CN109679958A - 特异识别猪Tert位点的sgRNA及其编码DNA和应用 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了特异识别猪Tert位点的sgRNA，其中所述的sgRNA由pTert‑exon1‑sgRNA和pTert‑exon2‑sgRNA组成，所述pTert‑exon1‑sgRNA中负责识别靶片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；所述pTert‑exon2‑sgRNA中负责识别靶片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。所述猪Tert位点的sgRNA，特异性强。猪Tert位点的sgRNA可利用CRISPR/Cas9基因编辑系统与双荧光富集的方法，能够高效的实现猪Tert基因的大片段敲除，纯合子效率可达50％，为后续的针对猪Tert基因功能研究提供了前期技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及特异识别猪Tert位点的sgRNA及其编码DNA和应用。
背景技术
衰老是人类疾病最大的危险因子，肿瘤、糖尿病、心血管疾病和老年痴呆等的发病风险均随着年龄的增长而逐年增加。端粒逆转录酶(Tert)基因在老龄化发生过程中发挥重要作用，但其调控动物老龄化的相关分子机制尚未完全解析。猪的生理学等方面特征与人类高度相似，是人类疾病的理想模型。如果以猪为研究对象，利用基因组编辑技术制备Tert基因编辑猪细胞模型，揭示Tert基因调控猪衰老表型的分子机制，将为人类衰老相关疾病的机理阐述与药物的研发提供新的思路，具有重要意义。
ZFN和TALEN打靶技术是目前研究较为成熟的两种种定点突变技术，但是这两种技术构建程序较为繁琐，每一个位点需要构建一对相应的核酸酶，而CRISPR/Cas9系统对特异位点的识别靠小的crRNA的引导，CRISPR区可以有一系列的crRNA组成，每个针对特异位点的crRNA只有几十个碱基，整个载体较小，相对于ZFN和TALEN载体，更加容易构建。
(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)是细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。CRISPR/Cas9利用一段小RNA来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。Cong等及Mali等证明Cas9系统能在293T、K562、iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，非同源重组(NHEJ)、同源重组(HR)效率在3-25％之间，与TALEN酶切效果相当。他们还证明，多个靶点可以同时进行靶向酶切。借助于这一技术，动植物基因功能研究及育种等等都将得到迅猛的发展。
因此，寻求能高效的特异性识别猪的Tert基因的序列，并借助Cas9酶对该位点进行高效的定点切割，将会为后面的针对猪Tert基因功能研究实验打下了坚实的基础。
发明内容
本公开的一个目的是提供了特异识别猪Tert位点的sgRNA。本公开是利用编码sgRNA序列的短片段DNA构建表达载体，该表达载体能够表达出该sgRNA的识别染色体上特定的DNA序列的片段序列，该sgRNA序列能够特异地识别猪Tert位点。
为实现上述目的，本公开的技术方案如下：
特异识别猪Tert位点的sgRNA，由pTert-exon1-sgRNA和pTert-exon2-sgRNA组成，所述pTert-exon1-sgRNA中负责识别靶片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；所述pTert-exon2-sgRNA中负责识别靶片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
其中，上述pTert-exon1-sgRNA识别的靶片段，为序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸。
其中，上述pTert-exon2-sgRNA识别的靶片段，为序列表中SEQ ID NO:4所示的核苷酸。
其中，上述pTert-exon1-sgRNA能够特异识别猪Tert基因的第一外显子序列，所述第一外显子的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO:5所示。
其中，上述pTert-exon2-sgRNA能够特异识别猪Tert基因的第二外显子序列，所述第二外显子的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO:6。
所述特异识别猪Tert位点的sgRNA在猪Tert基因功能研究的应用，所述猪Tert基因的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO:7所示。
本公开的有益效果是：提供了特异识别猪Tert位点的sgRNA，特异性强。所述猪Tert位点的sgRNA利用CRISPR/Cas9基因编辑系统与双荧光富集的方法，能够高效的实现猪Tert基因的大片段敲除，纯合子效率可达50％，为后续的针对猪Tert基因功能研究提供了前期技术支持。
附图说明
图1为实施例3效率检测图。
图2为实施例4细胞克隆图。
图3为实施例4PCR阳性鉴定图。
具体实施方式
以下各步骤仅用以说明本公开的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各步骤对本公开进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各步骤所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本公开各步骤技术方案的范围。
实施例1特异识别猪Tert位点的sgRNA的设计
根据猪Tert基因序列中第一外显子序列，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:5所示，设计sgRNA；根据PAM序列选择用于基因敲除的sgRNA靶点，PAM序列为NGG，所以在Tert基因第一外显子序列上sgRNA的靶点为(命名为Tert-ag1)：CGCCGCACGAAGGTGGCCAGCGG，相对应的sgRNA序列中识别该靶点的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，编码该上述序列的DNA序列如序列表中的SEQ ID NO:3所示。
根据猪Tert基因序列中第二外显子序列，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:6所示，设计sgRNA；根据PAM序列选择用于基因敲除的sgRNA靶点，PAM序列为NGG，所以在Tert基因第二外显子序列上sgRNA的靶点为(命名为Tert-ag2)：TGGCTTCGCGCTGCTGGACGGGG，相对应的sgRNA序列中识别该靶点的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，编码该上述序列的DNA序列如序列表中的SEQ ID NO:4所示。
实施例2特异识别猪Tert位点的sgRNA表达载体的构建
从唯尚利德公司购买CRISPR/Cas9快速构建试剂盒VK001-02与VK001-04，将上述实施例1中的Tert-sg1参照试剂盒说明书连接至VK001-02载体，将上述实施例1中的Tert-sg2参照说明书连接至VK001-04载体上，经测序验证正确后，进行下一步实验。
实施例3特异识别猪Tert位点的sgRNA效率的验证
将上述实施例2中的Tert-sg1表达载体与Tert-sg2表达载体利用电转染法，共转入猪胎儿成纤维细胞中，将细胞平分为2组，一组不用流式富集，一组通过流式细胞仪进行富集，筛选出同时表达红色荧光与绿色荧光的细胞，培养3天后提取总DNA，扩增出Tert基因编辑区域，其中扩增步骤为：以巴马猪基因组DNA为模板，以表1中所示的为引物，以表2的体系进行反应，反应条件为95℃5min；95℃30s，59℃30s，72℃1min 30s 35×；72℃5min。
表1引物序列表
表2 PCR反应体系
将上述反应产物进行电泳检测，结果显示如图1(M为Marker，1为未转染Cas9质粒的细胞DNA PCR产物，2为转染Cas9质粒但未富集的细胞DNA PCR产物，3为转染Cas9质粒但富集后的细胞DNA PCR产物)，发现通过荧光富集后，大片段敲除效率大大增加，在下一步克隆的筛选实验中，我们将主要采用该方法。
实施例4细胞筛选与阳性鉴定
将上述实施例2中的Tert-sg1表达载体与Tert-sg2表达载体利用电转染法，共转入猪胎儿成纤维细胞中，通过流式细胞仪进行富集，利用有限稀释法，挑取细胞单克隆如图2，利用PCR法鉴定出大片段筛除细胞克隆，然后统计其敲除率。
经过PCR鉴定后，其结果如图3所示，经统计后其结果如表3，显示未敲除的野生型(WT)率为36％，敲除突变杂合(HT)率为13.6％，敲除突变纯合(HO)率为50％，说明双等位基因大片段敲除率能够达到50％。
表3克隆结果统计
| WT | HT | HO | |
| 数量 | 16 | 6 | 22 |
| 百分比 | 36％ | 13.6％ | 50％ |
综上可以得出本公开所设计的两条特异识别猪Tert基因的sgRNA，借助CRISPR/Cas9基因编辑系统与双荧光富集的方法，能够高效的实现猪Tert基因的大片段敲除。
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山科学技术学院
<120> 特异识别猪Tert位点的sgRNA及其编码DNA和应用
<130> 2019
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agcgaccccc ccgtgatgac acctaccaga gccgctgcga aagccaagtc tcgggagggt 960
gaggcgcccg gaacccggca cctttcccct caagcaggcg gtgcgcgggg tacctgcccc 1020
ccatcctggt ggcagccaca cctccagggc aagcccagtc ctcatgtgtg cgctgccgag 1080
accaagcgct tcctctactg ctcggggagc aaggaagggc tgcgccgctc gttcctgctc 1140
tgctccctgc cgcccagcct ggcgggggcc gggaggctcg tggaggtcat ctttctggcc 1200
tcaaagcccg ggcagccagg ggcgcgccgc gtgcccgcac gctactggcg gatgaggccc 1260
ctgttccggg agctgcttaa gaaccacgcg cggtgcccct acaaggcgct tctcagggcg 1320
cactgcccgt tgcgggctgc ggcgaccctc tcggggtccg gcggtcaggt gtgcgaccac 1380
aaagtgggcc ccctcgctcc agagcggctg gcagcggccg ccgaggggga ctcggcctcg 1440
aggcgcctag tccagctgct ccgccagcac agcagcccct ggcaggtgta ccgcctcctg 1500
cgggcctgtc ttcaccggct ggtgcccccg ggcctctggg gctccccgca caacaagcgg 1560
cgctttctga agaatgtgaa gaagctcgtc tccctgggga agcacgccag gctctcgctg 1620
caggagctga tgtggaagat gaaagtgcaa gactgcatct ggctgcgccg gagcccgggt 1680
gaggaggagc cgcccgcccc gcaggcccag accccaggac ctgctgcgtc cctcccttgg 1740
aggctggggg cttcttggtg gtgatgggtg gtgccatctg atttctcggc ctctgactcc 1800
ctctccatcc agtttgcacc catccgccga ctttcacgga ctcgggtaga ttctggttgc 1860
cggggtgggg cagcggggag atgggcacat ggggagtagg gctgtgccga caggaggtac 1920
caggagccct ggtaagcgtg cctacagctt tttgacttaa gggtcatcgc ctagaggtgg 1980
tgcccgcgat agaaacggga gctgagctga gaacttcttt tggggggctg ggggtgaggc 2040
tccgggttcc cagggggatc taggcagtgg agggtagatc caaatgcagc tgaagtgtgc 2100
tgccccaggc cagggccagc ggagttcctg ctggacgccc cttccgccaa gccgaccgtg 2160
cgctctgtcc acagccgcag gctcctttgc cttggtcccg cttgccatgc tggcactgac 2220
ctcgccagct ccttgatccc cagcccggga ggccagacca caggcattcc gtatctgcct 2280
ccaggtatcg ccagaattcc tgcttgctgc cacagctggg cacgtgcctg tccacccaca 2340
tccaaccaca atcactcttc ctgagctgcg gtgggagcgg gcccctcccg cctcgccctt 2400
ggcatgtctc ccacatctcc gtggggccgc cagcctgagt ctccccgccg cccgccttct 2460
ctcgcgctcc tcctcctgcc gcgactgtcc gcgtctcccc agctccacgc cagctgctct 2520
gtgtttgatg ttggcgcaca tttttatttg agccgctttt taagtgtttt ctgtttcttc 2580
tcctttgatc ctggagttac tggacacgtg tttcttattt tccaaacgcg tggctgtttt 2640
aagtggcctt cgttgctggt ttccctttca gccggtgggg gtcagactgg cttgatctcg 2700
tgcctgggcc tctgcaggaa tgtccctgtg tgtttgcggg cccgggctgg ggccgtcgtg 2760
tcggtgctcg atgcagaggt cacagcccct gggcgtcggt ccccctcgtc ctctcaaggt 2820
ggacttgggt cgcactcacc gcgcacacgt ccagggttta tctccgagag gaaggtcccg 2880
tgaccctcta gcgtagagcc cggcagccgc tcctggagcc tccgtgcggc cccagccggt 2940
tagcgcctcc ctctggtgcc atttttcctt cttaattttt atattcaacc tcttcgtgtc 3000
ctacgaggac atgtggttta agtgtcttgt caacaccaag ctgatgtttc acgtgtcttt 3060
tttttgcttg tgttcttgcg gccccagtgg catatggagc tcctgggcca gggatccgat 3120
ccaagctgga gttgcgacct gagccgcagc tgtggcaacg tgggaacctt cacccacggt 3180
gccgggctgg ggattgaacc tgcgtccctg gctcccaggg cgccacccgt cctcccagtt 3240
tgtccacttt ctccctggtt tcctggcggg tcctgtgcag tttcttgctg tgggtacttg 3300
ctggctctgc atccttgctg taggtttcta gtctccactt tctctttgct ggttaccttc 3360
tgaaccaggt aagggctttt tttttttttt ggtctttctg ccttttctag ggcctctccc 3420
atggcatatg gaggttccca ggctaggggt ccaatcggag ctgcagccac cagcctatgc 3480
cagagccaca gcaacaggga atccgagcca cgtctgcagc ccacaccaca gctcacggca 3540
atgccgggtc cttaacccac tgagcaaggc cattgatcga acccacaacc tcatggttcc 3600
tagtcggatt cattaaccac tgctccacga cgggaactcc agggctttgc ccttgtaatc 3660
agatcacagc ctgactcgag ccacttccca tactgaccca gttgtgtccc cagcagagac 3720
gtctcggtgc tgtctctcgg gccgacgttt gctggactcc cttcttcctc tttgctcgct 3780
ggtctgtctc ctgccccaga cctgcctctg gggccccttt ggtctctgta tgtgcccttc 3840
atgctgggta gtggccgcag agccccggct gtctttgccg aggcgccctg gcacctgctc 3900
gtgttcccaa gggcacagaa caaacgcaga ggaccacggg gcgggcaccc gtctcggccc 3960
gaggcaagtg cgccaagccc gaggtgcctg gcatccctca gccagcatgt ggcggtctct 4020
tctcgcccga ggttggcctg taaaccccca ggcgtttctg ggtcgtgctg cccagtggcg 4080
aagcccgagt ccacacagac cagcccccgg cagcgtgtct ctggggggca gccttcgctt 4140
tgtgcagccc gtgtgtaacc aggacaagtg acaaggcccc tcgcccttcc tgcccagtag 4200
caacacaaag tgagctctgc acacgactaa gctttccagg agccctggta acaaagtgaa 4260
aaggcgcggg gaactcggtt aaaagggttt cacacgcccc tgggagaagc gccgtttccg 4320
aggtacccgc ctccccctct gctgcgtctc ccagacacgc cgcaagcagc ccagacctgc 4380
cccgggccct cgggggacga ggcgggcggt gcacgggttg agcacccacc tttctcctcc 4440
cagacgctcg ccatgtccag gccgccgagc accgtctgag agaggccatt ctggccaagt 4500
tcctgcgctg gttgatgggc acgtacgtgg tcgagctgct caggtcgttt ttttatgtca 4560
cggagaccac gtttcagaag aaccggctct tcttcttccg gaagcgcatc tggagccggc 4620
tgcagagcgc aggcatcagg taccgggggc ggcggggggg gggtgtcaca cggtgtctcg 4680
ttcctgtctg ggcgatgcca ggggcctgct cccagccccg cgccttcccc aggccccctc 4740
ctggcggctg ggcttgggct cttgcagccc ctctcattac ctgcccgccg gggctcgagc 4800
tggctggtct ggagggtttg gaaggagtct gtacggactg aagtggggag ggtgggctgc 4860
tggcgtctcc ctggcacatg ggcccagcgc tgtttaattc atgcagaacg ggcaggactt 4920
ggcggatgtg ctgtggggag ccccctggga cccggggctg cattgcagtg gcgggggcca 4980
tgagatttgt ctcagcggct cagtgaccgc tgtgtccatt tcgaaggact gggcagaggt 5040
cagccgggcg agggttcgct gggatggtgt gacagcctga aagactggga tgcccagggt 5100
cagaggctcg gcgccctgag ccaggtgtcc gtgcagggag ccaggcaggg cccctgagcc 5160
cgcggggtgg agcccgtgtc ctcctgcgtc tggggaaggc tctggtgtca gacttacggg 5220
tctcagcaaa ggcacagtgg cccgatttca ttttaagtat tttgtgccgt gtgacctgaa 5280
gcagccgtgt gggctctcgt ggggtgttcg agtcccaggc tgggctgtgc ttgtgaagca 5340
ccttttatcc tggggccacc agcacagaga gcacctcacc tcggtggccc gggggtgggg 5400
gcacccagac cctccctgtg gctggtttag gggtaaaggt cacgggtctt tgggagcgag 5460
gctgcaccga cggcggggag gaaggcgggg tccctcaggc cccagcctgc actgcccagg 5520
gcgtcgtctg ccgggaccca ggtgtccggc cccgccaggg cgctgggcgt gggctccgcc 5580
agcctcccta gctctggtgt cccccaggct cacctgcctg cctttccacg ggcccgtctg 5640
tttcaggcaa cacttagatc gtgtgcggct tcgagaactg tcggaagcag agatcaggcg 5700
acgccgggag gccaggcccg ctgtactgac ctccaagctc cgcttcgtcc ccaaacccga 5760
cgggctgcgg cccatcgtga acatggcgaa cgtcgtgcga gccaggacag gccccggaga 5820
caagaaggtc actgccggtg tcgtttttag gcgaagtgca tttcagcccc aggcctgggt 5880
ttctgtcatc agagccccga gggccaggga accggggatc ccggggaggg ccgggcgccg 5940
ggcgccagtg atcccaggtc cagaggagga gctcccagga ggccagtcct gcgaggcggt 6000
ggccgggctc cagagccccc tgtccctaca cgctccacaa gccagggcag aggggcctcg 6060
cgatcagctg tcaccagcct gtcggggtcc cgaggaccct ctgggacctc gctccctccc 6120
gtaaccccgg tgcctgcgtt gccctcactg cgtctccacg tgcccagcag ctccgaccct 6180
tccgggggcc tccctgcggt attggggtgt ttcaccgtta gtgggagaga gaagccattg 6240
gtggtgatgg gggtttggtc tccagccgaa ataaactcct cagggcgggg tcccctggag 6300
gcagtgccct cttcgcttgg ggggcgggca ggcgagcgga ggggatccag ggcctagcca 6360
gctgcactct ccagcgtccg tgaccccacg gccatccctg ggtgggggtg ggggggccct 6420
gctggggttt cggggaggct ggctggccga ggggggcagc gggggctgtg tgaccccagg 6480
ccctcttccg ccgcggccct cctgacgaca ctgcccaccc tgggcggggc ctgcaggtcc 6540
ggcgtctcac ggggcaggtc aagacgctgt ttgctgtgct gaactacgag cgggcgcggc 6600
gcccgcgcct cctgggggcc tccgtgctgg gcgtgggtga catccacagg gcctggcggg 6660
cctttgtgct gcccctgcgg gcccaggacc cggccccccc gctgtacttt gtcaaggtgg 6720
gtgcccgcct cctagccccc caagggagct gggtccctgc cggtgtgggg accgtccgcc 6780
ttcggcagcc ctgtctgtgt cccatacatt ctcctgagag ggggagggca gggaccctgc 6840
ttccatgtgg gggtgtctgg tctgaggcag aagctttgtg ccttcccctc cggagtggac 6900
tctgactgta ccccaactcc aggggctgcc gccctcgggg gatgccctca gagaaggaaa 6960
tgcctgctca gatcccagta ccccgtcgcc cccagcccct cagtcatcca ccaggggcct 7020
cctggtcacc agccagcagt tcagggagag gggcgcagcc tgctgccctg ggggcgctca 7080
gagcctgggg gacctgggcg gggggaggtc tcagtgagag cccccggggg cgggcgagcg 7140
tgtgctggga caggatggct cagaggggca ggccccggga gctcgggtcc agagagagca 7200
tgtcgtcagg cgctcctgac cacacaggtg gacgtgacgg gggcctacga cgccctccct 7260
caggacaggc tgctggaggt ggtcgccaac gtgatccggc cccacgagag cacgtactgc 7320
gtgcgccagt gcgccgtgct ccggaggacc gcccgcgggc acgtgcgcaa gtccttccaa 7380
acccacgtaa gcccccgggg gcggggcgcc ggccgcgggc ggggcggggg cccttggtgt 7440
tgggggacgg ggtcgccgac ctcactcttt ctggggttcc caggagtcct ctccccccgg 7500
ctgcccaggc ctggcctgca gccttgcaga ggggctgtgt gtggtctcgg gggcgggagg 7560
cagagggagg ctcgctcgct gtccctgtcg gcttagaggg ccgggggtcc gcgggccccc 7620
gcaggctgcc acctcagtct agggcctgtt gggaattatt ttcgtgctct gtctccgctt 7680
gagcctgggc tttgcaggct ggtcttgcgc gcgctcatct gccgccgtgc ctgactttac 7740
acgcacttgg ccttcctcgg tctggcagcg tgttttccag ccttaggaag ccacgtgaac 7800
ttgctctgtc tctgggtaaa cccgccgtct tgcccttgtt tcatgagcag tgttctcgtc 7860
acgaatttga acattccaga aacgggatgc cacctcaccc gcaggcacgt ttctctcgtg 7920
tttttttctg ccatttcgcg cttggttttg gtcacaggcc tgtcttgcag ctgcggcgtt 7980
tcgggcggga tgcctggctt tgtacagagc tttcgcgtgt tttcctgcag aaagggtggt 8040
attttcctga cagttggggg agccctggcc tgagtctcgt gagggtcagt tcgacgaggc 8100
agtgtggcct ctgatctctc tctctctctg tctcggccct tttgcccact cgcccgggag 8160
ctggtgtggg cccctcagag gagccgggct cccccagcct cccagccctg caggcagtca 8220
cgacctgctc tccccggctt cctgcagccc ctcctccctg gggcccagct ctgcaccccc 8280
tcctccctct gcggcccctc ctccctgggg ctgcccccac ttccctgctg ctctgcggcc 8340
ctgaagcctg aagtctttag cctggtcgcc cccacttcct gcttgagcac cacctgtcac 8400
agtggtcaca ggccttggag aagttagggt gaggtgggat gcaccccgag atggaaccca 8460
gcccgcctgc atcctgcctc ccagcgcccc ctagtggcca cggtggagtg acctcagaag 8520
cttcacggtg aggggccctc ccgggcgtcc acctgctcac cgcatcctcc tggccagcag 8580
gtgtccacct tcgcagacct ccagccttac atgagacagt ttgtggcaca cctgcaggca 8640
accggcccgc tgagggacgc cgtggtcatc gagcaggtcc gtgtgggcac ccagctcact 8700
gctggcgggg ttggggtggg gcgtgggcac cctccagggc cgacggagac tggcttctgc 8760
tgcgggcagt gttttccctt tgctgccccg cgaaccctct gctgctgccc gaggctctcc 8820
cgtgactcgt cgcaagtctt cttcccccac tgcggtcctg aagccaaaga cgacgagccc 8880
ctactttagg cggacaaaga gggtttggcc tgtagacaca cccccacctg gcccatcaag 8940
gggacgcgct tcctgcctgt gagcagggtc cccaggctgg gttcaccagc agggggtcgg 9000
cccttgtggc tccatgcttt gcgcagagcg gttttggggc gaccttgcca ccacgtgagg 9060
ctctgagacc cttgcgtccg gcggcccagc ccgctcacca cacaccgcct gctttgcaga 9120
gctgctctct gaacgaggcc ggcagccgtc tcctggagct tttcctgagc ctgctgcgaa 9180
accacgtcat ccggatcggg ggcaggtggg tcagcctccc acccccagca cccctgatgg 9240
cgctccgcca cgcggctggc gtggcccagc atggcgccca cggttacgga agtccctgtg 9300
ttcaaaaccc agcagagaac gtttttcacg ggcgtgaaac cagacttgcc tgggcaggcg 9360
cctgtgtgag accccgagta tctggggaga gtggtggtcc tgggttgcca gctcagggcc 9420
caggtcgtca gaggtcagcc cggactgtgt gccaagcccc ggagctttct cgttcaaggg 9480
cgtgcctttc tcattaaagt cacgggcacg ctctgagtgg cgcacatgct aagggcacgc 9540
atggcagggc aagtttggac aaagggtaca cgtgtgtgta acgggcaccg gggaggaaga 9600
gagctgctcc tgtgtcccct gactcctccc agggcgccac ccactgtggc cctcatggca 9660
tccacctggt cacttgccac gtgtgagcag gtgcgtggca gggcgtggcg agggagcatg 9720
agaaatcctg gctcatgtca ccccgggtgg gtgcaatgtg tacacaggag cgggcgtgtc 9780
tgcccacctt ccgacctcgt cttgccccca ggtcctacgt ccagtgtcag gggatcccac 9840
agggctccat tctgtccacg ctgctctgca gcctgtgcta cggggacatg gaaaacagac 9900
tcttccccgg gatccagcgt gacgggtacg acccacggga cgggcgtccg gcccgttcag 9960
cctccttttt ggccatgcct tgcctgcgac atgcggaaac tcctgggcca gggatcgaac 10020
ctgcgccaca gcggggatac cagatccttg acccagtgcg ccgtcagggg gctccgcgtt 10080
tggatttctg gtcagggggc cacatcacgg ggccgccccc tttcttcacg tagcagtgca 10140
cacggtggtc cgcgggcctg catgtggcgg gcacgtgcgc gtgaccgcag gaccccggct 10200
tgttgtcata gccagagccg agtccccaga aacttaagtc gtctatcagc ctctttgcgg 10260
gaggtcattg taccgcgtcc ccgagttcag gctgcaaccc atgggagggc ggcacacgtg 10320
ggcatgaaac agcgcgttcg gggtctctgc ttgtccaggg tgctcctgcg cttggtggac 10380
gacttcctgc tggtgacccc tcacctgaca cgagccaaag cctttctcag gtgaggtccc 10440
tgcgcgtgtc cagtggctgc tggggggcag tgcagacagg gtgggcatca ctgacagtgc 10500
ccacagcgcc cccccccccg cctccgccca cggttgacgc ggcctctgcg tcaggaccct 10560
ggtccgcggc gtgcccgagt acggctgcct ggccaacttg cggaagacgg ccgtgaactt 10620
ccctgtggag gacggcgccc ggggcggccc ggccccactg cagctgccgg cacactgcct 10680
gttcccctgg tgcgggctgc tgctggacac ccgcacgctg gaggtgcact gcgactatgc 10740
caggtgagtg ccaggggccc gcaacccagg aggtcagagg ccggggtcgt cctcccgtcc 10800
cacatggggc cagagtctcc agggcagcag ttttccggcc ttttttaata aaaggagatt 10860
gtgaggccga cttgggggca ccagatgttc tgcgggaaag cgtgtagctc taaaccagag 10920
atcccagcac ctggcaggtc tctgcagggc gggggcgcat gtgctgacgc cgcccggggt 10980
gtcaccgggt gtcaggcttc atggtcacct gggtcggccg ggatcgcagg tggcctgcgc 11040
tggctgtgcc gccgtccgtg cctctgtcgg ctcaggctgc gaccttatgc tctcggtcct 11100
ggaggctgga agctgggtca ggtgtcacag ccgcctcccc atgagccttt cccggcgtgt 11160
gggtgcgtca gcccccgcgg tccccatggc ctcacgcggt ggccctcatc tgcacgcatt 11220
tcggtgactc ttggggctct cgtctcgttg catgggggcc ccacccttat gactttattt 11280
cacttaatca ccatcttaaa ggccttgtgc ccatgcggcc acgagggtca gtgcttcagc 11340
atgtggactt gggggcccag ttcagcccct gacagcctgt ccccaccccc ccaccagcct 11400
gagagcgcag cccggctcag acttggccca gatacagagg gacctgagac aggcgtgggt 11460
gcaggaatct gtctgctgat gggtacaaga tgccagtgtc caggccgtgt ggacatcgtg 11520
tgtccccagc ctgggctgtg accctgctgc tcaggctgga accctcgggc tggctgggtc 11580
tgctcccggg gtgggggccg caggctctcc gtgtgcagtg cccacaccac ccctcgcacg 11640
tccctgcacc aaccactcca gtcagtcgtg aactgcccgc ccgcctgttg ctgtgaccat 11700
tgggcgcagg cgcccgttcc agcccagcac agcctcagtg ggtgtcactg cgccacgggc 11760
ggagccgaga agggccgtac cgccggccgt agcccagaac aagtgggcgt tgggagtcgg 11820
ccgtggtgcc gatgcctgaa ccttccaggc tccagggcca ctgctttggc agatgcctgt 11880
tcgcggaagc tacaagttca gccatggagt tgggggtgac cctcagaacc ccgcgagggc 11940
ttctcgagca cacagccaag cacctgcgag gccgcgaaga cagagaagcc ggaaagaaga 12000
gcctttgaaa gaagagcggt ggggtgagcc ccaggctcgg ccgccccacc ccgcagcccg 12060
gggctgcaca gggacgaccg ccgggcagag cggccagaag ccccgcccca aagctgggcc 12120
ccgggcactg gacggggacg aggctggcga tgtggtcgtc gtcttagaaa accctccgga 12180
agaaagcggt gcagccattt tacctcacag cacaagcggg agaaacgccc ggtgggaaag 12240
gcgttcaacg cggaaaccaa cgtgacgacg gaaacgaaca aaaggactca aagaagtggt 12300
cgtgctggcg ggtcgcatgt cgcgggcagt tggccggaaa ggaggccttg gtcctgacgc 12360
aggaaagccg gtcccctgtc ccgatgggca ccgctggtgc cacccactgt cgtcctggcg 12420
ttggtctcaa agctcatccc ggggcagacg gggcgggggg cccacgggca gcaggatcca 12480
gcccggctcc agaccccgct ccgtgcacgg agcttctgca caagtcggac gcggtcctga 12540
gcaagccaga gattgtgaca ggccgacggt cgcgggcgca ggcctgagcg caggagcctc 12600
tgcccgccag ccatggggag cgcggtcagg gcggccgggc ggaggcgccc cgacagctgc 12660
tcttggaacc agaaacctgc cctgccttct tcagcagtcc tgcgtgtccc agcagttcca 12720
cttccagaaa cccaccccga ggcgaggccg agaggcactg tctgtcttca ggcgcttggg 12780
ggcaacacag caccgcaaac agggatgtcg tgtcgccagg aagaactctt gctctgtcgt 12840
taaggttgat ctcagagaac gtttaaggag acagcaggcc cgtctcacgg acgagaactt 12900
ctcccttagg agctggagtg agagaacccc tcccggtctg ggctgtgcca cacactcatc 12960
ctgggcacac acgcacctgg cggggctcct gacccgtctg tctggcgccg ccctccaagc 13020
acagaggtgg ctgcacctga ccaggacctc cagggaggtg ggcgggccgg gtgtgcgcga 13080
gggtcgggcc cacacatctg cccaaaggag gaggccacga gtctgacggg accccgccct 13140
gtcccgcagt tacgcccgga cctcgatcag agcgagtctc accttcaacc agggcttcaa 13200
gcccgggagg aacatgcgcc gcaagctctt ggcggtcttg cggctaaagt gccacgggat 13260
ccttctggac ctgcaggtgc gagggcttcc gggaggcggc cgggacttcc gggtgagggg 13320
cggcaggtgt cagtgcctcc tgtccagggc gtgctgtgta gaccctggca gggagcgtgt 13380
gtgagggcgc gtggctatgc gtgcatgtgg gtgaaagcac gccagacatc acatacgtgt 13440
gcgctcacac acgtgtgtcc atgtaacgaa tgtgcacacc tttgagggtg tgtgtgttgt 13500
gtgggcatgc tcgttagtgt gtgtgttatg catgcacgtg actgtgggtg tgcgtgtgtg 13560
tgcgcgccga caccaatgag tggatgcgtg tgtgcgaccg caggcgtgtg ttgtgtgcag 13620
atgtgtgcat gaacgtgtgc acgagtgtgt gtgttgggag tgttcacagg tgtgtgcgtg 13680
tgtcagcccc ggcgtcacct gctgaggagc tgccccccca ggctgtgggg ccgagcccgg 13740
ctccgcccct cgcccccaca aatatcttcc ctggggtcct gctccagcag ccgctggggg 13800
cgcggtgagg gcctggcggg ggccgaaggc cctggcgggt tcttctcaaa atggcccttt 13860
tcctggctcc gccggacgcg gccatacgcg gaagatagac gctcaggcgc caggggcgtc 13920
gccagcatcc cttcttcctc gactgcaggt gaacagtctt ccgacggtgc tcgccaacgt 13980
ttacaagatc ttcctgctgc aggcctacag gtgcctcccg cgcccccgcg gcctggcggg 14040
cgccgcggcc tcgctctggg gaagcagcgt cccagccccc ccccaccccc cgcttggggg 14100
tcactgggcg ggggtcgggg ggcggagact ctccaggcag ctcccggtca gcccagccac 14160
gcttccagaa tgttccctgt ccacgggtgg ctcggcggcc ccgctgccga gacctggggc 14220
ccggtctggg ctggagcgtg tgctcttctg cgtgtccgcc tccccggagg gcggcgctcg 14280
gggagcggct ctgcctgacg aggccggcgt gtcctaggtt ccacgcgtgt gtgctgcagc 14340
tgcccttccg tcagccgctt gcgaggaacc cctcattttt cctccggctt gtctccgaca 14400
ccgcgtcctg ctgctactcg ctcctgaaag ccagaaacgc aggtgcgcgc cccacccacg 14460
gccgcggggc agtgagatgg ggactcgggg taccccttcc actcgctgac tcgccccctg 14520
gctcgcccgc cctcccctgc actattggag agtgatggcc atttgggggc cggctggtga 14580
ctgtcccctg cctcctggct cattctgcct gctccctggt gctctgggca cctgcatgga 14640
cctaggtcag tggtcagcag gaggccctgg gcatcccaga accgtgaggg gcaccgcgcc 14700
agccacaccg tcagcttcgg gtccactgtc catggctcgt tgtccccttg acgtccccac 14760
cgagaggccc cgaagcctgc agccacgtcc caggcatttc tgacctgcct gcggttcagg 14820
ccgtgtgtgt ctccgagtcc tgggtgggac agactttgct ttttgctgct tatgcctgtg 14880
ggggtttctt ggagaagtca aggcaaacct gtcagtgtca gcttcctgcg cccgtgtcgg 14940
ggggtccctg cactgcaagt gccctttcgc cccatcccaa accccgtctc ggtgttccgc 15000
tggggccctg gctgcacggg cgatgtctgg ggcccagagt cccctgggag cagcgctggg 15060
gcacagcccc agccgggcca ggcttcagct ccttgtgtcc ccagggatgt ccctgggagc 15120
caggggcgcc tccggcccgt ttccctctga agccgcagag tggctctgcc tccacgcctt 15180
cctgctcaag ctggttcgtc accgcgttac ctacagctgt cttctggggc cgctccgggc 15240
aggtaggcat gggcggggtc agtggcccct tggggagcgc cgccccaccc tctggtctcc 15300
cccaccccac cctgccatgt cccggggcag gtgggtgggt ccaggagcgc ctggggggga 15360
gggggtgcgg gtgccccaag ggttacagtt cccctcctgc gtccaggact gcccaccccg 15420
cctccctctt gggacctggc ctcctctcca gcacccccga gtctgcatcc cctggagtct 15480
ttgcccgccc gaggccccca gcatggtggg gtgccagctc caccggggct cctcccctgg 15540
tgccaccgtc tgcccgtctc agtggcaccc ccaggtcccc atcagggcca tgctccagtt 15600
ttattctggg aggaggtctg atttcagtca cccccttgca gccagagagc gattgtgcca 15660
gcggctccct ggggccacac tggccgccct cgaggccgcc gccgacccag ccctgactac 15720
agacttccgg accatcctgg actgacggtt ggcccttggc gggttctggc cccctgaccc 15780
gggcagcacc ccagcttggt gcccacacct gctgcaccgc ccccccaccc cagctgcatc 15840
ccaaattcag cctcacaggc ctccccagaa gcaaagggcc ccgtcagctg tttgaggccc 15900
gtctccagcc tccgcccctt gcccccggcc tcgcccctgc acctgcccgc tactcccgct 15960
tctacgacgt tctgcgcagg tcccgcctgg cacagggcca tcgccccagc gagggaaggt 16020
ggcgggctct cgctgactgt ttgataaagt cttcctttgg tgtttgcact agagtgtgtt 16080
ctagagagtg cccaactctg ccaggcgtgc tgcccctgag gcctggcctg cctgggaggg 16140
gatgtggggg agggcagtgg gtggggcagt aaggggactc ttgtggggtc agcaggaagg 16200
cgcccacacc cacccctgag cccccatgtg cctccctctg cccttgggga cacacatatc 16260
atcgctctag acaggataga cgggaactcc cacggcgccc ggcccccacc cctgcctgct 16320
ctggctccag ccgaactcca cagacactca ggggtcccca gtctcctggg ggcggggggc 16380
acacagatgc cctggtctcc tgggtcgggg gggaaccaca caggtgctgc cccttccctg 16440
agcttcggtt cagcaggtac agggcgaggc ctgggggcga gtcctacgct aggcccagat 16500
ggtgccgatg ctgctggcgg atggggtggt ttggaggctg gtctgggtgc tgtgtcttct 16560
atgcagggac ccccgagggc agggcagcca gcagctggct cggtccacag tcggggccag 16620
gggttgggta aggttgtggg gacacggctc agctgcagga agaaggggag cggagatgtt 16680
acgggggctt gtttgagagc agcggcccct ccgcgccata acccgtcaga gtccctctgc 16740
gtccttggtc agatccccgc cctccgcgac ctcagatccc tgtgcggcgc ccccaaccac 16800
cgagagagcc cgttttccag ggagctgcag gggtccttcc ggcaagtcgg gcccgccctg 16860
ctttgtctgt gctgaggccg tgcccttcag aaagaacagc agggcgccgc tcgggggtgc 16920
cctgtgggct ggctgtgccc tgtgcctggg gagagcacaa aggccgtagg tggcattttg 16980
atgacaattc ccaaggcttt ctcccaggat gtccccatgg ggccatccaa cctggcaggt 17040
gccacggtgt gtaccttggc cggtgtcggt gctaatgcag ctgaatcggc tgagcgtggg 17100
cgcctgtcag ggtttatggc tgttacctgt ttactgacgc cactgcgacc acgttcccgt 17160
gaccgagctg atgagtttat gatggaccca agtccgcgga gtgtatcatg aatgcatgag 17220
atgatccacg agggactggc cccacccacc tgtgtgccag cctggtagtg ccctcgctgg 17280
aaaggactga cctgccactc agggcagagg acacttcatg caggcggagg tgtccaacac 17340
gccacgcctg tgcctactgc ccgccgctga ccaccacggg ctcccgctgc cctgggcctg 17400
ttggtggcat ttccgtaaca caccaagccg gtcacgactc cgtttaccag tatctacgca 17460
gctcagaacc tcatctgtct agtaaatgca ttttgtccga gttttactta gaatcgtgtg 17520
tgcctttcct aaagtgaaag ggcttggaga ggaatgccca acatggctca gcggaaatga 17580
atctgactgg tatccatgag tccccggcct cgctcagtgg gttaaggatc tggtattgct 17640
gcgaactgtg gtggaggtcg cagatgtggc tccgatccca cgttgctgtg gccgtggtgg 17700
aggccggcag ctgcagttcc tatccagccc ctaccccggg aaccaccata caccgcggga 17760
gcggccctca aaagacaaat aatgataata aagtgcttgg agaggctgtg ctctggtcac 17820
aggctcagca gaccaaaacc tccttccgat ttctgtcttt ttaaaaccgc tgtgcagacc 17880
accaaacctg ctcagggtga taatgtcaaa ataataaaat tttgagaagt gaaaa 17935
Claims (6)
1.特异识别猪Tert位点的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA由pTert-exon1-sgRNA和pTert-exon2-sgRNA组成，所述pTert-exon1-sgRNA中负责识别靶片段的核苷酸序列为SEQID NO:1；所述pTert-exon2-sgRNA中负责识别靶片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
2.根据权利要求书1所述的特异识别猪Tert位点的sgRNA，其特征在于，所述pTert-exon1-sgRNA识别的靶片段，为序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸。
3.根据权利要求书1所述的特异识别猪Tert位点的sgRNA，其特征在于，所述pTert-exon2-sgRNA识别的靶片段，为序列表中SEQ ID NO:4所示的核苷酸。
4.根据权利要求书1所述的特异识别猪Tert位点的sgRNA，其特征在于，所述pTert-exon1-sgRNA能够特异识别猪Tert基因的第一外显子序列，所述第一外显子的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO:5所示。
5.根据权利要求书1所述的特异识别猪Tert位点的sgRNA，其特征在于，所述pTert-exon2-sgRNA能够特异识别猪Tert基因的第二外显子序列，所述第二外显子的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO:6。
6.权利要求书1-5中任意一项所述的特异识别猪Tert位点的sgRNA在猪Tert基因功能研究上的应用，其特征在于，所述猪Tert基因的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO:7所示。
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| CN114480397A (zh) * | 2022-03-10 | 2022-05-13 | 佛山科学技术学院 | 特异性识别猪Wip1基因的sgRNA及其应用和产品 |
Citations (1)
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-
2019
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| CN114480397B (zh) * | 2022-03-10 | 2023-09-08 | 佛山科学技术学院 | 特异性识别猪Wip1基因的sgRNA及其应用和产品 |
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