CN114480397B - 特异性识别猪Wip1基因的sgRNA及其应用和产品 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种特异性识别猪Wip1基因的sgRNA及其应用和产品，涉及基因工程技术领域，本发明提供的特异性识别猪Wip1基因的sgRNA通过特定序列的选择，能够特异性识别猪Wip1基因的启动子前1500bp，且本发明提供的sgRNA用于CRISPR/Cas9系统。本发明通过实验发现，该sgRNA配合CRISPR/Cas9系统，敲除效率分别为35％、40％和43％，能够高效的对猪Wip1基因进行基因编辑操作，可实现猪细胞或者个体的基因功能研究以及抗病育种等方面的应用。

Description

特异性识别猪Wip1基因的sgRNA及其应用和产品
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种特异性识别猪Wip1基因的sgRNA及其应用和产品。
背景技术
猪是我国重要的家畜品种之一，其在农业经济、医学疾病模型和分子遗传学研究中均有重要地位。而基因编辑猪在生物学研究、农业新品种培育以及生物医药研究中具有重要的应用价值，CRISPR/Cas9系统的出现极大的提高了猪的基因编辑效率。
Wip1基因的全称是野生型p53诱导磷酸酶1(Wild-type p53-inducedphosphatasel)，作为PP2C家族中的一员,Wip1由PPM1D(protein phosphatase,Mg2+/Mn2+dependent 1D)基因编码。研究报道Wip1基因通过调控机体内一些重要信号分子(如p53、p38MAPK、ATM等)，从而影响细胞发挥正常功能，此外，Wip1基因也在生殖调控、免疫调节、肿瘤发生等病理过程发挥重要影响。
因此对猪Wip1基因启动子前1500bp区域进行编辑，探索该区域调控元件对生殖，免疫及肿瘤等方面的调控，对猪的基因功能研究、新型基因编辑猪的制备和培育具有重要的应用价值。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供特异性识别猪Wip1基因的三条sgRNA，该sgRNA用于CRISPR/Cas9系统，能够特异性识别猪Wip1基因的启动子前1500bp区域。
本发明的第二目的在于提供一种含有编码上述sgRNA的序列的DNA分子。
本发明的第三目的在于提供一种对猪基因组中Wip1基因进行基因编辑的方法。
本发明的第四目的在于提供一种用于对猪基因组中Wip1基因进行基因编辑的试剂盒。
本发明的第五目的在于提供一种上述特异性识别猪Wip1基因的sgRNA或上述DNA分子的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种特异性识别猪Wip1基因的sgRNA，所述sgRNA包括sgRNA-1、sgRNA-2或sgRNA-3中的一种或多种；
所述sgRNA-1中负责识别靶片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述sgRNA-2中负责识别靶片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述sgRNA-3中负责识别靶片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步的，所述sgRNA-1具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
可选地，所述sgRNA-2具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；
可选地，所述sgRNA-3具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种用于猪Wip1基因编辑的DNA分子，包含编码上述的sgRNA的DNA分子。
进一步的，编码sgRNA-1中负责识别靶片段的核苷酸序列的DNA分子序列如SEQ IDNO.8所示；
可选地，编码sgRNA-2中负责识别靶片段的核苷酸序列的DNA分子序列如SEQ IDNO.9所示；
可选地，编码sgRNA-3中负责识别靶片段的核苷酸序列的DNA分子序列如SEQ IDNO.10所示。
进一步的，编码所述sgRNA-1的DNA分子序列如SEQ ID NO.11所示；
可选地，编码所述sgRNA-2的DNA分子序列如SEQ ID NO.12所示；
可选地，编码所述sgRNA-3的DNA分子序列如SEQ ID NO.13所示。
本发明还提供了一种对猪基因组中Wip1基因进行基因编辑的方法，所述方法包括将(a)和(b)导入猪源生物材料中，以对猪基因组中Wip1基因进行编辑；
(a)上述sgRNA或上述DNA分子；
(b)Cas9分子，所述Cas9分子包括Cas9蛋白分子或Cas9核酸分子；
优选地，所述猪源生物材料包括猪源细胞。
本发明还提供了一种试剂盒，包括上述的sgRNA或DNA分子。
本发明还提供了上述的sgRNA、DNA分子、方法或试剂盒在对猪进行基因编辑中的应用。以及，上述的sgRNA、DNA分子或试剂盒在制备对猪进行基因编辑的产品中的应用。
进一步的，所述对猪进行基因编辑包括对猪Wip1基因的启动子前1500bp的核苷酸序列进行编辑；
优选地，猪Wip1基因的启动子前1500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的特异性识别猪Wip1基因的sgRNA能够特异性识别猪Wip1基因的启动子前1500bp，且本发明提供的sgRNA用于CRISPR/Cas9系统。本发明通过实验发现，该sgRNA配合CRISPR/Cas9系统，敲除效率分别为35％、40％和43％，能够高效的对猪Wip1基因进行基因编辑操作，可实现猪细胞或者个体的基因功能研究以及抗病育种等方面的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的3条sgRNA活性检测胶图。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，提供了一种特异性识别猪Wip1基因的sgRNA，所述sgRNA包括sgRNA-1、sgRNA-2或sgRNA-3中的一种或多种；
所述sgRNA-1中负责识别靶片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述sgRNA-2中负责识别靶片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述sgRNA-3中负责识别靶片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明提供的特异性识别猪Wip1基因的sgRNA特异性强，在进行基因编辑时，可以显著减少脱靶现象，简单、准确、高效和定点的靶向修饰Wip1基因的启动子前1500bp，使蛋白质发生移码突变从而实现Wip1基因缺失。并且，本发明提供的sgRNA配合CRISPR/Cas9系统，敲除效率分别为35％、40％和43％，能够高效的对猪Wip1基因进行基因编辑操作，可实现猪细胞或者个体的基因功能研究以及抗病育种等方面的应用。
在sgRNA行使其向导功能时，除去负责识别靶序列的片段外，还含有Cas9核酸酶募集序列等具有其他功能的序列，参与CRISPR/Cas9对DNA的靶向切割，因此优化sgRNA的骨架序列，能够提高CRISPR/Cas9系统对靶基因的修饰效率。在一些优选的实施方式中，包含骨架的完整的sgRNA序列含有如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列，以含有如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列的sgRNA序列和Cas9配合使用，CRISPR/Cas9系统对靶基因的修饰效率更佳。
根据本发明的第二个方面，还提供了一种用于猪Wip1基因编辑的DNA分子，包含编码上述的sgRNA的DNA分子。
本发明提供的该DNA分子能够分别转录得到sgRNA-1、sgRNA-2和sgRNA-3，将该DNA分子导入猪源细胞中与Cas9蛋白共同实现猪Wip1基因编辑。
作为优选，编码sgRNA-1中负责识别靶片段的核苷酸序列的DNA分子序列如SEQ IDNO.8所示；编码sgRNA-2中负责识别靶片段的核苷酸序列的DNA分子序列如SEQ ID NO.9所示；编码sgRNA-3中负责识别靶片段的核苷酸序列的DNA分子序列如SEQ ID NO.10所示。
编码所述sgRNA-1的DNA分子序列如SEQ ID NO.11所示；编码所述sgRNA-2的DNA分子序列如SEQ ID NO.12所示；编码所述sgRNA-3的DNA分子序列如SEQ ID NO.13所示。
根据本发明的第三个方面，还提供了一种对猪基因组中Wip1基因进行基因编辑的方法，所述方法包括将(a)和(b)导入猪源生物材料中，以对猪基因组中Wip1基因进行编辑；
(a)上述sgRNA或上述DNA分子；
(b)Cas9分子，所述Cas9分子包括Cas9蛋白分子或Cas9核酸分子。
可以理解的是，可以将本发明提供的sgRNA与Cas9蛋白分子共同导入猪源生物材料中、或者将本发明提供的sgRNA与Cas9核酸分子共同导入猪源生物材料中、或者将本发明提供的DNA分子与Cas9蛋白分子共同导入猪源生物材料中、或者将本发明提供的DNA分子与Cas9核酸分子共同导入猪源生物材料中，本发明对此不做限制。
其中，所述猪源生物材料包括猪源细胞，典型的可以为猪睾丸细胞。
基于本发明提供的sgRNA和DNA分子的有益效果，本发明还提供了一种试剂盒，包括上述的sgRNA或DNA分子。该试剂盒能够高效和定点的靶向修饰Wip1基因的启动子前1500bp，实现对猪基因的高效编辑。
此外，本发明还提供了上述sgRNA及相关产品在对猪进行基因编辑中的应用，以及上述sgRNA及相关产品和方法在制备对猪进行基因编辑的产品中的应用。
其中，所述对猪进行基因编辑包括对猪Wip1基因的启动子前1500bp的核苷酸序列进行编辑；
优选地，猪Wip1基因的启动子前1500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明通过实验发现，本发明提供的三条sgRNA，能通过CRISPR/Cas9系统对猪Wip1基因启动子前1500bp区域进行修饰，可实现猪Wip1基因功能研究、新品种培育等方面的应用。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。
实施例1、利用sgRNA和Cas9敲除猪睾丸细胞中Wip1基因的应用
1、制备sgRNA及表达其的载体
根据sgRNA打靶序列设计寡聚核苷酸(Oligo)DNA序列，送北京天一辉远生物科技有限公司合成(每条合成1OD，纯化方式选择PAGE)。具体序列如下表1：
名称 序列5’-3’ 编号
gRNA-1-g-up CACCGTGAATAGGCTGGGAAAAGCG SEQ ID NO.14
gRNA-1-g-dn AAACCGCTTTTCCCAGCCTATTCAC SEQ ID NO.15
gRNA-2-g-up CACCGGAAACCTCAGTTTGGAAGG SEQ ID NO.16
gRNA-2-g-dn AAACCCTTCCAAACTGAGGTTTCC SEQ ID NO.17
gRNA-3-g-up CACCGTTGGAAGGTGGTTTGTGAAT SEQ ID NO.18
gRNA-3-g-dn AAACATTCACAAACCACCTTCCAAC SEQ ID NO.19
将以上三对Oligo DNA分别退火，形成带有粘性末端的双链DNA片段sgRNA-1-g、sgRNA-2-g和sgRNA-3-g。
将上述带有粘性末端的双链DNA片段sgRNA-1-g、sgRNA-2-g和sgRNA-3-g分别连入用限制性内切酶BsmBI酶切回收后的pX458载体(addgene#48138)中，得到pX458-Wip1-sgRNA1载体、pX458-Wip1-sgRNA2载体、pX458-Wip1-sgRNA3载体。
经过测序，pX458-Wip1-sgRNA1载体为将如SEQ ID NO.1所示序列的编码基因插入pX458载体得到的载体，与载体上片段融合表达得到sgRNA-1(SEQ ID NO.4)；
pX458-Wip1-sgRNA2载体为将如SEQ ID NO.2所示序列的编码基因插入pX458载体得到的载体，与载体上片段融合表达得到sgRNA-2(SEQ ID NO.5)；
pX458-Wip1-sgRNA载体为将如SEQ ID NO.3所示序列的编码基因插入pX458载体得到的载体，与载体上片段融合表达得到sgRNA-3(SEQ ID NO.6)。
sgRNA-1的靶序列如SEQ ID NO.8所示，为猪Wip1基因(GeneID:100525714)启动子前的第450-469位所示的DNA分子。
sgRNA-2的靶序列如SEQ ID NO.9所示，为猪Wip1基因(GeneID:100525714)启动子前的第423-442位所示的DNA分子。
sgRNA-3的靶序列如SEQ ID NO.10所示；为猪Wip1基因(GeneID:100525714)的第435-454位所示的DNA分子。
2.转基因细胞的获得
将上述1制备的pX458-Wip1-sgRNA1载体、pX458-Wip1-sgRNA2载体、pX458-Wip1-sgRNA3载体分别通过核转染(Nucleofector system，转染质粒量5微克/100微升体系)至猪睾丸细胞，得到转pX458-Wip1-sgRNA1细胞、转pX458-Wip1-sgRNA2细胞、转pX458-Wip1-sgRNA3细胞。
3.sgRNA活性检测
提取转染48h后的细胞DNA，使用以下的引物进行PCR反应，扩增猪Wip1基因启动子前1500bp部分区域。
PCR引物1(扩增产物长度680bp)：
Wip1-F：GCTTTCGCTTTGCAGTGGG(SEQ ID NO.20)；
Wip1-R：AACTGACCTGCCAACTCTGA(SEQ ID NO.21)。
将PCR扩增产物变性退火，加入T7E1酶及缓冲液进行酶切反应，将酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过ImageJ软件计算切割效率。
结果如图1所示(M.100bp DNA Marker；1,3,5,7.野生空白对照细胞；2.野生细胞酶切产物；4.pX458-Wip1-sgRNA1转染细胞酶切产物；6.pX458-Wip1-sgRNA2转染细胞酶切产物；8.pX458-Wip1-sgRNA3转染细胞酶切产物)，经过T7E1酶切后，sgRNA-1的PCR产物出现680bp、408bp和272bp的三条条带，说明sgRNA-1使打靶区域产生了序列突变，通过ImageJ软件计算条带亮度得出sgRNA-1的切割效率为35％左右。sgRNA-2的PCR产物出现680bp、435bp和245bp的三条条带，说明sgRNA-2使打靶区域产生了序列突变，通过ImageJ软件计算条带亮度得出sgRNA-2的切割效率为40％左右。sgRNA-3的PCR产物出现680bp、423bp和257bp的三条条带，说明sgRNA-3使打靶区域产生了序列突变，通过ImageJ软件计算条带亮度得出sgRNA-3的切割效率为43％左右。图中M代表100bp DNA Marker；1,3,5,7代表野生空白对照细胞；2代表野生细胞酶切产物；4代表pX458-Wip1-sgRNA1转染细胞酶切产物；6代表pX458-Wip1-sgRNA2转染细胞酶切产物；8代表pX458-Wip1-sgRNA3转染细胞酶切产物。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山科学技术学院
<120> 特异性识别猪Wip1基因的sgRNA及其应用和产品
<130> 2022
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 21
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<213> 人工序列
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<212> RNA
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 猪
<400> 7
gcaatgcgcc tcccccgcct gcccgcgccc accacacaaa tcggacgttc tccccggctg 60
acgtcactcg gctctctggg gccgaccaat ccggagtcga gttgggggcg aacacgccct 120
ccgcccctcc cttctcccta caacggccgc actccctcct ccctgcgcgg gcgcgaagcc 180
agcgcgctac ccggctggct ttcgctttgc agtgggcggt ttcgtcctcc ggcttttcgg 240
cgggtgctaa acgcttatct agcgccttct ctgtcacctt tttgctccgt ccccgcggtc 300
gaattgcagc ctgctgccca gggcgttgcg ttgcttgcct ggtgggaaaa gccgtgtagg 360
ctcgggcctc gcacgagtgt gaagaatcta gagagaaaaa ccttccattt cttgaagtgg 420
cgggaaacct cagtttggaa ggtggtttgt gaataggctg ggaaaagcgt ggcactgtcg 480
aactggactt gggtgggatg gatccgactg ggagttgtga aaggaaatcc actttgtgtt 540
aagaaaacac gggaaatttc caccattggc tgcacggtct cgtttcacat aaactaggta 600
tgtcggacac ttaaacggct tatgttttaa gttcttttca gcttttgcta aaagtagtac 660
tttccccgat gagccctgga tgcagcattt tagtccttcg gcggaatcac ttgaacagac 720
cacttgaaaa taggttacaa aaactgccca gcgctcgagt gctccaagac cttggttatc 780
gtctctcctc ttctcccatg ggttgcaatc taagccctaa aacctttgcc cggatttcga 840
cggcattaaa ataagcctca gagttggcag gtcagtttgt tatcaacagc aaatgttcct 900
gtgagtcaaa ttaaagttca ctttttcagt tttcggccac ttcaccatca cctctcctgt 960
gtgccccttc ctgtacagcc ttagaaattt ccaaatgaaa tgctcctggt actgaactgg 1020
gaatagggaa aaaaactgct ctctctcttt tttttttttt ttgtcttttt gctatttctt 1080
gggccgctcc cacggcatat ggaggttccc aggctagggg tctaatcgga gccgtagcca 1140
ccagcctacg ccagagccac agcaacgcag gatctgagcc gcgtctacaa cctacaccac 1200
agctcacgca aggccagatc gttaacccaa tgagcaaggg cagggaccga acctgcaacc 1260
tcatggttcc tagtcagatt cgttaaccac tgcgccagga ggggaactcc atgctcattt 1320
ttttgacatc tggcacaaga aatacaacta gaaaaaaaat cctcccaata aaagaagtaa 1380
aatcaccccg aaatggagaa aatctgaata gatccattaa attaaaaatg taatcaaaga 1440
taagccctat gttaaaatgc accagaccag atggttccag agtgtaaaaa cacttggaaa 1500
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gtgaataggc tgggaaaagc g 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggaaacctca gtttggaagg 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gttggaaggt ggtttgtgaa t 21
<210> 11
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gtgaataggc tgggaaaagc ggttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt 60
ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgc 97
<210> 12
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ggaaacctca gtttggaagg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 96
<210> 13
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gttggaaggt ggtttgtgaa tgttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt 60
ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgc 97
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
caccgtgaat aggctgggaa aagcg 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
aaaccgcttt tcccagccta ttcac 25
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
caccggaaac ctcagtttgg aagg 24
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
aaacccttcc aaactgaggt ttcc 24
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
caccgttgga aggtggtttg tgaat 25
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
aaacattcac aaaccacctt ccaac 25
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gctttcgctt tgcagtggg 19
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
aactgacctg ccaactctga 20

Claims (8)

1.一种特异性识别猪Wip1基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA包括sgRNA-1、sgRNA-2或sgRNA-3中的一种或多种；
所述sgRNA-1中负责识别靶片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述sgRNA-2中负责识别靶片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述sgRNA-3中负责识别靶片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.据权利要求1所述的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述sgRNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述sgRNA-3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.一种用于猪Wip1基因编辑的DNA分子，其特征在于，为编码权利要求1或2所述的sgRNA的DNA分子。
4.根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于，编码sgRNA-1中负责识别靶片段的核苷酸序列的DNA分子序列如SEQ ID NO.8所示；
编码sgRNA-2中负责识别靶片段的核苷酸序列的DNA分子序列如SEQ ID NO.9所示；
编码sgRNA-3中负责识别靶片段的核苷酸序列的DNA分子序列如SEQ ID NO.10所示。
5.根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于，编码所述sgRNA-1的DNA分子序列如SEQID NO.11所示；
编码所述sgRNA-2的DNA分子序列如SEQ ID NO.12所示；
编码所述sgRNA-3的DNA分子序列如SEQ ID NO.13所示。
6.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的sgRNA或权利要求3-5任一项所述的DNA分子。
7.权利要求1或2所述的sgRNA、权利要求3-5任一项所述的DNA分子或权利要求6所述的试剂盒在制备对猪进行基因编辑的产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述对猪进行基因编辑为对猪Wip1基因的启动子前1500bp的核苷酸序列进行编辑；
所述猪Wip1基因的启动子前1500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
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