CN106318934B

CN106318934B - 胡萝卜β(1,2)木糖转移酶的基因全序列及用于转染双子叶植物的CRISPR/CAS9的质粒构建

Info

Publication number: CN106318934B
Application number: CN201610838271.3A
Authority: CN
Inventors: 李大伟; 荣荣; 胡凌云; 苏其达; 武正华; 周冰洁; 必思沃思
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2016-09-21
Filing date: 2016-09-21
Publication date: 2020-06-05
Anticipated expiration: 2036-09-21
Also published as: CN106318934A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及悬浮胡萝卜细胞基因组中β(1,2)木糖转移酶的基因全序列及其相应的用于转染双子叶植物的CRISPR/CAS9的质粒构建。本发明首次发现和确定了胡萝卜β(1,2)木糖转移酶的基因全序列，并针对此序列设计了两个有效的gRNA，合成相应的CRISPR/CAS9质粒，从而达到敲除悬浮胡萝卜细胞基因组中β(1,2)木糖转移酶的目的。本发明还发现β(1,2)木糖转移酶的基因序列中存在两段STR位点，这对于胡萝卜种属鉴定及其进化方面具有重大意义。

Description

胡萝卜β(1,2)木糖转移酶的基因全序列及用于转染双子叶植物的CRISPR/CAS9的质粒构建

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及悬浮胡萝卜细胞基因组中β(1,2)木糖转移酶的基因全序列及其相应的用于转染双子叶植物的CRISPR/CAS9的质粒构建。

背景技术

利用植物表达异源蛋白质是近三十年前才开始的技术。在1986年，第一个具有药理活性的蛋白，人类生长激素，被成功地通过转基因烟草表达出来。自那以后，各种各样的与人相关的蛋白通过不同种的植物被表达出来。从1989年第一个植物表达抗体的诞生到1992年第一个植物疫苗的出现，基因改造植物在生物学领域的地位逐步增高。

目前市面上较为成熟的蛋白表达体系有细菌表达、酵母、哺乳动物细胞以及转基因动物等。转基因植物与上述表达体系相比，不仅有着产物质量较高，污染风险低，储藏成本小等优点，而且在产能扩大方面远远优于上述其他体系。较低的场地、设备费用使其产物有着较高的价格优势。然而蛋白产量与质量的多变性、难以适应GMP规则、农药与肥料对植物的影响、害虫与疾病甚至当地的土壤与气候等因素限制了大规模生产的应用。在这方面，植物细胞培养既保留了上述生产方法的优点，又避免了实地种植所带来的不便。

植物细胞悬浮培养优点繁多，操作简便，被广泛的用于多方面的研究中。通过组培得到的细胞形态单一，材料方便易得，培养成本低廉，单一培养系统中较高的容纳量以及较好的重现性使得植物组织培养成为生物药生产的重要手段。然而其缺点也不容忽视。脱分化细胞因为其较硬的细胞壁和较大的尺寸而对剪切力十分敏感，这限制了大规模培养时的操作条件；另一方面，植物细胞悬浮培养需要添加植物生长因子，这些因子可能会使悬浮细胞发生体细胞克隆变异，从而改变被培养细胞的基因型。

在这其中，胡萝卜(Daucuscarota L.)由于有着相对容易的愈伤组织发生和较高的再生潜力而成为了这个领域中的模式植物。胡萝卜隶属伞形科，其主根富含维生素A，为人类摄取维生素A的主要来源。在生物制药领域，胡萝卜也是用途广泛。它为两年生植物，因此可以在其尚未结出种子的时候收获，这大大的提高了基因工程植物的生物安全性。除此之外，由于胡萝卜的主根本身可食用，因此源于植物中的有效成分可直接通过食用主根进行口服吸收，减少了其中的后续加工步骤。胡萝卜在植物分子农业领域中有着重要的地位，它也是第一个获得批准用于生产生物药的植物种类。到目前为止有众多形式的生物药物通过胡萝卜生产出来，其中包括抗体、疫苗、细胞因子和酶等。起源于上世纪80年代的分子农业在2012年终于完成了第一个由植物生产的人用药物的上市，这个用于治疗高歇氏病的葡糖脑苷脂酶便是由胡萝卜生产得到。此次成功预示着胡萝卜在生物药制备中的巨大前景。

利用悬浮胡萝卜细胞生产人源重组蛋白有着成本低，安全性高，可规模化等诸多优势。然而，哺乳动物细胞与植物细胞所分泌生产出的蛋白糖基化修饰结构不同。与其他真核细胞相同，植物细胞中新生蛋白N-糖基化起始于内质网腔内前体寡糖的共价连接，由寡糖转移酶复合物催化完成。如果新生蛋白通过分泌途径转运，则前体寡糖需要经过内质网和高尔基体中的一系列酶的修饰才能得到成熟的蛋白。其中高尔基体中的糖蛋白修饰正是人与植物糖蛋白差异的根源，其区别如下：

在哺乳动物细胞中，寡糖链主链有α(1,6)-果糖存在，且糖链末端为与β(1,4)-半乳糖连接的唾液酸；而在植物细胞中，寡糖链主链有α(1,3)-海藻糖存在，在糖链分枝处有β(1,2)- 木糖连接。

由此可知，如果直接将一段蛋白的基因导入到植物细胞中，所表达的蛋白会因为糖基化修饰的不同而有别于原始蛋白。糖基化的差异不仅可能导致在植物中表达的动物蛋白功能丧失或改变，而且可能会引发人体的免疫反应：核心链段的β(1,2)-木糖和α(1,3)-海藻糖是IgE结合植物致敏原的重要的碳水化合物决定位点。实际上，有研究显示用植物的糖蛋白作为抗原触发山羊或兔子的免疫反应时，产生的抗体特异性识别核心链段的β(1,2)-木糖和α(1,3)-海藻糖。这也凸显了通过植物生产药物的潜在问题：植物生产的生物药物是否会触发人类的免疫反应。

为了解决上述问题，可以将植物产生的重组蛋白人源化，利用CRISPR/CAS9系统敲除植物基因组中的α(1,3)-海藻糖转移酶和β(1,2)-木糖转移酶基因，从而减小了动物细胞和植物细胞生产出的蛋白的糖基化的区别。

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是近几年新兴起的一种基因编辑技术，利用此技术可以敲除细胞基因组中的某个特定的基因，其作用原理如下：

CRISPR包含两个组件：一个向导RNA分子(gRNA)和一个非特异性CRISPR相关蛋白-9(Cas9)。gRNA由两部分序列构成，一部分为Cas9结合序列，另一部分为使用者自定的靶向目标基因的序列(约20bp)。由此可见若想改变靶点，只需将gRNA稍作调整即可。CRISPR在最初只用来敲除不同细胞或组织中的特定基因，随着Cas9酶的不断改造，这个方法的用途也被逐渐拓宽，如选择性的激活或沉默某个基因，纯化某个DNA的特定部分，甚至可以用来进行活细胞的DNA荧光成像。相对简便的实验操作也使得它成为最具扩展性的基因组编辑技术，并在近期被用来实施基因组层面的筛选。

CRISPR/Cas9技术可通过细胞内共表达gRNA和Cas9核酸内切酶并对特定基因进行剪切的方式生产基因敲除的细胞或者动物，被切割的靶点(约20bp)需满足下述两个条件：

1.该靶点不会在基因组其他区域出现；

2.靶点位置需与前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif，PAM)相邻并处于上游；PAM序列是Cas9酶行使功能所必需的，不同的Cas9其对应的PAM序列也不同。

一旦Cas9蛋白和gRNA被表达出来，两者通过gRNA中的Cas9结合序列以及Cas9蛋白中被暴露在表面的正电荷沟结合，形成核酸-蛋白复合物，此时Cas9经历构象变化，从原先的未激活状态变为有DNA结合活性的状态。核酸-蛋白复合物会结合在任意一个有PAM 序列的DNA链段中，但是gRNA中的靶向序列是否与靶点结合决定了Cas9是否行使酶切功能。当这个复合物结合靶点序列时，处于gRNA靶向序列部分的3’端“种子”序列开始与靶点序列配对。如果能够成功配对，则剩下的gRNA靶向序列部分沿着3’到5’的方向开始配对。只有当正确配对率足够高的时候，Cas9才会对靶点基因进行切割。Cas9切割与gRNA 结合的DNA单链后进行构象变化，再对另一条DNA单链进行切割，因此最终靶点DNA 呈双链断裂状态(断裂位点通常在PAM序列上游3-4个bp)。

被切断的DNA通过两种方法进行修复：高效但出错率高的非同源末端连接(NHEJ)以及低效但高保真的同源性修复(HDR)。NHEJ修复通路是最活跃的修复途径，能够在短时间内修复双链断裂的DNA，但经常会导致断裂位点插入或缺失核苷酸。正是因为其出错率高，表达Cas9和gRNA的细胞会产生一系列的突变，产生不同的性状。在大多数情况中， NHEJ造成的核苷酸片段插入或缺失会使转录出来的mRNA在翻译时出现氨基酸的插入、缺失或移码突变，其中移码突变可能会造成mRNA可读框内出现终止密码子而使翻译提前结束。这些突变最终会造成靶点基因功能的缺失，从而达到基因敲除的目的。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种分离的胡萝卜XylT 基因及其应用。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种分离和测定胡萝卜XylT基因的序列的方法，包括：

(1)提取胡萝卜基因组DNA；

(2)利用巢式PCR技术获得XylT基因片段，纯化，获得纯化后的XylT基因片段；

(3)将获得的纯化后的XylT基因片段进行测序，获得分离的胡萝卜XylT基因的序列。

优选地，步骤(2)包括：设计外侧一对引物和内侧一对引物，以步骤(1)中提取的胡萝卜基因组DNA为模板，使用外侧一对引物进行第一次PCR反应，获得第一次PCR产物；再以第一次PCR产物作为模板，使用内侧一对引物进行第二次PCR反应；所述外侧一对引物包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物和SEQ ID NO.2所示的反向引物；所述内侧一对引物包括如SEQ ID NO.3所示的正向引物和SEQ ID NO.4所示的反向引物。

优选地，步骤(3)包括：采用如SEQ ID NO.9所示的W3F与如SEQ ID NO.12所示的W4R作为PCR反应的引物，以步骤(2)中获得的纯化后的XylT基因片段为模板进行PCR 反应，获得未知序列PCR产物；然后采用酶切连接的方法将其插入质粒中，获得单克隆后对插入片段进行测序。

进一步优选地，采用如SEQ ID NO.9所示的W3F与如SEQ ID NO.12所示的W4R作为测序时所采用的引物。

本发明的第二方面，提供一种分离的胡萝卜XylT基因，其核苷酸序列中含有两段STR 位点。

所述胡萝卜XylT基因，亦即胡萝卜β(1,2)木糖转移酶基因。

优选地，第一STR位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，具体为：

TATATATATATATATATATATATATATATA；第二STR位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示，具体为：TATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATA。

优选地，所述分离的胡萝卜XylT基因的全长核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

本发明的第三方面，提供一种分离的核酸分子，包含：单链RNA，所述单链RNA中含有能够在严紧条件下与XylT基因杂交的核苷酸序列。

优选地，所述XylT基因来源于胡萝卜。更进一步优选地，所述XylT基因的全长核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

优选地，所述单链RNA的序列与XylT基因中的靶序列基本相同。

优选地，所述XylT基因中的靶序列包括：如SEQ ID NO.14所示的第一靶序列和如SEQ ID NO.15所示的第二靶序列。

进一步地，所述单链RNA为gRNA(向导RNA)。所述单链RNA包括：如SEQ ID NO.27 所示的第一gRNA和如SEQ ID NO.28所示的第二gRNA。

将所述gRNA和CAS9在细胞内表达后，CAS9和sgRNA组成RNA-protein复合体(RNP)。其中所述gRNA通过RNA-DNA碱基互补配对原则，将此RNP定位到XylT基因的特定位置，这时，CAS9将发挥其核酸内切酶的特性，在碱基互补配对的位置上对XylT 基因进行切割，形成DNA双链断裂。进而，特异性敲除细胞内源性XylT基因表达。

本发明的第四方面，提供了一种XylT基因干扰核酸构建体，含有编码前述分离的核酸分子的基因片段，能表达如SEQ ID NO.27所示的第一gRNA和如SEQ ID NO.28所示的第二gRNA。

所述的XylT基因干扰核酸构建体，可以是将能表达如SEQ ID NO.27所示的第一gRNA 和如SEQ ID NO.28所示的第二gRNA的基因片段克隆入已知载体获得。

进一步地，所述的XylT基因干扰核酸构建体可以是质粒载体。

本发明的一优选实施例中，所述的XylT基因干扰核酸构建体是CRISR/Cas9质粒。

优选地，所述的XylT基因干扰核酸构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。

本发明的第五方面，提供一种敲除XylT基因的试剂盒，所述试剂盒包括：存在于容器中的前述分离的核酸分子和/或前述的XylT基因干扰核酸构建体。

本发明的第六方面，提供一种敲除XylT基因的方法，包括：将前述分离的核酸分子和/ 或前述的XylT基因干扰核酸构建体施用于对象中。

所述敲除XylT基因的方法可以是体内的也可以是体外的。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次发现和确定了胡萝卜β(1,2)木糖转移酶的基因全序列，并针对此序列设计了两个有效的gRNA，合成相应的CRISPR/CAS9质粒，从而达到敲除悬浮胡萝卜细胞基因组中β(1,2)木糖转移酶的目的。本发明利用了巢式PCR的扩增技术和cloning技术，以提取的悬浮胡萝卜细胞基因组为模板，对β(1,2)木糖转移酶进行两次扩增后，利用cloning技术，将扩增片段插入pET21a质粒上后进行测序，发现β(1,2)木糖转移酶的基因序列中存在两段 STR位点，这对于胡萝卜种属鉴定及其进化方面具有重大意义。

附图说明

图1：胡萝卜细胞基因组DNA 1％琼脂糖凝胶电泳检测(1kb Ladder)结果，其中左列代表Marker条带，右列代表胡萝卜细胞基因组DNA条带。

图2a：实施例2中第一次PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳检测(1kb Ladder)结果图。

图2b：实施例2中两次PCR反应产物1％琼脂糖凝胶电泳检测(1kb Ladder)结果图。

图2c：实施例2中纯化后PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳检测(1kb Ladder)结果图。

图3a：实施例4中质粒1％琼脂糖凝胶电泳检测，其中，M为1kb Marker，1～12为所挑选的1～12号克隆提取的质粒，pET-21a为原始质粒，作为阴性对照。

图3b：实施例4中质粒1％琼脂糖凝胶电泳检测，其中M为1kb Marker，13～24为所挑选的13～24号克隆提取的质粒，pET-21a为原始质粒，作为阴性对照。

图3c：实施例4中质粒1％琼脂糖凝胶电泳检测，其中M为1kb Marker，25～47为所挑选的25～47号克隆提取的质粒，pET-21a为原始质粒，作为阴性对照。

图4：gRNA1和gRNA2PCR产物1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，Marker为5000bp的marker。

图5：g1和g2酶切鉴定2％的琼脂糖凝胶电泳检测，Marker为5000bp的marker，箭头指示的为被切下来的片段。

图6a：g1质粒1％琼脂糖凝胶电泳检测图，其中M为1kb Marker，1～6为所挑选的 1～6号克隆提取的质粒。

图6b：g2质粒1％琼脂糖凝胶电泳检测图，其中M为1kb Marker，1～6为所挑选的 1～6号克隆提取的质粒。

图7：U6g2片段PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳检测，其大小为590bp，Marker为5000bp的marker。

图8：g1g2串联质粒1％琼脂糖凝胶电泳检测，其中，M为1kb Marker，g1g2大小为16.6kb。

图9：g1g2串联质粒酶切鉴定1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，其中，M为1kb Marker；红色箭头指示的为被切下来的片段。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1 胡萝卜基因组DNA的提取

1.实验方法

此步骤使用天根生化科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒。

具体操作步骤包括：

取新鲜的胡萝卜细胞团块约100mg，加入液氮充分研磨。将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL65℃预热缓冲液GP1的离心管(实验前，需要在预热的GP1中加入巯基乙醇，现配现用，使其终浓度为0.1％)，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中每过5min颠倒离心管数次以混合样品。加入700μL氯仿，充分混匀，12,000rpm 离心5min。将上一步所得的上层水相转入新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀。将混匀的液体小心地转移到吸附柱CB3中，12,000rpm离心30sec，弃去废液。(吸附柱容积为700μL左右，可以分数次加入混匀的液体离心。)向吸附柱CB3的中心加入500 μL缓冲液GD(GD需要加入无水乙醇，使用前检查加入与否)，12,000rpm离30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中心加入600μl漂洗液PW(PW需要加入无水乙醇，使用前先检查加入与否)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3 放入收集管中。重复操作上一步骤。将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。之后在室温下将吸附柱CB3放置数分钟，或者放入超净台中开启最大风速吹干，将吸附柱材料中残余的所有漂洗液彻底去除。将吸附柱CB3转移入一个干净的新离心管中，向吸附膜的中间部位小心地悬空滴加50-200ul洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，然后12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。注意：洗脱缓冲液的体积应不少于50ul，体积过小将会影响回收效率。此外，洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响，因此若用 ddH₂O做洗脱液的话，应保证其pH值在7.0-8.5范围内，倘若pH值低于7.0就会降低洗脱效率；并且收集的DNA产物应保存在-20℃，以防止DNA降解。为了增加基因组DNA 的得率，可以将离心得到的溶液再次加入吸附柱CB3中，室温放置2min后12,000rpm离心2min。

2.实验结果

如图1所示，采用1％脂糖凝胶电泳进行检测，并用NanoDrop仪器检测其OD260/OD280 比值为2.06，说明所得胡萝卜基因组DNA纯度较高。

实施例2 利用巢式PCR技术获得XylT片段

1.实验方法

(1)PCR反应：

以实施例1中获得的胡萝卜基因组DNA为模板，利用基因同源性从胡萝卜数据库中获得3段exon序列，根据此序列设计外侧和内侧两对引物，使用外侧一对引物进行第一次PCR 反应。再以第一次PCR产物稀释10倍后为模板，使用内侧一对引物进行第二次PCR反应。PCR引物序列见表1，反应各组分见表2。第一次PCR反应的循环参数为98℃1min，95℃0.5min，55℃0.5min，68℃10min，35个循环，68℃10min。第二次PCR反应的循环参数为98℃1min，95℃0.5min，55℃0.5min，68℃6min，35个循环，68℃10min。

表1 PCR反应引物序列

表2 PCR反应各组份

Reagents	Volume
		2×KOD FX Buffer	25ul
2mM dNTPs	10ul
		10uM Primer forward	1.5ul
10uM Primer reverse	1.5ul
		Template DNA(ng)	5ng
KOD FX	1ul
		ddH2O	To 50ul

(2)PCR产物纯化

此步骤使用北京索莱宝科技有限公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，实验操作步骤包括：

(使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签)

1、琼脂糖凝胶电泳后，将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)，放入干净的离心管中，称取重量；

2、向胶块中加入3倍体积溶胶液(如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100ul,则加入300ul溶胶液)，50-55℃水浴放置10min，期间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；

注意：溶胶时，如果溶胶液变为红色(正常情况下为淡黄色)，可向含有DNA的胶溶液中加入10-30ul 3M醋酸钠(pH5.2)将胶溶液调为淡黄色，否则将会影响DNA与吸附柱的结合，影响回收效率；

3、将上一步所得溶液加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30-60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；

注意：胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱；

4、向吸附柱中加入700ul漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中；

5、向吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中；

6、12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，防止漂洗液中的乙醇影响后续的实验；

7、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加适量经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置2min，12000rpm离心1min；

8、DNA产物-20℃保存。

2.实验结果

如图2所示，本次PCR产物依然用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。其中，图2a为第一次PCR反应产物，图2b为两次PCR反应产物，图2c为纯化后PCR产物，纯化后PCR产物大小约为5kb。其中所用DNA Marker均为1Kb Ladder。

实施例3 XylT纯化后PCR产物测序

1.实验方法

将实施例2纯化后PCR产物送于上海华津生物科技有限公司进行测序。以外侧两对PCR引物作为第一对测序引物，同时向中间进行测序。再依据测序结果设计两对引物继续进行测序。测序引物序列见表3。

表3测序引物序列

测序引物名称	引物序列(5’-3’)	序号
			W1F	GCTTATTTTGGTAATGGCTTTACTCGAC	SEQ ID NO.5
W1R	CAAGAATATAGGATGGTACTCTAATC	SEQ ID NO.6
			W2F	AATCCTTTTCTGGAGTTGAG	SEQ ID NO.7
W2R	GGCTGTTGCCACAGATCATG	SEQ ID NO.8
			W3F	CGTATTACTATGAGGCGAGG	SEQ ID NO.9
W3R	ATGCAGCATACCAATCTGTAACTG	SEQ ID NO.10
			W4F	GATTTCTTGATGGCATGGTCAAG	SEQ ID NO.11
W4R	TCCATCTCCACCACTTCCACC	SEQ ID NO.12

2.实验结果

测序结果显示，当用W4F与W4R引物进行测序时，测序图谱结果显示各碱基峰混乱，无法得到完整的序列。此步的其他对引物测序结果将与实施例4的结果一起展示。

实施例4 利用Cloning技术获得未知序列中的2段STR位点

1.实验方法

用W3F与W4R作为PCR反应的引物，以实施例2中获得的XylT纯化后PCR产物作为模板进行PCR反应。获得未知序列PCR产物后，采用酶切连接的方法将其插入pET21a 质粒中，获得单克隆后对插入片段进行测序。具体操作步骤如下：

(1)PCR反应及其产物纯化

PCR反应的循环参数为98℃1min，95℃0.5min，55℃0.5min，68℃2min，30个循环，68℃2min。PCR反应体系见表4。获得PCR片段产物后使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对其进行纯化，详细步骤见实施例2。

表4未知序列PCR反应体系

Reagents	Volume
		2×KOD FX Buffer	25ul
2mM dNTPs	10ul
		10uM Primer W3F	1.5ul
10uM Primer W4R	1.5ul
		Template DNA(ng)	5ng
KOD FX	1ul
		ddH2O	To 50ul

(2)酶切连接反应

pET21a质粒含有一个PmeI酶切位点，需用PmeI酶对其进行消化，消化反应体系见表 5，消化反应条件为37℃，4h。质粒消化完全后，加入上一步所得PCR纯化后产物进行连接反应。连接反应体系见表6。其反应条件为37℃，2h。将上述连接体系再次用PmeI消化，以减少转化后的空载体质粒。二次消化体系见表7，反应条件为37℃，2h。

表5消化载体体系

表6连接反应体系

表7二次消化体系

(3)转化

取酶切连接产物5ul加到50ul的感受态细胞(DH5α)中，轻轻摇匀，冰浴30min。42℃热激90s，快速转到冰浴2-3min，注意不要摇动管。向管中加入500ul的LB培养基，150rmp，37℃，摇45min。将菌液全部涂到含100ug/ml Ampicilin的LB平板上。将平板正置直至液体全部吸收。倒置平板，于37℃培养16h。

(4)抽提质粒

挑取转化后的单菌落，接种到2ml含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中，37℃， 150rpm，摇床培养12～16h。取1-1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，4℃，13000rpm离心30s，弃上清，然后再短暂离心，用枪头将离心管底部少量残液吸出弃掉。剩余菌液4℃保存。将细胞沉淀漩涡震荡打散后，重悬于100μl冰预冷的碱裂解液Ⅰ中，漩涡震荡，使细菌悬浮均匀。细菌重悬液中加入200μl碱裂解液Ⅱ，上下翻转离心管5次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，置于冰上(<5min)。加入150μl冰预冷的碱裂解液Ⅲ,上下翻转离心管8次,使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，并将离心管置于冰上1～3min,4℃， 13000rpm离心5min，将～400μl的上清转移至另一个离心管中。加400μl酚:氯仿(V:V＝1:1)，震荡充分混合有机相和水相，13000rpm离心2min，取上清于新离心管中。用2～2.5体积的乙醇(850μl)室温沉淀核酸，混合均匀，室温静置2min。13000rpm离心5min。小心的把上清倒掉(注意不要把沉淀倒出)；然后再短暂离心，用枪头把离心管底部少量残液小心的吸出弃掉。加1ml左右70％乙醇于沉淀中，颠倒离心管数次，洗涤管壁与沉淀，如沉淀偏离管底需13000rpm离心1min。小心的把上清倒掉(注意不要把沉淀倒出)，然后再短暂离心，用枪头把离心管底部少量残液小心的吸出(若沉淀漂浮，用枪头将其置于离心管底部)。打开离心管，室温静置3～5min，使乙醇充分挥发，直至离心管内没有可见的液体存在。加50μl TE缓冲液(含20μg/mlRNase A)于离心管中，静置5min，温和震荡混匀。贮存于-20℃，并取5ul用于琼脂糖凝胶电泳的检测。

(5)测序

将凝胶电泳检测后确定有片段插入的质粒(条带位置高于ctrl的质粒)送于测序公司进行测序。测序引物即为PCR反应的引物。

2.实验结果

质粒琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3a/b/c所示。将条带位置高于ctrl的质粒送于公司测序，测序结果发现该段序列中含有2段STR位点。其中STR1有5种TA序列的重复，分别是13，14，15，18，19个TA的重复序列。STR2有6种TA重复序列，分别是24，15， 22，13，21，7个TA的重复。

结合实施例3的测序结果，胡萝卜XylT的全序列如下(其中STR1与STR2以c为例)：ATGAAGACGAAAAGTTTAAAGATTATTATATTTCTCATATTGATCAACACAATAA CCCTCTTTCTCTACTTGTCATCTCACCCCGACTACTTGAAACACCGCTCACCTCC CTCTCCCCAGCAAGCCCATCATCATTTTTCTGGGTTTTCTCAAATCAATTCTTCA ACTAAGCCCTGGCCCATCCTCCCCTCTTATCTCCCCTGGTCTCAGAACCCTAATG TTAAGTTTGGATCATGTGAGGCTTATTTTGGTAATGGTTTTACTCGACCCTTTTA TCTTCTCAACTCCTCTTCGGGTTCCGATGGTTGGTTTCGGTGTTTCAAGAGTGAT ACTTTGTTGACTTCTATTTGTGAAGGTGGGATTATTAGAATGAATCCGGCTAAG ATTAATATGTCTCATGGTGGTGAGCTCTTGGAGACTGTTATTGGCAGGGAAGAG AATGATGAGCTGCCTGTTTTCCAGCCCGGAGCTTTCGATATTCTGGTTCATAAC AAGGCCAAATTTGGGGATAAGATTATAACTCCCTATTTGCTTCATCGTGTTTTTC CGCAAGGGGAGGTTATTAGGCACACTATGCGCAGCTTGTTGAATTCCATTCGCT TGGTTTCACCTGGTGACTTTCAATGCTCTGAGGTAATCAACGTCGTCTCTTTGCT TGCATTTATGTTTTTTGTCTGATTATTGTCTACTCCACTTTCTATTTAATGCTACTAG CAGATTATACCATGCCGAGATAATTAGGATAACCAACCTTAACTCTATACTTACTATC CAAGATAATTAGGATAACCAACCTTAACTCTATACTTACTATGCGCTCATCATTGGAT TAGTATTCTTAGTAATAGATAGAGTTCAGCAGTATAATAGATGCATGCCCTTGAGCTA TTTTTATTGTGATTATTTGATTCAGAAGTGAAGGCCGAATCCTTTTCTGGAGTTGAGT AAATACTGCAATATGTCCTACTTATCACCACATTTATTACCCTTTTTTTTGGTGGAGGC AATTTTAGAAGTTTTTAATACTTACACCCTTGGACAACTTAATCAAAGTTTAAATCCT TATATTATATTTGGTTGGGGTGAATGAAAATGGACGGAATAGAATGAAATTTGAACTACTCCCTCCGTCTCACCAAATTGTTTACGTTGGGTTTGGGCACGGAGGTTAAGAAATA TGTATAAAGTAGTGGAAAAGAGAAAGAAAAGTGGGTGAAATGGTGGGACCCATTGA TTTTTAATATATAAAAGAGATAGTGGAGTAAAAGTAGTGTGAAAAGGAAAAAAAAA GTGGGAAAGTGGTGGGACCCATTAACTATTTTAGGAAAGTTTTATAATGTAAAGAAA TGAGTGGGACGTCCAGAAAAGGAAACTTTAAAGAATCTGGTGGGACGGAGGGAGTA TAATTTAGTTAAATGTTTAATAATTTCATTTCCTCCATCATTCCACTCTTATCACCCTT AACTTGAGCTCAAGCCCTCCGCTTTATGAAGGAATGCTACATTCTTTATCATATCCAT TTTCTACCCAAATCTCATCATACAAAATTTGCATCCACTCATTATTTTTTTCCAAGTCC TTCCTTTTACCCTTAAATTTTTTCTTTTTATTTTCACTCGCTCCATTCCATTCCATTTCA TTCACCCCAACCAAACAAAACATTAACCTCGTATTACTATGAGGCGAGGGGTATTCG ATGTAGTTGGATCTTTTGATTTCTTGATGGCATGGTCAAGATTTTTGTTTGTTCAGATG TCAAGAATATATATATATATATATATATATATATATATTCAAAAGTGATGGCCGAAGCTTTT TTTTTTTTAACTTGAGCATTTATTATCCTTTTTCTTGGTAGGGGCAATTTTAGAAATTT TTAATACTCACACTCTTGGGCAACTGCATTGAAGTTAAAACCCTTGTGTTTCCTTGGC GTGAATGAAGATGGAATGAATGGAATGAAATTTGAGCTATAATTTAATTAAATGTTT AATAATTTCATTCCCTCCATCATTCCATTTCTATCACCCTTAACTAGACTCAAGCCATC CACTTTGTGAAGAAATTCTCCATTCCTATCATACCTACTTTCTACCGCAATCTCATCAT GCAAAATTTGCATCCCCACATTAGTTTTTCAAGTCCTCTCTTTTATCCTCTACCCTTTGTTATATCCTTTTATTTTCACACATCCATTGACCCCAACCAAACACAACATTAACCTCT CATTACCTTGAGGCGAGGGGTATACACTATACTATGTAGTTGGATATTTTGATTTCTT CATGGCGTGGATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAATAGGGTC CTACTTCACTACAAACTTTCTTAAAATAAAAACTATAAATTAATATTATTTTTTTAACT CACATCAAAATATCAAACATATGGTTTGAAAATTGATCGTTGGAAGATTAAGAAAAA TACAGCTGTGGAAGACAACTAGGGTTGCAATTAAAAGATGACAATGGAGGTGAAAG AGGCAGAAGAGAGGAGGCAACAGCGGTGGGTGAAGGAGGCGGTGGAGGAGGAGGC AGCGGCGGAGGTGGAAGTGGTGGAGATGGAGGTGTAGGTATTAGTGATATGAGCTT CAGAATTTAGTGATATTTGAGGTGGGTTTTTAGTTTCTAGGATAAGGAGGTTTCTATT AGAGTAAGACTCTCTCTCTCTCTCTATATATATATAACTACATTATACATATGATTCC ACATGCTTACAACTTACAAGGGATTTTGGTGTGCGCCATGTCGTGGGCTTTGGCCGGA GAAACACTTGGAAATACACTTTCACTCAAAATCTAGGTCAGAGCAAGAATGTTATTG TTTATCTTGTATGGAAAATTAATAAACAAGTCAAAGTGTCGCAAAACTTTTCGGTGTA TGTCTTGCCTTGACTCTTTATGAAAATAAATATAATACATATAAGTAGGTGCAGATTT CATCTTCATGTTTCCAGTATTACACAATTAGTAGTCATCTCTTGTTCTGACACATCTAT GTTTCTTAAGAAATAATATGGAATACCAATGTCATAAAACTGAAAGTCCTATCCAT AATTTATCACCAGATGTCCCTTTTAAATATTGTACCATCTCTTACAGTTTGGTAT TTAAGTTCTTGACTTATAGTATCTATCTTCAGTGGGTTGAGGAGCCAACACTTTT GGTTACACGCTTTGAGTATGCAAACCTATTTCATACAGTTACAGATTGGTATGCT GCATACGTGGCTTCTAGAGTAACTGGTTTGCCCTATCGTCCTCAGCTGGTGTTT GTAGATGGTCACTGCATGGTAAGTGTACTCAGCTTCACTTCATTACAGTATTTAG TATTTACAGATCGTAATTCTTCTTGTTGGTGTCATGATGATTGCCTGCTCGCAAA TTCATTATGTGCAGTCTTTCACTTATAAATATTCCATGTTCTTTAATTCAGACATAT GTAGAACATTATATATTTTGTTATATTTTTCAAATCTGAACCTGTATATAAGCAACCA GAATAGTGTGGTTACTCATTTACCTTGATACTGCTGTATGAATGCTTTTTCATTCTTTC CTGTTAAATGCTATGTAGATGATTGGGCACAATCTTAAATATGTGAAGTTGACAAGC AGTAGGCACACATTAGTTTTTGGCATTTTGCTTTTCAAATTTTTAGAATTCATATATTT TAAATTTGTCTAAAGAAAAAGGTACATTTTAATGTATATGTAAGTAACTACGTCGAG TCCCTGGGTATTCCTGGTGCTCACGTTCTTATCTACTTGCCTAGATATGTTCCACACAG AACCAACATGCTGCATAGAATTATCTTCTTAATGTCTTGTCAATGTTCCAGGCACCC TTGGAAGAAACATGGAAAGCGATGTTCTCAAGCCTAAGATATGCTAAAAATTTT AGTGGACCTGTTTGTTTTCGCCATGCTATCCTTTCACCTTTAGGATATGAAACTG TCCTATTTAAAGGGCTGACTGAAGACGTAGATTGCCATGGAGCTTCTGCTCATG ATCTGTGGCAACAGCCTGATGATCGAAAAACAGCTCGCATATCTGAATTTGGAG AGATGATAAGAGCTTCCTTTGGATTTCCTGTGGATAGGCACCAAACTTCGAAGC CCGATGCAGGTCTAAATGTTCTCTTTGTTCGGCGTGAGAATTACTTGGCTCATC CACGCCATGCTGGTAAGGTTCAATCAAGGCTCGCCAACGAACAAGAGCTTTTTG ATTCGTTAAAGATCTGGGCATCAAAAGATGTAGATTGCAAAATAAATTTAGTCA ATGGGATATTTGCCCATATGCCGATGAAAGATCAGGTCCGAGCAATTCACGATG CCTCGGTCATTATTGGGGCTCATGGAGCTGGCCTCACTCATATAGTGTCAGCCT CACCGAAAGCAGTTATTCTAGAGATCGTTGCTGCTGAGTTTATGCGCCCGCATT TCACGCTTATTGCAAAATGGAAAGGATTAGAGTACCATCCTATATTCTTGTCAGA CTCTTATGCTAAACCTTTAATTGTCAAACAAAAACTTAGTAGCATCCTGAAAACC CTTGGATGCTAA(SEQ ID NO.13)(粗体字母为胡萝卜XylT基因的3段exon序列，斜体字母部分为STR位点)。

其中，第一STR位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，具体为：

胡萝卜的XylT基因全序列为其作为被敲除基因的靶点奠定了重要的基础，实施例5将基于此序列结果设计相应的gRNA。此外，本实施例的结果中发现了胡萝卜XylT基因中含有两段STR位点，这为胡萝卜等植物的进化研究及其种属鉴定提供了可靠依据。

实施例5 XylT基因中gRNA靶点的选取

1.实验方法

根据实施例3和4中得到的测序结果，使用在线设计工具CHOP CHOP设计gRNA。具体操作步骤如下：

打开靶点在线设计工具CHOP CHOP(http://chopchop.cbu.uib.no/)，输入实施例 3和4所测得的基因序列Exon1和Exon3，设置好各项选择提交后，即可给出数个合适的在PAM序列周围的靶位点供选择，并给出各位点的潜在脱靶位置、数目等信息。根据给出的这些靶位点，综合考虑各项参数后选择预测脱靶效应较低的靶位点。根据以下原则进行筛选：脱靶数目的多寡；脱靶处是否有错配还是可以完美结合非目标序列；靶标序列在基因中的位置，越靠近5’端越好；GC含量，有近期研究显示GC含量在40％～80％的gRNAs更有效；在靶标处20位左右的鸟嘌呤可以增加剪切效率。设计的两种gRNA中，gRNA1用以敲除 XylT Exon1，gRNA2用以敲除XylT Exon3。

2.实验结果

使用在线设计工具CHOP CHOP分别获得gRNA1和gRNA2的靶点位置及其序列。

gRNA	gRNA靶点序列5’-3’(含PAM序列)	序号
			gRNA1	GAGATGACAAGTAGAGAAAGAGG	SEQ ID NO.14
gRNA2	GAGCTTCTGCTCATGATCTGTGG	SEQ ID NO.15

实施例6 gRNA活性的体外检测

1.实验方法

此步实验使用北京维尚立德生物科技有限公司的Cas9-gRNA靶点效率检测试剂盒(Catalog.No.VK007)。具体操作步骤如下：

(1)gRNA PCR产物的获得

a：引物合成

先合成含有T7promoter的gRNA引物，引物序列见下表：

正向引物中，序列TAATACGACTCACTATAG是T7promoter，斜体字母为gRNA靶点，序列GTTTTAGAGCTAGAAATAGC是gRNA骨架部分。反向引物亦为gRNA骨架部分。

b：PCR扩增反应：

使用上述引物(引物需稀释浓度为10uM)，并以含有gRNA骨架的质粒为模板(本实验选用北京唯尚立德生物科技有限公司的标准gRNA模板VK007-17)进行PCR反应，反应循环参数为98℃1min，95℃0.5min，55℃0.5min，68℃1min，35个循环，68℃1min。 PCR产物大小为120bp。反应体系见下表：

Reagents	Volume
		2×KOD FX Buffer	25ul
2mM dNTPs	10ul
		10uM Primer gRNAg1F/gRNAg2F	1.5ul
10uM Primer gRNAR	1.5ul
		Template DNA(ng)	5ng
KOD FX	1ul
		ddH2O	To 50ul

c：PCR产物的纯化与检测

使用琼脂糖凝胶DNA回收纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，并用1.5％琼脂糖凝胶电泳对其进行检测。浓度应大于70ng/ul。此步需要DNA浓缩处理后浓度才能达到要求。纯化步骤详见实施例2。DNA浓缩步骤如下：

向纯化后DNA溶液中加入1/10体积的3M NaAc，混匀。再加入2倍体积的无水乙醇，混匀。4℃静置10-30min。12000rpm，4℃离心10min。弃上清，加入700ul75％乙醇清洗沉淀。12000rpm离心1min。弃上清，室温放置几分钟，晾干乙醇，加入DNA洗脱缓冲液溶解DNA，室温静置5min，混匀。跑胶鉴定。

(2)gRNA的转录

gRNA的体外转录体系如下：

反应结束后，加入2ul DNaseI，37℃反应30min。

(3)gRNA的回收与提取

加入115ul DEPC水，15ul Stop Solution均匀后，加入2倍体积的无水乙醇，混匀后， -20℃冻存过夜。13000rpm 4℃离心20min，去除上清保留沉淀。加入300ul的70％乙醇清洗沉淀，13000rpm 4℃离心1min，弃上清，室温晾置1-2min后，加入40ul DEPC水溶解RNA沉淀。用NanoDrop测其浓度。

(4)体外酶切反应

反应体系如下：

充分混匀后，37℃1h。用2％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

2.实验结果

图4为gRNA PCR产物纯化后1.5％琼脂糖凝胶电泳检测示意图；经DNA浓缩后，用NanoDrop测其浓度gRNA1的PCR产物为73ng/ul，gRNA2的PCR产物浓度为80ng/ul。

图5为2％的琼脂糖凝胶电泳酶切鉴定示意图；结果可知gRNA1和gRNA2体外检测均有活性，且活性很好。故gRNA1和gRNA2可以做为胡萝卜XylT基因的2个gRNA靶点。

实施例7 敲除XylT基因的CRISR/Cas9质粒构建

1.实验方法

此步骤所用试剂盒为北京唯尚立德生物科技有限公司的植物Cas9/gRNA质粒构建试剂盒(Catalog.No.VK005-04)。此试剂盒能快速方便地将gRNA靶点序列插入到CAS9/gRNA质粒中，且多个gRNA可以构建到同一载体中。详细步骤如下：

(1)使用CHOPCHOP软件确定gRNA靶点位置后，按照如下格式设计引物：

Target-Sense：5’-TTG-gRNAsense

Target-Anti：5’-AAC-gRNAanti

(gRNA引物不能加上PAM序列)

将合成的引物分别稀释成10μM后，按如下比例混合均匀：

Reagents	Volume
		Target-Sense	5μL
Target-Anti	5μL
		H<sub>2</sub>O	15μL
Total	25μL

混匀后，按照如下程序处理：95℃3min→95℃到25℃缓慢冷却(可将样品管放在95℃水中，自然冷却至室温)→16℃5min

(2)按照如下体系，将各试剂添加进PCR管中，混合均匀，16℃反应2h。

(3)取上一步最终产物5-10ul转化至50ul DH5a感受态细胞中。具体步骤详见实施例4 转化。

(4)挑3-5个菌落摇菌，抽提质粒后跑DNA胶检测，将大小对的质粒送测序。测序引物为：sqprimer:5’-GATGAAGTGGACGGAAGGAAGGAG-3’(SEQ ID NO.19)。

按照上述方法将g1，g2质粒构建好后，进而构建串联质粒g1g2。

利用VK005-04的三个酶切位点，将g1与g2串联在同一质粒中，得到敲除XylT基因质粒g1g2。首先构建好g1和g2后，使用AscI+SpeI酶切处理g2，得到U6g2片段。在这里，为了获得较多的该片段，使用了PCR的方法来扩增大小为569bp的U6g2片段，经过纯化及测序鉴定序列正确后，将其与AscI+AvrII酶切处理过的g1质粒载体进行连接。

获得U6g2片段的PCR反应引物见下表：

引物名称	引物序列5’-3’	序号
			U6g2F	CGAGCTCGGTACCCGGGGATC	SEQ ID NO.20
U6g2R	GAGGATAAAACCTCACCAAAATACG	SEQ ID NO.21

U6g2片段大小约为590bp，故PCR反应循环数参数为：98℃1min，95℃0.5min，55℃0.5min，68℃1min，30个循环，68℃2min。

PCR反应体系见下表：

Reagents	Volume
		2×KOD FX Buffer	25ul
2mM dNTPs	10ul
		10uM Primer U6g2F	1.5ul
10uM Primer U6g2R	1.5ul
		Template DNA(ng)质粒g2	5ng
KOD FX	1ul
		ddH2O	To 50ul

g1质粒用AscI+AvrII酶切的消化体系见下表：

消化后g1载体与U6g2片段的连接体系见下表：

取5ul上述反应体系转化至DH5a感受态细胞中，挑单克隆，抽提质粒后酶切鉴定，选取酶切鉴定后正确的质粒用sqprimer测序引物进行测序。

2.实验结果

图6a和6b所示g1和g2质粒1％琼脂糖凝胶电泳检测示意图；质粒大小约为16kb。

g1质粒挑选3号克隆的测序结果如下(gRNA用斜字体表示)：

5’-CAGGAAACAGCTATGACATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCTTTCAC TGGCGCGCCCCAATGTCCCTAGGTTCGTTGAACAACGGAAACTCGACTTGCCTTCCGC ACAATACATCATTTCTTCTTAGCTTTTTTTCTTCTTCTTCGTTCATACAGTTTTTTTTTGT TTATCAGCTTACATTTTCTTGAACCGTAGCTTTCGTTTTCTTCTTTTTAACTTTCCATTCG GAGTTTTTGTATCTTGTTTCATAGTTTGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGCATCGAACCT TCAAGAATTTGATTGAATAAAACATCTTCATTCTTAAGATATGAAGATAATCTTCAAAA GGCCCCTGGGAATCTGAAAGAAGAGAAGCAGGCCCATTTATATGGGAAAGAACAATA GTATTTCTTATATAGGCCCATTTAAGTTGAAAACAATCTTCAAAAGTCCCACATCGCTTA GATAAGAAAACGAAGCTGAGTTTATATACAGCTAGAGTCGAAGTAGTGATTGGAGATG ACAAGTAGAGAAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTA TCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTACTAGTTTTGATCTTGAAAG ATCTTTTATCTTTAGAGTTAAGAACTCTTTCGTATTTTGGTGAGGTTTTATCCTCTTGAG TTTTGGTCATAGACCTATTCATGGCTCTGATACCAATTTTTAAGCGGGGGCTTATGCGGA TTATTTCTTAAATTGATAAGGGGTTATTAGGGGGTATAGGGTATAAATACAAGCATTCCC TTAGCGTATAGTATAAGTATAGTAGCGTACCTCTATCAAATTTCCATCTTCTTACCTGCAC AGGGCCTGCAACCTACTGCTCAA-3’(SEQ ID NO.22)。

其中，第一gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示，具体为：GAGATGACAAGTAGAGAAAG。

g2质粒挑选3号克隆的测序结果如下(gRNA用斜字体表示)：

5’-CAGGAAACAGCTATGACATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCTTTCAC TGGCGCGCCCCAATGTCCCTAGGTTCGTTGAACAACGGAAACTCGACTTGCCTTCCGC ACAATACATCATTTCTTCTTAGCTTTTTTTCTTCTTCTTCGTTCATACAGTTTTTTTTTGT TTATCAGCTTACATTTTCTTGAACCGTAGCTTTCGTTTTCTTCTTTTTAACTTTCCATTCG GAGTTTTTGTATCTTGTTTCATAGTTTGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGCATCGAACCT TCAAGAATTTGATTGAATAAAACATCTTCATTCTTAAGATATGAAGATAATCTTCAAAA GGCCCCTGGGAATCTGAAAGAAGAGAAGCAGGCCCATTTATATGGGAAAGAACAATA GTATTTCTTATATAGGCCCATTTAAGTTGAAAACAATCTTCAAAAGTCCCACATCGCTTA GATAAGAAAACGAAGCTGAGTTTATATACAGCTAGAGTCGAAGTAGTGATTGGAGCTT CTGCTCATGATCTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTAT CAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTACTAGTTTTGATCTTGAAAGA TCTTTTATCTTTAGAGTTAAGAACTCTTTCGTATTTTGGTGAGGTTTTATCCTCTTGAGT TTTGGTCATAGACCTATTCATGGCTCTGATACCAATTTTTAAGCGGGGGCTTATGCGGAT TATTTCTTAAATTGATAAGGGGTTATTAGGGGGTATAGGGTATAAATACAAGCATTCCCT TAGCGTATAGTATAAGTATAGTAGCGTACCTCTATCAAATTTCCATCTTCTTACCTGCAC AGGGCCTGCAACCTACTGCTCAA-3’(SEQ ID NO.23)。

其中，第二gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示，具体为：GAGCTTCTGCTCATGATCTG。

图7所示PCR反应U6g2片段的1％琼脂糖凝胶电泳检测示意图；U6g2片段大小约为590bp。

图8所示转化后g1g2串联质粒1％琼脂糖凝胶电泳检测示意图；质粒大小约为16.6kb。

图9所示g1g2串联质粒酶切鉴定1.5％琼脂糖凝胶电泳检测示意图；被切下来的片段大小约为1180bp。

g1g2串联质粒的测序结果如下(gRNA用斜字体表示)：

5’-CAGGAAACAGCTATGACATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCTTTC ACTGGCGCGCCCCAATGTCCCTAGGTTCGTTGAACAACGGAAACTCGACTTGCCTTCC GCACAATACATCATTTCTTCTTAGCTTTTTTTCTTCTTCTTCGTTCATACAGTTTTTTTT TGTTTATCAGCTTACATTTTCTTGAACCGTAGCTTTCGTTTTCTTCTTTTTAACTTTCCA TTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTCATAGTTTGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGCATC GAACCTTCAAGAATTTGATTGAATAAAACATCTTCATTCTTAAGATATGAAGATAATC TTCAAAAGGCCCCTGGGAATCTGAAAGAAGAGAAGCAGGCCCATTTATATGGGAAA GAACAATAGTATTTCTTATATAGGCCCATTTAAGTTGAAAACAATCTTCAAAAGTCCC ACATCGCTTAGATAAGAAAACGAAGCTGAGTTTATATACAGCTAGAGTCGAAGTAGT GATTGGAGATGACAAGTAGAGAAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAG GCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTACTAGGTT CGTTGAACAACGGAAACTCGACTTGCCTTCCGCACAATACATCATTTCTTCTTAGCTT TTTTTCTTCTTCTTCGTTCATACAGTTTTTTTTTGTTTATCAGCTTACATTTTCTTGAAC CGTAGCTTTCGTTTTCTTCTTTTTAACTTTCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTCATA GTTTGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGCATCGAACCTTCAAGAATTTGATTGAATAA AACATCTTCATTCTTAAGATATGAAGATAATCTTCAAAAGGCCCCTGGGAATCTGAA AGAAGAGAAGCAGGCCCATTTATATGGGAAAGAACAATAGTATTTCTTATATAGGCC CATTTAAGTTGAAAACAATCTTCAAAAGTCCCACATCGCTTAGATAAGAAAACGAAG CTGAGTTTATATACAGCTAGAGTCGAAGTAGTGATTGCGGGTTCCGATGGTTGGTTTGT TTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAG TGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTACTAGTTTTGATCTTGAAAGATCTTTTATCTTTAG AGTTAAGAACTCTTTCGTATTTTGGTGAGGTTTTATCCTCTTGAGTTTTGGTCATAGAC CTATTCATGGCTCTGATACCAATTTTTAAGCGGGGGCTTATGCGGATTATTTCTTAAATTGATAAGGGGTTATTAGGGGGTATAGGGTATAAATACAAGCATTCCCTTAGCGTAT AGTATAAGTATAGTAGCGTACCTCTATCAAATTTCCATCTTCTTACCTGCACAGGGCC TGCAACCTACTGCTCAA-3’(SEQ ID NO.24)。采用本实施例所构建的g1g2串联质粒的去敲除XylT基因，结果敲除效率高。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。