CN114262709A

CN114262709A - 含有trem2突变基因的类小胶质细胞系、小鼠模型及其构建方法

Info

Publication number: CN114262709A
Application number: CN202111617586.2A
Authority: CN
Inventors: 唐毅; 秦琪; 韦玉生; 李沉简
Original assignee: Xuanwu Hospital
Current assignee: Xuanwu Hospital
Priority date: 2021-12-27
Filing date: 2021-12-27
Publication date: 2022-04-01

Abstract

本申请涉及一种含有TREM2突变基因的类小胶质细胞系、小鼠模型及其构建方法。含有TREM2突变基因的类小胶质细胞系构建方法包括：取含有核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示的TREM2突变基因的皮肤组织细胞，利用转录因子进行培养，诱导得到多能干细胞；之后分化成早期原始造血细胞；再分化成类小胶质细胞系。含有TREM2突变基因的小鼠模型是采用CRISPR/Cas9系统构建，步骤包括：将含有Cas9 mRNA、sgRNA和TREM2突变基因的单链寡核苷酸显微注射至小鼠受精卵中，再移植到鼠输卵管内进行孕育，出生的小鼠即为含有TREM2突变基因的小鼠模型。本申请提供的类小胶质细胞系便于体外研究TREM2通过类小胶质细胞在AD病理过程中产生作用的原因，小鼠模型的建立便于体内研究TREM2突变对AD病理过程的作用机制。

Description

含有TREM2突变基因的类小胶质细胞系、小鼠模型及其构建方法

技术领域

本申请属于基因工程技术领域，具体涉及一种含有TREM2突变基因的类小胶质细胞系、小鼠模型及其构建方法。

背景技术

阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease，AD)是目前影响人类健康的主要神经退行性疾病，其典型表现为认知功能的缓慢进行性丧失。因其发病与年龄密切相关，且多发于老人；故随着社会人口的老龄化，发病率会越来越高。美国每800万人口就有2047位AD患者，中国的AD患病人群也有600-1000万人。然而，到目前为止人类还没有治疗该病的有效措施。

研究发现，APP，PSEN1，PSEN2的基因变异和APOE的基因分型与AD的发生有很大关系。近年来通过GWAS研究发现髓系细胞2中表达触发受体(TREM2)基因发生变异后，AD的风险也会增高。TREM基因簇位于6号染色体p21.1，包含4个TREM基因(TREM1，TREM2，TREM4，TREM5)和两个TREM样的基因(TREML1，TREML2)。TREM2是髓系细胞细胞膜上的免疫球蛋白家族跨膜蛋白，在中枢神经系统中只表达在小胶质细胞上。小胶质细胞是脑内的巨噬细胞，在非特异免疫中发挥着关键作用，比如修剪突触，清除凋亡神经元等。在神经退行性疾病中，如在应对疾病特异性物质Aβ刺激时，稳态小胶质细胞通过两步激活为疾病相关小胶质细胞(DAM)，其中第二步依赖TREM2的正常功能。这近一步揭示小胶质细胞可能在AD的发生发展过程中起到重要作用，但仍难以深入探究TREM2在AD中发挥的作用。

发明内容

本申请的目的是提供一种含有TREM2突变基因的类小胶质细胞系、小鼠模型及其构建方法，以便于深入研究TREM2在AD病理过程中产生的作用。

为实现上述目的，本申请采用如下技术方案：

本申请第一方面提供了一种TREM2突变基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。

本申请第二方面提供了一种重组载体，其包含本申请第一方面所述的TREM2突变基因。本申请对于构建重组载体时采用的载体的种类不做特别的限制，只要能够实现本申请的目的。

本申请第三方面提供了一种含有TREM2突变基因的类小胶质细胞系的构建方法，包括步骤：S1、取含有本申请第一方面所述的TREM2突变基因的皮肤组织细胞，利用转录因子进行培养，诱导得到多能干细胞；S2、将所述多能干细胞分化成早期原始造血细胞；S3、将所述早期原始造血细胞分化成类小胶质细胞系。

在本申请的一些实施方式中，步骤S1中，所述转录因子选自Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc中的至少一种；步骤S2中，所述分化是在含造血分化因子的培养基中进行分化；步骤S3中，所述分化是在含有CSF-1、IL-34和TGFβ1的无血清分化培养基中进行分化。

本申请第四方面提供了一种本申请第三方面所述的方法构建得到的含有TREM2突变基因的类小胶质细胞系。

本申请第五方面提供了一种含有TREM2突变基因的小鼠模型的构建方法，所述含有TREM2突变基因的小鼠模型是采用CRISPR/Cas9系统进行构建，包括：将含有Cas9 mRNA、sgRNA和本申请第一方面所述的TREM2突变基因的单链寡核苷酸显微注射至小鼠的受精卵中，之后移植到假孕鼠输卵管内进行孕育，出生的小鼠即为所述含有TREM2突变基因的小鼠模型。

在本申请的一些实施方式中，所述TREM2突变基因的单链寡核苷酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

在本申请的一些实施方式中，所述Cas9 mRNA、所述sgRNA和本申请第一方面所述的TREM2突变基因的单链寡核苷酸的质量比为1：(0.4-0.6)：(0.4-0.6)；制备所述sgRNA时，采用的单链序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

本申请第六方面提供了本申请第五方面所述的方法构建得到的含有TREM2突变基因的小鼠模型。

本申请第七方面提供了本申请第一方面所述的TREM2突变基因、本申请第二方面所述的重组载体、本申请第四方面所述的含有TREM2突变基因的类小胶质细胞系或本申请第六方面所述的含有TREM2突变基因的小鼠模型在研究TREM2在阿尔茨海默病中的作用机制中的应用。

本申请提供的技术方案，具有如下的有益效果：

本申请采用的含有TREM2突变基因的皮肤组织细胞，可以诱导出多能干细胞，近一步分化为类小胶质细胞，从而获得携带TREM2突变基因的MUT细胞系；该类小胶质细胞细胞系的建立将更好的模拟人体内的病理过程，便于体外研究TREM2通过类小胶质细胞在AD病理过程中产生作用的原因。

本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请实施例1中的含有TREM2突变基因的类小胶质细胞系的构建方法的流程示意图；

图2为本申请实施例1中iPSC分化为iHPCs的方法的流程示意图。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本申请的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本申请的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

目前针对TREM2在AD病理过程中发挥作用的模型主要应用的是通过人为敲除TREM2基因的小鼠模型，或者通过CRISPR/Cas9或BAC方法构建携带TREM2基因R47H突变的小鼠模型，探究的模型较为单一，不能很好的模拟病人的发病机制。

本申请始于本团队接诊的一位早发AD病人，进行全基因组测序后，发现患者存在一种首次发现的TREM2基因起始密码子突变。由此，发明人通过获取患者与正常对照组1-4mm正常皮肤组织，诱导出多能干细胞，近一步分化为类小胶质细胞，获得了携带病人TREM2基因突变的MUT细胞系，通过CRISPR/Cas9系统构建的TREM2敲除KO细胞系，以及正常对照细胞系。该类小胶质细胞细胞系的建立便于体外研究TREM2通过小胶质细胞在AD病理过程中产生作用的原因，本申请的靶点TREM2可以用于治疗阿尔茨海默症的研究中。

再者，本申请发明人构建了相应的小鼠模型，便于在体内探索TREM2在AD中的作用机制。本动物模型利用FVB背景的小鼠，通过CRISPR/Cas9系统，构建出与患者相同的TREM2单碱基起始密码子突变的TREM2 MUT小鼠模型及TREM2敲除的TREM2 KO小鼠模型。本申请提供了一种有效研究TREM2在AD发病机制研究的在体研究模型。

下面结合具体实施例对本申请的技术方案做进一步的说明。

实施例1

材料：含有核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示的TREM2突变基因的皮肤组织细胞、含有正常TREM2基因的皮肤组织细胞。

如图1所示，本实施例提供了一种含有TREM2突变基因的类小胶质细胞系的构建方法，包括如下步骤。

S1：表皮细胞诱导分化为多能干细胞(induced pluripotent stem cell，下文简称为iPSC)

将含有核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示的TREM2突变基因的皮肤组织细胞、含有正常TREM2基因的皮肤组织细胞，分别在包括4个转录因子Oct4、Klf4、Sox2及c-Myc的细胞培养液中进行培养，诱导出具有类似胚胎干细胞生物学特征的多能性的细胞，即iPSC。

S2：iPSC分化成早期原始造血细胞(下文简称为iHPCs)如图2所示，将iPSC在含造血分化因子的化学培养基中进行分化，第0天至第4天采用5vol％O₂，第4天至第10天采用20vol％O₂，第0天时加入因子FGF2、BMP4、Activin A和LiCl，第2天加入因子FGF2、VEGF，第4天加入因子FGF2、VEGF、TPO、SCF、IL3、IL6。10天后，通过流式细胞分选技术筛选出10天后产生原始的CD43+/CD235a+/CD41+iHPCs。

S3：iHPCs分化成类小胶质细胞系(microglia-like cell，下文简称为iMGL)

CD43+iHPCs在含CSF-1、IL-34和TGFβ1的无血清分化培养基(室内配制)中生长，并在此过程中每四天流式分选一次细胞。

第14天，细胞表达PU.1和TREM2基因代表该细胞向小胶质细胞样转化。第14天早期iMGL为c-kit/CD45+，提示可能与髓系谱系有关。还可以进一步细分为CD45+/CX3CR1-(A1)和CD45+/CX3CR1+(A2)群体，类似于发育中的类小胶质细胞祖细胞。在发展中的iMGL中持续监测CD45表达，并与单核细胞来源的巨噬细胞进行比较。

第38天，通过cytospin/Giemsa染色，得到的iMGL类似于人小胶质细胞，但不是单核细胞或巨噬细胞，并表达许多其他小胶质细胞富集的蛋白，包括MERTK、ITGB5、CX3CR1、TGFbR1和PROS1，并且在形态上产生更多分枝。

本申请所述的方法，能从100万个iPSC中产生3000万至4000万iMGL，且在分化过程中，维护了基因组的完整性。

本申请所述的方法可以构建得到三种细胞系，分别为：包括TREM2突变基因的MUT细胞系、TREM2 KO细胞系和正常对照细胞系。

其中，包括TREM2突变基因的MUT细胞系包括如序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，具体为aagcagctgacctttactgtagaagcctcctttccttcctccctccctcacgcccttctccctccttgaatcacagcgcctaccctagtcctgactgttgctcaatccaggagcacagttcctgtgggctgagcctgactggcttggtcatctcttttctgcacttcaagggaaaagcaagatcttgcacaaggtcccctccggctggctgctggcaaaggaaaggtgccataggacctctccaccagtttctcctgctgctgatcacaggtgggaccacaggagggacctaccttcagcaacactgtcttttcctcaccttccttgagcagatggctggggtgtgggggcagggtggcatggagggggaactattatggaggctggagtcctggtacactccagtgtc。

正常对照细胞系包括如序列表SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，具体为：aagcagctgacctttactgtagaagcctcctttccttcctccctccctcacgcccttctccctccttgaatcacagcgcctaccctagtcctgactgttgctcaatccaggagcacagttcctgtgggctgagcctgactggcttggtcatctcttttctgcacttcaagggaaaagcaagatcttgcacaaggtcccctccggctggctgctggcaaaggaaaggtgccatgggacctctccaccagtttctcctgctgctgatcacaggtgggaccacaggagggacctaccttcagcaacactgtcttttcctcaccttccttgagcagatggctggggtgtgggggcagggtggcatggagggggaactattatggaggctggagtcctggtacactccagtgtc。

TREM2 KO细胞系包括如序列表SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，具体为：aagcagctgacctttactgtagaagcctcctttccttcctccctccctcacgcccttctccctccttgaatcacagcgcctaccctagtcctgactgttgctcaatccaggagcacagttcctgtgggctgagcctgactggcttggtcatctcttttctgcacttcaagggaaaagcaagatcttgcacaaggtcccctccggctggctgctggcaaaggaaaggtgccatggacctctccaccagtttctcctgctgctgatcacaggtgggaccacaggagggacctaccttcagcaacactgtcttttcctcaccttccttgagcagatggctggggtgtgggggcagggtggcatggagggggaactattatggaggctggagtcctggtacactccagtgtc。

本申请涉及一种阿尔茨海默病的关键风险基因TREM2基因，利用新的TREM2基因起始密码子突变，构建了相应类小胶质细胞系。相比于传统的基于TREM2 KO或TREM2 R47H模型，本申请有着全新的基因突变位点，并且相比于传统的体外细胞培养，iPSC分化的类小胶质细胞更接近人体内的细胞，本申请为探究TREM2通过调节小胶质细胞在AD发生发展过程中的作用机制提供了更好的体外研究模型；并且本申请有助于AD潜在治疗靶点的研究，本申请的靶点TREM2可以用于治疗阿尔茨海默症的研究中。

实施例2

本实施例提供了一种含有TREM2突变基因的小鼠模型的构建方法，包括如下步骤。

S1：sgRNA的制备

1、sgRNA设计与合成：利用鼠TREM2基因组信息，设计合成CRISPR系统所用gRNA单链序列。

TREM2 gRNA2 F：TAGG TGCACAAGGTCCCCTCCGGC(SEQ ID No.3)。

TREM2 gRNA2 R：AAAC GCCGGAGGGGACCTTGTGCA(SEQ ID No.4)。

2、单链寡核苷酸退火复性。

3、pUC57-sgRNA质粒构建，包括如下步骤：1)pUC gRNA质粒结扎，加水至20μL，37℃孵育2小时，偶尔摇匀。2)用PCR纯化试剂盒纯化消化产物。3)用bsai酶切的pUC57-sgRNA连接退火寡聚体。4)在Kan+平板(50g/mL)上进行转化和平板。5)M13-47引物测序，确认sgRNA寡聚体正确插入。6)新鲜转化pUC57-gRNA质粒，取克隆到15-18mL LB培养基中。

S2：体外转导sgRNAs

(I)gRNA转录

1、酶消化，包括：将sgRNA质粒与Dra I配对；加水至120μL，37℃孵育3-4小时，偶尔摇匀；检测质粒经凝胶电泳完全消化，在1％琼脂糖凝胶中装入2μL，观察到两个条带(1621和1152bp)。

2、RNA保护：加入4μL RNAsecure，在60℃恒温箱中孵育10分钟。

3、纯化：用MinElute PCR Purification Kit试剂盒(货号28006)，将5体积缓冲PB加入1体积消解液中，搅拌均匀；将MinElute色谱柱转移到2mL收集管中，并离心13000rpm，1分钟，弃掉流动；加入750缓冲PE，然后13000rpm离心1分钟，丢弃流动，再13000rpm离心1分钟，减少残留乙醇；将色谱柱放入新的1.5mL试管中，加入10μL无核酸酶水，保持至少1min，离心13000rpm，1分钟用于DNA提取；4μg的DNA将被回收。

(II)sgRNAs体外转录

利用MEGAshortscript^TMKit(试剂盒：MEGAshortscript^TMT7 Transcription Kit，货号AM1354)，在37℃的水浴或热循环器中孵育反应4-8h；加入1.5μL TURBO Dnase，37℃孵育15min，去除DNA模板。

(III)纯化sgRNAs

采用MEGAclear^TMKit(试剂盒MEGAclear kit，货号：AM1908，公司LifeTechnologies)。用洗脱液将RNA样品带入100μL，轻且彻底地搅拌；在样品中加入350μL的结合液浓缩液，用移液管轻轻搅拌。在样品中加入250μL 100％乙醇。用移液管轻轻搅拌；将滤芯插入所提供的其中一个收集和洗脱管中，将RNA混合物移液管移入滤芯中；在RCF 10000-15000g(通常10000-14000rpm)下离心15秒至1分钟；弃用2×500μL洗涤液，弃用洗涤液后，继续离心或将滤芯留在真空歧管上10-30秒，以去除最后残留的洗涤液；将洗脱液50μL预热95℃至滤芯中心，室温RCF 10000-15000×g离心1分钟洗脱RNA；加入另一预热95℃的洗脱液50μL，离心至复配；将1：10体积的5M乙酸铵(NH₄Ac)加入纯化的RNA中并混合；加入2.5体积乙醇，混合均匀，-20℃孵育至少30分钟；在4℃或RT下以最高速度离心15分钟；去除上清液，用500μL70％乙醇洗涤，再次离心，去除最后痕量上清液；空气干燥颗粒(5min)；用50μL游离RNAse水重新悬浮颗粒；使用一滴OD-1000+分光光度计评估sgRNA的收率；凝胶电泳评价sgRNA质量。RNA装载在DNA装载缓冲液中，并在1％琼脂糖凝胶(180V，10分钟)上运行。

S3：Cas9体外转录

(I)Cas9转录模板的准备

1、酶消化：用NheI消化hCas9-polyA(72602)质粒，并纯化消化产物；加水至120μL，37℃孵育3小时，偶尔摇匀。检测质粒经凝胶电泳完全线性化，在1％琼脂糖凝胶中装入2μL。没有必要对含有sgRNA序列的条带进行凝胶纯化。

2、RNA保护：加入5μL RNAsecure，在60℃恒温箱中孵育10分钟。

3、纯化：采用MinElute PCR纯化试剂盒。将5体积缓冲PB加入1体积消解液中，搅拌均匀；在提供的2mL收集管中转移到MinElute色谱柱，并13000rpm离心1分钟，弃掉流动；加入750μL缓冲PE，然后13000rpm离心1分钟，丢弃流动，再13000rpm离心1分钟，以减少残留乙醇；将色谱柱放入新的1.5mL试管中，加入10μL无核酸酶水，保持至少1min，13000rpm离心1分钟，用于DNA提取；4-8μg DNA被回收。

(II)体外转录Cas9(试剂盒：mMESSAGE

T7 ΜLtra试剂盒)

1、封端转录反应组装

1)解冻冷冻试剂：将RNA聚合酶混合酶放在冰上，储存在甘油中且不会在-20℃下冷冻。漩涡10×T7反应缓冲和T7 2×NTP/ARCA，直到它们完全在溶液中。一旦解冻，将T7核糖核酸(2×NTP/ARCA)储存在冰上，但在组装反应时将10×T7反应缓冲液保持在室温。

2)在室温下组装转录反应：在水和核糖核酸已经在管中之后加入10×T7反应缓冲液。一次加入以下成分：至20μL无核酸酶水；10μLT7 2×NTP/ARCA；2μL 10×T7反应缓冲液；0.1-1μg线性模板

2μL T7混合酶；用0.1-0.2μg PCR模板或约1μg线性化质粒模板。

3)彻底混合：用管或移液管轻轻地上下轻弹混合物，然后用微滤管快速收集管底的反应混合物。

4)37℃孵育2小时：在1小时的孵育后，产量可达到80％。为了获得最大产量，进行2小时培养。

5)加入1μLTURBO DNase，混合均匀，37℃孵育15分钟。

2、Poly(A)跟踪过程

1)添加尾试剂：在20μL mMESSAGE

T7 ΜLtra反应中依次添加尾试剂，如下：36μL无核酸酶水；20μL5×E-PAP缓冲液；10μL 25mM MnCl₂溶液；10μL ATP溶液。

2)保留2.5μL的反应混合物：在加入E-PAP酶前去除反应混合物2.5μL；这种负酶控制将在靠近尾RNA的凝胶上运行实验。

3)加入4μL E-PAP，轻轻混合，最终反应体积为100μL。

4)37℃孵育30-45分钟，置冰。

3、纯化Cas9 mRNA(试剂盒：MinElute PCR Purification Kit，货号28006，Qiagen公司)：根据说明书纯化Cas9 mRNA；用一滴OD-1000+分光光度计(或等效的)评估sgRNA的产量，用凝胶电泳评估sgRNA的质量。RNA装载在DNA装载缓冲液中，并在1％琼脂糖凝胶(180V，10分钟)上运行。得到约40g RNA，每只约1μg，在液氮中快速冷冻，-80℃保存。

(III)突变寡核苷酸模板的合成

合成突变寡核苷酸单链作为DNA模板：CCTCCTGTGGTCCCACCTGTGATCAGCAGCAGGAGAAACTGGTGGAGAGGTCCTATGGCACCTTTCCTTTGCCAGCAGCCAGCCGGAGGGGAC(序列表SEQ ID No.2所示)。

S4：受精卵的显微注射

1、4周龄FVB雌鼠，于第一天16：00-17：00PM，注射5U PMSG(苏州三生)，第三天16：00-17：00PM，注射5U HCG，与种鼠合笼。

2、第二天早上挑取见精栓雌鼠，取输卵管，M2(Sigma M7167)溶液中划破膨大部取出卵丘，300μg/mL透明质酸酶(sigma H3884)中消化2-3分钟分离出单个受精卵，M2洗-4-5遍，移入M16培养液(Sigma M7292)，CO₂孵箱培养。

3、注射核酸混合：将Cas9 mRNA：gRNA：ssODN按照终浓度100：50：50ng/μL用RNaseFree的水配成30μL混合液，用于注射。

4、挑选受精卵，利用Olympus显微操作系统和Eppendorf电动气压注射泵和注射系统，将核酸混合液注入到受精卵胞质。

5、注射后存活状态好的受精卵25个/只，移植到假孕鼠输卵管内，做好记录，待出生。

S5：小鼠基因型鉴定

1、出生后10-14天小鼠，剪尾，消化组织。

2、PCR扩增突变位点附近片段，连接T载体测序，以确定突变基因型。

本实施例得到三种小鼠模型，分别包括如下序列：

(1)TREM2 MUT小鼠模型包括如序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，具体为：aagcagctgacctttactgtagaagcctcctttccttcctccctccctcacgcccttctccctccttgaatcacagcgcctaccctagtcctgactgttgctcaatccaggagcacagttcctgtgggctgagcctgactggcttggtcatctcttttctgcacttcaagggaaaagcaagatcttgcacaaggtcccctccggctggctgctggcaaaggaaaggtgccatgggacctctccaccagtttctcctgctgctgatcacaggtgggaccacaggagggacctaccttcagcaacactgtcttttcctcaccttccttgagcagatggctggggtgtgggggcagggtggcatggagggggaactattatggaggctggagtcctggtacactccagtgtc。

(2)野生型小鼠模型包括如序列表SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，具体为：aagcagctgacctttactgtagaagcctcctttccttcctccctccctcacgcccttctccctccttgaatcacagcgcctaccctagtcctgactgttgctcaatccaggagcacagttcctgtgggctgagcctgactggcttggtcatctcttttctgcacttcaagggaaaagcaagatcttgcacaaggtcccctccggctggctgctggcaaaggaaaggtgccataggacctctccaccagtttctcctgctgctgatcacaggtgggaccacaggagggacctaccttcagcaacactgtcttttcctcaccttccttgagcagatggctggggtgtgggggcagggtggcatggagggggaactattatggaggctggagtcctggtacactccagtgtc。

(3)TREM2 KO小鼠模型包括如序列表SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，具体为：aagcagctgacctttactgtagaagcctcctttccttcctccctccctcacgcccttctccctccttgaatcacagcgcctaccctagtcctgactgttgctcaatccaggagcacagttcctgtgggctgagcctgactggcttggtcatctcttttctgcacttcaagggaaaagcaagatcttgcacaaggtcccctccggctggctgctggcaaaggaaaggtgccatggacctctccaccagtttctcctgctgctgatcacaggtgggaccacaggagggacctaccttcagcaacactgtcttttcctcaccttccttgagcagatggctggggtgtgggggcagggtggcatggagggggaactattatggaggctggagtcctggtacactccagtgtc。

本申请利用发现全新的TREM2基因起始密码子突变，通过CRISPR/Cas9系统构建了模拟突变的相应的全新的小鼠模型，即TREM2 MUT小鼠模型及TREM2敲除的TREM2 KO小鼠模型；该体内模型的将更好的模拟人体内的病理过程，研究TREM2在AD发生发展过程中的机制，并可能在AD的治疗与研究中起到重要作用。相比于传统的基于TREM2 KO或TREM2 R47H模型，不能很好的模拟病人的发病机制；本申请有着全新的基因突变位点，该位点为探究TREM2通过调节小胶质细胞在AD发生发展过程中的作用机制提供了更好的模型，有助于AD潜在治疗靶点的研究。

以上仅是本申请的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的发明内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 首都医科大学宣武医院

<120> 含有TREM2突变基因的类小胶质细胞系、小鼠模型及其构建方法

<130> 2

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 409

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aagcagctga cctttactgt agaagcctcc tttccttcct ccctccctca cgcccttctc 60

cctccttgaa tcacagcgcc taccctagtc ctgactgttg ctcaatccag gagcacagtt 120

cctgtgggct gagcctgact ggcttggtca tctcttttct gcacttcaag ggaaaagcaa 180

gatcttgcac aaggtcccct ccggctggct gctggcaaag gaaaggtgcc ataggacctc 240

tccaccagtt tctcctgctg ctgatcacag gtgggaccac aggagggacc taccttcagc 300

aacactgtct tttcctcacc ttccttgagc agatggctgg ggtgtggggg cagggtggca 360

tggaggggga actattatgg aggctggagt cctggtacac tccagtgtc 409

<210> 2

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cctcctgtgg tcccacctgt gatcagcagc aggagaaact ggtggagagg tcctatggca 60

cctttccttt gccagcagcc agccggaggg gac 93

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

taggtgcaca aggtcccctc cggc 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaacgccgga ggggaccttg tgca 24

<210> 5

<211> 409

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aagcagctga cctttactgt agaagcctcc tttccttcct ccctccctca cgcccttctc 60

cctccttgaa tcacagcgcc taccctagtc ctgactgttg ctcaatccag gagcacagtt 120

cctgtgggct gagcctgact ggcttggtca tctcttttct gcacttcaag ggaaaagcaa 180

gatcttgcac aaggtcccct ccggctggct gctggcaaag gaaaggtgcc atgggacctc 240

tccaccagtt tctcctgctg ctgatcacag gtgggaccac aggagggacc taccttcagc 300

aacactgtct tttcctcacc ttccttgagc agatggctgg ggtgtggggg cagggtggca 360

tggaggggga actattatgg aggctggagt cctggtacac tccagtgtc 409

<210> 6

<211> 408

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aagcagctga cctttactgt agaagcctcc tttccttcct ccctccctca cgcccttctc 60

cctccttgaa tcacagcgcc taccctagtc ctgactgttg ctcaatccag gagcacagtt 120

cctgtgggct gagcctgact ggcttggtca tctcttttct gcacttcaag ggaaaagcaa 180

gatcttgcac aaggtcccct ccggctggct gctggcaaag gaaaggtgcc atggacctct 240

ccaccagttt ctcctgctgc tgatcacagg tgggaccaca ggagggacct accttcagca 300

acactgtctt ttcctcacct tccttgagca gatggctggg gtgtgggggc agggtggcat 360

ggagggggaa ctattatgga ggctggagtc ctggtacact ccagtgtc 408

Claims

1.一种TREM2突变基因，其特征在于：所述TREM2突变基因的核苷酸序列如序列表SEQID No.1 所示。

2.一种重组载体，其特征在于：所述重组载体包含如权利要求1所述的TREM2突变基因。

3.一种含有TREM2突变基因的类小胶质细胞系的构建方法，其特征在于，包括步骤：S1、取含有权利要求1所述的TREM2突变基因的皮肤组织细胞，利用转录因子进行培养，诱导得到多能干细胞；S2、将所述多能干细胞分化成早期原始造血细胞；S3、将所述早期原始造血细胞分化成类小胶质细胞系。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤S1中，所述转录因子选自Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc中的至少一种；步骤S2中，所述分化是在含造血分化因子的培养基中进行分化；步骤S3中，所述分化是在含有CSF-1、IL-34和TGFβ1的无血清分化培养基中进行分化。

5.权利要求3或4所述的方法构建得到的含有TREM2突变基因的类小胶质细胞系。

6.一种含有TREM2突变基因的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述含有TREM2突变基因的小鼠模型是采用CRISPR/Cas9系统进行构建，包括：将含有Cas9 mRNA、sgRNA和权利要求1所述的TREM2突变基因的单链寡核苷酸显微注射至小鼠的受精卵中，之后移植到鼠输卵管内进行孕育，出生的小鼠即为所述含有TREM2突变基因的小鼠模型。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于：所述TREM2突变基因的单链寡核苷酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2 所示。

8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于：所述Cas9 mRNA、所述sgRNA和权利要求1所述的TREM2突变基因的单链寡核苷酸的质量比为1：（0.4-0.6）：（0.4-0.6）；制备所述sgRNA时，采用的单链序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

9.权利要求6-8任一项所述的方法构建得到的含有TREM2突变基因的小鼠模型。

10.权利要求1所述的TREM2突变基因、权利要求2所述的重组载体、权利要求5所述的含有TREM2突变基因的类小胶质细胞系或权利要求9所述的含有TREM2突变基因的小鼠模型在研究TREM2在阿尔茨海默病中的作用机制中的应用。