CN114032240A - 一种用于提高基因敲除效率的方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于提高基因敲除效率的方法，本发明涉及一种用于提高基因敲除效率的方法。本发明的目的是为了解决现有CRISPR/Cas9存在基因敲除效率低的问题，本发明针对靶向目的基因的位置约上下游50bp的序列范围使用多个高效sgRNA(约3‑6个)，结合Cas9蛋白进行基因编辑细胞转染实验。这将显著的提高基因敲除效率，本发明应用于CRISPR‑Cas9介导的基因组编辑领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于提高基因敲除效率的方法。
背景技术
相对于传统的ZFN(zinc-finger nucleases)和TALEN(transcriptionactivator-like effector nucleases)基因编辑技术，CRISPR/Cas9基因编辑技术，由于它的高效便捷的优势，目前已在众多基因治疗和生命科学研究中扮演者重要的角色。而现有的CRISPR/Cas9除了存在脱靶效应和sgRNA靶向位置依赖基因组中的PAM位点外，还有基因敲除效率不高等问题。如果敲除效率低会导致基因敲除后的细胞基因改变频率低，只有极少的细胞发生了基因敲除。对于细胞群体而言等于没有明显的细胞功能变化，从而对于细胞功能的研究和细胞的功能改变大大降低。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有CRISPR/Cas9存在基因敲除效率低的问题，提供一种用于提高基因敲除效率的方法。
本发明一种用于提高基因敲除效率的方法，按以下步骤进行：
一、针对目的基因序列片段设计5-15个候选的sgRNA，然后分别进行合成，得到5-15组sgRNA，将各组sgRNA与Cas9蛋白共转到细胞中，转染后24h-48h提取各组sgRNA的细胞基因组进行测序分析，检测每个候选sgRNA的基因编辑效率；
二、筛选sgRNA浓度大于1ug/uL、编辑效率大于30％的sgRNA，按编辑效率由高至低的顺序选出3-6个sgRNA；
三、将步骤二选出的3-6个sgRNA分别与Cas9蛋白体外孵育组装成Cas9/sgRNA蛋白复合物；
四、将步骤三组装的多个Cas9/sgRNA蛋白复合物混匀后转染到目的细胞中；
五、目的细胞培养24-48h小时后，检测细胞基因敲除效率。
本发明的有益效果为：
本发明针对靶向目的基因的位置约上下游50bp的序列范围设计多个高效sgRNA(3-6个)，结合Cas9蛋白进行基因编辑细胞转染实验。基因编辑效率的高低与所使用的sgRNA具有显著相关性。单个sgRNA的基因敲除效率是固定且有限的。同时导入多个sgRNA(已验证均具有较高的基因敲除效率)，这样可以使得不同的sgRNA同时进入细胞中，并在目的基因附近均可同时发生基因敲除，从而提高基因敲除效率。
附图说明
图1为NCBI检索图；
图2为PCR引物和sgRNA设计的示意图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式一种用于提高基因敲除效率的方法，按以下步骤进行：
一、针对目的基因序列片段设计5-15个候选的sgRNA，然后分别进行合成，得到5-15组sgRNA，将各组sgRNA与Cas9蛋白共转到细胞中，转染后24h-48h提取各组sgRNA的细胞基因组进行测序分析，检测每个候选sgRNA的基因编辑效率；
二、筛选sgRNA浓度大于1ug/uL、编辑效率大于30％的sgRNA，按编辑效率由高至低的顺序选出3-6个sgRNA；
三、将步骤二选出的3-6个sgRNA分别与Cas9蛋白体外孵育组装成Cas9/sgRNA蛋白复合物；
四、将步骤三组装的多个Cas9/sgRNA蛋白复合物混匀后转染到目的细胞中；
五、目的细胞培养24-48h小时后，检测细胞基因敲除效率。
本实施方式的有益效果为：本实施方式针对靶向目的基因的位置约上下游50bp的序列范围设计多个高效sgRNA(3-6个)，结合Cas9蛋白进行基因编辑细胞转染实验。基因编辑效率的高低与所使用的sgRNA具有显著相关性。单个sgRNA的基因敲除效率是固定且有限的。同时导入多个sgRNA(已验证均具有较高的基因敲除效率)，这样可以使得不同的sgRNA同时进入细胞中，并在目的基因附近均可同时发生基因敲除，从而提高基因敲除效率。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：目的基因序列片段为目的基因位点前50bp-目的基因位点后50bp。其他与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：目的基因序列片段为BCL11A基因第58号增强子序列。其他与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中合成sgRNA的方法为体外制备。其他与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：体外制备sgRNA的方法为：使用sgRNA体外转录试剂盒制备和纯化sgRNA。其他与具体实施方式一至四之一相同。本实施方式中的sgRNA体外转录试剂盒为赛默飞的Precision gRNA SynthesisKit(货号：A29377)。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤一中合成sgRNA的方法为化学合成。其他与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤四中将多个Cas9/sgRNA蛋白复合物按照等体积、等浓度混合。其他与具体实施方式一至六之一相同。
为验证本发明的有益效果进行了以下实验：
实施例：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对患者自体核移植胚胎干细胞的BCL11A的+58红系增强子序列进行基因敲除：
背景概述：人体内有三种携带氧气的蛋白，有肌红蛋白，胎红蛋白，血红蛋白。胎红蛋白的氧结合能力比血红蛋白要强，它只在婴儿时期大量表达，方便婴儿通过胎盘从母体里面获得更多的氧气。当婴儿长大到一岁后，人体内基因调控开始进行，胎红蛋白表达受到抑制，血红蛋白开始大量表达。因为血红蛋白的氧运输能力更强，所以更利于成人的正常生活。而β地贫患者或镰刀状细胞贫血症患者，他的血红蛋白的基因发生了变异，导致氧运输能力出现异常，从而引发各种并发症。我们的思路就是利用基因编辑技术重新开放患者的胎红蛋白的表达。通过最近研究发现，形成胎红蛋白的γ蛋白被BCL11A基因抑制了，研究者对BCL11A基因进行了大量实验研究，证实了作为转录抑制因子的BCL11A对胎儿血红蛋白(Hb F)的表达有直接负性调控作用，尤其是抑制Hb F的表达。虽然BCL11A基因的结构缺陷会导致胚胎死亡和淋巴细胞发育受损，但是在红细胞中特异表达的BCL11A基因存在缺陷则会抵消对Hb F基因的沉默作用从而提升Hb F水平，进而缓解镰刀状细胞贫血症和地中海贫血的临床症状。体细胞核移植(SCNT)技术是将体细胞的细胞核移植至去核的卵母细胞中，培养得到遗传特性与供体高度一致的胚胎干细胞系。自体核移植干细胞建系指利用SCNT技术建立全能胚胎干细胞系(ES)，并已在猪、牛、猴的动物模型上取得了成功。YoungGieChung(郑永基)等人在2014年实现世界上首次利用35岁和75岁成年人的体细胞建立自体核移植细胞系。人自体核移植建系的成功为多种目前无药可治的疾病带来了希望。我们的方案是利用基因编辑技术对患者的自体核移植干细胞的BCL11A基因的+58红系增强子序列进行敲除，就可以降低BCL11A基因的表达。BCL11A表达降低后，γ蛋白表达量就提高了，胎红蛋白的表达就被成功打开，从而实现患者的疾病治疗。由于我们基因编辑的位点是BCL11A基因的红系特异增强子位置，并不会对淋巴细胞分化、成熟过程产生影响。我们对β地贫患者的自体核移植干细胞系进行BCL11A基因敲除后，可用于将来的造血干细胞分化实验，为缓解镰刀状细胞贫血症和地中海贫血患者提供一个细胞移植替代治疗的途径。
实验目的：
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对患者自体核移植胚胎干细胞的BCL11A的+58红系增强子序列进行基因敲除,重新开放β地贫患者或镰刀状细胞贫血症患者胎红蛋白的表达，可用于将来的造血干细胞分化实验，为患者提供一个细胞移植替代治疗的途径。
实验步骤：
一、靶向+58红系增强子序列的sgRNA设计与合成：
(1)通过NCBI检索，下载BCL11A基因的全长序列，长度为109332bp，位于2号染色体上(检索图见图1)。
(2)通过在线sgNRA设计网站httpchopchop.cbu.uib.no和httpssg.idtdna.com进行预测有效的sgRNA。通过文献调研，确定了BCL11A的+58红系增强子的序列。并且通过在线sgNRA设计网站httpchopchop.cbu.uib.no和httpssg.idtdna.com进行预测有效的sgRNA。根据预测结果，从中挑选出评分较优的sgRNA序列。
(3)候选sgRNA的确定与基因组上下游PCR引物设计：
如图2所示，图2为sgRNA和PCR引物设计示意图，其中BCL+58F和BCL+58R为PCR引物，sgRNA序列中的sg1-0、sg7-0、sg41、sg42、sg43、sg44、sg45、sg46、sg47、sg48、sg2、sg3、sg4、sg5、sg8-0、sg6-0均来自公开文献，sg21、sg22、sg23、sg24、sg25、sg26、sg27、sg28、sg29、sg30、sg31、sg32来自sgRNA设计网站httpchopchop.cbu.uib.no，sg11-16来自sgRNA设计网站httpchopchop.cbu.uib.no。根据文献中记载的编辑效率和网站预测评分从高到低，从上述sgRNA序列中挑选出6个候选sgRNA，其中包括：sg42，sg2，sg11，sg14，sg31，sg16。
使用GeneArtTMPrecision gRNA Synthesis Kit进行sgRNA片段的体外制备，并将纯化后的sgRNA产物冻存于-80℃冰箱备用。
二、Cas9蛋白：直接采购商业化的Cas9蛋白(ThermoFisher Scientific)。
三、细胞准备与细胞培养：
(1)293T细胞的培养；
(2)患者的自体核移植胚胎干细胞的培养；
四、高效sgRNA的筛选：
(1)将sgNRA和Cas9蛋白分别体外孵育组装。
(2)利用电穿孔转染仪转染到步骤三培养的293T细胞中。
(3)转染后细胞培养24小时。
(4)利用提基因组试剂盒提取各组细胞样品的基因组。
(5)利用设计好的基因组PCR引物对各组基因组进行PCR扩增，引物序列见下表：
(6)基因组PCR产物纯化和送至生物公司进行测序。
(7)通过测序结果筛选出编辑效率较高的sgRNA。
五、多个高效sgRNA与Cas9蛋白孵育与细胞的转染：
(1)将步骤四筛选出的高效sgRNA分别与Cas9蛋白体外组装。
(2)组装后等比例混匀即可得到多重sgRNA/Cas9蛋白复合物。
(3)将多重sgRNA/Cas9蛋白复合物，利用电穿孔转染法转染到步骤三培养的患者的自体核移植胚胎干细胞中。
(4)按照步骤四中的3-6的方法进行基因敲除效率的测序验证。
本实施例导入多个sgRNA(已验证均具有较高的基因敲除效率)，这样可以使得不同的sgRNA同时进入细胞中，并在目的基因附近均可同时发生基因敲除，从而提高基因敲除效率。
序列表
<110>珠海横琴爱姆斯坦生物科技有限公司
<120>一种用于提高基因敲除效率的方法
<160>14
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
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<210>8
<211> 34
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物BCL-T7-sg14-R的核苷酸序列。
<400> 8
TTCTAGCTCTAAAACATGGAGAGGTCTGCCAGTC 34
<210>9
<211> 36
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物BCL-T7-sg31-F的核苷酸序列。
<400> 9
TAATACGACTCACTATAGTGGGTGGGGTAGAAGAGG 36
<210>10
<211> 34
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物BCL-T7-sg31-R的核苷酸序列。
<400> 10
TTCTAGCTCTAAAACGTCCTCTTCTACCCCACCCA 34
<210>11
<211> 36
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物BCL-T7-sg16-F的核苷酸序列。
<400> 11
TAATACGACTCACTATAGAAGGGTTTGGCCTCTGAT 36
<210>12
<211> 34
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物BCL-T7-sg16-R的核苷酸序列。
<400> 12
TTCTAGCTCTAAAACAATCAGAGGCCAAACCCTT 34
<210>13
<211> 36
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物BCL-T7-sg42-F的核苷酸序列。
<400> 13
TAATACGACTCACTATAGCTAACAGTTGCTTTTATC 36
<210>14
<211> 35
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物BCL-T7-sg42-R的核苷酸序列。
<400> 14
TTCTAGCTCTAAAACGTGATAAAAGCAACTGTTAG 35
Claims (7)
1.一种用于提高基因敲除效率的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、针对目的基因序列片段设计5-15个候选的sgRNA，然后分别进行合成，得到5-15组sgRNA，将各组sgRNA与Cas9蛋白共转到细胞中，转染后24h-48h提取各组sgRNA的细胞基因组进行测序分析，检测每个候选sgRNA的基因编辑效率；
二、筛选sgRNA浓度大于1ug/uL、编辑效率大于30％的sgRNA，按编辑效率由高至低的顺序选出3-6个sgRNA；
三、将步骤二选出的3-6个sgRNA分别与Cas9蛋白体外孵育组装成Cas9/sgRNA蛋白复合物；
四、将步骤三组装的多个Cas9/sgRNA蛋白复合物混匀后转染到目的细胞中；
五、目的细胞培养24-48h小时后，检测细胞基因敲除效率。
2.根据权利要求1所述的一种用于提高基因敲除效率的方法，其特征在于目的基因序列片段为目的基因位点前50bp-目的基因位点后50bp。
3.根据权利要求1所述的一种用于提高基因敲除效率的方法，其特征在于目的基因序列片段为BCL11A基因第58号增强子序列。
4.根据权利要求1所述的一种用于提高基因敲除效率的方法，其特征在于步骤一中合成sgRNA的方法为体外制备。
5.根据权利要求4所述的一种用于提高基因敲除效率的方法，其特征在于体外制备sgRNA的方法为：使用sgRNA体外转录试剂盒制备和纯化sgRNA。
6.根据权利要求1所述的一种用于提高基因敲除效率的方法，其特征在于步骤一中合成sgRNA的方法为化学合成。
7.根据权利要求1所述的一种用于提高基因敲除效率的方法，其特征在于步骤四中将多个Cas9/sgRNA蛋白复合物按照等体积、等浓度混合。
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