CN111534519A - 识别猪eIF4G1基因的sgRNA及其编码DNA和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了识别猪eIF4G1基因的sgRNA及其编码DNA和应用。该sgRNA特异性识别猪eIF4G1基因的sgRNA识别猪eIF4G1基因的第16外显子，且用于CRISPR/Cas9系统，含有如序列1、序列2和序列3所示的负责识别靶片段的序列。本发明提供的特异性识别猪eIF4G1基因的sgRNA能够特异性识别猪eIF4G1基因的第16外显子，且本发明提供的sgRNA用于CRISPR/Cas9系统。本发明通过实验发现，该sgRNA配合CRISPR/Cas9系统，敲除效率分别为70％、45％和50％，能够高效的对猪eIF4G1基因进行基因编辑操作，可实现猪细胞或者个体的基因功能研究以及抗病育种等方面的应用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种识别猪eIF4G1基因的sgRNA及其编码DNA和应用。
背景技术
猪是我国重要的家畜品种之一，其在农业经济、医学疾病模型和分子遗传学研究中均有重要地位。而基因编辑猪在生物学研究、农业新品种培育以及生物医药研究中具有重要的应用价值，CRISPR/Cas9系统的出现极大的提高了猪的基因编辑效率。
eIF4G1基因的全称是整合翻译起始因子4γ1(eukaryotic translationinitiation factor 4 gamma 1)，该基因编码的蛋白质是多亚基蛋白质复合物EIF4F的组成部分。该复合物促进mRNA募集到核糖体，这是蛋白质合成起始阶段的限速步骤。mRNA帽的识别和5'-末端二级结构的ATP依赖性解旋由该复合物中的因子催化。多种动物病毒能够表达降解eIF4G1的蛋白酶，从而劫持宿主mRNA翻译和蛋白合成工厂，利用其合成病毒自身蛋白。
因此对猪eIF4G1基因进行基因编辑，改变或者修饰eIF4G1基因编码序列，有望打破病毒对宿主mRNA翻译和蛋白合成工厂的劫持，从而避免病毒的感染，对猪的基因功能研究、新型基因编辑猪的制备和培育具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种sgRNA。
本发明提供的sgRNA，其靶序列为猪eIF4G1基因的第16外显子或其上任意片段。
上述sgRNA的靶序列为如下a1-a4中任一种：
a1)、核苷酸序列为序列8；
a2)、核苷酸序列为序列9；
a3)、核苷酸序列为序列10；
a4)、将a1)-a3)中任一核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的核苷酸。
上述sgRNA为如下b1)-b5)中任一种：
b1)、含有序列1的核苷酸序列；
b2)、含有序列2的核苷酸序列；
b3)、含有序列3的核苷酸序列；
b4)、由b1)-b3)中所示的sgRNA任两种组成；
b5)、将b1)-b4)中任一核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的核苷酸。
上述sgRNA为如下c1-c5中任一种：
c1)、核苷酸序列为序列4所示；
c2)、核苷酸序列为序列5所示；
c3)、核苷酸序列为序列6所示；
c4)、由c1)-c3)中所示的sgRNA任两种组成；
c5)、将c1)-c4)中任一核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的核苷酸。
上述sgRNA中，c4)由c1)和c3)组成的sgRNA。
所述序列1、序列2和序列3所示序列负责识别靶片段；本发明中“含有”指的是所述sgRNA中除去含有负责识别靶片段的序列外，还可以含有具有其他功能的序列，包括但不限于Cas9核酸酶募集序列以及连接各功能单元的连接单元等。
在sgRNA行使其向导功能时，除去负责识别靶序列的片段外，还含有Cas9核酸酶募集序列等具有其他功能的序列，参与CRISPR/Cas9对DNA的靶向切割，因此优化sgRNA的骨架序列，能够提高CRISPR/Cas9系统对靶基因的修饰效率。在一些优选的实施方式中，包含骨架的完整的sgRNA序列含有如序列4、序列5和序列6所示序列，以含有如序列4、序列5和序列6所示序列的sgRNA序列和Cas9配合使用，CRISPR/Cas9系统对靶基因的修饰效率更佳。
本发明提供的特异性识别猪eIF4G1基因的sgRNA能够特异性识别猪eIF4G1基因的第16外显子，其中识别的猪eIF4G1基因的第16外显子优选含有序列7所示序列。本发明通过实验发现，本发明提供的三条sgRNA，能通过CRISPR/Cas9系统对猪eIF4G1基因第16外显子进行修饰，可实现猪eIF4G1基因功能研究、新品种培育等方面的应用。
编码上述sgRNA的DNA分子或含有所述DNA分子的表达盒或表达载体也是本发明保护的范围。
上述编码上述sgRNA的DNA分子的核苷酸序列为序列11、序列12或序列13。
上述含有所述DNA分子的表达盒中，除去编码sgRNA的DNA分子，还可以含有具有其他作用的功能元件，其他功能元件的实例包括但不限于为启动子、终止子、增强子和标记基因等，以及用于作为载体的DNA分子部分。在一些可选的实施方式中，“表达盒”指的是能够提供和调节其中引入的编码核酸序列的表达的核酸构建体，可选的包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件，例如含有启动子、编码上述sgRNA的DNA序列和终止子的表达盒；
“表达载体”指的是能够将靶序列引入细胞中，并使细胞中表达靶序列的DNA分子，表达载体的实例包括但不限于质粒和病毒基因组，例如含有编码上述sgRNA的DNA序列的pT7-sgRNA载体或pX330、pX458等Cas9基因编辑载体。
在本发明的实施例中，表达载体具体为pX330-eIF4G1-sgRNA1、pX330-eIF4G1-sgRNA2和/或pX330-eIF4G1-sgRNA3。
上述sgRNA或上述编码sgRNA的DNA分子在制备CRISPR/Cas9系统中的应用也是本发明保护的范围；
或上述sgRNA或上述编码sgRNA的DNA分子和cas9分子在制备CRISPR/Cas9系统中的应用也是本发明保护的范围。
本发明另一个目的是提供一种特异性识别猪eIF4G1基因的CRISPR/Cas9系统。
本发明提供的系统，其sgRNA为上述sgRNA。
上述系统还包括cas9分子。所述Cas9分子可以为Cas9蛋白分子或Cas9核酸分子。
所述Cas9核酸分子指的是编码Cas9的mRNA或DNA，可以理解的是，Cas9核酸分子还包括和编码Cas9的mRNA或DNA共同作用的功能元件，其他功能元件的实例包括但不限于为启动子、终止子、增强子和标记基因等，以及用于作为载体的DNA分子部分；所述Cas9分子可以为常规的Cas9分子或经过分子生物学改造的Cas9分子，只要具有Cas9分子的剪切功能即可，本发明对此不做限制。本发明提供的对猪基因组中eIF4G1基因进行基因编辑的方法，由于采用了上述sgRNA或编码上述sgRNA的DNA分子，并结合CRISPR/Cas9系统，敲除效率高且特异性强，在进行序列敲除时脱靶率更低。进一步的，对猪基因组中eIF4G1基因进行基因编辑的方法优选的编辑对象是含有如序列7所示序列的猪eIF4G1基因的第16外显子。
在本发明的实施例中，系统为表达编码sgRNA的DNA分子和cas9蛋白的质粒，具体为pX330-eIF4G1-sgRNA1、pX330-eIF4G1-sgRNA2和/或pX330-eIF4G1-sgRNA3。
上述sgRNA或上述DNA分子或上述的载体或系统在制备具有如下d1-d5至少一种功能产品中的应用也是本发明保护的范围:
d1、特异性识别猪eIF4G1基因(具体识别猪eIF4G1基因16外显子)；
d2、敲除猪eIF4G1基因(具体敲除猪eIF4G1基因16外显子)；
d3、对猪eIF4G1基因进行基因编辑(具体基因编辑猪eIF4G1基因16外显子)；
d4、避免猪感染病毒；
d5、培育或制备基因编辑猪。
可以理解的是，所述对猪进行基因编辑可以只对猪基因组中eIF4G1基因进行基因编辑，也可以对猪中包括eIF4G1基因的多个基因进行基因编辑。需要说明的是，本发明提供的应用用于非治疗目的的对猪基因功能研究，包括在猪eIF4G1位点定点整合外源基因的研究。将本发明提供的sgRNA及其编码分子、基因编辑的方法或试剂盒应用于猪的基因编辑，敲除效率高且脱靶率低。
所述产品可以用于只对猪基因组中eIF4G1基因进行基因编辑，也可以用于对猪中包括eIF4G1基因的多个基因进行基因编辑。上述产品可以为试剂盒。
本发明另一个目的是提供一种试剂盒。
本发明提供的试剂盒，其包括上述sgRNA或上述的DNA分子或上述的载体或系统；
所述试剂盒具有如下d1-d5至少一种功能：
d1、特异性识别猪eIF4G1基因；
d2、敲除猪eIF4G1基因；
d3、对猪eIF4G1基因进行基因编辑；
d4、避免猪感染病毒；
d5、培育或制备基因编辑猪。
该试剂盒可以用于对猪eIF4G1基因进行基因编辑，也可以用于对包括猪eIF4G1基因在内的多种基因进行基因编辑。
在一些可选的实施方式中，所述试剂盒中包含上述sgRNA以及用于贮存该sgRNA的试剂，以及Cas9蛋白分子。
在一些可选的实施方式中，所述试剂盒包含编码上述sgRNA的载体以及编码Cas9蛋白的载体；编码sgRNA的载体包括但不限于pT7-sgRNA载体或pX330载体。
本发明还有一个目的是提供了一种猪eIF4G1基因进行基因编辑的方法。
本发明的方法，为非疾病诊断和治疗方法，其包括如下步骤：将上述系统导入猪源生物材料(具体为离体猪体细胞)中，实现猪eIF4G1基因的基因编辑。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的特异性识别猪eIF4G1基因的sgRNA能够特异性识别猪eIF4G1基因的第16外显子，且本发明提供的sgRNA用于CRISPR/Cas9系统。本发明通过实验发现，该sgRNA配合CRISPR/Cas9系统，敲除效率分别为70％、45％和50％，能够高效的对猪eIF4G1基因进行基因编辑操作，可实现猪细胞或者个体的基因功能研究以及抗病育种等方面的应用。
附图说明
图1为sgRNA-1打靶效率。
图2为sgRNA-2打靶效率。
图3为sgRNA-3打靶效率。
图4为sgRNA-1和sgRNA-3成对使用时的打靶效率。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
将下述实施例中用于编辑eIF4G1基因的第16外显子的sgRNA命名为sgRNA-1、sgRNA-2和sgRNA-3，其核苷酸序列分别如序列4、序列5和序列6所示，sgRNA-1、sgRNA-2和sgRNA-3的编码DNA分子分别如序列11、12和序列13所示，其中负责识别靶片段的序列分别如序列1、序列2和序列3所示，将序列1、序列2和序列3所示序列部分命名为sgRNA-1-g、sgRNA-2-g和sgRNA-3-g，sgRNA-1、sgRNA-2和sgRNA-3的靶序列如序列8、序列9和序列10所示，序列8、序列9和序列10所示序列为猪eIF4G1基因(Gene ID:449528；NC_010455.5，提交日2018-1-12)的第7953-7971、7960-7979以及7946-7965bp DNA分子。
序列7为EIF4G1基因的第16外显子部分序列(DNA)。
实施例1、利用sgRNA和Cas9敲除猪胎儿成纤维细胞中eIF4G1基因的应用
1、制备sgRNA及表达其的载体
根据sgRNA打靶序列(eIF4G1基因)设计寡聚核苷酸(Oligo)DNA序列，送北京天一辉远生物科技有限公司合成(每条合成1OD，纯化方式选择PAGE)。具体序列如下表1：
表1
将以上两对Oligo DNA分别退火，形成带有粘性末端的双链DNA片段sgRNA-1-g、sgRNA-2-g和sgRNA-3-g。
将上述带有粘性末端的双链DNA片段sgRNA-1-g、sgRNA-2-g和sgRNA-3-g分别连入用限制性内切酶BsmBI酶切回收后的pX330载体(addgene#42230，该载体本身能同时表达Cas9蛋白和gRNA)中，得到pX330-eIF4G1-sgRNA1载体、pX330-eIF4G1-sgRNA2载体、pX330-eIF4G1-sgRNA3载体。
经过测序，pX330-eIF4G1-sgRNA1载体为将如序列1所示序列的编码基因插入pX330载体BsmBI酶切位点间得到的载体，与载体上片段gRNA融合表达得到sgRNA-1(序列4)，且同时表达Cas9蛋白；
pX330-eIF4G1-sgRNA2载体为将如序列2所示序列的编码基因插入pX330载体BsmBI酶切位点间得到的载体，与载体上片段gRNA融合表达得到sgRNA-2(序列5)，且同时表达Cas9蛋白；
pX330-eIF4G1-sgRNA3载体为将如序列3所示序列的编码基因插入pX330载体BsmBI酶切位点间得到的载体，与载体上片段gRNA融合表达得到sgRNA-3(序列6)，且同时表达Cas9蛋白；
sgRNA-1的靶序列如序列8所示，为猪eIF4G1基因的第7953-7971位所示的DNA分子。
sgRNA-2的靶序列如序列9所示，为猪eIF4G1基因的第7960-7979位所示的DNA分子。
sgRNA-3的靶序列如序列10所示；为猪eIF4G1基因的第7946-7965位所示的DNA分子。
2、猪胎儿成纤维细胞的获得
制备方法及使用试剂配方可参考如下文献(刘志国.转基因克隆猪的研制与ZFNs介导基因敲除的初步研究[D].中山大学,2013.)，步骤如下：
(1)从妊娠35天的怀孕母猪的子宫中取出胎儿，用含有双抗的DPBS冲洗；
(2)在超净工作台中用眼科剪去除胎儿的头，四肢和内脏，DPBS冲洗后转移到一个新的培养皿中；
(3)用灭菌的眼科剪将剩余部分剪碎，大小为1mm3；
(4)加入少许胎牛血清，用剪过头的1mL移液枪头将组织块转移到T-75细胞培养瓶的底壁上，并均匀铺开；
(5)将T-75培养瓶铺有组织块的一面向上，加入15mL含有青霉素和链霉素的DMEM细胞培养液，再放入CO2培养箱，37℃，5％CO2培养；
(6)待培养6～8h后，将培养瓶翻转过来，使细胞培养液浸没组织块继续培养；
(7)培养3天后观察组织块周围细胞爬出情况；
(8)培养期间每2d换液一次，待细胞生长至70％汇合时，进行传代培养或者进行冷冻保存；
3、转基因细胞的获得
将上述1制备的pX330-eIF4G1-sgRNA1载体、pX330-eIF4G1-sgRNA2载体、pX330-eIF4G1-sgRNA3载体分别通过核转染(Lonza AMAXA公司的Nucleofector 2b细胞核转染仪)上述2制备的离体猪胎儿成纤维细胞，转染中，质粒量为5微克/100微升体系，细胞量为1*106个/100微升体系，得到转pX330-eIF4G1-sgRNA1细胞、转pX330-eIF4G1-sgRNA2细胞和转pX330-eIF4G1-sgRNA3细胞。
4、TA克隆检测打靶效率
提取上述3中转染48h后细胞的DNA，使用以下的引物进行PCR反应，扩增猪eIF4G1基因第16外显子部分区域。
PCR引物1(扩增产物长度243bp)：
eIF4G1-ex16-F：ACTTCTCCTGTCCTTTTTGCAG(序列20)
eIF4G1-ex16-R：ACCTGTGACACCATCACATCTC(序列21)
将PCR扩增产物连接T载体，然后转化DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄的LB平板进行生长，挑取单菌落扩大培养并测序并比较各自靶序列突变情况。
计算突变样本数(单菌落)占总样品数(单菌落)的比例即为打靶效率。
结果如下：
如图1所示，其中，WT为eIF4G1基因16显子的靶序列；1-10为sgRNA-1打靶的10个单菌落测序样品；在sgRNA-1打靶的10个单菌落测序样品中有7个存在序列突变，说明sgRNA-1和Cas9蛋白对猪eIF4G1位点的敲除效率为70％左右。
如图2所示，其中，WT为eIF4G1基因16显子的靶序列；1-11为sgRNA-2打靶的10个单菌落测序样品；在sgRNA-2打靶的11个单菌落测序样品中有5个存在序列突变，说明sgRNA-2和Cas9蛋白对猪eIF4G1位点的敲除效率为45％左右。
如图3所示，其中，WT为eIF4G1基因16显子的靶序列；1-18为sgRNA-1打靶的18个单菌落测序样品；在sgRNA-3打靶的18个单菌落测序样品中有9个存在序列突变，说明sgRNA-1和Cas9蛋白对猪eIF4G1位点的敲除效率分别为50％左右。
上述可以看出，sgRNA-1和cas9的敲除效果最好。
因此，sgRNA-1和cas9分子(可为Cas9蛋白分子或Cas9核酸分子)可以作为敲除猪eIF4G1位点的系统的组分。
实施例2、利用成对的sgRNA和Cas9敲除猪胎儿成纤维细胞中eIF4G1基因的应用
1、制备sgRNA及表达其的载体
与实施例1的1相同。
2、猪胎儿成纤维细胞的获得
与实施例1的2相同。
3、转基因细胞的获得
选择打靶效率高的进行共转染：
将上述1制备的pX330-eIF4G1-sgRNA1载体和pX330-eIF4G1-sgRNA3载体共同通过核转染(Nucleofector system)上述2制备的猪胎儿成纤维细胞，转染中，质粒量为5微克/100微升体系，2个质粒同时转染时的质量均为5微克/100微升体系；细胞量为1*106个/100微升体系)得到转pX330-eIF4G1-sgRNA1-3细胞。
4、TA克隆检测打靶效率
检测方法同实施例1中的4。
结果如图4所示，其中，WT为eIF4G1基因16显子的靶序列；1-9为sgRNA-1和sgRNA-3打靶的9个单菌落测序样品；成对使用sgRNA-1和sgRNA-3对猪的eIF4G1基因时，在9个单单菌落测序样品全部发生突变，说明成对使用sgRNA-1和sgRNA-3以及Cas9蛋白对猪eIF4G1位点的敲除效率分别为100％左右。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120>识别猪eIF4G1基因的sgRNA及其编码DNA和应用
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 20
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cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 96
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<211> 2006
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ccaatagtgg cagtatctgt gccaaagagg agacggaaaa ttaaggagct caataaaaag 240
gagactgtag gagaccttct agatgccttc aaggaggtaa gggaacagaa agtagcagag 300
gaagaagggc taagtttggg tatggaacag tggtctcact gcaaccaaaa cggaatatcc 360
caacaatggt tacaggtgaa cccaggagta ccagaggtgg aaaaccagcc tcctctagag 420
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gagacctggg actcaaagga ggacaagatt caaaatgctg agaacatcca gcccgctgaa 540
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ggagccagag gtcctgaaag agttgtctgt agccctaact agcctgtttt tgatacttct 900
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aggcataaac tgtggcccag acttcactcc gtcctttgcc aaccttggcc gaccagccct 1020
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agtcagccct ggagatgtga tggtgtcaca ggttggctga ctcattctgt gtcttttctt 1200
gtctctgctc cttgcttagc aggctggcct gggaccccgg cggtctcagc agggtccccg 1260
aaaggaacca cgcaagatca ttgccacagt atcaatgact gaagacataa agctgaataa 1320
agcagagaag gcctggaaac ccagcagcaa gcggacggca gccgataagg accgagggga 1380
agaggatgct gatggcagta aaacccaggt acctgcaagt cctacgagcc tccgttcctt 1440
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<400> 21
acctgtgaca ccatcacatc tc 22
Claims (10)
1.一种sgRNA，其靶序列为猪eIF4G1基因的第16外显子或其上任意片段。
2.根据权利要求1所述的sgRNA，其特征在于：
所述sgRNA的靶序列为如下a1-a4中任一种：
a1)、核苷酸序列为序列8；
a2)、核苷酸序列为序列9；
a3)、核苷酸序列为序列10；
a4)、将a1)-a3)中任一核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的sgRNA，其特征在于：
所述sgRNA为如下b1)-b5)中任一种：
b1)、含有序列1的核苷酸序列；
b2)、含有序列2的核苷酸序列；
b3)、含有序列3的核苷酸序列；
b4)、由b1)-b3)中所示的sgRNA任两种组成；
b5)、将b1)-b4)中任一核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的核苷酸。
4.根据权利要求1-3中任一所述的sgRNA，其特征在于：
所述sgRNA为如下c1-c5中任一种：
c1)、核苷酸序列为序列4所示；
c2)、核苷酸序列为序列5所示；
c3)、核苷酸序列为序列6所示；
c4)、由c1)-c3)中所示的sgRNA任两种组成；
c5)、将c1)-c4)中任一核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的核苷酸。
5.根据权利要求4所述的sgRNA，其特征在于：
c4)由c1)和c3)组成的sgRNA。
6.编码权利要求1-5中任一所述sgRNA的DNA分子、含有所述DNA分子的表达盒或表达载体。
7.一种特异性识别猪eIF4G1基因的CRISPR/Cas9系统，其sgRNA为权利要求1-5中任一所述sgRNA。
8.根据权利要求7所述的系统，其特征在于：所述系统还包括cas9分子。
9.权利要求1-5中任一所述sgRNA或权利要求6所述的DNA分子或权利要求7或8所述的载体或系统在制备具有如下d1-d5至少一种功能产品中的应用:
d1、特异性识别猪eIF4G1基因；
d2、敲除猪eIF4G1基因；
d3、对猪eIF4G1基因进行基因编辑；
d4、避免猪感染病毒；
d5、培育或制备基因编辑猪。
10.一种试剂盒，其包括权利要求1-5中任一所述sgRNA或权利要求6所述的DNA分子或权利要求7或8所述的载体或系统；
所述试剂盒具有如下d1-d5至少一种功能：
d1、特异性识别猪eIF4G1基因；
d2、敲除猪eIF4G1基因；
d3、对猪eIF4G1基因进行基因编辑；
d4、避免猪感染病毒；
d5、培育或制备基因编辑猪；
或，一种猪eIF4G1基因进行基因编辑的方法，包括如下步骤：将权利要求7或8所述的系统导入离体猪体细胞中，实现猪eIF4G1基因的基因编辑。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010453632.9A CN111534519B (zh) | 2020-05-26 | 2020-05-26 | 识别猪eIF4G1基因的sgRNA及其编码DNA和应用 |
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| CN202010453632.9A CN111534519B (zh) | 2020-05-26 | 2020-05-26 | 识别猪eIF4G1基因的sgRNA及其编码DNA和应用 |
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-
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| CN114480397B (zh) * | 2022-03-10 | 2023-09-08 | 佛山科学技术学院 | 特异性识别猪Wip1基因的sgRNA及其应用和产品 |
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