JP2022180510A - 胎児ヘモグロビンの発現を増加させる方法 - Google Patents

胎児ヘモグロビンの発現を増加させる方法 Download PDF

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Abstract

【課題】胎児ヘモグロビンの発現を増加させることを含む、サラセミアと鎌状赤血球貧血などの貧血疾患の治療に使用される細胞治療スキームを提供する。【解決手段】遺伝子編集技術によりＢＣＬ１１ＡゲノムのＣＴＴＣＣＴ領域を破壊することを含む、造血幹細胞ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー部位を遺伝子編集する方法が提供される。遺伝子編集された造血幹細胞は正常な細胞機能を有し、胎児ヘモグロビン発現を有意に改善することができる。【選択図】図３１

Description

（相互参照）
本出願は、２０１７年１０月２７日に提出された中国特許出願２０１７１１０２７７０
８６の優先権を享有することを主張する。当該中国特許出願の開示内容は、その全体が引
用により本出願に取り込まれる。
本発明は、遺伝子編集技術によりヒト造血幹細胞のＢＣＬ１１Ａエンハンサー部位を効
率よく且つ安全に遺伝子修飾することを含む、特に、遺伝子編集技術により造血幹細胞に
おける２番染色体上のＣＴＴＣＣＴの６つの連続した塩基のＢＣＬ１１Ａゲノム領域を破
壊し、γグロビンと胎児ヘモグロビンの発現をアップレギュレーションし、疾患を治療す
る目的を達成することを含む、サラセミアと鎌状赤血球貧血などの貧血疾患の治療に使用
される細胞治療スキームに関する。
サラセミアは、グロビン生成障害性貧血または海洋性貧血とも呼ばれ、遺伝子欠陥など
の遺伝的要因によって引き起こされる一組の溶血性貧血疾患である。遺伝的遺伝子欠陥に
より、ヘモグロビン内の一種または複数のグロビンペプチド鎖の合成が欠失したり不足し
たりして、貧血または溶血性病態が引き起こされる。ヘモグロビンを合成するグロビン鎖
の減少または欠失は、異常なヘモグロビン構造を引き起こしてしまい、このような異常な
ヘモグロビンを含有する赤血球は、変形能が低下し、寿命が短くなり、骨髄内でｉｎ ｓ
ｉｔｕ溶血が発生する可能性があり、末梢血循環に入った後に脾臓などの臓器によって予
め破壊され、貧血、体内の鉄沈着、さらには異常な発達さえも引き起こされてしまう。異
なるグロビン鎖遺伝子変異の多様性と複雑さのため、グロビン欠失のタイプ、数、および
臨床症状の変動が非常に大きい。
サラセミアは、欠失したグロビン鎖の種類および欠失程度によって命名され、分類され
る。グロビンペプチド鎖生成障害の種類により、α型、β型、δ型、δβ型に分けられる
。サラセミアは現在、世界で最も一般的な遺伝子欠陥の遺伝的疾患の一つである。統計に
よると、全世界の人口の４．８３％に変異したグロビン遺伝子があり、その中には、１．
６７％にα、βサラセミアヘテロ接合体が含まれ、それとともに、１．９２％に鎌状赤血
球変異したヘモグロビンが含まれ、０．９５％にヘモグロビンＥが含まれ、０．２９％に
ヘモグロビンＣなどが含まれる。これによって疾患の症状を伴う異常ヘモグロビンを保有
する世界的な出生率は０．０２４％以上であり、これは一般的ン遺伝子欠陥疾患である。
β－サラセミア（以下、β－サラセミアと称する）は、サラセミアの一種であり、その
発症メカニズムは、βグロビンペプチド鎖の遺伝子変異に起因し、ほとんどの患者は点突
然変異であるが、少数の患者は大きいフラグメントの遺伝子欠失である。遺伝子欠失と特
定の点突然変異により、βグロビンペプチド鎖の一部の合成が完全に阻害される可能性が
あり、このタイプはβ０サラセミアと呼ばれる。少数の点突然変異により、β鎖の合成は
部分的に阻害され、それでもペプチド鎖合成の一部が保持され、このタイプはβ＋サラセ
ミアと呼ばれる。組み合わせによって異なる臨床症状が示される可能性がある。β－サラ
セミア遺伝子変異には多くの種類が有し、統計によると、世界には約３００種類以上の遺
伝子異常が有し、１００種類以上の変異点がすでに発見されており、現在中国国内臨床で
２８種類が報告されている。その中で、よく見られる変異は６種類あり、β４１－４２（
－ＴＣＴＴ欠失）は約４５％を占め、ＩＶＳ－ＩＩ６５４（ＣからＴへの点突然変異）は
約２４％を占め、β１７（ＡからＴへの点突然変異）は約１４％を占め、ＴＡＴＡボック
ス－２８（ＡからＴへの点突然変異）は約９％を占め、Ｂ７１－７２（＋Ａ挿入変異）は
約２％を占め、β２６（ＧからＡへの点突然変異）は約２％を占める。
重度のβ－サラセミアには２種類の変異遺伝子がある。一つはβホモ接合体であり、も
う一つはβ０とβ＋サラセミアのダブルヘテロ接合体である。βグロビンペプチド鎖の生
成がほぼ完全に阻害されるため、体内ではβグロビン鎖を生成することができず、α鎖と
β鎖とからなる正常なヘモグロビンＡの合成が減少または消失する。過剰なα鎖タンパク
質は赤血球内のγ鎖と結合してヘモグロビンＦを形成することができるが、出生後、γ合
成はだんだん阻害される（ヘモグロビン鎖合成切り換えとも呼ばれる）ため、過剰なα鎖
は赤血球に沈着して封入体を形成し、赤血球膜の表面に付着する。これによって、赤血球
膜の特性が変化し、細胞が硬くなり、変形能が低下し、骨髄内で破壊されて「無効な造血
」になってしまう。サラセミアの一部の赤血球は骨髄で成長して成熟し、最終的に末梢血
循環に放出されることができるが、局所的な末梢微小循環（脾臓などの臓器）を通過する
と、変形能が低下するため、機械的な破壊を受けやすい。上記の理由により、患児は臨床
上で、出生時に無症状であるが、出生後、ＨｂＦ（胎児ヘモグロビン）発現のため、且つ
赤血球の寿命が１２０日と長いため、多くの場合は６ヵ月後、γ鎖合成が生理学的に阻害
されることにより、ヘモグロビン鎖の合成がβ鎖に切り替えられると共に、遺伝子欠陥の
ためβ鎖が合成できず、細胞の病理学的な変化により破壊が増加し、慢性溶血性貧血を示
し、さらに骨髄構成の変化を引き起こす。治療中に繰り返して輸血する必要があり、これ
によってヘモジデリン沈着症が引き起こされ、重要な臓器機能に影響を与える。
β－サラセミアと同様に、鎌状赤血球貧血は、常染色体劣性遺伝病に属するが、β－サ
ラセミアとの違いは、当該貧血症の変異部位が単一であることであり、これは、βグロビ
ンの単一の塩基変異により、正常なβ遺伝子の６番目のコドンがＧＡＧ（グルタミン酸を
コードする）からＧＴＧ（バリン）に変異したからである。変異ホモ接合体の状態では、
正常なαグロビンと異常なβグロビンは、ＨｂＳと呼ばれる四量体複合体を形成し、この
四量体は、酸素を持つ能力が正常なヘモグロビンの能力の半分であり、脱酸素状態で凝集
してポリマーになる。形成されたポリマーの配向方向は、膜と平行で細胞膜に緊密に接触
しているため、ポリマーの数がある程度になると、細胞膜は通常の凹型から鎌型に変える
。鎌状赤血球は変形能に乏しく、破砕しやすくて溶血を起こし、血管の閉塞、損傷、壊死
などを引き起こす。
β－サラセミアと鎌状赤血球貧血の治療方法には、一般的な支持療法、大量輸血と定期
的な除鉄療法、造血幹細胞移植、胎児ヘモグロビン誘発薬物療法、および探索的遺伝子療
法が含まれる。現在、すべての治療法の中で唯一の治癒希望のある方法は同種造血幹細胞
移植である。トーマスが１９８１年にサラセミア患者に初の造血幹細胞移植を行って成功
を収めて以来、世界中の複数のサラセミア研究センターで造血幹細胞移植技術が使用され
、しかも従来の輸血と除鉄治療法を成功的に置き換えた。しかし、ＨＬＡの完全に一致す
るドナーが非常に足りなく、且つ移植後のＧＶＨＤ（ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓ
ｔ ｄｉｓｅａｓｅ、移植片対宿主病）による死亡のため、サラセミア治療における造血
幹細胞移植の広範な適用はまだ制限されている。これと同時に、研究者はサラセミアの治
療のための薬剤を持続的に研究している。現在、ＦＤＡによって唯一に承認された臨床治
療のための経口薬はヒドロキシウレアであり、主に胎児ヘモグロビンの発現を誘発するこ
とで疾患の臨床症状を緩和するが、この薬剤の臨床効果は一貫的ではなく、しかも大きな
副作用があり、並びに用量関連の骨髄阻害があるため、β－サラセミアと鎌状赤血球貧血
などの関連貧血疾患を治療するための新しい治療法の開発が緊急である。
本明細書全文でいくつかの文献が引用されている。ここで、各文献（いずれのジャーナ
ル文章または要約、公開済みまたは未公開の特許出願、登録した特許、メーカーの仕様書
、プロトコルなどを含む）は言及により本文に取り込まれる。しかしながら、ここに引用
された文献が実際に本発明の既存技術であると認めるわけではない。
本発明は、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術のような遺伝子編集技術を利
用して、新世帯の造血幹細胞を開発した。既存技術による造血幹細胞と比べて、この造血
幹細胞は、ＢＣＬ１１Ａエンハンサーの遺伝子ノックアウト効率が大幅に増加し、これに
より、分化成熟後の赤血球の胎児ヘモグロビンの発現が大幅に増加し、既存技術における
ＢＣＬ１１Ａエンハンサーの編集効率が低く、胎児ヘモグロビンの発現が臨床適用を満た
せないという問題をある程度で解決した。また、本発明は、遺伝子編集後の造血幹細胞の
培養および分化の策略をさらに改善し、造血幹細胞から成熟赤血球への分化プロセスを大
幅に短縮するだけでなく、採取した成熟赤血球の数をも大幅に増加させ、これによって臨
床適用の要件を満たすことができる。
具体的には、本発明は下記の項に係る：
１、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）の発現を増加させる方法であ
って、
前記造血幹細胞の２番染色体上の、ＣＴＴＣＣＴ配列の上流０～１５個のヌクレオチド
から当該ＣＴＴＣＣＴ配列の下流０～１５個のヌクレオチドまでのＢＣＬ１１Ａゲノム領
域を遺伝子編集技術によって破壊することを含み、当該ＢＣＬ１１Ａゲノム領域がｃｈｒ
２：６０４９５２３６とｃｈｒ２：６０４９５２７１との間にある、方法。
２、前記ＢＣＬ１１Ａゲノム領域配列はＣＴＴＣＣＴである、項１に記載の方法。
３、前記遺伝子編集技術は、ジンクフィンガーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、
ＴＡＬＥＮ遺伝子編集技術またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集技術である、項１また
は２に記載の方法。
４、前記遺伝子編集技術がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術である、項３に記載
の方法。
５、前記ＢＣＬ１１Ａゲノム領域の編集を実現するように、前記ＢＣＬ１１Ａゲノム領
域を標的とするｓｇＲＮＡを前記造血幹細胞に導入することを含む、項１～４のいずれか
一項に記載の方法。
６、前記ＢＣＬ１１Ａゲノム領域の編集を実現するように、配列番号３、４、８および
３３～６３から選択されるいずれか一つの配列を含むｓｇＲＮＡを前記造血幹細胞に導入
することを含む、項３～５のいずれか一項に記載の方法。
７、前記ＢＣＬ１１Ａゲノム領域の編集を実現するように、配列番号４の配列を含むｓ
ｇＲＮＡを前記造血幹細胞に導入することを含む、項３～６のいずれか一項に記載の方法
。
８、前記ｓｇＲＮＡは、２’－Ｏ－メチル類縁体及び／またはヌクレオチド間３’チオ
により修飾されたものである、項５～７のいずれか一項に記載の方法。
９、前記化学修飾は、前記ｓｇＲＮＡの５’末端の最初の１つ、２つ、及び／または３
つの塩基及び／または３’末端の最後の１つの塩基の２’－Ｏ－メチル類縁体による修飾
である、項８に記載の方法。
１０、前記ｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細
胞に導入する、項４～９のいずれか一項に記載の方法。
１１、ｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドとをエレクトロポレーション
によって一緒に前記造血幹細胞に導入する、項１０に記載の方法。
１２、前記エレクトロポレーションの条件は、２００～６００Ｖ、０．５～２ｍｓであ
る、項１１に記載の方法。
１３、ＣＴＴＣＣＴ配列の上流０～１５個のヌクレオチドから当該ＣＴＴＣＣＴ配列の
下流０～１５個のヌクレオチドまでのＢＣＬ１１Ａゲノム領域を標的とするｓｇＲＮＡを
造血幹細胞に導入することを含み、前記ＢＣＬ１１Ａゲノム領域がｃｈｒ２：６０４９５
２３６とｃｈｒ２：６０４９５２７１との間にあり、前記ｓｇＲＮＡが２’－Ｏ－メチル
類縁体及び／またはヌクレオチド間３’チオにより修飾されたものである、ＣＲＩＳＰＲ
／Ｃａｓ９システムを介してインビトロで造血幹細胞を効率的に編集する方法。
１４、配列番号４、８および３３～６３から選択されるいずれか一つの配列を含むｓｇ
ＲＮＡを造血幹細胞に導入することを含み、前記ｓｇＲＮＡが２’－Ｏ－メチル類縁体及
び／またはヌクレオチド間３’チオにより修飾されたものである、項１３に記載の方法。
１５、前記ｓｇＲＮＡとＣａｓ９をコードするヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞
に導入する、項１３または１４に記載の方法。
１６、ｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドとをエレクトロポレーション
によって一緒に前記造血幹細胞に導入する、項１５に記載の方法。
１７、前記エレクトロポレーションの条件は、２００～６００Ｖ、０．５～２ｍｓであ
る、項１６に記載の方法。
１８、項１～１７のいずれか一項に記載の方法によって得られた造血幹細胞。
１９、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）の発現が遺伝子改変によって増加したヒト造血幹細
胞であって、前記造血幹細胞の２番染色体上の、ＣＴＴＣＣＴ配列の上流０～１５個のヌ
クレオチドから当該ＣＴＴＣＣＴ配列の下流０～１５個のヌクレオチドまでのＢＣＬ１１
Ａゲノム領域が遺伝子編集技術によって破壊され、当該ＢＣＬ１１Ａゲノム領域がｃｈｒ
２：６０４９５２３６とｃｈｒ２：６０４９５２７１との間にある、ヒト造血幹細胞。
２０、項１８または１９に記載の造血幹細胞を分化培養することにより得られた、成熟
赤血球になる前の分化の異なる段階にある前駆細胞。
２１、項１８または１９に記載の造血幹細胞を分化培養することにより得られた成熟赤
血球。
２２、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）の発現が遺伝子改変によって増加した成熟赤血球ま
たはその前駆細胞を製造する方法であって、
（ａ）項１～１７のいずれか一項に記載の方法を使用して遺伝子改変された造血幹細胞
を得ることと、
（ｂ）造血幹細胞赤血球系増殖および分化培地を使用して、前記遺伝子改変された造血
幹細胞に対して造血幹細胞赤血球系増殖および分化を行うこととを含み、
前記造血幹細胞赤血球系増殖および分化培地は、基礎培地と、成長因子組成物とを含み
、前記成長因子組成物は、幹細胞成長因子（ＳＣＦ）、インターロイキン３（ＩＬ－３）
、およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含む、方法。
２３、赤血球系分化脱核培地を使用して造血幹細胞の赤血球系分化および脱核を行うこ
とをさらに含み、
前記赤血球系分化脱核培地は、基礎培地、成長因子、およびプロゲステロン受容体とグ
ルココルチコイド受容体の拮抗薬および／または阻害剤を含む、
項２２に記載の方法。
２４、前記赤血球系分化脱核培地における成長因子はエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含
み、前記プロゲステロン受容体とグルココルチコイド受容体の拮抗薬および／または阻害
剤は、下記化合物（Ｉ）～（ＩＶ）から選択されるいずれか１つまたは２つ以上である、
項２３に記載の方法。
Figure 2022180510000002
２５、項２２～２４のいずれか一項に記載の方法によって得られた成熟赤血球または前
駆細胞。
２６、項１８または１９に記載の造血幹細胞、若しくは項２０または２５に記載の前駆
細胞、若しくは項２１または２５に記載の成熟赤血球を含む、組成物。
２７、項１８または１９に記載の造血幹細胞、若しくは項２０または２５に記載の前駆
細胞、若しくは項２１または２５に記載の成熟赤血球を含む、医療製品。
２８、項１８または１９に記載の造血幹細胞、若しくは項２０または２５に記載の前駆
細胞、若しくは項２１または２５に記載の成熟赤血球の、それの必要がある被験者の疾患
の予防または治療における、使用。
２９、前記疾患が貧血疾患、出血性疾患、腫瘍、または予防または治療のために大量の
輸血を必要とする他の疾患である、項２８に記載の使用。
３０、前記疾患はβ－サラセミアまたは鎌状赤血球貧血である、項２９に記載の使用。
３１、前記被験者はヒトである、項２８～３０のいずれか一項に記載の使用。
３２、被験者の疾患を予防または治療するための薬剤または医療製品の調製における、
項１８または１９に記載の造血幹細胞、若しくは項２０または２５に記載の前駆細胞、若
しくは項２１または２５に記載の成熟赤血球の使用。
３３、前記疾患が貧血疾患、出血性疾患、腫瘍、または予防または治療のために大量の
輸血を必要とする他の疾患である、項３２に記載の使用。
３４、前記疾患はβ－サラセミアまたは鎌状赤血球貧血である、項３３に記載の使用。
３５、前記被験者はヒトである、項３２～３４のいずれか一項に記載の使用。
３６、ＣＴＴＣＣＴ配列の上流０～１５個のヌクレオチドから当該ＣＴＴＣＣＴ配列の
下流０～１５個のヌクレオチドまでのＢＣＬ１１Ａゲノム領域を標的とするｓｇＲＮＡを
含み、当該ＢＣＬ１１Ａゲノム領域がｃｈｒ２：６０４９５２３６とｃｈｒ２：６０４９
５２７１との間にある、ｓｇＲＮＡ構築体。
３７、配列番号３、４、８および３３～６３から選択されるいずれか一つのヌクレオチ
ド配列を含む、項３６に記載の構築体。
３８、２’－Ｏ－メチル類縁体及び／またはヌクレオチド間３’チオによる修飾を含む
、項３６または３７に記載の構築体。
３９、前記化学修飾は、前記ヌクレオチド配列の５’末端の最初の１つ、２つ、及び／
または３つの塩基及び／または３’末端の最後の１つの塩基の２’－Ｏ－メチル類縁体に
よる修飾である、項３８に記載の構築体。
４０、項３６～３９のいずれか一項に記載の構築体を含むベクター、宿主細胞または製
剤。
４１、造血幹細胞の遺伝子編集における、項３６～３９のいずれか一項に記載の構築体
の使用。
４２、項１８または１９に記載の造血幹細胞、項２０または２５に記載の前駆細胞、若
しくは項２１または２５に記載の成熟赤血球を被験者に投与することを含む、被験者の貧
血疾患、出血性疾患、腫瘍、または予防または治療のために大量の輸血を必要とする他の
疾患を治療または予防する方法。
４３、前記疾患はβ－サラセミアまたは鎌状赤血球貧血である、項４２に記載の方法。
４４、前記被験者はヒトである、項４３に記載の方法。
本発明は実験を通して、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の、ｃｈｒ２：６０４９５２３６とｃｈｒ
２：６０４９５２７１との間に位置するＢＣＬ１１Ａゲノム領域、例えば、ＣＴＴＣＣＴ
の６ｂｐ塩基配列、を破壊することにより、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子による胎児ヘモグロビン
合成への阻害を解消でき、それにより胎児ヘモグロビンの発現を増加させることができる
ことを証明した。これは、「ＣＴＴＣＣＴ」配列とその隣接領域は、胎児ヘモグロビンの
発現を調節するＢＣＬ１１Ａ遺伝子の重要な領域であることを示した。
本発明の一部の実施形態では、造血幹細胞中の２番染色体上の、配列がＣＴＴＣＣＴ（
ｃｈｒ２：６０４９５２５１～６０４９５２５６）であるＢＣＬ１１Ａゲノム領域を遺伝
子編集法によって破壊し、遺伝子編集された造血幹細胞を調製し、しかも、この遺伝子編
集された造血幹細胞が赤血球系に分化すると、γグロビンと胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）
の発現を有意に増加させることができ、それを動物体内に注入すると、動物モデルの造血
系を再構築することができることを実験によって証明した。また、オフターゲット分析に
より、本発明の方法は安全性が高く、遺伝子編集による副作用はほとんど検出されていな
いことが分かった。
自己造血幹細胞の遺伝子編集によりβ－サラセミアと鎌状赤血球貧血を治療するフローを示す図である。末梢血を患者から動員し、インビトロ分離によりＣＤ３４陽性の造血幹細胞を得て、インビトロで遺伝子編集して胎児ヘモグロビンの発現を増加させた後、遺伝子修飾された自己造血幹細胞を患者に再注入した。 癌細胞株Ｋ５６２で複数ロットの実験により最適なエレクトロポレーション条件を検出し、ＧＦＰのエレクトロポレーションの４日後の蛍光顕微鏡の写真を示す図である。「Ｖ」はパルス電圧を表し、「ｍｓ」はパルス時間を表す。 癌細胞株Ｋ５６２で複数ロットの実験により最適なエレクトロポレーション条件を検出し、ＧＦＰのエレクトロポレーションの４日後の、フローサイトメトリー解析による７－ＡＡＤとＧＦＰ発現の統計分析を示す図である。７－ＡＡＤは細胞生存率を表し、７－ＡＡＤ（７－アミノ－アクチノマイシンＤ）は、正常な原形質膜を通過できない核酸色素である。アポトーシスと細胞死のプロセスにおいて、原形質膜への７－ＡＡＤの通過性は徐々に増加し、適切な波長の励起光の励起下で明るい赤色の蛍光を発することができる。７－ＡＡＤ陰性は正常な生細胞であり、ＧＦＰはエレクトロポレーション効率を表す。「２５０－１」は２５０Ｖ電圧、１ｍｓのパルス時間、「２５０－１－１」と「２５０－１－２」はそれぞれ２５０Ｖ １ｍｓ、２回の繰り返しを表し、「３００－１－１」と「３００－１－２」はそれぞれ３００ｖ １ｍｓ、２回の繰り返しを表す。 ３００Ｖ、１ｍｓのエレクトロポレーション条件下で、ＧＦＰｍＲＮＡをエレクトロポレーションにより造血幹細胞に導入してから４日後の蛍光顕微鏡の写真を示す図である。それぞれ、明視野、緑のチャネル、赤のチャネル、明視野と緑のチャネルのオーバーレイの四つの視野を含む。 ３００Ｖ、１ｍｓのエレクトロポレーション条件下で、ＧＦＰｍＲＮＡをエレクトロポレーションにより造血幹細胞に導入してから４日後の、フローサイトメトリー解析によるＧＰＦとＣＤ３４タンパク質の発現を示す図である。 ヒトＢＣＬ１１Ａのエンハンサー５８Ｋの位置に対して設計された複数のｓｇＲＮＡを示す模式図である。 ヒトＢＣＬ１１Ａのエンハンサー５８Ｋ部位の１５０ｂｐ配列情報を示す図である。 ヒトＢＣＬ１１Ａのエンハンサー５８Ｋ部位の１５０ｂｐの位置に対して設計された２３個のｓｇＲＮＡの具体的なＤＮＡの配列情報を示す図である。 ＣＤ３４陽性の造血幹細胞に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡと複数のｓｇＲＮＡをエレクトロポレーションにより形質転換してから４日後にゲノムを抽出し、フラグメントを増幅し、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングを行い、ＴＩＤＥソフトウェア分析によるＩｎｄｅｌｓの生成効率の統計分析を示す図である。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐２、３、４、５、及び６ ｓｇＲＮＡ（すなわち、図中のＥｎｈａｎｃｅｒ－２、３、４、５、及び６）をエレクトロポレーションにより３つの異なる臍帯血由来のＣＤ３４陽性造血幹細胞に導入してから４日後、ＴＩＤＥソフトウェア分析によるＩｎｄｅｌｓの生成効率の統計分析を示す図である。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐２ ｓｇＲＮＡをエレクトロポレーションにより臍帯血由来のＣＤ３４陽性造血幹細胞に導入してから２日後、インビトロコロニー形成実験（ＣＦＵ検出）を実施し、１４日後に異なる血液系のコロニー数をカウントした結果を示す図である。ＢＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－Ｍ、ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－Ｇ、ＣＦＵ－ＭＭは、赤血球系、骨髄系、リンパ系などの血液系の異なる系統のコロニー形成を表す。その中で、Ｍｏｃｋは遺伝子編集されていない細胞を表す。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐２ ｓｇＲＮＡをエレクトロポレーションにより造血幹細胞に導入し、放射計で照射されたＮＰＧ免疫不全マウスモデルに、遺伝子修飾された細胞と遺伝子修飾されていない細胞を同時に移植し、６週間、８週間、１０週間、１２週間、１６週間後、マウスの末梢血でヒトＣＤ４５陽性細胞の割合を検出し、同時に移植した１６週間後のマウスの骨髄と脾臓でヒトＣＤ４５陽性細胞の割合を検出し、なお、ＣＤ４５陽性細胞の割合の計算方法として、ヒトＣＤ４５陽性細胞％／（ヒトＣＤ４５陽性細胞％＋マウスＣＤ４５陽性細胞％）が使用され、ヒトＣＤ４５陽性細胞％とマウスＣＤ４５陽性細胞％がそれぞれフローサイトメトリー解析実験により測定された結果である。Ｍｏｃｋは遺伝子編集されていない細胞を表す。Ｅｎｈａｎｃｅｒ－２は遺伝子編集された細胞を表す。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐２ ｓｇＲＮＡをエレクトロポレーションにより臍帯血由来の造血幹細胞に導入し、放射計で照射されたＮＰＧ免疫不全マウスモデルに、遺伝子修飾された細胞と遺伝子修飾されていない細胞を同時に移植してから１６週間後、それぞれマウスの骨髄、脾臓、末梢血における、ヒトＣＤ４５タンパク質に対するＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３３、ＣＤ５６、ＣＤ１９などのヒト細胞膜タンパク質の割合を検出したことを示す図である。Ｍｏｃｋは遺伝子編集されていない細胞を表す。Ｅｎｈａｎｃｅｒ－２は遺伝子編集された細胞を表す。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐２ ｓｇＲＮＡをエレクトロポレーションにより臍帯血由来の造血幹細胞に導入し、放射計で照射されたＮＰＧ免疫不全マウスモデルに、遺伝子修飾された細胞を移植してから、１６週間後、それぞれマウスの骨髄、脾臓、末梢血におけるマウスＣＤ４５、ヒトＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８の発現をフローサイトメトリー解析によって検出した結果を示す図である。ＳＳＣ－Ｈチャネルは、細胞の粒度を表す横角散乱を表し、値が大きいほど、細胞の粒度が大きい。粒度とは、細胞表面のしわ、細胞内の細胞小器官や粒子の数などを指す。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐２ ｓｇＲＮＡをエレクトロポレーションにより臍帯血由来の造血幹細胞に導入し、放射計で照射されたＮＰＧ免疫不全マウスモデルに、遺伝子修飾された細胞を移植し、１６週間後、マウスの骨髄、脾臓、末梢血における、一匹のマウスのヒトＣＤ３３、ＣＤ５６、ＣＤ４９をフローサイトメトリー解析によって検出した結果を示す図である。ＳＳＣ－Ｈチャネルは、細胞の粒度を表す横角散乱を表し、値が大きいほど、細胞の粒度が大きい。粒度とは、細胞表面のしわ、細胞内の細胞小器官や粒子の数などを指す。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐２ ｓｇＲＮＡをエレクトロポレーションにより臍帯血由来の造血幹細胞に導入し、移植前の細胞と移植してから１６週間後の末梢血、骨髄、脾臓のゲノムを抽出し、目標フラグメントを増幅してＳａｎｇｅｒシーケンシングを行い、ＴＩＤＥソフトウェアで遺伝子編集Ｉｎｄｅｌｓ効率を分析した結果を示す図である。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐２ ｓｇＲＮＡをエレクトロポレーションにより臍帯血由来の造血幹細胞に導入し、赤血球への分化を行って１２日後に検出を行った結果を示す図である。図Ａは、分化後の赤血球の写真を示す図である。図Ｂは、ヒトＣＤ７１とヒト２３５ａとの２つの膜タンパク質の発現の検出を示し、赤血球系の分化効率を示す図である。Ｍｏｃｋは遺伝子編集されていない細胞を表す。Ｅｎｈａｎｃｅｒ－２は遺伝子編集された細胞を表す。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐２ ｓｇＲＮＡをエレクトロポレーションにより臍帯血由来の造血幹細胞に導入し、赤血球への分化を行って１２日後、ＢＣＬ１１Ａ、ＨＢＢ、ＨＢＧなどの遺伝子のｍＲＮＡ発現を蛍光定量によって検出した結果を示す図である。Ｍｏｃｋは遺伝子編集されていない細胞を表す。Ｅｎｈａｎｃｅｒ－２は遺伝子編集された細胞を表す。 ６μｇのＣａｓ９ ｍＲＮＡと４μｇのＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐２ ｓｇＲＮＡをエレクトロポレーションにより臍帯血由来の造血幹細胞に導入し、赤血球への分化を行って１２日後、細胞内の胎児ヘモグロビンＨｂＦの発現状況を示す図である。左側はフローサイトメトリー解析チャートであり、右側は胎児ヘモグロビン発現の統計分析の図である。Ｍｏｃｋは遺伝子編集されていない細胞を表す。Ｅｎｈａｎｃｅｒ－２は遺伝子編集された細胞を表す。 新たに単離されたβ－サラセミア患者の末梢血におけるＣＤ４５とＣＤ３４の発現を検出した結果を示す図である。左側は対照群であり、右側は実験群である。実験サンプルは、３名のβ－サラセミア患者から由来する。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐２、３、４、５および６ ｓｇＲＮＡ（すなわち、図の中のＥｎｈａｎｃｅｒ－２、３、４、５、６）をエレクトロポレーションにより、３名の異なるβ－サラセミア患者の末梢血から単離されたＣＤ３４陽性造血幹細胞に導入し、４日後、ＴＩＤＥソフトウェア分析によるＩｎｄｅｌｓの生成効率の統計分析を示す図である。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐２ ｓｇＲＮＡをエレクトロポレーションにより、β－サラセミア患者の末梢血から単離されたＣＤ３４陽性造血幹細胞に導入してゲノムを抽出し、ＮＧＳディープシーケンス分析による１４の潜在的なオフターゲット部位の統計図である。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐２、３、４、５および６ ｓｇＲＮＡ（すなわち、図の中のＥｎｈａｎｃｅｒ－２、３、４、５、６）をエレクトロポレーションにより、β－サラセミア患者に由来の造血幹細胞に導入し、赤血球への分化を行って１２日後に検出した結果を示す図である。図Ａは、分化後の赤血球の写真を示す図である。図Ｂは、ヒトＣＤ７１とヒト２３５ａとの２つの膜タンパク質の発現の検出を示し、赤血球系の分化効率を示す図である。Ｍｏｃｋは遺伝子編集されていない細胞を表す。Ｅｎｈａｎｃｅｒ－２、３、４、５、及び６は遺伝子編集された細胞を表す。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐２、３、４、５および６ ｓｇＲＮＡ（すなわち、図の中のＥｎｈａｎｃｅｒ－２、３、４、５、６）をエレクトロポレーションにより、β－サラセミア患者の末梢血から単離されたＣＤ３４陽性造血幹細胞に導入し、赤血球への分化を行って１２日後に、ＢＣＬ１１Ａとγ－グロビンの遺伝子発現を検出した結果を示す図である。Ｍｏｃｋは遺伝子編集されていない細胞を表す。Ｅｎｈａｎｃｅｒ－２、３、４、５、及び６は遺伝子編集された細胞を表す。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐２ ｓｇＲＮＡをエレクトロポレーションにより、β－サラセミア患者に由来のＣＤ３４陽性造血幹細胞に導入し、２日後にインビトロコロニー形成実験（ＣＦＵ検出）を行い、１４日後、異なる血液系のコロニー数をカウントした結果を示す図である。ＢＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－Ｍ、ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－Ｇ、ＣＦＵ－ＭＭは、赤血球系、骨髄系、リンパ系などの血液系の異なる系統のコロニー形成を表す。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐３（Ｅｎｈａｎｃｅｒ－３）、エンハンサー‐４（Ｅｎｈａｎｃｅｒ－４）、またはエンハンサー‐５（Ｅｎｈａｎｃｅｒ－５） ｓｇＲＮＡをエレクトロポレーションにより、β－サラセミア患者に由来のＣＤ３４陽性造血幹細胞に導入し、遺伝子編集効率、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子発現、及びγ－グロビンの遺伝子発現を評価した結果を示す図である。Ａ）エレクトロポレーションの４日後、ＴＩＤＥソフトウェア分析による異なるｓｇＲＮＡｓのＩｎｄｅｌｓ生成効率の統計分析を示す図である。Ｂ）造血幹細胞のエレクトロポレーション後、赤血球分化を行い、１２日後にＢＣＬ１１Ａ遺伝子発現を検出した結果を示す図である。Ｃ）造血幹細胞のエレクトロポレーション後、赤血球への分化を行い、１２日後にγ－グロビン遺伝子発現を検出した結果を示す図である。Ｍｏｃｋは遺伝子編集されていない細胞を表す。Ｅｎｈａｎｃｅｒ－３、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－４、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－５は、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－３、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－４、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－５ ｓｇＲＮＡの導入後に遺伝子編集された細胞を表す。 遺伝子編集されていない細胞（Ｍｏｃｋ）と遺伝子編集された細胞（エンハンサー２ｓｇＲＮＡで編集された）を代表するクロマトグラフィーの結果を示し、ＨｂＦとＨｂＡの発現量を示す図である。 遺伝子編集されていない細胞（Ｍｏｃｋ）と遺伝子編集された細胞（エンハンサー３、４、５、及び６ ｓｇＲＮＡで編集された）を代表するクロマトグラフィーの結果を示し、ＨｂＦとＨｂＡの発現量を示す図である。 図２７および図２８のクロマトグラフィー結果に基づいて算出したＨｂＦとＨｂＡ発現量の比を示す図である。 実施例９におけるＨｂＦ染色後のＨｂＦ高発現（約１０％割合）とＨｂＦ低発現（約１０％割合）の細胞の割合を示す図である。 実施例９におけるＨｂＦ高発現（約１０％割合）とＨｂＦ低発現（約１０％割合）の細胞に対し、ゲノムを抽出してそれぞれ次世代シーケンシングを行った結果を示す図である。
本出願は、ＣＤ３４陽性造血幹細胞のＢＣＬ１１Ａエンハンサー部位、特にＢＣＬ１１
Ａ遺伝子の、ＣＴＴＣＣＴ配列の上流０～１５個のヌクレオチドから当該ＣＴＴＣＣＴ配
列の下流０～１５個のヌクレオチドまでの領域、例えば、「ＣＴＴＣＣＴ」の６ｂｐ塩基
配列（ｃｈｒ２：６０４９５２５１－６０４９５２５６）、の破壊に係り、これによって
ＢＣＬ１１Ａ遺伝子による胎児ヘモグロビン合成の阻害を解消し、胎児ヘモグロビンの発
現を増加させることができる。
一態様では、本発明は、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）の発現を
増加させる方法を提供し、この方法は、前記造血幹細胞の２番染色体上の、ＣＴＴＣＣＴ
配列の上流０～１５個のヌクレオチドから当該ＣＴＴＣＣＴ配列の下流０～１５個のヌク
レオチドまでのＢＣＬ１１Ａゲノム領域を遺伝子編集技術によって破壊することを含み、
ＢＣＬ１１Ａゲノム領域がｃｈｒ２：６０４９５２３６とｃｈｒ２：６０４９５２７１と
の間にある。一部の実施形態では、前記ＢＣＬ１１Ａゲノム領域の配列はＣＴＴＣＣＴで
ある。
本願でいうＢＣＬ１１Ａゲノム領域の「ＣＴＴＣＣＴ」配列とは、ヒト２番染色体上の
、６０４９５２５１番目から６０４９５２５６番目までに位置する配列をいい、染色体の
ヌクレオチド位置は、ＧＲＣｈ３８標準によるヒト遺伝子配列における位置である。異な
るヒトゲノム配列を参照すると、当該ＣＴＴＣＣＴ配列の位置が異なる場合があることを
、当業者は理解するはずである。一部の実施形態では、ＣＴＴＣＣＴ配列の上流０～１５
個のヌクレオチドから当該ＣＴＴＣＣＴ配列の下流０～１５個のヌクレオチドまでのＢＣ
Ｌ１１Ａゲノム領域を破壊することは、この領域に、ヌクレオチド配列の「付加および／
または削除（ｉｎｄｅｌ）」を導入することを含み、例えば、任意のタイプ（例えば、Ａ
、Ｔ、Ｃ、Ｇから選択される）および／または数量（例えば、１～２０、１～１５、１～
１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１～２個）のヌクレ
オチドのｉｎｄｅｌを導入することを含む。一部の実施形態では、前記破壊は、元のヌク
レオチド配列を新しいヌクレオチド配列で置き換えることを含み、例えば、ＣＴＴＣＣＴ
の連続した６つのヌクレオチドの中の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを
、１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドで置き換えることを含む。一部の実施
形態では、前記破壊は、ＣＴＴＣＣＴ配列の上流０～１５個のヌクレオチドから当該ＣＴ
ＴＣＣＴ配列の下流０～１５個のヌクレオチドまでのＢＣＬ１１Ａゲノム領域にヌクレオ
チド配列をノックイン（ｋｎоｃｋ－ｉｎ）またはノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）
することを含み、例えば、ＣＴＴＣＣＴの連続した６つのヌクレオチド領域にヌクレオチ
ド配列をノックインまたはノックアウトすることを含む。遺伝子解析の結果によると、「
ＣＴＴＣＣＴ」の６ｂｐ塩基配列は、ＳＴＡＴ１とＥＬＦ１遺伝子の結合部位を含む。
理論や仮設に拘束されることなく、本発明におけるＣＴＴＣＣＴおよびその近傍領域へ
の破壊、例えば、当該領域にｉｎｄｅｌを導入することは、本発明の実施形態でエンハン
サー２によって実証されたように、ＳＴＡＴ１及びＥＬＦ－１とＢＣＬ１１Ａエンハンサ
ーとの結合に直接に影響を及ぼし、胎児ヘモグロビンの発現を有意且つ効率的に高めるこ
とができる。「ＣＴＴＣＣＴ」領域を囲む遺伝子編集、例えば「ＣＴＴＣＣＴ」領域の上
流および／または下流１～１５、１～１４、１～１３、１～１２、１～１１、１～１０、
１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１～２のヌクレオチド領域
を囲む遺伝子編集も、例えばこれらの領域にｉｎｄｅｌを導入すると、本発明の図１０、
２３および２４に示されるように、胎児ヘモグロビンの発現を異なる程度で改善すること
ができる。
一部の実施形態では、本発明で破壊されるＢＣＬ１１Ａゲノム領域は、ＣＴＴＣＣＴ配
列の上流０～１５個のヌクレオチドから当該ＣＴＴＣＣＴ配列の下流０～１５個のヌクレ
オチドまでの領域であり、当該ＢＣＬ１１Ａゲノム領域はｃｈｒ２：６０４９５２３６と
ｃｈｒ２：６０４９５２７１との間に位置する。一部の実施形態では、本発明で破壊され
るＢＣＬ１１Ａゲノム領域は、ＣＴＴＣＣＴ配列の上流０～１４個のヌクレオチドから当
該ＣＴＴＣＣＴ配列の下流０～１４個のヌクレオチドまでの領域であり、ＢＣＬ１１Ａゲ
ノム領域はｃｈｒ２：６０４９５２３７とｃｈｒ２：６０４９５２７０との間に位置する
。一部の実施形態では、本発明で破壊されるＢＣＬ１１Ａゲノム領域は、ＣＴＴＣＣＴ配
列の上流０～１３個のヌクレオチドから当該ＣＴＴＣＣＴ配列の下流０～１３個のヌクレ
オチドまでの領域であり、当該ＢＣＬ１１Ａゲノム領域はｃｈｒ２：６０４９５２３８と
ｃｈｒ２：６０４９５２６９との間に位置する。一部の実施形態では、本発明で破壊され
るＢＣＬ１１Ａゲノム領域は、ＣＴＴＣＣＴ配列の上流０～１２個のヌクレオチドから当
該ＣＴＴＣＣＴ配列の下流０～１２個のヌクレオチドまでの領域であり、当該ＢＣＬ１１
Ａゲノム領域はｃｈｒ２：６０４９５２３９とｃｈｒ２：６０４９５２６８との間に位置
する。一部の実施形態では、本発明で破壊されるＢＣＬ１１Ａゲノム領域は、ＣＴＴＣＣ
Ｔ配列の上流０～１１個のヌクレオチドから当該ＣＴＴＣＣＴ配列の下流０～１１個のヌ
クレオチドまでの領域であり、当該ＢＣＬ１１Ａゲノム領域はｃｈｒ２：６０４９５２４
０とｃｈｒ２：６０４９５２６７との間に位置する。一部の実施形態では、本発明で破壊
されるＢＣＬ１１Ａゲノム領域は、ＣＴＴＣＣＴ配列の上流０～１０個のヌクレオチドか
ら当該ＣＴＴＣＣＴ配列の下流０～１０個のヌクレオチドまでの領域であり、当該ＢＣＬ
１１Ａゲノム領域はｃｈｒ２：６０４９５２４１とｃｈｒ２：６０４９５２６６との間に
位置する。一部の実施形態では、本発明で破壊されるＢＣＬ１１Ａゲノム領域は、ＣＴＴ
ＣＣＴ配列の上流０～９個のヌクレオチドから当該ＣＴＴＣＣＴ配列の下流０～９個のヌ
クレオチドまでの領域であり、当該ＢＣＬ１１Ａゲノム領域はｃｈｒ２：６０４９５２４
２とｃｈｒ２：６０４９５２６５との間に位置する。一部の実施形態では、本発明で破壊
されるＢＣＬ１１Ａゲノム領域は、ＣＴＴＣＣＴ配列の上流０～８個のヌクレオチドから
当該ＣＴＴＣＣＴ配列の下流０～８個のヌクレオチドまでの領域であり、当該ＢＣＬ１１
Ａゲノム領域はｃｈｒ２：６０４９５２４３とｃｈｒ２：６０４９５２６４との間に位置
する。一部の実施形態では、本発明で破壊されるＢＣＬ１１Ａゲノム領域は、ＣＴＴＣＣ
Ｔ配列の上流０～７個のヌクレオチドから当該ＣＴＴＣＣＴ配列の下流０～７個のヌクレ
オチドまでの領域であり、当該ＢＣＬ１１Ａゲノム領域はｃｈｒ２：６０４９５２４４と
ｃｈｒ２：６０４９５２６３との間に位置する。一部の実施形態では、本発明で破壊され
るＢＣＬ１１Ａゲノム領域は、ＣＴＴＣＣＴ配列の上流０～６個のヌクレオチドから当該
ＣＴＴＣＣＴ配列の下流０～６個のヌクレオチドまでの領域であり、当該ＢＣＬ１１Ａゲ
ノム領域はｃｈｒ２：６０４９５２４５とｃｈｒ２：６０４９５２６２との間に位置する
。一部の実施形態では、本発明で破壊されるＢＣＬ１１Ａゲノム領域は、ＣＴＴＣＣＴ配
列の上流０～５個のヌクレオチドから当該ＣＴＴＣＣＴ配列の下流０～５個のヌクレオチ
ドまでの領域であり、当該ＢＣＬ１１Ａゲノム領域はｃｈｒ２：６０４９５２４６とｃｈ
ｒ２：６０４９５２６１との間に位置する。一部の実施形態では、本発明で破壊されるＢ
ＣＬ１１Ａゲノム領域は、ＣＴＴＣＣＴ配列の上流０～４個のヌクレオチドから当該ＣＴ
ＴＣＣＴ配列の下流０～４個のヌクレオチドまでの領域であり、当該ＢＣＬ１１Ａゲノム
領域はｃｈｒ２：６０４９５２４７とｃｈｒ２：６０４９５２６０との間に位置する。一
部の実施形態では、本発明で破壊されるＢＣＬ１１Ａゲノム領域は、ＣＴＴＣＣＴ配列の
上流０～３個のヌクレオチドから当該ＣＴＴＣＣＴ配列の下流０～３個のヌクレオチドま
での領域であり、当該ＢＣＬ１１Ａゲノム領域はｃｈｒ２：６０４９５２４８とｃｈｒ２
：６０４９５２５９との間に位置する。一部の実施形態では、本発明で破壊されるＢＣＬ
１１Ａゲノム領域は、ＣＴＴＣＣＴ配列の上流０～２個のヌクレオチドから当該ＣＴＴＣ
ＣＴ配列の下流０～２個のヌクレオチドまでの領域であり、当該ＢＣＬ１１Ａゲノム領域
はｃｈｒ２：６０４９５２４９とｃｈｒ２：６０４９５２５８との間に位置する。一部の
実施形態では、本発明で破壊されるＢＣＬ１１Ａゲノム領域は、ＣＴＴＣＣＴ配列の上流
０～１個のヌクレオチドから当該ＣＴＴＣＣＴ配列の下流０～１個のヌクレオチドまでの
領域であり、当該ＢＣＬ１１Ａゲノム領域はｃｈｒ２：６０４９５２５０とｃｈｒ２：６
０４９５２５７との間に位置する。一部の実施形態では、本発明で破壊されるＢＣＬ１１
Ａゲノム領域はＣＴＴＣＣＴであり、当該ＢＣＬ１１Ａゲノム領域はｃｈｒ２：６０４９
５２５１とｃｈｒ２：６０４９５２５６との間に位置する。
一部の実施形態では、当該ＢＣＬ１１Ａゲノム領域の最上流は、当該ＣＴＴＣＣＴ配列
の上流の１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、また
は１番目のヌクレオチドに位置し、または、ＣＴＴＣＣＴ配列の５’末端の１、２、また
は３番目のヌクレオチドに位置する。一部の実施形態では、当該ＢＣＬ１１Ａゲノム領域
の最下流は、当該ＣＴＴＣＣＴ配列の下流の１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、
８、７、６、５、４、３、２、または１番目のヌクレオチドに位置し、または、ＣＴＴＣ
ＣＴ配列の３’末端の１、２、または３番目のヌクレオチドに位置する。一部の実施形態
では、当該ＢＣＬ１１Ａゲノム領域の最上流は、ｃｈｒ２：６０４９５２５３、ｃｈｒ２
：６０４９５２５２、ｃｈｒ２：６０４９５２５１、ｃｈｒ２：６０４９５２５０、ｃｈ
ｒ２：６０４９５２４９、ｃｈｒ２：６０４９５２４８、ｃｈｒ２：６０４９５２４７、
ｃｈｒ２：６０４９５２４６、ｃｈｒ２：６０４９５２４５、ｃｈｒ２：６０４９５２４
４、ｃｈｒ２：６０４９５２４３、ｃｈｒ２：６０４９５２４２、ｃｈｒ２：６０４９５
２４１、ｃｈｒ２：６０４９５２４０、ｃｈｒ２：６０４９５２３９、ｃｈｒ２：６０４
９５２３８、ｃｈｒ２：６０４９５２３７、またはｃｈｒ２：６０４９５２３６に位置す
る。一部の実施形態では、当該ＢＣＬ１１Ａゲノム領域の最下流は、ｃｈｒ２：６０４９
５２５４、ｃｈｒ２：６０４９５２５５、ｃｈｒ２：６０４９５２５６、ｃｈｒ２：６０
４９５２５７、ｃｈｒ２：６０４９５２５８、ｃｈｒ２：６０４９５２５９、ｃｈｒ２：
６０４９５２６０、ｃｈｒ２：６０４９５２６１、ｃｈｒ２：６０４９５２６２、ｃｈｒ
２：６０４９５２６３、ｃｈｒ２：６０４９５２６４、ｃｈｒ２：６０４９５２６５、ｃ
ｈｒ２：６０４９５２６６、ｃｈｒ２：６０４９５２６７、ｃｈｒ２：６０４９５２６８
、ｃｈｒ２：６０４９５２６９、ｃｈｒ２：６０４９５２７０、またはｃｈｒ２：６０４
９５２７１に位置する。当該ＢＣＬ１１Ａゲノム領域の最上流と最下流は、上記最上流と
最下流の位置のいずれかの組み合わせであってもよく、しかも当該ＢＣＬ１１Ａゲノム領
域はＧＡＴＡＡ部位ではない。
一部の実施形態では、本発明のＢＣＬ１１Ａゲノム領域は、下記の配列番号３１または
配列番号３２に示される配列の１～３６（例えば、１～４、１～６、１～８、１～１０、
１～１５、１～２０、１～２５、または１～３０）の連続したヌクレオチド配列から選択
され、しかもそのヌクレオチド配列はＧＡＴＡＡではない：
配列番号３１（ｃｈｒ２：６０４９５２３６とｃｈ２：６０４９５２７１との間のヌク
レオチド配列）
ａｔｃａｇａｇｇｃｃａａａｃｃｃｔｔｃｃｔｇｇａｇｃｃｔｇｔｇａｔａａａ
配列番号３２（ｃｈｒ２：６０４９５２３６とｃｈ２：６０４９５２７１との間のヌク
レオチド配列の相補配列）
ｔｔｔａｔｃａｃａｇｇｃｔｃｃａｇｇａａｇｇｇｔｔｔｇｇｃｃｔｃｔｇａｔ
よって、一態様では、本発明は、ヒト造血幹細胞における２番染色体上ＣＴＴＣＣＴの
６つの連続した塩基（ｃｈｒ２：６０４９５２５１－６０４９５２５６）のＢＣＬ１１Ａ
ゲノム領域を遺伝子編集技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞の胎児ヘモグ
ロビン（ＨｂＦ）の発現を増加させる方法に関する。本発明はさらに、ヒト造血幹細胞に
おける２番染色体上の、ＣＴＴＣＣＴの６つの連続した塩基領域の上流および／または下
流１～１５、１～１４、１～１３、１～１２、１～１１、１～１０、１～９、１～８、１
～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１～２のヌクレオチドを囲む領域を遺伝子編集
技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞の胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）の発現
を増加させる方法に関する。
一部の実施形態では、前記遺伝子編集技術は、ジンクフィンガーヌクレアーゼに基づく
遺伝子編集技術、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集技術またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集技術
である。一部の実施形態では、前記遺伝子編集技術はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集
技術である。
一部の実施形態では、前記方法は、ＢＣＬ１１Ａゲノム領域の編集を実現するように、
ＣＴＴＣＣＴ配列の上流０～１５個のヌクレオチドから当該ＣＴＴＣＣＴ配列の下流０～
１５個のヌクレオチドまでのＢＣＬ１１Ａゲノム領域を標的とするｓｇＲＮＡ、例えば、
ＣＴＴＣＣを含むｓｇＲＮＡ、またはＣＴＴＣＣと相補的な配列を含むｓｇＲＮＡ、を前
記造血幹細胞に導入することを含み、前記ＢＣＬ１１Ａゲノム領域は、ｃｈｒ２：６０４
９５２３６とｃｈｒ２：６０４９５２７１との間に位置する。一部の実施形態では、前記
方法は、前記ＢＣＬ１１Ａゲノムの編集を実現するように、配列番号３、４、８および３
３～６３から選択されるいずれか一つの配列を含むｓｇＲＮＡを前記造血幹細胞に導入す
ることを含む。
本発明は、ＣＴＴＣＣＴ配列の上流０～１５個のヌクレオチドから当該ＣＴＴＣＣＴ配
列の下流０～１５個のヌクレオチドまでのＢＣＬ１１Ａゲノム領域を標的とするｓｇＲＮ
Ａを含む、造血幹細胞を遺伝子編集するために必要なｓｇＲＮＡ（例えば、化学修飾され
たｓｇＲＮＡ）を提供し、前記ＢＣＬ１１Ａゲノム領域がｃｈｒ２：６０４９５２３６と
ｃｈｒ２：６０４９５２７１との間にあり、例えば、ＣＴＴＣＣ、またはＣＴＴＣＣと相
補的なヌクレオチド配列を含み、さらに、配列番号３、４、８および３３～６３から選択
されるいずれか一つのヌクレオチド配列を含む。
本発明はさらに、β－サラセミアと鎌状赤血球貧血患者のための造血幹細胞を編集する
方法を提供する。
本発明はまた、遺伝子編集によって破壊された、本発明のいずれか一つのＢＣＬ１１Ａ
ゲノム領域の造血幹細胞、成熟赤血球、または成熟赤血球の前駆細胞を提供する。一部の
実施形態では、その造血幹細胞、成熟赤血球、または成熟赤血球の前駆細胞における破壊
されたＢＣＬ１１Ａゲノム領域は、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－２－Ｉｎｄｅｌ－１、２、３、ま
たは４など、図３１に示すいずれかの配列を含む。
本発明の目的の一つは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集技術に基づいてＣＤ３４＋造
血幹細胞を効率的に修飾することである。例えば、臍帯血または骨髄からＣＤ３４陽性の
造血幹細胞を得て、Ｃａｓ９と所定のｓｇＲＮＡとを、最適化されたエレクトロポレーシ
ョン条件によって造血幹細胞に導入し、造血幹細胞を遺伝子編集して、遺伝子編集された
造血幹細胞を実験動物に移植して当該造血幹細胞が造血系を再構築する能力を評価しても
よい。前記ｓｇＲＮＡは、「ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮ ＴＯＯＬＳ」ソフトウェアなど、
複数の設計ソフトウェアを用いて、ＢＣＬ１１Ａ（＋５８）部位などのＢＣＬ１１Ａのエ
ンハンサーに対して設計することができる。一部の実施形態では、設計されたｓｇＲＮＡ
は、例えば、前記ｓｇＲＮＡの５’および３’末端の３つの塩基の２’－Ｏ－メチル類縁
体による修飾、及びヌクレオチド間の３’チオ修飾など、化学修飾される。Ｃａｓ９ｍＲ
ＮＡと、異なるｓｇＲＮＡとの組み合わせをテストすることで高効率のｓｇＲＮＡを得る
ことができる。一部の実施形態では、前記造血幹細胞は、臨床レベルの磁気カラム選別に
よって得られ、遺伝子編集に使用されるＣａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチドお
よび化学修飾されたｓｇＲＮＡは、インビトロ転写実験を通じて得られる。遺伝子編集さ
れた造血幹細胞を赤血球系へ分化させ、赤血球生成の割合を検出する。例えば、遺伝子編
集された造血幹細胞を、放射計で照射されたＮＰＧマウスに移植して造血系を再構築する
能力を評価してもよいし、患者のＣＤ３４陽性の造血幹細胞を分離して遺伝子編集効率、
赤血球系分化能、γグロビンおよび胎児ヘモグロビンの発現を評価してもよい。
まず、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集技術により造血幹細胞ＢＣＬ１１Ａのエ
ンハンサー部位を遺伝子編集することを含む、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）の発現を増加
させる方法を提供する。編集プロセスは、造血幹細胞ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー部位の
標的配列に対してｓｇＲＮＡを設計する。ＢＣＬ１１Ａのエンハンサーには、その転写開
始点からの距離（ｋｉｌо－ｂａｓｅ数）に応じて＋６２、＋５８、＋５５と命名された
部位がある。ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球系エンハンサーは、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ
）の発現を負に調節することができ、転写開始点から５５ｋｂ（ｋｂは、１０００の塩基
を表す）、５８ｋｂ、６２ｋｂ離れた位置は重要な調節領域であることが報告されている
。＋５５、＋５８、＋６２部位について研究した研究者もいるが、上記三つの部位の前後
の遺伝子配列は何れも１０００ｂｐ以上であり、合計で約６０００ｂｐであるため、具体
的にはどの領域を編集すると理想の編集効果を実現できるか、当業者は分からず、＋５８
という一つの部位にとっても、遺伝子編集効率にも大きな差がある（Ｂａｕｅｒ，Ｄ．Ｅ
．ｅｔ ａｌ． Ａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ ＢＣＬ１１Ａ
ｓｕｂｊｅｃｔ ｔｏ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ
ｆｅｔａｌ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｌｅｖｅｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ３４２，２５３
－２５７（２０１３）、及びＣａｎｖｅｒ ＭＣ， ｅｔ ａｌ． ＢＣＬ１１Ａのエン
ハンサーｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎ ｓｉｔｕ
ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ． Ｎａｔｕｒｅ． ２０１５ Ｎｏｖ
１２；５２７（７５７７）：１９２－７参照）。そのため、編集効率にとって極めて重
要な具体的な領域を見つけることは、当業者が最初に直面する問題である。
本願の発明者は深く研究した結果、＋５８位置における１５０ｂｐの塩基配列（ヒト２
番染色体の６０４９５１９７番目から６０４９５３４６番目までの領域に位置し、本明細
書ではｃｈｒ２：６０４９５１９７－６０４９５３４６と略記し、その配列は例えば、配
列番号２に示される）は遺伝子編集の効率に大きな影響を与え、その中で最も重要な領域
は「ＣＴＴＣＣＴ」６ｂｐの塩基配列領域であることが分かった。その領域を破壊するこ
とで、胎児ヘモグロビンの発現を大幅かつ効率的に増加させることができる。ＣＴＴＣＣ
Ｔ配列の上流０～１５個のヌクレオチドから当該ＣＴＴＣＣＴ配列の下流０～１５個のヌ
クレオチドまでのＢＣＬ１１Ａゲノム領域、例えば、ＣＴＴＣＣＴ配列の上流および／ま
たは下流１～１５、１～１４、１～１３、１～１２、１～１１、１～１０、１～９、１～
８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１～２のヌクレオチドを囲む領域を破壊
することも、胎児ヘモグロビンの発現を異なる程度で改善することができる。
本発明のｓｇＲＮＡはいずれも、正常ドナーおよび貧血患者からの造血幹細胞の遺伝子
編集を効率的に実現することができ、その中で、比較的に効率的な候補ｓｇＲＮＡは何れ
も、胎児ヘモグロビンの発現を有意に増加させることができる。ある文献報告によると、
＋５５、＋５８、＋６２部位に対してｓｇＲＮＡｓライブラリーを設計し、ＣＲＩＳＰＲ
／Ｃａｓ９を利用して細胞モデルによるスクリーニングをした結果、標的される＋５８の
「ＧＡＴＡＡ」部位が重要な調節制御の配列であり、すなわち、「ＧＡＴＡＡ」配列を含
むｓｇＲＮＡによる胎児ヘモグロビンの発現の増加効果が最も顕著であることが分かった
。しかしながら、本発明で見出されたｓｇＲＮＡによってアンカーされた＋５８近傍の領
域は、既存技術に開示された重要な「ＧＡＴＡＡ」塩基部位とは異なることに注意すべき
である。
本発明の発明者は、ＢＣＬ１１Ａゲノム領域において配列「ＣＴＴＣＣＴ」が重要な標
的配列（図３１の矢印で示される位置）であることを発見した。遺伝子編集された細胞に
おいて該配列は破壊されると、胎児ヘモグロビンの発現を大幅にアップレギュレーション
することができる。遺伝子解析の結果によると、「ＣＴＴＣＣＴ」６ｂｐの塩基配列は、
ＳＴＡＴ１とＥＬＦ１遺伝子の結合部位を含んでいる。その中で、文献の報告によると、
ＳＴＡＴ１の結合部位は、「ＴＴＣＣｎＧＧＡ」モチーフ（ｎは任意の塩基を表す）であ
り（Ｒａｊａ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２０
０８；Ｇｅｏｒｇｅ， ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２００１； Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ， ｅｔ ａｌ． Ｐｌｏｓ
ｏｎｅ． ２０１０）、ＥＬＦ－１の結合部位は「ＴＴＣＣ」モチーフである（Ｓｔｅｖ
ｅｎ， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ． ２０１５； Ｙｕａ
ｎｇ－Ｔａｕｎｇ Ｊｕａｎｇ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ． ２００７）。本発明のｓｇＲＮＡにより導入される遺伝子編集は、
胎児ヘモグロビンの発現を大幅に増加させ、臨床的治療に十分適用できる。
効率的な遺伝子編集領域を知った後、ジンクフィンガーヌクレアーゼに基づく遺伝子編
集技術、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集技術、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（例えば、ＣＲＩＳＰ
Ｒ／Ｃａｓ９）遺伝子編集技術、および将来発見される他の遺伝子編集方法など、任意の
遺伝子編集方法を用いて前記知った効率的な遺伝子編集領域を編集し、遺伝子編集条件を
最適化し、効率的な編集の目的を実現することができると、当業者は理解できる。よって
、本発明は、任意の利用可能な遺伝子編集方法によって本発明で同定された配列３～２５
および３３～６３から選択されるＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的配列の技術構成をカバーする
。一部の好ましい実施形態では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術によ
って効率的な遺伝子編集を実現する技術構成に係る。
本出願で使用されたように、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」は遺伝子編集技術であり、例え
ば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのような、自然に存在するまたは人工的に設計され
た様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含むが、これらに限られていない。自然に存在
するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ＣＲＩ
ＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ）は、細菌と古細菌が長期的な進化中に形成した適応性免
疫防御であり、侵入するウイルスおよび外因性ＤＮＡと対抗することができる。例えば、
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の作動原理は、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｒ
ＮＡ）が塩基対を通してｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＲＮＡ
）と結合してｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ複合体を形成し、この複合体は、ヌクレアー
ゼＣａｓ９タンパク質をガイドしてｃｒＲＮＡとペアになっている配列標的部位で二本鎖
ＤＮＡを切断する。ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡを人工的に設計することにより、ガイ
ド作用を有するｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）を改変形成し、Ｃａｓ
９がＤＮＡを部位特異的に切断することをガイドするようにすることができる。ＲＮＡ指
向性ｄｓＤＮＡ結合タンパク質として、Ｃａｓ９エフェクターヌクレアーゼは、ＲＮＡ、
ＤＮＡ、およびタンパク質に共局在化することができるため、巨大な改変可能性を有する
。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムには、クラス１、クラス２、またはクラス３のＣａｓタ
ンパク質が使用可能である。本発明の一部の実施形態では、前記方法にはＣａｓ９が使用
される。その他の適用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＷＯ２０１３１７６７７
２、ＷＯ２０１４０６５５９６、ＷＯ２０１４０１８４２３、ＵＳ８，６９７，３５９に
記載されているシステムと方法を含むが、これらに限られていない。
本発明のもう一態様は、効率的な遺伝子編集を実現できる本発明の一連のｓｇＲＮＡ分
子に係る。
本発明において、「ｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ」と「ｇＲＮＡ（
ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）」、または、「シングルガイドＲＮＡ」、「合成されたガイドＲＮ
Ａ」または「ガイドＲＮＡ」は、置き換えて使用できる。本発明のｓｇＲＮＡは、目標配
列を標的とするガイド配列を含む。好ましい実施形態では、本発明のｓｇＲＮＡはさらに
ｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒシャペロン配列とを含む。
本発明の「ガイド配列」（ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、標的部位を特定する約
１７～２０ｂｐの配列であってもよく、しかも「指導配列」または「スペーサー」と置き
換えて使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する背景において、「標的配列
」は例えば、ガイド配列がそれに相補的になるように設計された配列であり、標的配列と
ガイド配列との間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。
前記ハイブリダイゼーションは、「標的配列」と「ガイド配列」または「指導配列」とが
、ハイブリダイゼーションを引き起こしてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分
な相補性を持っていればよいが、完全な相補は必要ではない。
「相補」とは、「ガイド配列」または「指導配列」と標的ヌクレオチド配列（本発明で
は、造血幹細胞におけるＢＣＬ１１Ａゲノム標的ヌクレオチド配列）とが、ワトソンアン
ドクリークにより発見されたヌクレオチドペアリング原則によってハイブリダイズするこ
とができることを指す。当業者が理解できるように、十分な相補性がある限り、「ガイド
配列」は標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができ、それらの間に１００％
の完全な相補の必要はない。一部の実施形態では、適切なアラインメントアルゴリズムを
使用して最適なアラインメントを行う場合、ガイド配列およびそれに対応する標的配列間
の相補程度は約７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％
以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９
９％以上またはそれ以上であってもよい。最適なアラインメントは、配列をアラインする
ための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定でき、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎア
ルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｉｍｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅ
ｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づいたアルゴリズムなどを含む。
通常は、内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの背景において、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成（ガ
イド配列と標的配列がハイブリダイズして１つ以上のＣａｓタンパク質と複合することを
含む）により、標的配列中または標的配列の近く（例えば、標的配列から１、２、３、４
、５、６、７、８、９、１０、２０、５０またはそれ以上の塩基対の範囲内）の１つの鎖
または２つの鎖の切断が引き起こされる。理論に拘束されるつもりはなく、ｔｒａｃｒ配
列は、野生型ｔｒａｃｒ配列の全部または一部を含むことができ、例えば、野生型ｔｒａ
ｃｒ配列の約２０以上、２３以上、２６以上、２９以上、３２以上、３５以上、３８以上
、４１以上、４４以上、４７以上、５０以上、５３以上、５６以上、５９以上、６２以上
、６５以上、７０以上、７５以上、８０以上、８５以上、またはそれ以上のヌクレオチド
または上記からなるｔｒａｃｒ配列はさらにＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成することが
でき、例えば、ｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿って、ガイド配列に操作可能に連結
されたｔｒａｃｒシャペロン配列の全部または一部とハイブリダイズする。
一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒシャペロン配列は、ハイブリダイズ
してＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に寄与するのに十分な相補性を有する。「標的配列」と「
ガイド配列」または「指導配列」とのハイブリダイゼーションと同様に、その機能を発揮
するのに十分である限り、完全な相補は必要ではない。一部の実施形態では、最適なアラ
インメントの場合、ｔｒａｃｒ配列はｔｒａｃｒシャペロン配列の長さに沿って少なくと
も５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の相補性を有する。
本願において、ＢＣＬ１１Ａゲノム領域を標的とするｓｇＲＮＡ配列は、当該ＢＣＬ１
１Ａゲノム領域に相補的な少なくとも１７、好ましくは１８、好ましくは１９、または好
ましくは２０の連続したヌクレオチドのｓｇＲＮＡを含む。一部の実施形態では、造血幹
細胞ＢＣＬ１１Ａ部位の標的配列は配列番号３１または３２に示され、配列番号３１また
は３２に示される塩基領域に対してｓｇＲＮＡを設計し、ｓｇＲＮＡ配列は、配列番号３
１または３２の配列の少なくとも１７、好ましくは１８、好ましくは１９、または好まし
くは２０の連続したヌクレオチドの配列に相補的である必要がある。
具体的には、次の表は、ＣＴＴＣＣＴ配列の上流０～１５のヌクレオチドからＣＴＴＣ
ＣＴ配列の下流０～１５のヌクレオチド配列までのＢＣＬ１１Ａゲノム領域を標的とする
ｓｇＲＮＡ配列を示している。
Figure 2022180510000003
一部の実施形態では、本発明は、造血幹細胞の２番染色体の６０４９５２３６番目から
６０４９５２５５番目まで、特に６０４９５２３８番目のＢＣＬ１１Ａゲノム領域を遺伝
子編集技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン（Ｈ
ｂＦ）の発現を増加させる方法を提供する。この遺伝子編集技術は、ジンクフィンガーヌ
クレアーゼに基づく遺伝子編集技術、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集技術またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃ
ａｓ９遺伝子編集技術であり、好ましくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術であり
、好ましくは、前記ＢＣＬ１１Ａゲノム標的ヌクレオチド配列と、配列番号４を含むｓｇ
ＲＮＡのガイド配列とが相補的である。本発明の方法は、前記ＢＣＬ１１Ａゲノム領域の
編集を実現するように、配列番号４の配列を含むｓｇＲＮＡを造血幹細胞に導入すること
に係り、好ましくは、前記ｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド（例えば、
ｍＲＮＡ）とを一緒に前記造血幹細胞に導入し、好ましくは、２００～６００Ｖ、０．５
～２ｍｓのエレクトロポレーション条件で前記ｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９をコードするヌク
レオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは
、２’－Ｏ－メチル類縁体及び／またはヌクレオチド間３’チオにより修飾されたもので
あり、例えば、化学修飾は、前記ｓｇＲＮＡの５’末端の最初の１つ、２つ、及び／また
は３つの塩基及び／または３’末端の最後の１つの塩基の２’－Ｏ－メチル類縁体による
修飾である。一部の実施形態では、本発明はさらに、造血幹細胞の２番染色体の６０４９
５２３６番目から６０４９５２５５番目まで、特に６０４９５２３８番目のＢＣＬ１１Ａ
ゲノム領域標的配列の一つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊された造血幹細胞に
係る。さらに、該造血幹細胞をインビトロで分化培養して得られた赤血球、及びこの赤血
球を含む医療製品に係る。
一部の実施形態では、本発明は、ヒト造血幹細胞の２番染色体の６０４９５２４７番目
から６０４９５２６６番目まで、特に６０４９５２６３番目のＢＣＬ１１Ａゲノム領域を
遺伝子編集技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン
（ＨｂＦ）の発現を増加させる方法を提供する。この遺伝子編集技術は、ジンクフィンガ
ーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集技術またはＣＲＩＳＰＲ
／Ｃａｓ９遺伝子編集技術であり、好ましくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術で
あり、好ましくは、前記ＢＣＬ１１Ａゲノム標的ヌクレオチド配列と、配列番号３を含む
ｓｇＲＮＡのガイド配列とが相補的である。本発明の方法は、前記ＢＣＬ１１Ａゲノム領
域の編集を実現するように、配列番号３の配列を含むｓｇＲＮＡを造血幹細胞に導入する
ことに係り、好ましくは、前記ｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド（例え
ば、ｍＲＮＡ）とを一緒に前記造血幹細胞に導入し、好ましくは、２００～６００Ｖ、０
．５～２ｍｓのエレクトロポレーション条件で前記ｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９をコードする
ヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記ｓｇＲＮ
Ａは、２’－Ｏ－メチル類縁体及び／またはヌクレオチド間３’チオにより修飾されたも
のであり、例えば、化学修飾は、前記ｓｇＲＮＡの５’末端の最初の１つ、２つ、及び／
または３つの塩基及び／または３’末端の最後の１つの塩基の２’－Ｏ－メチル類縁体に
よる修飾である。一部の実施形態では、本発明はさらに、造血幹細胞の２番染色体の６０
４９５２４７番目から６０４９５２６６番目まで、特に６０４９５２６３番目のＢＣＬ１
１Ａゲノム領域標的配列の一つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊された造血幹細
胞に係る。さらに、該造血幹細胞をインビトロで分化培養して得られた赤血球、及びこの
赤血球を含む医療製品に係る。
一部の実施形態では、本発明は、ヒト造血幹細胞の２番染色体の６０４９５２５２番目
から６０４９５２７１番目まで、特に６０４９５２６８番目のＢＣＬ１１Ａゲノム領域を
遺伝子編集技術によって破壊することを含む、ヒト造血幹細胞における胎児ヘモグロビン
（ＨｂＦ）の発現を増加させる方法を提供する。この遺伝子編集技術は、ジンクフィンガ
ーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集技術またはＣＲＩＳＰＲ
／Ｃａｓ９遺伝子編集技術であり、好ましくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術で
あり、好ましくは、前記ＢＣＬ１１Ａゲノム標的ヌクレオチド配列と、配列番号８を含む
ｓｇＲＮＡのガイド配列とが相補的である。本発明の方法は、前記ＢＣＬ１１Ａゲノム領
域の編集を実現するように、配列番号８の配列を含むｓｇＲＮＡを造血幹細胞に導入する
ことに係り、好ましくは、前記ｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド（例え
ば、ｍＲＮＡ）とを一緒に前記造血幹細胞に導入し、好ましくは、２００～６００Ｖ、０
．５～２ｍｓのエレクトロポレーション条件で前記ｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９をコードする
ヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記ｓｇＲＮ
Ａは、２’－Ｏ－メチル類縁体及び／またはヌクレオチド間３’チオにより修飾されたも
のであり、例えば、化学修飾は、前記ｓｇＲＮＡの５’末端の最初の１つ、２つ、及び／
または３つの塩基及び／または３’末端の最後の１つの塩基の２’－Ｏ－メチル類縁体に
よる修飾である。一部の実施形態では、本発明はさらに、造血幹細胞の２番染色体の６０
４９５２５２番目から６０４９５２７１番目まで、特に６０４９５２６８番目のＢＣＬ１
１Ａゲノム領域標的配列の一つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊された造血幹細
胞に係る。さらに、該造血幹細胞をインビトロで分化培養して得られた赤血球、及びこの
赤血球を含む医療製品に係る。
一部の実施形態では、発明者は、ＢＣＬ１１Ａエンハンサーを標的とする２３のｓｇＲ
ＮＡを設計した。次の表は、２３のｓｇＲＮＡに標的されるヒト２番染色体上のゲノム配
列の位置、及び各ｓｇＲＮＡによって引き起こされるＣａｓ９切断部位を示している。
Figure 2022180510000004
上記２３のｓｇＲＮＡの切断部位を分析すると、これらのｓｇＲＮＡによって引き起こ
されたＣａｓ９切断部位は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の６０４９５２１９番目から６０４９５
３３６番目のゲノム領域に集中していることが明らかになった。そして、ＣＴＴＣＣＴ配
列の上流０～１５のヌクレオチドからＣＴＴＣＣＴ配列の下流０～１５のヌクレオチドま
での領域を標的とすると、例えば、ＣＴＴＣＣＴ部位のｓｇＲＮＡによるＩｎｄｅｌｓの
生成効率が最もよく、及び／またはオフターゲット効果が小さく、すなわち、効率的に遺
伝子編集することができる。
さらに、本発明において、発明者が設計したｓｇＲＮＡは何れもＩｎｄｅｌｓを効果的
に生成することができ、本発明の好ましいｓｇＲＮＡは、配列番号３、４、８および３３
～６３から選択されるいずれかである。
本発明の一つの具体的な実施形態は、本発明に係る上記いずれかのｓｇＲＮＡまたはそ
のベクターを含むｓｇＲＮＡの組成物をさらに含む。
一般に、ｓｇＲＮＡの中のガイド配列は、標的ポリヌクレオチド配列と十分な相補性を
有し、標的配列とハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合
をガイドする任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、適切なアライン
メントアルゴリズムを使用して最適なアラインメントを行う場合、ガイド配列およびそれ
に対応する標的配列間の相補程度は約８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上
、９７．５％以上、９９％以上またはそれ以上である。最適なアラインメントは、配列を
アラインするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定でき、その非限定的な例に
は、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｉｍｓｃｈア
ルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づいたアルゴリ
ズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、Ｃｌｕｓｔａｌ
Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｉ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））、
ＳＯＡＰ（ｓоａｐ．ｇｅｎоｍｉｃｓ．оｒｇ．ｃｎで入手可能）およびＭａｑ（ｍａ
ｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が含まれる。一部の実施形態では、ガ
イド配列の長さは、約１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、
１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、
２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３５以上、
４０以上、４５以上、５０以上、５５以上、６０以上、６５以上、７０以上、７５以上、
またはそれ以上のヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態では、ガイド配列の長さ
は、約７５未満、７０未満、６５未満、６０未満、５５未満、５０未満、４５未満、４０
未満、３５未満、３０未満、２５未満、２０未満、１５未満、１２未満、またはそれより
少ないヌクレオチドであってもよい。ＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列の配列特異的結合を
ガイドするガイド配列の能力は、任意の適切な測定方法により評価することができる。例
えば、対応する標的配列を有する宿主細胞に、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するには十分な
ＣＲＩＳＰＲシステムのコンポーネント（テストされるガイド配列を含む）を提供しても
よく、例えば、ＣＲＩＳＰＲ配列コンポーネントをコードするベクターを使用してトラン
スフェクションし、そして標的配列内の優先的な切断（例えば、本明細書に記載のＳｕｒ
ｖｅｙｏｒにより測定する）を評価することで行うことができる。同様に、標的ポリヌク
レオチド配列の切断は、試験管内で、標的配列、ＣＲＩＳＰＲ複合体（テストされるガイ
ド配列と、ガイド配列と異なる対照ガイド配列とを含む）のコンポーネントを提供し、標
的配列へのテストと対照ガイド配列の結合または切断率を比較して評価することができる
。また、当業者に既知の他の測定方法を使用して上記測定と評価を行うことができる。
本発明では、遺伝子編集過程において使用されるｓｇＲＮＡは、好ましくは化学修飾さ
れたものである。「化学修飾されたｓｇＲＮＡ」とは、ｓｇＲＮＡについて行った特定の
化学修飾であり、例えば、その５’末端および３’末端の３つの塩基にある２’－Ｏ－メ
チル類縁体による修飾および／またはヌクレオチド間の３’チオによる修飾である。
本発明者らが使用した化学修飾されたｓｇＲＮＡは、以下の２つの利点を有すると考え
られる。第一に、ｓｇＲＮＡは一本鎖ＲＮＡであり、半減期が非常に短いため、細胞に入
ると急速に分解する（最長１２時間）が、Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡとが結合して
遺伝子編集の役割を発揮するには少なくとも４８時間がかかる。そのため、化学修飾され
たｓｇＲＮＡは細胞に入った後、安定して発現し、Ｃａｓ９タンパク質に結合した後、効
率的にゲノムを遺伝子編集してＩｎｄｅｌｓを生成することができる。第二に、未修飾の
ｓｇＲＮＡは細胞膜を透過する能力が低く、細胞または組織に効果的に入って対応する機
能を発揮することができない。化学修飾されたｓｇＲＮＡは細胞膜を透過する能力が一般
的に強化されている。本発明において、本分野で常用の化学修飾方法を使用することがで
き、ｓｇＲＮＡの安定性（半減期を延長する）と細胞膜への侵入能力を向上させることが
できる限り、いずれも使用できる。実施例に使用されている具体的な化学修飾の他に、例
えば、Ｄｅｌｅａｖｅｙ ＧＦ１，Ｄａｍｈａ ＭＪ． Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｃｈｅｍ
ｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔａｒ
ｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ． Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１２ Ａｕｇ
２４；１９（８）：９３７－５４、およびＨｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ ｅｎｈａｎｃｅ ＣＲＩＳＰＲ－
Ｃａｓ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ
ｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１５ Ｓｅｐ；３３（９）：９８５－９８
９の文献に報告された化学修飾方法など、その他の修飾方法を含む。
一部の実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ、及び／またはＣａｓ９をコードするヌクレオチ
ド（例えば、ｍＲＮＡ）をエレクトロポレーションによって造血幹細胞に導入する。例え
ば、２５０～３６０Ｖ、０．５～１ｍｓ；２５０～３００Ｖ、０．５～１ｍｓ；２５０Ｖ
、１ｍｓ；２５０Ｖ、２ｍｓ；３００Ｖ、０．５ｍｓ；３００Ｖ、１ｍｓ；３６０Ｖ、０
．５ｍｓ；または３６０Ｖ、１ｍｓのエレクトロポレーション条件で造血幹細胞に導入す
る。一部の実施形態では、前記ｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドとをエ
レクトロポレーションによって一緒に造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記
ｓｇＲＮＡをエレクトロポレーションによってＣａｓを発現する造血幹細胞に導入する。
一部の実施形態では、前記Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドはｍＲＮＡであり、例え
ば、ＡＲＣＡキャップを含むｍＲＮＡである。一部の実施形態では、前記Ｃａｓ９をコー
ドするヌクレオチドはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターにある。一部の実
施形態では、前記Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドは、例えば、配列番号２６の配列を
含む。一部の実施形態では、前記ｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドとは
同一のベクターにある。
本発明は、本発明に係る遺伝子改変方法によって得られた造血幹細胞、前記遺伝子改変
された造血幹細胞を分化培養することにより得られた、成熟赤血球の前の分化の異なる段
階にある前駆細胞、及び前記遺伝子改変された造血幹細胞を分化培養することにより得ら
れた成熟赤血球に係る。
本発明は、本発明に係る遺伝子改変方法によって得られた造血幹細胞、または前記遺伝
子改変された造血幹細胞を分化培養することにより得られた、成熟赤血球の前の分化の異
なる段階にある前駆細胞、または前記遺伝子改変された造血幹細胞を分化培養することに
より得られた成熟赤血球を含む、本発明の方法により得られた医薬組成物に係る。
本発明に係る医薬組成物は、静脈内注入経路など、細胞成分を含む医薬品の投与に通常
用いられる経路を介して、それを必要とする被験者に投与することができる。投与量は、
被験者の病状および一般的な健康状況に基づいて具体的に決めることができる。
一部の態様では、本発明は、本発明に記載のｓｇＲＮＡおよび／またはＣａｓ９をコー
ドするヌクレオチドを造血幹細胞に送達する方法を提供する。一部の実施形態では、前記
送達として、通常のウイルスおよびウイルスに基づかない遺伝子移転方法によって前記構
築体を造血幹細胞またはその他の宿主細胞に導入することができる。非ウイルス送達系は
、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載されているベクター転写物）、裸
の核酸、及びリポソームを含む。ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡとＲＮＡウイルスを
含み、細胞への送達のための遊離または組み込まれたゲノムを有する。一部の実施形態で
は、発明者は、エレクトロポレーションを利用してＣａｓ９とｓｇＲＮＡのコード遺伝子
を造血幹細胞に導入して造血幹細胞ＢＣＬ１１Ａゲノム領域の具体的な配列を遺伝子編集
する。実験を繰り返した後、発明者は、２００～６００ｖ、０．５ｍｓ～２ｍｓのエレク
トロポレーション条件下でＣａｓ９をコードするヌクレオチドおよびｓｇＲＮＡを一緒に
造血幹細胞に導入する場合の遺伝子編集効率は、他のエレクトロポレーション条件下での
遺伝子編集効率より有意に高いことを発見した。
一部の実施形態では、化学修飾されたｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９をコードする遺伝子を
共にエレクトロポレーションによってＣＤ３４＋造血幹細胞に導入し、効率的な遺伝子編
集効率（Ｉｎｄｅｌｓ％で表される）を生成する。実施例のデータによって、Ｃａｓ９
ｍＲＮＡと一緒にエレクトロポレーションを行ったのは化学修飾されていないｓｇＲＮＡ
である場合、そのＩｎｄｅｌｓ効率は２．７％しかなく、化学修飾されたｓｇＲＮＡを、
エレクトロポレーションを行った時に得られたＩｎｄｅｌｓ効率（効率は少なくとも１０
％以上）よりはるかに低いことは示されている。
本出願で使用されるように、「Ｉｎｄｅｌ」は、挿入／欠失、すなわち、挿入と欠失変
異と呼ばれる。
本明細書で使用されるように、「造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ
ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ，ＨＳＰＣｓ）」は、さまざまな血球を発
生させる最も原始的な造血細胞であり、その主な特徴は、強力な増殖能、多方向分化能、
及び自己再生能を有することである。そのため、さまざまな血球を分化・補充するだけで
はなく、幹細胞の特性と数量を自己再生により維持することもできる。造血幹細胞は分化
および増殖能力が異なり、不均一性がある。多能性造血幹細胞は最も原始的であり、最初
に定方向多能性造血幹細胞、例えば、顆粒球系、赤血球系、単核系、及び巨核球‐血小板
系を生成できる骨髄系造血幹細胞、及びＢリンパ球とＴリンパ球を生成できるリンパ幹細
胞など、に分化する。この二種の幹細胞は、造血幹細胞の基本的な特徴を持っていながら
わずかに分化し、それぞれ「骨髄成分」とリンパ球の発生に関与するので、定方向多能性
造血幹細胞と呼ばれる。これらはさらに造血前駆細胞に分化する。この細胞は原始的な血
球でもあるが、造血幹細胞の多くの基本的な特徴を失っている。例えば、多方向分化能力
を失って、１系統または密接に関連する２系統の細胞にしか分化できなくなったり、繰り
返し再生する能力を失い、数量を補うために造血幹細胞の増殖分化に依存するしかなくな
ったり、増殖の可能性が限られており、数回しか分裂することができなくなったりする。
造血前駆細胞が分化して生成できる血液細胞株の数に応じて、また単能性造血前駆細胞（
１つの血液細胞株のみに分化する）とオリゴ能性造血前駆細胞（２～３つの血液細胞株に
分化できる）に分けられる。本発明の「造血幹細胞」という用語は、多能性造血幹細胞、
定方向多能性造血幹細胞、及び造血前駆細胞を含み、不均一性の異なる造血幹細胞の総称
である。
本発明の具体的な実施形態では、本発明で使用される遺伝子編集される造血幹細胞（Ｈ
ＳＰＣｓ）は、骨髄、臍帯血、または末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏ
ｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ，ＰＢＭＣ）に由来し得る。
本願で使用されるように、「ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮ」は、韓国の科学者Ｊｉｎ－Ｓｏ
ｏ Ｋｉｍの研究チームによって開発されたｓｇＲＮＡの設計のための専用のウェブサイ
ト名であり、そのウェブサイトアドレスはｗｗｗ.ｒｇｅｎｏｍｅ.ｎｅｔ/ａｂｏｕｔ/で
ある。
本明細書で使用されるように、「ＴＩＤＥ」とは、Ｉｎｄｅｌｓの効率を分析するため
の専用のツールウェブサイト名であり、そのウェブサイトアドレスはｔｉｄｅ－ｃａｌｃ
ｕｌａｔｏｒ．ｎｋｉ．ｎｌである。
本明細書で使用されるように、「ＣＤ３４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、
ＣＤ３３、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ７１、ＣＤ２３５ａ」は血液系細胞の膜タンパク質
マーカーである。
本明細書で使用されるように、「ＢＣＬ１１Ａ」は転写因子であり、レトロウイルスの
結合部位としてマウスで最初に発見され、Ｅｖｉ９と名付けられた。その後、この遺伝子
はヒトゲノムでも発見され、２番染色体の短腕２ｐ１３部位に位置付けられ、主にＢリン
パ球の胚中心に発現する。
本明細書で使用されるように、「ＨＢＢ／ＨＢＧ」はヘモグロビンの異なるサブタイプ
である。ヘモグロビンは、高等生物の体内で酸素運搬に関与するタンパク質である。ヘモ
グロビンは４つの鎖、すなわち、２つのα鎖と２つのβ鎖とからなり、各鎖には１つの鉄
原子を含む環状ヘムがある。酸素は鉄原子に結合し、生体での使用のために赤血球によっ
て輸送される。
さらに、本発明は、上記の本発明の方法を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集技術
によって造血幹細胞ＢＣＬ１１Ａの具体的な配列を遺伝子編集した後に得られる造血幹細
胞に係る。また、この造血幹細胞を含む製品も本発明の範囲内である。
本発明に係る造血幹細胞または製品は、貧血疾患、出血性疾患、腫瘍、または治療のた
めに大量の輸血を必要とする他の疾患から選択される疾患の治療に使用できる。特に、β
－サラセミアまたは鎌状赤血球貧血の治療に使用できる。
また、本発明は、本発明により得られた遺伝子編集された造血幹細胞を下記のようにイ
ンビトロで分化培養することによって得られた赤血球に係る。
また、本発明は、本発明により得られた遺伝子編集された造血幹細胞を下記の造血幹細
胞の赤血球系の増殖および分化工程により処理することによって得られた、造血幹細胞か
ら成熟赤血球への各分化段階の前駆細胞に係る。
上記のインビトロで分化培養することは、造血幹細胞の赤血球系の増殖および分化の工
程、及び造血幹細胞の赤血球系の分化脱核の工程を含む。
前記赤血球系の増殖および分化の工程では、造血幹細胞の赤血球系増殖および分化培地
を使用して造血幹細胞を培養する。
前記赤血球系の分化脱核工程では、赤血球系分化脱核培地を使用する。
一部の実施形態では、前記造血幹細胞の赤血球系増殖および分化培地は、基礎培地と、
成長因子組成物とを含み、前記成長因子組成物は、幹細胞成長因子、すなわちＳＣＦ、イ
ンターロイキン３、すなわち、ＩＬ－３、およびエリスロポエチン、すなわちＥＰＯを含
む。
一部の実施形態では、前記赤血球系分化脱核培地は、基礎培地、成長因子、およびプロ
ゲステロン受容体とグルココルチコイド受容体の拮抗薬および／または阻害剤を含む。
上記の方法を使用して、遺伝子編集された造血幹細胞を培養すると、当該造血幹細胞を
２つのステップで成熟赤血球に分化させることができる。既存技術と比較して、本発明の
インビトロでの分化培養を使用する場合、所要時間がわずか１４日であり、時間的に短く
なり、２１日以上が必要である既存技術と比べて、サイクルは大幅に短縮されている。
一部の実施形態では、前記成長因子はエリスロポエチン、すなわちＥＰＯを含み、前記
プロゲステロン受容体とグルココルチコイド受容体の拮抗薬および／または阻害剤は、下
記化合物（Ｉ）～（ＩＶ）から選択されるいずれか１つまたは２つ以上である。
Figure 2022180510000005
一部の実施形態では、前記造血幹細胞赤血球系増殖および分化培地は、ＳＴＥＭＳＰＡ
ＮＴＭ ＳＦＥＭ ＩＩ（ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ Ｉｎｃ．）、
ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ
）、Ｘ－ＶＩＶＯ １５、ａｌｐｈａ－ＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０、ＤＦ１２などの基
礎培地を含む。前記成長因子について、例えば、基礎培地としてＳＴＥＭＳＰＡＮＴＭ
ＳＦＥＭ ＩＩが選択された場合、追加する必要がある成長因子は、５０～２００ｎｇ／
ｍｌ ＳＣＦ、１０～１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３、１～１０Ｕ／ｍｌ ＥＰＯを含み、
なお、Ｕの単位の定義として、特定の条件下で、１分で１μｍоｌの基質を変換できるタ
ンパク質の量、すなわち、１ ＩＵ＝１μｍоｌ／分である。現在、国内外のほとんどの
臨床実験室は、「Ｉ」（国際）という文字を省略し、すなわち、ＩＵをＵに省略している
。ＥＰＯ、すなわちエリスロポエチンは、主に低酸素症または貧血に対応して腎臓から分
泌される糖タンパク質であり、本実施形態では、造血幹細胞の分化を促進することができ
る。通常は作用を発揮する時間は７日くらいである。
基礎培地としてＳＴＥＭＳＰＡＮＴＭ ＳＦＥＭ ＩＩ以外の基礎培地が選択された場
合、１００Ｘ ＩＴＳ（ｉｎｓｕｉｎ－ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ－ｓｅｌｅｎｉｕｍ）（
培地中のＩＴＳの各物質の最終濃度として、インスリンの濃度は０．１ｍｇ／ｍｌ、ヒト
トランスフェリンは０．００５５ｍｇ／ｍｌ、セレン元素は６．７＊１０－６ｍｇ／ｍｌ
である）（すなわち、主にインスリン、ヒトトランスフェリンおよびセレン元素を含む）
、１０～５０μｇ／ｍｌビタミンＣ、０．５～５％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ
ａｌｂｕｉｎ、ウシ血清アルブイン）、成長因子、例えば、５０～２００ｎｇ／ｍｌ Ｓ
ＣＦ、１０～１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３、１～１０Ｕ／ｍｌ ＥＰＯを添加する必要が
ある。
また、当業者が理解できるように、一般的に使用される任意の基礎培地はいずれも使用
できる。例えば、ＳＴＥＭＳＰＡＮＴＭ ＳＦＥＭ ＩＩ（（ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ Ｔ
ＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳから購入）や、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入したＩＭＤ
Ｍ、ＤＦ１２、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０、Ａｌｐｈａ ＭＥＭ
、ＤＭＥＭなど、本分野で一般的に使用される基礎培地が挙げられる。
また、上記の培地には、必要に応じて、ＩＴＳ（主にインスリン、ヒトトランスフェリ
ン、及びセレン元素を含む）、Ｌ－グルタミン、ビタミンＣ、及びウシ血清アルブミンな
ど他の成分をさらに添加することができる。例えば、ＩＭＤＭ培地に、ＩＴＳ、２ｍＭ
Ｌ－グルタミン、１０～５０μｇ／ｍｌのビタミンＣ、及び０．５～５質量％のＢＳＡ（
ウシ血清アルブミン）を添加することができる。また、上記ＤＦ１２には、同じ濃度のＩ
ＴＳ、Ｌ－グルタミン、ビタミンＣ、及びウシ血清アルブミンを添加することができる。
Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭには、同じ濃度のＩＴＳ、Ｌ－グルタミン、ビタミンＣ、及
びウシ血清アルブミンを添加することができ、ＲＰＭＩ １６４０には、同じ濃度のＩＴ
Ｓ、Ｌ－グルタミン、ビタミンＣ、及びウシ血清アルブミンを添加することができ、Ａｌ
ｐｈａ ＭＥＭには、同じ濃度のＩＴＳ、Ｌ－グルタミン、ビタミンＣ、及びウシ血清ア
ルブミンを添加することができ、ＤＭＥＭにも同じ濃度のＩＴＳ、Ｌ－グルタミン、ビタ
ミンＣ、及びウシ血清アルブミンを添加することができる。ここで、各基礎培地に添加さ
れるＩＴＳの濃度として、インスリン濃度が０．１ｍｇ／ｍｌ、ヒトトランスフェリンが
０．００５５ｍｇ／ｍｌ、セレン元素が６．７×１０－６ｍｇ／ｍｌであってもよい。ま
た、添加されるＩＴＳの各成分の濃度も、実際のニーズに合わせて調整できる。ＩＴＳは
Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒから購入でき、必要に応じて適切な最終使用濃度に調整できる
。
一つの実施形態では、前記赤血球系分化脱核培地は、基礎培地、成長因子、およびプロ
ゲステロン受容体とグルココルチコイド受容体の拮抗薬を含む。
一つの実施形態では、前記造血幹細胞赤血球系分化脱核培地は、ＳＴＥＭＳＰＡＮＴＭ
ＳＦＥＭ ＩＩ（ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ Ｉｎｃ．）、ＩＭＤ
Ｍ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｘ
－ＶＩＶＯ １５、ａｌｐｈａ－ＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０、ＤＦ１２などの基礎培地
を含む。さらに成長因子を含み、例えば、基礎培地としてＳＴＥＭＳＰＡＮＴＭ ＳＦＥ
Ｍ ＩＩが選択された場合、追加する必要がある成長因子は、１～１０Ｕ／ｍｌ ＥＰＯ
、１００～１０００μｇ／ｍｌ ｈｕｍａｎ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（ヒトトランスフ
ェリン）、０．５～１０μｍоｌ／．ｍｌのミフェプリストン（Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎ
ｅ）などの化学的小分子を含む。
基礎培地としてＳＴＥＭＳＰＡＮＴＭ ＳＦＥＭ ＩＩ以外の基礎培地が選択された場
合、例えばＩＴＳ（ｉｎｓｕｉｎ－ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ－ｓｅｌｅｎｉｕｍ）（培地
中のＩＴＳの各物質の最終濃度として、インスリンの濃度は０．１ｍｇ／ｍｌ、ヒトトラ
ンスフェリンは０．００５５ｍｇ／ｍｌ、セレン元素は６．７×１０－６ｍｇ／ｍｌであ
る）（すなわち、主にインスリン、ヒトトランスフェリンおよびセレン元素を含む）、１
０～５０μｇ／ｍｌビタミンＣ、０．５～５％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌ
ｂｕｉｎ、ウシ血清アルブイン）、成長因子、例えば、１～１０Ｕ／ｍｌ ＥＰＯ、１０
０～１０００μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン、０．５～１０μｍоｌ／．ｍｌのミフェ
プリストン（Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ）などの化学的小分子を添加する必要がある。
また、当業者が理解できるように、一般的に使用される任意の基礎培地はいずれも使用
できる。例えば、ＳＴＥＭＳＰＡＮＴＭ ＳＦＥＭ ＩＩ（（ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ Ｔ
ＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳから購入）や、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入したＩＭＤ
Ｍ、ＤＦ１２、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０、Ａｌｐｈａ ＭＥＭ
、ＤＭＥＭなど、本分野で一般的に使用される基礎培地が挙げられる。
また、上記の培地には、必要に応じて、例えばＩＴＳ（主にインスリン、ヒトトランス
フェリン、及びセレン元素を含む）、Ｌ－グルタミン、ビタミンＣ、及びウシ血清アルブ
ミンなど他の成分をさらに添加することができる。例えば、ＩＭＤＭ培地に、ＩＴＳ、２
ｍＭ Ｌ－グルタミン、１０～５０μｇ／ｍｌのビタミンＣ、及び０．５～５質量％のＢ
ＳＡ（ウシ血清アルブミン）を添加することができる。また、上記ＤＦ１２には、同じ濃
度のＩＴＳ、Ｌ－グルタミン、ビタミンＣ、及びウシ血清アルブミンを添加することがで
きる。Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭには、同じ濃度のＩＴＳ、Ｌ－グルタミン、ビタミン
Ｃ、及びウシ血清アルブミンを添加することができ、ＲＰＭＩ １６４０には、同じ濃度
のＩＴＳ、Ｌ－グルタミン、ビタミンＣ、及びウシ血清アルブミンを添加することができ
、Ａｌｐｈａ ＭＥＭには、同じ濃度のＩＴＳ、Ｌ－グルタミン、ビタミンＣ、及びウシ
血清アルブミンを添加することができ、ＤＭＥＭにも同じ濃度のＩＴＳ、Ｌ－グルタミン
、ビタミンＣ、及びウシ血清アルブミンを添加することができる。ここで、各基礎培地に
添加されるＩＴＳの濃度として、インスリン濃度が０．１ｍｇ／ｍｌ、ヒトトランスフェ
リンが０．００５５ｍｇ／ｍｌ、セレン元素が６．７×１０－６ｍｇ／ｍｌであってもよ
い。また、添加されるＩＴＳの各成分の濃度も、実際のニーズに合わせて調整できる。Ｉ
ＴＳはＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒから購入でき、必要に応じて適切な最終使用濃度に調整
できる。
本明細書で使用されているミフェプリストン（Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ）は、化学的
に合成された小分子であり、この小分子は、プロゲステロン受容体とグルココルチコイド
受容体の拮抗薬であり、構造式は次の通りである。
Figure 2022180510000006
Ｃｙｐｒｏｔｅｒｏｎｅ Ａｃｅｔａｔｅ、Ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ、ＣＯＲＴ１０
８２９７などを含む、その他のプロゲステロン受容体とグルココルチコイド受容体の拮抗
薬および阻害剤も本発明で使用することができる。化学構造式は次の通りである。
Figure 2022180510000007
一部の実施形態では、本発明の成熟赤血球は、以下のステップａ）～ｃ）を含む方法に
よって生成することができる：ａ）本発明に記載のいずれかの方法を使用して、ヒト臍帯
血からＣＤ３４陽性ＨＳＰＣｓを分離して遺伝子改変すること；ｂ）遺伝子改変されたＨ
ＳＰＣｓを、５～１０日、例えば、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、増殖および
分化させて、例えば、赤芽球（ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔ）、有核赤血球、未成熟赤血球
および網赤血球などのような赤血球前駆細胞を得ること、ｃ）赤血球前駆細胞をさらに７
日間分化処理して成熟赤血球を得ること。
一部の実施形態では、本発明の成熟赤血球は、以下のステップａ）～ｄ）を含む方法に
よって生成することができる：
ａ）磁気ビーズ選別により、ヒト臍帯血からＣＤ３４陽性ＨＳＰＣｓを分離すること；
ｂ）本発明に記載のいずれかの方法を使用して前記ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣｓを遺伝子改
変すること；
ｃ）追加の成長因子を無血清培地（Ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＭＥ）
）に添加し、５～１０日、例えば、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、増殖および
分化した後、ＨＳＰＣｓを赤血球前駆細胞に分化させること（この段階の培地を、造血幹
細胞赤血球系増殖および分化培地（ＨＳＰＣｓ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｅｘｐａｎｓｉｏ
ｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉоｎ ｍｅｄｉｕｍ；ＨＥＥＤＭと略記する）
となづける）；
ｄ）追加の成長因子を無血清培地（Ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＭＥ）
）に添加し、７日間分化した後、成熟した赤血球を得ること（この段階の培地を、造血幹
細胞赤血球系分化脱核培地（ＨＳＰＣｓ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ
ｔｉоｎ ｅｎｕｃｌｅａｔｉоｎ ｍｅｄｉｕｍ；ＨＥＤＥＭと略記する）となづける
）。
すなわち、編集されたＣＤ３４陽性造血幹細胞について、本発明の上記方法を用いて２
つのステップで成熟赤血球を得ることができ、全工程時間は１０～１８日、１１～１７日
、１２～１６日、１３～１５日、１０～１７日、１０～１６日、１０～１５日、または１
０～１４日であってもよく、この時間は、３つのステップまたは４つのステップの方法を
使用する既存技術の少なくとも２１日のサイクルを大幅に短縮した。
上述のように、本発明は、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）の発現が遺伝子改変によって増
加した成熟赤血球またはその前駆細胞を製造する方法に係り、この方法は、（ａ）本発明
に係る遺伝子改変方法を使用して造血幹細胞を得ることと、（ｂ）上記造血幹細胞赤血球
系増殖および分化培地を使用して、遺伝子改変された造血幹細胞に対して造血幹細胞赤血
球系増殖および分化を行うこととを含む。
さらに、本発明は、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）の発現が遺伝子改変によって増加した
成熟赤血球またはその前駆細胞を製造する方法に係り、この方法は、（ａ）本発明に係る
遺伝子改変方法を使用して造血幹細胞を得ることと、（ｂ）上記造血幹細胞赤血球系増殖
および分化培地を使用して、遺伝子改変された造血幹細胞に対して造血幹細胞赤血球系増
殖および分化を行うことと、（ｃ）赤血球系分化脱核培地を使用して造血幹細胞赤血球系
の分化および脱核を行うこととを含む。本発明はまた、造血幹細胞または成熟赤血球の前
駆細胞の増殖および／分化における、上記方法で使用される造血幹細胞赤血球系増殖およ
び分化培地および／または赤血球系分化脱核培地の使用に係る。
本願で使用されているように、「分化」とは、細胞の構造または機能がその分裂、増殖
および成長の過程で特殊化される現象を指し、すなわち、生体の細胞または組織の特徴及
び機能が変化して細胞または組織に与えられた機能を実行する現象を指す。一般に、その
中の比較的に単純な系が性質の異なる２つ以上の部分系に分かれる現象を指す。
本願で使用されているように、「Ｆｉｃｏｌｌ液体密度勾配遠心分離法」の基本的な原
理として、血液中の異なる成分の比重に差があり、低速密度勾配遠心分離の場合、異なる
細胞成分を分離することができる。赤血球と顆粒球の密度は成層液体の密度より高く、ｆ
ｉｃоｌｌ液体に会ったら、赤血球はすぐにひも状に凝縮してチューブの底に蓄積する。
成層液体の密度に相当する単核細胞のみが血漿層と成層液体、すなわち、造血幹細胞が存
在する白い膜層との間に濃縮され、後続の磁気ビーズ選別によって取得することができる
。本発明において、単核細胞は、市販のリンパ球分離チューブを用いて得られる。
本願で使用されているように、「成熟赤血球」とは、血液中の含有量が最も多い一種の
細胞を指し、酸素、アミノ酸、二酸化炭素などの栄養素を運ぶ機能を持っている。成熟し
た赤血球にはミトコンドリアと細胞核はない。
本願で使用されているように、「インターロイキン３、ＩＬ－３」とは、活性化された
ＣＤ４とＣＤ８陽性Ｔリンパ球によって生成するサイトカインを指し、その主な生物学的
機能は、骨髄における造血幹細胞の増殖と分化の調節に寄与することである。
本願で使用されているように、「エリスロポエチン、Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ、ＥＰＯ）」
とは、ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｓ、すなわち、赤血球前駆細胞によって分泌される成長
因子を指す。成体では、腎皮質と腎尿細管の周りの間質細胞及び肝臓によって分泌される
糖タンパク質がある。ＥＰＯは、造血幹細胞を刺激して赤血球に分化させることができる
。
一部の実施形態では、幹細胞因子、ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔоｒ（ＳＣＦ）は、
マスト細胞成長因子（ＭＧＦ）、キットリガンド（ＫＬ）、及びスチール因子（ＳＬＦ）
を含む。
本願で使用されているように、「造血幹細胞赤血球系増殖および分化培地」とは、ＨＳ
ＰＣｓ細胞が大量に増殖し、赤血球系前駆細胞に分化するのを助ける培養システムを指す
。本発明において、この培地は、基礎培地と成長因子添加剤との２つの主要成分を含む。
基礎培地は無血清システムであり、ＳＴＥＭＳＰＡＮＴＭ ＳＦＥＭ ＩＩ（ＳＴＥＭ
ＣＥＬＬＳ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ Ｉｎｃ．）であってもよく、または、ＩＭＤＭ（Ｉ
ｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）に、さらに
ＩＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）と、Ｌ－ｇｕｌｕｔａｍｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓ
ｈｅｒ）と、ビタミンＣと、ウシ血清アルブミンとを追加してもよい。成長因子添加剤は
、ＩＬ－３、ＳＣＦ、ＥＰＯの異なる濃度の組み合わせである。
本願で使用されているように、「造血幹細胞赤血球系分化脱核培地」とは、赤血球系前
駆細胞がさらに脱核した赤血球に増殖分化することを助ける培地を指す。本発明において
、この培地は、基礎培地と、成長因子および化学的小分子添加剤との２つの主要成分を含
む。基礎培地は無血清システムであり、ＳＴＥＭＳＰＡＮＴＭ ＳＦＥＭ ＩＩ（ＳＴＥ
Ｍ ＣＥＬＬＳ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ Ｉｎｃ．）であってもよく、または、ＩＭＤＭ
（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）に、さ
らにＩＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）と、Ｌ－ｇｕｌｕｔａｍｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏｆ
ｉｓｈｅｒ）と、ビタミンＣと、ウシ血清アルブミンとを追加してもよい。成長因子およ
び化学的小分子添加剤は、ＥＰＯとヒトトランスフェリン、及び化学的小分子ミフェプリ
ストンを含む。
一部の実施形態では、造血幹細胞は磁気ビーズによって選別され、例えば、超常磁性Ｍ
ＡＣＳ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（ＭＡＣＳマイクロ磁気ビーズ）を用いて細胞を特異的に
標識し、磁気標識後、これらの細胞を強力で安定した磁場に配置された選別カラムに通す
。選別カラムのマトリックスは、高勾配磁場を築く。
磁気標識された細胞はカラムに残り、標識されていない細胞は流出する。選別カラムを
磁場から外すと、カラム内に残った磁気標識された細胞は溶出でき、これによって、標識
された細胞画分と標識されていない細胞画分の両方を取得することができる。
本発明の一部の具体的な実施形態では、本発明に記載のｓｇＲＮＡを使用し、本発明に
記載の遺伝子改変方法により、３つの異なる臍帯血に由来する造血幹細胞を改変し、効率
的な遺伝子編集を実現することができ、効率は少なくとも４０％以上、例えば、５０％以
上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上に達する。例えば、好まし
いｓｇＲＮＡに対しても、平均的な遺伝子編集効率は８０％に達する。
本発明の一部の具体的な実施形態では、本発明の遺伝子編集方法によって得られた造血
幹細胞をマウスに移植し、遺伝子編集されていない造血幹細胞を移植したマウスと比べて
、遺伝子編集された造血幹細胞を移植した後、マウスのヒトｈＣＤ４５発現率は増加し続
け、末梢血サンプルでは、６週目の２０％から１６週目の６０％に増加し、１６週目の骨
髄での割合は９０％にも達しており、脾臓では７０％に達している。これは、遺伝子編集
された造血幹細胞は、マウスモデルの造血系に迅速かつ効率的に移植でき、細胞の体内分
化機能は正常であることを示している。
本発明の一部の具体的な実施形態では、本発明の遺伝子編集方法を使用して臍帯血由来
の造血幹細胞を改変してから、本発明の「二段階方法」という分化方法を用いて分化し、
すなわち、造血幹細胞赤血球系増殖および分化培地を用いて増殖および分化をし、そして
造血幹細胞赤血球系分化脱核培地を用いてさらに分化する。テストした結果、分化した赤
血球のヘモグロビン（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ、ＨＢＧ）の発現が、元の赤血球のＨＢＧ発
現と比べて２０％～９０％増加し、さらに１００％増加し、すなわち、約１倍（元の２倍
）と増加し、胎児のヘモグロビンの発現も、元の赤血球の胎児ヘモグロビンの発現と比べ
て２０％～９０％、さらに１００％も増加し、すなわち、約１倍（元の２倍）と増加し、
さらに２００％、すなわち、約２倍（元の３倍）と増加し、さらに３００％、すなわち、
約３倍（元の４倍）と増加し、さらに４００％、すなわち、約４倍（元の５倍）と増加し
、さらに５００％、すなわち、約５倍以上（元の６倍以上）と増加したことは示された。
次は実施例により本発明をさらに説明する。これらの実施例は、説明するための例示の
みを目的としており、本発明の保護範囲を限定するものとして解釈されるべきではないこ
とは、当業者にとって自明である。したがって、本発明の実質的な保護範囲は、添付の請
求の範囲およびその均等物によって限定される。
実施例１：臍帯血由来のＣＤ３４陽性造血幹細胞の効率的な遺伝子編集
１－１：Ｋ５６２細胞を使用してエレクトロポレーション条件を調べる
造血幹細胞の供給源が少なく、一回単離するコストが高いため、本実施例では、エレク
トロポレーション条件を調べるためのモデル細胞株として、癌細胞株Ｋ５６２（ＡＴＣＣ
社から購入、ウェブサイト：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．оｒｇ）を選択した。
具体的には、実施手順は下記通りである。
実験ロット一：５×１０５のＫ５６２細胞をエレクトロポレーションにより形質転換し
、ＧＦＰｍＲＮＡ（配列番号１に示す配列）の量は５μｇであり、ＢＴＸ８３０エレクト
ロポレーターを使用し、それぞれ２５０Ｖ １ｍｓ、３６０Ｖ １ｍｓ、４００Ｖ １ｍ
ｓ、５００Ｖ １ｍｓの条件下で、４日後にＧＦＰ発現及び７－ＡＡＤ発現をフローサイ
トメトリー解析実験により検出した。ＧＦＰはエレクトロポレーションの効率を表し、７
－ＡＡＤはエレクトロポレーション後の細胞の成長状態、すなわち生存能力（ｖｉａｂｉ
ｌｉｔｙ）を表す。
配列番号１：ＧＦＰｍＲＮＡの配列情報：
atgagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatgggcacaaatt
ttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacggaaaacttacccttaaatttatttgcactactggaaaactac
ctgttccatggccaacacttgtcactactttctcttatggtgttcaatgcttttcaagatacccagatcatatgaaacgg
catgactttttcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaaagaactatatttttcaaagatgacgggaactacaa
gacacgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatagaatcgagttaaaaggtattgattttaaagaagatg
gaaacattcttggacacaaattggaatacaactataactcacacaatgtatacatcatggcagacaaacaaaagaatgga
atcaaagttaacttcaaaattagacacaacattgaagatggaagcgttcaactagcagaccattatcaacaaaatactcc
aattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtccacacaatctgccctttcgaaagatcccaacgaaa
agagagaccacatggtccttcttgagtttgtaacagctgctgggattacacatggcatggatgaactatacaaatag
実験ロット二：５×１０５のＫ５６２細胞をエレクトロポレーションにより形質転換し
、上記ＧＦＰｍＲＮＡの量は５μｇであり、ＢＴＸ８３０エレクトロポレーターを使用し
、それぞれ２５０Ｖ １ｍｓ、２５０Ｖ ２ｍｓ、３００Ｖ ０．５ｍｓ、３００Ｖ １
ｍｓ、３６０Ｖ ０．５ｍｓ、３６０Ｖ １ｍｓの条件下で、４日後にＧＦＰ発現及び７
－ＡＡＤ発現をフローサイトメトリー解析実験により検出した。ＧＦＰはエレクトロポレ
ーションの効率を表し、７－ＡＡＤはエレクトロポレーション後の細胞の成長状態、すな
わち生存能力（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を表す。
実験ロット三：５×１０５のＫ５６２細胞をエレクトロポレーションにより形質転換し
、上記ＧＦＰｍＲＮＡの量は５μｇであり、ＢＴＸ８３０エレクトロポレーターを使用し
、それぞれ２５０Ｖ １ｍｓ、２５０Ｖ １ｍｓ、３００Ｖ １ｍｓ、３００Ｖ １ｍｓ
の条件下で、４日後にＧＦＰ発現及び７－ＡＡＤ発現をフローサイトメトリー解析実験に
より検出した。ＧＦＰはエレクトロポレーションの効率を表し、７－ＡＡＤはエレクトロ
ポレーション後の細胞の成長状態、すなわち生存能力（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を表す。そ
の結果は図２と図３に示す。
その中で、図２は、癌細胞株Ｋ５６２で複数ロットの実験により検出した最適なエレク
トロポレーション条件下で、ＧＦＰのエレクトロポレーションの４日後の蛍光顕微鏡の写
真を示す図である。「Ｖ」はパルス電圧を表し、「ｍｓ」はパルス時間を表す。
図３は、癌細胞株Ｋ５６２で複数ロットの実験により検出した最適なエレクトロポレー
ション条件下で、ＧＦＰのエレクトロポレーションの４日後の、フローサイトメトリー解
析による７－ＡＡＤとＧＦＰ発現の統計分析を示す図である。フローサイトメトリー解析
での７－ＡＡＤ陰性は細胞生存率を表し、７－ＡＡＤ（７－アミノ－アクチノマイシンＤ
）は、正常な原形質膜を通過できない核酸色素である。アポトーシスと細胞死のプロセス
において、原形質膜への７－ＡＡＤの通過性は徐々に増加し、適切な波長の励起光の励起
下で明るい赤色の蛍光を発することができる。７－ＡＡＤ陰性は正常な生細胞であり、Ｇ
ＦＰ効率はエレクトロポレーション効率を表す。「２５０－１」を例にして、２５０Ｖ電
圧、１ｍｓのパルス時間を表す。
本実験のデータは、癌細胞株Ｋ５６２に関して、「３００Ｖ １ｍｓ」のエレクトロポ
レーション条件下で、エレクトロポレーション効率と細胞生存率の総合的指標が最も高い
ことを示し、それからの実験で後続実験のエレクトロポレーション条件として使用される
。
１－２．３００ｖ １ｍｓでＧＦＰｍＲＮＡをエレクトロポレーションにより造血幹細
胞に導入する
前のステップで効率および生存率が最も高い条件、すなわち、３００Ｖ １ｍｓを選択
し、５×１０５の造血幹細胞（ＡＬＬＣＥＬＬＳ（上海）社から購入、ｗｗｗ．ａｌｌｃ
ｅｌｌｓ．ｃ）に上記ＧＦＰｍＲＮＡをエレクトロポレーションにより形質転換し、４日
後にＧＦＰとＣＤ３４の発現状況を検出した。結果を図４と図５に示す。
その中で、図４は、３００Ｖ、１ｍｓのエレクトロポレーション条件下で、上記ＧＦＰ
ｍＲＮＡをエレクトロポレーションにより造血幹細胞に導入して４日後の蛍光顕微鏡の写
真を示す図である。それぞれ、明視野、緑のチャネル、赤のチャネル、明視野と緑のチャ
ネルのオーバーレイの四つの視野を含む。
図５は、３００Ｖ、１ｍｓのエレクトロポレーション条件下で、ＧＦＰｍＲＮＡをエレ
クトロポレーションにより造血幹細胞に導入して４日後の、ＧＰＦとＣＤ３４タンパク質
の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である。図５の中の対照群は
造血幹細胞であるが、ＧＦＰｍＲＮＡが導入されておらず、ＣＤ３４抗体が染色されない
状況をフローサイトメトリーで解析したものである。
図４と図５の結果から分かるように、本実験のデータは、「３００Ｖ １ｍｓ」のエレ
クトロポレーション条件下で、臍帯血由来の造血幹細胞におけるＧＦＰの発現の比率が高
いことを示している。
１－３：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して臍帯血由来の造血幹細胞へのエレクトロポ
レーションによりＢＣＬ１１Ａ部位を編集する
Ａ、ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー５８Ｋ部位（この標的５８Ｋ部位の配列は配列番号２
に示される）について、「ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮ ＴＯＯＬＳ」ソフトウェアを使用し
てＢＣＬ１１Ａ（＋５８）部位に対して複数のｓｇＲＮＡを設計し、化学修飾されたｓｇ
ＲＮＡを合成した。情報は図６、７、８に示す。
配列番号２：ＣＬ１１Ａエンハンサー５８Ｋ部位１５０ｂｐ配列：
ctgccagtcctcttctaccccacccacgcccccaccctaatcagaggccaaacccttcctggagcctgtgataaaagcaa
ctgttagcttgcactagactagcttcaaagttgtattgaccctggtgtgttatgtctaagagtagatgcc
配列番号３：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐１と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎ
ｃｅｒ－１と呼ばれることもある）：
cacaggctccaggaagggtt
配列番号４：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐２と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎ
ｃｅｒ－２と呼ばれることもある）：
atcagaggccaaacccttcc
配列番号５：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐３と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎ
ｃｅｒ－３と呼ばれることもある）：
ctaacagttgcttttatcac
配列番号６：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐４と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎ
ｃｅｒ－４と呼ばれることもある）：
ttgcttttatcacaggctcc
配列番号７：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐５と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎ
ｃｅｒ－５と呼ばれることもある）：
ttttatcacaggctccagga
配列番号８：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐６と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎ
ｃｅｒ－６と呼ばれることもある）：
tttatcacaggctccaggaa
配列番号９：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐７と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎ
ｃｅｒ－７と呼ばれることもある）：
tgggtggggtagaagaggac
配列番号１０：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐８と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａ
ｎｃｅｒ－８と呼ばれることもある）：
gggcgtgggtggggtagaag
配列番号１１：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐９と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａ
ｎｃｅｒ－９と呼ばれることもある）：
ttagggtgggggcgtgggtg
配列番号１２：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐１０と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈ
ａｎｃｅｒ－１０と呼ばれることもある）：
attagggtgggggcgtgggt
配列番号１３：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐１１と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈ
ａｎｃｅｒ－１１と呼ばれることもある）：
gattagggtgggggcgtggg
配列番号１４：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐１２と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈ
ａｎｃｅｒ－１２と呼ばれることもある）：
tctgattagggtgggggcgt
配列番号１５：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐１３と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈ
ａｎｃｅｒ－１３と呼ばれることもある）：
ctctgattagggtgggggcg
配列番号１６：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐１４と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈ
ａｎｃｅｒ－１４と呼ばれることもある）：
cacgcccccaccctaatcag
配列番号１７：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐１５と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈ
ａｎｃｅｒ－１５と呼ばれることもある）：
ttggcctctgattagggtgg
配列番号１８：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐１６と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈ
ａｎｃｅｒ－１６と呼ばれることもある）：
tttggcctctgattagggtg
配列番号１９：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐１７と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈ
ａｎｃｅｒ－１７と呼ばれることもある）：
gtttggcctctgattagggt
配列番号２０：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐１８と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈ
ａｎｃｅｒ－１８と呼ばれることもある）：
ggtttggcctctgattaggg
配列番号２１：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐１９と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈ
ａｎｃｅｒ－１９と呼ばれることもある）：
aagggtttggcctctgatta
配列番号２２：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐２０と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈ
ａｎｃｅｒ－２０と呼ばれることもある）：
gaagggtttggcctctgatt
配列番号２３：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐２１と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈ
ａｎｃｅｒ－２１と呼ばれることもある）：
actcttagacataacacacc
配列番号２４：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐２２と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈ
ａｎｃｅｒ－２２と呼ばれることもある）：
cttcaaagttgtattgaccc
配列番号２５：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐２３と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈ
ａｎｃｅｒ－２３と呼ばれることもある）：
ctcttagacataacacacca
上記のように、ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー５８Ｋ部位の１５０ｂｐ配列に対して上記
２３のｓｇＲＮＡを設計した。
Ｂ、３００Ｖ １ｍｓのエレクトロポレーション条件を選択し、発明者はＣａｓ９ｍＲ
ＮＡ（配列番号２６に示す配列）および上記の設計された化学修飾された２３のｓｇＲＮ
Ａを合成した。その中で、２３のｓｇＲＮＡに対する化学修飾は、ｓｇＲＮＡの５’末端
の最初の３つの塩基及び３’末端の最後の３つの塩基の２’－Ｏ－メチル類縁体による修
飾およびヌクレオチド間の３’チオ修飾である。下記の化学式に示すように、左側は化学
修飾されたｓｇＲＮＡであり、右側は修飾されていないｓｇＲＮＡである。
Figure 2022180510000008
上記決めたエレクトロポレーション条件下で、臍帯血由来のＣＤ３４陽性造血幹細胞（
ＡＬＬＣＥＬＬＳ（上海）社から購入、ｗｗｗ．ａｌｌｃｅｌｌｓ．ｃоｍ）に上記２３
の化学修飾されたｓｇＲＮＡをエレクトロポレーションにより形質転換し、４日後にＴＩ
ＤＥでＩｎｄｅｌｓ効率を分析した。その結果は図９に示す。同様に、本実施例では、比
較として、化学修飾されていないｓｇＲＮＡについても同じ方法でエレクトロポレーショ
ンにより形質転換したが、化学修飾されていないｓｇＲＮＡのＩｎｄｅｌｓ効率は２．７
％しかなく、それからの実施例で使用されたのはいずれも化学修飾されたｓｇＲＮＡであ
る。
図９は、ＣＤ３４陽性の造血幹細胞に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡと２３のｓｇＲＮＡをエレ
クトロポレーションにより形質転換してから４日後に当該ＣＤ３４陽性の造血幹細胞のゲ
ノムを抽出し、ｓｇＲＮＡの切断部位の左と右それぞれ約４５０ｂｐ、全長９０３ｂｐの
フラグメントを選択して増幅した。増幅に使用したプライマー配列を以下に示す
フォワードプライマー：cacctcagcagaaacaaagttatc（配列番号２９）
リバースプライマー：gggaagctccaaactctcaa（配列番号３０）
切断部位の選択：Ｅｎｈａｎｃｅｒ－２を例にして、5‘-ctaacagttg cttttatcac-3’
で、切断部位は３’末端の右側にある（Ｃｏｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２
０１３）。
上記増幅したフラグメントに対してＳａｎｇｅｒシーケンシングを行い、シーケンシン
グ時に使用した上流および下流プライマーの配列は、配列番号２７と配列番号２８に示さ
れる。シーケンシングの結果についてＴＩＤＥソフトウェアでＩｎｄｅｌｓの生成効率を
統計分析した。ＴＩＤＥソフトウェアは、Ｉｎｄｅｌｓ効率をオンラインで分析するソフ
トウェアであり、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングの結果を基に、Ｉｎｄｅｌｓにより引き起
こされたダブルピーク変異の効率を分析した。ｔｉｄｅ．ｄｅｓｋｇｅｎ．ｃоｍを参照
できる。
その結果、当該エレクトロポレーション条件下で、本実施例で合成された２３のｓｇＲ
ＮＡがいずれも造血幹細胞の遺伝子編集に成功し、効果的にＩｎｄｅｌｓを生成でき、効
率が少なくとも１０％であることは示された。その中で、最も効率的なのはＥｎｈａｎｃ
ｅｒ－２である。
配列番号２６：Ｃａｓ９ｍＲＮＡ配列
gacaagaagtacagcatcggcctggacatcggcaccaactctgtgggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgcc
cagcaagaaattcaaggtgctgggcaacaccgaccggcacagcatcaagaagaacctgatcggagccctgctgttcgaca
gcggcgaaacagccgaggccacccggctgaagagaaccgccagaagaagatacaccagacggaagaaccggatctgctat
ctgcaagagatcttcagcaacgagatggccaaggtggacgacagcttcttccacagactggaagagtccttcctggtgga
agaggataagaagcacgagcggcaccccatcttcggcaacatcgtggacgaggtggcctaccacgagaagtaccccacca
tctaccacctgagaaagaaactggtggacagcaccgacaaggccgacctgcggctgatctatctggccctggcccacatg
atcaagttccggggccacttcctgatcgagggcgacctgaaccccgacaacagcgacgtggacaagctgttcatccagct
ggtgcagacctacaaccagctgttcgaggaaaaccccatcaacgccagcggcgtggacgccaaggccatcctgtctgcca
gactgagcaagagcagacggctggaaaatctgatcgcccagctgcccggcgagaagaagaatggcctgttcggcaacctg
attgccctgagcctgggcctgacccccaacttcaagagcaacttcgacctggccgaggatgccaaactgcagctgagcaa
ggacacctacgacgacgacctggacaacctgctggcccagatcggcgaccagtacgccgacctgtttctggccgccaaga
acctgtccgacgccatcctgctgagcgacatcctgagagtgaacaccgagatcaccaaggcccccctgagcgcctctatg
atcaagagatacgacgagcaccaccaggacctgaccctgctgaaagctctcgtgcggcagcagctgcctgagaagtacaa
agagattttcttcgaccagagcaagaacggctacgccggctacattgacggcggagccagccaggaagagttctacaagt
tcatcaagcccatcctggaaaagatggacggcaccgaggaactgctcgtgaagctgaacagagaggacctgctgcggaag
cagcggaccttcgacaacggcagcatcccccaccagatccacctgggagagctgcacgccattctgcggcggcaggaaga
tttttacccattcctgaaggacaaccgggaaaagatcgagaagatcctgaccttccgcatcccctactacgtgggccctc
tggccaggggaaacagcagattcgcctggatgaccagaaagagcgaggaaaccatcaccccctggaacttcgaggaagtg
gtggacaagggcgcttccgcccagagcttcatcgagcggatgaccaacttcgataagaacctgcccaacgagaaggtgct
gcccaagcacagcctgctgtacgagtacttcaccgtgtataacgagctgaccaaagtgaaatacgtgaccgagggaatga
gaaagcccgccttcctgagcggcgagcagaaaaaggccatcgtggacctgctgttcaagaccaaccggaaagtgaccgtg
aagcagctgaaagaggactacttcaagaaaatcgagtgcttcgactccgtggaaatctccggcgtggaagatcggttcaa
cgcctccctgggcacataccacgatctgctgaaaattatcaaggacaaggacttcctggacaatgaggaaaacgaggaca
ttctggaagatatcgtgctgaccctgacactgtttgaggacagagagatgatcgaggaacggctgaaaacctatgcccac
ctgttcgacgacaaagtgatgaagcagctgaagcggcggagatacaccggctggggcaggctgagccggaagctgatcaa
cggcatccgggacaagcagtccggcaagacaatcctggatttcctgaagtccgacggcttcgccaacagaaacttcatgc
agctgatccacgacgacagcctgacctttaaagaggacatccagaaagcccaggtgtccggccagggcgatagcctgcac
gagcacattgccaatctggccggcagccccgccattaagaagggcatcctgcagacagtgaaggtggtggacgagctcgt
gaaagtgatgggccggcacaagcccgagaacatcgtgatcgaaatggccagagagaaccagaccacccagaagggacaga
agaacagccgcgagagaatgaagcggatcgaagagggcatcaaagagctgggcagccagatcctgaaagaacaccccgtg
gaaaacacccagctgcagaacgagaagctgtacctgtactacctgcagaatgggcgggatatgtacgtggaccaggaact
ggacatcaaccggctgtccgactacgatgtggaccatatcgtgcctcagagctttctgaaggacgactccatcgacaaca
aggtgctgaccagaagcgacaagaaccggggcaagagcgacaacgtgccctccgaagaggtcgtgaagaagatgaagaac
tactggcggcagctgctgaacgccaagctgattacccagagaaagttcgacaatctgaccaaggccgagagaggcggcct
gagcgaactggataaggccggcttcatcaagagacagctggtggaaacccggcagatcacaaagcacgtggcacagatcc
tggactcccggatgaacactaagtacgacgagaatgacaagctgatccgggaagtgaaagtgatcaccctgaagtccaag
ctggtgtccgatttccggaaggatttccagttttacaaagtgcgcgagatcaacaactaccaccacgcccacgacgccta
cctgaacgccgtcgtgggaaccgccctgatcaaaaagtaccctaagctggaaagcgagttcgtgtacggcgactacaagg
tgtacgacgtgcggaagatgatcgccaagagcgagcaggaaatcggcaaggctaccgccaagtacttcttctacagcaac
atcatgaactttttcaagaccgagattaccctggccaacggcgagatccggaagcggcctctgatcgagacaaacggcga
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tgaaaaagaccgaggtgcagacaggcggcttcagcaaagagtctatcctgcccaagaggaacagcgataagctgatcgcc
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ggtacaccagcaccaaagaggtgctggacgccaccctgatccaccagagcatcaccggcctgtacgagacacggatcgac
ctgtctcagctgggaggcgac
配列番号２７シーケンスプライマー
cacctcagcagaaacaaagttatc
配列番号２８シーケンスプライマー
gggaagctccaaactctcaa
Ｃ、上記の実験結果に基づいて、遺伝子編集効率が比較的に高いＥｎｈａｎｃｅｒ－２
、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－３、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－４、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－５およびＥｎｈａ
ｎｃｅｒ－６を選択し、３００Ｖ １ｍｓのエレクトロポレーション条件下で、Ｃａｓ９
ｍＲＮＡと、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－２、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－３、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－４、Ｅ
ｎｈａｎｃｅｒ－５およびＥｎｈａｎｃｅｒ－６をエレクトロポレーションにより臍帯血
由来の造血幹細胞に導入してから４日後にＩｎｄｅｌｓ効率を検出した。その結果は図１
０に示す。図１０は、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐２ ｓｇＲＮ
Ａ、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－３ ｓｇＲＮＡ、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－４ ｓｇＲＮＡ、Ｅｎｈａ
ｎｃｅｒ－５ ｓｇＲＮＡおよびＥｎｈａｎｃｅｒ－６ ｓｇＲＮＡをエレクトロポレー
ションにより３つの異なる臍帯血由来のＣＤ３４陽性造血幹細胞に導入してから４日後、
上記と同じ方法を使用してＴＩＤＥソフトウェア分析によるＩｎｄｅｌｓの生成効率の統
計分析を示す図である。
図１０の結果、３つの異なる臍帯血由来の造血幹細胞では、５つのｓｇＲＮＡはいずれ
も効率的な遺伝子編集を実現し、効率は少なくとも４０％以上であり、その中で、最も効
率が高いのは、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－２ ｓｇＲＮＡであり、平均的な遺伝子編集効率は８
０％にも達しており、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－３、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－４、Ｅｎｈａｎｃｅｒ
－５およびＥｎｈａｎｃｅｒ－６より有意に高いと共に、既存の文献で報告されている造
血幹細胞での遺伝子編集効率よりも高いことは示された（Ｘｕ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１７；ＤｅＷｉｔｔ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓ
ｌ Ｍｅｄ．２０１６）。
これに基づいて、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－２ ｓｇＲＮＡを標的ターゲットとして後続実験
が行われた。
実施例２：遺伝子編集された臍帯血由来の造血幹細胞のインビトロコロニー形成
本実験は、遺伝子編集された臍帯血由来の造血幹細胞のコロニー形成単位（ＣＦＵ、ｃ
ｏｌｏｎｙ－ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｕｎｉｔｓ）の検出に係る。
３００Ｖ １ｍｓのエレクトロポレーション条件を選択し、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびＥ
ｎｈａｎｃｅｒ－２をエレクトロポレーションにより臍帯血由来の造血幹細胞に導入し、
８００～１０００の細胞を１ｍｌ Ｈ４４３４（カナダＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ ＴＥＣＨ
ＮＯＬＯＧＩＥＳから購入）とＩＭＤＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）および
ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）の混合液に再懸濁し、１４日後にＣＦＵ
－Ｍ、ＢＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－Ｇ、ＣＦＵ－ＧＭ、ＧＥＭＭなど形成された異
なる形のコロニー数を顕微鏡で観察し、その結果を図１１に示す。図１１は、Ｃａｓ９
ｍＲＮＡとＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐２ ｓｇＲＮＡをエレクトロポレーションして
臍帯血由来のＣＤ３４陽性造血幹細胞に導入してから２日後、インビトロコロニー形成実
験（ＣＦＵ検出）を実施し、１４日後に異なる血液系のコロニー数をカウントした結果を
示す図である。ＢＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－Ｍ、ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－Ｇ、ＣＦ
Ｕ－ＭＭは、赤血球系、骨髄系、リンパ系などの血液系の異なる系統のコロニー形成を表
す。その中で、Ｍｏｃｋは遺伝子編集されていない細胞を表す。
実施例２のデータによって、遺伝子編集されていない造血幹細胞と比べて、遺伝子編集
された細胞のインビトロ分化機能が正常であり、血液系の異なる系統のコロニー（クロー
ン）に分化することができることは示されている。
実施例３：遺伝子編集された臍帯血由来の造血幹細胞によるマウスモデルの造血系の再
構築
３００Ｖ １ｍｓのエレクトロポレーション条件を選択し、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびＥ
ｎｈａｎｃｅｒ－２をエレクトロポレーションにより臍帯血由来の造血幹細胞に導入し、
放射計で照射されたＮＰＧ免疫不全マウスモデル（北京維通達生物技術有限公司（Ｂｅｉ
ｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌｓｔａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）から購入）に
移植した。移植して６週間、８週間、１０週間、１２週間、１６週間後、末梢血でヒトＣ
Ｄ４５陽性細胞とマウスＣＤ４５の発現を検出すると共に、移植して１６週間後の骨髄と
脾臓でヒトＣＤ４５とマウスＣＤ４５の発現を検出し、その結果は図１２と図１４に示す
。マウスへの移植方法は次の通りである。細胞移植の２４時間前に、１．０Ｇｙの照射を
行ってマウスモデルの骨髄を除去した。そして、２０μＬ ０．９％生理食塩水で再懸濁
した１．０×１０６の細胞をマウスの尾静脈に注射し、クリーングレードの動物舎に飼育
した。
図１２と図１４に示す結果によれば、遺伝子編集されていない造血幹細胞と比べて、遺
伝子編集された造血幹細胞をマウスモデルに移植した後、遺伝子編集された細胞は時間が
経つにつれて、ヒト由来ｈＣＤ４５の発現率が増加し続け、末梢血サンプルでは、６週目
の２０％から１６週目の６０％に増加し、１６週目の骨髄での割合は９０％にも達してお
り、脾臓では７０％に達している。これは、遺伝子編集された造血幹細胞は、マウスモデ
ルの造血系に迅速かつ効率的に移植でき、細胞の体内分化機能は正常であることを示して
いる。既存の文献報告から明らかに、６週間後の末梢血におけるＣＤ４５の発現率は１～
１０％であり、１６週間後のＣＤ４５の発現率は２０～４０％であり、骨髄におけるＣＤ
４５の発現率は５０％くらいである。よって、本発明の動物実験結果は、既存の分野で報
告されている移植実験結果よりも明らかに優れている（Ｘｕ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１７；ＤｅＷｉｔｔ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ
Ｍｅｄ．２０１６；Ｍｅｔｔａｎａｎｄａ，ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕ
ｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２０１７）。
同時に、遺伝子編集された細胞を移植されたマウスにおいて、１６週間後にＣＤ３、Ｃ
Ｄ４、ＣＤ８、ＣＤ３３、ＣＤ５６、ＣＤ１９などのヒト細胞膜タンパク質の発現を検出
し、その結果は図１３、１４、１５に示す。その結果、遺伝子編集された細胞はこれらの
タンパク質を正常に発現でき、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージなどの血液系の細胞に分
化でき、マウスモデルの造血系を効率的に再構築できることを示している。既存の文献で
報告されている結果と比較して、まずＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３３、ＣＤ１９、ｈ
ＣＤ５６など６つの細胞膜表面タンパク質を検出してマウスの血液におけるＴ細胞、骨髄
細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞などの発現状況を判断し、移植されたヒト造血幹細胞がマウス
の造血系を再構築する能力をより正確に評価した。これに対して、既存の文献では、ＣＤ
３、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ３３などのタンパク質の発現のみをテストしている。次に
、末梢血、骨髄、及び脾臓など３つの重要な血液系関連組織における上記の６つのタンパ
ク質の発現プロファイルを検出し、マウスの造血系を再構築する能力をより全面的に評価
した。これに対して、既存の文献では、骨髄のみが検出の組織とされている（Ｃｈａｎｇ
，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．２０
１７；ＤｅＷｉｔｔ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１６；Ｍｅｔｔ
ａｎａｎｄａ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２０１７）
。
また、遺伝子編集された細胞は、マウスモデルの造血系を迅速かつ効率的に再構築する
ことができる。再構築マウスモデルの細胞で遺伝子編集が行われたか否かについての判定
結果を図１６に示す。移植前の細胞と移植して１６週間後の末梢血、骨髄、脾臓のゲノム
を抽出し、目標フラグメントを増幅してＳａｎｇｅｒシーケンシングを行い、ＴＩＤＥソ
フトウェアでＩｎｄｅｌｓ効率を分析した。その結果、移植して１６週間後の末梢血、骨
髄、脾臓のヒト細胞がいずれも遺伝子編集され、効率は５０～７０％の範囲で移植前の細
胞に似ていることは示されている。
実施例４：遺伝子編集された臍帯血由来造血幹細胞の赤血球系分化によるγグロビンお
よび胎児ヘモグロビンの発現の検出
４－１．赤血球の分化
３００Ｖ １ｍｓのエレクトロポレーション条件を選択し、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびＥ
ｎｈａｎｃｅｒ－２をエレクトロポレーションにより臍帯血由来の造血幹細胞に導入し、
次の「二段階法」分化スキームを使用して分化させた。
二段階法による分化は、造血幹細胞の赤血球系増殖および分化培地を使用して分化させ
、そして造血幹細胞の赤血球系分化脱核培地を使用して分化させることである。
造血幹細胞赤血球系増殖および分化培地としては、基礎培地はＳｔｅｍＳｐａｎＴＭ
ＳＦＥＭ ＩＩであり、成長因子は、５０～２００ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、１０～１００ｎ
ｇ／ｍｌ ＩＬ－３、１～１０Ｕ ＥＰＯ／ｍｌであり、培養条件は、造血幹細胞の赤血
球系増殖および分化培地を使用して造血幹細胞１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌを培養し
、７日間増殖した。
造血幹細胞赤血球系分化脱核培地としては、基礎培地はＳＴＥＭＳＰＡＮＴＭ ＳＦＥ
Ｍ ＩＩであり、成長因子は、１～１０Ｕ ＥＰＯ、１００～１０００μｇ／ｍｌヒトト
ランスフェリンであり、化学的小分子は０．５～１０μｍのミフェプリストン（Ｍｉｆｅ
ｐｒｉｓｔｏｎｅ）であり、前のステップで培養した１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの
細胞を造血幹細胞赤血球系分化脱核培地で５日間分化させた。
そして、図１７に示すように、ＣＤ７１とＤＣ２３５ａの発現を検出した。実験群と対
照群は何れも効率的に赤血球に分化でき、ＣＤ７１とＣＤ２３５ａの発現率は何れも９０
％以上である。
４－２．γグロビンと胎児ヘモグロビンの発現の検出
上記の赤血球が分化した細胞のｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写し、ＢＣＬ１１Ａ
、ＨＢＢ、ＨＢＧなどの遺伝子の発現を蛍光定量ＰＣＲによって検出し、その結果を図１
８に示す。その結果、ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー部位の遺伝子がノックアウトされた細
胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子発現が１倍ダウンレギュレーションされ、ＨＢＧ発現が１倍と増
加した。
赤血球系分化後の細胞の胎児ヘモグロビンの発現を検出し、図１９に示すように、フロ
ーサイトメトリー解析の結果、ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー部位の遺伝子がノックアウト
された細胞は、胎児ヘモグロビンの発現が約１倍と増加したことは示されている。
実施例５：β－サラセミア患者由来の造血幹細胞のＢＣＬ１１Ａのエンハンサー部位の
遺伝子編集
５－１．β－サラセミア患者の末梢血からの造血幹細胞の単離
従来の磁気ビーズ選別によってＣＤ３４陽性の造血幹細胞を得た。結果を図２０に示す
。
５－２．β－サラセミア患者の末梢血からの造血幹細胞のエレクトロポレーション
３００Ｖ １ｍｓのエレクトロポレーション条件を選択し、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとＥｎ
ｈａｎｃｅｒ－２、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－３、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－４、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－
５およびＥｎｈａｎｃｅｒ－６をエレクトロポレーションにより、β－サラセミア患者の
末梢血からの造血幹細胞に導入し、４日後、Ｉｎｄｅｌｓ効率を検出し、その結果を図２
１に示す。３名の異なる患者の末梢血からの造血幹細胞において、５つのｓｇＲＮＡは何
れも効率的な遺伝子編集を実現でき、その中で、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－２の効率が最も高く
、７０％以上にも達していることは示されている。
実施例６：遺伝子編集された貧血患者の末梢血に由来する造血幹細胞の赤血球系分化に
よるγグロビンおよび胎児ヘモグロビンの発現の検出
実施例５で遺伝子編集された造血幹細胞をインビトロで赤血球系分化させ、その方法は
実施例４－１を参照できる。分化の結果を図２２に示す。実験の結果、対照群、Ｅｎｈａ
ｎｃｅｒ－２、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－３、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－４、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－５お
よびＥｎｈａｎｃｅｒ－６の赤血球分化効率が互いに近く、いずれもＣＤ７１とＣＤ２３
５ａ細胞膜タンパク質を高く発現したことは示されている。
１２日後、赤血球分化後の細胞のｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写し、ＢＣＬ１１
Ａ、ＨＢＢ、ＨＢＧ、ＨＢＡなどの遺伝子の発現を蛍光定量ＰＣＲによって検出し、その
結果を図２３に示す。その結果、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－６を除き、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－２、
Ｅｎｈａｎｃｅｒ－３、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－４、およびＥｎｈａｎｃｅｒ－５は何れも細
胞におけるＢＣＬ１１Ａの遺伝子発現をダウンレギュレーションでき、その中で、Ｅｎｈ
ａｎｃｅｒ－２の効果が最も顕著であり、約１倍とダウンレギュレーションし、また、Ｅ
ｎｈａｎｃｅｒ－２、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－３、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－４、Ｅｎｈａｎｃｅｒ
－５、及びＥｎｈａｎｃｅｒ－６がいずれもγグロビン発現を増加させることができ、そ
の中で、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－２の効果が最も顕著であり、γグロビンの発現が９倍と増加
し、臨床治療の標準に合致することは示されている。既存の文献の結果と比較して、まず
、重症のサラセミア患者に由来する造血幹細胞を最初の評価細胞ソースとして使用し、本
発明の方法が臨床治療の要件を満たすことを正確に検証した。これに対して、既存の文献
は正常のヒト骨髄または末梢血のサンプルしか使用していない。次に、既存の文献で報告
されている胎児ヘモグロビンの増加倍率は４～７倍しかなく、本発明の胎児ヘモグロビン
の発現増加倍率より低い。これは、本発明の実験結果が既存の文献報告よりもはるかに優
れていることを示している（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉ
ｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．２０１７；Ｍａｔｔｅｗ Ｃ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ
ｕｒｅ．２０１５）。
また、図２７、２８および２９に示すように、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－２、Ｅｎｈａｎｃｅ
ｒ－３、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－４、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－５、及びＥｎｈａｎｃｅｒ－６がＢ
ＣＬ１１Ａのエンハンサー部位を遺伝子編集することによる胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）
と正常ヘモグロビン（ＨｂＡ）のタンパク質発現量への影響をより正確に評価するために
、本発明では、造血幹細胞を１２日間分化させた後に得られた赤血球のタンパク質を抽出
し、ＨＰＬＣ試験（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔ
ｏｇｒａｐｈｙ、高速液体クロマトグラフィー）を行った。その結果、１）保持時間が約
５．４分と１０分でのクロマトグラフィーピークはそれぞれＨｂＦとＨｂＡを表す。２）
遺伝子編集されていない細胞と比べて、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－２、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－３、
Ｅｎｈａｎｃｅｒ－４、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－５、及びＥｎｈａｎｃｅｒ－６により遺伝子
編集された細胞のＨｂＦ発現量はより高く（ピークがより高く、ピーク面積がより大きい
）、ＨｂＡの発現量はより低く（ピークがより低く、ピーク面積がより小さい）、これは
、ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー部位の遺伝子編集はＨｂＦの発現を増加させ、ＨｂＡの発
現をダウンレギュレーションしたことを示している。３）その中で、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－
２のＨｂＦ／ＨｂＡの比率は約５．２８であり、ｍоｃｋのＨｂＦ／ＨｂＡの比率は約０
．７９であり、６．６８倍と増加しており、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－３、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－
４、Ｅｎｈａｎｃｅｒ－５、及びＥｎｈａｎｃｅｒ－６がＨｂＦ／ＨｂＡに対する比率倍
数より有意に高い。臨床上では、本発明の背景技術に記載されているように、重度のβ－
サラセミア患者はβグロビンが欠失するため、血液中のヘモグロビンは少量のＨｂＡと大
多数のＨｂＦとからなり、通常は重度のβ－サラセミア患者のヘモグロビンは２０ｇ／Ｌ
くらいであり、そのうちＨｂＦは９０％以上を占めている。９０％の比率を占めているこ
ととして計算すると、遺伝子編集された細胞のＨｂＦ発現量は６．６８倍増加したので、
最終のヘモグロビン量は２０＊０．９＊６．６８＋２０＊０．１＝１２２．２４ｇ／Ｌで
あり、正常なヒトヘモグロビン発現量の範囲は１１５～１５０ｇ／Ｌであり、この結果は
臨床治療の標準に完全に合致している（Ａｎｔｏｎｉｏ Ｃａｏ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ
ｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１０；２０１０年『重度のβ－サラセミアの診断と治
療のガイドライン』）。既存の文献と比較して、本発明は、β－サラセミア患者の造血幹
細胞において、胎児ヘモグロビンを改善するためのＢＣＬ１１Ａのエンハンサーの遺伝子
編集の有効性をＨＰＬＣ実験によって正確に評価した唯一の発明研究であり、しかもその
結果、胎児ヘモグロビンの発現が有意に増加し、重度のβ－サラセミア患者を治療する臨
床要件を満たしていることを示している（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．２０１７；Ｍａｔｔｅｗ Ｃ ｅｔ ａ
ｌ． Ｎａｔｕｒｅ．２０１５；Ｌｉｎ Ｙｅ，ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ．２０１６；Ｍａ
ｔｔｈｅｗ Ｈ． Ｐｒｏｔｅｕｓ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ
ｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１３）
実施例７：遺伝子編集された貧血患者の末梢血由来の造血幹細胞のインビトロコロニー
形成
３００Ｖ １ｍｓのエレクトロポレーション条件を選択し、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびＥ
ｎｈａｎｃｅｒ－２をエレクトロポレーションにより貧血患者の末梢血由来の造血幹細胞
に導入し、５００～８００の細胞を１ｍｌ Ｈ４４３４（カナダＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ
ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳから購入）とＩＭＤＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入
）およびＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）の混合液に再懸濁し、１４日後
にＣＦＵ－Ｍ、ＢＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－Ｇ、ＣＦＵ－ＧＭ、ＧＥＭＭなど形成
された異なる形のコロニー数を顕微鏡で観察し、その結果を図２５に示す。
本実験データによって、遺伝子編集されていない造血幹細胞と比べて、遺伝子編集され
た細胞のインビトロでの分化機能が正常であり、血液系の異なる系統のコロニーに分化す
ることができることは示されている。
実施例８：遺伝子編集された貧血患者の末梢血由来の造血幹細胞のオフターゲット効果
本実験は遺伝子シーケンシング法に係り、具体的には、遺伝子編集された貧血患者の末
梢血由来の造血幹細胞のオフターゲット効果（оｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔ）を
次世代シーケンシング技術（Ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，
ＮＧＳ）によって分析する。
３００Ｖ １ｍｓのエレクトロポレーション条件を選択し、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびＥ
ｎｈａｎｃｅｒ－２をエレクトロポレーションにより貧血患者の末梢血由来の造血幹細胞
に導入し、４日間増殖した後、ゲノムを抽出して次世代シーケンス分析をした。１４の潜
在的なオフターゲット部位を、ソフトウェアを介して予測し、その結果を図２２に示す。
本実験データによって、遺伝子編集のオンターゲット（оｎ－ｔａｒｇｅｔ）効率は７
６％であり、１４の潜在的なオフターゲット部位の比率はいずれも０．３％未満であり、
次世代シーケンシング自体のエラーに相当することは示されている。これより明らかに、
シーケンシングエラー範囲内で、遺伝子編集によるオフターゲット現象は検出されていな
いため、この遺伝子編集スキームは安全である。
上記実施例のデータから分かるように、由来の異なる細胞のいずれに対して、Ｅｎｈａ
ｎｃｅｒ－２は最良の効果を示している。
実施例９
３００Ｖ １ｍｓのエレクトロポレーション条件を選択し、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびＥ
ｎｈａｎｃｅｒ－２をエレクトロポレーションにより貧血患者の末梢血由来の造血幹細胞
に導入してから、上記実施例４の「二段階法」を使用して赤血球の分化を行った。ただし
、実施例９では、増殖の時間は４日間であり、その後１４日間分化し、１４日後にＨｂＦ
染色を行い、フローサイトメトリーによる選別単離によりＨｂＦ高発現（約１０％割合）
とＨｂＦ低発現（約１０％割合）の細胞を取得し、ゲノムを抽出してそれぞれ次世代シー
ケンシング分析（ディープシーケンス分析）を行った。
ＨｂＦ染色の工程は次の通りである。１）培養プレート内の細胞を採集し、６００ｇで
５分間遠心分離して上澄みを除去した；２）４℃に予冷した、０．０５％グルタルアルデ
ヒド含有リン酸塩緩衝液を加え、室温で１０分間固定した。６００ｇで５分間遠心分離し
て上澄みを除去した；３）０．１％ＢＳＡを含むリン酸塩緩衝液を加え、ピペッティング
して再懸濁し、６００ｇで５分間遠心分離して上澄みを除去した。３回繰り返して、残っ
たグルタルアルデヒドを可能な限り除去した；４）０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００含
有０．１％ＢＳＡのリン酸塩緩衝液を加え、室温で４分間放置し、６００ｇで５分間遠心
分離して上澄みを除去した；５）０．１％ＢＳＡを含むリン酸塩緩衝液を加え、ピペッテ
ィングして再懸濁し、６００ｇで５分間遠心分離して上澄みを除去した；６）０．１％Ｂ
ＳＡを含むリン酸塩緩衝液１００ｕｌを加え、５ｕｌのＨｂＦフローサイトメトリー抗体
を加え、室温で１５分間染色した；７）０．１％ＢＳＡを含むリン酸塩緩衝液を加え、６
００ｇで５分間遠心分離して上澄みを除去した；８）０．１％ＢＳＡを含むリン酸塩緩衝
液１００ｕｌを加え、ピペッティングして再懸濁し、フローサイトメトリーで分析をした
。
ＨｂＦ高発現とＨｂＦ低発現との２つのグループの細胞をディープシーケンス分析して
比較し、分析結果を図３１に示す。図３１から分かるように、ＨｂＦ高発現の細胞グルー
プには主に５つの遺伝子型があり、その中で、野生型の効率は４６．４７％、「－５」は
１４．３８％、「－１」は１４．６０％、「－４」は１４．５５％、「＋１」は１０．０
０％である。この結果より明らかに、主に「－５」、「－１」、「－４」、及び「＋１」
の４つの遺伝子型の細胞が、胎児ヘモグロビンＨｂＦを高度に発現している。上記４つの
遺伝子型から分かるように、配列「ＣＴＴＣＣＴ」は重要な標的配列である（図３１の矢
印で示される位置）。実施例９の結果によって、遺伝子編集された細胞においてこの配列
が破壊された場合、胎児ヘモグロビンの発現を効果的にアップレギュレーションできるこ
とは示されている。
遺伝子解析の結果によると、「ＣＴＴＣＣＴ」の６ｂｐの塩基配列は、ＳＴＡＴ１とＥ
ＬＦ１遺伝子の結合部位を含む。文献報告によれば、ＳＴＡＴ１の結合部位は「ＴＴＣＣ
ｎＧＧＡ」モチーフ（ｎは任意の塩基を表す）であり（Ｒａｊａ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００８；Ｇｅｏｒｇｅ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００１；Ｃｈｒｉｓｔ
ｏｐｈ，ｅｔ ａｌ．Ｐｌｏｓｏｎｅ．２０１０）、ＥＬＦ－１の結合部位は「ＴＴＣＣ
」モチーフである（Ｓｔｅｖｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ
．２０１５；Ｙｕａｎｇ－Ｔａｕｎｇ Ｊｕａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００７）。
その中で、ＳＴＡＴ１とＥＬＦ１は、血液系の発育と赤血球の発育に関与する重要な調
節転写因子である。ＳＴＡＴ１は、転写因子ＢＣＬ１１Ａと結合することで調節ネットワ
ークを形成して赤血球の発育をマイナスに調節する（Ｊａｓｏｎ Ｄ Ｂｕｅｎｒｏｓｔ
ｒｏ，ｅｔ ａｌ．ＢｉｏＲｘｉｖ．２０１７；Ｋｅｉｔａ Ｋｉｒｉｔｏ，ｅｔ ａｌ
．Ｂｌｏｏｄ．１９９８）。転写因子ＥＬＦ－１は血液系の発育過程において、ＧＡＴＡ
－２、ＦＬＩ－１と複合体を形成し、下流の重要な転写因子ＧＡＴＡ１の発現を活性化す
る（Ｇｅｍｍａ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２００６
）。
本発明の実験結果は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の中の、「ＣＴＴＣＣＴ」の６ｂｐを含む塩
基配列を破壊することにより、ＳＴＡＴ１とＥＬＦ－１の結合部位を破壊し、ＳＴＡＴ１
とＥＬＦ－１がＢＣＬ１１Ａエンハンサーに結合できず、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子が胎児ヘモ
グロビンの合成に対する阻害を解除し、これによって血液中の胎児ヘモグロビンの発現を
増加させたことを示している。
本発明によれば、本発明の方法は以下のいくつかの利点を有する。まず、本方法は、サ
ラセミア患者由来の造血幹細胞を遺伝子編集することができ、サラセミアおよび鎌状赤血
球貧血の臨床治療の要件を完全に満たすことができる。そして、化学修飾されたｓｇＲＮ
Ａを使用することにより、遺伝子編集効率が高く、胎児ヘモグロビンの発現が大幅に増加
し、細胞はモデルマウスの造血系を再構築することができる。最後に、オフターゲット分
析によって高い安全性を示している。これに基づいて、本発明により開発された方法は、
従来の造血幹細胞移植治療技術に取って代わって、重度のサラセミアおよび鎌状赤血球貧
血の患者を治癒することができる。
具体的な特徴を参照して本発明を詳しく説明してきたが、この説明は好ましい実施形態
についてのみであり、本発明の範囲を限定するものではないことは、当業者にとって自明
である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求の範囲およびその均等物によ
って限定される。

Claims (44)

  1. ヒト造血幹細胞の２番染色体上の、ＣＴＴＣＣＴ配列の上流０～１５個のヌクレオチ
    ドから当該ＣＴＴＣＣＴ配列の下流０～１５個のヌクレオチドまでのＢＣＬ１１Ａゲノム
    領域を遺伝子編集技術によって破壊することを含み、ＢＣＬ１１Ａゲノム領域がｃｈｒ２
    ：６０４９５２３６とｃｈｒ２：６０４９５２７１との間にある、ヒト造血幹細胞におけ
    る胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）の発現を増加させる方法。
  2. 前記ＢＣＬ１１Ａゲノム領域配列はＣＴＴＣＣＴである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記遺伝子編集技術は、ジンクフィンガーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、ＴＡ
    ＬＥＮ遺伝子編集技術またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集技術である、請求項１また
    は２に記載の方法。
  4. 前記遺伝子編集技術がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術である、請求項３に記載
    の方法。
  5. 前記ＢＣＬ１１Ａゲノム領域の編集を実現するように、前記ＢＣＬ１１Ａゲノム領域を
    標的とするｓｇＲＮＡを前記造血幹細胞に導入することを含む、請求項１～４のいずれか
    一項に記載の方法。
  6. 前記ＢＣＬ１１Ａゲノム領域の編集を実現するように、配列番号３、４、８および３３
    ～６３から選択されるいずれか一つの配列を含むｓｇＲＮＡを前記造血幹細胞に導入する
    ことを含む、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記ＢＣＬ１１Ａゲノム領域の編集を実現するように、配列番号４の配列を含むｓｇＲ
    ＮＡを前記造血幹細胞に導入することを含む、請求項３～６のいずれか一項に記載の方法
    。
  8. 前記ｓｇＲＮＡは、２’－Ｏ－メチル類縁体及び／またはヌクレオチド間３’チオによ
    り修飾されたものである、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記化学修飾は、前記ｓｇＲＮＡの５’末端の最初の１つ、２つ、及び／または３つの
    塩基及び／または３’末端の最後の１つの塩基の２’－Ｏ－メチル類縁体による修飾であ
    る、請求項８に記載の方法。
  10. 前記ｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導
    入する、請求項４～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記ｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドとをエレクトロポレーションに
    よって一緒に前記造血幹細胞に導入する、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記エレクトロポレーションの条件は、２００～６００Ｖ、０．５～２ｍｓである、請
    求項１１に記載の方法。
  13. ＣＴＴＣＣＴ配列の上流０～１５個のヌクレオチドから当該ＣＴＴＣＣＴ配列の下流０
    ～１５個のヌクレオチドまでのＢＣＬ１１Ａゲノム領域を標的とするｓｇＲＮＡを造血幹
    細胞に導入することを含み、前記ＢＣＬ１１Ａゲノム領域がｃｈｒ２：６０４９５２３６
    とｃｈｒ２：６０４９５２７１との間にあり、前記ｓｇＲＮＡが２’－Ｏ－メチル類縁体
    及び／またはヌクレオチド間３’チオにより修飾されたものである、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ
    ｓ９システムを介してインビトロで造血幹細胞を効率的に編集する方法。
  14. 配列番号４、８および３３～６３から選択されるいずれか一つの配列を含むｓｇＲＮＡ
    を造血幹細胞に導入することを含み、前記ｓｇＲＮＡが２’－Ｏ－メチル類縁体及び／ま
    たはヌクレオチド間３’チオにより修飾されたものである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記ｓｇＲＮＡとＣａｓ９をコードするヌクレオチドとを一緒に前記造血幹細胞に導入
    する、請求項１３または１４に記載の方法。
  16. ｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドとをエレクトロポレーションによっ
    て一緒に前記造血幹細胞に導入する、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記エレクトロポレーションの条件は、２００～６００Ｖ、０．５～２ｍｓである、請
    求項１６に記載の方法。
  18. 請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法によって得られた造血幹細胞。
  19. 胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）の発現が遺伝子改変によって増加したヒト造血幹細胞であ
    って、前記造血幹細胞の２番染色体上の、ＣＴＴＣＣＴ配列の上流０～１５個のヌクレオ
    チドから当該ＣＴＴＣＣＴ配列の下流０～１５個のヌクレオチドまでのＢＣＬ１１Ａゲノ
    ム領域のｓｇＲＮＡが造血幹細胞に導入され、前記ＢＣＬ１１Ａゲノム領域がｃｈｒ２：
    ６０４９５２３６とｃｈｒ２：６０４９５２７１との間にある、ヒト造血幹細胞。
  20. 請求項１８または１９に記載の造血幹細胞を分化培養することにより得られた、成熟赤
    血球の前の分化の異なる段階にある前駆細胞。
  21. 請求項１８または１９に記載の造血幹細胞を分化培養することにより得られた成熟赤血
    球。
  22. 胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）の発現が遺伝子改変によって増加した成熟赤血球またはそ
    の前駆細胞を製造する方法であって、
    （ａ）請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法を使用して遺伝子改変された造血幹
    細胞を得ることと、
    （ｂ）造血幹細胞赤血球系増殖および分化培地を使用して、前記遺伝子改変された造血
    幹細胞に対して造血幹細胞赤血球系増殖および分化を行うこととを含み、
    前記造血幹細胞赤血球系増殖および分化培地は、基礎培地と、成長因子組成物とを含み
    、前記成長因子組成物は、幹細胞成長因子（ＳＣＦ）、インターロイキン３（ＩＬ－３）
    、およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含む、方法。
  23. 赤血球系分化脱核培地を使用して造血幹細胞の赤血球系分化および脱核を行うことをさ
    らに含み、
    前記赤血球系分化脱核培地は、基礎培地、成長因子、およびプロゲステロン受容体とグ
    ルココルチコイド受容体の拮抗薬および／または阻害剤を含む、
    請求項２２に記載の方法。
  24. 前記赤血球系分化脱核培地における成長因子はエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含み、前
    記プロゲステロン受容体とグルココルチコイド受容体の拮抗薬および／または阻害剤は、
    下記化合物（Ｉ）～（ＩＶ）から選択されるいずれか１つまたは２つ以上である、請求項
    ２３に記載の方法。
    Figure 2022180510000009
  25. 請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法によって得られた成熟赤血球または前駆
    細胞。
  26. 請求項１８または１９に記載の造血幹細胞、若しくは請求項２０または２５に記載の前
    駆細胞、若しくは請求項２１または２５に記載の成熟赤血球を含む、組成物。
  27. 請求項１８または１９に記載の造血幹細胞、若しくは請求項２０または２５に記載の前
    駆細胞、若しくは請求項２１または２５に記載の成熟赤血球を含む、医療製品。
  28. 請求項１８または１９に記載の造血幹細胞、若しくは請求項２０または２５に記載の前
    駆細胞、若しくは請求項２１または２５に記載の成熟赤血球のそれの必要がある被験者の
    疾患の予防または治療における、使用。
  29. 前記疾患が貧血疾患、出血性疾患、腫瘍、または予防または治療のために大量の輸血を
    必要とする他の疾患である、請求項２８に記載の使用。
  30. 前記疾患はβ－サラセミアまたは鎌状赤血球貧血である、請求項２９に記載の使用。
  31. 前記被験者はヒトである、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の使用。
  32. 被験者の疾患を予防または治療するための薬剤または医療製品の調製における、請求項
    １８または１９に記載の造血幹細胞、若しくは請求項２０または２５に記載の前駆細胞、
    若しくは請求項２１または２５に記載の成熟赤血球の使用。
  33. 前記疾患が貧血疾患、出血性疾患、腫瘍、または予防または治療のために大量の輸血を
    必要とする他の疾患である、請求項３２に記載の使用。
  34. 前記疾患はβ－サラセミアまたは鎌状赤血球貧血である、請求項３３に記載の使用。
  35. 前記被験者はヒトである、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の使用。
  36. ＣＴＴＣＣＴ配列の上流０～１５個のヌクレオチドから当該ＣＴＴＣＣＴ配列の下流０
    ～１５個のヌクレオチドまでのＢＣＬ１１Ａゲノム領域を標的とするｓｇＲＮＡを含み、
    前記ＢＣＬ１１Ａゲノム領域がｃｈｒ２：６０４９５２３６とｃｈｒ２：６０４９５２７
    １との間にある、ｓｇＲＮＡ構築体。
  37. 配列番号３、４、８および３３～６３から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列
    を含む、請求項３６に記載の構築体。
  38. ２’－Ｏ－メチル類縁体及び／またはヌクレオチド間３’チオ修飾を含む、請求項３６
    または３７に記載の構築体。
  39. 前記化学修飾は、前記ヌクレオチド配列の５’末端の最初の１つ、２つ、及び／または
    ３つの塩基及び／または３’末端の最後の１つの塩基の２’－Ｏ－メチル類縁体による修
    飾である、請求項３８に記載の構築体。
  40. 請求項３６～３９のいずれか一項に記載の構築体を含むベクター、宿主細胞または製剤
    。
  41. 造血幹細胞の遺伝子編集における、請求項３６～３９のいずれか一項に記載の構築体の
    使用。
  42. 請求項１８または１９に記載の造血幹細胞、請求項２０または２５に記載の前駆細胞、
    若しくは請求項２１または２５に記載の成熟赤血球を被験者に投与することを含む、被験
    者の貧血疾患、出血性疾患、腫瘍、または予防または治療のために大量の輸血を必要とす
    る他の疾患を治療または予防する方法。
  43. 前記疾患はβ－サラセミアまたは鎌状赤血球貧血である、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記被験者はヒトである、請求項４３に記載の方法。
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