验检测最佳电转条件，电转GFP 4 天后，流式分析7-AAD和GFP表达统计分析图，以7-AAD表示细胞活率， 7-AAD(7-氨基-放线菌素D)是一种核酸染料，它不能通过正常质膜，随着细胞凋亡、细胞死亡过程，质膜对7-AAD的通透性逐渐增加，在合适波长的激发光的激发下可发出明亮的红色荧光，7-AAD阴性为正常活力细胞；用 GFP表示电转效率。“250-1”表示250V电压，1ms脉冲时间，“250-1-1”，“250-1-2”分别表示250V 1ms,两个重复；“300-1-1”，“300-1-2”分别表示300v 1ms,两个重复。
图4在300V,1ms电转条件下，电转GFP mRNA进入造血干细胞4天后的荧光显微镜拍照图，分别包括明场、绿色通道、红色通道和明场绿色通道叠加四个视野。
图5在300V,1ms电转条件下，电转GFP mRNA进入造血干细胞4天后流式分析GPF和CD34蛋白表达情况。
图6针对人BCL11A的增强子58K位置设计的多条sgRNA的示意图。
图7针对人BCL11A的增强子58K位点的150bp序列信息。
图8针对人BCL11A的增强子58K位点150bp的位置设计的23条 sgRNA的具体DNA序列信息。
图9在CD34阳性造血干细胞上，电转Cas9mRNA和多条sgRNA 4天后提取基因组，扩增片段和Sanger测序，TIDE软件分析产生Indels效率的统计分析。
图10电转Cas9mRNA和BCL11A的增强子-2、3、4、5和6sgRNA(即图中的Enhancer-2、3、4、5和6)进入3个不同脐带血来源的CD34阳性造血干细胞，4天后，TIDE软件分析产生Indels效率的统计分析。
图11电转Cas9mRNA和BCL11A的增强子-2sgRNA进入脐带血来源的CD34阳性造血干细胞，2天后进行体外克隆形成实验(CFU检测)，14天后统计不同血液系统的克隆数目，BFU-E、CFU-M、CFU-GM、CFU-E、 CFU-G、CFU-MM代表红系、髓系、淋巴系等血液系统不同谱系的克隆形成。其中，Mock:代表未经过基因编辑的细胞。
图12电转Cas9mRNA和BCL11A的增强子-2sgRNA进入造血干细胞，同时移植经过基因修饰和未经过基因修饰的细胞进入经过辐照仪照射的 NPG免疫缺陷小鼠模型，6周、8周、10周、12周、16周后，在小鼠外周血检测人CD45阳性细胞的比例，同时移植16周后在小鼠骨髓和脾脏中检测人CD45阳性细胞的比例，其中CD45阳性细胞的比例的计算方式为人 CD45阳性细胞％/(人CD45阳性细胞％+小鼠CD45阳性细胞％)，人CD45 阳性细胞％和小鼠CD45阳性细胞％分别是通过流式分析实验测得的结果。 Mock:代表未经过基因编辑的细胞。Enhancer-2代表经过基因编辑的细胞。
图13电转Cas9mRNA和BCL11A的增强子-2sgRNA进入脐带血来源的造血干细胞，同时移植经过基因修饰和未经过基因修饰的细胞进入经过辐照仪照射的NPG免疫缺陷小鼠模型，16周后分别在小鼠骨髓、脾脏、外周血中检测CD3、CD4、CD8、CD33、CD56、CD19等人细胞膜蛋白占人CD45 蛋白的比例。Mock:代表未经过基因编辑的细胞。Enhancer-2代表经过基因编辑的细胞。
图14电转Cas9mRNA和BCL11A的增强子-2sgRNA进入脐带血来源的造血干细胞，移植经过基因修饰细胞进入经过辐照仪照射的NPG免疫缺陷小鼠模型，16周后分别在小鼠骨髓、脾脏、外周血中，流式分析检测小鼠CD45、人CD45、CD3、CD4、CD8的表达结果。SSC-H通道代表侧向角散射，其代表细胞的颗粒度，值越大代表细胞的颗粒度越大，颗粒度指细胞表面的皱折度，细胞内亚细胞器、颗粒的数目等。
图15电转Cas9mRNA和BCL11A的增强子-2sgRNA进入脐带血来源的造血干细胞，移植经过基因修饰细胞进入经过辐照仪照射的NPG免疫缺陷小鼠模型，16周后分别在小鼠骨髓、脾脏、外周血中，流式分析检测一只小鼠的人CD33、CD56、CD49。SSC-H通道代表侧向角散射，其代表细胞的颗粒度，值越大代表细胞的颗粒度越大，颗粒度指细胞表面的皱折度，细胞内亚细胞器、颗粒的数目等。
图16电转Cas9mRNA和BCL11A的增强子-2sgRNA进入脐带血来源的造血干细胞，提取移植前细胞和移植后16周的外周血、骨髓、脾脏的基因组，扩增目的片段和Sanger测序，通过TIDE软件分析基因编辑Indels效率。
图17电转Cas9mRNA和BCL11A的增强子-2sgRNA进入脐带血来源的造血干细胞，进行红细胞分化，12天后检测。A图代表分化后的红细胞拍照图；B图代表检测人CD71和人235a两个膜蛋白表达，表示红系分化效率。Mock:代表未经过基因编辑的细胞。Enhancer-2代表经过基因编辑的细胞。
图18电转Cas9mRNA和BCL11A的增强子-2sgRNA进入脐带血来源的造血干细胞，进行红细胞分化，12天后通过荧光定量PCR检测BCL11A、 HBB、HBG等基因mRNA表达。Mock:代表未经过基因编辑的细胞。 Enhancer-2代表经过基因编辑的细胞。
图19电转6μg Cas9mRNA和4ug BCL11A的增强子-2sgRNA进入脐带血来源的造血干细胞向红细胞分化12天后的细胞内胎儿血红蛋白HbF的表达情况。左侧是流式分析图，右侧是胎儿血红蛋白表达统计分析图。Mock:代表未经过基因编辑的细胞。Enhancer-2代表经过基因编辑的细胞。
图20检测新鲜分离的β地中海贫血病人的外周血中CD45和CD34的表达，左侧是对照组，右侧是实验组。实验样品分别来自3名β-地中海贫血病人。
图21电转Cas9mRNA和BCL11A的增强子-2、3、4、5和6sgRNA(即图中的Enhancer-2、3、4、5和6)进入3个不同β地中海贫血病人的外周血分离的CD34阳性的造血干细胞，4天后，TIDE软件分析产生Indels效率的统计分析。
图22电转电转Cas9mRNA和BCL11A的增强子-2sgRNA进入β地中海贫血病人的外周血分离的CD34阳性的造血干细胞，提取基因组，NGS 深度测序分析14个潜在的脱靶位点统计图。
图23电转Cas9mRNA和BCL11A的增强子-2、3、4、5和6sgRNA(即图中的Enhancer-2、3、4、5和6)进入β地中海贫血病人来源的造血干细胞，进行红细胞分化，12天后检测。A图代表分化后的红细胞拍照图；B图代表检测人CD71和人235a两个膜蛋白表达，表示红系分化效率。Mock:代表未经过基因编辑的细胞。Enhancer-2、3、4、5和6代表经过基因编辑的细胞。
图24电转电转Cas9mRNA和BCL11A的增强子-2、3、4、5和6sgRNA(即图中的Enhancer-2、3、4、5和6)进入β地中海贫血病人的外周血分离的CD34 阳性的造血干细胞，红细胞分化12天后，检测BCL11A和γ-珠蛋白的基因表达。Mock:代表未经过基因编辑的细胞。Enhancer-2、3、4、5和6代表经过基因编辑的细胞。
图25电转Cas9mRNA和BCL11A的增强子-2sgRNA进入β地中海贫血病人来源的CD34阳性的造血干细胞，2天后进行体外克隆形成实验(CFU 检测)，14天后统计不同血液系统的克隆数目，BFU-E、CFU-M、CFU-GM、 CFU-E、CFU-G、CFU-MM代表红系、髓系、淋巴系等血液系统不同谱系的克隆形成。
图26电转Cas9mRNA和BCL11A的增强子-3(Enhancer-3)、Enhancer-4 或Enhancer-5sgRNA进入β地中海贫血病人来源的CD34阳性的造血干细胞，评估基因编辑效率，BCL11A基因表达和γ-珠蛋白的基因表达。A)电转 4天后，TIDE软件分析不同sgRNAs产生Indels效率的统计分析；B)电转造血干细胞后，进行红细胞分化，12天后检测BCL11A基因表达。C)电转造血干细胞后，进行红细胞分化，12天后检测γ-珠蛋白基因表达。Mock:代表未经过基因编辑的细胞。Enhancer-3,Enhancer-4,Enhancer-5代表经过 Enhancer-3,Enhancer-4,Enhancer-5sgRNA导入后基因编辑的细胞。
图27显示代表未经过基因编辑的细胞(Mock)和经过基因编辑的细胞(利用增强子2sg RNA编辑的)后的色谱结果，显示HbF和HbA的表达量。
图28显示代表未经过基因编辑的细胞(Mock)和经过基因编辑的细胞(利用增强子3、4、5、以及6sg RNA编辑的)后的色谱结果，显示HbF和HbA 的表达量。
图29显示根据图27和图28中的色谱结果进行计算后的HbF和HbA表达量的比值。
具体实施方式
本申请涉及对CD34阳性造血干细胞的BCL11A增强子位点进行基因编辑，通过优化CRISPR/Cas系统的各项条件，例如sgRNA和转化条件等，获得BCL11A增强子被高效编辑的造血干细胞。实验结果证明，本发明获得的造血干细胞体外红系分化和动物模型体内重建造血系统的功能正常，并通过脱靶分析证明其同时具备安全性，达到临床治疗标准。
本发明提供用于治疗或预防贫血性疾病、失血性疾病、肿瘤或其它需要大量输血进行预防或治疗的疾病(如β-地中海贫血和镰刀红细胞贫血)的满足临床治疗级别的基因编辑后的造血干细胞、红细胞前体、或成熟红细胞。
本发明还提供用于基因编辑造血干细胞所需的sgRNA(如经过化学修饰的sgRNA)，其包含选自SEQ ID NOs:3-25任一的核苷酸序列。
本发明还提供用于β-地中海贫血和镰刀红细胞贫血患者的造血干细胞的编辑方法。
根据本发明的目的之一是基于CRISPR/Cas基因编辑技术，高效基因修饰CD34+造血干细胞。例如可以从脐带血或骨髓中获得CD34阳性的造血干细胞，并将Cas9和给定的sgRNA，通过优化的电转条件导入造血干细胞，对造血干细胞进行基因编辑，并将基因编辑后的造血干细胞移植进入实验动物以评价该造血干细胞重建造血系统的能力。所述sgRNA可以通过多种设计软件，例如“CRISPR RGEN TOOLS”软件，针对BCL11A的增强子，例如针对BCL11A(+58)位点进行设计。在一些实施方案中，对设计的sgRNA进行化学修饰，例如在其5’和3’末端3个碱基处的2’-O-甲基类似物修饰和核苷酸间的3’硫代修饰。可以通过测试Cas9mRNA和不同sgRNA的组合，获取高效的sgRNA。在某些实施方案中，所述的造血干细胞是通过使用临床级别的磁柱分选获得，用于基因编辑的Cas9蛋白编码核苷酸以及经过化学修饰的sgRNA是经过体外转录实验获得。将基因编辑后的造血干细胞向红系分化，检测红细胞生成比例，例如，可以将基因编辑后的造血干细胞移植进入经过辐照仪照射的NPG小鼠，评价重建造血系统的能力，也可以分离病人的CD34阳性的造血干细胞，评价基因编辑效率、红系分化能力、γ珠蛋白和胎儿血红蛋白的表达。
首先，本发明提供一种提高胎儿血红蛋白(HbF)表达的方法，包括：通过CRISPR/Cas9编辑技术基因编辑造血干细胞BCL11A的增强子位点。编辑过程针对造血干细胞BCL11A的增强子位点靶向序列设计sgRNA。 BCL11A的增强子根据其转录起始位点的距离(kilo-base数)存在命名为+62、 +58、+55的位点，有报道称BCL11A基因的红系增强子能够负向调控胎儿血红蛋白(HbF)表达，其中距离转录起始位点55kb(kb表示1000个碱基)，58kb、62kb位置是关键的调控区域。虽然已经有研究人员针对+55、+58、 +62位点进行研究，但是上述三个位点前后的基因序列均在1000bp以上，总共约6000bp，因此具体编辑哪些区域可以实现理想的编辑效果本领域技术人员并不知晓，即使针对一个+58位点而言，基因编辑效率也差别很大(参见：Bauer,D.E.et al.An erythroid enhancer of BCL11A subject togenetic variation determines fetal hemoglobin level.Science.342,253–257(2013)，以及 Canver MC,et al.BCL11A的增强子dissection by Cas9-mediated in situsaturating mutagenesis.Nature.2015Nov 12；527(7577):192-7.)。因此，寻找到对编辑效率至关重要的具体区域是本领域技术人员首先面临的问题。
本申请的发明人通过深入研究发现+58位置中150bp的碱基序列(例如，如SEQ IDNO:2所示的)对基因编辑的效率影响很大，而通过本发明sgRNA 靶向的区域是实现高效的、能达到临床应用的可编辑区域。该150bp的基因组序列位于人类第2号染色体第60495197位至第60495346位的区域(在本文中，简写为chr2:60495197-60495346)。
本发明的sgRNA均能高效实现基因编辑正常供体和贫血病人来源的造血干细胞，其中相对效率更高的候选的sgRNA均能显著提高胎儿血红蛋白的表达。有文献报道通过针对+55、+58、+62位点设计sgRNAs文库，利用 CRISPR/Cas9进行细胞模型上的筛选，发现靶向+58处中“GATAA”位点是关键的调控序列，即包含”GATAA”序列的sgRNA所导致的胎儿血红蛋白提升效果最明显。然而，值得注意的是，本发明中发现的sgRNA锚定的+58k 附近的区域与现有技术中公开的关键的“GATAA”碱基位点是不同的。通过本发明sgRNA导入的基因编辑对胎儿血红蛋白的表达起到了显著的提升作用，足以应用于临床治疗。
本领域技术人员可以理解，在获知高效基因编辑区域后，本领域技术人员可以用任何基因编辑方法，例如基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN 基因编辑技术和CRISPR/Cas(如CRISPR/Cas9)基因编辑技术，以及今后发现的其它基因编辑方法，对所获知的高效基因编辑区域进行编辑，优化基因编辑条件，实现高效编辑的目的。因此，本发明涵盖通过任何可利用的基因编辑方法对本发明所鉴定的选自序列3-25的BCL11A基因靶序列的技术方案。在一些优选实施方案中，本发明涉及通过CRISPR/Cas9基因编辑技术实现高效基因编辑的技术方案。
如本申请使用的，“CRISPR/Cas”是一种基因编辑技术，包括但不限于各种自然存在或人工设计的CRISPR/Cas系统,如CRISPR/Cas9系统。自然存在的CRISPR/Cas系统(Naturally occurring CRISPR/Cas system)是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。例如，CRISPR/Cas9的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA) 通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计tracrRNA和crRNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(single guide RNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割。作为一种RNA导向的dsDNA结合蛋白，Cas9效应物核酸酶能够共定位 RNA、DNA和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。CRISPR/Cas系统可使用一类，二类或三类Cas蛋白。本发明的一些实施方式中，所述方法使用Cas9。其他适用的CRISPR/Cas系统包括但不限于WO2013176772， WO2014065596，WO2014018423，US8,697,359中所描述的系统和方法。
本发明的另一方面，涉及可实现高效基因编辑的本发明的一系列sgRNA 分子。
本发明中，“sgRNA(single guide RNA)”和“gRNA(guide RNA)”或可以是“单指导RNA”、“合成的指导RNA”或“指导RNA”可互换使用。本发明的sgRNA包含靶向目标序列的指导序列。在优选实施方案中，本发明的sgRNA进一步包含tracr序列和tracr伴侣序列。
本发明中的“指导序列”(guide sequence)可以是指定靶向位点的约 17-20bp的序列，且可与“引导序列”或“间隔子”互换使用。在形成CRISPR 复合物的背景下，“靶序列”例如是指导序列经设计以与其具有互补性的序列，其中靶序列和指导序列间的杂交促进CRISPR复合物的形成，所述杂交要求“靶序列”和“指导序列”或称“引导序列”有足够的互补性，能引起杂交并促进CRISPR复合物形成即可，完全互补不是必须的。
“互补”是指“指导序列”或称“引导序列”与靶核苷酸序列(就本发明而言为造血干细胞中BCL11A基因组靶核苷酸序列)可以通过沃森和克里克发现的核苷酸配对原则杂交。本领域技术人员可以理解，只要具有足够的互补性，“指导序列”便可与靶核苷酸序列杂交，而不需要它们之间具有100％的完全互补。在一些实施方案中，当使用适当的比对算法最佳比对时，指导序列及其相应靶序列间的互补程度可为约或大于约75％、80％、85％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。最佳比对可使用用于比对序列的任何适当的算法确定，包括Smith-Waterman算法、 Needleman-Wimsch算法、基于Burrows-Wheeler Transform的算法等。
通常，在内源CRISPR系统的背景下，CRISPR复合物的形成(包括指导序列与靶序列杂交并与一种或多种Cas蛋白复合)导致靶序列中或靶序列附近(例如，距离靶序列1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多碱基对的范围内)的一条链或两条链的切割。不希望受理论所限，tracr序列可包含野生型tracr序列的全部或其一部分，例如野生型tracr序列约或大于约 20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、70、 75、80、85或更多个核苷酸)或由上述组成的tracr序列还可形成CRISPR复合物的一部分，例如通过沿tracr序列的至少一部分与指导序列可操作连接的tracr伴侣序列的全部或一部分杂交。
在一些实施方案中，tracr序列与tracr伴侣序列具有足够的互补性以杂交并参与CRISPR复合物的形成。与“靶序列”和“指导序列”或称“引导序列”杂交的情况类似，完全互补并不是必须的，只要足以发挥其功能即可。在一些实施方案中，在最佳对齐的情况下，tracr序列沿tracr伴侣序列的长度具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的互补性。
本申请中所指的造血干细胞中2号染色体第60495219位至第60495336 位的BCL11A基因组区域是根据GRCh38标准人类基因序列中的位置定义的。本领域技术人员应明白该定位参照不同的标准人类基因组序列，可能有所不同，但本领域技术人员能够明白参照不同的标准人类基因序列时所述区域相应的位置。在一些实施例中，所述破坏造血干细胞中2号染色体第 60495219位至第60495336位的BCL11A基因组区域，包括在此区域引入核苷酸序列的“添加和/或删除(indel)”，例如引入任何类型(例如选自A、T、 C、G)和/或数量(例如1-20、1-15、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、 1-3、1-2个)的核苷酸的indel。在一些实施例中，所述的破坏包括用新的核苷酸序列置换原有的核苷酸序列。在一些实施例中，所述的破坏包括在所述区域敲入(knock-in)或敲除(knock-out)一段核苷酸序列。
在本申请中，造血干细胞BCL11A位点靶向序列如SEQ ID NO：2所示。本申请针对SEQ ID NO：2所示的150bp碱基区域设计sgRNA，要求sgRNA 序列互补于SEQ ID NO：2序列的至少17个，优选18个，优选19个，或优选20个连续核苷酸的序列。
在一些实施方式中，本发明提供一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白 (HbF)表达的方法，包括：通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495203位至第60495222位，尤其是第60495219位的BCL11A基因组区域。该基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术，优选为CRISPR/Cas9基因编辑技术，优选所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与包含SEQ ID NO:9的sgRNA 的引导序列互补。本发明方法涉及将包含SEQ ID NO：9的序列的sgRNA 导入造血干细胞以实现对所述BCL11A基因组的编辑，优选将所述sgRNA 与Cas9编码核苷酸(如mRNA)共同导入所述造血干细胞，优选通过电转条件为200-600V，0.5ms-2ms的电转方法来将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。在一些实施方案中，该sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的，比如，化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。在一些实施方案中，本发明还涉及一种造血干细胞，该造血干细胞中染色体2上第60495203位至第60495222位，尤其是第60495219位的BCL11A 基因组靶序列中的一个或多个位点通过基因编辑技术被破坏。进一步，涉及通过体外分化培养该造血干细胞后得到的红细胞，以及包含该红细胞的医用制品。
在一些实施方式中，本发明提供一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白 (HbF)表达的方法，包括：通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495208位至第60495227位，尤其是第60495224位的BCL11A基因组区域。该基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术，优选为CRISPR/Cas9基因编辑技术，优选所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与包含SEQ ID NO:10的sgRNA 的引导序列互补。本发明方法涉及将包含SEQ ID NO：10的序列的sgRNA 导入造血干细胞以实现对所述BCL11A基因组的编辑，优选将所述sgRNA 与Cas9编码核苷酸(如mRNA)共同导入所述造血干细胞，优选通过电转条件为200-600V，0.5ms-2ms的电转方法来将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。在一些实施方案中，该sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的，比如，化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。在一些实施方案中，本发明还涉及一种造血干细胞，该造血干细胞中染色体2上第60495208位至第60495227位，尤其是第60495224位的BCL11A 基因组靶序列中的一个或多个位点通过基因编辑技术被破坏。进一步，涉及通过体外分化培养该造血干细胞后得到的红细胞，以及包含该红细胞的医用制品。
在一些实施方式中，本发明提供一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白 (HbF)表达的方法，包括：通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495217位至第60495236位，尤其是第60495233位的BCL11A基因组区域。该基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术，优选为CRISPR/Cas9基因编辑技术，优选所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与包含SEQ ID NO:11的sgRNA 的引导序列互补。本发明方法涉及将包含SEQ ID NO：11的序列的sgRNA 导入造血干细胞以实现对所述BCL11A基因组的编辑，优选将所述sgRNA 与Cas9编码核苷酸(如mRNA)共同导入所述造血干细胞，优选通过电转条件为200-600V，0.5ms-2ms的电转方法来将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。在一些实施方案中，该sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的，比如，化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。在一些实施方案中，本发明还涉及一种造血干细胞，该造血干细胞中染色体2上第60495217位至第60495236位，尤其是第60495233位的BCL11A 基因组靶序列中的一个或多个位点通过基因编辑技术被破坏。进一步，涉及通过体外分化培养该造血干细胞后得到的红细胞，以及包含该红细胞的医用制品。
在一些实施方式中，本发明提供一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白 (HbF)表达的方法，包括：通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495218位至第60495237位，尤其是第60495234位的BCL11A基因组区域。该基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术，优选为CRISPR/Cas9基因编辑技术，优选所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与包含SEQ ID NO:12的sgRNA 的引导序列互补。本发明方法涉及将包含SEQ ID NO：12的序列的sgRNA 导入造血干细胞以实现对所述BCL11A基因组的编辑，优选将所述sgRNA 与Cas9编码核苷酸(如mRNA)共同导入所述造血干细胞，优选通过电转条件为200-600V，0.5ms-2ms的电转方法来将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。在一些实施方案中，该sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的，比如，化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。在一些实施方案中，本发明还涉及一种造血干细胞，该造血干细胞中染色体2上第60495218位至第60495237位，尤其是第60495234位的BCL11A 基因组靶序列中的一个或多个位点通过基因编辑技术被破坏。进一步，涉及通过体外分化培养该造血干细胞后得到的红细胞，以及包含该红细胞的医用制品。
在一些实施方式中，本发明提供一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白 (HbF)表达的方法，包括：通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495219位至第60495238位，尤其是第60495235位的BCL11A基因组区域。该基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术，优选为CRISPR/Cas9基因编辑技术，优选所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与包含SEQ ID NO:13的sgRNA 的引导序列互补。本发明方法涉及将包含SEQ ID NO：13的序列的sgRNA 导入造血干细胞以实现对所述BCL11A基因组的编辑，优选将所述sgRNA 与Cas9编码核苷酸(如mRNA)共同导入所述造血干细胞，优选通过电转条件为200-600V，0.5ms-2ms的电转方法来将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。在一些实施方案中，该sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的，比如，化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。在一些实施方案中，本发明还涉及一种造血干细胞，该造血干细胞中染色体2上第60495219位至第60495238位，尤其是第60495235位的BCL11A 基因组靶序列中的一个或多个位点通过基因编辑技术被破坏。进一步，涉及通过体外分化培养该造血干细胞后得到的红细胞，以及包含该红细胞的医用制品。
在一些实施方式中，本发明提供一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白 (HbF)表达的方法，包括：通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495221位至第60495240位，尤其是第60495223位的BCL11A基因组区域。该基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术，优选为CRISPR/Cas9基因编辑技术，优选所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与包含SEQ ID NO:16的sgRNA 的引导序列互补。本发明方法涉及将包含SEQ ID NO：16的序列的sgRNA 导入造血干细胞以实现对所述BCL11A基因组的编辑，优选将所述sgRNA 与Cas9编码核苷酸(如mRNA)共同导入所述造血干细胞，优选通过电转条件为200-600V，0.5ms-2ms的电转方法来将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。在一些实施方案中，该sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的，比如，化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。在一些实施方案中，本发明还涉及一种造血干细胞，该造血干细胞中染色体2上第60495221位至第60495240位，尤其是第60495223位的BCL11A 基因组靶序列中的一个或多个位点通过基因编辑技术被破坏。进一步，涉及通过体外分化培养该造血干细胞后得到的红细胞，以及包含该红细胞的医用制品。
在一些实施方式中，本发明提供一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白 (HbF)表达的方法，包括：通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495222位至第60495241位，尤其是第60495238位的BCL11A基因组区域。该基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术，优选为CRISPR/Cas9基因编辑技术，优选所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与包含SEQ ID NO:14的sgRNA 的引导序列互补。本发明方法涉及将包含SEQ ID NO：14的序列的sgRNA 导入造血干细胞以实现对所述BCL11A基因组的编辑，优选将所述sgRNA 与Cas9编码核苷酸(如mRNA)共同导入所述造血干细胞，优选通过电转条件为200-600V，0.5ms-2ms的电转方法来将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。在一些实施方案中，该sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的，比如，化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。在一些实施方案中，本发明还涉及一种造血干细胞，该造血干细胞中染色体2上第60495222位至第60495241位，尤其是第60495238位的BCL11A 基因组靶序列中的一个或多个位点通过基因编辑技术被破坏。进一步，涉及通过体外分化培养该造血干细胞后得到的红细胞，以及包含该红细胞的医用制品。
在一些实施方式中，本发明提供一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白 (HbF)表达的方法，包括：通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495223位至第60495242位，尤其是第60495239位的BCL11A基因组区域。该基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术，优选为CRISPR/Cas9基因编辑技术，优选所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与包含SEQ ID NO:15的sgRNA 的引导序列互补。本发明方法涉及将包含SEQ ID NO：15的序列的sgRNA 导入造血干细胞以实现对所述BCL11A基因组的编辑，优选将所述sgRNA 与Cas9编码核苷酸(如mRNA)共同导入所述造血干细胞，优选通过电转条件为200-600V，0.5ms-2ms的电转方法来将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。在一些实施方案中，该sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的，比如，化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。在一些实施方案中，本发明还涉及一种造血干细胞，该造血干细胞中染色体2上第60495223位至第60495242位，尤其是第60495239位的BCL11A 基因组靶序列中的一个或多个位点通过基因编辑技术被破坏。进一步，涉及通过体外分化培养该造血干细胞后得到的红细胞，以及包含该红细胞的医用制品。
在一些实施方式中，本发明提供一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白 (HbF)表达的方法，包括：通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495228位至第60495247位，尤其是第60495244位的BCL11A基因组区域。该基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术，优选为CRISPR/Cas9基因编辑技术，优选所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与包含SEQ ID NO:17的sgRNA 的引导序列互补。本发明方法涉及将包含SEQ ID NO：17的序列的sgRNA 导入造血干细胞以实现对所述BCL11A基因组的编辑，优选将所述sgRNA 与Cas9编码核苷酸(如mRNA)共同导入所述造血干细胞，优选通过电转条件为200-600V，0.5ms-2ms的电转方法来将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。在一些实施方案中，该sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的，比如，化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。在一些实施方案中，本发明还涉及一种造血干细胞，该造血干细胞中染色体2上第60495228位至第60495247位，尤其是第60495244位的BCL11A 基因组靶序列中的一个或多个位点通过基因编辑技术被破坏。进一步，涉及通过体外分化培养该造血干细胞后得到的红细胞，以及包含该红细胞的医用制品。
在一些实施方式中，本发明提供一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白 (HbF)表达的方法，包括：通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495229位至第60495248位，尤其是第60495245位的BCL11A基因组区域。该基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术，优选为CRISPR/Cas9基因编辑技术，优选所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与包含SEQ ID NO:18的sgRNA 的引导序列互补。本发明方法涉及将包含SEQ ID NO：18的序列的sgRNA 导入造血干细胞以实现对所述BCL11A基因组的编辑，优选将所述sgRNA 与Cas9编码核苷酸(如mRNA)共同导入所述造血干细胞，优选通过电转条件为200-600V，0.5ms-2ms的电转方法来将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。在一些实施方案中，该sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的，比如，化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。在一些实施方案中，本发明还涉及一种造血干细胞，该造血干细胞中染色体2上第60495229位至第60495248位，尤其是第60495245位的BCL11A 基因组靶序列中的一个或多个位点通过基因编辑技术被破坏。进一步，涉及通过体外分化培养该造血干细胞后得到的红细胞，以及包含该红细胞的医用制品。
在一些实施方式中，本发明提供一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白 (HbF)表达的方法，包括：通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495230位至第60495249位，尤其是第60495246位的BCL11A基因组区域。该基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术，优选为CRISPR/Cas9基因编辑技术，优选所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与包含SEQ ID NO:19的sgRNA 的引导序列互补。本发明方法涉及将包含SEQ ID NO：19的序列的sgRNA 导入造血干细胞以实现对所述BCL11A基因组的编辑，优选将所述sgRNA 与Cas9编码核苷酸(如mRNA)共同导入所述造血干细胞，优选通过电转条件为200-600V，0.5ms-2ms的电转方法来将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。在一些实施方案中，该sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的，比如，化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。在一些实施方案中，本发明还涉及一种造血干细胞，该造血干细胞中染色体2上第60495230位至第60495249位，尤其是第60495246位的BCL11A 基因组靶序列中的一个或多个位点通过基因编辑技术被破坏。进一步，涉及通过体外分化培养该造血干细胞后得到的红细胞，以及包含该红细胞的医用制品。
在一些实施方式中，本发明提供一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白 (HbF)表达的方法，包括：通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495231位至第60495250位，尤其是第60495247位的BCL11A基因组区域。该基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术，优选为CRISPR/Cas9基因编辑技术，优选所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与包含SEQ ID NO:20的sgRNA 的引导序列互补。本发明方法涉及将包含SEQ ID NO：20的序列的sgRNA 导入造血干细胞以实现对所述BCL11A基因组的编辑，优选将所述sgRNA 与Cas9编码核苷酸(如mRNA)共同导入所述造血干细胞，优选通过电转条件为200-600V，0.5ms-2ms的电转方法来将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。在一些实施方案中，该sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的，比如，化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。在一些实施方案中，本发明还涉及一种造血干细胞，该造血干细胞中染色体2上第60495231位至第60495250位，尤其是第60495247位的BCL11A 基因组靶序列中的一个或多个位点通过基因编辑技术被破坏。进一步，涉及通过体外分化培养该造血干细胞后得到的红细胞，以及包含该红细胞的医用制品。
在一些实施方式中，本发明提供一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白 (HbF)表达的方法，包括：通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495234位至第60495253位，尤其是第60495250位的BCL11A基因组区域。该基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术，优选为CRISPR/Cas9基因编辑技术，优选所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与包含SEQ ID NO:21的sgRNA 的引导序列互补。本发明方法涉及将包含SEQ ID NO：21的序列的sgRNA 导入造血干细胞以实现对所述BCL11A基因组的编辑，优选将所述sgRNA 与Cas9编码核苷酸(如mRNA)共同导入所述造血干细胞，优选通过电转条件为200-600V，0.5ms-2ms的电转方法来将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。在一些实施方案中，该sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的，比如，化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。在一些实施方案中，本发明还涉及一种造血干细胞，该造血干细胞中染色体2上第60495234位至第60495253位，尤其是第60495250位的BCL11A 基因组靶序列中的一个或多个位点通过基因编辑技术被破坏。进一步，涉及通过体外分化培养该造血干细胞后得到的红细胞，以及包含该红细胞的医用制品。
在一些实施方式中，本发明提供一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白 (HbF)表达的方法，包括：通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495235位至第60495254位，尤其是第60495251位的BCL11A基因组区域。该基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术，优选为CRISPR/Cas9基因编辑技术，优选所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与包含SEQ ID NO:22的sgRNA 的引导序列互补。本发明方法涉及将包含SEQ ID NO：22的序列的sgRNA 导入造血干细胞以实现对所述BCL11A基因组的编辑，优选将所述sgRNA 与Cas9编码核苷酸(如mRNA)共同导入所述造血干细胞，优选通过电转条件为200-600V，0.5ms-2ms的电转方法来将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。在一些实施方案中，该sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的，比如，化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。在一些实施方案中，本发明还涉及一种造血干细胞，该造血干细胞中染色体2上第60495235位至第60495254位，尤其是第60495251位的BCL11A 基因组靶序列中的一个或多个位点通过基因编辑技术被破坏。进一步，涉及通过体外分化培养该造血干细胞后得到的红细胞，以及包含该红细胞的医用制品。
在一些实施方式中，本发明提供一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白 (HbF)表达的方法，包括：通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495236位至第60495255位，尤其是第60495238位的BCL11A基因组区域。该基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术，优选为CRISPR/Cas9基因编辑技术，优选所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与包含SEQ ID NO:4的sgRNA 的引导序列互补。本发明方法涉及将包含SEQ ID NO：4的序列的sgRNA 导入造血干细胞以实现对所述BCL11A基因组的编辑，优选将所述sgRNA 与Cas9编码核苷酸(如mRNA)共同导入所述造血干细胞，优选通过电转条件为200-600V，0.5ms-2ms的电转方法来将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。在一些实施方案中，该sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的，比如，化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。在一些实施方案中，本发明还涉及一种造血干细胞，该造血干细胞中染色体2上第60495236位至第60495255位，尤其是第60495238位的BCL11A 基因组靶序列中的一个或多个位点通过基因编辑技术被破坏。进一步，涉及通过体外分化培养该造血干细胞后得到的红细胞，以及包含该红细胞的医用制品。
在一些实施方式中，本发明提供一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白 (HbF)表达的方法，包括：通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495247位至第60495266位，尤其是第60495263位的BCL11A基因组区域。该基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术，优选为CRISPR/Cas9基因编辑技术，优选所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与包含SEQ ID NO:3的sgRNA 的引导序列互补。本发明方法涉及将包含SEQ ID NO：3的序列的sgRNA 导入造血干细胞以实现对所述BCL11A基因组的编辑，优选将所述sgRNA 与Cas9编码核苷酸(如mRNA)共同导入所述造血干细胞，优选通过电转条件为200-600V，0.5ms-2ms的电转方法来将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。在一些实施方案中，该sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的，比如，化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。在一些实施方案中，本发明还涉及一种造血干细胞，该造血干细胞中染色体2上第60495247位至第60495266位，尤其是第60495263位的BCL11A 基因组靶序列中的一个或多个位点通过基因编辑技术被破坏。进一步，涉及通过体外分化培养该造血干细胞后得到的红细胞，以及包含该红细胞的医用制品。
在一些实施方式中，本发明提供一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白 (HbF)表达的方法，包括：通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495252位至第60495271位，尤其是第60495268位的BCL11A基因组区域。该基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术，优选为CRISPR/Cas9基因编辑技术，优选所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与包含SEQ ID NO:8的sgRNA 的引导序列互补。本发明方法涉及将包含SEQ ID NO：8的序列的sgRNA 导入造血干细胞以实现对所述BCL11A基因组的编辑，优选将所述sgRNA 与Cas9编码核苷酸(如mRNA)共同导入所述造血干细胞，优选通过电转条件为200-600V，0.5ms-2ms的电转方法来将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。在一些实施方案中，该sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的，比如，化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。在一些实施方案中，本发明还涉及一种造血干细胞，该造血干细胞中染色体2上第60495252位至第60495271位，尤其是第60495268位的BCL11A 基因组靶序列中的一个或多个位点通过基因编辑技术被破坏。进一步，涉及通过体外分化培养该造血干细胞后得到的红细胞，以及包含该红细胞的医用制品。
在一些实施方式中，本发明提供一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白 (HbF)表达的方法，包括：通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495253位至第60495272位，尤其是第60495269位的BCL11A基因组区域。该基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术，优选为CRISPR/Cas9基因编辑技术，优选所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与包含SEQ ID NO:7的sgRNA 的引导序列互补。本发明方法涉及将包含SEQ ID NO：7的序列的sgRNA 导入造血干细胞以实现对所述BCL11A基因组的编辑，优选将所述sgRNA 与Cas9编码核苷酸(如mRNA)共同导入所述造血干细胞，优选通过电转条件为200-600V，0.5ms-2ms的电转方法来将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。在一些实施方案中，该sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的，比如，化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。在一些实施方案中，本发明还涉及一种造血干细胞，该造血干细胞中染色体2上第60495253位至第60495272位，尤其是第60495269位的BCL11A 基因组靶序列中的一个或多个位点通过基因编辑技术被破坏。进一步，涉及通过体外分化培养该造血干细胞后得到的红细胞，以及包含该红细胞的医用制品。
在一些实施方式中，本发明提供一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白(HbF)表达的方法，包括：通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495257位至第60495276位，尤其是第60495273位的BCL11A基因组区域。该基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术，优选为CRISPR/Cas9基因编辑技术，优选所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与包含SEQ ID NO:6的sgRNA 的引导序列互补。本发明方法涉及将包含SEQ ID NO：6的序列的sgRNA 导入造血干细胞以实现对所述BCL11A基因组的编辑，优选将所述sgRNA 与Cas9编码核苷酸(如mRNA)共同导入所述造血干细胞，优选通过电转条件为200-600V，0.5ms-2ms的电转方法来将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。在一些实施方案中，该sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的，比如，化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。在一些实施方案中，本发明还涉及一种造血干细胞，该造血干细胞中染色体2上第60495257位至第60495276位，尤其是第60495273位的BCL11A 基因组靶序列中的一个或多个位点通过基因编辑技术被破坏。进一步，涉及通过体外分化培养该造血干细胞后得到的红细胞，以及包含该红细胞的医用制品。
在一些实施方式中，本发明提供一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白 (HbF)表达的方法，包括：通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495264位至第60495283位，尤其是第60495280位的BCL11A基因组区域。该基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术，优选为CRISPR/Cas9基因编辑技术，优选所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与包含SEQ ID NO:5的sgRNA 的引导序列互补。本发明方法涉及将包含SEQ ID NO：5的序列的sgRNA 导入造血干细胞以实现对所述BCL11A基因组的编辑，优选将所述sgRNA 与Cas9编码核苷酸(如mRNA)共同导入所述造血干细胞，优选通过电转条件为200-600V，0.5ms-2ms的电转方法来将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。在一些实施方案中，该sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的，比如，化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。在一些实施方案中，本发明还涉及一种造血干细胞，该造血干细胞中染色体2上第60495264位至第60495283位，尤其是第60495280位的BCL11A 基因组靶序列中的一个或多个位点通过基因编辑技术被破坏。进一步，涉及通过体外分化培养该造血干细胞后得到的红细胞，以及包含该红细胞的医用制品。
在一些实施方式中，本发明提供一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白 (HbF)表达的方法，包括：通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495299位至第60495318位，尤其是第60495301位的BCL11A基因组区域。该基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术，优选为CRISPR/Cas9基因编辑技术，优选所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与包含SEQ ID NO:24的sgRNA 的引导序列互补。本发明方法涉及将包含SEQ ID NO：24的序列的sgRNA 导入造血干细胞以实现对所述BCL11A基因组的编辑，优选将所述sgRNA 与Cas9编码核苷酸(如mRNA)共同导入所述造血干细胞，优选通过电转条件为200-600V，0.5ms-2ms的电转方法来将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。在一些实施方案中，该sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的，比如，化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。在一些实施方案中，本发明还涉及一种造血干细胞，该造血干细胞中染色体2上第60495299位至第60495318位，尤其是第60495301位的BCL11A 基因组靶序列中的一个或多个位点通过基因编辑技术被破坏。进一步，涉及通过体外分化培养该造血干细胞后得到的红细胞，以及包含该红细胞的医用制品。
在一些实施方式中，本发明提供一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白 (HbF)表达的方法，包括：通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495319位至第60495338位，尤其是第60495335位的BCL11A基因组区域。该基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术，优选为CRISPR/Cas9基因编辑技术，优选所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与包含SEQ ID NO:25的sgRNA 的引导序列互补。本发明方法涉及将包含SEQ ID NO：25的序列的sgRNA 导入造血干细胞以实现对所述BCL11A基因组的编辑，优选将所述sgRNA 与Cas9编码核苷酸(如mRNA)共同导入所述造血干细胞，优选通过电转条件为200-600V，0.5ms-2ms的电转方法来将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。在一些实施方案中，该sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的，比如，化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。在一些实施方案中，本发明还涉及一种造血干细胞，该造血干细胞中染色体2上第60495319位至第60495338位，尤其是第60495335位的BCL11A 基因组靶序列中的一个或多个位点通过基因编辑技术被破坏。进一步，涉及通过体外分化培养该造血干细胞后得到的红细胞，以及包含该红细胞的医用制品。
在一些实施方式中，本发明提供一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白 (HbF)表达的方法，包括：通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495320位至第60495339位，尤其是第60495336位的BCL11A基因组区域。该基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术，优选为CRISPR/Cas9基因编辑技术，优选所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与包含SEQ ID NO:23的sgRNA 的引导序列互补。本发明方法涉及将包含SEQ ID NO：23的序列的sgRNA 导入造血干细胞以实现对所述BCL11A基因组的编辑，优选将所述sgRNA 与Cas9编码核苷酸(如mRNA)共同导入所述造血干细胞，优选通过电转条件为200-600V，0.5ms-2ms的电转方法来将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。在一些实施方案中，该sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的，比如，化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。在一些实施方案中，本发明还涉及一种造血干细胞，该造血干细胞中染色体2上第60495320位至第60495339位，尤其是第60495336位的BCL11A 基因组靶序列中的一个或多个位点通过基因编辑技术被破坏。进一步，涉及通过体外分化培养该造血干细胞后得到的红细胞，以及包含该红细胞的医用制品。
进一步，在本发明中，发明人设计的23条sgRNA均能有效产生Indels，即可以高效地进行基因编辑，本发明优选的sgRNA选自SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：25中任一个，所述sgRNA对应的靶序列的切割位点的序列位于 chr2:60495219～chr2:60495336(即染色体2上的第60495219位至第60495336 之间)。
具体来说，下表列出了本发明涉及的23条sg RNA所靶向的人染色体2 上的基因组序列位置，以及每条sgRNA引发的Cas9切割位点。
分析上述23条sg RNA的切割位点发现，这些sgRNA所引发的Cas9 切割位置集中在BCL11A基因第60495219位至第60495336位基因组区域。
本发明的一个具体的实施方式还包括sgRNA的组合物，其包括本发明涉及的上述23条sgRNA或其载体。
一般而言，sgRNA中的指导序列是与靶多核苷酸序列具有足够的互补性以与靶序列杂交并指导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用适当的比对算法最佳比对时，指导序列及其相应靶序列间的互补程度为约或大于约80％、85％、90％、95％、 97.5％、99％或更多。最佳比对可使用用于比对序列的任何适当的算法确定，其非限制性实例包括Smith-Waterman算法、Needleman-Wimsch算法、基于 Burrows-Wheeler Transform的算法(例如Burrows Wheeler Aligner)、ClustalW、Clustai X、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies,ELAND((Illumina,San Diego,CA)、SOAP(可在soap.genomics.org.cn获得)和Maq(可在 maq.sourceforge.net获得)。在一些实施方案中，指导序列长度可以为约或大于约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或更多个核苷酸。在一些实施方案中，指导序列长度少于约75、70、65、60、55、50、 45、40、35、30、25、20、15、12或更少的核苷酸。指导序列指导CR1SPR 复合物与靶序列的序列特异性结合的能力可通过任何适当的测定方法评估。例如，可向具有相应靶序列的宿主细胞提供足以形成CRISPR复合物的 CRISPR系统的组件(包括待测试的指导序列)，如可通过使用编码CRISPR 序列组件的载体转染，随后评估靶序列内的优先切割(如通过如本文所述的 Surveyor测定)来进行。同样地，靶多核苷酸序列的切割可在测试管中通过提供靶序列、CRISPR复合物(包含待测试的指导序列和不同于指导序列的对照指导序列)的组件，并比较测试和对照指导序列在靶序列的结合或切割率，以此进行评估。也可以使用本领域技术人员知道的其它测定方法进行上述测定和评估。
在本发明中，进行基因编辑过程中所使用的sgRNA优选是经过化学修饰的。“化学修饰的sgRNA”指针对sgRNA进行特殊的化学修饰，例如在其 5’和3’末端3个碱基处的2’-O-甲基类似物修饰和/或核苷酸间的3’硫代修饰。
本发明人采用的经过化学修饰的sgRNA认为具有以下两个优点。第一、由于sgRNA是单链形式的RNA，其半衰期非常短，进入到细胞后，会迅速降解(最长不超过12小时)，而Cas9蛋白结合sgRNA发挥基因编辑作用则至少需要48hrs。因此，采用经过化学修饰的sgRNA，进入细胞后，稳定表达，与Cas9蛋白结合后，能高效基因编辑基因组，产生Indels。第二、未经修饰的sgRNA穿透细胞膜能力差，无法有效进入细胞或组织发挥相应功能。而经过了化学修饰的sgRNA穿透细胞膜的能力通常是增强的。在本发明中可以采用本领域中常用的化学修饰方法，只要能够提高sgRNA稳定性(延长半衰期)和提升进入细胞膜能力，均可以使用。除了实施例中使用的具体的化学修饰之外，还包括采用其它的修饰方法，例如，Deleavey GF1,Damha MJ. Designing chemically modified oligonucleotides fortargeted gene silencing. Chem Biol.2012Aug 24；19(8):937-54，以及Hendel etal.Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in humanprimary cells.Nat Biotechnol.2015Sep；33(9):985-989文献中报道的化学修饰方法。
在一些实施方案中，所述sgRNA和/或Cas9编码核苷酸(如mRNA) 通过电转导入造血干细胞，例如，通过250-360V，0.5-1ms；250-300V，0.5-1ms； 250V 1ms；250V 2ms；300V0.5ms；300V 1ms；360V 0.5ms；或360V1ms的电转条件导入造血干细胞。在一些实施方案中，所述sgRNA和Cas9编码核苷酸通过电转方式共同导入造血干细胞。在一些实施方案中，所述sgRNA通过电转方式导入表达Cas9的造血干细胞。
在一些实施方案中，所述Cas9编码核苷酸为mRNA，如含有ARCA帽的mRNA。在一些实施方案中，所述Cas9编码核苷酸在病毒载体中，如慢病毒载体。在一些实施方案中，所述Cas9编码核苷酸包含如SEQ ID NO： 26所述的序列。在一些实施方案中，所述sgRNA与Cas9编码核苷酸在同一载体中。
本发明涉及利用本发明涉及的基因改造方法获得的造血干细胞，以及通过分化培养经所述基因改造得到的造血干细胞获得的、处于成熟红细胞之前的不同分化阶段的前体细胞，以及分化培养经所述基因改造得到的造血干细胞获得的成熟红细胞。
本发明涉及包含通过本发明的方法获得的药物组合物，其包括利用本发明涉及的基因改造方法获得的造血干细胞，或者通过分化培养经所述基因改造得到的造血干细胞获得的、处于成熟红细胞之前的不同分化阶段的前体细胞，或者分化培养经所述基因改造得到的造血干细胞获得的成熟红细胞。
本发明涉及的药物组合物可以通过给药包含细胞成分的医药制品常规使用的途径，例如静脉输注途径，给药有此需要的受试者。给药剂量可以基于受试者的病情和一般健康状况具体确定。
在一些方面，本发明提供向造血干细胞递送包含本发明所述sgRNA和/ 或Cas9编码核苷酸的方法。在一些实施方案中，所述递送可使用常规的病毒和不基于病毒的基因转移方法将所述构建体引入造血干细胞或其它宿主细胞。非病毒递送系统包括DNA质粒、RNA(例如本文所述的载体转录物)、裸核酸和脂质体。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，其具有用于递送至细胞的游离或整合的基因组。在一些实施方案中，发明人利用电转方法将Cas9和sgRNA的编码基因导入造血干细胞中对造血干细胞BCL11A基因的具体序列进行基因编辑。经过反复实验，发明人发现在200-600v， 0.5ms-2ms的电转条件下将Cas9的编码核苷酸和sgRNA共同导入造血干细胞的基因编辑效率显著高于其它电转条件下的基因编辑效率。
在一些实施方案中，经过化学修饰的sgRNA与Cas9编码基因共同电转进入CD34+的造血干细胞，产生高效的基因编辑效率(以Indels％表示)。实施例中的数据显示，如果和Cas9mRNA一起电转的是未经化学修饰的 sgRNA，其Indels效率只有2.7％，远远低于电转经化学修饰的sgRNA时获得的Indels效率(效率至少为10％以上)。
如本申请使用的，“Indel”全称为插入/缺失,即插入和缺失突变。
如本文使用，“造血干细胞(hematopoietic stem and progenitor cells,HSPCs)”是发生各种血细胞的最原始的造血细胞。其主要特点是具有旺盛的增殖潜力、多向分化的能力和自我更新能力，因此，它不仅能分化、补充各种血细胞，还能通过自我更新保持干细胞的特性和数量。造血干细胞的分化程度和增殖能力不一，有异质性。多能造血干细胞最原始，先分化为定向多能造血干细胞，例如能生成粒系、红系、单核系和巨核-血小板系的髓系造血干细胞及能发生B淋巴细胞和T淋巴细胞的淋巴干细胞。这两类干细胞既保持着造血干细胞基本特点，又略有分化，分别负责“骨髓成分”和淋巴细胞的发生，故称定向多能造血干细胞。它们进一步分化成为造血祖细胞，此细胞虽然也是原始的血细胞，但是它已丧失造血干细胞的许多基本特点，如已失去多向性分化能力，只能朝向一系或密切相关的二系细胞分化；失去了反复自我更新能力，而要依靠造血干细胞的增殖分化来补充数量；增殖潜力有限，只能分裂数次。根据造血祖细胞所能分化生成的血细胞系多少，又分为单能造血祖细胞(只分化为一个血细胞系)和寡能造血祖细胞(可分化为 2～3个血细胞系)。本发明“造血干细胞”术语涵盖多能造血干细胞、定向多能造血干细胞和造血祖细胞，是具有不同异质性的造血干细胞的总称。
在本发明的具体的实施方式中，本发明使用的待进行基因编辑的造血干细胞(HSPCs)可来源于骨髓、脐带血或外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclearcell,PBMC)。
如本申请使用的，“CRISPR RGEN”是由韩国科学家Jin-Soo Kim的科研团队开发的专门用于设计sgRNA的网站名称，其网址为 www.rgenome.net/about/。
如本文使用，“TIDE”指专门用于分析Indels效率的工具性网站名称，其网址为tide-calculator.nki.nl。
如本文使用，“CD34、CD45RA、CD3、CD4、CD8、CD33、CD19、CD56、 CD71、CD235a”是血液系统细胞的膜蛋白标志物。
如本文使用，“BCL11A”是一种转录因子，首先在小鼠中发现，作为逆转录病毒的结合位点，被命名为Evi9,后来在人类基因组中也发现这一基因，定位于2号染色体短臂2p13位点，主要在B淋巴细胞的生发中心表达。
如本文使用，“HBB/HBG”是血红蛋白的不同亚型。血红蛋白是高等生物体内负责运载氧气的一种蛋白质。血红蛋白由四条链组成，两条α链和两条β链，每一条链有一个包含一个铁原子的环状血红素。氧结合在铁原子上，由红细胞运输，供机体利用。
进一步，本发明还涉及一种造血干细胞，其是利用上述本发明的方法，通过CRISPR/Cas9编辑技术基因编辑造血干细胞BCL11A的具体序列之后得到的造血干细胞。此外，包含该造血干细胞的制品也在本发明的范围之内。
本发明涉及的造血干细胞或制品可以用于治疗选自贫血性疾病、失血性疾病、肿瘤或其它需要大量输血进行治疗的疾病。尤其是可以用于治疗β- 地中海贫血或镰刀形红细胞贫血。
进一步，本发明涉及一种红细胞，其是通过下述体外分化培养通过本发明获得的经过基因编辑的造血干细胞而获得的。
进一步，本发明涉及从造血干细胞到成熟红细胞之间各个分化阶段的前体细胞，其是通过下述造血干细胞红系扩增和分化步骤处理本发明获得的经过基因编辑的造血干细胞而获得的。
其中，上述体外分化培养包括：造血干细胞红系扩增和分化步骤；以及造血干细胞红系分化脱核步骤。
所述红系扩增和分化步骤使用造血干细胞红系扩增和分化培养基对造血干细胞进行培养。
所述红系分化脱核步骤使用红系分化脱核培养基。
在一些实施方案中，所述造血干细胞红系扩增和分化培养基包含：基础培养基，以及生长因子的组合物，其中，所述生长因子的组合物包括：干细胞生长因子，即SCF；白介素3，即IL-3；以及促红细胞生成素，即EPO。
在一些实施方案中，所述红系分化脱核培养基包含基础培养基、生长因子、以及孕酮受体和糖皮质激素受体的拮抗剂和/或抑制剂。
利用上述方法培养经基因编辑之后的造血干细胞，该造血干细胞可以通过两步向成熟的红细胞的分化，相比较现有技术，利用本发明的体外分化培养，只需14天，时间更短，相比于现有技术中必须要21天以上，该周期被大幅缩短。
在一些实施方案中，所述生长因子包括促红细胞生成素，即EPO，所述孕酮受体和糖皮质激素受体的拮抗剂和/或抑制剂为选自下述化合物(I)～(IV) 中的任一种或两种及以上：
在一些实施方案中，所述造血干细胞红系扩增和分化培养基包含基础培养基，所述基础培养例如STEMSPANTMSFEM II(STEM CELLS TECHNOLOGY Inc.),IMDM(Iscove'sModified Dulbecco's Medium),X-VIVO 15,alpha-MEM,RPMI 1640和DF12等。所述生长因子，例如基础培养基若选用STEMSPANTMSFEM II，则需要额外添加的生长因子包括50-200ng/ml SCF,10-100ng/ml IL-3,1-10U/ml EPO，其中U的单位定义为：在特定的条件下，1min能转化1μmol底物的蛋白量，即1IU＝1μmol/min。目前国内外大多数临床实验室常省略国际二字，即将IU简写为U。EPO，促红细胞生成素，主要是由肾脏为了响应低氧或者贫血而分泌的糖蛋白，在本实施例中，能促进造血干细胞向分化。通常发挥作用时间是7天左右。
基础培养基若选用STEMSPANTMSFEM II外其它的基础培养基，则需要添加有100XITS(insuin-transferrin-selenium)(其中培养基中ITS中各物质的终浓度是：胰岛素浓度是0.1mg/ml、人转铁蛋白是0.0055mg/ml、硒元素 6.7*10-6mg/ml)(即主要包括胰岛素、人转铁蛋白以及硒元素),10-50μg/ml维生素C,0.5-5％BSA(Bovine serum albuin，牛血清白蛋白)，生长因子，例如 50-200ng/ml SCF,10-100ng/ml IL-3,1-10U/ml EPO。
此外，本领域技术人员可以理解，任何常用的基础培养基均可以使用。例如可以列举本领域中常用的基础培养基，例如STEMSPANTMSFEM II(购自STEM CELL TECHONOLOGIES)；例如购自Thermo Fisher的IMDM、 DF12、Knockout DMEM、RPMI 1640、Alpha MEM、DMEM等。
此外，可以根据需要进一步在上述培养基中外加一些其他成分，例如可以外加ITS(即主要包括胰岛素、人转铁蛋白以及硒元素)、L-谷氨酰胺、维生素C以及牛血清白蛋白。例如可以在IMDM培养基中外加ITS、外加2mM L-谷氨酰胺、外加10-50μg/ml维生素C以及0.5-5质量％的BSA(牛血清白蛋白)。此外，上述DF12可以外加同样浓度的ITS，L-谷氨酰胺，维生素C 和牛血清白蛋白。Knockout DMEM可以外加同样浓度的ITS，L-谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白，RPMI 1640可以外加同样浓度的ITS，L-谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白，Alpha MEM可以外加同样浓度的ITS，L- 谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白，DMEM也可以外加同样浓度的ITS， L-谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白。在此，各种基础培养基中外加的ITS 的浓度可以是：胰岛素浓度是0.1mg/ml、人转铁蛋白是0.0055mg/ml、硒元素6.7×10- 6mg/ml。此外，外加的ITS各成分的浓度也可以根据实际需要来调整。ITS可以从Thermofisher购买，并根据需要调节成合适的最终使用浓度。
在一个实施方案中，所述红系分化脱核培养基包含基础培养基、生长因子和孕酮受体和糖皮质激素受体的拮抗剂。
在一个实施方案中，所述造血干细胞红系分化脱核培养基包含基础培养基，例如STEMSPANTMSFEM II(STEM CELLS TECHNOLOGY Inc.),IMDM (Iscove's ModifiedDulbecco's Medium),X-VIVO 15,alpha-MEM,RPMI 1640 和DF12等。还包含生长因子，例如基础培养基若选用STEMSPANTMSFEM II，则需要额外添加的生长因子包括1-10U/ml EPO,100-1000μg/ml human transferrin(人转铁蛋白)，化学小分子为0.5-10μmol//mlmifepristone。
基础培养基若选用STEMSPANTMSFEM II外其它的基础培养基，则需要添加例如ITS(insuin-transferrin-selenium)(其中培养基中ITS中各物质的终浓度是：胰岛素浓度是0.1mg/ml、人转铁蛋白是0.0055mg/ml、硒元素6.7×10-6 mg/ml)(即主要包括胰岛素、人转铁蛋白以及硒元素),10-50ug/ml维生素C, 0.5-5％BSA(Bovine serum albuin,牛血清白蛋白)，生长因子，例如1-10U/ml EPO，100-1000ug/ml人转铁蛋白，化学小分子例如0.5-10μmol//ml mifepristone。
此外，本领域技术人员可以理解，任何常用的基础培养基均可以使用。例如可以列举本领域中常用的基础培养基，例如STEMSPANTMSFEM II(购自STEM CELL TECHONOLOGIES)；例如购自Thermo Fisher的IMDM、 DF12、Knockout DMEM、RPMI 1640、Alpha MEM、DMEM等。
此外，可以根据需要进一步在上述培养基中外加一些其他成分，例如可以外加ITS(即主要包括胰岛素、人转铁蛋白以及硒元素)、L-谷氨酰胺、维生素C以及牛血清白蛋白。例如可以在IMDM培养基中外加ITS、外加2mM L-谷氨酰胺、外加10-50μg/ml维生素C以及0.5-5质量％的BSA(牛血清白蛋白)。此外，上述DF12可以外加同样浓度的ITS，L-谷氨酰胺，维生素C 和牛血清白蛋白。Knockout DMEM可以外加同样浓度的ITS，L-谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白，RPMI 1640可以外加同样浓度的ITS，L-谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白，Alpha MEM可以外加同样浓度的ITS，L- 谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白，DMEM也可以外加同样浓度的ITS， L-谷氨酰胺，维生素C和牛血清白蛋白。在此，各种基础培养基中外加的ITS 的浓度可以是：胰岛素浓度是0.1mg/ml、人转铁蛋白是0.0055mg/ml、硒元素6.7×10- 6mg/ml。此外，外加的ITS各成分的浓度也可以根据实际需要来调整。ITS可以从Thermofisher购买，并根据需要调节成合适的最终使用浓度。
本文中使用的mifepristone是一种化学合成的小分子，该小分子是孕酮受体和糖皮质激素受体的拮抗剂，结构式如下：
其它孕酮受体和糖皮质激素受体的拮抗剂和抑制剂也可应用到本发明中，包括Cyproterone Acetate，Geldanamycin，CORT 108297等。化学结构式如下：
在一些实施方案中，本发明的成熟红细胞可通过包括下列a)-c)步骤的方法产生：a)使用本发明所述的任一方法对从人脐带血中分离CD34阳性的 HSPCs进行基因改造；b)将基因改造后的HSPCs经过5-10天，例如5天、6 天、7天、8天、9天、10天，扩增和分化后获得红细胞前体细胞，例如成红细胞(erythroblast)、有核红细胞、幼红细胞和网织红细胞，c)将红细胞前体细胞再经过7天的分化处理获得成熟的红细胞。
在一些实施方案中，本发明的成熟红细胞成熟的红细胞可通过包括下列步骤a)-d)的方法产生：
a)从人脐带血中通过磁珠分选的方法分离CD34阳性的HSPCs；
b)使用本发明所述的任一方法对所述的CD34阳性的HSPCs进行基因改造；
c)在无血清培养基(Serum-free medium(SFME))中，添加额外的生长因子，经过5-10天，例如5天、6天、7天、8天、9天、10天扩增和分化后，将HSPCs分化成为红细胞前体细胞，该阶段的培养基命名为造血干细胞红系扩增和分化培养基(HSPCs erythroid expansionand differentiatin medium；缩写为HEEDM)；
d)在无血清培养基(Serum-free medium(SFME))中，添加额外的生长因子，经过7天分化后，即可获得成熟的红细胞，该阶段的培养基命名为：造血干细胞红系分化脱核培养基(HSPCs erythroid differentiation enucleation medium,缩写为HEDEM)。
即针对经过编辑的CD34阳性的造血干细胞，利用上述本发明的方法可以通过两步就可以获得成熟的红细胞，整个过程的时间可以为10-18天、 11-17天、12-16天、13-15天、10-17天、10-16天、10-15天或10-14天，这个时间将现有技术中利用三步或者四步的方法中的至少21天的周期大大缩短。
如上所述，本发明涉及一种制造通过基因改造使胎儿血红蛋白(HbF)表达升高的成熟红细胞或其前体细胞的方法，该方法包括：(a)使用本发明的所涉及的基因改造方法得到造血干细胞；(b)使用上述造血干细胞红系扩增和分化培养基对基因改造过的造血干细胞进行造血干细胞红系扩增和分化。
进一步，本发明涉及一种制造通过基因改造使胎儿血红蛋白(HbF)表达升高的成熟红细胞或其前体细胞的方法，该方法包括：(a)使用本发明的所涉及的基因改造方法得到造血干细胞；(b)使用上述造血干细胞红系扩增和分化培养基对基因改造过的造血干细胞进行造血干细胞红系扩增和分化；以及(c) 使用红系分化脱核培养基进行造血干细胞红系分化脱核。本发明还涉及上述方法中使用的造血干细胞红系扩增和分化培养基和/或红系分化脱核培养基在扩增和/或分化造血干细胞或成熟红细胞的前体细胞中的用途。
如本申请使用的，“分化”指其中细胞的结构或功能在分裂、增殖和其生长过程中特化的现象，即，生物体细胞或组织的特征和功能改变以实施给予细胞或组织的功能。一般而言，其指其中相对简单的系统分为两种或多种性质不同的部分系统的现象。
如本申请使用的，“Ficoll液密度梯度离心法”，其基本原理是血液中的不同成分的比重存在差异，在低速密度梯度离心时，可将不同的细胞层粉离开。红细胞和粒细胞密度大于分层液体，并且因红细胞遇到ficoll液之后会迅速凝集成串钱状而积于管底。唯有于分层液体密度相当的单个核细胞富集在血浆层和分层液之间，即白膜层，造血干细胞即存在于此层，通过后续磁珠分选即可获得。在本发明中，单个核细胞是利用商售的淋巴细胞分离管获得。
如本申请使用的，“成熟红细胞”是指血液中含量最多的一类细胞，具有携带氧气、氨基酸、二氧化碳等营养物质的功能。成熟的红细胞没有线粒体和细胞核。
如本申请使用的，“白介素3,IL-3”是指由激活的CD4和CD8阳性的T 淋巴细胞产生的一种细胞因子，其主要生物学功能是参与调控骨髓中造血干细胞的增殖和分化。
如本申请使用的，“促红细胞生成素，Erythropoietin，EPO”是指 erythroblasts即红细胞前体细胞分泌产生的一种生长因子。在成体中，是有肾皮质肾小管周围间质细胞和肝脏分泌产生的糖蛋白。EPO能刺激造血干细胞分化形成成红细胞。
在一些实施方案中，干细胞因子，stem cell factor(SCF)包括肥大细胞生长因子(MGF)，Kit配体(KL)及Steel因子(SLF)。
如本申请使用的，“造血干细胞红系扩增和分化培养基”是指帮助 HSPCs的细胞大量扩增和向红系祖细胞分化的配演体系。本发明中该培养基包含两种主要成分，分别是基础培养基和生长因子添加剂。基础培养基是无血清体系，可以是STEMSPANTMSFEM II(STEMCELLS TECHNOLOGY Inc.),也可以是IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)，外加ITS (Thermofisher)和L-gulutamin(Thermofisher)和维生素C和牛血清白蛋白。生长因子添加剂为IL-3,SCF,EPO的不同浓度的组合。
如本申请使用的，“造血干细胞红系分化脱核培养基”是指帮助红系祖细胞进一步扩增分化成为脱核的红细胞培养基。本发明中该培养基包含两种主要成分，分别是基础培养基和生长因子及化学小分子添加剂。基础培养基是无血清体系，可以是STEMSPANTMSFEMII(STEM CELLS TECHNOLOGY Inc.),也可以是IMDM(Iscove's Modified Dulbecco'sMedium)，外加ITS (Thermofisher)和L-gulutamin(Thermofisher)和维生素C和牛血清白蛋白。生长因子及化学小分子添加剂包括EPO和人转铁蛋白，以及化学小分子mifepristone。
在一些实施方案中，造血干细胞通过磁珠分选，例如把细胞用超级顺磁性的MACSMicroBeads(MACS微型磁珠)特异性地标记，磁性标记完后，把这些细胞通过一个放在强而稳定磁场中的分选柱。分选柱里的基质造成一个高梯度磁场。
被磁性标记的细胞滞留在柱里而未被标记的细胞则流出。当分选柱移出磁场后，滞留柱内的磁性标记细胞就可以被洗脱出来，这样就完全可以获得标记和未标记的两个细胞组份。
在本发明的一些具体的实施方式中，利用本发明的所述的sgRNA，通过本发明描述的基因改造方法，对3个不同的脐带血来源的造血干细胞进行改造，可以实现高效基因编辑，效率达到至少40％以上，例如50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、或90％以上。例如，甚至于针对于优选的sgRNA，平均基因编辑效率达到80％。
在本发明的一些具体实施方式中，向小鼠移植了经本发明基因编辑方法得到的造血干细胞，与移植了未经过基因编辑的造血干细胞相比，在移植了经基因编辑的造血干细胞之后，小鼠人源的hCD45表达比例持续增高，在外周血样品中，由第6周的20％提高到16周的60％，16周的骨髓中比例甚至达到90％，脾脏达到70％,表明经过基因编辑的造血干细胞能够快速、高效地植入小鼠模型的造血系统，细胞体内分化功能正常。
在本发明的一些具体实施方式中，利用本发明的基因编辑方法对脐带血来源的造血干细胞进行改造，然后利用本发明的“两步法”分化方法进行分化，即利用造血干细胞红系扩增和分化培养基进行扩增和分化，然后利用造血干细胞红系分化脱核培养基进行进一步分化。通过检测显示，分化后的红细胞其血红蛋白(hemoglobin，HBG)表达相比于原始的红细胞的HBG表达提高了20％-90％、甚至于提高了100％，即提高约1倍(为原始的2倍)，胎儿血红蛋白表达相比于原始的红细胞的胎儿血红蛋白的表达也提高了 20％-90％、甚至于高达100％，即提高约1倍(为原始的2倍)，甚至于高达 200％，即提高约2倍(为原始的3倍)，甚至于高达300％，即提高约3倍(为原始的4倍)，甚至于高达400％，即提高约4倍(为原始的5倍)，甚至于高达500％以上，即提高约5倍以上(为原始的6倍以上)等。
实施例
此后，本发明将参照实施例进一步说明。对本领域的技术人员显而易见的是这些实施例仅出于说明目的而不应理解为对本发明保护范围的限制。因此，本发明的实质性保护范围将通过所附权利要求和其等同物限定。
实施例1：高效基因编辑脐带血来源的CD34阳性的造血干细胞
1-1:利用K562细胞测试电转条件
由于造血干细胞来源少且单次分离成本高，因此在本实施例中选择癌症细胞系K562(购买自ATCC公司，网址：https://www.atcc.org)作为测试电转条件的模型细胞系。
具体地，以下为具体实施步骤。
第一批实验：电转5×105个K562细胞，GFP mRNA(序列如SEQ ID No.1 所示)的量为5μg,选用BTX830电转仪器，分别测试在250V 1ms,360V 1ms, 400V 1ms,500V 1ms的条件下，4天后流式分析实验检测GFP表达和7-AAD 表达，GFP表示电转效率，7-AAD表示电转后细胞的生长状态即活力 (viability)。
SEQ ID No.1：GFP mRNA的序列信息：
atgagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatgggcacaaattt tctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacggaaaacttacccttaaatttatttgcactactggaaaactac ctgttccatggccaacacttgtcactactttctcttatggtgttcaatgcttttcaagatacccagatcatatgaaacggca tgactttttcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaaagaactatatttttcaaagatgacgggaactacaag acacgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatagaatcgagttaaaaggtattgattttaaagaagatgg aaacattcttggacacaaattggaatacaactataactcacacaatgtatacatcatggcagacaaacaaaagaatgg aatcaaagttaacttcaaaattagacacaacattgaagatggaagcgttcaactagcagaccattatcaacaaaatact ccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtccacacaatctgccctttcgaaagatcccaacg aaaagagagaccacatggtccttcttgagtttgtaacagctgctgggattacacatggcatggatgaactatacaaata g。
第二批实验：电转5×105K562细胞，上述GFP mRNA的量为5μg,选用 BTX830电转仪器，测试分别在250V 1ms,250V 2ms,300V 0.5ms,300V 1ms， 360V 0.5ms,360V1ms条件下，4天后流式分析实验检测GFP表达和7-AAD 表达，GFP表示电转效率，7-AAD表示电转后细胞的生长状态即活力 (viability)。
第三批实验：电转5×105K562细胞，上述GFP mRNA的量为5μg,选用 BTX830电转仪器，测试分别在250V 1ms,250V 1ms,300V 1ms,300V 1ms 条件下，4天后流式分析实验检测GFP表达和7-AAD表达，GFP表示电转效率，7-AAD表示电转后细胞的生长状态即活力(viability)。结果如图2和3 所示。
其中，图2显示在癌症细胞系K562上进行多批次实验检测的最佳电转条件下，在电转GFP 4天后的荧光显微镜拍照图。“V”指脉冲电压，“ms”指脉冲时间。
图3在癌症细胞系K562上进行多批次实验检测的最佳电转条件下，在电转GFP 4天后，流式分析7-AAD和GFP表达统计分析图，流式分析中的 7-AAD阴性代表细胞活率，7-AAD(7-氨基-放线菌素D)是一种核酸染料，它不能通过正常质膜，随着细胞凋亡、细胞死亡过程，质膜对7-AAD的通透性逐渐增加，在合适波长激发光的激发下可发出明亮的红色荧光，7-AAD 阴性为正常活力细胞；GFP效率表示电转效率。其中，以“250-1”为例，其表示250V电压，1ms脉冲时间。
本实验的数据表明针对癌症细胞系K562，在“300V 1ms”的电转条件下，电转效率和细胞活率的综合指标最高，在以后的实验中将作为后续实验的电转条件。
1-2.利用300v 1ms电转GFP mRNA进入造血干细胞
选取上一步骤中效率和活率最高的条件300V 1ms，向5×105造血干细胞 (购买自澳赛尔斯生物技术(上海)有限公司,www.allcells.c)电转上述GFP mRNA，4天后检测GFP和CD34的表达情况。结果如图4、5所示。
其中，图4为在300V,1ms电转条件下，电转上述GFP mRNA进入造血干细胞4天后的荧光显微镜拍照图，分别包括明场、绿色通道、红色通道和明场绿色通道叠加四个视野。
图5为在300V,1ms电转条件下，电转GFP mRNA进入造血干细胞4 天后流式分析GPF和CD34蛋白表达情况。其中图5中的对照组是造血干细胞，但是没有转入GFP mRNA,且流式分析不染CD34抗体的情况。
根据图4和5的结果可以看出，本实验的数据显示利用“300V 1ms”的电转条件，在脐带血来源的造血干细胞上GFP的表达比例高。
1-3:利用CRISPR/Cas9电转脐带血来源的造血干细胞来编辑BCL11A位点
A、针对BCL11A的增强子58K位点(该目标58K位点的序列如SEQ ID NO:2所示)，利用“CRISPR RGEN TOOLS”软件设计针对BCL11A(+58)位点的多条sgRNA并合成经过化学修饰的sgRNA，信息如图6、7、8所示。
SEQ ID NO:2：CL11Aenhancer 58K位点150bp序列：
ctgccagtcctcttctaccccacccacgcccccaccctaatcagaggccaaacccttcctggagcctgtgataaa agcaactgttagcttgcactagactagcttcaaagttgtattgaccctggtgtgttatgtctaagagtagatgcc
SEQ ID NO:3：名称为BCL11A的增强子-1的sgRNA(有时也简称为 enhancer-1)：
cacaggctccaggaagggtt
SEQ ID NO:4：名称为BCL11A的增强子-2的sgRNA(有时也简称为 enhancer-2)：
atcagaggccaaacccttcc
SEQ ID NO:5：名称为BCL11A的增强子-3的sgRNA(有时也简称为 enhancer-3)：
Ctaacagttgcttttatcac
SEQ ID NO:6：名称为BCL11A的增强子-4的sgRNA(有时也简称为 enhancer-4)：
ttgcttttatcacaggctcc
SEQ ID NO:7：名称为BCL11A的增强子-5的sgRNA(有时也简称为 enhancer-5)：
ttttatcacaggctccagga
SEQ ID NO:8：名称为BCL11A的增强子-6的sgRNA(有时也简称为 enhancer-6)：
tttatcacaggctccaggaa
SEQ ID NO:9：名称为BCL11A的增强子-7的sgRNA(有时也简称为 enhancer-7)：
tgggtggggtagaagaggac
SEQ ID NO:10：名称为BCL11A的增强子-8的sgRNA(有时也简称为 enhancer-8)：
gggcgtgggtggggtagaag
SEQ ID NO:11：名称为BCL11A的增强子-9的sgRNA(有时也简称为 enhancer-9)：
ttagggtgggggcgtgggtg
SEQ ID NO:12：名称为BCL11A的增强子-10的sgRNA(有时也简称为 enhancer-10)：
attagggtgggggcgtgggt
SEQ ID NO:13：名称为BCL11A的增强子-11的sgRNA(有时也简称为 enhancer-11)：
gattagggtgggggcgtggg
SEQ ID NO:14：名称为BCL11A的增强子-12的sgRNA(有时也简称为 enhancer-12)：
tctgattagggtgggggcgt
SEQ ID NO:15：名称为BCL11A的增强子-13的sgRNA(有时也简称为 enhancer-13)：
ctctgattagggtgggggcg
SEQ ID NO:16：名称为BCL11A的增强子-14的sgRNA(有时也简称为 enhancer-14)：
cacgcccccaccctaatcag
SEQ ID NO:17：名称为BCL11A的增强子-15的sgRNA(有时也简称为 enhancer-15)：
ttggcctctgattagggtgg
SEQ ID NO:18：名称为BCL11A的增强子-16的sgRNA(有时也简称为 enhancer-16)：
tttggcctctgattagggtg
SEQ ID NO:19：名称为BCL11A的增强子-17的sgRNA(有时也简称为 enhancer-17)：
gtttggcctctgattagggt
SEQ ID NO:20：名称为BCL11A的增强子-18的sgRNA(有时也简称为 enhancer-18)：
ggtttggcctctgattaggg
SEQ ID NO:21：名称为BCL11A的增强子-19的sgRNA(有时也简称为 enhancer-19)：
aagggtttggcctctgatta
SEQ ID NO:22：名称为BCL11A的增强子-20的sgRNA(有时也简称为 enhancer-20)：
gaagggtttggcctctgatt
SEQ ID NO:23：名称为BCL11A的增强子-21的sgRNA(有时也简称为 enhancer-21)：
actcttagacataacacacc
SEQ ID NO:24：名称为BCL11A的增强子-22的sgRNA(有时也简称为 enhancer-22)：
cttcaaagttgtattgaccc
SEQ ID NO:25：名称为BCL11A的增强子-23的sgRNA(有时也简称为 enhancer-23)：
ctcttagacataacacacca
如上所述，针对BCL11A的增强子58K位点的150bp序列设计了上述 23条sgRNA。
B、选取300V 1ms的电转条件，发明人合成了Cas9mRNA(序列如SEQ ID No.26所示)和经过化学修饰的上述设计的23条sgRNA。其中，对于23条sgRNA的化学修饰是指对于sgRNA的5’端的前三个碱基以及3’端的最后三个碱基进行了2’-O-甲基类似物修饰和核苷酸间的3’硫代修饰。如下述化学式所示，左侧是化学修饰后的sgRNA,右侧是未经过修饰的sgRNA。
在上述确定的电转条件下向脐带血来源的CD34阳性的造血干细胞(购买自澳赛尔斯生物技术(上海)有限公司,www.allcells.com，电转了上述23条经过化学修饰sgRNA，4天后通过TIDE分析Indels效率。结果如图9所示。同样，在本实施例中，作为对比，将未经化学修饰的sgRNA也通过同样的方法电转，但是未经化学修饰的sgRNA，其Indels效率只有2.7％，在以后的实施例中使用的均是经化学修饰的sgRNA。
图9显示在CD34阳性造血干细胞上，电转Cas9mRNA和23条sgRNA， 4天后提取该CD34阳性的造血干细胞的基因组，选取sgRNA切割位点左右各约450bp，总长度为903bp的片段进行扩增，用于扩增的引物序列序列如下所示。
正向引物:cacctcagcagaaacaaagttatc(SEQ ID NO:29)
反向引物：gggaagctccaaactctcaa(SEQ ID NO:30)
切割位点选择：以Enhancer-2为例,5‘-ctaacagttg cttttatcac-3’,切割位点在3’端右侧(Cong L,et al.Science.2013)。
针对上述扩增片段进行Sanger测序，测序时使用的上下游引物序列如 SEQ IDNO:27和SEQ ID NO:28所示。针对测序结果利用TIDE软件分析产生Indels效率的统计分析。其中，TIDE软件是在线分析Indels效率的软件，以一代测序结果为基础，分析Indels引起的双峰突变的效率，可以参考 tide.deskgen.com。
结果表明，在该电转条件下，本实施例中合成的23条sgRNA均能够成功基因编辑造血干细胞，都可以有效地产生Indels，效率至少10％。其中效率最高的是Enhancer-2。
SEQ ID NO:26：Cas9mRNA序列
gacaagaagtacagcatcggcctggacatcggcaccaactctgtgggctgggccgtgatcaccgacgagtacaag gtgcccagcaagaaattcaaggtgctgggcaacaccgaccggcacagcatcaagaagaacctgatcggagccct gctgttcgacagcggcgaaacagccgaggccacccggctgaagagaaccgccagaagaagatacaccagacgg aagaaccggatctgctatctgcaagagatcttcagcaacgagatggccaaggtggacgacagcttcttccacagact ggaagagtccttcctggtggaagaggataagaagcacgagcggcaccccatcttcggcaacatcgtggacgaggt ggcctaccacgagaagtaccccaccatctaccacctgagaaagaaactggtggacagcaccgacaaggccgacc tgcggctgatctatctggccctggcccacatgatcaagttccggggccacttcctgatcgagggcgacctgaacccc gacaacagcgacgtggacaagctgttcatccagctggtgcagacctacaaccagctgttcgaggaaaaccccatca acgccagcggcgtggacgccaaggccatcctgtctgccagactgagcaagagcagacggctggaaaatctgatc gcccagctgcccggcgagaagaagaatggcctgttcggcaacctgattgccctgagcctgggcctgacccccaac ttcaagagcaacttcgacctggccgaggatgccaaactgcagctgagcaaggacacctacgacgacgacctggac aacctgctggcccagatcggcgaccagtacgccgacctgtttctggccgccaagaacctgtccgacgccatcctgc tgagcgacatcctgagagtgaacaccgagatcaccaaggcccccctgagcgcctctatgatcaagagatacgacg agcaccaccaggacctgaccctgctgaaagctctcgtgcggcagcagctgcctgagaagtacaaagagattttcttc gaccagagcaagaacggctacgccggctacattgacggcggagccagccaggaagagttctacaagttcatcaag cccatcctggaaaagatggacggcaccgaggaactgctcgtgaagctgaacagagaggacctgctgcggaagca gcggaccttcgacaacggcagcatcccccaccagatccacctgggagagctgcacgccattctgcggcggcagg aagatttttacccattcctgaaggacaaccgggaaaagatcgagaagatcctgaccttccgcatcccctactacgtgg gccctctggccaggggaaacagcagattcgcctggatgaccagaaagagcgaggaaaccatcaccccctggaac ttcgaggaagtggtggacaagggcgcttccgcccagagcttcatcgagcggatgaccaacttcgataagaacctgc ccaacgagaaggtgctgcccaagcacagcctgctgtacgagtacttcaccgtgtataacgagctgaccaaagtgaa atacgtgaccgagggaatgagaaagcccgccttcctgagcggcgagcagaaaaaggccatcgtggacctgctgtt caagaccaaccggaaagtgaccgtgaagcagctgaaagaggactacttcaagaaaatcgagtgcttcgactccgtg gaaatctccggcgtggaagatcggttcaacgcctccctgggcacataccacgatctgctgaaaattatcaaggacaa ggacttcctggacaatgaggaaaacgaggacattctggaagatatcgtgctgaccctgacactgtttgaggacagag agatgatcgaggaacggctgaaaacctatgcccacctgttcgacgacaaagtgatgaagcagctgaagcggcgga gatacaccggctggggcaggctgagccggaagctgatcaacggcatccgggacaagcagtccggcaagacaat cctggatttcctgaagtccgacggcttcgccaacagaaacttcatgcagctgatccacgacgacagcctgacctttaa agaggacatccagaaagcccaggtgtccggccagggcgatagcctgcacgagcacattgccaatctggccggca gccccgccattaagaagggcatcctgcagacagtgaaggtggtggacgagctcgtgaaagtgatgggccggcac aagcccgagaacatcgtgatcgaaatggccagagagaaccagaccacccagaagggacagaagaacagccgc gagagaatgaagcggatcgaagagggcatcaaagagctgggcagccagatcctgaaagaacaccccgtggaaa acacccagctgcagaacgagaagctgtacctgtactacctgcagaatgggcgggatatgtacgtggaccaggaact ggacatcaaccggctgtccgactacgatgtggaccatatcgtgcctcagagctttctgaaggacgactccatcgaca acaaggtgctgaccagaagcgacaagaaccggggcaagagcgacaacgtgccctccgaagaggtcgtgaagaa gatgaagaactactggcggcagctgctgaacgccaagctgattacccagagaaagttcgacaatctgaccaaggcc gagagaggcggcctgagcgaactggataaggccggcttcatcaagagacagctggtggaaacccggcagatcac aaagcacgtggcacagatcctggactcccggatgaacactaagtacgacgagaatgacaagctgatccgggaagt gaaagtgatcaccctgaagtccaagctggtgtccgatttccggaaggatttccagttttacaaagtgcgcgagatcaa caactaccaccacgcccacgacgcctacctgaacgccgtcgtgggaaccgccctgatcaaaaagtaccctaagct ggaaagcgagttcgtgtacggcgactacaaggtgtacgacgtgcggaagatgatcgccaagagcgagcaggaaa tcggcaaggctaccgccaagtacttcttctacagcaacatcatgaactttttcaagaccgagattaccctggccaacg gcgagatccggaagcggcctctgatcgagacaaacggcgaaaccggggagatcgtgtgggataagggccggga ttttgccaccgtgcggaaagtgctgagcatgccccaagtgaatatcgtgaaaaagaccgaggtgcagacaggcgg cttcagcaaagagtctatcctgcccaagaggaacagcgataagctgatcgccagaaagaaggactgggaccctaa gaagtacggcggcttcgacagccccaccgtggcctattctgtgctggtggtggccaaagtggaaaagggcaagtc caagaaactgaagagtgtgaaagagctgctggggatcaccatcatggaaagaagcagcttcgagaagaatcccat cgactttctggaagccaagggctacaaagaagtgaaaaaggacctgatcatcaagctgcctaagtactccctgttcg agctggaaaacggccggaagagaatgctggcctctgccggcgaactgcagaagggaaacgaactggccctgcc ctccaaatatgtgaacttcctgtacctggccagccactatgagaagctgaagggctcccccgaggataatgagcaga aacagctgtttgtggaacagcacaagcactacctggacgagatcatcgagcagatcagcgagttctccaagagagt gatcctggccgacgctaatctggacaaagtgctgtccgcctacaacaagcaccgggataagcccatcagagagca ggccgagaatatcatccacctgtttaccctgaccaatctgggagcccctgccgccttcaagtactttgacaccaccatc gaccggaagaggtacaccagcaccaaagaggtgctggacgccaccctgatccaccagagcatcaccggcctgta cgagacacggatcgacctgtctcagctgggaggcgac
SEQ ID NO:27测序引物
cacctcagcagaaacaaagttatc
SEQ ID NO:28测序引物
gggaagctccaaactctcaa
C、根据上述实验结果，选取基因编辑效率相对高效的Enhancer-2、 Enhancer-3、Enhancer-4、Enhancer-5以及Enhancer-6，在300V 1ms的电转条件，电转Cas9mRNA和Enhancer-2、Enhancer-3、Enhancer-4、Enhancer-5 以及Enhancer-6进入脐带血来源的造血干细胞4天后检测Indels效率，结果如图10所示。图10显示电转Cas9mRNA和BCL11A的增强子-2sgRNA、 Enhancer-3sgRNA、Enhancer-4sgRNA、Enhancer-5sgRNA以及Enhancer-6sgRNA进入3个不同脐带血来源的CD34阳性的造血干细胞，4天后，采用与上述相同的方法利用TIDE软件分析产生Indels效率的统计分析。
图10的结果表明在3个不同的脐带血来源的造血干细胞上，5条sgRNA 均实现高效基因编辑，效率达到至少40％以上，其中效率最高的是Enhancer-2 sgRNA,平均基因编辑效率达到80％，显著高于Enhancer-3、Enhancer-4、 Enhancer-5以及Enhancer-6，同时比现有的文献报道的在造血干细胞上基因编辑效率高(Xu,et al.Molecular Therapy.2017；DeWitt,et al.Sci Transl Med. 2016)。
基于此，后续实验以Enhancer-2sgRNA为目的靶点开展。
实施例2：基因编辑脐带血来源的造血干细胞的体外克隆形成
本实验涉及基因编辑脐带血来源的造血干细胞的克隆形成单位(CFU, colony-formation units)检测。
选取300V 1ms的电转条件，电转Cas9mRNA和Enhancer-2进入脐带血来源的造血干细胞,将800-1000个细胞重悬入1ml H4434(购自加拿大STEM CELLS TECHNOLOGIES)和IMDM(购自Thermo Fisher)以及FBS(购自 Thermo Fisher)的混合液中，14天后显微镜下观察CFU-M、BFU-E、CFU-E、 CFU-G、CFU-GM、GEMM等不同形态的克隆形成数目，结果如图11所示。其中，图11显示电转Cas9mRNA和BCL11A的增强子-2sgRNA进入脐带血来源的CD34阳性造血干细胞，2天后进行体外克隆形成实验(CFU检测)， 14天后统计不同血液系统的克隆数目，BFU-E、CFU-M、CFU-GM、CFU-E、CFU-G、CFU-MM代表红系、髓系、淋巴系等血液系统不同谱系的克隆形成。其中，Mock:代表未经过基因编辑的细胞。
根据实施例2的数据表明，与未经过基因编辑的造血干细胞相比，基因编辑后的细胞功能体外分化功能正常，能分化不同血液系统谱系的克隆。
实施例3：基因编辑脐带血来源的造血干细胞重建小鼠模型的造血系统
选取300V 1ms的电转条件，电转Cas9mRNA和Enhancer-2进入脐带血来源的造血干细胞，移植进入经过辐照仪照射的NPG免疫缺陷小鼠模型(购自北京维通达生物技术有限公司(Beijing Vitalstar Biotechnology,Inc.)。在移植6周、8周、10周、12周、16周后的外周血中检测人CD45和小鼠CD45 的表达情况，同时检测移植16周后骨髓、脾脏的人CD45和小鼠CD45的表达情况，其结果如图12和图14所示。其中移植到小鼠中的方法为：在细胞移植24小时前，进行1.0Gy射线照射，清除小鼠模型的骨髓。随后将用 20μL 0.9％的生理盐水重悬的1.0×106的细胞注射到小鼠的尾静脉中，随后放入洁净级别的动物房中饲养。
图12和图14的结果表明经过基因编辑的造血干细胞，移植进入小鼠模型后，与未经过基因编辑的造血干细胞相比，经过基因修饰的细胞随着时间延长，人源的hCD45表达比例持续增高，在外周血样品中，由第6周的20％提高到16周的60％，16周的骨髓中比例甚至达到90％，脾脏达到70％,表明经过基因编辑的造血干细胞能够快速、高效地植入小鼠模型的造血系统，细胞体内分化功能正常。而现有的文献报道表明，6周后外周血中CD45表达比例在1-10％之间，16周后CD45表达比例在20-40％之间，骨髓中CD45 表达比例在50％左右，因此，本发明中的动物实验结果明显好于现有领域中报道的移植实验结果(Xu,etal.Molecular Therapy.2017；DeWitt,et al.Sci Transl Med.2016；Mettananda,etal.Nature Communications.2017)。
同时，在移植基因编辑的细胞的小鼠中，16周后检测了人源的CD3、 CD4、CD8、CD33、CD19、CD56等细胞膜蛋白的表达如图13、14、15所示。结果表明，经过基因修饰的细胞能正常表达这些蛋白，表明可以分化为 T细胞、B细胞、巨噬细胞等血液系统的细胞，能高效重建小鼠模型的造血系统。与现有文献报道结果相比，首先我们检测了CD3、CD4、CD8、CD33、CD19、hCD56等6个细胞膜表面蛋白判定T细胞、髓系细胞、B细胞和NK 细胞等在小鼠血液中表达情况，更准确地评估移植的人造血干细胞重建小鼠造血系统的能力，而现有文献中仅测试了CD3、CD19、CD56、CD33等蛋白表达。其次我们检测了外周血、骨髓和脾脏等三个重要的血液系统相关组织中以上6个蛋白的表达谱，更全面地评估了重建小鼠造血系统的能力,而现有文献中只以骨髓作为检测的组织(Chang,et al.Methods&ClinicalDevelopment.2017；DeWitt,et al.Sci Transl Med.2016；Mettananda,et al. NatureCommunications.2017)。
此外，虽然基因编辑的细胞能够快速、高效重建小鼠模型的造血系统。针对重建小鼠模型的细胞是否发生了基因编辑的判断结果如图16所示，提取移植前细胞、移植16周后外周血、骨髓和脾脏的基因组，扩增目的片段和Sanger测序，通过TIDE分析，检测Indels效率。结果表明移植16周后的外周血、骨髓和脾脏的人源细胞均发生了基因编辑，效率与移植前细胞相似，在50～70％之间。
实施例4：基因编辑脐带血来源的造血干细胞红系分化检测γ珠蛋白和胎儿血红 蛋白表达
4-1.红细胞分化
选取300v 1ms的电转条件，电转Cas9mRNA和Enhancer-2进入脐带血来源的造血干细胞，利用下述“两步法”分化方案进行分化。
其中两步法分化为利用造血干细胞红系扩增和分化培养基进行分化，然后利用造血干细胞红系分化脱核培养基进行分化。
造血干细胞红系扩增和分化培养基为基础培养基为StemSpanTMSFEM II,生长因子为50-200ng/ml SCF,10-100ng/ml IL-3,1-10U EPO/ml，培养条件：利用造血干细胞红系扩增和分化培养基培养造血干细胞1.0×105cells/ml，扩增7天。
造血干细胞红系分化脱核培养基为基础培养基为STEMSPANTMSFEM II,生长因子为1-10U EPO,100-1000μg/ml人转铁蛋白，化学小分子为 0.5-10μm mifepristone，将利用上一步骤培养的1.0×106cells/ml细胞在造血干细胞红系分化脱核培养基分化5天。
然后，检测CD71和CD235a表达，如图17所示。实验组和对照组均能高效分化成为红细胞，CD71和CD235a的表达比例均在90％以上。
4-2.检测γ珠蛋白和胎儿血红蛋白表达
提取上述红细胞分化后的细胞的mRNA,反转录成cDNA，通过荧光定量PCR检测BCL11A、HBB、HBG等基因的表达，如图18所示。结果表明，基因敲除BCL11A enhancher位点的细胞BCL11A基因表达下调1倍，HBG 表达提高一倍。
检测红系分化后的细胞的胎儿血红蛋白表达，如图19所示，流式分析结果表明基因敲除BCL11A enhancher位点的细胞，胎儿血红蛋白表达提高约1倍。
实施例5：基因编辑β-地中海贫血病人来源的造血干细胞的BCL11A的增强子位点
5-1.β-地中海贫血病人外周血来源的造血干细胞分离
通过常规的磁珠分选获得CD34阳性的造血干细胞。结果如图20所示。
5-1.电转β-地中海贫血病人外周血来源的造血干细胞
选取300V 1ms的电转条件，电转Cas9mRNA和Enhancer-2、Enhancer-3、 Enhancer-4、Enhancer-5以及Enhancer-6进入β-地中海贫血病人外周血来源的造血干细胞，4天后检测Indels效率，结果如图21所示。表明在3个不同的病人外周血来源的造血干细胞上，5条sgRNA均可实现高效基因编辑，其中，效率最高的是Enhancer-2，达到至少70％以上。
实施例6：基因编辑贫血病人外周血来源的造血干细胞红系分化检测γ珠蛋白和 胎儿血红蛋白表达
将实施例5中经过基因编辑的造血干细胞进行体外红系分化，方法见实施例4-1。分化结果如图22所示，实验结果表明对照组、Enhancer-2、 Enhancer-3、Enhancer-4、Enhancer-5以及Enhancer-6红系分化效率相似，均高表达CD71和CD235a细胞膜蛋白。
12天后，提取红细胞分化后的细胞的mRNA,反转录成cDNA，通过荧光定量PCR检测BCL11A、HBB、HBG、HBA等基因的表达，如图23所示。结果表明，除Enhancer-6以外，Enhancer-2、Enhancer-3、Enhancer-4和 Enhancer-5均能下调细胞中BCL11A基因表达，其中Enhancer-2效果最为显著下调约1倍左右；此外，Enhancer-2、Enhancer-3、Enhancer-4、Enhancer-5 以及Enhancer-6均能够提高γ珠蛋白表达，其中效果最显著的是Enhancer-2，γ珠蛋白表达提高9倍，符合临床治疗的标准。与现有文献中的结果相比，首先我们以重症地贫病人来源的造血干细胞作为起始的评估细胞来源，精确验证了本发明的方法符合临床治疗的要求，而现有文献只使用了正常人的骨髓或者外周血的样本；其次，现有文献中报道的提高胎儿血红蛋白的倍数只在4-7倍之间，低于本发明中提高胎儿血红蛋白的表达比例。由此表明，本发明的实验结果显著优于现有的文献报道(Chang et al.Methods&ClinicalDevelopment.2017；Mattew C et al.Nature.2015)。
此外，为了更精确地评估Enhancer-2、Enhancer-3、Enhancer-4、Enhancer-5 以及Enhancer-6基因编辑BCL11A enhancer位点对于胎儿血红蛋白(HbF)和正常血红蛋白(HbA)的蛋白表达量的影响，在本发明中，我们提取了造血干细胞分化12天后获得的红细胞的蛋白，进行了HPLC试验(High Performance Liquid Chromatography,高效液相色谱法)，如图27、28和29所示。结果表明，1)保留时间约为5.4min和10min处的色谱峰分别代表HbF和HbA。2) 与未经过基因编辑的细胞相比，Enhancer-2、Enhancer-3、Enhancer-4、 Enhancer-5以及Enhancer-6基因编辑的细胞HbF表达量更高(峰更高和峰面积更大),HbA的表达量更低(峰更低和峰面积更小)，表明基因编辑BCL11A enhancer位点提高了HbF的表达，且下调了HbA的表达。3)其中，Enhancer-2 的HbF/HbA的比例为约为5.28，mock的HbF/HbA的比例为约为0.79，提高了6.68倍，显著高于Enhancer-3、Enhancer-4、Enhancer-5以及Enhancer-6 对于HbF/HbA的比例倍数。在临床上，如本发明的背景中所述重型β地贫患者由于β珠蛋白缺失，血液中的血红蛋白由少量的HbA和占绝大部分的 HbF组成，通常重型β地贫患者的血红蛋白约为20g/L，其中HbF占比达到 90％以上。我们按照占比90％计算，经过基因编辑后的细胞HbF表达量提高了6.68倍，最终的血红蛋白量为20*0.9*6.68+20*0.1＝122.24g/L,正常人的血红蛋白表达量的范围是115-150g/L之间，该结果完全符合临床治疗的标准(Antonio Cao,et al.Genes in Medicine.2010；2010年《重型β地中海贫血的诊断和治疗指南》)。与现有文献相比，本发明是唯一在β地贫患者的造血干细胞上，通过HPLC实验精确评估了基因编辑BCL11A enhancer提高胎儿血红蛋白的有效性的发明研究，且结果表明显著提高了胎儿血红蛋白的表达，达到治疗重型β地贫患者的临床要求(Chang etal.Methods&Clinical Development.2017；Mattew C et al.Nature.2015；Lin Ye，etal.PNAS.2016； Matthew H.Porteus,Advances in Experimental Medicine andBiology.2013)。
实施例7：基因编辑贫血病人外周血来源的造血干细胞体外克隆形成
选取300V 1ms的电转条件，电转Cas9mRNA和Enhancer-2进入贫血病人外周血来源的造血干细胞,将500-800个细胞重悬入1ml H4434(购自加拿大STEM CELLSTECHNOLOGIES)和IMDM(购自Thermo Fisher)以及 FBS(购自Thermo Fisher)的混合液中，14天后显微镜下观察CFU-M、BFU-E、 CFU-E、CFU-G、CFU-GM、GEMM等不同形态的克隆形成数目，结果如图 25所示。
本实验数据表明，与未经过基因编辑的造血干细胞相比，基因编辑后的细胞功能体外分化功能正常，能分化不同血液系统谱系的克隆。
实施例8：基因编辑贫血病人外周血来源的造血干细胞的脱靶效应
本实验涉及基因测序方法，具体是通过2代测序技术(Next generationsequencing,NGS)分析基因编辑贫血病人外周血来源的造血干细胞的脱靶效应(off-target effect)。
选取300V 1ms的电转条件，电转Cas9mRNA和Enhancer-2进入贫血病人外周血来源的造血干细胞,扩增4天后，提取基因组进行2代测序分析。我们通过软件预测了14个潜在的脱靶位点，结果如图22所示。
本实验数据表明，基因编辑中靶(on-target)效率为76％，而14个潜在的脱靶位点的比率均低于0.3％，与二代测序本身误差相当，由此可见，在测序误差范围内，我们并没有检测到由于基因编辑而导致的脱靶现象，所以该基因编辑方案是安全的。
根据上述实施例的数据可以看出，针对不同来源的细胞，Enhancer-2均显示出最好的效果。
工业实用性
根据本发明，本发明的方法有以下几个优点，首先本方法能够基因编辑地中海贫血病人来源的造血干细胞，完全满足临床治疗地中海贫血和镰刀型红细胞贫血的要求；其次，通过使用经过化学修饰的sgRNA,基因编辑效率高，显著提高胎儿血红蛋白的表达，细胞能够重建模型小鼠的造血系统；最后，脱靶分析显示安全性高。基于此，本发明开发的方法将有可能代替传统的造血干细胞移植治疗技术来治愈重型地中海贫血和镰刀型红细胞贫血的患者。
尽管已提及具体特征对本发明进行详细描述，但对本领域的技术人员显而易见的是此描述仅用于优选的实施方案而非限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围会通过所附权利要求和其等同物来进行限定。
序列表
<110> 博雅辑因（北京）生物科技有限公司
<120> 一种提高胎儿血红蛋白表达水平的方法
<130> PB00142
<150> CN201711027708.6
<151> 2017-10-27
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GFP mRNA的序列信息
<400> 1
atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60
gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120
aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180
gtcactactt tctcttatgg tgttcaatgc ttttcaagat acccagatca tatgaaacgg 240
catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaaagaac tatatttttc 300
aaagatgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360
aatagaatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct tggacacaaa 420
ttggaataca actataactc acacaatgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 480
atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 540
cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600
ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 660
cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaatag 717
<210> 2
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CL11A enhancer 58K位点150bp序列
<400> 2
ctgccagtcc tcttctaccc cacccacgcc cccaccctaa tcagaggcca aacccttcct 60
ggagcctgtg ataaaagcaa ctgttagctt gcactagact agcttcaaag ttgtattgac 120
cctggtgtgt tatgtctaag agtagatgcc 150
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 名称为BCL11A的增强子-1的sgRNA(有时也简称为enhancer-1)
<400> 3
cacaggctcc aggaagggtt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 名称为BCL11A的增强子-2的sgRNA(有时也简称为enhancer-2)
<400> 4
atcagaggcc aaacccttcc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 名称为BCL11A的增强子-3的sgRNA(有时也简称为enhancer-3)
<400> 5
ctaacagttg cttttatcac 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 名称为BCL11A的增强子-4的sgRNA(有时也简称为enhancer-4)
<400> 6
ttgcttttat cacaggctcc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 名称为BCL11A的增强子-5的sgRNA(有时也简称为enhancer-5)
<400> 7
ttttatcaca ggctccagga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 名称为BCL11A的增强子-6的sgRNA(有时也简称为enhancer-6)
<400> 8
tttatcacag gctccaggaa 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 名称为BCL11A的增强子-7的sgRNA(有时也简称为enhancer-7)
<400> 9
tgggtggggt agaagaggac 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 名称为BCL11A的增强子-8的sgRNA(有时也简称为enhancer-8)
<400> 10
gggcgtgggt ggggtagaag 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 名称为BCL11A的增强子-9的sgRNA(有时也简称为enhancer-9)
<400> 11
ttagggtggg ggcgtgggtg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 名称为BCL11A的增强子-10的sgRNA(有时也简称为enhancer-10)
<400> 12
attagggtgg gggcgtgggt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 名称为BCL11A的增强子-11的sgRNA(有时也简称为enhancer-11)
<400> 13
gattagggtg ggggcgtggg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 名称为BCL11A的增强子-12的sgRNA(有时也简称为enhancer-12)
<400> 14
tctgattagg gtgggggcgt 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 名称为BCL11A的增强子-13的sgRNA(有时也简称为enhancer-13)
<400> 15
ctctgattag ggtgggggcg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 名称为BCL11A的增强子-14的sgRNA(有时也简称为enhancer-14)
<400> 16
cacgccccca ccctaatcag 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 名称为BCL11A的增强子-15的sgRNA(有时也简称为enhancer-15)
<400> 17
ttggcctctg attagggtgg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 名称为BCL11A的增强子-16的sgRNA(有时也简称为enhancer-16)
<400> 18
tttggcctct gattagggtg 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 名称为BCL11A的增强子-17的sgRNA(有时也简称为enhancer-17)
<400> 19
gtttggcctc tgattagggt 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 名称为BCL11A的增强子-18的sgRNA(有时也简称为enhancer-18)
<400> 20
ggtttggcct ctgattaggg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 名称为BCL11A的增强子-19的sgRNA(有时也简称为enhancer-19)
<400> 21
aagggtttgg cctctgatta 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 名称为BCL11A的增强子-20的sgRNA(有时也简称为enhancer-20)
<400> 22
gaagggtttg gcctctgatt 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 名称为BCL11A的增强子-21的sgRNA(有时也简称为enhancer-21)
<400> 23
actcttagac ataacacacc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 名称为BCL11A的增强子-22的sgRNA(有时也简称为enhancer-22)
<400> 24
cttcaaagtt gtattgaccc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 名称为BCL11A的增强子-23的sgRNA(有时也简称为enhancer-23)
<400> 25
ctcttagaca taacacacca 20
<210> 26
<211> 4101
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cas9 mRNA序列
<400> 26
gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc 60
accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 120
agcatcaaga agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc 180
acccggctga agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat 240
ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg 300
gaagagtcct tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 360
atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa 420
ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg 480
atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 540
gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc 600
aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg 660
ctggaaaatc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggcaacctg 720
attgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat 780
gccaaactgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 840
atcggcgacc agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 900
ctgagcgaca tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg 960
atcaagagat acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag 1020
cagctgcctg agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1080
tacattgacg gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa 1140
aagatggacg gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag 1200
cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc 1260
attctgcggc ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag 1320
aagatcctga ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga 1380
ttcgcctgga tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg 1440
gtggacaagg gcgcttccgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac 1500
ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat 1560
aacgagctga ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc 1620
ggcgagcaga aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg 1680
aagcagctga aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc 1740
ggcgtggaag atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc 1800
aaggacaagg acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg 1860
accctgacac tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac 1920
ctgttcgacg acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg 1980
ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat 2040
ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2100
ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac 2160
gagcacattg ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg 2220
aaggtggtgg acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2280
gaaatggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg 2340
aagcggatcg aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg 2400
gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat 2460
atgtacgtgg accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc 2520
gtgcctcaga gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac 2580
aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac 2640
tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc 2700
aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg 2760
gtggaaaccc ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact 2820
aagtacgacg agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag 2880
ctggtgtccg atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac 2940
caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac 3000
cctaagctgg aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3060
atcgccaaga gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac 3120
atcatgaact ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct 3180
ctgatcgaga caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc 3240
accgtgcgga aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag 3300
acaggcggct tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc 3360
agaaagaagg actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat 3420
tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa 3480
gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt 3540
ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac 3600
tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag 3660
aagggaaacg aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3720
tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 3780
cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc 3840
ctggccgacg ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc 3900
atcagagagc aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct 3960
gccgccttca agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag 4020
gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac 4080
ctgtctcagc tgggaggcga c 4101
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 测序引物
<400> 27
cacctcagca gaaacaaagt tatc 24
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 测序引物
<400> 28
gggaagctcc aaactctcaa 20
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于扩增的引物序列：正向引物
<400> 29
cacctcagca gaaacaaagt tatc 24
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于扩增的引物序列：反向引物
<400> 30
gggaagctcc aaactctcaa 20

Claims (39)

1.一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白(HbF)表达的方法，包括：
通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体第60495219位至第60495336位的BCL11A基因组区域。
2.权利要求1所述的方法，其中所述基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术。
3.权利要求2所述的方法，其中所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9基因编辑技术。
4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中，所述BCL11A基因组靶核苷酸序列与选自SEQID NO:3～SEQ ID NO:25任一序列互补。
5.权利要求3或4的方法，将包含选自SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：25任一序列的sgRNA导入所述造血干细胞以实现对所述BCL11A基因组的编辑。
6.权利要求5的方法，其中所述sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的。
7.权利要求6的方法，其中所述化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。
8.权利要求3-7任一项的方法，其中将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。
9.权利要求8的方法，其中通过电转方法将sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。
10.权利要求9的方法，其中所述电转条件为200-600V，0.5ms-2ms。
11.一种通过CRISPR/Cas9系统体外高效编辑造血干细胞的方法，包括将含有选自SEQID NO：3～SEQ ID NO：25任一序列的sgRNA导入造血干细胞，其中该sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的。
12.权利要求11的方法，其中将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。
13.权利要求12的方法，其中通过电转方法将sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。
14.权利要求13的方法，其中所述电转条件为200-600V，0.5ms-2ms。
15.通过权利要求1～14中任一项所述的方法得到的造血干细胞。
16.一种通过基因改造使胎儿血红蛋白(HbF)表达升高的人造血干细胞，其中该造血干细胞中第2号染色体第60495219位至第60495336位的BCL11A基因组区域通过基因编辑技术被破坏。
17.通过分化培养权利要求15或16所述的造血干细胞获得的、处于成熟红细胞之前的不同分化阶段的前体细胞。
18.通过分化培养权利要求15或16所述的造血干细胞获得的成熟红细胞。
19.一种制造通过基因改造使胎儿血红蛋白(HbF)表达升高的成熟红细胞或其前体细胞的方法，该方法包括：
(a)使用权利要求1～14中任一项所述的方法得到基因改造的造血干细胞；
(b)使用造血干细胞红系扩增和分化培养基对所述基因改造的造血干细胞进行造血干细胞红系扩增和分化，
其中，所述造血干细胞红系扩增和分化培养基包括基础培养基，以及生长因子的组合物，其中所述生长因子的组合物包括干细胞生长因子(SCF)；白介素3，(IL-3)和促红细胞生成素(EPO)。
20.根据权利要求19所述的方法，该方法还包括：
使用红系分化脱核培养基进行造血干细胞红系分化脱核，
所述红系分化脱核培养基包含基础培养基、生长因子、以及孕酮受体和糖皮质激素受体的拮抗剂和/或抑制剂。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述红系分化脱核培养基中的生长因子包括促红细胞生成素(EPO)，所述孕酮受体和糖皮质激素受体的拮抗剂和/或抑制剂为选自下述化合物(I)～(IV)中的任一种或两种及以上：
22.一种组合物，包含权利要求15或16的造血干细胞或权利要求17的前体细胞或权利要求18的成熟红细胞。
23.包含权利要求15或16的造血干细胞或权利要求17的前体细胞或权利要求18的成熟红细胞的医用制品。
24.权利要求15或16的造血干细胞或权利要求17的前体细胞或权利要求18的成熟红细胞在预防或治疗有需要的受试者的疾病中的用途。
25.权利要求24的用途，所述疾病为贫血性疾病、失血性疾病、肿瘤或其它需要大量输血进行预防或治疗的疾病。
26.根据权利要求25的用途，其中所述疾病为β-地中海贫血或镰刀形红细胞贫血。
27.权利要求24-26中任一项的用途，其中所述受试者为人。
28.权利要求15或16的造血干细胞或权利要求17的前体细胞或权利要求18的成熟红细胞在制备预防或治疗受试者疾病中的药物或医用制品中的用途。
29.权利要求28的用途，所述疾病为贫血性疾病、失血性疾病、肿瘤或其它需要大量输血进行预防或治疗的疾病。
30.根据权利要求29的用途，其中所述疾病为β-地中海贫血或镰刀形红细胞贫血。
31.权利要求28-30中任一项的用途，其中所述受试者为人。
32.一种sgRNA构建体，包含选自SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：25之一的核苷酸序列。
33.权利要求32的构建体，其包含2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰。
34.权利要求33的构建体，其中所述化学修饰为在选自SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：25之一的核苷酸序列的5’端的前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。
35.包含权利要求32-34中任一项的构建体的载体、宿主细胞或制剂。
36.包含权利要求32-34中任一项的构建体在基因编辑造血干细胞中的用途。
37.一种治疗或预防受试者贫血性疾病、失血性疾病、肿瘤或其它需要大量输血进行预防或治疗的疾病的方法，其包括给药受试者权利要求15或16的造血干细胞，权利要求17的前体细胞或权利要求18的成熟红细胞。
38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述疾病为β-地中海贫血或镰刀形红细胞贫血。
39.根据权利要求38所述的方法，其中，所述受试者为人。
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